MXPA01004598A - Secuencias de nucleotidos y proteinas de los genes nogo y metodos basados en estas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al gen nogo, sus productos proteicos codificados, asi como a los derivados y analogos de estos. Tambien se proporciona la produccion de las proteinas nogo, los derivados y anticuerpo. La invencion ademas se refiere a las composiciones terapeuticas y a los metodos de diagnostico y tratamiento.

Description

SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y PROTEÍNAS DE LOS GENES NOGO Y MÉTODOS BASADOS EN ESTAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional de Estados Unidos No. 60/107,446, presentada el 6 de noviembre de 1998, la cual se incorpora como referencia en su entereza en la presente. 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere al gen, JVogo y en particular a Nogo, sus productos proteínicos codificados, así como los derivados y análogos de éstos. También se proporciona la producción de las proteínas, derivados y anticuerpos de Nogo. La invención además se refiere a las composiciones terapéuticas y los métodos de diagnóstico y tratamiento. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el sistema nervioso central (CNS) de los vertebrados superiores, la regeneración de los axones después de lesión es casi ausente y limitada la plasticidad estructural. Los inhibidores del crecimiento asociados con la mielina del CNS probablemente desempeñan una función importante. Esto se evidenció por un anticuerpo monoclonal (mAb), IN-1, que neutraliza una proteína ielina, inhibidora potente del crecimiento de las neuritas o axones, favoreciendo por este medio la regeneración axonal de largo alcance y mejorando la plasticidad compensatoria después de lesiones de la médula espinal o el cerebro en ratas adultas. Algunas observaciones in vi tro e in vivo han manifestado un nuevo aspecto de la regulación del crecimiento de las neuritas, que es la presencia de señales y factores de repulsión e inhibición (Keynes y Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5: 75-82). Al parecer, la mayor parte de estas señales son proteínas o glucoproteínas . Un primer parte aguas hacia la identificación de los factores fue la purificación y clonación cDNA de una molécula que induce el colapso del cono de crecimiento proveniente de cerebro de pollo, Colapsina-1, ahora denominada Semaforina 3A. Un segundo grupo de indicios repulsivos recién purificados y clonados es ahora denominado efriñas. Estos son ligandos para la familia tirosina cinasa del receptor Eph. ?frin-A5 y Efrin-A2 se expresan como gradientes en el techo óptico del embrión de pollo, y su expresión ectópica o deleción causa errores de dirección de los axones retínales que crecen hacia adentro. Como las semaforinas, la familia efrin tiene 15 a 20 miembros, cada uno con expresión compleja y dinámica dentro y fuera del sistema nervioso. Las funciones de la mayoría de estas moléculas deben s ;r analizadas. Un tercer grupo de| indicios de dirección que pueden repeler el crecimiento de los axones y se expresa en el sistema nervioso en desarrollo son las netrinas . La netrina ha sido purjlficada como un quimioatrayente proveniente del piso ventral para los exones de la comisura en las médu] as espinales tempranas, como su ortólogo de C. elegarjs unc-6. Netrin-1 resultó tener efectos repulsivos para ciertos tipos de neuronas dependiendo del tipo de receptor presente en los conos de crecimiento neuronal elegidos (Tessier-Lavigne y col., 1996, Science 274: 1123 3-33) . Anteriormente, Car oni y Schwab (1998, J. Cell Biol. 106: 1281-1288) reportaron una actividad inhibitoria potente del crecimientc de las neuritas o axones asociada con los oligodendrocitfs y mielina del CNS en adulto. Un constituyente principa L es una proteína de membrana de peso molecular alto (NI-250, con un componente más pequeño, NI-35, en rdta) que en fechas recientes fue purificado, y el cual asta relacionado con el tema de la presente invención, y esta unido por el mAb, neutralizante, IN-1 ( anoni y Schwab, 1988, J. Cell. Biol. 106: 1281-1288 Patentes Estadounidenses Nos. 5,684,133; 5,250,414; Publicación PCT WO 93/00427).

