PT1960429E - Imunoglobulinas dirigidas contra nogo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "IMUNOGLOBULINAS DIRIGIDAS CONTRA NOGO"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a imunoglobulinas, particularmente anticorpos que se ligam a NOGO e neutralizam a sua actividade, polinucleótidos codificando esses anticorpos, formulações farmacêuticas contendo os referidos anticorpos e à utilização desses anticorpos no tratamento e/ou profilaxia de doenças neurológicas. Outros aspectos, objectivos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição abaixo.

Antecedentes da Invenção 0 acidente vascular cerebral é uma causa principal de morte e incapacidade no Mundo Ocidental. Não há qualquer outra terapia aprovada para o tratamento do acidente vascular cerebral para além do plasminogénio tecidular (t-PA) , o qual deve ser administrado no espaço de 3 horas do inicio após uma tomografia computorizada (CT) para excluir hemorragia. Até à data, a maioria dos agentes terapêuticos dirigidos para o tratamento do acidente vascular cerebral agudo (i. e., neuroprotecção) envolveu, predominantemente, direccionamento para receptores de glutamato e as suas vias de sinalização a jusante, conhecidas por estarem envolvidas na morte celular aguda. Contudo, até à data, estas estratégias provaram ser mal sucedidas em ensaios clínicos e são frequentemente associadas a efeitos secundários 1 limitativos de dose (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (supl. III) 10-14 (1998)). Há, por conseguinte, uma necessidade de novas abordagens dirigidas para o melhoramento da morte celular após a cessação do fluxo de sangue. A neuroprotecção é a capacidade de um tratamento prevenir ou melhorar a perda celular neuronal, em resposta a um processo de insulto ou doença. Tal pode ser alcançado através do direccionamento para os neurónios, directamente ou indirectamente, através da prevenção da perda celular glial (incluindo oligodendrocitica).

Após o inicio do acidente vascular cerebral, observa-se em muitos doentes algum grau de recuperação funcional espontânea, sugerindo que o cérebro tem a capacidade (embora limitada) para se reparar e/ou reorganizar após a lesão. Os agentes que têm o potencial de melhorar esta recuperação podem, por conseguinte, permitir que a intervenção seja realizada muito mais tarde (potencialmente, dias) após o inicio da isquemia cerebral. Os agentes que são capazes de oferecer neuroprotecção aguda e melhorar a recuperação funcional podem proporcionar vantagens significativas em relação às actuais estratégias neuroprotectoras potenciais. A doença de Alzheimer (AD) é caracterizada pela presença de duas caracteristicas de diagnóstico da patologia. Estas são, placas de amilóide e feixes neurofibrilares compostos por péptido amilóide beta agregado (Αβ40 e Αβ42) e tau hiperfosforilado, respectivamente (Dawbam & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP).

Um estudo abrangente mostrou uma forte ligação em doentes entre a acumulação de amilóide beta e o declínio cognitivo (Naslund et al., JAMA, 22/29 de Março de 2000, Vol. 283, N° 12, 2 páginas 1571-1577). Tal é consistente com estudos genéticos e epidemiológicos que sugerem que algumas mutações nos genes de APP e presenilina podem predispor ao inicio precoce da AD, cujas mutações também melhoram os niveis de péptido Αβ40 e Αβ42, incluindo a sua proporção. A clivagem da proteína precursora de amilóide transmembranar de tipo I (APP) por duas proteases distintas, designadas secretase beta e gama, é necessária para a formação de péptido amilóide beta. Foi confirmada a identidade molecular de secretase beta como a aspartil-protease Asp2/BACE1 (Hussain et al. Mol. Cell. Neurosci. 16, 609-619 (2000); Vassar et ai., Science (1999), 22 de Outubro; 286 (5440):735-741). A natureza da secretase gama permanece fonte de algum debate e é provável que consista num complexo de elevado peso molecular consistindo, pelo menos, nas seguintes proteínas: presenilinas, Aphl, Pen2 e nicastrina (revisto em Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15 (9) :829-41) . É provável que o processamento da APP no SNC ocorra num número de tipos de células, incluindo neurónios, oligodendrócitos, astrócitos e micróglia. A taxa global de processamento de APP nestas células será influenciada pelo nível relativo de expressão de APP, BACE1/Asp2, presenilina 1 e 2, Aphl, Pen2 e nicastrina.

Além disso, factores adicionais regulando a localização subcelular de APP também podem influenciar o seu processamento, como mostrado pela verificação de que a mutação do motivo YENP no domínio citoplasmático de APP, que bloqueia a sua endocitose, reduz a produção de amilóide beta (Perez et al. 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6). A retenção do APP-beta-CTF no ER, pela adição 3 do motivo de retenção KKQN, é suficiente para reduzir a produção de amilóide em células transfectadas (Maltese et ai. 2001 J Biol Chem 276 (23) 20267-20279). Inversamente, a elevação de endocitose, por superexpressão de Rab5, é suficiente para elevar a secreção de amilóide a partir de células transfectadas (Grbovic et al. 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261-31268).

Consistentes com estas verificações, estudos adicionais mostraram que a redução de níveis de colesterol celular (um factor de risco para a AD bem conhecido) reduziu a formação de amilóide beta. Esta alteração estava dependente de endocitose alterada, como demonstrado pela utilização de mutantes de dinamina dominantes negativos (K44A) e superexpressão da proteína RN-Tre de activação da GTPase Rab5 (Ehehalt et al. 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123) .

Os microdomínios ricos em colesterol, ou rafts, também são um importante local celular de produção de amilóide beta e mostrou-se que a APP, BACE1 e componentes do complexo secretase gama residem todos, de forma transiente, nos rafts. A reticulação de anticorpo de APP e BACE1 para rafts ricos em colesterol foi capaz de elevar a produção de amilóide beta (Ehehalt et al. 2003 J Cell. Biol 160 (1) 113-123). De modo semelhante, a expressão de BACE1 ancorado em GPI, o qual é exclusivamente direccionado para rafts lipídicos, é capaz de elevar a clivagem de APP e produção de amilóide beta (Cordy et al. 2003 PNAS 100(20) 11735-11740).

Os mecanismos subjacentes à recuperação funcional após um acidente vascular cerebral ou outro evento ou doença neurolesivo são, actualmente, desconhecidos. A germinação de axónios lesionados ou não lesionados foi proposta como um possível 4 mecanismo. Contudo, embora estudos in vivo tenham mostrado que o tratamento da lesão de medula espinal ou acidente vascular cerebral com factores neurotróficos resulte em recuperação funcional melhorada e um grau de germinação axonal, estes não provam uma ligação directa entre o grau de germinação axonal e a extensão da recuperação funcional (Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sei. USA., 94:8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). Além disso, a germinação axonal requer um neurónio viável. Em doenças, tal como o acidente vascular cerebral, que está associado a extensa morte celular, o melhoramento da recuperação funcional oferecido por um determinado agente após o acidente vascular cerebral pode, por conseguinte, ser através de mecanismos diferentes da germinação axonal, tais como diferenciação de células estaminais endógenas, activação de vias redundantes, alterações na distribuição de receptores ou excitabilidade de neurónios ou glia (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer & Gage, 2000, Nature 407 963-970) .

Pensa-se que a capacidade limitada do sistema nervoso central (SNC) se reparar após lesão seja, em parte, devido a moléculas no ambiente do SNC que têm um efeito inibidor na germinação axonal (crescimento de neurite). Pensa-se que a mielina do SNC contém moléculas inibidoras (Schwab ME e Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). Duas proteínas de mielina, a glicoproteína associada a mielina (MAG) e a NOGO, foram clonadas e identificadas como inibidores putativos do crescimento de neurite (Sato S. et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163,1473-1480; McKerracher L et al. (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al. (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K e Lundborg G (199 7) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al. 5 (1996) Neuron 16, 1107-1113; documento W09522344; documento

WO9701352; Prinjha R et ai. (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al. (2000) Nature 403, 439-444; documento US005250414A; documento W0200005364A1; documento W00031235).

Foram identificadas três formas da NOGO humana: NOGO-A, tendo 1192 resíduos de aminoácidos (acesso GenBank N° AJ251383); NOGO-B, uma variante de excisão que está desprovida dos resíduos 186 a 1004 no domínio putativo extracelular (acesso GenBank N° AJ251384) e uma variante de excisão mais curta, NOGO-C, a qual também está desprovida dos resíduos 186 a 1004 e também tem um pequeno domínio amino terminal alternativo (acesso Genbank N° AJ251385) (Prinjha et al. (2000) supra). A inibição das proteínas inibidoras do SNC, tal como a NOGO, pode proporcionar um meio terapêutico para melhorar a lesão neuronal e promover a reparação e crescimento neuronais, potencialmente assistindo assim a recuperação da lesão neuronal, tal como a sustentada no acidente vascular cerebral. Exemplos desses inibidores da NOGO podem incluir moléculas pequenas, péptidos e anticorpos.

Foi referido que um anticorpo monoclonal de murino, IN-1, que foi produzido contra NI-220/250, uma proteína de mielina que é um potente inibidor do crescimento de neurite (e que se mostrou, subsequentemente, ser um fragmento da NOGO-A), promove a regeneração axonal (Caroni, P e Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L e Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272;

Bregman, BS et al. (1995) Nature 378 498-501 e Thallmair, M et al. (1998) Nature Neuroscience 1 124-131) e a recuperação funcional após lesão isquémica (Papadopoulos et al. (2002) Ann 6

Neurol 51 433-441). Também foi referido que a NOGO-A é o antigénio para IN-1 (Chen et al. (2000) Nature 403 434-439). Um fragmento Fab de IN-1 derivado de Escherichia coli foi descrito por Bandtlow et al. (European Journal of Blochemlstry (1996) 241 468-475) e foi capaz de neutralizar a inibição do crescimento de neurite associada a mielina. A administração do fragmento Fab de IN-1 ou IN-1 humanizado a ratos que foram submetidos a transecção de medula espinal também melhorou a recuperação (Fiedler, M et al. (2002) Proteln Eng 15 931-941; Brõsamle, C et al. (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068).

Os anticorpos monoclonais que se ligam a NOGO são descritos nos documentos WO 04/052932 e W02005028508. O documento WO 04/052932 divulga um anticorpo murino, 11C7, que se liga a determinadas formas da NOGO humana com elevada afinidade. O pedido de patente W005/061544 também divulga anticorpos monoclonais de elevada afinidade, incluindo um anticorpo monoclonal murino 2A10 e divulga, em geral, os seus variantes humanizados, por exemplo, H1L11 (as sequências para o Hl e Lll são proporcionadas nas SEQ ID N° 33 e 34, respectivamente (apenas as sequências de VH ou VL) ) . Os anticorpos divulgados ligam-se a NOGO-A humana com elevada afinidade. O anticorpo 2A10 murino (e os seus variantes humanizados enxertados em CDR) é caracterizado pelas seguintes sequências da região determinante de complementaridade (CDR) (como determinadas utilizando o método de Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequências de proteínas de interesse imunológico"; Quinta Edição; Departamento da Saúde e dos Serviços Sociais dos EUA; publicação NIH N° 91-3242)) nas suas regiões variáveis de cadeia leve e pesada: 7

Tabela 1: CDR de cadeia leve do anticorpo 2A10 CDR Sequência LI RSSKSLLYKDGKTYLN (SEQ ID N° 4) L2 LMSTRAS (SEQ ID N° 5) L3 QQLVEYPLT (SEQ ID N° 6)

Tabela 2: CDR de cadeia pesada do anticorpo 2A10 CDR Sequência Hl SYWMH (SEQ ID N° 1) H2 NINPSNGGTNYNEKFKS (SEQ ID N° 2) H3 GQGY (SEQ ID N° 3) 0 documento W005/061544 divulga, ainda, "análogos" dos anticorpos que compreendem as CDR das Tabelas 1 e 2 acima, esses "análogos" têm a mesma especificidade de ligação de antigénio e/ou capacidade neutralizante que o anticorpo dador de onde foram derivados. Não obstante a técnica proporcionar anticorpos anti-NOGO de elevada afinidade, subsiste ainda um objectivo altamente desejável de isolar e desenvolver anticorpos monoclonais alternativos, ou melhorados, terapeuticamente úteis que se ligam e inibem a actividade da NOGO humana. 0 processo de neurodegeneração subjaz a muitas doenças/distúrbios neurológicos incluindo mas não limitados a doenças agudas, tais como acidente vascular cerebral (isquémico ou hemorrágico), lesão cerebral traumática e lesão da medula espinal, assim como doenças crónicas incluindo doença de Alzheimer, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, doença de Huntington, esclerose múltipla e miosite de corpos de inclusão. Consequentemente, os anticorpos monoclonais anti-NOGO e semelhantes da presente invenção podem ser úteis no tratamento destas doenças/distúrbios. Os anticorpos para o tratamento das doenças/distúrbios acima mencionados são proporcionados pela presente invenção e descritos em detalhe abaixo.

Breve Sumário da Invenção A invenção proporciona um anticorpo isolado ou um seu fragmento, capaz de se ligar a NOGO-A humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 47 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 14. 0 anticorpo ou um seu fragmento, pode ser formatado pelo modo de imunoglobulina convencional (por exemplo, IgG, igA, IgM humanas, etc.) ou em qualquer outro formato de fragmento ou "semelhante a anticorpo" que se ligue a NOGO-A humana (para um resumo de formatos de "anticorpo" alternativos ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23, N° 9, 1126-1136)).

Os anticorpos da presente invenção ou seus fragmentos, retêm a actividade dos anticorpos de ligação da NOGO humana que compreendem a CDR H3: GQGY, em termos da sua actividade, como 9 medida em experiências de ELISA e Biacore e, em alguns casos, a actividade nestas experiências é aumentada.

Regiões variáveis de cadeia pesada humanas ou humanizadas contendo G95M (numeração de substituição segundo Kabat)

Os anticorpos ou os seus fragmentos, da presente invenção compreendem as CDR definidas na Tabela 3 (como definido por Kabat):

Tabela 3: CDR Sequência Hl SYWMH (SEQ ID N° 1) H2 NINPSNGGTNYNEKFKS (SEQ ID N° 2) H3 MQGY (SEQ ID N° 45)

Os anticorpos aqui descritos compreendem uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 66 (região variável de H98) compreendendo, adicionalmente, substituições nas posições 48, 67, 68 e 79; em que cada resíduo de aminoácido substituído é substituído com o resíduo de aminoácido na posição equivalente na SEQ ID N° 7 (a região variável de cadeia pesada do anticorpo dador 2A10).

Neste contexto, as substituições que são descritas são equivalentes em conceito a "mutações inversas", onde os resíduos de aminoácidos da estrutura humana em posições específicas dentro da sequência de H98 são mutados de volta para os resíduos 10 de aminoácidos na posição equivalente na sequência do anticorpo dador 2AIO.

Salvo aqui especificamente referido de outro modo, quando é mencionada neste documento uma posição numérica de um residuo de aminoácido verificado numa sequência especifica, por exemplo "posição 12", significa que o leitor com conhecimentos na matéria atribui a posição "1" ao primeiro aminoácido na sequência e conta desde a posição um e identifica o aminoácido que está na posição desejada, neste exemplo o décimo segundo residuo de aminoácido na sequência. 0 leitor com conhecimentos na matéria notará que este sistema de numeração não corresponde ao sistema de numeração de Kabat que é frequentemente utilizado para definir posições de aminoácidos dentro de sequências de anticorpo.

Para afinidade de ligação óptima, verificou-se, para a humanização do anticorpo 2A10 de murganho (a VH para a qual é a SEQ ID N° 7), que o par de resíduos de aminoácidos nas posições 48 e 68 deverá ser I e A, respectivamente (visto existirem em 2A10), ou M e V, respectivamente (visto existirem em H98). Espera-se que que a verificação acima também seja de relevância para a humanização da variante G95M de 2A10. A seguinte tabela inclui detalhes de três diferentes regiões variáveis (VH) de cadeia pesada. Cada VH divulgada é baseada na VH de H98 (SEQ ID N° 66) compreendendo, adicionalmente, as substituições mencionadas na tabela (Tabela 4), onde o resíduo de H98 na posição relevante é substituído com o resíduo 2A10 nessa posição (na tabela, significa que não há substituição nessa posição e, assim, o resíduo permanece como na sequência de H98): 11

Tabela 4

Nova VH (SEQ ID NS X) Resíduo Nmftérico ' í jy’· v1 : 38 40 * % % s- fr. i s*·? 1 ν y % , 67 ' ·>.-·~ s 68 β 70 Η72* 74 Λ-λΟν.· 79, ' 38 ' 40 ,y48? 66 67 69 7% , 73 im- > iiii R ' κ V' W??: - Α H9Ô~ ,r A, κ ΊΓ~ V Λί R Μ: H26 (47) : - - 1 - Α - - - Α H 271(48) v K R 1 κ Α L V κ Α H28 (49) - - 1 κ Α - - - Α

Por conseguinte, as regiões variáveis (VH) de cadeia pesada aqui descritas são VH de H26 (SEQ ID N° 47), VH de H27 (SEQ ID N° 48) e VH de H28 (SEQ ID N° 49).

SEQ ID 47: Construção H26 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN

PSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG

QGTLVTVSS

SEQ ID 48: Construção H27 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIN PSNGGTN YN EKFKSKATLTVD KSTST AYMELSSLRSEDTAVYYC ELMQGYWG QGTLVTVSS

SEQ ID 49: Construção H28 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN

PSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG

QGTLVTVSS

Regiões variáveis de cadeia pesada humanas ou humanizadas incluindo G101S (numeração de substituição segundo Kabat)

Também é aqui descrita uma região variável de cadeia pesada humana ou humanizada que compreende CDR definidas na Tabela 5: 12

Tabela 5: CDR De acordo com Kabat Hl SYWMH (SEQ ID N° 1) H2 NINPSNGGTNYNEKFKS (SEQ ID N° 2) H3 GQSY (SEQ ID N° 62)

As CDR da Tabela 5 podem ser incorporadas numa sequência de região variável de cadeia pesada humana. Noutra forma de realização, a região variável de cadeia pesada humanizada compreende as CDR listadas na Tabela 5 numa estrutura de anticorpo aceitador, tendo identidade superior a 40% nas regiões de estrutura, ou identidade superior a 50%, ou superior a 60%, ou superior a 65% com a região variável de cadeia pesada de anticorpo dador 2A10 murino (SEQ ID N° 7).

Numa construção, as CDR da Tabela 5 estão inseridas numa região variável de cadeia pesada humana, para dar a seguinte sequência (H99):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNI

NPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYW GQGTLVTVSS (SEQ ID 61: Construção H99 humanizada de 2A10 VH) .

Noutras construções, são adicionadas mutações inversas adicionais à sequência VH de H99 em qualquer uma das posições (denotadas por posição numérica de residuo) 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74 ou 79; em que cada residuo de aminoácido substituído é substituído com o resíduo de aminoácido na posição equivalente na SEQ ID N° 7 (a região variável de cadeia pesada do anticorpo dador 2A10) e o número de substituições é entre 1 e 9. Noutras 13 construções, o número de substituições é 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7, ou 8 ou 9. A VH de H99 é a equivalente de VH de Hl (SEQ ID N° 33), diferindo apenas em que a CDR H3 é GQSY em H99, em vez de GQGY, como verificado em Hl.

Para afinidade de ligação óptima, verificou-se, para a humanização do anticorpo 2A10 de murganho (a VH para a qual é a SEQ ID N° 7) que o par de resíduos de aminoácidos nas posições 48 e 68 deverá ser I e A, respectivamente (visto existirem em 2A10), ou M e V, respectivamente (visto existirem em H98) . Espera-se que que a verificação acima também seja de relevância para a humanização do variante G95M de 2A10.

Numa construção, as mutações inversas estão localizadas nas posições indicadas na Tabela 6 abaixo, onde o resíduo de H99 na posição relevante é substituído com o resíduo 2A10 nessa posição (na tabela, significa que não há substituição nessa posição e, assim, o resíduo permanece como na sequência de Hl):

Tabela 6,

Nova VH (SEQ ID NS X) Resichiò Numérioo - i 38 λ, ''js ' : í», 40 I* ; 48 ' ' "4, ' 6 T % 68 70 * < 72 ..... 2 79 Kabat N* 38 40 ροβι 67 mm =71 ,"'i73f. 78 2À10 : l· 'tf •v FV ,,ν A V K - A H99 tf em* ;tf V mâ1 R V H100 (63)¾ m - I - A m 9 m A H101<64fcá K R I K A L V K A H102<65) - - I K A - - 9 A 14

Anticorpos ou fragmentos que compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve humanas ou humanizadas

As construções de VH aqui descritas podem ser emparelhadas com uma cadeia leve, para formar uma unidade de ligação da NOGO-A humana (Fv) em qualquer formato, incluindo um formato de anticorpo IgG convencional, tendo sequências de cadeia pesada de domínio variável e constante de comprimento completo (FL) . São exemplos de sequências de cadeia pesada de IgGl de comprimento completo (FL), compreendendo as construções de VH da presente invenção e mutações inactivantes nas posições 235 e 237 (numeração do índice EU) , para tornar o anticorpo não lítico, as SEQ ID N° 53, 54 e 55. SEQ ID 53: Construção H26 humanizada de cadeia pesada

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM HW VRQ APGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKF KSRATMTRDT STSTAYM E LSSL

RSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT

QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKD

TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK. SEQ ID 54: Construção H27 humanizada de cadeia pesada

QVQ LVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTSYWM HWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLR SEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVUTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSOGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15 SEQ ID 55: Construção H28 humanizada de cadeia pesada

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM hwvrqapgqglewigninpsnggtnynekfkskatmtrdtststaymelsslr

SEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW

SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSOGSFFLYSKLT

VOKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK A sequência da região variável de cadeia leve que forma uma Fv com as sequências da região variável de cadeia pesada descritas acima pode ser qualquer sequência que permita que a Fv se ligue à NOGO-A Humana. Por exemplo, a região variável de cadeia leve pode ser a cadeia leve de 2A10 (ver o documento WO 05/061544), cuja região variável de cadeia leve é aqui proporcionada como SEQ ID N° 8, ou pode ser um seu variante humanizado. Os variantes humanizados da cadeia leve de 2A10 contêm, de um modo preferido, a totalidade das CDR de região variável de cadeia leve que são descritas na Tabela 1, enxertadas numa estrutura aceitadora de região variável de cadeia leve humana. As regiões variáveis de cadeia leve humanizadas incluem Lll (SEQ ID N° 34), L13 (SEQ ID N° 13) ou L16 (SEQ ID N° 14). As regiões variáveis de cadeia leve alternativas que são baseadas em L13 e L16, que compreendem substituições especificas nas posições 37 e/ou 45 de Kabat, são proporcionadas na Tabela 7. 16

Tabela 7

Descrição SEQ ID N° Sequência L100 (L13+Q37R) 67 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ rpgqspqlliylmstrasgvpdrfsgggsgtdftlkisrvea EDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L101 (L13+Q45R) 68 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQ RPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L102 (L13+Q37R/G145R) 69 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ rpgqsprlliylmstrasgvpdrfsgggsgtdftlkisrveae DVGVYYCGQLVEYPLTFGQGTKLEiK L103 (L16+Q37R) 70 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLK1SRVEA EDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L104(L16+Q45R) 71 divmtqsplsnpvtlgqpvsiscrssksllykdgktylnwflq RPGQSPRLL1YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK L105 (L16+Q37R/Q45R) 72 DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQ RPGQ SP R LLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

As sequências de cadeia leve de comprimento completo (FL) São FL de LI 1 (SEQ ID N° 36), FL de L13 (SEQ ID N° 17) ou FL de L16 (SEQ ID N° 18) .

