KR20160019434A - 항-tweakr 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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스테파니 하머
우베 그리찬
산드라 베른트
드미트리 주보브
라르스 린덴
스벤 크리스티안
악셀 하렌가
외르크 비르켄펠트
크리스토프 프라이베르크
스벤 골피어
안드레아 에이커
시모네 그레벤
베아트릭스 스텔테-루드비크
마리안 라슈케
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바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 TWEAKR (TNFRSF12A, FN14)에 특이적인 재조합 항원-결합 영역 및 이러한 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편을 제공한다. 항체는 따라서, TWEAKR의 발현과 연관된 종양 및 다른 장애 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 그를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 지침서가 있는 키트를 제공한다.

Description

항-TWEAKR 항체 및 그의 용도 {ANTI-TWEAKR ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 TWEAKR (TNFRSF12A, FN14)에 특이적인 재조합 항원-결합 영역 및 이러한 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편을 제공한다.
항체는 따라서, TWEAKR의 발현과 연관된 종양 및 다른 장애 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 그를 함유하는 벡터, 제약 조성물, 및 사용 지침서가 있는 키트를 제공한다.
항체-기반 요법은 고형 종양을 비롯한 다양한 암의 치료에서 매우 효과적인 것으로 입증되고 있다. 예를 들어, 헤르셉틴(HERCEPTIN)®은 유방암을 치료하기 위해 성공적으로 사용되고 있고, 리툭산(RITUXAN)®은 B-세포 관련 암 유형에 효과적이다. 신규한 성공적인 항체-기반 요법 개발의 핵심은 상응하는 수용체의 활성을 기능적으로 변형시킬 수 있는, 종양 세포 상에서 우선적으로 발현되는 것으로 발견된 세포-표면 단백질에 대한 항체의 단리이다.
종양 괴사 인자 (TNF) 유사 약한 아폽토시스 유도인자 (TWEAK) 및 TWEAK 수용체 (TWEAKR, 일명 TNFRSF12A, FN14, CD266; 스위스 프롯 Acc. Q9NP84, NP_057723)는 염증, 증식, 침습, 이동, 분화, 아폽토시스 및 혈관신생에 수반되는 TNF 슈퍼패밀리 리간드-수용체 쌍이다 (Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25; Michaelson JS and Burkly LC, Results Probl Cell Differ. 2009;49:145-60). TWEAK는 TWEAKR에 0.8 - 2.4 nM의 친화도로 결합하고, 이러한 수용체에 결합하는 TNF 패밀리의 유일한 구성원이다 (Wiley SR et al., Immunity. 2001 Nov;15(5):837-46). TWEAKR은 정상 조직에서는 비교적 낮은 수준으로 발현되지만, 손상된 조직에서 국부적으로 현저하게 증가되고, 여기서 이는 조직 재형성의 역할을 한다 (Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25; Zhou et al., Mol Cancer Ther. 2011 Jul;10(7):1276-88; Burkly LC et al., Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):99-114). TWEAKR 신호전달은 상처 치유, 만성 자가면역 질환 및 급성 허혈성 졸중과 같은 과정에 수반된다 (Burkly LC et al., Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):99-114). 또한, TWEAKR은 예를 들어 췌장암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 결장직장암 (CRC), 유방암, 신암, 두경부암, 식도암, 방광암, 간세포성 암종, 난소암, 흑색종 뿐만 아니라 간 및 골 전이와 같은 다양한 고형 종양 유형에서 고도로 발현된다 (Culp P et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508; Zhou H et al., J Invest Dermatol. 2013 Apr;133(4):1052-62). 증가된 TWEAKR 발현과 보다 높은 종양 등급 및/또는 불량한 예후의 연관성이 뇌암 (Tran NL et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66(19):9535-42), 유방암 (Willis AL et al., Mol Cancer Res. 2008 May;6(5):725-34; Wang J et al., Histol Histopathol. 2013 Jan 9 [Epub ahead of print]), 식도암 (Watts GS et al., Int J Cancer. 2007 Nov 15;121(10):2132-9 2007), 전립선암 (Huang M et al., Carcinogenesis. 2011 Nov;32(11):1589-96), 위암 (Kwon OH et al., Cancer Lett. 2012 Jan 1;314(1):73-81), 신경모세포종 (Pettersen I et al., Int J Oncol. 2013 Apr;42(4):1239-48) 및 방광암 (Shimada K et al., Clin Cancer Res. 2012 Oct 1;18(19):5247-55)에서 기재되어 있다.
TWEAKR의 발현은 FGF, PDGF 및 VEGF와 같은 성장 인자에 의해 유도된다 (Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008 May;7(5):411-25). 이러한 관찰과 일치하여, TWEAKR 발현이 NSCLC에서의 EGFR 과다발현 또는 활성화 (Whitsett TG et al., Am J Pathol. 2012 Jul;181(1):111-20) 및 유방암에서의 HER2 발현 (Wang J et al., Histol Histopathol. 2013 Jan 9 [Epub ahead of print]; Chao DT et al., J Cancer Res Clin Oncol. 2013 Feb;139(2):315-25)과 상호관련되는 것으로 제시되어 있다.
TWEAK에 의한 TWEAKR의 활성화는 TNF-수용체 회합 인자 (TRAF)의 세포내 결합 도메인으로의 동원으로 이어지고, 이는 정규 및 비-정규 NF-κB 경로를 통한 연장된 NF-κB 활성화 및 IL-8 및 MCP-1과 같은 시토카인 분비의 유도를 야기한다 (문헌 [Michaelson JS and Burkly LC, Results Probl Cell Differ. 2009;49:145-60]에서 검토됨). 이는 기재되어 있는 TWEAK/TWEAKR 경로의 염증유발 역할과 잘 부합된다. 그러나, TWEAKR은 특징적인 "사멸 도메인"이 결여되어 있기 때문에 TWEAKR을 통해 세포 사멸을 담당하는 신호전달 경로는 덜 분명하다. 일부 종양 세포주 (Kym-1, SKOV-3, OVCAR)에서, 이는 TNF를 통한 아폽토시스 및 TRAF2의 동원에 이어, 생성된 TRAF2-cIAP 복합체의 리소솜 분해를 유도한다 (Nakayama M. et al., J Immunol. 2002 Jan 15;168(2):734-43; Schneider P et al., Eur J Immunol. 1999 Jun;29(6):1785-92; Vince JE et al., J Cell Biol. 2008 Jul 14;182(1):171-84). 다른 세포주 (HSC3, HT-29, KATO-III)에서, TWEAK 유도된 아폽토시스는 TNF 비의존적인 것으로 보고되어 있다 (Nakayama M et al., J Immunol. 2003 Jan 1;170(1):341-8; Wilson CA et al., Cell Death Differ. 2002 Dec;9(12):1321-33). 최근 보고에서, JAK-억제제에 의한 처리가 WiDr 세포에서 TWEAK가 카스파제3/7 활성화를 증가시키는 능력을 무효화시켰기 때문에, TWEAK에 의한 아폽토시스의 유도는 Stat-1 인산화의 자극에 의존적인 것으로 제시되었다 (Chapman MS et al., Cytokine. 2013 Jan;61(1):210-7).
여러 연구는 TWEAKR을 종양성 표적으로서 확인시켜 주었다. 마이클슨 등은 TWEAK의 투여가 뮤린 이종이식편 모델에서 종양 성장을 감소시키는 것으로 제시하였다 (Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75). 이러한 항종양 효과는 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의해 여러 군에 의해 모방되었다. 잠재적인 약물 후보, 즉 BIIB0036/P4A8 (Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75) 및 PDL-192 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508)는 마우스의 면역화에 이어 클론 선택 및 인간화에 의해 생성되었다.
PDL-192는 TWEAKR에 5.5 nM의 결합 친화도로 결합하고 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508), 여러 TWEAKR 발현 암 세포주의 성장을 억제한다. 그러나, TWEAK 리간드와 비교하여 PDL-192는 증식 및 아폽토시스 검정에서 EC/IC50과 관련하여 덜 강력하고, 단지 감소된 카스파제 3/7 활성화의 효능 (Vmax)에 도달하는 것으로 제시되었다 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508). 보다 큰 패널의 유방암 세포주에서의 프로파일링은 단량체성 PDL-192의 단지 약간의 항증식 활성을 확인시켜 주었고 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508; Chao DT et al., J Cancer Res Clin Oncol. 2013 Feb;139(2):315-25), 27개의 세포주 중 5개만이 >20%의 증식 억제 반응을 보였다. 항체의 항증식 활성은 항체의 가교 또는 고정화에 의해 약간 증진되었다. 또한, PDL-192는 ADCC를 나타내고, 이종이식편 모델에서 기재된 항종양 활성은 ADCC 및 종양 세포 성장 억제 효과의 혼합인 것으로 생각된다 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508). PDL-192의 추가의 한계는 특히 마우스 및 래트에서의 종 교차-반응성의 결여로, 이는 예를 들어 독성학적 연구와 같은 공통 전-임상 연구의 평가를 허용하지 않는다.
약물 후보로서 기재되어 있는 제2 효능작용적 항-TWEAKR 항체, BIIB036/P4A8은 TWEAKR에 1.7 nM의 친화도로 결합하고, 이는 내인성 리간드 TWEAK와 유사한 범위 내이다 (Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75). 이러한 항체는, 재조합 가용성 TWEAK와 유사한 활성을 갖는 Fc-TWEAK, hIgG1 Fc-가용성 TWEAK (aa 106-249)의 융합과 비교하여 유의하게 덜 효과적이기는 하지만, 암 세포에서 NF-κB의 활성화 및 시토카인 방출을 유도하는 것으로 제시되어 있다 (Michaelson JS et al., Oncogene. 2005 Apr 14;24(16):2613-24). 그러한 사실은 세포 증식 검정에서 뿐만 아니라 항체를 사용한 세포의 처리 후의 TUNEL 염색에서 제시된 바와 같은 아폽토시스의 유도의 경우에도 마찬가지였고, 여기서 BIIB036/P4A8의 효력은 또한 Fc-TWEAK와 비교하여 유의하게 감소되었다. 항증식 활성은 항체의 다량체화 후에 증가되지만, 또한 다량체화 형태도 재조합 Fc-TWEAK와 비교하여 여전히 덜 효과적이다. 대조적으로, BIIB036/P4A8은 ADCC의 강력한 유도인자이고, 이종이식편 모델에서 항종양 활성은 Fc 이펙터 기능에 매우 의존적인 것으로 제시되었다.
둘 다의 약물 후보 외에도, 여러 뮤린 항체는 인간 요법을 위해 유용해지도록 인간화를 위한 항체 조작이 필요할 것으로 기재되어 있다. 암 세포에 대해 항증식 활성을 갖는 제1 항-TWEAKR 항체는 나카야마 등에 의해 기재된 항체 Item 1-4이다 (Nakayama M et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003 Jul 11;306(4):819-25). 이들 항체는 그러나 단지 비교적 약한 효능작용적 활성을 보유하고, TWEAK 매개 TWEAKR 활성화와 관련하여 부분적 효능제/길항제로서 작용하는 것으로 제시되어 있다. 항체 136.1 및 18.3.3 (WO2009/020933)은 TWEAK 리간드와 비교하여 더 높은 친화도 결합을 나타내며, 이는 더 효과적인 카스파제 활성화로 해석되지 않는다. 항체 P3G5 및 P2D3 (WO2009/140177)은 암 세포에서 Fc-TWEAK와 비교하여 유의하게 덜 효과적으로 시토카인 방출을 유도한다. 요약하면, 관련 기술분야에 기재되어 있는 항-TWEAKR 항체의 아폽토시스의 유도 및 증식의 억제와 관련하여 TWEAKR 효능작용적 활성은 한계가 있고, 내인성 리간드 TWEAK의 효능에 이르거나 이를 초과하지 못한다. 이러한 효능작용적 활성의 결여는 이들 항체가 내인성 리간드 TWEAK와 비교하여 유사한 범위 내의 친화도로 TWEAKR에 결합하기 때문에 감소된 친화도로 인한 것은 아니고 (Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75; Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508), 또한 보다 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 반드시 보다 강력한 신호전달 활성을 나타내지는 않는다 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508). 이전에 기재된 항체의 항종양 활성은 Fc 이펙터 기능에 의존적인 것으로 제시되어 있고, ADCC는 마우스 모델에서 생체내 효능에 유의한 역할을 하는 것으로 제시되어 있다. 그러나 항체의 챌린지 및 고형 종양 내로의 면역 이펙터 세포 침투를 고려하면, 임상에서 고형 종양에서의 항종양 활성에 대한 ADCC의 기여 및 Fc-Fc 수용체 (FcR) 상호작용을 통한 생체내 가교는 여전히 덜 분명하다 (Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508). 추가로, FcγRIIIA의 낮은-친화도 대립유전자를 보유하는 환자는 보다 낮은 Fc-FcR 상호작용 능력으로 인해 치료로부터 감소된 이익을 나타낼 것이다 (Varchetta S et al., Cancer Res. 2007 Dec 15;67(24):11991-9).
따라서, 내인성 리간드 TWEAK와 비교하여 동일하거나 훨씬 더 높은 정도로 TWEAKR의 과다-활성화에 의해 암 세포 아폽토시스 및 성장 억제를 유도하는 강력한 내재적 능력을 갖는 개발가능한 인간 항체가 매우 요구된다. 아폽토시스의 유도 및 증식의 억제는 수년전부터 환자에서 항종양 반응을 유도하는데 있어서 유효한 개념이기 때문에 (Hanahan D and Weinberg RA, Cell. 2000 Jan 7;100(1):57-70; Kim R et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2002 Nov;50(5):343-52; Fesik SW, Nat Rev Cancer. 2005 Nov;5(11):876-855) 이들 항체는 인간에서 고형 종양에서 증가된 항종양 활성을 나타낼 것으로 예상되고, 따라서 이는 암의 치료를 위한 유망한 약물 후보이다.
본 발명은 TWEAKR의 강력한 활성화를 야기하여 TWEAKR의 과다발현을 나타내는 다양한 암 세포에서 아폽토시스의 강력한 유도를 야기하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체에 관한 것이다. 본원에 기재된 항체에 의한 암 세포 아폽토시스의 유도는 관련 기술분야에 기재되어 있는 모든 항체 (예를 들어 PDL-192 또는 BIIB0036/P4A8; 예를 들어 가교제의 첨가를 필요로 함)와 비교하여 보다 효과적이다. 본 발명의 항체의 고유한 특성은 TWEAKR (서열 169; 및 도 1 참조)의 위치 47의 아미노산 (D47)에 대한 항체의 선택적 결합을 특징으로 하는 신규 결합 에피토프를 기반으로 한다.
본 발명의 항체는 따라서 암 뿐만 아니라 그의 전이, 특히 TWEAKR 발현 종양, 예컨대 결장직장암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 두경부암, 식도암, 흑색종, 간세포성 암종, 방광암, 위암, 유방암, 췌장암, 신세포 암종, 전립선암, 난소암 및 자궁경부암의 치료에 적합하다.
본 발명은 대부분의 세포주에서 내인성 리간드 TWEAK와 비교하여 우월한 수준으로 암 세포 아폽토시스의 강력한 활성화를 유도한다는 점에서 기존 항-TWEAKR 항체과 구별되는 항체를 기재한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 a) TWEAKR을 강력하게 활성화하고, b) 암 세포에서 아폽토시스를 유도하고, c) 암 세포로부터 시토카인 분비를 유도하여, d) 이는 모두 함께 생체내 종양 실험에서 항체의 항종양 활성을 생성하고, e) 추가로 항체는 항체 단독이 어떠한 효과도 갖지 않는 실험 조건에서 사포린-접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션된 경우에 TWEAKR의 내재화 및 암 세포 증식의 억제를 야기하고, f) 여러 종과 교차반응성이다. 본 발명의 이들 및 다른 목적은 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에 항체는 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 효능을 잠재적으로 추가로 증가시키기 위해 항체는 세포독성제, 면역독소, 독성단 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명은 추가로, TWEAKR 발현이 정상 조직과 비교하여 상승된 악성 또는 이형성 상태의 진단을 위한 도구를 구성하는 항체를 제공한다. 검출가능한 마커에 접합된 항-TWEAKR 항체가 제공된다. 바람직한 마커는 방사성표지, 효소, 발색단 또는 형광물질이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 세포, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생산하는 방법, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 이형성 세포의 성장을 억제하는 방법, 및 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 암을 치료하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 TWEAKR의 에피토프에 특이적인 상기 언급된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 각각 코딩할 수 있는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 재조합 생산에 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 TWEAKR 발현 세포의 바람직하지 않은 존재와 연관된 장애 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 장애는 암이다. 이러한 방법은 본원에 기재되거나 고려된 바와 같은 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 함유한다.
본 발명은 또한 항체 라이브러리를 사용하여 TWEAKR에 특이적으로 결합하는 이러한 라이브러리의 1종 이상의 구성원을 단리하는 것에 대한 지침을 제공한다.
도 1: 다양한 종의 TWEAKR 시스테인 풍부 도메인 (aa 34-68)의 정렬. (숫자는 신호 서열을 포함하는 전장 구축물; 서열 169 내 아미노산 위치를 나타냄)
도 2: A - TWEAKR (서열 169)의 구조의 개략적 다이어그램. 다이어그램은 시스테인 풍부 도메인 (36-67)을 포함하는 세포외 도메인 (aa 28-80) (서열 168), 막횡단 도메인 - TM (81-101), 및 세포내 도메인 (102-129)을 제시한다. TPP-2202 - hIgG1의 Fc 도메인에 융합된 전체 엑토도메인 (28-80). TPP-2203 - hIgG1의 Fc 도메인에 융합된 N- 및 C-말단 절단을 갖는 세포외 도메인 (34-68). 디술피드 가교 Cys36-Cys49, Cys52-Cys67 및 Cys55-Cys64는 흑색 막대로 표시한다. N-말단에서, TPP-2203은 순수한 시스테인 풍부 도메인과 비교하여 2개의 아미노산을 함유하고 C-말단에서 1개의 아미노산을 더 함유하며, 이는 적절한 폴딩을 보장한다. TPP-1984 - HIS6 태그에 융합된 C-말단 절단을 갖는 세포외 도메인 (28-68). 모든 3종의 구축물은 본 발명의 항체 및 PDL-192(TPP-1104)에 대해 비슷한 결합을 나타낸다. P4A8(TPP-1324)은 전체 세포외 도메인 (TPP-2202)에만 결합한다.
B - 세포외 도메인의 아미노산 서열: aa46은 TWEAK 리간드 결합에 필수적인 것으로 공개되어 있고, aa47은 본 발명의 항체의 결합에 필수적인 것으로 특성화되었다.
도 3: TWEAKR 엑토도메인과 본 발명의 항체 및 참조 항체의 상호작용. TWEAKR-Fc 융합 단백질 (TPP-2202) 코팅 (1μg/ml) 및 가용성 결합 파트너로서 비오티닐화 IgG 0.08 μg/ml (개방 막대) 및 0.3 μg/ml (채워진 막대)와의 ELISA의 결과를 제시한다. 검출은 스트렙타비딘-HRP 및 암플렉스-레드(Amplex-Red) 기질을 사용하여 행하였다. Y는 "ELISA 신호 강도 [Rfu]"이고; X는 "시험된 항체 구축물"이고: a는 "TPP-2090"이고; b는 "TPP-2084"이고; c는 "PDL-192(TPP-1104)"이고; d는 "P4A8(TPP-1324)"이고; e는 "P3G5(TPP-2195)"이고; f는 "136.1(TPP-2194)"이고; h는 "ITEM1"이고; i는 "ITEM4"이고; j는 뮤린 이소형 대조군이고; k는 인간 이소형 대조군이다. 모든 시험된 항체는 80 ng/ml의 농도에 의해 포화된 결합을 나타낸다.
도 4: TWEAKR 시스테인 풍부 도메인과 본 발명의 항체 및 참조 항체의 상호작용. TWEAKR(34-68)-Fc 융합 단백질 (TPP-2203) 코팅 (1μg/ml) 및 가용성 결합 파트너로서 비오티닐화 IgG 0.08 μg/ml (개방 막대) 및 0.3 μg/ml (채워진 막대)와의 ELISA의 결과를 제시한다. 검출은 스트렙타비딘-HRP 및 암플렉스-레드 기질을 사용하여 행하였다. Y는 "ELISA 신호 강도 [Rfu]"이고; X는 "시험된 항체 구축물"이고: a는 "TPP-2090"이고; b는 "TPP-2084"이고; c는 "PDL-192(TPP-1104)"이고; d는 "P4A8(TPP-1324)"이고; e는 "P3G5(TPP-2195)"이고; f는 "136.1(TPP-2194)"이고; h는 "ITEM1"이고; i는 "ITEM4"이고; j는 뮤린 이소형 대조군이고; k는 인간 이소형 대조군이다. 본 발명의 항체는 시스테인 풍부 도메인에 결합한다.
도 5: TWEAKR(28-68)과 본 발명의 항체 및 참조 항체의 상호 작용. TWEAKR(28-68)-HIS (TPP-1984) 코팅 (1μg/ml) 및 가용성 결합 파트너로서 비오티닐화 IgG 0.08 μg/ml (개방 막대) 및 0.3 μg/ml (채워진 막대)와의 ELISA의 결과를 제시한다. 검출은 스트렙타비딘-HRP 및 암플렉스-레드 기질을 사용하여 행하였다. Y는 "ELISA 신호 강도 [Rfu]"이고; X는 "시험된 항체 구축물"이고: a는 "TPP-2090"이고; b는 "TPP-2084"이고; c는 "PDL-192(TPP-1104)"이고; d는 "P4A8(TPP-1324)"이고; e는 "P3G5(TPP-2195)"이고; f는 "136.1(TPP-2194)"이고; h는 "ITEM1"이고; i는 "ITEM4"이고; j는 뮤린 이소형 대조군이고; k는 인간 이소형 대조군이다. 본 발명의 항체는 시스테인 풍부 도메인에 결합한다. 항체 P4A8(TPP-1324), P3G5(TPP-2195), ITEM-1 및 ITEM-4는 손상된 결합을 나타낸다.
도 6: a - 시스테인 풍부 도메인의 알라닌 스캔. TWEAKR(34-68)-Fc의 뮤테인에 대해 PDL-192(TPP-1104) (X) 및 TPP-2090 (Y) 결합을 분석하였다. S37A, R38A, S40A, W42A, S43A, D45A, D47A, K48A, D51A, S54A, R56A, R58A, P59A, H60A, S61A, D62A, F63A 및 L65A 뮤테인을 HEK293 세포에서 발현시켰다 (흑색 다이아몬드). PDL-192(TPP-1104) 및 TPP-2090을 코팅하고 (1 μg/ml), TWEAKR 뮤테인 결합을 위해 HEK293 발효 브로쓰의 8-배 희석된 상청액을 첨가하였다. X는 "PDL-192(TPP-1104) 상호작용의 ELISA 강도 [Rfu]"이고, Y는 "TPP-2090 상호작용의 ELISA 강도 [Rfu]"이다. TPP-2090 (Y)은 D47A TWEAKR 뮤테인에 대해 손상된 결합을 나타내고 (폐쇄된 박스), PDL-192(TPP-1104) (X)는 R56A에 대해 손상된 결합을 나타낸다 (점선 박스).
b - Y는 "wt 결합 신호 [%]에 의해 정규화된 % 결합"이고, 1은 "TPP-2090"이고; 2는 "PDL-192(TPP-1104)"이고; 3은 "P4A8(TPP-1324)"이다. 항체를 코팅하고 (1 μg/ml), TWEAKR 변이체를 250 ng/ml로 첨가하고, 항-HIS HRP를 통해 검출하였다. TTP-2090은 WT 구축물과 비교하여 5% 미만의 결합을 나타낸다.
c - Y는 "wt 결합 신호 [%]에 의해 정규화된 % 결합"이고, 1은 "TPP-2090"이고; 2는 "TPP-2149"이고, 3은 "TPP-2093"이고; 4는 "TPP-2148"이고; 5는 "TPP-2084"이고; 6은 "TPP-2077"이고; 7은 "TPP-1538"이고; 8은 "TPP-883"이고; 9는 "TPP-1854"이고; 10은 "TPP-1853"이고; 11은 "TPP-1857"이고; 12는 "TPP-1858"이고; 13은 "PDL-192(TPP-1104)"이다. 항체를 코팅하고 (1 μg/ml), TWEAKR 변이체를 250 ng/ml로 첨가하고, 항-HIS HRP를 통해 검출하였다. 모든 변이체는 PDL-192를 제외하고 WT 구축물과 비교하여 5% 미만의 결합을 나타낸다.
도 7: 문헌 [Pellegrini et al. (FEBS 280:1818-1829)]에 공개된 바와 같은 TWEAKR 엑토도메인의 NMR 구조. TWEAK 결합은 L46에 (Pellegrini et al.), TPP-2090 결합은 D47에, 그리고 PDL-192 결합은 R56에 의존한다. PDL-192는 TWEAK 리간드 결합 부위의 반대편에 결합하고, TPP-2090은 TWEAK 리간드 부위에 바로 결합한다.
도 8: 본 발명의 항체 및 참조 항체의 결합 에피토프를 구별하기 위해 경쟁 실험을 수행하였다. 제2 항체의 주사 후의 제2 결합 사건의 결여는 각각의 항체 쌍 내에서의 분명한 경쟁을 나타낸다. 비 경쟁 항체 쌍은 제2 항체 주사 후에 배경을 넘는 분명한 결합 신호를 나타내었다. 또한, 내부 시스템 대조군으로서 자기-경쟁 조사 (동일한 제1 & 제2 항체)를 모니터링하였다. (-) 어떠한 제2 결합도 검출되지 않음; (+) 제2 결합. 본 발명의 항체는 모든 시험된 항체와 경쟁한다.
도 9: 본 발명의 항체 및 참조 항체의 결합 에피토프를 구별하기 위해 경쟁 실험을 수행하였다. 일반적으로, 모든 분석된 항-TWEAKR 항체는 3개의 구별되는 "경쟁 군"으로 군집화될 수 있다. 1개의 군은 TPP-2084 및 TPP-2090을 독점적으로 함유하고, 이는 둘 다 모든 다른 시험된 구성원과 경쟁을 나타낸다. 이들 다른 구성원은 2개의 개별 세트의 항체로 분할될 수 있고, 이는 서로간에 어떠한 경쟁도 나타내지 않는다. 본 발명의 항체 둘 다는 신규하고 고유한 에피토프에 결합한다.
도 10: 모든 29종의 공지된 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원의 상동성 트리. 가장 가까운 상동체 TNFRSF13C 및 TNFRSF17은 단지 약 30% 서열 동일성을 갖는다.
