CN114728171A - 抗tigit抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸、其治疗组合物,以及它们用于增强T细胞功能以上调细胞介导的免疫反应和用于治疗T细胞功能障碍性疾病(例如肿瘤免疫)以治疗传染病和癌症的用途。
Description
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并通过引用其全部内容纳入本文。于2020年11月5日创建的所述ASCII拷贝命名为P19-193_WO_SL.txt,大小为40,940字节。
技术领域
本申请涉及抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸、其治疗组合物,以及它们用于增强T细胞功能以上调细胞介导的免疫反应和用于治疗T细胞功能障碍性疾病(例如肿瘤免疫)以治疗传染病和癌症的用途。
背景技术
淋巴细胞的发育和激活
人类的两种主要淋巴细胞是T淋巴细胞(胸腺来源)和B淋巴细胞(骨髓来源)。这些细胞来源于骨髓和胎儿肝脏中的造血干细胞,这些干细胞致力于淋巴发育途径。这些干细胞的后代遵循不同的途径成熟为B或T淋巴细胞。人类B淋巴细胞的发育完全在骨髓内进行。而T细胞则由未成熟的前体细胞发育而来,这些前体细胞离开骨髓,通过血液进入胸腺,在那里增殖并分化为成熟的T淋巴细胞。
来自胸腺或骨髓的成熟淋巴细胞处于静止,或“静息”状态,即它们是有丝分裂未激活的。当分散到血液中时,这些“幼稚”或“原始”淋巴细胞进入各种次级或外周淋巴器官,如脾脏、淋巴结或扁桃体。大多数原始淋巴细胞天生具有较短的寿命,离开骨髓或胸腺几天后就会死亡。然而,如果这种细胞接收到表明存在抗原的信号,它们可能会激活并经历连续几轮的细胞分裂。由此产生的后代细胞中的一些随后恢复到静息状态,成为记忆淋巴细胞——B和T细胞,其基本上为刺激性过敏原的下一次接触做好准备。激活的原始淋巴细胞的其他后代是效应细胞,它们只能存活几天,但是执行特定的防御活动。
淋巴细胞激活指的是一系列有序的事件,经过这些事件,静息淋巴细胞被刺激以分裂并产生后代,其中一些后代会成为效应细胞。完整的反应包括诱导细胞增殖(有丝分裂)和表达免疫功能两者。当特定配体与淋巴细胞表面的受体结合时,淋巴细胞就会被激活。T细胞和B细胞的配体不同,但是所产生的细胞内生理机制相似。
一些外来抗原本身可以诱导淋巴细胞激活,尤其是交叉连接B细胞的表面免疫球蛋白或T细胞的其他糖蛋白的大型聚合抗原。然而,大多数抗原不是聚合的,甚至大量的直接与B细胞结合也不能导致激活。在B细胞与附近的激活的辅助性T淋巴细胞被共同刺激时,这些更常见的抗原激活B细胞。这种刺激可能由T细胞分泌的淋巴因子产生,但通过B细胞与T细胞表面蛋白的直接接触传播最有效,该T细胞表面蛋白与某些B细胞表面受体相互作用以产生次级信号。
T细胞
T淋巴细胞不表达免疫球蛋白,而是通过称为T细胞受体(TCR)的表面蛋白来检测外来物质的存在。这些受体通过直接接触或通过影响其他免疫细胞的活性来识别抗原。与巨噬细胞一起,T细胞是参与细胞介导免疫的主要细胞类型。
与B细胞不同,T细胞只能在特定环境下检测异物。特别地,只有当外源蛋白首先被切割成小肽,然后该小肽显示在称为抗原呈递细胞(APC)的第二宿主细胞的表面时,T淋巴细胞才会识别该外源蛋白。许多类型的宿主细胞在某些条件下可以呈递抗原,但是某些类型的宿主细胞更特异地适合于此目的,并且在控制T细胞活性方面尤其重要,包括巨噬细胞和其他B细胞。抗原呈递部分地取决于呈递细胞表面的特定蛋白质,称为主要组织相容性复合体(MHC)蛋白质。因此,为了刺激细胞介导的免疫,必须将外源肽与MHC肽组合呈递至T细胞,并且这种组合必须被T细胞受体识别。
有两种重要的T细胞亚群:细胞毒性T淋巴细胞(Tc细胞或CTL)和辅助性T细胞(TH)细胞,其可以根据标记物CD8和CD4的细胞表面表达进行大致鉴定。Tc细胞在病毒防御中很重要,可以通过识别某些细胞表面表达的病毒肽直接杀死病毒。TH细胞促进其他细胞类型的增殖、成熟和免疫功能,例如淋巴因子分泌,以控制B细胞、巨噬细胞和细胞毒性T细胞的活动。
原始T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞两者通常都处于静息状态,在这种状态下,它们不表现出显着的辅助性或细胞毒活性。当被激活时,这些细胞会经历几轮有丝分裂以产生子细胞。这些子细胞中的一些作为记忆细胞返回到静息状态,而其他的则成为积极表达辅助性或细胞毒活性的效应细胞。这些子细胞类似于它们的亲本:CD4+细胞只能产生CD4+后代,而CD8+细胞只能产生CD8+后代。效应T细胞表达在静息T细胞上不表达的细胞表面标志物,诸如CD25、CD28、CD29、CD40L、转铁蛋白受体和II类MHC蛋白。当激活刺激被撤回时,随着效应细胞死亡或恢复到静息状态,细胞毒性或辅助活性在几天内逐渐减弱。
与B细胞的激活类似,T淋巴细胞对大多数抗原的反应也需要两种类型的同时刺激。第一种是抗原,如果其被抗原呈递细胞上的MHC蛋白适当地显示,它可以被T细胞受体识别和结合。虽然这种抗原MHC复合物确实向细胞内部发送信号,但通常不足以导致T细胞活化。完全激活,诸如与辅助性T细胞同时发生的激活,需要与抗原呈递细胞表面表达的被称为共刺激因子的其他特定配体共同刺激。另一方面,细胞毒性T细胞的激活通常需要IL-2,其为一种由激活的辅助性T细胞分泌的细胞因子。
免疫调节受体
抑制性免疫调节受体(IMR)通常作为维持自身耐受的免疫检查点,对肿瘤微环境逃避免疫的能力至关重要,这一发现是肿瘤免疫治疗成为可能的一个关键因素。阻断抑制性IMR似乎比利用激活细胞因子或肿瘤疫苗直接刺激肿瘤免疫更有效地释放有力的肿瘤特异性免疫反应,这种方法有可能改变人类癌症治疗。现在出现了一个重要的意义和机会,即有可能为其他IMR开发新的抗体拮抗剂,并将拮抗剂抗体与多个IMR结合,以增加肿瘤临床试验中应答者的比例,以及扩大肿瘤免疫治疗有效的肿瘤适应症。
重要的是,抑制性IMR和调节细胞免疫的配体通常在肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上过度表达。值得注意的是,PD-L1在肿瘤中的过度表达与肿瘤特异性T细胞衰竭和不良预后相关。在临床试验中,阻断PD-1/PD-L1连接可使大部分患者产生持久的肿瘤消退反应。最近的一份报告表明,与单独表达任一种IMR的细胞相比,在黑色素瘤患者来源的肿瘤特异性CD8+T细胞中,PD-1和另一种抑制性IMR(TIM-3)的共同表达与更加功能失调的T细胞衰竭表型相关。此外,一些使用临床前肿瘤模型的报告显示,与单独拮抗PD-1相比,阻断包括PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4的多个IMR更有效地诱导抗肿瘤反应。这些结果强调了进一步研究IMR途径的重要性。
TIGIT结构和信号传导
TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是一种主要在活化的T细胞和NK细胞上表达的免疫调节受体。TIGIT也称为VSIG9、VSTM3、以及WUCAM。其结构显示一个细胞外免疫球蛋白结构域、一个1型跨膜区和两个ITIM基序。TIGIT构成共刺激网络的一部分,该共刺激网络由T细胞上的阳性(CD226)和阴性(TIGIT)免疫调节受体以及APC上表达的配体(CD155/PVR和CD112)组成。
TIGIT结构的一个重要特征是在其细胞质尾域存在一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。与PD-1和CTLA-4一样,TIGIT的胞质区中的ITIM结构域预计将招募酪氨酸磷酸酶,诸如SHP-1和SHP-2,并随后使T细胞受体(TCR)亚基上的免疫受体酪氨酸激活基序(IT AM)内的酪氨酸残基去磷酸化。因此,通过肿瘤细胞或TAM表达的受体配体CD155和CD112与TIGIT的连接可能有助于抑制TCR信号传导和T细胞激活,这对于增强有效的抗肿瘤免疫至关重要。因此,针对TIGIT的拮抗抗体可以抑制CD155和CD112诱导的T细胞反应抑制,并增强抗肿瘤免疫。本发明的目的是获得可以单独或与其他试剂组合用于治疗传染病和癌症的抗TIGIT抗体。人类TIGIT的氨基酸序列如下(Genbank登录号NP_776160):
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG(SEQ ID NO:1)
TIGIT和CD96与CD226(DNAM-1)一起形成了一条与CD28/CTLA-4通路非常相似的通路。与CD28和CTLA-4类似,CD226是一种共刺激受体,与作为共抑制受体的TIGIT和CD96共享配体。CD226和TIGIT结合两种连接蛋白和连接蛋白样(necl)蛋白:PVR(CD155,necl-5)和CD112(PVRL2,nectin-2)。CD96共享CD155与CD226和TIGIT的结合,但也与CD111结合。
TIGIT在激活时在CD8+T细胞上上调(Joller等人,J Immunol 186:1338-1342,2011)。其他人和我们已经证明,在小鼠的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上TIGIT表达高度富集(Johnston等人,Cancer Cell.2014;26:923-937,Kurtulus等人,J ClinInvestig.2015;125:4053-4062)。重要的是,TIGIT在非小细胞肺癌、结肠癌和黑色素瘤的CD8+TIL上(Chauvin等人,J Clin Investig.2015;125:20406-2058,Johnston等人,CancerCell.2014;26:923-937)以及急性髓细胞白血病(AML)患者的外周血单个核细胞(PBMC)中也高度表达(Kong等人,Clin Cancer Res.2016;22:3057-3066)。在CD8+TIL中,TIGIT标记了共表达共抑制受体Tim-3和PD-1的CD8+T细胞的一个亚群,是TNF-α和IL-2的不良生产者,并且与TIGIT-CD8+TIL相比细胞毒性降低(Kurtulus等人,J Clin Investig.2015;125:4053-4062)。重要的是,黑色素瘤患者的PD-1+Tim-3+CD8+TIL中TIGIT的表达也显著较高,并且TIGIT与黑色素瘤和AML患者的细胞因子生成不良相关(Kong等人,Clin CancerRes.2016;22:3057-3066)。总之,这些数据表明,在小鼠和人类两者中,在表现出功能失调的表型的CD8+TIL上都发现了TIGIT。
若干证据表明,TIGIT限制了CD8+T细胞的效应功能和扩增。Kurtulus等人表明,Tigit-/-小鼠的CD8+TIL表现出增强的细胞毒性和增殖能力(J Clin Investig.2015;125:4053-4062)。类似地,AML患者CD8+T细胞中TIGIT的基因抑制(knockdown)除导致功能性缺陷的逆转(Kong等人,Clin Cancer Res.2016;22:3057-3066)。此外,其他研究表明,阻断TIGIT与PD-1阻断协同作用,以通过小鼠结肠癌TIL中的CD8+T细胞增加IFN-γ和TNF-α生产(Johnston等人,Cancer Cell.2014;26:923-937),并增强抗原特异性增殖、细胞因子产生,以及CD8+T细胞从黑色素瘤患者的PBMC和和TIL的脱颗粒(Chauvin等人,J ClinInvestig.2015;125:2046-2058)。总之,这些数据支持TIGIT在肿瘤背景下抑制CD8+T细胞的扩增和效应功能方面的作用(Johnston等人,Cancer Cell.2014;26:923-937,41和Kong等人,Clin Cancer Res.2016;22:3057-3066)。
特别地,TIGIT信号传导的抑制被认为是增强T细胞免疫以用于治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持续)感染)的一种手段。阻断TIGIT信号传导的抑制剂已知于例如WO16028656和WO16011264。然而,由于针对这一通路中的靶点的最佳治疗方法尚未商业化,因此存在着严重未满足的医疗需求。
发明内容
本发明的目的是提供抗TIGIT抗体,包括编码这种抗体的核酸和含有这种抗体的组合物,以及它们用于增强抗肿瘤免疫的应用。令人惊讶地发现,与经测试的先前叙述的抗TIGIT抗体相比,本发明的抗TIGIT抗体在介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和增强混合淋巴细胞反应(MLR)方面尤其有效。此外,这些抗体不仅能阻断人TIGIT和人PVR(CD155)之间的相互作用,还能阻断相应的食蟹猴蛋白之间的相互作用。最后,本发明的抗体结合一个独特的表位,该表位包含人类TIGIT的残基Q53、T55、Y113和P114。
一方面,本发明提供了包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的分离的重链可变区多肽,其中:
(a)HVR-H1序列是GYTFTX1YP(SEQ ID NO:36);
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP(SEQ ID NO:14);
(c)HVR-H3序列是ARX2GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13(SEQ ID NO:37);
并且其中:X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y、S或F;X5是S、G或T;X6是V、S或G;X7是D、Y或P;X8是E、D或Y;X9是Y或W;X10是A、F或S;X11是F或D;X12是D或P;X13是V、I或不存在。
在一个实施方式中,X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y或S;X5是S或G;X6是V或S;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A或F;X11是F;X12是D;X13是V或I。
在另一个实施方式中,X1是S;X2是V或T;X3是G;X4是Y;X5是S或G;X6是V;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V或I。
在又另一个实施方式中,X1是S;X2是V;X3是G;X4是Y;X5是S;X6是V;X7是D;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V。
一方面,多肽4还包含位于HVR之间的可变区重链框架序列HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和HC-FR4,由此形成下式的序列:(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。
在一个实施方式中,框架序列源自人类共有框架序列或人类种系框架序列。
在另一个实施方式中,框架序列的至少之一如下列所述:
HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:2);
HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO:3);
HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC(SEQ ID NO:4);
HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)。
在再一个实施方式中,多肽包含至少CH1结构域,以及可选择的CH2和CH3结构域。
再一方面,重链多肽进一步与包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合,其中:
(a)HVR-L1序列是QGISSY(SEQ ID NO:6);
(b)HVR-L2序列是AAS(SEQ ID NO:7);
(c)HVR-L3序列是X14QX15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO:38);
并且其中X14是Q、G或H;X15是L、V或T;X16是N、S、I或M;X17是S、R或F;X18是Y或R;X19是P或L;X20是T或A。
在一个实施方式中,X14是Q或G;X15是L或V;X16是N或S;X17是S或R;X18是Y;X19是P;X20是T。
在另一个实施方式中,X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T(SEQ IDNO:8)。
一方面,轻链还包含位于HVR之间的可变区轻链框架序列LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3和LC-FR4,由此形成下式的序列:(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。
在一个实施方式中,轻链框架序列源自人类共有框架序列或人类种系框架序列。
在另一个实施方式中,轻链框架序列是kappa轻链序列。
在又另一个实施方式中,轻链框架序列的至少之一如下列所述:
LC-FR1序列是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO:9);
LC-FR2序列是LAWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:10);
LC-FR3序列是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:11);
LC-FR4序列是FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)。
在再一个实施方式中,轻链多肽包含CL结构域。
另一方面,本发明提供了分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,并且其中:(i)HVR-H1序列是GYTFTX1YP;(ii)HVR-H2序列是INTNTGNP(SEQ ID NO:14);(iii)HVR-H3序列是ARX2GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13(SEQ ID NO:37);
(b)轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3,并且其中:(iv)HVR-L1序列是QGISSY(SEQID NO:6);(v)HVR-L2序列是AAS(SEQ ID NO:7);(vi)HVR-L3序列是X14QX15X16X17X18X19X20(SEQ ID NO:38);
并且其中X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y、S或F;X5是S、G或T;X6是V、S或G;X7是D、Y或P;X8是E、D或Y;X9是Y或W;X10是A、F或S;X11是F或D;X12是D或P;X13是V、I或不存在;X14是Q、G或H;X15是L、V或T;X16是N、S、I或M;X17是S、R或F;X18是Y或R;X19是P或L;X20是T或A。
在一个实施方式中,X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y或S;X5是S或G;X6是V或S;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A或F;X11是F;X12是D;X13是V或I;X14是Q或G;X15是L或V;X16是N或S;X17是S或R;X18是Y;X19是P;X20是T。
在另一个实施方式中,X1是S;X2是V或T;X3是G;X4是Y;X5是S或G;X6是V;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V或I;X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T。
在又另一个实施方式中,X1是S;X2是V;X3是G;X4是Y;X5是S;X6是V;X7是D;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V;X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T。
在又另一个特定实施方式中,本发明提供了分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,其中
(a)HVR-H1序列是GYTFTSYP(SEQ ID NO:13),
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP(SEQ ID NO:14),
(c)HVR-H3序列是ARVGGYSVDEYAFDV(SEQ ID NO:15);
并且其中
(d)HVR-L1序列是QGISSY(SEQ ID NO:6),
(e)HVR-L2序列是AAS(SEQ ID NO:7),
(f)HVR-L3序列是QQLSSYPT(SEQ ID NO:8)。
再一方面,重链可变区包含如下的位于HVR之间的一个或多个框架序列:(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),并且轻链可变区包含如下的位于HVR之间的一个或多个框架序列:(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。
在一个实施方式中,框架序列源自人类共有框架序列或人类种系序列。
在另一个实施方式中,轻链框架序列为:
HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:2);
HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO:3);
HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC(SEQ ID NO:4);
HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)。
在又再一个实施方式中,轻链框架序列是kappa轻链序列。
在还再一个实施方式中,轻链框架序列的一个或多个为:
LC-FR1是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO:9);
LC-FR2是LAWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:10);
LC-FR3是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:11);
LC-FR4是FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)。
在还再一个特定实施方式中,本发明提供了分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,其中
(a)可变重链框架序列如下所述:
(i)HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:2);
(ii)HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW(SEQ ID NO:3);
(iii)HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC(SEQ ID NO:4);
(iv)HC-FR4是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5);并且
(b)可变轻链框架序列如下所述:
(i)LC-FR1序列是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO:9);
(ii)LC-FR2序列是LAWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:10);
(iii)LC-FR3序列是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:11);
(iv)LC-FR4序列是FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)。
再一方面,本发明提供了分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,具有上文公开的HC-FR和LC-FR序列,选自下列:
i)抗体,其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3序列选自实施例1的表2中所示的ID之一,并且其中
(a)HVR-L1序列是QGISSY(SEQ ID NO:6),
(b)HVR-L2序列是AAS(SEQ ID NO:7),
(c)HVR-L3序列是QQLNSYPT(SEQ ID NO:8);
ii)抗体,其中HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3序列选自实施例1的表3中所示的ID之一,并且其中
(a)HVR-H1序列是GYTFTSYP(SEQ ID NO:13),
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP(SEQ ID NO:14),
(c)HVR-H3序列是ARVGGYSVDEYAFDV(SEQ ID NO:15);或者
iii)抗体,选自实施例1的表4。
再一方面,重链可变区多肽、抗体或抗体片段还包含至少CH1结构域。
还再一方面,上述和下述的抗TIGIT抗体的可变区轻链、抗体或抗体片段还包含CL结构域。
还再一方面,抗体还包含CH1、CH2、CH3和CL结构域。
还再一方面,抗体还包括人或鼠恒定区。
在一个实施方式中,人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4所组成的组。
还再一方面,本发明的抗TIGIT抗体是全人源抗体。
还再一方面,本发明提供了分离的抗TIGIT抗体,包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85%的序列同一性:QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16),
并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85%的序列同一性:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLSSYPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:17)。
在具体的方面,序列同一性是86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在更具体的方面,序列同一性是100%。
在非常具体的方面,抗TIGIT抗体是全人源IgG1抗体,并且重链和轻链可变区序列还包含人恒定区序列,以产生如下所述的全长重链和轻链序列:
重链:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:18)。
在实施方式中,取决于表达系统,重链可以包含末端K(赖氨酸)残基。
轻链:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLSSYPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:19)。
该抗体在下文中称为3963H03-12,或者简称为H03-12。上述所有具体(即不包括变量)序列是抗体H03-12的序列。
在其他的非常具体的方面,本发明提供了分别称为3964A06、3965D08、3966C11、7728B03和7729G05的抗TIGIT抗体,或者简称为A06、D08、C11、B03和G05,其序列在下文中叙述。
在一个实施方式中,抗体能够结合人和食蟹猴TIGIT。
在更具体的实施方式中,抗体能够阻断人或食蟹猴TIGIT与相应的人或食蟹猴CD155/PVR受体之间的相互作用。
在另一个实施方式中,抗体以10x10-9 M以下的KD、优选以6x10-9 M以下的KD、甚至更优选以4x10-9 M以下的KD结合人TIGIT。
另一方面,本发明涉及分离的抗TIGIT抗体(H03-12)或其抗原结合片段,其结合包含人TIGIT残基Q53、T55、Y113和P114的功能性表位。
在一个实施方式中,抗体(H03-12)结合还包含人TIGIT的Q56、N70和H111的功能性表位。
再一方面,抗体(H03-12)结合包含人TIGIT的T51、Q53、T55、H111、T112、Y113、P114和G116的构象表位。
在一个实施方式中,构象表位包含人TIGIT的T51、A52、Q53、T55、Q56、A71、D72、H111、T112、Y113、P114、G116和T117。
在另一个实施方式中,抗体(H03-12)结合包含人TIGIT的T51、A52,Q53、T55、Q56、N70、D72、H111、T112、Y113、P114和G116的构象表位。
在另一个实施方式中,抗体(A06)结合包含人TIGIT的T51、A52,Q53、T55、Q56、N70、A71、D72、H111、T112、Y113、P114、G116和T117的构象表位。
在另一个实施方式中,抗体(C11)结合包含人TIGIT的T51、A52,Q53、T55、Q56、N70、A71、D72、H111、T112、Y113、P114和G116的构象表位。
在另一个实施方式中,抗体(B03)结合包含人TIGIT的T51、A52,Q53、T55、Q56、N70、A71、D72、H111、T112、Y113、P114、D115、G116和T117的构象表位。
在另一个实施方式中,抗体(G05)结合包含人TIGIT的M23、T51,Q53、V54、T55、Q56、N70、A71、H111、T112、Y113、P114、D115、G116和T117的构象表位。
再一方面,本发明涉及抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,其与本文所述的根据本发明的抗体交叉竞争结合TIGIT。
再一方面,本发明提供了药物组合物,包含上述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与至少一种药学上可接受的载体的组合。
再一方面,本发明提供了分离的核酸,其编码本文所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的多肽、或抗体轻链或重链、或可变区序列。
在一个实施方式中,编码所述重链的分离的核酸具有以下序列:
ATGGAAACAGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCTCCACAGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAACCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTACCCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCAACACCGGCAACCCTACCTACGCCCAGGGCTTCACCGGCAGGTTCGTGTTCTCCCTGGACACCAGCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGTGGGAGGCTACTCCGTGGACGAGTACGCCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCACGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT(SEQ ID NO:20)。
在一个实施方式中,编码所述轻链的分离的核酸具有以下序列:
ATGAGGGCCCTGCTGGCTAGACTGCTGCTGTGCGTGCTGGTCGTGTCCGACAGCAAGGGCGACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTTCCTGTCCGCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACTTGTCGTGCCTCCCAGGGCATCTCCTCCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACACTGCAGTCCGGCGTGCCCTCCAGGTTTTCCGGATCCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCTGTCCTCCTACCCCACCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:21)。
另一方面,本发明提供了载体,其适合于表达一种或多种所述核酸。
再一方面,本发明提供了宿主细胞,包含所述载体,适合于表达核酸以及递送如本文所述的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的成熟、正确折叠的多肽、或抗体轻链或重链、或可变区序列。
在一个实施方式中,宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
在具体实施方式中,真核细胞是哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)。
在更具体的实施方式中,CHO细胞是CHO-K1SV。
另一方面,本发明提供了制造抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法,包含在适于产生该抗体或片段的条件下,以适于表达的形式培养含有编码任意前述TIGIT抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞,并回收抗体或片段。
又另一方面,本发明涉及工程化抗TIGIT抗体或其工程化片段,其直接或经由连接分子与诸如细胞因子或生长因子的治疗剂融合。这样的工程化抗体或工程化抗体片段也可以用于肿瘤疗法和免息系统相关疾病。抗体融合蛋白,尤其是免疫细胞因子,在本领域是众所周知的。融合伴侣可以结合于抗体或抗体片段的N端或其C端。
还再一方面,本发明提供了治疗癌症的方法,包含向有需要的受试者施用有效量的本文中所公开的抗TIGIT抗体或本文中所公开的药物组合物。
在一个实施方式中,癌症选自由下列所组成的组:乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾腺癌、胃癌、胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。
还再一方面,本发明提供了增强T细胞功能的方法,包含施用有效量的任意上述抗TIGIT抗体或组合物。
在一个实施方式中,抗TIGIT抗体或组合物使功能失调的T细胞非功能失调化(non-dysfunctional)。
在还再一个实施方式中,本发明提供了治疗T细胞功能障碍性疾病的方法,包含施用治疗有效量的任意上述抗TIGIT抗体或组合物。
在一个具体方面,T细胞功能障碍性疾病是肿瘤免疫。
在还再具体的方面,肿瘤免疫源于选自由乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾腺癌、胃癌、胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌所组成的组的癌症。
在更加具体的方面,肿瘤免疫源于选自由肺癌、头颈癌、结肠癌、膀胱癌和肾癌所组成的组的癌症。
因此,另一方面,本发明的方法可以用于治疗需要增强免疫原性(诸如提高肿瘤免疫原性)的病症,以治疗癌症,该癌症可能处于早期或处于晚期和/或转移。
在本发明方法的一些实施方式中,一些癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平升高,这可能指示癌组织中存在T细胞。本领域已知,T细胞浸润可能与某些癌症的临床结果改善有关(参见,例如,Zhang等人,N.Engl.J.Med.348(3):203-213(2003))。然而,在肿瘤环境中,TIL还包括耗竭的T细胞(例如CD8+T细胞)和抑制性T细胞(例如调节性T细胞),它们表达高水平的抑制性共受体,诸如PD-1、TIGIT、TIM3、LAG3,并且缺乏产生效应细胞因子的能力。预计的是,具有ADCC潜能的抗TIGIT抗体将阻断TIGIT相互作用,以防止和/或挽救T细胞衰竭,并且减少抑制性T细胞。
在本发明方法的一些实施方式中,个体具有T细胞功能障碍性疾病,在一些实施方式中,其特征在于T细胞无能或分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活性的能力降低。在其他实施方式中,T细胞功能障碍性疾病以T细胞衰竭为特征。在一些实施方式中,T细胞是CD4+和CD8+T细胞。
与上述增强T细胞功能、治疗T细胞功能障碍性疾病或治疗癌症的方法相同,本发明同样涉及上文和下文所述的抗TIGIT抗体或组合物在制造用于增强T细胞功能、治疗T细胞功能障碍性疾病或治疗癌症的药物中的应用,或者抗TIGIT抗体或组合物在增强T细胞功能或治疗T细胞功能障碍性疾病或癌症中的应用。
另一方面,本文提供了用于增加、增强或刺激患有癌症的个体的免疫反应或功能的方法,包含向该个体施用有效量的抗TIGIT抗体和抗癌剂和/或抗癌疗法。
另一方面,本文提供了用于治疗或延迟肿瘤免疫或癌症的进展、或减少或抑制个体中的癌症复发的方法,包含向该个体施用有效量的抗TIGIT抗体和抗癌剂和/或抗癌疗法。
在某些实施方式中,方法包含向个体施用有效量的抗TIGIT抗体和/或抗癌剂和/或抗癌疗法。
在某些实施方式中,抗癌疗法选自由辐射疗法、手术、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、辅助疗法、新辅助疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗及其组合所组成的组。
在可与任意前述实施方式组合的某些实施方式中,抗癌剂选自由化疗剂或生长抑制剂、靶向治疗剂、表达嵌合抗原受体的T细胞、抗体或其抗原结合片段、抗体药物缀合物、血管生成抑制剂、抗肿瘤剂、癌症疫苗、佐剂及其组合所组成的组。
在某些实施方式中,化疗剂或生长抑制剂选自由烷基化剂、蒽环类药物(anthracycline)、抗激素剂、芳香化酶抑制剂、抗雄激素、蛋白激酶抑制剂、脂质激酶抑制剂、反义寡核苷酸、核糖酶、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性剂或抗肿瘤抗生素、蛋白酶体抑制剂、抗微管剂、EGFR拮抗剂、类维生素A(rentinoid)、酪氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其组合所组成的组。
在可与任意前述实施方式组合的某些实施方式中,靶向治疗剂选自由B-raf抑制剂、MEK抑制剂、K-ras抑制剂、c-Met抑制剂、Alk抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、Akt抑制剂、p70S6K抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、双重磷脂酰肌醇3-激酶/mTOR抑制剂及其组合所组成的组。
在可与任意前述实施方式组合的某些实施方式中,靶向治疗剂是抗体或其抗原结合片段或抗体融合蛋白,选自由阿仑单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝林妥欧单抗(blinatumomab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、艾库组单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米珠单抗(emicizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、吉妥单抗-奥佐米星(gemtuzumab-ozogamincin)、替伊莫单抗-tiuxetan(ibritumomab-tiuxetan)、奥英妥珠单抗(inotuzumab-ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(pantitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(retuximab)、洛伐妥珠单抗-特司林(rovalpituzumab-teserine)、塞妥昔单抗(siltuximab)、曲美木单抗(tremelimumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、扎木单抗(zanolimumab)、抗IL-12和抗-17所组成的组。在更具体的实施方式中,至少一种治疗剂为阿维鲁单抗。
在可与任意前述实施方式组合的某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段特异性结合至靶点,所述靶点选自由下列所组成的组:PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD52、VEGF-A、EGFR、CD20、HER2、HLA-DRB、CD62L、IL-6R、β淀粉样蛋白、CD44、CanAg、CD4、TNF-α、IL-2、CD25、补体C5、CDl la、CD22、CD18、呼吸道合胞病毒F、干扰素γ、CD33、CEACAM5、IL-5、整合素α4、IgE、IL-4、IL-5、CD154、FAP、CD2、MUC-1、AFP、整合素α-v-β-3、IL6R、CD40L、EpCAM、志贺样毒素II、IL-12、IL-23、IL-17和CD3。
在一个实施方式中,抗TIGIT抗体在抗癌剂或抗癌疗法之前施用。在另一个实施方式中,抗TIGIT抗体与抗癌剂或抗癌疗法同时施用。在又另一个实施方式中,抗TIGIT抗体在抗癌剂或抗癌疗法之后施用。
本发明的另一方面涉及本文公开的抗TIGIT抗体或组合物的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在癌症治疗中的应用。因此,本发明涉及一种治疗癌症的方法,包含向有需要的受试者施用有效量的抗TIGIT抗体,其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
另一方面,抗体或组合物治疗或预防持续感染的症状,例如通过人类免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒或人乳头状瘤病毒的病毒感染。
又再一方面,本发明提供了试剂盒套件,包含本文公开的药物组合物,以及说明用于治疗个体的T细胞功能障碍性疾病和/或癌症的应用的包装说明书。
又再一方面,本公开提供了试剂盒,包含本文公开的药物组合物、抗癌剂、以及包含将抗癌剂与抗TIGIT抗体组合使用以治疗个体的T细胞功能障碍性疾病和/或癌症的说明的包装说明书。
定义
抗体相关定义
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如,双特异性抗体、双抗体)和单链分子,以及抗体片段(例如,Fab、F(ab')2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)可与本文中的“抗体”互换使用。基本的4链抗体单元是一种杂四聚糖蛋白,由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。IgM抗体由5个基本的杂四聚体单元和一个额外的称为J链的多肽组成,并且含有10个抗原结合位点,而IgA抗体由2-5个基本的4链单元组成,其可以聚合,与J链组合形成多价聚集体(assemblage)。就IgG而言,4链单元通常约为150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键连接到一个H链,而两个H链通过一个或多个二硫键连接,具体取决于H链的同型。每个H和L链也有规则间隔的链内二硫键。每个H链在N端都有一个可变结构域(VH),然后是三个恒定结构域(CH),分别对应于α和γ重链同型,以及四个CH结构域,对应于μ和ε重链同型。每个L链在N端有一个可变域(VL),然后在其另一端有一个恒定域。VL与VH对齐,CL与重链的第一个恒定域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对在一起形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和性质,参见例如《基础与临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》第8版,Daniel P.Sties、AbbaI.Terr和Tristram G.Parsolw(编辑),Appleton and Lange,Norwalk,CT,1994年,第71页和第6章。基于其恒定结构域的氨基酸序列,任何脊椎动物物种的L链都可以分为两种明显不同的类型之一,称为κ(kappa)和λ(lambda)。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的类别或同型。免疫球蛋白有五类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,重链分别指定为α、δ、ε、γ和μ。基于CH序列和功能的相对较小差异,γ和α类进一步划分为亚类,例如,人类表达以下亚类:IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于同类的其他抗体),并且含有抗原结合位点。
术语“可变”指代在抗体之间,可变结构域的某些片段在序列上存在巨大差异的事实。V结构域介导抗原结合并且限定抗体对其抗原的特异性。然而,变异性并不是均匀分布在可变结构域的整个范围内。相反,它集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(HVR)的三个片段中。可变结构域中更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区域,主要采取β-叠片构型,由三个HVR连接,形成连接β-叠片结构的环,并且在某些情况下形成β-叠片结构的一部分。每条链中的HVR通过FR区紧密结合在一起,并且与其他链中的HVR一起,有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,《免疫学关注蛋白质序列(Sequences of Immunological Interest)》,第五版,NationalInstitute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但是表现出各种效应功能,诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”,当在本文中使用时,指代抗体可变结构域的区域,其在序列上是高可变的并且/或者形成结构上限定的环。一般而言,抗体包含六个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中,H3和L3在六个HVR中显示出最多的多样性,并且H3尤其被认为在赋予抗体良好的特异性方面发挥着独特的作用。参见,例如,Xu等人,Immunity 13:37-45(2000);Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology248:1-25(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上,天然产生的骆驼类抗体仅由重链组成,在没有轻链的情况下具有功能性和稳定性。参加,例如,Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993);Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。许多HVR描绘(delineations)正在使用中。ImMunGeneTics(IMGT)独特的Lefranc编号(IMGT编号)(Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))考虑了序列保守性、X射线衍射研究的结构数据以及高变环的特征,以定义FR和HVR。Kabat互补性决定区(CDR)基于序列可变性,也是常用的(Kabat等人,《免疫学关注蛋白质序列》,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。相反地,Chothia指代结构环的位置(Chothia和Lesk,/.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表了Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷,并且在Oxford Molecular的AbM抗体建模软件中使用。“接触”HVR基于对现有复杂晶体结构的分析。
各种HVR的残基如下所示。