Composiçoes farmacêuticas

Um aspecto adicional da invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-NOGO da presente invenção ou um seu fragmento ou equivalente funcional, 17 juntamente com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-NOGO ou um seu fragmento, da presente invenção, para tratamento ou profilaxia do acidente vascular cerebral (particularmente, acidente vascular cerebral isquémico) e outras doenças neurológicas, em particular doença de Alzheimer, e tratamento de um doente sofrendo de um trauma mecânico no SNC (tal como lesão da medula espinal).

Noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um anticorpo anti-NOGO da invenção ou um seu fragmento funcional, na preparação de um medicamento para tratamento ou profilaxia do acidente vascular cerebral (particularmente, acidente vascular cerebral isquémico) e outras doenças neurológicas, em particular doença de Alzheimer e tratamento de um doente sofrendo de um trauma mecânico no SNC (tal como lesão da medula espinal).

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são adicionalmente descritos na descrição detalhada e nas suas formas de realização preferidas.

Descrição Detalhada da Invenção 0 anticorpo ou um seu fragmento, pode, por conseguinte, compreender as regiões VH da invenção formatadas num anticorpo de comprimento completo, um fragmento (Fab')2/· um fragmento Fab, ou seu equivalente (tais como scFV, bi- tr- ou tetra-corpos, Tandabs, etc.), quando emparelhado com uma cadeia leve apropriada. 0 anticorpo pode ser um IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4; 18 ou IgM; IgA, IgE ou IgD ou um seu variante modificado. 0 dominio constante da cadeia pesada do anticorpo pode ser seleccionado em conformidade. 0 dominio constante de cadeia leve pode ser um dominio constante capa ou lambda. Além disso, o anticorpo pode compreender modificações de todas as classes, e. g., dimeros de IgG, mutantes de Fc gue já não se ligam a receptores Fc ou medeiam a ligação de Clg. 0 anticorpo também pode ser um anticorpo quimérico do tipo descrito no documento WO86/01533 que compreende uma região de ligação de antigénio e uma região de não imunoglobulina. A região constante é seleccionada de acordo com a funcionalidade requerida. Normalmente, uma IgGl demonstrará capacidade litica através de ligação ao complemento e/ou mediará a ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Se for requerido um anticorpo de bloqueio não citotóxico será preferida uma IgG4. Contudo, os anticorpos IgG4 podem demonstrar instabilidade em produção e, por conseguinte, pode ser mais preferido modificar a IgGl geralmente mais estável. As modificações sugeridas são descritas no documento EP0307434, as modificações preferidas incluem nas posições 235 e base de dados, e. g., a base de dados KABAT®, base de dados de Los Alamos e base de dados Swiss Protein, por homologia com as sequências nucleotidicas e de aminoácidos do anticorpo dador (neste caso, o anticorpo dador 2A10 murino). Um anticorpo humano, caracterizado por uma homologia com as regiões de estrutura do anticorpo dador (numa base de aminoácidos), pode ser adequado para proporcionar uma região constante de cadeia pesada e/ou uma região de estrutura variável de cadeia pesada para inserção das CDR dadoras (ver a Tabela 1 para as CDR de 2A10, para inserção na estrutura aceitadora). Um anticorpo aceitador adequado, capaz de doar regiões de estrutura constantes ou variáveis de cadeia 19 leve, pode ser seleccionado num modo semelhante. Deve notar-se que não se requer que as cadeias pesada e leve do anticorpo aceitador tenham origem no mesmo anticorpo aceitador. A técnica anterior descreve várias formas de produzir esses anticorpos humanizados - ver, por exemplo, os documentos EP-A-0239400 e EP-A-054951. 0 termo "anticorpo dador" refere-se a um anticorpo não humano que contribui com as sequências de aminoácidos das suas regiões variáveis, CDR ou os seus outros fragmentos ou análogos funcionais, para o anticorpo humanizado e, desse modo, proporciona o anticorpo humanizado com a especificidade antigénica e actividade neutralizante caracteristicas do anticorpo dador. 0 termo "anticorpo aceitador" refere-se a um anticorpo heterólogo ao anticorpo dador, que proporciona as sequências de aminoácidos das suas regiões de estrutura de cadeia pesada e/ou leve e/ou suas regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve ao anticorpo humanizado. 0 anticorpo aceitador pode ser derivado de qualquer mamífero, desde que seja não imunogénico em humanos. De um modo preferido, o anticorpo aceitador é um anticorpo humano.

Alternativamente, a humanização pode ser alcançada por um processo de "folheamento". Uma análise estatística de regiões variáveis únicas de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, humanas e murinas, revelou que os padrões exactos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos humanos e murinos e a maioria das posições de superfície individuais tem uma forte preferência por um pequeno número de resíduos diferentes (ver Padlan E.A. et al. ; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 e Pedersen J.T. et al. (1994) J. Mol. Blol. 235; 959-973). Por conseguinte 20 é possível reduzir a imunogenicidade de uma Fv não humana, através da substituição de resíduos expostos nas suas regiões de estrutura que diferem dos habitualmente verificados em anticorpos humanos. Em virtude da antigenicidade de proteína poder ser correlacionada com acessibilidade de superfície, a substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar a região variável de murganho "invisível" ao sistema imunitários humano (ver, também, Mark G.E. et al. (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: A farmacologia de Anticorpos monoclonais, Springer-Verlag, p. 105-134). Este processo de humanização é referido como "folheamento" porque apenas a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suporte permanecem não perturbados. Uma abordagem alternativa adicional é apresentada no documento W004/006955.

As "CDR" são definidas como sequências de aminoácidos da região determinante de complementaridade de um anticorpo, que são as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Ver, e. g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., Departamento da Saúde e dos Serviços Sociais dos EUA, National Institutes of Health (1987). Há três CDR de cadeia pesada e três de cadeia leve (ou regiões CDR) na porção variável de uma imunoglobulina. Deste modo, "CDR", como aqui utilizado, refere-se a todas as três CDR de cadeia pesada, ou todas as três CDR de cadeia leve (ou todas as CDR de cadeia pesada e todas de cadeia leve, se apropriado). A estrutura e enrolamento de proteína do anticorpo podem significar que outros resíduos sejam considerados parte da região de ligação de antigénio e seria compreendido como sendo assim por um especialista. Ver, por exemplo, Chothia et al., (1989) Conformações de regiões hipervariáveis de imunoglobulina; Nature 342, p. 877-883. 21

Um anticorpo bi-específico é um anticorpo tendo especificidades de ligação para, pelo menos, dois epitopos diferentes. Os métodos de preparação desses anticorpos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos bi-especificos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia H-cadeia L de imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm especificidades de ligação diferentes, ver Millstein et al., Nature 305 537-539 (1983), documento WO93/08829 e Traunecker et al. EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Devido ao agrupamento aleatório das cadeias H e L, é produzida uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a especificidade de ligação desejada. Uma abordagem alternativa envolve a fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas à região constante de cadeia pesada compreendendo, pelo menos, parte da região de articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido que a região CHI contenha o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em, pelo menos, uma das fusões. O ADN codificando estas fusões e, se desejado, a cadeia L, são inseridos nos vectores de expressão separados e são, depois, co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Todavia, é possível inserir as sequências codificantes para duas ou todas as três cadeias num vector de expressão. Numa abordagem preferida, o anticorpo bi-específico é composto por uma cadeia H, com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeias H-L, proporcionando uma segunda especificidade de ligação no outro braço, ver o documento WO94/0469. Ver também Suresh et ai. Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

Também é aqui descrito um anticorpo terapêutico bi-específico, em que, pelo menos, uma especificidade de ligação do referido anticorpo se liga a NOGO humana no epitopo descrito 22 na SEQ ID N° 60. O anticorpo bi-específico pode compreender a sequência MQGY de CDR H3 da região variável de cadeia pesada (SEQ ID N° 45) . O anticorpo bi-específ ico pode compreender os seguintes pares de regiões variáveis de cadeias pesada e leve: H27L16 (SEQ ID N° 48 + SEQ ID N° 14), H28L13 (SEQ ID N° 49 + SEQ ID N° 13) ou H28L16 (SEQ ID N° 49 + SEQ ID N° 14).

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por transfecção de uma célula hospedeira com um vector de expressão compreendendo a sequência codificante para os anticorpos da invenção. Um vector de expressão ou plasmídeo recombinante é produzido através da colocação destas sequências codificantes para o anticorpo em associação operativa com sequências de controlo regulatórias convencionais, capazes de controlarem a replicação e expressão numa, e/ou secreção a partir de uma, célula hospedeira. As sequências regulatórias incluem sequências promotoras, e. g. , promotor CMV, e sequências de sinal, as quais podem ser derivadas de outros anticorpos conhecidos. De modo semelhante, pode ser produzido um segundo vector de expressão, tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia leve ou pesada de anticorpo complementar. De um modo preferido, este segundo vector de expressão é idêntico ao primeiro, excepto no que se refere às sequências codificantes e marcadores seleccionáveis, de modo a garantir, na medida do possível, que cada cadeia polipeptídica seja expressa de um modo funcional. Alternativamente, as sequências codificantes de cadeias pesada e leve para o anticorpo alterado podem residir num único vector.

Uma célula hospedeira seleccionada é co-transfectada por técnicas convencionais, com o primeiro e segundo vectores (ou, simplesmente, transfectada por um único vector), para criar a célula hospedeira transfectada da invenção compreendendo as 23 cadeias leve e pesada, recombinantes ou sintéticas. A célula transfectada é, depois, cultivada por técnicas convencionais para produzir o anticorpo manipulado da invenção. 0 anticorpo que inclui a associação da cadeia pesada e/ou cadeia leve recombinante é rastreado a partir da cultura por ensaio apropriado, tais como ELISA ou RIA. Técnicas convencionais semelhantes podem ser empregues para construir outros anticorpos e moléculas alterados.

Um sistema de expressão útil é um sistema da glutamato sintetase (tal como comercializado por Lonza Biologics), particularmente se a célula hospedeira for CHO ou NSO (ver abaixo). 0 polinucleótido codificando o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado utilizando processos convencionais (e. g., sondas oligonucleotidicas) . Os vectores que podem ser utilizados incluem plasmídeo, virus, fago, transposões, minicromossomas, dos quais os plasmideos são uma forma de realização típica. Em geral, esses vectores incluem, ainda, uma sequência sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e sequências de terminação de transcrição ligadas, de um modo operativo, ao polinucleótido de cadeia leve e/ou pesada, de modo a facilitar a expressão. 0 polinucleótido codificando as cadeias leve e pesada pode ser inserido em vectores separados e introduzido (e. g., por electroporação) na mesma célula hospedeira ou, se desejado, a cadeia pesada e cadeia leve podem ser inseridas no mesmo vector para transfecção na célula hospedeira. Deste modo, também é aqui descrito um processo de construção de um vector codificando as cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo terapêutico ou um seu fragmento de ligação de antigénio, da invenção, cujo método compreende inserir num vector um polinucleótido codificando uma cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo terapêutico da invenção.

Também é aqui descrito um polinucleótido codificando uma região variável de cadeia pesada humanizada, tendo a sequência apresentada como SEQ ID N° 47, 48 ou 49 e um polinucleótido codificando uma cadeia pesada humanizada, tendo a sequência apresentada como SEQ ID N° 53, 54 ou 55.

Será imediatamente evidente para os especialistas na técnica que, devido à redundância do código genético, também estão disponíveis polinucleótidos alternativos aos aqui divulgados, que codificarão os polipéptidos da invenção.

Os vectores adequados para as etapas de clonagem e subclonagem empregues nos métodos e construção das composições

desta invenção podem ser seleccionados por um especialista na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada a série pUC convencional de vectores de clonagem. Um vector, pUC19, está comercialmente disponível a partir de fornecedores, tais como

Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) ou Pharmacia (Uppsala, Suécia) . Além disso, qualquer vector que seja capaz de se replicar facilmente, tenha uma abundância de sítios de clonagem e genes seleccionáveis (e. g., resistência a antibióticos) e seja facilmente manipulado pode ser utilizado para clonagem. Deste modo, nesta invenção, a selecção do vector de clonagem não é um factor limitativo. Outras sequências de vectores preferidas incluem uma sequência sinal poli A, tais como da hormona do crescimento bovina (BGH) e a sequência promotora de betaglobina (betaglopro). Aqui os vectores de expressão úteis podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas dos especialistas nesta técnica. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que 25 (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) deficiências auxotróficas de complemento ou fornecimento de nutrientes não disponíveis nos meios complexos. 0 esquema de selecção pode envolver a interrupção do crescimento da célula hospedeira. As células que foram transformadas com sucesso com os genes codificando o anticorpo terapêutico da presente invenção, sobrevivem devido, e. g., à resistência aos fármacos conferida pelo marcador de selecção. Outro exemplo é o denominado marcador de selecção DHFR, em que os transformantes são cultivados na presença de metotrexato. As células CHO são uma linha celular particularmente útil para a selecção de DHFR. Os métodos de selecção de células hospedeiras transformadas e amplificação do número de cópia de célula do transgene incluem a utilização do sistema DHFR, ver Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, para revisão ver Wemer RG, Noe W, Kopp K, Schluter M, "Sistemas de expressão de mamífero apropriados para biomedicamentos", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, Agosto de 1998. Um exemplo adicional é o sistema de expressão da glutamato sintetase (Lonza Biologics). Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl; ver Stinchcomb et al. Nature 282, 38, 1979.

Os componentes desses vectores, e. g., replicões, genes de selecção, estimuladores, promotores, sequências de sinal e semelhantes, podem ser obtidos de fontes comerciais ou naturais ou sintetizados por processos conhecidos, para utilização no direccionamento da expressão e/ou secreção do produto do ADN recombinante num hospedeiro seleccionado. Para este efeito, também podem ser seleccionados outros vectores de expressão apropriados, dos quais numerosos tipos para expressão mamífera, 26 bacteriana, de insecto, de levedura e fúngica são conhecidos na técnica. A presente invenção também abrange uma linha celular transfectada com um plasmideo recombinante contendo a sequência codificante dos anticorpos ou equivalentes da presente invenção. As células hospedeiras úteis para a clonagem e outras manipulações destes vectores de clonagem também são convencionais. Contudo, de um modo muito desejável, as células de diversas estirpes de E. coli são utilizadas para replicação dos vectores de clonagem e outras etapas na construção de anticorpos alterados desta invenção.

As células hospedeiras ou linhas celulares adequadas para a expressão do anticorpo da invenção são, de um modo preferido, células mamíferas, tais como NSO, Sp2/0, CHO (e. g., DG44) , COS, uma célula de fibroblasto (e. g., 3T3) e células de mieloma e, de um modo mais preferido, uma célula CHO ou uma célula de mieloma. Podem ser utilizadas células humanas permitindo, deste modo, que a molécula seja modificada com padrões de glicosilação humanos. Alternativamente, podem ser empregues outras linhas celulares eucarióticas. A selecção de células hospedeiras mamíferas adequadas e métodos para transformação, cultivo, amplificação, rastreio e produção e purificação de produto são conhecidas na técnica. Ver, e. g., Sambrook et al., citado acima.

As células bacterianas podem revelar-se úteis como células hospedeiras adequadas para a expressão dos anticorpos ou os seus fragmentos (tais como Fab ou ScFv recombinantes) da presente invenção (ver, e. g., Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Contudo, devido à tendência das proteínas expressas em 27 células bacterianas estarem numa forma desenrolada, ou impropriamente enrolada, ou numa forma não glicosilada, qualquer fragmento recombinante produzido numa célula bacteriana teria de ser rastreado para retenção da capacidade de ligação de antigénio. Se a molécula expressa pela célula bacteriana fosse produzida numa forma apropriadamente enrolada, essa célula bacteriana seria um hospedeiro desejável. Por exemplo, no campo da biotecnologia, diversas estirpes de E. coli utilizadas para expressão são bem conhecidas como células hospedeiras. Também podem ser empregues neste método diversas estirpes de B. subtilis, Streptomyces, outros bacilos e semelhantes.

Onde desejado, as estirpes de células de levedura conhecidas dos especialistas na técnica também estão disponíveis como células hospedeiras, assim como células de insecto, e. g., Drosophila e Lepidoptera e sistemas de expressão virai. Ver, e. g. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) e referências aí citadas.

Os métodos gerais pelos quais os vectores podem ser construídos, os métodos de transfecção requeridos para produzir as células hospedeiras da invenção e métodos de cultura necessários para produzir o anticorpo da invenção a partir dessa célula hospedeira são todos técnicas convencionais. Tipicamente, o método de cultura da presente invenção é um método de cultura isento de soro, habitualmente através do cultivo de células isentas de soro em suspensão. Do mesmo modo, uma vez produzidos, os anticorpos da invenção podem ser purificados do conteúdo da cultura celular de acordo com processos correntes da técnica, incluindo precipitação por sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, electroforese em gel e semelhantes. Essas técnicas estão no domínio da técnica e nao 28 limitam esta invenção. Por exemplo, a preparação de anticorpos é descrita nos documentos WO 99/58679 e WO 96/16990.

Ainda outro método de expressão dos anticorpos pode utilizar expressão num animal transgénico, tal como descrito na Patente U.S. N° 4873316. Este refere-se a um sistema de expressão utilizando o promotor de caseína do animal que, quando transgenicamente incorporado num mamífero, permite que a fêmea produza a proteína recombinante desejada no seu leite.

Num aspecto adicional da invenção, é proporcionado um método de produção de um anticorpo da invenção, cujo método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector codificando a cadeia leve e/ou pesada do anticorpo da invenção e a recuperação do anticorpo produzido desse modo.

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vectores codificando anticorpos da invenção são células procarióticas, de levedura ou eucarióticas superiores. As células procarióticas adequadas incluem eubactérias, e. g., enterobacteriaceae, tal como Escherichia, e. g., E. Coli (por exemplo ATCC 31446; 31537; 27325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella, e. g., Salmonella typhimurium, Serratia, e. g., Serratia marcescans e Shigella, assim como Bacilos, tais como B. subtilis e B. licheniformis (ver o documento DD 266710), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (e. g., ATCC 16045; 12424; 24178; 56500), yarrowia (documento EP402226), Pichia Pastoris (documento EP183070, ver, também, Peng et al. J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia 29 (documento EP244234), Penicillin, Tolypocladium e hospedeiros de Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger, também estão contemplados.

Embora as células hospedeiras procarióticas e de levedura estejam especificamente contempladas pela invenção, contudo, tipicamente, as células hospedeiras da presente invenção são células de vertebrado. As células hospedeiras de vertebrado adequadas incluem células mamíferas, tais como COS-1 (ATCC N° CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), linha 293 de rim embrionário humano, células de rim de hámster bebé (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC N° CRL 10314), 293 (ATCC N° CRL 1573), células de ovário de hámster Chinês CHO (e. g., CHO-K1, ATCC N° CCL 61, linha celular DHFR-CHO, tal como DG44 (ver Urlaub et al., (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556)), particularmente as linhas de células CHO adaptadas para cultura em suspensão, células sertoli de murganho, células de rim de macaco, células de rim de macaco verde Africano (ATCC CRL-1587), células HeLa, células de rim canino (ATCC CCL 34), células de pulmão humano (ATCC CCL 75) , células Hep G2 e de mieloma ou linfoma, e. g., NSO (ver o documento US 5807715), Sp2/0, Y0.

