CN101374863B - 针对nogo的免疫球蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对NOGO的抗体、含有它们的药物制剂，并涉及这些抗体在神经疾病/失调的治疗和/或预防中的用途。

Description

针对NOGO的免疫球蛋白
发明领域
本发明涉及免疫球蛋白，特别是结合NOGO并中和其活性的抗体，编码这种抗体的多核苷酸，含有所述抗体的药物制剂，并且涉及这些抗体在治疗和/或预防神经疾病方面的用途。根据以下的详细说明，本发明的其他方面、目的和优点将变得显而易见。
发明背景
中风是西方世界中死亡和失能(disability)的主要原因。除了组织血纤蛋白溶解酶原(t-PA)之外对于中风的处理没有批准的治疗，组织血纤蛋白溶解酶原在计算机断层成像术(CT)扫描以排除出血之后在发作的3小时之内施用。迄今为止，直接针对急性中风的治疗(即，神经保护)的大多数治疗试剂主要涉及靶向谷氨酸受体和已知涉及急性细胞死亡的它们的下游信号转导(signalling)途径。然而迄今为止这些策略在临床试验中被证明是不成功的，通常与剂量限制性副作用相关(Hill&Hachinski，The Lancet，352：(suppl III)10-14(1998))。因而，针对在血流停止之后改善细胞死亡，需要新的方法。神经保护是一种防止或改善响应于损伤或疾病过程的神经元细胞损失的处理能力。这可以通过直接地靶向神经元、或间接地通过防止神经胶质(包括少突胶质细胞)细胞损失来实现。
在中风发作之后，在许多患者中观察到了一定程度的自发的功能恢复，表明大脑具有在损伤之后修复和/或重塑的能力(虽然是有限的)。具有增强这种恢复的潜力的试剂因而可以容许在脑缺血发作之后晚得多之时进行介入(可能数天)。能够提供急性神经保护并增强功能恢复的试剂可以提供优于当前的潜在的神经保护策略的显著的优点。
阿尔茨海默氏病(AD)特征在于两种病理诊断特征的存在。它们分别是由聚集的β-淀粉样蛋白肽(Aβ40和Aβ42)和超磷酸化的tau组成的淀粉样蛋白斑块和神经原纤维缠结(Dawbarn & Allen 2001Neurobiology of Alzheimer′s Disease OUP)。
综合分析显示了在患者中β-淀粉样蛋白积聚和认知下降之间的强的联系(Naslund et al，JAMA，March 22/29，2000，Vol.283，No；12，page1571-1577)。这与遗传学和流行病学研究一致，其表明了在APP和早老素(presenilin)基因中的某些突变可以倾向于早期发作AD，这些突变还提高了Aβ40和Aβ42肽的水平，包括其比率。
I型跨膜淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)被称为β-和γ-分泌酶的两种不同蛋白酶的裂解是β-淀粉样蛋白肽的形成所必需的。已经确认了β-分泌酶作为天冬氨酸(aspartyl)蛋白酶Asp2/BACE1的分子身份(Hussain et al Mol.Cell.NeuroSci.16，609-619(2000)；Vassar et al，Science(1999)，Oct.22；286(5440)：735-741)。γ-分泌酶的性质仍然是某些争论的来源，可能由至少包括以下蛋白质的高分子量复合物组成：早老素、Aph1、Pen2和nicastrin(综述见Medina & Dotti Cell Signalling2003 15(9)：829-41)。
APP在CNS中的加工可能在许多细胞类型内发生，包括神经元、少突胶质细胞、星形细胞和小胶质细胞。而在这些细胞中APP加工的总体速率将受到APP、BACE1/Asp2、早老素-1和-2、Aph1、Pen2和nicastrin的表达的相对水平的影响。
此外，调节APP的亚细胞位置的其他因素也可以影响它的加工，如以下的发现所显示，阻断其内吞作用的APP细胞质结构域中YENP基序的突变降低了β-淀粉样蛋白产生(Perez et al 1999J Biol Chem 274(27)18851-6)。通过添加KKQN滞留基序，APP-β-CTF在ER中的滞留足以降低转染的细胞中的淀粉样蛋白产量(Maltese et al 2001 J Biol Chem276(23)20267-20279)。反之，通过Rab5的过量表达，内吞作用的升高足以提高来自转染的细胞的淀粉样蛋白分泌(Grbovic et al 2003 JBiol Chem 278(33)31261-31268)。
与这些发现一致，进一步的研究显示了细胞胆固醇水平(公知的AD风险因素)的降低降低了β-淀粉样蛋白形成。这种变化取决于通过使用显性阴性dynamin突变体(K44A)以及Rab5GTPase活化蛋白RN-Tre的过量表达展现的改变的内吞作用(Ehehalt et al 2003J Cell Biol160(1)113-123)。
富胆固醇微结构域或筏(rafts)也是β-淀粉样蛋白产生的重要细胞位点，APP、BACE1和γ-分泌酶复合物的成分都显示了短暂地存在于筏内。针对富胆固醇筏的APP和BACE1的抗体交联能够提高β-淀粉样蛋白产生(Ehehalt et al 2003 J Cell Biol 160(1)113-123)。专门地靶向脂质筏的、GPI锚定的BACE1的表达，类似地能够提高APP裂解和β-淀粉样蛋白产生(Cordy et al 2003 PNAS 100(20)11735-11740)。
在中风或其他神经损伤事件或疾病之后功能恢复的机制当前是未知的。损伤的或未损伤的轴突的出芽(sprouting)被认为是一种可能的机制。然而，虽然体内研究显示了用神经营养因子治疗脊髓损伤或中风引起了增强的功能恢复和一定程度的轴突出芽，这些没有证明轴突出芽的程度和功能恢复的程度之间的直接联系(Jakeman，et al.1998，Exp.Neurol.154：170-184，Kawamata et al.1997，Proc Natl Acad.Sci.USA.，94：8179-8184，Ribotta，et al.2000，J Neurosci.20：5144-5152)。此外，轴突出芽需要活的神经元。在疾病例如与广泛的细胞死亡相关的中风中，给定的试剂在中风后提供的功能恢复的增强因而可能通过轴突出芽以外的机制，例如内源干细胞的分化、冗余途径的活化、受体分布的改变、或神经元或神经胶质的可激发性(Fawcett & Asher，1999，Brain Res.Bulletin，49：377-391，Horner & Gage，2000，Nature 407 963-970)。
中枢神经系统(CNS)在损伤之后修复的有限能力被认为部分是由于CNS环境内的分子，所述分子对于轴突出芽(轴索长出)具有抑制效果。CNS髓鞘质被认为含有抑制性分子(Schwab ME and Caroni P(1988)J.Neurosci.8，2381-2193)。两种髓鞘质蛋白，髓鞘质相关糖蛋白(MAG)和NOGO已经被克隆并鉴定为轴索长出的推定的抑制物(Sato S.et al(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163，1473-1480；McKerracher L et al(1994)Neuron 13，805-811；Mukhopadhyay G et al(1994)Neuron 13，757-767；Torigoe K and Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262；Schafer et al(1996)Neuron 16，1107-1113；WO9522344；WO9701352；Prinjha R et al(2000)Nature 403，383-384；Chen MS et al(2000)Nature 403，434-439；GrandPre T et al(2000)Nature 403，439-444；US005250414A；WO200005364A1；WO0031235)。
已经鉴定了三种形式的人类NOGO：NOGO-A具有1192个氨基酸残基(GenBank accession no.AJ251383)；NOGO-B，缺少推定的细胞外结构域中残基186-1004的剪接变体(GenBank accession no.AJ251384)，以及更短的剪接变体NOGO-C，其也缺乏残基186到1004，并且具有更小的、可选择的氨基末端结构域(GenBank accessionno.AJ251385)(Prinjha et al(2000)上文)。
CNS抑制性蛋白质例如NOGO的抑制可以提供治疗手段来改善神经元损坏并促进神经元修复和生长，从而潜在地帮助从神经元损伤例如中风中遭受的损伤的恢复。这种NOGO抑制物的实例可以包括小分子、肽和抗体。
报道了鼠单克隆抗体IN-1促进轴突再生，其针对髓鞘质蛋白NI-220/250产生，NI-220/250是轴索生长的强力抑制物(后来显示了是NOGO-A的片段)(Caroni，P and Schwab，ME(1988)Neuron 1 85-96；Schnell，L and Schwab，ME(1990)Nature 343269-272；Bregman，BS et al(1995)Nature 378498-501 and Thallmair，M et al(1998)NatureNeuroscience 1124-131)。还报道的是NOGO-A是IN-1的抗原(Chen etal(2000)Nature 403434-439)。IN-1Fab片段或人源化的IN-1对经历了脊髓横切的大鼠的施用增强了恢复(Fiedler，M et al(2002)ProteinEng 15 931-941；Brosamle，C et al(2000)J.Neuroscience 20 8061-8068)。
在WO 04/052932和WO2005028508中描述了结合NOGO的单克隆抗体。WO 04/052932公开了鼠抗体11C7，其以高亲和性结合某些形式的人类NOGO。
专利申请WO05/061544还公开了高亲和性单克隆抗体，包括鼠单克隆抗体2A10，并一般地公开了其人源化的变体，例如H1L11(H1和L11的序列分别在SEQ ID NO：33和34中提供(仅VH或VL序列))。公开的抗体以高亲和性与人类NOGO-A结合。鼠2A10抗体(和其CDR移植(grafted)的人源化变体)特征在于它们的轻链和重链可变区内的以下互补决定区(CDR)序列(如使用Kabat方法测定的(Kabat et al.(1991)″Sequences of proteins of immunological interest″；Fifth Edition；US Department of Health and Human Services；NIH publication No91-3242))：
表1：抗体2A10轻链CDR
  CDR   序列
  L1   RSSKSLLYKDGKTYLN(SEQ ID NO：4)
  L2   LMSTRAS(SEQ ID NO：5)
  L3   QQLVEYPLT(SEQ ID NO：6)
表2：抗体2A10重链CDR
  CDR   序列
  H1   SYWMH(SEQ ID NO：1)
  H2   NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO：2)
  H3   GQGY(SEQ ID NO：3)
WO05/061544进一步公开了所述抗体的“类似物”，其包含以上表1和2的CDR，这种“类似物”具有与衍生它们的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
尽管本领域提供了高亲和性抗NOGO抗体，分离并开发结合并抑制人类NOGO的活性的可选择的、或改进的、治疗有用的单克隆抗体仍然是高度期望的目标。
神经变性(neurodegeneration)的过程是许多神经疾病/失调的基础，包括但不限于，急性疾病例如中风(缺血性的或溢血性的)、外伤性脑损伤和脊髓损伤，以及慢性疾病，包括阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆(tau蛋白病变(tauopathies))、周围神经病、帕金森氏病、Creutzfeldt-Jakob病(CJD)、精神分裂症、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、Huntington’s病、多发性硬化和包含体肌炎。因而，本发明的抗NOGO单克隆抗体等等，在这些疾病/失调的治疗中是有用的。用于上述疾病/失调的治疗的抗体由本发明提供，并在下文中详细描述。
发明概述
本发明提供了特异性重链可变区，以及包含所述特异性重链可变区和轻链可变区的抗体或其片段，所述轻链可变区容许当与所述重链可变区配对时，Fv二聚体以高亲和性结合人类NOGO-A，从而中和人类NOGO-A的活性。
本发明的重链可变区可以是格式化的(formatted)，与轻链可变区一起以允许结合人类NOGO-A，以常规的免疫球蛋白方式(例如，人类IgG、IgA、IgM等等)，或以结合人类NOGO-A的其任何其他片段或“抗体样”形式(例如，单链Fv、双抗体(diabodies)、TandabsTM等等(可选择的“抗体”形式的概述参见Holliger and Hudson，NatureBiotechnology，2005，Vol 23，No.9，1126-1136))。
重链可变区包含基本上由氨基酸残基GQGY组成的第三个CDR，其中所述CDR含有GQGY核心序列内的至少一个替换，所述替换选自以下替换：其中第一位置的G被R、I、W或M取代；第二位置的Q被D、I、A、L、V或S取代；第三位置的G被W、N、Y、S、L或F取代；第四位置的Y被W取代。
在另一个实施方式中，第三个重链CDR(CDR H3)仅含有一个替换，产生以下CDR H3：RQGY(SEQ ID NO：75)、IQGY(SEQ ID NO：76)、MQGY(SEQ ID NO：45)、GDGY(SEQ ID NO：77)、GIGY(SEQ ID NO：78)、GSGY(SEQ ID NO：79)、GQNY(SEQ ID NO：80)、GQYY(SEQ ID NO：81)、GQSY(SEQ ID NO：62)、GQLY(SEQ ID NO：82)、GQFY(SEQ ID NO：83)、GQGW(SEQ ID NO：84)、WQGY(SEQ ID NO：86)、GAGY(SEQ ID NO：87)、GLGY(SEQ ID NO：88)、GVGY(SEQ ID NO：89)、GQWY(SEQ ID NO：90)。
在另一个实施方式中，上述重链可变区进一步含有表2所列的其他CDR，即，CDR H1(SEQ ID NO：1)和CDR H2(SEQ ID NO：2)。
本发明的抗体或其片段保持了包含CDR H3：GQGY的抗体的人类NOGO结合活性，对如ELISA和Biacore实验中测量的它们的活性而言，在某些情况下，在这些实验中活性被提高。
含有G95M的人类或人源化的重链可变区(替换通过Kabat计数)。
在本发明的一个实施方式中，本发明的重链可变区包含表3中定义的CDR(如Kabat所定义的)：
表3：
 CDR   序列
  H1   SYWMH(SEQ ID NO：1)
  H2   NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO：2)
  H3   MQGY(SEQ ID NO：45)
在本发明的一个实施方式中，提供了包含表3所列每一个CDR的人类或人源化重链可变区。在本发明的另一个实施方式中，提供了处在人类重链可变区的更大序列内的包含表3中所列CDR的人源化的重链可变区。在又一个实施方式中，人源化的重链可变区包含处在接受体抗体框架内的表3所列的CDR，所述接受体抗体框架在框架区域中具有与鼠2A10供体抗体重链可变区(SEQ ID NO：7)的大于40％的同一性、或大于50％、或大于60％、或大于65％的同一性。
当表3的CDR被全部使用时，在一个实施方式中，重链可变区序列是作为SEQ ID NO：66提供的序列H98(H98 VH是H1 VH(SEQ IDNO：33)的等价物，不同仅在于在H98中CDR H3是MQGY，而不是H1中发现的GQGY)。
在本发明的一个方面，抗体包含具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链可变区(H98可变区)，进一步包含在位置38、40、48、67、68、70、72、74和79的一个或多个处的一定数量的替换；其中每个替换的氨基酸残基被SEQ ID NO：7(供体抗体2A10的重链可变区)中等价位置处的氨基酸残基取代，替换的数目在1到9之间。在其他实施方式中，替换的数目是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8或9。
在上下文中，所描述的替换在概念上等价于“回复突变”，其中在H98序列内特定位置中人类框架氨基酸残基被回复突变为2A10供体抗体序列内的等价位置中的氨基酸残基。