Los inhibidores del crecimiento de las neuritas o exones asociados con mielina desempeñan una función importante en la prevención de la regeneración de los axones lesionados del CNS. Cuando se bloquea el desarrollo de los oligodendrocitos y la formación de mielina en pollos o ratas, se prolonga el periodo permisivo de regeneración después de las lesiones al CNS. En realidad, la formación de mielina coincide en el tiempo con el término del periodo de desarrollo donde el CNS muestra alta plasticidad estructural y un alto potencial para regeneración. Es muy probable que NI-250 y NI-35 sean los componentes principales de la inhibición del crecimiento asociada con mielina según se evidenció por la aplicación in vivo de IN-1 a la médula espinal de ratas adultas lesionadas que indujo regeneración de los axones corticoespinales sobre distancias prolongadas y permitió la recuperación funcional motora y conductual, en especial, con respecto a la locomoción. Experimentos similares en el nervio óptico y la ruta colinérgica del tabique hipocámpico también demostraron la relevancia in vivo del antígeno reconocido por IN-1, NI-35/250 (Schnell y Schwab, 1990, Nature 343: 269-272; Bregman y col., 1995, Nature 378: 498-501). Los sistemas de fibras no lesionadas también responden a la neutralización de los inhibidores del crecimiento de las neuritas mediante IN-1. Experimentos recientes han mostrado de manera concluyente que después de una lesión selectiva del tracto corticoespinal (piramidotomias) , fibras intactas retoñan a través de la línea media en la médula espinal y el tallo cerebral y establecen un modelo de innervación bilateral, acompañado por una recuperación conductal casi completa de los movimientos de precisión en presencia de IN-1 (Z'Graggen y col., 1998, J. Neuroscience 18 (12): 4744-4757). El aislamiento del gen que codifica la proteína inhibitoria del crecimiento de las neuritas proporciona múltiples oportunidades para desarrollar productos útiles en la regeneración neuronal y en el tratamiento de los diferentes trastornos neurológicos, incluido el tumor en el CNS. La mención de una referencia en lo anterior no debe ser considerado como una admisión de que tal referencia esta disponible como técnica anterior de la presente invención. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos de los genes Nogo ( Nogo humano, de rata y bovino y homólogos Nogo de otras especies) , y las secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas, así como los derivados (por ejemplo, fragmentos) y análogos de estos. Los ácidos nucleicos hidrolizables a o complementarios para las secuencias de nucleótidos antes mencionados también se proporcionan. En una modalidad específica, la proteína Nogo es una proteína de rata, bovino o humano. La invención también se refiere a un método para identificar genes que interactúan con Nogo. Nogo es un gen proporcionado por la presente invención, identificado por el método de la invención, que codifica e interactúa con las proteínas reguladoras del crecimiento neuronal. La invención también se refiere a los derivados Nogo y análogos de la invención que tienen actividad funcional, es decir, que son capaces de mostrar una o más actividades funcionales asociadas con una proteína Nogo que ocurre en la naturaleza. Por ejemplo, se ha identificado una región inhibidora importante entre los aminoácidos 542 a 722. Estas actividades funcionales incluyen, pero no están limitadas a, la inhibición del crecimiento de las neuritas de las células neurales, propagación y migración de los fibroblastos, o cualquier célula que presente crecimiento neoplásico, la capacidad para interactuar con o competir para la interacción con las proteínas reguladoras del crecimiento neural, antigenicidad que es la capacidad para unirse (o competir con Nogo para la unión) a un anticuerpo anti-Nogo, inmunogenicidad que es la capacidad para generar anticuerpos que se unan a Nogo. Estos anticuerpos tienen el potencial para inducir el crecimiento hacia afuera de las neuritas o prevenir el colapso de los conos del crecimiento de los ganglios radiculares dorsales inhibiendo la función de Nogo, y los fragmentos funcionales o derivados de Nogo, con la capacidad para inhibir la excrecencia de