Deste modo, numa forma de realização da invenção, é proporcionada uma célula hospedeira transformada de um modo estável, compreendendo um vector codificando uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo terapêutico ou um seu fragmento de ligação de antigénio, como aqui descrito. Tipicamente, essas células hospedeiras compreendem um primeiro vector codificando a cadeia leve e um segundo vector codificando a referida cadeia pesada. 30

As células hospedeiras transformadas com vectores codificando os anticorpos terapêuticos da invenção ou os seus fragmentos de ligação de antigénio, podem ser cultivadas por qualquer método conhecido dos especialistas na técnica. As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos spinner, garrafas de rolamento ou sistemas de fibra oca mas, para produção em grande escala, prefere-se que sejam utilizados reactores de tanque agitado, particularmente para culturas em suspensão. Tipicamente, os tanques agitados estão adaptados para arejamento utilizando, e. g., aspersores, deflectores ou propulsores de baixo cisalhamento. Para colunas de borbulhadores e reactores de agitação pneumática, pode ser utilizado arejamento directo com ar ou bolhas de oxigénio. Se as células hospedeiras forem cultivadas em meios de cultura isentos de soro, prefere-se que os meios sejam suplementados com um agente protector celular, tal como pluronic F-68, para ajudar a prevenir a lesão celular em resultado do processo de arejamento. Dependendo das caracteristicas da célula hospedeira, podem ser utilizados microtransportadores como substratos de crescimento para linhas celulares dependentes de ancoragem ou as células podem ser adaptadas para cultura em suspensão (que é típico) . 0 cultivo de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de vertebrado, pode utilizar uma variedade de modos operacionais, tais como processamento em semicontínuo, contínuo repetido (ver Drapeau et al. (1994) cytotechnology 15: 103-109), processo em contínuo prolongado ou cultura em perfusão. Embora as células hospedeiras mamíferas transformadas de um modo recombinante possam ser cultivadas em meios contendo soro, tal como meios compreendendo soro de vitelo fetal (FCS), prefere-se que essas células hospedeiras sejam cultivadas em meios sintéticos isentos de soro, tal como os divulgados em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meios comercialmente 31 disponíveis, tais como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, EUA) , se necessário suplementados com uma fonte de energia, tal como glucose e factores de crescimento sintéticos, tal como insulina recombinante. 0 cultivo isento de soro de células hospedeiras pode requerer que essas células estejam adaptadas para crescerem em condições isentas de soro. Uma abordagem de adaptação é cultivar essas células hospedeiras em meios contendo soro e, repetidamente, trocar 80% do meio de cultura pelos meios isentos de soro, de modo que as células hospedeiras aprendam a adaptar-se em condições isentas de soro (ver, e. g., Scharfenberg K et al. (1995) em Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al. ed.), p. 619-623, Kluwer Academic publishers).

Os anticorpos da invenção segregados para dentro dos meios podem ser recuperados e purificados dos meios utilizando uma variedade de técnicas, de modo a proporcionar um grau de purificação adequado para a utilização pretendida. Por exemplo, a utilização de anticorpos terapêuticos da invenção para o tratamento de doentes humanos exige, de um modo típico, pelo menos, 95% de pureza, de um modo mais típico, 98% ou 99% de pureza, em comparação com os meios de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. No primeiro caso, os detritos celulares dos meios de cultura são tipicamente removidos utilizando centrifugação, seguida de uma etapa de clarificação do sobrenadante utilizando, e. g., microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração profunda. Está disponível uma variedade de outras técnicas, tais como diálise e electroforese em gel e técnicas cromatográficas, tais como hidroxiapatite (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente, envolvendo um sistema de marcação de afinidade, tal como poli-histidina) e/ou cromatografia de interacção hidrófoba (HIC, ver o documento US 5429746). Numa 32 forma de realização, os anticorpos da invenção, após diversas etapas de clarificação, são capturados utilizando cromatografia de afinidade de Proteína A ou G, seguida de etapas adicionais de cromatografia, tais como cromatografia de permuta iónica e/ou HA, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, de exclusão de tamanho e precipitação por sulfato de amónio. Tipicamente, também são empregues diversas etapas de remoção de vírus (e. g., nanofiltração, utilizando, e. g., um filtro DV-20). Após estas diversas etapas, é proporcionada uma preparação purificada (tipicamente, monoclonal) compreendendo, pelo menos, 75 mg/mL ou superior, e. g., 100 mg/mL, ou superior, do anticorpo da invenção ou um seu fragmento de ligação de antigénio e, por conseguinte, constitui uma forma de realização da invenção. Adequadamente, essas preparações estão substancialmente isentas de formas agregadas de anticorpos da invenção.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um método de produção de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção que se liga especificamente e neutraliza a actividade da NOGO-A humana, cujo método compreende as etapas de; (a) proporcionar um primeiro vector codificando uma cadeia pesada do anticorpo; (b) proporcionar um segundo vector codificando a cadeia leve do anticorpo; (c) transformar uma célula hospedeira mamífera (e. g., CHO) com os referidos primeiro e segundo vedores; (d) cultivar a célula hospedeira da etapa (c) sob condições conducentes à secreção do anticorpo desde a referida célula hospedeira para os referidos meios de cultura; (e) recuperar o anticorpo segregado da etapa (d). 33

Uma vez expresso pelo método desejado, o anticorpo é, depois, examinado para actividade in vitro por utilização de um ensaio apropriado. São empregues os formatos de ensaio ELISA presentemente convencionais para avaliar a ligação qualitativa e quantitativa do anticorpo a NOGO. Além disso, também podem ser utilizados outros ensaios in vitro para verificar a eficácia neutralizante, antes de estudos clínicos humanos subsequentes, realizados para avaliar a persistência do anticorpo no corpo, não obstante os mecanismos de depuração habituais.

Outras modificações aos anticorpos da presente invenção incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. Sabe-se que a glicosilação de anticorpos em posições conservadas nas suas regiões constantes tem um efeito profundo na função de anticorpo, particularmente o funcionamento efector, tal como os descritos acima, ver, por exemplo, Boyd et al. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Estão contemplados variantes de glicosilação dos anticorpos terapêuticos ou os seus fragmentos de ligação de antigénio, da presente invenção, em que uma ou mais fracções de hidratos de carbono são adicionadas, substituídas, delecionadas ou modificadas. A introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio potencial para conjugação enzimática de fracções de hidratos de carbono e pode, por conseguinte, ser utilizado para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40, 8868-8876, a sialiação terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou ressialilação, utilizando beta-1,4-galactosiltransferase e/ou alfa,2,3 sialiltransferase. Pensa-se que, aumentando a sialilação terminal, aumenta a meia-vida da imunoglobulina. Os anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos na natureza como uma 34 mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente evidente quando os anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente mamíferas. Foi desenvolvida uma variedade de métodos para preparar glicoformas definidas, ver Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears et al., Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al. (2002) Science, 298 1790, Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102, 5 79, Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34, 727. Deste modo, a invenção diz respeito a uma pluralidade de anticorpos terapêuticos (tipicamente, monoclonais) (que podem ser do isótipo IgG, e. g., IgGl), como aqui descrito, compreendendo um número definido (e. g., 7 ou menos, por exemplo 5 ou menos, tais como dois ou um único) de glicoforma (s) dos referidos anticorpos ou os seus fragmentos de ligação de antigénio.

Os agentes terapêuticos desta invenção podem ser administrados como uma profilaxia ou após o evento/inicio do acidente vascular cerebral de sintomas clínicos, ou como de outro modo necessário. A dose e duração do tratamento referem-se à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana e podem ser ajustadas por um especialista na técnica, dependendo do estado a ser tratado e da saúde geral do doente. Considera-se que, para se alcançar a eficácia terapêutica máxima, pode ser requerido o doseamento repetido (e. g., uma vez por semana ou uma vez de duas em duas semanas), ao longo de um período de tempo prolongado (e. g., quatro a seis meses) . O modo de administração do agente terapêutico da invenção pode ser qualquer via adequada que distribua o agente ao hospedeiro. Os anticorpos e composições farmacêuticas da invenção são particularmente úteis para administração 35 parentérica, i. e., subcutaneamente (s.c.), intratecalmente, intraperitonealmente (i.p.), intramuscularmente (i.m.), intravenosamente (i.v.) ou intranasalmente (i.n.).

Os agentes terapêuticos da invenção podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do anticorpo da invenção como um ingrediente activo, num veiculo farmaceuticamente aceitável. No agente profiláctico da invenção, prefere-se uma suspensão ou solução aquosa contendo o anticorpo manipulado, de um modo preferido tamponado a pH fisiológico, numa forma pronta para injecção. As composições para administração parentérica compreenderão, em geral, uma solução do anticorpo da invenção, ou uma sua mistura, dissolvida num veiculo farmaceuticamente aceitável, de um modo preferido um veiculo aquoso. Pode ser empregue uma variedade de veículos aquosos, e. g., solução salina a 0,9%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. Estas soluções podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (e. g., filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como requerido para condições fisiológicas aproximadas, tais como agentes de regulação de pH e de tamponização, etc. A concentração do anticorpo da invenção nessa formulação farmacêutica pode variar largamente, i. e., de menos de cerca de 0,5%, habitualmente a ou, pelo menos, a cerca de 1%, até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e será seleccionada, principalmente, com base em volumes de fluido, viscosidades, etc., de acordo como o modo particular de administração seleccionado.

Deste modo, uma composição farmacêutica da invenção para injecção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 mL de 36 água tamponada estéril e entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, e. g., cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou, de um modo mais preferido, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um anticorpo da invenção. De modo semelhante, uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa poderia ser preparada para conter cerca de 250 mL de solução de Ringer estéril e cerca de 1 a cerca de 30 e, de um modo preferido, 5 mg a cerca de 25 mg de um anticorpo manipulado da invenção por mL de solução de Ringer. Os métodos actuais para a preparação de composições parentericamente administráveis são bem conhecidos ou serão evidentes para os especialistas na técnica e estão descritos em maior detalhe, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Para a preparação de formulações de anticorpo intravenosamente administráveis da invenção, ver Lasmar U e Parkins D "A formulação de produtos Biofarmacêuticos", Pharma. Sei. Tech. today, páginas 129-137, Vol. 3 (3 de Abril de 2000), Wang, W "Instabilidade, estabilização e formulação de medicamentos proteicos líquidos", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Estabilidade de Medicamentos Proteicos Parte A e B, ed. Ahern T.J., Manning M.C., Nova Iorque, NI: Plenum Press (1992), Akers, M.J. "Interacções Excipiente-Fármaco em formulações Parentéricas", J. Pharm Sei 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al. "Efeitos de tipos de açúcar na estabilização de Proteína no estado seco", J Pharm Sei 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Cristalinidade de excipiente e o seu efeito de estabilização de estrutura de proteína durante a liofilização", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Formulações versáteis de misturas de manitol-sacarose para a liofilização proteica", J. Pharm. Sei, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Formação de peróxido na estabilidade de polissorbato 80 e proteína", J. Pharm Sei, 91, 2252-2264, (2002). 37

Prefere-se que o agente terapêutico da invenção, quando numa preparação farmacêutica, esteja presente nas formas de dose unitária. A dose terapeuticamente eficaz apropriada será facilmente determinada pelos especialistas na técnica. Para tratar de modo eficaz o acidente vascular cerebral e outras doenças neurológicas num humano, considera-se que uma dose na gama de 700 a 3500 mg por 70 kg de peso corporal de um anticorpo desta invenção seja administrada parentericamente, de um modo preferido s.c., i.v. ou i.m. (intramuscularmente). Essa dose pode, se necessário, ser repetida em intervalos de tempo apropriados, seleccionados conforme apropriado por um médico.

Os anticorpos aqui descritos podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num veículo adequado, antes da utilização. Esta técnica demonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais e podem ser empregues técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados em métodos de tratamento para atenuar ou parar a progressão e/ou início da doença de Alzheimer, além do (ou como uma alternativa ao) tratamento de doença estabelecida num doente humano.

As doenças ou distúrbios neurológicos como aqui utilizados acima incluem mas não estão limitados a lesão cerebral traumática, lesão de medula espinal, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington e, em particular, doença de Alzheimer, esclerose múltipla ou esclerose lateral amiotrófica (ALS).

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados num método de promoção da germinação axonal, compreendendo a etapa 38 de colocação em contacto de um axónio humano com um anticorpo anti-NOGO da presente invenção. Este método pode ser realizado in vitro ou in vivo, de um modo preferido, o método é realizado in vivo.

Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados num método de modulação da produção de um péptido amiloidogénico, compreendendo a colocação em contacto de uma célula, o qual está a expressar o precursor a partir do qual o péptido amiloidogénico é derivado e um polipéptido NOGO (e. g., NOGO-A humano), com um anticorpo anti-NOGO da presente invenção. Em formas de realização típicas, o precursor é a APP. Em formas de realização típicas adicionais, o péptido amiloidogénico é Αβ, de um modo muito preferido, Αβ40, Αβ42 ou uma combinação de ambos.

Como aqui utilizado, o termo "recuperação funcional" refere-se a um melhoramento motor e/ou sensório e/ou comportamental num indivíduo após, e. g., um evento ou lesão isquémico ou começo de sintomas clínicos. A recuperação funcional em humanos pode ser avaliada por instrumentos concebidos para medirem funções neurológicas elementares, tais como resistência motora, sensação e coordenação, funções cognitivas, tais como memória, linguagem e a capacidade para seguir instruções e capacidades funcionais, tais como actividades básicas da vida diária ou actividades instrumentais. A recuperação da função neurológica elementar pode ser medida com instrumentos, tal como a Escala de acidente vascular cerebral NIH (NIHSS), a recuperação da função cognitiva pode ser medida com testes neuropsicológicos, tais como o Teste de Vocabulário de Boston, Testes de Sequência Alfanumérica e Teste de Aprendizagem Verbal da Califórnia e as actividades da vida diária podem ser medidas com instrumentos, tais como a escala de 39 ADCS/ADL (Estudos Clínicos da Doença de Alzheimer/Actividades da Vida Diária) ou as Actividades de Bristol da Escala de Vida Diária, todos os testes e escalas conhecidos na técnica.

Os exemplos seguintes ilustram mas não limitam a invenção.

Exemplo 1, Construção e expressão de anticorpos anti-NOGO humanizados

As construções de VH e VL humanizadas foram preparadas de novo através da construção de oligonucleótidos de sobreposição, incluindo sítios de restrição para clonagem para vectores de expressão mamíferos Rld e Rln (ou qualquer outro vector de expressão adequado para expressão de proteínas em células mamíferas), assim como uma sequência sinal humana. Os sítios de restrição Hind III e Spe I foram introduzidos para enquadrar o domínio VH contendo a sequência sinal CAMPATH-1H, para clonagem para Rld contendo a região constante mutada de γΐ humana, para prevenir a actividade de ADCC e CDC (L235A e G237A - sistema de numeração do índice EU). Os sítios de restrição Hind III e BsiWI foram introduzidos para enquadrar o domínio VL contendo a sequência sinal CAMPATH-1H, para clonagem dentro de Rln contendo a região constante capa humana.

Sequência de sinal CAMPATH-1H: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID N° 31)

Foram produzidos plasmídeos codificando sequências de aminoácidos de cadeia pesada de IgG humana, em que as CDR eram as descritas na tabela 2. Os plasmídeos codificando as 40 sequências de aminoácidos de cadeia pesada de IgG humana, em que as CDR eram as descritas na tabela 3, foram produzidos a partir dos plasmideos existentes anteriores, através da introdução de mutações pontuais únicas, G95M (numeração de Kabat), utilizando o kit Quickchange (Stratagene). A tabela seguinte divulga quais as sequências proteicas de cadeia pesada de comprimento completo que foram preparadas nos vectores plasmidicos e quais das sequências estavam emparelhadas, no sentido em que a única diferença nas sequências de aminoácidos das sequências de cadeia pesada de comprimento completo (FL) emparelhadas era uma substituição em G95M (numeração de Kabat) na CDR H3 da região variável:

Tabela 8 CDR, como definidas na Tabela 2 Substituição G95M (para formar a CDR H3 da Tabela 3) FL de Hl (SEQ ID N° 35) Não feita FL de H6 (SEQ ID N° 15) FL de H26 (SEQ ID N° 53) FL de Hl6 (SEQ ID N° 16) FL de H27 (SEQ ID N° 54) FL de H20 (SEQ ID N° 42) FL de H28 (SEQ ID N° 55)

Os plasmideos codificando as cadeias pesadas foram, depois, co-transfectados para as células CHO (para detalhes, ver o exemplo 2) com uma das seguintes sequências de cadeia leve de comprimento completo: FL de Lll (SEQ ID N° 36), FL de L13 (SEQ ID N° 17) ou FL de L16 (SEQ ID N° 18). 41

Em paralelo, foi produzida uma quimera, designada HcLc (que é a quimera de 2A10 (SEQ ID N° 9 e 10 - as cadeias de comprimento completo compreendendo a VH (SEQ ID N° 7) e VL (SEQ ID N° 8) murinas de 2A10 e as regiões constantes de IgG humana)) .

Exemplo 2, Expressão de anticorpo em células CHO

Os plasmídeos Rld e Rln (ou outros vectores adequados para utilização em células mamíferas) codificando as cadeias pesada e leve, respectivamente, foram co-transfectados, de forma transiente, para as células CHO e expressos em pequena escala ou grande escala para produzir anticorpos. Alternativamente, os mesmos plasmídeos foram co-transfectados para as células DHFR-CHO por electroporação e uma população policlonal estável de células expressando o anticorpo apropriado foi seleccionada utilizando meios isentos de nucleósidos (o Rld contém o gene da DHFR, o Rln contém um marcador de selecção de neomicina) . Em alguns ensaios, os anticorpos foram avaliados directamente desde o sobrenadante de cultura de tecidos. Noutros ensaios, o anticorpo recombinante foi recuperado e purificado por cromatografia de afinidade em Proteína A sepharose.

Exemplo 3, O anticorpo anti-NOGO humanizado liga-se a NOGO A NOGO-A56 humana-GST (ver o exemplo 5), a 0,05-1 pg/mL em PBS, foi revestido sobre placas Immunosorp da Nunc (100 pL por poço), a 4 °C, de um dia para o outro. Os poços foram enxaguados uma vez com TBS + Tween a 0,05% (TBST) , depois, incubados com BSA a 2% em TBST, para bloquear sítios de ligação não 42 específicos, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Os anticorpos foram diluídos em TBST + BSA a 2% para 10 pg/mL e diluições de 1/2 preparadas a partir desta. Os anticorpos foram adicionados a poços em duplicado e incubados, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Os poços foram lavados três vezes com TBST, depois, incubados com conjugado de peroxidase capa anti-humano (1:2000), durante 1 hora. Os poços foram lavados três vezes com TBST e, depois, incubados com 100 pL de substrato de peroxidase OPD (Sigma), por poço, durante 10 minutos. A reacção de cor foi interrompida pela adição de 25 pL de H2SO4 concentrado. A densidade óptica a 490 nm foi medida utilizando um leitor de placas. Os valores do fundo lidos desde os poços sem anticorpo foram subtraídos.

As figuras 1-4 ilustram a ligação dependente de dose de anticorpos humanizados, em comparação com a quimera (designada HcLc, que é a quimera de 2A10 (compreendendo a VH (SEQ ID N° 7) e VL (SEQ ID N° 8) murinas de 2A10 e as regiões constantes de IgG humana)) para NOGO-A56 humana-GST (para detalhes, ver o Exemplo 5) num ensaio ELISA. O eixo Y mostra a densidade óptica (OD) , medida a 490 nm, uma medida quantitativa de anticorpo capturado nos poços. O eixo X mostra a concentração de anticorpo utilizada (mcg/mL) por poço em cada ponto de dados. O material de anticorpo utilizado nas Figuras 1-4 é anticorpo purificado produzido pelo sistema de expressão policlonal ou transfecções transientes de grande escala. Nestes casos, os níveis de IgG foram quantificados por ELISA e densidade óptica.

Os resultados das experiências mostrados nas Figuras 1-4 mostram que a inclusão da mutação G95M melhora o desempenho do 43 anticorpo. A única excepção é H27L16, mostrada na Figura 3 e 4, que teve um desempenho muito fraco. Pensa-se que estes dados resultaram de um problema técnico não identificado com o ensaio H27L16, visto que a H27L16 teve, de outro modo, um desempenho consistentemente bom noutros ensaios (em ELISA mostrado nas Figuras 1 e 2 e nos ensaios BIAcore (Tabelas 9 e 10)). Também se mostrou que a H27L16 funciona muito bem em experiências anteriores (ver as Figuras 9 e 10).

Exemplo 4, Protocolo de Quantificação de Anticorpo

As placas Immunosorp da Nunc foram revestidas com um anticorpo de captura de cadeia IgG anti-humano de cabra (Sigma #13382), a 2 pg/mL, em tampão Bicarbonato (Sigma #C3041) e incubado, de um dia para o outro, a 4 °C. As placas foram lavadas duas vezes com TBS contendo Tween 20 a 0,05% (TBST) e bloqueadas com 200 pL de TBST contendo BSA a 2% (ou desde 1-3%) (tampão de bloqueio), durante 1 h, à temperatura ambiente. As placas foram lavadas duas vezes com TBST. Os sobrenadantes de cultura de tecidos contendo anticorpos foram titulados em toda a placa, em etapas de diluições de 2 vezes e para o tampão de bloqueio e incubados, à temperatura ambiente, durante 1 h. As placas foram lavadas três vezes com TBST. O anticorpo H23 conjugado a HRP (cadeia capa anti-humano de cabra, Sigma #A7164) foi diluído 1:2000 em TBST e 100 pL adicionados a cada poço. As placas foram incubadas, à temperatura ambiente, durante 1 h. As placas foram lavadas três vezes com TBST e desenvolvidas com 100 pL de substrato Fast-OPD (Sigma #P9187). Deixou-se

desenvolver a cor, durante 5-10 min, tempo após o qual o ELISA foi interrompido com 25 pL de H2S04 a 3 Μ. A absorvência a 490 nM 44 foi lida em placa e a concentração de anticorpo foi determinada por referência a uma curva-padrão.