HVR可包括如下“扩展HVR”:VL中的24-40(LI)、56-69(L2)和105-117(L3),VH中的24-40(HI)、55-74(H2)和105-117(H3)。对于这些定义,可变结构域残基根据上述Lefranc等人的文献进行编号。
“使用IMGT定义的可变结构域残基编号”或“IMGT中的氨基酸位置编号”及其变体指代上述Lefranc等人的文献中用于抗体可变结构域的编号系统。使用该编号系统,实际线性氨基酸序列可能含有更少或额外的氨基酸,对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变域可以包括在重链HVR残基111之后或重链HVR 112之前插入的残基(例如,根据Lefranc的残基111.1和112.1等)。对于给定抗体,可通过在抗体序列的同源区域与“标准”IMGT编号的序列对齐来确定残基的IMGT编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的HVR残基之外的可变结构域残基。
“人类共有框架”或“受体人类框架”是代表了一系列人类免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常见的氨基酸残基的框架。通常,所选择的人类免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列的一个亚组。一般而言,序列的亚组是,如Kabat等人的《免疫学关注蛋白质序列》,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的亚组。例如,对于VL,亚组可以是上述Kabat等人的文献中的kappa I、kappa II、kappa III或kappa IV亚组。此外,对于VH,亚组可以是上述Kabat等人的文献中的亚组I、亚组II或亚组III。或者,人类共有框架可以源自其中特定残基的上述内容,诸如当人类框架残基基于其与供体框架的同源性来选择,通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合对齐。“源自”人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的受体人类框架可以包含其相同的氨基酸序列,或其可包含预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方式中,预先存在的氨基酸变化的数量为10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下。
“VH亚组I共有框架”包含从上述Kabat等人的文献中的可变重亚群I的氨基酸序列中获得的共有序列。
“VH kappa I共有框架”包含从上述Kabat等人的文献中的可变轻kappa亚群I的氨基酸序列中获得的共有序列。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域,包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同,但是人类IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230位置的氨基酸残基延伸到其羧基端。除非本文中另有说明,否则免疫球蛋白重链恒定区中的残基编号为EU指数,如上述Kabat等人的文献所述。“Kabat中的EU指数”指代人类IgG1 EU抗体的残基编号。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被去除,例如,在抗体的生产或纯化过程中,或者通过重组工程化编码抗体重链的核酸。因此,完整抗体的组合物可以包含去除所有K447残基的抗体群、未去除K447残基的抗体群、以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群。用于本发明抗体的合适天然序列Fc区域包括人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。首选的FcR是天然序列人类FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的FcR,包括这些受体的等位变体和选择性剪接形式,FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),其具有类似的氨基酸序列,主要在其细胞质结构域中不同。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM),参见M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。FcR的综述可见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991);Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994);以及deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他FcR,包括未来待被识别的FcR,包含在本文的术语“FcR”中。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn,其负责将母体IgG转移到胎儿。Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见例如,Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997);Ghetie等人,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997);Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004);WO 2004/92219(Hinton等人)。人FcRn高亲和力结合多肽在体内和血清中与FcRn结合的半衰期可以进行测定,例如在转基因小鼠或表达人FcRn的转染人类细胞系中测定,或在施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。也参见Shields等人,J.Biol.CHem.9(2):6591-6604(2001)。
“Fc片段”包含由二硫键结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区的序列决定,该区也被某些类型细胞上的Fc受体(FcR)识别。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由一个重链和一个轻链可变区结构域紧密非共价结合的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各有三个环),它们为抗原结合提供氨基酸残基,并赋予抗体抗原结合特异性。然而,即使是单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性HVR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力。
在指定位置(例如Fc区)的“氨基酸修饰”指代指定残基的取代或删除,或邻近指定残基插入至少一个氨基酸残基。“邻近”指定残基的插入意指在其一到两个残基内插入。插入可以是在指定残基的N端或C端。本文中优选的氨基酸修饰是取代。
术语“裸抗体”指代未与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换地用于指代基本完整形式的抗体,与抗体片段相反。具体而言,完整抗体包括具有重链和轻链的抗体,包括Fc区。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如,人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在某些情况下,完整抗体可能具有一个或多个效应功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选为完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双抗体;线性抗体(参见美国专利5,641,870,实施例2;Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]);单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,以及一个残余的“Fc”片段,这一名称反映了易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的,即具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段,其大致对应于两个二硫键连接的具有不同抗原结合活性的Fab片段,并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于,在CH1结构域的羧基末端有几个额外的残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'的命名。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生,在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”也简称为“sFv”或“scFv”,是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽连接体,其使sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述,参见Pluckthun,《单克隆抗体药理学(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,269-315页(1994)。本发明抗体的“功能片段”包含完整抗体的一部分,通常包括完整抗体的抗原结合或可变区,或者保留FcR结合能力或具有修饰的FcR结合能力的抗体的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”指代通过在VH和VL结构域之间构建具有短连接体(约5-10个残基)的sFv片段(见上段)制备的小抗体片段,以实现V结构域的链间而非链内配对,从而产生二价片段,即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体,其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细的描述于,例如,EP 404,097;WO 93/11161;Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源,只要它们表现出所需的生物活性。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合抗体,其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施方式中,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的HVR(下文定义)的残基被来自非人类物种(供体抗体)的HVR的残基取代,所述非人类物种诸如具有所需特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下,人类免疫球蛋白的骨架(“FR”)残基被相应的非人类残基替代。此外,人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修改以进一步改进抗体性能,诸如结合亲和力。一般而言,人源化抗体将包含至少一个(通常是两个)可变结构域的基本上全部,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环,并且所有或基本上所有的FR区域是人类免疫球蛋白序列的高变环,尽管FR区域可以包括一个或多个单独的FR残基取代以改善抗体性能,诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中这些氨基酸取代的数量在H链中通常不多于6个,在L链中不多于3个。人源化抗体还可选择地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常为人免疫球蛋白的恒定区。如需了解更多详细信息,参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见,例如,Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人类抗体”是具有与人类产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体,和/或使用本文所公开的任何制备人类抗体的技术制备的抗体。人类抗体的定义明确排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可以使用本领域已知的各种技术生产,包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,/.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人,J.Mol.Biol,222:581(1991)。用于制备人类单克隆抗体也可行的方法记载于Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)。人类抗体可以通过向转基因动物施用抗原来制备,该转基因动物经过基因修饰以响应于抗原引入而产生部分或完全人类抗体,但其内源性基因座已被禁用,例如,OmniAb治疗性抗体平台(Ligand Pharmaceuticals)、免疫异种小鼠(关于异种小鼠技术,,参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)等。关于通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体,还参见,例如,Li等人,Proc.Natl.Acad.Set USA,103:3557-3562(2006)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指代从基本上同质的抗体群体中获得的抗体,即,除了可能以少量存在的自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外,构成该群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同,每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除特异性之外,单克隆抗体的优势在于它们是通过杂交瘤培养合成的,不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表示抗体的性质是从基本上同质的抗体群体中获得的,不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如,根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备,包括例如杂交瘤法(例如,Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995);Harlow等人,《抗体:实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nded.1988);Hammerling等人,《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》563-681(Elsevier,N.Y.,1981)),重组DNA方法(参见,例如,美国专利号4,816,567),噬菌体展示技术(参见,例如,Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)),以及在具有部分或全部人类免疫球蛋白基因座或编码人类免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人类或类人类抗体的技术(参见,例如,Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993);Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
“亲和力成熟”抗体是指其一个或多个HVR中存在一个或多个改变的抗体,与不具有这些改变的亲本抗体相比,这些改变导致抗体对抗原的亲和力提高。在一个实施方式中,亲和力成熟抗体对目标抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟抗体通过本领域已知的过程产生。例如,Marks等人在Bio/Technology 10:779-783(1992)中描述了通过VH和VL结构域重排(shuffling)进行亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机突变如以下文献所述,例如,Barbas等人,Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier等人,Gene 169:147-155(1995);Yelton等人,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用,术语“特异性结合”或“对于……特异”指代可测量且可再现的相互作用,诸如靶标与抗体之间的结合,在包括生物分子在内的异质分子群存在的情况下,其对于靶标的存在是确定性的。例如,特异性结合至靶标(可以是表位)的抗体是与同其他靶标的结合相比,以更大亲和力、活动性(avidity)、更容易和/或时间更长的方式结合该靶标的抗体。
如本文所用,术语“免疫粘附素”指代组合异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应功能的抗体样分子。在结构上,免疫粘附素包括具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合,该氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即“异源”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可从任意免疫球蛋白获得,诸如IgG1、IgG2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物优选包括本文所述的多肽或抗体的结构域取代Ig分子内的至少一个可变区。在特别优选的实施方式中,免疫球蛋白融合物包括IgGl分子的铰链、CH2和CH3,或铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的生产,也参见1995年6月27日发布的美国专利号5,428,130。Ig-Fc和细胞表面受体的ECD的免疫粘附素组合有时被称为可溶性受体。
“阻断”抗体或“拮抗”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方式中,阻断抗体或拮抗抗体基本上或完全抑制抗原的表达或生物活性。例如,本发明的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段可以抑制TIGIT表达、阻断TIGIT与PVR的相互作用、阻断TIGIT与PVRL2的相互作用、阻断TIGIT与PVRL3的相互作用、抑制和/或阻断TIGIT与PVR结合介导的细胞内信号传导、抑制和/或阻断TIGIT结合PVRL2介导的细胞内信号传导、和/或抑制和/或阻断TIGIT结合PVRL3介导的细胞内信号传导。
“激动剂”或激活抗体是通过其结合的抗原增强或启动信号传导的抗体。在一些实施方式中,激动剂抗体在不存在天然配体的情况下引起或激活信号。
术语“交叉竞争”和“交叉阻断”在本文中可互换使用,意指抗体或其片段通过本发明抗体对其目标抗原的变构调节直接或间接干扰结合的能力。一种抗体或其片段能够干扰另一种抗体与靶标的结合的程度,以及因此其能否根据本发明称作交叉阻断或交叉竞争,可以使用竞争结合分析来确定。一种特别适合的定量交叉竞争分析使用基于FACS或基于AlphaScreen的方法来测量标记的(例如,His标记的、生物素标记的或放射性标记的)抗体或其片段与另一种抗体或其片段之间在其与靶点结合方面的竞争。一般而言,交叉竞争抗体或其片段例如是在交叉竞争分析中将结合到靶标的抗体或其片段,使得在分析期间以及在存在第二抗体或其片段的情况下,根据本发明的免疫球蛋白单一可变结构域或多肽的记录位移(例如,在基于FACS的竞争分析中)高达以一定数量存在的待测潜在交叉阻断抗体或其片段的最大理论位移(例如,需要被交叉阻断的冷(例如,未标记)抗体或其片段的位移)的100%。优选地,交叉竞争抗体或其片段具有在10%至100%之间的记录位移,更优选在50%至100%之间。
“双特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体,优选为人类或人源化抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上,双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达,其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983))。
“结合亲和力”通常指代分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,如本文所用,“结合亲和力”、“结合至”、或“结合到”指代反映结合对(例如,抗体Fab片段和抗原)的成员之间1对1相互作用的内在结合亲和力。分子X与其伴侣Y的亲和力通常可以用离解常数(KD)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量,包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常与抗原结合缓慢且易于解离,而高亲和力抗体通常与抗原结合更快且保持结合的时间更长。本领域已知多种测量结合亲和力的方法,其中任何一种都可用于本发明的目的。下面描述用于测量结合亲和力(即结合强度)的具体说明性和示例性实施方式。
根据本发明的“KD”或“KD值”可以通过使用抗体的Fab版本和抗原分子进行放射性标记抗原结合分析(RIA)来测量,或者通过使用BIACORE仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用表面等离子体共振分析来测量。
本文使用的术语“功能表位”指代对抗体的结合有能量贡献的抗原的氨基酸残基,即形成“能量表位”。将抗原的任何一个有能量贡献的残基突变为丙氨酸将破坏抗体的结合,但不会破坏抗原的折叠,使得抗体的相对KD比率(KD突变型TIGIT/KD野生型TIGIT)大于3.2,就ΔΔG而言,这相当于0.7kcal/mol。
本文使用的术语“构象表位”指代当多肽链折叠形成天然蛋白质时,在表面聚集的TIGIT抗原的氨基酸残基,并且在共晶体结构中的结合Fab中的氨基酸残基的3.8埃范围内。构象表位包含但不限于功能表位。
免疫系统相关定义
“免疫原性”指代物质激发免疫反应的能力。肿瘤具有免疫原性,增强肿瘤的免疫原性有助于通过免疫反应清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的实例包括但不限于利用免疫调节受体抑制剂的治疗。
本文使用的术语“疫苗”包括当接种到宿主时诱导针对特定病原体的保护性免疫的任何非致病性免疫原。疫苗可以采取多种形式。疫苗可以是与病原体共享重要抗原的完整生物体,但其本身不是致病性的(例如,牛痘)。疫苗也可以用灭活疫苗(例如,SaIk脊髓灰质炎疫苗)或减毒疫苗(失去产生疾病的能力,例如,Sabin脊髓灰质炎疫苗)制备。疫苗也可以从病原体分离的纯化大分子中制备。
“增强T细胞功能”意指诱导、导致或刺激T细胞以具有持续或放大的生物功能,或更新或重新激活耗竭或失活的T细胞。增强T细胞功能的实例包括:与干预前的水平相比,CD8+T细胞的γ-干扰素分泌增加、增殖增加、抗原反应性(例如,病毒、病原体或肿瘤清除)增加。在一个实施方式中,增强水平至少为50%,或者为60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