las neuritas la invención además se refiere a los fragmentos (y derivados y análogos de estos) de Nogo que comprenden uno o más dominios de una proteína Nogo como puede ser el aminc terminal rico en ácido y prolina (por ejemplo, en los aminoácidos 31 a 58 de la SEQ ID NO: 2), los carboxi terminales altamente conservados, y dos extensiones hidrofóbicas de 35 y 36 aminoácidos de longitud en Nodo de rata, y también el carboxi terminal (por ejemplo, en los aminoácidos 988 a 1023, y en los 1090 a 1125 de la SEQ ID NO: 2) . Además se proporcionan los anticuerpos para los diferentes Nogo, y los derivados y análogos de Nogo. En particular, como un ejemplo, se han derivado dos anticuerpos, el primer anticuerpo, denominado AS472, fue obtenido utilizando como inmunógeno un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 623 a 640 de la SEQ ID NO: 2, y el segundo anticuerpo, denominado AS Bruna, fue generado contra los aminoácidos 762 a 1163 carboxilo 5 terminales de la SEQ ID NO: 2 de Nogo. Los métodos de producción de las proteínas Nogo, los derivados y análogos, por ejemplo por medios recombinantes, también se proporcionan. ^^ La presente invención también se refiere a los 10 métodos terapéuticos y de diagnóstico y las composiciones a base de las proteínas Nogo y ácidos nucleicos. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, las proteínas Nogo y análogos y derivados (incluidos los fragmentos) de esta; los anticuerpos para 15 estas; los ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, los análogos, o derivados; y las ribozimas Nogo, y los ácidos nucleicos antisentido Nogo. ^fc La presente invención también se refiere a los métodos terapéuticos y de diagnóstico y las composiciones 20 a base de proteínas y ácidos nucleicos Nogo y anticuerpos anti-Nogo. La invención proporciona el tratamiento del CNS y tumores neurales administrando compuestos que favorecen la actividad Nogo (por ejemplo, las proteínas Nogo y los análogos funcionalmente activos y derivados 25 que incluyen fragmentos de estos; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos o derivados, agonistas de Nogo) . La invención también proporciona el tratamiento de las enfermedades, padecimientos o daños que finalmente 5 dan origen a daño del sistema nervioso; tales enfermedades, trastornos o daño incluyen, pero no se limitan a, trauma del sistema nervioso central (CNS) , (lesiones de la médula espinal o del cerebro) , infarto, —^ infección, malignidad, exposición a compuestos tóxicos, 10 deficiencias nutricionales, síndromes paraneoplásicos y enfermedades nerviosas degenerativas (incluido, pero no se limita a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica y parálisis supranuclear 15 progresiva) , administrando los compuestos que interfieren con la actividad de Nogo (por ejemplo, un derivado Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos A) nucleicos antisentido de Nogo; ribozimas como Nogo o grupos químicos que se unan a un sitio activo de Nogo) . 20 Los modelos animales, métodos de diagnóstico y métodos de detección para la predisposición a los trastornos, y los métodos para identificar y evaluar los agonistas y antagonistas de Nogo, también se proporcionan por la invención. 25 3.1 DEFINICIONES Cuando se utiliza en la presente, subrayado o en itálicas el nombre del gen debe indicar el gen, contrario a su producto proteína codificada que esta indicado por el nombre del gen en ausencia de subrayado o itálicas. Por ejemplo, "Nogo" debe significar el gen Nogo mientras que, "Nogo" debe indicar el producto proteínico del Nogo . 4. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras la-Ib: (a) clones de cDNA de Nogo: CWP1-3 es un clon de cDNA de bovino aislado de la detección de una biblioteca de cDNA de materia blanca de la médula espinal de bovino con oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (combinados) y MSC9. El RNA complementario proveniente de este clon fue utilizado para la detección subsiguiente de la biblioteca de cDNA de rata. Olí 3 y Oli 18 son aislados de una biblioteca de oligodendrocitos de rata cebados con oligo d(T). R1-3U21, R018U1 y R018U37-3 son aislados de una biblioteca de tallo cerebral/médula espinal (Stratagene) de rata cebada con hexanucleótidos.