Exemplo 5. Produção de Fragmento da NOGO-A (N0G0-A56, SEQ ID N° 32)

Uma sequência de ADNc codificando um polipéptido

compreendendo os aminoácidos 586-785 e uma cauda GST (SEQ ID N° 32) da NOGO-A humana foi criada através da clonagem de um ADNc codificando os aminoácidos 586-785 da NOGO-A humana para os sítios BamHI-Xhol de pGEX-6Pl, para produzir uma proteína de fusão com cauda GST, designada GST-humana-NOGO-A56. 0 plasmídeo foi expresso em células BL21, em meio 2XTY com 100 yg/mL de ampicilina, após indução com IPTG para 0,5 mM, a 37 °C, durante 3 horas. Os sedimentos celulares foram lisados por sonicação e a proteína de fusão purificada utilizando Glutationo-sepharose (Amersham Pharmacia), seguindo as instruções do fabricante. A proteína purificada foi eluída utilizando glutationo reduzido e extensamente dialisada contra PBS, quantificada utilizando padrões de BSA e um ensaio de proteína baseado em coomassie da BioRad e, depois, armazenada em alíquotas, a -80 °C.

Exemplo 6. Análise BiaCore de Anticorpos Monoclonais Anti NOGO Humanizados A cinética de ligação do anticorpo monoclonal (mAb) anti-NOGO para NOGO-A humana GST recombinantemente expressa foi analisada utilizando o biossensor Biacore 3000 ou BIAcore T100. O chip hNOGO-A foi preparado como se segue: 45 Método A NOGO-A56 humana-GST foi imobilizada num chip CM5 por ligação de amina primária, utilizando o programa Wizard da Biacore concebido para visar niveis de imobilização. 0 sensor de superfície CM5 foi activado através da passagem de uma solução de N-hidroxi-succinimida (NHS) a 50 mM e carboneto de N-etil-N'-dimetilaminopropilo (EDC) a 200 mM. Depois, NOGO-A56 humana-GST, em tampão de acetato de sódio, pH 5,0 ou pH 4,5, foi passada sobre o chip e imobilizada. Depois de a imobilização estar completa, quaisquer ésteres ainda activados foram bloqueados por uma injecção de cloridrato de etanolamina a 1 M, pH 8,5.

Os mAb anti-NOGO foram diluídos em HBS-EP (HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e surfactante P-20 a 0,005%) para o BIAcore 3000 ou HBS-EP+ (HEPES a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e surfactante P-20 a 0,05%) no caso de T100 e foram efectuados estudos de ligação a uma gama de concentrações definidas de anticorpo. Todas as corridas foram referenciadas contra uma superfície sensora em branco (uma que tinha sido activada e bloqueada como descrito anteriormente mas não tinha adição de ligando). A análise de ligação foi efectuada utilizando a versão 4.1 do software de análise cinética BIAevaluat ion para o BIAcore 3000 e versão 1.0 do software de análise cinética T100. A análise Biacore de outros anticorpos da invenção seguiu, essencialmente, o mesmo protocolo como aqui descrito. Salvo indicação em contrário, as experiências BIAcore foram realizadas a 25 °C.

Na seguinte secção de Resultados, cada tabela de dados representa os resultados obtidos de uma experiência individual. 46

Resultados - Tabela 9

Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) HcLc 3,19E6 2,49E-3 779 H27L13 6,2E6 1,8E-3 291 H26L13 3,23E6 3,11 E-3 963 H28L13 7,26E6 3,3E-3 454 H27L16 6,24E6 1,21 E-3 194 H28L16 7,25E6 2,14E-3 296

Resultados - Tabela 10

Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) HcLc (25 °C) 2,66E6 3,13E-3 1, 18 HcLc (37 °C) 5,0 8E6 7,74E-3 1, 46 H16L16 (25 °C) 3,43E6 3,72E-3 1,08 H16L16 (37 °C) 5,31 E6 6,16E-3 1, 16 H20L16 (25 °C) 4,6 9E6 5,42E-3 1, 16 H20L16 (37 °C) 7,17E6 1,08E-3 1,51 H27L16 (25 °C) 3,94E6 1,50E-3 0,380 H27L16 (37 °C) 7,18E6 3,06E-3 0,426 H27L13 (25 °C) 3,5 0E6 2,13E-3 0,606 H27L13 (37 °C) 6,5 8E6 4,22E-3 0,641 H28L16 (25 °C) 4,33E6 2,64E-3 0,610 H28L16 (37 °C) 7,73E6 5,24E-3 0,678 H28L13 (25 °C) 4,16E6 3,89E-3 0,936 H28L13 (37 °C) 7,43E6 7,59E-3 1,02

Resultados - Tabela 11

Anticorpos ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM) HcLc 3,17E6 2,33E-3 0, 74 H26L13 3,45E6 2,88E-3 0,87 H27L13 6,5 8E6 1,83E-3 0,28 H28L13 6,97E6 3,17E-3 0, 45 H28L16 6,8 9E6 1,95E-3 0,28

Exemplo 7: Análise BiaCore de anticorpos monoclonais Anti NOGO humanizados utilizando classificação de velocidade de subtracção 0 chip NOGO-A56 humana-GST foi preparado como para a análise cinética. Os sobrenadantes celulares foram retirados directamente de transfecções transientes de células CH0-K1. Estes foram passados directamente sobre a superfície sensora e a interacção medida. Foi utilizado um sobrenadante celular falsamente transfectado para duplo referenciamento, para remover quaisquer interferências devido aos meios de cultura de tecidos. Todas as corridas foram referenciadas contra uma superfície sensora em branco (uma que tinha sido activada e bloqueada como descrito anteriormente mas não tinha adição de ligando). A análise de liqação foi efectuada utilizando a versão 4.1 do software de análise cinética BIAevaluation. 48

Exemplo 8: Mapeamento Peptídico

Foram obtidos 47 péptidos de sobreposição abrangendo a porção NOGO-A56 do domínio da NOGO-A56 humana-GST (SEQ ID N° 32) (de Mimotope™). Os péptidos têm 16 aminoácidos em comprimento, com uma sobreposição de doze aminoácidos com o péptido adjacente (cada péptido compreendendo, adicionalmente, uma sequência de biotina-SGSG no terminal N), com a excepção do primeiro péptido, que tem uma cauda de GSG-biocitina no terminal C. Os péptidos foram utilizados para mapear epitopicamente o sítio de ligação de 2A10 e H28L16. Método para mapeamento epitópico:

A estreptavidina, a 5 pg/mL, em água estéril, foi revestida sobre placas immunosorp da Nunc (100 pL por poço), a 37 °C, de um dia para o outro. As placas foram enxaguadas 3 vezes com PBS contendo Tween a 0,05% (PBST), depois, bloqueadas com BSA a 3% em PBST, a 4 °C, de um dia para o outro. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST. Os péptidos foram, depois, adicionados aos poços, a uma concentração de, aproximadamente, 10 pg/mL (diluídos em BSA a 3% em PBST) e incubados, à temperatura ambiente, durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST, depois, incubadas, durante 1 hora, com anticorpo anti-NOGO diluído para 5 pg/mL, em BSA a 3%, em PBST. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST, depois, incubadas com conjugado de peroxidase capa anti-humano ou anti-murganho (1:1000, diluído em BSA a 3% em PBST), durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e, depois, incubadas com 100 pL de substrato de peroxidase OPD (Sigma), por poço, durante 10 minutos. A reacção de cor foi interrompida pela adição de 50 pL de H2S04 a 3 molar. 49 A absorvência a 490 nm foi medida utilizando um leitor de placas.

Os dados indicaram que 2A10 e H28L16 se ligam aos péptidos 6 e 7, dos quais a porção específica da NOGO é dada na SEQ ID N° 73 e SEQ ID N° 74, respectivamente, ambas as quais contêm a sequência VLPDIVMEAPLN. Estes resultados indicam que VLPDIVMEAPLN (SEQ ID N° 60) contém o epitopo de ligação de 2A10 e H28L16.

Exemplo 9: Comparação de HcLc e HcLc contendo a mutação G95M da CDR H3

Uma variante modificado de HcLc foi construído a partir de plasmídeos de expressão existentes, através da introdução de uma única mutação pontual, G95M (numeração de Kabat), utilizando o kit Quikchange (Stratagene). A sequência proteica da proteína do domínio Hc pesado variável (G95M) é dada na SEQ ID 59. O Hc(G95M)Lc foi expresso em células CHO, como descrito anteriormente. O anticorpo foi quantificado como descrito no Exemplo 4. As Figuras 5 e Figura 6 mostram uma comparação da actividade de ligação de Hc(G95M)Lc e HcLc, como determinada utilizando um ELISA de ligação da NOGO-A humana, quando a NOGO foi revestida sobre placas immunosorp da Nunc, a 0,05 (Figura 5) e 1 pg/mL (Figura 6) . A Tabela 12 abaixo mostra uma comparação das afinidades de ligação de Hc(G95M)Lc e HcLc. 50

Tabela 12 Velocidade de subtracção medida por classificação de Biacore com base numa experiência

Anticorpo Sequência ID da região variável de cadeia pesada Kd de velocidade de subtracção (1/s) H6L13 11 1,38E-2 H6(G95M)L13 47 4,31E-3 HcLc 7 2,66E-3 Hc(G95M)Lc 59 6,14E-4

Os dados demonstram que a substituição G95M dentro de CDR H3 aumenta, não apenas a actividade de ligação dos anticorpos humanizados (H6L13), mas também o anticorpo 2A10 dador murino (HcLc).

Exemplo 10: Construção e teste de anticorpos NOGO contendo substituições em CDR H3

Foi criado um painel de 90 regiões variáveis de cadeia pesada por mutações pontuais únicas nos resíduos contidos na CDR H3, ou a Leucina anterior. Especificamente, foram preparados vectores codificando uma cadeia pesada (baseada em H6FL, SEQ ID N° 15) codificando regiões variáveis de cadeia pesada, onde cada resíduo de aminoácido na CDR H3 e na Leucina anterior foi substituído (utilizando o kit Quikchange (Stratagene)) com todos os outros aminoácidos de ocorrência natural, excluindo cisteína e expressos em conjunto com uma cadeia leve (L13FL, SEQ ID N° 17) para dar 90 anticorpos diferentes. Estes 51 anticorpos foram ensaiados para ligação a NOGO em experiências de ELISA e Biacore.

As Figuras 7 e 8 mostram uma comparação da actividade de ligação dos variantes de H6FL em comparação com H6FL L13FL. As Tabelas 13 e 14 mostram uma comparação da cinética de velocidade de subtracção, como medida por Biacore - apenas se mostram os resultados para os anticorpos que tinham uma velocidade de subtracção mensurável no ensaio Biacore e tinham actividade de ligação comparável a H6L13 em ELISA.

Tabela 13

Anticorpo Parental VH CDR3 Kd (1/s) H6L13 MQGY 4,85E-03 HcLc GQGY 5,58E-03 H6L13 GQNY 9,66E-03 H6L13 GQLY 1,32E-02 H6L13 IQGY 1,72E-02 H6L13 RQGY 1,75E-02 H6L13 GQSY 1,86E-02 H6L13 GQGY 1,98E-02 H6L13 GSGY 2,0 7E-02 H6L13 GDGY 2,12E-02 H6L13 GQGW 2,16E-02 H6L13 GIGY 2,57E-02 H6L13 GQYY 3,28E-02 H6L13 GQFY 3,35E-02 52 (continuação)

Anticorpo Parental VH CDR3 Kd (1/s) H6L13 WQGY 1,98E-02 H6L13 GAGY 3,15E-02 H6L13 GLGY 1,90E-02 H6L13 GVGY 1,78E-02 H6L13 GQWY 1,77E-02

Conclusões

Os resultados indicam que os anticorpos que retêm as propriedades de ligação do 2A10 murino e do anticorpo H6L13 contendo GQGY, são os que contêm a seguinte CDR H3: RQGY, IQGY, MQGY, GDGY, GIGY, GSGY, GQNY, GQYY, GQSY, GQLY, GQFY, GQGW, WQGY, GAGY, GLGY, GVGY, GQWY.

Exemplo 11, Comparação de mab contendo GQGY (H20L16) com mab de variante G95M (H27L16 e H28L 13 e H28L16)

Os anticorpos listados na Tabela 14 foram preparados como descrito acima. 53

Tabela 14 - anticorpos anti-Nogo-A de 2A10 humanizados dando o número total de mutações inversas para o anticorpo intacto (2x cadeia pesada + 2x cadeia leve).

Anticorpo Número total de mutações inversas por anticorpo/tetrâmero intacto H20L16 22 H28L16 22 H28L13 16 H27L16 32

Caracteristicas de ligação in vitro

Numa tentativa de classificar os anticorpos, as suas propriedades de ligação foram investigadas numa gama de ensaios, incluindo ELISA, ELISA de formato reverso, ELISA de competição, Biacore e por citometria de fluxo.

11.1 Ligação a NOGO-A humana recombinante em ELISA A capacidade de os anticorpos se ligarem a Nogo-A humana recombinante (Nogo-A56 humana-GST) foi investigada por diversos ensaios ELISA relacionados (realizados num protocolo relacionado, mas ligeiramente diferente, que o descrito no Exemplo 3). No primeiro ensaio, a Nogo-A recombinante é directamente revestida na placa, a diversas concentrações antigénicas diferentes. Os resultados do ELISA de ligação directo, quando o antigénio é carregado a 1 mcg/mL ou 0,05 mcg/mL, são mostrados na Figura 9A e Figura 9B, 54 respectivamente. Os dados confirmam que todos os anticorpos mostram actividade de ligação comparável a Nogo-A humana recombinante, quando comparados com a forma quimérica do anticorpo parental (HcLc). A concentrações superiores de revestimento de antigénio, todos os anticorpos produzem um valor de EC50 semelhante. Em contraste, a uma concentração de revestimento de antigénio inferior, o ensaio foi capaz de discriminar entre os anticorpos. Embora não fossem obtidas curvas de saturação, uma análise de tendência nas linhas revelou a seguinte ordem de classificação: H27L16>H28L16, H28L13, H20L16 .

Numa experiência paralela, o formato do ensaio foi revertido. Neste formato, o anticorpo é capturado na placa e a ligação da Nogo-A humana recombinante (Nogo-A-56 humana-GST) detectada utilizando a cauda GST. Os resultados do formato ELISA reverso são mostrados na Figura 10. Os dados confirmam que todos os anticorpos mostram actividade de ligação comparável a Nogo-A humana recombinante, quando comparados com a forma quimérica do anticorpo parental (HcLc). Este formato do ELISA de ligação não distinguiu entre os anticorpos. 11.2 ELISA de Competição

A capacidade de os anticorpos competirem directamente com o anticorpo parental para o mesmo epitopo em Nogo-A humana foi avaliada utilizando um ELISA de competição. A Nogo-A humana recombinante (Nogo-A56 humana-GST) foi revestida sobre as placas. O anticorpo parental 2A10 e os anticorpos humanizados foram pré-misturados antes da adição às placas. A ligação de 2A10 foi quantificada utilizando um conjugado de IgG-HRP 55 anti-murganho (Dakocytomation, #P0260). Os resultados mostrados na Figura 11 confirmam gue todos os guatro anticorpos podem competir com 2A10. Isto sugere gue os anticorpos humanizados e anticorpo parental reconhecem um epitopo de sobreposição em Nogo-A humana. Além disso, a actividade dos anticorpos humanizados é comparável ou melhor do gue a quimera HcLc. Os resultados indicam que H27L16, H28L16 e H28L13 são mais potentes do que H20L16. 11.3 Medições de Afinidade Biacore 0 Biacore foi utilizado para determinar afinidades e classificar anticorpos utilizando duas metodologias diferentes. Na primeira abordagem, a Nogo-A recombinante foi ligada à superfície do chip e os anticorpos anti-Nogo-A passados sobre esta superfície. Na segunda abordagem, foi utilizada Proteína A para capturar o anticorpo na superfície do chip sobre o qual a NOGO-A56 humana-GST recombinante foi passada. Os resultados mostrados na Tabela 15 foram obtidos através da ligação do antigénio à superfície e confirmam que todos os quatro anticorpos mostram afinidade comparável/melhor do que o anticorpo parental (HcLc). Com base na média de seis corridas independentes, em termos de afinidade global, os anticorpos classificam-se na seguinte ordem: H27L16>H28L16>H28L13>H20L16, consistente com a ordem de classificação do ELISA de ligação directo (Figura 9B) . No caso de H27L16 e H28L16, os anticorpos humanizados demonstram afinidade 2-3x mais elevada do que o anticorpo parental (HcLc). 56

Tabela 15 - Cinéticas de ligação dos anticorpos humanizados anti-Nogo-A a Nogo-A humana recombinante (Nogo-A56 humana-GST), como determinadas utilizando o Biacore T100. O antigénio foi ligado ao chip CM5 por ligação de amina primária. Os anticorpos foram fluídos sobre diversas concentrações (0,125-8 nM) . Os valores mostram a média e desvio-padrão (entre parêntesis) de seis corridas independentes efectuadas em duplicado. Cada conjunto de dados completo foi analisado independentemente antes do cálculo da média e desvio-padrão. **Apenas 11 conjuntos de dados analisados para H20L16, visto que um conjunto não pôde ser analisado.

Anticorpo Ka kd KD (nM) H20L16** 5,37E6 (7,65E5) 9,70E-3 (2,65E-3) 1,80(0,31) H27L16 3,96E6 (9,93E5) 2,30E-3 (1,11E-3) 0,56 (0,15) H28L13 8,13E6 (1,35E6) 9,10E-3 (2,65E-3) 1,11(0,18) H28L16 6,97E6 (6,62E5) 43E-3 (1,18E-3) 0,64 (0,15) HcLc 3,8 0E6 (7,11E5) 7,09E-3 ( 2,22E-3) 1,86 (0,32)

Num modo semelhante ao ELISA, a cinética de ligação de anticorpo a Nogo-A humana recombinante (Nogo-A56 humana-GST) também foi avaliada num formato reverso (ver o Exemplo 11.1). Neste ensaio, os anticorpos humanizados foram capturados no chip CM5 por Proteína A. As médias dos resultados para seis corridas independentes são mostradas na Tabela 16. Consistente com o ELISA de formato reverso, todos os anticorpos Nogo-A humanizados mostram cinéticas de ligação semelhantes à quimera (HcLc) no Biacore de formato reverso. 57

Tabela 16 - Cinéticas de ligação de formato reverso dos anticorpos humanizados anti-Nogo-A a Nogo-A humana recombinante (GST Nogo-A 5+6), como determinadas utilizando o Biacore TlOO. A Proteína A foi imobilizada para, aproximadamente, 4000 RU por amina primária e utilizada para capturar 200-300 RU dos anticorpos da amostra. A Nogo-A humana recombinante foi passada a diversas concentrações (0,125-8 nM) . Os valores mostram a média e desvio-padrão (entre parêntesis) de três corridas independentes em duplicado. Cada conjunto de dados foi analisado independentemente antes do cálculo da média e desvio-padrão.

Anticorpo Ka kd KD (nM) H20L16 1,01 E6 (1,35E5) 3,13E-4 (2,79E-5) 0,31 (0,036) H27L16 9,93E5 (2,02E4) 3,04E-4 (1,83E-5) 0,31 (0,019) H28L13 1,12E6 (1,21 ES) 3,84E-4 (3,24E-5) 0,34 (0,015) H28L16 1,18E6 (8,32E4) 4,01E-4 (2,48E-5) 0,34 (0,032) HcLc 1,3 8E6 (3,7 0E5) 5,69E-4 (1,54E-4) 0,41 (0,062) 11.4 Ligação a NOGO humana nativa

Para demonstrar que os anticorpos humanizados se ligam a Nogo-A humana nativa, com um perfil comparável ao anticorpo parental, foram desenvolvidos dois ensaios baseados em citometria de fluxo. No primeiro ensaio, foi gerada uma linha celular baseada em CH0-K1 expressando o domínio extracelular da NOGO-A humana na superfície celular. A ligação dos anticorpos anti-Nogo-A humanizados foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando um IgG anti-humano marcado com PE (Sigma, #P8047). A Figura 12 abaixo mostra um perfil típico para os anticorpos anti-Nogo-A na linha celular CHO-Nogo-A. Embora o ensaio não seja suficientemente sensível para distinguir entre os anticorpos, os resultados confirmam que todos os quatro 58 anticorpos podem reconhecer Nogo-A humana expressa na superfície celular, a níveis comparáveis aos da quimera. Nenhum dos anticorpos reconhece a linha celular parental (CH0-K1 - dados não mostrados).

No segundo ensaio, foi avaliada a capacidade de os anticorpos humanizados se ligarem a Nogo-A nativa utilizando uma linha celular de neuroblastoma humana - IMR32. Esta linha celular é caracterizada por elevados níveis intracelulares/baixos níveis de superfície celular de proteína Nogo-A. Numa tentativa de aumentar o sinal de ligação, o ensaio foi configurado para detectar Nogo-A intracelular (residente em ER) . As células IMR32 foram permeabilizadas e fixadas antes da coloração com os anticorpos humanizados anti-Nogo-A. A ligação dos anticorpos a Nogo-A foi detectada utilizando um IgG secundário marcado com PE anti-humano (Sigma, #P8047). Os resultados, mostrados na Figura 14 abaixo, confirmam que todos os anticorpos se ligam a Nogo-A intracelular, a níveis comparáveis ou mais elevados do que o anticorpo HcLc parental. Estes dados, em conjunto com os resultados da linha celular CHO-Nogo-A, confirmam que os anticorpos humanizados podem reconhecer uma forma mais nativa da proteína Nogo-A, a níveis comparáveis ou melhores do que a quimera, HcLc. Os ensaios não são suficientemente sensíveis para classificar o painel de anticorpos. 11.5 Ensaios de crescimento de neurite

Os anticorpos anti-Nogo-A humanizados foram testados para a sua capacidade de neutralizarem a actividade inibitória do crescimento de neurite (NO) da NOGO-A, num ensaio que se baseia 59 na quantificação de NO como descrito anteriormente. Os anticorpos testados no ensaio foram seleccionados com base na sua cinética de ligação para Nogo-A. Anticorpos humanizados de elevada afinidade, nomeadamente H28L16, H27L16, H20L16 e, para referência, os seus anticorpos parentais 2A10 (monoclonal de murganho) e HcLc (quimera murganho humano) foram testados para neutralização da NOGO-A. Para comparação, os anticorpos 11 C7 (ver o Exemplo 13) também foram testados no ensaio.