“T细胞功能障碍性疾病”是T细胞的疾病或病况,其特征在于对抗原刺激(例如,针对表达免疫原的肿瘤)的反应性降低。例如,T细胞功能障碍性疾病的特征可以是T细胞无能或分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活动的能力下降。反应性降低可能导致对表达免疫原的肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍性疾病包括肿瘤免疫和癌症。
在免疫功能障碍的上下文中,术语“功能障碍”指代对抗原刺激的免疫反应性降低的状态。该术语包括抗原识别可能发生但随后的免疫反应对控制感染或肿瘤生长无效的衰竭和/或无能两者的共同因素。
本文使用的术语“功能失调”还包括对抗原识别的难治性或无反应性,具体而言,将抗原识别转化为下游T细胞效应功能的能力受损,例如增殖、细胞因子生产(例如,IL-2)和/或靶细胞杀伤。
术语“无能”指代通过T细胞受体传递的信号不完整或不足导致的抗原刺激无反应状态(例如,在缺乏ras激活的情况下,细胞内Ca+2增加)。在共刺激缺失的情况下,抗原刺激也会导致T细胞无能,导致即使在共刺激的情况下,细胞对抗原的随后激活也变得不耐受。无反应状态通常可以被白细胞介素-2的存在覆盖。无能T细胞不进行克隆扩增和/或获得效应功能。
术语“衰竭”指代T细胞衰竭,作为一种T细胞功能障碍状态,由许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导引起。它与无能的区别在于,它不是通过不完整或缺陷的信号传导产生的,而是通过持续的信号传导产生的。其定义是效应功能差,抑制性受体持续表达,以及不同于功能性效应或记忆T细胞的转录状态。衰竭阻碍了对感染和肿瘤的最佳控制。衰竭既可由外在负性调节途径(例如,免疫调节细胞因子)引起,也可由细胞内在负性调节(共刺激)途径引起。
“肿瘤免疫”指代肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此,作为一种治疗概念,当这种逃逸被减弱,并且肿瘤被免疫系统识别和攻击时,肿瘤免疫被“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC指代一种细胞毒性形式,其中分泌的Ig结合在某些细胞毒性细胞(例如,自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FCR)上,使这些细胞毒性效应细胞与携带抗原的靶细胞特异性结合,然后利用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞,并通过这种机制杀死靶细胞。用于介导ADCC的原代细胞,NK细胞,仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页的表3中。为了评估关注分子的ADCC活性,可以进行体外ADCC分析,诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。作为替代或补充,可以在体内评估关注分子的ADCC活性,例如,在动物模型中,诸如Clynes等人,PNAS USA 95:652-656(1998)中所公开的动物模型。
“效应细胞”是表达一个或多个FCR并执行效应功能的白细胞。一方面,效应细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人类白细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源(例如血液)中分离。效应细胞通常是与效应期相关的淋巴细胞,其功能是产生细胞因子(辅助性T细胞)、杀死感染病原体的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“自身免疫性疾病”是由个体的自身组织或器官或其共同分离或表现或由其产生的疾病或障碍。自身免疫性疾病可以是器官特异性疾病(即,免疫反应特异性针对一个器官系统,诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝脏系统、肾脏系统、甲状腺、耳朵、神经肌肉系统、中枢神经系统等),或者是可以影响多器官系统的全身性疾病(例如,系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、多发性肌炎等)。
癌症相关定义
本文所用的“肿瘤”指代所有恶性或良性肿瘤细胞生长和增殖,以及所有癌前和癌变细胞和组织。术语“癌症”、“癌变”、“细胞增殖性疾病”、“增殖性疾病”和“肿瘤”在本文中并非相互排斥。
如本文所用,“癌症”和“癌变”指代或描述典型特征为无序细胞生长的哺乳动物中的生理状况。该定义包括良性和恶性肿瘤以及休眠态肿瘤或微转移。
如本文所用,“转移”意指癌症从其原发部位到身体其他部位的扩散。癌细胞可以脱离原发肿瘤,渗透到淋巴管和血管中,在血液中循环,并在身体其他部位的正常组织中的远处病灶生长(转移)。转移可以是局部的,也可以是远处的。转移是一个连续的过程,取决于从原发肿瘤脱离的肿瘤细胞,在血流中移动,并在远处位点停止。在新的位点,这些细胞建立血液供应并且可以生长以形成威胁生命的块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径两者都调节这种行为,并且肿瘤细胞和远处位点中的宿主细胞之间的相互作用也很重要。
如本文所用,“减少或抑制癌症复发”意指减少或抑制肿瘤或癌症复发或肿瘤或癌症进展。如本文所公开,癌症复发和/或癌症进展包括但不限于癌症转移。
如本文所用,“无进展生存期”(PFS)指代治疗期间和治疗后,被治疗的疾病(例如癌症)不会恶化的时间长度。无进展生存期可能包括患者经历完全缓解或部分缓解的时间,以及患者经历病情稳定的时间。
如本文所用,“总体缓解率”(ORR)指代完全缓解(CR)率和部分缓解(PR)率之和。
如本文所用,“总体存活率”指代一组个体在一段时间后可能存活的百分比。
如本文所用,“完全缓解”或“CR”指代所有靶病变的消失;“部分缓解”或“PR”指代靶病变的最大直径之和(SLD)至少减少30%,以基线SLD为参考;并且“病情稳定”或“SD”指代靶病变没有足够的缩小以符合PR标准,也没有足够的增加以符合PD标准,以自治疗开始以来的最小SLD为参考。
如本文所用,“进展性疾病”或“PD”指代靶病变的SLD至少增加20%,以自治疗开始或出现一个或多个新病变以来记录的最小SLD为参考。
制剂和药物递送相关定义
术语“药物制剂”指代处于允许活性成分的生物活性有效的形式且不包含对施用该制剂的受试者具有不可接受毒性的额外成分的制剂。这种制剂是无菌的。
“无菌”制剂是无菌的,或不含所有活的微生物及其孢子。
本文使用的术语“约”指代本技术领域技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。
短语“药学上可接受”表示物质或组合物必须在化学上和/或毒理学上与包含制剂的其他成分和/或用其治疗的个体相容。
“稳定”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的,并在以下文献中进行了综述:《肽和蛋白质药物递送(Peptide and Protein Drug Delivery)》,247-301,Vincent Lee编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.(1991);以及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。稳定性可以在选定的温度和选定的时间段内进行测量。为了快速筛选,制剂可以在40℃下保存2周至1个月,在此期间测量稳定性。如果制剂将在2-8℃下储存,通常制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月,和/或在2-8℃下稳定至少2年。如果制剂将在30℃下储存,通常制剂应在30℃下稳定至少2年和/或在40℃下稳定至少6个月。例如,储存期间的聚集程度可以用作蛋白质稳定性的指标。因此,“稳定”制剂可以是其中小于约10%,并且优选小于约5%的蛋白质作为聚集体存在于制剂中的制剂。
“重建的”制剂是通过将冻干蛋白质或抗体制剂溶解在稀释剂中以使得蛋白质充分分散而制备的制剂。重建的制剂适合于向待利用关注蛋白质治疗的患者施用(例如,皮下施用),并且在本发明的某些实施方式中,可以是适合于胃肠外或静脉内施用的制剂。
“等渗(isotonic)”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂通常具有约250至350mOsm的渗透压。术语“高渗(hypertonic)”描述渗透压高于人血液的制剂。相应地,术语“高渗(hypertonic)”用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如,可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性(isotonicity)。
“药学上可接受的”缓冲剂和盐包括从上述酸和碱的酸和碱加成盐两者中衍生的那些。具体的缓冲剂和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和醋酸盐。
本文所用的“药学上可接受的载体”指代在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或个体无毒的赋形剂。通常,药学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。医药上可接受的载体的实例包括缓冲液,例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇;成盐的反离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如吐温(Tween)、聚乙二醇(PEG)和Pluronics。
“包装说明书”指代通常包括在药物的商业包装中的说明书,其中包含有关适应症、用法、剂量、给药、禁忌症、与包装产品结合的其他药物,和/或有关使用此类药物的警告等信息。
其他定义
如本文所用,术语“治疗”指代设计为改变在临床病理过程中(例如,癌症或肿瘤免疫)被治疗的个体或细胞的自然病程的临床干预。理想的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、以及缓解或改善预后。例如,如果一个或多个与癌症相关的症状得到缓解或消除,包括但不限于减少(或破坏)癌变细胞的增殖,减少疾病引起的症状,提高疾病患者的生活质量,减少治疗疾病所需的其他药物的剂量,延缓疾病进展,和/或延长个体的生存期,该个体就被成功“治疗”。
如本文所用,“延缓疾病进展”意指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定和/或延迟疾病(例如癌症或肿瘤免疫)的发展。根据疾病史和/或正在接受治疗的个人,这种延缓可以具有各种时间长度。对于本领域技术人员来说显而易见的是,充分或显著的延缓实际上可以涵盖预防,因为那样个体不会发生疾病。例如,晚期癌症,诸如转移的发展可能被延缓。
“有效量”至少是引起可测量的疾病改善或预防所需的最低浓度。本文中的有效量可根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重,以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。有效量也是治疗的任何毒性或有害影响被治疗有益影响超过的量。对于预防性使用,有益或期望的结果包括消除或降低风险、减轻严重程度或延缓疾病的发病的结果,所述疾病的发病包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗用途,有益或期望的结果包括下列临床结果,诸如减少疾病引起的一个或多个症状,提高疾病患者的生活质量,减少治疗疾病所需的其他药物的剂量,通过诸如靶向增强其他药物的效果,延缓疾病进展,和/或延长生存期。在癌症或肿瘤的情况下,有效量的药物可能具有以下效果:减少癌细胞数量;缩小肿瘤大小;抑制(即,在一定程度上减缓或有意停止)癌细胞浸润到外周器官;抑制(即,在一定程度上减缓并有意停止)肿瘤转移;在某种程度上抑制肿瘤生长;和/或在某种程度上缓解与该疾病相关的一种或多种症状。有效量可以在一次或多次施用中施用。为本发明的目的,有效量的药物、化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的,药物、化合物或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物、化合物或药物组合物结合实现。因此,可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”,并且如果单一药剂与一种或多种其他药剂结合给予时可以实现或实现了期望的结果,则该单一药剂可以考虑为以有效量给予。
如本文所用,“联合使用”指代除了另一种治疗方式之外,还施用一种治疗方式。因此,“联合使用”指代在给个体施用另一种治疗方式之前、期间或之后,施用一种治疗方式。术语“结合使用”可在本文中互换使用。
如本文和所附权利要求中所使用,除非上下文另有明确规定,否则单数形式“一(a)”、“或(or)”和“所述(the)”包括复数的指代,
本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如,提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用,术语“个体”和“受试者”可以互换使用,并且指代哺乳动物,包括但不限于人类或非人类哺乳动物,诸如牛、马、犬、绵羊或猫。优选地,个体或受试者是人类。患者也是本文中的个体或受试者。
肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(%)和“同源性”定义为在对齐序列并引入间隙(如有必要)以实现最大百分比的序列同一性之后,候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比,并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。可以通过本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比的对齐,例如,使用公开可用的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2或ALIGN软件。本领域技术人员可以确定用于测量对齐的适当参数,包括在所比较的序列的整个长度上实现最大对齐所需的任何算法。
编码本文中的多肽和抗体的“分离的”核酸分子是从至少一个污染的核酸分子中识别和分离的核酸分子,该污染核酸分子通常与其所产生的环境相关联。优选地,分离的核酸不与与生产环境相关的所有组分相关联。编码本文中的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于在自然界中发现它的形式或环境。因此,分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文的多肽和抗体的核酸。
本文中使用的短语“实质性减少”或“实质性不同”表示两个数值(通常一个与分子相关,另一个与参考/比较分子相关)之间的足够高的差异程度,使得本领域技术人员在通过所述值(例如,KD值)测量的生物特性的上下文中将认为两个值之间的差异具有统计意义。所述两个值之间的差异作为参考/比较分子的值的函数,例如,大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%和/或大于约50%。
本文使用的术语“基本相似”或“基本相同”表示两个数值(例如,一个与本发明抗体相关,另一个与参考/比较抗体相关)之间的足够高的相似程度,使得本领域技术人员在通过所述值(例如,Kd值)测量的生物特性的上下文中将认为两个值之间的差异几乎或没有生物学和/或统计意义。所述两个值之间的差异作为参考/比较值的函数,例如,小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%和/或小于约10%。
“融合蛋白”和“融合多肽”指代具有共价连接在一起的两个部分的多肽,其中每一部分是具有不同性质的多肽。该性质可以是生物性质,诸如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质,例如与目标分子的结合、反应的催化等。两个部分可以通过单个肽键或通过肽连接物直接连接,但彼此处于阅读框架中。抗体融合蛋白的一个例子是bintrafusp alfa,它是一种能够与PD-L1和TGF-β结合的双功能分子。
术语“拮抗剂”以最广泛的意义使用,并且包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的天然多肽的生物活性的任何分子。以类似的方式,术语“激动剂”以最广泛的意义使用,并且包括模拟本文所公开的天然多肽的生物活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子具体包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、小有机分子等。识别多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以包含将多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触,并且测量通常与该多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。
术语“TIGIT拮抗剂”和“TIGIT活性或TIGIT表达的拮抗剂”可互换使用,并且指代通过减少编码TIGIT的核酸的转录或翻译,或者通过抑制或阻断TIGIT多肽活性,或者两者兼有,来干扰TIGIT正常功能的化合物。TIGIT拮抗剂的实例包括但不限于反义多核苷酸、干扰RNA、催化RNA、RNA-DNA嵌合体、TIGIT特异性适体、抗TIGIT抗体、抗TIGIT抗体的TIGIT结合片段、TIGIT结合小分子、TIGIT结合肽、以及特异性结合TIGIT的其他多肽(包括但不限于一个或多个TIGIT配体的TIGIT结合片段,可选择地融合到一个或多个附加结构域),使得TIGIT拮抗剂和TIGIT之间的相互作用导致TIGIT活性或表达的减少或停止。本领域普通技术人员应当理解,在某些情况下,TIGIT拮抗剂可拮抗一种TIGIT活性而不影响另一种TIGIT活性。例如,在本文的某些方法中使用的理想TIGIT拮抗剂是TIGIT拮抗剂,其响应于PVR相互作用、PVRL3相互作用或PVRL2相互作用中的一种而拮抗TIGIT活性,例如,不影响或最小程度地影响任何其他TIGIT相互作用。
附图说明
图1
图中示出竞争性ELISA评估抗TIGIT抗体阻断TIGIT与CD155结合的能力的结果。
图2
与人类TIGIT(灰色)结合的抗TIGIT Fab的晶体结构呈现,重链为黑色,轻链为浅灰色:A.3963H03;B.3966C11;C.3964A06;D.7729G05;E.7728B03;F.3963H03-12。
图3
Fab 3963H03-12的晶体结构呈现与TIGIT与PVR复合物的晶体结构呈现(ProteinData Bank条目3UDW)的叠加,示出3963H03-12与TIGIT上PVR的结合位点重叠。PVR的表面渲染为深灰色。3963H03-12的轻链显示为浅灰色,重链显示为深灰色。
图4
人类TIGIT ECD晶体结构,具有与3963H03接触的诱变残基,以棒状物示出。根据突变为丙氨酸或甘氨酸时结合亲和力的变化对残基进行着色。(深灰色:>3kcal/mol;中灰色>2kcal/mol;浅灰色<0.7kcal/mol)。
图5
示出抗TIGIT 3963H03-12与TIGIT突变体的动力学结合亲和力的总结。结合KD突出显示为突变时结合亲和力的丧失(ΔΔG)。突变导致结合能显著损失的位点以三种不同的阴影突出显示,表明损失的程度。强于KD=0.1nM的结合亲和力被报告为<0.1,因为它超出了仪器的测量范围。NB表示没有结合。如果进行了多于一次的实验,则报告标准偏差。
图6
为抗TIGIT 3963H03-12示出从动力学亲和力数据转换而来的与TIGIT突变体的结合亲和力的变化。结合亲和力ΔG由KD计算得出,公式为ΔG=ln(KD)*RT。结合亲和力的变化ΔΔG是突变体和亲本TIGIT之间结合亲和力的差异。如果任一变体的KD大于0.1nM,则不计算ΔΔG,并将其指示为ND(未确定)。
图7
图中示出使用表达人类TIGIT(A)或食蟹猴TIGIT(B)胞外结构域的CHO-S细胞进行基于细胞的结合分析的结果。在不同浓度下测试抗TIGIT抗体,并且通过流式细胞术测量结合。
图8
功能性TIGIT/CD155相互作用的阻断。通过基于细胞的Jurkat报告试验(PromegaCS198801),在一定范围浓度的抗TIGIT抗体或同型对照抗体的存在下,测量TIGIT/CD155相互作用的阻断。测试了序列优化的3963H03-12、亲本3963H03和同型对照。利用GraphPadPrism程序绘制数据、进行曲线拟合和EC50值计算。RLU,相对荧光素酶单位。
图9
图中示出抗TIGIT抗体3963H03和3963H03-12的ADCC活性,使用表达人类TIGIT胞外结构域的CHO-S细胞作为靶标。
图10
图中示出3963H03-12的补体依赖性细胞毒性(CDC),使用表达人TIGIT胞外结构域的51Cr标记的CHO-S细胞作为靶标。
图11
图中展示了抗TIGIT抗体A06、C11、D08、H03在使用抗CD3和抗CD28的T细胞活化试验中增强了IFNγ生产。
图12
图中展示了抗TIGIT H03抗体在使用抗CD3的CD8+T细胞活化试验中通过增加IFNγ生产逆转了CD155介导的CD8+T细胞抑制。
图13
图中展示了H03-12与人类(A)和食蟹猴(B)CD3+T细胞的结合。
图14
图中展示了H03-12在人类全血(A)和食蟹猴脾细胞(B)中的剂量依赖性靶点占有率。
图15
图中展示了H03-12剂量依赖性阻断TIGIT/CD155(A)和TIGIT/CD112(B)相互作用。
图16
图中展示了基于FRET的TIGIT/CD226阻断试验的设置(a),以及3963H03-12对于TIGIT/CD226相互作用的剂量依赖性抑制(B)。
图17
图中展示了双向MLR试验中3963H03-12的剂量依赖性活性。
图18
图中展示了单向MLR allo试验中3963H03-12的剂量依赖性活性。
图19
图中展示了在NK细胞介导的杀伤试验中,3963H03-12增强了NK细胞的激活,使用P815.hCD155细胞(A)和MDA-MB-231GFP/Luc细胞(B)。
图20
图中展示了3963H03-12和3963H03-12-muIgG2c对muCD155和muCD112与CHO-S-huTIGIT细胞的结合的阻断效力。
图21
3963H03-12-muIgG2c在B-huTIGIT基因敲入的MC38荷瘤小鼠中的药代动力学评价。
图22
图中展示了在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38结肠癌模型(A)、GL261胶质母细胞瘤模型(B)、Hepa 1-6肝细胞癌模型(C)和3LL肺癌模型(D)中3963H03-12-muIgG2c的抗肿瘤效果。
图23
图中展示了在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中,3963H03-12-muIgG2c的剂量依赖性抗肿瘤效果。除以天数表示的中位生存期之外,还绘制了每个治疗组的平均肿瘤体积和个体肿瘤体积。
图24
图中展示了在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38模型(A)或Hepa 1-6模型(B)中,有效应能力的3963H03-12-muIgG2c具有抗肿瘤效果,而无效应能力的3963H03-12-muIgG1(D265A)不具有抗肿瘤效果。
图25
图中示出在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中使用3963H03-12-muIgG2c和阿维鲁单抗联合治疗的结果,除以天数表示的中位生存期之外,还比较了每个治疗组的平均肿瘤体积和个体肿瘤体积。
图26
在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中使用3963H03-12-muIgG2c和bintrafusp alfa联合治疗的结果。与任一单一疗法相比,联合治疗的平均肿瘤体积和个体肿瘤体积均显示出增强的抗肿瘤效果。与任一单一疗法相比,联合治疗也观察到了延长的生存期。
图27
对MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠进行的再引入研究的结果,示出在使用3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp alfa的联合治疗之后的完全肿瘤消退。示出了未试验过的小鼠与治愈的小鼠相比的肿瘤体积。