도 11: TPP-2090의 선택성 평가를 위한 모든 29종의 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원과의 결합 ELISA. ELISA의 결과를 제시한다: Y는 "ELISA 신호 강도 [Rfu]"이고; X는 "시험된 TNF 수용체 슈퍼패밀리 단백질 (Fc-융합 단백질)"이고: 1은 "TWEAKR"이고; 2는 "TWEAKR"이고; 3은 "Apo-3"이고; 4는 "Trail-R1"이고; 5는 "Trail-R2"이고; 6은 "CD385"이고; 7은 "CD95"이고; 8은 "Rank"이고; 9는 "TNF-R1"이고; 10은 "TNF-R2"이고; 11은 "BAFF-R"이고; 12는 "DcR3"이고; 13은 "BCMA"이고; 14는 "TACI"이고; 15는 "OX40"이고; 16은 "CD30"이고; 17은 "CD27"이고; 18은 "CD40"이고; 19는 "오스테오프로테게린"이고; 20은 "EDAR"이고; 21은 "GITR"이고; 22는 "HVEM"이고; 23은 "NGF R"이고; 24는 "Trail R3"이고; 25는 "림프독소 β R"이고; 26은 "Trail R4"이고; 27은 "EDA2R"이고; 28은 "TROY"이고; 29는 "RELT"이고; 30은 "4-1BB"이다. (1) 300 pM으로 TPP-2090을 사용하고, (2) 75 nM으로 사용하였다. TPP-2090은 매우 낮은 농도 300 pM (1) 및 높은 농도 75 nM (2)에서 TWEAKR에 포화 결합한다. 모든 다른 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 (3 - 30)에 대한 결합 분석을 위해 75 nM TPP-2090을 사용하였다. TPP-2090은 TWEAKR에 선택적으로 결합한다.
도 12: HT-29 세포에의 항-TWEAKR 항체의 결합에 대한 FACS 분석. Y는 "FACS 신호의 배경 교정된 기하-평균 [au]"이다. 2차 항체 단독과 인큐베이션된 HT-29 세포의 형광의 기하-평균에 의해 차감된, 10μg/ml에서 표시된 바와 같은 항체와 인큐베이션된 HT-29 세포의 FACS 분석 후의 형광을 제시한다. 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-2084, TPP-2090)는 이 농도에서 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104) 및 P4A8(TPP-1324)]와 비교하여 더 낮은 세포 결합을 나타낸다.
도 13: HT-29 세포에서 항-TWEAKR 항체에 의한 카스파제 3/7 활성화. X는 "시험된 항-TWEAKR 항체 [μg/ml]"이고; Y는 "상대 광 단위 [RLU]"이다. HT-29 세포를 항-TWEAKR 항체와 표시된 바와 같은 다양한 농도 (0.03-300μg/ml)에서 24시간 동안 IFN감마의 존재 하에 인큐베이션하였다. 카스파제 3/7 글로(Glo) 시약 (프로메가(Promega))에 의한 발광으로서 측정된 카스파제 3/7 활성을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 3중으로 수행된 1-3개의 대표적인 실험의 평균 값을 표준 편차를 포함시켜 제시한다. 채워진 기호는 본 발명의 항체를 나타내고, 개방된 기호는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104); P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194)]를 나타낸다. 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-1854, TPP-2084, TPP-2090)는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104); P4A8(TPP-1324) 및 136.1(TPP-2194)]와 비교하여 카스파제 3/7 활성화를 유도하는데 보다 강력한 효능을 나타낸다.
도 14: WiDr (A) 및 786-O (B) 세포에서 항-TWEAKR 항체의 항증식 활성. X는 "시험된 항-TWEAKR 항체 [μg/ml]"이고; Y는 "비처리 대조군 세포의 증식 관련 세포 증식 [%]"이다. 세포를 항-TWEAKR 항체와 표시된 바와 같은 다양한 농도 (0.03-300μg/ml)에서 96시간 동안 인큐베이션하였다 (WiDr 세포는 IFN 감마의 부재, 786-O 세포는 IFN 감마의 존재 하). 3중으로 수행된 대표적인 실험의 평균 값을 나타내고, 표준 편차는 오차 막대로 표시한다. 채워진 기호: 본 발명의 항체, 개방된 기호는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104) 및 P4A8(TPP-1324]. 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-1854, TPP-2084, TPP-2090)는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104) 및 P4A8(TPP-1324]와 비교하여 세포 증식을 억제하는데 보다 강력한 효능을 나타낸다.
도 15: A375 세포에서 항-TWEAKR 항체에 의해 유도된 IL-8 분비. X는 "시험된 항-TWEAKR 항체 [μg/ml]"이고; Y는 "IL-8 수준 [pg/ml]"이다. A375 세포를 항-TWEAKR 항체와 함께 표시된 바와 같은 다양한 농도 (0.03-300μg/ml)에서 인큐베이션하였다. IL-8의 수준은 24시간 처리 후에 세포의 상청액 내에서 결정하고, 사용된 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 3중으로 수행된 1-3개의 대표적인 실험의 평균 값을 표준 편차를 포함시켜 제시한다. 채워진 기호는 본 발명의 항체를 나타내고, 개방된 기호는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104); P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194)]를 나타내고, 이소형 대조군 항체에 의한 처리는 (C)로 표시한다. 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-1854, TPP-2084, TPP-2090)는 공지된 항체 [PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194)]와 비교하여 A375 세포로부터 IL-8 분비를 유도하는데 보다 강력한 효능을 나타낸다.
도 16: 마우스 내의 이종이식편에서 항-TWEAKR 항체에 의해 유도된 인간 IL-8 분비.
A: WiDr 이종이식 종양 보유 마우스를 단일 용량의 3 mg/kg TPP-2090 (개방 기호) 또는 비히클 (C - 채워진 기호)로 처리하고, 인간 IL-8의 수준 (IL-8 pg/ml)을 처리 후의 다양한 시점에 종양 보유 마우스의 혈장 내에서 결정하였다. X는 "처리 후 시간 [h]"이고; Y는 "Il-8 수준 [pg/ml]"이다. 군당 3마리의 동물로부터의 결과를 표시하고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 인간 IL-8 분비는 WiDr 종양 보유 마우스에서 TPP-2090에 의한 처리 후에 시간 의존적 방식으로 특이적으로 유도되었다.
B: A375 종양 보유 (채워진 기호) 또는 비-종양 보유 (개방 기호) 마우스를 단일 용량의 10 mg/kg TPP-1538, 비히클 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. C1은 "비히클 대조군"이고; C2는 "이소형 대조군 항체"이고; Y는 "인간 Il-8의 수준 [pg/ml]"이다. 인간 IL-8의 수준은 처리 7시간 후에 군당 4마리의 마우스의 혈청에서 결정하여 제시하였다. IL-8 분비는 A375 종양 보유 마우스에서 TPP-1538에 의해 특이적으로 유도되었지만, 동등하게 처리된 종양 무함유 동물에서는 그렇지 않았다.
도 17: 내인성 TWEAKR 발현 세포에의 항체 결합 시 TWEAKR의 특이적 내재화의 시간 경과적 현미경 평가 (인셀 애널라이저(InCell Analyzer)). 신암 세포주 786-O에 대해 TPP-1538 및 TPP-2090의 내재화를 조사하였다. 본 발명의 항체 (1μg/ml에서) 또는 이소형 대조군 (C-, 5μg/ml에서)에 의한 처리 후의 과립 카운트/세포를 표시된 바와 같은 다양한 인큐베이션 시간 동안 플롯팅하였다 (X는 "시간 [min]"이고; Y는 "과립 카운트/세포 [양]"임). 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-2090)는 TWEAKR 발현 세포에서 신속하고 특이적인 내재화를 나타낸다.
도 18: 사포린-접합된 2차 항체와의 인큐베이션 후의 항-TWEAKR 항체에 의한 786-O 세포 증식의 억제 (Hum-Zap 검정). 786-O 세포를 TWEAKR 또는 이소형 대조군 항체와 함께 사포린-접합된 2차 항체의 존재 또는 부재 하에 10nM 항체 농도로 48시간 동안 (IFN 감마의 부재 하에) 인큐베이션하였다. X는 "시험된 항체 변이체"이고, a는 "비히클 대조군"이고, b는 "이소형 대조군 항체"이고, c는 "TPP-2084"이고, d는 "TPP-2090"이고; Y는 "비처리 대조군 세포와 비교하여 세포 증식 [%]"이다. 비처리 대조군 세포와 비교하여 세포 증식을 사포린-접합된 2차 항체의 존재 (개방 막대) 또는 부재 (채워진 막대) 하에 상이한 항체로 처리된 786-O 세포에 대해 플롯팅하였다. 3중 실험 중 하나의 대표적인 실험으로부터의 결과를 제시하며, 표준 편차는 오차 막대로 표시한다. 사용된 실험 조건에서 사포린-커플링된 2차 항체의 존재 하에 본 발명의 항체 (TPP-2084, TPP-2090)만이 786-O 세포의 증식을 거의 완전히 억제하였다. 따라서, 사포린-접합된 2차 항체의 존재 하에 항-TWEAKR 항체로부터 관찰된 항증식 효과는 TWEAKR 발현 세포에의 항체-복합체의 결합 후에 사포린의 특이적 내재화의 결과이다.
도 19: 종양 세포 접종 후 제7일에 시작된 0.3, 1.0 및 3.0 mg/kg (i.v., q4dx3)에 의한 처리 후의 인간 신세포암 이종이식편 786-O에서의 항-TWEAKR 항체의 효능. 제40일의 최종 종양 중량을 제시한다. A는 "PBS (i.v. q4dx3)로 처리된 비히클 군"이다. B는 "이소형, 3 mg/kg"이고, C는 "TPP-2084, 0.3 mg/kg"이고, D는 "TPP-2084, 1 mg/kg"이고, E는 "TPP-2084, 3 mg/kg"이고, F는 "TPP-2090, 0.3 mg/kg"이고, G는 "TPP-2090, 1 mg/kg"이고, H는 "TPP-2090, 3 mg/kg"이다. (Y는 "n=8의 종양 중량 평균; SD [g]"임).
도 20: 인간 결장암 이종이식편 WiDr에서 단독요법 및 이리노테칸 (5mg/kg, i.v., 4d 온, 3d 오프) 및 레고라페닙 (10mg/kg, p.o., 매일)과의 조합 요법으로의 3mg/kg TPP-2090 (i.v., q4dx7)의 효능. 처리는 접종 7일 후에 종양이 약 40mm2로 확립되면 시작하였다. A는 "PBS (i.v. q4dx7)로 처리된 비히클 군"이다. B는 "TPP-2090, 3 mg/kg"이고, C는 "TPP-2090, 10 mg/kg"이고, D는 "이리노테칸, 5 mg/kg"이고, E는 "조합 요법 TPP-2090 3 mg/kg + 이리노테칸, 5 mg/kg"이고, F는 "레고라페닙, 10 mg/kg"이고, G는 "조합 요법 TPP-2090, 3mg/kg + 레고라페닙 10 mg/kg"이다. (X는 "접종 후 시간 [일]"이고, Y는 "종양 면적, n=10의 평균; SD [mm2]임)
도 21: 인간 폐암 이종이식편 NCI-H322에서 단독요법 및 파클리탁셀 (16mg/kg, i.v., q7dx4)과의 조합 요법으로의 10mg/kg TPP-2090 (i.v., q4dx8)의 효능. 처리는 접종 14일 후에 종양이 약 45mm2로 확립되면 시작하였다. A는 "PBS (i.v. q4dx8)로 처리된 비히클 군"이다. B는 "TPP-2090, 5mg/kg"이고, C는 "TPP-2090, 10mg/kg"이고, D는 "파클리탁셀, 16 mg/kg"이고, E는 "조합 요법 TPP-2090 10 mg/kg + 파클리탁셀 16 mg/kg"이다. (X는 "접종 후 시간 [일]"이고; Y는 "종양 면적, n=10의 평균; SD [mm2]"임)
도 22: 본 발명의 항체에 의한 처리 후의 이종이식편 내 증식성 세포의 감소. PBS (i.v., q4dx7: A) 또는 TPP-2090 (10 mg/kg , i.v. q4dx7:B)에 의한 처리 후의 WiDr 이종이식 종양으로부터의 냉동 절편을 면역조직화학에 의해 증식 마커 Ki67에 대해 염색하였다. 처리는 종양 세포 접종 후 제7일에 시작하였고, 연구 말미 (제29일)에 채취한 종양으로부터 냉동 절편을 제조하였다. 군당 N=3 종양을 분석하고, 대표적인 영상을 제시한다. TPP-2090에 의한 처리는 마우스 내 WiDr 이종이식 종양에서 Ki67 양성 세포 (영상에서 흑색 염색된 세포)의 강력한 감소를 야기한다.
도 23: 생체내 항-TWEAKR 항체에 의한 Stat-1 및 NF-카파B2 신호전달 경로의 유도. PBS (i.v., q4dx7: 레인 1&2) 또는 TPP-2090 (3mg/kg, i.v., q4dx7: 레인 3&4)에 의한 처리 후의 순간 동결 WiDr 이종이식 종양의 용해물을 웨스턴 블롯 분석하여 P-Stat1 (a), Stat-1 (b), NF-카파2 - p52 (c) 및 GAPDH (d)에 대한 특이적 항체로 검출하였다. 마우스의 처리는 종양 세포 접종 후 제7일에 시작하였고, 연구 말미 (제29일)에 채취한 순간 동결 종양으로부터 용해물을 제조하였다. 군당 2마리의 대표적인 동물로부터의 블롯을 제시한다. TPP-2090에 의한 처리는 WiDr 이종이식 종양에서 P-Stat1 & 총 Stat1 수준 뿐만 아니라 NF-카파B2 활성화 (p52 밴드의 출현에 의해 제시됨)의 강력한 유도를 야기한다.
도 24: 항-TWEAKR 항체에 대한 컨센서스 서열. CDR-H1 - 위치 5에서의 X: M 또는 I; CDR-H2 - 위치 8에서의 X: S 또는 K; CDR-L1 - 위치 8에서의 X: G 또는 S; CDR-L2 - 위치 1에서의 X: N, A 또는 Q; CDR-L3 - 위치 5에서의 X: T 또는 S; 위치 6에서의 X: S 또는 T; 위치 8에서의 X: F 또는 G
도 25: 연속 CDR 서열 명명. (A) 박스 내 위치는 돌연변이 수집 동안 다양화된다 (성숙 과정). (B) 박스 내 단일 치환은 하나의 재조합 라이브러리에서 재조합되었다.
도 26: 본 발명의 서열
본 발명은 TWEAKR에 특이적 친화도를 가지며 대상체에게 치료 이익을 전달할 수 있는 신규 항체의 발견을 기반으로 한다. 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있는 본 발명의 항체는 많은 경우에 사용될 수 있고, 이는 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그러나, 하기 참고문헌은 본 발명과 관련된 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공할 수 있고, 이러한 정의가 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미와 일치하는 한 참조되고 사용될 수 있다. 이러한 참고문헌은 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); and Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); 및 Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 본원에 사용된 용어의 정의를 제공하는, 통상의 기술자가 입수가능한 임의의 추가의 기술적 자원이 참고될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 추가로 정의된다. 추가의 용어는 명세서의 다른 곳에 정의되어 있다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "유전자"에 대한 언급은 1개 이상의 유전자에 대한 언급이고, 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물을 포함하는 등이다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포괄한다.
"인간" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에서 키메라가 아니고 (예를 들어, "인간화"되지 않고), (전적으로 또는 부분적으로) 비-인간 종으로부터의 것이 아닌 것으로 정의된다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 전적으로 또는 부분적으로, 공지된 인간 항체 서열의 분석을 기반으로 한 합성 서열로부터 인 실리코 유래의 서열을 갖는 항체로서 본원에 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 설계는, 예를 들어 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고, 그로부터 얻은 데이터를 활용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리 (예를 들어, 이러한 라이브러리는 인간 천연 공급원으로부터 획득한 항체를 기반으로 함)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩된 것이다. 인간 항체의 예는 문헌 [Soederlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856]에 기재된 것과 같은 항체를 포함한다.
"인간화 항체" 또는 그의 인간화 항원-결합 단편은 (i) 비-인간 공급원 (예를 들어, 이종 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스)으로부터 유래되고, 항체가 인간 배선 서열을 기반으로 하는 것; (ii) 비-인간 항체의 프레임워크 영역의 아미노산이 유전자 조작에 의해 인간 아미노산 서열로 부분적으로 교환된 것, 또는 (iii) 가변 도메인의 CDR은 비-인간 기원으로부터의 것이지만, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간 기원의 것이고, 불변 도메인 (존재하는 경우)은 인간 기원의 것인 CDR-그라프트된 것으로 본원에 정의된다.
"키메라 항체" 또는 그의 항원-결합 단편은 가변 도메인이 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인이 인간 기원으로부터 유래된 것으로 본원에 정의된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특징을 나타낸다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 모노클로날 항체 제제는, 그의 특이성에 더하여, 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유리하다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 용어 모노클로날 항체는 구체적으로 키메라, 인간화 및 인간 항체를 포함한다. 본원에 사용된 "효능제/효능작용적 항체"는 관심 폴리펩티드 (여기서 TWEAKR 리간드 TWEAK)의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체가 관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적 (여기서, TWEAKR)"에 특이적으로 결합한다", "에 특이적이다" 또는 "을 특이적으로 인식한다"는 것은, 상기 항체가 치료제로서 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 유용하도록 충분한 친화도로 상기 항원에 결합하며, 다른 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않거나, 또는 상기 언급된 항원 표적의 오르토로그 및 변이체 (예를 들어, 돌연변이체 형태, 스플라이스 변이체 또는 단백질분해적으로 말단절단된 형태) 이외의 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는다는 것이다. 본원에 사용된 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프"를 특이적으로 인식한다" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적이다"는 것은, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 항원에 대해 약 10-4 M 미만, 대안적으로 약 10-5 M 미만, 대안적으로 약 10-6 M 미만, 대안적으로 약 10-7 M 미만, 대안적으로 약 10-8 M 미만, 대안적으로 약 10-9 M 미만, 대안적으로 약 10-10 M 미만, 대안적으로 약 10-11 M 미만, 대안적으로 약 10-12 M 미만, 또는 그 미만의 1가 KD를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 항체는, 이러한 항체가 항원과 하나 이상의 참조 항원(들)을 구별할 수 있는 경우에, 항원"에 특이적으로 결합하거나", "에 특이적이거나", 또는 "을 특이적으로 인식한다". 그의 가장 일반적인 형태로, "특이적 결합", "에 특이적으로 결합한다", "에 특이적이다", 또는 "를 특이적으로 인식한다"는, 예를 들어 하기 방법 중 하나에 따라 결정되는 바와 같은, 관심 항원과 비관련 항원을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 표준 발색에 의한 스코어링이 수행될 수 있다 (예를 들어, 2차 항체와 양고추냉이 퍼옥시다제, 및 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소). 특정 웰에서의 반응은, 예를 들어 450nm에서의 광학 밀도에 의해 스코어링된다. 전형적인 배경 (=음성 반응)은 0.1 OD일 수 있고; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성 차이가 5-배, 10-배, 50-배 초과, 바람직하게는 100-배 초과임을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원이 아니라, 약 3 내지 5종의 비관련 항원, 예컨대 우유 분말, BSA, 트랜스페린 등의 세트를 사용하여 수행된다.
"결합 친화도"는 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 사이의 비-공유 상호작용의 강도의 총 합을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 해리 상수 "KD"는 통상적으로 분자 (예컨대 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대 항원) 사이의 친화도, 즉 리간드가 특정한 단백질에 얼마나 단단하게 결합하는지를 기재하는데 사용된다. 리간드-단백질 친화도는 2개의 분자 사이의 비-공유 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"은 실시예 2에 따라 비아코어(Biacore) T100 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.(GE Healthcare Biacore, Inc.))를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용함으로써 측정된다. 다른 적합한 장치는 비아코어 T200, 비아코어(R)-2000, 비아코어 4000, 비아코어 (R)-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 프로테온(ProteOn) XPR36 기기 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.))이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 바람직하게는 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)가 전형적으로 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 이뮤노글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은, 예를 들어 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시-말단으로, 예를 들어 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 최대 4개의 FR로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)은 그의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 약 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26- 32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987))를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 정의된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "부류"로 할당될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 "하위부류" (이소형), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 상이한 항체 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마] 및 [뮤]라 불린다. 상이한 이뮤노글로불린 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배위가 널리 공지되어 있다. 본원에 사용된 항체는 통상적으로 공지된 항체 및 그의 기능적 단편이다.
항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 본원에서 항원-결합 영역을 보유하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 예를 들어 CDR1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역이, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 또한 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 아미노산 잔기 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 아미노산 잔기 4 내지 111을 포함하며, 완전한 VL 및 VH 쇄 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 아미노산 위치 1 내지 113; WO 97/08320에 따른 넘버링)가 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용하기 위한 이뮤노글로불린의 바람직한 부류는 IgG이다.
본 발명의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 단일 도메인 항체 (DAb), 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적, 예컨대 이중- 및 삼중-특이적 항체를 포함한다 (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). "다중-특이적" 또는 "다중-기능적" 항체 이외의 항체는 각각 동일한 결합 부위를 갖는 것으로 이해된다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 변이체는 TWEAKR에 대한 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되어 있는 분자이다.
본 발명에서 고려되는 결합 단백질은, 예를 들어 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 애드넥틴, 안티칼린, DARPin, 아비머, 나노바디이다 (문헌 [Gebauer M. et al., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. et al., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617]에 의해 검토됨).
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 화학적으로 활성인 표면 분자 군, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄, 또는 그의 조합으로 이루어지며, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.
"단리된" 항체는 이를 발현한 세포의 성분으로부터 확인 및 분리된 것이다. 세포의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법, UV-Vis 분광분석법에 의해 또는 (예를 들어, 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII, GX 90 또는 바이오라드 바이오애널라이저 장치 상에서의) SDS-모세관 겔 전기영동에 의해 결정 시, 95 중량%의 항체를 초과하는 정도로, 추가의 바람직한 실시양태에서는 99 중량%를 초과하는 정도로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 동질인 정도로 정제된다. 단리된 자연 발생 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 감마 수용체 (FcγR)에 결합된 분비형 Ig가, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 예를 들어 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는, 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 관심 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 그의 동족 항원에 결합되어 있는 (적절한 하위부류의) 항체에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합이, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 Bl 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다.
용어 면역접합체 ("항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 상호교환가능하게 지칭됨)는 1종 이상의 세포독성제 또는 세포증식억제제, 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 지칭한다. 면역접합체는 암의 치료에서 세포독성제, 즉 세포를 사멸시키거나 그의 성장 또는 증식을 억제하는 약물의 국부 전달에 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Liu et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618-8623)]). 비접합 약물의 전신 투여가 정상 세포 및/또는 조직에 대해 허용되지 않는 수준의 독성을 야기할 수 있는 경우에, 면역접합체는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화 전달, 및 그 내에서의 세포내 축적을 가능하게 한다. 항체-독소 접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 그의 세포독성 효과를 발휘할 수 있다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우에 갭을 도입시켜 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후에, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각의 백분율로 정의된다. 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 갭이 없는 정렬이 바람직하다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 '성숙 항체' 또는 '성숙 항원-결합 단편', 예컨대 성숙 Fab 변이체는 주어진 항원, 예컨대 TWEAKR의 세포외 도메인에 대해 보다 강력한 결합 - 즉 증가된 친화도에 의한 결합 - 을 나타내는 항체 또는 항체 단편의 유도체를 포함한다. 성숙은 이러한 친화도 증가를 생성하는 항체 또는 항체 단편의 6개의 CDR 내의 소수의 돌연변이를 확인하는 과정이다. 성숙 과정은 항체 내로의 돌연변이의 도입을 위한 분자 생물학 방법 및 개선된 결합제를 확인하기 위한 스크리닝의 조합이다.
아미노산은 본원에서 그의 통상적으로 공지되어 있는 3문자 기호에 의해, 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권고되는 1-문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 그의 통상적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"효능작용적" 항체 또는 "효능작용적 활성"을 갖는 항체는 그의 표적에 결합하고, 예를 들어 각각의 표적에 의해 매개되는 신호전달 경로 또는 생물학적 효과의 활성화를 야기하는 각각의 표적의 활성화를 유도하는 것이다.
본 발명의 항체
본 발명은 TWEAKR (서열 169 (단백질); 서열 170 (DNA))의 강력한 활성화를 야기하여, TWEAKR의 과다발현을 나타내는 다양한 암 세포에서 강력한 아폽토시스의 유도를 야기하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체에 관한 것이다.
이전에 기재된 항-TWEAKR 항체 (예를 들어 PDL-192)의 아폽토시스의 유도 및 증식 억제에 관한 TWEAKR 효능작용적 활성은 한계가 있고, 내인성 리간드 TWEAK의 효능에 이르지 못한다. 이러한 효능작용적 활성의 결여는, 이들 항체가 TWEAKR에 내인성 리간드 TWEAK와 비교하여 유사한 범위 내의 친화도로 결합하고 (Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75; Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508) 또한 보다 높은 결합 친화도를 갖는 항체가 반드시 보다 효과적인 신호전달 활성을 나타내는 것은 아니기 때문에 (Culp PA, et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):497-508), 감소된 친화도로 인한 것은 아니다. 또한, 이전에 기재된 항체의 항종양 활성은 Fc 이펙터 기능에 의존적인 것으로 제시되어 있고, ADCC는 마우스 모델에서 생체내 효능을 위해 유의한 역할을 하는 것으로 제시되어 있다.
본 발명은 유의한 역할을 하는 ADCC 없이 생체내 항종양 효능을 달성할 수 있는, 아폽토시스의 유도 및 증식의 억제와 관련하여 이러한 강력한 효능작용적 활성을 갖는 항체, 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체를 제공한다. 통상의 기술자는 항원 결합 및 효능작용적 활성은 유지시키면서 ADCC를 방지하기 위해 Fc 감마 수용체 활성화가 결여된 항체 변이체를 제공하는 방법을 알고 있다. 이러한 방법은 인간 IgG2 및 인간 IgG4 항체 이소형의 사용, 비-글리코실화 항체의 사용, 또는 Fc 감마 수용체 활성화를 방지하는 돌연변이를 갖는 항체의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 실시양태는 1종 이상의 TWEAKR 발현 세포주에서 카스파제-3/7의 강력한 유도를 갖는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 TWEAKR 발현 세포주는 WiDr, A253, NCI-H322, HT-29 및 786-O 세포로 이루어진 군에 포함된다. "카스파제 3/7의 유도"는 본원에 기재된 것을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "카스파제 3/7의 유도"는 카스파제 3/7 용액 (프로메가, #G8093)에 의한 활성 결정을 사용하고 빅토르(VICTOR) V (퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 발광을 판독함으로써 측정된다. 인큐베이션 시간의 말미에 카스파제 3/7 활성을 결정하고, 비처리 세포와 비교하여 카스파제 3/7의 배수 유도를 계산한다. 유도 배수가 1.2 초과, 바람직하게는 1.5 초과, 보다 바람직하게는 1.8 초과, 보다 바람직하게는 2.1 초과, 보다 바람직하게는 2.5 초과인 경우에, 항체는 카스파제-3/7의 "강력한 유도"를 갖는다고 언급된다. 이전에 기재된 효능작용적 항체 [예를 들어 PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194)]와 비교하여, 또한 300ng/ml 재조합 인간 TWEAK와 비교하여 HT-29 세포에서 카스파제 3/7의 보다 강력한 유도를 야기하는 항-TWEAKR 항체가 제공된다. 암 세포에서 카스파제 3/7을 유도하는 이러한 강력한 효능은 또한 WiDr, A253, NCI-H322 및 786-O 세포에서도 관찰되었고, 여기서 시험된 본 발명의 항체는 대부분의 실험에서 참조 항체 [PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324)] 및 300ng/ml TWEAK와 비교하여 보다 높은 배수-변화를 유도하였다. 일부 본 발명의 항체는 내인성 리간드 TWEAK의 친화도와 비교하여 분명히 더 낮고 다른 공지된 효능작용적 항체와 비교하여 더 낮은 단지 중간 정도의 친화도 (>10nM)로 TWEAKR에 결합한다. 이러한 특성은 예를 들어 잠재적으로 개선된 종양 침투와 같은 추가의 잠재적 이점을 제공한다.
