BRPI0619855A2

BRPI0619855A2 - região variável de cadeia pesada, anticorpo, composição farmacêutica, uso de um anticorpo, e, polinucleotìdeo

Info

Publication number: BRPI0619855A2
Application number: BRPI0619855-4A
Authority: BR
Inventors: Stephanie Jane Clegg; Jonathan Henry Ellis; Volker Germaschewski; Paul Andrew Hamblin; George Kopsidas; Ruth Mcadam; Rabinder Kumar Prinjha
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2011-10-25
Also published as: DK1960429T3; SI1960429T1; UA96279C2; ES2389380T3; HK1119720A1; CA2633501A1; NZ569143A; EA200801343A1; US20130287781A1; US20100221260A1; EA015536B1; IL192086A0; KR101355118B1; WO2007068750A3; CR10099A; KR20080080644A; ZA200906162B; AU2006325228B2; MA30041B1; EP2228391A3

Abstract

REGIãO VARIáVEL DE CADEIA PESADA, ANTICORPO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DE UM ANTICORPO, E, POLINUCLEOTìDEO. A presente invenção refere-se aos anticorpos para NOGO, às formulações farmacêuticas contendo-os e ao uso de tais anticorpos no tratamento e/ou na profilaxia de distúrbios/doenças neurológicas.

Description

"REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM ANTICORPO, E, POLINUCLEOTÍDEO"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se às imunoglobulinas, particularmente aos anticorpos que se ligam em NOGO e neutralizam a sua atividade, aos polinucleotídeos codificadores de tais anticorpos, e às formulações farmacêuticas contendo os citados anticorpos e ao uso de tais anticorpos no tratamento e/ou na profilaxia de doenças neurológicas. Outros aspectos, objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição abaixo.

Fundamentos da invenção

Derrame cerebral é uma causa maior de morte e de incapacidade no Mundo Ocidental. Não há terapia aprovada para o tratamento de derrame cerebral diferente de plasminogênio de tecido (t-PA) que tem que ser administrado dentro de 3 horas do início após a varredura de tomografia computadorizada (CT) para excluir hemorragia. Até o presente agentes direcionados na direção do tratamento de derrame cerebral agudo (i.e. neuroproteção), têm predominantemente envolvido a seleção de receptores de glutamato e suas rotas de sinalização a jusante que conhecidamente estão envolvidas em morte de célula aguda. Contudo até o presente estas estratégias têm se mostrado mal sucedidas em testes clínicos e estão muitas vezes associadas com os efeitos colaterais dose-limitantes (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998)). Portanto há uma necessidade de abordagens novas direcionadas na direção de melhoria da morte celular após a cessação do fluxo sangüíneo. Neuroproteção é a capacidade de um tratamento prevenir ou melhorar a perda de célula neuronal em resposta a um insulto ou processo doentio. Isto pode ser alcançado pela seleção de neurônios direta ou indiretamente pela prevenção de perda de célula glial (incluindo oligodendrócito).

Após o início do derrame cerebral, algum grau de recuperação funcional espontânea é observado em muitos pacientes, sugerindo que o cérebro possui capacidade (embora limitada) de se reparar e/ou se remodelar após a lesão. Agentes que possuem o potencial para intensificar esta recuperação podem portanto permitir que intervenção seja feita muito mais tarde (potencialmente dias) após o início da isquemia cerebral. Agentes que são capazes tanto de oferecer neuroproteção aguda quanto de intensificar recuperação funcional podem proporcionar vantagens significativas sobre as correntes estratégias neuroprotetoras potenciais.

Mal de Alzheimer (AD) é caracterizado pela presença de duas características diagnosticas de patologia. Estas são placas amilóides e feixes neurofibrilares compostos de peptídeo beta-amilóide agregado (Αβ40 e Αβ42) e tau hidrofosforilado respectivamente (Dawbarn & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer1S Disease OUP).

Um estudo abrangente tem mostrado uma forte ligação em pacientes entre acúmulo beta-amilóide e declínio cognitivo (Naslund et al, JAMA, March 22/29, 2000, Vol.283, No;12, páginas 1571-1577). Isto está consistente com os estudos genéticos e epidemiológicos que sugerem que algumas mutações em genes presenilina e APP podem predispor ao AD de início precoce, cujas mutações também intensificam os níveis de peptídeo Αβ40 e Αβ42, incluindo a razão deles.

Clivagem da proteína precursora amilóide (APP) de transmembrana de tipo I por duas proteases distintas designadas por beta- e gama-secretase é necessária para a formação de peptídeo beta-amilóide. A identidade molecular de beta-secretase como a aspartil-protease Asp2/BACE1 tem sido confirmada (Hussain et al Mol.Cell.NeuroSci. 16, 609-619 (2000); Vassar et al, Science (1999), Oct.22; 286 (5440):735-741). A natureza de gama-secretase permanece uma fonte de debate e provavelmente consiste de um complexo de peso molecular alto consistindo de pelo menos as seguintes proteínas: presenilinas, Aph 1, Pen2 e nicastrina (revisto em Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15(9):829-41).

O processamento de APP dentro do CNS provavelmente ocorre dentro de numerosos tipos de célula incluindo neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e microglia. Embora a taxa total de processamento de APP nestas células seja influenciada pelo nível relativo de expressão de APP, BACE1/Asp2, presenilina-1 e -2, Aph 1, Pen2 e nicastrina.

Adicionalmente, fatores adicionais relando a localização subcelular de APP também podem influenciar seu processamento como mostrado pela descoberta de que a mutação do motivo YENP no domínio citoplásmico de APP que bloqueia sua endocitose reduz a produção de beta- amilóide (Perez et al 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6). Retenção de APP- beta-CTF em ER pela adição de motivo de retenção KKQN é suficiente para reduzir a produção de amilóide em células transfectadas (Maltese et al. 2001 J Biol Chem 276 (23) 20267-20279). Inversamente, a elevação de endocitose, por sobreexpressão de Rab5 é suficiente para elevar a secreção de amilóide das células transfectadas (Grbovic et al 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261- 31268).

Consistentes com estas descobertas outros estudos têm mostrado que a redução de níveis de colesterol celular (um fator de risco bem conhecido para AD) reduziu a formação de beta-amilóide. Esta mudança foi dependente da endocitose alterada como demonstrado pelo uso dos mutantes de dinamina negativos dominantes (K44A) e a sobreexpressão de proteína ativadora de Rab5 GTPase, RN-Tre (Ehehalt et al 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123).

Balsas ou microdomínios ricos em colesterol também são um sítio celular importante de produção de beta-amilóide e tem sido mostrado que todos APP5 BACEl e componentes de complexo de gama-secretase residem dentro de balsas. Ligação cruzada de anticorpo de APP e BACEl na direção de balsas ricas em colesterol foi capaz de elevar a produção de beta- amilóide (Ehehalt et al 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123). Expressão de BACEl GPI-ancorado, que é exclusivamente selecionado para balsas de lipídeo, é similarmente capaz de elevar a clivagem de APP e a produção de beta-amilóide (Cordy et al 2003 PNAS 100(20) 11735-11740).

Os mecanismos por traz da recuperação funcional após um derrame cerebral ou outro evento ou doença neurodanificadora, são correntemente desconhecidos. A germinação de axônios lesionados ou não- lesionados tem sido proposta como um mecanismo possível. Contudo, embora estudos in vivo tenham mostrado que o tratamento de derrame cerebral ou de lesão na espinha dorsal com fatores neurotróficos resulta em recuperação funcional intensificada e um grau de germinação axonal, estes não se mostram como uma ligação direta entre o grau de germinação axonal e a extensão de recuperação funcional (Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proc Natl Acad. Sei. USA., 94:8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). Adicionalmente, a germinação axonal requer um neurônio viável. Em doenças tal como derrame cerebral que estão associadas com morte celular extensiva, intensificação de recuperação funcional oferecida por um dado agente após derrame cerebral pode ser portanto por intermédio de mecanismos diferentes de germinação axonal tal como diferenciação de células-tronco endógenas, ativação de rotas redundantes, mudanças em distribuição de receptor ou excitabilidade de neurônios e glia (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer & Gage, 2000, Nature 407 963-970). A capacidade limitada do sistema nervoso central (CNS) para se reparar após a lesão é considerada em parte devido às moléculas dentro do ambiente do CNS que têm um efeito inibitório sobre a germinação axonal (crescimento de neurito). Mielina de CNS é considerada em conter moléculas inibitórias (Schwab ME e Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). Duas proteínas de mielina, NOGO e glicoproteína mielina-associada (MAG) têm sido clonadas e identificadas como inibidores putativos de crescimento de neurito (Sato S. et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163,1473-1480; McKerracher L et al (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G et al (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K e Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al (1996) Neuron 16, 1107-1113; W09522344; W09701352; Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS et al (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; W0200005364A1; W00031235).

Três formas de NOGO de humano têm sido identificadas:

NOGO-A possuindo 1192 resíduos de aminoácido (número de acesso no GenBank de AJ251383); NOGO-B, uma variante de editoração que é faltante dos resíduos 186 a 1004 no domínio extracelular putativo (número de acesso no GenBank de AJ251384) e uma variante de editoração mais curta, NOGO- C, que também é faltante de resíduos 186 a 1004 e também possui domínio amino-terminal alternativo, menor (número de acesso no GenBank de AJ251385) (Prinjha et al (2000) supra).

Inibição das proteínas inibitórias do CNS tal como NOGO pode proporcionar um meio terapêutico para melhorar o dano neuronal e promover o reparo e crescimento neuronal potencialmente auxiliando deste modo a recuperação da lesão neuronal tal como aquela prolongada em derrame cerebral. Exemplos tais inibidores de NOGO podem incluir moléculas pequenas, peptídeos e anticorpos.

Tem sido relatado que um anticorpo monoclonal murino, IN-1, que foi produzido contra Nl-220/250, uma proteína de mielina que é um inibidor potente de crescimento de neurito (e subseqüentemente mostrada em ser fragmento de NOGO-A), promove regeneração axonal (Caroni, P e Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L e Schwab, ME (1990) Nature 343 269- 272; Bregman, BS et al (1995) Nature 378 498-501 e Thallmair, M et al (1998) Nature Neuroscience 1 124-131). Também tem sido relatado que NOGO-A é o antígeno para IN-I (Chen et al (2000) Nature 403 434-439). Administração de fragmento IN-I Fab ou de IN-I humanizado a ratos que têm sofrido de transecção de espinha dorsal, intensificou a recuperação (Fiedler, M et al. (2002) Protein Eng 15 931 -941; Brosamle, C et al (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068).

Anticorpos monoclonais que se ligam em NOGO são descritos em WO 04/052932 e W02005028508. WO 04/052932 descreve um anticorpo murino 11C7 que se liga em certas formas de NOGO de humano com afinidade alta.

Pedido de Patente W005/061544 também descreve anticorpos monoclonais de afinidade alta, incluindo um anticorpo monoclonal murino 2A10, e geralmente descreve suas variantes humanizadas, por exemplo Hl L11 (as seqüências para as H1 e L11 são proporcionadas em SEQ ID NOs. 33 e 34 respectivamente (seqüências de VH ou VL apenas)). Os anticorpos descritos se ligam em NOGO-A de humano com afinidade alta. O anticorpo murino 2A10 (e suas variantes humanizadas CDR-enxertadas) são caracterizados pelas seguintes seqüências de região determinante de complementaridade (CDR) (como determinado usando a metodologia de Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequences of proteins of immunological interest"; Fifth Edition; US Department of Health and Human Services; NIH publication No 91-3242)) dentro de suas regiões de cadeias leve e pesada:

Tabela 1: CDRs de cadeia leve de anticorpo 2A10

<table>table see original document page 7</column></row><table> Tabela 2: CDRs de cadeia pesada de anticorpo 2A10

<table>table see original document page 8</column></row><table>

W005/061544 adicionalmente descreve "análogos" dos anticorpos que compreendem as CDRs de Tabelas 1 e 2 acima, tais "análogos" possuem as mesmas capacidade de neutralização e/ou especificidade de ligação em antígeno que as do anticorpo doador do qual foram derivados.

A despeito da técnica proporcionar anticorpos de afinidade alta anti-NOGO, permanece como um objetivo elevadamente desejável o isolamento e o desenvolvimento de anticorpos monoclonais alternativos, ou melhorados, terapeuticamente úteis que se ligam em e inibem a atividade de NOGO de humano.

O processo de neurodegeneração está por trás de muitos distúrbios/doenças neurológicas incluindo, mas não limitados a, doenças agudas tais como derrame cerebral (isquêmico ou hemorrágico), lesão cerebral traumática e lesão na espinha dorsal bem como doenças crônicas incluindo mal de Alzheimer, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), Esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, doença de Huntington, esclerose múltipla e miosite de corpo de inclusão. Conseqüentemente os anticorpos monoclonais anti-NOGO, e semelhantes, da presente invenção podem ser úteis no tratamento destas doenças/distúrbios. Anticorpos para o tratamento das doenças/distúrbios mencionados acima são proporcionados pela presente invenção e descritos em detalhe abaixo.

Breve Sumário da Invenção

A invenção proporciona regiões variáveis de cadeia pesada específicas, e anticorpos ou fragmentos do mesmo compreendendo as citadas regiões variáveis de cadeia pesada específicas e uma região variável de cadeia leve que permite, quando pareada com as regiões variáveis de cadeia pesada, que o dímero Fv se ligue em NOGO-A de humano com afinidade alta, e deste modo neutraliza a atividade de NOGO-A de humano.

As regiões variáveis de cadeia pesada da presente invenção podem ser formatadas, juntas com as regiões variáveis de cadeia leve para permitir a ligação em NOGO-A de humano, na maneira de imunoglobulina convencional (por exemplo, IgG, IgA, IgM de humano etc.) ou em qualquer outro seu fragmento ou formato de "anticorpo-semelhante" que se liga em NOGO-A de humano (por exemplo, Fv de cadeia única, diacorpos, Tandabs™ etc (para um sumário dos formatos de "anticorpo" alternativos veja Holliger e Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126- 1136)).

Uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma terceira CDR consistindo essencialmente dos resíduos de aminoácido GQGY nos quais CDR contém pelo menos uma substituição dentro da seqüência núcleo GQGY, as substituições sendo selecionadas das seguintes substituições: onde o G na primeira posição é substituído por R, I, W ou Μ; o Q na segunda posição é substituído por D, I, A, L, V ou S; o G na terceira posição é substituído por W, Ν, Y, S, L ou F; e o Y na quarta posição é substituído por W.

Em outra modalidade, a CDR de terceira cadeia pesada (CDR H3) apenas contém uma substituição para dar a seguinte CDR H3: RQGY (SEQ ID NO.75), IQGY (SEQ ID NO.76), MQGY (SEQ ID N0.45), GDGY (SEQ ID NO.77), GIGY (SEQ ID NO.78), GSGY (SEQ ID N0.79), GQNY (SEQ ID N0.80), GQYY (SEQ ID NO.81), GQSY (SEQ ID NO.62), GQLY (SEQ ID NO.82), GQFY (SEQ ID NO.83), GQGW (SEQ ID NO.84), WQGY(SEQ ID NO.86), GAGY(SEQ ID NO.87), GLGY(SEQ ID NO.88), GVGY(SEQ ID NO.89), GQWY(SEQ ID N0.90).

Em outra modalidade, as regiões variáveis de cadeia pesada acima adicionalmente contêm as outras CDRs listadas em Tabela 2, i.e. CDR Hl (SEQ ID NO. 1) e CDR H2 (SEQ ID NO.2).

Os anticorpos da presente invenção, ou seus fragmentos, retêm a capacidade de ligação de NOGO de humano de anticorpos que compreendem a CDR H3: GQGY, em termos de sua atividade conforme medida em experimentos de ELISA e Biacore, e em alguns casos a atividade nestes experimentos está aumentada.

Regiões variáveis de cadeia pesada de humano ou humanizadas contendo G95M (numeração de substituição por Kabat)

Em uma modalidade da presente invenção, as regiões variáveis de cadeia pesada da presente invenção compreendem as CDRs definidas em Tabela 3 (como definido por Kabat):

Tabela 3:

<table>table see original document page 10</column></row><table>

Em uma modalidade da presente invenção é proporcionada uma região variável de cadeia pesada de humano ou humanizada compreendendo cada uma das CDRs listadas em Tabela 3. Em outra modalidade da presente invenção é proporcionada um região variável de cadeia pesada humanizada compreendendo as CDRs listadas em Tabela 3 dentro da seqüência maior de uma região variável de cadeia pesada de humano. Em ainda outra modalidade a região variável de cadeia pesada humanizada compreende as CDRs listadas em Tabela 3 dentro de uma armação de anticorpo aceptor possuindo mais do que 40% de identidade nas regiões de armação, ou mais do que 50%, ou mais do que 60%, ou mais do que 65% de identidade com a região variável de cadeia pesada de anticorpo doador murino 2A10 (SEQ ID NO.7).