实验部分
下面给出的工作实例旨在说明本发明的特定实施方式,而无意以任何方式限制说明书或权利要求书的范围。
1.抗体的选择和改进
为了产生针对TIGIT的全人单克隆抗体,使用多位点重复免疫策略(也称为RIMMS),利用人类TIGIT(Sino Biological Inc,目录号10917-H08H)的重组胞外结构域(ECD)免疫OmniRats(Open Monoclonal Technologies,Inc./Ligand PharmaceuticalInc.)。8至12周龄的大鼠每两周用重组TIGIT蛋白免疫六次,第一次注射用弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich,目录号F5881)乳化,其余注射用弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich,目录号F5506)乳化。通过针对ELISA的免疫原检测血清免疫反应。简言之,用人类TIGIT蛋白(SinoBiologic Inc,目录号10917-H08H)涂布96孔透明平底板(Thermo Scientific,目录号439454),在4℃下过夜。用PBS/0.05%吐温20清洗板,并用3%BSA(Sigma,目录号A3912-100G)在室温下孵育2小时。将连续稀释的血清样品加入板中,并在室温下孵育1小时。然后将板用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗鼠IgG Fc片段(JacksonImmunoResearch,目录号112-036-071)孵育1小时。使用100ul的四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)底物(BioFx,目录号TMBW-1000-01)显色,并通过添加50ul的2N硫酸(Sigma-Aldrich,目录号320501-500)停止显色。使用SpectraMax M5(Molecular Devices)读取450nm处的吸收。
从具有高血清免疫反应的免疫大鼠的血液和/或脾脏和/或淋巴结收集的淋巴细胞进行单个B细胞分选。简言之,将细胞与抗鼠CD32(克隆D34-485,BD Biosciences)一起孵育5分钟,然后与人类TIGIT蛋白(R&D,目录号7898-TG)在4℃下孵育1小时。然后清洗细胞,并用FITC缀合的小鼠抗鼠IgM(克隆MRM-47,Biolegend)、PE-Cy7缀合的小鼠抗鼠CD45R(克隆HIS 24,eBioscience)和APC缀合的小鼠抗His(克隆AD1.1.10R,R&D)抗体的混合物在4℃下孵育30分钟。在BD FACS Aria III流式细胞仪上,将单个TIGIT+B细胞分选到96孔板的每个孔中,每个孔板含有4ul裂解缓冲液(0.1M DTT,40U/ml RNA酶抑制剂,Invitrogen,目录号10777-019)。用Microseal‘F’薄膜(BioRad)将板密封,并立即在干冰上冷冻,然后在-80℃下储存。
从单个分选的B细胞中克隆Ig V基因,采用根据Tiller等人,2008,J Imm Methods329修订的方案进行。简言之,按照制造商的方案,在原96孔分选板中,使用无核酸酶水(Invitrogen,目录号AM9935),使用最终量/浓度为150ng的随机六聚体引物(pd(N)6,Applied Biosystems,P/N N808-0127)和50USuperscript III逆转录酶(Invitrogen,目录号18080-044),以14μl/孔的最终体积逆转录来自单个分选的B细胞的总RNA。引物(未列出)根据之前的出版物(Wardemann等人,Science 2003 301:1374-1377)进行修饰和/或通过检查(国际免疫遗传学信息系统,http://www.imgt.org;Lefranc等人,2009)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)数据库中已发表的Ig基因片段核苷酸序列进行设计。以3.5μl的cDNA为模板,通过两轮巢式(Igh、Igk和Igl)PCR分别扩增人Igh、Igk和Igl V基因转录本。按照制造商的方案,使用AccuPrime Taq DNA聚合酶高保真试剂盒(Invitrogen,目录号12346-094),在96孔板中以每孔40μl的总体积进行所有PCR反应。第一轮PCR在95℃下进行2分钟,然后在94℃下30秒、50℃下30秒、72℃下40秒,进行40个循环,最后在72℃下孵育5分钟。
巢式第二轮PCR用5μl未纯化的第一轮PCR产物在95℃下进行2分钟,然后在94℃下30秒、42℃下30秒、72℃下45秒,进行5个循环,然后在94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下45秒,进行50个循环,最后在72℃下孵育5分钟。PCR产物被克隆到IgG表达载体中,用于Ig表达和功能筛选。
用单细胞荧光激活细胞分选法分离了总共860个TIGIT+B细胞。从单个裂解的B细胞制备的cDNA中,PCR扩增免疫球蛋白VH和VL区。从388个B细胞裂解物中获得成对的VH和VL区,并克隆到IgG表达载体中用于表达、以及生化表征和DNA测序。
根据阻断CD155与TIGIT结合的效力以及与人类TIGIT和食蟹猴TIGIT两者结合的能力,选择命中优化的候选者。最初通过ELISA确定与TIGIT的结合,并通过FACS确定与TIGIT表达细胞的结合,然后通过Biacore进行定量。通过ELISA和流式细胞术分析,83个克隆被确定为人和食蟹猴TIGIT(Novoprotein cat.No.CP02)交叉反应性细胞结合物。其中30个克隆阻断了TIGIT:CD155相互作用。四个候选者3963H03、3964A06、3965D08和3966C11(也分别简称为H03、A06、D08和C11)符合预定义的配置,并且最终选择3963H03用于序列优化。序列优化的目标是用种系残基替代可变区框架中的非种系残基,并通过去除可能发生翻译后修饰的序列基序来提高可制造性。
3963H03的重链和轻链氨基酸序列如下:
重链:
EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:22)
轻链:
AIRLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:23)
酵母展示AFM和序列优化
对3963H03重链和轻链CDR3区域进行简约诱变并用于构建酵母展示文库,以获得亲和力成熟变体。初步构建了两个文库:(1)与亲本重链配对的诱变L3-CDR轻链文库;和(2)与亲本轻链配对的诱变H3-CDR重链文库。通过FACS对L3-CDR和H3-CDR文库分别进行两轮筛选,以选择信号高于表达亲本3963H03的酵母克隆的前5-10%的结合物(binder)。从上述选择所得的库中分离诱变的轻链和重链,并转化到酵母中以制备复杂性降低的新文库。由此,制作交配文库,并进行长达三轮的筛选,以通过FACS分离前1-0.1%的高亲和力结合物。选择并验证的具有更高亲和力的克隆被亚克隆到哺乳动物表达载体中,用于通过BIACORETM分析进一步验证亲和力。两个候选者7729G05和7728B03展现了皮摩尔KD范围内的与人类和食蟹猴TIGIT的亲和力,并被选作进一步研究。
通过对3963H03可变区序列的评估,在轻链可变区框架中识别了两个非种系氨基酸残基,并且在重链可变区框架中识别了两个非种系氨基酸。此外,在重链框架4内的一个蛋氨酸残基被识别为有可能随时间氧化,并且在轻链CDR3中识别了一个脱酰胺基序。基于这些分析,生成了一系列序列设计,其中潜在问题的氨基酸被替换为该位置的种系相关氨基酸,或者在种系蛋氨酸的情况下,被替换为生物物理上保守的亮氨酸。氨基酸取代如表1所示
表1 3963H03重链和轻链V区的氨基酸取代变体
指定为H03-12的序列优化变体,由VH1.03(E1Q、I2V、M117L,顺序编号)和VL1.02(A1D、R3Q、N92S,顺序编号)组成,其基于具有最有利的取代、在CHO细胞中的良好生产性以及在结合和功能测定中具有与亲本分子相当或更好的活性而被选择为首要候选者。
1.1通过NGS和SPR的变体识别
通过下一代测序技术(NGS)扩增了3963H03相关的B细胞序列。简言之,从用于克隆3963H03的同一淋巴结组织中,使用FACS通过批量分拣收集约5X105个TIGIT特异性B细胞和浆细胞。提取总RNA生成NGS文库。在cDNA合成后,使用IGVH7-4和IGKV1-9(与3963H03命中相关)基因特异性引物对3963H03特异性IgH和IgK B细胞V区序列进行RT-PCR分离;这些被亚克隆到IgG抗体的表达载体中。73个具有独特CDR序列的与3963H03相关的VH序列(表2)与3963H03的亲本轻链配对,并在Expi293F细胞中作为IgG表达。类似地,20个具有独特CDR序列的与3963H03相关的VK序列(表3)与3963H03的亲本重链配对,并在Expi293F细胞中作为IgG表达。收集这93个IgG以及39603H03亲本的培养上清液,以1:10稀释,并使用GEHealthcare Biacore 4000仪器通过表面等离子体共振(SPR)测量与人类TIGIT结合的动力学解离率(off-rate),如下所示。按照制造商描述的程序,使用直接偶联至游离氨基的方法,将山羊抗人Fc抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories,#109-005-098)首先固定在BIAcore羧甲基葡聚糖CM5芯片上。然后在CM5生物传感器芯片上捕获抗体。使用HBS-EP+电泳缓冲液进行结合测量。在25℃和30μl/min的流速下,注射起始浓度在100nM和10nM之间的his标记的人类TIGIT的两倍稀释系列。使用简单的1:1Langmuir结合模型(BiacoreEvaluation Software)计算解离率(koff,s-1)。测量的koff在表2和表3中示出,显示了新变体中的较慢和较快的koff。
1.2通过重链和轻链的成对相加性识别高亲和力变体。
我们假设koff增加或减少是成对相加的,如式1中数学上所示。
式1
根据式1,使用表2和表3中抗体的解离率预测变体重链或轻链与其他变体轻链或重链配对的活性。15个NGS识别的变体对被预测为具有改善的结合亲和力。表达了这15个变体,并通过SPR表征了动力学解离率。这些中的三个在3963H03的1.5倍范围内,而12个变体具有3963H03的2到4.7倍的改善的亲和力,如所预测的(表4)。总体而言,这一策略与之前的策略一起,允许对具有一系列活性的变体的识别,包括许多相对于初始命中的3963H03具有改善的解离率的变体,其中其序列被用作生成文库的探针。
表2通过NGS识别出73个与3963H03相关的具有独特CDR的VH序列。将其与3963H03的轻链配对,并测量koff。
表3通过NGS识别出20个与3963H03相关的具有独特CDR的VK序列。将其与3963H03的重链配对,并测量koff。
ID | HVR-H1 | HVR-H2 | HVR-H3 | koff(秒<sup>-1</sup>) |
3963H03 VK | QGISSY | AAS | QQLNSYPT | 6.3E-04 |
H03K02 | QGISSY | AAS | QQLNSYLT | 1.7E-03 |
H03K03 | QGISSY | AAS | QQLNGYLT | 2.5E-03 |
H03K04 | QAISSY | AAS | QQLNGYLT | 1.6E-03 |
H03K05 | QGISSY | AAS | QQLNNYLT | 2.0E-03 |
H03K06 | QGISSY | GAS | QQLNGYPT | 2.7E-04 |
H03K07 | QGISSY | GAS | QQLNSYPT | 3.4E-04 |
H03K08 | QVISSY | AAS | QQLNSYPT | 3.6E-04 |
H03K09 | QGISSY | AAS | QQLNSYPL | 5.6E-04 |
H03K10 | QGISSY | AAS | QQLNSYPP | 8.8E-04 |
H03K11 | QGISSY | AAS | QQLNGYPT | 2.8E-04 |
H03K12 | QGISSY | AAS | QQLNGSPT | 3.5E-04 |
H03K15 | QGISSS | AAS | QQLNSYPT | 3.4E-04 |
H03K24 | QGIPSY | AAS | QQLNSYPT | 3.6E-04 |
H03K25 | QAISSY | AAS | QQLNSYPT | 4.6E-04 |
H03K26 | QGISSY | AAS | QQPNGYLT | 4.2E-04 |
H03K29 | QGISTY | AAS | QQLNSYLT | 1.6E-03 |
H03K30 | QGINSY | AAS | QQLNSYPT | 3.4E-04 |
H03K31 | QAISSY | AAS | QQPNGYLT | 6.5E-04 |
H03K34 | QGISSY | AAS | QQLNSYPH | 6.1E-04 |
H03K35 | QGISSY | AAS | QQLNSYIT | 6.2E-04 |
表4通过NGS识别并预测具有较慢koff的与3963H03相关的VH和VK序列的新配对
2.生产和纯化
2.1生物生产、澄清和纯化
所公开的抗体H03-12是从CHO-K1SV细胞生产的。
3963H03-12重链:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:18)。
3963H03-12轻链:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLSSYPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:19)。
在37℃下,细胞在添加葡萄糖的专有CHO补料分批培养基中生长。在接种后第3、5、7和10天,用专有补料成分的混合物对培养物进行补料。
使用2.2m2 Millistak+Pod D0HC(Millipore MD0HC10FS1)和1.1m2 Millistak+Pod X0HC(Millipore#MX0HC01FS1)过滤器对来自生物反应器运行的粗调节培养基进行澄清,随后使用Millipore Opticap XL3 0.5/0.2μm过滤器(Millipore#KHGES03H3)进行终端过滤。
然后使用标准方法纯化抗体,并配制在10mM组氨酸、5mM蛋氨酸、8%海藻糖、pH5.5和0.05%吐温20中。
抗体可以储存在磷酸盐缓冲液中,调节pH值并用NaCl作为等渗剂。
3.生化和生物表征
3.1 Biacore结合亲和性和特异性
使用GE Healthcare Biacore 4000仪器和GE Healthcare Biacore T200仪器,通过表面等离子体共振(SPR)测量抗TIGIT命中候选抗体与人类TIGIT和食蟹猴TIGIT的结合亲和力,如下所示。按照制造商描述的程序,使用直接偶联至游离氨基的方法,将山羊抗人Fc抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories,#109-005-098)首先固定在BIAcore羧甲基葡聚糖CM5芯片上。然后在CM5生物传感器芯片上捕获抗体,以实现大约200响应单元(RU)。使用HBS-EP+电泳缓冲液进行结合测量。在25℃和30μl/min的流速下,注射起始浓度在100nM和10nM之间的His标记的人类TIGIT和食蟹猴(cyno)TIGIT蛋白的2倍稀释系列。使用简单的1:1Langmuir结合模型(Biacore Evaluation Software)计算结合率(kon,M-1s-1)和解离率(koff,s-1)。平衡解离常数(KD,M)计算为koff/kon的比率。候选者3963H03、3963H03-12、3964A06、3965D08和3966C11与人类TIGIT结合的亲和力范围为2.5至10nM,与cyno TIGIT结合的亲和力范围为0.8至8.7nM(表5)。
表5 OmniRat的抗TIGIT命中候选者的Biacore亲和性测量
1亲和性测量低于Biacore仪器的灵敏度(50pM)
表6a示出本文所述候选抗体的CDR序列。
表6a不同抗TIGIT候选者的抗TIGIT CDR
表6b示出与抗体H03-12相比在框架区序列中的差异。所有其他框架区氨基酸以及恒定区都与H03-12相对应。
表6b不同抗TIGIT候选者的抗TIGIT FR,与H03-12相比
完整的可变区序列如下所示:
A06-VH
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTAYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVYDYAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:24)
A06-VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:25)
C11-VH
EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTNAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYGGYDYAFDIWGQGTMVTVSS(SEQIN NO:26)
C11-VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPTFGGGTKLEIK(SEQIN NO:27)
H03-VH
EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:28)
H03-VL
AIRLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:29)
D08-VH
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTGYSGSYYWFDPWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
D08-VL
DIRLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYLTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:31)
B03-VH
QMQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTGGYSVDEYSFDIWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:32)
B03-VL
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQTIFRPTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:33)
G05-VH
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGFTVPEYAFDIWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:34)
G05-VL
DIRLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCGQVMRYPAFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:35)
3.2选择性
在ELISA EC50分析中,3963H03、3964A06、3965D08、3966C11及衍生物与相关家族成员蛋白CD226或无关蛋白PD-L1不具有可检测的结合。
为了更全面地评估选择性,Retrogenix Ltd.(High Peak,UK)使用专有的固定细胞微阵列技术筛选变体3963H03-12,以与主要包括细胞表面膜蛋白的5647个人类蛋白质的文库进行非靶向结合。该文库包括大多数已知的与TIGIT相关的免疫球蛋白超家族受体,诸如CD226、CD96、PVR和连接蛋白1-4。该研究分四个阶段进行:(1)预筛选以确定背景水平和筛选的最佳试验抗体浓度,(2)3963H03-12与表达5647个蛋白质的固定HEK293细胞的结合的初步筛选,(3)通过在HEK293细胞中重新表达假想命中并测试3963H03-12与固定细胞的结合,同时进行同型对照,而完成确认/特异性筛选,以及(4)通过在活HEK293细胞中表达特异性命中并通过流式细胞术分析与3963H03-12和同型对照的结合,进行进一步验证。
在初步筛选中识别了11种结合物,强度从很弱到强不等。在确认/特异性次级筛选中,所有11个都被确认为结合物。强结合物包括3963H03-12靶蛋白TIGIT。11种主要结合物中的6种也与一种对照抗体结合,并被归类为非特异性结合物。这些包括直接结合一级抗体Fc或二级抗体的Fcγ受体。其中一种结合物非常弱,太接近背景,无法认为具有显著性,剩下四种最终结合物:TIGIT(Genbank登录号NM_173799.3)、TMEM25同种型1(Genbank登录号NM_032780.3)、HAVCR2(Genbank登录号BC063431.1)和细胞周期蛋白素G相关激酶(GAK,Genbank登录号BC008668)。GAK是一种胞内蛋白,在活的HEK293细胞中表达时不与3963H03-12结合,因此无效。TMEM25同种型1和HAVCR2是跨膜蛋白,在固定细胞筛选中被评分为3963H03-12的弱结合物,随后显示在活转染细胞中显示具有低水平的相互作用,与结合到仅载体转染的HEK293细胞的3963H03-12相比,平均荧光分别高4.3倍和3.0倍。同型对照抗体与TMEM25同种型1和HAVCR2转染的HEK293细胞的结合强度略低于3963H03-12,与结合到仅载体转染的HEK293细胞的同型对照相比,平均荧光分别高1.4倍和1.9倍,这与利用胞内蛋白GAK转染的细胞的结合相似。相比之下,与仅载体转染的HEK293细胞相比,3963H03-12与TIGIT转染的HEK293细胞结合的平均荧光高130倍。
总之,这些结果显示3963H03-12选择性地与TIGIT结合。
3.3基于ELISA的TIGIT:CD155竞争试验
通过竞争ELISA确定抗TIGIT抗体和对照抗体与生物素化人TIGIT-Fc嵌合体与人CD155-Fc嵌合体结合的竞争能力。图1示出测试抗体的代表性竞争曲线。结果表明,抗TIGIT抗体3963H03、3964A06、3965D08、3966C11以0.8-1.2nM的IC50有效地阻断TIGIT与CD155的相互作用。
使用了以下试验方案:
1.用2.5μg/ml rhCD155 Fc(Sino Biologicals;目录号10109H02H)以50μl/孔涂布96孔板,并在4℃下孵育过夜。
2.用PBS、0.05%吐温、200μl/孔润洗3次。
3.在室温下,用200μl PBS中的1%BSA封闭孔1小时。
4.用PBS、0.05%吐温、200μl/孔润洗3次。
5.将75μl 1mg/ml人类TIGIT-Fc-生物素(R&D Systems,目录号7898-TG,于EMD-Serono生物素化)与75μl测试或对照抗体混合,以1:3稀释系列(166.7至0.08nM),并向每个重复孔中添加50μl。在室温下孵育2小时。
6.用PBS、0.05%吐温、200μl/孔润洗3次。
7.为了检测,以1:200稀释加入链霉亲和素-HRP缀合物(Millipore,目录号18-152),100μl/孔;并在室温下孵育30分钟。
8.用PBS、0.05%吐温、200μl/孔润洗3次。
9.加入1-StepTM Ultra TMB-ELISA底物溶液(ThermoFisher Scientific,目录号34028),100μl/孔,在室温下孵育1-2分钟。
10.向每孔加入100μl 2N硫酸。
11.在ELISA酶标仪上测量450nm和630nm处的OD。
3.4结构和功能TIGIT表位作图
a)TIGIT与本发明的Fab片段的共结晶
测定人TIGIT ECD和本发明抗体的各种Fab片段的复合物的晶体结构,以识别人TIGIT和抗体可变区之间的相互作用氨基酸。人TIGIT在大肠杆菌包涵体中表达、复性,并通过亲和层析和体积排阻色谱纯化。Fab片段与His标记在Expi293F细胞中用表达,并根据标准方法通过亲和层析纯化。形成TIGIT和每个Fab片段的1:1复合物,并通过凝胶过滤层析纯化,产生纯度大于95%的同质蛋白质复合物。浓缩含有该复合物的溶液,并应用高通量蒸汽扩散结晶筛选的标准技术。
