TW201609810A - 非糖苷基抗－ｔｗｅａｋｒ抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種特異性針對TWEAKR(TNFRSF12A、FN14)之重組抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區。在Fc區N297(採用Kabat EU編號)包含突變之促效性抗-TWEAKR抗體所造成之非糖苷基抗體相較於包含Fc區之天然序列之抗體具有較低副作用及改善之毒性型態。 因此該等抗體可用於治療腫瘤及其他與TWEAKR之表現相關之疾病及病症。本發明亦提供一種編碼上述抗體之核酸序列、含其之載體、醫藥組成物及附有使用說明書之套組。

Description

非糖苷基抗-TWEAKR抗體及其用途
本發明提供一種對TWEAKR(TNFRSF12A、FN14)具特異性之重組抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區。
因此該等抗體可用於治療腫瘤及與TWEAKR之表現相關之其他疾病及病症。本發明亦提供一種編碼上述抗體之核酸序列、含其之載體、醫藥組成物及附有使用說明書之套組。
已證實基於抗體之療法可以極有效治療各種不同癌症，包括實體腫瘤。例如：HERCEPTIN®已成功用於治療乳癌，及RITUXAN®可以有效治療B-細胞相關之癌症型態。基於抗體之新穎之成功療法之發展重心在於單離一種可對抗被發現優先表現在腫瘤細胞上之細胞表面蛋白質之抗體，其功能在於修飾相應受體之活性。
腫瘤壞死因子(TNF)樣弱凋亡誘導物(TWEAK)及TWEAK受體(TWEAKR、alias TNFRSF12A、FN14、CD266；Swiss Prot Acc.Q9NP84,NP_057723)為涉及發炎、增生、侵入、轉移、分化、凋亡及血管新生之TNF超級家族配體-受體對(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May；7(5)：411-25；Michaelson JS及Burkly LC,Results Probl Cell Differ.2009；49：145-60)。TWEAK對TWEAKR之結合親和力為0.8-2.4nM，且為TNF家族中唯一會與此受體結合之成員(Wiley SR等人之Immunity.2001 Nov；15(5)：837-46)。TWEAKR在正常組織中之表現程度相當低，但在受傷組織 中之局部表現卻顯著提高，其在組織再造中扮演某種角色(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008年5月；7(5)：411-25；Zhou等人之Mol Cancer Ther.2011 Jul；10(7)：1276-88；Burkly LC等人之Immunol Rev.2011 Nov；244(1)：99-114)。TWEAKR訊號傳導涉及諸如傷口癒合、慢性自體免疫疾病及急性絕血性中風等過程(Burkly LC等人之Immunol Rev.2011 Nov；244(1)：99-114)。此外，TWEAKR高度表現在各種不同實體腫瘤型態，如，例如：胰癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌(CRC)、乳癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、膀胱癌、肝細胞癌瘤、卵巢癌、黑色素瘤及肝與骨轉移(Culp P等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508；Zhou H等人之J Invest Dermatol.2013 Apr；133(4)：1052-62)。TWEAKR表現提高與腫瘤級數提高及/或預後不佳之相關性已說明於：腦癌(Tran NL等人之Cancer Res.2006 Oct 1；66(19)：9535-42)、乳癌(Willis AL等人之Mol Cancer Res.2008 May；6(5)：725-34；Wang J等人之Histol Histopathol.2013 Jan 9[以電子報形式刊登])、食道癌(Watts GS等人之Int J Cancer.2007 Nov 15；121(10)：2132-92007)、攝護腺癌(Huang M等人之Carcinogenesis.2011 Nov；32(11)：1589-96)、胃癌(Kwon OH等人之Cancer Lett.2012 Jan 1；314(1)：73-81)、神經母細胞瘤(Pettersen I等人之Int J Oncol.2013 Apr；42(4)：1239-48)及膀胱癌(Shimada K等人之Clin Cancer Res.2012 Oct 1；18(19)：5247-55)。
TWEAKR之表現係受生長因子誘發，如：FGF、PDGF及VEGF(Winkles JA,Nat Rev Drug Discov.2008 May；7(5)：411-25)。依據此觀察結果，已顯示TWEAKR表現與NSCLC中EGFR之過度表現或過度活化(Whitsett TG等人之Am J Pathol.2012 Jul；181(1)：111-20)及與乳癌中HER2表現(Wang J等人之Histol Histopathol.2013 Jan 9[以電子報形式刊登]；Chao DT等人之J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb；139(2)：315-25)有相關性。
TWEAKR被TWEAK活化會造成TNF-受體相關因子(TRAF)募集至細胞內結合功能域，造成透過典型與非典型NF-κB途徑而延長NF-κB活化作用，並誘發分泌如：IL-8與MCP-1之細胞素(概述於Michaelson JS及Burkly LC之Results Probl Cell Differ.2009；49：145-60)。其係完全依據 所說明之TWEAK/TWEAKR途徑之促炎性角色。然而，負責經由TWEAKR殺死細胞之訊號傳導途徑則較不明瞭，因為TWEAKR缺乏特徵之“死亡功能域”。有些腫瘤細胞株(Kym-1、SKOV-3、OVCAR)中，其透過TNF誘發細胞凋亡並募集TRAF2，隨後由溶酶體降解所得之TRAF2-cIAP複合物(Nakayama M.等人之J Immunol.2002 Jan 15；168(2)：734-43；Schneider P等人之Eur J Immunol.1999 Jun；29(6)：1785-92；Vince JE等人之J Cell Biol.2008 Jul 14；182(1)：171-84)。在其他細胞株(HSC3、HT-29、KATO-III)中，TWEAK所誘發之細胞凋亡據稱與TNF無相關性(Nakayama M等人之J Immunol.2003 Jan 1；170(1)：341-8；Wilson CA等人之Cell Death Differ.2002 Dec；9(12)：1321-33)。最近有關TWEAK對細胞凋亡之誘發作用之報告則顯示其係與刺激Stat-1磷酸化作用相關，因為當於WiDr細胞中使用JAK-抑制劑治療時，會破壞TWEAK提高凋亡蛋白酶(caspase)3/7活化作用之能力(Chapman MS等人之Cytokine.2013 Jan；61(1)：210-7)。
數項研究已證實TWEAKR為腫瘤學的目標。Michaelson等人已在鼠類異種移植模式中顯示，投與TWEAK可降低腫瘤生長(Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75)。已經有許多小組使用促效性之抗-TWEAKR抗體模擬此種抗腫瘤效應。有潛力之候選藥物，亦即BIIB0036/P4A8)(Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75)及PDL-192(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)已經利用小鼠之免疫接種及隨後選拔純系及人類化來產生。
PDL-192與TWEAKR結合之結合親和力為5.5nM(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)，並抑制數種表現TWEAKR之癌細胞株之生長。此外，相較於TWEAK配體，PDL-192已在增生與細胞凋亡分析法之EC/IC50上顯示較低之效力，且在凋亡蛋白酶3/7活化作用上僅顯示下降之效力(Vmax)(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。剖析較大族群之乳癌細胞株型態時證實，單體PDL-192僅具有輕度抗增生活性(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508；Chao DT等人之J Cancer Res Clin Oncol.2013 Feb；139(2)：315-25)，在27種細胞株中僅對5種具有>20%之抑制增生效應。抗體之交聯或固定化可以稍微加強抗體之抗增生活性。此外，PDL-192具有ADCC，且在異種移植模式中說明之抗腫瘤活性被認為係ADCC與腫瘤細胞生長抑制效應之混合(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。PDL-192之另一項限制為缺乏物種交叉反應性，尤指小鼠與大鼠，以致例如：無法在臨床前共通分析法中作為毒物研究用。使用PD-L192之臨床試驗之第一項結果顯示有限毒性劑量(dose limiting toxicity)相當低，為1-1.5mg/kg之劑量(Lam等人之Abstract C18,Mol.Cancer Ther.2011；10：C18)。
作為候選藥物之第二種促效性抗TWEAKR抗體為BIIB036/P4A8，其與TWEAKR之結合親和力為1.7nM，係在類似內因性配體TWEAK之範圍內(Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75)。此抗體顯示可以誘發活化NF-κB，並在癌細胞中釋放細胞素，儘管其效力顯著低於Fc-TWEAK，但可溶性TWEAK之hIgG1 Fc-融合物(aa 106-249)仍具有類似重組可溶性TWEAK之活性(Michaelson JS等人之Oncogene.2005 Apr 14；24(16)：2613-24)。此點同樣於細胞增生分析法中證實，並在使用抗體處理細胞後如TUNEL染色法所顯示，可以誘發細胞凋亡，其中BIIB036/P4A8之效力亦顯著低於Fc-TWEAK。抗體在多聚化後會提高抗增生活性，但該多聚化型之效力仍低於重組Fc-TWEAK。反之，BIIB036/P4A8為ADCC之強力誘發劑，且在異種移植模式中之抗腫瘤活性亦顯示極需依賴Fc效應子功能。
除了這兩種候選藥物外，亦已說明數種鼠類抗體可能需要經過抗體工程人類化處理，使其適用於人類療法。第一種對癌細胞具有抗增生活性之抗-TWEAKR抗體為Nakayama等人說明之第1至4項抗體(Nakayama M等人之Biochem Biophys Res Commun.2003 Jul 11；306(4)：819-25)。然而，此等抗體僅具有相當弱之促效活性，並顯示其在TWEAK所介導之TWEAKR活化作用上可作為部份促效劑/拮抗劑。抗體136.1及18.3.3(WO2009/020933)顯示高於TWEAK配體之結合親和力，後者無法轉 譯成更有效之凋亡蛋白酶活化作用。抗體P3G5及P2D3(WO2009/140177)誘發癌細胞釋放細胞素之效力顯著低於Fc-TWEAK。
總言之，TWEAKR對相關技藝所說明抗-TWEAKR抗體誘發細胞凋亡及抑制增生之促效活性受到限制，且無法達到或超越內因性配體TWEAK之效力。這種促效活性之缺陷並未歸因於此等抗體對TWEAKR之結合親和力下降，因為其親和力仍在類似內因性配體TWEAK之親和力之範圍內(Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75；Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)，此外，具有較高結合親和力之抗體不一定具有較強力之訊號傳導活性(Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。過去所說明抗體之抗腫瘤活性已顯示需依賴Fc效應子功能，且在小鼠模式亦顯示ADCC在活體內效力中扮演重要角色。此外，帶有FcγRIIIA之低親和力對偶基因之患者由於Fc-FcR交互作用能力較低，因此降低從治療中得到之效益(Varchetta S等人之Cancer Res.2007 Dec 15；67(24)：11991-9)。
因此，極需要一種可以發展之人類抗體，其應具有藉由過度活化TWEAKR之作用來誘發癌細胞凋亡及抑制生長之強力固有能力，其效力應等同或甚至高於內因性配體TWEAK。目前已知經由Fc-Fc受體(FcR)交互作用之活體內交聯係促效性抗TWEAKR抗體之必要特徵。
此外，基於使用PDL-192之臨床試驗之第一項結果顯示在1-1.5mg/kg之相當低之有限毒性劑量(Lam等人之Abstract C18,Mol.Cancer Ther.2011；10：C18)，亦極需要具有改善之安全性與耐受性型態之抗體。
許多年來，誘發細胞凋亡及抑制增生即為誘發患者之抗腫瘤效應之有效觀念(Hanahan D及Weinberg RA,Cell.2000 Jan 7；100(1)：57-70；Kim R等人之Cancer Chemother Pharmacol.2002 Nov；50(5)：343-52；Fesik SW,Nat Rev Cancer.2005 Nov；5(11)：876-855)，期望此等抗體可以在人類之實體腫瘤中顯示提高之抗腫瘤活性，因此成為治療癌症之可靠之候選藥物。
本發明係有關一種包含突變Fc區之抗體，該突變Fc區缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣(稱為非糖苷基抗體)，且其造成強力活化TWEAKR，因此在顯示過度表現TWEAKR之各種不同癌細胞中導致強力誘發細胞凋亡，並具有改善之安全性及耐受性型態。
本文所說明抗體對癌細胞細胞凋亡之誘發作用比相關技藝所說明所有抗體更有效(例如：PDL-192或BIIB0036/P4A8；例如：需要添加交聯劑)。本發明抗體之獨特性質係基於新穎之結合性抗原決定基特徵在於抗體選擇性結合TWEAKR之位置47之胺基酸(D47)(SEQ ID NO：169；及參見圖1)。
因此本發明抗體適合在單方療法中及在與其他標靶及非標靶抗腫瘤療法之組合中治療癌症及其轉移，特定言之表現TWEAKR之腫瘤，如：結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌、食道癌、黑色素瘤、肝細胞癌瘤、膀胱癌、胃癌、乳癌、胰癌、腎細胞癌瘤、攝護腺癌、卵巢癌及子宮頸癌。
本發明說明之抗體不同於現有抗-TWEAKR抗體之處在於前者可誘發癌細胞凋亡之強力活化作用，其在大多數細胞株中之誘發程度遠優於內因性配體TWEAK。本發明抗體a)強力活化TWEAKR，b)誘發癌細胞之細胞凋亡，c)誘發癌細胞分泌細胞素，d)基於所有此等作用而在活體內腫瘤實驗中造成該抗體之抗腫瘤活性，e)此外，當該抗體於該抗體單獨使用時無法有效治療之實驗條件下與接合肥皂草素(saporine)之二次抗體培養時，亦造成TWEAKR之內化及抑制癌細胞增生，f)可與數種物種交互反應。本文將更詳細說明本發明此等及其他目的。
此外，本發明抗體包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區。已驚人地發現，包含Fc區之N297A(採用Kabat EU編號)突變而造成非糖苷基抗體之促效性抗-TWEAKR抗體具有比包含Fc區之天然序列之抗體較少之副作用及改善之毒性型態。TWEAKR藉由抗-TWEAKR抗體經由結合在細胞上之FcγRIIB而寡聚合，所造成之不當活化作用可能在所觀察到之副作用中扮演重要角色。與其他Fcγ受體及 補體之結合亦強化此效應。
包含Fc區突變造成非糖苷基抗體而使其對Fcγ受體之親和力低於包含野生型Fc區之抗體之此等抗體不再依賴利用Fc-Fc受體(FcR)交互作用之活體內交聯，此點被視為促效性抗TWEAKR抗體所必需。與目前意見矛盾之處在於此等抗體在抗癌症活性上之功能幾乎等同糖苷基化抗體。
雖然排除CH2功能域中之聚醣似乎會顯著影響效應子功能及促效性抗-TWEAKR抗體之副作用及毒性型態，但抗體之其他功能與物理性質(結合性質，等等)仍然不變。明確言之，已知排除聚醣對血清半衰期(Leabman等人之MAbs.2013 Nov-Dec；5(6)：896-903)及與抗原之結合性(參見實例)之影響很小至無影響。
本發明抗體可以與已知醫藥共同投藥，且有些例子中，抗體本身可以經過修飾。例如：抗體可以接合細胞毒性劑、免疫毒素、帶毒體或放射性同位素，以進一步提高效力潛能。
本發明進一步提供一種抗體，其可構成供診斷其中TWEAKR之表現高於正常組織之惡性或發育不良病症之工具。提供一種接合可檢測標記物之抗-TWEAKR抗體。較佳標記物為放射性標記、酵素、發色團或螢光團。
本發明亦有關一種編碼本發明抗體之聚核苷酸、表現本發明抗體之細胞、製造本發明抗體之方法、使用本發明抗體抑制發育不良細胞生長之方法、及使用本發明抗體治療與檢測癌症之方法。
本發明亦有關一種單離之核酸序列，該等序列可分別編碼上述針對TWEAKR之抗原決定基之抗體。本發明核酸適合重組製造抗體。因此，本發明亦有關一種包含本發明核酸序列之載體及宿主細胞。
本發明組成物可用於醫療或預防用途。因此本發明包括一種醫藥組成物，其包含本發明抗體及其醫藥上可接受之載劑或賦形劑。在一項相關態樣中，本發明提供一種治療與不希望出現之表現TWEAKR之細胞有關之疾患或病症之方法。一項較佳具體實施例中，上述疾患為癌症。此等方法包括對有此需要之個體投與有效量之包含本文所說明或所涵括之本發 明抗體之醫藥組成物之步驟。
本發明亦提供一種說明書，指示供使用抗體庫來單離此等集合庫中可以特異性結合TWEAKR之一或多種組員。
圖1：不同物種之TWEAKR半胱胺酸富集功能域(aa 34-68)之排列。(以編號指示全長度構築體(包括訊號序列)中之胺基酸位置；SEQ ID NO：169)
圖2：A-TWEAKR(SEQ ID NO：169)結構之圖解。該圖顯示細胞外功能域(aa 28-80)(SEQ ID NO：168)，其包括半胱胺酸富集功能域(36-67)、穿膜功能域-TM(81-101)、及細胞內功能域(102-129)。TPP-2202-與hIgG1之Fc功能域融合之整個胞外功能域(28-80)。TPP-2203-與hIgG1之Fc功能域融合之截短N-與C-末端之細胞外功能域(34-68)。以黑色粗線代表二硫橋鍵Cys36-Cys49、Cys52-Cys67及Cys55-Cys64。相較於純的半胱胺酸富集功能域，TPP-2203在N-末端多包含兩個胺基酸，及在C-末端多包含一個胺基酸，以確保適當的折疊。TPP-1984-與HIS6標籤融合之截短C-末端之細胞外功能域(28-68)。這三種構築體均與本文所揭示抗體及PDL-192(TPP-1104)顯示類似之結合性。P4A8(TPP-1324)僅結合整個細胞外功能域(TPP-2202)。
B-細胞外功能域之胺基酸序列：公開已知aa46為TWEAK配體結合性之必要條件，已經判別aa47為本發明抗體結合性之必要條件。
圖3：TWEAKR胞外功能域與本文所揭示抗體及參考抗體之交互作用。圖中出示使用TWEAKR-Fc融合蛋白質(TPP-2202)塗層(1μg/ml)與0.08μg/ml(空心粗線)及0.3μg/ml(實心粗線)生物素基化IgG(作為可溶性結合對象)之ELISA結果。採用鏈親和素(Streptavidin)-HRP及Amplex-Red作為受質進行檢測。Y為“ELISA訊號強度[Rfu]”；X為“試驗抗體構築體”：a為“TPP-2090”；b為“TPP-2084”；c為“PDL-192(TPP-1104)”；d為“P4A8(TPP-1324)”；e為“P3G5(TPP-2195)”；f為“136.1(TPP-2194)”；h為 “ITEM1”；i為“ITEM4”；j為鼠類同型對照組；k為人類同型對照組。所有試驗抗體均在濃度80ng/ml下顯示飽和之結合性。
圖4：TWEAKR半胱胺酸富集功能域與本文所揭示抗體及參考抗體之交互作用。圖中出示使用TWEAKR(34-68)-Fc融合蛋白質(TPP-2203)塗層(1μg/ml)與0.08μg/ml(空心粗線)及0.3μg/ml(實心粗線)生物素基化IgG(作為可溶性結合對象)之ELISA結果。採用鏈親和素-HRP及Amplex-Red作為受質進行檢測。Y為“ELISA訊號強度[Rfu]”；X為“試驗抗體構築體”：a為“TPP-2090”；b為“TPP-2084”；c為“PDL-192(TPP-1104)”；d為“P4A8(TPP-1324)”；e為“P3G5(TPP-2195)”；f為“136.1(TPP-2194)”；h為“ITEM1”；i為“ITEM4”；j為鼠類同型對照組；k為人類同型對照組。本發明抗體可結合半胱胺酸富集功能域。
圖5：TWEAKR(28-68)與本文所揭示抗體及參考抗體之交互作用。圖中出示使用TWEAKR(28-68)-HIS(TPP-1984)塗層(1μg/ml)與0.08μg/ml(空心粗線)及0.3μg/ml(實心粗線)生物素基化IgG(作為可溶性結合對象)之ELISA結果。採用鏈親和素-HRP及Amplex-Red作為受質進行檢測。Y為“ELISA訊號強度[Rfu]”；X為“試驗抗體構築體”：a為“TPP-2090”；b為“TPP-2084”；c為“PDL-192(TPP-1104)”；d為“P4A8(TPP-1324)”；e為“P3G5(TPP-2195)”；f為“136.1(TPP-2194)”；h為“ITEM1”；i為“ITEM4”；j為鼠類同型對照組；k為人類同型對照組。本發明抗體可結合半胱胺酸富集功能域。抗體P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、ITEM-1與ITEM-4均顯示受損之結合性。
圖6：A-半胱胺酸富集功能域之丙胺酸掃瞄圖。分析TWEAKR(34-68)-Fc之突變蛋白質之PDL-192(TPP-1104)(X)與TPP-2090(Y)結合性。S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A及L65A突變蛋白質係表現在HEK293細胞(黑色菱形)。塗佈PDL-192(TPP-1104)及TPP-2090(1μg/ml)，添加稀釋8倍之HEK293發酵營養液上清液，測定TWEAKR突變蛋白質結合性。X為“PDL-192(TPP-1104) 交互作用之ELISA強度[Rfu]”，Y為“TPP-2090交互作用之ELISA強度[Rfu]”。TPP-2090(Y)顯示D47A TWEAKR突變蛋白質之受損之結合性(實心框線)及PDL-192(TPP-1104)(X)顯示對R56A之受損之結合性(虛點框線)。
B-Y為“經過WT結合訊號[%]校正之結合性%”，1為“TPP-2090”；2為“PDL-192(TPP-1104)”；3為“ITEM-1”。塗佈抗體(1μg/ml)，添加250ng/ml之TWEAKR變異體(TWEAKR(34-68)-Fc之D47A突變蛋白質)與TWEAKR(34-68-Fc)，利用抗-HISHRP檢測。TTP-2090顯示其與D47A突變蛋白質之結合性比WT構築體低5%。PDL-192及ITEM-1均依相等之嚴格性與這兩種構築體結合。Y之計算法如下：訊號強度TWEAKR(34-68)Fc-D47A突變蛋白質/訊號強度TWEAKR(34-68)-Fc)* 100。
C-Y為„TWEAKR(34-68)-Fc之D47A突變蛋白質相對於WT結合訊號(TWEAKR(34-68-Fc)[%]校正之結合性%“，1為„TPP-2090”；2為“TPP-2149”，3為“TPP-2093”；4為“TPP-2148”；5為“TPP-2084”；6為“TPP-2077”；7為“TPP-1538”；8為“TPP-883”；9為“TPP-1854”；10為“TPP-1853”；11為“TPP-1857”；12為“TPP-1858”；13為“PDL-192(TPP-1104)”。塗佈抗體(1μg/ml)，添加250ng/ml之TWEAKR變異體，利用抗-HIS HRP檢測。除了PDL-192外，所有變異體均顯示比對WT構築體低5%之結合性。Y之計算法如下：訊號強度TWEAKR(34-68)Fc-D47A突變蛋白質/訊號強度TWEAKR(34-68)-Fc)* 100。
圖7：如Pellegrini等人(FEBS 280：1818-1829)所公開之TWEAKR胞外功能域之NMR結構。TWEAK結合性依賴L46(Pellegrini等人)，TPP-2090結合性依賴D47，及PDL-192結合性依賴R56。PDL-192結合在TWEAK配體結合位點之相反位置，TPP-2090直接結合TWEAK配體位點。
圖8：為了區分本文所揭示抗體與及參考抗體之結合性抗原決定基，而進行競爭性實驗。即使注射第二抗體後仍缺乏第二結合性，此表示各成對抗體內明顯有競爭性。沒有競爭性之成對抗體則在注射第二抗體後 出現顯著高於背景之結合訊號。此外並檢測自我競爭性(第一與第二抗體相同)作為內部系統對照組。(-)表示沒有檢測到第二結合性；(+)表示有第二結合性。本文所揭示抗體會與所有試驗抗體競爭。
圖9：為了區分本文所揭示抗體與及參考抗體之結合性抗原決定基，而進行競爭性實驗。一般將所有分析之抗-TWEAKR抗體分成三個獨立“競爭組”。其中一組僅包含TPP-2084及TPP-2090，此二者均顯示與所有其他試驗成員之競爭性。此等其他成員可再分成兩組抗體，其彼此之間沒有出現任何競爭性。本文所揭示兩種抗體均可結合新穎及獨特之抗原決定基。
圖10：所有29種已知TNF受體超級家族成員之同系物樹狀圖。最接近之同系物TNFRSF13C及TNFRSF17僅具有約30%序列同一性。
圖11：供選擇性分析TPP-2090之所有29種TNF受體超級家族成員之結合性ELISA。出示ELISA之結果；Y為“ELISA訊號強度[Rfu]”；X為“試驗之TNF受體超級家族蛋白質(Fc-融合物蛋白質)”：1為“TWEAKR”；2為“TWEAKR”；3為“Apo-3”；4為“Trail-R1”；5為“Trail-R2”；6為“CD385”；7為“CD95”；8為“Rank”；9為“TNF-R1”；10為“TNF-R2”；11為“BAFF-R”；12為“DcR3”；13為“BCMA”；14為“TACI”；15為“OX40”；16為“CD30”；17為“CD27”；18為“CD40”；19為“護骨素(osteoprotegerin)”；20為“EDAR”；21為“GITR”；22為“HVEM”；23為“NGFR”；24為“Trail R3”；25為“淋巴毒素(Lymphotioxin)ß R”；26為“Trail R4”；27為“EDA2R”；28為“TROY”；29為“RELT”；30為“4-1BB”。(1)中使用300pM TPP-2090，(2)中使用75nM。(1)在300pM之極低濃度下即與TPP-2090結合，及(2)則在75nM高濃度下對TWEAKR達飽和結合性。分析所有其他TNF受體超級家族成員(3至30)之結合性時，使用75nM TPP-2090。TPP-2090選擇性結合TWEAKR。
圖12：分析抗-TWEAKR抗體與HT-29細胞之結合性之FACS。Y為“經過背景校正之FACS訊號[au]之幾何平均值”。其中出示FACS分析與10μg/ml之指定抗體培養之HT-29細胞之螢光值扣除僅與二次抗體培養 之HT-29細胞之螢光值幾何平均值後之數值。本文所揭示抗體(TPP-1538、TPP-2084、TPP-2090)在此濃度下顯示低於已知抗體[PDL-192(TPP-1104)與P4A8(TPP-1324)]之細胞結合性。
圖13：HT-29細胞中抗-TWEAKR抗體對凋亡蛋白酶3/7之活化作用。X為“試驗抗-TWEAKR抗體[μg/ml]”；Y為“相對光單位[RLU]”。HT-29細胞與指定不同濃度之抗-TWEAKR抗體(0.03-300μg/ml)於IFNγ之存在下培養24小時。由凋亡蛋白酶3/7 Glo試劑(Promega)之發光度來測定凋亡蛋白酶3/7活性，相對於抗體濃度作圖。出示分別進行三重覆之1至3項代表性實驗之平均值，包括標準偏差。實心符號代表本文所揭示抗體，空心符號代表已知抗體[PDL-192(TPP-1104)；P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]。本文所揭示抗體(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)對誘發凋亡蛋白酶3/7活化作用顯示比已知抗體[PDL-192(TPP-1104)；P4A8(TPP-1324)及136.1(TPP-2194)]更強之效力。
圖14：抗-TWEAKR抗體於WiDr(A)及786-O(B)細胞中之抗增生活性。X為“試驗之抗-TWEAKR抗體[μg/ml]”；Y為“相對於未處理之對照細胞之增生作用之細胞增生[%]”。細胞與所指定不同濃度之抗-TWEAKR抗體(0.03-300μg/ml)培養96h(不含WiDr細胞，含IFNγ之786-O細胞)。出示代表性實驗進行三重覆之平均值及以誤差條表示之標準偏差。實心符號：本文所揭示抗體，空心符號：已知抗體[PDL-192(TPP-1104)及P4A8(TPP-1324)]。本文所揭示抗體(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)在抑制細胞增生上顯示比已知抗體[PDL-192(TPP-1104)及P4A8(TPP-1324)]更強之效力。
圖15：抗-TWEAKR抗體於A375細胞中誘發分泌IL-8。X為“試驗之抗-TWEAKR抗體[μg/ml]”；Y為“IL-8含量[pg/ml]”。A375細胞與所指定不同濃度之抗-TWEAKR抗體(0.03-300μg/ml)培養。處理24小時後測定細胞上清液之IL-8含量，並相對於所使用之抗體濃度作圖。出示1-3次代表性實驗進行三重覆之平均值，包括以誤差條表示之標準偏差。實心符號表示本文所揭示抗體，空心符號表示已知抗體[PDL-192(TPP-1104)； P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]，並出示使用同型對照組抗體之處理(C)。本文所揭示抗體(TPP-1538、TPP-1854、TPP-2084、TPP-2090)在誘發A375細胞分泌IL-8上顯示比已知抗體[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]更強之效力。
圖15a：抗-TWEAKR抗體TPP-2090及TPP-2658於A375細胞中誘發分泌IL-8，並與非結合性同型對照組(C)比較。X為“試驗之抗-TWEAKR抗體[μg/ml]”；Y為“IL-8含量[pg/ml]”。A375細胞與所指定不同濃度之抗-TWEAKR抗體(0.01-100μg/ml)培養。處理24小時後測定細胞上清液之IL-8含量，並相對於所使用之抗體濃度作圖。出示進行三重覆之數值，包括標準偏差。相較於TPP-2090，TPP-2658可強力誘發IL-8分泌。
圖16：抗-TWEAKR抗體於小鼠之異種移植物中誘發分泌人類IL-8b。
A：帶有WiDr異種移植腫瘤之小鼠接受單一劑量3mg/kg TPP-2090(空心符號)或媒劑(C-實心符號)處理，並在處理後不同時間點測定帶腫瘤小鼠之血漿中之人類IL-8含量(IL-8pg/ml)。X為“處理後小時數[h]”；Y為“Il-8含量[pg/ml]”。出示每組3隻動物之結果，以誤差條代表標準偏差。以TPP-2090處理後，在帶WiDr腫瘤之小鼠中明確地隨時間之變化誘發分泌人類IL-8。
B：帶A375腫瘤(實心符號)或未帶腫瘤(空心符號)小鼠接受單一劑量10mg/kgTPP-1538、媒劑或同型對照組抗體處理。C1為“媒劑對照組”；C2為“同型對照抗體”；Y為“人類Il-8含量[pg/ml]”。出示處理後7小時，在每組4隻小鼠之血清中測定之人類IL-8含量。TPP-1538在帶A375腫瘤小鼠中明確地誘發分泌IL-8，但在經過相同處理之無腫瘤動物中則沒有誘發分泌。
圖17：當抗體結合內因性TWEAKR表現細胞時，以顯微鏡觀察TWEAKR之特異性內化隨時間之變化(InCell Analyzer分析儀)。於腎癌細胞株786-O上研究TPP-1538及TPP-2090之內化。以經過本文所揭示抗體(1μg/ml)或同型對照組C(5μg/ml)處理後之顆粒數/個細胞相對於所指定不同培養時間作圖(X為“時間[min]”；Y為“顆粒數/個細胞[數量]”)。本文所 揭示抗體(TPP-1538、TPP-2090)於TWEAKR表現細胞中顯示快速及特異性之內化。
圖18：抗-TWEAKR抗體在與接合肥皂草素之二次抗體培養後抑制786-O細胞增生(Hum-Zap分析法)。786-O細胞與TWEAKR或同型對照抗體於10nM抗體濃度之接合肥皂草素之二次抗體之存在或不存在下培養48小時(不含IFNγ)。X為“試驗抗體變異體”，a為“媒劑對照組”，b為“同型對照抗體”，c為“TPP-2084”，d為“TPP-2090”；Y為”相對於未處理對照組細胞之細胞增生[%]”。由相對於未處理對照組細胞之細胞增生相對於在接合肥皂草素之二次抗體之存在(空心粗線)或不存在(實心粗線)下經過不同抗體處理之786-O細胞作圖。出示一項代表性實驗之三重覆結果，並以誤差條代表標準偏差。在該實驗條件下，僅本文所揭示抗體(TPP-2084、TPP-2090)在偶聯肥皂草素之二次抗體之存在下幾乎完全抑制786-O細胞增生。因此，抗-TWEAKR抗體在接合肥皂草素之二次抗體之存在下所觀察到之抗增生效力即為抗體-複合物結合TWEAKR表現細胞後所造成肥皂草素特異性內化之結果。
圖19：於接種腫瘤細胞後第7天開始使用0.3、1.0及3.0mg/kg(i.v.，q4dx3)之抗-TWEAKR抗體處理人類腎細胞癌症異種移植物786-O後之效力。其中出示第40天之最終腫瘤重量。A為“載劑組，使用PBS處理(i.v.q4dx3)”。B為“同型，3mg/kg”，C為“TPP-2084，0.3mg/kg”，D為“TPP-2084，1mg/kg”，E為“TPP-2084，3mg/kg”，F為“TPP-2090，0.3mg/kg”，G為“TPP-2090，1mg/kg”，H為“TPP-2090，3mg/kg”。(Y為“腫瘤重量平均值，n=8；SD[g]”)。