Las posiciones de las seis secuencias de péptidos NI220 (bNI220) de bovino están indicadas en CWP1-3 y R13U21.

Las secuencias en las uniones de los diferentes exones están marcadas en la parte superior de cada clon. Las marcas de interrogación indicadas en R018U1 identifican la secuencia en este clon la cual no coincide con las secuencias de cualquiera de los otros clones Nogo . R018U37-3 fue secuenciado solo desde el extremo 5' , y la porción no secuenciada esta representada por puntos, (b) Demostración esquemática del mecanismo hipotético para la generación de tres transcritos de Nogo. Pl y P2 representan la ubicación putativa de los promotores alternativos. Se requiere un número mínimo de tres exones para generar los tres transcritos como se muestra en el esquema, aunque cada exon podría dividirse potencialmente en exones múltiples. Figuras 2a-2b: (a) Nucleótido (SEQ ID NO: 1) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) del transcrito A de Nogo (secuencia generada conectando las secuencias del cDNA R018U37-3, olil8 y R1-3U21) . Ovalo: codón de iniciación supuesto; subrayado con puntos: extensión acida; D : sitios PKC potenciales; ?: sitios potenciales de caseína cinasa II; subrayado grueso: regiones hidrofóbicas carboxilo terminales y dominios transmembranales potenciales; subrayado delgado: sitios potenciales para N-glucosilación. (b) Comparación de las secuencias de péptidos entre NI220 (bNI220; SEQ ID NOS: 3-8) de bovino, purificada, secuenciada y las secuencias de bovino (SEQ ID NOS: 9-14) y de rata (SEQ ID NOS: 15-20) correspondientes traducidas a partir de los cDNA de rata y bovino. Las secuencias de aminoácidos de rata y bovino, que no coinciden con las secuencias peptídicas bNI220, están en minúsculas. Figuras 3a-3b: (a) Comparación de las secuencias de aminoácidos de las 180 regiones aminoácidas comunes carboxilo terminales de NSP (humano; SEQ ID NO: 21), S-REX (rata) (SEQ ID NO: 22) CHS-REX (pollo; SEQ ID NO: 23), NOGOBOV (bovino; SEQ ID NO: 24), NOGORAT (rata; SEQ ID NO: 25), un clon EST de C. elegans (W06A7A; SEQ ID NO: 26), y un clon EST de D. melanogaster (US51048; SEQ ID NO: 27). (b) Conservación evolucionaría de dos regiones hidrofóbicas. Se muestran los porcentajes de similitudes dentro y a través de las especies de las regiones hidrofóbicas comunes. Letras sombreadas: aminoácidos conservados. Figuras 4a-4c: (a) Hibridación Northern de diferentes tejidos con la sonda común Nogo . La sonda común contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 2583-4678. ON, nervio óptico; SC, médula espinal; C, corteza cerebral; DRG, ganglios de la raíz dorsal; SN, nervio sciático; PC12, línea celular PC12. (b) Hibridación Northern de los NRA de la médula espinal y células PC12 con una sonda específica del exon 1 (lado izquierdo) y de los RNA del rombencéfalo (HB)y del músculo esquelético (M) con una sonda específica del exon 2 (lado derecno) . (c) Hibridación Northern con la sonda común Nogo. K, riñon; B, cartílago (de tórax); Sk, piel; M, músculo esquelético; Lu, pulmón; Li, hígado; Sp, bazo, los tres transcritos principales están marcados (4.6 kilobases (kb), 2.6 kb y 1.7 kb) . ?: una banda difusa pero consistente de aproximadamente 1.3 kb de tamaño. Figuras 5a-5f: Hibridación in situ de secciones de médula espinal y cerebelo de rata adulta (a,d) filas de oligodendrocitos (OL) en la médula espinal