Quando todas as CDRs de Tabela 3 forem usadas, em uma modalidade a região variável de cadeia pesada seqüência é a seqüência H98 proporcionada como SEQ ID NO. 66 (H98 VH é o equivalente de Hl VH (SEQ ID NO.33) diferindo apenas pelo fato de que a CDR H3 é MQGY em H98 em vez de GQGY como verificado em Hl).

Em um aspecto da presente invenção os anticorpos compreendem a região variável de cadeia pesada possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQ ED NO. 66 (região variável H98) adicionalmente compreendendo um número de substituições em uma ou mais posições 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74, e 79; na qual cada resíduo de aminoácido substituído é substituído pelo resíduo de aminoácido na posição equivalente em SEQ ID NO 7 (a região variável de cadeia pesada do anticorpo doador 2A10) e o número de substituições está entre 1 e 9. Em outras modalidades o número de substituições é de 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7, ou 8 ou 9.

Neste contexto as substituições que são descritas são equivalentes em conceito às "retro-mutações" onde os resíduos de aminoácido de armação de humano em posições específicas dentro da seqüência H98 seqüência são retro-mutados para os resíduos de aminoácido na posição equivalente dentro da seqüência de anticorpo doador 2A10.

A não ser que seja especificamente enunciado diferentemente contrariamente como aqui, quando uma posição numérica de um resíduo de aminoácido encontrado dentro de uma seqüência específica é mencionada neste documento, por exemplo "posição 12", é intencionado que o leitor experiente designe o primeiro aminoácido na seqüência com a posição "1" e conte a partir da posição 1 e identifique o aminoácido que está na posição desejada, neste exemplo o décimo segundo resíduo de aminoácido na seqüência. O leitor experiente notará que este sistema de numeração não corresponde ao sistema de numeração de Kabat que é muitas vezes usado para definir as posições de aminoácido dentro de seqüências de anticorpo.

Para afinidade de ligação ótima, foi verificado que a humanização do anticorpo de camundongo 2AlO (a VH para o qual é SEQ ID NO. 7) que o par de resíduos de aminoácido em posições 48 e 68, deve ser I e A respectivamente (como existem em 2A10) ou M e V respectivamente (como existem em H98). E esperado que a descoberta acima também seja relevante para a humanização da variante G95M de 2A10.

A tabela seguinte inclui detalhes de três regiões variáveis de cadeia pesada (VH) diferentes que podem formar parte dos anticorpos da presente invenção. Cada VH descrita pe baseada na H98 VH (SEQ ID NO. 66) adicionalmente compreendendo as substituições mencionadas na tabela (Tabela 4) onde o resíduo H98 na posição relevante é substituído pelo resíduo 2A10 naquela posição (na tabela, "-" significa que não há substituição naquela posição, e assim o resíduo permanece como na seqüência de H98):

Tabela 4,

<table>table see original document page 12</column></row><table>

Em uma modalidade da presente invenção, portanto, as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) da presente invenção são H26 VH (SEQ ID NO. 47), H27 VH (SEQ ID NO. 48) e H28 VH (SEQ ID NO. 49)

SEQ ID 47: Construto humanizado H26 de VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN PSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG QGTL VTVSS

SEQ ID 48: Construto humanizado H27 de VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIN PSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG QGTLVTVSS

SEQ ID 49: Construto humanizado H28 de VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIN PSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWG QGTLVTVSS Regiões variáveis de cadeia pesada de humano ou humanizadas incluindo GlOl S (numeração de substituição por Kabat)

Em outra modalidade da presente invenção é proporcionada uma região variável de cadeia pesada de humano ou humanizada que compreende CDRs definidas em Tabela 5:

Tabela 5:

<table>table see original document page 13</column></row><table>

Em uma modalidade as CDRs de Tabela 5 são incorporadas

dentro de uma região variável de cadeia pesada de humano seqüência. Em outra modalidade a região variável de cadeia pesada humanizada compreende as CDRs listadas em Tabela 5 dentro de uma armação de anticorpo aceptor possuindo mais do que 40% de identidade nas regiões de armação, ou mais do que 50%, ou mais do que 60%, ou mais do que 65% de identidade em relação à to the região variável de cadeia pesada de anticorpo doador 2A10 murino (SEQ ID NO.7).

Em outra modalidade as CDRs de Tabela 5 são inseridas dentro da região variável de cadeia pesada de humano para dar a seguinte seqüência (H99):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAP GQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS EDTAVYYCELGQSYW GQGTLVTVS S (SEQ ID 61: 2A10 Construto humanizado de VH H99).

Em outras modalidades, outras retro-mutações são adicionadas na seqüência H99 VH em qualquer uma das posições (denotadas por posição numérica de resíduo) 38, 40, 48, 67, 68, 70, 72, 74 ou 79; na cada resíduo de aminoácido substituído é substituído pelo resíduo de aminoácido na posição equivalente em SEQ ID NO 7 (a região variável de cadeia pesada do anticorpo doador 2A10) e o número de substituições está entre 1 e 9. Em outras modalidades o número de substituições é 1, ou 2, ou 3, ou 4, ou 5, ou 6, ou 7, ou 8 ou 9. Η99 VH é o equivalente de Hl VH (SEQ ID NO.33) diferindo apenas pelo fato de que a CDR H3 é GQSY em H99 em vez de GQGY como encontrado em Hl.

Para afinidade de ligação ótima, foi verificado para a humanização do anticorpo de camundongo 2A10 (a VH para a qual é SEQ ID NO. 7) que o par de resíduos de aminoácido em posições 48 e 68, deve ser I e A respectivamente (como existem em2A10) ou M e V respectivamente (como existem emH98). E esperado que a descoberta acima também seja relevante para a humanização da variante G95M de 2A10.

Em uma modalidade as retro-mutações estão localizadas nas posições indicadas em Tabela 6 abaixo onde o resíduo H99 na posição relevante é substituído pelo resíduo 2A10 na posição (na tabela, na tabela, "-" significa que não há substituição naquela posição, e assim o resíduo permanece como na seqüência de Hl):

Tabela 6,

<table>table see original document page 14</column></row><table>

Anticorpos ou fragmentos que compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve de humano ou humanizadas

Os construtos VH da presente invenção podem ser pareados com uma cadeia leve para formarem uma unidade de ligação de NOGO-A de humano (Fv) em qualquer formato, incluindo um formato de anticorpo IgG convencional possuindo seqüências de cadeia pesada de domínio constante e variável de comprimento total (FL). Exemplos de seqüências de cadeia pesada de IgGl de comprimento total (FL) compreendendo os construtos VH da presente invenção e mutações inativadoras em posições 235 e 237 (numeração de índice EU) para tornar os anticorpo não-lítico são SEQ ID NOs 53, 54 e 55.

SEQ ED 53: Construto humanizado H26 de cadeia pesada

MGWSCIILFLVAfATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FTSYWM

HWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSL

RSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL

GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT

QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKD

TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

SEQ ID 54: Construto humanizado H27 de cadeia pesada

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWM

HWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLR

SEDTA VYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALG

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW

SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT

VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID 55: Construto humanizado H28 de cadeia pesada

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT FTSYWM

HWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLR

SEDTA VYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG

CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQ

TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV

SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT

VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

A seqüência de região variável de cadeia leve que forma uma Fv com as seqüências de região variável de cadeia pesada da presente invenção pode ser qualquer seqüência quer permite que a Fv se ligue em NOGO-A de humano.

Em uma modalidade da presente invenção a região variável de cadeia leve é a cadeia leve de 2A10 (veja WO 05/061544), cuja região variável de cadeia leve é aqui proporcionada como SEQ ID NO. 8 ou suas variantes humanizadas. Variantes humanizadas da cadeia leve de 2A10 contêm todas as CDRs de região variável de cadeia leve que são descritas em Tabela 1 enxertadas em uma armação de aceptor de região variável de cadeia leve de humano. Em uma modalidade as regiões variáveis de cadeia leve humanizadas são Lll (SEQ ID NO.34), L13 (SEQ ID NO. 13 ) ou L16 (SEQ ID NO. 14). Regiões variáveis de cadeia leve alternativas que são baseadas em L13 e L16, que compreendem substituições específicas em posições de kabat 37 e/ou 45, são proporcionadas em Tabela 7.

Tabela 7,

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Em outra modalidade as seqüências de cadeia leve de comprimento total (FL) são Lll FL (SEQ ID N0.36), L13 FL (SEQ ID NO. 17) ou L16 FL (SEQ ID NO. 18).

Em outra modalidade os anticorpos, fragmentos ou equivalentes funcionais dos mesmos compreendem uma seqüência VH selecionada de H26, H27, H28, Hl00, HlOl e Hl02; em combinação com qualquer uma das seguintes seqüências VL L11,L13, Ll6, LlOO5 Ll01, Ll02, L103, L104, e Ll05. E intencionado que todas as combinações possíveis das regiões variáveis de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve listadas sejam especificamente descritas (e.g. H28L104 et. al.).

Em modalidades particulares os anticorpos, fragmentos ou equivalentes funcionais dos mesmos compreendem os seguintes pares de regiões variáveis:

H27L16 (SEQ ID NO.48 + SEQID NO. 14) H28L13 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO. 13) H28L16 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO. 14) Em outra modalidade os anticorpos da presente invenção compreendem as seguintes seqüências de comprimento total:

H27FL L16FL (SEQ ID NO. 54 + SEQ ID NO. 18) H28FL L13FL (SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO. 17) H28FL L16FL (SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO. 18) Em uma modalidade o anticorpo da presente invenção compreende H27L16 (SEQ ID NO.48 + SEQ ID NO. 14), ou é o anticorpo de comprimento total H28FL L16FL (SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO. 18).

Em outra modalidade, o anticorpo o seu fragmento se liga no mesmo epítopo de NOGO de humano que o de H28L16, ou compete com a ligação de H28L16 em NOGO de humano, caracterizado em ambos os casos pelo fato de que o anticorpo competidor, ou seu fragmento, não é o anticorpo murino 2A10 ou uma sua variante humanizada ou de humano compreendendo uma CDR H3 possuindo a seqüência GQGY (SEQ ID N0.3) ou uma seqüência contendo uma substituição de aminoácido na CDR H3.

H100L16 (SEQ ID NO.63 + SEQ ID NO. 14) H101 L13 (SEQ ID NO.64 + SEQ ID NO.13)

H102L16 (SEQ ID NO.65 + SEQ ID NO. 14)

Mapeamento de epítopo e outros anticorpos que se ligam no mesmo epítopo Em outra modalidade é proporcionado um anticorpo ou fragmento do mesmo, que é capaz de se ligar em proteína NOGO de humano, ou seu fragmento tal como uma proteína GST-NOGO-A56 (SEQ ID NO.32), em um ensaio ELISA, no qual a ligação do anticorpo, ou de seu fragmento, na proteína NOGO de humano, ou seu fragmento, no ensaio ELISA é reduzida na presença de um peptídeo possuindo a seguinte seqüência VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60), e não é reduzida na presença de um peptídeo irrelevante, por exemplo um peptídeo de NOGO de humano que não coincide com a SEQ ID N0.60 (tal como SEQ ID NO. 85, YESIKHEPENPPPYEE), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo não é um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma CDR H3 consistindo dos resíduos de aminoácido GQGY ou seus análogos possuindo uma substituição de aminoácido na CDR H3. Alternativamente o peptídeo competidor é TPSPVLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 73) ou VLPDIVMEAPLNSAVP (SEQ ID NO. 74). Em adição, o anticorpo que se liga no mesmo epítopo que o dos anticorpos, ou seus fragmentos, pode ser um anticorpo que não compreende todas as CDRs listadas em Tabelas 1 e 2, ou qualquer anticorpo que compreende um conjunto de CDRs que possui 80% ou mais de homologia com as CDRs listadas em Tabelas 1 e 2 combinadas, ou Tabelas 1 ou 2 sozinhas.

Em outra modalidade da presente invenção é proporcionado um anticorpo ou fragmento do mesmo, que é capaz de ligação em um ensaio ELISA em uma região de proteína NOGO de humano consistindo da seqüência de polipeptídeo de VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo não é anticorpo compreendendo um domínio pesado variável possuindo CDR H3 consistindo de resíduos de aminoácido GQGY ou seus análogos possuindo uma substituição de aminoácido na CDR H3. Alternativamente o anticorpo ou fragmento do mesmo é capaz de ligação em TPSPVLPDIVMEAPLN (SEQ ED NO. 73) ou VLPDIVMEAPLNSAVP (SEQ ID NO. 74). Em adição, o anticorpo que se liga no mesmo epítopo que o dos anticorpos, ou seus fragmentos, pode ser um anticorpo que não compreende todas as CDRs listadas em Tabelas 1 e 2, ou qualquer anticorpo que compreende um conjunto de CDRs que possui 80% ou mais de homologia com as CDRs listadas em Tabelas 1 e 2 combinadas, ou Tabelas 1 ou 2 sozinhas.

Em outra modalidade da presente invenção é proporcionado um método de obtenção de um anticorpo ou fragmento do mesmo de ligação, que se liga em epítopo de NOGO de humano VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60), compreendendo imunização de um mamífero com o citado peptídeo e isolamento de células capazes de produzirem um anticorpo que se liga no citado peptídeo. Em outra modalidade da presente invenção é proporcionado um método de obtenção de um anticorpo isolado, ou de seu fragmento de ligação, que se liga no epítopo de NOGO de humano VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60) compreendendo a triagem de uma biblioteca que compreende uma pluralidade de anticorpos ou de seus fragmentos de ligação, cada um sendo isolável da biblioteca juntamente com uma seqüência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo de ligação, pela ligação do anticorpo, ou de seu fragmento de ligação no epítopo de NOGO VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60).

Composições farmacêuticas

Um outro aspecto da presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-NOGO da presente invenção ou seu fragmento funcional ou equivalente junto com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento ou profilaxia de derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico) e outras doenças neurológicas, em particular mal de Alzheimer, e tratamento de um paciente sofrendo de um trauma mecânico no CNS (tal como lesão na espinha dorsal), em um humano que compreende administrar ao citado humano em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-NOGO da invenção ou seus fragmentos funcionais.

Em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-NOGO da invenção ou um seu fragmento funcional na preparação de um medicamento para tratamento ou profilaxia de derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico) e outras doenças neurológicas, em particular mal de Alzheimer e tratamento de um paciente sofrendo de um trauma mecânico no CNS (tal como lesão na espinha dorsal).

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de inibição de neurodegeneração e/ou promoção de recuperação funcional em um paciente humano afligido com, ou sob risco de desenvolver, um derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico) ou outra doença neurológica, em particular mal de Alzheimer, e tratamento de um paciente sofrendo de um trauma mecânico no CNS (tal como lesão na espinha dorsal), que compreende administrar ao citado humano em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-NOGO da invenção ou um seu fragmento funcional.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-NOGO da invenção ou um seu fragmento funcional na preparação de um medicamento para inibição de neurodegeneração e/ou promoção de recuperação funcional em um paciente humano afligido com, ou sob risco de desenvolver, um derrame cerebral e outra doença neurológica, em particular mal de Alzheimer e tratamento de um paciente sofrendo de um trauma mecânico no CNS (tal como lesão na espinha dorsal).

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são aqui descritos adiante na descrição detalhada e nas suas modalidades preferidas. Descrição Detalhada da Invenção

As regiões variáveis de cadeia pesada da invenção podem ser

formatadas na estrutura de um anticorpo natural ou seu fragmento funcional ou equivalente. O anticorpo portanto pode compreender as regiões VH da invenção formatadas em um anticorpo de comprimento total, um fragmento (Fab')2, um fragmento Fab5 ou seu equivalente (tal como scFV, bi- tri- ou tetra-corpos, Tandabs, etc.), quando pareado com uma cadeia leve apropriada. O anticorpo pode ser uma IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4; ou IgM; IgA, IgE ou IgD ou uma sua variante modificada. O domínio constante da cadeia pesada do anticorpo pode ser conseqüentemente selecionado. O domínio constante de cadeia leve pode ser um domínio constante kappa ou lambda. Adicionalmente, o anticorpo pode compreender modificações em toda as classes eg dímeros de IgG, mutantes de Fc que não mais se ligam em receptores de Fc ou medeiam ligação Clq. O anticorpo também pode ser um anticorpo quimérico do tipo descrito em W086/01533 que compreende uma região de ligação de antígeno e uma região de não-imunoglobulina.