圖20：3mg/kg TPP-2090(i.v.，q4dx7)單方療法及與抗癌妥(Irinotecan)(5mg/kg，i.v.，使用4天，停用3天)及癌瑞格(Regorafenib)(10mg/kg，p.o.，每天)之組合療法對人類結腸癌異種移植物WiDr之效力。在接種後7天確定腫瘤為約40mm2時開始處理。A為“載劑組，使用PBS處理(i.v.q4dx7)”。B為“TPP-2090，3mg/kg”，C為“TPP-2090、10mg/kg”，D為“抗癌妥，5mg/kg”，E為“組合TPP-2090 3mg/kg+抗癌妥5mg/kg”，F 為“癌瑞格，10mg/kg”，G為“組合TPP-2090 3mg/kg+癌瑞格10mg/kg”。(X為”接種後時間[天]”，Y為“腫瘤面積，n=10之平均值；SD[mm2])。
圖21：10mg/kg TPP-2090(i.v.，q4dx8)於單方療法及與太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(16mg/kg，i.v.，q7dx4)組合療法中對人類肺癌異種移植物NCI-H322之效力。在接種14天後確定腫瘤約45mm2時開始處理。A為“載劑組，使用PBS處理(i.v.q4dx8)”。B為“TPP-2090，5mg/kg”，C為“TPP-2090，10mg/kg”，D為“太平洋紫杉醇，16mg/kg”，E為“組合TPP-2090 10mg/kg+太平洋紫杉醇16mg/kg”。(X為”接種後時間[天]”；Y為“腫瘤面積，n=10之平均值；SD[mm2]”)。
圖22：使用本文所揭示抗體處理後減少異種移值物中之增生細胞。取經過PBS(i.v.，q4dx7：A)或TPP-2090(10mg/kg，i.v.q4dx7：B)處理之WiDr異種移植腫瘤之冷凍切片，利用免疫組織化學之染色法，檢測增生標記物Ki67。在接種腫瘤細胞後第7天開始處理，並在試驗結束時(第29天)從取出之腫瘤製備冷凍切片。每組分析N=3個腫瘤，並出示代表性影像。使用TPP-2090處理小鼠之WiDr異種移植腫瘤時，造成強力減少Ki67陽性細胞(在影像中呈深色染色之細胞)。
圖23：利用抗-TWEAKR抗體於活體內誘發Stat-1與NF-κB2訊號傳導途徑。取快速冷凍之WiDr異種移植腫瘤經過PBS(i.v.，q4dx7：條帶1與2)或TPP-2090(3mg/kg，i.v.，q4dx7：條帶3與4)處理後之溶胞液進行西方墨點分析，使用P-Stat1(a)、Stat-1(b)、NF-κ2-p52(c)及GAPDH(d)之特異性抗體檢測。在接種腫瘤細胞後第7天開始處理小鼠，並於試驗結束時(第29天)，由取出快速冷凍之腫瘤製備溶胞液。出示每組2隻代表性動物之墨點。使用TPP-2090處理時，在WiDr異種移植腫瘤中強力誘發P-Stat1與總Stat1含量及誘發NF-κB2活化作用(由出現p52條帶得知)。
圖23A：利用抗-TWEAKR抗體於WiDr細胞中，於活體外誘發Stat-1與NF-κB2訊號傳導途徑。WiDr細胞之溶胞液經過PBS(條帶1)、100μg/ml之IgG1-同型對照組抗體(條帶2)、0.1/1/10/100μg/ml之TPP-2090(條 帶3-6)、0.1/1/10/100μg/ml之TPP-2658(條帶9-12)或10/300ng/ml重組體人類TWEAK(條帶7&8)處理24小時後進行西方墨點分析，使用P-Stat1(a)、Stat-1(b)、NF-κ2-p52(c)、TWEAKR(d)及GAPDH(e)之特異性抗體檢測。使用TPP-2090及TPP-2658處理時，在WiDr細胞中對P-Stat1與TWEAKR含量具有同樣誘發程度並誘發NF-κB2活化作用(由出現p52條帶得知)。
圖24：抗-TWEAKR抗體之共同序列。CDR-H1-位置5之X：M或I；CDR-H2-位置8之X：S或K；CDR-L1-位置8之X：G或S；CDR-L2-位置1之X：N、A或Q；CDR-L3-位置5之X：T或S；位置6之X：S或T；位置8之X：F或G。
圖25：連續CDR序列命名法。(A)框線中之位置係隨突變群集(突變過程)而有多樣變化。(B)框線中之單一取代係於一個重組庫中重組。
圖26：本文所揭示之序列。
本發明係基於發現一種新穎抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留之N-連接位點之聚醣之突變Fc區(稱為非糖苷基抗體)，對TWEAKR具有特異性親和力，並對個體提供醫療效益。本發明抗體可為用於許多方面之人類抗體、人類化抗體、或嵌合抗體，本文將有更詳細說明。
定義
除非另有說明，否則所有技術與科學術語均具有熟悉本發明所屬相關技術者習知之定義。然而，下列參考文獻可為熟悉本發明所屬相關技術者提供本發明所採用許多術語之一般定義，只要此等定義符合相關技藝習知之定義即可作為參考並採用。此等參考文獻包括(但不限於)：Singleton等人之Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編輯，1988)；Hale & Marham之The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)； 及Lackie等人之The Dictionary of Cell & Molecular Biology(第3版，1999)；及Cellular and Molecular Immunology，Abbas、Lichtman與Pober編輯，第2版，W.B.Saunders Company。任何可提供本文所採用術語且具有相關技藝上習知定義之熟悉此相關技術者可取得之任何其他技術來源均可用於諮詢。為了本發明之目的，進一步定義下列術語。其他術語則如本文之另外說明。本文及附錄之申請專利範圍所採用單數型式"一"與"該"係包括所提及之複數型，除非另有明確說明。因此，例如：提及"一種基因"時係指一或多種基因，且包括彼等熟悉此相關技術者已知之其同等物，等等。
術語"多肽"及"蛋白質"在本文中交換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。該術語亦適用於其中一個或多個胺基酸殘基為對應於天然胺基酸之人造化學擬似物之胺基酸聚合物，及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物。除非另有說明，否則特定多肽序列亦包括其經保留性修飾之變異體。
術語"抗-TWEAKR抗體"及"結合TWEAKR之抗體"係指可依充份親和力結合TWEAKR之抗體，使得該抗體適用於靶向TWEAKR之診斷劑及/或醫療劑。一項具體實施例中，抗TWEAKR抗體與非相關之非TWEAKR蛋白質之結合程度比該抗體與TWEAKR之結合程度降低約10%，其係由例如：表面電漿共振儀(SPR)測定。某些具體實施例中，一種會結合TWEAKR之抗體之解離係數(KD)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、或0.001nM(例如：10-8M或以下，例如：10-8M至10-13M，例如：10-9M至10-13M)。某些具體實施例中，抗-TWEAKR抗體所結合TWEAKR之抗原決定基係保留在不同物種之TWEAKR中之抗原決定基。
本文所採用術語"抗體"意指免疫球蛋白分子，其較佳係由4條多肽鏈(兩條重(H)鏈與兩條輕(L)鏈)通常在中間利用二硫鍵連接所組成。各重鏈係由重鏈可變區(本文縮寫為VH)與重鏈恆定區組成。該重鏈恆定區可包含例如：三個功能域CH1、CH2及CH3。各輕鏈係由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)與輕鏈恆定區組成。該輕鏈恆定區係由一個功能域(CL)組成。該VH與VL區可再分成高度可變區，稱為互補決定區(CDR)，中間穿插保留 性較高之區，稱為架構區(FR)。各VH與VL通常由三個CDR與至多4個FR組成。其依胺基末端往羧基末端方向之排列為例如：下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本文所採用術語"互補決定區(CDR；例如：CDR1、CDR2、與CDR3)"係指抗體可變功能域之胺基酸殘基，其存在係抗原結合性之必要條件。各可變功能域通常具有3個CDR區，稱為CDR1、CDR2及CDR3。各互補決定區可包含來自"互補決定區"之胺基酸殘基，其係依Kabat之定義(例如：約指輕鏈可變功能域之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變功能域之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人之Sequences of Proteins of Immulological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或彼等來自"高度可變環"之殘基(例如：約指輕鏈可變功能域殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變功能域之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。有些例子中，互補決定區可包括來自根據Kabat所定義CDR區及來自高度可變環之胺基酸。
依其重鏈之恆定功能域之胺基酸序列而定，完整之抗體可分成不同"類"。完整抗體有5大類：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且其中幾種可再分成"小類"(同型)，例如：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。一類較適用於本發明之免疫球蛋白為IgG。
對應於不同類抗體之重鏈恆定功能域分別稱為[α]、[δ]、[ε]、[γ]、及[μ]。不同類免疫球蛋白之亞單位結構及三維組態係習知者。本文所採用抗體為常見之已知抗體及其功能片段。
抗體/免疫球蛋白之“功能片段”或“抗原結合性抗體片段”之定義為抗體/免疫球蛋白中保留抗原-結合區之片段(例如：IgG之可變區)。抗體之“抗原-結合區”通常出現在抗體之一個或多個高度可變區，例如：CDR1、-2、與/或-3區；然而，該可變“架構”區亦可能在抗原結合性上扮演重要角色，如：作為CDR之模架。較佳係“抗原結合區”至少包含可變輕(VL)鏈之胺基酸殘基4至103及可變重(VH)鏈之5至109，更佳係VL之胺基酸殘基 3至107及VH之4至111，及特別佳係整個VL及VH鏈(VL之胺基酸位置1至109及VH之1至113；依據WO 97/08320之編號)。
“功能片段”或“抗原結合性抗體片段”包括Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段；雙價抗體；單一功能域抗體(DAb)、線性抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及由抗體片段形成之多重特異性，如：雙重-及三重-特異性抗體(C.A.K Borrebaeck編輯(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel編輯(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。咸了解，"多重特異性"或"多重功能性"抗體以外之抗體係指其各結合性位點均相同。F(ab’)2或Fab可經過工程處理，以儘量減少或完全排除出現在CH1及CL功能域之間之分子間二硫鍵交互作用。
本文所採用術語"Fc區"係定義免疫球蛋白重鏈中包含至少一部份恆定區之C-末端區。該術語包括天然序列Fc區及變異體Fc區。一項具體實施例中，人類IgG重鏈Fc區係從Cys226或從Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非另有說明，否則Fc區或恆定區之胺基酸殘基編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，其說明於Kabat等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
本所採用術語“非糖苷基抗體”係定義一種包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區之抗體或抗體衍生物。該非糖苷基抗體可為例如：由N297(採用Kabat EU編號)之重鏈糖苷基化位點突變所製得。此等抗體之衍生物可為例如：包含scFv-Fc之抗體。
術語"非糖苷基抗-TWEAKR抗體"及"結合TWEAKR之非糖苷基抗體"係指可以依充份之親和力結合TWEAKR之非糖苷基抗體，使得該抗體適用為靶向TWEAKR之診斷劑與/或醫療劑。
本文所採用術語“非糖苷基促效性抗-TWEAKR抗體”或“促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體”係定義具有促效活性之非糖苷基抗-TWEAKR 抗體。
本發明所涵括抗體或抗原結合性抗體片段之變異體為保持該抗體或抗原結合性抗體片段之結合活性之分子。
本發明所涵括“結合性蛋白質”為例如：抗體擬似物，如：Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies(其說明於Gebauer M.等人之Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D.等人之Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617)。
“人類”抗體或其抗原結合性片段在本文中之定義為非嵌合性(例如：非“人類化”)及(全部或部份)不來自非人類物種者。人類抗體或其抗原結合性片段可衍生自人類或可為合成性人類抗體。“合成性人類抗體”在本文中之定義為該抗體所具有之序列係由電腦依據已知人類抗體序列之分析，由合成性序列完全或部份模擬所衍生之序列。該經由電腦模擬設計之人類抗體序列或其片段之作法為例如：分析人類抗體或抗體片段序列之資料庫，並利用所得資料庫推衍多肽序列。人類抗體或其抗原結合性片段之另一項實例為由自人類來源之抗體序列庫單離之核酸所編碼得到者(例如：此等資料庫係依據得自人類來源之抗體)。人類抗體實例包括說明於Söderlind等人之Nature Biotech.2000,18：853-856中之抗體。
“人類化抗體”或其人類化抗原結合性片段在本文中之定義為其係一種(i)衍生自非人類來源(例如：帶有異源性免疫系統之轉殖基因小鼠)，該抗體係基於人類生殖系序列；(ii)其中非人類抗體之架構區之胺基酸利用基因工程法部份交換成人類胺基酸序列；或(iii)CDR移植，其中可變功能域之CDR來自非人類來源，而可變功能域之一個或多個架構則來自人類來源，且(若有任何)恆定功能域係來自人類來源。
“嵌合性抗體”或其抗原結合性片段在本文中之定義為一種其中可變功能域衍生自非人類來源且部份或所有恆定功能域衍生自人類來源。
本文所採用術語"單株抗體"係指得自實質上同源性抗體之族群之抗體，亦即構成該族群之個別抗體除了可能存在少量之突變(例如：天然突變)外其餘均相同。因此術語"單株"係指該抗體之特徵不為不同抗體之混 合物。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上單一決定子。除了其特異性外，單株抗體製劑之優點在於其通常沒有攙雜其他免疫球蛋白雜質。術語"單株”並不限於要求利用任何特別方法製造之抗體。術語單株抗體明確包括嵌合性、人類化及人類抗體。
"單離"之抗體係一種已經從表現該抗體之細胞之組份中判別且單離之抗體。該細胞之雜質組份為可能干擾該抗體之診斷或醫療用途之材料，且可能包括酵素、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。
"單離"之核酸係一種已經從其天然環境之組份中判別且單離之核酸。單離之核酸包括含在通常包含該核酸分子之細胞中之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置之染色體位置上。
本文所採用“特異性結合”之抗體係指其“特異性針對”或“特異性辨識”所需抗原，例如：腫瘤相關之多肽抗原標靶，係指其與抗原具有充份之結合親和力，使得該抗體適用為靶向表現該抗原之細胞或組織之醫療劑，且不會與其他蛋白質有顯著交叉反應或不會與上述抗原標靶之直向同源系及變異體(例如：突變型、剪接變異體、或蛋白質水解截短型)以外之蛋白質有顯著交叉反應。本文所採用術語"特異性辨識"或"特異性結合"或"特異性針對"特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基係指例如：抗體或其抗原結合性片段對該抗原之單價KD低於約10-4M，或者低於約10-5M，或者低於約10-6M，或者低於約10-7M，或者低於約10-8M，或者低於約10-9M，或者低於約10-10M，或者低於約10-11M，或者低於約10-12M，或更低。抗體“特異性結合”係指若此等抗體可以區分此等抗原與一或多種參考抗原時，表示其可“特異性針對”或“特異性辨識”一種抗原。其最常見型式中，“特異性結合”、“結合特異性”為“特異性針對”或“特異性辨識”，其係指該抗體有能力區分所需抗原與不相關抗原，此點係依據例如：下列一種方法決定。此等方法包括(但不限於)：西方墨點法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試驗及肽掃瞄法。例如：可進行標準ELISA分析法。可採用標準色譜展開法進 行記分(例如：連結辣根過氧化酶之二次抗體及連結過氧化氫之四甲基聯苯胺)。先記錄某些孔中反應之光密度，例如：450nm之光密度。通常背景(=負反應)可為0.1 OD；典型正反應可為1 OD。此表示正/負差異超過5-倍、10-倍、50-倍，較佳超過100-倍。通常，結合性特異性之決定法不使用單一參考抗原，而使用一組約3至5種不相關抗原，如：奶粉、BSA、轉鐵蛋白或類似物。
"結合親和力"或“親和力”係指分子之單一結合位點與其結合對象之間之非共價交互作用之強度總和。除非另有說明，否則本文所採用"結合親和力"係指一對結合對之成員(例如：抗體與抗原)之間依1：1交互作用時之固有結合性親和力。解離係數“KD”常用於說明分子(如：抗體)與其結合對象(如：抗原)之間之親和力，亦即配體與特定蛋白質結合之緊密性。配體-蛋白質親和力會受到兩個分子之間之分子間非共價交互作用影響。可採相關技藝上已知之常用方法測定親和力，包括本文說明之彼等方法。一項具體實施例中，根據本發明"KD"或"KD值"係採用表面電漿共振儀分析法，使用Biacore T200儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)測定。其他合適裝置為例如：Biacore T100、Biacore-2000、Biacore-4000、Biacore-3000、或ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。
本文所採用術語“抗原決定基”包括可以特異性結合免疫球蛋白或T-細胞受體之任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由化學活性表面分子基團組成，如：胺基酸或糖側鏈，或其組合，且通常具有特定之三維結構特徵，及特定之電價特徵。
作為參考抗體之"結合相同抗原決定基之抗體"係指一種在競爭分析法中封阻參考抗體與其抗原之結合性達50%或以上之抗體，及反之指一種在競爭分析法中封阻抗體與其抗原之結合性達50%或以上之參考抗體。本文提供競爭分析法實例。
"抗體-依賴性細胞介導性細胞毒性"或"ADCC"係指一種型式之細胞毒性，其中結合在某些細胞毒性細胞(例如：NK細胞、嗜中性血球、與巨噬細胞)上之Fcγ受體(FcγR)之分泌之Ig使得此等細胞毒性效應子細胞 特異性結合帶抗原之標靶細胞，隨後會例如：利用細胞毒素殺死標靶細胞。分析所需抗體之ADCC活性時，可進行活體外ADCC分析法，如：說明於美國專利案案號5,500,362或5,821,337或美國專利案案號6,737,056(Presta)。適用於此等分析法之效應子細胞包括PBMC及NK細胞。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"係指標靶細胞在補體之存在下溶解。典型補體途徑之活化作用之啟動係由補體系統之第一組份(C1q)結合(適當亞類之)抗體，後者則已結合其同族抗原。分析補體活化作用時，可進行CDC分析法，例如：說明於Gazzano-Santoro等人之J.Immunol.Methods 202：163(1996)。具有改變之Fc區胺基酸序列(具有變異體Fc區之多肽)及提高或降低C1q結合性之多肽變異體說明於例如：美國專利案案號6,194,551 B1及WO 1999/51642。
本文所採用“裸抗體”係指一種沒有接合異源性部份體(例如：細胞毒性部份體)或放射性標記之抗體。此裸抗體可含在醫藥組成物中。
術語“免疫接合物”(可與"抗體-藥物接合物"或"ADC"交換使用)係指一種接合一或多種細胞毒性或細胞生長抑制劑(如：化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如：蛋白質毒素、源於細菌、真菌、植物或動物之酵素活性毒素，或其片段))、或放射性同位素(亦即放射性接合物)之抗體。免疫接合物已用於局部傳送細胞毒性劑，亦即會殺死或抑制細胞生長或增生，用於治療癌症之藥物(例如：Liu等人之Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623))。免疫接合物可以靶向傳送藥物部份體給腫瘤，並在細胞內累積，而全身性投與未接合之藥物可能對正常細胞及/或組織造成無法接受之毒性程度。用於抗體-毒素接合物中之毒素包括細菌毒素(如：白喉毒素)、植物毒素(如：蓖麻素)、小分子毒素(如：格爾德黴素(geldanamycin))。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合性、DNA結合性、或拓樸異構酶抑制作用等機轉來產生其細胞毒性效應。
分別相對於參考聚核苷酸或多肽序列之"序列同一性百分比(%)"之定義係指候選序列之核酸或胺基酸殘基分別與參考聚核苷酸或多肽序列之核酸或胺基酸殘基在經過序列排比並在必要時引進空缺以達到最大 序列同一性百分比時之同一性。保留性取代並不視為序列同一性之一部份。較佳為無空缺之排比。為了決定胺基酸序列同一性百分比之排比法可採用熟悉此相關技術者習知之各種不同方式達成，例如：使用可公開取得之電腦軟體，如：BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟悉此相關技術者可以決定排比序列時之適當參數，包括為了在整個需要比對之序列長度中達成最大排比之任何演算法。
"序列同質性"係指相同之胺基酸或代表保留性胺基酸取代之胺基酸百分比。
術語“成熟抗體”或“成熟抗原結合性片段”，如：成熟Fab變異體包括對指定抗原(如：標靶蛋白質之細胞外功能域)具有更強結合性(亦即提高結合親和力)之抗體或抗體片段之衍生物。成熟係一種判別抗體或抗體片段之6個CDR中造成此親和力提高之少數突變之過程。成熟過程係分子生物學方法之組合，供引進突變至抗體內，並篩選判別已改良之結合物。
“拮抗性”抗體或“封阻性”抗體係一種顯著(部份或完全)抑制其所結合抗原之生物活性之抗體。
"促效性"抗體或具有“促效活性”之抗體係一種會結合其標靶並(部份或完全)誘發各標靶活化作用之抗體，例如：造成受到各標靶介導之訊號傳導途徑或生物效應之活化作用。本文所採用"促效劑/促效性抗體"為擬似所需多肽(此時指TWEAKR配體TWEAK)之至少一種功能活性之抗體。
術語"醫藥調配物"/“醫藥組成物”係指該一種可以讓其中所含活性成份發揮有效生物活性之製劑型式，且其中不再包含可能對接受投與該調配物之個體產生不可接受毒性之其他組份。
胺基酸在本文中係以其常見之已知三字母符號或如IUPAC-IUB生化命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)建議之單字母符號表示。同樣地，核苷酸亦可採用其一般接受之單字母代號表示。
本文所採用術語"載體"係指可以讓其所連接之另一個核酸進行繁殖之核酸分子。該術語包括可呈自行複製核酸結構之載體及進入所引進宿主細胞之基因組中之載體。某些載體可以主導已依操作方式連接之核酸 之表現。此等載體在本文稱為"表現載體"。
術語"宿主細胞"、"宿主細胞株"、及"宿主細胞培養物"可交換使用，並指其中已引進外因性核酸之細胞，包括此等細胞之後代。宿主細胞包括"轉化體"及"轉化細胞"，其包括一代轉化細胞及由其衍生之後代(不論其傳代次數)。後代之核酸含量可能不會與親代細胞完全相同，但可能包含某些突變。從原始之轉化細胞中所篩選或選拔具有相同功能或生物活性之突變後代均包括在本文中。
抗體產生
採用完全人類抗體噬菌體展現集合庫(Hoet RM等人之Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，採用蛋白質淘選法(panning)(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，以人類及鼠類TWEAKR之二聚合Fc-融合之細胞外功能域作為固定標靶，來單離本發明TWEAKR-特異性之人類單株抗體。
判別11種不同Fab-噬菌體，並再選殖對應抗體至哺乳動物IgG表現載體中，其提供一種不存在於可溶性Fab中之缺失CH2-CH3功能域。判別較佳抗體後，此等係呈全長度IgG表現。此等構築體為例如：過渡表現在哺乳動物細胞中者，如說明於：Tom等人之Methods Express：Express Systems之第12章，Micheal R.Dyson與Yves Durocher編輯，Scion Publishing Ltd,2007(參見實例1)。採用蛋白質A層析法純化該抗體，進一步於實例2所說明之ELISA與BIAcore分析法中判別其與可溶性單體TWEAKR之結合親和力特徵。測定抗-TWEAKR抗體之細胞結合性特徵時，採用流式細胞儀測試其與一組細胞株(HT29、HS68、HS578)之結合性。
進行NF-κB報導子基因分析法來分析所有11種已判別抗體(人類IgG1)之促效活性。選拔具有最強活體外效力之抗體(TPP-883)進一步分析其效力及親和力成熟(詳細內容參見實例1)。檢測1株單一取代之變異體之改良之促效活性：CDR-H3之G102T。最後，與最佳之單一取代變異體G102T相比較，依據加強之親和力選拔出7株變異體。再選殖此等之對應DNA至哺乳動物IgG表現載體中，於上述NFkB報導子細胞分析法中測試功能活 性。最後由所得序列與人類生殖系序列比較，並在不會顯著影響親和力與效力下調整其偏差。採用抗體集合庫篩選及調整親和力及/或效力成熟，得到下列抗體：“TPP-2658”、“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、及“TPP-1858”。其中有些抗體具有糖苷基化Fc區。此等很容易利用標準分子生物學方法轉化成非糖苷基抗體。
本發明抗體可進一步利用相關技藝上已知之方法產生，如：抗體噬菌體展現篩選法(例如：參見Hoet RM等人之Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)、已完整建立之雜化瘤技術(例如：參見Köhler及Milstein之Nature.1975 Aug7；256(5517)：495-7)、或小鼠之免疫接種法，特別指hMAb小鼠之免疫接種(例如：VelocImmune mouse®)。
本發明抗體
本發明係有關一種抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區(非糖苷基抗體，並造成強力活化TWEAKR(SEQ ID NO：169(蛋白質)；SEQ ID NO：170(DNA))，因此在各種不同過度表現TWEAKR之癌細胞中強力誘發細胞凋亡。
過去曾說明之抗-TWEAKR抗體(例如：PDL-192)在誘發細胞凋亡及抑制增生作用上之TWEAKR促效活性有限制且無法達到內因性配體TWEAK之效力。這種缺乏促效活性並不歸因於親和力降低，因為此等抗體與TWEAKR之結合親和力係在類似內因性配體TWEAK之範圍內(Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75；Culp PA等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)，且結合親和力較高之抗體不一定具有更有效之訊號傳導活性(Culp PA,等人之Clin Cancer Res.2010 Jan 15；16(2)：497-508)。此外，過去所說明抗體之抗腫瘤活性已顯示依賴Fc效應子功能，且ADCC顯示在小鼠模式之活體內效力中扮演重要角色。
本發明所提供在誘發細胞凋亡及抑制增生作用上具有強力促效活性之抗體可達到活體內抗腫瘤效力，不會受到ADCC顯著影響。
人類Fcγ受體(hFcγR)家族係由活化性受體FcγRI、FcγRIIA、與 FcγRIIIA，及抑制性受體FcγRIIB組成。雖然FcγRI與IgG之結合親和力高(奈莫耳濃度結合常數)，但FcγRIIA、FcγRIIB、及FcγRIIIA與IgG之結合親和力為微莫耳濃度，僅在經由與經調理之抗原之熱烈多價交互作用時才活化。IgG與FcγR之結合性對其CH2功能域上天冬醯胺297(N297)之單一N-連接之糖苷基化位點存在之糖苷基化高度敏感(Jefferis & Lund,2002,Immunol Lett 82：57-65；Arnold等人之2007,Annu Rev Immunol 25：21-50)，而且喪失在N297點突變株中所觀察到與低親和力FcγRs之結合性(Shields等人之2001,J Biol Chem 276：6591-6604；Tao & Morrison,1989,J Immunol 143：2595-2601)、酵素性Fc脫糖苷基化(Mimura等人之2001,J Biol Chem 276：45539-45547)、於N-連接之糖苷基化抑制劑衣黴素之存在下之重組IgG表現(Walker等人之1989,Biochem J 259：347-353)、或於細菌中之表現(Mazor等人之2007,Nat Biotechnol 25：563-565；Simmons等人之2002,J Immunol Methods 263：133-147)。
本發明係有關具有降低之效應子功能之非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其特徵在於該抗體中Fc部份之CH2功能域之保留之N-連接位點經過修飾。本發明一項具體實施例係提供一種促效性抗-TWEAKR抗體，其Fcγ受體結合性低於包含野生型Fc區之抗體。較佳抗體係其與Fcγ受體(活化性受體FcγRI、FcγRIIA、或FcγRIIIA，或抑制性受體FcγRIIB)結合之KD值比包含未修飾Fc區之親本抗體高2倍、或高5倍、或高10倍之抗體。極佳抗體係其與FcγRIIB結合之KD值比包含未修飾Fc區之親本抗體高10倍之抗體。
此等本發明抗體不再依賴經由Fc-Fc受體(FcγR)交互作用之活體內交聯(其被視為促效性抗TWEAKR抗體之必要條件)。較佳係非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其對Fcγ受體之結合性低於包含野生型Fc區之抗體對受體FcγRIIA、FcγRIIB，及甚至更佳為對FcγRIIB之結合性。進一步較佳為人類Fcγ受體。較佳非糖苷基抗-TWEAKR抗體對FcγRIIB(較佳為對人類FcγRIIB)之結合性親和力為超過50μM，或者超過100μM，或者超過200μM。極佳係該結合性親和力(KD)超過200μM。
目前有兩種方式可以降低mAb之效應子功能，同時仍保留其Fc部份之有價值之貢獻。其中一種修飾抗體之方式為使mAb表面上涉及效應子結合性交互作用之胺基酸突變。另一種方式係有關降低效應子功能之非糖苷基抗體，其特徵在於利用例如：位置297或299(採用Kabat EU編號)殘基之突變來修飾該抗體中Fc部份之CH2功能域之保留之N-連接位點。
本發明一項具體實施例中，該修飾包括在重鏈糖苷基化位點進行突變，以防止此位點發生糖苷基化。因此，本發明一項較佳具體實施例中，由重鏈糖苷基化位點突變，亦即於N297(採用Kabat EU編號)突變，並表現在適當宿主細胞中，產生該非糖苷基抗-TWEAKR抗體。較佳為S/T299突變成為丙胺酸或N297突變成為丙胺酸或麩醯胺。極佳為N297突變成為丙胺酸。
本發明較佳具體實施例中，非糖苷基抗-TWEAKR抗體包含人類IgG Fc區，及甚至更佳為包含選自下列各物所組成群中之人類IgG Fc區：人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 Fc區。極佳為人類IgG1 Fc區。
本發明一項具體實施例中，該修飾包括在重鏈糖苷基化位點突變，以防止此位點發生糖苷基化，並組合一或多種選自下列各物所組成群中之會影響Fc受體結合性之突變：E282V、M428I、S298G、T299A、N390D、E382V，及M428L(採用Kabat EU編號)。較佳為E282V與M428I之組合及S298G與T299A、N390D、E382V、及M428L之組合。
本發明一項具體實施例係提供一種非糖苷基抗體，其可在一或多種TWEAKR表現細胞株中強力誘發凋亡蛋白酶-3/7。較佳具體實施例中，該一或多種TWEAKR表現細胞株係屬於WiDr、A253、NCI-H322、HT-29及786-O細胞(較佳為HT-29)所組成之群組。“凋亡蛋白酶3/7之誘發”可採用相關技藝上已知習知方法測定，包括本文說明之彼等方法。一項具體實施例中，根據本發明"凋亡蛋白酶3/7之誘發"係採用凋亡蛋白酶3/7溶液(Promega、#G8093)測定活性並於VICTOR V(Perkin Elmer)上讀取發光度來決定。在培養時間結束時，測定凋亡蛋白酶3/7活性，並與無處理之細胞比較，計算凋亡蛋白酶3/7之誘發倍數。若誘發倍數超過1.2，較佳為超過1.5， 更佳為超過1.8、更佳為超過2.1、更佳為超過2.5時，則稱該抗體可“強力誘發”凋亡蛋白酶-3/7。並提供一種抗-TWEAKR抗體，其可在HT-29細胞造成比過去說明之促效性抗體[例如：PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]及比300ng/ml重組體人類TWEAK更強力誘發凋亡蛋白酶3/7。這種在癌細胞中誘發凋亡蛋白酶3/7之強力效力亦出現在WiDr、A253、NCI-H322及786-O細胞中。有些本文所揭示抗體與TWEAKR僅具有輕度之結合親和力(>10nM)，其顯然低於內因性配體TWEAK之親和力，並低於其他已知促效性抗體。這種性質提供另一種優勢潛力，如，例如：可能改良腫瘤滲透性。