y materia blanca del cerebelo, respectivamente, pueden observarse marcadas por la ribosonda "común" antisentido Nogo. Esto es muy semejante a las señales detectadas cuando se híbrido una sección de médula espinal consecutiva a una ribosonda plop antisentido (b) . (c) Las neuronas en la materia gris (GM) también fueron marcadas por la ribosonda "común" antisentido de Nogo. WM: materia gris. Campo brillante y vista fluorescente, respectivamente, de una sección de cerebelo con doble marca con la radiosonda "común" antisentido de Nogo (e) y de un anticuerpo anti-GFAP (f) . Las células de Purkinje (doble cabeza de flecha) están fuertemente marcadas con la sonda de Nogo, mientras que los astrocitos (cabezas de flecha, negra y blanca) son negativos. Algunas células en la capa de células granulares (Gr) también están marcadas con la sonda Nogo, m: capa molecular. Barra de escala: a, b, d-f : 50 p.m. ; c: 280 p.m. Figuras 6a-6i: Hibridación in situ de los nervios ópticos en diferentes días posteriores al nacimiento (a,f: PO; b,g; P3; c,h: P7; d,e,i: P22) con sondas Nogo o pip (antisentido o sentido) . (a-d) sonda antisentido de Nogo; (e) sonda sentido de Nogo; (g-i) sonda antisentido pip; (f) sonda sentido pip. La expresión de Nogo en los precursores oligodendrocitos puede ser detectada tan pronto como PO, mientras que la expresión de pip solo comenzó a ser detectable en los nervios ópticos P3 cercanos al quiasma (g) . Figura 7: AS Bruna y AS 472 reconocen una proteína mielina de aproximadamente 200 kD. El extracto de mielina de rata y la combinación Q de bovino fueron preparados de acuerdo con Spillman y col., 1998, J. Biol Chem. 273 (30): 19283-19293. AS Bruna y AS 472 cada uno reconoció una banda de 200 kD así como varias bandas inferiores en mielina de bovino, que pueden ser productos de degradación de bNl220. AS Bruna tiñó una banda de 200 kD en mielina de rata. I: AS Bruna; P: AS Bruna, suero preinmune; E: AS 472 purificado por afinidad. Figuras 8a-8i: Inmunohistoquímica sobre la médula espinal y cerebelo de rata utilizando IN-1 (a-e) , AS Bruna (d-f) y AS 472 (g-i) , como se indicó a la izquierda de cada imagen. Se observó fuerte tinción de mielina en ambos tejidos con todos los tres anticuerpos cuando las secciones congeladas fueron fijadas con etanol/ácido acético (a, b, d, e, g, h) . el tratamiento de las secciones con metanol eliminó la tinción de mielina excepto para los cuerpos celulares oligodendrocitos (flechas; c,f,i). Cabezas de flechas: células de Purkinje, WM, materia blanca; GM, materia gris, DR: raíz dorsal; Gr, capa de células granulares; m, capa molecular. Barra de la escala: a,d,g: 415 µ; b,c,e,f,h,i: 143 µ. Figuras 9a-9d: Actividad neutralizante de AS 472 y AS Bruna en diferentes bioensayos. (a) los fibroblastos NIH 3T3 fueron plaqueados sobre placas de cultivo celular revestidas con q-pool y pretratadas con IN-1, AS Bruna, AS 472 o los sueros preimunes correspondientes. Ambos sueros policlonales mostraron incluso una neutralización ligeramente mejor del sustrato inhibitorio en comparación con IN-1. Los sueros preinmunes no tuvieron efecto significativo sobre la propagación de las células NIH 3T3. La visión de un exceso de péptido (P472) que se utilizó para aumentar AS 472 compitió con la actividad neutralizante, mientras que un péptido no específico (Px) no tuvo efecto, (b) el tratamiento previo del