이를 목적으로, 본 발명의 한 실시양태는 TWEAKR (서열 169; 및 도 1 참조)의 위치 47의 아스파르테이트 (D) (D47)에의 선택적 결합을 특징으로 하는, 신규 에피토프에서 TWEAKR에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 항체 단편을 제공한다. 항체 상호작용을 위해 특정 TWEAKR 아미노산에 대한 확인된 의존은 이들 항체에 대해 결정된 효능작용적 활성과 상호관련된다. 천연 리간드 TWEAK는 TWEAKR의 효율적인 활성화를 나타내고, TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 내의 류신 46에 의존하여 결합한다 (Pellegrini et al., FEBS 280:1818-1829). P4A8은 매우 낮은 효능작용적 활성을 나타내고, TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 외부 도메인과 적어도 부분적으로 상호작용한다. PDL-192는 중간 정도의 효능작용적 활성을 나타내고, R56에 의존하여 시스테인 풍부 도메인이지만 TWEAK 리간드 부위의 반대편에 결합한다. 본 발명의 항체 (예시적인 TPP-2090)는 D47에 의존하여 결합하며, TWEAK는 L46에 의존하여 결합하고 유사하지만 구별가능한 결합 부위에 결합한다 (도 7). 따라서, 강력한 효능작용적 활성을 나타내는 본 발명의 항체는 매우 강력한 효능작용적 활성과 연관된 항체에 대한 신규 에피토프에 결합한다 (D47 의존적).
실시예 2 및 도 6에 기재된 바와 같이 위치 47의 아미노산 (D47)을 알라닌으로 교환하는 것에 의해 항체가 그의 ELISA 신호를 20% 초과, 대안적으로 30% 초과, 대안적으로 40% 초과, 대안적으로 50% 초과, 대안적으로 60% 초과, 대안적으로 70% 초과, 대안적으로 80% 초과, 대안적으로 90% 초과, 대안적으로 100% 상실하는 경우에, TWEAKR (서열 169)의 이 잔기는 본 발명의 항체의 결합을 위해 중요한 것으로 간주되며, 이는 항체가 TWEAKR (서열 169)의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 대안적으로, 항체가 TPP-2203과 비교하여 TPP-2614에 대한 그의 ELISA 신호를 20% 초과, 대안적으로 30% 초과, 대안적으로 40% 초과, 대안적으로 50% 초과, 대안적으로 60% 초과, 대안적으로 70% 초과, 대안적으로 80% 초과, 대안적으로 90% 초과, 대안적으로 100% 상실하는 경우에 항체는 TWEAKR (서열 169)의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 항체가 TPP-2203과 비교하여 TPP-2614에 대한 그의 ELISA 신호를 80% 초과하여 상실하는 경우에 항체는 TWEAKR (서열 169)의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 감소된 ADCC 활성을 갖거나 ADCC 활성이 결여되어 있고, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 카스파제3/7의 유도, TWEAKR 발현 세포주의 증식의 억제, 및 시토카인 분비의 유도로 이루어진 효능작용적 활성의 군으로부터 선택된 것인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 카스파제3/7의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 TWEAKR 발현 암 세포주에서의 카스파제3/7의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 WiDr, A253, NCI-H322, HT-29 및 786-O 세포로 이루어진 군에 포함되는 TWEAKR 발현 암 세포주에서의 카스파제3/7의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 보다 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 HT-29 및/또는 786-O 세포주에서의 재조합 인간 TWEAK에 의한 유도와 비교하여 카스파제3/7의 보다 높은 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 사용된 항-TWEAKR 항체의 농도는 100μg/ml이고, 재조합 인간 TWEAK의 농도는 300 ng/ml이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 다양한 종 (도 1)의 TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 (서열 169의 aa 34-68)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 (서열 169의 aa 34-68)에 특이적으로 결합하고 TWEAKR의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 인간, 마우스, 개, 돼지, 래트 및 마카카 파시쿨라리스(macaca fascicularis)로 이루어진 군의 TWEAKR 종에 포함되는 적어도 2종의 TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 (서열 169의 aa 34-68)에 특이적으로 결합하고 TWEAKR의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 2종은 인간 및 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 다양한 TWEAKR 발현 세포주의 증식을 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 카스파제 3/7의 강력한 유도와 일치하여, 다양한 암 세포주의 증식의 효과적인 억제가 관찰된다. 본 발명의 항체는 다양한 암 세포의 증식을 억제하는데 있어서 다른 공지된 항체 (PDL-192, P4A8)와 비교하여 보다 효과적이다. 대부분의 실험에서, 본 발명의 항체는 TWEAK 리간드와 비교하여 보다 높은 효능 또는 동일한 효능을 나타낸다. 따라서, 항체는 786-O, LOVO, NCI-H1975, SW480, WiDr, HT-29, A253, SK-OV3을 포함하나 이에 제한되지는 않는 넓은 패널의 암 세포주에서 아폽토시스 및 증식 억제를 유도하는 그의 효능면에서 고유하다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 TWEAKR 발현 세포주의 증식의 억제인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, TWEAKR 발현 세포주는 786-O, LOVO, NCI-H1975, SW480, WiDr, HT-29, A253, 및 SK-OV3으로 이루어진 군에 포함된다.
본 발명의 추가의 보다 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 재조합 인간 TWEAK에 의한 억제와 비교하여 786-O 및/또는 WiDr 세포주의 증식의 보다 강력한 억제인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 사용된 항-TWEAKR 항체의 농도는 100μg/ml이고, 재조합 인간 TWEAK의 농도는 300 ng/ml이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 A375, WiDr 세포 및 이종이식편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 암 세포로부터 시토카인 분비를 강력하게 유도하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 유도되는 시토카인은 IL-8, IL-15, IP-10, IL-1RA 및 MCP-1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유도되는 바람직한 시토카인은 IL-8이다. 본 발명의 항체는 다른 공지된 항체 (PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194))와 비교하여 A375 세포에서 IL-8을 유도하는데 보다 높은 효능을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 시토카인 분비의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 TWEAKR 발현 암 세포주에서의 시토카인 분비의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 보다 바람직한 실시양태에서, TWEAKR 발현 암 세포주는 A375 또는 WiDr 세포주이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 시토카인 분비의 유도이고, 여기서 시토카인은 IL-8, IL-15, IP-10, IL-1RA 및 MCP-1로 이루어진 시토카인 군에 포함되는 것인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 TWEAKR 발현 암 세포주에서의 시토카인 분비의 유도이고, 여기서 시토카인은 IL-8, IL-15, IP-10, IL-1RA 및 MCP-1로 이루어진 시토카인 군에 포함되는 것인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 TWEAKR 발현 암 세포주에서의 시토카인 분비의 유도이고, 여기서 시토카인은 IL-8, IL-15, IP-10, IL-1RA 및 MCP-1로 이루어진 시토카인 군에 포함되고, 여기서 TWEAKR 발현 암 세포주는 A375 또는 WiDr 세포주인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 시토카인은 IL-8이고, 보다 더 바람직한 실시양태에서, IL-8은 인간 IL-8이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 마우스 종양 이종이식편 모델에서의 시토카인 분비의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 분비된 시토카인은 종양 이종이식편으로부터 유래된 인간 시토카인이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 마우스 종양 이종이식편 모델에서의 인간 IL-8 분비의 유도인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 마우스 종양 이종이식편 모델은 A375 또는 WiDr 마우스 이종이식편 모델이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 시토카인 분비의 유도는 3mg/kg 이상 또는 10 mg/kg 이상의 본 발명의 항-TWEAKR 항체의 주사 후에 관찰된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 항-TWEAKR 항체의 효능작용적 활성이 상기 항체의 3mg/kg의 주사 후의 마우스 WiDr 종양 이종이식편 모델에서의 인간 IL-8 분비의 유도이고, 여기서 마우스 IL-8 유사체 KC의 유도는 전혀 검출되지 않는 것인, TWEAKR (서열 169)의 아스파르테이트 47 (D47)에 특이적으로 결합하는 효능작용적 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 시토카인 분비의 유도는 종양 보유 마우스의 혈장에서 관찰된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 표 21에 제시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않은 넓은 범위의 다양한 TWEAKR 발현 세포주에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 표 21에서의 예는 많은 종양 기원으로부터의 인간 및 뮤린 세포주를 포함한다 (예를 들어 NSCLC, CRC, HNSCC, RCC, PancCA, OvCa, 유방CA, 흑색종, 위CA, 식도 CA, 방광 CA, HCC, 전립선 CA, 신경모세포종).
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 투여에 안전한 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 TWEAKR에 결합하고, 뮤린, 래트, 돼지, 개, 마카카 파시쿨라리스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 또 다른 종의 TWEAKR에 대해 유사한 친화도로 교차-반응성인 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 다른 종은 설치류, 예컨대 예를 들어 마우스 또는 래트이다. 가장 바람직하게는, 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체는 인간 TWEAKR에 결합하고, 뮤린 TWEAKR에 대해 교차-반응성이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 TWEAKR 발현이 정상 조직과 비교하여 상승되어 있거나 또는 TWEAKR이 세포 표면으로부터 쉐딩되어 혈청에서 검출가능하게 된 악성 또는 이형성 상태의 진단을 위한 도구를 구성하는 항체를 제공하는 것이다. 검출가능한 마커에 접합된 항-TWEAKR 항체가 제공된다. 바람직한 마커는 방사성표지, 효소, 발색단 또는 형광물질이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 표 31에 도시된 바와 같은 하기 본 발명의 바람직한 항체가 언급된다: "TPP-2090", "TPP-2149", "TPP-2093", "TPP-2148", "TPP-2084", "TPP-2077", "TPP-1538", "TPP-883", "TPP-1854", "TPP-1853", "TPP-1857", "TPP-1858", 및 "TPP-2658".
TPP-2090은 서열 2에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 1에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2149는 서열 12에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 11에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2093은 서열 22에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 21에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2148은 서열 32에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 31에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2084는 서열 42에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 41에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2077은 서열 52에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 51에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1538은 서열 62에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 61에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-883은 서열 72에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 71에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1854는 서열 82에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 81에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1853은 서열 92에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 91에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1857은 서열 102에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 101에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1858은 서열 112에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 111에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2658은 서열 213에 상응하는 중쇄 영역 및 서열 1에 상응하는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2090은 서열 10에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 9에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2149는 서열 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 19에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2093은 서열 30에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 29에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2148은 서열 40에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 39에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2084는 서열 50에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 49에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-2077은 서열 60에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 59에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1538은 서열 70에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 69에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-883은 서열 80에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 79에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1854는 서열 90에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 89에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1853은 서열 100에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 99에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1857은 서열 110에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 109에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
TPP-1858은 서열 120에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열 119에 상응하는 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항체 "TPP-2090", "TPP-2149", "TPP-2093", "TPP-2148", "TPP-2084", "TPP-2077", "TPP-1538", "TPP-883", "TPP-1854", "TPP-1853", "TPP-1857" 또는 "TPP-1858" 중 적어도 하나의, 바람직하게는 상응하는 CDR 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60% 70%, 80%, 90, 또는 95% 동일하거나, 또는 "TPP-2090", "TPP-2149", "TPP-2093", "TPP-2148", "TPP-2084", "TPP-2077", "TPP-1538", "TPP-883", "TPP-1854", "TPP-1853", "TPP-1857" 또는 "TPP-1858"의 VH 또는 VL 서열 각각에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95% 동일한 중쇄 또는 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 적어도 1개의 CDR 서열 또는 적어도 1개의 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 6 (H-CDR1), 서열 7 (H-CDR2) 및 서열 8 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 3 (L-CDR1), 서열 4 (L-CDR2) 및 서열 5 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 16 (H-CDR1), 서열 17 (H-CDR2) 및 서열 18 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 13 (L-CDR1), 서열 14 (L-CDR2) 및 서열 15 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 26 (H-CDR1), 서열 27 (H-CDR2) 및 서열 28 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 23 (L-CDR1), 서열 24 (L-CDR2) 및 서열 25 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 36 (H-CDR1), 서열 37 (H-CDR2) 및 서열 38 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 33 (L-CDR1), 서열 34 (L-CDR2) 및 서열 35 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 46 (H-CDR1), 서열 47 (H-CDR2) 및 서열 48 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 43 (L-CDR1), 서열 44 (L-CDR2) 및 서열 45 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 56 (H-CDR1), 서열 57 (H-CDR2) 및 서열 58 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 53 (L-CDR1), 서열 54 (L-CDR2) 및 서열 55 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 66 (H-CDR1), 서열 67 (H-CDR2) 및 서열 68 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 63 (L-CDR1), 서열 64 (L-CDR2) 및 서열 65 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 76 (H-CDR1), 서열 77 (H-CDR2) 및 서열 78 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 73 (L-CDR1), 서열 74 (L-CDR2) 및 서열 75 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 86 (H-CDR1), 서열 87 (H-CDR2) 및 서열 88 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 83 (L-CDR1), 서열 84 (L-CDR2) 및 서열 85 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 96 (H-CDR1), 서열 97 (H-CDR2) 및 서열 98 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 93 (L-CDR1), 서열 94 (L-CDR2) 및 서열 95 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 106 (H-CDR1), 서열 107 (H-CDR2) 및 서열 108 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 103 (L-CDR1), 서열 104 (L-CDR2) 및 서열 105 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 116 (H-CDR1), 서열 117 (H-CDR2) 및 서열 118 (H-CDR3)을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하고, 서열 113 (L-CDR1), 서열 114 (L-CDR2) 및 서열 115 (L-CDR3)를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
본 발명의 항체의 CDR의 서열 정렬로 컨센서스 서열이 밝혀졌다 (도 24 참조). 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
Figure pct00001
식 PYPMX (서열 171)를 포함하며, 여기서 X는 I 또는 M인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR1;
Figure pct00002
식 YISPSGGXTHYADSVKG (서열 172)를 포함하며, 여기서 X는 S 또는 K인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR2; 및
Figure pct00003
식 GGDTYFDYFDY (서열 173)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR3;
을 포함하는 가변 중쇄
및
Figure pct00004
식 RASQSISXYLN (서열 174)을 포함하며, 여기서 X는 G 또는 S인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR1;
Figure pct00005
식 XASSLQS (서열 175)를 포함하며, 여기서 X는 Q, A, 또는 N인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR2; 및
Figure pct00006
식 QQSYXXPXIT (서열 176)를 포함하며, 여기서 위치 5의 X는 T 또는 S이고, 위치 6의 X는 T 또는 S이고, 위치 8의 X는 G 또는 F인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR3
을 포함하는 가변 경쇄.
항체는 서열상, 그의 상보성 결정 영역 (CDR) 내에서 뿐만 아니라, 프레임워크 (FR) 내에서 상이하다. 이들 서열 차이는 상이한 V-유전자 내에 코딩된다. 인간 항체 배선 레퍼토리는 완전히 서열분석되어 있다. 서열 상동성에 따라 6개의 서브패밀리 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5 및 VH6으로 그룹화될 수 있는 약 50개의 기능적 VH 배선 유전자가 존재한다 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227, 776-798; Matsuda & Honjo, 1996, Advan. Immunol. 62, 1-29). 7개의 서브패밀리를 포함하는 약 40개의 기능적 VL 카파 유전자가 공지되어 있다 (Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 827-836; Barbie & Lefranc, 1998, Exp. Clin. Immunogenet. 15, 171-183). V카파1, V카파2, V카파3, V카파4, V카파5, V카파6 및 V카파7. 인간 VH3 서브패밀리에 속하는 본 발명의 항체의 중쇄 및 인간 V카파1 서브패밀리에 속하는 본 발명의 항체의 경쇄가 각각 본원에 개시되어 있다. 동일한 서브패밀리에 속하는 항체의 프레임워크 서열은 밀접한 관련이 있는 것으로 공지되어 있고, 예를 들어 인간 Vh3 서브패밀리 구성원을 포함하는 항체는 모두 비슷한 안정성을 공유한다 (Honegger et al., 2009, Protein Eng Des Sel. 22(3):121-134). 항체로부터의 CDR은 상응하는 기원 항체의 특별한 특징은 유지하면서 상이한 프레임워크에 그라프트될 수 있는 것으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. CDR은 상이한 종에 속하는 프레임워크에 뿐만 아니라, 상이한 서브패밀리에 속하는 동일한 종의 프레임워크에 성공적으로 그라프트되어왔다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 본 발명의 항체의 적어도 1개의 CDR 서열 및 인간 가변 쇄 프레임워크 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 경쇄 또는 가변 경쇄의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 서열을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄 또는 가변 중쇄의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 서열을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 인간 가변 경쇄 및 인간 가변 중쇄 프레임워크 서열을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 경쇄 또는 가변 경쇄의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 서열을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄 또는 가변 중쇄의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 서열을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄에 대한 인간 VH3 서브패밀리 프레임워크 서열 및 가변 경쇄에 대한 인간 V카파 1 서브패밀리 프레임워크 서열을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가변 중쇄에 대한 인간 VH3 서브패밀리 프레임워크 서열은 VH3-07, VH3-09, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-30.3, VH3-30.5, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74 및 VH3-d로 이루어진 VH3 서브패밀리 프레임워크 서열의 군에 포함된다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 인간 VH3 프레임워크 서열은 인간 VH3-23 프레임워크 서열과 비교하여 16개 미만 또는 15개 미만의 아미노산 교환을 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가변 경쇄에 대한 인간 V카파1 서브패밀리 프레임워크 서열은 V카파 1-5, V카파 1-6, V카파 1-8, V카파 1D-8, V카파 1-9, V카파 1-12, V카파 1D-12, V카파 1-13, V카파 1D-13, V카파 1-16, V카파 1D-16, V카파 1-17, V카파 1D-17, V카파 1-27, V카파 1-33, V카파 1D-33, V카파 1-37, V카파 1D-37, V카파 1-39, V카파 1D-39, V카파 1D-42, V카파 1D-43으로 이루어진 V카파1 서브패밀리 프레임워크 서열의 군에 포함된다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 인간 V카파 1 프레임워크 서열은 인간 V카파 1-39 프레임워크 서열과 비교하여 15개 미만 또는 13개 미만의 아미노산 교환을 갖는다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 경쇄 또는 가변 경쇄의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 서열을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄 또는 가변 중쇄의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 서열을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄에 대한 인간 VH3 서브패밀리 프레임워크 서열 및 가변 경쇄에 대한 인간 V카파 1-39 프레임워크 서열을 포함한다.
가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 표 31에 도시된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 경쇄 또는 가변 경쇄의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 서열을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄 또는 가변 중쇄의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 서열을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 가변 중쇄에 대한 인간 VH3-3 프레임워크 서열 및 가변 경쇄에 대한 인간 V카파 1-39 프레임워크 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 가변 경쇄 프레임워크 서열은 인간 V카파1 서브패밀리에 속하고, 가변 중쇄 프레임워크 서열은 인간 VH3 서브패밀리에 속한다. VH3 서브패밀리 또는 V카파1 서브패밀리 가변 쇄 프레임워크 서열은 각각의 CDR 서열의 삽입을 위한 프레임워크를 채택하기 위해 각각의 WT 프레임워크 서열과 비교하여 서열 변이를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, WT 프레임워크 서열과 비교하여 서열 변이를 포함하는 VH3 서브패밀리 또는 V카파1 서브패밀리 가변 쇄 프레임워크 서열은 각각 VH3 서브패밀리 구성원 또는 V카파1 서브패밀리 구성원이다. 바람직하게는, 이러한 변이체 프레임워크 서열은 최대 15개의 서열 변이, 보다 바람직하게는 최대 10개의 서열 변이, 보다 바람직하게는 최대 5개의 서열 변이, 가장 바람직하게는 최대 3개의 서열 변이를 갖는다.
본 발명의 항체는 IgG (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)일 수 있고, 한편 항체 단편은 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 또는 scFv일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 방식으로 거동하는 항원-결합 영역일 수 있거나 또는 이러한 항원-결합 영역을 함유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 모노클로날 항체 또는 항원-결합 항체 단편이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TWEAKR에 특이적으로 결합하고/거나 그에 대해 고친화도를 갖는 항원-결합 영역을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체 또는 항원-결합 단편은 친화도 측정치가 250 nM 미만인 경우에 (항체 또는 항원-결합 단편의 1가 친화도), 항원에 대해 "고친화도"를 갖는 것으로 언급된다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 영역은 바람직하게는 인간 TWEAKR에 대해, 표 6에 제시된 바와 같이 인간 TWEAKR에 대한 1가 친화도로서 결정 시 (실시예 2 참조) 250 nM 미만, 바람직하게는 150 nM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만, 보다 바람직하게는 30 nM 미만, 보다 바람직하게는 20 nM 미만의 친화도로 결합할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TWEAKR에 특이적으로 결합하고, TPP-2090에 대해 예시적으로 도 11에 제시된 바와 같은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 다른 구성원에는 결합하지 않는 (표 20 참조) 항원-결합 영역을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
IgG1 포맷을 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 세포-기반 친화도 평가에 사용하였다. 표 21은 TPP-2090 및 TPP-1538에 대해 예시적으로, 인간 및 뮤린 기원의 암 세포주에 대한 대표적인 항-TWEAKR 항체의 결합의 요약을 제공한다. 본 발명의 FACS 분석에 의해 검출된 바와 같은 항체의 최대 세포 결합은 다른 기재된 항체와 비교하여 중간 정도이지만, 그럼에도 불구하고 이들 항체는 매우 강력한 효능작용적 활성을 가지며, 이는 본 발명의 항체에 대해 발견된 신규 에피토프의 중요성을 강조한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 TWEAKR 발현 세포에의 결합 후에 효율적으로 내재화되는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 항체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에 항체는 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 효능을 잠재적으로 추가로 증가시키기 위해 항체는 세포독성제, 면역독소, 독성단 또는 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 TWEAKR 발현 종양 세포 내로의 과립 카운트/세포에 의한 측정 시 그의 절반 최대 내재화 시간 (t ½)이 400분 미만 또는 보다 바람직하게는 300분 미만, 보다 더 바람직하게는 200분 미만인 경우에 "효율적으로" 내재화된다. 실시예 7 및 도 17에 기재된 프로토콜에 의한 결정 시 100분 이하의 절반 최대 내재화 시간 (t ½)을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편이 추가로 바람직하다.
내재화가능한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체-약물 접합체 (ADC)의 표적화 모이어티로서 적합하다. 항체 또는 항원-결합 단편은 화합물, 바람직하게는 세포독성제를 TWEAKR 발현 세포 내로 전달하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 적합하다. 효율적인 내재화는 형광 표지된 항체에 의해 제시된다 (실시예 7). 항체 약물 접합체로서의 효율적인 사용은 사포린-접합된 항체에 의해 예시된다 (실시예 7).
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그를 코딩하는 핵산이 단리된다. 단리된 생물학적 성분 (예컨대 핵산 분자 또는 단백질, 예컨대 항체)은 성분이 자연 발생된 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체-외 DNA 및 RNA, 단백질 및 소기관으로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 것이다. "단리된" 핵산 및 단백질은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA) 및 Robert K. Scopes et al. 1994 (Protein Purification, - Principles and Practice, Springer Science and Business Media LLC)]에 기재된 바와 같은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포 내에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산을 포괄한다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 완전 인간 CDR을 새로운 항체 분자로 재조합시키는 n-CoDeR® 기술을 사용한, 다수의 건강한 지원자의 항체로부터 단리된 아미노산 서열을 기반으로 한 재조합 항체 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 또는 대안적으로 문헌 [Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8]에 기재된 완전 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 항체 라이브러리를 사용하여 TWEAKR-특이적 항체를 단리할 수 있다.
항체 생성
완전 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리 (Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)는 고정된 표적으로서 인간 및 뮤린 TWEAKR의 이량체성 Fc-융합 세포외 도메인에 의한 단백질 패닝 (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3):1105-16)에 의해 본 발명의 TWEAKR-특이적, 인간 모노클로날 항체를 단리하는데 사용되었다.
11종의 상이한 Fab-파지가 확인되었고, 상응하는 항체를 가용성 Fab에는 존재하지 않는 누락 CH2-CH3 도메인을 제공하는 포유동물 IgG 발현 벡터 내로 재-클로닝시켰다. 바람직한 항체의 확인 후에, 이들을 전장 IgG로서 발현시켰다. 이들 구축물을 예를 들어 문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재된 바와 같이 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켰다 (실시예 1 참조). 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA 및 비아코어 분석에서 가용성 단량체성 TWEAKR에 대한 그의 결합 친화도에 의해 추가로 특성화하였다. 항-TWEAKR 항체의 세포 결합 특성을 결정하기 위해, 한 패널의 세포주 (HT29, HS68, HS578)에 대해 유동 세포측정법에 의해 결합을 시험하였다.
NF-카파B 리포터 유전자 검정을 수행하여 모든 11종의 확인된 항체 (인간 IgG1)의 효능작용적 활성을 평가하였다. 가장 강력한 시험관내 효능을 갖는 항체 (TPP-883)를 추가의 효력 및 친화도 성숙을 위해 선택하였다 (상세사항은 실시예 1 참조). 1개의 단일 치환 변이체가 개선된 효능작용적 활성을 갖는 것으로 검출되었다: CDR-H3의 G102T. 마지막으로, 최고의 단일 치환 변이체, G102T와 비교하여 증진된 친화도를 기초로 하여 7종의 변이체를 선택하였다. 이들의 상응하는 DNA를 포유동물 IgG 발현 벡터 내에 재-클로닝시키고, 상기 언급된 NFkB 리포터 세포 검정에서 기능적 활성에 대해 시험하였다. 마지막으로, 수득된 서열을 인간 배선 서열과 비교하고, 친화도 및 효력에 대해 유의한 영향 없이 편차를 조정하였다. 항체 라이브러리 스크리닝 및 친화도 및/또는 효력 성숙에 의해 하기 항체가 수득되었다: "TPP-2090", "TPP-2149", "TPP-2093", "TPP-2148", "TPP-2084", "TPP-2077", "TPP-1538", "TPP-883", "TPP-1854", "TPP-1853", "TPP-1857", 및 "TPP-1858".
본 발명의 항체는 항체 파지 디스플레이 스크리닝 (예를 들어 문헌 [Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8] 참조), 널리-확립된 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Koehler and Milstein Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7] 참조), 또는 마우스의 면역화, 특히 hMAb 마우스의 면역화 (예를 들어 벨로크이뮨 마우스(VelocImmune mouse)®)와 같은 관련 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 추가로 생성될 수 있다.
펩티드 변이체
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에 제공된 특정 펩티드 서열에 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이들 폴리펩티드의 변이체도 또한 포괄한다. 본 발명의 개시내용 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참고문헌을 참조하여, 통상의 기술자는 본원에 개시된 항체의 기능적 변이체를 제조, 시험 및 활용할 수 있을 것이고, 한편 TWEAKR에 결합하는 능력을 갖는 이들 변이체가 본 발명의 범위 내에 속한다는 것을 인지할 것이다.
변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 서열과 비교 시 적어도 1개의 변경된 상보성 결정 영역 (CDR) (초가변) 및/또는 프레임워크 (FR) (가변) 도메인/위치를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 개념을 보다 잘 예시하기 위해, 항체 구조에 대한 간략한 설명이 하기 기재되어 있다.