基於此等目標，本發明一項具體實施例提供一種在新穎之抗原決定基上特異性結合TWEAKR之非糖苷基抗體，其特徵在於選擇性結合TWEAKR位置47之天冬胺酸(D)(D47)(SEQ ID NO：169；及參見圖1)。本發明較佳具體實施例提供一種抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區，且在新穎之抗原決定基上特異性結合TWEAKR，其特徵在於選擇性結合性TWEAKR位置47之天冬胺酸(D)(D47)(SEQ ID NO：169；及參見圖1)。本發明較佳具體實施例提供一種抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區，其與Fcγ受體之結合親和力低於包含未修飾Fc區之親本抗體，並在新穎之抗原決定基上特異性結合TWEAKR，其特徵在於選擇性結合TWEAKR位置47之天冬胺酸(D)(D47)(SEQ ID NO：169；及參見圖1)。較佳抗體係與Fcγ受體(活化性受體FcγRI、FcγRIIA、或FcγRIIIA，或抑制性受體FcγRIIB)結合之KD值高於包含未修飾Fc區之親本抗體超過2倍，或者超過5倍，或者超過10倍之抗體。極佳抗體係與FcγRIIB結合之KD值高於包含未修飾Fc區之親本抗體超過10倍之抗體。較佳為此等非糖苷基抗-TWEAKR抗體對FcγRIIB(較佳係人類FcγRIIB)之結合性親和力大於50μM，或者大於100μM，或者大於200μM。結合性親和力(KD)大於200μM為極佳。較佳為Fc區之N297突變形成丙胺酸或麩醯胺(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
抗體交互作用對某些TWEAKR胺基酸之已知依賴性係與針對此等抗體已測定之促效活性具相關性。天然配體TWEAK顯示有效活化TWEAKR且其結合性依賴TWEAKR之半胱胺酸富集功能域之白胺酸46(Pellegrini等人之FEBS 280：1818-1829)。P4A8顯示極低促效活性，且至少與TWEAKR半胱胺酸富集功能域外面之功能域部份交互作用。PDL-192顯示輕度促效活性，並依賴R56而結合在半胱胺酸富集功能域但與TWEAK配體位點相反之位置。本發明抗體(例如：TPP-2658)之結合性依賴D47，及TWEAK之結合性依賴L46，並結合在類似但可區分之結合位點(圖7)。因此，顯示強力促效活性之本發明抗體可結合與極強力促效活性相關之抗體之新穎抗原決定基(依賴D47)。
TWEAKR位置47之胺基酸(D47)(SEQ ID NO：169)對本發明抗體之結合性很重要，當此殘基改成丙胺酸，使抗體之ELISA訊號下降超過20%，或者超過30%，或者超過40%，或者超過50%，或者超過60%，或者超過70%，或者超過80%，或者超過90%，或者100%(如實例2及圖6所說明)時，此表示該抗體特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)(SEQ ID NO：169)。或者，當該抗體對TPP-2614之ELISA訊號比TPP-2203下降超過20%，或者超過30%，或者超過40%，或者超過50%，或者超過60%，或者超過70%，或者超過80%，或者超過90%，或者100%時，表示該抗體特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)(SEQ ID NO：169)。較佳係當該抗體對TPP-2614之ELISA訊號比TPP-2203下降超過80%時，表示抗體特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)(SEQ ID NO：169)。
本發明較佳具體實施例為一種非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)。
本發明另一項較佳具體實施例係一種非糖苷基促效性抗-TWEAKR抗體，其特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)。較佳為在Fc區包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。本發明另一項較佳具體實施例為一種促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其具有降低之ADCC活 性或其缺乏ADCC活性，且其特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)。本發明另一項較佳具體實施例為一種促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係選自下列促效活性所組成群中：誘發凋亡蛋白酶3/7、抑制TWEAKR表現細胞株增生、及誘發分泌細胞素。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係誘發凋亡蛋白酶3/7。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在TWEAKR表現癌細胞株中誘發凋亡蛋白酶3/7。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在WiDr、A253、NCI-H322、HT-29及786-O細胞所組成群中之TWEAKR表現癌細胞株中誘發凋亡蛋白酶3/7。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項更佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性於HT-29及/或786-O細胞株中對凋亡蛋白酶3/7之誘發程度高於被重組體人類TWEAK誘發之程度。另一項較佳具體實施例中，抗-TWEAKR抗體之使用濃度為100μg/ml及重組體人類 TWEAK之使用濃度為300ng/ml。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其特異性結合不同物種之TWEAKR之半胱胺酸富集功能域(SEQ ID：169之aa 34-68)(圖1)。
本發明另一項較佳具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其特異性結合TWEAKR之半胱胺酸富集功能域(SEQ ID：169之aa 34-68)且特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其特異性結合來自人類、小鼠、狗、豬、大鼠，及食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之TWEAKR所組成群中之至少兩種物種之TWEAKR之半胱胺酸富集功能域(SEQ ID：169之aa 34-68)且特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)。較佳具體實施例中，該兩種物種為人類與小鼠。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其抑制不同TWEAKR表現細胞株之增生。由凋亡蛋白酶3/7之強力誘發性可觀察到有效抑制不同癌細胞株之增生。本發明抗體在抑制各種不同癌細胞增生上比其他已知抗體(PDL-192、P4A8)更有效。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性可抑制TWEAKR表現細胞株之增生。本發明較佳具體實施例中，該TWEAKR表現細胞株係來自786-O、LOVO、NCI-H1975、SW480、WiDr、HT-29、A253、與SK-OV3所組成群中。本發明更佳具體實施例中，該TWEAKR表現細胞株為WiDr。
本發明另一項更佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體， 其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性對抑制786-O與/或WiDr細胞株增生之效力比重組體人類TWEAK之抑制效力更強。另一項較佳具體實施例中，該抗-TWEAKR抗體之使用濃度為100μg/ml，及重組體人類TWEAK為300ng/ml。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其強力誘發各種不同癌細胞(包括(但不限於)：A375、WiDr細胞及異種移植物)分泌細胞素。所誘發之細胞素包括(但不限於)：IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA及MCP-1。所誘發之較佳細胞素為IL-8。
本發明較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係誘發分泌細胞素。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在TWEAKR表現癌細胞株中誘發分泌細胞素。更佳具體實施例中，TWEAKR表現癌細胞株為A375或WiDr細胞株。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係誘發分泌細胞素，其中該細胞素係包括在下列各物所組成群中之細胞素：IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA與MCP-1。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在TWEAKR表現癌細胞株中誘發分泌細胞素，其中該分泌之細胞素係包括在下列各物所組成群中之細胞素： IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA及MCP-1。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在TWEAKR表現癌細胞株中誘發分泌細胞素，其中該分泌之細胞素係包括在下列各物所組成群中之細胞素：IL-8、IL-15、IP-10、IL-1RA及MCP-1，及其中該TWEAKR表現癌細胞株為A375或WiDr細胞株。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。另一項較佳具體實施例中，該細胞素為IL-8，在一項甚至更佳具體實施例中，該IL-8為人類IL-8。
本發明較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在小鼠腫瘤異種移植模式中誘發分泌細胞素。另一項較佳具體實施例中，該分泌之細胞素為衍生自腫瘤異種移植物之人類細胞素。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在小鼠腫瘤異種移植模式中誘發分泌人類IL-8。另一項較佳具體實施例中，小鼠腫瘤異種移植模式為A375或WiDr小鼠異種移植模式。另一項較佳具體實施例中，在注射3mg/kg或更多或10mg/kg或更多本發明抗-TWEAKR抗體後，誘發分泌細胞素。
本發明另一項較佳具體實施例為一種特異性結合TWEAKR之天冬胺酸47(D47)(SEQ ID NO：169)之促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其中該抗-TWEAKR抗體之促效活性係在小鼠WiDr腫瘤異種移植模式中，於注射3mg/kg該抗體後誘發分泌人類IL-8，其中沒有觀察到誘發小鼠IL-8 類似物KC。
另一項較佳具體實施例中，在帶腫瘤小鼠之血漿中觀察到誘發分泌細胞素。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其結合至寬廣範圍之不同TWEAKR表現細胞株，包括(但不限於)如表21所示之一者。表21之實例包括來自許多腫瘤來源(例如：NSCLC、CRC、HNSCC、RCC、胰CA、OvCa、乳房CA、黑色素瘤、胃CA、食道CA、膀胱CA、HCC、攝護腺CA、神經母細胞瘤)之人類及鼠類細胞株。
本發明一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其在許多種衍生自細胞株及衍生自患者之人類腫瘤模式中具有強力抗腫瘤效力。該腫瘤模式包括(但不限於)：786-O、A375、A253、SK-OV-3、WiDr、SW480、Co5682、NCI-H1975、NCI-H322、Lu7343、Co5676、Co 5841 SCaBER及SCC4。例如：TPP-2658之效力示於實例13之WiDr及SCaBER中。
本發明另一項具體實施例提供一種促效性非糖苷基抗-TWEAKR抗體，其可安全投與人類。本發明非糖苷基抗體比包含Fc區之天然序列之抗體具有更低副作用及改善之毒性型態。較佳為在Fc區中包含N297突變形成丙胺酸或麩醯胺之非糖苷基抗體(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其會結合人類TWEAKR並與另一種物種之TWEAKR交叉反應，該等物種包括(但不限於)：具有類似親和力之鼠類、大鼠、豬、狗、食蟹獼猴(Macaca fascicularis)。該另一種物種較佳為囓齒類，如：例如：小鼠或大鼠。最佳係該抗體會結合人類TWEAKR並與鼠類TWEAKR交互反應。
本發明另一項具體實施例提供一種非糖苷基抗體，其構成供診斷其中TWEAKR表現比正常組織提高或其中TWEAKR從細胞表面流失並可在血清中檢測到TWEAKR之惡性或發育不良病症之工具。提供一種接合可檢測標記物之非糖苷基抗-TWEAKR抗體。較佳標記物為放射性標記、酵素、發色團或螢光團。
除了此等非糖苷基抗-TWEAKR抗體(如：TPP-2658)外，亦說明下列可經由突變轉化成對應非糖苷基抗體之抗體(如：TPP-2090)。抗體TPP-2090之實例係已藉由N297突變形成丙胺酸而轉化之非糖苷基抗體TPP-2658。為了轉化此等糖苷基化抗體形成非糖苷基抗體，較佳係由Fc區之N297突變形成丙胺酸或麩醯胺(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
本案全文中提及表31所示之下列抗體：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”、及“TPP-2658“。
TPP-2658為本發明之極佳抗體。
TPP-2658代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：213之重鏈區及對應於SEQ ID NO：1之輕鏈區。
TPP-2090代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：2之重鏈區及對應於SEQ ID NO：1之輕鏈區。
TPP-2149代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：12之重鏈區及對應於SEQ ID NO：11之輕鏈區。
TPP-2093代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：22之重鏈區及對應於SEQ ID NO：21之輕鏈區。
TPP-2148代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：32之重鏈區及對應於SEQ ID NO：31之輕鏈區。
TPP-2084代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：42之重鏈區及對應於SEQ ID NO：41之輕鏈區。
TPP-2077代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：52之重鏈區及對應於SEQ ID NO：51之輕鏈區。
TPP-1538代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：62之重鏈區及對應於SEQ ID NO：61之輕鏈區。
TPP-883代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：72之重鏈區及對應於SEQ ID NO：71之輕鏈區。
TPP-1854代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：82之重鏈區及對應於SEQ ID NO：81之輕鏈區。
TPP-1853代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：92之重鏈區及對應於SEQ ID NO：91之輕鏈區。
TPP-1857代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：102之重鏈區及對應於SEQ ID NO：101之輕鏈區。
TPP-1858代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：112之重鏈區及對應於SEQ ID NO：111之輕鏈區。
TPP-2658代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：10之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：9之可變輕鏈區。
TPP-2090代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：10之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：9之可變輕鏈區。
TPP-2149代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：20之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：19之可變輕鏈區。
TPP-2093代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：30之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：29之可變輕鏈區。
TPP-2148代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：40之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：39之可變輕鏈區。
TPP-2084代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：50之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：49之可變輕鏈區。
TPP-2077代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：60之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：59之可變輕鏈區。
TPP-1538代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：70之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。
TPP-883代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：80之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：79之可變輕鏈區。
TPP-1854代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：90之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：89之可變輕鏈區。
TPP-1853代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：100之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：99之可變輕鏈區。
TPP-1857代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：110之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：109之可變輕鏈區。
TPP-1858代表一種抗體，其包含對應於SEQ ID NO：120之可變重鏈區及對應於SEQ ID NO：119之可變輕鏈區。
另一項較佳具體實施例中，該非糖苷基抗體包含重鏈或輕鏈CDR序列，其分別與抗體“TPP-2658”、“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”或“TPP-1858”中至少一個(較佳係對應之)CDR序列為至少50%、55%、60%70%、80%、90、或95%同一性，或分別與“TPP-2658”、“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”或“TPP-1858”之VH或VL序列為至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性。
另一項較佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含如表31所示之至少一個CDR序列或至少一個可變重鏈或可變輕鏈序列。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：6(H-CDR1)、SEQ ID NO：7(H-CDR2)及SEQ ID NO：8(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：3(L-CDR1)、SEQ ID NO：4(L-CDR2)及SEQ ID NO：5(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：16(H-CDR1)、SEQ ID NO：17(H-CDR2)及SEQ ID NO：18(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：13(L-CDR1)、SEQ ID NO：14(L-CDR2)及SEQ ID NO：15(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：26(H-CDR1)、SEQ ID NO：27(H-CDR2)及SEQ ID NO：28(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：23(L-CDR1)、 SEQ ID NO：24(L-CDR2)及SEQ ID NO：25(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：36(H-CDR1)、SEQ ID NO：37(H-CDR2)及SEQ ID NO：38(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：33(L-CDR1)、SEQ ID NO：34(L-CDR2)及SEQ ID NO：35(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：46(H-CDR1)、SEQ ID NO：47(H-CDR2)及SEQ ID NO：48(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：43(L-CDR1)、SEQ ID NO：44(L-CDR2)及SEQ ID NO：45(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：56(H-CDR1)、SEQ ID NO：57(H-CDR2)及SEQ ID NO：58(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：53(L-CDR1)、SEQ ID NO：54(L-CDR2)及SEQ ID NO：55(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：66(H-CDR1)、SEQ ID NO：67(H-CDR2)及SEQ ID NO：68(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：63(L-CDR1)、SEQ ID NO：64(L-CDR2)及SEQ ID NO：65(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：76(H-CDR1)、SEQ ID NO：77(H-CDR2)及SEQ ID NO：78(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：73(L-CDR1)、SEQ ID NO：74(L-CDR2)及SEQ ID NO：75(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：86(H-CDR1)、SEQ ID NO：87(H-CDR2)及SEQ ID NO：88(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：83(L-CDR1)、SEQ ID NO：84(L-CDR2)及SEQ ID NO：85(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：96(H-CDR1)、SEQ ID NO：97(H-CDR2)及SEQ ID NO：98(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：93(L-CDR1)、 SEQ ID NO：94(L-CDR2)及SEQ ID NO：95(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含重鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：106(H-CDR1)、SEQ ID NO：107(H-CDR2)及SEQ ID NO：108(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：103(L-CDR1)、SEQ ID NO：104(L-CDR2)及SEQ ID NO：105(L-CDR3)。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含SEQ ID NO：116(H-CDR1)、SEQ ID NO：117(H-CDR2)及SEQ ID NO：118(H-CDR3)，且包含輕鏈抗原-結合區，其包含SEQ ID NO：113(L-CDR1)、SEQ ID NO：114(L-CDR2)及SEQ ID NO：115(L-CDR3)。
本發明抗體之CDR之序列排比顯示有共同序列(參見圖24)。更佳具體實施例中，本發明抗體或其抗原結合性片段包含：可變重鏈，其包含 ˙重鏈CDR1，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：PYPMX(SEQ ID NO：171)，其中X為I或M；˙重鏈CDR2，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)，其中X為S或K；及˙重鏈CDR3，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)；與可變輕鏈，其包含˙輕鏈CDR1，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)，其中X為G或S；˙輕鏈CDR2，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：XASSLQS(SEQ ID NO：175)，其中X為Q、A、或N；及˙輕鏈CDR3，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)，其中位置5之X為T或S，及位置6之X為T或S，及位置8之X為G或F。
抗體之序列差異不僅出現在其互補決定區(CDR)中，而且出現在架構(FR)中。此等序列差異係由不同V-基因編碼。人類抗體生殖系譜系已 完全定序。其具有約50個功能VH生殖系基因，可依據序列同質性分成6個子群：VH1、VH2、VH3、VH4、VH5及VH6(Tomlinson等人之1992,J.Mol.Biol.227,776-798；Matsuda & Honjo,1996,Advan.Immunol.62,1-29)。約40個功能VL κ基因，已知其包含7個子群(Cox等人之1994、Eur.J.Immunol.24,827-836；Barbie & Lefranc,1998,Exp.Clin.Immunogenet.15,171-183)：Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6及Vκ7。本文揭示分別屬於人類VH3子群之本發明抗體之重鏈及屬於人類Vκ1子群之本發明抗體之輕鏈。已知屬於相同子群之抗體之架構序列具有緊密相關性，例如：包含人類VH3子群成員之抗體均具有共同之類似安定性(Honegger等人之2009,Proteins Eng Des Sel.22(3)：121-134)。相關技藝上習知來自抗體之CDR可接枝在不同架構上，同時維持對應來源抗體之特性。CDR已成功接枝在屬於不同物種之架構上及屬於不同子群之相同物種之架構上。本發明抗體或抗原結合性片段之另一項具體實施例包含本發明抗體之至少一個CDR序列(如表31所示)及人類可變鏈架構序列。
本發明較佳具體實施例中，該非糖苷基抗體包含本發明抗體之可變輕鏈或包含可變輕鏈之L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈抗原結合區，及可變重鏈或包含可變重鏈之H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈抗原結合區(如表31所示)及人類可變輕鏈與人類可變重鏈架構序列。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含本發明抗體之可變輕鏈或包含可變輕鏈之L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈抗原結合區及可變重鏈或包含可變重鏈之H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈抗原結合區(如表31所示)及可變重鏈之人類VH3子群架構序列及可變輕鏈之人類Vκ 1子群架構序列。更佳具體實施例中，可變重鏈之人類VH3子群架構序列係包括在下列各物所組成群中之VH3子群架構序列：VH3-07、VH3-09、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30.3、VH3-30.5、VH3-33、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74及VH3-d。一項甚至更佳之具體實施 例中，該人類VH3架構序列比人類VH3-23架構序列減少16個或減少15個胺基酸交換。更佳具體實施例中，可變輕鏈之人類Vκ1子群架構序列係包括在下列各物所組成群中之Vκ1子群架構序列：Vκ 1-5、Vκ 1-6、Vκ 1-8、Vκ 1D-8、Vκ 1-9、Vκ 1-12、Vκ 1D-12、Vκ 1-13、Vκ 1D-13、Vκ 1-16、Vκ 1D-16、Vκ 1-17、Vκ 1D-17、Vκ 1-27、Vκ 1-33、Vκ 1D-33、Vκ1-37、Vκ 1D-37、Vκ 1-39、Vκ 1D-39、Vκ 1D-42、Vκ 1D-43。一項甚至更佳之具體實施例中，該人類Vκ 1架構序列比人類Vκ 1-39架構序列減少15個或減少13個胺基酸交換。
更佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含本發明抗體之可變輕鏈或包含可變輕鏈之L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈抗原結合區及可變重鏈或包含可變重鏈之H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈抗原結合區(如表31所示)及可變重鏈之人類VH3子群架構序列與可變輕鏈之人類Vκ 1-39架構序列。
最佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體包含本發明抗體之可變輕鏈或包含可變輕鏈之L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3序列之輕鏈抗原結合區及可變重鏈或包含可變重鏈之H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3序列之重鏈抗原結合區(如表31所示)及可變重鏈之人類VH3-3架構序列與可變輕鏈之人類Vκ 1-39架構序列。
較佳具體實施例中，該可變輕鏈架構序列屬於人類Vκ1子群，及該可變重鏈架構序列屬於人類VH3子群。VH3子群或Vκ1子群可變鏈架構序列相較於各WT架構序列可包含之序列變異為接收供插入各CDR序列之架構。另一項具體實施例中，包含不同於WT架構序列之序列變異之VH3子群或Vκ1子群可變鏈架構序列分別為VH3子群成員或Vκ1子群成員。較佳係此等變異體架構序列具有至多15個序列變異，更佳為至多10個序列變異，更佳為至多5個序列變異，最佳為至多3個序列變異。