将0.75μl蛋白质溶液(50mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl,24.57mg/mL)与0.5μl储液溶液(0.2M柠檬酸铵,pH 7.0,20%PEG 3350)和0.25μl种原液在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长3963H03 Fab与人TIGIT复合的晶体。将0.5μl蛋白质溶液(50mM Tris-HClpH 7.5,200mM NaCl,20.26mg/mL)与0.3μl储液溶液(0.15M柠檬酸钠,0.1M Bis-Tris 8.5,22%PEG 3350)和0.2μl种原液在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长3963H03-12 Fab与人TIGIT复合的晶体。将0.75μl蛋白质溶液(50mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl,18.66mg/mL)与0.5μl储液溶液(0.2M甲酸钠,20%PEG 3350)和0.25μl种原液在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长3964A06 Fab与人TIGIT复合的晶体。将0.5μl蛋白质溶液(50mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl,27mg/mL)与0.5μl储液溶液(16%PEG 4000,5%-10%异丙醇,0.1M Hepes,pH7.5)在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长3966C11 Fab与人TIGIT复合的晶体。将0.75μl蛋白质溶液(50mM Tris-HCl pH 7.5,200mM NaCl,22.35mg/mL)与0.5μl储液溶液(25%PEG 3350,0.1M Tris pH 8.5)和0.25μl种原液在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长7728B03 Fab与人TIGIT复合的晶体。将0.3μl蛋白质溶液(50mM Tris-HCl pH7.5,200mM NaCl,21mg/mL)与0.2μl储液溶液(0.1M磷酸盐/柠檬酸盐,40%v/v乙醇,5%w/vPEG 1000)和0.1μl种原液在20℃下混合,使用坐滴蒸气扩散法生长7729G05 Fab与人TIGIT复合的晶体。
晶体被闪冻并在100K的温度下测量。在SWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,瑞士)或Deutsches Elektronen-Synchrotron(Hamburg,德国)使用低温条件收集了X射线衍射数据。使用XDS程序处理数据。
通过使用人类TIGIT(PDB ID:3UCR)和Fab(内部结构)的结构作为搜索模型,使用Phaser版本2.5.7(McCoy,A.J.等人,J.Appl.Cryst.(2007).40,658-674)进行分子置换,解析复合物的结构。使用Buster版本2.11.6(Bricogne,G.等人,Buster version 2.11.6(2016)Cambridge,United Kingdom:Global Phasing Ltd.)对结构进行优化。包括最终蛋白质模型在内的所有模型都是使用COOT版本0.8.1(Emsley,P.和Cowtan,K.(2004).ActaCryst.D60,2126-2132)建立的。有关数据收集、数据处理、结构优化和结构质量的所有相关数据见表7和表8。
表7 TIGIT与Fab复合体的数据收集和处理统计
1 SWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,瑞士)
2 Deutsches Elektronen-Synchrotron(Hamburg,德国)
3括号内的值指代最高分辨率
6利用独立反射计算
1 SWISS LIGHT SOURCE(SLS,Villigen,瑞士)
2括号内的值指代最高分辨率
5利用独立反射计算
表8 TIGIT的优化统计1
1值由REFMAC5定义,无西格玛截止值
2测试集含有5%的测量反射
3衍射组分精度指数(DPI)是根据CRUICKSHANK,D.W.J.(1999)ACTA CRYST D55,583-601的式27计算的,其中σ(x,Bavg)=1.0(Ni/nobs)1/2C-1/3Rfreedmin
4与几何目标值的均方根偏差
5利用MOLPROBITY计算
1值由REFMAC5定义,无西格玛截止值
2测试集含有5%的测量反射
3衍射组分精度指数(DPI)是根据CRUICKSHANK,D.W.J.(1999)ACTA CRYST D55,583-601的式27计算的,其中σ(x,Bavg)=1.0(Ni/nobs)1/2C-1/3Rfreedmin
4与几何目标值的均方根偏差
5利用MOLPROBITY计算
与TIGIT ECD复合的抗TIGIT抗体3963H03、3963H03-12、3966C11、3964A06、7729G05和7728B03的Fab格式的结构分别以2.41、2.87、1.73、1.6、1.9和的分辨率进行解析。
这些复合物具有几乎相同的折叠,如图2所示,在抗原和抗体可变区的非氢原子上的平均RMSD为结构显示每个Fab结合到TIGIT上的一个区,将在空间上干扰PVR结合。实际上,图3提供了TIGIT:3963H03-12共晶体结构与现有的TIGIT:PVR共晶体结构(ProteinData Bank条目3UDW)的叠加,显示了PVR和Fab的显著重叠。
人TIGIT-ECD与抗TIGIT-Fab复合物的晶体结构用于识别TIGIT上抗TIGIT-Fabs的表位。接触残基定义为具有在Fab的非氢原子3.8埃范围内的非氢原子的TIGIT的残基。使用BioPython软件包从最终晶体坐标测量距离。每个晶体结构的不对称单元的所有复合物中存在的接触报告于表9。FAB在TIGIT上的相互作用表面由几个连续和不连续(即非连续)序列形成:即残基Met23、Thr51、Ala52、Gln53、Thr55、Gln56、Asn70、Ala71、Asp72、His111、Thr112、Tyr113、Pro114、Asp115、Gly116或Thr117,详见表9。这些残基形成由本发明中所述的抗TIGIT Fabs识别的示例性三维构象表位。
表9每个晶体结构的不对称单元的所有复合物中存在的接触。人TIGIT与本发明所述抗体的抗原结合区之间的相互作用。抗体残基根据其线性氨基酸序列进行编号。标记了相应的链(重链为“H”,轻链为“L”)。此处所示的TIGIT残基在抗体的非氢原子3.8埃范围内具有至少一个非氢原子。
b)诱变
通过将选定的残基突变为丙氨酸来评估TIGIT ECD上的接触残基对抗TIGIT抗体结合能的贡献。亲本残基为丙氨酸或脯氨酸的位置被甘氨酸取代。突变后结合能的损失表明亲本残基对结合的重要性。总共设计了11个带有点突变为丙氨酸或甘氨酸的人类TIGIT变体。突变体在大肠杆菌中表达,并用亲和层析和体积排阻色谱纯化。利用表面等离子体共振(SPR)表征抗体3963H03-12的结合动力学。结合热点或对结合能贡献最大的残基(Wells.J.A.,PNAS 93,1-6,1996)被确定为在100nM抗原不满足阈值结合信号的那些。此外,还测定了抗体对野生型和每个突变体的亲和力,并用于计算每个表位残基对结合能的贡献。
图4示出TIGIT ECD结构的图,其中诱变残基以棒状物显示,并根据亲和力的变化进行着色。此外,结果总结于下表10,其中11个TIGIT点突变与野生型TIGIT抗原进行了抗体结合比较。SPR(Biacore)用于进行动力学研究,以确定动力学速率常数(ka和kd)。简言之,将羊多克隆抗人Fc抗体化学偶联至CM5芯片。接下来注射3963H03-12抗体,并用多克隆抗体捕获。使用缓冲液洗出未结合的抗体,直到基线RU稳定。接下来以固定浓度注射抗原(野生型或突变型人类TIGIT ECD)3分钟,并记录结合。再注射缓冲液3分钟,观察到解离。抗原注射浓度为100nM、50nM、25nM、12.5nM和6.25nM。在每个循环之间,用低pH缓冲液再生芯片,并在注射下一浓度抗原之前捕获新鲜的3963H03-12。速率常数是通过最小化卡方检验的算法将数据迭代拟合到1:1的结合模型来确定的。平衡解离常数(KD)计算为动力学常数之比,并且突变体相对于野生型TIGIT的结合吉布斯自由能变化(ΔΔGmut)由野生型与突变体KD之比得出。自由能变化根据抗体-抗原结合的失稳作用(destabilization)突出显示;“**”:>3kcal/mol失稳作用(结合热点);“*”:>0.7kcal/mol。根据此分析,标记有“**”或“*”的氨基酸是功能表位的一部分。NB表示没有结合。给出了野生型和突变型蛋白质荧光监测热变性的温度中点。野生型TIGIT及其所有突变体在体积排阻色谱(SEC)上显示为单分散。对于KD,在n>1时给出了平均值和标准差。
表10通过分析3963H03-12与TIGIT突变体的结合亲和力进行表位定位
重要的是确认Q53A、T55A、Y113A和P114G点突变体与3963H03-12结合的缺失确实是由于热点残基的丢失,而不是抗原的整体去折叠。使用荧光监测的热去折叠分析确定突变蛋白质的结构完整性,在该分析中,蛋白质与在水溶液中淬灭但被暴露的疏水残基结合时发出荧光的染料一起孵育。随着温度的升高,蛋白质的热变性暴露出疏水核心残基,这可以通过染料荧光的增加来监测。数据用式2(改编自Bullock,A.N.等人,Thermodynamicstability of wild-type and mutant p53 core domain.PNAS 94,14338-14342(1997))拟合以确定曲线拐点(T1/2)处的温度。
式2
Q53A、T55A、Y113A和P114G的突变体表现出抗原的最小失稳作用,这由荧光监测的去折叠的T1/2略有下降所表明(表10)。这证实了Q53、T55、Y113和P114是3963H03-12的真正的结合热点。也通过这种方法证实了大多数其他突变蛋白的结构完整性(表10)。大多数突变蛋白在分析性体积排阻色谱上的表现与野生型相似,这一观察结果为突变抗原蛋白的天然结构提供了进一步的支持。
3.5通过直接FACS结合试验测量EC50
通过流式细胞术证实了3963H03与细胞表面靶点的剂量依赖性结合能力。它以4.7nM的EC50与CHO-S细胞表面表达的人类TIGIT ECD有效结合,以3.6nM的EC50与CHO-S细胞表面表达的食蟹猴TIGIT ECD有效结合(表11和图8)。这些分析定性地描述了抗TIGIT抗体的剂量依赖性结合特征。
表11通过流式细胞术测量的抗TIGIT抗体与表达人TIGIT-ECD或食蟹猴TIGIT-ECD的细胞的EC50结合
3.6 TIGIT Jurkat报告试验
使用制造商提供的方案,对3963H03及其序列优化变体3963H03-12在基于细胞的TIGIT/CD155 Blockade Bioassay(Promega,目录号CS198801)中进行了测试。该试验包含表达带有由IL2启动子驱动的荧光素酶报告基因的重组人TIGIT的人Jurkat细胞,与表达人CD155的CHO-K1细胞和T细胞受体激活剂共同培养。克隆命中3963H03及其序列优化变异体3963H03-12(用IgG1和kappa恒定区格式化)的B细胞具有相似的EC50,范围为6.3至12.5ug/ml(图8和表12)。
表12序列优化和亲和力成熟的抗TIGIT抗体变体的基于细胞的TIGIT/CD155Blockade试验
3.7抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
使用稳定转染的CHO-S-hTIGIT靶细胞和带有杂合FcγRIIIa 158V/158F同种异型的供体效应细胞,使用标准铬释放试验,检测抗TIGIT 3963H03及其序列优化变异体3963H03-12的ADCC活性。简言之,CHO-S-hTIGIT细胞首先用51Cr标记45分钟,然后在37℃下用4倍系列稀释的抗TIGIT抗体在33nM的起始浓度下孵育15分钟。以1:100的比例加入效应细胞,并在37℃下孵育4小时。将细胞转移至Lumaplate 96孔干板,干燥过夜,并使用伽马计数器测量放射性。溶解百分比计算为:((计数-Spont)/(100%溶解-Spont))x100的比率,其中Spont是单独使用CHO-S-hTIGIT细胞(在没有抗体和效应细胞的情况下)计数的放射性,并且100%溶解是通过使用洗涤剂溶解CHO-S-hTIGIT细胞计算的。所示的示例分析是使用来自带有同种异型V/F的三个供体的效应细胞进行的。在该示例分析中测试的两种抗体均诱导CHO-S-hTIGIT靶细胞的ADCC,EC50范围为0.026至0.1nM(表13),并且类似的最大细胞裂解百分比大约为20-30%(图9)。
表13抗TIGIT抗体的ADCC活性,EC50(nM)
3.8补体依赖性细胞毒性(CDC)活性
对于CDC分析,CHO-S-人类TIGIT ECD细胞首先用51Cr标记45分钟,然后在37℃下用4倍系列稀释的抗TIGIT抗体在20,000ng/ml的起始浓度下孵育15分钟。以1:10的稀释度添加预先CDC合格的正常人血清补体,并在37℃下孵育2小时。将细胞转移至Lumaplate 96孔计数板,干燥过夜,并使用MicroBeta2计数器(Perkin Elmer)测量放射性。溶解百分比计算为:((计数-Spont)/(100%溶解-Spont))x100的比率,其中Spont是单独使用CHO-S-huTIGIT细胞(在没有抗体和补体的情况下)计数的放射性,并且100%溶解是通过使用洗涤剂溶解标记的CHO-S-人类TIGIT ECD细胞计算的。图10显示了使用CHO-S-human TIGIT ECD靶细胞和3963H03-12进行的分析,表明该抗体能够介导CDC活性。
3.9 T细胞激活试验
当用抗CD3和抗CD28抗体处理时,人PBMC中的T细胞被激活。拮抗性抗TIGIT抗体的联合治疗可以阻断TIGIT抑制信号传导,并且作为结果,可能潜在地进一步增强T细胞的激活,通过IFNγ的生产来测量。用0.5ng/ml抗CD3OKT3和20ng/ml抗CD28,在抗TIGIT抗体或人IgG1同型对照(20μg/ml)的存在下,刺激人PBMC 48小时。通过ELISA测量培养上清中的IFN-γ。检测了来自4个不同供体(1003、1579、1059、1558)的PBMC。抗TIGIT抗体(A06、C11、D08、H03)增强了IFNγ生产,如图11所示。与A06、C11和D08相比,抗TIGIT H03更能持续增强IFNγ生产。
3.10 CD8+T细胞拮抗性试验
CD155与TIGIT的结合触发了向CD8+T细胞的抑制性信号传导,并且利用拮抗性抗TIGIT抗体的联合治疗可以阻断TIGIT/CD155相互作用,并且作为结果增强T细胞的激活,通过IFNγ的生产来测量。用抗CD3(OKT3,2μg/ml)和重组CD155 Fc(2μg/ml)共涂布将96孔细胞培养板。加入新鲜分离的人CD8+T细胞,并在10μg/ml可溶性抗TIGIT抗体或人IgG1同型对照的存在下培养4天。通过ELISA测量上清液中的IFNγ生产。抗TIGIT 3963H03逆转了CD155介导的T细胞抑制,并且作为结果,增加了IFNγ生产,如图12所示。
3.11原代细胞结合试验
通过流式细胞术测定3963H03-12与在人和食蟹猴原代T细胞表面表达的TIGIT结合的能力。用3963H03-12的系列稀释液(1:3)孵育人或食蟹猴PBMC,并且用抗hIgG APC(1:1000)检测抗TIGIT抗体与CD3+T细胞的结合。使用BD-Calibur进行流式细胞术分析。对CD3+T细胞进行门控,并测定亲本群体的平均荧光强度(MFI)和APC染色百分比。3963H03-12以剂量依赖性方式与原代人和食蟹猴T细胞结合,EC50分别为85.2±28.8ng/mL(0.6±0.2nM)和132.2±29.2ng/mL(0.8±0.2nM),如图13所示。
3.12靶点占有率(TO)分析
使用人全血和食蟹猴脾细胞,通过流式细胞术测量抗TIGIT 3963H03-12在CD3+T细胞上的靶点占有率。将系列稀释的抗TIGIT与人或食蟹猴样品一起孵育1小时,并使用生物素化抗TIGIT(3963H03-12)通过流式细胞术测量CD3+原代T细胞上未被占据的TIGIT。使用BD-Calibur门控在CD3+细胞上进行流式细胞术分析,分析如下。使用以下公式计算靶点占有率(TO%),TO(%)=(1-(Dt-Ct)/(D0-C0))*100,其中Dt=TIGIT染色的百分比,Ct=在一定浓度的抗TIGIT下的同型对照染色的百分比,D0=TIGIT染色的百分比,并且C0=无TIGIT时同型对照染色的百分比。显示了3963H03-12在人(图14A)和食蟹猴(图14B)T细胞上均能有效饱和靶点。来自9个人类供体的平均EC50为239.8±168.04ng/mL(1.6±1.1nM),并且来自6个食蟹猴供体的平均EC50为92.7±21.6ng/mL(0.6±0.1nM)。
3.13基于细胞的TIGIT/CD155和TIGIT/CD112阻断试验
为了评估抗TIGIT 3963H03-12阻断TIGIT与其配体CD155和CD112相互作用的能力,使用稳定表达人TIGIT的CHO-S工程化细胞(CHO-S-hTIGIT细胞系#4-60)进行阻断试验。在加入生物素化的人CD112-Fc或人CD155-Fc(最终浓度2μg/mL)之前,用3963H03-12的系列稀释液(1:3)孵育CHO-S-人TIGIT细胞。通过链霉亲和素-APC(1:1000)检测CD155/TIGIT或CD112/TIGIT的相互作用。3963H03-12剂量依赖性地阻断TIGIT与CD155(图15A)和CD112(图15B)的相互作用,IC50分别为165.0±39.7ng/mL(1.1±0.3nM)和410.6±315.5ng/mL(2.8±2.1nM)。
3.14基于细胞的TIGIT/CD226阻断试验
细胞表面表达的TIGIT受体与CD226相互作用并破坏对于CD226刺激功能重要的CD226同源二聚体。用3963H03-12阻断减少CD226和TIGIT的相互作用,并可能通过CD226导致共刺激信号传导增加。FRET分析旨在测量TIGIT和CD226之间的相互作用,以及3963H03-12对这种相互作用的影响(图16A)。CHO-CD226细胞是通过使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000-015)用CD226/SNAP标记质粒转染CHO细胞,然后用250μg/ml潮霉素B(Invitrogen,10687010)选择稳定表达CD226的细胞而生成的。接种在白色96孔板(GreinerBio One,655083)上的CHO-CD226细胞,使用Lipofectamine 3000用0.1μg/孔TIGIT/HA标记质粒转染,并与3963H03-12或同型对照抗体在10、1和0.1μg/ml浓度下孵育24小时。之后,用Tag-lite标记培养基(Cisbio,7SEC30K)清洗细胞,然后在37℃-5%CO2培养箱中用1μMSNAP-Red受体(Cisbio,SSNPREDE)染色1小时。接下来,将细胞洗涤三次,并在室温下与1.6nM抗HA-TB穴状物供体(Cisbio,610HATTA)孵育2小时。使用Envision酶标仪(PerkinElmer,Xcite Multilabel Reader)在320nm激发和60μs延迟后,在665nm和615nm处记录150μs的FRET信号。FRET强度计算为:(TIGIT转染细胞的665nm发射/615nm发射)-(模拟转染细胞的665nm发射/615nm发射)。以同型对照归一化的FRET百分比计算为:(用抗TIGIT抗体阻断的TIGIT转染的Cho.CD226细胞的FRET强度)/(用同型对照抗体阻断的TIGIT转染的Cho.CD226细胞的FRET强度)*100。通过3963H03-12测量TIGIT和CD226相互作用得到的FRET信号抑制的定量表明,3963H03-12阻断了TIGIT/CD226相互作用(图16B)。
3.15同种异型双向MLR(混合淋巴细胞反应)试验
在使用来自两个无关供体的PBMC进行的双向MLR试验中,应答者(效应T细胞)在两个供体中响应于应答细胞和刺激(靶)细胞之间的主要组织相容性抗原(MHC I和II类)的差异,进行激活和增殖。与功能性拮抗剂检查点抑制剂(CPI)抗体的联合治疗进一步增强T细胞激活,通过IFNγ的生产来测量。来自两个不同人类供体的PBMC以1:1的比例共同培养,并用3963H03-12或同型对照的连续稀释液处理2天。通过测量上清液中的IFN-γ来评估免疫细胞激活。将7对不同供体的7次试验结果以设为1的1ng/mL同型对照的倍率变化绘制在一起。3963H03-12剂量依赖性地增强IFN-γ生产,EC50为158.9±185.0ng/mL(1.1±1.2nM)(图17)。
3.16同种异型单向MLR(混合淋巴细胞反应)试验
在使用来自两个无关供体的细胞进行的单向MLR试验中,应答(效应T)细胞响应于应答细胞和刺激(靶)细胞之间的主要组织相容性抗原(MHC I和II类)的差异,进行激活和增殖。与功能性拮抗剂检查点抑制剂(CPI)抗体的联合治疗进一步增强T细胞激活,通过IFNγ的生产来测量。将辐照后的MDA-MB-231肿瘤细胞与来自人类供体的PBMC共同培养7天,使用IL-2(R&DSystems,IL-010)诱导同种异型反应性T细胞扩增。然后收集这些细胞(效应细胞),并以2:1E:T的比例与新照射的MDA-MB-231细胞(靶细胞)共同培养,并用抗TIGIT和/或抗PD-L1(阿维鲁单抗)抗体共同处理。通过测量上清液中的IFN-γ来评估T细胞激活。用3963H03-12或同型对照的连续稀释液处理共同培养的细胞。将两次试验的结果以设为1的1ng/mL同型对照的倍率变化绘制在一起。3963H03-12剂量依赖性增强同种异型(Allo)抗原特异性T细胞激活,EC50为136.9±114.6ng/mL(0.9±0.8nM)(图18)。对于组合研究,共同培养的细胞用阿维鲁单抗的系列稀释和10μg/mL的同型对照或H03-12处理。H03-12与阿维鲁单抗的组合进一步增强了IFNγ生产(图19B)。
3.17 NK细胞杀伤试验
通过使用经修饰表达人CD155的P815细胞系,证实了3963H03-12通过阻断TIGIT/CD155相互作用增强NK介导的肿瘤细胞杀伤的能力。将NK细胞与P815.hCD155细胞在10μg/mL 3963H03-12或IgG1同型对照抗体存在下共同培养。通过使用IncuCyte系统测量绿色信号(Caspase-3/7)4.5小时来监测肿瘤细胞死亡。在四个区域监测细胞杀伤情况,IgG1对照组和抗TIGIT抗体治疗组之间的双向ANOVA比较的p值为:p<0.00005(****)。与同型对照组相比,3963H03-12使肿瘤细胞杀伤率提高了2倍(图19A)。使用表达GFP报告物的乳腺癌MDA-MB-231细胞系进一步证明了抗TIGIT H03-12增强NK介导的肿瘤细胞杀伤的能力。将NK细胞与MDA-MB-231GFP/Luc细胞在10μg/mL抗TIGIT H03-12或IgG1对照抗体存在下共同培养。通过使用IncuCyte系统测量GFP信号来监测肿瘤细胞杀伤。将每个时间点的GFP信号归一化至0时间点。在四个区域监测细胞杀伤情况,IgG1对照组和抗TIGIT H03-12抗体组之间的双向ANOVA比较的p值为:p<0.00005(****),p<0.005(**)。从2.5到12.5小时,检测到抗TIGITH03-12导致NK介导的肿瘤细胞死亡显著增加(图19B)。
4.体内活性
4.1 3963H03-12和3963H03-12-muIgG2c对小鼠CD155(muCD155)和小鼠CD112(muCD112)与CHO-s-huTIGIT细胞结合的阻断试验
为了评估3963H03-12在体内的效力,开发了带有小鼠免疫球蛋白的3963H03-12版本(3963H03-12-muIgG2c)。
3963H03-12-muIgG2c和3963H03-12阻断TIGIT与其配体muCD155和muCD112相互作用的能力,通过使用稳定表达人TIGIT的CHO-S工程细胞(CHO-S-hTIGIT细胞系)进行的基于流式细胞术的结合试验进行评估。与3963H03-12-muIgG2c和3963H03-12预孵育,但不是同型对照,导致muCD155Fc与CHO-hTIGIT细胞的结合减少。3963H03-12-muIgG2c和3963H03-12均以剂量依赖性方式阻断TIGIT与muCD155的相互作用,IC50分别为290.7ng/mL(1.994nM)和499.3ng/mL(3.450nM)(图22)。3963H03-12-muIgG2c和3963H03-12也都以剂量依赖性方式阻断TIGIT与muCD112的相互作用,IC50分别为1189ng/mL(8.155nM)和1678ng/mL(11.593nM)(图20)。