항체는 2개의 펩티드 쇄로 구성되고, 각각은 1개 (경쇄) 또는 3개 (중쇄)의 불변 도메인 및 가변 영역 (VL, VH)을 함유하며, 후자는 각각의 경우에 4개의 FR 영역 및 3개의 개재된 CDR로 구성된다. 항원-결합 부위는 1개 이상의 CDR에 의해 형성되지만, FR 영역은 CDR을 위한 구조적 프레임워크를 제공하고, 따라서 항원 결합에서 중요한 역할을 한다. CDR 또는 FR 영역에서 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경함으로써, 통상의 기술자는 일상적으로 항원에 대해, 예를 들어 새로운 또는 개선된 특성에 대해 스크리닝될 수 있는 돌연변이되거나 다양화된 항체 서열을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 VH 및 VL 서열이 표 31에 제시된 바와 같이 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이다. 통상의 기술자는 표 31의 데이터를 사용하여 본 발명의 범위 내에 있는 펩티드 변이체를 설계할 수 있다. 1개 이상의 CDR 영역 내의 아미노산을 변화시킴으로써 변이체를 구축하는 것이 바람직하며; 변이체는 또한 1개 이상의 변경된 프레임워크 영역을 가질 수 있다. 변경은 또한 프레임워크 영역에서도 이루어질 수 있다. 예를 들어, 펩티드 FR 도메인은 배선 서열과 비교하여 잔기에서 편차가 존재하도록 변경될 수 있다.
대안적으로, 통상의 기술자는 예를 들어 문헌 [Knappik A., et al., JMB 2000, 296:57-86]에 기재된 절차를 사용하여 본원에 개시된 아미노산 서열을 이러한 항체의 동일한 부류의 공지된 서열과 비교함으로써 동일한 분석을 수행할 수 있다.
또한, 추가의 최적화를 위한 출발점으로서 하나의 항체를 사용하여, 항체 내의 1개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1개 이상의 CDR 내의 아미노산 잔기를 다양화하고, 생성된 항체 변이체 집합체를 개선된 특성을 갖는 변이체에 대해 스크리닝함으로써 변이체를 수득할 수 있다. VL 및/또는 VH의 CDR3 내의 1개 이상의 아미노산 잔기의 다양화가 특히 바람직하다. 예를 들어 트리뉴클레오티드 돌연변이유발 (TRIM) 기술을 사용하여 DNA 분자의 집합체를 합성함으로써 다양화를 행할 수 있다 (Virnekaes B. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600.). 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어 변경된 반감기를 생성하는 변형 (예를 들어, Fc 부분의 변형 또는 추가의 분자, 예컨대 PEG의 부착), 변경된 결합 친화도 또는 변경된 ADCC 또는 CDC 활성을 생성하는 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형/변이를 갖는 분자를 포함한다.
항체의 한 실시양태는 변경된 ADCC를 생성하는 변형을 포함하는 TPP-2658이다. TPP-2658은 ADCC가 결여된 비-글리코실화 항체 변이체를 생성하는 Fc 부분 내 N297에서 돌연변이를 갖는다 (TPP-2090과 비교됨).
보존적 아미노산 변이체
본원에 기재된 항체 펩티드 서열의 전체적인 분자 구조가 보존된 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. 통상의 기술자는 개별 아미노산의 특성을 고려하여 일부 합리적인 치환을 인식할 것이다. 아미노산 치환, 즉 "보존적 치환"은, 예를 들어 수반되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; (c) 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 전형적으로 군 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그의 능력에 기초하여 서로 치환될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 보다 통상적으로 발견되는 반면에, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 시트에서 보다 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴 및 프롤린은 통상적으로 턴에서 발견된다. 일부 바람직한 치환은 하기 군 사이에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 구축할 수 있다.
본원에 사용된 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다. "서열 상동성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다.
본 발명의 DNA 분자
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 항체 발현을 위해 사용되는 DNA 서열을 표 32에 제시한다. 이들 서열은 포유동물 발현을 위해 최적화된다. 본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 제한되지 않고, 그의 변이체도 또한 포함한다. 본 발명에 속하는 DNA 변이체는 혼성화에서의 그의 물리적 특성을 참조하여 기재될 수 있다. 통상의 기술자는 DNA를 사용하여 그의 상보물을 확인할 수 있고, DNA가 이중 가닥이기 때문에 핵산 혼성화 기술을 사용하여 그의 등가물 또는 상동체를 확인할 수 있음을 인식할 것이다. 또한 100% 미만의 상보성으로 혼성화가 일어날 수 있다는 것도 인식할 것이다. 그러나, 조건의 적절한 선택 하에, 혼성화 기술을 사용하여 DNA 서열을 특정한 프로브에 대한 그의 구조적 관련성에 기초하여 구별할 수 있다. 이러한 조건에 관한 지침에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989 supra 및 Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)]을 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 이러한 조건 하에서는 가장 구조적으로 관련된 분자만이 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 비-엄격한 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상호관련된다. 하기 관계가 혼성화와 관련성을 상호관련시키는데 유용하다 (여기서, Tm은 핵산 듀플렉스의 용융 온도임):
a. Tm = 69.3 + 0.41(%G+C)℃
b. 미스매치된 염기 쌍의 수가 1% 증가할 때마다 듀플렉스 DNA의 Tm이 1℃만큼 감소됨.
c. (Tm)μ2 - (Tm) μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
여기서 μ1 및 μ2는 2종의 용액의 이온 강도임.
혼성화 엄격성은 전체적인 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재를 비롯한 많은 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 보다 긴 프로브 크기, 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 전형적으로는 2개의 단계: "결합" 단계 및 "세척" 단계로 수행된다.
기능적으로 등가인 변이체
본 발명의 범위 내의 또 다른 부류의 DNA 변이체가 이들이 코딩하는 생성물과 관련하여 기재될 수 있다. 이러한 기능적으로 등가인 폴리뉴클레오티드는 이들이 유전자 코드의 축중성으로 인해 동일한 펩티드 서열을 코딩한다는 사실을 특징으로 한다.
본원에 제공된 DNA 분자의 변이체는 몇몇 다양한 방식으로 구축될 수 있는 것으로 인식된다. 예를 들어, 이는 완전히 합성 DNA로서 구축될 수 있다. 20 내지 약 150개 뉴클레오티드 범위의 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 널리 이용가능하다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)]을 참조한다. 중첩 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)]에 처음 보고된 방식으로 합성되고 어셈블리될 수 있으며; 또한 문헌 [Ausubel et al., supra, Section 8.2]를 참조한다. 합성 DNA는 바람직하게는 적절한 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자의 5' 및 3' 말단에서 조작된 편리한 제한 부위를 갖도록 설계된다.
제시된 바와 같이, 변이체를 생성하는 방법은 본원에 개시된 DNA 중 하나로 출발한 다음, 부위-지정 돌연변이유발을 수행하는 것이다. 문헌 [Ausubel et al., supra, chapter 8, Supplement 37 (1997)]을 참조한다. 전형적인 방법으로, 표적 DNA는 단일-가닥 DNA 박테리오파지 비히클 내로 클로닝된다. 단일-가닥 DNA를 단리하고, 목적 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화시킨다. 상보적 가닥을 합성하고, 이중 가닥 파지를 숙주 내로 도입시킨다. 생성된 자손 중 일부는 목적 돌연변이체를 함유할 것이고, 이는 DNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다. 또한, 자손 파지가 목적 돌연변이체일 가능성을 증가시키는 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이러한 돌연변이체를 생성하기 위한 키트가 상업적으로 입수가능하다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다 (표 32 참조). 본 발명의 재조합 구축물은 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 관련하여 사용되고, 이러한 벡터 내로 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 DNA 분자가 삽입된다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계 없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 제공된 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체는 경쇄 및 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산 서열의 숙주 세포 내에서의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체, 항원 결합 부분, 또는 그의 변이체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포 내에서 발현되도록 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.)에 기재된 바와 같이, 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이들 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입시킨다.
또한, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어 전장 항체 쇄, Fab 단편 또는 scFv를 코딩하는 핵산 서열로 전환시킬 수 있다. VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 (2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임이도록) 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
특정 검정에서, 본 발명의 항체의 뮤린 IgG로서의 발현이 바람직하며, 예를 들어 인간 샘플에 의한 면역조직화학은 뮤린 항체를 사용함으로써 보다 용이하게 분석될 수 있다.
scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 인접한 단일-쇄 단백질로서 VH 및 VL 서열이 발현될 수 있도록, VH- 및 VL-코딩 핵산을 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554] 참조).
항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 참조). 예를 들어, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입한 다음, 이를 적합한 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 예를 들어 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 또는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 동일한 벡터 내로 삽입된다. 조절 서열의 선택을 비롯하여 발현 벡터의 설계는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준, 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지의 여부와 같은 인자에 의해 영향을 받는 것으로 이해된다.
박테리아 발현
목적하는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 기능적 프로모터가 있는 작동가능한 판독 상 내에 삽입함으로써 박테리아 사용에 유용한 발현 벡터가 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 바람직한 경우에, 숙주 내에서의 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 다양한 종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 벡터는, 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이들 벡터는 널리-공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 전형적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터를 적절한 수단 (예를 들어, 온도 변경 또는 화학적 유도)에 의해 탈-억제/유도하고, 세포를 추가의 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴시키고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 유지시킨다.
박테리아 시스템에서, 발현시킬 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하거나 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에는, 예를 들어 용이하게 정제되는 융합 단백질 산물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 신규 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 예시적인 설명에 대해서는 실시예 1을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움, 및 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 속에 속하는 다양한 종을 비롯한 원핵 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다.
포유동물 발현 & 정제
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 그의 서열의 추가 설명에 대해서는, 예를 들어 U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 (Axel et al.) 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여한다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 표준 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에 제공된 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 그의 변이체를 발현시키는데 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 [예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 분비되도록 설계된다. 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리-공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, 또는 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 및 20]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는 또한 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이고, 여기서 숙주 세포는 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하고 항체 및 항원 결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 숙주 세포를 사용하여 상기 항체를 생산하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 숙주 세포, 및 적어도 95 중량% 동질성까지의 본 발명에 따른 항체의 정제에 의한 이들 항체의 생산이다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 의해 고려되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 투여하는 것을 수반한다. 본원에서 "치료 유효" 양은 단일 용량으로서 또는 다중 용량 요법에 따라, 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 - 대상체의 치료된 영역에서 TWEAKR 양성 세포의 증식을 감소시키거나 TWEAKR 발현 종양의 크기를 감소시키는데 충분한 양인 항체 또는 항원-결합 단편의 양으로서 정의되고, 이는 유해 상태의 완화로 이어지지만 이러한 양은 독성학상 허용된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 개, 원숭이 또는 다른 하등 영장류)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 넓은 패널의 세포주-유래 및 환자-유래 인간 종양 모델에서 강력한 항종양 효능을 갖는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편, 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다. 종양 모델은 786-O, A375, A253, SK-OV-3, WiDr, SW480, Co5682, NCI-H1975, NCI-H322, Lu7343 및 Lu7433 (추가의 상세사항은 실시예 8 참조), Co5676 및 Co 5841 (추가의 상세사항은 실시예 10 참조), SCaBER (추가의 상세사항은 실시예 11 참조) 및 SCC4 (추가의 상세사항은 실시예 12 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, TPP-2084 및 TPP-2090의 용량-의존적 효능이 인간 신세포암 모델 786-O에 대해 도 19에서 제시된다. 생체내 항종양 효능은 TPP-2090에 대해 예시적으로 도 20에서는 인간 결장암 이종이식편 WiDr에서, 도 21에서는 인간 폐암 이종이식편 NCI-H322에서 제시된다. 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 효능은 또한 SW480과 같은 다른 결장직장 종양 모델 및 환자-유래 종양 모델 Co5682에서 단독요법 및/또는 조합 요법으로 유사한 양호한 결과를 갖는 것으로 조사되었다 (표 29 참조). 추가의 종양 모델 786-O, A375, A253, SK-OV-3, Bx-PC3이 표 28에서 제시되고, NCI-H322, NCI-H1975, Lu7343, 및 Lu7433은 표 30에서 제시된다.
본 발명의 한 실시양태는 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 실시양태는 암의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 본 발명의 한 실시양태는 암의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 한 실시양태는 암의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에 항체는 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 세포독성제 또는 방사성동위원소에 접합시켜 효능을 잠재적으로 추가로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 단독 제약 작용제로서 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합되어 투여될 수 있고, 여기서 조합물은 어떠한 허용되지 않는 부작용도 유발하지 않는다. 이러한 조합 요법은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 1종 이상의 추가의 치료제를 함유하는 단일 제약 투여 제제의 투여, 뿐만 아니라 그 자체의 개별 제약 투여 제제 내의 본 발명의 항체 및 각각의 추가의 치료제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 치료제는 환자에게 단일 액체 조성물로 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제가 개별 투여 제제로 투여될 수 있다.
개별 투여 제제가 사용되는 경우에, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 1종 이상의 추가의 치료제는 본질적으로 동일한 시간에 (예를 들어, 병용), 또는 개별적으로 시차를 둔 시간에 (예를 들어, 순차적으로) 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 항체 치료가 이리노테칸, 레고라페닙, 파클리탁셀, PI3K-억제제 1, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 5-플루오르우라실 (5-FU), 겜시타빈 또는 세툭시맙과 조합되는 경우에 세포주-유래 및 환자-유래 인간 종양 모델에서 상승작용적 또는 상가적 효능을 갖는 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체와 이리노테칸, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 5-플루오르우라실 (5-FU), 레고라페닙 및 세툭시맙으로 이루어진 성분 군에 포함되는 추가의 활성 성분의 조합이다. 항체 TPP-2090과 이리노테칸, 시스플라틴, 5-플루오르우라실 (5-FU) 및 레고라페닙으로 이루어진 성분 군에 포함되는 추가의 활성 성분의 조합이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체와 이리노테칸, 옥살리플라틴, 5-플루오르우라실 (5-FU), 레고라페닙 및 세툭시맙으로 이루어진 성분 군에 포함되는 추가의 활성 성분의 조합이다. 결장직장암의 치료에 사용하기 위한 항체 TPP-2090과 이리노테칸, 5-플루오르우라실 (5-FU) 및 레고라페닙으로 이루어진 성분 군에 포함되는 추가의 활성 성분의 조합이 보다 더 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 결장직장암은 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체와 이리노테칸, 옥살리플라틴, 5-플루오르우라실 (5-FU), 레고라페닙, 또는 세툭시맙의 조합에 의해 치료된다. TPP-2090과 이리노테칸, 5-플루오르우라실 (5-FU) 또는 레고라페닙의 조합에 의한 결장직장암의 치료가 보다 더 바람직하다.
추가의 바람직한 실시양태는 방광암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체와 시스플라틴의 조합이다. 방광암의 치료에 사용하기 위한 항체 TPP-2090과 시스플라틴의 조합이 보다 더 바람직하다.
추가의 바람직한 실시양태는 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 항체 단편 또는 그의 변이체와 시스플라틴의 조합에 의한 방광암의 치료이다. 시스플라틴과 조합된 TPP-2090에 의한 방광암의 치료가 보다 더 바람직하다.
인간 결장암 이종이식편 WiDr에서, 예를 들어 TPP-2090이 이리노테칸 또는 레고라페닙과 조합된 경우에 분명한 긍정적 효과가 입증될 수 있다. 인간 폐암 이종이식편 NCI-H322 및 NCI-H1975에서, 예를 들어 TPP-2090이 파클리탁셀과 조합된 경우에 긍정적 효과가 입증될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 다른 항종양제, 예컨대 알킬화제, 항대사물, 식물-유래 항종양제, 호르몬 요법제, 토포이소머라제 억제제, 캄프토테신 유도체, 키나제 억제제, 표적화 약물, 항체, 인터페론 및/또는 생물학적 반응 조절제, 항혈관신생 화합물, 및 다른 항종양 약물과의 고정 또는 개별 조합되어 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 하기는 본 발명의 항체와 조합되어 사용될 수 있는 2차 작용제의 예의 비-제한적 목록이다:
알킬화제는 질소 머스타드 N-옥시드, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, 라니무스틴, 니무스틴, 테모졸로미드, 알트레타민, 아파지쿠온, 브로스탈리신, 벤다무스틴, 카르무스틴, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 글루포스파미드, 마포스파미드, 벤다무스틴 및 미토락톨을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 백금-배위 알킬화 화합물은 시스플라틴, 카르보플라틴, 엡타플라틴, 로바플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴 및 사트라플라틴을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
항대사물은 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린 리보시드, 메르캅토퓨린, 단독의 또는 류코보린과 조합된 5-플루오로우라실, 테가푸르, 독시플루리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 시타라빈 옥포스페이트, 에노시타빈, 겜시타빈, 플루다라빈, 5-아자시티딘, 카페시타빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 데시타빈, 에플로르니틴, 에티닐시티딘, 시토신 아라비노시드, 히드록시우레아, 멜팔란, 넬라라빈, 놀라트렉세드, 옥포스파이트, 이나트륨 프레메트렉세드, 펜토스타틴, 펠리트렉솔, 랄티트렉세드, 트리아핀, 트리메트렉세이트, 비다라빈, 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
호르몬 요법제는 엑세메스탄, 루프론, 아나스트로졸, 독세르칼시페롤, 파드로졸, 포르메스탄, 11-베타 히드록시스테로이드 데히드로게나제 1 억제제, 17-알파 히드록실라제/17,20 리아제 억제제, 예컨대 아비라테론 아세테이트, 5-알파 리덕타제 억제제, 예컨대 피나스테리드 및 에프리스테리드, 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜 시트레이트 및 풀베스트란트, 트렐스타, 토레미펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 레트로졸, 항안드로겐, 예컨대 비칼루타미드, 플루타미드, 미페프리스톤, 닐루타미드, 카소덱스 및 항프로게스테론 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
식물-유래 항종양 물질은, 예를 들어 유사분열 억제제, 예를 들어 에포틸론, 예컨대 사고필론, 익사베필론 및 에포틸론 B, 빈블라스틴, 빈플루닌, 도세탁셀 및 파클리탁셀로부터 선택된 것을 포함하고;
세포독성 토포이소머라제 억제제는 아클라루비신, 독소루비신, 아모나피드, 벨로테칸, 캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 디플로모테칸, 이리노테칸, 토포테칸, 에도테카린, 에핌비신, 에토포시드, 엑사테칸, 기마테칸, 루르토테칸, 미톡산트론, 피람비신, 픽산트론, 루비테칸, 소부족산, 타플루포시드 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
면역제제는 인터페론, 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마-1a 및 인터페론 감마-n1, 및 다른 면역 증진제, 예컨대 L19-IL2 및 다른 IL2 유도체, 필그라스팀, 렌티난, 시조필란, 테라시스, 우베니멕스, 알데스류킨, 알렘투주맙, BAM-002, 다카르바진, 다클리주맙, 데니류킨, 겜투주맙, 오조가미신, 이브리투모맙, 이미퀴모드, 레노그라스팀, 렌티난, 흑색종 백신 (코릭사(Corixa)), 몰그라모스팀, 사르그라모스팀, 타소네르민, 테크류킨, 티말라신, 토시투모맙, 빔리진, 에프라투주맙, 미투모맙, 오레고보맙, 펨투모맙, 및 프로벤지를 포함하고;
생물학적 반응 조절제는 살아있는 유기체의 방어 메카니즘 또는 조직 세포의 생물학적 반응, 예컨대 생존, 성장 또는 분화를 변형시켜 이들이 항종양 활성을 갖도록 지시하는 작용제이고; 이러한 작용제는, 예를 들어 크레스틴, 렌티난, 시조피란, 피시바닐, 프로뮨 및 우베니멕스를 포함하고;
항혈관신생 화합물은 아시트레틴, 아플리베르셉트, 안지오스타틴, 아플리딘, 아센타르, 악시티닙, 베바시주맙, 브리바닙 알라니네이트, 실렌그티드, 콤브레타스타틴, 엔도스타틴, 펜레티니드, 할로푸기논, 파조파닙, 라니비주맙, 레비마스타트, 레센틴, 레고라페닙, 리모밥, 레블리미드, 소라페닙, 스쿠알라민, 수니티닙, 텔라티닙, 탈리도미드, 우크라인, 바탈라닙 및 비탁신을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
항체는 트라스투주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 리툭시맙, 티실리무맙, 이필리무맙, 루밀릭시맙, 카투막소맙, 아타시셉트, 오레고보맙, 파니투무맙 및 알렘투주맙을 포함하나 이에 제한되지는 않고;
VEGF 억제제, 예컨대 예를 들어, 소라페닙, 레고라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 레센틴, 악시티닙, 아플리베르셉트, 텔라티닙, 브리바닙 알라니네이트, 바탈라닙, 파조파닙 및 라니비주맙;
EGFR (HER1) 억제제, 예컨대 예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 게피티닙, 에를로티닙 및 작티마;
HER2 억제제, 예컨대 예를 들어, 라파티닙, 트라투주맙 및 페르투주맙;
mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어, 템시롤리무스, 시롤리무스/라파마이신 및 에베롤리무스;
c-Met 억제제;
PI3K 억제제, 예컨대 PI3K 억제제 1 (2-아미노-N-[7-메톡시-8-(3-모르폴린-4-일프로폭시)-2,3-디히드로이미다조[1,2-c]퀴나졸린-5-일]피리미딘-5-카르복스아미드 디히드로클로라이드 (실시예 1 및 2 WO 2012/136553의 화합물 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)
및 AKT 억제제;
CDK 억제제, 예컨대 로스코비틴 및 플라보피리돌;
스핀들 어셈블리 체크포인트 억제제 및 표적화된 항유사분열제, 예컨대 PLK 억제제, 오로라 억제제 (예를 들어 헤스페라딘), 체크포인트 키나제 억제제 및 KSP 억제제;
HDAC 억제제, 예컨대 예를 들어, 파노비노스타트, 보리노스타트, MS275, 벨리노스타트 및 LBH589;
HSP90 및 HSP70 억제제;
프로테아솜 억제제, 예컨대 보르테조밉 및 카르필조밉;
MEK 억제제 및 Raf 억제제, 예컨대 소라페닙을 비롯한 세린/트레오닌 키나제 억제제;
파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 예를 들어, 티피파르닙;
예를 들어, 다사티닙, 닐로티빕, 레고라페닙, 보수티닙, 소라페닙, 베바시주맙, 수니티닙, 세디라닙, 악시티닙, 아플리베르셉트, 텔라티닙, 이마티닙 메실레이트, 브리바닙 알라니네이트, 파조파닙, 라니비주맙, 바탈라닙, 세툭시맙, 파니투무맙, 벡티빅스, 게피티닙, 에를로티닙, 라파티닙, 트라투주맙, 페르투주맙, 및 c-키트 억제제를 비롯한 티로신 키나제 억제제;
비타민 D 수용체 효능제;
Bcl-2 단백질 억제제, 예컨대 오바토클락스, 오블리메르센 소듐 및 고시폴;
분화 클러스터 20 수용체 길항제, 예컨대 예를 들어, 리툭시맙;
리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대 예를 들어, 겜시타빈;
종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드 수용체 1 효능제, 예컨대 예를 들어, 마파투무맙;
종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드 수용체 2 효능제, 예컨대 예를 들어, 렉사투무맙, 코나투무맙, CS-1008, PRO95780;
5-히드록시트립타민 수용체 길항제, 예컨대 예를 들어, rEV598, 크살리프로드, 팔로노세트론 히드로클로라이드, 그라니세트론, 진돌 및 AB-1001;
알파5-베타1 인테그린 억제제를 비롯한 인테그린 억제제, 예컨대 예를 들어, E7820, JSM 6425, 볼로식시맙 및 엔도스타틴;
예를 들어 난드롤론 데카노에이트, 플루옥시메스테론, 안드로이드, 프로스트-에이드, 안드로무스틴, 비칼루타미드, 플루타미드, 아포-시프로테론, 아포-플루타미드, 클로르마디논 아세테이트, 안드로큐어, 타비, 시프로테론 아세테이트 및 닐루타미드를 비롯한 안드로겐 수용체 길항제;
아로마타제 억제제, 예컨대 예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 테스토락톤, 엑세메스탄, 아미노글루테티미드 및 포르메스탄;
매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제;
예를 들어, 알리트레티노인, 앰플리겐, 아트라센탄 벡사로텐, 보르테조밉, 보센탄, 칼시트리올, 엑시술린드, 포테무스틴, 이반드론산, 밀테포신, 미톡산트론, I-아스파라기나제, 프로카르바진, 다카르바진, 히드록시카르바미드, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 타자로텐, 벨케이드, 질산갈륨, 칸포스파미드, 다리나파르신, 및 트레티노인을 비롯한 다른 항암제.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 화학요법 (즉, 세포독성제), 항호르몬 및/또는 표적화 요법, 예컨대 다른 키나제 억제제 (예를 들어, EGFR 억제제), mTOR 억제제 및 혈관신생 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 방사선 요법 및/또는 외과적 개입과 함께 암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 일부 경우에 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체를 상기 언급된 화합물에 제한되지 않는 임의의 것 또는 임의의 방사성동위원소에 접합시켜 효능을 잠재적으로 추가로 증가시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 그대로 또는 조성물로, 연구 및 진단학에서, 또는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 분석용 참조 표준물 등으로서 활용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이상 TWEAKR-신호전달을 갖는 다양한 상황, 예를 들어 세포 증식성 장애, 예컨대 암 또는 섬유화 질환에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체에 의한 치료에 특히 적합한 장애 및 상태는 고형 종양, 예컨대 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 안구, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암, 및 그의 원격 전이이다. 그러한 장애는 또한 림프종, 육종 및 백혈병을 포함한다.
소화관의 종양은 항문, 결장, 결장직장, 식도, 담낭, 위, 췌장, 직장, 소장 및 타액선 암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
식도암의 예는 식도 세포 암종 및 선암종, 뿐만 아니라 편평 세포 암종, 평활근육종, 악성 흑색종, 횡문근육종 및 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
위암의 예는 장형 및 미만형 위 선암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
췌장암의 예는 관 선암종, 선편평상피 암종 및 췌장 내분비 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
유방암의 예는 삼중 음성 유방암, 침습성 관 암종, 침습성 소엽성 암종, 관상피내 암종 및 상피내 소엽성 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
기도의 암의 예는 소세포 및 비소세포 폐 암종, 뿐만 아니라 기관지 선종 및 흉막폐 모세포종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
뇌암의 예는 뇌간 및 시상하부 신경교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종, 상의세포종, 뿐만 아니라 신경외배엽 및 송과체 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
남성 생식 기관의 종양은 전립선암 및 고환암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 여성 생식 기관의 종양은 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암 및 외음부암, 뿐만 아니라 자궁 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
난소암의 예는 혈청 종양, 자궁내막양 종양, 점액성 낭선암종, 과립막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양 및 남성배종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
자궁경부암의 예는 편평 세포 암종, 선암종, 선편평상피 암종, 소세포 암종, 신경내분비 종양, 유리질 세포 암종 및 융모선 선암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
요로의 종양은 방광, 음경, 신장, 신우, 요관, 요도, 및 유전성 및 산발성 유두상 신암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
신장암의 예는 신세포 암종, 요로상피 세포 암종, 사구체근접 세포 종양 (레닌종), 혈관근지방종, 신장 종양세포종, 벨리니관 암종, 신장의 투명-세포 육종, 중배엽성 신종 및 윌름스 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
방광암의 예는 이행 세포 암종, 편평 세포 암종, 선암종, 육종 및 소세포 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
안암은 안내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
간암의 예는 간세포성 암종 (섬유층판성 변이체를 갖거나 갖지 않는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 담관 암종), 및 혼합 간세포성 담관암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피부암은 편평 세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
두경부암은 두경부의 편평 세포암, 후두암, 하인두암, 비인두암, 구인두암, 타액선암, 구순암 및 구강암, 및 편평 세포암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
림프종은 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 버킷 림프종, 호지킨병, 및 중추 신경계의 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
육종은 연부 조직 육종, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 및 모발상 세포 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 암 질환의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 방법에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 암이 고형 암인 암 질환의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 방법에 적합하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 위암, 유방암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 자궁내막암, 식도암, 두경부암, 간세포성 암종, 흑색종 및 방광암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 방법에 적합하다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 방광암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 신장암, 흑색종, 난소암, 두경부암 및 췌장암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료 또는 진단을 위한 치료 또는 진단 방법에 적합하다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 방광암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 신장암, 흑색종, 난소암, 두경부암 및 췌장암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료를 위한 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.