A região constante é selecionada de acordo com a funcionalidade requerida. Normalmente uma IgGl demonstrará capacidade lítica através da ligação em complemento e/ou mediará ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Uma IgG4 será preferida se um anticorpo bloqueador não-citotóxico for requerido. Contudo, anticorpos IgG4 podem demonstrar instabilidade em produção e portanto pode ser mais preferível modificar a IgGl geralmente mais estável. Modificações sugeridas são descritas em EP0307434 modificações preferidas incluem nas posições 235 e 237. A invenção proporciona uma forma lítica e não-lítica de um anticorpo de acordo com a invenção. Em formas preferidas portanto o anticorpo da invenção é um anticorpo IgGl não-lítico de comprimento total (i.e. tetrâmero H2L2) possuindo as regiões variáveis de cadeia pesada aqui descritas.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos codificadores das regiões variáveis de cadeia pesada como aqui descritas.

"NOGO" refere-se a qualquer polipeptídeo NOGO, incluindo formas variantes. Isto inclui, mas não é limitado a, NOGO-A possuindo 1192 resíduos de aminoácido (número de acesso no GenBank de AJ251383); NOGO-B, uma variante de editoração que é faltante de resíduos 186 a 1004 no domínio extracelular putativo (número de acesso no GenBank de AJ251384) e uma variante de editoração mais curta, NOGO-C, que também é faltante de resíduos 186 a 1004 e também possui domínio amino-terminal, alternativo, mais curto (número de acesso no GenBank de AJ251385) (Prinjha et al (2000) supra). Todas as referências aqui a "NOGO" são entendidas para incluírem quaisquer e todas as formas variantes de NOGO tais como NOGO- A e as variantes de editoração descritas, a não ser que uma forma específica seja indicada.

"Neutralizar" e suas variações gramaticais refere-se à inibição, quer total quer parcial, de função de NOGO incluindo sua ligação em neurônios e inibição de crescimento de neurito.

Os termos Fv, Fe, Fd, Fab, ou F(ab)2 são aqui usados com seus significados padrão (veja, e.g., Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Um "anticorpo quimérico" refere-se a um tipo de anticorpo engenhado que contém uma região variável naturalmente ocorrente (cadeia leve e cadeia pesadas) derivada de um anticorpo doador em associação com regiões de cadeias leve e pesada derivadas de um anticorpo aceptor.

Um "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo de anticorpo engenhado possuindo suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora de não-humano, as partes derivadas de imunoglobulina restantes da molécula sendo derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) de humano. Em adição, os resíduos de suporte de armação podem ser alterados para preservarem a afinidade de ligação (veja, e.g., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Um anticorpo aceptor de humano adequado pode ser um selecionado de um banco de dados convencional, e.g., o banco de dados KABAT®, banco de dados Los Alamos, e banco de dados Swiss Protein, por homologia com seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos do anticorpo doador (neste caso o anticorpo doador murino 2A10). Um anticorpo de humano caracterizado por uma homologia com as regiões de armação do anticorpo doador (em uma base de aminoácido) pode ser adequado para proporcionar uma região constante de cadeia pesada e/ou uma região de armação variável de cadeia pesada para inserção das CDRs doadoras (veja Tabela 1 para as 2A10 CDRs para inserção na armação de aceptor). Um anticorpo aceptor adequado capaz de doar regiões de armação variáveis ou constantes de cadeia leve pode ser selecionado em uma maneira similar. Deve ser notado que não é requerido que as cadeias pesada e leve de anticorpo aceptor sejam originadas do mesmo anticorpo aceptor. A arte anterior descreve vários modos de produzir tais anticorpos humanizados - veja por exemplo EP-A-0239400 e EP-A-054951.

O termo "anticorpo doador" refere-se a um anticorpo de não- humano que contribui com as seqüências de aminoácidos de suas regiões variáveis, CDRs, ou outros fragmentos funcionais ou análogos do mesmo para o anticorpo humanizado, e deste modo proporciona o anticorpo humanizado com especificidade antigênica e atividade neutralizadora características do anticorpo doador.

O termo "anticorpo aceptor" refere-se a um anticorpo heterólogo ao anticorpo doador, que proporciona as seqüências de aminoácidos de suas regiões de armação de cadeia pesada e/ou leve e/ou de suas regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve para o anticorpo humanizado. O anticorpo aceptor pode ser derivado de qualquer mamífero desde que ele seja não-imunogênico em humanos. Preferivelmente o anticorpo aceptor é um anticorpo de humano.

Alternativamente, humanização pode ser realizada por um processo de "revestimento". Uma análise estatística de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de imunoglobulina murina e de humano revelou que os padrões precisos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos murino e de humano, e posições superficiais mais individuais possuem uma preferência forte por um número pequeno de resíduos diferentes (veja Padlan E.A. et al; (1991) Mol. Immunol.28, 489-498 e Pedersen J.T. et al (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Portanto é possível reduzir a imunogenicidade de um Fv de não-humano pela substituição de resíduos expostos em suas regiões de armação que diferem daquelas normalmente encontradas em anticorpo de humanos. Devido ao fato de a antigenicidade de proteína poder ser correlacionada com a acessibilidade da superfície, substituição dos resíduos de superfície pode ser suficiente para tornar a região variável de camundongo "invisível" ao sistema imune de humano (veja também Mark G.E. et al (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, ppl05-134). Este procedimento de humanização é referido como "revestimento" porque apenas a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de suporte permanecem não-perturbados. Uma outra abordagem alternativa é descrita em W004/006955.

"CDRs" são definidas como as seqüências de aminoácidos de região determinante de complementaridade de um anticorpo que são as regiões hipervariáveis das cadeias leve e pesada de imunoglobulina. Veja, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health e Human Services, National Institutes of Health (1987). Há três CDRs de cadeia leve e três CDRs de cadeia pesada (ou regiões de CDR) na porção variável de uma imunoglobulina.

Assim, "CDRs" como aqui usado refere-se a todas as três CDRs de cadeia pesada, ou a todas as três CDRs de cadeia leve (ou ambas a todas as CDRs de cadeia pesada e a todas as CDRs de cadeia leve, se apropriado). A estrutura e o dobramento de proteína do anticorpo podem significar que outros resíduos são considerados parte da região de ligação de antígeno e serão entendidas assim por uma pessoa experiente na arte. Veja por exemplo Chothia et al., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p877-883.

Um anticorpo biespecífico é um anticorpo possuindo especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Métodos de preparação de tais anticorpos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia L - cadeia H de Imunoglobulina, onde as duas cadeias H possuem especificidades diferentes veja Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), W093/08829 e Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659. Devido à classificação aleatória de cadeias H e L, é produzida uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes das quais apenas uma possui a especificidade de ligação desejada.Uma abordagem alternativa envolve fusão dos domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas para a região constante de cadeia pesada compreendendo pelo menos parte da região de dobradiça, regiões CH2 e CH3. E preferido que se tenha a região CHl contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNA codificador destas fusões, e se desejada a cadeia L são inseridos em vetores de expressão separados e então co-transferidos para um organismo hospedeiro. Em uma abordagem preferida, o anticorpo biespecífico é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias H-L, proporcionando uma segunda especificidade de ligação no outro braço,veja W094/04690. Veja também Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

Em uma modalidade da invenção é proporcionado um anticorpo terapêutico biespecífico no qual pelo menos uma especificidade de ligação de citado anticorpo liga-se em NOGO de humano no epítopo descrito em SEQ ID NO. 60. Em outra modalidade da presente invenção o anticorpo biespecífico compreende a seqüência de região variável de cadeia pesada CDR H3 MQGY (SEQ ID NO. 45). Em outra modalidade o anticorpo biespecífico compreende os seguintes pares de regiões variáveis de cadeias leve e pesada: H27L16 (SEQ ID NO.48 + SEQ ID NO. 14), H28L13 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO. 13) ou H28L16 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO. 14).

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de expressão compreendendo a seqüência codificadora de anticorpos da invenção. Um vetor de expressão ou plasmídeo recombinante é produzido pelo posicionamento destas seqüências codificadoras do anticorpo em associação operativa com seqüências de controle regulatórias convencionais capazes de controlarem a replicação e a expressão em, e/ou secreção de, uma célula hospedeira. Seqüências regulatórias incluem seqüências de promotor, e.g., promotor CMV, e seqüências de sinal, que podem ser derivadas de anticorpos conhecidos. Similarmente, um segundo vetor de expressão pode ser produzido possuindo uma seqüência de DNA que codifica uma cadeia pesada ou leve de anticorpo complementar. Preferivelmente este segundo vetor de expressão é idêntico ao primeiro exceto na medida em que as seqüências codificadoras e os marcadores selecionados estão envolvidos, de modo a garantir o máximo possível que cada cadeia de polipeptídeo seja funcionalmente expressada. Alternativamente, as seqüências codificadoras de cadeias pesada e leve do anticorpo alterado podem residir em um único vetor.

Uma célula hospedeira selecionada é co-transfectada por técnicas convencionais com ambos o primeiro e o segundo vetores (ou simplesmente transferidos pelo único vetor) para criar a célula hospedeira transfectada da invenção compreendendo ambas as cadeias leve e pesada sintéticas ou recombinantes. A célula transfectada é então cultivada por técnicas convencionais para produzir o anticorpo engenhado da invenção. O anticorpo que inclui a associação de ambas a cadeia leve e/ou a cadeia pesada recombinante é selecionado da cultura pelo ensaio apropriado, tal como ELISA ou RIA. Técnicas convencionais similares podem ser empregadas para construir outros anticorpos e moléculas alteradas.

Um sistema de expressão útil é um sistema de glutamato sintase (tal como vendido por Lonza Biologics), particularmente onde a célula hospedeira é CHO ou NSO (veja abaixo). Polinucleotídeo codificador do anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (e.g. sondas de oligonucleotídeo). Vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomos dos quais os plasmídeos são uma modalidade típica. Geralmente tais vetores adicionalmente incluem uma seqüência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, uma seqüência de promotor e de terminação de transcrição operacionalmente ligada no polinucleotídeo de cadeia pesada e/ou leve de modo a facilitar a expressão. Polinucleotídeo codificador das cadeias leve e pesada pode ser inserido em vetores separados (e.g. por eletroporação) na mesma célula hospedeira ou, se desejado ambas as cadeia leve e a cadeia pesada podem ser inseridas no mesmo vetor para transfecção na célula hospedeira. Assim, de acordo com uma modalidade da presente invenção é proporcionado um processo de construção de um vetor codificador das cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo terapêutico ou de seu fragmento de ligação de antígeno da invenção, cujo método compreende inserir em um vetor, um polinucleotídeo codificador de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de um anticorpo terapêutico da invenção.

Em outra modalidade é proporcionado um polinucleotídeo codificador de uma região variável de cadeia pesada humanizada possuindo a seqüência mostrada em SEQ.ID.NO: 47, 48 ou 49.

Em outra modalidade é proporcionado um polinucleotídeo codificador da cadeia pesada humanizada possuindo a seqüência mostrada em SEQ.ID.NO: 53, 54 ou 55.

Será imediatamente evidente para aquelas pessoas experientes na arte que devido à redundância do código genético, também estão disponíveis polinucleotídeos alternativos àqueles aqui descritos que codificarão os polipeptídeos da invenção.

Vetores adequados para as etapas de clonagem e de subclonagem empregadas nos métodos e na construção das composições desta invenção podem ser selecionados por uma pessoa experiente na arte. Por exemplo, a série pUC convencional de vetores de clonagem pode ser usada. Um vetor, pUC19, está comercialmente disponível em casas fornecedoras, tais como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) ou Pharmacia (Uppsala, Suécia). Adicionalmente, qualquer vetor que seja capaz de pronta replicação, possui uma abundância de sítios de clonagem e genes selecionáveis (e.g., resistência a antibiótico), e é facilmente manipulado pode ser usado para clonagem. Assim, a seleção do vetor de clonagem não é um fator limitante nesta invenção. Outras seqüências de vetor preferíveis incluem uma seqüência de sinal de poli A, tal como do hormônio de crescimento bovino (BGH) e a seqüência de promotor de betaglobina (betaglopro). Os vetores de expressão aqui úteis podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas e.g. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) deficiências auxiotróficas de complemento ou nutrientes de suprimento não disponíveis em meios complexos. O esquema de seleção pode envolver a parada do crescimento da célula hospedeira. Células, que têm sido bem sucedidamente transformadas com os genes codificadores do anticorpo terapêutico da presente invenção, sobrevivem devido a e.g. resistência à droga conferida pelo marcador de seleção. Outro exemplo é o denominado marcador de seleção DHFR no qual transformantes são cultivados na presença de metotrexato. Células CHO são a linhagem celular particularmente útil para a seleção de DHFR. Métodos de seleção de células hospedeiras transformadas e de amplificação do número de cópias de célula do transgene incluem o sistema DHFR veja Kaufinan RJ. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621, para revisão, veja Werner RG, Noe W, Kopp K5Schluter M, "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel- Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug. Um outro exemplo é o sistema de expressão de glutamato sintetase (Lonza Biologics). Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl; veja Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979.

Os componentes de tais vetores, e.g. replicons, genes de seleção, intensificadores, promotores e semelhante, podem ser obtidos de fontes comerciais ou naturais ou sintetizados por procedimentos conhecidos para uso na direção da expressão e/ou secreção do produto do DNA recombinante em um hospedeiro selecionado. Outros vetores de expressão apropriados cujos numerosos tipos são conhecidos na arte para expressão em mamífero, bactérias, insetos, leveduras, e fungos também podem ser selecionados para este propósito.

A presente invenção também inclui uma linhagem celular transfectada com um plasmídeo recombinante contendo as seqüências codificadoras dos anticorpos ou equivalentes da presente invenção. Células hospedeiras úteis para a clonagem e outras manipulações destes vetores de clonagem também são convencionais. Contudo, mais desejavelmente, células de várias cepas de E. coli são usadas para replicação dos vetores de clonagem e em outras etapas na construção de anticorpos alterados desta invenção.

Linhagens celulares ou células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo da invenção são preferivelmente células de mamífero tais como NSO, Sp2/0, CHO (e.g. DG44), COS, uma célula de fibroblasto (e.g., 3T3), e células de mielomas, e mais preferivelmente uma célula CHO ou uma célula de mieloma. Células de humano podem ser usadas, permitindo assim que a molécula seja modificada com padrões de glicosilação de humano. Alternativamente, outras linhagens de célula eucariótica podem ser empregadas. A seleção de células hospedeiras de mamífero adequadas e de métodos para a transformação, cultura, amplificação, triagem e produção e purificação de produto são conhecidos na arte. Veja, e.g., Sambrook et al., citado acima.

Células bacterianas podem se mostrar úteis como células hospedeiras adequadas para a expressão dos anticorpos ou de seus fragmentos (tais como Fabs ou ScFvs recombinante) da presente invenção (veja, e.g., Plückthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Contudo, devido à tendência de as proteínas expressadas em células bacterianas estarem em uma forma não dobrada ou impropriamente dobrada ou em uma forma não- glicosilada, qualquer fragmento recombinante produzido em uma célula bacteriana teria que ser triado para retenção de capacidade de ligação de antígeno. Se a molécula expressada pela célula bacteriana fosse produzida em uma forma apropriadamente dobrada, aquela célula bacteriana seria uma hospedeira desejável. Por exemplo, várias cepas de E. coli usadas para expressão são bem conhecidas como células hospedeiras no campo da biotecnologia. Várias cepas de B. subtilis, Streptomyces, outros bacilos e semelhante também podem ser empregadas neste método.

Onde desejado, cepas de células de levedura conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte também estão disponíveis como células hospedeiras, bem como células de inseto, e.g. Drosophila e Lepidoptera e sistemas de expressão viral. Veja, e.g. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) e as referências lá citadas.

Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, o método de transfecção requerido para produzir as células hospedeiras da invenção, e os métodos de cultura necessários para produzir o anticorpo da invenção a partir de tal célula hospedeira são todos técnicas convencionais. Tipicamente, o método de cultura da presente invenção é um método de cultura livre de soro, normalmente pela cultura de células livres de soro em suspensão. Igualmente, uma vez produzidos, os anticorpos da invenção podem ser purificados do conteúdo de cultura de célula de acordo com procedimentos padrão da arte, incluindo precipitação por sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhante. Tais técnicas estão dentro da experiência da arte e não limitam esta invenção. Por exemplo, preparação de anticorpos são descritas em WO 99/58679 e WO 96/16990.

Ainda outro método de expressão dos anticorpos pode utilizar a expressão em um animal transgênico, tal como descrito em Patente U.S. de No. 4.873.316. Isto refere-se a um sistema de expressão usando promotor de caseína de animal que quando transgenicamente incorporado em um mamífero permite que a fêmea produza a proteína recombinante desejada em seu leite.

Em um outro aspecto da invenção é proporcionado um método de produção de um anticorpo da invenção cujo método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor codificador das cadeias leve e/ou pesada do anticorpo da invenção e recuperar o anticorpo produzido deste modo.

Células hospedeiras adequadas para vetores de clonagem ou de expressão codificadores de anticorpos da invenção são procarióticas, de levedura ou células eucarióticas superioras. Células procarióticas adequadas incluem eubactérias e.g. enterobacteriaceae tal como Escherichia e.g. E.Coli (por exemplo ATCC 31.446; 31.537; 27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella e.g. Salmonella typhimurium, Serratia e.g. Serratia marcescans e Shigella bem como Bacilli tais como B.subtilis e B.Iicheniformis (veja DD 266 710), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (e.g. ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56.500), yarrowia (EP402.226), Pichia Pastoris (EP183.070, veja também Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 234), Penicillin, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger também são contempladas.

Embora células hospedeiras procarióticas e de levedura sejam especificamente contempladas pela invenção, tipicamente contudo, células hospedeiras da presente invenção são células de vertebrado. Células de vertebrado adequadas incluem células de mamífero tais como COS-I (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem celular de rim embriônico de humano 293, células renais de hamster bebê (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células de ovário de hamster chinês CHO (e.g. CHO-Kl, ATCC NO: CCL 61, linhagem de células DHFR-CHO tal como DG44 (veja Urlaub et al, (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556)), particularmente aquelas linhagens de célula CHO adaptadas para cultura em suspensão, células sertoli de camundongo, células renais de macaco, células renais de macaco verde africado (ATCC CRL-1587), células HELA, células renais de canino (ATCC CCL 34), células pulmonares de humano (ATCC CCL 75), células de linfoma, de mieloma ou Hep G2 e.g. NSO (veja US 5.807.715), Sp2/0, YO.

Assim em uma modalidade da invenção é proporcionada uma célula hospedeira estavelmente transformada compreendendo um vetor codificador de uma cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo terapêutico ou de seu fragmento de ligação de antígeno como aqui descrito. Tipicamente tais células hospedeiras compreendem um primeiro vetor codificador da cadeia leve e um segundo vetor codificador da cadeia pesada.

Células hospedeiras transformadas com vetores codificadores de anticorpos terapêuticos da invenção ou de seus fragmentos de ligação de antígeno podem ser cultivadas por qualquer método conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Células hospedeiras podem ser cultivados em frascos rotativos, garrafas rolantes ou sistemas de fibra oca mas é preferido para a produção em grande escala que reatores de tanque agitado sejam usados particularmente para culturas em suspensão. Tipicamente os tanques agitados estão adaptados para aeração usando e.g. aspersores, defletores ou impulsores de cisalhamento baixo. Para colunas de borbulhadores e reatores agitados por ar aeração direta com bolhas de ar ou de oxigênio pode ser usada. Onde as células hospedeiras são cultivadas em meio de cultura livre de soro é preferido que o meio seja suplementado com um agente protetor das células tal como pluronic F-68 para ajudar a prevenir dano celular como um resultado do processo de aeração. Dependendo das características da célula hospedeira, quer microveículos podem ser usados como substratos de crescimento para ancoragem de linhagens celulares dependentes quer as células podem ser adaptadas para a cultura em suspensão (que é típico). A cultura de células hospedeiras, particularmente de células hospedeiras de vertebrados pode utilizar uma variedade de modos operacionais tais como processamento em batelada, em batelada alimentada, em batelada repetida (veja Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), processos em batelada estendida ou cultura em perfusão. Embora células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meio contendo soro tal como meio compreendendo soro fetal bovino (FCS), é preferido que tais células hospedeiras sejam cultivadas em meio livre de soro tal como descrito em Keen et al. (1995) Cytotechnology 17:153-163, ou meio comercialmente disponível tal como ProCHO-CDM ou UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementado onde necessário com uma fonte de energia tal como glicose e fatores de crescimento sintéticos tal como insulina recombinante. A cultura livre de soro de células hospedeiras pode requerer que aquelas células sejam adaptadas para cresceram em condições livres de soro. Uma abordagem de adaptação é o cultivo de tais células hospedeiras em meio contendo soro e repetidamente substituir 80% do meio de cultura por meio livre de soro de modo que as células hospedeiras aprendam a se adaptar em condições livres de soro (veja e.g. Scharfenberg K et al (1995) em Animal Cell Technology: Developments towards the 2 Ist century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

Anticorpos da invenção secretados para dentro do meio podem ser recuperados e purificados do meio usando uma variedade de técnicas para proporcionar um grau de purificação adequado para o uso intencionado. Por exemplo o uso de anticorpos terapêuticos da invenção para o tratamento de pacientes humanos tipicamente exige pelo menos 95% de pureza, mais tipicamente 98% ou 99% de pureza comparado com o meio de cultura compreendendo os anticorpos terapêuticos. No primeiro caso, fragmentos celulares do meio de cultura são tipicamente removidos usando centrifugação seguido por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando e.g. microfiltração, ultrafiltração e/ou filtração profunda. Uma variedade de outras técnicas tal como diálise e eletroforese em gel e técnicas cromatográficas tais como cromatografia com hidróxi-apatita (HA), cromatografia de afinidade (opcionalmente envolvendo uma sistema de etiquetação de afinidade tal como poli-histidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, veja US 5.429.746) estão disponíveis. Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, após várias etapas de clarificação, são capturados usando cromatografia de afinidade de Proteína A ou G seguida por outras etapas de cromatografia tal como cromatografia HA e/ou de troca iônica, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação por sulfato de amônio. Tipicamente, várias etapas de remoção de vírus também são empregadas (e.g. nanofiltração usando e.g. um filtro DV-20). Após estas várias etapas, é proporcionada uma preparação (tipicamente monoclonal) purificada compreendendo pelo menos 75mg/mL ou mais e.g. 1OO mg/mL ou mais do anticorpo da invenção ou de seu fragmento de ligação de antígeno e portanto forma uma modalidade da invenção. Adequadamente tais preparações estão substancialmente livres de formas agregadas de anticorpos da invenção.

De acordo com a presente invenção é proporcionado um método de produção de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção que especificamente se liga em ou neutraliza a atividade de NOGO-A de humano cujo método compreende as etapas de;

(a) proporcionar um primeiro vetor codificador de uma cadeia pesada do anticorpo;

(b) proporcionar um segundo vetor codificador de uma cadeia leve do anticorpo;

(c) transformar uma célula hospedeira de mamífero (e.g. CHO) com os citados primeiro e segundo vetores;

(d) cultivar a célula hospedeira da etapa (c) sob condições conducentes à secreção do anticorpo de citada célula hospedeira para dentro do meio de cultura;

(e) recuperar o anticorpo secretado da etapa (d). Uma vez expressado pelo método desejado, o anticorpo é então examinado para atividade in vitro pelo uso de um ensaio apropriado. Formatos de ensaio ELISA presentemente convencionais são empregados para avaliar a ligação qualitativa e quantitativa do anticorpo em NOGO. Adicionalmente, outro ensaio in vitro também pode ser usado para verificar a eficácia de neutralização antes dos subseqüentes estudos clínicos em humano realizados para avaliar a persistência do anticorpo no corpo a despeito dos mecanismos de depuração usuais.

Outras modificações nos anticorpos da presente invenção incluem variantes de glicosilação dos anticorpos da invenção. E sabido que a glicosilação de anticorpos em posições conservadas em suas regiões constantes tem um efeito profundo sobre a função do anticorpo, particularmente o efetor funcionando tal como aqueles descritos acima, veja por exemplo, Boyd et al (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318. Variantes de glicosilação dos anticorpos terapêuticos ou seus fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção nas quais um ou mais grupos carboidrato são adicionados, substituídos, deletados ou modificados são contempladas. Introdução de um motivo asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio potencial para ligação enzimática de grupos carboidrato e portanto pode ser usada para manipular a glicosilação de um anticorpo. Em Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876 a sialilação terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou ressialilação usando beta-l,4-galactosil-transferase e/ou alfa,2,3-sialil-transferase. E crido que o aumento da sialilação terminal aumenta a meia-vida da imunoglobulina. Anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos em natureza como uma mistura de glicoformas. Esta mistura é particularmente aparente quando os anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente em células de mamífero. Uma variedade de métodos tem sido desenvolvida para manufaturar glicoformas definidas, veja Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727. Assim a invenção refere-se a uma pluralidade de anticorpos terapêuticos (tipicamente monoclonais) (que podem se do isótipo IgG, e.g. IgGl) como aqui descritos compreendendo um número definido (e.g. 7 ou menos, por exemplo 5 ou menos tal como duas ou uma única) glicoforma(s) de citados anticorpos ou fragmentos do mesmo de ligação de antígeno.

Os agentes terapêuticos desta invenção podem ser administrados como uma profilático ou após o ataque / evento de derrame cerebral de sintomas clínicos, ou como uma necessidade diferente. A dose e a duração do tratamento referem-se à duração relativa das moléculas da presente invenção na circulação humana, e podem ser ajustadas por uma pessoa experiente na arte dependendo da condição sendo tratada e da saúde geral do paciente. E planejado que a dosagem repetida (e.g. uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas) durante um período de tempo prolongado (e.g. quatro a seis meses) pode ser requerida para se alcançar eficácia terapêutica máxima.

O modo de administração do agente terapêutico da invenção pode ser qualquer rota que libere o agente no hospedeiro. Os anticorpos, e as composições farmacêuticas da invenção são particularmente úteis para administração parenteral, i.e., subcutânea (s.c.), intratecal, intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), ou intranasal (i.n.).

Agentes terapêuticos da invenção podem ser preparados como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do anticorpo da invenção como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. No agente profilático da invenção, é preferida uma solução ou suspensão aquosa contendo o anticorpo engenhado, preferivelmente tamponado em pH fisiológico, em uma forma pronta para injeção. As composições para administração parenteral comumente compreenderão uma solução do anticorpo da invenção ou um seu coquetel dissolvido em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser empregada, e.g., solução salina 0,9%, glicina 0,3%, e semelhante. Estas soluções são estéreis e geralmente estão livres de matéria particulada. Esta soluções podem ser esterilizadas por técnicas convencionais, bem conhecidas (e.g. filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como requeridas para se aproximarem das condições fisiológicas tais como agentes ajustadores de pH e agentes tampão, etc. A concentração do anticorpo da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, i.e., de menos do que cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1% a tanto quanto 15 ou 20% em peso e será selecionada primariamente baseado nos volumes de fluido, nas viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado.

Assim, a composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 mL de água tamponada estéril, e entre cerca de 1 ng a cerca de 100 mg, e.g. cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou mais preferivelmente, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um anticorpo da invenção. Similarmente, a composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa poderia ser composta para conter cerca de 250 mL de solução estéril de Ringer, e cerca de 1 a cerca de 30 e preferivelmente 5 mg a cerca de 25 mg de um anticorpo engenhado da invenção por mL de solução de Ringer. Métodos reais para preparar as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos e serão evidentes para aquelas pessoas experientes na arte e são descritos com mais detalhe em, por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Science, ISth ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Para a preparação de formulações de anticorpo intravenosamente administráveis da invenção veja Lasmar U e Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation amd formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A e B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient- Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283- 2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S.

"Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sei, 91 (2002) 914-922, Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sei, 91, 2252- 2264,(2002) cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados como referências e aos quais o leitor deve se referir especificamente.

E preferido que o agente terapêutico da invenção, quando em uma preparação farmacêutica, esteja presente em formas de dosagem unitárias. A dose terapeuticamente eficaz apropriada será determinada por aquelas pessoas experientes na arte. Para eficazmente tratar derrame cerebral e outras doenças neurológicas em um humano, uma dose dentro da faixa de 700 a 3500 mg por 70 kg de peso corporal de um anticorpo desta invenção é planejada para ser administrada parenteralmente, preferivelmente s.c., i.v. ou i.m. (intramuscularmente). Tal dose pode, se necessário, ser repetida em intervalos de tempo apropriados selecionados conforme apropriado por um médico.

Os anticorpos aqui descritos podem ser liofilizados para armazenagem e reconstituídos em um veículo apropriado antes do uso. Tem sido mostrado que esta técnica é eficaz com imunoglobulinas convencionais e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na arte podem ser empregadas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo anti-NOGO anticorpo da presente invenção ou um seu fragmento funcional e um veículo farmaceuticamente aceitável para o tratamento ou a profilaxia de derrame cerebral e outras doenças neurológicas.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-NOGO da presente invenção ou um seu fragmento funcional e um veículo farmaceuticamente aceitável para a inibição de neurodegeneração e/ou promoção de recuperação funcional em um paciente humano sofrendo de, ou sob o risco de desenvolver, um derrame cerebral ou outra doença neurológica.

A invenção adicionalmente proporciona um método de tratamento ou profilaxia de derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico) e de outros distúrbios/doenças neurológicas, em particular mal de Alzheimer, em um humano que compreende administrar ao citado humano em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção ou de um seu fragmento funcional. Anticorpos da invenção podem ser usados em métodos de tratamento para tornas mais lenta ou interromper a progressão e/ou o início do mal de Alzheimer em adição ao (ou como uma alternativa ao) tratamento de doença estabelecida em um paciente humano.

Adicionalmente a invenção proporciona o uso de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção, ou de um seu fragmento funcional, na preparação de um medicamento para tratamento ou profilaxia de derrame cerebral e de outros distúrbios/doenças neurológicas, em particular mal de Alzheimer.

A invenção também proporciona um método de inibição de neurodegeneração e/ou promoção de recuperação funcional em um paciente humano sofrendo de, ou sob o risco de desenvolver, uma derrame cerebral ou outra(o) doença/distúrbio neurológica(o), em particular mal de Alzheimer, que compreende administrar ao citado humano em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção ou de um seu fragmento funcional. Em adição a invenção proporciona o uso de um anticorpo anti- NOGO da presente invenção ou um seu fragmento funcional na preparação de um medicamento para inibição de neurodegeneração e/ou promoção de recuperação funcional em um paciente humano afligido com, ou sob risco de desenvolver, um derrame cerebral e outra(o) doença/distúrbio neurológica(o), em particular mal de Alzheimer.

A invenção adicionalmente proporciona um método de tratamento ou profilaxia de derrame cerebral ou de outra(o) doença/distúrbio neurológica(o), em particular mal de Alzheimer, em um humano compreendendo a etapa de administração parenteral de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção. Preferivelmente o citado anticorpo anti-NOGO é administrado intravenosamente.

Doenças ou distúrbios neurológicas(os) como aqui acima incluem, mas não são limitadas(os) a lesão cerebral traumática, lesão da espinha dorsal, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington, e em particular mal de Alzheimer, esclerose múltipla ou esclerose lateral amiotrófica (ALS).

A invenção também proporciona um método de promoção de germinação axonal compreendendo a etapa de contatar um axônio de humano com um anticorpo anti-NOGO da presente invenção. Este método pode ser realizado in-vitro ou in-vivo, preferivelmente o método é realizado in-vivo.

Em um outro aspecto portanto é a provisão de um método de tratamento de derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico), lesão cerebral, lesão da espinha dorsal, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e em particular mal de Alzheimer em um paciente humano cujo método compreende a administração intravenosa de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-NOGO da invenção.

Em um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um método de promoção da germinação axonal de neurônios dentro do sistema nervoso central de um indivíduo humano (e.g. paciente) cujo método compreende administrar (e.g. administrar intravenosamente) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção.

Em um outro aspecto da presente invenção é proporcionado o uso de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção (e.g. um anticorpo anti-NOGO compreendendo as CDRs aqui descritas) na manufatura de um medicamento intravenosamente administrável para o tratamento de derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico), lesão cerebral, lesão da espinha dorsal, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington, e em particular mal de Alzheimer, esclerose múltipla ou esclerose lateral amiotrófica (ALS) em um paciente humano.