除非另外特别地声明与此处的相反，当在本文件中提及特定序列中存在的氨基酸残基的数字性位置时，例如“位置12”，意图指熟练的读者为序列中的第一个氨基酸分配位置“1”并从位置一开始计数，并识别处在期望的位置中的氨基酸，在这个实例中是序列中的第十二个氨基酸残基。熟练的读者将注意到，这种编号系统不符合Kabat编号系统，Kabat编号系统常常被用于定义抗体序列内的氨基酸位置。
对于最佳的结合亲和性，对于小鼠抗体2A10(它的VH是SEQ IDNO：7)的人源化发现的是，在位置48和68处的氨基酸残基对，应当分别是I和A(如同它们存在于2A10中)或分别是M和V(如同它们存在于H98中)。预期的是，上述发现还与2A10的G95M变体的人源化相关。
以下表格包括三种不同的重链可变(VH)区域的细节，它们可以形成本发明的抗体的部分。每一种公开的VH是基于H98VH(SEQ IDNO：66)的，进一步包含在表格(表4)中提及的替换，其中在相关位置的H98的残基被该位置的2A10的残基替换(在表中，“-”是指在该位置没有替换，从而残基保持与H98的序列中一样)：
表4，
Figure GSB00000912100000081
因而，在本发明的一个实施方式中，本发明的重链可变区(VH)是H26 VH(SEQ ID NO：47)、H27VH(SEQ ID NO：48)和H28 VH(SEQ ID NO：49)。
SEQ ID 47：VH人源化的构建体H26
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN
PSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG
QGTLVTVSS
SEQ ID 48：VH人源化的构建体H27
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIN
PSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG
QGTLVTVSS
SEQ ID 49：VH人源化的构建体H28
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN
PSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG
QGTLVTVSS
包括G101S人类或人源化重链可变区(通过Kabat编号的替换)
在本发明的其他实施方式中，提供了包含表5中定义的CDR的人类或人源化重链可变区：
表5：
 CDR   根据Kabat
 H1   SYWMH(SEQ ID NO：1)
 H2   NINPSNGGTNYNEKFKS(SEQ ID NO：2)
 H3   GQSY(SEQ ID NO：62)
在一个实施方式中，表5的CDR包括在人类重链可变区序列中。在又一个实施方式中，人源化的重链可变区包含处在接受体抗体框架内的表5所列的CDR，所述接受体抗体框架在框架区域中具有与鼠2A10供体抗体重链可变区(SEQ ID NO：7)的大于40％的同一性、或大于50％、或大于60％、或大于65％的同一性。
在另一个实施方式中，表5的CDR被插入人类重链可变区来得到以下的序列(H99)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNI
NPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYW
GQGTLVTVSS(SEQ ID 61：2A10VH人源化的构建体H99).
在其他实施方式中，进一步的回复突变被添加到H99 VH序列的位置38、40、48、67、68、70、72、74或79(通过数字性残基位置表示)的任一个中；其中每个替换的氨基酸残基被SEQ ID NO：7(供体抗体2A10的重链可变区)中等价位置的氨基酸残基取代，替换的数目在1到9之间。在其他实施方式中，替换的数目是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8或9个。H99VH是H1VH(SEQ ID NO：33)的等价物，不同仅在于CDR H3在H99中是GQSY，而不是H1中发现的GQGY。
对于最佳的结合亲和性，对于小鼠抗体2A10(它的VH是SEQ IDNO：7)的人源化发现的是，在位置48和68处的氨基酸残基对，应当分别是I和A(如同它们存在于2A10中)或分别是M和V(如同它们存在于H98中)。预期的是，上述发现还与2A10的G95M变体的人源化相关。
在一个实施方式中，回复突变位于以下表6中表明的位置，其中在相关位置的H99的残基被该位置的2A10的残基替换(在表中，“-”意思是在该位置没有替换，从而残基保持与H1的序列中的一样)：
表6，
Figure GSB00000912100000101
包含人类或人源化重链可变区和轻链可变区的抗体或片段
本发明的VH构建体可以与轻链配对来形成任何形式的人类NOGO-A结合单位(Fv)，包括常规的具有全长(FL)可变区和恒定区结构域重链序列的IgG抗体形式。包含本发明的VH构建体和在位置235和237处的失活突变(EU Index编号)使得抗体为非溶胞性的全长(FL)IgG1重链序列的实例是SEQ ID NO：53、54和55。
SEQ ID 53：重链人源化的构建体H26
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM
HWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSL
RSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ ID 54：重链人源化的构建体H27
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM
HWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLR
SEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 55：重链人源化的构建体H28
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM
HWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLR
SEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
CLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ
TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV
SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE
LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
与本发明的重链可变区序列形成Fv的轻链可变区序列可以是容许Fv结合人类NOGO-A的任何序列。
在本发明的一个实施方式中，所述轻链可变区是2A10轻链(参见WO 05/061544)，其轻链可变区在此提供为SEQ ID NO：8或其人源化变体。2A10轻链的人源化变体优选地含有嫁接到人类轻链可变区接受体框架上的表1中描述的所有轻链可变区CDR。在一个实施方式中，所述人源化的轻链可变区是L11(SEQ ID NO：34)、L13(SEQ ID NO：13)或L16(SEQ ID NO：14)。在表7中提供了包含kabat位置37和/或45中的特定替换、基于L13和L16的可选择的轻链可变区。
表7，
Figure GSB00000912100000121
在另一个实施方式中，全长(FL)轻链序列是L11FL(SEQ ID NO：36)、L13FL(SEQ ID NO：17)或L16FL(SEQ ID NO：18)。
在另一个实施方式中，抗体、其片段或功能等价物包括选自H26、H27、H28、H100、H101和H102的VH序列；与以下的VL序列LL11、L13、L16、L100、L101、L102、L103、L104和L105的任一个组合。预期的是，特别地公开了列出的重链可变区和轻链可变区的所有可能的组合(例如，H28L104等)。
在特定的实施方式中，抗体、其片段或功能等价物包含以下的可变区配对：
H27L16(SEQ ID NO：48+SEQ ID NO：14)
H28L13(SEQ ID NO：49+SEQ ID NO：13)
H28L16(SEQ ID NO：49+SEQ ID NO：14)
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含以下的全长序列：
H27FL L16FL(SEQ ID NO：54+SEQ ID NO：18)
H28FL L13FL(SEQ ID NO：55+SEQ ID NO：17)
H28FL L16FL(SEQ ID NO：55+SEQ ID NO：18)
在一个实施方式中，本发明的抗体包含H27L16(SEQ ID NO：48+SEQ ID NO：14)、或是全长抗体H28FL L16FL(SEQ ID NO：55+SEQID NO：18)。
在另一个实施方式中，抗体或其片段结合到与H28L16的相同的人类NOGO表位，或者与H28L16竞争结合人类NOGO，在这两种情况下特征在于所述竞争抗体或其片段不是鼠抗体2A10或其人类或人源化变体，所述鼠抗体2A10或其人类或人源化变体包含具有序列GQGY的CDR H3(SEQ ID NO：3)或含有CDR H3中的一个氨基酸取代的序列。
在特定的实施方式中，抗体、其片段或功能等价物包含以下的可变区配对：
H100L16(SEQ ID NO：63+SEQ ID NO：14)
H101L13(SEQ ID NO：64+SEQ ID NO：13)
H102L16(SEQ ID NO：65+SEQ ID NO：14)
表位作图和结合相同表位的进一步的抗体
在另一个实施方式中，提供了抗体或其片段，其能够在ELISA分析中结合人类NOGO蛋白或其片段，例如GST-NOGO-A56蛋白质(SEQ IDNO：32)，其中在ELISA分析中所述抗体或其片段与人类NOGO蛋白或其片段的结合在存在具有以下序列VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO：60)的肽的情况下被降低，并且在存在不相关的肽，例如来自人类NOGO不与SEQ ID NO：60重叠的肽(例如SEQ ID NO：85，YESIKHEPENPPPYEE)的情况下不被降低，特征在于所述抗体或其片段不是包含具有由氨基酸残基GQGY组成的CDR H3的重链可变结构域的抗体或在CDR H3中具有一个氨基酸替换的其类似物。做为选择，竞争性肽是TPSPVLPDIVMEAPLN(SEQ  ID  NO：73)或VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQ ID NO：74)。此外，结合与所述抗体或其片段相同的表位的抗体可以是不包含表1和2中所列全部CDR的抗体，或者是包含与组合的表1和2中、或单独的表1或2中所列CDR具有80％或更大同源性的一组CDR的任何抗体。
在本发明的另一个实施方式中，提供了抗体或其片段，其能够在ELISA分析中结合由多肽序列VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO：60)组成的人类NOGO蛋白质的区域，特征在于所述抗体或其片段不是包含具有由氨基酸残基GQGY组成的CDR H3的可变重链结构域的抗体或在CDR H3中具有一个氨基酸替换的其类似物。做为选择，所述抗体或其片段能够结合TPSPVLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO：73)或VLPDIVMEAPLNSAVP(SEQ ID NO：74)。此外，结合与所述抗体或其片段相同的表位的抗体可以是不包含表1和2中所列全部CDR的抗体，或者是包含与组合的表1和2中、或单独的表1或2中所列CDR具有80％或更大同源性的一组CDR的任何抗体。
在本发明的另一个实施方式中，提供了获得抗体或其结合片段的方法，所述抗体或其结合片段结合人类NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQID NO：60)，包括用所述肽免疫哺乳动物并分离能够产生结合所述肽的抗体的细胞。在本发明的另一个实施方式中，提供了获得分离的抗体或其结合片段的方法，所述抗体或其结合片段结合人类NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO：60)，包括通过抗体或其结合片段与NOGO表位VLPDIVMEAPLN(SEQ ID NO：60)的结合来筛选含有多种抗体或其结合片段的库，每一种抗体或其结合片段与编码所述抗体或其结合片段的核苷酸序列一起是可从所述库中分离的。
药物组合物
本发明的进一步的方面提供了药物组合物，其包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段或等价物，以及药学上可接受的稀释剂或载体。
在进一步的方面，本发明提供了在人类中治疗或预防中风(特别是缺血性的中风)和其他神经疾病，特别是阿尔茨海默氏病，以及治疗患有对CNS的机械性损伤(例如脊索损伤)的方法，其包括向有需要的所述人类施用本发明的有效量的抗NOGO抗体或其功能片段。
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗NOGO抗体或其功能片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防中风(特别是缺血性中风)和其他神经疾病，特别是阿尔茨海默氏病和患有对CNS的机械性创伤(例如脊索损伤)的患者的治疗。
在进一步的方面，本发明提供了在患有或存在风险发生中风(特别是缺血性中风)或其他神经疾病，特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中，和在患有对CNS的机械性损伤(例如脊索损伤)的患者的治疗中抑制神经变性和/或促进功能恢复的方法，其包括向所述有需要的人类施用有效量的本发明的抗NOGO抗体或其功能片段。
在又进一步的方面，本发明提供了本发明的抗NOGO抗体或其功能片段在制备药物中的用途，所述药物用于在患有或存在风险发生中风和其他神经疾病、特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中以及患有对CNS的机械性损伤(例如脊索损伤)的患者的治疗中抑制神经变性和/或促进功能恢复。
本发明的其他方面和益处在详细的说明中和其优选的实施方式中进一步描述。
发明的详细说明
本发明的重链可变区可以形成天然抗体或其功能片段或等价物的结构。因而抗体可以包含当与合适的轻链配对时形成全长抗体、(Fab’)2片段、Fab片段或其等价物(例如，scFv、二、三或四体、Tandabs，等等)的本发明的VH区域。所述抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；IgA，IgE或IgD，或其修饰的变体。可以相应地选择抗体重链的恒定区。轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区。此外，抗体可以包含所有种类的修饰，例如，IgG二聚体、不再结合Fc受体或介导Clq结合的Fc突变体。抗体还可以是在WO86/01533中描述的类型的嵌合抗体，其包含抗原结合区和非免疫球蛋白区域。
根据需要的功能选择恒定区。通常，IgG1将通过结合补体展现溶胞能力，和/或将介导ADCC(抗体依赖性的细胞的细胞毒性)。如果需要非细胞毒性封闭抗体，IgG4将是优选的。然而，IgG4抗体可能展现产品中的不稳定性，因而更优选的是修饰一般更为稳定的IgG1。在EP0307434中描述了建议的修饰，优选的修饰包括在位置235和237。
因而，本发明提供了溶胞性或非溶胞形式的根据本发明的抗体。
因而在优选的形式中，本发明的抗体是具有在此描述的重链可变区的全长(即，H2L2四聚体)的非溶胞性IgG1抗体。
在进一步的方面中，本发明提供了编码在此描述的重链可变区的多核苷酸。
“NOGO”是指任何NOGO多肽，包括变体形式。这包括但不限于，具有1192个氨基酸残基的NOGO-A(GenBank accession no.AJ251383)；NOGO-B，一种缺少推定的细胞外结构域中的残基186-1004的剪接变体(GenBank accession no.AJ251384)和更短的剪接变体NOGO-C，其也缺少残基186-1004，并且还具有更小的、可选择的氨基末端结构域(GenBank accession no.AJ251385)(Prinjha et al(2000)上文)。在此所有对“NOGO”的引用被理解为包括NOGO的任何和所有的变体形式，例如NOGO-A和所描述的剪接变体，除非指明了特定的形式。