보다 바람직한 실시양태는 방광암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 신장암, 흑색종, 난소암, 두경부암 및 췌장암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도이다.
보다 바람직한 실시양태는, 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 투여를 포함하는, 방광암, 결장직장암, 비소세포 폐암, 신장암, 흑색종, 난소암, 두경부암 및 췌장암으로 이루어진 군에 포함되는 암 질환의 치료를 위한 방법이다.
또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 섬유화 질환, 예컨대 폐포내 섬유증, 실리카-유발 폐 섬유증, 실험적 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 신섬유증, 뿐만 아니라 림프관평활근종증, 다낭성 난소 증후군, 여드름, 건선, 진주종, 진주종성 만성 중이염, 치주염, 일광 흑색점, 장 질환, 아테롬성동맥경화증 또는 자궁내막증과 같으나 이에 제한되지는 않는, TWEAKR가 관여하는 다양한 다른 장애에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다.
상기 언급된 장애는 인간에서 잘 특성화되어 있지만, 포유동물을 비롯한 다른 동물에서도 유사한 병인으로 또한 존재하고, 본 발명의 제약 조성물을 투여함으로써 치료될 수 있다.
임의의 상기 장애를 치료하기 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 1종 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상의 방식으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 이는 치료할 장애의 유형에 따라 달라질 수 있다. 가능한 투여 경로는 비경구 (예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하) 투여, 폐내 투여 및 비강내 투여를 포함하고, 국부 면역억제 치료가 바람직한 경우에, 병변내 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는, 예를 들어 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로는 투여가 단기적인지 또는 장기적인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 투여할 양은 다양한 인자, 예컨대 임상 증상, 개체의 체중, 다른 약물이 투여되는지 여부에 의존할 것이다. 통상의 기술자는 투여 경로가 치료할 장애 또는 상태에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다.
본 발명의 신규 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체의 치료 유효량을 결정하는 것은, 주로 특정한 환자 특성, 투여 경로, 및 치료할 장애의 속성에 의존할 것이다. 일반적인 지침은, 예를 들어, 국제 조화 회의의 간행물 및 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)]에서 찾아볼 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량을 결정하는 것은 의약의 독성 및 효능과 같은 인자에 의존할 것이다. 독성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 상기 참고문헌에서 찾아볼 수 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 효능은 하기 실시예에 기재된 방법과 함께 동일한 지침을 활용하여 결정될 수 있다.
진단 방법
항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TWEAKR-발현 종양의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 혈청 및 조직 생검 시편을 비롯한 다양한 생물학적 샘플 내의 TWEAKR-함유 세포 또는 쉐딩된 TWEAKR의 존재는 항-TWEAKR 항체에 의해 검출될 수 있다. 또한, 항-TWEAKR 항체는 99Tc (또는 다른 동위원소) 접합된 항체를 사용하는 면역섬광조영과 같은 다양한 영상화 방법론에 사용될 수 있다. 예를 들어, 111In 접합된 항-PSMA 항체를 사용하여 기재된 것과 유사한 영상화 프로토콜을 사용하여 췌장 또는 난소 암종을 검출할 수 있다 (Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997). 사용될 수 있는 또 다른 검출 방법은 본 발명의 항체를 적합한 동위원소와 접합시키는 것에 의한 양전자 방출 단층촬영이다 (문헌 [Herzog et al., J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993] 참조).
제약 조성물 및 투여
본 발명의 한 실시양태는 염수, 완충 염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체 중에서 투여될 수 있는, 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 단독으로 또는 적어도 1종의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합하여 포함하는 제약 조성물이다. 추가 실시양태는 TWEAKR 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 TWEAKR 관련 질환, 예컨대 암을 치료하는데 적합한 추가의 제약 활성 화합물을 포함하는 제약 조성물이다. 임의의 이들 분자는 환자에게 단독으로, 또는 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합된 제약 조성물 중에서 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
본 발명은 또한 제약 조성물의 투여에 관한 것이다. 이러한 투여는 경구로 또는 비경구로 달성된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내 (종양에 직접), 근육내, 피하, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 이들 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제 내로의 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가의 상세사항은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 찾아볼 수 있다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분은 전혀 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
경구 투여를 위한 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체를 경구 투여에 적합한 투여량으로 사용하여 제제화할 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화될 수 있게 한다.
경구 사용을 위한 제약 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후에 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하는 것을 통해 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당; 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로스, 예컨대 메틸-셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스; 및 아라비아 검 및 트라가칸트를 비롯한 검; 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐이다. 원하는 경우에, 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.
당의정 코어는 농축된 당 용액과 같은 적합한 코팅에 의해 제공될 수 있고, 이는 또한 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 제품 확인을 위해, 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특성화하기 위해 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸시-피트 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 연질 밀봉 캡슐, 및 코팅, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨을 포함한다. 푸시-피트 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 안정화제의 존재 또는 부재 하에 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제제는 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 제약 조성물은 수용액 중에, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 생리학상 완충 염수 중에 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드 또는 리포솜을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하게 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
국소 또는 비강 투여를 위해, 침투시킬 특정한 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.
키트
본 발명은 추가로 상기 언급된 본 발명의 조성물의 성분 중 1종 이상이 충전된 1개 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트에 관한 것이다. 이러한 용기(들)와 함께, 인간 투여를 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관에 의한 승인을 반영하는, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 있을 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는 이들 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현에 적합한 플라스미드 내에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서의 DNA의 발현을 조절하기 위한 프로모터 (종종 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 다양한 항체를 생산하기 위해 다른 DNA 서열의 플라스미드 내로의 삽입을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 코딩된 단백질의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위한 다수의 다른 요소를 함유할 수 있다. 이러한 요소는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 선택 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 포함한다.
제조 및 저장
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 이는 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 산에 의해 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에서 보다 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 사용 전에 완충제와 조합되는, pH 범위 4.5 내지 5.5의 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 2%-7% 만니톨 중의 동결건조 분말일 수 있다.
허용되는 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제조한 후에, 이를 적절한 용기에 넣고, 지시된 상태의 치료에 대한 라벨을 붙일 수 있다. 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 대해, 이러한 라벨은 투여량, 투여 빈도 및 방법을 포함할 것이다.
치료 유효 용량.
본 발명에 사용하는데 적합한 제약 조성물은 의도된 목적, 즉 TWEAKR 발현을 특징으로 하는 특정한 질환 상태의 치료를 달성하기 위해 활성 성분을 유효량으로 함유하는 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 충분히 통상의 기술자의 능력 내에 있다.
임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량은 먼저 세포 배양 검정, 예를 들어 신생물성 세포에서, 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 추정될 수 있다. 또한, 동물 모델은 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용된다. 이어서, 이러한 정보를 사용하여 인간에서의 투여에 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
치료 유효 용량은 증상 또는 상태를 개선시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50%에 치사성인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이고, 이는 비, ED50/LD50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간 사용을 위한 투여량의 범위를 제제화하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 이러한 범위 내에서, 사용되는 투여 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 달라진다.
정확한 투여량은 치료할 환자를 고려하여 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 목적 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가의 인자는 질환 상태의 중증도, 예를 들어 종양 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 감수성, 및 요법에 대한 허용성/반응을 포함한다. 장기 작용 제약 조성물은 특정한 제제의 반감기 및 클리어런스율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 2주마다 1회, 또는 3주마다 1회 투여될 수 있다.
통상의 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 마이크로그램, 최대 약 2 g의 총 용량으로 달라질 수 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌에 제공되어 있다. 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조한다. 통상의 기술자는 단백질 또는 그의 억제제의 경우와 달리 폴리뉴클레오티드의 경우에는 상이한 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정한 세포, 상태, 위치 등에 특이적일 것이다. 방사성표지된 항체에 대한 바람직한 특이적 활성은 0.1 내지 10 mCi/mg의 단백질 범위일 수 있다 (Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275-3280, 1999; Ulaner et al., 2008 Radiology 246(3):895-902).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 다음과 같다:
1. TWEAKR (서열 169)의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하는 단리된 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
2. 제1 실시양태에 있어서, TWEAKR (서열 169)의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체가 TPP-2203과 비교하여 TPP-2614에 대한 그의 ELISA 신호를 80% 초과하여 상실한 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 제1 실시양태 또는 제2 실시양태에 있어서, 효능작용적 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제1 실시양태 내지 제3 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
(a) 식 PYPMX (서열 171)를 포함하며, 여기서 X는 I 또는 M인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR1;
(b) 식 YISPSGGXTHYADSVKG (서열 172)를 포함하며, 여기서 X는 S 또는 K인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR2; 및
(c) 식 GGDTYFDYFDY (서열 173)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR3
을 포함하는 가변 중쇄
및
(a) 식 RASQSISXYLN (서열 174)을 포함하며, 여기서 X는 G 또는 S인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR1;
(b) 식 XASSLQS (서열 175)를 포함하며, 여기서 X는 Q, A, 또는 N인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR2; 및
(c) 식 QQSYXXPXIT (서열 176)를 포함하며, 여기서 위치 5의 X는 T 또는 S이고, 위치 6의 X는 T 또는 S이고, 위치 8의 X는 G 또는 F인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR3
을 포함하는 가변 경쇄.
5. 제1 실시양태 내지 제4 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
a. 서열 6에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 7에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 8에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 3에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 4에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 5에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
b. 서열 16에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 17에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 18에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 13에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 14에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 15에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
c. 서열 26에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 27에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 28에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 23에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 24에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 25에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
d. 서열 36에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 37에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 38에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 33에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 34에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 35에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
e. 서열 46에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 47에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 48에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 43에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 44에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 45에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
f. 서열 56에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 57에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 58에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 53에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 54에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 55에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
g. 서열 66에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 67에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 68에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 63에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 64에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 65에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
h. 서열 76에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 77에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 78에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 73에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 74에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 75에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
i. 서열 86에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 87에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 88에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 83에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 84에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 85에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
j. 서열 96에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 97에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 98에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 93에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 94에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 95에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
k. 서열 106에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 107에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 108에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 103에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 104에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 105에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
l. 서열 116에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 117에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 118에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
서열 113에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 114에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 115에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄.
6. 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
a. 서열 10에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 9에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
b. 서열 20에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 19에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
c. 서열 30에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 29에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
d. 서열 40에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 39에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
e. 서열 50에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 49에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
f. 서열 60에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 59에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
g. 서열 70에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 69에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
h. 서열 80에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 79에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
i. 서열 90에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 89에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
j. 서열 100에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 99에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
k. 서열 110에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 109에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
l. 서열 120에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 119에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열.
7. 제1 실시양태 내지 제6 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, IgG 항체인 항체.
8. 제1 실시양태 내지 제7 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
a. 서열 2에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 1에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
b. 서열 12에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 11에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
c. 서열 22에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 21에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
d. 서열 32에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 31에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
e. 서열 42에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 41에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
f. 서열 52에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 51에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
g. 서열 62에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 61에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
h. 서열 72에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 71에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
i. 서열 82에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 81에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
j. 서열 92에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 91에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
k. 서열 102에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 101에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
l. 서열 112에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 111에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
m. 서열 213에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 1에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열.
9. 제1 실시양태 내지 제8 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
10. 제1 실시양태 내지 제9 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
11. 제1 실시양태 내지 제10 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
12. 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
13. 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
14. 제13 실시양태에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
15. 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나 제13 실시양태에 따른 핵산 또는 제14 실시양태에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
16. 제15 실시양태에 있어서, 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
17. 제16 실시양태에 따른 세포의 배양 및 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
18. 제1 실시양태 내지 제12 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체.
19. 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 진단제로서 사용하기 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
20. 제1 실시양태 내지 제12 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항체-약물 접합체.
21. 제1 실시양태 내지 제11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제12 실시양태에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
22. 제21 실시양태에 따른 제약 조성물 및 1종 이상의 치료 활성 화합물의 조합물.
23. 바람직하지 않은 TWEAKR의 존재와 연관된 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제21 실시양태에 따른 제약 조성물 또는 제22 실시양태에 따른 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다. 실시예는 단지 구체적 실시양태를 참조함으로써 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 이들 예시는 본 발명의 특정의 구체적 측면을 예시하지만, 개시된 발명의 제한을 나타내거나 그의 범위를 국한시키지 않는다.
상세하게 달리 기재된 경우를 제외하고는, 모든 실시예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 상용되는 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예의 상용 분자 생물학 기술은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
실시예 1: 다이액스(Dyax) 항체 라이브러리로부터의 항체 생성
완전 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리 (Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)를 사용하여 고정된 표적으로서 인간 및 뮤린 TWEAKR의 이량체성 Fc-융합 세포외 도메인에 의한 단백질 패닝 (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3):1105-16)에 의해 본 발명의 TWEAKR-특이적, 인간 모노클로날 항체를 단리하였다.
<표 1> 항체 선택에 사용된 재조합 항원의 목록
Figure pct00007
항원을 대략 2-배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스(Pierce); 카탈로그 번호 21347)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 비오티닐화하고, 제바(Zeba) 탈염 칼럼 (피어스; 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 탈염시켰다. 세척된 자기 비드 (디나비즈(Dynabeads))를 200 nM의 비오티닐화 인간 항원과 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 차단 완충제 (3% BSA, 0.05% 트윈(Tween)-20 함유 PBS)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단된 Fab-파지 라이브러리를 차단된 TWEAKR-비드 (디나비즈 스트렙타비딘 M280 - 인비트로젠(Invitrogen) 112-06D)에 첨가하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 엄격한 세척 (차단 완충제 중 3 x 및 0.05% 트윈-20 함유 PBS (150 mM NaCl; 8 mM Na2HPO4; 1.5 mM KH2PO4; pH = 7.4-7.6으로 조정됨) 중 9 x) 후에, 비오티닐화 TWEAKR-비드 (디나비즈 스트렙타비딘 M280 - 인비트로젠 112-06D)에 특이적으로 결합한 Fab-파지를 PBS 중에 재현탁시키고, 증폭을 위해 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 TG1의 감염에 직접 사용하였다. 선택 라운드 2에서 뮤린 TWEAKR (200nM)을 사용하여 교차-반응성 결합제를 선택하고, 선택 라운드 3에서 인간 TWEAKR의 농도를 감소시켜 (100nM) 고친화도 결합제에 대한 선택 압력을 증대시켰다.
11종의 상이한 Fab-파지를 확인하고, 상응하는 항체를 가용성 Fab에는 존재하지 않는 누락 CH2-CH3 도메인을 제공하는 포유동물 IgG 발현 벡터 내로 재-클로닝시켰다. 생성된 IgG를 문헌 [Tom et al., Chapter 12 in Methods Express: Expression Systems edited by Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007]에 기재된 바와 같이 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 간략하게, CMV-프로모터 기반 발현 플라스미드를 HEK293-6E 세포 내로 형질감염시키고, 페른바흐(Fernbach)-플라스크 또는 웨이브-백(Wave-Bag) 내에서 인큐베이션하였다. 발현은 F17 배지 (인비트로젠) 중에서 37℃에서 5 내지 6일 동안 행하였다. 형질감염 24시간 후에 1% 울트라-로우(Ultra-Low) IgG FCS (인비트로젠) 및 0.5 mM 발프로산 (시그마(Sigma))을 보충하였다. 항체를 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA 및 비아코어 분석에서 가용성 단량체성 TWEAKR에 대한 그의 결합 친화도에 의해 추가로 특성화하였다.
<표 2> 친화도 측정에 사용된 재조합 항원의 목록
Figure pct00008
항-TWEAKR 항체의 세포 결합 특성을 결정하기 위해, 유동 세포측정법에 의해 한 패널의 세포주 (HT29, HS68, HS578)에 대한 결합을 시험하였다. 세포를 FACS 완충제 중 항체 희석물 (5μg/ml)에 현탁시키고, 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 2차 항체 (PE 염소 항-인간 IgG, 디아노바(Dianova) #109-115-098)를 첨가하였다. 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 FACS-어레이 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 세포를 분석하였다.
NF-카파B 리포터 유전자 검정을 수행하여 모든 11종의 확인된 항체 (인간 IgG1)의 효능작용적 활성을 평가하였다. 293펙틴을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 HEK293 세포를 NF-카파B 리포터 구축물 (바이오카트(BioCat), 카탈로그 번호 LR-0051-PA)로 일시적으로 형질감염시켰다. 백색 폴리-리신 코팅된 384웰 플레이트 (BD)를 F17 배지 (혈청-무함유; 인비트로젠) 중 형질감염된 세포로 37℃, 5% CO2에서 시딩하였다. 다음날 세포를 6시간 동안 다양한 농도의 정제된 항체로 자극하고, 이어서 표준 절차에 따라 루시페라제 검정을 수행하였다.
내재화에 이어 항-TWEAKR 항체가 형광 표지되었다 (CypHer 5E 모노 NHS 에스테르; 지이 헬스케어). 처리 전에 HT29 세포 (2 x 104/웰)를 96-MTP 플레이트 (편평, 흑색, 투명 바닥 No 4308776, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 100 μl 배지 중에 시딩하였다. 37℃ / 5% CO2에서 18시간 인큐베이션 후에, 배지 (표 번호 21)를 바꾸고, 표지된 항-TWEAKR 항체를 다양한 농도 (10, 5, 2.5, 1, 0.1 μg/ml)로 첨가하였다. 선택된 인큐베이션 시간은 0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6 및 24시간이었다. 형광 측정은 인셀 애널라이저 1000 (지이 헬스케어)을 사용하여 수행하였다.
가장 강력한 시험관내 효능을 갖는 항체 (TPP-883)를 추가의 효력 및 친화도 성숙을 위해 선택하였다.
TPP-883
Figure pct00009
TPP-883의 경쇄 (서열 71) 및 중쇄 (서열 72)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
제1 돌연변이 수집 라운드에 의해 성숙을 행한 다음, 가장 친화도- 및 효력-증가 아미노산 변화의 재조합을 행하였다. 돌연변이 수집을 위해, NNK (N = AGCT, K = G 또는 T) 코돈-다양화를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 부위 지정 돌연변이유발에 의해 하기 개별 아미노산 위치에서 NNK 무작위화를 생성하였다 (연속 아미노산 명명, 도 25에서 비교함): CDR-L1에서 S35, S36, Y37 및 N39; CDR-L2에서 A51, S53, S54, Q56 및 S57; CDR-L3에서 S92, Y93, S94, S95, G97 및 I98; CDR-H1에서 P31, Y32, P33, M34 및 M35; CDR-H2에서 Y50, S52, P53, S54, G56, K57 및 H59; CDR-H3에서 G99, G100, D101, G102, Y103, F104, D105 및 Y106. 모든 단일 NNK 포화 돌연변이유발 라이브러리의 DNA를 각각, 효력 성숙을 위해 포유동물 IgG 발현 벡터에, 그리고 친화도 성숙을 위해 파지미드 벡터에 재-클로닝시켰다. 친화도 성숙은 파지 패닝에 의해 행하였다. 세척된 자기 비드 (디나비즈)를 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM의 비오티닐화 인간 항원과 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 차단 완충제 (3% BSA, 0.05% 트윈-20 함유 PBS)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 차단시켰다. 차단된 Fab-파지 라이브러리를 이론적 라이브러리 복잡도와 비교하여 10000-배, 1000-배 및 100-배 과량으로 차단된 TWEAKR-디나비즈에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이에 따라 총, 12종의 전략이 이어졌다 (4종의 항원 농도 x 3종의 Fab-파지 역가). 엄격한 세척 (차단 완충제 중 3 x 및 0.05% 트윈-20 함유 PBS 중 9 x) 후에, 비오티닐화 TWEAKR-디나비즈 (디나비즈 스트렙타비딘 M280 - 인비트로젠 112-06D)에 특이적으로 결합한 Fab-파지를 PBS 중에 재현탁시키고, 증폭을 위해 에스케리키아 콜라이 균주 TG1의 감염에 직접 사용하였다. 선택 라운드 2에서 인간 TWEAKR-Fc의 농도를 감소시키고 (1 nM, 100 pM, 10 pM 및 1 pM), 모든 12종의 전략에 대해 동일한 Fab-파지 역가를 사용하였다 (4.4 x 1011). 가용성 Fab 발현을 위해, 파지미드 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 MluI로 소화시켜 파지 상에서의 Fab 디스플레이를 위해 요구되는 유전자III 막 앵커 서열을 제거하고 재라이게이션시켰다. 12종의 선택 풀의 각각의 96종의 변이체가 가용성 Fab로서 발현되었고, ELISA 포맷으로 시험하였다. 따라서, 2.5 nM 비오티닐화 TWEAKR-Fc 항원을 코팅하고, 가용성 Fab의 결합을 항-c-Myc 항체 (압캠(Abcam) ab62928)에 의해 검출하였다. 7종의 단일 치환 변이체 (연속 아미노산 명명, 도 25에서 비교함)가 TWEAKR-Fc (서열 138)에 대해 개선된 결합을 갖는 것으로 검출되었다: CDR-L1의 S36G, CDR-L2의 A51Q 및 S57K, CDR-L3의 S94T 및 G97F, CDR-H1의 M35I 및 CDR-H3의 G102T. 효력 성숙을 위해, HEK293 세포를 NF-카파B 리포터 (바이오카트, 카탈로그 번호 LR-0051-PA)로 형질감염시켰다. 백색 폴리-리신 코팅된 384웰 플레이트 (BD)를 F17 배지 (혈청-무함유; 인비트로젠) 중 형질감염된 세포로 시딩하고, NNK-다양화 위치 항체 (인간 IgG1) 라이브러리의 개개의 변이체를 포유동물 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 다음날, NF-카파B 리포터 세포를 발현된 단일 NNK 돌연변이유발 항체 변이체로 6시간 동안 자극한 다음, 표준 절차에 따라 루시페라제 검정을 수행하였다. 1개의 단일 치환 변이체가 개선된 효능작용적 활성을 갖는 것으로 검출되었다: CDR-H3의 G102T. 이 변이체는 또한 친화도 성숙에서도 수득되었고, 가장 큰 친화도 증진을 또한 나타내었다. 친화도 및 효력 스크리닝에 의한 돌연변이 수집 후에, 모든 7종의 유익한 단일 치환을 1개의 재조합 라이브러리에서 재조합시켰다 (라이브러리 복잡도: 128 변이체). 이를 위해, 각각의 선택된 위치에 선택된 돌연변이 또는 상응하는 야생형 아미노산이 도입되도록 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 라이브러리 구축은 순차적 라운드의 중복 연장 PCR을 사용하여 수행하였다. 최종 PCR 산물을 박테리아 가용성 Fab 발현 벡터 내로 라이게이션하고, 앞서 기재된 바와 같은 가용성 Fab와의 평형 ELISA 스크리닝을 위해 528종의 변이체를 무작위 선택하였다 (~ 4배 과다샘플링). 마지막으로, 최고의 단일 치환 변이체, G102T와 비교하여 증진된 친화도를 기초로 하여 7종의 변이체를 선택하였다. 이들의 상응하는 DNA를 포유동물 IgG 발현 벡터 내에 재클로닝시키고, 상기 언급된 NF-카파B 리포터 세포 검정에서 기능적 활성에 대해 시험하였다. 마지막으로, 수득된 서열을 인간 배선 서열과 비교하고, 친화도 및 효능에 유의한 영향 없이 편차를 조정하였다. 항체 라이브러리 스크리닝 및 친화도 및/또는 효력 성숙에 의해 하기 서열을 갖는 항체를 수득하였다:
TPP-2090
Figure pct00010
TPP-2090의 경쇄 (서열 1) 및 중쇄 (서열 2)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-2149
Figure pct00011
TPP-2149의 경쇄 (서열 11) 및 중쇄 (서열 12)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-2093
Figure pct00012
TPP-2093의 경쇄 (서열 21) 및 중쇄 (서열 22)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-2148
Figure pct00013
TPP-2148의 경쇄 (서열 31) 및 중쇄 (서열 32)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-2084
Figure pct00014
TPP-2084의 경쇄 (서열 41) 및 중쇄 (서열 42)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-2077
Figure pct00015
TPP-2077의 경쇄 (서열 51) 및 중쇄 (서열 52)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-1538
Figure pct00016
TPP-1538의 경쇄 (서열 61) 및 중쇄 (서열 62)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-1854
Figure pct00017
TPP-1854의 경쇄 (서열 81) 및 중쇄 (서열 82)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-1853
Figure pct00018
TPP-1853의 경쇄 (서열 91) 및 중쇄 (서열 92)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-1857
Figure pct00019
TPP-1857의 경쇄 (서열 101) 및 중쇄 (서열 102)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
TPP-1858
Figure pct00020
TPP-1858의 경쇄 (서열 111) 및 중쇄 (서열 112)의 아미노산 서열; 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR을 밑줄로 표시한다.
실시예 2: 항체의 생화학적 특성
비아코어 분석에 의한 결합 친화도의 결정:
항-TWEAKR 항체의 결합 친화도를 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 상에서 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정하였다. 항체를 간접 포획 시약인 항-인간 IgG(Fc)를 통해 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. "인간 항체 포획 키트" (BR-1008-39, 지이 헬스케어 비아코어, 인크.)로부터의 시약을 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 사용하였다. 항-TWEAKR 항체를 10초 동안 10μl/분으로 10μg/ml의 농도로 주입하였다.
<표 3> 친화도 측정에 사용된 재조합 항원 (TWEAKR)의 목록
Figure pct00021
<표 4> 친화도 측정에 사용된 항체의 목록
Figure pct00022
<표 5> 친화도 측정에 사용된 상업적으로 입수가능한 항체의 목록
Figure pct00023
다양한 농도 (200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.12 nM, 1.56nM)의 정제된 재조합 인간 TWEAKR 단백질 (TPP-2305, 서열 168)을 HEPES-EP 완충제 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 중 고정된 항-TWEAKR 항체 상에 60 μl/분의 유량으로 3분 동안 주입하고, 5분 동안 해리되게 하였다. 인-라인 참조 셀 보정에 이어 완충제 샘플 차감 후에 센소그램을 생성하였다. 해리 평형 상수 (KD)는 1차 1:1 결합 모델로 센소그램을 피팅시킴으로써 수득된 회합 (kon) 및 해리 속도 (koff) 상수의 비를 기반으로 하여 계산하였다.
<표 6> TWEAKR 단백질 (TPP-2305 (서열 168))과의 비아코어에 의해 측정된 항-TWEAKR 항체의 1가 KD 값.