De modo a testar a actividade neutralizante de anticorpos humanizados seleccionados, poços revestidos com NOGO-A56 humana-GST recombinante humana e tratados com concentrações variáveis de anticorpos, a 37 °C, durante 1 h, antes da adição de neurónios granulares de cerebelo (CGN). Os poços de controlo foram tratados com HBSS. 0 comprimento médio de neurite por neurite foi medido para cada poço. A Figura 14 mostra os resultados para os anticorpos humanizados testados no ensaio. Um painel de anticorpos de controlo (IgG de controlo, IgG de murganho purificado; Campath e outros anticorpos humanizados irrelevantes) foi utilizado para confirmar a especificidade da actividade. Como um controlo adicional, os mesmos anticorpos humanizados foram titulados em placas revestidas com GST. Os resultados confirmam que H28L16, H27L16 e H20L16 revertem a inibição mediada por Nogo-A do crescimento de neurite para um grau semelhante ao observado para os anticorpos parentais (2A10 e HcLc). Os efeitos parecem ser robustos e estáveis e foram verificados com H28L16 em oito de onze experiências independentes de crescimento de neurite. Em contraste, os anticorpos humanizados não aumentam o crescimento de neurite em placas revestidas com GST e o painel de anticorpos de controlo não mostra qualquer reversão de inibição dependente de dose, confirmando que o efeito dos anticorpos humanizados é específico 60 para a inibição mediada por Nogo-A. Os dados apresentados para o crescimento de neurite são seleccionados do número de experiências repetidas. Embora um número das repetições, que não são mostradas, pareça ser variável em natureza, pensa-se que os dados mostrados reflectem uma verdadeira actividade dos anticorpos da presente invenção na redução do efeito inibidor da NOGO no ensaio de crescimento de neurite.

Exemplo 12, Caracterização adicional de H28L16 12.1 Ligação a Nogo-A recombinante de comprimento completo A capacidade de os anticorpos se ligarem a Nogo-A humana recombinante de domínio extracelular de comprimento completo (GST-Nogo-A humana-ECD) foi investigada por um ensaio ELISA de ligação directo. Neste caso, o ECD era uma variante de excisão encontrando-se, aproximadamente, na região da posição 186-1004 da NOGO A humana (a porção começando DETFAL (SEQ ID N° 95) e terminando com ELSKTS (SEQ ID N° 96)). A GST-Nogo-A humana-ECD recombinante foi directamente revestida na placa, a 1 pg/mL. Os dados mostrados na Figura 15 confirmam que o H28L16 pode reconhecer GST-Nogo-A humana-ECD como níveis comparáveis ou melhores do que o parental (HcLc) ou H20L16 . 12.2 Inibição da funcionalidade de Fc

Para melhorar o perfil de segurança do candidato, os resíduos L235 e G237 no domínio CH2 da região constante de 61 cadeia pesada (sistema do índice EU) foram mutados para resíduos de alanina reduzindo, deste modo, a probabilidade de provocar funções efectoras imunológicas mediadas por anticorpo. A ligação reduzida de Clq humano foi utilizada como um substituto para inibição da funcionalidade de Fc. A Figura 16 abaixo mostra que o H28L16 reduziu significativamente a actividade de ligação de Clq, em comparação com Campath-IgGl (tipo selvagem) e comparável a uma construção Campath IgGl contendo as mesmas mutações (anticorpo mutado de Fc (Fc-)) e Campath IgG4. Estes dados sugerem que as mutações do domínio CH2 presentes em H28L16 reduzirão, significativamente, a probabilidade de provocar funções efectoras mediadas por Fc. 12.3 Ligação de ortólogo

Para confirmar que o H28L16 mostra actividade de ligação a diversos ortólogos da NOGO-A, comparável à do anticorpo parental (HcLc), foi realizada uma série de ensaios de ligação. A Figura 17 A-D abaixo mostra os resultados de um ELISA de ligação directo a NOGO recombinante (Nogo-A56 humana-GST) de rato (SEQ ID N° 94), cinomolgos (SEQ ID N° 92), saguim (SEQ ID N° 93) e macaco-esquilo, respectivamente (SEQ ID N° 91). Em todos os casos, o H28L16 mostra actividade comparável ou melhor do que o anticorpo quimérico (HcLc). Os valores de EC50 calculados são muito semelhantes aos calculados para ligação a Nogo-A recombinante humana. A cinética de ligação de H28L16 aos diversos ortólogos da NOGO-A, em comparação com HcLc e 11C7, foi determinada utilizando o Biacore. As Tabela 17 e Tabela 18 abaixo mostram as cinéticas de ligação em dois formatos diferentes do ensaio. Onde 62 a Nogo-A recombinante estava ligada directamente ao chip CM5 (Tabela 17), as cinéticas de ligação para rato, macaco cinomolgos, macaco-esguilo e saguim são muito semelhantes aquelas para humano (gama = 0,33-0,67 nM) . Quando o formato do ensaio foi revertido e os anticorpos são capturados no chip utilizando Proteína A (Tabela 18), a afinidade de ligação de H28L16 para Nogo-A de rato é, aproximadamente, 4 vezes mais baixa do que para Nogo-A humana. Uma tendência semelhante é observada para Nogo-A de cinomolgos (afinidade 8,5x mais baixa do que a humana) e os outros ortólogos de primata (afinidade 12-17x mais baixa do que a humana) . O anticorpo HcLc quimérico mostra um perfil semelhante de ligação aos ortólogos da NOGO-A em ambas as orientações do ensaio. Visto não ser claro que formato de ensaio melhor representa a situação in vivo, as conclusões primárias que podem ser tiradas deste estudo são 1) o H28L16 reteve o perfil de reactividade cruzada de ortólogo associado a anticorpo HcLc quimérico e 2) a afinidade de HcLc para Nogo-A de rato e cinomolgos está dentro de 4 vezes e 8,5 vezes da afinidade para Nogo-A humana e, sob determinadas condições, pode ser muito semelhante. 63

Tabela 17 - Cinéticas de ligação de 11281 lê, 11 C7 e HcLc aos ortólogos recombinantes da NOGO-A humana, como determinadas utilizando o Biacore TlOO. Apmimadamente 140-18Ú RB dos diversos ortólogos da NOGO-A foram capturados no chip CM5 por ligação de amina primária. Os anticorpos foram fluídos sobre diversas concentrações (0,125-8 nMj. Os valores mostram a média e desvio-padrão (entre parêntesis) de 1-2 corridas independentes efectuadas em duplicado com cada conjunto de dados independentemente analisado antes do cálculo da média e desvio-padrão. *Dm conjunto de curvas foi descartado devido a curvas não interpretáveis para o anticorpo 11C7. 6 4 H28L16 11C7 HcLc Ortólogo Kâ Kd KD (nM) Kâ Kd KD (nM) Kâ Kd KD (nM) Cinomolgos 4,65E6 3,07E-3 0,67 1,47E6 3,40E-4 0,23 2,94E6 4,78E-3 1,68 (2 corridas)* (7,47E5) (2,37E-4) (0,06) (1,67E5) (4,45E-5) (0,01) (7,13E5) (6,34E-4) (0,35) Rato 4,64E6 l,54E-3 0,33 8,36E5 1,20E-4 0,11 2,53E6 2,83E-3 1,12 (2 corridas) (2,34E5) (3,06E-5) (0,01) (5,58E5) (2,14E-5) (0,03) (5,32E4) (2,30E-5) (0,03) Saguim 4,2E6 3,02E-3 0,626 1,16E6 2,80E-4 0,24 3,13E6 4,44E-3 1,419 (1 corrida) (2,47E4) (5,09E-5) (0,000) (5,37E4) (6,15E-6) (0,006) (2,76E4) (1,41 E-4) (0,03) Macaco-esquilo 4,46E6 2,73E-3 0,61 1,10E6 2,86E-4 0,26 3,04E6 4,68E-3 1,54 (1 corrida) (6,08E4) (4,95E-6) (0,000) (3,25E4) (1,87E-5) (0,010) (1,64E5) (2,11 E-4) (0,15) Humano 3,97E6 4,43E-3 0,64 1,58E6 2,64E-4 0,19 3,80E6 7,09E-3 1,86 (6,62E5) (1,18E-3) (0,15) (6,42E5) (5,57E-5) (7,96E-2) (7,11 E5) (2,22E-3) (0,32)

Tabela 18 - Cinéticas de ligação de formto reverso de H28L 16, 11 Cl e HcLc âos ortólogos recombínântes da NOGO-A hmm, como determinadas no Bíãcore T100. A Proteínâ A foi imobilizada nâ superfície a cerca de 4000 RU e os ânticorpos anti-Nogo-A forem capturados a, aproximadamente, 300-400 RU. As proteínas recombínântes (GST- N0G0-A56) foram fluídas sobre diversas concentrações (0,125-64 nM), dependendo da construção. Todas as corridas foram feitas em duplicados. Os valores mostram a média e desvio-padrão (entre parêntesis) de 1-3 corridas independentes, com cada corrida feita em duplicado com cada conjunto de dados índependentemente analisado antes do cálculo da média e desvio-padrão. 6 5 H28L16 11C7 HcLc Ortólogo Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) Ka Kd KD (nM) Cinomolgos 3,26E5 1,11E-3 3,41 4,02E5 2,97E-4 0,76 3,03E5 1,41 E-3 4,66 (3 corridas) (4,06E3) (2,23E-5) (0,65) (6,85E4) (1,11 E-5) (0,12) (4,58 E3) (2,84E-5) (0,08) Rato 3,80E5 16,69E-4 1,76 2,83E5 1,77E-4 0,64 5,47 1,10E-3 2,01 (3 corridas) (5,68E3) (1,24E-5) (0,03) (4,6SE4) (1,34E-5) (0,09) (1,20E4) (2,86E-5) (0,07) Saguim 2,22E5 1,09E-3 4,89 1,91 E5 2,54E-4 1,33 3,02 1,36E-3 4,51 (1 corrida) (3,61 E3) (7,35E-5) (0,25) (2,90E3) (3,46E-6) (0,00) (9,90E2) (7,92E-5) (0,28) Macaco-esquilo 1,57E5 l,08E-3 GO 1,03E5 2,78E-4 2,69 1,74E5 1,29E-3 7,45 (1 corrida) (2,69E3) (5,02E-5) (0,20) (2,12E3) (3,61 E-6) (0,02) (2,19E3) (7,64E-5) (0,34) Humano 1,20E6 4,75E-4 0,40 2,64E5 l,49E-4 0,57 1,32E6 7,00E-4 0,54 (1 corrida) (8,49E4) (9,97E-6) (0,02) (3,32E3) (1,61 E-5) (0,07) (2,71 E5) (3,18 E-5) (0,09) 12.4 Propriedades físicas

As propriedades físico-químicas de H28L16 e H20L16 foram avaliadas por SEC-HPLC e SDS-PAGE. A SEC-HPLC foi efectuada a 1,0 mL/minuto, utilizando fosfato de sódio a 100 mM, cloreto de sódio a 400 mM, pH 6,8 e uma coluna de aço inoxidável TSK G3000 SW xl 30 cm x 7,8 mm, com detecção a 214 nm e 280 nm. O SDS-PAGE foi efectuado num gel de Tris-HCL a 4-20% da Novex, carregando 10 pg de produto e coloração com Sypro Ruby. O C-IEF foi efectuado numa MDQ da Beckman, utilizando anfolinas a pH 3,5 - 10.

Foram obtidos os seguintes resultados:

Tabela 19 - Análise de HPLC de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) dos anticorpos anti-Nogo-A. Os valores mostrados são percentagens do anticorpo atribuído a cada das três espécies diferentes.

Anticorpo % de Agregado % de Monómero % de Fragmento H28L16 0,50 99,50 0, 00 H20L16 14,21 85, 75 0, 05 66

Tabela 20 - Análise de SDS-PAGE dos anticorpos anti-Nogo-A. Os valores mostrados são percentagens do anticorpo verificado nas bandas principais.

Anticorpo Não reduzido Reduzido H28L16 82, 4% HC:6 7,2 % LC:2 7,7% H+L:94,9% H20L16 84, 6% HC: 69,3% LC: 26,4% H+L: 95,7%

Os dados de SEC-HPLC sugerem que o H20L16 é mais susceptível a agregação do que o H28L16 (H28L16) . Se os dados aqui referidos fossem repetidos em grande escala, tal poderia ter impacto na capacidade do processo de fabrico para produzir material de qualidade aceitável para utilização clinica (>95% de monómero) . Os dados de SDS-PAGE mostram que ambos os candidatos são aceitáveis, com ambos a mostrarem um perfil típico.

Exemplo 13, Comparaçao de H28L16 com 11C7

Um anticorpo anti-Nogo-A murino, designado 11C7, é descrito no documento WO2004052932, que foi deduzido para um epitopo peptídico. Um 11C7 quimérico foi preparado com base na informação de sequência proporcionada no documento W02004052932. Para comparar os epitopos de ligação de 2A10 e 11C7, foi estabelecido um ELISA de competição para investigar se 11 C7 e 67 2Α10 reconhecem um epitopo de sobreposição em Nogo-A. Como mostrado na Figura 20 abaixo, o H28L16 foi capaz de competir com 2A10 para ligação a Nogo-A recombinante humano, ao passo que o 11C7 não mostrou competição com 2A10, mesmo a concentrações de até 100 mcg/mL.

Exemplo 14: ELISA de competição para demonstrar a capacidade de os péptidos competirem directamente com NOGO-5+6 humana para ligação a NOGO H28L16 Método para ELISA de competição A capacidade dos péptidos competirem directamente com NOGO-A (NOGO-A56 humana-GST) para ligação a NOGO H28L16 foi avaliada utilizando um ELISA de competição. IgG anti-humano de coelho (Sigma, #1-9764), a 5 g/mL em tampão bicarbonato, foi revestido sobre placas immunosorp da Nunc (100 pL por poço), a 4 °C, de um dia para o outro. As placas foram enxaguadas 3 vezes com TBS contendo Tween a 0,05% (TBST), depois, bloqueadas com BSA a 1% em TBST, à temperatura ambiente, durante 1 hora. O H28L16 foi, depois, capturado na placa (1 pg/mL, diluída em BSA a 1% em TBST, 50 pL por poço), à temperatura ambiente, durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST. Os péptidos (desde 0 a 100 g/mL) e NOGO-A56 humana-GST, a uma concentração de 1 pg/mL (diluída em BSA a 1% em TBST), foram pré-misturados antes da adição para os poços e incubados, à temperatura ambiente, durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST, depois, incubadas, durante 1 hora, com conjugado de peroxidase anti-GST de coelho (Sigma, #A7340, 1:2000, diluídas em BSA a 1% em TBST), durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST e, depois, incubadas com 50 pL de substrato de peroxidase OPD (Sigma), por poço, durante 10 minutos. A reacção de cor foi 68 interrompida pela adiçao de 25 pL de H2S04 concentrado. A absorvência a 490 nm foi medida utilizando um leitor de placas.

Os resultados mostrados na Figura 19 confirmam que os péptidos 6 e 7, que eram positivos no ELISA de mapeamento epitópico (Exemplo 8), podem competir com ligação da NOGO-A56 humana-GST a H28L16. Isto sugere que os péptidos que eram positivos no estudo de mapeamento epitópico contêm um epitopo para ligação de H28L16. Os péptidos 16 e 17 (que contêm péptidos NOGO, mas não se sobrepõem com os péptidos 6 ou 7), que não contêm o epitopo proposto, não competem com NOGO-5+6.

Exemplo 15: Análise ELISA de um anticorpo monoclonal Anti NOGO humanizado com base nos variante G101S/Q37R de anticorpo NOGO O G101S (também conhecido por H100 (SEQ ID N° 63)), uma variante modificado da região variável de cadeia pesada de H6 (SEQ ID N° 11), foi produzido através da introdução de uma única substituição, G101 S (numeração de Kabat), dentro de CDR H3, como descrito acima. De modo semelhante, Q37R, uma variante modificado da região variável de cadeia leve de L13 (SEQ ID N° 13), foi produzido através da introdução de uma única substituição (numeração de Kabat Q37R) na região de estrutura (para formar L100) . A sequência proteica do domínio Q37R leve variável é dada na SEQ ID N° 67.

Os genes codificando versões de comprimento completo das cadeias pesada e leve contendo as substituições G101S/Q37R foram expressos em células CHO, como descrito anteriormente e 69 ensaiados num ELISA de ligação directo, como descrito anteriormente.

Os resultados do ELISA de ligação directo, quando o antigénio é carregado a 0,05 gg/mL, são mostrados na Figura 20. Os dados confirmam que o anticorpo H100L100 mostra actividade de ligação comparável a NOGO-A56 humana-GST recombinante, quando comparada com H27L16 e que o H100L100 tem um perfil de ligação melhorado, quando comparado com H6L13. Os correspondentes valores de EC50 são mostrados na tabela abaixo:

Tabela 21: Medições de EC50 para o variante G101S/Q37R, em comparação com H6L13 e H27L16

Anticorpo Valor de EC50 H6L13 0,086 H27L16 0,052 Hl 0 0/LI 0 0 0,048

Exemplo 16: Análise BiaCore de Anticorpos Monoclonais Anti NOGO humanizados com base no variante G101S de CDR H3 H100, uma variante modificado da região variável de cadeia pesada de H6 (SEQ ID N° 11), foi gerado através da introdução de uma única substituição, G101 S (numeração de Kabat), em CDR H3. A sequência proteica da proteína H100 de domínio pesado variável é dada na SEQ ID N° 63. De modo semelhante, L100 e L101, variantes modificados da região variável de cadeia leve de L13 (SEQ ID N° 13), foram produzidos através da introdução de uma 70 única substituição (numeração de Kabat Q37R e Q45R, respectivamente) na região de estrutura. As sequências proteicas das proteínas L100 e L101 de domínio variável leve são dadas na SEQ ID N° 67 e SEQ ID N° 68, respectivamente.

As versões de comprimento completo de H100L100 e H100L101 foram expressas em células CHO, como descrito anteriormente. A Tabela 21 mostra uma comparação das afinidades de ligação de H6L13 com H100L100 e H100L101 e indica que H100L100 e H100L101 têm uma afinidade de ligação melhorada, quando comparada com H6L13. Neste exemplo, o método foi realizado essencialmente como descrito no Exemplo 6, onde o chip CM5 foi activado através da passagem de soluções de NHS e EDC sobre o chip, a 5 pL/mL, durante 7 minutos e a NOGO foi suspensa em tampão de acetato de sódio a 10 nM (pH 4,5), antes da passagem sobre o chip.

Tabela 22 - Medições Biacore para os variantes G101S da cadeia pesada variável de H6, em combinação com variantes da cadeia leve variável de L13, em comparação com H6L13.