“中和”和其语法上的变体是指全部或部分地抑制NOGO功能，包括它与神经元的结合，以及对轴突生长的抑制作用。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2按照它们标准的意义使用(参见，例如Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，(1988))。
“嵌合抗体”是指一种工程化的抗体，其含有来自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)，与来自接受体抗体的轻链和重链恒定区连接。
“人源化的抗体”是指一种工程化的抗体，具有来自非人类供体免疫球蛋白的CDR，分子的其余的免疫球蛋白衍生部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。此外，框架支持残基可以被改变以保持结合亲和性(参见，例如，Queen et al.，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson et al.，Bio/Technology，9：421(1991))。适合的人类接受体抗体可以是选自常规数据库的一种，例如，
Figure GSB00000912100000161
数据库、LosAlamos数据库和Swiss蛋白质数据库，通过与供体抗体(在这种情况下，为鼠供体抗体2A10)的核苷酸和氨基酸序列的同源性。特征在于与供体抗体的框架区域的同源性的人类抗体(在氨基酸的基础上)可以适合于提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于插入供体CDR(对于插入接受体框架的2A10CDR，参见表1)。能够供给轻链恒定或可变框架区域的适合的接受体抗体可以按类似方式选择。要注意的是，接受体抗体重链和轻链不需要来源于相同的接受体抗体。先有技术描述了几种产生这样的人源化抗体的方法，参见，例如，EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语“供体抗体”是指非人类抗体，其向人源化抗体贡献它的可变区、CDR或其他功能片段或类似物的氨基酸序列，从而为人源化抗体提供供体抗体的抗原特异性和中和活性特征。
术语“接受体抗体”是指异源于供体抗体的抗体，其向人源化抗体提供了它的重链和/或轻链框架区和/或它的重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列。接受体抗体可以来自任何哺乳动物，只要它在人类中是非免疫原性的。优选的，接受体抗体是人类抗体。
做为选择，人源化可以通过“饰面(veneering)”的过程来实现。独特的人类和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计分析揭示了暴露的残基的确切模式在人类和鼠抗体中是不同的，最独特(individual)的表面位置具有对少数不同残基的强的偏爱性(参见Padlan E.A.et al；(1991)Mol.Immunol.28，489-498和Pedersen J.T.et al(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因而，有可能通过替换其框架区域中与在人类抗体中通常发现的不同的暴露残基来降低非人类Fv的免疫原性。因为蛋白质抗原性可能与表面可接近性相关，表面残基的替换可能足以使小鼠可变区对于人类免疫系统来说成为“看不见的”(还参见Mark G.E.et al(1994)in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113：Thepharmacology of monoclonal Antibodies，Springer-Verlag，pp105-134)。这种人源化的过程被称为“饰面”，因为仅改变了抗体的表面，支持残基保持原状的。进一步可选择的方法在WO04/006955中列出。
“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因而，在此使用的“CDR”是指所有三个重链CDR，或所有三个轻链CDR(或者如果合适，指全部重链和全部轻链CDR)。抗体的结构和蛋白质折叠可能意味着其他残基被认为是抗原结合区域的部分，技术人员应当理解为是这样。参见例如Chothia et al.，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariableregions；Nature 342，p877-883。
双特异性抗体是具有对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。产生这种抗体的方法是本领域已知的。惯例地，双特异性抗体的重组生产是基于两条免疫球蛋白H链-L链配对的共表达，其中两条H链具有不同的结合特异性，参见Millstein et al，Nature 305537-539(1983)，WO93/08829和Traunecker et al EMBO，10，1991，3655-3659。由于H和L链的随机分配，产生了十种不同抗体结构的潜在混合物，其中仅有一种具有期望的结合特异性。可选择的方法包括将具有期望的结合特异性的可变区融合到至少包含绞链区、CH2和CH3区域的部分的重链恒定区。优选的是含有轻链结合所必需的位点的CH1区域存在于至少一个所述融合物中。编码这些融合物和如果希望，编码L链的DNA被插入到独立的表达载体中，然后共转染到适合的宿主有机体中。然而可能的是将两条或全部三条链的编码序列插入到一个表达载体中。在一个优选的方法中，双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的H链和在另一臂上提供第二结合特异性的H-L链配对组成，参见WO94/04690。还参见Suresh et al Methods in Enzymology 121，210，1986。
在本发明的一个实施方式中，提供了双特异性治疗性抗体，其中所述抗体的至少一个结合特异性在SEQ ID NO：60中描述的表位处结合人类NOGO。在本发明的另一个实施方式中，所述双特异性抗体包含重链可变区CDR H3序列MQGY(SEQ ID NO：45)。在另一个实施方式中，所述双特异性抗体包含以下的重链和轻链可变区对：H27L16(SEQ IDNO：48+SEQ ID NO：14)，H28L13(SEQ ID NO：49+SEQ ID NO：13)或H28L16(SEQ ID NO：49+SEQ ID NO：14)。
本发明的抗体可以通过用包含本发明的抗体的编码序列的表达载体转染宿主细胞来产生。通过将抗体的这些编码序列与常规的调节控制序列可操作性相连地放置，产生表达载体或重组质粒，所述调节控制序列能够控制在宿主细胞中的复制和表达和/或从宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子，和信号序列，其可以来源于其他已知的抗体。类似地，可以产生具有DNA序列的第二表达载体，所述DNA序列编码互补的抗体轻链或重链。优选的，除了所涉及的编码序列和可选择标记之外，这种第二表达载体与第一表达载体相同，以确保尽可能地功能上表达每条多肽链。做为选择，改变的抗体的重链和轻链编码序列可以存在于单个载体上。
选定的宿主细胞通过常规技术用第一和第二载体共转染(或仅用单个载体转染)，来创建包含重组或合成的轻链和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后通过常规技术培养转染的细胞来产生本发明的工程化的抗体。通过合适的分析，例如ELISA或RIA，来从培养物筛选包括了重组重链和/或轻链的缔合的抗体。可以采用相似的常规技术来构建其他改变的抗体和分子。
一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(例如，Lonza Biologics所出售的)，特别是其中宿主细胞是CHO或NS0时(见下文)。使用常规过程(例如，寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码抗体的多核苷酸。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体(minichromsomes)，其中质粒是典型的实施方式。一般地，这些载体进一步包括与轻链和/或重链多核苷酸可操作连接的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列以便于表达。编码轻链和重链的多核苷酸可以插入独立的载体中，并导入(例如，通过电穿孔)相同的宿主细胞，或者，如果希望，重链和轻链可以被插入相同的载体用于转染到宿主细胞中。因而根据本发明的一个实施方式，提供了构建编码本发明的治疗性抗体的轻链和/或重链或其抗原结合片段的载体的过程，所述方法包括向所述载体中插入编码本发明的治疗性抗体的轻链和/或重链的多核苷酸。
在另一个实施方式中，提供了编码具有SEQ ID NO：47、48或49所列序列的人源化重链可变区的多核苷酸。
在另一个实施方式中，提供了编码具有SEQ ID NO：53、54或55所列序列的人源化重链的多核苷酸。
对于本领域技术人员直接显而易见的是，由于遗传密码的冗余，对于在此公开的那些的可选择的多核苷酸也是可获得的，其将编码本发明的多肽。
对于在本发明的方法和组合物构建中采用的克隆和亚克隆步骤的合适的载体可以由本领域技术人员选择。例如，可以使用常规的pUC克隆载体系列。一种载体pUC19是可从供应点例如Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala，Sweden)商业获得的。另外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和可选择基因(例如，抗生素抗性)并且易于操作的任何载体可以用于克隆。因而，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。其他优选的载体序列包括多聚腺苷酸(poly A)信号序列，例如来自牛生长激素(BGH)的，以及β珠蛋白(betaglobin)启动子序列(betaglopro)。在此有用的表达载体可以通过本领域技术人员公知的技术来合成。典型的选择基因编码了蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素的抗性，或(b)补足营养缺陷或补充复合培养基中不可获得的营养物。选择方案可以涉及廷滞宿主细胞的生长。用编码本发明的治疗性抗体的基因成功地转化的细胞由于例如选择标记物所赋予的药物抗性而存活。另一个实例是所谓的DHFR选择标记，其中转化体在存在氨甲蝶呤的情况下培养。CHO细胞是DHFR选择的特别有用的细胞系。选择转化的宿主细胞和扩增转基因的细胞拷贝数的方法包括使用DHFR系统，参见Kaufman R.J.et al J.Mol.Biol.(1982)159，601-621，综述参见Werner RG，Noe W，Kopp K，Schluter M，”Appropriatemammalian expression systems for biopharmaceuticals”，Arzneimittel-Forschung.48(8)：870-80，1998Aug。进一步的实例是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologics)。用于酵母中的适合的选择基因是trp1基因；参见Stinchcomb et al Nature 282，38，1979。
这些载体的组件，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等等，可以从商业上的或天然的来源获得，或通过已知的过程合成，用于指导重组DNA的产物在选定的宿主中的表达和/或分泌。用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的本领域已知的许多类型的其他合适的表达载体也可以为了这个目的而被选择。
本发明还包括用含有编码本发明的抗体或等价物的序列的重组质粒转染的细胞系。对于这些克隆载体的克隆和其他操作有用的宿主细胞也是常规的。然而，最理想地，来自E.coli的各种菌株的细胞被用于克隆载体的复制和本发明的改变的抗体的构建中的其他步骤。
用于表达本发明的抗体的适合的宿主细胞或细胞系优选的是哺乳动物细胞，例如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、成纤维细胞(例如，3T3)和骨髓瘤细胞，更优选的是CHO或骨髓瘤细胞。可以使用人类细胞，因而允许分子用人类糖基化模式来修饰。做为选择，可以采用其他真核细胞系。适合的哺乳动物宿主细胞的选择以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法是本领域已知的。参见，例如以上引述的Sambrook et al.。
细菌细胞作为适合于表达本发明的抗体或其片段(例如重组Fab或ScFv)的宿主细胞可以证明是有用的(参见，例如Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130：151-188(1992))。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白质处于未折叠或不正确折叠形式或处于非糖基化形式的倾向，在细菌细胞中产生的任何重组片段应当筛选抗原结合能力的保留。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主。例如，用于表达的E.coli的各种菌株在生物技术领域中作为宿主细胞是公知的。B.subtilis、Streptomyces、其他牙胞杆菌属(bacilli)等等的各种菌株也可以用于这个方法中。
当希望时，本领域技术人员已知的酵母细胞的菌株作为宿主细胞也是可获得的，以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统。参见，例如，Miller et al.，Genetic Engineering，8：277-298，Plenum Press(1986)和其中引用的参考文献。
可以构建载体的一般方法、产生本发明的宿主细胞需要的转染方法、从这些宿主细胞产生本发明的抗体所必需的培养方法都是常规技术。一般地，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常通过在悬浮液中无血清培养细胞。同样地，一旦产生了，本发明的抗体可以根据本领域的标准方法从细胞培养物内容物中纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等。这些技术处于本领域技术人员的能力之内，并且不限制本发明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了抗体的制备。
抗体表达的又一个方法可以利用在转基因动物中表达，例如在美国专利No.4,873,316中描述的。这涉及利用动物的酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因掺入哺乳动物中时允许雌性在它的奶中产生期望的重组蛋白质。
在本发明的进一步的方面，提供了产生本发明的抗体的方法，所述方法包括培养用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞并回收由此产生的抗体的步骤。
用于克隆或表达编码本发明的抗体的载体的适合的宿主细胞是原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。适合的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如Escherichia例如E.Coli(例如ATCC31，446；31，537；27，325)，Enterobacter，Erwinia，Klebsiella Proteus，Salmonella例如Salmonella typhimurium，沙雷氏菌属，例如，Serratiamarcescans和shigella以及牙胞杆菌属，例如B.subtilis和B.licheniformis(参见DD 266 710)，假单胞菌属，例如P.aeruginosa和streptomyces。在酵母宿主细胞中，Saccharomyces cerevisiae、schizosaccharomycespombe、Kluyveromyces(例如ATCC 16，045；12，424；24178；56，500)、yarrowia(EP402,226)、Pichia Pastoris(EP183,070，还参见Peng et alJ.Biotechnol.108(2004)185-192)、Candida、Trichoderma reesia (EP244,234)、Penicillin、Tolypocladium和Aspergillus宿主例如A.nidulans和A.niger也是期待的。