Figure pct00024
본 발명의 항체는 TWEAKR에 중간 정도의 친화도 (KD 10 - 200 nM)로 결합하는 반면에, 비교를 위해 사용된 일부 항체 (예를 들어 PDL-192(TPP-1104), 136.1(TPP-2194), 18.3.3(TPP-2193), P4A8(TPP-1324), P3G5(TPP-2195), P2D3(TPP-2196), ITEM-1, ITEM-4)는 높은 친화도 결합 (0.7 - 3.7 nM)을 나타내는 것으로 결정되었다. 특허 WO2009/020933 및 WO2009/140177로부터 항체 PDL-192, 136.1, 18.3.3, P4A8, P3G5 및 P2D3의 가변 도메인의 서열을 수득하고, 인간 IgG1 및 뮤린 IgG2의 불변 영역을 코딩하는 서열을 첨가하여, 전장 IgG PDL-192(TPP-1104), 136.1(TPP-2194), 18.3.3(TPP-2193), P4A8(TPP-1324), P3G5(TPP-2195), P2D3(TPP-2196)을 생성하였다. 다른 이전에 기재된 항체에 대해 이러한 연구에서 측정된 친화도의 범위는 공개된 데이터와 잘 일치한다: PDL-192, 18.3.3 및 136.1의 경우에, KD 값은 5.5, 0.2 및 0.7 nM으로 공개되어 있고 (WO2009/020933); P4A8의 경우에는 2.6 nM으로 공개되어 있다 (WO2009/140177). 비교를 위해, 천연 리간드 TWEAK는 TWEAKR에 0.8 - 2.4 nM의 KD 값으로 결합한다 (Immunity. 2001 Nov;15(5):837-46; Biochem J. 2006 Jul 15;397(2):297-304; Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Apr 1;23(4):594-600).
그 결과, 본 발명의 항체 (TPP-883, TPP-1538, TPP-2077, TPP-2084, TPP-2148, TPP-2093, TPP-2149 및 TPP-2090)는 TWEAKR에 중간 정도의 친화도 (KD 10 - 200 nM)로 결합한다.
비아코어 분석에 의한 종 교차 반응성의 분석:
종 교차 반응성의 분석을 위해, 인간, 래트, 뮤린, 개, 돼지 및 마카카 파시쿨라리스 TWEAKR을 인간 Fc 단편 융합 단백질로서 발현 및 정제하고, 표준 EDC/NHS-매개 화학 (BR-1006-33, 지이 헬스케어 비아코어, 인크.)을 통한 아민 커플링을 사용하여 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다.
<표 7> 종간 결합제를 프로파일링하기 위한 ELISA에 사용된 재조합 단백질의 목록
Figure pct00025
다양한 농도 (200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.12 nM, 1.56 nM)의 항-TWEAKR 항체를 HEPES-EP 완충제 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 중 고정된 TWEAKR 종 상에 60 μl/분의 유량으로 3분 동안 주입하고, 5분 동안 해리되게 하였다. 인-라인 참조 셀 보정에 이어 완충제 샘플 차감 후에 센소그램을 생성하였다. 해리 평형 상수 (KD)는 비아밸류에이션(Biavaluation) 소프트웨어 (버전 4.0)를 사용하여 2가 분석물 모델로 센소그램을 피팅시킴으로써 수득된 회합 (kon1) 및 해리 속도 (koff1) 상수의 비를 기반으로 하여 계산하였다. 항-TWEAKR 항체의 종 교차 반응성은 고정된 2가 항원과의 "결합력 모드"로 결정하였고, 이는 "절대" KD 값은 제공하지 않지만 양호한 비교 데이터를 제시하였다.
<표 8> 비아코어에 의해 측정된 다양한 종에 대한 항-TWEAKR 항체의 KD 값 (nM)
Figure pct00026
그 결과, 본 발명의 항체 (TPP-1538, TPP-2077, TPP-2084 및 TPP-2090)는 모든 시험된 종 (인간, 래트, 뮤린, 개, 돼지 및 마카카 파시쿨라리스 TWEAKR)에 대해 친화도를 나타내었다.
TWEAKR 엑토도메인의 N- 및 C-말단 절단 변이체에 의한 TPP-2090의 결합 에피토프의 특성화:
다양한 종의 TWEAKR 시스테인 풍부 도메인 (aa 34-68)의 정렬 (도 1)은 모든 6종의 분석된 종에 걸쳐 그것이 잘 보존되어 있음을 보여준다. PDL-192는 R56에 의존하여 결합하고 (WO2009/020933: 도 2B), 따라서 래트, 돼지 및 마우스 TWEAKR에는 결합하지 않는다. TPP-2090은 보존된 아미노산 D47에 의존하여 결합하고, 따라서 모든 도시된 종에 결합한다.
상기 언급된 항체의 결합 에피토프를 특성화하기 위한 제1 접근법으로, TWEAKR 엑토도메인의 N- 및 C-말단 절단 돌연변이체를 생성하고, 다양한 항-TWEAKR 항체에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. N-말단의 아미노산 28 내지 33 및 C-말단의 아미노산 69 내지 80을 결실시켜, Cys36-Cys49, Cys52-Cys67 및 Cys55-Cys64 사이에 디술피드 가교를 갖는 시스테인 풍부 도메인은 무손상으로 유지시켰다 (도 2에서 비교함). 둘 다의 구축물, N- 및 C-말단을 포함하는 전장 엑토도메인 28-80 및 말단절단된 엑토도메인 34-68을 Fc 융합 단백질 TPP-2202 및 TPP-2203으로서 각각 발현 및 정제하였다.
결합을 분석하기 위해, 1 μg/ml의 각각의 이량체성 TWEAKR-Fc 구축물을 코팅하고, 0.3 μg/ml 및 0.08 μg/ml의 비오티닐화 IgG를 가용성 결합 파트너로서 사용하였다. 검출은 스트렙타비딘-HRP 및 암플렉스-레드 기질을 사용하여 행하였다. IgG를 대략 2-배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스; 카탈로그 번호 21347)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 비오티닐화하고, 제바 탈염 칼럼 (피어스; 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 탈염시켰다. 가용성 리간드의 모든 적용된 농도에서, 본 발명의 항체는 둘 다의 구축물에 대해 포화 결합을 나타낸 반면에, 항체 P4A8(TPP-1324), P3G5(TPP-2195) 및 ITEM-4는 전장 엑토도메인에 대해서만 포화 결합을 나타내고 N- 및 C-말단 절단된 구축물에 대해서는 손상된 결합을 나타내었다 (도 3 & 도 4). 이는 본 발명의 항체의 결합 에피토프가 아미노산 34-68 사이의 시스테인 풍부 도메인 내에 위치함을 나타낸다. P4A8(TPP-1324) 및 P3G5(TPP-2195) 결합을 위해 TWEAKR 엑토도메인의 N-말단 또는 C-말단이 필요한지 여부를 분석하기 위해, 아미노산 69 내지 80의 C-말단 결실을 갖는 단량체성 엑토도메인을 생성하였다. C-말단 절단된 TWEAKR 엑토도메인에 대한 P4A8(TPP-1324) 및 P3G5(TPP-2195)의 결합이 또한 손상된 반면에, 본 발명의 항체는 포화 결합을 나타내었다 (도 5).
<표 9> 에피토프 프로파일링을 위한 ELISA 분석에 사용된 재조합 항원의 목록
Figure pct00027
<표 10> 에피토프 프로파일링을 위한 ELISA 분석에 사용된 항체의 목록
Figure pct00028
따라서, TPP-2090, TPP-2084, PDL-192(TPP-1104) 및 136.1(TPP-2194)의 결합 에피토프는 시스테인 풍부 도메인 내에 위치하고, P4A8(TPP-1324) 및 P3G5(TPP-2195)의 결합 에피토프는 적어도 부분적으로 시스테인 풍부 도메인의 외부에 위치한다.
항체 친화도에 대한 TWEAKR-Fc 뮤테인의 효과:
본 발명의 항체의 결합 특성을 보다 상세하게 정의하기 위해, 공지된 효능작용적 항체의 결합에 관련이 있는 것으로 제안되는 TWEAKR의 특정 뮤테인을 시험하였다 (WO2009/140177). 따라서, 하기 단일 아미노산 치환을 갖는 전장 엑토도메인 (아미노산 28-80)을 Fc 융합 단백질로서 발현 및 정제하였다: T33Q; S40R; W42A; M50A; R56P; H60K; L65Q.
<표 11> 뮤테인 결합에 대한 ELISA 분석에 사용된 재조합 단백질의 목록
Figure pct00029
용량-반응 데이터를 수집하기 위해, 다양한 TWEAKR-Fc 뮤테인을 384-웰 맥시소르브(Maxisorb) ELISA 플레이트에 저농도 (62 ng/ml)로 코팅하고, 100 nM의 농도에서 시작하는 비오티닐화 IgG의 연속 2배 희석물을 가용성 결합 파트너로서 사용하였다. 스트렙타비딘-HRP 및 암플렉스 레드를 사용하여 검출을 행하였다. 시험된 IgG는 본 발명의 TPP-2090 및 TPP-2084, WO2009/020933으로부터의 PDL-192, 136.1 및 18.3.3, WO2009/140177로부터의 P4A8 및 P3G5, 및 문헌 [Nakayama et al. [Biochem Biophys Res Com 306: 819-825]]으로부터의 ITEM-1 및 ITEM-4였다.
<표 12> 뮤테인 결합에 대한 ELISA 분석에 사용된 항체의 목록
Figure pct00030
<표 13> 뮤테인 결합에 대한 ELISA에 사용된 상업적으로 입수가능한 항체의 목록
Figure pct00031
IgG를 대략 2-배 몰 과량의 비오틴-LC-NHS (피어스; 카탈로그 번호 21347)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 비오티닐화하고, 제바 탈염 칼럼 (피어스; 카탈로그 번호 89889)을 사용하여 탈염시켰다. 용량-반응 데이터를 피팅시키고, IC50을 결정하였다. 결과를 시각화하기 위해 표를 생성하였고, "-"는 50 nM 초과의 IC50을 나타내고, "+"는 1 내지 150 pM 범위의 IC50을 나타낸다.
<표 14> 항체 결합에 대한 뮤테인의 효과
Figure pct00032
이전에 공개된 바와 같이, ITEM-4는 H60K 뮤테인 [WO2009/140177: 도 23F]에 대해 및 PDL-192는 R56P 뮤테인 [WO2009/020933: 도 22B]에 대해 손상된 결합을 나타내었다. 공개된 데이터와 대조적으로, ITEM-1은 R56P에 대해 및 모든 항체는 W42A [WO2009/140177: 도 23E, 도 23F]에 대해 손상된 결합을 나타내었다. 이러한 차이는 선택된 방법에 의해 설명될 수 있다; 극도로 낮은 코팅 농도는 그것이 결합력 효과를 최소화하기 때문에 오프-레이트 손상의 구별에 유리하다. 분석된 항체 중 어떠한 것도 W42A 뮤테인에 대해 비손상 결합을 나타내지 않았기 때문에, 이러한 치환은 결합 에피토프의 직접 변경이 아닌 오히려 구조적 변화를 유발하는 것으로 보인다.
ITEM-1, ITEM-4, PDL-192, 136.1 및 18.3.3과 대조적으로, 본 발명의 항체는 W42A 치환을 제외한 모든 것에 비의존적으로 결합한다.
시스테인 풍부 도메인의 알라닌 스캔:
본 발명의 항체의 결합 부위를 묘사하기 위해, 시스테인 풍부 도메인 (아미노산 34-68)의 알라닌 스캔을 수행하였다. 도 6에서 TWEAKR의 전장 엑토도메인의 N- 및 C-말단 절단 변이체는 본 발명의 항체의 결합을 손상시키지 않는 것으로 제시될 수 있다. 따라서 결합 에피토프는 시스테인 풍부 도메인 내에 위치한다. 하기 치환을 TWEAKR(34-68)-Fc 구축물에 도입하였다: S37A, R38A, S40A, S41A, W42A, S43A, D45A, D47A, K48A, D51A, S54A, R56A, R58A, P59A, H60A, S61A, D62A, F63A 및 L65A.
<표 15> 시스테인 풍부 도메인의 알라닌 스캔을 위한 TWEAKR 뮤테인 구축물의 목록
Figure pct00033
이들 TWEAKR(34-68)-Fc 뮤테인을 HEK293 세포에서 발현시켰다. 용량-반응 데이터를 수집하기 위해, IgG를 384-웰 맥시소르프(Maxisorp) ELISA 플레이트에 1 μg/ml의 농도로 코팅하고, 연속 2배 희석의 TWEAKR 뮤테인 함유 상청액을 가용성 결합 파트너로서 사용하였다. 항-HIS-HRP 및 암플렉스 레드를 사용하여 검출을 행하였다. 시험된 IgG는 본 발명의 TPP-2090, WO2009/020933으로부터의 PDL-192 및 WO2009/140177로부터의 P4A8이었다.
<표 16> 시스테인 풍부 도메인의 알라닌 스캔에 사용된 항체의 목록
Figure pct00034
다양한 IgG에의 결합에 대한 각각의 TWEAKR 뮤테인의 관련성을 평가하기 위해, 특정 뮤테인 농도에서 상관관계 블롯을 준비하였다. 예시적으로, 도 6에서 TWEAKR 발현 브로쓰의 8배 희석된 상청액에 대한 상관관계 블롯을 X 축 상 PDL-192(TPP-1104) 및 Y 축 상 TPP-2090으로 나타낸다. 블롯은 TPP-2090의 결합이 치환 D47A에 의해 손상되었고 PDL-192(TPP-1104)의 결합이 R56A에 의해 손상되었음을 나타내었다. 모든 구축물에 대해, P4A8(TPP-1324)에 대한 어떠한 결합도 검출할 수 없었고, 이는 이전에 수득된 결과와 일치한다 (도 6). 따라서, P4A8 에피토프는 적어도 부분적으로 시스테인 풍부 도메인의 외부에 위치한다. 항체 상호작용을 위한 특정 TWEAKR 아미노산에 대해 확인된 의존성은 이들 항체에 대해 결정된 효능작용적 활성과 상호관련된다. 천연 리간드 TWEAK는 TWEAKR의 효율적 활성화를 나타내고, TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 내 류신 46에 의존하여 결합한다 (Pellegrini et al., FEBS 280:1818-1829). P4A8은 매우 낮은 효능작용적 활성을 나타내고, 적어도 부분적으로 TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인의 외부 도메인과 상호작용한다. PDL-192는 중간 정도의 효능작용적 활성을 나타내고, R56에 의존하여 시스테인 풍부 도메인이지만 TWEAK 리간드 부위 반대편에 결합한다. TPP-2090 및 TWEAK는 각각 D47 및 L46에 의존하여 결합하고, 따라서 유사한 결합 부위에 결합한다 (도 7).
본 발명의 모든 항체에 대한 공통 에피토프의 증거를 지지하기 위해, 추가의 항체 (즉 TPP-2090, TPP-2149, TPP-2093, TPP-2148, TPP-2084, TPP-2077, TPP-1538, TPP-883, TPP-1854, TPP-1853, TPP-1857, TPP-1858)를 시험하였다. 시험된 모든 항체는 TWEAKR의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하였다 (도 6c 참조). PDL-192(TPP-1104)는 여전히 TWEAKR의 D47A 뮤테인에 결합할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 항체 (예를 들어 TPP-2090)는 D47에 의존하여 TWEAKR에 결합한다.
항체 상호작용을 위한 특정 TWEAKR 아미노산에 대해 확인된 의존성은 이들 항체에 대해 결정된 효능작용적 활성과 상호관련된다. 천연 리간드 TWEAK는 TWEAKR의 효율적 활성화를 나타내고, TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인 내 류신 46에 의존하여 결합한다 (Pellegrini et al., FEBS 280:1818-1829). P4A8은 매우 낮은 효능작용적 활성을 나타내고, 적어도 부분적으로 TWEAKR의 시스테인 풍부 도메인의 외부 도메인과 상호작용한다. PDL-192는 중간 정도의 효능작용적 활성을 나타내고, R56에 의존하여 시스테인 풍부 도메인이지만 TWEAK 리간드 부위 반대편에 결합한다. 본 발명의 항체 (도 6c 참조)는 D47에 의존하여 결합하고, TWEAK는 L46에 의존하여 결합하고, 유사하지만 구별가능한 결합 부위에 결합한다 (도 7). 따라서, 강력한 효능작용적 활성을 나타내는 본 발명의 항체는 매우 강력한 효능작용적 활성과 연관된 항체에 대한 신규 에피토프 (D47 의존적)에 결합한다. 흥미롭게도, 마이클슨 등 (문헌 [Michaelson JS et al., MAbs. 2011 Jul-Aug;3(4):362-75]의 페이지 369, 좌측 칼럼 참조)은 그들이 조사한 모든 효능작용적 항체가 천연 리간드 TWEAK와 비교하여 왜 더 약한 효능작용적 활성을 갖는지를 설명하였다. 그들의 결론은, 감소된 효능은 항체와 TWEAKR의 이량체성 결합 상호작용의 기능일 수 있으며, 여기서 TWEAK는 아마도 삼량체성 상호작용에 관여할 것이라는 것이었다. 따라서, 본 발명의 항체가, TWEAKR과의 이량체성 상호작용이기는 하지만, 훨씬 더 높은 효능작용적 활성을 갖는다는 것은 놀라운 발견이다. 이러한 놀라운 효과는 본 발명의 항체의 특이적 결합 특성, 여기서는 TWEAKR의 D47에 대한 특이적 결합과 커플링된다.
에피토프 경쟁 실험에 의한 본 발명의 항체의 특성화:
본 발명의 항체 및 다른 공지된 항-TWAEKR 항체의 차이를 이해하기 위해, 경쟁 실험을 수행하였다. 여러 항-TWEAKR 항체에 대한 중첩 결합 모티프의 조사는 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 상에서의 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 수행하였다.
<표 17> 경쟁 실험에 사용된 항체의 목록
Figure pct00035
<표 18> 경쟁 실험에 사용된 상업적으로 입수가능한 항체의 목록
Figure pct00036
<표 19> 경쟁 실험에 사용된 재조합 항원의 목록
Figure pct00037
모든 항체를 "아민 커플링 키트" (BR-1006-33, 지이 헬스케어 비아코어, 인크.)를 사용하여 CM5 센서 칩 상에 직접 고정시켰다. 시약은 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 사용하였다. 항원에 의한 제1 항체 (고정된 항체)의 포화를 위해, HEPES-EP 완충제 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.) 중 200 nM TWEAKR (TPP-2305)을 30 μl/분으로 120초 동안 주입하였다. 이어서 HEPES-EP 완충제 중 제2 항체 ("경쟁 항체") 200 nM을 유동 세포에 30μl/분으로 120초 동안 주입하였다. 일반적으로, 인-라인 참조 셀 보정에 이어 샘플 완충제 차감 후에 센소그램을 생성하였다. 정성적 경쟁 데이터 (도 8)는 비아밸류에이션 소프트웨어 (버전 4.0)를 사용하여 센소그램의 철저한 수동 검사에 의해 생성하였다. 제2 항체의 주입 후 제2 결합 사건의 결여는 각각의 항체 쌍 내에서의 분명한 경쟁을 나타낸다. 비 경쟁 항체 쌍은 제2 항체 주입 후에 배경을 넘는 분명한 결합 신호를 나타내었다. 또한, 내부 시스템 대조군으로서 자기-경쟁 (동일한 제1 & 제2 항체)을 모니터링하였다. 전체적으로, 9 대 9 항체 매트릭스를 본 분석에 포함시켰다.
일반적으로 항-TWEAKR 항체는 3개의 구별되는 "경쟁 군"으로 군집화될 수 있다 (도 9). 1개의 군은 TPP-2084 및 TPP-2090을 독점적으로 함유하고, 이는 둘 다 모든 다른 시험된 구성원과 경쟁을 나타낸다. 이들 다른 구성원은 2개의 개별 세트의 항체로 분할될 수 있고, 이는 서로간에 어떠한 경쟁도 나타내지 않는다. 따라서 모든 시험된 항-TWEAKR 항체와의 "완전" 경쟁은 TPP-2084 및 TPP-2090에 대해 고유하다.
이는 둘 다의 시험된 본 발명의 항체가 신규하고 고유한 에피토프에 결합한다는 상기 기재된 발견을 지지한다.
본 발명의 항체의 선택성 평가:
본 발명의 항체 TPP-2090에 대해 그의 선택성을 평가하기 위해, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대한 결합을 또한 시험하였다. TNF 수용체 슈퍼패밀리는 도 10에 도시된 바와 같이 매우 높은 서열 다양성을 나타낸다. TWEAKR과 가장 유사한 것은 TNFRSF13C 및 TNFRSF17로, 단지 약 30% 서열 동일성을 갖는다. 에피토프 영역 그 자체 (시스테인 풍부 도메인)는 임의의 다른 TNFRSF 구성원에서 전혀 매칭되지 않는다 (최고 히트에 대한 BLAST E-값 = 0.7). 모든 29종의 공지된 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원의 엑토도메인을 Fc 융합 단백질로서 구입하고 (표 20), 1 μg/ml를 맥시소르프 ELISA 플레이트에 코팅하였다.
용량-반응 데이터를 수집하기 위해, 2 μM의 농도로 시작하는 비오티닐화 IgG의 연속 3배 희석물을 가용성 결합 파트너로서 사용하였다. 검출은 항-hIgG1-HRP 및 암플렉스 레드를 사용하여 행하였다. 시험된 IgG는 본 발명의 TPP-2090이었다. 도 11에 도시된 바와 같이, TPP-2090은 이미 매우 낮은 농도 300 pM에서 TWEAKR에 포화상태로 결합한 반면에, 또한 매우 높은 농도 75 nM에서도 이는 모든 다른 28종의 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원에 결합하지 않았다.
따라서, TPP-2090은 TWEAKR에 선택적으로 결합한다.
<표 20> 선택성 프로파일링을 위한 ELISA에 사용된 재조합 단백질의 목록
Figure pct00038
실시예 3: 암 세포주의 세포 표면에 대한 항-TWEAKR 항체의 결합
마우스 및 인간 암 세포주에 대한 항-TWEAKR 항체의 결합 특성을 결정하기 위해, 유동 세포측정법에 의해 한 패널의 세포주에 대한 결합을 시험하였다. 부착 세포를 Ca 및 Mg가 없는 PBS (바이오크롬(Biochrom) #L1825: 8000mg/l NaCl, 200mg/l KCl, 1150mg/l Na2HPO4, 및 200mg/l KH2PO4를 함유하는 수용액)로 2회 세척하고, 효소-무함유 PBS 기반 세포 해리 완충제 (인비트로젠)에 의해 탈착시켰다. 세포를 FACS 완충제 (Ca/Mg가 없는, 3% FCS 함유 PBS, 바이오크롬) 중에 대략 105개 세포/웰로 현탁시켰다. 세포를 원심분리하고 (250g, 5분, 4℃), 상청액을 따라버렸다. 세포를 FACS 완충제 중 관심 항체 희석물에 재현탁시키고 (달리 나타내지 않는 한 80μl 중 10μg/ml), 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 차가운 FACS 완충제 100μl로 1회 세척하고, 1:150으로 희석된 2차 항체 (PE 염소 항-인간 IgG, 디아노바 #109-115-098, 또는 PE 염소 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) #115-115-164) 80μl를 첨가하였다. 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 다시 차가운 FACS 완충제로 세척하고, 100μl FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS-어레이 (BD 바이오사이언시스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 2차 항체 단독으로의 검출에 의해 측정된 바와 같은, 배경 형광이 차감된 관심 항체에 의해 검출된 형광의 기하 평균으로서 결과를 계산하였다. 값을 하기 시스템에 따라 스코어링하였다:
기하 평균 - 2차 항체 단독의 기하 평균 >10: +, >100: ++, >1000: +++, 10000: ++++, () 내의 카테고리 경계에 근접함. 세포주 공급원을 표 21에 제시한다.
표 21에 나타낸 바와 같이, 10μg/ml의 농도로 사용된 본 발명의 모든 항-TWEAKR 항체는 다양한 종양 실체를 대표하는 뮤린 (4T1, 루이스 폐) 및 인간 (표에 포함된 모든 다른 세포주) 기원의 넓은 범위의 TWEAKR 발현 종양 세포에 결합한다.
<표 21> FACS 분석의 스코어링에 의한, 다양한 세포주에 대한 항-TWEAKR 항체 (10μg/ml)의 결합: TPP-1538 및 TPP-2090은 다양한 종양 적응증을 대표하는 넓은 패널의 뮤린 및 인간 종양 세포주에 결합한다.
Figure pct00039
(기하 평균-2차 항체 단독의 기하 평균 >10: +, >100: ++, >1000: +++, >10000: ++++, () 내의 카테고리 경계에 근접함)
*표 21의 암 세포주에 대한 성장 배지의 목록:
1. DMEM / Ham's F12; (바이오크롬;# FG 4815, 안정한 글루타민 함유), 10% FCS
2. RPMI 1640; (바이오크롬;# FG 1215, 안정한 글루타민 함유), 10% FCS
3. DMEM; (바이오크롬;# FG 0435, 안정한 글루타민 함유) ,10% FCS
4. MEM Earle's; (바이오크롬;# FG 0325, 안정한 글루타민 함유), 10% FCS
5. DMEM; (바이오크롬;# FG 0435, 안정한 글루타민 함유) L-알라닐-L-글루타민; (마지막 4mM에 대해 2mM 추가, 바이오크롬, # K 0302) 비 필수 아미노산; (최종: 1x, 바이오크롬; # K 0293),10% FCS
6. DMEM; (바이오크롬;# FG 0445, 안정한 글루타민 함유 높은 글루코스),10% FCS
7. RPMI 1640; (바이오크롬;# FG 1215, 안정한 글루타민 함유), 20% FCS
8. MEM Earle's; (바이오크롬;# F 0315), L-알라닐-L-글루타민; (최종: 2mM, 바이오크롬; # K 0302) 비 필수 아미노산; (최종: 1x, 바이오크롬; # K 0293), 10% FCS
9. DMEM / Ham's F12; (바이오크롬;# FG 4815, 안정한 글루타민 함유), 말 혈청 (최종: 2.5%); (바이오크롬; # S 9135) 10% FCS
10. DMEM / Ham's F12; (바이오크롬;# FG 4815, 안정한 글루타민 함유), 히드로코르티손; (최종: 40ng/mL, 바이오크롬; # K 3520), 10% FCS
11. McCoy's 5A; (바이오크롬;# F 1015) L-알라닐-L-글루타민; (1.5mM 추가, 바이오크롬; # K 0302), 10% FCS
전체적으로, FACS 분석에 의해 검출된 바와 같은 본 발명의 항체의 최대 세포 결합은 다른 공지된 항체와 비교하여 중간 정도임을 주목해야 한다. 표 23 및 도 12에 제시된 바와 같이, FACS 분석에 의해 검출된 바와 같은 다양한 세포에 결합된 항체의 양은 다른 공지된 항체 (PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324))와 비교하여, FACS 분석에 의해 검출된 바와 같은 항체의 세포 결합이 그의 정점에 도달하는 농도 (데이터는 제시되지 않음)인 10μg/ml에서 더 낮다.
<표 22> FACS 분석에 사용된 항체의 목록
Figure pct00040
<표 23> FACS 분석의 스코어링에 의한, 한 패널의 세포주에 대한 다양한 항-TWEAKR 항체 10μg/ml의 결합. 특이적 항체에 의한 검출에 의한 형광 측정치의 기하평균 마이너스 2차 항체 단독에 의해 측정된 기하평균이 제시된다.