Em um outro aspecto da invenção é proporcionado um método de regeneração de processos axonais em neurônios do sistema nervoso central em um paciente humano afligido com (ou suscetível ao) derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico), lesão cerebral, lesão da espinha dorsal, demência fronto-temporal (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e em particular mal de Alzheimer cujo método compreende a etapa de administrar (e.g. intravenosamente) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção.

Em um outro aspecto da invenção é proporcionado o uso de um anticorpo anti-NOGO da presente invenção na manufatura de uma composição farmacêutica intravenosamente administrável para a regeneração de processos axonais em neurônios do sistema nervoso central em um paciente humano afligido com (ou suscetível ao) derrame cerebral (particularmente derrame cerebral isquêmico), lesão cerebral, lesão da espinha dorsal, demências fronto-temporais (tauopatias), neuropatia periférica, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose múltipla e em particular mal de Alzheimer.

Em um outro aspecto da invenção é proporcionado um método de modulação da produção de um peptídeo amiloidogênico compreendendo contatar uma célula que está expressando o precursor do qual o peptídeo amiloidogênico é derivado e um polipeptídeo NOGO (e.g. NOGO-A de humano) com um anticorpo anti-NOGO da presente invenção. Em modalidades típicas, o precursor é APP. Em outras modalidades típicas o peptídeo amiloidogênico é Αβ, mais preferivelmente Αβ40, Αβ42 ou uma combinação de ambos.

Como aqui usado, o termo "recuperação funcional" refere-se a uma melhoria motora e/ou sensorial e/ou comportamental em um indivíduo após e.g. evento ou lesão isquêmica ou início de sintomas clínicos. Recuperação funcional em humanos pode ser avaliada por instrumentos projetados para medir as funções neurológicas elementares tais como força motora, sensação e coordenação, funções cognitivas tais como memória, linguagem e a capacidade para seguir direções, e capacidades funcionais tais como atividades básicas da vida diária ou atividades instrumentais. Recuperação da função neurológica elementar pode ser medida com instrumentos tais como Escala Cerebral de Derrame NIH (NIHSS), recuperação da função cognitiva pode ser medida com testes neuropsicológicos tais como o Teste de Nomeação de Boston, Testes de Trilhas, e Teste de Aprendizagem Verbal de Califórnia, e atividades de vida diária podem ser medidos com instrumentos tais como a escala de ADCS/ADL (Estudos Clínicos de Mal de Alzheimer /Atividades da Vida Diária) ou tas Atividades de Bristol da Escala da Vida Diária, todos os testes e escalas conhecidos na arte. Os seguintes exemplos ilustram mas não limitam a invenção. Exemplo 1, Construção e expressão de anticorpos humanizados anti-NOGO

Construtos VH e VL humanizados foram preparados de novo pela construção de oligonucleotídeos de recobrimento incluindo sítios de restrição para clonagem em vetores de expressão em mamífero Rld e Rln (ou qualquer outro vetor de expressão apropriado para expressão de proteínas em células de mamífero) bem como uma seqüência de sinal de humano. Sítios de restrição Hind III e Spe I foram introduzidos na matriz do domínio VH contendo a seqüência de sinal CAMPATH-1H para clonagem em Rld contando a região constante mutada γ1 de humano para prevenir atividade de ADCC e CDC (sistema de numeração de índice EU de L235A e G237A). Sítios de restrição Hind III e BsiWI foram introduzidos para por em matriz o domínio VL contendo a seqüência de sinal CAMPATH-1H para clonagem em Rin contendo a região constante kappa de humano.

Seqüência de sinal C AMPATH-I H: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ.ID.NO:31)

Foram produzidos plasmídeos codificadores de seqüências de aminoácidos de cadeia pesada de IgG de humano, nas quais as CDRs foram aquelas descritas em tabela 2. Plasmídeos codificadores de seqüências de aminoácidos de cadeia pesada de IgG de humano, nas quais as CDRs foram aquelas descritas em tabela 3, foram produzidos a partir daqueles plasmídeos iniciais existentes pela introdução de mutações pontuais individuais, G95M (numeração de Kabat), usando o kit Quickchange (Stratagene).

A seguinte tabela descreve quais seqüências de cadeia pesada de comprimento total foram preparadas nos vetores de plasmídeo e quais das seqüências foram pareadas, no sentido de que a única diferença nas seqüências de aminoácidos das seqüências de cadeia pesada de comprimento total (FL) pareadas foi uma substituição em G95M (numeração de kabat) dentro da CDR H3da região variável: Tabela 8,

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Plasmídeos codificadores das cadeias pesadas foram então co- transfectados em células CHO (para detalhes veja exemplo 2) com uma das seguintes seqüências de cadeia leve de comprimento total: Lll FL (SEQ LD NO. 36), L13 FL (SEQ ID NO. 17), ou L16 FL (SEQ ID NO. 18).

Em paralelo foi produzida uma quimera chamada de HcLc (que é a quimera de 2A10 (SEQ ID NO. 9 e 10 - as cadeias de comprimento total compreendendo as regiões constantes de IgG de humano, VH (SEQ ID NO. 7) e VL (SEQ ID NO.8) de 2A10 murino)).

Exemplo 2, Expressão de anticorpo em células CHO

Plasmídeos Rld e Rln (ou outros vetores adequados para uso em células de mamífero) codificadores de cadeia pesada e leve respectivamente foram transientemente co-transfectados em células CHO e expressados em escala pequena ou escala grande para produzir anticorpo. Alternativamente os mesmos plasmídeos foram co-transfectados em células DHFR- CHO por eletroporação e uma população policlonal estável de células expressando o anticorpo apropriado foi selecionada usando um meio livre de nucleosídeo Rld contém o gene DHFR, Rln contém um marcador de seleção de neomicina). Em alguns ensaios, anticorpos foram avaliados diretamente do sobrenadante da cultura de tecido. Em outros ensaios, anticorpo recombinante foi recuperado e purificado por cromatografia de afinidade sobre Protein A Sepharose.

Exemplo 3, Anticorpo anti-NOGO humanizado se liga em NOGO

GST-NOGO-A56 de humano (veja exemplo 5) a 0,05-1 μg/mL em PBS foi revestido sobre placas Nunc Immunosorp (100 μι por cavidade) a 4°C durante a noite. Cavidades foram lavadas uma vez com TBS + 0,05% Tween (TBST) então incubadas com 2% BSA em TBST para bloquear sítios de ligação não-específica na temperatura ambiente por 1 hora. Anticorpos foram diluídos com TBST + 2% BSA para 10 pg/mL e diluição 1/2 foi preparada desta. Anticorpos foram adicionados nas cavidades em duplicata e incubados na temperatura ambiente por 1 hora. Cavidades foram lavadas três vezes com TBST então foram incubadas com conjugado de peroxidase anti- kappa de humano (1:2000) por 1 hora. As cavidades foram lavadas três vezes com TBST e então incubadas com 100 pL de substrato de peroxidase OPD (Sigma) por cavidade por IOs. A reação colorida foi interrompida pela adição de 25 jxL de H2SO4 concentrado. Densidade óptica a 490 nm foi medida usando uma leitora de placa. Valores de fundo lidos das cavidades sem anticorpo foram subtraídos.

Figuras 1-4 ilustram a ligação dependente de dose dos anticorpos humanizados em comparação com a quimera (chamada de HcLc que é a quimera de 2A10 (compreendendo regiões constantes de IgG de humano e VH (SEQ ID NO. 7) e VL (SEQ ID NO.8) de 2A10 murino)) em GST-NOGO-A56 de humano (veja Exemplo 5 para detalhes) em um ensaio ELISA. O eixo-Y mostra a densidade óptica (OD) medida a 490 nm, uma medição quantitativa de anticorpo capturado nestas cavidades. O eixo-X mostra a concentração de anticorpo usado (mcg/mL) por cavidade em cada ponto de dado.

O material de anticorpo usado em Figuras 1-4 é anticorpo purificado gerado quer por sistema de expressão policlonal quer por transfecções transientes de grande escala. Nestes casos, níveis de IgG foram quantificados por ELISA e densidade óptica.

Os Resultados dos experimentos mostrados em Figuras 1-4 mostram que a inclusão da mutação G95M melhora o desempenho do anticorpo. A única exceção é H27L16 mostrado em Figuras 3 e 4 que apresentou desempenho muito insatisfatório. Acreditamos que estes dados resultaram de um problema técnico indefinido com o ensaio de H27L16, porque H27L15 tem diferentemente mostrado desempenho consistentemente bom em outros ensaios (em ELISA mostrado em Figuras 1 e 2, e em ensaios BIAcore (Tabelas 9 e 10)). Também tem sido mostrado que H27L16 funciona muito bem em experimentos posteriores (veja Figuras 11 e 12).

Exemplo 4, Protocolo de quantificação de anticorpo

Placas Nunc Immunosorp foram revestidas com um anticorpo de captura de cabra anti-cadeia de IgG de humano (Sigma #13382) a 2 μg/mL em tampão Bicarbonato (Sigma #C3041) e incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas duas vezes com TBS contendo Tween20 0,05% (TBST) e bloqueadas com 200 μΙ. de TBST contendo (BSA 2% ou de 1-3%) (tampão de bloqueio) por 1 h na temperatura ambiente. As placas foram lavadas duas vezes com TBST. Sobrenadantes de cultura de tecido contendo anticorpo foram titulados através da placa em etapas de diluição dupla em tampão de bloqueio e incubadas na temperatura ambiente por 1 h. As placas foram lavadas três vezes com TBST. Anticorpo H23 conjugado com HRP (de cabra anti-cadeia kappa de humano, Sigma #A7164) foi diluído 1:2000 em TBST e 100 uL foram adicionados em cada cavidade. As placas foram incubadas na temperatura ambiente por 1 h. As placas foram lavadas três vezes com TBST e reveladas com 100 μΙ, de substrato Fast-OPD (Sigma #P9187). Cor foi permitida se desenvolver por 5-10 min após cujo tempo o ELISA foi interrompido com 25 μι de H2SO4 3M. A absorbância a 490 nm foi lida na placa e a concentração de anticorpo foi determinada por referência a uma curva padrão.

Exemplo 5, Produção de Fragmento NOGO-A (NOGO-A56, SEQ.ID.NO:32)

Uma seqüência de cDNA codificadora de um polipeptídeo compreendendo aminoácido 586-785 e uma etiqueta GST(SEQ ID.NO:32) de NOGO-A de humano foi criada pela clonagem de um cDNA codificador de aminoácidos 586-785 of NOGO-A de humano nos sítios BamHI-XhoI de pGEX-6Pl para gerar uma proteína de fusão etiquetada com GST chamada de GST-human-NOGO-A56. Plasmídeo foi expressado em células BL21 em meio 2XTY com 100 μg/mL de ampicilina após indução com IPTG a 0,5mM a 37°C por 3horas. Pelotas celulares foram lisadas por sonicação e a proteína de fusão foi purificada usando Glutathione-Sepharose (Amersham Pharmacia) seguindo as instruções do fabricante. Proteína purificada foi eluída usando glutationa reduzida e extensivamente dialisada contra PBS5 quantificada usando padrões de BSA e um ensaio de proteína baseado em BioRad coomassie e então armazenada em alíquotas a -80°C. Exemplo 6, Análise de BiaCore de Anticorpos Monoclonais Anti-NOGO

A cinética de ligação do anticorpo monoclonal (mAb) anti- NOGO em GST-NOGO-A de humano expressada foi analisada usando o biossensor Biacore3000 ou Biacore Tl00. O chip hNOGO-A foi preparado como segue:

Método

GST-NOGO-A56 de humano foi imobilizada em um chip CM5 por copulação de amina primária usando o programa Biacore Wizard planejado para níveis de imobilização selecionados. A superfície do sensor CM5 foi ativada pela passagem de uma solução de N-hidróxi-succinimida (NHS) 50 mM e de carboneto de N-etil-N'-dimetil-amino-propila (EDC) 200mM. Então GST-NOGO-A56 de humano em tampão acetato de sódio, pH 5,0 ou pH 4,5, foi passada sobre o chip e imobilizada. Após completitude da imobilização quaisquer ésteres ainda ativados foram bloqueados por uma injeção de cloridrato de etanol-amina 1M, pH 8,5.

Os mABs anti-NOGO foram diluídos em HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, e tensoativo P-20 0,005%) para Biacore 3000 ou HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, e tensoativo P-20 0,05%) no caso de TlOO e estudos de ligação foram realizados em uma faixa de concentrações definidas de anticorpo. Todas as corridas foram referidas contra uma superfície de sensor em branco (uma que havia sido ativada e bloqueada como descrito no início mas não tinha adição de ligante). Análise da ligação foi realizada usando o programa de computador de análise cinática BIAevaluation versão 4.1 para Biacore 3000 e o programa de computador análise cinética versão 1.0 para Biacore T100. Análise Biacore de outros anticorpos da invenção essencialmente seguiu o mesmo protocolo como aqui descrito. A não ser que seja indicado de outro modo, os experimentos Biacore foram realizados a 25°C.

Na seguinte seção de Resultados cada tabela de dados representa os Resultados obtidos de um experimento individual.

Resultados - Tabela 9

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Resultados - Tabela 10

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Resultados - Tabela 11

<table>table see original document page 49</column></row><table> Exemplo 7: Análise BiaCore de anticorpos monoclonais humanizados anti- NOGO usando classificação de dissociação

O chip de GST-NOGO-A56 de humano foi preparado para análise de cinética. Sobrenadantes celulares foram obtidos diretamente de transfecções transientes de células CHO-Kl. Estes foram passados diretamente sobre a superfície de sensor e a interação foi medida. Foi usado um sobrenadante celular falsamente transfectado para referência dupla para remover quaisquer artefatos devido ao meio de cultura de tecido. Todas as corridas foram referidas contra uma superfície de sensor em branco (uma que havia sido ativada e bloqueada como descrito no início mas sem adição de ligante). Análise de ligação foi realizada usando o programa de computador de análise cinética BIAevaluation de versão 4.1.

Exemplo 8: Mapeamento de peptídeo

47 Peptídeos de sobreposição abarcando a porção NOGO-A56 de domínio GST-NOGO-A56 de humano (SEQ ID NO. 32) foram obtidos (de Mimotope™). Os peptídeos são de 16 aminoácidos em comprimento com uma sobreposição de doze aminoácidos com o peptídeo adjacente (cada peptídeo adicionalmente compreendendo uma seqüência de biotina-SGSG na terminação-N) com a exceção do primeiro peptídeo que possui uma etiqueta de GSG-biocitina na terminação-C. Os peptídeos foram usados para mapear epítopo do sítio de ligação de 2A10 e H28L16. Método de mapeamento de epítopo:

Estreptavidina a 5μg/mL em água estéril foi revestida sobre placas Nunc Immunosorp (100 μι por cavidade) a 37°C durante a noite. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS contendo Tween 0,05% (PBST) então foram bloqueadas com BSA 3% em PBST a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST. Peptídeos foram então adicionados nas cavidades em uma concentração de aproximadamente 10 μg/mL (diluídos em BSA 3% em PBST) e incubados na temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST então foram incubadas por 1 hora com anticorpos anti-NOGO diluídos para 5 μ§/πιί em BSA 3% em PBST. As placas foram lavadas três vezes com PBST então foram incubadas com conjugado de anti-kappa de humano ou anti-kappa de camundongo - peroxidase (1:1000, diluído em BSA 3% em PBST) por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e então foram incubadas com 100 de substrato de peroxidase OPD (Sigma) por cavidade por 10 minutos. A reação colorida foi interrompida pela adição de 50 μι de H2SO4 3 molar. Absorbância a 490 nm foi medida usando uma leitora de placa.

Os Resultados são mostrados em figura 5 (mapeamento de epítopo usando H28L16), figura 6 (mapeamento de epítopo usando 2A10). Figuras 5 e 6 mostram os Resultados do mapeamento de epítopo de 2A10 e H28L16, respectivamente. Os dados mostrados indicam que 2A10 e H28L16 se ligam em peptídeos 6 e 7 cuja porção específica NOGO é dada em SEQ ID NO.73 e SEQ ID NO.74 respectivamente, ambas as quais contêm a seqüência VLPDIVMEAPLN. Estes Resultados indicam que VLPDIVMEAPLN (SEQ ID N0.60) contém o epítopo de ligação de 2A10 e H28L16.