4.2 3963H03-12-muIgG2c在B-huTIGIT基因敲入(knock-in)的MC38荷瘤小鼠中的药代动力学评价
在由Biocytogen开发的MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中测量3963H03-12-muIgG2c的PK。在此模型中,通过极端基因组编辑(EGE)将小鼠TIGIT替换为人类TIGIT。对于所有剂量组,在单次腹腔给药后,在24小时内测量3963H03-12-muIgG2c峰值血浆浓度。Cmax之后,在三个剂量组中观察到不同的PK曲线。在高剂量组中观察到缓慢单相消除,而在低剂量组中观察到快速单相消除。在中剂量组中观察到双相消除,在168小时内浓度缓慢下降,随后直到最后的可量化时间点(336小时)快速下降。根据PK曲线,低剂量组和中剂量组的计算终点半衰期相当,高剂量组的计算终点半衰期较长。与剂量从0.25mg/kg到25mg/kg成比例增加相比,AUC 0-∞增加的更高,AUC 0-∞比值为1.0:26.8:334,而实际剂量比为1:10:100。从2.5mg/kg到25mg/kg,增加量大致与剂量成比例,其中AUC 0-∞比率为1.0:15.0,而实际剂量比率为1:10(图21)。
4.3 3963H03-12-muIgG2c在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38、GL261、Hepa 1-6和3LL肿瘤模型中的抗肿瘤效果
在B-hTIGIT基因敲入小鼠(C57BL/6背景)中评估3963H03-12-muIgG2c的抗肿瘤效果。10周大的雌性B-huTIGIT基因敲入小鼠由Biocytogen提供。将结肠癌细胞系MC38、多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系GL261、肝细胞癌(HCC)细胞系Hepa 1-6和肺癌细胞系3LL皮下接种于右上腹侧。接种细胞量分别为1x10e6、5x10e6、2x10e6和5x10e6。
当肿瘤尺寸达到50-100mm3时,在第0天、第7天、第14天通过腹腔注射向荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠以25mg/kg的剂量给药3963H03-12-muIgG2c和抗HEL-muIgG2c。每周两次使用卡尺测量肿瘤三维大小,体积用mm3表示,公式为:宽x长x高x 0.5236。%TGI如下式所定义:TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100;Ti是治疗组在给定日期的平均肿瘤体积,T0是治疗组在治疗第一天的平均肿瘤体积,Vi是与Ti同一天的溶媒对照组的平均肿瘤体积,V0是溶媒组在治疗第一天的平均肿瘤体积。进行双向ANOVA用于显著性分析。
结果在图22中示出。与抗HEL同型对照(与鸡蛋溶菌酶结合)相比,3963H03-12-muIgG2c的TGI在MC38结肠癌中为63.5%(p<0.0001),在GL261GBM中为85.3%(p<0.0001),在Hepa 1-6肝癌中为85.7%(p<0.0001),在3LL肺癌中为41.5%(p=0.0034)。综上所述,这些数据表明3963H03-12-muIgG2c在多种肿瘤模型中显示出抗肿瘤效果,表明在广泛的适应症中具有抗肿瘤效果。
4.4 3963H03-12-muIgG2c在B-huTIGIT基因敲入小鼠MC38肿瘤模型中的剂量依赖性抗肿瘤效果
使用B-huTIGIT基因敲入小鼠评估3963H03-12-muIgG2c的抗肿瘤效果。为了优化最佳治疗剂量,在第0天、第7天、第14天通过腹腔注射向MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠以25、5、1或0.2mg/kg的剂量给药3963H03-12-muIgG2c。肿瘤接种和肿瘤大小测量方法与第4.3节所述相同。
与抗HEL同型对照相比,25mg/kg、5mg/kg和1mg/kg剂量的3963H03-12-muIgG2c诱导了显著的肿瘤生长抑制(分别为TGI=63.5%、41%和42.3%,三组中的每一组P<0.0001,第30天),并与同型对照(31.5天)相比延长了中位生存期(分别为42、37和38.5天)。相反,与同型对照相比,0.2mg/kg的3963H03-12-muIgG2c没有显示出显著的肿瘤生长抑制(TGI=17.6%,P>0.05,第30天)(图23)。
尽管以5mg/kg 3963H03-12-muIgG2c治疗的小鼠与以1mg/kg治疗的小鼠之间在肿瘤体积上没有显著差异(P>0.05,第30天),但是与0.2mg/kg剂量3963H03-12-muIgG2c相比,5mg/kg和1mg/kg剂量两者的肿瘤体积显著减小(分别为P=0.0075和P=0.0039,第30天)。与5mg/kg或1mg/kg剂量相比,25mg/kg的3963H03-12-muIgG2c也显著减小了肿瘤体积(分别为P=0.0118和P=0.0211,第30天)。综上所述,这些数据表明3963H03-12-muIgG2c在这个肿瘤模型中具有剂量依赖性抗肿瘤效果。
4.5抗体Fc介导的效应功能对3963H03-12抗肿瘤效应的贡献
在MC38和Hepa 1-6荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中比较3963H03-12-muIgG2c和3963H03-12-muIgG1(D265A)的抗肿瘤活性。10周大的雌性B-huTIGIT基因敲入小鼠由Biocytogen提供。每只小鼠在右腹侧皮下接种(sc)0.1mL PBS中的MC38肿瘤细胞(1x 10e6)或0.1mL PBS中的Hepa 1-6肿瘤细胞(5x 10e6),用于肿瘤生成。当平均肿瘤体积达到大约50mm3时,根据肿瘤体积分层随机将小鼠分配到治疗组。每组10只小鼠。在第0天、第7天和第14天通过腹腔注射利用抗HELmuIg2C(25mg/kg)或3963H03-12-muIgG2c(25mg/kg)或3963H03-12-muIgG1(D265A)(25mg/kg)治疗小鼠。肿瘤大小测量和数据分析方案与第4.3节所述相同。
为了评估抗体Fc介导的效应功能在3963H03-12抗肿瘤效果中的作用,利用有效应能力3963H03-12-muIgG2c或无效应能力3963H03-12-muIgG1(D265A)治疗MC38和Hepa 1-6荷瘤小鼠。3963H03-12-muIgG1(D265A)的免疫效应功能被破坏(abolish)以降低FcγR激活和Fc介导的毒性。3963H03-12-muIgG1(D265A)与3963H03-12-muIgG2c有许多共同的功能特征,但它是一种“效应沉默”型并且不能诱导细胞毒性效应功能。与同型对照相比,有效应能力的3963H03-12-muIgG2c治疗在MC38和Hepa 1-6模型中均导致显著的肿瘤抑制(分别为TGI=46.82%,P<0.0001,第24天;TGI=106.45%,P=0.0087,第30天),而无效应能力的3963H03-12-muIgG1(D265A)的抗肿瘤效果(分别为TGI=-4.88%和TGI=-33.07%)显著低于有效应能力的(分别为P<0.0001,第24天;P=0.0002,第30天),并且与同型对照组相比没有显著增强(图24)。这些结果表明,Fc介导的免疫效应功能在3963H03-12-muIgG2c的抗肿瘤效果中起着重要作用。
4.6在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中利用3963H03-12-muIgG2c和阿维鲁单抗的联合治疗
也在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中评估了3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗联合使用的抗肿瘤效果。与抗HEL+抗PD-L1同型对照相比,3963H03-12-muIgG2c和阿维鲁单抗单药疗法均诱导了显著的肿瘤生长抑制(分别为TGI=75.3%和56.7%,每组与同型对照相比P<0.0001,第27天),并且与同型对照(30天)相比延长了中位生存期(分别为41和40.5天)(图25)。与3963H03-12-muIgG2c(P=0.0028,第27天)和阿维鲁单抗(P<0.0001,第27天)相比,3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗的组合(TGI=90.5%)进一步增强了肿瘤生长抑制。3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗的组合也延长了中位生存期(55天)(图25)。
4.6在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中利用3963H03-12-muIgG2c和M7824的联合治疗
也在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中评估了3963H03-12-muIgG2c与bintrafusp alfa(M7824)联合使用的抗肿瘤效果。与抗HEL+无活性抗PD-L1同型对照相比,3963H03-12-muIgG2c和M7824单药疗法均诱导了显著的肿瘤生长抑制(分别为TGI=75.3%和63.3%,每组与同型对照相比P<0.0001,第27天),并且与同型对照(30天)相比延长了中位生存期(分别为41和42.5天)(图26)。与3963H03-12-muIgG2c(P=0.0011,第27天)和M7824(P<0.0001,第27天)相比,3963H03-12-muIgG2c与M7824的组合(TGI=96.6%)进一步增强了肿瘤生长抑制。3963H03-12-IgG2c与M7824的组合也延长了中位生存期(55天)(图26)。
4.7再引入研究
然后在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠上进行了再引入研究,显示了在使用3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp alfa的联合治疗之后至少3个月的完全肿瘤消退。来自多个研究的被3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp-alfa联合治疗“治愈”的小鼠(分别为n=2和n=4)在初始注射的相对侧用MC38肿瘤细胞再引入。这些小鼠中没有一只在至少36天内发展出肿瘤(分别为0/2或0/4只小鼠,0%),而注射了MC38细胞的未试验过的B-huTIGIT基因敲入小鼠(n=10)均发展出肿瘤(10/10,100%)(见图27)。这些结果表明,3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp-alfa联合治疗为B-huTIGIT基因敲入小鼠赋予肿瘤抗原特异性长期保护性免疫。
4.5在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中利用3963H03-12-muIgG2c和阿维鲁单抗的联合治疗
也在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中评估了3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗联合使用的抗肿瘤效果。与抗HEL+无活性抗PD-L1同型对照相比,3963H03-12-muIgG2c和阿维鲁单抗单药疗法均诱导了显著的肿瘤生长抑制(分别为TGI=75.3%和56.7%,每组与同型对照相比P<0.0001,第27天),并且与同型对照(30天)相比延长了中位生存期(分别为41和40.5天)(图26)。与3963H03-12-muIgG2c(P=0.0028,第27天)和阿维鲁单抗(P<0.0001,第27天)相比,3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗的组合(TGI=90.5%)进一步增强了肿瘤生长抑制。3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗的组合也延长了中位生存期(55天)(图25)。
4.6在B-huTIGIT基因敲入小鼠的MC38肿瘤模型中利用3963H03-12-muIgG2c和M7824的联合治疗
也在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠中评估了3963H03-12-muIgG2c与bintrafusp alfa(M7824)联合使用的抗肿瘤效果。与抗HEL+无活性抗PD-L1同型对照相比,3963H03-12-muIgG2c和M7824单药疗法均诱导了显著的肿瘤生长抑制(分别为TGI=75.3%和63.3%,每组与同型对照相比P<0.0001,第27天),并且与同型对照(30天)相比延长了中位生存期(分别为41和42.5天)(图26)。与3963H03-12-muIgG2c(P=0.0011,第27天)和M7824(P<0.0001,第27天)相比,3963H03-12-muIgG2c与M7824的组合(TGI=96.6%)进一步增强了肿瘤生长抑制。3963H03-12-IgG2c与M7824的组合也延长了中位生存期(55天)(图26)。
4.7再引入研究
然后在MC38荷瘤B-huTIGIT基因敲入小鼠上进行了再引入研究,显示了在使用3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp alfa的联合治疗之后至少3个月的完全肿瘤消退。被3963H03-12-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafusp-alfa联合治疗“治愈”的小鼠(分别为n=2和1)在初始注射的相对侧用MC38肿瘤细胞再引入。这些小鼠中没有一只在至少36天内发展出肿瘤(分别为0/2或0/1只小鼠,0%),而注射了MC38细胞的未试验过的B-huTIGIT基因敲入小鼠(n=10)均发展出肿瘤(10/10,100%)(见图27)。这些结果表明,3963H03-1-muIgG2c与阿维鲁单抗或bintrafuspalfa联合治疗为B-huTIGIT基因敲入小鼠赋予肿瘤抗原特异性保护性免疫。
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Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
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Thr Glu Thr Gly
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<213> 人工序列
<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成肽"
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Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr
1 5 10 15
Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
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Ala Ala Ser
1
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr
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35
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<220>
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
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65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 19
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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210
<210> 20
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<212> DNA
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<220>
<221> source
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tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tcctacccca tgaactgggt gaggcaggct 180
cctggccagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcaa ccctacctac 240
gcccagggct tcaccggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 300
ctgcagatct cctccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggtggga 360
ggctactccg tggacgagta cgccttcgac gtgtggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 420
tcctccgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcacgg 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
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<210> 21
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 120
atcacttgtc gtgcctccca gggcatctcc tcctacctgg cctggtacca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gcttccacac tgcagtccgg cgtgccctcc 240
aggttttccg gatccggctc cggcaccgag ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ctgtcctcct accccacctt cggcggcggc 360
acaaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600
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agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 699
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 22
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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290 295 300
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Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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<211> 106
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<220>
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<400> 27
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 28
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Tyr Ser Val Asp Glu Tyr Ala Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 29
Ala Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 31
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 32
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Gly Tyr Ser Val Asp Glu Tyr Ser Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Thr Ile Phe Arg Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成多肽"
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Phe Thr Val Pro Glu Tyr Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 35
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Val Met Arg Tyr Pro Ala
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> SITE
<222> (1)..(8)
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体残基没有偏好"
<400> 36
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Pro
1 5
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成肽"
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<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> VARIANT
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<221> VARIANT
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<221> VARIANT
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<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
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<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
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<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
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<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> /替换="Phe"或"Ser"
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> /替换="Pro"