本發明抗體可為IgG(例如：IgG1 IgG2、IgG3、IgG4)。
較佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體為單株。另一項較佳具體實施例中，本發明非糖苷基抗體為人類、人類化或嵌合性。
另一項態樣中，本發明提供一種非糖苷基抗體，其抗原結合區對TWEAKR具有結合特異性且/或具有高度親和力。若測得之親和力低於250nM(該抗體或抗原結合性片段之單價親和力)時，則稱該抗體對抗原具有“高度親和力”。當測定與人類TWEAKR之單價親和力時，本發明非糖苷基抗體對人類TWEAKR之結合親和力為低於250nM，較佳為低於150nM，更佳為低於100nM，更佳為低於50nM，更佳為低於30nM，更佳為低於20nM。
另一項態樣中，本發明提供一種抗體，其具有之抗原結合區對TWEAKR具有結合特異性且不會結合TNF受體超級家族之其他成員(參見表20)。
本發明另一項具體實施例提供一種抗體，其在有效內化後與TWEAKR表現細胞結合。本發明抗體可與已知醫藥共同投藥，且有些例子中，抗體本身可經過修飾。例如：抗體可接合細胞毒性劑、免疫毒素、帶毒體或放射性同位素，以進一步提高效力。
當由進入TWEAKR表現腫瘤細胞中之顆粒/細胞數測定抗體之最大內化時間半值(t ½)小於400分鐘或更佳為小於300分鐘，及亦更佳為小於200分鐘時，則稱該抗體“有效”內化。亦較佳為抗體或抗原結合性片段之最大內化時間半值(t ½)為100分鐘或以下，其係如實例7及圖17說明之方法測定。
可內化抗體適合作為抗體-藥物接合物(ADC)之靶向部份體。抗體或抗原結合性片段適用於活體外或活體內方法，供傳送化合物(較佳係細胞毒性劑)至TWEAKR表現細胞中。該有效內化係利用標記螢光之抗體顯示(實例7)。作為抗體藥物接合物之有效用途將以接合肥皂草素之抗體為例說明(實例7)。
有些具體實施例中，本發明抗體或編碼該抗體之核酸已經過單離。單離之生物組份(如：核酸分子或蛋白質，如：抗體)係指實質上已與有機體之細胞中天然存在之生物組份(例如：其他染色體及染色體外DNA與RNA、蛋白質及細胞器)分離或純化。已經"單離"之核酸及蛋白質包括採用 例如：Sambrook等人之1989(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)及Robert K.Scopes等人1994(Protein Purification,-Principles and Practice,Springer Science and Business Media LLC)說明之標準方法純化之核酸與蛋白質。該術語亦包括於宿主細胞中重組表現製成之核酸及蛋白質，及化學合成之核酸。
本發明抗體可衍生自基於已自大量健康自願者之抗體中單離之胺基酸序列之重組體抗體集合庫，例如：使用n-CoDeR®技術，由全人類CDR重組形成新的抗體分子。或者，可使用如：Hoet RM等人之Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)說明之全人類抗體噬菌體展現集合庫作為抗體集合庫作來單離TWEAKR-特異性抗體。
肽變異體
本發明抗體或抗原結合性片段並不限於本文所提供之特異性肽序列。本發明亦包括此等多肽之變異體。參照本文所揭示及常用之技術與參考文獻，熟悉此相關技術者即可製備、測試及利用本文所揭示抗體之功能性變異體，並應了解此等具有結合TWEAKR之能力之變異體均在本發明範圍內。
變異體可包括例如：對應於本文揭示之肽序列具有至少一個改變之互補決定區(CDR)(高度可變)與/或架構(FR)(可變)功能域/位置之抗體。為了更了解此觀念，簡要說明抗體結構如下。
抗體係由兩條肽鏈組成，各鏈包含一個(輕鏈)或三個(重鏈)恆定功能域及可變區(VL、VH)，後者各自由4個FR區與3個穿插之CDR組成。抗原結合位點係由一個或多個CDR形成，而FR區為CDR提供結構性架構，因此在抗原結合性上扮演重要角色。熟悉此相關技術者照例藉由改變CDR或FR區中一個或多個胺基酸殘基，即可產生突變或多樣化之抗體序列，其可用來篩選例如：針對抗原之新穎或改良之性質。
本發明另一項較佳具體實施例為一種抗體或抗原結合性片段，其中VH及VL序列係選自表31。熟悉此相關技術者可採用表31之數據來 設計本發明範圍內之肽變異體。較佳係藉由改變一個或多個CDR區內之胺基酸所構築之變異體；變異體亦可具有一個或多個改變之架構區。亦可改變架構區。例如：可改變肽FR功能域，讓其中一個殘基出現與生殖系序列之偏差。
或者，熟悉此相關技術者可使用例如：Knappik A.等人之JMB 2000,296：57-86進行相同分析，來比較本文所揭示胺基酸序列與同類此等抗體之已知序列。
此外，變異體可使用一種抗體作為起點，再進一步優化後製得，其係使抗體中一個或多個胺基酸殘基(較佳係一個或多個CDR中之胺基酸殘基)多樣化，並篩選所收集抗體變異體中具有改良性質之變異體。特別佳為VL及/或VH之CDR3中一個或多個胺基酸殘基之多樣化。多樣化之方法為例如：使用三核苷酸誘變(TRIM)技術合成收集DNA分子(Virnekäs B.等人之Nucl.Acids Res.1994,22：5600)。抗體或其抗原結合性片段包括具有修飾/變異之分子，包括(但不限於)：例如：修飾造成改變之半衰期(例如：修飾Fc部份或再附接其他分子，如：PEG)、改變結合性親和力或改變ADCC或CDC活性。
保留性胺基酸變異體
可藉由保留本文所說明抗體肽序列之整個分子結構來製得多肽變異體。熟悉此相關技術者可依據個別胺基酸之性質來辨識合理之取代。胺基酸取代，亦即"保留性取代"，可例如：依據所涉及殘基在極性、電價、溶解度、疏水性、親水性、與/或兩親性上之相似性來進行。
例如：(a)非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸與及甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、與麩醯胺；(c)帶正價(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸、與組胺酸；及(d)帶負價(酸性)胺基酸包括天冬胺酸與麩胺酸。取代法通常在群組(a)-(d)中進行。此外，甘胺酸及脯胺酸可依據其干擾α-螺旋之能力彼此取代。同樣地，某些胺基酸如：丙胺酸、半胱胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺、 組胺酸及離胺酸較常出現在α-螺旋，而纈胺酸、異白胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸則較常出現在β-折疊片。甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺與脯胺酸常輪流出現。有些較佳取代法可在下列群組之間進行：(i)S與T；(ii)P與G；及(iii)A、V、L與I。熟悉此相關技術者依據已知基因代碼，及重組與合成性DNA技術，即很容易構築編碼該保留性胺基酸變異體之DNA。
本文所採用兩個多肽序列之間之"序列同一性"係指該等序列之間之胺基酸同一性百分比。"序列同質性"係指相同胺基酸或代表保留性胺基酸取代之胺基酸之百分比。
本發明之DNA分子
本發明亦有關一種編碼本發明抗體或其抗原結合性片段之DNA分子。用於所表現抗體之DNA序列示於表32。此等序列經過優化以供哺乳動物表現。本發明之DNA分子不限於本文所揭示序列，而亦包括其變異體。本發明內之DNA變異體可參考其雜化時之物理性質說明。熟悉此相關技術者咸了解，DNA可用於判别其補體，且由於DNA為雙股，因此可使用核酸雜化技術來判別其同等物或同系物。亦咸了解，可在低於100%互補性下進行雜化。然而，若選擇適當條件，可採用雜化技術，依據其結構性與特定探針之相關性來區分DNA序列。有關此等條件之說明可參見如上述Sambrook等人之1989文獻及Ausubel等人之1995文獻(Ausubel,F.M.、Brent,R.、Kingston,R.E.、Moore,D.D.、Sedman,J.G.、Smith,J.A.與Struhl,K.編輯(1995)，Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley及Sons)。
兩種聚核苷酸序列之間之結構性相似性可採用該兩種序列即將進行雜化時之條件之"嚴苛性"之函數來表示。本文所採用術語"嚴苛性"係指不利於雜化之條件。嚴苛條件極不利於雜化，且僅有最具結構關係之分子可以在此等條件下雜化。反之，不嚴苛條件將有利於結構關係程度較低之分子之間之雜化。因此，雜化嚴苛性係與該兩種核酸序列之結構關係直接相關。下列結構關係適用於說明雜化與及關係度之間之相關性(其中Tm為核 酸雙螺旋之熔解溫度)：
a.Tm=69.3+0.41(%G+C)℃
b.雙螺旋DNA之錯配鹼基對每增加1%時，Tm即下降1℃。
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1=18.5 log10μ2/μ1
其中μ1與μ2為兩種溶液之離子強度。
雜化嚴苛性為許多因子之函數，包括DNA總濃度、離子強度、溫度、探針大小及會破壞氫鍵之製劑之存在。促進雜化之因子包括高濃度DNA、高離子強度、低溫、較長之探針及沒有會破壞氫鍵之製劑之存在。雜化通常分兩期進行：“結合”期與“洗滌”期。
功能等效變異體
本發明範圍內另一種DNA變異體可參照其所編碼之產物說明。此等功能等效聚核苷酸之特徵在於其因基因代碼簡併而編碼相同肽序列。
咸了解，本文所提供DNA分子之變異體可依不同方式構築。例如：其可構築成完全合成性DNA。有許多方法可用於有效合成範圍在20至約150個核苷酸之寡核苷酸。參見Ausubel等人之Supplement 21(1993)，第2.11節。重疊之寡核苷酸可依Khorana等人之J.Mol.Biol.72：209-217(1971)首先提出之方式合成及組裝；亦參見上述Ausubel等人之文獻，第8.2節。合成性DNA之較佳設計係在基因之5'與3'端有合宜之限制位點供進行工程處理，促進選殖至適當載體中。
如所指示，產生變異體之方法為從本文所揭示一種DNA開始，然後進行定點誘變。參見上述Ausubel等人之文獻，第8章，補充本37(1997)。在典型方法中，選殖標靶DNA至單股DNA噬菌體媒介中。單股DNA經過單離及與含所需核苷酸變化(群)之寡核苷酸雜化。合成互補股，並將該雙股噬菌體引至宿主中。有些所得後代將包含所需突變株，其可利用DNA定序證實。此外，可利用各種不同方法來提高該等後代噬菌體成為所需突變株之機率。此等方法係相關技藝上已習知，且可從商品取得產生此等突變株之套組。
抗體-藥物接合物(ADC)
本發明亦提供一種抗體-藥物接合物(ADC、免疫接合物)，其包含接合一或多種細胞毒性劑(如：化療劑或藥物)、生長抑制劑、毒素(例如：蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酵素活性毒素、或其片段)、或放射性同位素之非糖苷基抗-TWEAKR抗體。
一項具體實施例中，免疫接合物係一種抗體-藥物接合物(ADC)，其中由非糖苷基抗體接合一或多種藥物，包括(但不限於)：美登木素生物鹼(maytansinoid)(參見美國專利案案號5,208,020、5,416,064及歐洲專利案EP 0 425 235)；奥里斯他汀(auristatin)，如：奥里斯他汀甲酯(methylauristatin)藥物部份體DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利案案號5,635,483及5,780,588，及7,498,298)；德拉斯他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物；蒽環黴素(anthracycline)，如：道諾黴素(daunomycin)或阿黴素(doxorubicin)；胺甲喋昤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，如：歐洲紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、拉洛紫杉烷(larotaxel)、特西紫杉烷(tesetaxel)，及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴毒素(trichothecene)；及CC1065。
另一項具體實施例中，免疫接合物包含本文所說明非糖苷基抗體接合酵素活性毒素或其片段，包括(但不限於)：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒A鏈、雞母珠毒素A鏈、葫蓮根毒素A鏈、真菌核糖毒素(alphasarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、香石竹毒素(dianthin)蛋白質、垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白質(P API、P APII，及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲林黴素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酹黴素(phenomycin)、伊諾黴素(neomycin)，及新月毒素(tricothecenes)。
另一項具體實施例中，免疫接合物包含本文說明之非糖苷基抗體接合放射性原子，形成放射性接合物。有許多種放射活性同位素可用於製造放射性接合物。其實例包括Th227、Ac225、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當該放射性接合物 用於檢測時，其可包含供閃爍圖研究之放射性原子，例如：Tc99m，或供核磁共振(NMR)顯影之自旋標記物，如：再度使用碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
重組DNA構築體及表現
本發明進一步提供一種重組DNA構築體，其包含本發明一或多種核苷酸序列(參見表32)。本發明重組構築體係與載體(如：質體、噬質體、噬菌體或病毒載體)聯合使用，在其中嵌入編碼本發明抗體或其抗原結合性片段或其變異體之DNA分子。
本文所提供抗體係由編碼輕鏈及重鏈或其一部分之核酸序列於宿主細胞中重組表現製得。進行表現抗體時，宿主細胞可經過帶有編碼輕鏈及/或重鏈或其一部分之DNA片段之一或多種重組表現載體轉染，使該輕鏈及重鏈表現在宿主細胞中。採用標準重組DNA方法製備及/或製得編碼該重鏈與輕鏈之核酸，取此等核酸併入重組表現載體中，及將該載體引進宿主細胞中，如：彼等說明於Sambrook、Fritsch及Maniatis(編輯)之Molecular Cloning；A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.等人(編輯)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates,(1989)及Boss等人之美國專利案案號4,816,397。
此外，編碼重鏈與/或輕鏈可變區之核酸序列可以轉化成例如：編碼全長度抗體鏈之核酸序列、Fab片段、或scFv。編碼VL或VH之DNA片段可依操作方式連接(使得該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列在讀碼框內)另一個編碼例如：抗體恆定區或可彎曲性連接體之DNA片段。該人類重鏈及輕鏈恆定區之序列係相關技藝上已知(參見例如：Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，且可採用標準PCR擴增法得到包含此等區之DNA片段。
某些分析法中，本發明抗體較佳係呈鼠類IgG表現，例如：人類樣本之免疫組織化學比較容易使用鼠類抗體分析。
為了製造編碼scFv之聚核苷酸，可使編碼VH與VL之核酸以操作方式連接另一個編碼彎曲性連接體之片段，使VH及VL序列得以呈鄰接之單鏈蛋白質表現，其中VL與VH區係以彎曲性連接體連結(參見例如：Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人之Nature(1990)348：552-554)。
可採用標準重組DNA表現法來表現抗體(參見例如：Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。例如：編碼所需多肽之DNA可嵌入表現載體中，然後轉染至合適宿主細胞。合適宿主細胞為原核生物與真核生物細胞。原核生物宿主細胞實例為例如：細菌，真核生物宿主細胞實例為酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。有些具體實施例中，編碼該重鏈與輕鏈之DNA係嵌入分開之載體中。其他具體實施例中，編碼重鏈與輕鏈之DNA係嵌入相同載體中。咸了解，表現載體之設計，包括調節序列之選擇，係受到如：所選擇之宿主細胞、所需蛋白質之表現量及該表現是否為構成性或誘發性等因素影響。
因此，本發明具體實施例亦為包含載體或核酸分子之宿主細胞，因此該宿主細胞可為較高等之真核生物宿主細胞(如：哺乳動物細胞)、較低等之真核生物宿主細胞(如：酵母細胞)，及可能為原核生物細胞，如：細菌細胞。
本發明另一項具體實施例為一種使用宿主細胞製造抗體及抗原結合性片段之方法，其包括於合適條件下培養宿主細胞及回收該抗體。
因此本發明另一項具體實施例為使用本發明宿主細胞製造根據本發明抗體，及純化此等抗體達至少95重量%均質性。
細菌表現
適用於細菌之表現載體係由編碼所需蛋白質之結構性DNA序列與合適之轉譯起始與終止訊號一起於可操作之讀碼期中，使用功能性發動子共同嵌入所構築得到。該載體將包含一或多種表型選拔標記物與複製起點，以確實維持載體，且若需要時，在宿主內提供複製。適合轉化之原 核生物宿主包括(但不限於)：大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、及葡萄球菌屬(Staphylococcus)之各種不同物種。
細菌載體可為例如：基於細菌噬菌體、-質體或-噬質體者。此等載體可包含選拔之標記物及由自商品取得通常含有習知選殖載體pBR322(ATCC 37017)元素之質體所衍生之細菌複製起點。合適之宿主菌株轉化，及宿主菌株生長至適當細胞密度後，採用適當方式解除抑制/誘發所選拔之發動子(例如：採用溫度變遷或化學誘發法)，再培養細胞一段時間。通常採用離心、物理或化學方式瓦解，收集細胞，再保留所得粗萃物進一步純化。
在細菌系統中，可依計畫用於表現之蛋白質適當選擇許多種表現載體。例如：當計畫製造大量蛋白質供產生抗體或篩選肽集合庫時，則可能需要例如：可主導容易純化之融合蛋白質產物高度表現之載體。
因此，本發明一項具體實施例為一種表現載體，其包含編碼本發明新穎抗體之核酸序列。參見實例1之舉例說明。
本發明抗體包括天然純化產物、化學合成法產物、及來自下列原核生物宿主之重組技術產物，包括例如：大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、及葡萄球菌屬(Staphylococcus)之各種不同物種。較佳係來自大腸桿菌細胞。
哺乳動物表現
較適合哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括可在哺乳動物細胞中主導蛋白質高度表現之病毒元素，如：衍生自巨細胞病毒(CMV)(如：CMV發動子/加強子)、猴病毒(Simian Virus)40(SV40)(如：SV40發動子/加強子)、腺病毒(例如：腺病毒主要晚期發動子(AdMLP))及多瘤病毒之發動子及/或加強子。有關病毒調節元素及其序列之進一步說明可參見例如：Stinski之U.S.5,168,062b、Bell等人之U.S.4,510,245及Schaffner等人之U.S.4,968,615。重組表現載體亦可包括複製起點與可選拔標記物(參見例如： U.S.4,399,216、4,634,665及U.S.5,179,017)。合適之可選拔標記物包括可將針對如：G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤(methotrexate)藥物之抗性賦與引進該載體之宿主細胞上之基因。例如：二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦與針對胺甲喋昤之抗性及neo基因賦與針對G418之抗性。
表現載體轉染至宿主細胞中之過程可使用標準技術進行，如：電穿孔、磷酸鈣沉澱法，及DEAE-葡聚醣轉染法。
適合表現本文所提供抗體、其抗原結合性片段或其變異體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)[包括dhfr-CHO細胞，說明於Urlaub及Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220；使用DHFR可選拔標記物，例如：說明於R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621]、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。
可使用“人類胚胎腎臟”(HEK)細胞於哺乳動物細胞中過渡表現之較佳系統說明於Tom等人之”Methods Express：Expression Systems”，第12章，Micheal R.Dyson與Yves Durocher編輯，Scion Publishing Ltd,2007。簡言之，由基於CMV-發動子之表現質體轉染至HEK293-6E細胞中。
有些具體實施例中，該表現載體之設計係讓所表現之蛋白質分泌至宿主細胞所生長之培養基中。再使用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體、其抗原結合性片段或其變異體。
純化
本發明抗體可採用習知方法，從重組體細胞培養物中回收及純化，該等方法包括(但不限於)：硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取法、蛋白質A層析法、蛋白質G層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法及凝集素層析法。亦可採用高效液相層析法(“HPLC”)進行純化。參見例如：Colligan之Current Protocols in Immunology；或Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.(1997-2001)，例如：第1、4、6、8、9、10章，其揭示內容已分別以引用之方式完全併入本文中。
本發明抗體包括天然純化產物、化學合成過程產物、及由真核 生物宿主(包括例如：酵母、較高等植物、昆蟲與哺乳動物細胞)採用重組技術製造之產物。此等方法說明於許多種標準實驗室手冊中，如：如上述Sambrook之文獻，第17.37-17.42節；如上述Ausubel之文獻，第10、12、13、16、18與20章。
較佳具體實施例中，抗體係純化至(1)超過95重量%抗體，其係由例如：勞瑞法(Lowry method)、UV-可見光光譜法或SDS-毛細管凝膠電泳法(例如：於Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer裝置上)測定，且另一項較佳具體實施例係超過99重量%，(2)至足以得到N-末端或內部胺基酸序列有至少15個殘基之程度，或(3)至SDS-PAGE於還原或非還原條件下，使用考馬希藍(Coomassie blue)或較佳係使用銀染色測得為均質性。單離之天然抗體包括於重組體細胞內之原位抗體，因為抗體在天然環境下之至少一種組份將不會存在。然而，單離之抗體通常由至少一個純化步驟製備。
醫療方法
醫療方法涉及對需要治療之個體投與醫療有效量之本發明抗體。"醫療有效"量之定義係指該抗體之用量足以在個體之治療範圍內降低TWEAKR陽性細胞增生或縮小TWEAKR表現腫瘤之大小，其係投與單劑量或根據多重劑量療程投藥，其可單獨或組合其他可減輕副作用且其用量仍在可耐受毒性下之製劑使用。該個體可為人類或非人類動物(例如：兔子、大鼠、小鼠、狗、猴或其他較低等靈長類)。
本發明一項具體實施例提供一種抗體，其係作為醫藥使用。
本發明一項具體實施例提供一種抗體，其係作為治療癌症之醫藥使用。一項較佳具體實施例中，該癌症為實體腫瘤。
本發明抗體可用為出現TWEAKR-訊號轉導異常之各種不同狀況之醫療或診斷工具，例如：細胞增生疾患，如：癌症或纖維化疾病。特別適合使用本發明抗體治療之疾患及病症為實體腫瘤，如：乳房、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、尿道、眼睛、肝、皮膚、頭與頸、甲狀腺、副甲狀腺、及其遠距轉移等癌症。彼等疾患亦包括淋巴瘤、肉瘤及白血病。
消化道腫瘤包括(但不限於)：肛門、結腸、大腸、食道、膽囊、胃、胰臟、直腸、小腸、及唾液腺等癌症。
食道癌實例包括(但不限於)：食道細胞癌瘤及腺癌瘤，及鱗狀細胞癌瘤、平滑肌肉瘤、惡性黑色素瘤、橫紋肌肉瘤及淋巴瘤。
胃癌實例包括(但不限於)：小腸型及擴散型胃腺癌瘤。
胰癌實例包括(但不限於)：胰管腺癌瘤、腺鱗狀癌瘤及胰內分泌腫瘤。
乳癌實例包括(但不限於)：三重陰性乳癌、侵入性乳管癌瘤、侵入性小葉癌瘤、原位乳管癌瘤，及原位小葉癌瘤。
呼吸道癌症實例包括(但不限於)：小細胞及非小細胞肺癌瘤、支氣管腺瘤及胸膜肺母細胞瘤。
腦癌實例包括(但不限於)：腦幹與下丘腦膠質瘤、小腦與大腦星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤，及神經外胚層與松果體腫瘤。
男性生殖器官腫瘤實例包括(但不限於)：攝護腺與睪丸癌症。女性生殖器官腫瘤實例包括(但不限於)：子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道與陰門癌症，及子宮之肉瘤。
卵巢癌實例包括(但不限於)：漿液性腫瘤、子宮內膜樣腫瘤、黏液囊腫腺癌瘤、顆粒細胞腫瘤、塞-萊二氏(Sertoli-Leydig)細胞腫瘤及雄性細胞瘤。
子宮頸癌實例包括(但不限於)：鱗狀細胞癌瘤、腺癌瘤、腺鱗狀癌瘤、小細胞癌瘤、神經內分泌腫瘤、玻璃樣細胞癌瘤及子宮頸乳頭狀腺癌瘤。
泌尿道腫瘤實例包括(但不限於)：膀胱、陰莖、腎臟、腎盂、輸尿管、尿道、及遺傳性與偶發性乳突狀腎癌。
腎臟癌實例包括(但不限於)：腎細胞癌瘤、泌尿道上皮細胞癌瘤、近腎絲球細胞腫瘤(腎素瘤)、腎血管平滑肌脂肪瘤、腎嗜酸性細胞瘤、畢氏管(Bellini duct)癌瘤、腎臟之亮細胞肉瘤、中胚層腎瘤及威爾姆氏腫瘤(Wilms’ Tumor)。
膀胱癌實例包括(但不限於)：移形上皮細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤、腺癌瘤、肉瘤與小細胞癌瘤。
眼睛癌症包括(但不限於)：眼內黑色素瘤及視網膜母細胞瘤。
肝癌實例包括(但不限於)：肝細胞癌瘤(出現或沒出現纖維板層樣變異之肝細胞癌瘤)、膽管癌瘤(肝內膽管癌瘤)、及混合肝細胞膽管癌瘤。
皮膚癌症包括(但不限於)：鱗狀細胞癌瘤、卡波西氏肉瘤、惡性黑色素瘤、梅克爾(Merkel)細胞皮膚癌、及非黑色素瘤皮膚癌。
頭與頸癌症包括(但不限於)：頭與頸之鱗狀細胞癌症、喉、下咽、鼻咽、口咽癌症、唾液腺癌症、唇與口腔癌症、及鱗狀細胞癌症。
淋巴瘤包括(但不限於)：AIDS-相關之淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、包氏(Burkitt)淋巴瘤、霍奇金氏症、及中樞神經系統淋巴瘤。
肉瘤包括(但不限於)：軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤、及橫紋肌肉瘤。
白血病包括(但不限於)：急性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、及毛細胞白血病。
較佳具體實施例中，該抗體適合醫療或診斷方法，供治療或診斷癌症。較佳具體實施例中，本發明抗體適合供治療或診斷癌症(其中該癌症為實體癌)之醫療或診斷方法。
較佳具體實施例中，本發明抗體適合醫療或診斷方法，供治療或診斷包括在下列各物所組成群中之癌症：胃癌、乳癌、胰癌、結腸直腸癌、腎癌、攝護腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、子宮內膜癌、食道癌、頭頸癌、肝細胞癌瘤、黑色素瘤及膀胱癌。
較佳具體實施例中，該抗體適合醫療或診斷方法，供治療或診斷包括在下列各物所組成群中之癌症：結腸直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌、黑色素瘤、卵巢癌、頭頸癌及胰癌。
此外，本發明抗體亦可用為涉及TWEAKR之各種不同其他疾 患之醫療或診斷工具，如(但不限於)：纖維化疾病，如：肺泡內纖維變性、二氧化矽誘發之肺纖維變性、實驗肺纖維變性、病因不明性肺纖維變性、腎纖維變性，及淋巴血管平滑肌肉增生症、多囊性卵巢症候群、痤瘡、乾蘚、膽脂瘤、膽脂瘤型慢性中耳炎、牙周炎、曬斑、腸部疾病、動脈粥狀硬化或子宮內膜異位症。
上述疾患已於人類中判定，而且亦在其他動物中具有類似病因學，包括哺乳動物，並可藉由投與本發明醫藥組成物治療。
本發明抗體可與已知醫藥共同投藥，且有些例子中，抗體本身可能經過修飾。例如：抗體可接合細胞毒性劑或放射性同位素，以進一步提高效力。
本發明抗體可呈單一藥劑投藥或與一或多種其他醫療劑組合投藥，其中該組合不會引起不可接受之副作用。該組合療法包括投與包含本發明抗體與一或多種其他醫療劑之單一醫藥劑量調配物，及自行分開投與本發明抗體與各該其他醫療劑之醫藥劑量調配物。例如：本發明抗體與醫療劑可呈單一液態組成物一起投與患者，或各藥劑可呈分開劑量調配物投與。
若採用分開劑量調配物時，本發明抗體與一或多種其他醫療劑基本上可在在相同時間(例如：同時)投藥或分別錯開時間(例如：依序)投藥。