虽然原核和酵母宿主细胞是本发明特别期待的，然而一般地，本发明的宿主细胞是脊椎动物细胞。适合的脊椎动物宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、人类胚肾系293、婴儿仓鼠肾脏细胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-K1、ATCC NO：CCL 61，DHFR-CHO细胞系例如DG44(参见Urlaub et al，(1986)Somatic Cell Mol.Genet.12，555-556))，特别是适合于悬浮培养的那些CHO细胞系、小鼠滋养细胞、猴肾脏细胞、非洲绿猴肾脏细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾脏细胞(ATCC CCL 34)、人类肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞，例如NS0(参见US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。
因而在本发明的一个实施方式中，提供了包含载体的稳定地转化的宿主细胞，所述载体编码在此描述的治疗性抗体的重链和/或轻链或其抗原结合片段。一般地，这种宿主细胞包含编码轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。
用编码本发明的治疗抗体或其抗原结合片段的载体转化的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法来培养。宿主细胞可以在旋转烧瓶、滚瓶或空心丝系统中培养，但对于大规模生产优选的是，对悬浮培养物特别地使用搅拌罐反应器。一般地，搅拌罐适合于利用例如起泡器(sparger)、挡板或低剪切转子的曝气(aeration)。对于泡柱和气升反应器，可以使用空气或氧气泡的直接曝气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，优选的是培养基补充有细胞保护试剂，例如pluronic F-68以帮助防止作为曝气过程的结果的细胞损伤。取决于宿主细胞特征，微载体可以用作贴壁(anchorage)依赖性细胞系的生长底物，或者细胞可以适合于悬浮培养(这是典型的)。宿主细胞特别是脊椎动物宿主细胞的培养可以利用多种操作方式，例如进料-分批、重复的分批处理(参见Drapeau et al(1994)cytotechnology 15：103-109)、扩展的分配处理或灌注培养。虽然重组转化的哺乳动物宿主细胞可以在含有血清的培养基(这样的培养基包含胎牛血清(FCS))中培养，优选的是这种宿主细胞在如Keen et al(1995)Cytotechnology 17：153-163中所公开的合成的无血清培养基中或商业上可获得的培养基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ，USA)中培养，必要时补充能量来源例如葡萄糖和合成的生长因子例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能需要那些细胞适合于在无血清条件中生长。一种适应的方法是在含有血清的培养基中培养这种宿主细胞，并重复地将80％的培养基交换为无血清培养基，从而宿主细胞学习在无血清条件中的适应(参见例如，Scharfenberg K et al(1995)in Animal Cell technology：Developmentstowards the 21st century (Beuvery E.C.et al eds)，pp619-623，KluwerAcademic publishers)。
分泌到培养基中的本发明的抗体可以使用各种技术来从培养基中回收和纯化，以提供适合于预定用途的纯化的程度。例如，与包含治疗性抗体的培养基相比，用于治疗人类患者的本发明的治疗抗体的应用一般需要至少95％的纯度，更一般地98％或99％纯度。在第一种情况下，来自培养基的细胞碎片一般使用离心、随后通过利用例如微量过滤、超滤和/或深度过滤的上清液澄清步骤来除去。各种其他技术例如透析和凝胶电泳和层析技术例如羟磷灰石(HA)、亲和层析(任选的涉及例如聚组氨酸的亲和标签系统)和/或疏水性相互作用层析(HIC，参见US5,429,746)是可利用的。在一个实施方式中，本发明的抗体在一些澄清步骤之后使用蛋白A或G亲和层析来捕获，随后是进一步的层析步骤，例如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、尺寸(size)排阻层析和硫酸铵沉淀。一般地，还采用了各种病毒去除步骤(例如，使用例如DV-20过滤器的纳滤)。在这几个步骤之后，提供了包含至少75mg/ml或更高例如100mg/ml或更多本发明的抗体或其抗原结合片段的纯化的(通常为单克隆的)制品，因而形成本发明的实施方式。适当地，这种制品基本上没有聚集形式的本发明的抗体。
根据本发明，提供了产生本发明的抗NOGO抗体的方法，所述抗体特异性地结合并中和人类NOGO-A的活性，所述方法包括步骤：
(a)提供编码抗体的重链的第一载体；
(b)提供编码抗体的轻链的第二载体；
(c)用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如，CHO)；
(d)在有助于所述抗体从所述宿主细胞分泌到所述培养基中的条件下培养步骤(c)的宿主细胞；
(e)回收步骤(d)的分泌的抗体。
一旦通过期望的方法表达，通过使用合适的分析检查抗体的体外活性。采用当前常规的ELISA分析形式来评估抗体与NOGO的定性和定量的结合。另外，在随后进行的人类临床研究来评估不考虑一般的清除机制在体内的抗体留存之前，其他体外分析也可以用于证实中和效力。
对本发明的抗体的其他修饰包括本发明的抗体的糖基化变体。在抗体的恒定区中保守位置处抗体的糖基化已知对于抗体功能具有深刻的影响，特别是效应物功能，例如如上描述的那些，参见，例如Boyd et al(1996)，Mol.Immunol.32，1311-1318。其中添加、替换、删除或修饰了一个或多个碳水化合物部分的本发明的治疗性抗体或其抗原结合片段的糖基化变体是期待的。导入天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序创建了碳水化合物部分的酶学附着的潜在位点，因而可以用于操作抗体的糖基化。在Raju et al(2001)Biochemistry 40，8868-8876中，TNFR-IgG免疫粘附素(immunoadhesin)的末端唾液酸化(sialyation)通过利用β-1，4-半乳糖基转移酶和/或α，2，3唾液酸转移酶的重新半乳糖基化(regalactosylation)和/或重新唾液酸化的过程来提高。提高末端唾液酸化被认为提高免疫球蛋白的半衰期。与大多数糖蛋白一样，在自然中抗体一般作为糖形式(glycoform)的混合物来产生。当抗体在真核的特别是哺乳动物细胞中产生时，这种混合物是特别明显的。已经开发了多种方法来制造限定的糖形式，参见Zhang et al Science(2004)，303，371，Sears et al，Science，(2001)291，2344，Wacker et al(2002)Science，298 1790，Davis et al(2002)Chem.Rev.102，579，Hang et al(2001)Acc.Chem.Res 34，727。因而，本发明涉及在此描述的多种治疗性(一般单克隆的)抗体(其可以是IgG同种型，例如IgG1)，其包含所述抗体或其抗原结合片段的预定数量(例如7个或更少，例如5个或更少，例如两个或一个)糖形式。
本发明的治疗试剂可以预防性的、或在中风事件之后/在临床症状发作时、或根据另外的需要来施用。治疗的剂量和持续时间涉及本发明的分子在人类循环中的相对持续时间，可以由本领域技术人员取决于要治疗的状况和患者的一般健康状态来调整。设想的是，可能需要在延长的时间段(例如，四到六个月)上的重复剂量给药(例如，每周一次或每两周一次)来实现最大的治疗效力。
本发明的治疗试剂的施用方式可以是向宿主递送试剂的任何适合的途径。抗体和本发明的药物组合物对于肠胃外施用，即皮下地(s.c.)、鞘内地(intrathecally)、腹膜内地(i.p.)、肌肉内地(i.m.)、静脉内地(i.v.)或鼻内地(i.n.)是特别有用的。
本发明的治疗试剂可以作为药物组合物来制备，所述组合物包含在药学上可接受的载体中有效量的本发明的抗体作为活性成分。在本发明的预防性试剂中，优选的正在生理学的pH值下缓冲的、处于待注射形式的含有工程化的抗体的水悬浮液或溶液是优选的。用于肠胃外施用的组合物通常将包含溶于药学上可接受的载体、优选的水性载体中的本发明的抗体或其混合物(cocktail)的溶液。可以使用各种水性载体，例如0.9％盐水、0.3％甘氨酸，等等。这些溶液是无菌的，一般没有颗粒物质。这些溶液可以通过常规的、公知的灭菌技术(例如，过滤)来灭菌。组合物可以含有达到近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂，等等。在这种药物制剂中本发明的抗体的浓度可以广泛地变化，即，按重量从低于约0.5％，通常在或至少约1％到多达15或20％，将主要根据液体体积、粘度等等、根据选定的特定施用方式来选择。
因而，用于肌内注射的本发明的药物组合物可以被制备以含有1mL的无菌缓冲水，和约1ng到约100mg、例如约50ng到约30mg或更多、优选的约5mg到约25mg之间的本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可以被制备以含有约250ml无菌Ringer′S溶液，和每ml Ringer’s溶液约1到约30、优选的5mg到约25mg的本发明的工程化的抗体。制备胃肠外可施用的组合物的实际方法是公知的，或者对于本领域技术人员是显而易见的，在例如Remington′sPharmaceutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania中更详细地描述。对于本发明的静脉内可施用抗体制剂的制备，参见Lasmar U and Parkins D“The formulation ofBiopharmaceutical products”，Pharma.Sci.Tech.today，page 129-137，Vol.3(3rd April 2000)，Wang，W“Instability，stabilisation and formulation ofliquid protein pharmaceuticals”，Int.J.Pharm 185(1999)129-188，Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J.，ManningM.C.，New York，NY：Plenum Press(1992)，Akers，M.J.“Excipient-Druginteractions in Parenteral Formulations”，J.Pharm Sci 91(2002)2283-2300，Imamura，K et al“Effects of types of sugar on stabilization of Protein in thedried state”，J Pharm Sci 92(2003)266-274，Izutsu，Kkojima，S.“Excipientcrystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”，J Pharm.Pharmacol，54(2002)1033-1039，Johnson，R，“Mannitol-sucrosemixtures-versatile formulations for protein lyophilization”，J.Pharm.Sci，91(2002)914-922。
Ha，E Wang W，Wang Y.j.“Peroxide formation in polysorbate 80 andprotein stability”，J.Pharm Sci，91，2252-2264，(2002)它的完整内容通过引用合并在此，读者可以特别地参考它。
优选的是，本发明的治疗试剂当在药物制品中时，以单位剂量形式存在。合适的治疗有效剂量将由本领域技术人员容易地确定。为了在人类中有效地治疗中风和其他神经疾病，设想胃肠外地、优选的s.c、i.v.或i.m.(肌内地)施用每70kg体重700到3500mg范围内的本发明抗体的一个剂量。如果必要，这种剂量可以在由医师酌情选择的合适时间间隔上重复。
在此描述的抗体可以被冻干用于保存和在使用前在适合的载体中重构。这种技术已经显示了对于常规的免疫球蛋白是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重构技术。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体，用于中风和其他神经疾病的治疗或预防。
在又进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗NOGO抗体或其功能片段以及药学上可接受的载体，用于在患有、或存在风险发生中风或其他神经疾病的人类患者中抑制神经变性和/或促进功能恢复。
本发明进一步提供了在人类中治疗或预防中风(特别是缺血性中风)和其他神经疾病/失调、特别是阿尔茨海默氏病的方法，其包括向所述有需要的人类施用有效量的本发明的抗NOGO抗体或其功能片段。除了在人类患者中治疗确定的疾病之外(或作为选择)，本发明的抗体可以用于治疗方法中来减缓或停止阿尔茨海默氏病的发展和/或发作。
进一步的，本发明提供了本发明的抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于治疗或预防中风和其他神经疾病/失调、特别是阿尔茨海默氏病的药物中的用途。
本发明还提供了在患有或存在风险发生中风或其他神经疾病/失调、特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中抑制神经变性和/或促进功能恢复的方法，其包括向所述有需要的人类施用有效量的本发明的抗NOGO抗体或其功能片段。
此外，本发明提供了本发明的抗NOGO抗体或其功能片段在制备用于在患有或存在风险发生中风和其他神经疾病/失调、特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中抑制神经变性和/或促进功能恢复的药物中的用途。
本发明进一步提供了在人类中治疗或预防中风或其他神经疾病/失调、特别是阿尔茨海默氏病的方法，包括肠胃外施用治疗有效量的本发明的抗NOGO抗体的步骤。优选的，所述抗NOGO抗体是静脉内施用的。
上文中使用的神经疾病或失调包括但不限于外伤性脑损伤、脊髓损伤、额颞叶性痴呆(tau蛋白病变)、周围神经病、帕金森氏病、Huntington’s病，特别是阿尔茨海默氏病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
本发明还提供了促进轴突出芽的方法，包括用本发明的抗NOGO抗体接触人类轴突的步骤。这种方法可以体外或体内地进行，优选的所述方法体内地进行。
因而在进一步的方面，提供了在人类患者中治疗中风(特别是缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞叶痴呆(tau蛋白病变)、周围神经病、帕金森氏病、Huntington’s病、多发性硬化，以及特别是阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括静脉内施用治疗有效量的本发明的抗NOGO抗体。
在本发明的进一步的方面，提供了促进人类受试者(例如患者)的中枢神经系统中神经元的轴突出芽的方法，所述方法包括施用(例如，静脉内施用)治疗有效量的本发明的抗NOGO抗体。
在本发明的进一步的方面，提供了本发明的抗NOGO抗体(例如，包含在此所列CDR的抗NOGO抗体)在制造用于在人类患者中治疗中风(特别是缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞叶痴呆(tau蛋白病变)、周围神经病、帕金森氏病、Huntington’s病、特别是阿尔茨海默氏病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化(ALS)的静脉内可施用药物中的用途。
在本发明的进一步的方面，提供了在患有(或易感于)中风(特别是缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞叶痴呆(tau蛋白病变)、周围神经病、帕金森氏病、Huntington’s病、多发性硬化和特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中在中枢神经系统的神经元中再生轴突过程的方法，所述方法包括施用(例如，静脉内地)治疗有效量的本发明的抗NOGO抗体的步骤。