s-ustrato inhibidor con AS Bruna o AS 472 dio origen a una excrecencia de neuritas DRG comparable con la que se observo en un sustrato de laminina. Los ejemplos para la excrecencia de neurita a partir de DRG en q-pool pretratado con PBS (c; registro = 0) y pretratadas con AS Bruna (d; registro = 4). Figuras lOa-lOd: La inyección de explantes de nervio óptico con AS 472 originó crecimiento hacia adentro de los axones. (a) pares de nervios ópticos de rata adulta fueron disecados, inyectados con AS 472 o suero preinmune y colocados en cultivos de cámara de modo que un extremo de los nervios estuvo en contacto con neuronas DRG de rata PO disociadas, (b) después de 2 semanas in vi tro, secciones EM de los nervios fueron tomadas a 3.5 mm a partir del sitio de corte (flechas en A) y detectadas de manera sistemática para axones intactos (tres experimentos) . (c) haces de axones regenerados (flechas) crecen a través del nervio óptico inyectado con AS 472 con degeneración. (d) los axones en regeneración en contacto con mielina. Amplificación c r 12,000x; d, 35,000x. Figuras lla-llc: Expresión de Nogo A recombinante en células COS transfectadas (a) Western blot mostrando la inmuno-reactividad de AS Bruna para Nogo A recombinante (banda 2) y Nogo A endógeno de oligodendrocitos de rata cultivados, primarios (banda 3) . Las movilidades de estas dos proteínas son casi idénticas a aproximadamente 200 kD en un gel SDS desnaturalizante al 5%. Una muestra transfectada de la construcción LacZ control (banda 2) mostró ninguna inmuno-reactividad, con AS Bruna. La misma mancha también fue sondeada con anticuerpo anti-myc, 9E10, como se indica. La banda que reaccionó con AS Bruna también reaccionó con el anticuerpo etiqueta anti-myc, 9E10 (banda 5) , mientras que no fue así con Nogo A endógeno (banda 6) . La muestra de transfección control LacZ mostró la banda esperada en aproximadamente 118 kD (banda 4). Las células COS transfectadas de manera transitoria con una construcción Nogo A fueron doblemente teñidas con AS Bruna (b) y IN-1 (c) . Las células con tinción positiva con AS Bruna fueron también positivas con IN-1. Figura 12: La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 28) de cDNA de Nogo de bovino. Figura 13: La secuencia de aminoácidos de Nogo A de rata (SEQ ID NO: 2) alineada con la secuencia de aminoácidos teórica de Nogo humano (SEQ ID NO: 30) . La secuencia de aminoácidos de Nogo humana fue obtenida de la alineación de etiquetas de secuencia expresada (EST) para la secuencia Nogo de rata y traduciendo las EST humanas alineadas utilizando la Nogo de rata como una plantilla guía. Figura 14: Secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 31) de Nogo C de rata y su secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 32) . Figura 15a-15e: Nogo A esta presente sobre la membrana plasmática del oligodendrocito, según se 5 demostró por inmunocitoquímica y biotinilización de la superficie celular de los oligodendrocitos en cultivo. Inmunocitoquímica (a-d) : Oligodendrocitos de nervios ópticos de ratas PÍO fueron disociados y cultivados durante 2 días. La tinción de las células vivas con mAb 10 IN-1 (a) o AS 472 (c) mostró inmuno-reactividad sobre los cuerpos celulares de los oligodendrocitos y los procesos.

En presencia del péptido competente P472, AS 472 mostró solo marcado de fondo (todos los tipos de células) (d) .