特定言之，本發明抗體可與其他抗腫瘤劑呈固定或分開組合，如：烷化劑、抗代謝劑、植物衍生之抗腫瘤劑、激素治療劑、拓樸異構酶抑制劑、喜樹鹼衍生物、激酶抑制劑、標靶藥物、抗體、干擾素及/或生物效應修飾劑、抗血管新生化合物、及其他抗腫瘤藥物。基於此點，可與本發明抗體組合使用之第二藥劑實例之不受限實例如下列：烷化劑，包括(但不限於)：氮芥N-氧化物、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosfamide)、三胺硫磷(thiotepa)、卡莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、帝盟多(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、艾帕喹能(apaziquone)、布斯塔靈(brostallicin)、苯達莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、雌氮芥(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、葡磷醯胺(glufosfamide)、馬磷醯 胺(mafosfamide)、苯達莫司丁(bendamustin)、及二溴衛矛醇(mitolactol)；鉑配位烷化化合物，包括(但不限於)：順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、依鉑(eptaplatin)、洛鉑(lobaplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、草酸鉑(oxaliplatin)、及賽特鉑(satraplatin)；抗代謝劑，包括(但不限於)：氨甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤核糖苷、巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶可單獨使用或組合若克瘤(leucovorin)、替加氟(tegafur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabine ocfosfate)、依諾他濱(enocitabine)、健擇(gemcitabine)、氟達拉濱(fludarabin)、5-氮胞苷(5-azacitidine)、截瘤達(capecitabine)、克拉曲濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、氮雜胞苷(decitabine)、依氟鳥胺酸(eflornithine)、乙炔基胞嘧啶核苷(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、羥基脲、威克瘤(melphalan)、奈拉濱(nelarabine)、洛拉曲塞(nolatrexed)、歐弗特(ocfosfite)、培美曲塞二鈉(disodium premetrexed)、噴司他丁(pentostatin)、皮利曲松(pelitrexol)、雷替曲塞(raltitrexed)、蒂巴因(triapine)、三甲曲沙(trimetrexate)、阿糖腺苷(vidarabine)、長春新鹼(vincristine)、及長春瑞濱(vinorelbine)；激素醫療劑包括(但不限於)：依西美坦(exemestane)、利普安(Lupron)、阿那曲唑(anastrozole)、度骨化醇(doxercalciferol)、法倔唑(fadrozole)、福美司坦(formestane)、11 β-羥基類固醇脫氫酶1抑制劑、17-α羥化酶/17,20裂解酶抑制劑如：乙酸阿比特龍(abiraterone acetate)、5-α還原酶抑制劑如：非那雄胺(finasteride)與愛普列特(epristeride)、抗雌激素如：檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)與氟維司群(fulvestrant)、曲普瑞林(Trelstar)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)、抗雄性激素如：比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、米非司酮(mifepristone)、尼魯米特(nilutamide)、康士得(Casodex)、及抗孕酮與其組合；植物衍生之抗腫瘤物質，包括例如：彼等從有絲分裂抑制劑選出者，例如：埃博黴素類(epothilones)，如：沙戈匹隆(sagopilone)、易莎平(ixabepilone)及埃博黴素B(epothilone B)，長春鹼(vinblastine)、長春氟寧(vinflunine)、歐 洲紫杉醇(docetaxel)、及太平洋紫杉醇(Paclitaxel)；細胞毒性拓樸異構酶抑制劑，包括(但不限於)：阿克拉黴素(aclarubicin)、阿黴素(doxorubicin)、氨萘非特(amonafide)、貝洛替康(belotecan)、喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、二氟替康(diflomotecan)、抗癌妥(Irinotecan)、癌康定(topotecan)、依特卡靈(edotecarin)、表柔比星(epimbicin)、依託泊昔(etoposide)、依沙替康(exatecan)、吉馬替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、比柔比星(pirambicin)、匹杉瓊(pixantrone)、盧比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、特盧普塞(tafluposide)，及其組合；免疫學物，包括干擾素，如：干擾素α、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素β、干擾素γ-1a及干擾素γ-n1，及其他免疫加強劑，如：L19-IL2及其他IL2衍生物、非格司亭(filgrastim)、香菇多糖(lentinan)、裂褶菌胞外多醣(sizofilan)、TheraCys、烏苯美司(ubenimex)、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、BAM-002、達卡巴嗪(dacarbazine)、達利珠單抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉妥單抗(gemtuzumab)、奧佐米星(ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、來格司亭(lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、黑色素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim)、他索那敏(tasonermin)、泰克白介素(tecleukin)、司呱拉辛(thymalasin)、托西莫單抗(tositumomab)、維如利金(Vimlizin)、依帕珠單抗(epratuzumab)、米妥莫單抗(mitumomab)、奧雷瑞(oregovomab)、派圖莫(pemtumomab)與普拉維格(Provenge)；生物反應修飾劑係修飾活生物體防禦機制或生物反應(例如：組織細胞之存活、生長或分化)使其具有抗腫瘤活性之製劑；此等製劑包括雲芝多糖(krestin)、香菇多糖(lentinan)、西佐口南(sizofiran)、溶鏈菌(picibanil)、ProMune與烏苯美司(ubenimex)；抗血管新生化合物包括(但不限於)：阿西曲丁(acitretin)、阿柏西普(aflibercept)、血管抑素(angiostatin)、阿普利汀(aplidine)、阿斯拓(asentar)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninat)、昔冷特(cilengtide)、考布他汀(combretastatin)、內皮抑制素 (endostatin)、芬維A胺(fenretinide)、鹵夫酮(halofuginone)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、瑞比瑪斯特(rebimastat)、瑞斯汀(recentin)、癌瑞格(regorafenib)、雷莫氟(removab)、瑞復美(revlimid)、索拉非尼(sorafenib)、角鯊胺(squalamine)、舒尼替尼(sunitinib)、替拉替尼(telatinib)、沙利竇邁(thalidomide)、烏卡蘭(ukrain)、瓦他拉尼(vatalanib)、與維他辛(vitaxin)；抗體包括(但不限於)：曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、替斯利單抗(ticilimumab)、易普利單抗(ipilimumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、卡圖瑪素單抗(catumaxomab)、阿塞西普(atacicept)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)與阿侖單抗(alemtuzumab)；VEGF抑制劑，如，例如：索拉非尼(sorafenib)、癌瑞格(regorafenib)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、瑞斯汀(recentin)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、替拉替尼(telatinib)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninate)、瓦他拉尼(vatalanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、與雷珠單抗(ranibizumab)；EGFR(HER1)抑制劑，如，例如：西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、維必施(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、與紮西替尼(Zactima)；HER2抑制劑，如，例如：拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、與帕妥珠單抗(pertuzumab)；mTOR抑制劑，如，例如：特癌適(temsirolimus)、西羅莫司(sirolimus)/雷帕黴素(Rapamycin)、與依維莫司(everolimus)；PI3K抑制劑，如：PI3K抑制劑1(2-胺基-N-[7-甲氧基-8-(3-嗎啉-4-基丙氧基)-2,3-二氫咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]嘧啶-5-甲醯胺二鹽酸鹽(參見WO 2012/136553之實例1與2化合物(其揭示內容已以引用之方式完整併入本文中)；及AKT抑制劑； CDK抑制劑，如：若索非汀(roscovitine)與夫拉平度(flavopiridol)；紡錘體組裝檢控點抑制劑及標靶抗有絲分裂劑，如：PLK抑制劑、Aurora抑制劑(例如：Hesperadin)、檢控點激酶抑制劑，及KSP抑制劑；HDAC抑制劑，如，例如：帕比司他(panobinostat)、伏立諾他(vorinostat)、MS275、貝立諾他(belinostat)、與LBH589；HSP90及HSP70抑制劑；蛋白酶體抑制劑，如：硼替佐米(bortezomib)與卡菲索美(carfilzomib)；絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑，包括MEK抑制劑與Raf抑制劑，如：索拉非尼(sorafenib)；法呢基(Farnesyl)轉移酶抑制劑，如，例如：替吡法尼(tipifarnib)；酪胺酸激酶抑制劑，包括例如：達沙替尼(dasatinib)、尼魯替比(nilotibib)、癌瑞格(regorafenib)、博舒替尼(bosutinib)、索拉非尼(sorafenib)、貝伐單抗(bevacizumab)、舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、替拉替尼(telatinib)、伊馬替尼甲磺酸鹽(imatinib mesylate)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninate)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、瓦他拉尼(vatalanib)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、維必施(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、與c-Kit抑制劑；維他命D受體促效劑
Bcl-2蛋白質抑制劑，如：歐巴克斯(obatoclax)、奧利默森納(oblimersen sodium)、與棉籽酚(gossypol)；分化抗原簇20受體拮抗劑，如，例如：利妥昔單抗(rituximab)；核糖核苷酸還原酶抑制劑，如，例如：健擇(gemcitabine)；腫瘤壞死因子相關之細胞凋亡誘發配體受體1促效劑，如，例如：馬帕木單抗(mapatumumab)；腫瘤壞死因子相關之細胞凋亡誘發配體受體2促效劑，如：例如：來沙木單抗(lexatumumab)、康特單抗(conatumumab)、CS-1008、PRO95780； 5-羥基色胺受體拮抗劑，如，例如：rEV598、賽利普得(xaliprode)、帕洛諾司瓊鹽酸鹽(palonosetron hydrochloride)、格蘭塞隆(granisetron)、Zindol、與AB-1001；整合素抑制劑，包括αa5-β1整合素抑制劑，如，例如：E7820、JSM 6425、維樂希馬(volociximab)、與內皮抑素(endostatin)；雄激素受體拮抗劑，包括例如：癸酸苯丙酸諾龍(nandrolone decanoate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、Android、Prost-aid、安卓姆斯汀(andromustine)、比卡魯醯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、載脂蛋白環丙孕酮(apo-cyproterone)、載脂蛋白氟他胺(apo-flutamide)、乙酸氯地孕酮(chlormadinone acetate)、Androcur、Tabi、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、與尼魯米特(nilutamide)；芳香環酶抑制劑，如，例如：阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、睾內酯(testolactone)、依西美坦(exemestane)、胺基格魯米特(amino-glutethimide)、與福美坦(formestane)；基質金屬蛋白酶抑制劑；其他抗癌劑，包括例如：阿利維A酸(alitretinoin)、安普利金(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)、貝沙羅汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、波生坦(bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、依昔舒林(exisulind)、福莫司汀(fotemustine)、伊班膦酸(ibandronic acid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、I-天冬醯胺酶、丙卡巴肼(procarbazine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、羥基脲、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、他紮羅汀(tazaroten)、萬科(velcade)、硝酸鎵、散夫米德(canfosfamide)、達瑞帕星(darinaparsin)、與維甲酸(tretinoin)。
在較佳具體實施例中，本發明化合物可以組合使用化療劑(亦即細胞毒性劑)、抗激素劑與/或標靶療法，如：其他激酶抑制劑(例如：EGFR抑制劑)、mTOR抑制劑及血管新生抑制劑。
較佳具體實施例中，本發明抗體可組合使用檢控點抑制劑及針對可能使任何使用中之抗癌免疫反應變得太弱或無效之免疫療法受體之抗 體。較佳為干擾CTLA4、PD-1(CD279、PDCD1)、PD-L1(B7-H1、CD274、PDCD1LG1)、PD-L2(PDCD1LG2、B7-DC、CD273)、CD276(B7-H3)、TNFRSF4(OX-40、CD134)、CD27(TNFRSF7)、CD70(CD27配體)、TNFRSF9(CD137、CDw137、4-1BB、CD137、ILA)、TNFRSF18(GITR、AITR、CD357)、KIR3(KIR、NKAT3、NKB1、CD158e)、LAG3(CD223)、TIM-3之單株抗體(mAb)。此等抗體包括(但不限於)：抑普利單抗(ipilimumab)、尼弗魯單抗(nivolumab)、本伯利單抗(pembrolizumab)、比得利單抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、RG-7446、BMS-936559、杜瓦單抗(durvalumab)、MSB-0010718C、rHIgM12B7、MGA-271、124I-8H9、MEDI-6469、CDX-1127、瓦利單抗(varlilumab)、AMG 172、ARGX-110、SGN-70A、烏利單抗(urelumab)、PF-05082566、TRX-518、MK4166、力利單抗(lirilumab)、BMS-986016。極佳具體實施例中，本發明抗體係組合使用抗-CTLA4、抗-PD-1、及/或抗-PD-L1抗體，包括(但不限於)：抑普利單抗(ipilimumab)、尼弗魯單抗(nivolumab)、本伯利單抗(pembrolizumab)、BMS-936559、杜瓦單抗(durvalumab)、RG-7446。
本發明化合物亦可組合放射療法與/或外科手術，用於治療癌症。
此外，本發明抗體可呈本身或組成物用於研究及診斷，或作為分析參考標準物，及類似物，其係相關技藝上習知者。
診斷方法
抗-TWEAKR抗體可用於檢測TWEAKR-表現腫瘤之存在。可使用抗-TWEAKR抗體檢測各種不同生物檢體(包括血清)與組織生檢樣本中含TWEAKR細胞或脫落之TWEAKR之存在。此外，抗-TWEAKR抗體可用於各種不同顯影法，如：使用99Tc(或其他同位素)接合抗體之免疫閃爍法。例如：可採用類似使用111In接合抗-PSMA抗體所說明之顯影法來檢測胰臟或卵巢癌瘤(Sodee等人之Clin.Nuc.Med.21：759-766,1997)。另一種可使用之檢測方法為藉由本發明抗體與合適同位素接合之正子電腦斷層攝影(參見Herzog等人之J.Nucl.Med.34：2222-2226,1993)。
醫藥組成物及投藥法
為了治療上述任何疾患，根據本發明使用之醫藥組成物可依習知方式，使用一或多種生理上可接受之載劑或賦形劑調配。本發明抗體可採用任何合適方式投藥，其將隨所治療疾患型態而定。可能之投藥途徑包括非經腸式(例如：經肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下)、肺內與鼻內，且若需要局部抑制免疫治療法時，可在病灶內投藥。此外，本發明抗體可採用例如：逐漸降低劑量之抗體，利用脈衝輸注投藥。較佳係利用注射法投藥，最佳係經靜脈內或皮下注射，有一部份隨是否短暫或長期投藥而定。投藥量將隨各種不同因素決定，如：臨床症狀、個體之體重、是否投與其他藥物。熟悉此相關技術者咸了解，投藥途徑會隨所治療疾患或病症而定。
本發明具體實施例為一種醫藥組成物，其包含抗-TWEAKR抗體單一藥劑或組合使用至少一種其他藥劑，如：安定性化合物，其可含在任何無菌之生物相容性醫藥載劑中，包括(但不限於)：生理食鹽水、緩衝之生理食鹽水、右旋糖與水。另一項具體實施例為一種醫藥組成物，其包含TWEAKR結合性抗體與適合治療TWEAKR相關疾病(如：癌症)之其他醫藥活性化合物。任何此等分子均可單獨投與患者，或組合其他藥劑、藥物或激素，於醫藥組成物中，與賦形劑(群)或醫藥上可接受之載劑混合投藥。本發明一項具體實施例中，該醫藥上可接受之載劑為醫藥惰性載劑。
本發明亦有關醫藥組成物之投藥法。此等投藥法係經口或非經腸式投藥。非經腸式傳送法包括局部、動脈內(直接送至腫瘤)、肌內、皮下、脊髓內、鞘內、心室內、靜脈內、腹膜內、或鼻內投藥。除了活性成份，此等醫藥組成物可包含合適之醫藥上可接受之載劑，其包含促進活性化合物加工製成醫藥用製劑之賦形劑與輔劑。有關調配與投藥技術之詳細說明可參見最近版本之Remington's Pharmaceutical Sciences(編輯Maack Publishing Co,Easton,Pa.)。
經口投藥之醫藥組成物可使用相關技藝上習知之醫藥上可接受之載劑調配成適合經口投藥之劑量。此等載劑可使醫藥組成物調配成錠劑、 丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及類似物，供患者服用。
口服用醫藥製劑製法為組合活性化合物與固體賦形劑，視需要研磨所得混合物，並依需要在添加合適輔劑後加工該顆粒混合物，得到錠劑或糖衣錠內核。合適之賦形劑為碳水化合物或蛋白質填料，如：糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；來自玉米、小麥、米、馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素，如：甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、或羧甲基鈉纖維素；及膠質，包括阿拉伯膠與黃蓍膠；及蛋白質，如：明膠與膠原蛋白。若需要時，可添加崩解劑或溶解劑，如：交聯聚乙烯吡咯啶酮、洋菜、藻酸、或其鹽，如：藻酸鈉。
糖衣錠內核可具有合適包衣，如：濃縮糖液，其亦可包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波膠(carbopol gel)、聚乙二醇與/或二氧化鈦、清漆溶液、與合適之有機溶劑或溶劑混合物。可添加染料或色素至錠劑或糖衣錠包衣中，供分辨產品或判別活性化合物用量，亦即劑量。
可口服之醫藥製劑包括由明膠製成之推合式膠囊，及由明膠與包衣(如：甘油或山梨糖醇)製成之軟式密封膠囊。推合式膠囊可包含活性成份與填料或結合劑(如：乳糖或澱粉)、潤滑劑(如：滑石或硬脂酸鎂)、及視需要選用之安定劑之混合物。軟式膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮於含或不含安定劑之合適液體中，如：脂肪油類、液態石蠟、或液態聚乙二醇。
非經腸式投藥之醫藥調配物包括活性化合物之水溶液。注射用之本發明醫藥組成物可於水溶液中，較佳於生理上可相容之緩衝液中調配，如：漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)、或緩衝之生理食鹽水。水性注射懸浮液可包含會提高懸浮液黏度之物質，如：羧甲基鈉纖維素、山梨糖醇或葡聚醣。此外，活性化合物之懸浮液可製成適當油性注射懸浮液。合適之親脂性溶劑或媒劑包括脂肪酸油類(如：芝麻油)，或合成性脂肪酸酯類(如：油酸乙酯或三酸甘油酯)、或脂質體。該懸浮液可視需要亦包含合適安定劑或提高化合物溶解之製劑，以便製造高濃縮溶液。
供局部或鼻內投藥時，可在調配物中使用適合需要滲透之特定障壁之滲透劑。此等滲透劑係相關技藝上一般已知者。
本發明醫藥組成物可依相關技藝上已知方式製造，例如：採用一般混合法、溶解法、造粒法、糖衣錠製法、細磨法、乳化法、囊封法、包埋法、或凍乾法。
該醫藥組成物可呈鹽型提供，且可與酸類形成，包括(但不限於)：鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸，等等。相較於游離鹼型，鹽類傾向較容易溶於水性或其他質子性溶劑中。其他例子中，較佳製劑可為含在1mM-50mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露糖醇，pH範圍4.5至5.5之凍乾粉末，使用前再使用緩衝液組合。
於可接受之載劑中調配包含本發明化合物之醫藥組成物後，其可置入適當容器中，並標識供治療之適應症。投與抗-TWEAKR抗體時，此等標識將包括投藥之用量、頻率與方法。
套組
本發明進一步有關醫藥包裝與套組，其包含一個或多個容器，其中填充上述本發明組成物之一或多種成份。此等容器(群)可包括說明書，其係呈管理醫藥或生物產品之製造、用法或銷售之政府管理局單位所規定之格式，其反映該局已核准製造、使用、或銷售該產品供人類投藥。
醫療有效劑量
適用於本發明之醫藥組成物包括組成物，其中包含可達成計畫目的(亦即治療特徵在於TWEAKR表現之特定疾病狀態)之有效量活性成份。
彼等熟悉此相關技術者均有能力決定有效劑量。
本發明新穎抗體之醫療有效量之決定主要依據特定患者特徵、投藥途徑、及所治療疾患之性質而定。其一般指南可參見例如：International Conference on Harmonization及REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第27與28章，pp.484-528(第18版，Alfonso R.Gennaro編輯，Easton,Pa.：Mack Pub.Co.,1990)等公開文獻。更明確言之，醫療有效量 將隨如：該藥品之毒性與效力等因素決定。可採用相關技藝上習知方法並可參見上述參考文獻決定毒性。可利用相同指南並配合下文實例中說明之方法決定效力。
可先在細胞培養分析法中(例如：新生贅瘤細胞)，或在動物模式中(通常在小鼠、兔子、狗、豬或猴子中)預估任何化合物之醫療有效劑量。亦可採用動物模式來達到所需之濃度範圍及投藥途徑。此等資訊可用於決定適用於投與人類之劑量與途徑。
醫療有效劑量係指抗體或其抗原結合性片段可緩解症狀或病症時之用量。此等化合物之醫療效力與毒性可採用標準醫藥程序，於細胞培養物或實驗動物中測定，例如：ED50(使50%族群達到醫療有效性時之劑量)及LD50(使50%族群致死時之劑量)。醫療與毒性效應之間之劑量比值稱為醫療指數，並以ED50/LD50比值表示。以醫療指數高之醫藥組成物較佳。從細胞培養分析法及動物試驗得到之數據可用於調配供人類用之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳落在毒性很低或沒有毒性之包括ED50之循環範圍內。此範圍內之劑量端視所使用之劑型、患者之敏感度、與投藥途徑而變化。
由各醫師依據所治療患者來選擇確實劑量。可調整劑量與投藥法，以提供足量活性部份體或維持所需效力。其他可考慮之因素包括疾病狀態之嚴重性，例如：腫瘤大小與位置；患者之年齡、體重與性別；飲食、投藥時間與頻率、藥物組合(群)、反應敏感性、及對療法之耐受性/反應。長效性醫藥組成物可以例如：每3至4天投藥、每週投藥、每兩週投藥一次、或每3週投藥一次，端視該特定調配物之半衰期與清除率而定。
正常劑量可在0.1至100,000微克之間變化，至多達總劑量約2g，視投藥途徑而定。有關特定劑量與傳送方法之指示已提供於文獻中。參見美國專利案案號4,657,760；5,206,344；或5,225,212。彼等熟悉此相關技術者將可針對聚核苷酸與蛋白質或其抑制劑採用不同調配物。同樣地，聚核苷酸或多肽之傳遞將隨特定細胞、病症、位置，等等而異。放射性標記抗體之較佳比活性範圍可為0.1至10mCi/mg蛋白質(Riva等人之Clin.Cancer Res.5：3275-3280,1999；Ulaner等人之2008 Radiology 246(3)：895-902)。
本發明其他較佳具體實施例為：
1.一種單離之抗-TWEAKR抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留N-連接位點之聚醣之突變Fc區，其特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)(SEQ ID NO：169)。
2.根據具體實施例第1項之抗體，其包含Fc區胺基酸位置297及/或299之胺基酸取代，其中Fc區中殘基編號係Kabat之EU索引。
3.根據具體實施例第2項之抗體，其包含N297A或N297Q之胺基酸取代(Kabat之EU索引)。
4.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其中該抗體結合Fcγ受體，較佳係FcγRIIB，其KD值高於包含未修飾Fc區之親本抗體超過10倍。
5.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其中該抗體與人類FcγRIIB結合之KD值大於200μM。
6.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其中當抗體對TPP-2614之ELISA訊號比TPP-2203下降超過80%時，該抗體係與TWEAKR位置47之D(D47)(SEQ ID NO：169)特異性結合。
7.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其中該抗體係促效性抗體。
8.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其包含：可變重鏈，其包含：(a)重鏈CDR1，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：PYPMX(SEQ ID NO：171)，其中X為I或M；(b)重鏈CDR2，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO：172)，其中X為S或K；及(c)重鏈CDR3，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO：173)；與可變輕鏈，其包含：(a)輕鏈CDR1，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：RASQSISXYLN(SEQ ID NO：174)，其中X為G或S； (b)輕鏈CDR2，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：XASSLQS(SEQ ID NO：175)，其中X為Q、A、或N；及(c)輕鏈CDR3，其係由包含如下式之胺基酸序列編碼：QQSYXXPXIT(SEQ ID NO：176)，其中位置5之X為T或S，及位置6之X為T或S，及位置8之X為G、或F。
9.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其包含：a.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：6所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：7所示之可變重鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：8所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：3所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：4所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：5所示之可變輕鏈CDR3序列，或b.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：16所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：17所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：18所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：13所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：14所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：15所示之可變輕鏈CDR3序列，或c.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：26所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：27所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：28所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：23所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：24所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：25所示之可變輕鏈CDR3序列，或d.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：36所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：37所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：38所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：33所示之可變輕鏈CDR1序列、 如SEQ ID NO：34所示之可變輕鏈CDR2序列，及如SEQ ID NO：35所示之可變輕鏈CDR3序列，或e.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：46所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：47所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：48所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：43所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：44所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：45所示之可變輕鏈CDR3序列，或f.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：56所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：57所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：58所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：53所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：54所示之可變輕鏈CDR2序列，及如SEQ ID NO：55所示之可變輕鏈CDR3序列，或g.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：66所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：67所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：68所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：63所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：64所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：65所示之可變輕鏈CDR3序列，或h.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：76所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：77所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：78所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：73所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：74所示之可變輕鏈CDR2序列，及如SEQ ID NO：75所示之可變輕鏈CDR3序列，或 i.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：86所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：87所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：88所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：83所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：84所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：85所示之可變輕鏈CDR3序列，或j.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：96所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：97所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：98所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：93所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：94所示之可變輕鏈CDR2序列，及如SEQ ID NO：95所示之可變輕鏈CDR3序列，或k.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：106所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：107所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：108所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：103所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：104所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：105所示之可變輕鏈CDR3序列，或l.可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：116所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：117所示之可變重鏈CDR2序列、如SEQ ID NO：118所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：113所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：114所示之可變輕鏈CDR2序列，及如SEQ ID NO：115所示之可變輕鏈CDR3序列。