在本发明的进一步的方面，提供了本发明的抗NOGO抗体在制造用于在患有(或易感于)中风(特别是缺血性中风)、脑损伤、脊髓损伤、额颞叶痴呆(tau蛋白病变)、周围神经病、帕金森氏病、Huntington’s病、多发性硬化和特别是阿尔茨海默氏病的人类患者中的中枢神经系统的神经元中再生轴突过程的静脉内可施用药物组合物中的用途。
在本发明的进一步的方面，提供了调节淀粉样蛋白产生肽(amyloidogenic peptide)的产生的方法，包括用本发明的抗NOGO抗体接触表达前体和NOGO多肽(例如，人类NOGO-A)的细胞的步骤，所述淀粉样变性肽衍生自所述前体。在典型的实施方式中，所述前体是APP。在进一步典型的实施方式中，所述淀粉样变性肽是Aβ，最优选的是Aβ40、Aβ42或两者的组合。
如在此使用的，术语“功能恢复”是指在例如缺血性事件或损伤之后或临床症状发作后在受试者中运动和/或感觉和/或行为的改善。人类中的功能恢复可以通过工具来评估，所述工具被设计以测量基本神经功能例如运动强度、感觉和协调、认知功能例如记忆、语言和跟随指导的能力、功能能力例如每天的生活或器械活动的基本活动力。基本神经功能的恢复可以使用工具例如NIH Stroke Scale(NIHSS)来测量，认知功能的恢复可以利用神经心理学测试例如Boston Naming Test、Trail-making Tests和California Verbal Learning Test来测量，每天生活的活动力可以用仪器例如ADCS/ADL(Alzheimer′s Disease ClinicalStudies/Activities of Daily Living)scale或Bristol Activities of Daily LivingScale来测量，所有的测试和度量都是本领域已知的。
以下实施例说明但不限制本发明。
实施例1，人源化抗NOGO抗体的构建和表达
通过构建包括限制性位点的重叠寡核苷酸用于克隆到Rld和Rln哺乳动物表达载体(或用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质的任何其他适合的表达载体)中以及人类信号序列，从头开始制备人源化VH和VL构建体。Hind III和Spe I限制性位点被导入以构成(frame)含有CAMPATH-1H信号序列的VH结构域用于克隆到含有人类γ1突变的恒定区的Rld中，以防止ADCC和CDC活性(L235A和G237A-EU Index编号系统)。将Hind III和BsiWI限制性位点导入以构成含有CAMPATH-1H信号序列的VL结构域用于克隆到含有人类kappa恒定区的Rln中。
CAMPATH-1H信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ.ID.NO：31)
产生编码人类IgG重链氨基酸序列的质粒，其中CDR是表2中描述的那些。通过使用Quickchange试剂盒(Stratagene)导入单个点突变G95M(Kabat编号)从那些现有的较早的质粒产生编码人类IgG重链氨基酸序列的质粒，其中CDR是如表3中描述的那些。
以下表格公开了在质粒载体中产生了哪些全长重链蛋白质序列，以及哪些序列是配对的，配对的全长(FL)重链序列的氨基酸序列中仅有的差异是在可变区的CDR H3内G95M(kabat编号)处的替换：
表8，
  表2中定义的CDR   G95M替换(来形成表3的CDR H3)
  H1 FL(SEQ ID NO：35)   未进行
  H6 FL(SEQ ID NO：15)   H26 FL(SEQ ID NO：53)
  H16 FL(SEQ ID NO：16)   H27 FL(SEQ ID NO：54)
  H20 FL(SEQ ID NO：42)   H28 FL(SEQ ID NO：55)
编码重链的质粒然后与以下全长轻链序列之一共转染到CHO细胞中(细节参见实施例2)：L11FL(SEQ ID NO：36)，L13FL(SEQ IDNO：17)或L16FL(SEQ ID NO：18)。
并行地，产生称为HcLc的嵌合体(其是2A10的嵌合体(SEQ ID NO：9和10——包含2A10鼠VH(SEQ ID NO：7)和VL(SEQ ID NO：8)以及人类IgG恒定区的的全长链)。
实施例2，CHO细胞中的抗体表达
分别编码重链和轻链的Rld和Rln质粒(或适用于哺乳动物细胞中的其他载体)瞬时地共转染到CHO细胞中，并以小规模或大规模表达来产生抗体。做为选择，通过电穿孔将相同的质粒共转染到DHFR-CHO细胞中，使用无核苷培养基选择表达合适的抗体的稳定的多克隆细胞群体(Rld含有DHFR基因，Rln含有新霉素选择标记物)。在某些分析中，直接地从组织培养上清液评估抗体。在其他分析中，通过亲和层析在蛋白A琼脂糖上回收和纯化重组抗体。
实施例3人源化的抗NOGO抗体结合NOGO
在PBS中0.05-1μg/ml的GST-人类NOGO-A56(参见实施例5)包被在Nunc Immunosorp平板上(100μl每孔)在4℃过夜。用TBS+0.05％Tween(TBST)清洗反应孔(well)一次，随后与TBST中的2％BSA在室温下孵育1小时来阻断非特异性结合位点。抗体在TBST+2％BSA中稀释到10μg/ml，从中制备1/2稀释物。抗体一式两份添加到反应孔，在室温下孵育1小时。用TBST洗涤反应孔三次，与抗人类kappa过氧化物酶共轭物(1∶2000)孵育1小时。反应孔用TBST洗涤三次，然后与每个反应孔100μl OPD过氧化物酶底物(Sigma)孵育10分钟。显色反应通过添加25μl浓缩的H2SO4来停止。使用平板读数器测量490nm处的光密度。减去从没有抗体的反应孔读取的背景值。
附图1-4说明了在ELISA分析中人源化抗体与嵌合体(称为HcLc，其是2A10的嵌合体(包含2A10鼠VH(SEQ ID NO：7)和VL(SEQ IDNO：8)和人类IgG恒定区)相比对GST-人类NOGO-A56(细节参见实施例5)的剂量依赖性结合。Y轴显示了在490nm测量的光密度(OD)，在反应孔中捕获的抗体的定量测量。X轴显示了在每个数据点每个反应孔使用的抗体浓度(mcg/ml)。
附图1-4中使用的抗体材料是通过多克隆表达系统或大规模瞬时转染产生的纯化的抗体。在这些情况下，IgG水平通过ELISA和光密度来定量。
附图1-4中显示的实验的结果显示，G95M突变的包括改善了抗体的性能。唯一例外是附图3和4中显示的H27L16，其非常不良地进行。我们相信，这个数据由H27L16分析的未鉴别的技术问题引起，因为在其他分析中H27L16另外具有一致地良好表现(在附图1和2显示的ELISA中，以及在BIAcore分析中(表9和10))。H27L16在后来的实验中也显示了工作得非常好(参见附图11和12)。
实施例4，抗体定量方案
Nunc Immunosorp平板用碳酸氢盐缓冲液(Sigma#C3041)中2μg/ml的山羊抗人IgG链捕获抗体(Sigma#I3382)包被，在4℃孵育过夜。平板用含有0.05％Tween20的TBS(TBST)洗涤两次，用含有2％(或1-3％)BSA的200μl TBST(封闭缓冲剂)在室温下封闭1小时。平板用TBST洗涤两次。含有抗体的组织培养上清液跨越平板在2倍稀释步骤中滴定到封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。平板用TBST洗涤三次。HRP轭合的抗体H23(山羊抗人kappa链，Sigma#A7164)在TBST中1∶2000稀释，每个反应孔添加100μl。平板在室温下孵育1小时。平板用TBST洗涤三次，用100μl Fast-OPD底物(Sigma#P9187)显色。容许颜色显现5-10分钟，之后用25μl 3M H2SO4停止ELISA。在490nM处读取平板的吸光度，通过参考标准曲线测定抗体浓度。
实施例5，NOGO-A片段的产生(NOGO-A56，SEQ ID NO：32)
编码包含人类NOGO-A的氨基酸586-785和GST标签(SEQ ID NO：32)的多肽的cDNA序列通过将编码人类NOGO-A的氨基酸586-785的cDNA克隆到pGEX-6P1的BamHI-XhoI位点中来产生称为GST-人类-NOGO-A56的GST标签的融合蛋白来创建。质粒在具有100μg/ml氨苄青霉素的2XTY培养基中在BL21细胞中表达，随后用0.5mM的IPTG在37℃诱导3小时。通过超声处理裂解细胞团，根据厂家说明书使用Glutathione-琼脂糖(Amersham Pharmacia)纯化融合蛋白。纯化的蛋白质使用还原的谷胱甘肽洗脱，相对于PBS广泛地透析，使用BSA标准物和基于BioRad coomassie的蛋白质分析来定量，然后以等分量储存在-80℃。
实施例6，人源化的抗NOGO单克隆抗体的BiaCore分析
抗NOGO单克隆抗体(mAb)与重组表达的GST-人类NOGO-A的结合动力学使用Biacore3000生物传感器或BIAcore T100来分析。hNOGO-A芯片如下制备：
方法
GST-人类NOGO-A56使用为目标固定水平设计的Biacore Wizard程序通过伯胺联结固定在CM5芯片上。通过流通50mM N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)和200mM N-乙基-N’-二甲基氨基丙基碳化物(EDC)的溶液来活化CM5传感器表面。然后使醋酸钠缓冲剂中的GST-人类NOGO-A56，pH5.0或pH4.5，通过芯片上并固定。在固定完成之后，通过注射1M盐酸乙醇胺、pH8.5来封闭任何仍然活化的酯。
抗NOGO mAb在HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，和0.005％P-20表面活性剂)中稀释用于BIAcore 3000，或在T100的情况下在HBS-EP+(10mM HEPES，pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％P-20表面活性剂)中稀释，在限定的抗体浓度范围内进行结合研究。所有的运行都参考空白的传感器表面(如早先描述的活化和封闭但没有添加配体的表面)。结合分析对于BIAcore 3000使用BIAevaluation动力学分析软件版本4.1，以及T100动力学分析软件版本1.0来进行。本发明的其他抗体的Biacore分析基本上遵照与在此描述相同的方案。除非另有说明，BIAcore实验在25℃进行。
在以下的结果小节中，每个数据表格代表从单独的实验获得的结果。
结果-表9
  抗体   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD(pM)
  HcLc   3.19E6   2.49E-3   779
  H27L13   6.2E6   1.8E-3   291
  H26L13   3.23E6   3.11E-3   963
  H28L13   7.26E6   3.3E-3   454
  H27L16   6.24E6   1.21E-3   194
  H28L16   7.25E6   2.14E-3   296
结果-表10
Figure GSB00000912100000331
Figure GSB00000912100000341
结果-表11
  抗体   ka(1/Ms)   Kd(1/s)   KD(nM)
  HcLc   3.17E6   2.33E-3   0.74
  H26L13   3.45E6   2.88E-3   0.87
  H27L13   6.58E6   1.83E-3   0.28
  H28L13   6.97E6   3.17E-3   0.45
  H28L16   6.89E6   1.95E-3   0.28
实施例7：利用解离速率(off-rate)排列的人源化抗NOGO单克隆抗体 的BiaCore分析
如同为了动力学分析的制备GST-人类NOGO-A56芯片。细胞上清液直接取自CHO-K1细胞的瞬时转染。这些直接通过传感器表面，测量相互作用。模拟转染的细胞上清液被用于双重参考以除去由于组织培养基的任何伪差。所有的运行都参考空白的感受器表面(如早先描述的活化和封闭但没有添加配体的表面)。使用BIAevaluation动力学分析软件版本4.1进行结合分析。
实施例8：肽作图
获得跨越GST-人类NOGO-A56结构域(SEQ ID NO：32)的NOGO-A56部分的47个重叠肽(从MimotopeTM)。除了在C-末端具有GSG-生物胞素标签的第一个肽之外，肽长度是16个氨基酸，十二个氨基酸与邻近的肽重叠(每个肽进一步在N-末端包含生物素-SGSG序列)。肽被用于表位作图2A10和H28L16的结合位点。
表位作图的方法：
无菌水中5μg/ml的链霉抗生物素蛋白包被在Nunc immunosorp平板(100μl每孔)上37℃过夜。平板用含有0.05％Tween的PBS(PBST)清洗3次，然后用PBST中的3％BSA在4℃封闭过夜。平板用TBST洗涤3次。然后以大约10μg/ml(在PBST中的3％BSA中稀释)的浓度将肽添加到反应孔，在室温下孵育1小时。平板用PBST洗涤3次，然后与在PBST中的3％BSA中稀释到5μg/ml的抗NOGO抗体孵育1小时。平板用PBST洗涤3次，随后与抗人或抗小鼠kappa过氧化物酶共轭物(1∶1000，在PBST中的3％BSA中稀释)孵育1小时。平板用PBST洗涤3次，然后与每反应孔100μl OPD过氧化物酶底物(Sigma)孵育10分钟。通过添加50μl 3摩尔H2SO4来停止显色反应。使用平板读数器测量490nm处的吸光度。
结果在附图5(使用H28L16的表位作图)、附图6(使用2A10的表位作图)中显示。附图5和6分别显示了2A10和H28L16的表位作图的结果。显示的数据表明，2A10和H28L16结合于肽6和7，其NOGO特异性部分分别在SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74中给出，两者都含有序列VLPDIVMEAPLN。这些结果表明，VLPDIVMEAPLN(SEQ IDNO：60)含有2A10和H28L16的结合表位。
实施例9：HcLc与含有CDR H3的G95M突变的HcLc的比较
HcLc的修饰的变体通过使用Quikchange试剂盒(Stratagene)导入单个点突变G95M(Kabat编号)从现有的表达质粒构建。可变重链结构域Hc(G95M)蛋白质的蛋白序列在SEQ ID 59中给出。
Hc(G95M)Lc如早先描述的在CHO细胞中表达。抗体如实施例4中描述的定量。附图7和8显示了Hc(G95M)Lc与HcLc的结合活性的比较，如使用人类NOGO-A结合ELISA所测定的，此时NOGO以0.05(附图7)和1μg/ml(附图8)包被在Nunc immunosorp平板上。以下的表格显示了Hc(G95M)Lc和HcLc的结合亲和性的比较。
表12，基于一个实验通过Biacore排列测量的解离速率
  抗体   重链可变区的序列ID   解离速率kd(1/s)
  H6L13   11   1.38E-2
  H6(G95M)L13   47   4.31E-3
  HcLc   7   2.66E-3
  Hc(G95M)Lc   59   6.14E-4
数据展现了，CDR H3内的G95M替换不仅提高了人源化抗体(H6L13)的结合活性，还提高鼠供体抗体2A10(HcLc)的结合活性。
实施例10：含有CDRH3中的替换的NOGO抗体的构建和测试
通过在CDR H3中含有的残基、或前述亮氨酸中的单个点突变创建了90个重链可变区的面板。特别地，制造编码重链的载体(根据H6FL，SEQ ID NO：15)，其编码重链可变区，其中CDR H3中的每个氨基酸残基和前述亮氨酸使用除半胱氨酸外的所有其他天然存在的氨基酸替换(使用Quikchange试剂盒(Stratagene))，与轻链(L13FL，SEQ IDNO：17)一同表达来得到90种不同的抗体。在ELISA和Biacore实验中分析这些抗体对NOGO的结合。
附图9和10显示了与H6FL L13FL相比H6FL的变体的结合活性的比较。表14和15显示了通过Biacore测量的解离速率动力学的比较，仅显示了在Biacore分析中具有可测量的解离速率并在ELISA中具有与H6L13可比较的结合活性的那些抗体的结果。
表14
  亲本抗体   VH CDR3   kd(1/s)
  H6L13   MQGY   4.85E-03
  HcLc   GQGY 5.58E-03
  H6L13   GQNY   9.66E-03
  H6L13   GQLY   1.32E-02
  H6L13   IQGY   1.72E-02
  H6L13   RQGY   1.75E-02
  H6L13   GQSY   1.86E-02
  H6L13   GQGY 1.98E-02