Figure pct00041
실시예 4: 다양한 TWEAKR 발현 세포주에서의 카스파제-3/7 활성화의 유도
아폽토시스 유도의 수준을 결정하기 위해, 암 세포를 TWEAK 또는 효능작용적 항-TWEAKR 항체로 처리한 후에 카스파제-3/7 활성화를 측정하였다. 따라서 HT-29 세포를 96 웰 플레이트에 검정 배지 (DMEM/Ham'sF12, 바이오크롬 #FG4815 + 10% FCS + 100ng/ml IFN 감마 (R&D 시스템즈(R&D Systems) #285-IF)) 중 4000개 세포/75μl/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후에 세포를 TWEAKR에 대한 항체 (표 24 참조), 재조합 인간 TWEAK (R&D, #1090-TW-025/CF, 이. 콜라이 유래 재조합 가용성 인간 TWEAK, 수탁 # Q4ACW9의 Arg93-His249, 엔트레즈(Entrez) 유전자 ID 8742, N-말단 Met 및 6-His 태그 보유) 또는 상응하는 이소형 대조군 IgG와 함께 표시된 바와 같은 다양한 농도로 인큐베이션하였다. 항체와의 24시간 인큐베이션 후에, 100μl/웰 카스파제 3/7 용액 (프로메가, #G8093)을 세포에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 빅토르 V (퍼킨 엘머) 상에서 발광을 판독하여 카스파제 3/7 활성을 결정하였다.
도 13 및 표 25에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체와의 인큐베이션은 관련 기술분야에 기재되어 있는 항체 (PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324), 136.1(TPP-2194))와 비교하여, 또한 300ng/ml 재조합 인간 TWEAK와 비교하여, 더 강력한 카스파제 3/7의 최대 유도를 생성하였다 (표 25). 따라서, 본원에 기재된 항체는 HT-29 세포에서 카스파제 3/7을 유도하는데 이전에 기재된 항체보다 우월하다.
본 발명의 항체의 강력한 효능이 HT-29 이외의 다른 세포주에서도 또한 그러한지 여부를 결정하기 위해, 한 패널의 세포주에서 항-TWEAKR 항체에 의한 카스파제 3/7 유도 능력을 재조합 인간 TWEAK와 비교하여 평가하였다. 이러한 분석을 위해, 하기 조건을 사용하였다: WiDr 세포를 3000개 세포/웰로 플레이팅하고, TWEAK 또는 기재된 항체의 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션하고, A253 세포를 2500개 세포/웰로 플레이팅하고, 24시간 동안 인큐베이션하고, NCI-H322 세포를 5000개 세포/웰로 플레이팅하고, 48시간 동안 인큐베이션하고, 786-O 세포를 2500개 세포/웰로 플레이팅하고, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 표 21에 기재된 바와 같이 배지 중에 플레이팅하고, A253, NCI-H322 및 786-O 세포의 경우에는 100ng/ml IFN 감마 (R&D 시스템즈 #285-IF)를 첨가하였다. 플레이팅 24시간 후에 항체 100μg/ml 또는 TWEAK 300ng/ml (NCI-H322 세포의 경우에 100ng/ml TWEAK)를 첨가하고, 세포를 상기 나타낸 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 말미에 HT-29 세포에 대해 기재된 바와 같이 카스파제 3/7 활성을 결정하였다. 카스파제 3/7의 배수 유도를 비처리 세포와 비교하여 계산하였다.
표 25에 제시된 바와 같이, 모든 시험된 본 발명의 항체는 다른 공지된 항체와 비교하여 HT-29 세포에서 증가된 카스파제 3/7 유도를 나타내었고, 300ng/ml TWEAK 리간드와 비교하여 보다 강력한 활성에 도달하였다. 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 이러한 강력한 효능은 (카스파제 3/7 활성화에 의해 측정된 바와 같이) 또한 WiDr, A253, NCI-H322 및 786-O 세포에서도 관찰되었고, 여기서 시험된 본 발명의 항체는 대부분의 실험에서 다른 항체 및 300ng/ml TWEAK와 비교하여 더 높은 배수-변화를 유도하였다.
<표 24> 카스파제 유도 검정에 사용된 항체의 목록
Figure pct00042
<표 25> 100μg/ml 항-TWEAKR 항체 또는 재조합 인간 TWEAK (300ng/ml 또는 *100ng/ml)와의 인큐베이션 후의 다양한 암 세포에서의 카스파제 3/7의 배수 유도. 3중으로 수행된 1-3개의 대표적인 실험으로부터의 결과를 제시하며, 이는 표준 편차를 포함한다. 시험된 본 발명의 항체는 공지된 항체 또는 재조합 TWEAK와 비교하여 다양한 세포 유형에서 증진된 카스파제 3/7 유도를 나타낸다.
Figure pct00043
실시예 5: 암 세포주에서 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의한 증식의 억제
카스파제 3/7을 유도하는 본 발명의 항체의 효능이 또한 다양한 암 세포주의 증식의 효과적인 억제에 의해 반영되는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명의 항체와의 인큐베이션 후의 항증식 활성을 참조 항체 또는 TWEAK 리간드와 비교하여 측정하였다.
따라서, 세포를 96웰 플레이트에 75μl 검정 배지 (표 21로부터의 성장 배지, 786-O 세포의 경우에 100ng/ml IFN 감마 플러스) 중 하기 세포 수로 플레이팅하였다: WiDr 세포 3000개 세포/웰, 786-O 세포 2500개 세포/웰. 24시간 후에 세포를 항-TWEAKR 항체 (표 26 참조), 재조합 인간 TWEAK 또는 이소형 대조군 IgG (제시되지 않음)와 표시된 농도 (항체 0.03-300μg/ml, TWEAK 100 또는 300ng/ml)로 인큐베이션하였다. 항체 첨가 시점에 자매 플레이트에서 세포 생존율을 결정하였다 (시점 0): 따라서 75μl/웰 CTG 용액 (프로메가 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) 용액 (카탈로그 # G755B 및 G756B))을 세포에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 빅토르 V (퍼킨 엘머) 상에서 발광을 판독하였다. 작용제와의 인큐베이션 96시간 후에, 100μl/웰 CTG 용액을 첨가하고, 10분 인큐베이션하고, 발광을 판독하여 검정 플레이트에서 세포 생존율을 결정하였다. 대조군 웰에서의 증식은 비처리 대조군 웰 내 발광 값에서 시점 0 값을 차감하여 계산하였다. 세포 증식의 %는 화합물 처리 웰에서 비처리 대조군 웰과 비교하여 계산하였다.
대조군 세포와 비교하여 처리 세포에서의 세포 증식을 나타내는 생성된 용량 반응 곡선을 도 14A (WiDr 세포) 및 도 14B (786-O 세포)에 제시한다. 본 발명의 모든 시험된 항체는 WiDr 세포의 증식을 50-60%, 786-O 세포의 증식을 70-80% 억제하였고, 이는 다른 공지된 항체, 예를 들어 PDL-192(TPP-1104) 및 P4A8(TPP-1324)에 의해 도달된 증식 억제보다 유의하게 더 높았다. 따라서, 본 발명의 항체는 지금까지 기재된 가장 효과적인 항증식 항-TWEAKR 항체이다.
이러한 강력한 항증식 활성을 더 넓은 세포 패널에서도 관찰할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 추가로 LOVO, NCI-H1975, SW-480 (모두 3000개 세포/웰), HT-29 (4000개 세포/웰), A253 및 SK-OV3 (둘 다 2500개 세포/웰) 세포를 100μg/ml 항-TWEAKR 항체 또는 TWEAK 리간드와 표 27에 나타낸 바와 같은 시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 세포를 표 21에 나타낸 성장 배지에 시딩하고, WiDr 세포를 제외한 모든 세포의 경우에 세포 시딩 시 100ng/ml IFN감마를 검정 배지에 첨가하였다. 비처리 대조군 세포에서의 증식과 비교하여 처리 세포에 대한 성장 억제 백분율을 상기 기재된 바와 같이 측정하고 계산하였다.
표 27에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 다양한 암 세포주의 증식을 억제하는데 있어서 다른 공지된 항체와 비교하여 100μg/ml에서 보다 효과적이었다. 대부분의 실험에서, 본 발명의 항체는 또한 100-300ng/ml TWEAK 리간드와 비교하여 동등하거나 더 강력한 효능을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 기재된 항체는 넓은 패널의 암 세포주에서 아폽토시스 및 증식 억제를 유도하는 그의 활성에 있어서 고유하다.
<표 26> 증식 검정에 사용된 항체의 목록
Figure pct00044
<표 27> 100μg/ml 항-TWEAKR 항체 또는 TWEAK 리간드 (*100ng/ml, **300ng/ml)와의 인큐베이션에 의해 유도된 증식의 % 억제. 작용제의 존재 하의 인큐베이션 시간은 검정 시간 [h]로 표시된다. 3중으로 수행된 1-3개의 대표적인 실험으로부터의 결과를 제시한다. 본 발명의 항체는 공지된 항체 (PDL-192(TPP-1104), P4A8(TPP-1324))와 비교하여 보다 강력한 암 세포 증식의 억제를 나타내었고, 재조합 TWEAK와 비교하여 동등하거나 더 강력한 활성을 나타내었다.
Figure pct00045
실시예 6: 암 세포 및 이종이식 종양으로부터 항-TWEAKR 항체에 의해 유도된 시토카인 분비
다음으로, 본 발명의 항체의 강력한 효능작용적 활성이 암 세포로부터의 시토카인 분비의 유도에서도 관찰되지는지 여부가 관심 조사대상이었다.
따라서, A375 세포를 96웰 플레이트에서 성장 배지 DMEM (바이오크롬;# FG 0435, 안정한 글루타민 함유), 10% FCS 중 2500개 세포/웰로 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 항-TWEAKR 항체, 재조합 인간 TWEAK와 표시된 바와 같은 다양한 농도로, 또는 상응하는 이소형 대조군 IgG와 인큐베이션하였다. 항체와 인큐베이션 시작 24시간 후에, 세포 상청액 또는 그의 희석물을 인간 CXCL8/IL-8 ELISA 키트 (R&D 시스템즈 DY208)의 포획 Elisa 플레이트에 첨가하고, 300rpm 진탕함으로써 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 인간 CXCL8/IL-8-ELISA 키트 (R&D 시스템즈 DY208)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 샘플을 분석하였다. 광학 밀도는 450 nm에서 배경 보정과 함께 측정하였다 (테칸 스펙트라(Tecan Spectra), 레인보우(Rainbow)). IL-8의 절대 수준을 계산하기 위해, 재조합 인간 IL-8 단백질을 사용한 표준 곡선을 제조업체의 권고 (R&D 시스템즈)에 따라 적용하였다.
도 15에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 이전에 공지된 다른 항체와 비교하여 IL-8 방출의 증가된 유도를 나타내었다. 100μg/ml에서, 본 발명의 항체 TPP-1538/-1854/-2084/-2090은 300ng/ml TWEAK 리간드와 비교하여 각각 134/129/113/103%의 활성화에 도달하였다. 대조적으로, 비교를 위해 사용된 항체 PDL-192(TPP-1104)/P4A8(TPP-1324)/136.1(TPP-2194)은, 각각 단지 66/29/93%에 도달하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 IL-8 분비의 유도와 관련하여 이전에 공지된 항체 및 300ng/ml TWEAK 리간드와 비교하여 가장 강력한 활성을 나타내었다.
관찰된 시토카인 분비가 또한 마우스 내 이종이식 종양에서도 관련이 있는지 여부를 조사하기 위해, 종양 보유 (A375, WiDr) 뿐만 아니라 종양 무함유 마우스로부터의 혈청/혈장 중 인간 및 뮤린 시토카인을 조사하였다. 매트리겔/PBS (1:1) 중 5x106개의 A375 세포 또는 매트리겔/배지 (1:1) 중 5x106개의 WiDr 세포를 면역결핍 암컷 NMRI 누드 마우스에 피하 접종하였다. A375-보유 마우스와 병행하여, 비-종양 마우스를 조사하였다. 처리는 접종 7일 후에 종양이 약 40mm2 로 확립되면 시작하였다. 마우스는, 둘 다 PBS 중에 희석된 TPP-1538 (10 mg/kg) 또는 TPP-2090 (3 mg/kg)의 단일 정맥내 주사에 의해 꼬리 정맥으로 처리하였다. 이어서 마우스를 주어진 시점에 희생시켜 (A375-보유 마우스의 경우에 0, 6시간, 24시간 및 WiDr-보유 마우스의 경우에 0, 7시간, 24시간, 72시간, 168시간, 240시간) 혈청/혈장 샘플을 수거하였다. 단두 후에 혈액을 수집하고, 30분 응고에 이어 1000xg에서의 원심분리에 의해 혈청을 준비하였다.
시토카인은 루미넥스(Luminex)® 비드 면역검정을 사용하여 정량화하였다. 인간 시토카인은 IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-13, IL-15, IL-17, TNF-α, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, MIG, 에오탁신, RANTES, 및 MCP-1을 포함하는 인간 시토카인 자기 25-플렉스 패널 (인비트로젠®, 카탈로그-번호 LHC0009M)로 결정하였다. 뮤린 시토카인은 FGF 염기성, GM-CSF, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-12 (p40/p70), IL-17, IP-10, KC, MCP-1, MIG, MIP-1α, TNF-α 및 VEGF를 포함하는 마우스 시토카인 자기 20-플렉스 패널 (인비트로젠®, 카탈로그-번호 LHC0006M)로 결정하였다. 검정을 제조업체의 지침에 따라 수행하고, 루미넥스 판독기 바이오-플렉스(Bio-Plex) 200 (바이오-라드 게엠베하(Bio-Rad GmbH))에 의해 측정하였다. 시토카인 농도는 운영 소프트웨어 바이오-플렉스 매니저 (바이오-라드 게엠베하)에 의해, 검정 절차의 일부로서 표준 곡선으로부터 내삽하였다.
도 16A에 제시된 바와 같이, 인간 IL-8은 TPP-2090 3mg/kg에 의한 단독 처리에 의해 WiDr 이종이식편으로부터 시간 의존적 방식으로 방출되었다. 또한, TPP-2090에 의한 처리 후에 인간 MCP-1, IP-10 및 IL-15의 분비의 유도가 관찰되었다 (제시되지 않음).
본 발명의 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의한 처리 후에 종양 보유 마우스의 혈장에서 관찰되는 시토카인 유도가 실제로 종양 특이적인지 여부를 추가로 조사하기 위해, A375 종양 보유 및 종양 무함유 마우스에서 유사한 조사를 수행하고, 인간 뿐만 아니라 뮤린 시토카인을 측정하였다.
도 16B에 제시된 바와 같이, 인간 IL-8은 TPP-1538의 10 mg/kg으로의 처리 6시간 후에 종양 보유 마우스 내 A375 이종이식편으로부터 방출되었다. 또한, 증가된 수준의 인간 MCP-1, IP-10 및 IL-1RA가 관찰되었다 (제시되지 않음). 대조적으로, 처리된 종양 무함유 마우스의 혈장에서는 인간 시토카인 분비의 어떠한 증가도 검출되지 않았다 (도 16B 및 제시되지 않음). 또한, 뮤린 IL-8 유사체 KC를 비롯하여 어떠한 뮤린 시토카인의 증가도 TPP-1538에 의한 처리 후에 종양 보유 또는 종양 무함유 마우스의 혈장에서 검출되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 요약하면, 본 발명의 항체는 생체내 암 세포 및 이종이식편으로부터 종양 특이적 방식으로 시토카인의 분비를 강력하게 유도한다.
실시예 7: 약물 접합체 접근법을 위한 항-TWEAKR 항체의 내재화 및 유용성
본 발명의 항-TWEAKR 항체가 항체 약물 접합체 (ADC)의 생성을 위해 잠재적으로 사용가능한지 여부를 조사하기 위해, 항체의 내재화 능력을 조사하였다.
이 과정을 가시화하기 위해, TWEAKR 특이적 항체 TPP-1538 및 TPP-2090 및 이소형 대조군 항체를 선택하였다. 항체를 2배 몰 과량의 CypHer 5E 모노 NHS 에스테르 (배치 357392, 지이 헬스케어)의 존재 하에 pH 8.3에서 접합시켰다. 접합 후에 반응 혼합물을 4℃에서 밤새 투석하여 (슬라이드-A-라이저 투석 카세트 MWCD 10kD, 회사 피어스) 과량의 염료를 제거하고 pH-값을 조정하였다. 그 후 단백질 용액을 농축시켰다 (비바스핀(VIVASPIN) 500, 회사 사토리우스 스테딤 바이오텍(Sartorius Stedim Biotec)). pH-의존적 형광 염료 CypHer5E에 더하여, ph-비의존적 염료 알렉사(Alexa) 488을 사용하였다. 항체의 염료 로드는 분광광도계 (회사 나노드롭(NanoDrop))로 결정하였다. TPP-1538, TPP-2090 및 이소형 대조군 항체의 염료 로드는 유사한 범위로 존재하였다. 표지된 항체의 친화도를 세포 결합-검정에서 시험하여 표지가 TWEAKR에 대한 결합을 변경시키지 않음을 확실하게 하였다. 이들 표지된 항체를 하기 내재화 검정에 사용하였다. 처리 전에 세포 (2x104개/웰)를 96-MTP (편평, 흑색, 투명 바닥 No 4308776, 회사 어플라이드 바이오시스템즈)에서 100μl 배지 중에 시딩하였다. 37℃/5%CO2에서의 18시간 인큐베이션 후에 배지를 교환하고, 표지된 항-TWEAKR 항체 TPP-1538 및 TPP-2090을 다양한 농도 (10, 5, 2.5, 1, 0.3, 0.1μg/ml)로 첨가하였다. 동일한 처리를 동위원소 대조군 항체 (음성 대조군)로 수행하였다. 인큐베이션 시간은 0, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 및 24시간이 되도록 선택하였다. 형광 측정은 인셀애널라이저 1000 (회사 지이 헬스케어)으로 수행하였다. 세포당 과립 카운트 및 총 형광 강도를 동역학적 방식으로 측정하였다.
TPP-1538 및 TPP-2090의 고도로 특이적이고 유의한 내재화가 내인성 TWEAKR 발현 암 세포주 786-O (신암) 및 HT-29 (결장암)에서 관찰되었다.
이러한 내재화는, 흡수가 항-TWEAKR 항체를 사용한 경우에만 입증될 수 있었고 이소형 대조군 항체에 의해서는 어떠한 내재화도 관찰되지 않았기 때문에, 표적 의존적이었다. 처음 6시간 동안, 항-TWEAKR 항체는 이소형 대조군과 비교하여 항체 내재화의 20-40-배 증가를 나타내었다. 이소형 대조군 항체는 장기간 노출 (>24시간) 후에 약한 내재화를 나타내었다.
알렉사 488로 표지된 항-TWEAKR 항체의 내재화는 결합 시 내재화된 항체의 50% 초과가 세포내이입 경로를 따르는 것으로 보임을 밝혀내었다.
도 17에서, 내인성 TWEAKR 발현 세포에의 결합 시 TPP-1538 및 TPP-2090의 특이적 내재화의 시간 경과적 평가를 제시한다. 항체 (1 μg/ml)의 내재화를 신암 세포주 786-O에 대해 조사하였다. 세포당 과립 카운트를 동역학적 방식으로 측정하였다. TPP-1538 및 TPP-2090에 대해서는 신속한 내재화를 관찰할 수 있었던 반면에, 이소형 대조군 hIgG1은 내재화되지 않았다. 또한, TPP-2090에 의해 유의하게 개선된 내재화 효능이 관찰되었다. TPP-2090의 보다 높은 효능은 상이한 수용체 수준을 갖는 다양한 암 세포를 사용하여 수행한 내재화 검정에서 확인할 수 있었다 (제시되지 않음).
또한, 사포린-접합된 2차 항체의 존재 하에 인큐베이션한 경우에 항-TWEAKR 항체의 세포 증식 억제 활성을 Hum-Zap 검정에서 평가하였다. 따라서, 786-O 세포를 96 웰 플레이트에 성장 배지 (DMEM/Ham'sF12, 바이오크롬 #FG4815 + 10% FCS) 중 2500개 세포/75μl/웰로 플레이팅하였다. 24시간 후에 40nM 항체 (TPP-1538, TPP-2090 또는 이소형 대조군 항체)를 40nM 사포린-접합된 2차 항체 (Hum Zap, 어드밴스드 타겟팅 시스템즈(Advanced Targeting Systems) 카탈로그 #IT-22, 로트 59-83)의 존재 또는 부재 하에 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간 후에 25μl의 반응 믹스를 세포에 첨가하여, 샘플 웰 내 10nM 항체의 최종 농도를 생성하였다. 항체 첨가 시점에 자매 플레이트에서 세포 생존율을 결정하였다 (시점 0). 따라서, 75μl/웰 CTG 용액 (프로메가 셀 타이터 글로 용액 (카탈로그 # G755B 및 G756B))을 세포에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 빅토르 V (퍼킨 엘머) 상에서 발광을 판독하였다.
항체/Zap 복합체와의 인큐베이션 시작 48시간 후에, 100 μL/웰 CTG 용액을 모든 시험 웰에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션하고, 빅토르 V 상에서 발광을 판독하였다.
도 18에 제시된 바와 같이, 사포린-접합된 2차 항체의 존재 하에 10nM의 항-TWEAKR 항체와의 786-O 세포의 인큐베이션은 세포 증식을 거의 완전히 억제한 반면에, 동일한 실험 조건 하에 (IFN감마 부재, 단지 48시간 인큐베이션 시간) 사포린-접합된 2차 항체의 부재 하에서는 또는 이소형 대조군 항체에 의하면 어떠한 항증식 활성도 관찰되지 않았다.
요약하면, 본 발명의 항-TWEAKR 항체는 접합된 페이로드의 신속한 내재화 및 표적화 전달을 나타내고, 따라서 ADC의 생성 및 그로서의 사용에 널리 적합하다.
실시예 8: 생체내 이종이식편 모델에서 항-TWEAKR 항체의 항종양 효능
항-TWEAKR 항체가 생체내 항종양 활성을 나타내는지 여부를 조사하기 위해, 다양한 암 세포주로부터 유래된 이종이식 종양 또는 환자 유래 종양 모델에 대해 단독- 또는 조합 요법으로의 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의한 종양 성장 억제에 대한 그의 감수성을 시험하였다.
생체내 실험의 시작 전에, 선택된 이종이식편 모델에서의 TWEAKR의 발현을 면역조직화학에 의해 평가하였다. 따라서, 상응하는 이종이식편의 동결 절편 (5 μM)을 아세톤으로 5분 동안 4℃에서 고정시키고, 비특이적 단백질 결합 및 퍼옥시다제 활성에 대해 차단시켰다. 조직 절편을 토끼 항-TWEAKR 항체 (Fn14, 에피토믹스(Epitomics), 3488-1)와 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 퍼옥시다제 표지된 항 토끼 중합체 (다코(DAKO), K4011)와 30분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 디아미노벤지딘으로 발색시키고, 헤마톡실린으로 최종 대조염색하였다. TWEAKR의 발현에 대해 양성인 모델 만을 생체내 실험에 사용하였다.
항-TWEAKR 항체의 생체내 항종양 활성의 조사를 위해, 다양한 인간 종양 세포주로부터의 이종이식편을 보유하는 누드 마우스 또는 환자-유래 종양을 반복 정맥내 주사에 의해 처리하였다.
종양 세포주를 상기 파트에 기재된 바와 같이 배양하고, 세포주 특이적 개수의 종양 세포를 함유하는 100 μl를 암컷 무흉선 누드 마우스 (NMRI nu/nu, 6-8주, 20-25g, 타코닉(Taconic))에 피하 (s.c.) 접종하였다. 마우스를 표준화된 병원체 무함유 조건 하에 수용하고, 동물 복지 가이드라인에 따라 처리하였다.
대략 40mm2 크기로의 종양 성장 후에 마우스를 각각 n=8-10의 군 크기로 대조군 및 처리군으로 무작위화하였다. 마우스를 PBS 중에 희석된 다양한 용량의 항-TWEAKR 항체로 정맥내 주사 (i.v.)에 의해 꼬리 정맥으로 1주에 2회의 스케줄로 처리하였다 (q4dx3: 1주에 2회 적용, 총 3회 적용; q4dx8: 1주에 2회 적용, 총 8회 적용). 조합 요법 파트너, 예컨대 레고라페닙 (매일 10mg/kg, 경구로) 및 PI3K-억제제 1 (10mg/kg, BID, 2d 온, 5d 오프 (2 연속일에 매일 2회 적용, 이어서 5일 비처리), i.v.)을 그의 각각의 제제 중에 희석시키고, 한편 표준 치료 요법 이리노테칸 (5mg/kg, 4d 온, 3d 오프 (4 연속일에 매일 1회 적용, 이어서 3일 비처리) i.v.) 및 파클리탁셀 (16mg/kg, q7dx4 (1주에 1회 적용, 총 4회 적용), i.v.)은 0.9% NaCl 중에 희석시켰다. PBS를 주사한 동물을 대조 (비히클) 군으로서 제공하였다. 적용된 화합물 부피는 마우스당 5ml/kg 체중이었다.
종양 성장을 캘리퍼 측정 (길이 x 폭, mm)에 의해 1주에 2-3회 모니터링하고, 뿐만 아니라 체중 (g)도 모니터링하였다. 연구 말미에 종양을 해부해내고, 칭량하고, 종양-대-대조군 (T/C) 비 (대조군/비히클 동물의 평균 종양 중량으로 나눈 처리된 동물의 평균 종양 중량)의 계산에 사용하였다.
인간 신세포암 모델 786-O (양성 TWEAKR 발현)에서, 항-TWEAKR 항체 TPP-2084 및 TPP-2090의 효능을 3종의 상이한 저용량에서 이소형 대조군 항체와 대비하여 시험하였다. 100% 매트리겔 중 2x106개의 종양 세포를 암컷 누드 마우스에 s.c. 접종하였다. 7일 후에 약 40 mm2의 크기로 확립된 종양을 0.3 mg/kg, 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 항체로 처리하였다 (i.v., q4dx3: 1주에 2회 적용, 총 3회 적용). 제40일에, 해부 후의 종양 중량의 비교는 TPP-2084 및 TPP-2090의 용량-의존적 효능을 보여주었고, 3 mg/kg에서 최대였다 (도 19). 이소형 및 비히클 군 (PBS로 처리됨)에 대해 명백한 차이를 입증할 수 있었다. 임의의 군에서 어떠한 체중 손실도 관찰되지 않았다. 표 28에 열거된 종양-대-대조군 비는 786-O 모델 및 추가의 종양 모델 (A375, A253, SK-OV-3, Bx-PC3, 3-10 mg/kg 항-TWEAKR 항체 TPP-1538, TPP-2094 또는 TPP-2090에 의해 q7dx3 (1주에 1회 적용, 총 3회 적용) 또는 q4dx3 (1주에 2회 적용, 총 3회 적용) 스케줄로 처리됨, 단독요법 효능에 도달하기 위해 항-TWEAKR 항체의 보다 강한 투여 스케줄을 필요로 하지 않을 수 있는 MDA-MB-231은 제외)에서 양호한 효능을 입증하였다.
<표 28> TPP-1538, TPP-2084 또는 TPP-2090에 의한 처리 후의 786-O 및 추가의 종양 모델에서의 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비. 항-TWEAKR 항체는 상이한 고형 종양 적응증으로부터의 다양한 이종이식편 모델에서 강력한 항종양 활성을 나타내었다.