10.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其包含：a.如SEQ ID NO：10所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：9所示之可變輕鏈序列，或 b.如SEQ ID NO：20所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：19所示之可變輕鏈序列，或c.如SEQ ID NO：30所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：29所示之可變輕鏈序列，或d.如SEQ ID NO：40所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：39所示之可變輕鏈序列，或e.如SEQ ID NO：50所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：49所示之可變輕鏈序列，或f.如SEQ ID NO：60所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：59所示之可變輕鏈序列，或g.如SEQ ID NO：70所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：69所示之可變輕鏈序列，或h.如SEQ ID NO：80所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：79所示之可變輕鏈序列，或i.如SEQ ID NO：90所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：89所示之可變輕鏈序列，或j.如SEQ ID NO：100所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：99所示之可變輕鏈序列，或k.如SEQ ID NO：110所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：109所示之可變輕鏈序列，或l.如SEQ ID NO：120所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：119所示之可變輕鏈序列。
11.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其係IgG抗體，較佳係人類IgG1。
12.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其包含如SEQ ID NO：213所示之重鏈序列及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列。
13.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其為單株抗體。
14.根據前述具體實施例中任一項之抗體，其為人類、人類化或嵌合性抗體。
15.一種抗體-藥物接合物，其包含根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體。
16.一種單離之核酸序列，其編碼根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體。
17.一種載體，其包含根據具體實施例第16項之核酸序列。
18.一種單離之細胞，其表現根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體及/或包含根據具體實施例第16項之核酸或根據具體實施例第17項之載體。
19.根據具體實施例第18項之單離之細胞，其中該細胞為原核生物或真核生物細胞。
20.一種製造根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體之方法，其包括培養根據具體實施例第19項之細胞，並純化該抗體。
21.根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體或根據具體實施例第15項之抗體-藥物接合物，其係用為醫藥。
22.根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體，其係用為診斷劑。
23.根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體或根據具體實施例第15項之抗體-藥物接合物，其係用為治療癌症之醫藥。
24.一種醫藥組成物，其包含根據具體實施例第1至14項中任一項之抗體或根據具體實施例第15項之抗體-藥物接合物。
25.一種包含根據具體實施例第24項之醫藥組成物與一或多種醫療活性化合物之組合。
26.根據具體實施例第25項之組合，其中該醫療活性化合物為抗-CTLA4、抗-PD-1、或抗-PD-L1抗體。
27.一種治療與不希望存在TWEAKR有關之疾患或病症之方法，其包括對有此需要之個體投與有效量之根據具體實施例第24項之醫藥組成物或根據具體實施例25或具體實施例26之組合。
實例
本發明進一步利用下列實例說明。該等實例僅供參照明確具體實施例說明本發明。此等說明本發明某些特定態樣之範例並未加以限制或構成所揭示本發明之限制範圍。
所有實例均使用標準技術進行，除非另有詳細說明，否則其係熟悉此相關技術者習知之例行技術。下列實例之例行分子生物技術可依據標準實驗室手冊之說明進行，如：Sambrook等人之Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
實例中除了非糖苷基抗-TWEAKR抗體(如：TPP-2658)外，亦說明經由突變法轉化成相應非糖苷基抗體之抗體(如：TPP-2090)。所提供之抗體TPP-2090之實例係由非糖苷基抗體TPP-2658經由N297突變形成丙胺酸所轉化形成。為了轉化此等糖苷基化抗體形成非糖苷基抗體，較佳係在Fc區之N297突變形成丙胺酸或麩醯胺(採用Kabat EU編號)。極佳為N297突變形成丙胺酸。
實例1：由Dyax抗體集合庫產生抗體
採用全人類抗體噬菌體展現集合庫(Hoet RM等人之Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，採用蛋白質淘選法(panning)(Hoogenboom H.R.、Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)，使用人類及鼠類TWEAKR之二聚合Fc-融合細胞外功能域作為固定化標靶來單離本發明TWEAKR-特異性人類單株抗體。
依據製造商之指示，由抗原使用過量約2倍莫耳濃度之生物素-LC-NHS(Pierce；目錄編號21347)進行生素基化，並使用Zeba脫鹽管柱脫鹽(Pierce；目錄編號89889)。取洗滌磁珠(Dynabeads)與200nM生物素基化 人類抗原於4℃下培養，並於4℃下使用封阻緩衝液(含3% BSA、0.05% Tween-20之PBS)封阻1小時。添加封阻之Fab-噬菌體集合庫至封阻之TWEAKR-珠(Dynabeads Streptavidin M280-Invitrogen 112-06D)，於室溫下培養30min。經過嚴苛洗滌條件(3 x封阻緩衝液及9 x PBS(150mM NaCl；8mM Na2HPO4；1.5mM KH2PO4；調整至pH=7.4-7.6，含0.05% Tween-20)後，使特異性結合至生物素基化TWEAKR-珠(Dynabeads Streptavidin M280-Invitrogen 112-06D)之Fab-噬菌體再懸浮於PBS中，及直接用於感染大腸桿菌(Escherichia coli)菌株TG1進行擴增。在第二輪選拔時，使用鼠類TWEAKR(200nM)來選拔交叉反應結合劑，及在第三輪選拔時降低人類TWEAKR之濃度(100nM)，以加強選拔高親和力結合劑之壓力。
判別11種不同Fab-噬菌體，並再選殖相應抗體至哺乳動物IgG表現載體中，該載體提供原本不存在可溶性Fab中之缺失CH2-CH3功能域。所得IgG過渡表現在哺乳動物細胞中，其說明於Tom等人之Method Express：Expression Systems，Micheal R.Dyson與Yves Durocher編輯，Scion Publishing Ltd,2007。簡言之，取基於CMV-發動子之表現質體轉染至HEK293-6E細胞，並於馮巴赫瓶(Fernbach-Flasks)或塑料袋(Wave-Bags)中培養。於37℃下，於F17培養基(Invitrogen)中表現5至6天。在轉染24小時後補充1%超低IgG FCS(Invitrogen)及0.5mM丙基戊酸(Valproic acid)(Sigma)。抗體經蛋白質A層析法純化，進一步於實例2說明之ELISA與Biacore分析法中判別其對可溶性單體TWEAKR之結合性親和力特徵。
測定抗-TWEAKR抗體之細胞結合性特徵時，採用流式細胞儀測試一組細胞株(HT29、HS68、HS578)之結合性。取細胞懸浮於含抗體(5μg/ml)之FACS緩衝液之稀釋液中，於冰上培養1小時。隨後添加第二抗體(PE山羊抗人類IgG，Dianova #109-115-098)。於冰上培養1小時後，利用 流式細胞儀，使用FACS-Array(BD Biosciences)分析細胞。
進行NF-κB報導子基因分析法，分析所有11種已判別抗體(人類IgG1)之促效活性。使用NF-κB報導子構築體(BioCat，目錄編號LR-0051-PA)，依據製造商之指示，使用293fectin過渡轉染HEK293細胞。在塗佈聚離胺酸之白色384孔板(BD)中接種轉染細胞至37℃與5% CO2下之F17培養基(無血清；Invitrogen)中。次日，細胞接受不同濃度之純化抗體刺激6小時後，依據標準程序進行螢光素酶分析法。
內化後，進行抗-TWEAKR抗體之螢光標記(CypHer 5E單NHS酯；GE Healthcare)。在處理之前，先接種HT29細胞(2 x 104/孔)至96-MTP板(黑色透明平底No 4308776，Applied Biosystems)之100μl培養基中。於37℃/5% CO2下培養18小時後，更換培養基(表No 21)，添加不同濃度之已標記抗-TWEAKR抗體(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)。所選擇之培養時間為0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6及24小時。採用InCell分析儀1000(GE Healthcare)測定螢光。
選拔活體外效力最強之抗體(TPP-883)進一步分析效力與親和力成熟。
TPP-883
SEQ ID NO.71
SEQ ID NO.72 TPP-883之輕(SEQ ID NO.71)鏈與重(SEQ ID NO.72)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。。
成熟法係在第一輪突變簇集後，重組最能提高親和力-及效力之胺基酸變化。進行突變簇集NNK(N=AGCT、K=G或T)時，採用定點誘變法，使用合成性寡核苷酸(包括NNK密碼子-多樣化(連續胺基酸命名法，對照圖25)，隨機分佈在下列個別胺基酸位置上：CDR-L1之S35、S36、Y37及N39；CDR-L2之A51、S53、S54、Q56及S57；CDR-L3之S92、Y93、S94、S95、G97及I98；CDR-H1之P31、Y32、P33、M34及M35；CDR-H2之Y50、S52、P53、S54、G56、K57及H59；CDR-H3之G99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105及Y106。再分別選殖所有單一NNK飽和誘變集合庫之DNA至哺乳動物IgG表現載體中，讓效力成熟，及再選殖至噬質體載體，讓親和力成熟。採用噬菌體淘選法進行親和力成熟。取洗滌之磁珠(Dynabeads)與10nM、1nM、100pM及10pM生物素基化人類抗原，於4℃下培養，及於4℃下使用封阻緩衝液(含3% BSA、0.05% Tween-20之PBS)封阻1小時。添加比理論集合庫複雜度超過10000倍、1000倍及100倍之封阻之Fab-噬菌體集合庫至封阻之TWEAKR-Dynabeads中，於室溫下培養30min。因此共進行12種方式(4種抗原濃度x3種Fab-噬菌體效價)。經過嚴苛洗滌條件(3 x封阻性緩衝液及9 x含0.05% Tween-20之PBS)後，取Fab-噬菌體特異性結合至生物素基化TWEAKR-Dynabeads(Dynabeads Streptavidin M280-Invitrogen 112-06D)再懸浮於PBS，直接用於感染大腸桿菌菌株TG1，供進行擴增。在第二輪選拔中，降低人類TWEAKR-Fc之濃度(1nM、100pM、10pM及1pM)，及所有12種處理法均使用相同Fab-噬菌體效價(4.4 x 1011)。表現可溶性Fab時，使用限制內切核酸酶MluI分解噬質體載體，排除在噬菌體上展現Fab時所必需之基因III 膜錨序列，再黏接。12種選拔集合之各96種變異體均表現可溶性Fab，並以ELISA格式測試。因此，塗佈2.5nM生物素基化TWEAKR-Fc抗原，採用抗-c-Myc抗體(Abcam ab62928)檢測可溶性Fab之結合性。檢測對TWEAKR-Fc(Seq ID No 138)具有改良結合性之7種單一取代變異體(連續胺基酸命名，對照圖25)：CDR-L1之S36G、CDR-L2之A51Q與S57K、CDR-L3之S94T及G97F、CDR-H1之M35I及CDR-H3之G102T。進行效力成熟時，由HEK293細胞經過NF-κB報導子(BioCat，目錄編號LR-0051-PA)轉染。在塗佈聚離胺酸之白色384孔板(BD)中接種轉染細胞至F17培養基(無血清；Invitrogen)，並在哺乳動物細胞中過渡表現NNK-多樣位置抗體(人類IgG1)集合庫之個別變異體。次日，使用所表現之單一NNK誘變抗體變異體刺激NF-κB報導子細胞6小時，隨後依據標準製程進行螢光素酶分析法。檢測具有改良促效活性之1個單一取代變異體：CDR-H3之G102T。亦可從親和力成熟中得到此變異體，且亦顯示加強至最大親和力。在親和力之突變簇集及篩選效力之後，在一個重組集合庫中重組所有7個有利之單一取代(集合庫複雜度：128種變異體)。因此，合成寡核苷酸以在各選擇位置引進所選之突變或相應之野生型胺基酸。採用連續幾回重疊表現PCR來構築集合庫。取最終PCR產物黏接至細菌可溶性Fab表現載體中，並使用如上述可溶性Fab隨機選拔528種變異體(約4倍過量採樣)供進行平衡ELISA篩選法。最後，依據其比最佳單一取代變異體G102T加強之親和力選拔7種變異體。此等變異體之對應DNA則再選殖至哺乳動物IgG表現載體中，並在上述NF-κB報導子細胞分析法中測試其功能活性。最後，所得序列再與人類生殖系序列比較，並在不顯著影響親和力與效力下調整偏差。表31所示之抗體係由抗體集合庫篩選及親和力與/或效力成熟所製得。
TPP-2658
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.213： TPP-2658之輕(SEQ ID NO.1)鏈與重(SEQ ID NO.213)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2090
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2： TPP-2090之輕(SEQ ID NO.1)鏈與重(SEQ ID NO.2)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2149
SEQ ID NO.11
SEQ ID NO.12 TPP-2149之輕(SEQ ID NO.11)鏈與重(SEQ ID NO.12)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2093
SEQ ID NO.21
SEQ ID NO.22 TPP-2093之輕(SEQ ID NO.21)鏈與重(SEQ ID NO.22)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2148
SEQ ID NO.31
SEQ ID NO.32 TPP-2148之輕(SEQ ID NO.31)鏈與重(SEQ ID NO.32)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2084
SEQ ID NO.41
SEQ ID NO.42 TPP-2084之輕(SEQ ID NO.41)鏈與重(SEQ ID NO.42)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-2077
SEQ ID NO.51
SEQ ID NO.52 TPP-2077之輕(SEQ ID NO.51)鏈與重(SEQ ID NO.52)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-1538
SEQ ID NO.61
SEQ ID NO.62 TPP-1538之輕(SEQ ID NO.61)鏈與重(SEQ ID NO.62)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-1854
SEQ ID NO.81
SEQ ID NO.82 TPP-1854之輕(SEQ ID NO.81)鏈與重(SEQ ID NO.82)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-1853
SEQ ID NO.91
SEQ ID NO.92 TPP-1853之輕(SEQ ID NO.91)鏈與重(SEQ ID NO.92)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-1857
SEQ ID NO.101
SEQ ID NO.102 TPP-1857之輕(SEQ ID NO.101)鏈與重(SEQ ID NO.102)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
TPP-1858
SEQ ID NO.111
SEQ ID NO.112 TPP-1858之輕(SEQ ID NO.111)鏈與重(SEQ ID NO.112)鏈之胺基酸序列；重鏈與輕鏈之CDR均以下加線表示。
實例2：抗體之生化特徵分析 採用Biacore分析法測定結合親和力：
抗-TWEAKR抗體之結合親和力係採用表面電漿共振儀分析法，於Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)上測定。抗體係利用間接捕捉試劑(抗人類IgG(Fc))固定在CM5感測晶片上。依製造商之說明使用來自“人類抗體捕捉套組”(BR-1008-39,GE Healthcare Biacore,Inc.)之試劑。抗-TWEAKR抗體之注射濃度為10μg/ml，10μl/min，注射10秒。
取各種不同濃度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM)之純化重組體人類TWEAKR蛋白質(TPP-2305、SEQ ID NO：168)注入HEPES-EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)中，通過固定化抗-TWEAKR抗體，流速60μl/min，持續3分鐘，並進行解離5分鐘。在經過線上參考細胞校正後，扣除緩衝液樣本，產生感應譜。將第一級1：1結合模式代入感應譜，依據所得之締合(kon)與解離速率(koff)常數之比值計算解離平衡常數(KD)。
表6：採用Biacore，使用TWEAKR蛋白質(TPP-2305(SEQ ID NO：168))測定抗-TWEAKR抗體之單價KD值
本文所揭示之抗體經測定對TWEAKR之結合性為輕度親和力(KD值為10-200nM)，而有些用於對照之抗體(例如：PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)、ITEM-1、ITEM-4)則顯示高度親和力之結合性(0.7-3.7nM)。自專利案WO2009/020933及WO2009/140177取得抗體PDL-192、136.1、18.3.3、P4A8、P3G5及P2D3之可變功能域序列，並增加編碼人類IgG1及鼠類IgG2恆定區之序列，形成全長度IgG PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)。先前曾說明之其他抗體在此試驗中測定之親和力範圍係線上公開之數據：PDL-192、18.3.3與136.1之公開KD值為5.5、0.2及0.7nM(WO2009/020933)；P4A8為2.6nM(WO2009/140177)。用對照之天然配體TWEAK與TWEAKR結合之KD值為0.8-2.4nM(Immunity.2001 Nov；15(5)：837-46；Biochem J.2006 Jul 15；397(2)：297-304；Arterioscler Thromb Vasc Biol.2003 Apr 1；23(4)：594-600)。
因此本文所揭示之抗體(TPP-883、TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084、TPP-2148、TPP-2093、TPP-2149及TPP-2090)與TWEAKR係具有輕度結合親和力(KD 10-200nM)。
採用Biacore分析法分析物種交叉反應性：
分析物種交叉反應性時，表現人類、大鼠、鼠類、狗、豬及食蟹獼猴(macaca fascicularis)TWEAKR，並純化成人類Fc片段融合蛋白質，並利用胺偶合法，經由標準EDC/NHS-介導化學(BR-1006-33，GE Healthcare Biacore,Inc.)，固定在CM5感測晶片上。
取各種不同濃度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM)之抗-TWEAKR抗體注入HEPES-EP緩衝液(GE Healthcare Biacore,Inc.)中，通過固定化TWEAKR物種，流速60μl/min，持續3分鐘，並進行解離5分鐘。在經過線上參考細胞校正後，扣除緩衝液樣本，產生感應譜。使用Biavaluation軟體，採用二價分析物模式代入感應譜，依據所得之締合(kon)與解離速率(koff)常數之比值計算解離平衡常數(KD)。由未提供“絕對”KD值但提供良好對照數據之固定化二價抗原，依“穩定性模式”測定抗-TWEAKR抗體之物種交叉反應性
因此本文所揭示抗體(TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084及TPP-2090)對所有測試之物種(人類、大鼠、鼠類、狗、豬及食蟹獼猴TWEAKR)均顯示親和力。
採用TWEAKR胞外功能域之N-與C-末端截短變異體判別TPP-2090之結合性抗原決定基特徵：
不同物種之TWEAKR半胱胺酸富集功能域(aa 34-68)之排比(圖1)顯示，其保留在所有6種所分析之物種中。PDL-192結合性依賴R56(WO2009/020933：圖2B)，因此不會結合大鼠、豬及小鼠TWEAKR。TPP-2090結合性依賴保留之胺基酸D47，因此會結合所有所述之物種。
第一種判別上述抗體之結合性抗原決定基之方法中，產生TWEAKR胞外功能域之N-及C-末端截短突變株，測試其與不同抗-TWEAKR抗體之結合能力。刪除N-末端胺基酸28至33及C-末端胺基酸69至80，因此Cys36-Cys49、Cys52-Cys67及Cys55-Cys64之間具有二硫橋鍵之半胱胺酸富集功能域保持完整(參照圖2)。這兩種構築體均表現包括N-與C-末端之整個胞外功能域28-80及截短胞外功能域34-68，並分別純化成Fc融合蛋白質TPP-2202及TPP-2203。
為了分析結合性，塗佈1μg/ml各二聚合之TWEAKR-Fc構築體，使用0.3μg/ml與0.08μg/ml生物素基化IgG作為可溶性結合對象。使用鏈親和素-HRP及Amplex-Red受質檢測。使用過量約2倍莫耳濃度之生物素-LC-NHS(Pierce；目錄編號21347)，依據製造商之指示，使IgG進行生物素基化，並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；目錄編號89889)脫鹽。在所有施用之可溶性配體濃度下，本文所揭示抗體對這兩種構築體均顯示飽和結合性，而抗體P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)及ITEM-4則僅對全長胞外功能域顯示飽和結合性，而對截短N-與C-末端之構築體之結合性則降低(圖3 與圖4)。此表示本發明抗體之結合性抗原決定基位於胺基酸34-68之間之半胱胺酸富集功能域之內。為了分析P4A8(TPP-1324)及P3G5(TPP-2195)結合性是否需要TWEAKR胞外功能域之N-末端或C-末端，因此製造C-末端刪除胺基酸69至80之單體胞外功能域。P4A8(TPP-1324)及P3G5(TPP-2195)與C-末端截短TWEAKR胞外功能域之結合性亦下降，而本文所揭示抗體則顯示飽和結合性(圖5)。
因此，TPP-2090、TPP-2084、PDL-192(TPP-1104)與136.1(TPP-2194)之結合性抗原決定基位於半胱胺酸富集功能域之內，及P4A8(TPP-1324)與P3G5(TPP-2195)之結合性抗原決定基至少一部份在半胱胺酸富集功能域外面。
TWEAKR-Fc突變蛋白質對抗體親和力之影響：
為了更詳細界定本文所揭示抗體之結合特徵，已提出TWEAKR之某些突變蛋白質，測試其等與已知促效性抗體結合性之相關性(WO2009/140177)。因此，表現具有下列單一胺基酸取代之整個胞外功能域(胺基酸28-80)，並 純化成Fc融合蛋白質：T33Q；S40R；W42A；M50A；R56P；H60K；L65Q。
為了收集劑量-效應數據，取低濃度(62ng/ml)之不同TWEAKR-Fc突變蛋白質塗佈於384-孔Maxisorb ELISA板上，使用從100nM濃度開始連續稀釋2倍之生物素基化IgG作為可溶性結合對象。使用鏈親和素-HRP及Amplex Red檢測。所測試之IgG為TPP-2090與TPP-2084，來自WO2009/020933之PDL-192、136.1及18.3.3，來自WO2009/140177之P4A8與P3G5，及來自Nakayama等人之[Biochem Biophys Res Com 306：819-825]之ITEM-1及ITEM-4。
表13：用於ELISA中分析突變蛋白質結合性之抗體商品列表
使用過量約2倍莫耳濃度之生物素-LC-NHS(Pierce；目錄編號21347)，依據製造商之指示，使IgG進行生物素基化，並使用Zeba脫鹽管柱(Pierce；目錄編號89889)脫鹽。代入劑量-效應數據，及測定IC50。為了顯現結果，製作下表，“-“表示IC50高於50nM，“+”表示IC50在1至150pM之範圍內。
如過去公開數據所示，ITEM-4對H60K突變蛋白質之結合性[WO2009/140177：圖23F]及PDL-192對R56P突變蛋白質之結合性[WO2009/020933：圖22B]均降低。與該等已公開數據相反，ITEM-1顯示對R56P之結合性及所有抗體對W42A之結合性[WO2009/140177：圖23E、圖23F]均降低。此差異歸因於所選用之方法；極低之塗佈濃度有利於區分解離速率之下降，因為其使穩定性效應降至最低。由於沒有任何已分析之抗體對W42A突變蛋白質之結合性顯示未下降結果，因此此取代似乎係造成結構變化，而非直接改變結合性抗原決定基。
與ITEM-1、ITEM-4、PDL-192、136.1及18.3.3相反，除了W42A取代以外，本文所揭示抗體之結合性完全獨立。
半胱胺酸富集功能域之丙胺酸掃描：
為了描繪抗體之結合位點，進行半胱胺酸富集功能域(胺基酸34-68)之丙胺酸掃描。圖4中出示TWEAKR之全長胞外功能域之N-及C-末端截短變異體未降低抗體之結合性。因此，該結合性抗原決定基係位於半胱胺酸富集功能域之內。將下列取代引進TWEAKR(34-68)-Fc構築體內：S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A及L65A。
在HEK293細胞中表現此等TWEAKR(34-68)-Fc突變蛋白質。為了收集劑量-效應數據，取濃度1μg/ml之IgG塗佈於384-孔Maxisorb ELISA板上，使用含TWEAKR突變蛋白質之上清液之連續2倍稀釋液作為可溶性結合對象。使用抗-HIS-HRP及Amplex Red檢測。所測試之IgG為TPP-2090、來自WO2009/020933之PDL-192、及ITEM-1(購自Abcam)。
為了分析各TWEAKR突變蛋白質與對不同IgG之結合性之相關性，針對某些突變蛋白質濃度製作相關性墨點圖。舉例而言，圖6為TWEAKR表現營養液上清液之8倍稀釋液之相關性墨點圖，其中X軸為PDL-192(TPP-1104)及Y軸為TPP-2090。墨點顯示，取代D47A會降低TPP-2090之結合性及取代R56A會降低PDL-192(TPP-1104)之結合性。已判別某些TWEAKR胺基酸對抗體交互作用之依賴性係與此等抗體已測定之促效活性具有相關性。天然配體TWEAK顯示有效活化TWEAKR，且其結合性會依賴TWEAKR之半胱胺酸富集功能域中之白胺酸46(Pellegrini等人之FEBS 280：1818-1829)。P4A8顯示極低促效活性，且與TWEAKR之半胱 胺酸富集功能域外面至少部份交互作用(圖4)。PDL-192顯示輕度促效活性，且依賴R56，而結合在半胱胺酸富集功能域但與TWEAK配體位點之相反處。TPP-2090及TWEAK之結合分別依賴D47及L46，因此結合在類似結合位點(圖7)。
為了支持共有抗原決定基之證據，而測試TPP-2090、TPP-2149、TPP-2093、TPP-2148、TPP-2084、TPP-2077、TPP-1538、TPP-883、TPP-1854、TPP-1853、TPP-1857、TPP-1858。所有測試之抗體均特異性結合TWEAKR位置47之D(D47)(參見圖6C)。再次發現，PDL-192(TPP-1104)仍可結合TWEAKR之D47A突變蛋白質。
結論係本文所揭示抗體(例如：TPP-2090)依賴D47來結合TWEAKR。
已判別某些TWEAKR胺基酸對抗體交互作用之依賴性係與此等抗體已測定之促效活性具有相關性。天然配體TWEAK顯示有效活化TWEAKR，且其結合性會依賴TWEAKR之半胱胺酸富集功能域中之白胺酸46(Pellegrini等人之FEBS 280：1818-1829)。P4A8顯示極低促效活性，且與TWEAKR之半胱胺酸富集功能域外面至少部份交互作用。PDL-192顯示輕度促效活性，且依賴R56而結合在半胱胺酸富集功能域但與TWEAK配體位點相反處。本文所揭示抗體(參見圖6C)之結合依賴D47，及TWEAK之結合依賴L46，並結合在類似但可區分之結合位點(圖7)。因此，本文所揭示顯示強力促效活性之抗體係結合抗體之與極強力促效活性相關之新穎抗原決定基(依賴D47)。值得注意Michaelson等人(參見Michaelson JS等人之MAbs.2011 Jul-Aug；3(4)：362-75中第369頁左欄)解釋他們所檢測所有促效性抗體之促效活性均比天然配體TWEAK弱的原因。他們在結論中說明其下降之效力可能隨抗體與TWEAKR之二聚合結合交互作用變化，其中TWEAK可能參與三聚合交互作用。因此，意外發現本發明抗體儘管與TWEAKR具有二聚合交互作用，其甚至仍具有較高促效活性。這種驚人結果偶聯至本文所揭示抗體之特異結合性，因此可特異性結合TWEAKR之D47。