  H6L13   GSGY   2.07E-02
  H6L13   GDGY   2.12E-02
  H6L13   GQGW   2.16E-02
  H6L13   GIGY   2.57E-02
  H6L13   GQYY   3.28E-02
  H6L13   GQFY   3.35E-02
  H6L13   WQGY   1.98E-02
  H6L13   GAGY   3.15E-02
  H6L13   GLGY   1.90E-02
  H6L13   GVGY   1.78E-02
  H6L13   GQWY   1.77E-02
结论
结果表明，保持了鼠2A10以及含GQGY的抗体H6L13的结合性质的抗体是含有以下CDR H3的那些：RQGY、IQGY、MQGY、GDGY、GIGY、GSGY、GQNY、GQYY、GQSY、GQLY、GQFY、GQGW、WQGY、GAGY、GLGY、GVGY、GQWY。
实施例11，含有GQGY的mab(H20L16)与G95M变体mabs(H27L16和H28L13和H28L16)的比较
如上所述制造表15中所列的抗体。
表15-人源化2A10抗Nogo-A抗体给出完整抗体的回复突变的总数(2×重链+2×轻链)
  抗体   每个完整抗体/四聚体的回复突变的总数
  H20L16   22
  H28L16   22
  H28L13   16
  H27L16   32
体外结合特征
为了排列抗体，在包括ELISA、反向形式ELISA、竞争性ELISA、Biacore和通过流式细胞计的一系列分析中研究了它们的结合性质。
11.1在ELISA中与重组人类NOGO-A的结合
通过各种相关的ELISA分析研究了抗体结合重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A56)的能力(在与实施例3中描述的相关但稍微不同的方案中进行)。在第一分析中，重组Nogo-A以各种不同的抗原浓度直接包被在平板上。抗原以1mcg/ml或0.05mcg/ml加载时直接结合ELISA的结果分别在附图11A和附图11B中显示。数据证实了，当与嵌合形式的亲本抗体(HcLc)比较时，所有的抗体显示了对重组人类Nogo-A的可比较的结合活性。在更高的抗原包被浓度下，所有抗体产生了相似的EC50值。相比之下，在较低的抗原包被浓度下，分析能够辩别这些抗体。虽然没有获得饱和曲线，系列的(on the lines)趋势分析揭示了以下排列顺序：H27L16＞H28L16、H28L13、H20L16。
在平行实验中，分析的形式是反向的。在这种形式中，抗体被捕获到平板上，使用GST标签检测重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A-56)的结合。反向形式ELISA的结果在附图12中显示。数据证实了，当与嵌合形式的亲本抗体(HcLc)比较时，所有的抗体显示了对重组人类Nogo-A的可比较的结合活性。这种形式的结合ELISA不能区分这些抗体。
11.2竞争ELISA
使用竞争ELISA评估了抗体与亲本抗体直接竞争人类Nogo-A上的相同表位的能力。重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A56)包被在平板上。亲本抗体2A10和人源化抗体在添加到平板之前预先混合。2A10的结合使用抗小鼠IgG-HRP共轭物(Dakocytomation，#P0260)来定量。附图13中显示的结果证实了，所有四种抗体可以与2A10竞争。这表明，人源化抗体和亲本抗体识别人类Nogo-A上的重叠表位。此外，人源化抗体的活性与嵌合体HcLc是可比较的或更好的。结果表明，H27L16、H28L16和H28L13比H20L16更有效力。
11.3 Biacore亲和性测量
Biacore被用于使用两种不同的方法来测定亲和性和排列抗体。在第一种方法中，重组Nogo-A与芯片的表面联结，抗Nogo-A抗体通过这个表面。在第二种方法中，蛋白A被用于将抗体捕获在芯片的表面上，重组GST-人类Nogo-A56通过该表面。表16中显示的结果通过将抗原联结到表面来获得，证实了所有四种抗体显示了与亲本抗体(HcLc)可比较的或更好的亲和性。根据六个独立运行的平均值，就总体亲和性而言按以下顺序排列抗体：H27L16＞H28L16＞H28L13＞H20L16，与直接结合ELISA的排列顺序一致(附图11B)。对于H27L16和H28L16来说，人源化抗体展现了亲本抗体(HcLc)的2-3倍的亲和性。
表16-如使用Biacore T100测定的抗Nogo-A人源化抗体与重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A56)的结合动力学。抗原通过伯胺联结结合到CM5芯片上。抗体以各种浓度流通(0.125-8nM)。数值显示了一式两份进行的六个独立运行的平均值和标准偏差(括号中)。在计算平均值和标准偏差之前独立地分析每个完整的数据组。**对H20L16仅分析了11组数据，一组不能被分析。
  抗体   Ka   kd   KD(nm)
  H20L16**   5.37E6(7.65E5)   9.70E-3(2.65E-3)   1.80(0.31)
  H27L16   3.96E6(9.93E5)   2.30E-3(1.11E-3)   0.56(0.15)
  H28L13   8.13E6(1.35E6)   9.10E-3(2.65E-3)   1.11(0.18)
  H28L16   6.97E6(6.62E5)   4.43E-3(1.18E-3)   0.64(0.15)
  HcLc   3.80E6(7.11E5)   7.09E-3(2.22E-3)   1.86(0.32)
按照与ELISA类似的方式，还以反向形式评估了抗体结合重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A 56)的动力学(参见实施例11.1)。在这个分析中，人源化抗体通过蛋白A捕获在CM5芯片上。六个独立运行的平均结果在表17中显示。与反向形式的ELISA一致，在反向形式Biacore中，所有人源化Nogo-A抗体显示了与嵌合体(HcLc)相似的结合动力学。
表17-如使用Biacore T100测定的抗Nogo-A人源化抗体与重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A5+6)的反向形式结合动力学。蛋白A通过伯胺固定到大约4000RU，用于捕获200-300RU的样品抗体。重组人类Nogo-A以各种浓度流通(0125-8nM)。数值显示了一式两份进行的三个独立运行的平均值和标准偏差(括号中)。在计算平均值和标准偏差之前独立地分析每个数据组。
  抗体   Ka   Kd   KD (nM)
  H20L16   1.01E6(1.35E5)   3.13E-4(2.79E-5)   0.31(0.036)
  H27L16   9.93E5(2.02E4)   3.04E-4(1.83E-5)   0.31(0.019)
  H28L13   1.12E6(1.21E5)   3.84E-4(3.24E-5)   0.34(0.015)
  H28L16   1.18E6(8.32E4)   4.01E-4(2.48E-5)   0.34(0.032)
  HcLc   1.38E6(3.70E5)   5.69E-4(1.54E-4)   0.41(0.062)
11.4结合天然人类NOGO
为了展现人源化抗体以与亲本抗体可比较的分布型(profile)结合天然人类Nogo-A，开发了两种基于流式细胞计的分析。在第一种分析中，产生在细胞表面表达人类Nogo-A细胞外结构域的基于CHO-K1的细胞系。人源化抗Nogo-A抗体的结合通过流式细胞计使用PE标记的抗人类IgG(Sigma，#P8047)来评估。以下的附图14显示了抗Nogo-A抗体在CHO-Nogo-A细胞系上的典型分布。虽然该分析不是足够敏感以区分这些抗体，结果证实了所有四种抗体可以以与嵌合体可比较的水平识别细胞表面表达的人类Nogo-A。没有抗体识别亲本细胞系(CHO-K1-数据未显示)。
在第二种分析中，使用人类成神经细胞瘤细胞系IMR32评估人源化抗体结合天然Nogo-A的能力。这种细胞系特征在于Nogo-A蛋白质的高细胞内/低细胞表面水平。为了提高结合信号，建立分析来检测细胞内Nogo-A(ER-驻留的)。在用抗Nogo-A人源化抗体染色之前，IMR32细胞进行渗透化和固定。使用PE标记的二级抗人类IgG（Sigma，#P8047)来检测抗体与Nogo-A的结合。以下的附图15中显示的结果证实了，所有的抗体以与亲本抗体HcLc可比较的或更高的水平结合细胞内Nogo-A。与来自CHO-Nogo-A细胞系的结果一起，这些数据证实了人源化抗体可以以与嵌合体HcLc相比可比较的或更好的水平识别更为天然形式的Nogo-A蛋白质。这些分析不是足够敏感的以排列抗体面板。
11.5轴突长出分析
在早先描述的基于定量NO的分析中，测试人源化抗Nogo-A抗体中和Nogo-A的轴突长出(NO)抑制活性的能力。在该分析中测试的抗体在它们对Nogo-A的结合动力学的基础上来选择。对高亲和性人源化抗体即H28L16、H27L16、H20L16以及供参考的它们的亲本抗体2A10(小鼠单克隆的)和HcLc(人类小鼠嵌合体)检测了Nogo-A中和。为了比较，还在分析中测试了抗体11C7(参见实施例13)。
为了测试选定的人源化抗体的中和活性，在添加小脑粒状神经元(CGN)之前，反应孔用人类重组GST-人类Nogo-A56包被并在37℃用各种浓度的抗体处理1小时。对照孔用HBSS处理。对每个孔测量每个轴突的平均轴突长度。附图16显示了在该分析中测试的人源化抗体的结果。对照抗体的面板(对照IgG，纯化的小鼠IgG；Campath和另一个不相关的人源化抗体)用于确认活性的特异性。作为进一步的对照，相同的人源化抗体在GST包被的平板上滴定。结果证实了，H28L16、H27L16和H20L16逆转了Nogo-A介导的轴突长出抑制作用，达到对亲本抗体(2A10和HcLc)所观察的相似的程度。效果似乎是牢固(robust)和稳定的，在十一个独立的轴突长出实验中的八个中用H28L16见到。相比之下，人源化抗体不提高GST包被的平板上的轴突长出，对照抗体的面板不显示任何剂量依赖性的抑制作用逆转，证实了人源化抗体的效果特异于Nogo-A介导的抑制作用。为轴突长出呈现的数据选自多个重复实验。虽然没有显示的许多重复看起来在性质上是可变的，相信的是，显示的数据反应了本发明的抗体在轴突长出分析中降低NOGO的抑制效果方面的真实活性。
实施例12，H28L16的进一步的特征
12.1对全长重组Nogo-A的结合
通过直接结合ELISA分析研究了抗体结合全长细胞外结构域重组人类Nogo-A(GST-人类Nogo-A-ECD)的能力。在这种情况下，ECD是落入人类NOGO A的大约位置186-1004的区域(开始于DETFAL(SEQ IDNO：95)、以ELSKTS(SEQ ID NO：96)结束的部分)的剪接变体。
重组GST-人类Nogo-A-ECD直接以1μg/ml包被在平板上。附图17中的数据证实了，与亲本(HcLc)或H20L16相比，H28L16可以以可比较的或更好的水平识别GST-人类Nogo-A-ECD。
12.2 Fc功能的抑制作用
为了改善候选物的安全分布型，重链恒定区的CH2结构域内残基L235和G237(EU Index系统)被突变成丙氨酸残基，从而降低触发抗体介导的免疫学效应物功能的可能性。降低的人类Clq结合被用作Fc功能抑制的替代。以下的附图18显示了与Campath-IgG1(野生型)相比，H28L16具有显著降低的C1q结合活性，与带有相同突变(Fc突变的抗体(Fc-))的Campath IgG1构建体和Campath IgG4是可比较的。这些数据表明，H28L16中存在的CH2结构域突变将显著地降低触发Fc介导的效应物功能的可能性。
12.3 直系同源物(orthologue)结合
为了证实H28L16显示了与亲本抗体(HcLc)可比较的对Nogo-A的各种直系同源物的结合活性，进行了一系列的结合分析。以下的附图19A-D显示了对分别来自大鼠(SEQ ID NO：94)、猕猴(SEQ ID NO：92)、狨猴(SEQ ID NO：93)和松鼠猴(SEQ ID NO：91)的重组NOGO(GST-人类Nogo-A 56)的直接结合ELISA的结果。在所有情况中，H28L16显示了与嵌合抗体(HcLc)相比可比较的或更好的活性。计算的EC50值非常类似于对结合人类重组Nogo-A计算的那些。
使用Biacore测定了与HcLc和11C7相比较的H28L16对各种Nogo-A直系同源物的结合动力学。以下的表18和表19显示了在两种不同形式的分析中的结合动力学。当重组Nogo-A直接联结到CM5芯片时(表18)，大鼠、猕猴、松鼠猴和狨猴的结合动力学非常类似于人类的(范围＝0.33-0.67nM)。当分析的形式被逆转、抗体利用蛋白A捕获在芯片上时(表19)，H28L16对大鼠Nogo-A的结合亲和性为对人类Nogo-A的约四分之一。对于猕猴Nogo-A(为人类的8.5分之一的亲和性)和另一种灵长类直系同源物(为人类的12-17分之一的亲和性)观察到类似的趋势。在两种方向的分析中，嵌合抗体HcLc显示了结合Nogo-A的直系同源物的相似分布型。由于不清楚哪种分析形式最好地代表了体内状况，可以从这项研究得出的初步结论是1)H28L16保持了与嵌合抗体HcLc相关的直系同源物交叉反应性分布型，2)HcLc对大鼠和猕猴Nogo-A的亲和性处在对人Nogo-A的亲和性的4倍到8.5倍之间，在一定条件下可能是非常相似的。
表18-使用Biacore T100测定的H28L16、11C7和HcLc对人类Nogo-A的重组直系同源物的结合动力学。大约140-180RU的各种Nogo-A直系同源物通过伯胺联结捕获在CM5芯片上。抗体以各种浓度流通(0.125-8nM)。数值显示了一式两份进行的1-2个独立运行的平均值和标准偏差(括号中)，在计算平均值和标准偏差之前独立地分析每个数据组。*对于抗体11C7由于不可解释的曲线，丢弃一组曲线。
Figure GSB00000912100000431
表19-在Biacore T100上测定的H28L16、11C7和HcLc对人类Nogo-A的重组直系同源物的反向形式结合动力学。蛋白A以大约4000RU固定在表面上，抗Nogo-A抗体以大约300-400RU被捕获。取决于所述构建体，重组蛋白质(GST-NOGO-A56)以各种浓度(0.125-64nM)流动通过。所有的运行一式两份地进行。数值显示了1-3个独立运行的平均值和标准偏差(括号中)，每个运行一式两份地进行，在计算平均值和标准偏差之前独立地分析每个数据组。
Figure GSB00000912100000441
12.4物理性质
通过SEC-HPLC和SDS-PAGE评估了H28L16和H20L16的物理化学性质。SEC-HPLC使用100mM磷酸钠、400mM氯化钠pH 6.8和TSKG3000 SW xl 30cm x 7.8mm不锈钢柱以1.0ml/分钟进行，在214nm和280nm处检测。在加载10μg产物并用Sypro Ruby染色的4-20％NovexTris-HCL凝胶上进行SDS-PAGE。使用pH 3.5-10两性电解质(ampholines)在Beckman MDQ上进行C-IEF。
获得以下结果：
表20-抗Nogo-A抗体的尺寸排阻层析(SEC)HPLC分析。显示的数值是分配到三种不同种类的每一种中的抗体的百分比。
  抗体   聚集体％   单体％   片段％
  H28L16   0.50   99.50   0.00
  H20L16   14.21   85.75   0.05
表21-抗Nogo-A抗体的SDS-PAGE分析。显示的数值是主要条带中存在的抗体的百分比。
Figure GSB00000912100000451
SEC-HPLC数据表明，与H28L16(H28L16)相比，H20L16对聚集更为敏感。如果在此报告的数据在大的规模上重复，这可能影响生产过程产生临床使用可接受质量(＞95％单体)的材料的能力。SDS-PAGE数据显示了，两种候选物都是可接受的，两者都显示了典型的分布。
实施例13，H28L16与11C7的比较
称为11C7的鼠抗Nogo-A抗体在WO2004052932中描述，其是针对肽表位产生的。嵌合的11C7根据WO2004052932中提供的序列信息来制造。为了比较2A10和11C7的结合表位，建立竞争性ELISA来研究11C7和2A10是否识别Nogo-A上的重叠表位。如以下附图20中显示的，HcLc(2A10的嵌合形式)能够与2A10竞争结合人类重组Nogo-A，而11C7显示与2A10没有竞争，甚至是在高达100mcg/ml的浓度下。
实施例14：竞争性ELISA来展现肽与人类NOGO-5+6直接竞争结合 NOGO H28L16的能力
竞争性ELISA的方法