Anticorp o Ka de velocidade de adição (1/Ms) Kd de velocidade de subtracção (1/s) Afinidade (KD, nM) H6L13 1,04E+06 7,22E-03 6,97 H100L100 1,28E+07 5,07E-03 0,396 H100L101 1,30E+07 4,29E-03 0,329 71

Resumo de sequências de anticorpo NOGO (Tabela 23)

Descrição Identificador de sequência (SEQ ID N0) Sequência de aminoácidos Sequência de polinucleótidos 2A10, CDR-H1 1 - 2A10, CDR-H2 2 - 2A10, CDR-H3 3 - 2A10, CDR-L1 4 - 2A10, CDR-L2 5 - 2A10, CDR-L3 6 - 2A10, VH (murino) 7 19 2A10, VL (murino) 8 20 Cadeia pesada Hc quimérica 9 21 Cadeia leve Lc quimérica 10 22 Construção H6 humanizada de 2A10 VH 11 23 Construção H16 humanizada de 2AIO VH 12 24 Construção L13 humanizada de 2AIO VL 13 25 Construção L16 humanizada de 2AIO VL 14 26 Construção H6 humanizada de cadeia pesada de 2A10 15 27 Construção H6 humanizada de cadeia pesada de 2A10 16 28 72 (continuação)

Descrição Identificador de sequência (SEQ ID N0) Sequência de aminoácidos Sequência de polinucleótidos Construção L13 humanizada de cadeia leve de 2A10 17 29 Construção L16 humanizada de cadeia leve de 2A10 18 30 Sequência condutora Campath 31 - Aminoácidos 586-785 da NOGO A humana (NOGO-A56) fundida a GST 32 Construção Hl humanizada de 2A10 VH 33 37 Construção Lll humanizada de 2AIO VL 34 38 Construção Hl humanizada de cadeia pesada de 2A10 35 39 Construção Lll humanizada de cadeia leve de 2A10 36 40 Construção H20 humanizada de 2AIO VH 41 43 Construção H20 humanizada de cadeia pesada de 2A10 42 44 2A10, CDR-H3 (G95M) 45 Sequência do fraqmento NOGO-A de Saguim 46 Construção H26 humanizada de VH 47 50 Construção H27 humanizada de VH 48 51 73 (continuação)

Descrição Identificador de sequência (SEQ ID N0) Sequência de aminoácidos Sequência de polinucleótidos Construção H28 humanizada de VH 49 52 Construção H26 humanizada de cadeia pesada 53 56 Construção H27 humanizada de cadeia pesada 54 57 Construção H28 humanizada de cadeia pesada 55 58 Cadeia pesada Hc quimérica (G95M) 59 Epitopo 60 Construção H99 humanizada de 2AIO VH 61 CDR (G101S) 62 Construção H100 humanizada de VH 63 Construção H101 humanizada de VH 64 Construção H102 humanizada de VH 65 Construção H98 humanizada de VH 66 LI 0 0 (L13+Q37R) 67 LI 01 (L13+Q45R) 68 L102 (L13+Q37R/Q45R) 69 Ll03 (L16+Q37R) 70 LI 0 4 (L16+Q45R) 71 L105 (L16+Q37R/Q45R) 72 74 (continuação)

Descrição Identificador de sequência (SEQ ID N°) Sequência de aminoácidos Sequência de polinucleótidos Péptido 73 Péptido 74 Análogo de CDR H3 75 Análogo de CDR H3 76 Análogo de CDR H3 77 Análogo de CDR H3 78 Análogo de CDR H3 79 Análogo de CDR H3 80 Análogo de CDR H3 81 Análogo de CDR H3 82 Análogo de CDR H3 83 Análogo de CDR H3 84 Péptido NOGO 85 Análogo de CDR H3 86 Análogo de CDR H3 87 Análogo de CDR H3 88 Análogo de CDR H3 89 Análogo de CDR H3 90 NOGO de macaco-esquilo (A56) mais cauda GST 91 NOGO de macaco cinomolgos (A56) mais cauda GST 92 75 (continuação)

Descrição Identificador de sequência (SEQ ID N°) Sequência de aminoácidos Sequência de polinucleótidos NOGO de saguim (A56) mais cauda 93 GST NOGO de rato (A56) mais cauda 94 GST Péptido NOGO humano 95 Péptido NOGO humano 96

Sequências

SEQ ID N° 1: 2A10 CDR-H1 SYWMH

SEQ ID N° 2: 2A10 CDR-H2 NINPSNGGTNYNEKFKS

SEQ ID N° 3: 2A10 CDR-H3 GQGY

SEQ ID N° 4: 2A10 CDR-L1 RSSKSLLYKDGKTYLN

SEQ ID N° 5: 2A10 CDR-L2 LMSTRAS

SEQ ID N° 6: 2A10 CDR-L3 QQLVEYPLT 76 SEQ ID N° 7: 2A10, VH (murino)

QVQLQOPGTBLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKORPGQaLEWIGNINPSNGCTínrKEKFKSKATLTV

DKSSSTAYMCI^SLTSEDSAVYYCEJU^YWGQGTTI/rVSS SEQ ID N° 8: 2A10, VL (murino)

DIVITQDELSMPVTSGESVSISCnSSKSLLYKDOKTYLHWFLQRPGQSPQLLIYLMSTHASGVSDRFSGSGS

GTDFTLBISRVKAEDVCVYYC<&IA^PLTFGAGTKLELK SEQ ID N° 9: Cadeia pesada Hc quimérica

QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKORPGQGLEWIGNINP SNGCTTTOIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCBLGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA ΡΕδΚδΤδΚΉ/^νίΟΟΙ,νΚηΥΤΡΕΡντνδνΐΝΞαΑΙ/ΓδανΗΤΡΡΑνί-Οεδσΐ,ΥδΙ^δνντνΡεΕδΙ,στΟΤΥΙ^ VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVPOFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHBDPEV KFNWYVDGVBVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLrVLHQDWLNGKEYKCICVSNKAljPAPIEKTISKAKGÔPRB PQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFIYSKI/TVDKSRW QOGNVFSCSVKHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID N° 10: Cadeia leve Lc quimérica DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLiYKDGKTYLNNFLORPGQSPQLIi

XYLMSTRASGVSDRFSaSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCOQLVEYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFP psdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgmsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkv

YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID 11: Construção H6 humanizada de 2A10 VH

QVQLVQSGASVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGCTOYNEKFKSRATMTR

DTSTSTAYKELSSLRSEDTAVYYCELGOGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N° 12 Construção H16 humanizada de 2A10 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHMHWVKQRPGQâLEWIGNItIPSMfG&niyNBKFKâKATLTV dkststaymelsslrsedtavyycelgqgywgqgti»vtvss

SEQ ID N° 13: Construção L13 humanizada de 2A10 VL

DIVMTQSPLSL·PVTLGQPASISCRSSKSLI,YKDGKTYLNWPQQRPGQSPQI.LIYLMSTIiASαVPDRFSι3GGS gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtklbik

SEQ ID N° 14: Construção L16 humanizada de 2A10 VL

DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSULYKDGKTYLNWFLQRPGQSPOUjIYLMSTRASOVPDRFSGGGS gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtklbik 77 SEQ ID N° 15: Construção H6 humanizada de cadeia pesada de 2A10

QVQliVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINP snggthyhekpksratmtrdtststaymexsslrsedtavyycelgqgvwgootlvtvssastkgpsvfpla

PSSKSTSGGTAAIíGCLVKDYFPEPVTVSWMSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTOTYICN

VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLKISRTPEVTCWVDVSHEDPEV kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsmkaí,papibictiskakgqpre

PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKnPPVLDSDGS PFLYSKLTVDKSRW qqgnvfscsvmhbalhnhytqkslslspgk SEQ ID N° 16: Construção H16 humanizada de cadeia pesada de 2A10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKORPGQGLEWIGNINP snggtnynekpkskatltvdkststaymelsslrsedtavyycelgqoywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpbfvtvswnsgaltsgvhtppavlqssgIíYslsswtvpssslgtqtyicn VHMKPSirrKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPBIiA.GAPSVFLPPPKPXDTl.MISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAIiPAP 1EKTISKAKGQPRB PQVYTLPPSRDELTKKQVSLTGLVKGFYPSDIAVEWEBNGQPEMNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk SEQ ID N° 17: Construção L13 humanizada de cadeia leve de 2A10

DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRFGQSPQLIjI YLMSTRASGVPDRFSGCGSGTDPTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCUJWFYPREAKVQWKVDNALQSCNSQESVTEQDSKDSrYSLSSTLTLSKADYBKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID N° 18: Construção L16 humanizada de cadeia leve de 2A10

DIVMTQSPLSNPVTLGGPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWPLQRPaQSPQLLI YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTIiKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLBUaVrVAAPSVPIFPP SDEQLKSGTASWCLLNMFYPREAXVQWKVDNAXjOSGMSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHXVY ACEVTHQGLS5PVTKSFNRGEC SEQ ID N° 19: PN codificando 2A10, VH (murino) SEQ ID: 7 caggtccaactgcagcagcctgggactgaactggtgaagcctgggccttcagtgaagctgtcctgcaaggct tctcgctacaccttcaccagcxactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggatt goaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgta gacaaatccyccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgt gaactggoacagggctactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca 78 SEQ ID N° 20: PN codificando 2A10, VL (murino) SEQ ID: 8

GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACrTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGG

TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCT

CCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCA ggaacagatttcaccctggaaatcagtagagtgaaggctgaggatgtgggtgtgtattactgtcaacaactt gtagagtatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa SEQ ID N° 21: PN codificando a cadeia pesada Hc Quimérica SEQ ID: 9 atgggatggagctgtatcatcctctttttggtagcagcagctacaggtgtccactcccaggtccaactgcag cagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttc accagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagc acagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgaactgggacagggc tactggggccaaggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctggggccacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAOAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggxggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaatga SEQ ID N° 22: PN codificando a cadeia leve Lc Quimérica SEQ ID: 10 atgaggtgctctcttcagtttctgggggtgcttatgttctggatctctggagtcagtggggatattgtgata acccaggatgaactctccaatcctgtcacttctggagaatcagtttccatctcctgcaggtctagtaagagt ctcctatataaggatgggaagacatacttgaattggtttctgcagagaccaggacaatctcctcagctcctg atctatttgatgtccacccgxgcatcaggagtctcagaccggtttagtggcagtgggtcaggaacagatttc accctggaaatcagtagagtgaaggctgaggatgtgggtgtgtattactgtcaacaacttctagagtatccg ctcaggttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccg

CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCrCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCrATCCCAGAGAG gccaaagtacagtggaaggtggacaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtc tacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag 79 SEQ ID N° 23: PN codificando a construção H6 humanizada de 2A10 VH SEQ ID: 11

CAGGTGCAGCTGGrGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacacgcccctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagccaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgggacagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 24: PN codificando a construção H16 humanizada de 2A10 VH SEQ ID: 12

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTCAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGCCA tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaaacagcgacctggacaagggcttgagtggatc

GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC

GACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT gaactgggacagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 25: PN codificando a construção L13 humanizada de 2A10 VL SEQ ID: 13 gatattgtcatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcagg tctagtaagagtctcctatataaggatgggaagacatacttgaattggtttcagcagaggccaggccaatct ccacagctcctaatttatttgatgtccacccgtgcatctggggtcccagacagattcagcggcggtgggtca ggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgccaacaactt gtagagtatccgctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaa SEQ ID N° 26: PN codificando a construção L16 humanizada de 2A10 VL SEQ ID: 14 gatattgtgatgacccagtctccactctccaaccccgtcacccitggacagccggtctccatctcctgcagg tctagtaagagtctcctatataaggatgggaagacatacttgaattggtttctccagaggccaggccaatct ccacagctcctaatttatttgatgtccacccgtgcatctggggtcccagacagattcagcggcggtgggtca ggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgccaacaactt gtagagtatccgctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaa 80 SEQ ID N° 27: PN codificando a construção H6 humanizada da cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 15

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT agcaatggtggtagtaactacaatgagaagttcaagagcagagccaccatgaccagggacacgtccacgagc acagcctacatgqagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgggacagggc tactggggccagggaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaaxcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcqtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatcgcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC tccctgtctccgggtaaatga SEQ ID N° 28: PN codificando a construção H16 humanizada da cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 16

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACaTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCTAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 81 SEQ ID N° 29: PN codificando a construção L13 humanizada da cadeia leve de 2A10 SEQ ID: 17 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgatattgtgatgacc cagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtaagagtctc ctatataaggatgggaagacatacttgaattggtttcagcagaggccacgccaatctccacagctcctaatt

TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCXjGCQGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA ctgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgccaacaacttgtagagtatccgctc acgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggacaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag SEQ ID N° 30: PN codificando a construção L16 humanizada da cadeia leve de 2A10 SEQ ID: 18 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgatattgtgatgacc cagtctccactctccaaccccqtcacccttggacagccgotctccatctcctgcaggtctagtaagagtctc

CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT tatttgatgtccacccgtgcatctggggtcccagacagattcagcggcggtgggtcaggcactgatttcaca ctgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgitggggtttattactgccaacaacttgtagagtatocgctc acgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataactxctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggacaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

SEQ ID N° 31: Sequência condutora Campath MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID N° 32: Aminoácidos 586-785 da NOGO A humana (NOGO-A56) fundidos a GST

MSPILOYWKIKGnVOPTRLL,L8yLEBKYBEHIiYERDEODKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDQDVKLTOSMAII RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKNFEDRLCHKTyLN GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKI.VCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLOGWQATFGGGDHP PKSDLiFVLFQGPLGSMQESIjYPAAQIjCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPIjNSAVPSAGASVIQPSSSPLEAS SVNYESI KHEPENPPPYEEAMSVS1.KJCVSG IKEKIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPD FSDYSEMAKVEOPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMI,VKESLTBTSFESMIEYENK£ LBRPHRD

SEQ ID N° 33: Construção Hl humanizada de 2A10 VH

QVQlVQSCAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMCNINPSNGGTNYNEKFICSRVTMTR

DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCEI/GOGYWGQGTLVTVSS 82

SEQ ID N° 34: Construção Lll humanizada de 2A10 VL

DXVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKrYLNWFQQRPGQSPOlAlY&HSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVOVYYCQQIiVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 35: Construção Hl humanizada de cadeia pesada de 2A10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGN inp SNeGTNYNBKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSIjftSBDTAVYYCBliGGGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPIiA PSSKSTSGGTAALGCLiVKDYFPEPVTVSWNSGALTSQVHTFPAVLQSSGIiYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN VimKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDHLHGKEyKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSL.TCLVKGFYPSDIAVBWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSJtt.TVDKSRW QQGNVFSCSVMHBALKNHYTQKS LS LSPGK SEQ ID N° 36: Construção Lll humanizada de cadeia leve de 2A10

D2VXTQSPLSLPVTI«GQPA£1SCRSSKSIjLYKQGKTYIiHWFQQRPGQSPQLX«I ylmstrasgvpdrpsgggsgtdftlkisrveabdvgvyycqqlvbypltfgqgtkleikrtvaapsvfifpp

S DEQLfCSGTAS WCLLNN F YPRE AKVQWKVDNALQSGMSQES VTEQDS KDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVY ACBVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID N° 37: PN codificando a construção Hl humanizada de 2A10 VH SEQ ID: 33 caggtgcagctggtqcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatg ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagtcaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgggacagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 38: PN codificando a construção Lll humanizada de 2A10 VL SEQ ID: 34

GATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGQ tctagtaagagtctcctatataaggatgggaagacatacttgaattgotttcagcagaggccaogccaayct ccacagctcctaaittatttqatgtccacocgtgcatctggggtcccagacagattcagcggcgotgggtca ggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgccaacaactt gtagagtatccgctcacgtttggccagggoaocaagctggagatcaaa 83 SEQ ID N° 39: PN codificando a cadeia pesada Hl humanizada de 2A10 SEQ ID: 35

ATGGGATGGAGCTaTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc accagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagtcaccatoaccagggacacgtccacgagc acagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgggacagggc tactggggccagggaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacsagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacacgaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttgaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagoagtacaagtgc

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCArrCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCaCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG cagcagggqaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctcigcacaaccactacacgcagaagagcctc

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID N° 40: PN codificando a construção Lll de cadeia leve humanizada de 2A10 SEQ ID: 36 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgatattgtgataacc cagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtaagagtctc ctatataaggatgcgaagacatacttgaattggtttcagcaqagcccaggccaatctccacagctcctaatt

TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATrCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA

CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCdCTC acgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggacaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc aaggacagcacctacagcctcaqcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac

GCCTGCGAAGTCACCCATÇAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTrAG

SEQ ID N° 41: Construção H20 humanizada de 2A10 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSY WMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNE KFKS KATMTR DTSTSTAYMELSSliRSEDTAVYVCELGQGYHGQGTLVTVSS SEQ ID N° 42: Construção H20 humanizada de cadeia pesada de 2A10 qvqlvqsgaevkkpgasvkwsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninp

SNGGTWYWEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCEIiGOGYVíGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA

PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWÍÍSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSWTVPSSSLGrOTYICN

VMHKPSNTKVBKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV

KFNWYVDGVBVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHGDWLNGKEyKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRB PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCIíVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW OQGNVFSCSVMHEALKNHYTQKSLSLSpgk 84 SEQ ID N° 43: PN codificando a construção H20 humanizada de 2A10 VH SEQ ID: 41

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgggacagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 44: PN codificando a construção H20 humanizada da cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 42 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtgcagctggtg cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc

ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCrGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT

AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC

ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAACGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA

CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac

ACCCTCATGATCTCCCCGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTC AACTGG TACGTGGACGG CGTGGAG GTGCATAATG C CAAGACAAAGCCG CGGGAGGAG CAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGrGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatcaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaatga

SEQ ID N° 45: 2A10 CDR-H3 (G95M) MQGY SEQ ID N° 46: Sequência de aminoácidos do fragmento NOGO-A de Saguim vqdslcpvaqlcpsfeeseatpspvlpdivmeaplnsavpsagasavqpssspleassvnfesvkhepenpp

PYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSSYSEMAKVEQPLP DHSELVEDSS PDSEPVOLFSDDSI PDVPQKQDEAVl LVKETLTETSFESMIEHENK

SEQ ID N° 47: Construção H26 humanizada de VH

OVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIHPSMGGTNYIIEKFKSRATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS 85

SEQ ID N° 48: Construção H27 humanizada de VH qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfts ywmhwvkqr pgqgle w igninpsnggtnywekfks katltv dkststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvss

SEQ ID N° 49: Construção H28 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID N° 50: PN codificando a construção H26 humanizada de VH SEQ ID: 47

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTCGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGCCCTCACTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtccgacaggcccctcgacaagggcttgagtccatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagccaccatgaccagg gacacgtccacgaccacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactcatgcagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 51: PN codificando a construção H27 humanizada de VH SEQ ID: 48 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaaacagcgacctggacaagggcttgaqtggatc

GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGaGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC GACAAATCCACOAGCACAGC CTAC ATGGA GCTGAG C AG CCTG AGATC TG AGGAC ACGGCC GT GTATTACTQT gaactgatgcagggctactggggccaggqaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 52: PN codificando a construção H28 humanizada de VH SEQ ID: 49

CAGG TGCAGCTGGTCCAGTCTGGGGC TGAGG TGAAQ AAG CCTG GGQ CCTCAGTG AAGGTTT C C TGCAAGGCA tctggatacaccttcaccagctactggatggactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgqatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagg

GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGOKíAGCAGCCTGAGATCrGAGGACACGGCCGTOTATTACTGT gaactgatgcagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca SEQ ID N° 53: Construção H26 humanizada de cadeia pesada QVCLVQSGA&VKKPGASVKVâCiCASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL&WXGNINP SNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLCTOTYICN νΝΗΚΡεΗΤΚνΟΚΚνΕΡΚβαΛαΉΤΟΡΡΟΡΑΡδωνσΑΡβνϊΙ,ΡΡΡΚΡΚηΊΧΜΙδΙΙΤΡΕνΤΓνννίϊνΒΗΕΟΡΕν KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCJCVSJJKAIíPAPrEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKS RW qqgnvpscsvmhealhnkytqkslslspgk 86 SEQ ID N° 54: Construção H27 humanizada de cadeia pesada

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWWHWVKQRPGQGLEWIGNINP SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVS sas tkgpsvfpla PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEIjAGAPSVFl,FPFKPKDTliMISRTPÊ\rrcVWDVSHBDPEV kfnwyvdgvevhnaktkpreeqymstyr WSVLTVLHQDWLHGKE ykckvsnkalpap I EKT ISKAKGQPRS PQVYTLPPSRDEIjTKNQVSLTCLVKGPYPSDrAVEWESNGQPENNYKTTPPVl,DSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID N° 55: Construção H28 humanizada de cadeia pesada

aVQLVQSGAEVKXPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWICNINP SNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSIfRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPl* Ρ53Κ£ΤΞ(Χ5ΤΑΑΙ/ΧΓΙίνΚΠΥΡΡΕΡνΤν81τ/Ν30Α1ιΤ50νΗΤΓΡΑνΐ/03301ιΥ31·35νντνΡ335ΙΚ3Τ0ΤΥΙ0Ν VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAFSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV KFNMYVDGVE VHNAKTKPREBOYHSTYRWS VliTVLHQDWUia KEYKCKVSNKALPAP Γ EKT I SKAKGQPRS POVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEHESNGQPENWYKTTP PVLDSOGS FFLYSICLTVDKSRW OQGMVFS CSVMHEAjLHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID N° 56: PN codificando a construção H26 humanizada de Cadeia pesada SEQ ID: 53 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccagqtgcagctggtg cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc accagctactggatgcactgggtgcqacaggcccctggacaagggcttgagtggatcggajvatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagccaccatgaccagggacacgtccacgagc agagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgatgcagggc tactggggccaggcaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccocctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaacgg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccgggctgtcctacaotcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacqtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID N° 57: PN codificando a construção H27 humanizada de Cadeia pesada SEQ ID: 54 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtgcagctggtg

CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA7CTGGATAGACCTTC accagctactggatgcactgggtgaaacagcgacctggacaagggcttoagtggatcgoaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaagccaccctcaccgtcgacaaatccacgagc acagcctacatggagotgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgatgcagggc 87

TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGCGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctgctcaaggactacttcCccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca

GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC

GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTQACAAAACTCACACA

TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC

AAGTTCAAcrGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC

AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA

CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAOAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC

AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAQCCTC

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID N° 58: PN codificando a construção H28 humanizada de Cadeia pesada SEQ ID: 55

ATGGG ATGGAGC TG TATCAT CCTC TTCTTGG TAG CAACAGC TAC AGG TGT CCAC TCCCAGC TG CAGCTGGTG CAGTC TGGGG C TGAGG TGAAOAACC CTCGGG CCTCAG TGAAGGTTTC CTGCAAO G CATCTGOATACACCTTC AC C AGCTA CTGGATGCACTGGGTG CG A CAGG CC CCTGGACAAGG GCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT agcaatgotggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagggacacgtccacgagc

ACAGCCTACATOGAGCTGAOCAGCCTGAGATCTGAGCACACGOCCGTGTATTACTCTGAACTaATGCAGGGC tactggggccagggaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca

CCCTCCTCCAAOAGCACCTCTOOGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG

GTGAOOGTGTCOTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGaCTGTCCTACAaTCCTCA ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggggacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggqgcaccgtcaotcttcctcttcoccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaaoacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagoactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctccogtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagaocaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc

TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID N° 59: Cadeia pesada Hc (G95M)

&ν0ΐι00Ρ0ΤΕΙίνΚΡσΑ8νΚΙ,8αίΑ80ΥΤΡΤ8ΥΗΜΚΜνΚ(>ΙΐΡσ00&Β1ΐΙΟΝΙΝΡ SNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQGS5LTSEDSAVYYCELMQGYWGQGTLVTV5SASTKGPSVFPLA Ρ55Κ5ΤεθΟΤΑΑϋσθΙ,νΚΒΥΡΡΕΡντν5ΗΝ5σΑΧ,Τ5θνΗτΡΡΑνΣί055σΐΥεΐ>55νντνΡ355ΙΧ5ΤΟΤΥΙΟΝ VNHKPStfTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKBYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPRE PQVYTLPPSRDEL.TKNOVSLTCl,VKGFYPSDIAVEWESNGOPEWNYKTTPPVLDSDGSPFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL.SLS PGK

SEQ ID 60: Epitopo VLPDIVMEAPLN 88

SEQ ID 61: Construção H99 humanizada de 2A10 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR

DTSTSTVYMELSSLR5EDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N° 62: CDR H3 GQSY

SEQ ID N° 63: Construção H100 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEHIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N° 64: Construção H101 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTV

DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N° 65: Construção H102 humanizada de VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTOYNEKFKSKATMTR

DTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N° 66: Construção H98 humanizada de 2A10 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTHYNEKFKSRVTMTR

DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS SEQ ID N° 67

DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 68

DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 69 divmtqsplslpvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfrqrpgqsprlliylmstrasgvpdrfsgggs

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQL·VEYPL·TFGQGTKLEIK 89 SEQ ID N° 70

DXVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYIJilWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEOVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 71

DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS GTDFTLKX SR VEAEOVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK SEQ ID N° 72

DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDaKTYLNWFRQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS

GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID N° 73 TPSPVLPDIVMEAPLN

SEQ ID N° 74 VLPDIVMEAPLNSAVP

SEQ ID N° 75 RQGY

SEQ ID N° 76 IQGY

SEQ ID N° 77 GDGY

SEQ ID N° 78 GIGY

SEQ ID N° 79 GSGY 90

SEQ ID N° 80 GQNY

SEQ ID N° 81 GQYY

SEQ ID N° 82 GQLY

SEQ ID N° 83 GQFY

SEQ ID N° 84 GQGW

SEQ ID N° 85 YESIKHEPENPPPYEE

SEQ ID N° 86 WQGY

SEQ ID N° 87 GAGY

SEQ ID N° 88 GLGY

SEQ ID N° 89 GVGY

SEQ ID N° 90 GQWY 91 SEQ ID N° 91

MSPILGYWKIKGLVQPTRI,LLEYLBEKYEEHLYERDEGDKWR1IKXFEIjGI.EFPNIíPYYIDGDVXLTQSMAII ryiadkhnmlgccpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktyln

GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKL.VCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP

PKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPIJilSAVPSAVASAVQPSLSPLEAS svnyesvkhepenpppyeeamnvslkkvsgikeeikepesikaavqeteapyisiacdliketklsaeptpd

FSNYSEMAKVEQPLPDHSEIVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKENLjTETSFESMIEHENKL

ERPHRD SEQ ID N° 92 mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaii ryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchíctyln gdhvthpdfmlydaldwlymdpmcldafpklvcfkkrieaxpqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhp PKSDLEVLFQGPLGSKMDLVOTSEVMQESLY paaqlcpsfeeseatps pvlpdivmeaplnsavpsagasav qpssspleassvnyesiihepenpppyeeamsvslkkvsgikeeikepesinaavqetsapyisiacdlike

TKLSAEPTPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVNLVKENIjPBTSF

ESMIEHENKEKLSALPPEGQSSGRIVTD SEQ ID N° 93

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELOLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN GDHVTHPDFMLYD ALDWLYMDPMCLDAF PKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSS KYIAWPLQGWQATFGGGDHP PKSDLEVLFQGPLGSVQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEAS SVNFESVKHEPENPPPYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETXLSAEPTPD FSSYSEMAKVEQPLPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETI.TETSFESMIEHENKIi ERPHRD SEQ ID N° 94

MSPlLGYWKIKGLVQPTRLLl<EYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGIiEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIX

RYlADKHNMLGGCPKERAEISMLiEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN

GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPOIDKYLKSSKYIAWPLQGHQATFGGGDHP pksdlevlfqgplgsiqeslyptaqlcpsfeeaeatpspvlpdivmeaplnsllpsagaswqpsvspleap

PPVSYDSIKLEPENPPP YEEAMNVALKALGTKEGIKEPES FNAAVQETEA P Υ X SIACDLIKETKLSTEPSPD FSNYSEIAKFEKâVPEHAELVEDSSPESEPVDLFSDDSIPEVPQTQEEAVMLMKESLTEVSETVAQHKEERL

SEQ ID N° 95 DETFAL

SEQ ID N° 96 ELSKTS 92

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Paul Andrew Hamblin Jonathon Henry Ellis Volker Germaschewski Ruth Mcadam Rabinder Kumar Prinjha Stephanie Jane Clegg George Kapsidas <120> Imunoglobulinas <13 0> VB61773FF <160> 96 <17 0> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1

Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus 93 <4Ο0> 2

Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 Ser 5 10 15 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Gly Gin Gly Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5

Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 94

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus < 4 Ο Ο > 6

Gin Gin Leu Vai Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7

Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Gin Pro Gly Thr Glu 10 Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 Ser Vai Lys Leu 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Met Hls 35 Trp Vai Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp rle Gly Aan 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Lys Ala Thr Leu 70 Thr Vai Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80 Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Gly Gin ÍOO Gly Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Thr Leu Thr 110 Vai Ser <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus 95 <400> 8

Asp Ile Vai Ile Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro Vai Thr Ser Gly 1 5 10 15 Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Vai Ser 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Lys Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110

<210> 9 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Ab quimérico compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 9 meL Gly 1 -trp· Ser- -eys- 5 --íle Ile Leu Phe- Leu 10 -Veri- Ala -Aètt- Ala Thr 15 -&ty Vai Hi-o Serl Gin .#0 Λ Vai Gin Leu Gin S Gin SS- Pro Gly Thr Glu Ao Leu 35 Vai Lys Pro Gly sS Ala 85 Ser Vai Lys Leu 20 Ser 45 Cys Lys Ala Ser 'LS Gly 45 Tyr Thr Phe Thr Ser 30 -Μ Tyr Trp Met His 3* Trp -&5 Vai Lys Gin Arg *fo Pro 8Θ Gly Gin Gly Leu <tS Glu Trp •65 Ile Gly Asn Ile 75 Asn Pro Ser Asn SS Gly 75 Gly Thr Asn Tyr Ê*7 Asn 90 Glu Lys Phe Lys éS Ser -8-5 Lys Ala Thr Leu Thr 85 Vai Asp Lys Ser IS Ser -95 Ser Thr Ala Tyr Zó Met 4*0 Gin Leu Ser Ser ss Leu •455 Thr Ser Glu Asp Ser 4*5 Ala Vai Tyr. Tyr e5 Cys 345 Glu Leu Gly Gin Gly ISO Tyr Trp Gly Gin s}OS Gly *95 Thr Leu Vai 96

Thr val Ser Ser Ala 136 Pro Ser Ser Lys Ser 146 /Τ}·> Val Lys Asp Tyr Phe L&5 Ala Leu Thr Ser Gly 100 Gly Leu Tyr Ser Leu /i7S 3*5 Gly Thr Gin Thr Tyr /79" •340 Lys Val Asp Lys Lys 225 2" Cys Pro Pro Cys Pro £.25 Leu Phe Pro Pro Lys 260 Glu val Thr Cys Val -275 Lys Phe Asn Trp Tyr 2 7" -3*0 Lys Pro Arg Glu Glu •395 Leu Thr Val Leu His -375 Lys Val Ser Asn Lys $7" 240 Lys Ala Lys Gly Gin 3&S- Ser Arg Asp Glu Leu 3*» 370 Lys Gly Phe Tyr Pro 39S 57" Gin Pro Glu Asn Asn 37 £ -495 Gly Ser Phe Phe Leu 420 Gin Gin Gly Asn Val US -W5" Asn His Tyr Thr Gin *7 3" 459

Ser Thr Lys Gly Pro Ser ^Λ£ 495 /tló Thr Ser Gly Gly Thr Ala 4^0 /nS ±9G Pro Glu Pro Vai Thr Vai SS° 3rW Vai His Thr Phe Pro Ala Ser Ser Vai Vai Thr Vai /tSo -3ΘΟ Ile Cys Asn Vai Asn His yfOS 045 al.90 Vai Glu Pro Lys Ser Cys aat) OS 225 Ala Pro Glu Leu Ala Gly ΙΛ° 2$0 Pro Lys Asp Thr Leu Met *** 263 Vai Val Asp Vai Ser His 290' Val Asp Gly Val Glu Val «-?* 25Í £7" Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 3-itT z*>S 3-t5 Gin Asp Trp Leu Asn Gly Ala Leu Pro Ala Pro Ile 1i-S 34$- Pro Arg Glu Pro Gin Val >*»' 3rÇ0 Thr Lys Asn Gin Val Ser 2*5 3C" Ser Asp lie Ala Val Glu 260 57S 6T5S Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 39" 490 Tyr Ser Lys Leu Thr Val -425 Phe Ser Cys Ser Val Met -44Γ0 Lys Ser Leu Ser Leu Ser ^35 _4*5 4*τ"

Val Phe Pro Leu Ala *» /f«T

Ala Leu Gly Cys Leu tôO

Ser Trp Asn Ser Gly /)£( 4-95

Val Leu Gin Ser Ser /77 " 1W

Pro Ser Ser Ser Leu 2iS -245-

Lys Pro Ser Asn Thr 220 z*s~

Asp Lys Thr His Thr ZZ.o 240 Ala Pro Ser Val Phe 2-3·* -325

Ile Ser Arg Thr Pro ζ$ύ/ 340

Glu Asp Pro Glu Val

z(S

His Asn Ala Lys Thr 3-60 WS

Arg Val Val Ser Val yzo

Lys Glu Tyr Lys Cys W -395

Glu Lys Thr Ile Ser £3"

Tyr Thr Leu Pro Pro 37* 355Γ

Leu Thr Cys Leu Val 38-0 US

Trp Glu Ser Asn Gly 3<?° 4-οττ Val Leu Asp Ser Asp SVS 425

Asp Lys Ser Arg Trp 3/»" 43ΪΓ

His Glu Ala Leu His 475

Pro Gly Lys 44Θ <2l0> 10 <'2ll> 219 <212> prt <213> Sequência Artificial 97 <220> <223> Ab quimérico compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 10

Met—Arg Cys Ser Leu- Gin Phe Leu—GXy—Vai Leu Me-fc-P-he Trp Ile Ser i sr wr is

Oly Vai··Cor Gly Asp Ile Vai Ile Thr Gin Asp Glu Leu Ser Asn Pro -20 yf *5 lo

Vai Thr Ser Gly Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser >45

Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gin Arg *JB0 *£S *»40

Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala ^JêsS SVO 5>5 ζβΟ

Ser Gly Vai Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe CS5 ISO 725

Thr Leu Glu Ile Ser Arg Vai Lys Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr iJS iès J38

Cys Gin Gin Leu Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 4^5 100 105

Leu Glu Leu Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro l40 145 11L0

Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu lis i3o i35 íéo

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp lk-5 líb 1$5

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp lrfO 1^5 1^0

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 175 ϋ&§ M5

Ala Asg Tyr Glu Lys His Lvs Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin »1 MS 200

Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 24o 245

<210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 98 < 4 Ο Ο > 11

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 val Lys Lys Pro Gly Ala 15 Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 25 Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Met HÍS 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asn 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 60 Glu Lys Phe Lys 65 Ser Arg Ala Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Gly Gin 100 Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 105 Thr Leu Val Thr 110 Val Ser

<210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de Ab humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 12

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Hls Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser 99

<210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de Ab humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 13

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Θ5 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de Ab humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 100 < 4 Ο Ο > 14

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 15 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 15

Metr -QÍy-Trp Oer -eya- -íèe- -íie- -Leu- Phe Lou -Val· Aía- -Thr- -Thr- -Giy· 1 5 10 15 -Val·- -H-io Sor| Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 101

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Vai Thr Cys Vai Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 16 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial 102 <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 16

Wul -Gly- -Trp- Ser- -Cys" -f±e- -ttr Leu -Phe- Leu -Vai- -ftta- Thr -Rta- -Thr -Gíy- 1 5 10 15 -Va3~ "His· 3eii Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 103

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 3 65 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 17 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 17 44et- T-rp- Sor Cyo Ile Leu· -Phe- Leu- -Vai- -A-l-a -Thr- Aid -Ttn- -G±y 1 5 10 15 -Va·! His- -Ser Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai 20 25 30 Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 65 70 75 80 Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gin Gin Leu Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 13 0 135 140 104

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 18 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 18

Met Gly -Trp -Ser- Cys —I-l-e- -Lie- -Leu- -Phe· -Lau -Val· Ala -Thr- Ala -Th*- -Giy- 1 5 10 15 Val· -H-i-a- - Ocrl Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asn Pro val 20 25 30 Thr Leu Gly Gin Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gin Gin Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 105

Asn Asn Phe Tyr Pro 165 Arg Glu Ala Ala Leu Gin Ser 180 Gly Asn Ser Gin Lys Asp Ser 195 Thr Tyr Ser Leu Ser 200 Asp Tyr 210 Glu Lys His Lys Vai 215 Tyr Leu 225 Ser Ser Pro Vai Thr 230 Lys Ser

Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 170 175 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 185 190 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 205 Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly 220 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 235

<210> 19 <211> 339 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 19 ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 tctgcggtct attattgtga actgggacag 300 gtctcctca 339 caggtccaac tgcagcagcc tgggactgaa tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc cctggacaag gccttgagtg gattggaaat aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg atgcagctca gcagcctgac atctgaggac ggctactggg gccaaggcac cactctcaca <210> 20 <211> 336 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 20 gatattgtga taacccagga tgaactctcc atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tttctgcaga gaccaggaca atctcctcag tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt agtagagtga aggctgagga tzgtgggtgtg ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 60 tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 120 ctcctgatct atttgatgtc cacccgtgca 180 gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc 240 tattactgtc aacaacttgt agagtatccg 300 ctgaaa 336 106 <210> 21 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo quimérico compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 21 atgggatgga gctgtatcat cctctttttg gtagcagcag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt attgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc aaggcacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389

<210> 22 <211> 720 <212> ADN <213> Sequência Artificial 107 <220> <223> Construção de anticorpo quimérico compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 22 atgaggtgct ctcttcagtt tctgggggtg cttatgttct ggatctctgg agtcagtggg 60 gatattgtga taacccagga tgaactctcc aatcctgtca cttctggaga atcagtttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta tataaggatg ggaagacata cttgaattgg 180 tttctgcaga gaccaggaca atctcctcag ctcctgatct atttgatgtc cacccgtgca 240 tcaggagtct cagaccggtt tagtggcagt gggtcaggaa cagatttcac cctggaaatc 300 agtagagtga aggctgagga tgtgggtgtg tattactgtc aacaacttgt agagtatccg 360 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720

<210> 23 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 23 caggtgcagc tggtgcagtc tcctgcaagg catctggata cctggacaag ggcttgagtg aatgagaagt tcaagagcag atggagctga gcagcctgag ggctactggg gccagggaac tggggctgag gtgaagaagc caccttcacc agctactgga gatcggaaat attaatccta agccaccatg accagggaca atctgaggac acggccgtgt actagtcaca gtctcctca ctggggcctc agtgaaggtt 60 tgcactgggt gcgacaggcc 120 gcaatggtgg tactaactac 180 cgtccacgag cacagcctac 240 attactgtga actgggacag 300 108 339

<210> 24 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 24 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaaacagcga 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcaa agccaccctc accgtcgaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 33d

<210> 25 <211> 336 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 25 gatattgtga tgacccagtc atctcctgca ggtctagtaa tttcagcaga ggccaggcca tctggggtcc cagacagatt agcagggtgg aggctgagga ctcacgtttg gccaggggac tccactctcc ctgcccgtca gagtctccta tataaggatg atctccacag ctcctaattt cagcggcggt gggtcaggca tgttggggtt tattactgcc caagctggag atcaaa cccttggaca gccggcctcc 60 ggaagacata cttgaattgg 120 atttgatgtc cacccgtgca 180 ctgatttcac actgaaaatc 240 aacaacttgt agagtatccg 300 336 109 <210> 26

<211> 336 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 26 cccttggaca gccggtctcc 60 ggaagacata cttgaattgg 120 atttgatgtc cacccgtgca 180 ctgatttcac actgaaaatc 240 aacaacttgt agagtatccg 300 336 gatattgtga atctcctgca tttctccaga tctggggtcc agcagggtgg ctcacgtttg tgacccagtc ggtctagtaa ggccaggcca cagacagatt aggctgagga gccaggggac tccactctcc gagtctccta atctccacag cagcggcggt tgttggggtt caagctggag aaccccgtca tataaggatg ctcctaattt gggtcaggca tattactgcc atcaaa

<210> 27 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 110 < 4 Ο Ο > 27 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcagagc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389

<210> 28 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 28 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt gagaagttca agagcaaagc caccctcacc gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg tactggggcc agggaacact agtcacagtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tactggatgc actgggtgaa acagcgacct 180 aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gtcgacaaat ccacgagcac agcctacatg 300 gccgtgtatt actgtgaact gggacagggc 360 tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 111 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 1389 gtcaaggact acttccccga accggtgacg ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc cagccggaga acaactacaa gaccacgcct ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac ggtaaatga

<210> 29 <211> 717 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 29 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgatga cccagtctcc actctccctg cccgtcaccc ttggacagcc ggcctccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctatat aaggatggga agacatactt gaattggttt 180 cagcagaggc caggccaatc tccacagctc ctaatttatt tgatgtccac ccgtgcatct 240 ggggtcceag acagattcag cggcggtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300 agggtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccaac aacttgtaga gtatccgctc 360 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

<210> 30 <211> 717 <212> ADN 112 <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 30 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgatga cccagtctcc actctccaac cccgtcaccc ttggacagcc ggtctccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctatat aaggatggga agacatactt gaattggttt 1Θ0 ctccagaggc caggccaatc tccacagctc ctaatttatt tgatgtccac ccgtgcatct 240 ggggtcccag acagattcag cggcggtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300 agggtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccaac aacttgtaga gtatccgctc 360 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttcC atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717

<210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 31

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile teu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Vai His Ser <210> 32 <211> 439 <212> PRT <213> Homo sapiens 113 <400> 32

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp 1 5 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu 20 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 35 40 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro 50 55 Leu Thr Gin Ser Met Ala Ile Ile 65 70 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu 85 Gly Ala Vai Leu Asp Ile Arg Tyr 100 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Vai 115 120 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg 130 135 Gly Asp His Vai Thr His Pro Asp 145 150 Vai Vai Leu Tyr Met Asp Pro Met 165 Vai Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu 180 Leu Lys Ser Ser Lye Tyr ile Ala 195 200 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro 210 215 Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Met 225 230 Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu 245 Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala 260 Ala Gly Ala Ser Vai Ile Gin Pro 275 280 Ser Vai Asn Tyr Glu Ser Ile Lys 2 90 295 Tyr Glu Glu Ala Met Ser Vai Ser 305 310 Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn 325 Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala 340 Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp 355 360 Lys Vai Glu Gin Pro Vai Pro Asp 370 375 Ser Pro Asp Ser Glu Pro Vai Asp 385 390 Asp vai Pro Gin Lys Gin Asp Glu 405

Lys Ile 10 Lys Gly Leu val Gin 15 Pro Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Val Lys Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80 Arg Ala 90 Glu Ile Ser Met Leu 95 Glu Gly 105 Vai Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160 Cys Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lys 175 Leu Ala 185 Ile Pro Gin Ile Asp 190 Lys Tyr Trp Pro Leu Gin Gly 205 Trp Gin Ala Pro Lys Ser Asp 220 Leu Glu Val Leu Gin Glu Ser 235 Leu Tyr Pro Ala Ala 240 Ser Glu 250 Ala Thr Pro Ser Pro 255 Val Pro 265 Leu Asn Ser Ala Val 270 Pro Ser Ser Ser Ser Pro Leu 285 Glu Ala Ser His Glu Pro Glu 300 Asn Pro Pro Pro Leu Lys Lys 315 Val ser Gly Ile Lys 320 lie Asn 330 Ala Ala Leu Gin Glu 335 Thr Cys 345 Asp Leu Ile Lys Glu 350 Thr Lys Phe Ser Asp Tyr Ser 365 Glu Met Ala His Ser Glu Leu 380 Val Glu Asp Ser Leu Phe Ser 395 Asp Asp Ser He Pro 400 Thr Val 410 Met Leu Val Lys Glu 415 Ser 114

Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu 420 425 430

Leu Glu Arg Pro His Arg Asp 435

<210> 33 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 33

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110

<210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 115 < 4 Ο Ο > 34

Asp Ile Vai Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 35 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 35 MEtr -Gly Trp- Stíi cys- -f±e- -ixe- -faeu- Phe Leu -Val·- -Ad-a- -Thr- Ala -Thr- -9iy 1 5 10 15 .Val- His- -Ser Gin val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 116

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn 1 His 1 Tyr ' Thr i Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 36 <211> 218 <212> PRT <213> Sequência Artificial 117 <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 36

Met- 1 -GLy- Tcp- -Ser -Cys 5 -ile- -Ile- -Leu- -Phe- Leu- 10 -Vai- Ala- Thr Ala- Thr 15 -Gly- UaJU Soa?· Asp Ile Vai Ile Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai 20 25 30 Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 65 70 75 80 Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gin Gin Leu Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr, Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 37 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 118 <4Ο0> 37 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339

<210> 38 <211> 336 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 38 cccttggaca gccggcctcc 60 ggaagacata cttgaattgg 120 atttgatgtc cacccgtgca 180 ctgatttcac actgaaaatc 240 aacaacttgt agagtatccg 300 336 gatattgtga taacccagtc atctcctgca ggtctagtaa tttcagcaga ggccaggcca tctggggtcc cagacagatt agcagggtgg aggctgagga ctcacgtttg gccaggggac tccactctcc ctgcccgtca gagtctccta tataaggatg atctccacag ctcctaattt cagcggcggt gggtcaggca tgttggggtt tattactgcc caagctggag atcaaa

<210> 39 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 119 <4Ο0> 39 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcagagt caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agtctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaacga 1389

<210> 40 <211> 717 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 120 <4Ο0> 40 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgataa cccagtctcc actctccctg cccgtcaccc ttggacagcc ggcctccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctatat aaggatggga agacatactt gaattggttt 180 cagcagaggc caggccaatc tccacagctc ctaatttatt tgatgtccac ccgtgcatct 240 ggggtcccag acagattcag cggcggtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300 agggtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccaac aacttgtaga gtatccgctc 360 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 41 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 41

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala Pro 40 Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asn 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Lys Ala Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Gly Gin 100 Gly Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Leu Vai Thr 110 Vai Ser 121

<210> 42 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 42

Met Qly Trp oer Cyo Il-o-Ile Leu Phe Leu VaÍ~A~ld Tltr Ala Thr Cly 15 10 15

Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Gly Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 115 120 125 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 13 0 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 14 5 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Vai Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 122