採用抗原決定基競爭實驗判別本文所揭示抗體特徵：
為了了解本文所揭示抗體與其他已知抗-TWAEKR抗體之間之差異，因此進行競爭性實驗。採用表面電漿共振儀分析法，於Biacore T100儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)上探討數種抗-TWEAKR抗體之重疊結合基元。
所有抗體均使用“胺偶聯套組”(BR-1006-33，GE Healthcare Biacore,Inc.)直接固定在CM5感測晶片。依製造商之說明使用試劑。使用抗原飽和第一抗體(固定化抗體)時，注射200nM TWEAKR(TPP-2305)之HEPES-EP緩衝液溶液(GE Healthcare Biacore,Inc.)，30μl/min，持續120秒。隨後注射200nM第二抗體(“競爭抗體”)之HEPES-EP緩衝液溶液至流動細胞中，30μl/min，持續120秒。通常，在經過線上參考細胞校正後，扣除樣本緩衝液，產生感應譜。使用Biavaluation軟體，完全手動操作感應譜，產生定性競爭數據(圖8)。注射第二抗體後缺乏第二結合性時，表示各成對抗體之內顯著競爭性。非競爭性之成對抗體則在注射第二抗體後顯示超過背景之顯著結合訊號。此外，亦追蹤自我競爭(第一與第二抗體相同)作為內部系統對照組。整體而言，此分析法包括9x9種抗體之矩陣。
通常，抗-TWEAKR抗體可以分成三個不同之“競爭組”(圖9)。其中一組僅包括TPP-2084及TPP-2090，此二者均會與所有其他試驗成員競爭。此等其他成員可再分成兩個抗體子群，其彼等之間沒有任何競爭。因此，僅TPP-2084與TPP-2090出現與所有測試抗-TWEAKR抗體“完全”競爭。
此點支持上述所測試之兩種本文所揭示抗體會結合新穎且獨立之抗原決定基之結果。
本文所揭示抗體之選擇性分析：
亦測試抗體TPP-209對TNF受體超級家族中其他成員之結合性，以分析其選擇性。TNF受體超級家族顯示極高之序列多樣性，如圖10所示。最類似TWEAKR之TNFRSF13C及TNFRSF17之序列同一性僅約30%。抗原決定基區本身(半胱胺酸富集功能域)不會與任何其他TNFRSF成員匹配(最佳匹配(best hit)之BLAST E-V值=0.7)。所有29種已知TNF受體超級家族成員之胞外功能域均為購買之Fc融合蛋白質(表20)，並依1μg/ml塗佈於Maxisorp ELISA板上。
為了收集劑量效應數據，使用起始濃度為2μM之生物素基化IgG之連續稀釋3倍稀釋液作為可溶性結合對象。使用抗-hIgG1-HRP及Amplex Red檢測。所測試之IgG為TPP-2090。如圖11所示，TPP-2090在使TWEAKR 飽和之300pM之極低濃度下即可結合，而在75nM之極高濃度下仍不會結合所有其他28種TNF受體超級家族成員。
因此，TPP-2090可選擇性結合TWEAKR。
實例3：抗-TWEAKR抗體對癌細胞株細胞表面之結合性
為了測定抗-TWEAKR抗體對小鼠及人類癌細胞株之結合特性，採用流式細胞儀測定一組細胞株之結合性。使用不含Ca與Mg之PBS(Biochrom #L1825：含8000mg/l NaCl、200mg/l KCl、1150mg/l Na2HPO4、及200mg/l KH2PO4之水溶液)洗滌附著細胞2次，及利用基於不含酵素之PBS之細胞解離緩衝液(Invitrogen)分離。細胞依約105個細胞/孔懸浮於FACS緩衝液(不含Ca/Mg，含3% FCS之PBS，Biochrom)。細胞離心(250g，5min，4℃)，上清液棄置不要。細胞再懸浮於含所需抗體(除非另有指示，否則為10μg/ml含於80μl)之FACS緩衝液之稀釋液中，及於冰上培養1小時。隨後使用100μl冷的FACS緩衝液洗滌細胞一次，添加80μl之稀釋1：150之第二抗體(PE山羊抗-人類IgG，Dianova #109-115-098；或PE山羊抗-小鼠IgG，Jackson Immuno Research #115-115-164)。於冰上培養1小時後，再次使用冷的FACS緩衝液洗滌細胞，再懸浮於液100μl FACS緩衝液中，利用流式細胞儀，使用FACS-陣列(BD Biosciences)分析。計算利用所需抗體檢測到之螢光值扣除僅利用第二抗體檢測時所測定之背景螢光值後之幾何平均值結果。該等數值依據下列系統分級計分： 幾何平均值-單獨使用第二抗體時之幾何平均值>10：+，>100：++，>1000：+++，>10000：++++，接近分組之邊界值則以()表示)。細胞株來源示於表21。
如表21所示，所有本文所揭示抗-TWEAKR抗體在10μg/ml之使用濃度下均可與許多種代表各種不同腫瘤實體之腫瘤細胞結合，該等腫瘤細胞係表現鼠類(4T1、路易斯氏肺(Lewis Lung))及人類(包括在表中所有其他細胞株)來源之TWEAKR。
(幾何平均值-單獨使用第二抗體時之幾何平均值>10：+，>100：++，>1000：+++，>10000：++++，接近分組之邊界值則以()表示)*表21之癌細胞株之生長培養基列表：1.DMEM/漢氏(Ham’s)F12；(Biochrom；# FG 4815，含安定之麩醯胺)、10% FCS 2.RPMI 1640；(Biochrom；# FG 1215，含安定之麩醯胺)、10% FCS 3.DMEM；(Biochrom；# FG 0435，含安定之麩醯胺)，10% FCS 4.依爾氏(Earle's)MEM；(Biochrom；# FG 0325，含安定之麩醯胺)，10% FCS 5.DMEM；(Biochrom；# FG 0435，含安定之麩醯胺)L-丙胺醯基-L-麩醯胺；(額外添加2mM，最終4mM，Biochrom、# K 0302)非必需胺基酸；(最終：1x，Biochrom；# K 0293)，10% FCS 6.DMEM；(Biochrom；# FG 0445，高葡萄糖，含安定之麩醯胺)，10% FCS 7.RPMI 1640；(Biochrom；# FG 1215，含安定之麩醯胺)，20% FCS 8.依爾氏(Earle’s)MEM；(Biochrom；# F 0315)，L-丙胺醯基-L-麩醯胺；(最終：2mM，Biochrom；#K 0302)非必需胺基酸；(最終：1x，Biochrom；# K 0293)，10% FCS 9.DMEM/漢氏(Ham’s)F12；(Biochrom；# FG 4815，含安定之麩醯胺)，馬血清(最終：2.5%)；(Biochrom；# S 9135)10% FCS 10.DMEM/漢氏(Ham’s)F12；(Biochrom；# FG 4815，含安定之麩醯胺)、氫化可體松(Hydrocortison)；(最終：40ng/mL，Biochrom；# K 3520)、10% FCS 11.麥考衣氏(McCoy’s)5A；(Biochrom；# F 1015)L-丙胺醯基-L-麩醯胺；(額外添加1.5mM，Biochrom；# K 0302)、10% FCS
總言之，應注意，相較於其他已知抗體，FACS分析法所測定抗體之最大細胞結合性係輕度結合性。如表23及圖12所示，由FACS分析法檢測10μg/ml抗體對不同細胞之結合量低於其他已知抗體(PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324))，FACS分析法在該濃度下檢測到該抗體之細胞結合性達到其平頂期(未出示數據)。
實例4：於不同TWEAKR表現細胞株中誘發凋亡蛋白酶(caspase)-3/7活化作用
為了測定細胞凋亡誘發程度，在TWEAK或促效性抗-TWEAKR抗體處理癌細胞後測定凋亡蛋白酶-3/7活化作用。因此取HT-29細胞，依4000個細胞/75μl/孔之密度塗佈在96孔板之分析培養基(DMEM/Ham'sF12、Biochrom #FG4815+10% FCS+100ng/ml IFNγ(R&D Systems #285-IF))中。24小時後，細胞與指定不同濃度之針對TWEAKR(參見表24)、重組體人類TWEAK(R&D，#1090-TW-025/CF，大腸桿菌衍生之重組可溶性人類TWEAK，Arg93-His249登錄號# Q4ACW9，Entrez Gene ID 8742，具有N-末端Met及6-His標籤)之抗體或相應之同型對照IgG培養。與抗體培養24小時後，添加100μl/孔凋亡蛋白酶3/7溶液(Promega，#G8093)至細胞中，培養1小時，並於VICTOR V(Perkin Elmer)上讀取發光度，測定凋亡蛋白酶3/7活性。
如圖13及表25所示，與本文所揭示抗體培養時，對凋亡蛋白酶3/7之最大誘發程度比相關技藝所說明之抗體(PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194))及比300ng/ml重組體人類TWEAK(表25)更強。因此，本文說明之抗體於HT-29細胞中對凋亡蛋白酶3/7之誘發優於過去說明之抗體。
為了測定抗體之強力效力是否真的在其他細胞株中亦高於HT-29，因此在一組細胞株中比較抗-TWEAKR抗體與重組體人類TWEAK誘發凋亡蛋白酶3/7之能力。此分析法採用下列條件：WiDr細胞依3000個細胞/孔塗佈及於TWEAK或所說明抗體之存在下培養48小時，A253細胞依2500個細胞/孔塗佈及培養24小時，NCI-H322細胞依5000個細胞/孔塗佈及培養 48小時，及786-O細胞依2500個細胞/孔塗佈及培養48小時。塗佈細胞之培養基說明於表21中，在A253、NCI-H322及786-O細胞中添加100ng/ml IFNγ(R&D Systems #285-IF)。塗佈後24小時，添加100μg/ml之抗體或300ng/ml之TWEAK(NCI-H322細胞為100ng/ml TWEAK)，再依上述指定時間培養細胞。培養時間結束時，如HT-29細胞之說明測定凋亡蛋白酶3/7活性。與未處理之細胞比較，計算對凋亡蛋白酶3/7之誘發倍數。
如表25所示，所有測試抗體(包括TPP-2658，該TPP-2090之非糖苷基化變異體)在HT-29細胞中顯示比其他已知抗體加強誘發凋亡蛋白酶3/7，並相較於300ng/ml TWEAK配體達到更強活性。這種在癌細胞中強力誘發細胞凋亡之效力(由凋亡蛋白酶3/7活化作用測得)亦出現在WiDr、A253、NCI-H322及786-O細胞中，所測試之本文所揭示抗體在大多數實驗中，在其中誘發之變化倍數高於其他抗體及300ng/ml TWEAK。
實例5：促效性抗-TWEAKR抗體於癌細胞株中對增生之抑制作用
為了探討本文所揭示抗體誘發凋亡蛋白酶3/7之效力是否亦反映在不同癌細胞株中對增生之有效抑制作用，因此在與本文所揭示抗體培養後，測定抗增生活性，並與參考抗體或TWEAK配體比較。
因此將細胞塗佈於96孔板之75μl分析培養基中(表21之生長培養基，針對786-O細胞組添加100ng/ml IFNγ)，其細胞數如下：WiDr細胞為3000個細胞/孔、786-O細胞為2500個細胞/孔。24小時後，細胞與指定濃度(抗體為0.03-300μg/ml、TWEAK為100或300ng/ml)之抗-TWEAKR抗體(參見表26)、重組體人類TWEAK或同型對照IgG(未出示)培養。在添加抗體時，在另一個對應分析板(零時間點)中測定細胞活力。因此添加75μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液(目錄編號G755B及G756B))至細胞中，培養10分鐘，於Victor V(Perkin Elmer)上讀取發光度。與試劑培養96小時後，添加100μl/孔CTG溶液，培養10分鐘及讀取發光度，於分析板中測定細胞活力。由未處理對照組孔之發光度數值扣除零時間點之數值，計算對照組孔中之增生作用。以化合物處理組孔相對於未處理對照組孔計算細胞增生%。
所得劑量效應曲線代表處理組細胞相對於對照組細胞之細胞增生作用，示於圖14A(WiDr細胞)及圖14B(786-O細胞)。所有測試之本文所揭示抗體對WiDr細胞之增生抑制50-60%及對786-O細胞抑制70-80%，其顯著超過其他已知抗體(例如：PDL-192(TPP-1104)及P4A8(TPP-1324))可達到之抑 制增生作用。因此，本文所揭示抗體為目前所說明最有效之抗增生抗-TWEAKR抗體。
為了分析此強力抗增生活性是否亦可出現在更多種細胞組中，因此再取LOVO、NCI-H1975、SW-480(均為3000個細胞/孔)、HT-29(4000個細胞/孔)、A253及SK-OV3(均為2500個細胞/孔)細胞與100μg/ml抗-TWEAKR抗體或TWEAK配體培養，培養時間如表27所示。所有細胞均接種在表21所示之生長培養基中，且除了WiDr細胞外，所有細胞均在接種時添加100ng/ml IFNγ至分析培養基。測定處理組細胞相對於未處理對照組細胞之增生作用，如上述計算生長抑制百分比。
如表27所示，本文所揭示抗體在100μg/ml下，對各種不同癌細胞株之抑制增生作用效力高於其他已知抗體。本文所揭示抗體在大多數實驗中亦顯示與100-300ng/ml TWEAK配體同等或更強之效力。因此，本發明所說明抗體在許多癌細胞株中具有誘發細胞凋亡及抑制增生之獨特活性。表27a顯示另一個在WiDr細胞中，於如上述相同條件下，在培養基中添加或不添加100ng/ml IFNγ下進行之實驗。TPP-2658(係TPP-2090之非糖苷基化變異體)在培養96小時後顯示相當於TPP-2090及人類重組體TWEAKR配體之抗增生活性。使用同型對照抗體時沒有觀察到活性。
實例6：來自癌細胞及異種移植腫瘤之抗-TWEAKR抗體所誘發之細胞素分泌
其次，探討本文所揭示抗體之強力促效活性是否亦會誘發癌細胞分泌細胞素。
因此，取A375細胞依2500個細胞/孔塗佈在96孔板之含10% FCS之生長培養基DMEM中(Biochrom；# FG 0435，含安定之麩醯胺)。24小時後，細胞與指定各種不同濃度之抗-TWEAKR抗體、重組體人類TWEA或相應之同型對照IgG培養。與抗體開始培養24小時後，取細胞上清液或其稀釋液加至人類CXCL8/IL-8 ELISA套組之捕捉Elisa分析板(R&D Systems DY208)中，於4℃與300rpm下振盪培養一夜。次日，取樣本使用人類CXCL8/IL-8-ELISA套組(R&D Systems DY208)依據製造商之指示分析。測定450nm之光密度(Tecan Spectra,Rainbow)並進行背景校正。計算IL-8之絕對值時，依據製造商之建議(R&D Systems)，採用使用重組體人類IL-8蛋白質之標準曲線。
如圖15及15a所示，包括TPP-2658(係TPP-2090之非糖苷基化變異體)之抗體顯示比過去已知之其他抗體提高誘發釋出IL-8。在100μg/ml下，本文所揭示抗體TPP-1538/-1854/-2084/-2090所達到之活化作用分別為相對於300ng/ml TWEAK配體之134/129/113/103%。反之，用於比較之抗體 PDL-192(TPP-1104)/P4A8(TPP-1324)/136.1(TPP-2194)僅分別達到66/29/93%。因此，在誘發IL-8分泌上，相較於過去已知抗體及300ng/ml TWEAK配體，該等抗體顯示最強之活性。
為了探討所觀察到之細胞素分泌是否亦與小鼠中異種移植腫瘤相關，因此探討來自帶腫瘤(A375、WiDr)及無腫瘤之小鼠之血清/血漿中之人類及鼠類細胞素。取含5x106個A375細胞之基底膜基質(Matrigel)/PBS(1：1)或含5x106個WiDr細胞之基底膜基質(Matrigel)/培養基(1：1)經皮下接種至免疫缺陷雌性NMRI裸小鼠中。在與帶A375-小鼠平行之試驗中探討非腫瘤小鼠。在接種7天後確立腫瘤約40mm2時開始處理。小鼠接受單次靜脈內注射TPP-1538(10mg/kg)或TPP-2090(3mg/kg)(此二者均於PBS中稀釋)至尾靜脈中。隨後在指定時間點殺死小鼠(帶A375小鼠為0、6h、24h，及帶WiDr小鼠為0、7h、24h、72h、168h、240h)，以收集血清/血漿樣本。在殺頭後收集血液，隨後凝血30分鐘及於1000xg下離心，製備血清。
使用Luminex®珠免疫分析法定量細胞素。使用人類細胞素磁性25項分析板(Magnetic 25-plex panel)(Invitrogen®，目錄編號LHC0009M)(其包含IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、嗜酸細胞活化趨化因子(Eotaxin)、RANTES，及MCP-1)測定人類細胞素。使用小鼠細胞素磁性20項分析板(Magnetic 20-plex panel)(Invitrogen®，目錄編號LHC0006M)(其包含FGF basic、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-12(p40/p70)、IL-17、IP-10、KC、MCP-1、MIG、MIP-1α、TNF-α與VEGF)測定鼠類細胞素。該等分析法係依據製造商之指示進行，並採用Luminex讀數機Bio-Plex 200(Bio-Rad GmbH)測定。藉由操作軟體Bio-Plex Manger(Bio-Rad GmbH)，由作為分析製程一部份之標準曲線內插得到細胞素濃度。
如圖16A所示，WiDr異種移植物經過TPP-2090 3mg/kg處理一次後會隨時間變化釋出人類IL-8。此外，在使用TPP-2090處理後，會觀察到誘發 分泌人類MCP-1、IP-10及IL-15(未出示)。
為了進一步探討經過本文所揭示促效性抗-TWEAKR抗體處理後之帶腫瘤小鼠之血漿中所觀察到之誘發細胞素是否確實具腫瘤特異性，在帶A375腫瘤及無腫瘤小鼠及人類中進行類似探討試驗，並測定鼠類細胞素。
如圖16B所示，帶腫瘤小鼠中之A375異種移植物於經過10mg/kg之TPP-1538處理6小時後，釋出人類IL-8。此外，觀察到人類MCP-1、IP-10及IL-1RA含量提高(未出示)。反之，在經過處理之無腫瘤小鼠之血漿中沒有檢測到提高分泌人類細胞素(圖16B及未出示)。此外，帶腫瘤或無腫瘤小鼠經過TPP-1538處理後，均未在其血漿中檢測到提高之鼠類細胞素，包括鼠類IL-8類似物KC(未出示數據)。總言之，本文所揭示抗體可依腫瘤特異性方式，於活體內強力誘發癌細胞及異種移植物分泌細胞素。
實例7：抗-TWEAKR抗體之內化及藥物接合物策略之應用性
為了探討本文所揭示抗-TWEAKR抗體是否適用於產生抗體藥物接合物(ADC)，因此探討抗體之內化能力。
檢視此製程時，選出TWEAKR特異性抗體TPP-1538與TPP-2090及同型對照組抗體。抗體係在超過2倍莫耳濃度之CypHer 5E單NHS酯(批號357392，GE Healthcare)(pH 8.3)之存在下進行接合。接合後，反應混合物於4℃下透析(slide-A-Lyser透析管(Dialysis Cassettes)MWCD 10kD，Fa.Pierce)一夜，以排除過量染劑並調整pH-值。之後濃縮蛋白質溶液(VIVASPIN 500，Fa Sartorius Stedim Biotec)。除了依pH變化之螢光染劑CypHer5E外，亦使用不會依賴pH變化之染劑Alexa 488。使用光度計(Fa.NanoDrop)測定抗體之染劑承載量。TPP-1538、TPP-2090及同型對照組抗體之染劑承載量均在類似範圍。於細胞結合性分析法中測試有標記抗體之親和力，以確定該標記不會改變其對TWEAKR之結合性。採用此等有標記抗體進行下列內化分析法。在處理之前，接種細胞(2x104個/孔)至96-MTP(黑色透明平底板No 4308776，Fa.Applied Biosystems)之100μl培養基中。於37℃/5%CO2下培養18小時後，更換培養基，及添加各種不同濃度(10、5、2.5、1、0.3、0.1μg/ml)之有標記之抗-TWEAKR抗體TPP-1538及TPP-2090。使用同型對照 組抗體(陰性對照組)進行相同處理。所選擇之培養時間為0、0.5h、1h、2h、3h、6h及24h。使用InCellAnalyzer 1000分析儀(Fa.GE Healthcare)測定螢光。依動力學方式測定每個細胞之顆粒數及總螢光強度。
在內因性TWEAKR表現癌細胞株786-O(腎癌)及HT-29(結腸癌)中觀察到TPP-1538及TPP-2090之高度特異性及顯著內化。
此內化係依賴標靶變化，因為僅可使用抗-TWEAKR抗體證實其吸收，而使用同型對照抗體則未觀察到內化。在第一段6小時期間，抗-TWEAKR抗體顯示抗體之內化比同型對照組提高20至40倍。同型對照抗體在長期曝露(>24h)下仍顯示些微內化。
標記Alexa 488之抗-TWEAKR抗體之內化在結合時顯示超過50%之內化抗體似乎遵循內吞作用途徑。
圖17出示分析TPP-1538及TPP-2090之特異性內化與內因性TWEAKR表現細胞結合時隨時間過程之變化。於腎癌細胞株786-O上探討抗體(1μg/ml)之內化。依動力學方式測定每個細胞之顆粒數。可在TPP-1538及TPP-2090上觀察到快速內化，而同型對照hIgG1則未內化。此外，在TPP-2090上觀察到顯著改善之內化效力。可在使用各種不同癌細胞及不同受體含量之內化分析法中證實TPP-2090之更高效力(未出示)。
此外，於Hum-Zap分析法中，當於接合肥皂草素之二次抗體之存在下培養時，分析抗-TWEAKR抗體抑制細胞增生之活性。因此，取786-O細胞依2500個細胞/75μl/孔塗佈於96孔板之生長培養基中(DMEM/漢氏(Ham's)F12，Biochrom #FG4815+10% FCS)。24小時後，由40nM抗體(TPP-1538、TPP-2090或同型對照抗體)於40nM接合肥皂草素之二次抗體(Hum Zap,Advanced Targeting Systems目錄編號IT-22，批號59-83)之存在或不存在下，於室溫下培養15min。經過培養時間後，添加25μl反應混合物至細胞中，造成樣本孔之最終濃度為10nM抗體。在添加抗體時，在另一個對應分析板(零時間點)中測定細胞活力。因此添加75μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液(目錄編號G755B及G756B)至細胞中，培養10分鐘，於Victor V(Perkin Elmer)上讀取發光度。
與抗體/Zap複合物開始培養48小時後，添加100μL/孔CTG溶液至所有試驗孔中，培養10分鐘，及於VICTOR V上讀取發光度。
如圖18所示，786-O細胞與10nM抗-TWEAKR抗體於接合肥皂草素之二次抗體之存在下培養時，幾乎完全抑制細胞增生，而在相同實驗條件下(沒有IFNγ，僅培養48小時)，當接合肥皂草素之二次抗體不存在或使用同型對照抗體時，則沒有觀察到抗增生活性。
總言之，本文所揭示抗-TWEAKR抗體顯示快速內化及靶向傳送接合之承載物，因此極適合產生ADC並使用。
實例8：抗-TWEAKR抗體於異種移植模式中之活體內抗腫瘤效力
為了探討抗-TWEAKR抗體是否顯示活體內抗腫瘤活性，採用促效性抗-TWEAKR抗體之單方或組合療法，在衍生自不同癌細胞株之異種移植腫瘤或衍生自患者之腫瘤模式中測試其對腫瘤生長抑制作用之選擇性。
在開始活體內實驗之前，採用免疫組織化學分析TWEAKR在所選擇異種移植模式中之表現。因此，取相應異種移植物之冷凍切片(5μM)使用丙酮，於4℃下固定5分鐘，並封阻非特異性蛋白質結合及過氧化酶活性。組織切片與兔子抗-TWEAKR抗體(Fn14，Epitomics，3488-1)於室溫下培養60分鐘後，使用標記過氧化酶之抗兔子聚合物(DAKO，K4011)培養30分鐘。使用二胺基聯苯胺展開切片，及最後使用蘇木精(hematoxylin)進行對比染色。僅採用對TWEAKR之表現呈陽性反應之模式進行活體內實驗。
探討抗-TWEAKR抗體於活體內之抗腫瘤活性時，藉由重覆靜脈內注射處理帶有來自不同人類腫瘤細胞株或衍生自患者之腫瘤之異種移植物之裸小鼠。
如上述說明培養腫瘤細胞株，並於皮下(s.c.)接種100μl含細胞株之特定數量腫瘤細胞至雌性無胸腺裸小鼠(NMRI nu/nu，6至8週，20-25g，Taconic)。小鼠安置在標準無病原菌之條件下，依據動物福利準則處理。
待腫瘤生長至約40mm2大小後，小鼠隨機分成對照組及處理組，各組為n=8至10。小鼠接受各種不同劑量之抗-TWEAKR抗體(於PBS中稀釋) 經靜內注射(i.v.)至尾靜脈內，依每週2次之療程處理(q4dx3：每週投藥2次，共投藥3週；q4dx8：每週投藥2次，共投藥8週)。組合療法之對象，如：癌瑞格(Regorafenib)(每天10mg/kg，經口)及PI3K-抑制劑1(10mg/kg，BID，投藥2天，停藥5天(連續2天每天投藥2次，然後停藥不處理5天)，i.v.)係於其個別調配物中稀釋，而標準照護療法之抗癌妥(Irinotecan)(5mg/kg，投藥4天，停藥3天(連續4天每天投藥一次後，停藥不處理3天)，iv.)及太平洋紫杉醇(Paclitaxel)(16mg/kg，q7dx4(每週投藥一次，共投藥4週)，i.v.)係於0.9% NaCl中稀釋。以接受注射PBS之動物作為對照組(媒劑)。化合物之投藥體積為每隻小鼠5ml/kg體重。
每週利用量徑器追蹤腫瘤生長(長度x寬度，以mm表示)及體重(以g表示)2至3次。試驗結束時切割腫瘤，稱重，用於計算腫瘤相對於對照組(T/C)比值(處理組動物之平均腫瘤重量除以對照組/媒劑組動物之平均腫瘤重量)。
在人類腎細胞癌症模式786-O(陽性TWEAKR表現)中，測試抗-TWEAKR抗體TPP-2084及TPP-2090在三種不同低劑量下對抗同型對照抗體之效力。取含2x106個腫瘤之100%基底膜基質(Matrigel)經皮下接種至雌性裸小鼠中。7天後，腫瘤達到約40mm2之大小，使用0.3mg/kg、1mg/kg及3mg/kg抗體處理(i.v.，q4dx3：每週投藥2次，共投藥3週)。第40天時，比較切割後之腫瘤重量，顯示TPP-2084及TPP-2090在3mg/kg下顯示依賴劑量變化之最高效力(圖19)。其可證實針對同型與載劑組(使用PBS處理)有顯著差異。任何一組均沒有觀察體重下降。表28所列腫瘤相對於對照組比值證實其在786-O模式與其他腫瘤模式(A375、A253、SK-OV-3、Bx-PC3，使用3-10mg/kg抗-TWEAKR抗體TPP-1538、TPP-2094或TPP-2090處理，q7dx3(每週投藥一次，共投藥3週)或q4dx3(每週投藥2次，共投藥3週)療程)中顯示良好效力，但其中MDA-MB-231可能需要更密集之抗-TWEAKR抗體投藥療程才可能達到單方療法之效力。
表28：於786-O及其他腫瘤模式中經過TPP-1538、TPP-2084或TPP-2090處理後之最終腫瘤相對於對照組(T/C)比值。抗-TWEAKR抗體在來自不同 T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據腫瘤面積測定值(*)之腫瘤相對於對照組比值。
圖20顯示抗-TWEAKR抗體TPP-2090於人類結腸癌異種移植物WiDr(其代表HT-29腫瘤細胞株之一種次純系)於單方療法及與抗癌妥(Irinotecan)及癌瑞格(Regorafenib)之組合療法中之效力。取含5x106個WiDr細胞之基底膜基質(Matrigel)/培養基(1：1)經皮下接種至免疫缺陷NMRI裸小鼠中。在接種7天後確立腫瘤約40mm2時開始處理。即使3mg/kg TPP-2090(i.v.，q4dx7：每週投藥2次，共投藥7週)在單方療法中仍可強力有效控制腫瘤生長。3mg/kg TPP-2090與抗癌妥(5mg/kg，i.v.，投藥4天，停藥3天)或癌瑞格(10mg/kg，p.o.，每日投藥)之組合則以加成效力造成腫瘤消退。小鼠可以耐受所有醫療療程(最初體重下降至高4%且可以逆轉)。最終T/C值列於表29。
亦於其他結腸直腸腫瘤模式(如：SW480及衍生自患者之腫瘤模式Co5682)中探討TPP-2090，其同樣具有良好結果(表29)。10mg/kg劑量之TPP-2090之單方療法可在SW480中有效控制腫瘤生長(T/C 0.49)，及在與5mg/kg抗癌妥組合(T/C 0.22)或與10mg/kg癌瑞格組合(T/C 0.37)中造成腫 瘤消退。在Co5682異種移植物中，3mg/kg TPP-2090與抗癌妥組合(T/C 0.23)造成腫瘤消退及與癌瑞格組合(T/C 0.27)造成腫瘤停滯，而顯示協同性效力。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量之腫瘤相對於對照組比值，Tx：療法，combo：組合療法
圖21顯示抗-TWEAKR抗體TPP-2090於人類非小細胞肺癌異種移植物NCI-H322中，於單方療法及與太平洋紫杉醇(Paclitaxel)之組合療法中之效力。取含5x106個NCI-H322細胞之基底膜基質經皮下接種至免疫缺陷NMRI裸小鼠中。在接種後14天確立腫瘤約45mm2後開始處理。TPP-2090在5mg/kg劑量(i.v.，q4dx8)之單方療法中證實使腫瘤消退之強力效力。10mg/kg TPP-2090與太平洋紫杉醇(16mg/kg，i.v.，q7dx4)之組合產生小的加成效力。小鼠可以耐受所有療程(可逆轉之體重下降至高3%)。最終T/C值列於表30。
再度於肺癌模式(如：NCI-H1975及衍生自患者之腫瘤模式Lu7343及Lu7433)中探討TPP-2090，並得到類似結果(表30)。TPP-2090之3mg/kg劑量與16mg/kg太平洋紫杉醇組合時，在NCI-H1975中顯示造成腫瘤消退之加成效力(T/C 0.08)。相同劑量(3mg/kg)之非糖苷基化變異體TPP-2658與 太平洋紫杉醇(16mg/kg)之組合在NCI-H1975異種移植物中亦達到加成效力。同樣地，在衍生自患者之NSCLC模式Lu7343及Lu7433中，3mg/kg TPP-2090與10mg/kg PI3K-抑制劑1之組合係依加成模式造成有效控制腫瘤或消退(T/C 0.18-0.36)。
PI3K-抑制劑1為(2-胺基-N-[7-甲氧基-8-(3-嗎啉-4-基丙氧基)-2,3-二氫咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]嘧啶-5-甲醯胺二鹽酸鹽。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量之腫瘤相對於對照組比值，Tx：療法，combo：組合療法
所有說明之活體內實例均在衍生自許多細胞株及衍生自患者之人類腫瘤模式(所有均具有TWEAKR陽性表現)中，於單方療法及組合療法中均證實抗-TWEAKR抗體TPP-2090具有強力效力。在所有使用之劑量下，小鼠均可良好耐受TPP-2090。
實例9：抗-TWEAKR抗體於異種移植模式中之作用模式
為了探討抗-TWEAKR抗體之活體內作用模式，在試驗結束時，依實例8之說明，自WiDr異種移植物中取出腫瘤，並採用免疫組織化學與西方墨 點分析法探討。
取WiDr異種移植物之冷凍切片(5μm)(腫瘤來自每組3隻動物)，為增生標記物蛋白質Ki67進行免疫組織化學染色(參見實例8有關活體內實驗之詳細說明)。使用新鮮製備之4%多聚甲醛，於4℃下固定切片，並封阻非特異性蛋白質結合及過氧化酶活性。依據製造商之指示(DAKO，K3954)，使用生物素標記鼠類抗Ki67抗體(DAKO，M7240)並於室溫下與組織切片培養60min，然後與ExtraVidin-過氧化酶(DAKO，K3468)培養30min。使用二胺基聯苯胺展開切片，及最後使用蘇木精進行對比染色。定量時，掃描整個腫瘤切片，並使用ARIOL自動顯微鏡3.2版(Applied Imaging,San Jose CA,USA)分析。經過PBS(i.v.，q4dx7)及TPP-2090(10mg/kg，i.v.，q4dx7)處理之異種移植物之Ki67染色之代表性影像分別示於圖22A及B。使用ARIOL影像系統定量，顯示10mg/kg TPP-2090(i.v.q4dx7)處理組之355+/-59 Ki67陽性細胞/mm2，及媒劑處理組之863+/-90 Ki67陽性細胞/mm2。因此依據所觀察到縮小之腫瘤體積，使用促效性抗-TWEAKR抗體處理可以在異種移植腫瘤中減少增生標記物Ki67。
此外，WiDr異種移植腫瘤(參見實例8之活體內實驗詳細內容)，採用西方墨點法分析試驗結束時之瞬間冷凍物，以分析抗體處理法對Stat-1及NF-κB訊號傳導途徑之影響。取每組4隻動物之腫瘤切成每片直徑約5mm，每片與預先冷卻之5mm鋼珠(Qiagen)及500μl溶胞緩衝液(50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%甘油、1.5% Triton X-100，新鮮添加完全蛋白酶抑制劑混合液(Roche No.1873580001)、4mM Na3VO4，使用NaOH調整pH至7.4))一起置入2ml離心管中。樣本於300Hz之均質機(Tissuelyzer)(Qiagen)中溶胞3分鐘後，於冰上培養30min。然後，樣本於微型離心機(Micro-centrifuge)(Eppendorf)中，於13000rpm與4℃下離心10min，並將來自同一個腫瘤之上清液集合在一起。使用BCA蛋白質分析套組(Novagen，溶胞液於H20中稀釋1：50)測定腫瘤溶胞液之蛋白質濃度。稀釋樣本至最終濃度為4mg/ml，並取10μl樣本與3.08μl(10*)樣本還原劑(Sample Reducing agend)、10μl H2O及7,68 μl(4*)NuPAGE樣本緩衝液(Invitrogen)混合。取相當於40μg蛋白質之樣本施加至NuPage 4-12%SDS PAGE凝膠(來自Invitrogen)上，於120V下操作2h 45min。採用iBlot系統(Invitrogen)，依據製造商之建議進行墨點分析。於室溫下，於含5% BLOT QuickBlocker之PBST(Invitrogen)封阻膜2小時後，與第一抗體於4℃下培養一夜。第一抗體如下：Phospho-Stat1 #9167S、Stat-1 #9172，二者均來自Cell Signaling Technology，稀釋1：1000；TWEAKR/Fn14 #3488-1 Epitomics，稀釋1：10000；NF-κB2 p100/p52 #4882S，Cell Signaling Technology，於含3% BLOT QuickBlocker之PBST中稀釋1：1000。次日，於PBST中洗滌膜3次，然後與二次抗體(過氧化酶-接合驢抗-兔子IgG # NA934，GE Healthcare，於3% BLOT QuickBlocker/PBST中稀釋1：10000)於室溫下培養2小時。隨後，使用PBST洗滌膜10分鐘4次，與ECL試劑培養後，檢測化學發光度。檢測承載之對照組時，使用洗提溶液Re-Blot Plus強力溶液#2504，Milipore(於Milipore-H2O中稀釋1：10)，於室溫下振盪洗提膜15min，然後封阻及使用抗-GAPDH抗體(純系6C5，# MAB374，Millipore，於3% QuickBlocker/PBST中稀釋1：10000)及第二抗體(過氧化酶-接合山羊抗-小鼠IgG，Jackson Immunoresearch #115-035-003，於3% BLOT Quickblocker/PBST中稀釋1：10000 in)檢測。