使用竞争性ELISA来评估肽与NOGO-A(GST-人类Nogo-A56)直接竞争结合NOGO H28L16的能力。在碳酸氢盐缓冲剂中5g/ml的兔抗人类IgG(Sigma，#I-9764)包被在Nunc immunosorp平板(100μl每孔)上在4℃过夜。平板用含有0.05％Tween的TBS(TBST)清洗3次，然后用TBST中的1％BSA在室温下封闭1小时。H28L16然后在室温下捕获在平板上1小时(1μg/ml，在TBST中的1％BSA中稀释，50μl每孔)。平板用TBST洗涤3次。肽(0到100g/ml)和1μg/ml浓度(在TBST中的1％BSA中稀释)的GST-人类NOGO-A56在添加到反应孔之前预先混合，在室温下孵育1小时。平板用TBST洗涤3次，然后与兔抗GST过氧化物酶共轭物(Sigma，#A7340，1∶2000，在TBST中的1％BSA中稀释)孵育1小时。平板用TBST洗涤3次，然后与每孔50l OPD过氧化物酶底物(Sigma)孵育10分钟。通过添加25l浓缩的H2SO4来停止显色反应。使用平板读数器测量490nm处的吸光度。
附图21中显示的结果证实了在表位作图ELISA(实施例8)中是阳性的肽6和7可以与GST-人类NOGO-A56竞争结合H28L16。这表明在表位作图研究中是阳性的肽含有H28L16结合的表位。不含有建议的表位的肽16和17(其含有NOGO肽，但不与肽6或7重叠)不与NOGO-5+6竞争。
实施例15：基于NOGO抗体变体G101S/Q37R的人源化抗NOGO单克隆 抗体的ELISA分析
H6的重链可变区(SEQ ID NO：11)的修饰的变体G101S(也称为H100(SEQ ID NO：63))通过将单个替换G101S(Kabat编号)导入如上所述的CDR H3中来产生。类似地，L13的轻链可变区(SEQ ID NO：13)的修饰的变体Q37R通过将单个替换(Kabat编号Q37R)导入框架区域来产生(以形成L100)。可变轻链结构域Q37R的蛋白质序列在SEQ ID NO：67中给出。
编码含有G101S/Q37R替换的重链和轻链的全长版本的基因如早先描述的在CHO细胞中表达，并如早先描述的在直接结合ELISA中分析。
当抗原以0.05μg/ml加载时直接结合ELISA的结果在附图22中显示。数据证实了，当与H27L16比较时，抗体H100L100显示了对重组GST-人类NOGO-A56的可比较的结合活性，当与H6L13相比时H100L100具有改进的结合分布型。相应的EC50值在以下的表格中显示：
表22：与H6L13和H27L16相比较的G101S/Q37R变体的EC50测量值
  抗体   EC50值
  H6L13   0.086
  H27L16   0.052
  H100/L100   0.048
实施例16：根据CDR H3变体G101S的人源化抗NOGO单克隆抗体的 Biacore分析
H6的重链可变区(SEQ ID NO：11)的修饰的变体H100通过将单个替换G101S(Kabat编号)导入CDR H3中来产生。可变重链结构域H100蛋白的蛋白质序列在SEQ ID NO：63中给出。类似地，L13的轻链可变区(SEQ ID NO：13)的修饰的变体L100和L101通过将单个替换(分别是Kabat编号Q37R和Q45R)导入框架区域来产生。可变轻链结构域L100和L101蛋白的蛋白质序列分别在SEQ ID NO：67和SEQ IDNO：68中给出。
H100L100和H100L101的全长版本如早先描述的在CHO细胞中表达。表23显示了H6L13与H100L100和H100L101的结合亲和性的比较，表明了当与H6L13相比较时H100L100和H100L101具有改进的结合亲和性。在这个实施例中，该方法基本上如实施例6中描述的进行，其中CM5芯片通过以5μl/ml在芯片上通过NHS和EDC溶液7分钟来活化，在通过芯片之前，NOGO悬浮在10nM醋酸钠缓冲剂(pH 4.5)中。
表23-与H6L13相比较，H6可变重链的G101S变体与L13可变轻链的变体组合的Biacore测量值
Figure GSB00000912100000471
NOGO抗体序列概述(表24)
Figure GSB00000912100000481
Figure GSB00000912100000491
Figure GSB00000912100000501
序列
SEQ ID NO.1：2A10 CDR-H1
SYWMH
SEQ ID NO.2：2A10CDR-H2
NINPSNGGTNYNEKFKS
SEQ ID NO.3：2A10 CDR-H3
GQGY
SEQ ID NO.4：2A10 CDR-L1
RSSKSLLYKDGKTYLN
SEQ ID NO.5：2A10 CDR-L2
LMSTRAS
SEQ ID NO.6：2A10CDR-L3
QQLVEYPLT
SEQ ID NO.7：2A10，VH(鼠)
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV
DKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.8：2A10，VL(鼠)
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGS
GTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.9：嵌合的重链Hc
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.10：嵌合的轻链Lc
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLL
IYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID 11：2A10 VH人源化的构建体H6
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.12 2A10 VH人源化的构建体H16
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.13：2A10 VL人源化的构建体L13
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.14：2A10VL人源化的构建体L16
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.15：2A10重链人源化的构建体H6
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.16：2A10重链人源化的构建体H16
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.17：2A10轻链人源化的构建体L13
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLI
YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.18：2A10轻链人源化的构建体L16
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLI
YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.19：编码2A10，VH(鼠)SEQ ID：7的PN
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCT
TCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATT
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTA
GACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGT
GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.20：编码2A10，VL(鼠)SEQ ID：8的PN
GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGG
TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCT
CCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCA
GGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTT
GTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO.21：编码嵌合重链Hc SEQ ID：9的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAG
CAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC
ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGC
TACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO，22：编码嵌合轻链Lc SEQ ID：10的PN
ATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATA
ACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGT
CTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTG
ATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC
ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCG
CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG
CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAG
GCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC
AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC
TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO.23：编码2A10VH人源化的构建体H6 SEQ ID：11的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGG
GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.24：编码2A10VH人源化的构建体H16 SEQ ID：12的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC
GACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.25：编码2A10VL人源化的构建体L13 SEQ ID：13的PN
GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGG
TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT
CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA
GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT
GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.26：编码2A10 VL人源化的构建体L16 SEQ ID：14的PN
GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGG
TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCT
CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA
GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT
GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.27：编码2A10重链人源化的构建体H6 SEQ ID：15的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.28：编码2A10重链人源化的构建体H16 SEQ ID：16的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.29：编码2A10轻链人源化的构建体L13 SEQ ID：17的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC
CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC
CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT
TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA
CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC
ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA
TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC
AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC
AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO.30：编码2A10轻链人源化的构建体L16 SEQ ID：18的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC
CAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC
CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT
TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA
CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC
ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA
TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC
AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC
AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO.31：Campath前导序列
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID NO.32：与GST融合的人类NOGO A(NOGO-A56)的氨基酸586-785
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII
RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN
GDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP
PKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEAS
SVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPD
FSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE
LERPHRD
SEQ ID NO.33：2A10VH人源化的构建体H1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR
DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.34：2A10VL人源化的构建体L11
DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.35：2A10重链人源化的构建体H1
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINP
SNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.36：2A10轻链人源化的构建体L11
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLI
YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY
ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.37：编码2A10VH人源化的构建体H1SEQ ID：33的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGG
GACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.38：编码2A10VL人源化的构建体L11 SEQ ID：34的PN
GATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGG
TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT
CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA
GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT
GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO.39：编码2A10人源化的重链H1SEQ ID：35的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC
ACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.40：编码2A10人源化的轻链构建体L11 SEQ ID：36的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACC
CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC
CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT
TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA
CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC
ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA
TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC
AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC
AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO.41：2A10VH人源化的构建体H20
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.42：2A10重链人源化的构建体H20
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.43：编码2A10VH人源化的构建体H20S EQ ID：41的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGG
GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.44：编码2A10重链人源化的构建体H20SEQ ID：42的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.45：2A10CDR-H3(G95M)
MQGY
SEQ ID NO.46：狨猴NOGO-A片段的氨基酸序列
VQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEASSVNFESVKHEPENPP
PYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSSYSEMAKVEQPLP
DHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETLTETSFESMIEHENK
SEQ ID NO.47：VH人源化的构建体H26
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.48：VH人源化的构建体H27
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.49：VH人源化的构建体H28
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.50：编码VH人源化的构建体H26 SEQ ID：47的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGG
GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.51：编码VH人源化的构建体H27 SEQ ID：48的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC
GACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.52：编码VH人源化的构建体H28 SEQ ID：49的PN
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA
TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC
GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGG
GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.53：重链人源化的构建体H26
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ ID NO.54：重链人源化的构建体H27
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.55：重链人源化的构建体H28
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO S6：编码重链人源化的构建体H26 SEQ ID：53的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATCACCAGGGACACGTCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.57：编码重链人源化的构建体H27SEQ ID：54的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.58：编码重链人源化的构建体H28 SEQ ID：55的PN
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG
CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC
ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT
AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC
ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC
TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA
CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC
GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA
TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC
ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC
AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC
AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA
CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG
CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO.59：重链Hc(G95M)
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINP
SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN
VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID 60：表位
VLPDIVMEAPLN
SEQ ID 61：2A10VH人源化的构建体H99
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR
DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.62：CDR H3
GQSY
SEQ ID NO.63：VH人源化的构建体H100
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.64：VH人源化的构建体H101
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.65：VH人源化的构建体H102
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR
DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.66 2A10 VH人源化的构建体H98
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR
DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.67
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.68
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.69
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.70
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.71
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.72
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS
GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.73
TPSPVLPDIVMEAPLN
SEQ ID NO.74
VLPDIVMEAPLNSAVP
SEQ ID NO.75
RQGY
SEQ ID NO.76
IQGY
SEQ ID NO.77
GDGY
SEQ ID NO.78
GIGY
SEQ ID NO.79
GSGY
SEQ ID NO.80
GQNY
SEQ ID NO.81
GQYY
SEQ ID NO.82
GQLY
SEQ ID NO.83
GQFY
SEQ ID NO.84
GQGW
SEQ ID NO.85
YESIKHEPENPPPYEE
SEQ ID NO.86
WQGY
SEQ ID NO.87
GAGY
SEQ ID NO.88
GLGY
SEQ ID NO.89
GVGY
SEQ ID NO.90
GQWY
SEQ ID NO.91
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII
RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN
GDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP
PKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAVASAVQPSLSPLEAS
SVNYESVKHEPENPPPYEEAMNVSLKKVSGIKEEIKEPESIKAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPD
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SEQ ID NO.92
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SEQ ID NO.93
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ERPHRD
SEQ ID NO.94
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FSNYSEIAKFEKSVPEHAELVEDSSPESEPVDLFSDDSIPEVPQTQEEAVMLMKESLTEVSETVAQHKEERL
SEQ ID NO.95
DETFAL
SEQ ID NO.96
ELSKTS

Claims (10)

1.一种能够结合人类NOGO-A的分离的抗体，其中所述抗体的重链可变区示于SEQ ID NO:49的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变区示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的抗体，其中重链示于SEQ ID NO：55的氨基酸序列，轻链示于SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
3.表达载体，其包含编码权利要求1或2的抗体的序列的多核苷酸。
4.包含权利要求3的表达载体的宿主细胞。
5.权利要求4的宿主细胞，所述细胞包含编码轻链的第一载体和编码重链的第二载体。
6.生产能够结合人类NOGO-A的抗体的方法，该方法包括以下步骤：用包含编码示于SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链可变区的第一多核苷酸的表达载体和包含编码示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区的第二多核苷酸的表达载体转染宿主细胞，并且在有助于抗体从所述宿主细胞分泌到所述培养基中的条件下培养所述宿主细胞。
7.权利要求6的方法，进一步包括从培养基回收分泌的抗体的步骤。
8.权利要求6或7的方法，其中所述第一和第二多核苷酸包含在单个表达载体中。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1或2的抗NOGO-A抗体，以及药学上可接受的稀释剂或载体。
10.权利要求1或2的抗NOGO-A抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防中风、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、周围神经病、帕金森氏病、Creutzfeldt-Jakob病、精神分裂症、肌萎缩性侧索硬化、Huntington’s病、多发性硬化或包含体肌炎，或用于治疗患有对中枢或外周神经系统的机械性损伤的患者。
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