Figure pct00046
도 20은 인간 결장암 이종이식편 WiDr (이는 HT-29 종양 세포주의 서브클론을 나타냄)에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 단독요법, 및 이리노테칸 및 레고라페닙과의 조합 요법에서의 효능을 제시한다. 매트리겔/배지 (1:1) 중 5x106개의 WiDr 세포를 면역결핍 NMRI 누드 마우스에 s.c. 접종하였다. 처리는 접종 7일 후에 종양이 약 40mm2로 확립되면 시작하였다. 단독요법에서 TPP-2090은 심지어 3mg/kg에서도 (i.v., q4dx7: 1주에 2회 적용, 총 7회 적용) 종양 성장을 제어하는데 강력하게 효과적이었다. 3mg/kg TPP-2090과 이리노테칸 (5mg/kg, i.v., 4d 온, 3d 오프) 또는 레고라페닙 (10mg/kg, p.o., 매일)의 조합은 종양 퇴행의 추가의 효능을 생성하였다. 모든 치료 요법은 마우스에 의해 잘 허용되었다 (최대 4%의 초기 및 가역적 체중 손실). 최종 T/C 값을 표 29에 열거한다.
TPP-2090은 또한 다른 결장직장 종양 모델, 예컨대 SW480 및 환자-유래 종양 모델 Co5682에서 유사한 양호한 결과를 갖는 것으로 조사되었다 (표 29). 10mg/kg 용량의 TPP-2090은 SW480에서 단독요법으로 종양 성장을 제어하는데 효과적이었고 (T/C 0.49), 5mg/kg 이리노테칸 (T/C 0.22) 또는 10mg/kg 레고라페닙 (T/C 0.37)과의 조합으로 종양 퇴행을 야기하는데 효과적이었다. Co5682 이종이식편에서 3mg/kg의 TPP-2090은 이리노테칸 (T/C 0.23)과의 조합으로 종양 퇴행 및 레고라페닙 (T/C 0.27)과의 조합으로 종양 정체의 상승작용적 효능을 나타내었다.
<표 29> 연구 말미의 종양 중량을 기반으로 한, TPP-2090 및 조합 파트너에 의한 처리 후의 2종의 결장암 세포주 WiDr 및 SW480 및 1종의 환자-유래 결장암 이종이식편 Co5682의 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비.
Figure pct00047
도 21은 인간 비소세포 폐암 이종이식편 NCI-H322에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 단독요법, 및 파클리탁셀과의 조합 요법에서의 효능을 제시한다. 매트리겔 중 5x106개의 NCI-H322 세포를 면역결핍 NMRI 누드 마우스에 s.c. 접종하였다. 처리는 접종 14일 후에 종양이 약 45mm2으로 확립되면 시작하였다. 5mg/kg의 용량에서, TPP-2090 (i.v., q4dx8)은 단독요법에서 종양 퇴행을 입증하며 강력하게 효과적이었다. 10mg/kg TPP-2090과 파클리탁셀 (16mg/kg, i.v., q7dx4)의 조합은 경미한 상가적 효능을 생성하였다. 모든 치료 요법은 마우스에 의해 잘 허용되었다 (최대 3% 가역적 체중 손실). 최종 T/C 값을 표 30에 열거한다.
다시, TPP-2090은 또한 다른 폐암 모델, 예컨대 NCI-H1975 및 환자-유래 종양 모델 Lu7343 및 Lu7433에서 비슷한 결과를 갖는 것으로 조사되었다 (표 30). 3mg/kg 용량의 TPP-2090은 NCI-H1975에서 16mg/kg 파클리탁셀과 조합되어 종양 퇴행을 야기하는데 상가적 효과를 나타내었다 (T/C 0.08). 유사하게, 환자-유래 NSCLC 모델 Lu7343 및 Lu7433에서, 3mg/kg TPP-2090과 10mg/kg의 PI3K-억제제 1의 조합은 상가 효과적인 방식으로 종양 제어 또는 퇴행을 야기하였다 (T/C 0.18-0.36).
PI3K-억제제 1은 (2-아미노-N-[7-메톡시-8-(3-모르폴린-4-일프로폭시)-2,3-디히드로이미다조[1,2-c]퀴나졸린-5-일]피리미딘-5-카르복스아미드 디히드로클로라이드이다.
<표 30> 연구 말미의 종양 중량을 기반으로 한, TPP-2090 및 조합 파트너에 의한 처리 후의 2종의 NSCLC 세포주 NCI-H322 및 -H1975 및 2종의 환자-유래 폐암 이종이식편 Lu7343 및 Lu7433의 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비.
Figure pct00048
모든 기재된 생체내 실시예는 넓은 패널의 세포주-유래 및 환자-유래 인간 종양 모델 (모두 TWEAKR 양성 발현을 가짐)에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 단독요법 뿐만 아니라 조합 요법에서의 강력한 효능을 입증하였다. TPP-2090은 사용된 모든 용량에서 마우스에 의해 잘 허용되었다.
실시예 9: 이종이식편 모델에서 항-TWEAKR 항체의 작용 방식
항-TWEAKR 항체의 생체내 작용 방식을 조사하기 위해, WiDr 이종이식편으로부터의 종양을 실시예 8에 기재된 바와 같이 연구 말미에 채취하고, 면역조직화학 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사하였다.
WiDr 이종이식편 (군당 3마리의 개별 동물로부터의 종양)의 동결 절편 (5 μm)을 증식 마커 단백질 Ki67에 대해 면역조직화학적으로 염색하였다 (생체내 실험의 상세사항은 실시예 8 참조). 절편을 새롭게 제조한 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 4℃에서 고정시키고, 비특이적 단백질 결합 및 퍼옥시다제 활성에 대해 차단시켰다. 뮤린 항 Ki67 항체 (다코, M7240)를 제조업체의 지침에 따라 비오틴으로 표지하고 (다코, K3954), 조직 절편과 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 엑스트라비딘(ExtraVidin)-퍼옥시다제 (다코, K3468)와 30분 동안 인큐베이션하였다. 절편을 디아미노벤지딘으로 발색시키고, 헤마톡실린으로 최종 대조염색하였다. 정량화를 위해, 아리올(ARIOL) 자동화 현미경검사 버전 3.2 (어플라이드 이매징(Applied Imaging), 미국 캘리포니아주 산 호세)를 사용하여 전체 종양 절편을 스캐닝 및 분석하였다. Ki67에 대해 염색된 PBS (i.v., q4dx7) 및 TPP-2090 (10mg/kg, i.v., q4dx7) 처리 이종이식편의 대표적인 영상을 도 22A 및 B에 각각 제시한다. 아리올 영상 시스템을 사용한 정량화로 10 mg/kg TPP-2090 (i.v. q4dx7) 처리 군에서 355+/-59 Ki67 양성 세포/mm2, 및 비히클 처리 군에서 863 +/-90 Ki67 양성 세포/mm2가 밝혀졌다. 따라서, 종양 부피에서 관찰된 감소와 일치하여, 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의한 처리는 이종이식 종양에서 증식 마커 Ki67의 감소를 야기하였다.
또한, 연구 말미에 순간 동결시킨 WiDr 이종이식 종양 (생체내 실험의 상세사항은 실시예 8 참조)을 웨스턴 블롯에 의해 분석하여 Stat-1 및 NF-카파B 신호전달 경로에 대한 항체 처리의 효과를 평가하였다. 군당 4마리의 개별 동물의 종양을 약 5mm 직경의 슬라이스로 자르고, 각각의 슬라이스를 사전냉각시킨 5mm 스틸 불 (퀴아젠) 및 500μl 용해 완충제 (50mM Hepes pH 7.2, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Na4P2O7, 100mM NaF, 10% 글리세린, 1.5% 트리톤 X-100, 새로이 첨가된 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche) No. 1873580001), 4mM Na3VO4, pH는 NaOH에 의해 7.4로 조정됨))와 함께 2ml 에펜도르프 튜브에 넣었다. 샘플을 티슈라이저(Tissuelyzer) (퀴아젠) 내에서 300Hz에서 3분 동안 용해시킨 다음, 빙상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 마이크로-원심분리기 (에펜도르프) 내에서 13000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 하나의 원래 종양으로부터의 상청액을 다시 함께 풀링시켰다. 종양 용해물 내 단백질 수준은 BCA 단백질 검정 키트 (노바젠(Novagen), H20 중 1:50 희석된 용해물)를 사용하여 결정하였다. 샘플을 4mg/ml의 최종 농도로 희석시키고, 10μl의 샘플을 3.08 μl의 (10*) 샘플 환원제, 10μl H2O 및 7,68μl (4*) 뉴페이지(NuPAGE) 샘플 완충제 (인비트로젠)와 혼합하였다. 40μg의 단백질에 상응하는 샘플을 인비트로젠의 뉴페이지 4-12% SDS page 겔에 적용하고, 2시간 45분 동안 120V에서 구동시켰다. 블롯팅은 아이블롯(iBlot) 시스템 (인비트로젠)에 의해 제조업체의 권고에 따라 수행하였다. 막을 PBST 중 5% 블롯 퀵블로커(BLOT QuickBlocker) (인비트로젠) 중에서 실온에서 2시간 동안 차단시킨 다음, 1차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 1차 항체는 다음과 같다: 포스포-Stat1 #9167S, Stat-1 #9172, 둘 다 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 1:1000 희석; TWEAKR/Fn14 #3488-1 에피토믹스, 1:10000 희석; NF-카파B2 p100/p52 #4882S, 셀 시그널링 테크놀로지, PBST 중 3% 블롯 퀵블로커 중 1:1000 희석. 다음날, 막을 PBST 중에서 3회 세척한 다음, 2차 항체 (퍼옥시다제-접합된 당나귀 항-토끼 IgG # NA934, 지이 헬스케어 3% 블롯 퀵블로커/PBST 중 1:10000)와 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 후속해서, 막을 PBST로 10분 동안 4회 세척하고, ECL 시약과의 인큐베이션 후에 화학발광에 의해 신호를 검출하였다. 로딩 대조군을 검출하기 위해, 막을 스트리핑 용액 리-블롯 플러스 (Re-Blot Plus) 강용액 #2504, 밀리포어(Milipore) (밀리포어-H2O 중 1:10)로 실온에서 15분 진탕 동안 스트리핑한 다음, 차단하고, 항-GAPDH 항체 (클론6C5, # MAB374, 밀리포어 3% 퀵블로커/PBST 중 1:10000) 및 2차 항체 (퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG, 잭슨 이뮤노리서치 #115-035-003, 3% 블롯 퀵블로커/PBST 중 1:10000)에 의해 검출하였다.
TPP-2090 3mg/kg으로 처리된 군당 2마리의 동물의 종양으로부터의 대표적인 블롯을 비히클 처리된 동물로부터의 종양에 의한 블롯과 나란히 도 23에 제시한다. TPP-2090에 의한 처리는 총 및 인산화 Stat-1 수준의 강력한 증가 뿐만 아니라 p52 단편의 출현에 의해 표시되는 바와 같이 NF-카파B2의 강력한 활성화를 야기하였다. 따라서, NF-카파B2 뿐만 아니라 Stat-1 경로는 이종이식 종양에서 효능작용적 항-TWEAKR 항체에 의해 활성화되고, 이러한 활성화는 상응하는 항체의 항종양 활성에 잠재적으로 수반된다.
<표 31> 항체의 단백질 서열:
Figure pct00049
<표 32> 본 발명의 항체의 DNA 서열
Figure pct00050
실시예 10: 추가의 인간 생체내 결장직장암 모델에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 항종양 효능
추가의 인간 결장직장암 종양 세포주 Colo205 및 LoVo 및 추가의 인간 결장직장암 환자-유래 모델 Co7553, Co5896, Co5676, Co5841, CXF 1103 및 CXF 533에 대해 실시예 8에 기재된 바와 같은 동물 연구를 수행하였다. 표준 투여 스케줄은 4주 동안 매주 2회 TPP-2090 10 mg/kg 단독요법, 또는 레고라페닙 또는 표준 치료 (SoC) 이리노테칸 (5-15 mg/kg i.p., 4d 온, 3d 오프), 옥살리플라틴 (3-8 mg/kg i.p., 매주 2회), 5-플루오로우라실 (50-100 mg/kg i.p., 매주 1회) 및 세툭시맙 (15 mg/kg i.p., 매주 2회)과의 조합이다. TPP-2090 및 세툭시맙을 PBS 중에 제제화하였고, 이는 또한 대조군에서 비히클로서 사용하였고, SoC는 0.9% NaCl 중에 제제화하였다. 레고라페닙 제제는 실시예 8에 기재되어 있다.
이들 인간 결장직장암 환자-유래 및 세포주 기반 모델에서 TPP-2090의 단독요법 효능은 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비가 0.48-1.07의 범위로 중간 정도였다. TPP-2090과 SoC (특히 5-FU 및 이리노테칸)의 조합은 유의한 상가적이고 상승작용적인 효과를 생성하였다 (표 33-35 참조). 이들 모델에서 TPP-2090의 단독요법 효능이 한계가 있는 경우에, 결장직장암에 대해 실시예 8에 제시된 바와 같이 보다 높은 단독요법 효능에 도달하기 위해서는 항-TWEAKR 항체의 보다 강한 투여 스케줄이 요구될 수 있다.
<표 33> TPP-2090으로 단독요법 또는 이리노테칸 및 옥살리플라틴과의 조합으로 처리된 결장직장암 모델의 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비
Figure pct00051
<표 34> TPP-2090으로 5-FU 및 레고라페닙과의 조합으로 처리된 결장직장암 모델의 최종 종양-대-대조군 (T/C) 비
Figure pct00052
<표 35> TPP-2090으로 세툭시맙과의 조합으로 처리된 결장직장암 모델의 종양-대-대조군 (T/C) 비
Figure pct00053
실시예 11: 인간 생체내 방광암 모델에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 항종양 효능
인간 방광암 세포주 SCaBER 및 KU-19-19 및 인간 방광암 환자-유래 모델 BXF1352 및 BXF1228에 대해 실시예 8에 기재된 바와 같은 동물 연구를 수행하였다. 표준 투여 스케줄은 4주 동안 매주 2회 TPP-2090 10 mg/kg 단독요법, 또는 표준 치료 (SoC) 겜시타빈 (200 mg/kg i.p., 매주 1회) 및 시스플라틴 (3 mg/kg i.p., 매주 1회)과의 조합이다. TPP-2090을 PBS 중에 제제화하였고, 이는 또한 대조군에서 비히클로서 사용하였고, 표준 치료 (SoC)는 0.9% NaCl 중에 제제화하였다.
SCaBER 이종이식편 모델에서 TPP-2090의 강력한 단독요법 효능이 관찰되었다. 인간 방광암 환자-유래 방광암 모델 BXF1352 및 BXF1228에서 TPP-2090의 SoC (시스플라틴 및 겜시타빈)와의 조합은 유의한 상승작용적 효과를 생성하였다 (표 36 참조). 이들 방광암 모델에서 TPP-2090의 단독요법 효능이 한계가 있는 경우에, 보다 높은 단독요법 효능에 도달하기 위해서는 항-TWEAKR 항체의 보다 강한 투여 스케줄이 요구될 수 있다.
<표 36> TPP-2090으로 단독요법 또는 시스플라틴 또는 겜시타빈과의 조합으로 처리된 인간 방광암 모델의 종양-대-대조군 (T/C) 비
Figure pct00054
실시예 12: 추가의 인간 생체내 암 모델에서 항-TWEAKR 항체 TPP-2090의 항종양 효능
다양한 적응증의 추가의 인간 암 세포주에 대해 실시예 8에 기재된 바와 같은 동물 연구를 수행하였다. 표준 투여 스케줄은 2-3주 동안 매주 2회 TPP-2090 10 mg/kg 단독요법이다. TPP-2090을 PBS 중에 제제화하였고, 이는 또한 대조군에서 비히클로서 사용하였다.
TPP-2090의 강력한 단독요법 효능은 SCC4 (두 & 경부암) 및 A375 (흑색종) 이종이식편에서 관찰되었고, 중간 정도의 효능이 BxPC3 (췌장암) 이종이식편에서 관찰되었다 (표 37 참조). 특정 이종이식편 모델에서 TPP-2090의 단독요법 효능이 한계가 있는 경우에 (ACHN (신세포암), PA-1 (난소암), NCI-292 (비소세포 폐암) 및 U87MG (교모세포종)), 보다 높은 단독요법 효능에 도달하기 위해서는 항-TWEAKR 항체의 보다 강한 투여 스케줄이 요구될 수 있다.
<표 37> TPP-2090으로 단독요법으로 처리된 추가의 인간 암 모델의 종양-대-대조군 (T/C) 비
Figure pct00055
실시예 13: 이종이식편 모델에서 항-TWEAKR 항체의 추가의 작용 방식
TPP-2090의 항종양 효능이 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 의존적인지 또는 효능작용적 활성만으로 이미 충분한지를 평가하기 위해, SCID 베이지 마우스 (장비에르(Janvier))에서 이종이식편 연구를 수행하고, TPP-2090의 비-글리코실화 변이체, 즉 TPP-2658을 NMRI 누드 마우스에서 조사하였다.
이전 연구의 NMRI 누드 마우스에서의 종양 성장과 비슷한 대조군의 종양 성장을 갖는 SCID 베이지 마우스 내 WiDr (인간 결장직장암) 및 SCaBER (인간 방광암) 이종이식편에서 실시예 8에 기재된 바와 같은 동물 연구를 수행하였다. 표준 투여 스케줄은 2주 동안 매주 2회 TPP-2090 i.v. 10 mg/kg (PBS 중에 제제화됨) 단독요법이다.
NK-세포 결여 SCID 베이지 마우스 이종이식편 모델 (WiDr 및 SCaBER)에서 NMRI 누드 마우스에서 관찰된 것과 유사한, TPP-2090의 강력한 단독요법 효능이 발견되었다. 이는 ADCC 비의존적 생체내 작용 방식을 나타낸다 (표 38 참조).
<표 38> TPP-2090으로 단독요법으로 처리된 SCID 베이지 마우스 내 WiDr 및 SCaBER 종양의 종양-대-대조군 (T/C) 비 (비교를 위한 NMRI 마우스)
Figure pct00056
시험관내 분석은 TPP-2090의 HT29 세포 결합이 NK92V 이펙터 세포에 의한 표적 세포의 용량-의존적 ADCC를 야기하는 반면에, 비-글리코실화 TPP-2658은 ADCC를 유도할 수 없음을 나타내었다 (표 40). 1x104개의 HT-29 표적 세포를 분배하고, 시험 항체를 25 μg/ml; 5 μg/ml; 1 μg/ml; 0.2 μg/ml 및 0.04 μg/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 30분 사전인큐베이션 후에, 이펙터 세포를 첨가하였다 (5x104개의 NK92V 이펙터 세포). 37℃에서 4시간 인큐베이션 후에 HT29 세포 용해를 "세포독성 검출 키트 - LDH (로슈)"로 결정하였고, 최대 방출은 1% 트리톤 X-100 중에 용해시킨 세포로부터 수득되었고, 음성 대조군은 항체와 사전인큐베이션시키지 않았다. % HT29 용해의 계산을 위해 하기 식을 사용하였다: [Ext (샘플) - Ext (음성) x 100] / [Ext (최대 방출) - Ext (음성]. TPP-2090은 NK92V 이펙터 세포에 의한 표적 세포의 용량-의존적 ADCC를 야기하였고, N297 글리코실화에 의존적이었다.
그러나 TPP-2090의 비-글리코실화 변이체, 즉 TPP-2658을 WiDr- 또는 A375-이종이식편 모델에서 사용한 경우에 유사한 생체내 효과가 발견되었다 (표 39 참조). 변이체 TPP-2658은 둘 다의 모델에서 TPP-2090과 동등하게 강력한 단독요법 효능을 나타내었고, 이는 ADCC-비의존적 작용 방식을 나타낸다.
<표 39> TPP-2658으로 처리된 WiDr 및 A375-이종이식편의 종양-대-대조군 (T/C) 비 (비교를 위한 TPP-2090)
Figure pct00057
<표 40> 항체 TPP-2090 (hIgG1) 및 TPP-2658 (TPP-2090의 비-글리코실화 대응물 - hIgG1 N297A)을 시험하기 위한 HT-29 표적 세포 및 NK92V 이펙터 세포를 사용한 시험관내 ADCC 검정:
Figure pct00058
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma AG <120> Anti-TWEAKR Antibodies and Uses Thereof <130> BHC 13 1 017 <160> 213 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 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agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct gctttggccc 240 atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300 tggagacgat gccgcaggag agagaagttc accaccccca tagaggagac cggcggagag 360 ggctgcccag ctgtggcgct gatccagtga caatgtgccc cctgccagcc ggggctcgcc 420 cactcatcat tcattcatcc attctagagc cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc 480 caagctcctc caaccacaag gggggtgggg ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc 540 agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa 600 gggagcctca cgctggctca cacaaaacag ctgacactga ctaaggaact gcagcatttg 660 cacaggggag gggggtgccc tccttcctta ggacctgggg gccaggctga cttggggggc 720 agacttgaca ctaggcccca ctcactcaga tgtcctgaaa ttccaccacg ggggtcaccc 780 tggggggtta gggacctatt tttaacacta ggggctggcc cactaggagg gctggcccta 840 agatacagac ccccccaact ccccaaagcg gggaggagat atttattttg gggagagttt 900 ggaggggagg gagaatttat taataaaaga atctttaact ttaaaaaaaa aaaaaaaaa 959 <210> 171 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 171 Pro Tyr Pro Met Xaa 1 5 <210> 172 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 172 Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Xaa Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 173 Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 174 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Xaa Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 175 Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 176 Gln Gln Ser Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Ile Thr 1 5 10 <210> 177 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 177 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc ggctacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctaccag gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300 cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360 cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420 tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480 caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645 <210> 178 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 178 gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc 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acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347 <210> 179 <211> 645 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 179 gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc ggctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300 cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac 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gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 184 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 184 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300 gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 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accagcggca tgggcgtgtc ctggatcaga 120 cagcccagcg gcaagggcct ggaatggctg gcccacatct actgggacga cgacaagcgg 180 tacaacccca gcctgaagtc ccggctgacc atctccaagg acaccagccg gaatcaggtg 240 ttcctgaaga tcaccagcgt ggacaccgcc gataccgcca cctactactg cgccagaaga 300 ggccccgact actacggcta ctaccccatg gactattggg gccagggcac cagcgtgacc 360 gtgtctgcca agaccaccgc ccctagcgtg taccctctgg cccctgtgtg tggcgacacc 420 accggcagct ctgtgactct gggctgcctg gtcaagggct acttccccga gcccgtgaca 480 ctgacctgga acagcggcag cctgagcagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcag 540 agcgacctgt acaccctgag cagctccgtg accgtgacaa gcagcacctg gcccagccag 600 agcatcacct gtaacgtggc ccaccccgcc agcagcacca aggtggacaa gaagatcgag 660 cccagaggcc ccaccatcaa gccctgcccc ccttgcaagt gcccagcccc caatctgctg 720 ggcggaccca gcgtgttcat cttcccaccc aagatcaagg acgtgctgat gatcagcctg 780 agccccatcg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtccgagg acgaccccga cgtgcagatc 840 agttggttcg tgaacaacgt ggaagtgcac accgcccaga cccagaccca cagagaggac 900 tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgcc ctgcccatcc agcaccagga ctggatgagc 960 ggcaaagaat tcaagtgcaa agtgaacaac aaggacctgc ctgcccccat cgagcggacc 1020 atcagcaagc ccaagggcag cgtgcgggct ccccaggtgt acgtgctgcc cccacccgag 1080 gaagagatga ccaagaagca ggtcacactg acctgcatgg tcaccgactt catgcccgag 1140 gacatctacg tggaatggac caacaacggc aagaccgagc tgaactacaa gaacaccgag 1200 cctgtgctgg acagcgacgg cagctacttc atgtacagca agctgcgggt ggaaaagaaa 1260 aactgggtgg aacggaacag ctacagctgc agcgtggtgc acgagggcct gcacaaccac 1320 cacaccacca agagcttcag ccggaccccc ggc 1353 <210> 213 <211> 449 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 213 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly

Claims (22)

  1. 서열 169에 도시된 바와 같은 TWEAKR의 위치 47의 D (D47)에 특이적으로 결합하는 단리된 항-TWEAKR 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 효능작용적 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 식 PYPMX (서열 171)를 포함하며, 여기서 X는 I 또는 M인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR1;
    (b) 식 YISPSGGXTHYADSVKG (서열 172)를 포함하며, 여기서 X는 S 또는 K인 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR2; 및
    (c) 식 GGDTYFDYFDY (서열 173)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 중쇄 CDR3
    을 포함하는 가변 중쇄
    및
    (a) 식 RASQSISXYLN (서열 174)을 포함하며, 여기서 X는 G 또는 S인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR1;
    (b) 식 XASSLQS (서열 175)를 포함하며, 여기서 X는 Q, A, 또는 N인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR2; 및
    (c) 식 QQSYXXPXIT (서열 176)를 포함하며, 여기서 위치 5의 X는 T 또는 S이고, 위치 6의 X는 T 또는 S이고, 위치 8의 X는 G 또는 F인 아미노산 서열에 의해 코딩된 경쇄 CDR3
    을 포함하는 가변 경쇄.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a. 서열 6에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 7에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 8에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 3에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 4에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 5에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    b. 서열 16에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 17에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 18에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 13에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 14에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 15에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    c. 서열 26에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 27에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 28에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 23에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 24에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 25에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    d. 서열 36에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 37에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 38에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 33에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 34에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 35에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    e. 서열 46에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 47에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 48에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 43에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 44에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 45에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    f. 서열 56에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 57에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 58에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 53에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 54에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 55에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    g. 서열 66에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 67에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 68에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 63에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 64에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 65에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    h. 서열 76에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 77에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 78에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 73에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 74에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 75에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    i. 서열 86에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 87에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 88에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 83에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 84에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 85에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    j. 서열 96에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 97에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 98에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 93에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 94에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 95에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    k. 서열 106에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 107에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 108에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 103에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 104에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 105에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄, 또는
    l. 서열 116에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR1 서열, 서열 117에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR2 서열, 서열 118에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄, 및
    서열 113에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR1 서열, 서열 114에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR2 서열, 및 서열 115에 의해 제공된 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    a. 서열 10에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 9에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    b. 서열 20에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 19에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    c. 서열 30에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 29에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    d. 서열 40에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 39에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    e. 서열 50에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 49에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    f. 서열 60에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 59에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    g. 서열 70에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 69에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    h. 서열 80에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 79에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    i. 서열 90에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 89에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    j. 서열 100에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 99에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    k. 서열 110에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 109에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열, 또는
    l. 서열 120에 의해 제공된 바와 같은 가변 중쇄 서열 및 서열 119에 의해 제공된 바와 같은 가변 경쇄 서열.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    a. 서열 2에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 1에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    b. 서열 12에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 11에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    c. 서열 22에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 21에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    d. 서열 32에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 31에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    e. 서열 42에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 41에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    f. 서열 52에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 51에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    g. 서열 62에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 61에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    h. 서열 72에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 71에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    i. 서열 82에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 81에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    j. 서열 92에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 91에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    k. 서열 102에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 101에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열, 또는
    l. 서열 112에 의해 제공된 바와 같은 중쇄 서열 및 서열 111에 의해 제공된 바와 같은 경쇄 서열.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  13. 제12항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나 제12항에 따른 핵산 또는 제13항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  15. 제14항에 있어서, 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
  16. 제15항에 따른 세포의 배양 및 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체-약물 접합체.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 진단제로서 사용하기 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 위한 의약으로서 사용하기 위한 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체-약물 접합체.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제11항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  21. 제20항에 따른 제약 조성물 및 1종 이상의 치료 활성 화합물의 조합물.
  22. 바람직하지 않은 TWEAKR의 존재와 연관된 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제20항에 따른 제약 조성물 또는 제21항에 따른 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
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