來自每組2隻接受TPP-2090 3mg/kg處理之動物之腫瘤之代表性墨點與接受媒劑處理之動物之腫瘤併排示於圖23。使用TPP-2090處理造成強力提高總Stat-1含量及磷酸化Stat-1含量，且由p52片段之出現表示亦強力活化NF-κB2。因此，在異種移植腫瘤中，NF-κB2及Stat-1途徑被促效性抗-TWEAKR抗體活化，且此活化作用可能涉及相應抗體之抗腫瘤活性。
實例10：抗-TWEAKR抗體TPP-2090於其他人類結腸直腸癌模式中之活體內抗腫瘤效力
依實例8之說明於其他人類結腸直腸癌腫瘤細胞株Colo205與LoVo及其他衍生自患者之人類結腸直腸癌模式Co7553、Co5896、Co5676、Co5841、CXF 1103及CXF 533中進行動物試驗。標準投藥療程為於單方療法中或於與癌瑞格(Regorafenib)或標準照護藥物(SoCs)抗癌妥(Irinotecan)(5-15mg/kg i.p.，投藥4天，停藥3天)、草酸鉑(oxaliplatin)(3-8 mg/kg i.p.，每週2次)、5-氟尿嘧啶(50-100mg/kg i.p.，每週一次)及西妥昔單抗(cetuximab)(15mg/kg i.p.，每週2次)組合中投與10mg/kg TPP-2090，每週2次，共4週。TPP-2090及西妥昔單抗(cetuximab)係於PBS中調配，其亦作為對照組之媒劑，及SoCs係於0.9% NaCl中調配。癌瑞格(Regorafenib)之調配物說明於實例8。
TPP-2090於此等衍生自患者之人類結腸直腸癌及基於細胞株之模式中之單方醫療效力為輕度效力，其最終腫瘤相對於對照組(T/C)比值在0.48-1.07之範圍內。TPP-2090與SoCs(特定言之5-FU及抗癌妥(Irinotecan))之組合具有顯著加成及協同效力(參見表33-35)。若TPP-2090在此等模式中之單方醫療效力受到限制時，可能需要更密集投與抗-TWEAKR抗體，以達到更高之單方療法效力，如實例8中結腸直腸癌之結果所示。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據腫瘤面積測定值(*)之腫瘤相對於對照組比值。n.d.：未測定
T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據腫瘤面積測定值(*)之腫瘤相對於對照組比值。n.d.：未測定
T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據腫瘤面積測定值(*)之腫瘤相對於對照組比值。n.d.：未測定
實例11：抗-TWEAKR抗體TPP-2090於人類膀胱癌模式中之活體內抗腫瘤效力
依實例8之說明，由人類膀胱癌細胞株SCaBER與KU-19-19及衍生自患者之人類膀胱癌模式BXF1352與BXF1228進行動物試驗。標準投藥療程為於單方療法中或於與標準照護藥物(SoCs)健擇(gemcitabine)(200mg/kg i.p.，每週一次)及順鉑(cisplatin)(3mg/kg i.p.，每週一次)組合中投與10mg/kg TPP-2090，每週2次，共4週。TPP-2090係於PBS中調配，其亦作為對照組之媒劑，及標準照護藥物(SoCs)係於0.9% NaCl中調配。
在SCaBER異種移植模式中發現TPP-2090之強力單方醫療效力。TPP-2090與SoCs(順鉑及健擇)之組合在衍生自患者之膀胱癌之人類膀胱癌模式BXF1352及BXF1228中產生顯著協同效力(參見表36)。若TPP-2090之單方醫療效力在此等膀胱癌模式受到限制時，可能需要更密集投與抗-TWEAKR抗體，以達到更高之單方療法效力。
T/C：依據最終腫瘤重量之腫瘤相對於對照組比值n.d.：未測定
實例12：抗-TWEAKR抗體TPP-2090於其他人類癌症模式之活體內抗腫瘤效力
依實例8之說明進行動物試驗，探討不同適應症之其他人類癌症細胞株。標準投藥療程為10mg/kg之TPP-2090，每周2次，進行此單方療法2至3週。TPP-2090係於PBS中調配，其亦用為對照組之媒劑。
TPP-2090在SCC4(頭頸癌)及A375(黑色素瘤)異種移植物出現強力單方醫療效力，及在BxPC3(胰癌)異種移植物中出現輕度效力(參見表37)。當TPP-2090之單方醫療效力在某些異種移植模式中受到限制(ACHN(腎細胞癌症)、PA-1(卵巢癌)、NCI-292(非小細胞肺癌)及U87MG(膠質母細胞瘤))時，抗-TWEAKR抗體可能需要更密集之投藥療程才能達到更高之單方療法效力。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據測量之腫瘤面積(*)之腫瘤相對於對照組之比值
實例13：抗-TWEAKR抗體於異種移植模式中之其他作用模式
為了分析TPP-2090之抗腫瘤效力是否依賴抗體-依賴性細胞毒性(ADCC) 或僅促效活性即足夠，而於SCID灰棕色小鼠(Janvier)中進行異種移植物試驗，並於NMRI裸小鼠中探討TPP-2090之非糖苷基變異體，亦即TPP-2658。
使用表面電漿共振儀(SPR)分析法測定TPP-2090及TPP-2658對人類FcgR2B/C(CD32b/c，R&D Systems,Inc.，目錄編號1875-CD)、食蟹獼猴(Macaca fascicularis)FcgR2B(CD32b，Sino Biological Inc.，目錄編號90014-C08H)及鼠類FcgR2B(CD32b，R&D Systems,Inc.，目錄編號1460-CD)之結合性。使用加裝S系列感測晶片CM5(GE Healthcare Biacore,Inc.)之Biacore T200儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)進行實驗。於25℃下使用分析緩衝液HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4、150nM NaCl、0.05% SP20；GE Healthcare Biacore,Inc.)進行結合性分析法。使用經由胺偶聯化學共價固定於晶片表面之抗-His捕捉抗體捕捉標識聚組胺酸之FcγR蛋白質。所使用之胺偶聯試劑(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、乙醇胺-HCl pH 8.5)係購自胺偶聯套組(GE Healthcare，產品代碼BR-1000-50)。抗-His捕捉抗體得自(Molecular Probes,Inc.，目錄編號P21215)，及所使用之固定化緩衝液(10mM乙酸鈉pH 4.0)係來自人類抗體捕捉套組(GE Healthcare，BR-1008-39)。使用新鮮製備之0.2M EDC及0.05M NHS溶液，依流速10μl/min通過晶片表面420秒，使感測晶片表面活化後，依流速5μl/min注射抗-His捕捉抗體(於固定化緩衝液中溶解成10μg/ml)180秒。使用1莫耳濃度之乙醇胺溶液，依流速10μl/min持續注射420秒，以封阻過量之活化基團。
使用TPP-2090及TPP-2658作為分析物。在流速10μl/min下捕捉FcγR變異體至最終效應為~26RU後，才注射各分析物。分析結合性時，將介於0.64至25μM之間各種不同濃度之含人類IgG之分析緩衝液(參見上文)依流速30μl/min注射通過捕捉之FcγR變異體持續3分鐘，並追蹤解離作用5分鐘。所得感應譜係雙重參考，亦即在線上經過參考細胞校正後扣除緩衝液樣本。利用Biacore T200套裝分析軟體(Evaluation Software Package)分析數據。SPR結果清楚顯示TPP2090之非糖苷基化型，亦即TPP-2658在目前 實驗條件下破壞其與試驗之FcγR變異體之結合性。此點符合過去之研究(參見Mimura等人2001,JBC,doi：10.1074/jbc.M107478200)。
“+”表示在數種濃度下檢測到結合性“-“表示在目前實驗條件(亦即抗體濃度高達25μM)下沒有檢測到結合性(此表示KD>200μM)。
此外，定量分析TPP-2090之脫糖苷基化對TWEAKR結合性之影響。此時，使用如上述經由胺偶聯化學共價固定於晶片表面之抗-hIgG捕捉抗體(人類抗體捕捉套組，GE Healthcare，BR-1008-39)捕捉TPP-2090及TPP-26583。使用純化之重組體人類TWEAKR-ECD蛋白質(Fitzgerald Industries International,MA,USA，目錄編號30R-AT080)作為分析物。以流速10μl/min分析緩衝液持續60秒捕捉5μg/ml之TPP-2090及TPP-2658至最終效應為~220RU後，注射含有介於1.56-200nM濃度範圍之TWEAKR-ECD蛋白質之分析緩衝液HBS-EP+(參見上文)通過捕捉抗體，流速60μl/min，持續3分鐘。追蹤解離作用20分鐘。所得實驗性感應譜為雙重參考，並由Biacore T200套裝分析軟體進行穩定態親和力分析法推算親和力(K D值)。如表43所示，發現TPP-2090與TPP-2658之間對可溶性人類TWEAKR-ECD之結合性親和力沒有差異。
依實例8之說明，於WiDr(人類結腸直腸癌)及SCaBER(人類膀胱癌)異種移植物中，於SCID灰棕色小鼠中進行動物試驗，其中對照組之腫瘤生長相當於前述研究中之彼等NMRI裸小鼠。標準投藥療程為10mg/kg之TPP-2090 i.v.(於PBS中調配)，以單方療法每週投藥2次，共2週。
在NMRI裸小鼠中發現TPP-2090(包括其非糖苷基變異體TPP-2658)在缺乏NK-細胞之SCID灰棕色小鼠異種移植模式(WiDr及SCaBER)中具有類似之強力單方醫療效力。此表示不依賴ADCC之活體內作用模式(參見表38)。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量或依據腫瘤面積測值(*)之腫瘤相對於對照組比值。
活體外分析法顯示TPP-2090之HT29細胞結合導致NK92V效應子細胞對標靶細胞產生劑量依賴性ADCC，而非糖苷基TPP-2658則無法誘發ADCC(表40)。分配1x104個HT-29標靶細胞，添加試驗抗體，最終濃度為25μg/ml；5μg/ml；1μg/ml；0.2μg/ml及0.04μg/ml。經過預培養30分鐘後，添加效應子細胞(5x104個NK92V效應子細胞)。於37℃下培養4小時後，採用„細胞毒性檢測套組-LDH(Roche)“測定HT29細胞之溶解度，由溶解於1% Triton X-100之細胞得到最大釋出量，陰性對照組不使用抗體預培養。採用下列公式計算HT29溶胞%：[Ext(樣本)-Ext(陰性組)x 100]/[Ext(最大釋出量)-Ext(陰性組)]。TPP-2090導致NK92V效應子細胞對標靶細胞產生劑量依賴性ADCC，且依賴N297糖苷基化。
當在WiDr-或A375-異種移植模式中使用TPP-2090之非糖苷基變異體(亦即TPP-2658)時，可在活體內觀察到類似效力(參見表39)。變異體TPP-2658在這兩種模式中顯示與TPP-2090同等強力之單方醫療效力，此表示其係不依賴ADCC之作用模式。
與檢控點抑制劑組合處理：
臨床前證據建議單株抗體可用於組合中，其已在許多模式提供證據顯示協同效力。其包括針對檢控點抑制劑及免疫療法受體之抗體。例如：TPP-2658可組合使用抗-CLLA4、抗PD-1、結合鼠類蛋白質(小鼠替代物)之抗-PD-L1抗體。
抗-CLLA4(BE0131-R005mg)及抗PD-1抗體(BE0146-R005mg)係購自BioXcell。採用標準方法證實內毒素濃度低於2EU/mg，並直接使用該等抗體進行活體內實驗。
抗-PD-L1係由來自親本US8217149之抗-PD-L1抗體RG7446之可變功能域與mIgG1CH1-CH3序列融合，得到如下列序列之全長度嵌合性IgG：抗-PD-L1-mIgG1K_RG7446輕鏈(SEQ ID NO：214)：
抗-PD-L1-mIgG1K_RG7446重_鏈(SEQ ID NO：215)：
如上述製造抗體之章節中之說明表現抗-PD-L1抗體。
此外，在免疫活性小鼠品系Balb/cAnN之同基因小鼠CRC模式(CT26)中觀察到TPP-2658之強力單方醫療效力(參見表39)。本試驗係依實例8之說明進行，但其中小鼠改在接種腫瘤細胞3天後確立腫瘤之前開始處理且不進行隨機分組。然而，腫瘤移植成功率為100%。此實驗中，發現TPP-2658與免疫檢控點抑制劑抗CTLA4抗體之組合之加成效力使8隻帶腫瘤小鼠中8隻之腫瘤均完全減緩。
相較之下，TPP-2658與抗-CTLA4之各單方療法造成8隻中有3隻(38% CR)及8隻中有5隻(63%)之腫瘤完全消退。亦在TPP-2658與抗-PD-1抑制劑之組合中觀察到加成效力，其使8隻小鼠中有5隻(63% CR)之腫瘤完全消退，反之抗-PD-1單方療法則為0% CR(表39a)。
在MC38小鼠結腸腫瘤中(實驗條件與上述CT26實驗之說明相同)觀察到TPP-2658與免疫檢控點抑制劑抗-PD-L1組合之加成效力。該等化合物係依i.v.與q4dx3療程投藥。與各單方療法相反，由依據最終腫瘤重量或最終腫瘤面積得到之T/C值檢測該組合之效益(表39a)。
T/C：依據切割後最終腫瘤重量之腫瘤相對於對照組比值
T/C：腫瘤相對於對照組比值CR：腫瘤完全消退(以%表示之比例)
實例14：於食蟹獼猴中比較TWEAKR抗體之毒性副作用
探討TPP-2090及其非糖苷基變異體TPP-2658來分析本文所揭示TWEAKR抗體之耐受性，並在雌性與雄性食蟹獼猴(n=2-4)中，以每週四次投與10mg/kg之靜脈內劑量(i.v.)進行比較。測定獼猴血液樣本中肝特異性酵素：丙胺酸-胺基轉化酶(ALAT)及麩胺酸脫氫酶(GLDH)、及胰臟酵素脂酶與澱粉酶、及腎臟標記物肌酸酐(CREA)與尿素作為實驗參數。血液中此等肝與胰臟酵素上升時，表示此等特定器官受到細胞傷害。同樣地，血液中肌酸酐與尿素值上升表示腎臟受損。殺死動物後之組織學分析(依據常用之電腦輔助分級系統1至5：第1級：輕微異常，第2級：小異常，第3級：輕度異常，第4級：顯著異常，第5級：嚴重異常)係著重於心臟內皮、胰臟與肝組織。表41顯示，在TPP-2658與TPP-2090之比較下，每週劑量10mg/kg可大幅加強耐受性並減少實驗室參數與組織病理學之變化。
雖然TWEAKR在肝、胰與腎臟中之表現程度極低，但由於TPP-2090被免疫細胞之FcγR-介導交聯作用加強其促效作用模式，而會誘發毒性。反之，缺乏FcγR結合能力之TPP-2658則使此等毒性大幅下降至輕微等級。
TPP-2658處理組則完全沒有觀察到加強之ALAT、澱粉酶、尿素與CREA含量。TPP-2658降低GLDH含量之效力高於TPP-2090，而脂酶仍維 持不變。
組織學上，TPP-2090所誘發肝導管之高等級過度增生現象則完全未出現在相同劑量之TPP-2658處理組。肝上所出現之肉芽腫(第2級)則視為非特異性事件。TPP-2658使胰臟細胞之過度增生降至第2級，相對於TPP-2090則誘發至第5級。但TPP-2090所誘發之心臟血管炎(內皮細胞發炎)則未出現在TPP-2658處理中。
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 124
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
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<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
<210> 127
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
<210> 129
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 129
<210> 130
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 130
<210> 131
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 131
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 132
<210> 133
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 133
<210> 134
<211> 282
<212> PRT
<213> 大家鼠
<400> 134
<210> 135
<211> 282
<212> PRT
<213> 山豬
<400> 135
<210> 136
<211> 282
<212> PRT
<213> 狼
<400> 136
<210> 137
<211> 282
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 137
<210> 138
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
<210> 139
<211> 296
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
<210> 140
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
<210> 141
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
<210> 142
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
<210> 143
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
<210> 144
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
<210> 145
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
<210> 146
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
<210> 147
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
<210> 148
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
<210> 149
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
<210> 150
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
<210> 151
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
<210> 152
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
<210> 153
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
<210> 154
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
<210> 155
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
<210> 156
<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
<210> 157
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
<210> 158
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
<210> 159
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
<210> 160
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
<210> 161
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
<210> 162
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
<210> 163
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
<210> 164
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
<210> 165
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
<210> 166
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
<210> 167
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
<210> 168
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
<210> 169
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
<210> 170
<211> 959
<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 171
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 172
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 174
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 175
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為任何天然肢基酸
<400> 176
<210> 177
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
<210> 178
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
<210> 179
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
<210> 180
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
<210> 182
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
<210> 183
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
<210> 184
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
<210> 185
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
<210> 186
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
<210> 187
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 187
<210> 188
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
<210> 189
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 189
<210> 190
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 190
<210> 191
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 191
<210> 192
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
<210> 193
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 193
<210> 194
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 194
<210> 195
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 195
<210> 196
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 196
<210> 197
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 197
<210> 198
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 198
<210> 199
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 199
<210> 200
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
<210> 201
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 201
<210> 202
<211> 1350
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 202
<210> 203
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 203
<210> 204
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 204
<210> 205
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
<210> 206
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
<210> 207
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 207
<210> 208
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
<210> 209
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 209
<210> 210
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 210
<210> 211
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 211
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 212
<210> 213
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
<210> 214
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1-mIgG1Kappa_RG7446輕鏈
<400> 214
<210> 215
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-PD-L1-mIgG1Kappa_RG7446重鏈
<400> 215

Claims (24)

  1. 一種單離之抗-TWEAKR抗體，其包含缺乏附接在Fc區之CH2功能域中保留之N-連接位點之聚醣之突變Fc區；可變重鏈，其包含如SEQ ID NO：6所示之可變重鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：7所示之可變重鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：8所示之可變重鏈CDR3序列，及可變輕鏈，其包含如SEQ ID NO：3所示之可變輕鏈CDR1序列、如SEQ ID NO：4所示之可變輕鏈CDR2序列、及如SEQ ID NO：5所示之可變輕鏈CDR3序列。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗體，其包含Fc區之N297A或N297Q之胺基酸取代，其中Fc區中殘基之編號係依Kabat之EU索引。
  3. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體結合Fcγ受體，優先結合FcγRIIB，其KD值比包含未修飾Fc區之親本抗體高出10倍。
  4. 根據申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體結合人類FcγRIIB之KD值大於50μM。
  5. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其特異性結合如SEQ ID NO：169所示之TWEAKR位置47之D(D47)。
  6. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其中該抗體為促效性抗體。
  7. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其包含：如SEQ ID NO：10所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：9所示之可變輕鏈序列。
  8. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其係IgG抗體，較佳為人類IgG1。
  9. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其包含如SEQ ID NO：213所示之重鏈序列及如SEQ ID NO：1所示之輕鏈序列。
  10. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其為單株抗體。
  11. 根據前述申請專利範圍中任一項之抗體，其為人類、人類化或嵌合性抗體。
  12. 一種抗體-藥物接合物，其包含根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體。
  13. 一種單離之核酸序列，其編碼根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體。
  14. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第13項之核酸序列。
  15. 一種單離之細胞，其表現根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體及/或包含根據申請專利範圍第13項之核酸或根據申請專利範圍第14項之載體。
  16. 根據申請專利範圍第15項之單離之細胞，其中該細胞為原核生物細胞或真核生物細胞。
  17. 一種製造根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體之方法，其包括培養根據申請專利範圍第16項之細胞及純化該抗體。
  18. 根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第12項之抗體-藥物接合物，其係用為醫藥。
  19. 根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體，其係用為診斷製劑。
  20. 根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第12項之抗體-藥物接合物，其係用為治療癌症之醫藥。
  21. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第12項之抗體-藥物接合物。
  22. 一種根據申請專利範圍第21項之醫藥組成物與一或多種醫療活性化合物之組合。
  23. 根據申請專利範圍第22項之組合，其中該醫療活性化合物為抗-CTLA4、抗-PD-1、或抗-PD-L1抗體。
  24. 一種治療與不期望出現TWEAKR有關之疾患或病症之方法，其包括對有此需要之個體投與有效量之根據申請專利範圍第21項之醫藥組成物或根據申請專利範圍第22或23項之組合。
TW104118682A 2014-06-12 2015-06-10 非糖苷基抗－ｔｗｅａｋｒ抗體及其用途 TW201609810A (zh)

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