Exemplo 9: Comparação de HcLc e HcLc contendo a mutação G95M da CDR H3

Uma variante modificada de HcLc foi construída a partir dos plasmídeos de expressão existentes pela introdução de uma única mutação pontual, G95M (numeração de Kabat), usando o kit Quikchange (Stratagene). A seqüência de proteína da proteína de domínio pesado variável Hc (G95M) é dada em SEQ ID 59.

Hc(G95M)Lc foi expressada em células CHO como descrito previamente. O anticorpo foi quantificado como descrito em Exemplo 4. Figuras 7 e Figura 8 mostram uma comparação da atividade de ligação de Hc(G95M)Lc e HcLc como determinado usando um ELISA de ligação de NOGO-A de humano quando NOGO foi revestida sobre placas Nunc immunosorp a 0,05 (Figura 7) e 1 μg/mL (Figura 8). Tabela abaixo mostra uma comparação das afinidades de ligação de Hc(G95M)Lc e HcLc.

Tabela 12, Dissociação medida por classificação Biacore baseada em um experimento

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Os dados demonstram que a substituição de G95M dentro de CDR H3 não apenas aumenta a atividade de ligação dos anticorpos humanizados (H6L13), mas também do anticorpo doador murino 2AlO (HcLc).

Exemplo 10: Construção e teste de anticorpos para NOGO contendo substituições em CDR H3

Um painel de 90 regiões variáveis de cadeia pesada foi criado por mutações pontuais únicas nos resíduos contidos em CDR H3, ou a Leucina precedente. Especificamente, vetores codificadores de uma cadeia pesada (baseada em H6FL, SEQ ID NO. 15) foram preparados codificando regiões variáveis de cadeia pesada onde cada resíduo de aminoácido em CDR H3 e a Leucine precedente foram substituídos (usando o kit Quikchange (Stratagene)) por todos os outros aminoácidos naturalmente ocorrentes, excluindo cisteína, e expressados conjuntamente com uma cadeia leve (L13FL, SEQ ID NO. 17) para dar 90 anticorpos diferentes. Estes anticorpos foram ensaiados para ligação em NOGO em ELISA e experimentos Biacore.

Figuras 9 e 10 mostram uma comparação da atividade de ligação das variantes de H6FL em comparação com H6FL L13FL. Tabelas 14 e 15 mostram uma comparação da cinética de dissociação conforme medida por Biacore - são mostrados apenas os Resultados para estes anticorpos que tinham uma dissociação mensurável no ensaio Biacore e tinham uma atividade de ligação comparável para H6L13 em ELISA. Tabela 14

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Conclusões

Os Resultados indicam que os anticorpos que retêm as propriedades de ligação do 2A10 murino, e o anticorpo H6L13 contendo GQGY, são aqueles contendo a seguinte CDR H3: RQGY, IQGY, MQGY5 GDGY, GIGY5 GSGY5 GQNY5 GQYY5 GQSY5 GQLY5 GQFY5 GQGW5 WQGY5 GAGY5 GLGY5 GVGY5 GQWY.

Exemplo 11, Comparação de mab (H20L16) contendo GQGY com mabs G95M-variantes (H27L16 e H28L13 e H28L16)

Os anticorpos listados em Tabela 15 foram manufaturados como descrito acima.

Tabela 15 - Anticorpos 2A10 humanizados anti-Nogo-A dando um número total de retro-mutações para o anticorpo total (2x cadeia pesada + 2x cadeia leve).

<table>table see original document page 53</column></row><table> Características de ligação in vitro

Em uma tentativa para classificar os anticorpos, suas propriedades de ligação foram investigadas em uma variedade de ensaios incluindo ELISA, ELISA de formato reverso, ELISA de competição, Biacore e por citometria de fluxo.

11.1 Ligação em NOGO-A recombinante de humano em ELISA

A capacidade dos anticorpos de se ligarem em NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A56 de humano) foi investigada por vários ensaios ELISA relacionados (realizados em um protocolo relacionado, mas ligeiramente diferente, como aquele descrito em Exemplo 3). No primeiro ensaio, a Nogo-A recombinante é diretamente revestida na placa em várias concentrações de antígeno diferentes. Os Resultados no ELISA de ligação direta quando o antígeno é carregado a 1 mcg/mL ou 0,05 mcg/mL são mostrados em Figura IlA e Figura IlB respectivamente. Os dados confirmam que todos os anticorpos mostram atividade de ligação comparável a de NOGO-A recombinante de humano quando comparados com a forma quimérica do anticorpo parental (HcLc). Em concentrações de revestimento de antígeno mais altas, todos os anticorpos dão um valor de EC50 similar. Em contraste, em uma concentração de revestimento de antígeno mais baixa o ensaio foi capaz de discriminar entre os anticorpos. Embora as curvas de saturação não fossem obtidas, uma análise de tendência sobre as linhas revelou a seguinte ordem de classificação: H27L16>H28L16, H28L13, H20L16.

Em um experimento paralelo, o formato do ensaio foi revertido. Neste formato, o anticorpo é capturado sobre a placa e a ligação da NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A-56 de humano) é detectada usando a etiqueta GST. Os resultados de ELISA de formato reverso são mostrados em Figura 12. Os dados confirmam que todos os anticorpos mostram atividade de ligação comparável em NOGO-A recombinante de humano quando comparados com a forma quimérica do anticorpo parental (HcLc). Este formato de ligação do ELISA de ligação não distinguiu entre os anticorpos.

11.2 ELISA de competição

A capacidade dos anticorpos de competirem diretamente com o anticorpo parental pelo mesmo epítopo em NOGO-A de humano foi avaliada usando um ELISA de competição. A NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A56 de humano) foi revestida sobre as placas. O anticorpo parental 2A10 e os anticorpos humanizados foram pré-misturados antes da adição nas placas. A ligação de 2A10 foi quantificada usando um conjugado de HRP-anti-IgG de camundongo e (Dakocytomation, #P0260). Os Resultados mostrados em Figura 13 confirmam que todos os quatro anticorpos podem competir com 2A10. Isto sugere que os anticorpos humanizados e o anticorpo parental reconhecem um epítopo de sobreposição em NOGO-A de humano. Adicionalmente, a atividade dos anticorpos humanizados é comparável ou melhor do que a de quimera HcLc. Os Resultados indicam que H27L16, H28L16 e H28L13 são mais potentes do que H20L16.

11.3 Medições de afinidade Biacore

Biacore foi usado para determinar as afinidades e classificar os anticorpos usando duas metodologias diferentes. Na primeira abordagem, a NOGO-A recombinante foi copulada na superfície do chip e anticorpos anti- Nogo-A foram passados sobre esta superfície. Na segunda abordagem, Proteína A foi usada para capturar o anticorpo sobre a superfície do chip sobre a qual a GST-NOGO-A56 recombinante de humano foi passada. Os Resultados mostrados em Tabela 16 foram obtidos pela copulação do antígeno na superfície e confirmam que todos os quatro anticorpos mostram afinidade comparável / melhor do que a do anticorpo parental (HcLc). Baseado na média de seis corridas independentes, os anticorpos são classificados na seguinte ordem em termos de afinidade total: H27L16>H28L 16>H28L 13>H20L 16, consistente com a ordem de classificação do ELISA de ligação direta (Figura 11B). No caso de H27L16 e H28L16, os anticorpos humanizados demonstram afinidade 2-3x mais alta do que a do anticorpo parental (HcLc).

Tabela 16 - Cinética de ligação dos anticorpos humanizados anti-Nogo A para NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A56 de humano) conforme determinada usando o Biacore T100. O antígeno foi ligado no chip CM5 por copulação de amina primária. Os anticorpos foram fluídos sobre concentrações variadas (0,125-8 nM). Os valores mostram a média e o desvio padrão de seis corridas independentes realizadas em duplicata. Cada conjunto de dados completado foi analisado independentemente antes do cálculo da média e do desvio padrão. **Apenas 11 conjuntos de dados analisados para H20L16 como um conjunto não puderam ser analisados.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Em uma maneira similar a de ELISA, a cinética de ligação de anticorpo em NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A56 de humano) também foi avaliada em um formato reverso (veja Exemplo 11.1). Neste ensaio, os anticorpos humanizados foram capturados sobre o chip CM5 por Proteína A. Os Resultados médios de seis corridas independentes são mostrados em Tabela 17. Consistente com o ELISA de formato reverso, todos os anticorpos humanizados para Nogo-A mostram cinética de ligação similar à da quimera (HcLc) no Biacore de formato reverso.

Tabela 17 - Cinética de ligação em formato reverso dos anticorpos humanizados anti-Nogo-A anticorpos para NOGO-A recombinante de humano (GST Nogo-A 5+6) conforme determinado usando Biacore Tl00. Proteína A foi imobilizada em aproximadamente 4000RUs por amina primária e usada para capturar 200-3OORUs dos anticorpos da amostra. NOGO-A recombinante de humano foi passada sobre em várias concentrações (0,125-8 nM). Os valores mostram a média e desvio padrão (entre parênteses) de três corridas independentes em duplicata. Cada conjunto de dados foi independentemente analisado antes do cálculo da média e desvio padrão.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

11.4 Ligação em NOGO nativa de humano

Para demonstrar que os anticorpos humanizados se ligam em NOGO-A nativa de humano com um perfil comparável com o de anticorpo parental, foram desenvolvidos dois ensaios baseados em citometria de fluxo. No primeiro ensaio, foi gerada uma linhagem celular baseada em CHO-Kl expressando domínio extracelular de NOGO-A de humano sobre a superfície celular. A ligação dos anticorpos humanizados anti-Nogo-A foi ensaiada por citometria de fluxo usando um anticorpo anti-IgG de humano marcado com PE (Sigma, #P8047). Figura 14 abaixo mostra um perfil típico para os anticorpos anti-Nogo-A sobre a linhagem celular CHO-Nogo-A. Embora o ensaio são seja suficientemente sensível para distinguir entre os anticorpos, os resultados confirmam que todos os quatro anticorpos podem reconhecer a NOGO-A de humano expressada em superfície celular em níveis comparáveis àqueles da quimera. Nenhum dos anticorpos reconhece a linhagem celular parental (CHO-K1 - dados não mostrados).

No segundo ensaio, a capacidade dos anticorpos humanizados de se ligarem em Nogo-A nativa foi avaliada usando uma linhagem celular de neuroblastoma de humano - IMR32. Esta linhagem celular é caracterizada por níveis de superfície celular baixos / intracelulares altos de proteína Nogo-A. Em uma tentativa para aumentar o sinal de ligação, o ensaio foi configurado para detectar a Nogo-A intracelular (ER-residente). Células IMR32 foram permeabilizadas e fixadas antes da coloração com os anticorpos humanizados anti-Nogo-A. A ligação dos anticorpos em Nogo-A foi detectada usando um anticorpo secundário anti-IgG de humano marcado com PE (Sigma, #P8047). Os Resultados mostrados em Figura 15 abaixo, confirmam que todos os anticorpos se ligam em Nogo-A intracelular em níveis comparáveis com ou mais altos do que os de anticorpo parental HcLc. Estes dados, conjuntamente com os Resultados da linhagem celular CHO-Nogo-A, confirmam que os anticorpos humanizados podem reconhecer uma forma mais nativa de proteína Nogo-A comparáveis com ou melhores do que a quimera, HcLc. Os ensaios não são suficientemente sensíveis para classificar o painel de anticorpos.

11.5 Ensaios de crescimento de neurito

Anticorpos humanizados anti-Nogo-A foram testados para sua capacidade de neutralizar atividade inibitória de crescimento de neutralise neurito (NO) de Nogo-A em um ensaio baseado na quantificação de NO como descrito previamente. Anticorpos testados no ensaio foram selecionados baseando-se em sua cinética de ligação para Nogo-A. Anticorpos humanizados de afinidade alta a saber, H28L16, H27L16, H20L16 e para referência seus anticorpos parentais 2A10 (monoclonal de camundongo) e HcLc (quimera de humano e camundongo) foram testados para a neutralização de Nogo-A. Para comparação, anticorpo 11C7 (veja Exemplo 13) também foi testado no ensaio.

Com o objetivo de testar a atividade de neutralização de anticorpos humanizados selecionados, cavidades revestidas com GST- NOGO-A5 6 recombinante de humano e tratadas com concentrações variadas de anticorpos a 37°C por 1 h antes da adição de neurônios granulares de cerebelo (CGNs). Cavidades de controle foram tratadas com HBSS. Comprimento médio de neurito por neurito foi medido para cada cavidade. Figura 16 mostra os Resultados para os anticorpos humanizados testados no ensaio. Um painel de anticorpos de controle (IgG de controle IgG de camundongo purificada; Campath e anticorpos humanizados irrelevantes) foi usado para confirmar a especificidade da atividade. Como um outro controle, os mesmos anticorpos humanizados foram titulados sobre placas revestidas com GST. Os Resultados confirmam que H28L16, H27L16 e H20L16 revertem a inibição de crescimento de neurito mediada por Nogo-A em um grau similar ao observado para os anticorpos parentais (2A10 e HcLc). Os efeitos parecem ser robustos e estáveis e foram vistos com H28L16 em oito dos onze experimentos de crescimento de neutiro independentes. Em contraste, os anticorpos humanizados não aumentam o crescimento de neurito sobre placas revestidas de GST e o painel de anticorpos de controle não mostra qualquer reversão de inibição dependente de dose, confirmando que o efeito dos anticorpos humanizados é específico para a inibição mediada por Nogo-A. Os dados apresentados para o crescimento de neurito são selecionados de numerosos experimentos repetidos. Embora um número de repetições que não são mostradas apareceram ser variáveis em natureza, é crido que os dados mostrados refletem uma atividade verdadeira dos anticorpos da presente invenção na redução do efeito inibitório de NOGO no ensaio de crescimento de neurito.

Exemplo 12, Caracterização adicional de H28L16

12.1 Ligação em NOGO-A recombinante de comprimento total

A capacidade de os anticorpos se ligarem em domínio extracelular de comprimento total de NOGO-A recombinante de humano (GST-NOGO-A de humano-ECD) foi investigada por um ensaio ELISA de ligação direta. Neste caso o ECD foi uma variante de editoração caindo dentro da região de aproximadamente posição 186-1004 de NOGO-A de humano (a porção iniciando com DETFAL (SEQ ID N0.95) e terminando com ELSKTS (SEQ ID NO.96)). O GST-NOGO-A de humano recombinante-ECD foi diretamente revestido na placa a 1 μg/mL. Os dados mostrados em Figura 17 confirmam que H28L16 pode reconhecer GST-NOGO-A de humano-ECD em níveis comparáveis a ou melhores do que o parental (HcLc) ou H20L16.

12.2 Inibição de funcionalidade Fc

Para melhorar o perfil de segurança do candidato, os resíduos L235 e G237 dentro do domínio CH2 da região constante de cadeia pesada (sistema de índice EU) foram mutados para resíduos de alanina assim reduzindo a possibilidade de disparo das funções efetoras imunológicas mediadas por anticorpo. Ligação de Clq de humano reduzida foi usada como uma substituta para inibição de funcionalidade Fc. Figura 18 abaixo mostra que H28L16 tem significativamente reduzido a atividade de ligação de Clq, comparado com Campath-IgGl (de tipo selvagem ) e é comparável como um construto Campath IgGl possuindo as mesmas mutações (anticorpo (Fe-) Fc- mutado) e Campath IgG4. Estes dados sugerem que as mutações em domínio- CH2 presentes em H28L16 significativamente reduzirão a possibilidade de disparo das funções efetoras mediadas por Fc. 12.3 Ligação de ortólogo

Para confirmar que H28L16 mostra atividade de ligação em vários ortólogos de Nogo-A, comparável com aquela do anticorpo parental (HcLc)5 foi realizada uma série de ensaios de ligação. Figura 19 A-D abaixo mostra os Resultados de um ELISA de ligação direta em NOGO recombinante (GST-NOGO-A56 de humano) a partir de rato (SEQ ID NO.94), cinomolgo (SEQ ID NO. 92), sagüi (SEQ ID NO. 93) e macaco esquilo (SEQ ID NO. 91). Em todos os casos, H28L16 mostra atividade comparável com ou melhor do que a de anticorpo quimérico (HcLc). Valores de EC50 calculados são muito similares àqueles calculados para ligação em NOGO-A recombinante de humano.