Glu Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn Hls Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 43 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 43 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcaa ggccaccatg accagggaca cgtccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgggacag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339 123

<210> 44 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 44 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gggacagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389

<210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial 124 <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 45

Met Gin Gly Tyr 1

<210> 46 <211> 200 <212> PRT <213> Callithrix jacchus <400> 46

Vai Gin Asp Ser Leu Cys Pro Val 1 5 Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro 20 Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro 35 40 Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu Ala 50 55 Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro 65 70 Ser Arg Lys Lys Val Ser Gly Ile 85 Ser Ile Asn Ala Ala Val Gin Glu 100 Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr 115 120 Asp Phe Ser Ser Tyr Ser Glu Met 130 135 Asp His Ser Glu Leu Val Glu Asp 145 150 Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile 165 Glu Ala Vai Ile Leu Val Lys Glu 180 Ser Met Ile Glu His Glu Asn Lys 195 200

Ala Gin 10 Leu Cys Pro Ser Phe 15 Glu Val 25 Leu Pro Asp Ile Val 30 Met Glu Ser Ala Gly Ala Ser 45 Ala Val Gin Ser Ser Val Asn 60 Phe Glu Ser Val Pro Tyr Glu 75 Glu Ala Met Asn Val 80 Lys Glu 90 Glu Ile Lys Glu Pro 95 Glu Thr 105 Glu Ala Pro Tyr Ile 110 Ser Ile Lys Leu Ser Ala Glu 125 Pro Thr Pro Ala Lys Val Glu 140 Gin Pro Leu Pro Ser Ser Pro 155 Asp Ser Glu Pro Val 160 Pro Asp 170 Val Pro Gin Lys Gin 175 Asp Thr 185 Leu Thr Glu Thr Ser 190 Phe Glu 125

<210> 47 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 47

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Leu Met Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 100 105 110

<210> 48 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 126 <4Ο0> 48

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Met His 35 Trp Vai Lys Gin Arg Pro 40 Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asn 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Lys Ala Thr Leu 70 Thr Vai Asp Lys Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Met Gin 100 Gly Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Leu Vai Thr 110 Vai Ser <210> 49 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 49

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala Pro 40 Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asn 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Lys Ala Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Met Gin 100 Gly Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Leu Val Thr 110 Val Ser 127

<210> 50 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 50 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcag agccaccatg accagggaca cgtccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgatgcag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339 <210> 51

<211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 51 caggtgcagc tggtgcagtc tcctgcaagg catctggata cctggacaag ggcttgagtg aatgagaagt tcaagagcaa atggagctga gcagcctgag ggctactggg gccagggaac tggggctgag gtgaagaagc caccttcacc agctactgga gatcggaaat attaatccta agccaccctc accgtcgaca atctgaggac acggccgtgt actagtcaca gtctcctca ctggggcctc agtgaaggtt 60 tgcactgggt gaaacagcga 120 gcaatggtgg tactaactac 180 aatccacgag cacagcctac 240 attactgtga actgatgcag 300 339 128

<210> 52 <211> 339 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 52 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactgga tgcactgggt gcgacaggcc 12o cctggacaag ggcttgagtg gatcggaaat attaatccta gcaatggtgg tactaactac 180 aatgagaagt tcaagagcaa ggccaccatg accagggaca cgtccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtga actgatgcag 300 ggctactggg gccagggaac actagtcaca gtctcctca 339

<210> 53 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 53 -ttet- 1 -G-ly rpgp -Ser -Syo- 5 -í-le H I-* O -Leu -Phe Leu- 10 vai Ala-Thr—Ala .Thr Gly 15 -Ve-l·· -íEi-a Ser Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met Hls Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 129

Glu Lys Phe Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Met Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 130

<210> 54 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 54

MeL Qly -Trp- Ser Cys -fie- -Hre- -Leu- -Phe- -faett- r i > Ala -Thr- Ala -Thr- -eiy 1 5 10 15 -Va4r- His -Ser Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Met Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 131

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460

<210> 55 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 132 <4Ο0> 55

Met Gly Tio Sei' Cys •lir -f±e- Leu- -Phe- Leu- ^Vcrir -ftia- Thr -A-l-a- Thr -eiy 1 5 10 15 -Va4- -Hie- -Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Met Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 133

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 Leu Tyr Ser Lys Leu 410 Thr Vai Asp Lys Ser 415 Arg Trp Gin Gin Gly 420 Asn Vai Phe Ser Cys 425 Ser Vai Met His 430 Glu Ala Leu His Asn His 450 435 Tyr Thr Gin Lys Ser 455 440 Leu Ser Leu Ser Pro 460 445 Gly Lys

<210> 56 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 56 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcagagc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gatgcagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 134 <210> 57

<211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 57 âtgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ceactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa acagcgacct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaagc caccctcacc gtcgacaaat ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gatgcagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagc^g tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389

<210> 58 <211> 1389 <212> ADN <213> Sequência Artificial 135 <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 58 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gatgcagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccea 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389

<210> 59 <211> 443 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo quimérico compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 136 <400> 59

MuL-Gly -Trp- -Ser~ -eys- -tte- Leu Phe- Leu- ™Va-l- -fti*- -ftia- Ala Thr -e±y 1 5 10 15 Vel·- -ttts- -Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Thr Glu Leu Vai Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Met Gin Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 115 120 125 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Vai Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 305 310 315 320 Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 137

Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 435 440 445

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 60

Vai Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala Pro Leu Asn 15 10 <210> 61 <211> 113 <212> PRT Λ 00 \—1 CM V Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 61

Gin val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Θ5 90 95 Glu Leu Gly Gin Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser 138

<210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 62

Gly Gin Ser Tyr 1

<210> 63 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 63

Gin val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 8S 90 95 Glu Leu Gly Gin Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser 139 <210> 64

<211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 64

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 30 Tyr Trp Met His 35 Trp Vai Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asn 50 Ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Lys Ala Thr Leu 70 Thr Vai Asp Lys Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Gly Gin 100 Ser Tyr Trp Gly Gin 105 Gly Thr Leu vai Thr Vai 110 Ser

<210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 140 <4Ο0> 65

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 B0 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Gin Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 100 105 110 Ser

<210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 66

Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 30 Tyr Trp Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Asn 50 ile Asn Pro Ser Asn 55 Gly Gly Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe Lys 65 Ser Arg Vai Thr Met 70 Thr Arg Asp Thr Ser 75 Thr Ser Thr Val Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Glu Ser Leu Met Gin 100 Gly Tyr Trp Gly Gin 10S Gly Thr Leu Vai Thr Val 110 Ser 141 <210> 67 <211> 112

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 67

Asp He Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Arg Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile €5 70 75 Θ0 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Θ5 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 68 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 142 <400> 68

Asp 1 Ile Vai Met Thr 5 Gin Ser Pro Gin Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Asp Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp 40 Pro Arg 50 Leu Leu Ile Tyr Leu 55 Met Asp 65 Arg Phe Ser Gly Gly 70 Gly Ser Ser Arg Vai Glu Ala 85 Glu Asp Vai Vai Glu Tyr Pro 100 Leu Thr Phe Gly

Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 10 15

Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 25 30

Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 45

Ser Thr Arg Ala Ser Gly Vai Pro 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80

Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 90 95

Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110

<210> 69 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 6 9

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Arg Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 143

<210> 70 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 70

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Arg Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 Θ0 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 71 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens 144 <400> 71

Asp 1 Ile Vai Met Thr 5 Gin Ser Pro Leu Ser 10 Asn Pro Vai Thr Leu 15 Gly Gin Pro Vai Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser Ser 25 Lys Ser Leu Leu Tyr 30 Lys Asp Gly Lys 35 Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu 40 Gin Arg Pro 45 Gly Gin Ser Pro Arg 50 Leu Leu Ile Tyr Leu 55 Met Ser Thr Arg Ala 60 Ser Gly Vai Pro Asp 65 Arg Phe Ser Gly Gly 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80 Ser Arg Vai Glu Ala 85 Glu Asp Vai Gly Vai 90 Tyr Tyr Cys Gin Gin 95 Leu Vai Glu Tyr Pro 100 Leu Thr Phe Gly Gin Gly 105 Thr Lys Leu Glu Ile 110 Lys

<210> 72 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 72

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gin Pro Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Arg Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu 85 90 95 Vai Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 145 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Thr Pro Ser Pro Vai Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala Pro Leu Asn 1 s 10 15 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74

Vai Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Vai Pro 1 5 10 15 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Construção de anticorpo humanizado compreendendo sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 75

Arg Gin Gly Tyr 1 146

<210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 76

Ile Gin Gly Tyr 1

<210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 77

Gly Asp Gly Tyr 1

<210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial 147 <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 78

Gly Ile Gly Tyr 1

<210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 79

Gly Ser Gly Tyr 1

<210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 80

Gly Gin Asn Tyr 148

X <210> 81

<211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 81

Gly Gin Tyr Tyr 1

<210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 82

Gly Gin Leu Tyr 1

<210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens 149 <4Ο0> 83

Gly Gin Phe Tyr 1

<210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 84

Gly Gin Gly Trp 1

<210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 85

Glu Glu 15

Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr 15 10 150 <210> 86

<211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 86

Trp Gin Gly Tyr 1

<210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 87

Gly Ala Gly Tyr 1

<210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial 151 <220> <220> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 88

Gly Leu Gly Tyr 1

<210> 89 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 89

Gly Vai Gly Tyr 1

<210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> compreendendo <223> Construção de anticorpo humanizado sequências de Mus musculus e homo sapiens <400> 90

Gly Gin Trp Tyr 1 152 <210> 91

<211> 438 <212> PRT <213> Saimiri boliviensis <400> 91

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp 1 5 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu 20 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 35 40 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro 50 55 Leu Thr Gin Ser Met Ala lie Ile 65 70 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu 85 Gly Ala Vai Leu Asp Ile Arg Tyr 100 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 115 120 Met Leu Lys Met Phe Glu ASp Arg 130 135 Gly Asp Hl s Vai Thr His Pro Asp 145 150 Vai Vai Leu Tyr Met Asp Pro Met 165 Vai Cys Phe Lys Lys Arg ile Glu 180 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala 195 200 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro 210 215 Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Met 225 230 Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu 245 Leu Pro Asp Ile val Met Glu Ala 260 Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val 275 280 Gin Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu 290 295 Ile Ile His Glu Pro Glu Asn Pro 305 310 Vai Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly 325 Glu Ser Ile Asn Ala Ala Val Gin

Lys Ile 10 Lys Gly Leu Val Gin 15 Pro Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Val Lys Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80 Arg Ala 90 Glu Ile Ser Met Leu 95 Glu Gly 105 Val Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160 Cys Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lys 175 Leu Ala 185 Ile Pro Gin Ile Asp 190 Lys Tyr Trp Pro Leu Gin Gly 205 Trp Gin Ala Pro Lys Ser Asp 220 Leu GlU Val Leu Gin Glu Ser 235 Leu Tyr Pro Val Ala 240 Ser Glu 250 Ala Thr Pro Ser Pro 255 Val Pro 265 Leu Asn Ser Ala Val 270 Pro Ser Pro Ser Ala Gly Ala 285 Ser Ala Val Ala Ser Ser Val 300 Asn Tyr Glu Ser Pro Pro Tyr 315 Glu Glu Ala Met Ser 320 Ile Lys 330 Glu Glu Ile Lys Glu 335 Pro Glu 345 Thr Glu Ala Pro Tyr 350 Ile Ser 153 340

Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Thr 355 360 365 Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Vai Glu Gin Pro Vai 370 375 380 Pro Asp His Ser Glu Leu Vai Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro 385 390 395 400 Vai Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Vai Pro Gin Lys Gin 405 410 415 Asp Glu Ala Vai Met Leu Vai Lys Glu Asn Leu Pro Glu Thr Ser Phe 420 425 430 Glu Ser Met Ile Glu His Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Glu Gly Gly Ser Ser Gly Arg Ile Vai Thr Asp 450 455 460

<210> 92 <211> 460 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 92

Met 1 Ser Pro Ile Leu 5 Gly Tyr Trp Lys Ile 10 Lys Gly Leu Vai Gin 15 Pro Thr Arg Leu Leu 20 Leu Glu Tyr Leu Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu Tyr Glu Arg 35 Asp Glu Gly Asp Lys 40 Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu Gly Leu 50 Glu Phe Pro Asn Leu 55 Pro Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Vai Lys Leu 65 Thr Gin Ser Met Ala 70 Ile Ile Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80 Met Leu Gly Gly Cys 85 Pro Lys Glu Arg Ala 90 GlU Ile Ser Met Leu 95 Glu Gly Ala Vai Leu 100 Asp ile Arg Tyr Gly 105 Vai Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser Lys Asp Phe 115 Glu Thr Leu Lys Vai 120 Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu Met Leu 130 Lys Met Phe Glu Asp 135 Arg Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn 154

Gly Asp HÍS Vai 14 5 Vai Vai Leu Tyr Vai Cys Phe Lys Leu Lys Ser 180 Ser Thr Phe 195 Gly Gly Phe 210 Gin Gly Pro 225 Vai Met Gin Glu Glu Glu Ser Glu Glu Ala Pro 260 Leu Gin Pro 275 Ser Ser Ile 290 Ile His Glu 305 Vai Ser Leu Lys Glu Ser ile Asn Ile Ala Cys 340 Asp Pro Asp 355 Phe Ser Pro 370 Asp His Ser 385 Vai Asp Leu Phe Asp Glu Ala Vai Glu Ser Met 420 Ile Pro Glu 435 Gly Gly 450

Thr His 150 Pro Asp Met 165 Asp Pro Met Lys Arg Ile Glu Lys Tyr Ile Ala 200 Gly Asp His 215 Pro Leu Gly 230 Ser Lys Ser 245 Leu Tyr Pro Ala Thr Pro Ser Asn Ser Ala Val 280 Ser Pro Leu 295 Glu Pro Glu 310 Asn Pro Lys 325 Vai Ser Gly Ala Ala Vai Gin Leu Ile Lys Glu 360 Asp Tyr Ser 375 Glu Glu Leu 390 val Glu Ser 405 Asp Asp Ser Met Leu Val Lys Glu His Glu Asn 440 Ser Ser Gly 455 Arg

Phe Met Leu 155 Tyr Cys Leu 170 Asp Ala Ala 185 Ile Pro Gin Trp Pro Leu Gin Pro Lys Ser Asp 220 Met Asp Leu 235 Val Ala Ala 250 Gin Leu Pro 265 Val Leu Pro Pro Ser Ala Gly Ala Ser Ser Val 300 Pro Pro Tyr 315 Glu Ile Lys 330 Glu Glu Glu 345 Thr Glu Ala Thr Lys Leu Ser Met Ala Lys Val 380 Asp Ser Ser 395 Pro Ile Pro 410 Asp Val Glu 425 A9n Leu Pro Lys Glu Lys Leu Ile Val Thr Asp 460

Asp Ala Leu Asp 160 Phe Pro Lys 175 Leu Ile Asp 190 Lys Tyr Gly 205 Trp Gin Ala Leu Glu Val Leu Gin Thr Ser Glu 240 Cys Pro Ser 255 Phe Asp Ile 270 Val Met Ala 285 Ser Ala Val Asn Tyr Glu Ser Glu Ala Met Ser 320 Ile Lys Glu 335 Pro Pro Tyr 350 Ile Ser Ala 365 Glu Pro Thr Glu Gin Pro Val Asp Ser Glu Pro 400 Pro Gin Lys 415 Gin Glu Thr 430 Ser Phe Ser 445 Ala Leu Pro

<210> 93 <211> 438 <212> PRT <213> Callithrix jacchus 155 <400> 93

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp 1 5 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu 20 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 35 40 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro 50 55 Leu Thr Gin Ser Met Ala Ile ile 65 70 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu 85 Gly Ala Vai Leu Asp Ile Arg Tyr 100 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Vai 115 120 Met Leu Lys Met Phe GlU Αβρ Arg 130 135 Gly Asp His Vai Thr His Pro Asp 145 150 Vai Vai Leu Tyr Met Asp Pro Met 165 Vai Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu 180 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala 195 200 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro 210 215 Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Vai 225 230 Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu 245 Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala 260 Ala Gly Ala Ser Ala Vai Gin Pro 275 280 Ser Vai Asn Phe Glu Ser Vai Lys 290 295 Tyr Glu Glu Ala Met Asn Vai Ser 305 310 Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Ser 325 Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala 340 Leu Ser Ala Glu Pro Thr Pro Asp 355 360 Lys Vai Glu Gin Pro Leu Pro Asp 370 375 Ser Pro Asp Ser Glu Pro Vai Asp 385 390

Lys Ile 10 Lys Gly Leu Vai Gin 15 Pro Glu 25 Glu Lys Tyr Glu Glu 30 His Leu Trp Arg Asn Lys Lys 45 Phe Glu Leu Tyr Tyr Ile Asp 60 Gly Asp Vai Lys Arg Tyr Ile 75 Ala Asp Lys His Asn 80 Arg Ala 90 Glu Ile Ser Met Leu 95 Glu Gly 105 Vai Ser Arg Ile Ala 110 Tyr Ser Asp Phe Leu Ser Lys 125 Leu Pro Glu Leu Cys His Lys 140 Thr Tyr Leu Asn Phe Met Leu 155 Tyr Asp Ala Leu Asp 160 Cys Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lys 175 Leu Ala 185 Ile Pro Gin Ile Asp 190 Lys Tyr Trp Pro Leu Gin Gly 205 Trp Gin Ala Pro Lys Ser Asp 220 Leu Glu Vai Leu Gin Asp Ser 235 Leu Cys Pro Vai Ala 240 Ser Glu 250 Ala Thr Pro Ser Pro 255 Vai Pro 265 Leu Asn Ser Ala Vai 270 Pro Ser Ser Ser Ser Pro Leu 285 Glu Ala Ser His Glu Pro Glu 300 Asn Pro Pro Pro Arg Lys Lys 315 Vai Ser Gly Ile Lys 320 Ile Asn 330 Ala Ala Vai Gin Glu 335 Thr Cys 345 Asp Leu Ile Lys Glu 350 Thr Lys Phe Ser Ser Tyr Ser 365 Glu Met Ala His Ser Glu Leu 380 Vai Glu Asp Ser Leu Phe Ser 395 Asp Asp Ser Ile Pro 400 156

Ile Leu Vai Lys Glu Thr 415 Glu His Glu Asn Lys Leu 430

Asp Vai Pro Gin Lys Gin Asp Glu Ala Vai 405 410

Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile 420 425

Glu Arg Pro His Arg Asp 435

<210> 94 <211> 432 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 94 Met Ser Pro ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Vai Gin Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Vai Lys 50 55 60 Leu Thr Gin Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Vai Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Vai Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Vai Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 14 0 Gly Asp His Vai Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Vai Vai Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Vai Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gin Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gin Gly • Trp i Gin Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu . Glu . Vai . Leu 210 215 220 Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Ile Gin Glu Ser Leu Tyr Pro i Thr Ala 225 230 235 240 Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro 1 Ser Prc i Vai 245 250 255 Leu Pro Asp Ile Vai Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu . Leu . Prc i Ser 260 265 270 157

Ala Gly Ala Ser Vai Vai Gin Pro Ser Vai Ser Pro Leu Glu Ala Pro 275 280 285 Pro Pro Vai Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro 2 90 295 300 Pro Tyr Glu Glu Ala Met Asn Vai Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys 305 310 315 320 Glu Gly Ile Lys Glu Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gin Glu Thr 325 330 335 Glu Ala Pro Tyr He Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys 340 345 350 Leu Ser Thr Glu Pro Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala 355 360 365 Lys Phe Glu Lys Ser Vai Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser 370 375 380 Ser Pro Glu Ser Glu Pro Vai Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro 385 390 395 400 Glu Vai Pro Gin Thr Gin Glu Glu Ala Vai Met Leu Met Lys Glu Ser 405 410 415 Leu Thr Glu Vai Ser Glu Thr Vai Ala Gin His Lys Glu Glu Arg Leu <210> 95 420 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asp Glu Thr Phe Ala Leu 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96

Glu Leu Ser Lys Thr Ser 1 5

Lisboa, 18 de Setembro de 2012 158

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo isolado ou um seu fragmento, capaz de se ligar a NOGO-A humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 49 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 14.
2. 2. Anticorpo isolado como reivindicado na reivindicação 1, o qual tem uma cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 55 e uma cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 18.
3. 3. Vector de expressão compreendendo as sequências codificantes polinucleotídicas de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Célula hospedeira compreendendo um vector de expressão de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4, cuja célula compreende um primeiro vector codificando a cadeia leve e um segundo vector codificando a cadeia pesada.
6. 6. Método para a produção de um anticorpo capaz de se ligar a NOGO-A humana, o método compreendendo as etapas de: transfectar uma célula hospedeira com um vector de expressão compreendendo um primeiro polinucleótido codificando uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 49, e um vector de expressão compreendendo um segundo polinucleótido 1 codificando uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° 14, e cultivar a célula hospedeira sob condições que conduzem à secreção do anticorpo desde a referida célula hospedeira para dentro do referido meio de cultura.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendo adicionalmente a etapa de recuperar o anticorpo segregado desde o meio de cultura.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o primeiro e segundo polinucleótidos estão contidos num único vector de expressão.
9. 9. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-NOGO ou um seu fragmento, como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, juntamente com um diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. 10. Utilização de um anticorpo anti-NOGO ou um seu fragmento, como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, na preparação de um medicamento para tratamento ou profilaxia do acidente vascular cerebral e outras doenças/distúrbios neurológicos ou para o tratamento de um doente sofrendo de um trauma mecânico no sistema nervoso central ou periférico. 2
11. 11. Anticorpo anti-NOGO como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, para utilização no tratamento ou profilaxia do acidente vascular ou para mecânico cerebral e outras doenças/distúrbios neurológicos o tratamento de um doente sofrendo de um trauma no sistema nervoso central ou periférico. Lisboa, 18 de Setembro de 2012 3