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> /替换="Ile"或" "
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(15)
<223> /注释="序列中给出的变体残基相对于变体位置标注中的变
体残基没有偏好"
<400> 37
Ala Arg Val Gly Gly Tyr Ser Val Asp Glu Tyr Ala Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成肽"
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Gly"或"His"
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Ser"或"Ile"或"Met"
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /替换="Arg"或"Phe"
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Arg"
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> /替换="Leu"
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> /替换="Ala"
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(8)
<223> /注释="序列中给出的变体残基相对于变体位置标注中的变
体残基没有偏好"
<400> 38
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Thr
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的说明:合成肽"
<400> 39
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Thr
1 5
Claims (69)
1.一种分离的重链可变区多肽,包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列,其中:
(a)HVR-H1序列是GYTFTX1YP;
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP;
(c)HVR-H3序列是ARX2GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13;
并且其中:X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y、S或F;X5是S、G或T;X6是V、S或G;X7是D、Y或P;X8是E、D或Y;X9是Y或W;X10是A、F或S;X11是F或D;X12是D或P;X13是V、I或不存在。
2.根据权利要求1所述的多肽,其中X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y或S;X5是S或G;X6是V或S;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A或F;X11是F;X12是D;X13是V或I。
3.根据权利要求1所述的多肽,其中X1是S;X2是V或T;X3是G;X4是Y;X5是S或G;X6是V;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V或I。
4.根据权利要求1所述的多肽,其中X1是S;X2是V;X3是G;X4是Y;X5是S;X6是V;X7是D;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V。
5.根据权利要求1-4的任意一项所述的多肽,还包含位于HVR之间的可变区重链框架序列HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和HC-FR4,由此形成下式的序列:(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。
6.根据权利要求5所述的多肽,其中所述重链框架序列源自人类共有框架序列。
7.根据权利要求5所述的多肽,其中所述重链框架序列源自人类种系框架序列。
8.根据权利要求5所述的多肽,其中所述重链框架序列的一个或多个如下所述:
HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS;
HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW;
HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC;
HC-FR4是WGQGTLVTVSS。
9.根据权利要求5-8的任意一项所述的多肽,还包含至少CH1结构域。
10.根据权利要求9所述的多肽,还包含CH2和CH3结构域。
11.根据权利要求1-10的任意一项所述的分离的重链多肽与包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的可变区轻链组合,其中:
(a)HVR-L1序列是QGISSY;
(b)HVR-L2序列是AAS;
(c)HVR-L3序列是X14QX15X16X17X18X19X20;
并且其中X14是Q、G或H;X15是L、V或T;X16是N、S、I或M;X17是S、R或F;X18是Y或R;X19是P或L;X20是T或A。
12.根据权利要求11所述的多肽,其中X14是Q或G;X15是L或V;X16是N或S;X17是S或R;X18是Y;X19是P;X20是T。
13.根据权利要求11所述的多肽,其中X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T。
14.根据权利要求11-13的任意一项所述的多肽,还包含位于HVR之间的可变区轻链框架序列LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3和LC-FR4,由此形成下式的序列:(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。
15.根据权利要求14所述的多肽,其中所述轻链框架序列源自人类共有框架序列。
16.根据权利要求14所述的多肽,其中所述轻链框架序列源自人类种系框架序列。
17.根据权利要求14所述的多肽,其中所述轻链框架序列是kappa轻链序列。
18.根据权利要求14所述的多肽,其中所述轻链框架序列的一个或多个如下所述:
LC-FR1是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS;
LC-FR2是LAWYQQKPGKAPKLLIY;
LC-FR3是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC;
LC-FR4是FGGGTKVEIK。
19.根据权利要求14-18的任意一项所述的多肽,还包含CL结构域。
20.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)所述重链包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,并且其中:(i)HVR-H1序列是GYTFTX1YP;(ii)HVR-H2序列是INTNTGNP;(iii)HVR-H3序列是ARX2GX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13;
(b)所述轻链包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3,并且其中:(iv)HVR-L1序列是QGISSY;(v)HVR-L2序列是AAS;(vi)HVR-L3序列是X14QX15X16X17X18X19X20;
并且其中X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y、S或F;X5是S、G或T;X6是V、S或G;X7是D、Y或P;X8是E、D或Y;X9是Y或W;X10是A、F或S;X11是F或D;X12是D或P;X13是V、I或不存在;X14是Q、G或H;X15是L、V或T;X16是N、S、I或M;X17是S、R或F;X18是Y或R;X19是P或L;X20是T或A。
21.根据权利要求20所述的抗体或抗体片段,其中X1是S或A;X2是V或T;X3是G或Y;X4是Y或S;X5是S或G;X6是V或S;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A或F;X11是F;X12是D;X13是V或I;X14是Q或G;X15是L或V;X16是N或S;X17是S或R;X18是Y;X19是P;X20是T。
22.根据权利要求20所述的抗体或抗体片段,其中X1是S;X2是V或T;X3是G;X4是Y;X5是S或G;X6是V;X7是D或Y;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V或I;X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T。
23.根据权利要求20所述的抗体或抗体片段,其中X1是S;X2是V;X3是G;X4是Y;X5是S;X6是V;X7是D;X8是E;X9是Y;X10是A;X11是F;X12是D;X13是V;X14是Q;X15是L;X16是S;X17是S;X18是Y;X19是P;X20是T。
24.根据权利要求20所述的抗体或抗体片段,其中
(a)HVR-H1序列是GYTFTSYP,
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP,
(c)HVR-H3序列是ARVGGYSVDEYAFDV;
并且其中
(d)HVR-L1序列是QGISSY,
(e)HVR-L2序列是AAS,
(f)HVR-L3序列是QQLSSYPT。
25.根据权利要求20-24的任意一项所述的抗体或抗体片段,还包含
(a)位于HVR之间的可变区重链框架序列HC-FR1、HC-FR2、HC-FR3和HC-FR4,由此形成下式的序列:(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),以及
(b)位于HVR之间的可变区轻链框架序列LC-FR1、LC-FR2、LC-FR3和LC-FR4,由此形成下式的序列:(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。
26.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段,其中所述框架序列源自人类共有框架序列。
27.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段,其中所述框架序列源自人类种系框架序列。
28.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段,其中所述框架序列的一个或多个如下所述:
HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS;
HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW;
HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC;
HC-FR4是WGQGTLVTVSS。
29.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段,其中所述框架序列的一个或多个如下所述:
LC-FR1序列是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS;
LC-FR2序列是LAWYQQKPGKAPKLLIY;
LC-FR3序列是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC;
LC-FR4序列是FGGGTKVEIK。
30.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段,其中:
(a)所述可变重链框架序列如下所述:
(i)HC-FR1是QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS;
(ii)HC-FR2是MNWVRQAPGQGLEWMGW;
(iii)HC-FR3是TYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC;
(iv)HC-FR4是WGQGTLVTVSS,并且
(b)所述可变轻链框架序列如下所述:
(i)LC-FR1序列是DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRAS;
(ii)LC-FR2序列是LAWYQQKPGKAPKLLIY;
(iii)LC-FR3序列是TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC;
(iv)LC-FR4序列是FGGGTKVEIK。
31.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,具有根据权利要求30所述的HC-FR和LC-FR序列,选自下列:
i)抗体,其中HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3序列选自表2中所示的ID之一,并且其中
(a)HVR-L1序列是QGISSY,
(b)HVR-L2序列是AAS,
(c)HVR-L3序列是QQLNSYPT;
ii)抗体,其中HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3序列选自表3中所示的ID之一,并且其中
(a)HVR-H1序列是GYTFTSYP;
(b)HVR-H2序列是INTNTGNP,
(c)HVR-H3序列是ARVGGYSVDEYAFDV;或者
iii)抗体,选自表4。
32.根据权利要求25-31的任意一项所述的抗体或抗体片段,还包含至少CH1结构域。
33.根据权利要求32所述的抗体或抗体片段,还包含CH2和CH3结构域。
34.根据权利要求25-33的任意一项所述的抗体或抗体片段,还包含CL结构域。
35.根据权利要求34所述的抗体,其中恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4所组成的组。
36.根据权利要求35所述的抗体,其中所述恒定区是IgG1。
37.根据前述权利要求的任意一项所述的抗体或抗体片段,是全人源抗体。
38.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,包含重链可变区序列和轻链可变区序列,其中:
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85%的序列同一性:QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWI NTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVD EYAFDVWGQGTLVTVSS,并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85%的序列同一性:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLSSYPTFGGGTKVEIK。
39.根据权利要求38所述的抗体或抗原结合片段,其中序列同一性是至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
40.根据权利要求39所述的抗体或抗原结合片段,其中序列同一性是100%。
41.一种分离的抗TIGIT抗体,其中重链是:QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYPMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARVGGYSVDEYAFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,并且
(b)轻链是:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLSSYPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
42.根据权利要求20至41的任意一项所述的抗体,其中所述抗体能够结合人和食蟹猴TIGIT。
43.根据权利要求20至20的任意一项所述的抗体,其中所述抗体能够阻断人或食蟹猴TIGIT与相应的人或食蟹猴PVR之间的相互作用。
44.根据权利要求20至43的任意一项所述的抗体,其中所述抗体以10x10-9 M以下的KD结合人TIGIT。
45.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,结合包含人TIGIT残基Q53、T55、Y113和P114的功能性表位。
46.根据权利要求45所述的分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,其中所述功能性表位还包含人TIGIT残基Q56、N70和H111。
47.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,结合包含人TIGIT残基T51、A52,Q53、T55、Q56、N70、D72、H111、T112、Y113、P114和G116的构象表位。
48.一种分离的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段,与根据权利要求20-42的任意一项所述的抗体或抗原结合片段交叉竞争结合TIGIT。
49.一种药物组合物,包含根据权利要求20-48的任意一项所述的抗体或抗原结合片段与至少一种药学上可接受的载体。
50.一种分离的核酸,编码根据权利要求1-41的任意一项所述的多肽。
51.一种分离的核酸,编码根据权利要求20-41的任意一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链或重链序列。
52.一种分离的核酸,编码根据权利要求41所述的重链,所述核酸具有以下序列:
ATGGAAACAGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCTCCACAGGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAACCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTACCCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCAACACCGGCAACCCTACCTACGCCCAGGGCTTCACCGGCAGGTTCGTGTTCTCCCTGGACACCAGCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCTCCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGTGGGAGGCTACTCCGTGGACGAGTACGCCTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCACGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGT。
53.一种分离的核酸,编码根据权利要求41所述的氢链,所述核酸具有以下序列:
ATGAGGGCCCTGCTGGCTAGACTGCTGCTGTGCGTGCTGGTCGTGTCCGACAGCAAGGGCGACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTTCCTGTCCGCTTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACTTGTCGTGCCTCCCAGGGCATCTCCTCCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCTTCCACACTGCAGTCCGGCGTGCCCTCCAGGTTTTCCGGATCCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCTGTCCTCCTACCCCACCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT。
54.一种载体,包含根据权利要求50-53的任意一项所述的核酸。
55.一种宿主细胞,包含根据权利要求54所述的载体。
56.根据权利要求55所述的宿主细胞,是真核细胞。
57.根据权利要求56所述的宿主细胞,是哺乳动物细胞。
58.根据权利要求57所述的宿主细胞,是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,优选为CHO-K1SV。
59.一种制造抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的方法,包含在适于编码所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的载体表达的条件下培养根据权利要求55-58的任意一项所述的宿主细胞,并回收所述抗体或片段。
60.一种治疗癌症的方法,包含向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求20-48的任意一项所述的抗TIGIT抗体或根据权利要求49所述的药物组合物,其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
61.一种治疗癌症的方法,包含向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求20-48的任意一项所述的抗TIGIT抗体或根据权利要求49所述的药物组合物。
62.根据权利要求60或61所述的方法,其中所述癌症选自由下列所组成的组:乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾腺癌、胃癌、胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。
63.一种治疗T细胞功能障碍性疾病的方法,包含向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求20-48的任意一项所述的抗TIGIT抗体或根据权利要求49所述的药物组合物。
64.根据权利要求63所述的方法,其中所述T细胞功能障碍性疾病是肿瘤免疫。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述肿瘤免疫源于选自由下列所组成的组中的癌症:乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾腺癌、胃癌、胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头颈癌、胃癌和胰腺癌。
66.根据权利要求60至65的任意一项所述的方法,其中所述方法还包含应用选自由下列所组成的组中的治疗方案:辐射疗法、手术、化疗、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、辅助疗法、新辅助疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗。
67.根据权利要求60至66的任意一项所述的方法,还包含施用至少一种抗癌剂。
68.一种试剂盒套件,包含根据权利要求49所述的药物组合物,以及包含根据权利要求60-66的任意一项使用所述药物组合物用于治疗的说明的包装说明书。
69.一种试剂盒套件,包含根据权利要求49所述的药物组合物,至少一种抗癌剂,以及包含根据权利要求60-67的任意一项组合使用所述至少一种抗癌剂与所述药物组合物用于治疗的说明的包装说明书。
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