A cinética de ligação de H28L16 em vários ortólogos de Nogo-A em comparação com HcLc e 11C7 foi determinada usando o Biacore. Tabela 18 e Tabela 19 abaixo mostram a cinética de ligação em dois formatos diferentes do ensaio. Onde a NOGO-A recombinante foi copulada diretamente no chip CM5 (Tabela 18), as cinéticas de ligação para rato, macaco cinomolgo, macaco esquilo e sagüi são muito similares àquela para humano (faixa = 0,33-0,67 nM). Quando o formato do ensaio foi revertido e os anticorpos foram capturados sobre o chip usando Proteína A (Tabela 19), a afinidade de ligação de H28L16 em Nogo-A de rato é aproximadamente 14 vezes menor do que para NOGO-A de humano. Uma tendência similar é observada para Nogo-A de cinomolgo (afinidade 8,5x menor do que para humano) e os outros ortólogos de primata (afinidade 12-17x menor do que para humano). O anticorpo quimérico HcLc mostra um perfil similar de ligação nos ortólogos de Nogo-A em ambas as orientações do ensaio. Visto que não está claro qual formato de ensaio melhor representa a situação in vivo, as conclusões primárias que podem ser tiradas deste estudo são: 1) H28L16 tem retido o perfil de reatividade cruzada de ortólogo com o anticorpo quimérico HcLc e 2) a afinidade de HcLc para Nogo-A de rato e de cinomolgo está dentro de 4-vezes e 8,5-vezes a afinidade para NOGO-A de humano e sob certas condições pode ser muito similar.

Tabela 18 - Cinética de ligação de H28L16, 11C7 e HcLc para os ortólogos recombinantes de NOGO-A de humano conforme determinado usando o Biacore T100. Aproximadamente 140-180RUs dos vários ortólogos de Nogo- A foram capturados no chip CM5 por copulação de amina primária. Os anticorpos foram fluídos em concentrações variadas (0,125-8 nM). Os valores mostram a média e o desvio padrão (entre parênteses) de 1-2 corridas independentes realizadas em duplicada com cada conjunto de dados independentemente analisado antes do cálculo de média e desvio padrão.

*Um conjunto de curvas foi descartado devido às curvas não interpretáveis para o anticorpo 11C7. <table>table see original document page 62</column></row><table>

Tabela 19 - Cinética de ligação em formato reverso de H28L16, 11C7 e HcLc

para os ortólogos recombinantes de NOGO-A de humano conforme determinado em Biaeore Tl00. Proteína A foi imobilizada sobre a superfície a cerca de 4000RUs e anticorpos anti-Nogo-A foram capturados a aproximadamente 300-400RUs. As proteínas recombinantes (GST- NOGO- A56) foram fluídas em várias concentrações (0,125-64 nM) dependentes do construto. Todas as corridas foram realizadas em duplicatas. Os valores mostram a média e desvio padrão (entre parênteses) de 1-3 corridas independentes com cada corrida feira em duplicata e cada conjunto de dados foi analisado independentemente antes do cálculo da média e desvio padrão.

<table>table see original document page 62</column></row><table>

12.4 Propriedades físicas

As propriedades físico-químicas de H28L16 e H20L16 foram avaliadas por SEC-HPLC e SDS-PAGE. SEC-HPLC foi realizada a 1,0 mL/minuto usando fosfato de sódio 100 mM, cloreto de sódio 400 mM pH 6,8 e a coluna de aço inoxidável TSK G3000 SW xl 30cm χ 7,8 mm com detecção a 214 nm e 280 nm. SDS-PAGE foi realizada sobre um gel Novex Tris-HCL 4-20% carregando 10 μg de produto e coloração com Sypro Ruby. C-IEF foi realizado em um Beckman MDQ usando anfolinas de pH 3,5-10.

Os seguintes Resultados foram obtidos: Tabela 20 - Análise por HPLC - Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) dos anticorpos anti-Nogo-A. Os valores mostrados são percentagens do anticorpo designado para cada uma das três espécies diferentes.

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Tabela 21 - Análise por SDS-PAGE dos anticorpos anti-Nogo-A. Os valores mostrados são percentagens do anticorpo verificado nas bandas maiores.

<table>table see original document page 63</column></row><table>%

Os dados de SEC-HPLC sugerem que H20L16 é mais

suscetível à agregação do que H28L16 (H28L16). Se os dados aqui fossem repetidos em grande escala, isto poderia influenciar a capacidade do processo de manufatura para produzir o material de qualidade aceitável para uso clínico (>95% de monômero). Os dados de SDS-PAGE mostram que ambos os candidatos são aceitáveis com ambos mostrando um perfil típico. Exemplo 13, Comparação de H28L16 com 11C7

Um anticorpo murino anti-Nogo-A designado 11C7 é descrito em W02004052932, que foi produzido para um epítopo de peptídeo. Um 11C7 quimérico foi preparado baseado na informação de seqüência proporcionada W02004052932. Para comparar os epítopos de ligação de 2A10 e 11C7, foi estabelecido um ELISA de competição para investigar se 11C7 e 2A10 reconhecem um epítopo de sobreposição em Nogo-A. Como mostrado em Figura 20 abaixo, HcLc (a forma quimérica de 2A10) foi capaz de competir com 2A10 pela ligação em NOGO-A recombinante de humano enquanto que 11C7 não mostrou competição com 2A10, até mesmo em concentrações de até 100 mcg/mL.

Exemplo 14: ELISA de competição para demonstrar a capacidade dos peptídeos de competirem diretamente com NOGO-5+6 de humano pela ligação em NOGO H28L16

Método de ELISA de competição

A capacidade de os peptídeos competirem diretamente com NOGO-A (GST-NOGO-A56 de humano) pela ligação em NOGO H28L16 foi avaliada usando um ELISA de competição. IgG de coelho anti-Humano (Sigma, #1-9764) a 5 g/mL em tampão bicarbonato foi revestida sobre placas Nunc immunosorp (100 por cavidade) a 4°C durante a noite. As placas foram lavadas 3 vezes com TBS contendo Tween 0,05% (TBST) então foram bloqueadas com BSA 1% em TBST na temperatura ambiente por 1 hora. H28L16 foi então capturado sobre a placa (1 μg/mL, diluído em BSA 1% em TBST, 50 μΕ por cavidade) na temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST. Peptídeos (de 0 a 100 g/mL) e GST- NOGO-A56 de humano em uma concentração de 1 μg/mL (diluído em BSA 1% em TBST) foram pré-misturados antes da adição nas cavidades e incubados na temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST então foram incubadas por 1 hora com conjugado de peroxidase - anticorpo de coelho anti-GST (Sigma, #A7340, 1:2000, diluído em BSA 1% em TBST) por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com TBST e então foram incubadas com 50 μΐ de substrato de peroxidase OPD (Sigma) por cavidade por 10 minutos. A reação colorida foi interrompida pela adição de 25 μΐ de H2SO4. Absorbância a 490 nm foi medida usando uma leitora de placa.

Os Resultados mostrados em Figura 21 confirmam que os peptídeos 6 e 7, que foram positivos em ELISA de mapeamento de epítopo (Exemplo 8) podem competir com ligação de GST-NOGO-A56 de humano em H28L16. Isto sugere que os peptídeos que foram positivos no estudo de mapeamento de epítopo contêm um epítopo para ligação de H28L16.

Peptídeos 16 e 17 (que contêm peptídeos de NOGO3 mas não sobrepõem com peptídeos 6 ou 7), que não contêm o epítopo proposto, não competem com NOGO-5+6.

Exemplo 15: Análise por ELISA de um anticorpo monoclonal humanizado anti-NOGO baseado em variante G101S/Q37R de anticorpo para NOGO

GlOlS (também conhecida como HlOO (SEQ ID NO.63)), uma variante modificada da região variável de cadeia pesada de H6 (SEQ ID NO. 11) foi gerada pela introdução de uma única substituição, GlOlS (numeração de Kabat) em CDR H3 como descrito acima. Similarmente, Q37R, uma variante modificada da região variável de cadeia leve de L13 (SEQ ID NO. 13) foi gerada pela introdução de uma única substituição (numeração de Kabat Q37R) na região de armação (para formar L100). A seqüência de proteína do domínio leve variável Q37R é dada em SEQ ID NO. 67.

Genes codificadores de versões de comprimento total das cadeias pesada e leve contendo as substituições G101S/Q37R foram expressados em células CHO como previamente descrito e ensaiado em um ELISA de ligação direta como previamente descrito.

Os Resultados do ELISA de ligação direta quando o antígeno é carregado a 0,05 μg/mL são mostrados em Figura 22. Os dados confirmam que o anticorpo Hl OOL100 mostra atividade de ligação comparável com aquela de GST-NOGO-A5 6 recombinante de humano quando comparado com H27L16 e que HlOOL100 possui um perfil de ligação melhorado quando comparado com H6L13. Valores de EC50 correspondentes são mostrados na tabela abaixo:

Tabela 22: Medições de EC50 para a variante G101S/Q37R em comparação com H6L13 e H27L16 <table>table see original document page 66</column></row><table>

Exemplo 16: Análise BiaCore de anticorpos monoclonais de humano anti- NOGO baseados em variante G101S de CDR H3

H100, uma variante modificada da região variável de cadeia pesada de H6 (SEQ ID NO.11) foi gerada pela introdução de uma substituição única, GlOl S (numeração de Kabat) em CDR H3. A seqüência de proteína da proteína H100 de domínio pesado é dada em SEQ ID N0.63.

Similarmente, L100 e L101, variantes modificadas da região variável de cadeia leve de L13 (SEQ ID NO. 13) foram geradas pela introdução de uma substituição única (numeração de Kabat Q37R e Q45R respectivamente) na região de armação. As seqüências de proteína das proteínas Ll00 e L101 de domínios leves variáveis são dadas em SEQ ID NO.67 e SEQ ID N0.68 respectivamente.

Versões de comprimento total de Hl00L100 e Hl00L101 foram expressadas em células CHO como descrito previamente. Tabela 23 mostra uma comparação das afinidades de ligação de H6L13 com Hl 00L100 e Hl 00L101 e indica que Hl 00L100 e H100L101 possuem uma afinidade de ligação melhorada quando comparadas com H6L13. Neste exemplo, o método foi realizado essencialmente como descrito em Exemplo 6 onde o chip CM5 foi ativado pela passagem das soluções de NHS e EDC sobre o chip a 5 uL/mL for 7 minutos e a NOGO foi suspensa em tampão acetato de sódio 10 nM (pH 4,5) antes da passagem sobre o chip.

Tabela 23 - Medições Biacore para a variante G101S da cadeia pesada variável H6 em combinação com variantes da cadeia leve variável L13 em comparação com H6L13.

<table>table see original document page 66</column></row><table> Sumário de seqüências de anticorpo para NOGO (Tabela 24)

<table>table see original document page 67</column></row><table> <table>table see original document page 68</column></row><table>

Seqüências

SEQ ID NO. 1: CDR-Hll de 2A10 SYWMH

SEQ ID NO. 2: CDR-H2 de 2A10 NINPSNGGTNYNEKFKS

SEQ ID NO. 3: CDR-H3 de 2A10 GQGY

SEQ ID NO. 4: CDR-Ll de 2A10 RS SKSLL YKDGKT YLN SEQ ID NO. 5: CDR-L2 de 2A10 LMSTRAS

SEQ ID NO. 6: CDR-L3 de 2A10 QQL VE YPLT

SEQ ID NO. 7: 2A10, VH (murino) Qvqlqqpgtelvkpgasvklsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninpsnggtnynekfkskatltv dksss taymqls slt s ed savyyce lgqgywgqgttltvs s

SEQ ID NO. 8: 2A10, VL (murino) divitqdelsnpvtsgesvsiscrssksllykdgktylnwflqrpgqspqlliylmstrasgvsdrfsgsgs gtdftleisrvkaedvgvyycqqlveypltfgagtklelk mgwsciilflvaaatgvhsqvqlqqpgtelvkpgasvklsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninp snggtnynekfkskatltvdkssstaymqlssltsedsavyycelgqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn vnhkpsnt kvd kkvepks cd kthtcppcpapelagaps vflfppkp kdtlmi srtpevtcvvvdvshedpev kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO. 9: Cadeia pesada quimérica Hc

SEQ ID NO. 10: Cadeia leve quimérica Lc

mrcslqflgvlmfwisgvsgdivitqdelsnpvtsgesvsiscrssksllykdgktylnwflqrpgqspqll iylms trasgvsdrfsgsgsgtdftleisrvkaedvgvyycqqlveypltfgagtklelkrtvaapsvfifp psdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkv yacevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID 11: Construto humanizado H6 de VH de 2A10

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninpsnggtnynekfksratmtr dtststaymelsslrsedtavyycelgqgywgqgtlvtvss

SEQ ID NO. 12: Construto humanizado H16 de VH de 2A10

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninpsnggtnynekfkskatltv dkststaymelsslrsedtavyycelgqgywgqgtlvtvss

SEQ ID NO. 13: Construto humanizado L13 de VL de 2A10

divmtqs plsl pvtlgqpasiscrssks llykdgktylnwfqqrpgqs pqlliylmstrasgvpdrfsgggs gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

SEQ ID NO. 14: Construto humanizado L16 de VL de 2A10

divmtqsplsnpvtlgqpvsiscrssksllykdgktylnwflqrpgqspqll iylmstrasgvpdrfsgggs gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

SEQ ID NO. 15: Construto humanizado H6 de cadeia pesada de 2A10 mgwsciilflvatatgvhsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninp snggtnynekfksratmtrdtststaymelsslrsedtavyycelgqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn vnhkpsnt kvd kkvepks cd kthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpev kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvf scsvmhealhnhytqks l s l s pgk

SEQ ID NO. 16: Construto humanizado H16 de cadeia pesada de 2A10 mgwsciilflvatatgvhsqvql vqsgae vtckpgasvkvsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninp snggtttyne kf ks katltvd kststa ymels s lrsedtavyycelgqgywgqgtlvtvssastkgps vfpla

Psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn

vnhkpsntkvdkxvepkscdkthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvovshedpev kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskl tvd ksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO. 17: Construto humanizado L13 de cadeia leve de 2A10

mgwsciilflvatatgvhsdivmtqsplslpvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfqqrpgqspqlli ylmstrasgvpdrfsgggsgtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleikrtvaaps vfifpp sdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskad ye khkvy acevthqgls s pvtks fnrge c

SEQ ID NO. 18: Construto humanizado L16 de cadeia leve de 2A10

mgwsciilflvatatgvhsdivmtqsplsnpvtlgqpvsiscrssksllykdgktylnwflqrpgqspqlli ylmstrasgvpdrfsgggsgtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleikrtvaapsvfifpp sdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqes vteqds kdstysls stltls kad yekhkvy acevthqglsspvtksfnrgec

SEQ ID NO. 19: PN codificador de 2A10, VH (murino) SEQ ID: 7

caggtccaactgcagcagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggct tctggctacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggatt ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgta gacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgt gaactgggacagggctactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca

SEQID NO. 20: PN codificador de 2A10, VL (murino) SEQ ID: 8

gatattgtgataacccaggatgaactctccaatcctgtcacttctggagaatcagtttccatctcctgcagg tctagtaagagtctcctatataaggatgggaagacatacttgaattggtttctgcagagaccaggacaatct cctcagctcctgatctatttgatgtccacccgtgcatcaggagtctcagaccggtttagtggcagtgggtca ggaacagatttcaccctggaaatcagtagagtgaaggctgaggatgtgggtgtgtattactgtcaacaactt gtagagtatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

SEQ ID NO. 21: PN codificador de cadeia pesada quimérica Hc SEQ ID: 9

atgggatggagctgtatcatcctctttttggtagcagcagctacaggtgtccactcccaggtccaactgcag cagcctgggactgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttc accagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagc acagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgaactgggacagggc tactggggccaaggcacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaatga

SEQ ID NO. 22: PN codificador de cadeia leve quimérica Lc SEQ ID: 10 ATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTG TGATA ACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGT CTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTG ATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAG GCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGAC AGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO. 23: PN codificador de construto humanizado H62 de VH de AlO SEQ ID: 11

CAGGTG CAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGG GACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 24: PN codificador de construto humanizado Hl6 de VH de 2A10SEQID: 12

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATC GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTC GACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 25: PN codificador de construto humanizado L13 de VL de 2A10 SEQ ID: 13

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGG TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA

GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO. 26: PN codificador de construto humanizado L16 de VL de 2A10 SEQ ID: 14

GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGG TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCT CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO. 27: PN codificador de construto humanizado H6 de cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 15 ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 28: PN codificador de construto humanizado H16 de cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 16

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATT AATCCT AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCrrGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTC TCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 29: PN codificador de construto humanizado Ll3 de cadeia leve de 2A10 SEQ ID: 17

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC

CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO. 30: PN codificador de construto humanizado Ll6 de cadeia leve de 2A10SEQID: 18

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACC CAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC ACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO. 31: Seqüência líder Campath

MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID NO. 32: Aminoácidos 586-785 de NOGO A de humano(NOGO- A56)fusionada em GST

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKD FETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN GDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP PKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPAAQLCPSFEES EATPS PVL PDIVM EAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEAS SVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPD FSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE LERPHRD

SEQ ID NO. 33: Construto humanizado Hl de VHde 2A10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO. 34: Construto humanizado Lll de VL de 2A10

DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGS GTD FTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO. 35: Construto humanizado Hl de cadeia pesada de 2A10

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINP SNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTP PVLDSDGSFFLYSKL TVD KSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO. 36: Construto humanizado Lll de cadeia leve de 2A10

MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQS PQLLI YLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO. 37: PN codificador de construto humanizado Hl de VH de 2A10

SEQ ID: 3 3 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCA TCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG GGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGG GACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA

SEQ ID NO. 38: PN codificador de construto humanizado Lll de VL de 2A10 SEQ ID: 34

GATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGG TCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCA GGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTT GTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ED NO. 39: PN codificador de cadeia pesada H12 de AlO humanizado SEQ ID: 35

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCT AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC ACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 40: PN codificador de construto de cadeia leve de Lll de 2A10 humanizado SEQ ID: 36

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACC CAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTC CTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATT TATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACA CTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTC ACGTTT GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCC AAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO. 41: Construto humanizado H20 de VH de 2A10

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNE KFKS KATMTR DTSTSTAYMELS SLRS EDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO. 42: Construto humanizado H20 de cadeia pesada de 2A10 Mgwsciilflvatatgvhsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninp

snggtnynekfkskatmtrdtststaymelsslrsedtavyycelgqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicn vnhkpsntkvdkkvepksctkthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpev kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre

pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdi ave wesngqpennykttppvldsdgsfflyskl tvd ksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO. 43: PN codificador de construto humanizado H20 de VH de 2A10 SEQ ID: 41

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgggacagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca

SEQ ID NO. 44: PN codificador de construto humanizado H20 de cadeia pesada de 2A10 SEQ ID: 42

atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtgcagctggtg cagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc accagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatcggaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagggacacgtccacgagc acagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgggacagggc tactggggccagggaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaatga

SEQ ID NO. 45: CDR-H3 de 2A10 (G95M)

mqgy

SEQ ID NO. 46: Seqüência de aminoácidos de fragmento de NOGO-A de sagüi

vqds lcpvaqlcpsfeeseatpspvlpdivmeaplnsavps agasavqpsss pleass vnfesvkhepenpp pyeeamnvsrkkvsgikeeikepesinaavqeteapyisiacdliket klsaeptpdfssysemakveqplp dhselvedsspdsepvdlfsddsipdvpqkqdeavilvketltetsfesmiehenk

SEQ ID NO. 47: Construto humanizado H26 de VH

qvq lvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninpsnggtnynekf ks ratmtr dtststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvss SEQ ED NO. 48: Construto humanizado H27 de VH

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwkqrpgqglewigninpsnggtnynekfks katltv

Dkststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvss SEQ ID NO. 49: Construto humanizado H28 de VH

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninpsnggtnynekfks katmtr dtststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvss

SEQ ID NO. 50: PN codificador de construto humanizado H26 de VH SEQ ID: 47

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcagagccaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgatgcagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca

SEQ ID NO. 51: PN codificador de construto humanizado H27 de VH SEQ

ID: 48

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaaacagcgacctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaagccaccctcaccgtc gacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgatgcagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca

SEQ ID NO. 52: PN codificador de construto humanizado H28 de VH SEQ

ID: 49

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggca tctggatacaccttcaccagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatc ggaaatattaatcctagcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagg gacacgtccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgt gaactgatgcagggctactggggccagggaacactagtcacagtctcctca

SEQ ID NO. 53: Construto humanizado H26 de cadeia pesada

mgwsciilflvatatgvhsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninp snggtnynekfksratmtrdtststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn vnhkpsntk^kkvepkscdkthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpev

kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykc kvs nkal papiektis kakgq pre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk.

SEQ ID NO. 54: Construto humanizado H27 de cadeia pesada

mgwsciilflvatatgvhsqvql vqsgaev kkpgas vkvsckasgytftsywmhwvkqrpgqglewigninp snggtnynekfkskatltvdkststaymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn vnhkp sntkvd kkvepkscdkthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpev kf nwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgq pre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO. 55: Construto humanizado H28 de cadeia pesada MGWSCIILFLVATATGVHSOVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVROAPGOGLEWIGNINP SNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAWYCELMOGYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ED NO. 56: PN codificador de construto humanizado H26 de cadeia pesada SEQ ID: 53

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATT AATCCT AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGC ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCGTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC

ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 57: PN codificador de construto humanizado H27 de cadeia pesada SEQ ID: 54

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTG CAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTC ACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCT AGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGC ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGC TACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO. 58: PN codificador de construto humanizado H28 de cadeia pesada SEQ ID: 55 atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcccaggtgcagctggtg cagtctggggctcaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttc accagctactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatcggaaatattaatcct agcaatggtggtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccaccatgaccagggacacgtccacgagc acagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgaactgatgcagggc tactggggccagggaacactagtcacagtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggca ccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaac gtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacaca tgcccaccgtgcccagcacctgaactcgcgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggac accctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgc aaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaa ccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtc aaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctc tccctgtctccgggtaaatga

SEQID NO. 59: Cadeia pesada Hc (G95M)

MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINP

Snggtnynekfkskatltvdkssstaymqlssltsedsavyycelmqgywgqgtlvtvssastkgpsvfpla

psskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicn vnhkpsnt kvd kkvepks cd kthtcppcpapelagapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpev kfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre pqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID 60: Epítopo

vlpdivm eapln

SEQ ID 61: Construto humanizado H99 de VH de 2A10

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgninpsnggtnynekfksrvtmtr dtststvymelsslrsedtavyycelgqsywgqgtlvtvss

seq id no. 62: cdr h3 gqsy

SEQ ID NO. 63: Construto humanizado HlOO de VH

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninpsnggtnynekfksratmtr dtststaymelsslrsedtavyycelgqsywgqgtlvtvss

SEQ ID NO. 64: Construto humanizado HlOl de VH

qvqlvqsgaevkkpgas vkvsckasgytfts ywmh wkqrpgqglewigninpsnggtnynekf ks katltv dksts taymels s lrs edtavyycelgqs ywgqgtlvtvs s

SEQ ID NO. 65: Construto humanizado H102 de VH

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigninpsnggtnyne kfks katmtr dtststaymelsslrsedtavyycelgqsywgqgtlvtvss

SEQ ID NO. 66 Construto humanizado H98 de VH de 2A10

qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewmgninpsnggtnynekfksrvtmtr dtststvymelsslrsedtavyycelmqgywgqgtlvtvss SEQ ID NO. 67

Divmtqsplslpvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfrqrpgqspqlliylmstrasgvpdrfsgggs

gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik seq id no. 68

divmtqsplslpvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfqqrpgqsprlliylmstrasgvpdrfsgggs gtd ftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

seq id no. 6 9

divmtqsplslpvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfrqrpgqsprlliylmstrasgvpdrfsgggs gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

seq id no. 70

divmtqsplsnpvtlgqpvsiscrssksllykdgktylnwfrqrpgqspqlliylmstrasgvpdrfsgggs gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

seq id no. 71

divmtqsplsnpvtlgqp vsiscrssksll ykdgktylnwflqrpgqs prlliylmstrasgvpdrfsgggs gtd ftl kis rveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

seq id no. 72

divmtqsplsnpvtlgqpvsiscrssksllykdgktylnwfrqrpgqsprlli ylmstrasgvpdrfsgggs gtdftlkisrveaedvgvyycqqlveypltfgqgtkleik

seq id no. 73 tpspvlpdivmeapln

seq id no. 74 vlpdivmeaplnsavp

seq id no.75 rqgy SEQ ID NO.76 IQGY

SEQ ID NO.77 GDGY

SEQ ID NO.78 GIGY

SEQ ID NO.79 GSGY

SEQ ID NO.80 GQNY

SEQ ID NO.81 GQYY

SEQ ID NO.82 GQLY

SEQ ID NO.8 3 GQFY

SEQ ID NO.84 GQGW

SEQ ID NO.8 5 YESIKHEPENPPPYEE

SEQ ID NO.86 WQGY

SEQ ID NO.87 GAGY

SEQ ID NO.88 GLGY

SEQ ID NO.8 9 GVGY

SEQ ID NO.90 GQWY

SEQ ID NO. 91

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII RYIAD KHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN GDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP PKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAVASAVQPSLSPLEAS SVNYESVKHEPENPPPYEEAMNVSLKKVSGIKEEIKEPESIKAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPD FSNYSEMAKVEQPLPDHSEIVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKENLTETSFESMIEHENKL ERPHRD

SEQ ID NO. 92

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAII RYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLN GDHVTHPDFML YD ALDWL YMD PMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHP PKSDLEVLFQGPLGSKMDLVQTSEVMQESLYPAAQLCPSFEESEATPS PVLPDIVMEAPLNS AVPS AGASAV QPSSSPLEASSVNYESIIHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKE TKifS AEPTPDFSDYS EMAKVEQPVPDHS BLVEDSSPDSEPVDLFSDDSI PDVPQKQDE AVMLVKBMLPSTSF ESMIEHENKEKLSALPPEGGSSGRIVTD

SEQ ID NO. 93

MSPILGY WKIKGLVQ PTRLLLEYLEE KYSSHLYERDBODKWRNKKFELGLEFPMLPY YIDGDVKLTQSMAII RYIAD mNMl^CPKSRAEISMLÊGA^/LDIRYGVSRIAYSKDFETLfCVDFLSKLPEMLKffFBDRLCHKTYLN GDKVTHPSFMLYDALDVVL YitDPMCLDAF PKLVCFKKRtEAI PQIDKYLKS S KYI AWPLCJGtfQATFGGGDHP PKSDLEVLFQGPLG SVÇDSLCPVAQI^PSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLMSAVPS AGASAVQPSSSPLEAS SVNFESVKHEPEWPPPYSEAMNVSR KKVSGIKEEIKS PSSIKAAVOETEAPYISIACDLIKBTKLS AEPTPD FS SYSEMAKVSQPLPDKSELVEDSSPDSE PVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKE TLTETS FESMIEHEWKL ERPHRD

SSQ ID NO. 94

MS PILGYWKIKGLVQ PTRLLLE YLEE KYEEHL YERDBGDKWRHKKFELGLEF PNLPYYIDGQVKLTQSMAII RYIADKKKMLGGCPKER AEISKLEG AVLDIRYGVSRIAYS KDFETLKVDFLS KLPEMLKMFEDRLCHKTYLN GDHVTH PD FMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIE Al PQIDKYL KSS KYIAWPLCGWCATFGGGDHP PKSPLE VL FQGPLGSI QESLYPTAQiiCPS FESAEATPSPVLPDIVMEAP LMS LL P S AGAS WQ PSVS PLEAP PP VSYD SI KLEPENPPPYEEAl-INVALKaLGTKEG IKE PES FNAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSTEPSPD

fsnyseiakfeksvpehaelvedsspesbpvdlfsddsipevpqtqseavmlmkesltevsetvaqhkeerl

SEQ ID NO,95 DETFAL

seq id wo.96 elskts

Claims

1. Região variável de cadeia pesada, caracterizada pelo fato de que compreende uma terceira CDR consistindo essencialmente dos resíduos de aminoácido GQGY5 em que a CDR contém pelo menos uma substituição dentro da seqüência núcleo GQGY, as substituições sendo selecionadas das seguintes substituições: onde o G na primeira posição é substituído por R, I, W ou Μ; o Q na segunda é substituído por D, I, A, L, V ou S; o G na terceira posição é substituído por W, Ν, Y, S, L ou F; e o Y na quarta posição é substituído por W.

2. Região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que há uma única substituição na seqüência GQGY para dar uma das seguintes CDR H3: RQGY (SEQ ID NO.75), IQGY (SEQ ID NO.76), MQGY (SEQ ID NO.45), GDGY (SEQ ID NO.77), GIGY (SEQ ID N0.78), GSGY (SEQ ID NO.79), GQNY (SEQ ID N0.80), GQYY (SEQ ID NO.81), GQSY (SEQ ID NO.62), GQLY (SEQ ID NO.82), GQFY (SEQ ID NO.83), GQGW (SEQ ID NO.84), WQGY(SEQ ID NO.86), GAGY(SEQ ID NO.87), GLGY(SEQ ID NO.88), GVGY(SEQ ID NO.89), GQWY(SEQ ID N0.90).

3. Região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a CDR H3 é MQGY ou GQSY.

4. Região variável de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência SYWMH como CDR Hl (SEQ ID NO. 1) e NINPSNGGTNYNEKFKS como CDR H2 (SEQ ID NO.2).

5. Região variável de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada é uma seqüência humanizada.

6. Região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a seqüência de região variável de cadeia pesada de aceptor possui pelo menos 40% de identidade nas regiões de armação em relação à seqüência de região variável de cadeia pesada de anticorpo doador 2A10 dada em SEQ ID NO.7.

7. Região variável de cadeia pesada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a região variável de cadeia pesada possui uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO. 66 (região variável H98) ou SEQ ID NO. 61 (região variável H99), adicionalmente compreendendo um número de substituições em uma ou mais posições numéricas 38, 40, 67, 68, 70, 72, 74, e 79; na qual cada resíduo de aminoácido substituído é substituído pelo resíduo de aminoácido na posição equivalente em SEQID NO 7.

8. Região variável de cadeia pesada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de possuir a seqüência de aminoácidos dada em SEQ ID NO.47 (H26), SEQ ID N0.48 (H27), SEQ ID NO.49 (H28), SEQ ID NO. 63 (H100), SEQ ID NO. 54 (H101), SEQ ID NO. 65 (H102).

9. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser capaz de se ligar em NOGO-A de humano compreendendo a região variável de cadeia pesada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e uma região variável de cadeia leve.

10. Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender os seguintes pares de regiões variáveis de cadeias pesada e leve: H27L16 (SEQ ID NO.48 + SEQ ID NO. 14), H28L13 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO. 13), H28L16 (SEQ ID NO.49 + SEQ ID NO.14).

11. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes seqüências de cadeias leve e pesada H27FL L16FL (SEQ ID NO. 54 + SEQ ID NO. 18), H28FL L13FL (SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO.17), H28FL L16FL (SEQ ID NO. 55 + SEQ ID NO. 18).

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo anti-NOGO ou fragmento do mesmo compreendendo as regiões variáveis de cadeia pesada como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 ou os anticorpos ou fragmentos do mesmo de acordo com a reivindicações 9 a 11, junto com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

13. Uso de um anticorpo anti-NOGO ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou dos anticorpos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento ou profilaxia de derrame cerebral e de outros distúrbios/doenças neurológicas ou para o tratamento de um paciente sofrendo de um trauma mecânico no sistema nervoso central ou periférico.

14. Anticorpo ou fragmento do mesmo que é capaz de se ligar em uma região de proteína NOGO de humano consistindo do polipeptídeo seqüência de VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60), caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento do mesmo não é um anticorpo compreendendo um domínio pesado variável possuindo CDR H3 consistindo de resíduos de aminoácido GQGY ou análogos do mesmo possuindo uma substituição de aminoácido no mesmo.

15. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de codificar os polipeptídeos possuindo a seqüência mostrada em SEQ ID NOs. 47, 48, 49, -53, 54 ou 55.

16. Anticorpo ou fragmento do mesmo, que é capaz de se ligar em proteína NOGO de humano em um ensaio ELISA, no qual a ligação do anticorpo ou fragmento do mesmo, em proteína NOGO de humano é reduzida na presença de um peptídeo possuindo a seguinte seqüência VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO. 60), e não é reduzida na presença de um peptídeo irrelevante, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo não é um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada possuindo uma CDR H3 consistindo de resíduos de aminoácido GQGY ou análogos do mesmo possuindo uma substituição de aminoácido no mesmo.