Tinción no específica similar . se observó cuando los 15 anticuerpos primarios fueron omitidos (b) . Evaluación: las placas codificadas con números fueron combinadas al azar y clasificadas por tres observadores independientes. 8/10 placas fueron clasificadas correctamente AS 472 positivas, positivas para mAb IN-1 o controles por todos 20 los tres observadores. Biotinilación (e) : Cultivos de cerebros completos P4 de rata enriquecidos en oligodendrocitos fueron biotilinados en la superficie celular con un reactivo impermeable a la membrana después de 7 días en cultivo. 25 Después, los homogenados celulares fueron tratados con estreptavidina-Dynabeads . El precipitado (Ppt) y el sobrenadante (sup) fueron ensayados con AS 472. Estos mostraron un patrón de proteína distintos: Nogo A de la superficie celular encontrado en el precipitado mostró un mayor peso molecular aparente en comparación con Nogo A intracelular. Este desplazamiento es probablemente debido a la glucosilación. La proteína ER luminal BiP y la gran mayoría de ß-tubulina solo pudieron ser encontrados en la fracción intracelular. Figura 16a-16j : Los ensayos funcionales muestran la presencia de Nogo A sobre la membrana celular de los oligodendrocitos. La pre-incubación de los cultivos de nervio óptico con AS 472 (a,b) permitió que los fibroblastos NIH 3T3 se propagaran sobre los oligodendrocitos altamente ramificados que están delineados por tinción inmunofluorescente por GalC (anticuerpo 01) (a) . Las flechas en la imagen de contraste de fases correspondiente (b) indican los fibroblastos NIH 3T3 propagándose sobre la parte superior de los oligodendrocitos. (c,d): cuando se adicionó AS 472 junto con p472, los fibroblastos NIH 3T3 evitaron estrictamente los territorios de los oligodendrocitos GalC positivos (cabezas de flechas) (Caroni y Schwab, 1988, Neuron 1: 85-96). (e,f): En presencia de AS 472, las neuronas DRG disociadas de rata PO pudieron extender las neuritas sobre el territorio de los oligodendrocitos altamente ramificados (flechas en f) . (g,h): El péptido P472 compitió de manera eficaz con la actividad neutralizante de AS 472: las neuritas evitaron completamente los oligodendrocitos. ?l AS 472 que se utilizó en estos experimentos fue generado contra la secuencia del péptido 472 de rata. (i,j): La cuantificación de estos resultados (como se describió en los métodos) demostró la fuerte actividad neutralizante de AS 472 en ambos tipos de ensayos. Barra de escala: 40 µ. Figura 17a, 17e: Nogo A recombinante es un sustrato inhibidor y su actividad inhibidora se neutraliza por mAb, IN-1. Extractos enriquecidos con RecNogo A provenientes de una línea celular CHO-Nogo A, o ß-galactosidasa, aislados en paralelo de la línea celular CHO-LacZ estable, fueron recubiertos para los ensayos de propagación de los fibroblastos NIH 3T3 y la excrecencia de las neuritas DRG. (a) Gel de plata de recLacZ etiquetado con myc-his (banda 1) y recNogo A (banda 2) muestra la banda de Nogo A a 180 kD. La identidad de la banda de Nogo A fue confirmada por Western blot incubado con AS Bruna (banda 3) y un anticuerpo anti-myc 9E10 (banda 4). (b) Las placas recubiertas con RecNogo A fueron claramente inhibitorias para la propagación de NIH 3T3. La preincubación con el mAb IN-1 o AS Bruna dio origen a una neutralización altamente significativa (p< 0.01) de la actividad inhibitoria. El mAb 01 IgM control y el suero preinmune fueron ineficaces. El extracto CHO-LacZ tuvo un efecto inhibidor parcial sobre las células NIH 3T3, tal vez debido a las proteínas CHO endógenas. Esta actividad inhibitoria no fue influida por la preincubación con anticuerpos. (c) Para los ensayos de la excrecencia de neuritas DRG, el mismo material proteína como en (b) fue mezclado con laminina y revestido. El RecNogo A tuvo un efecto inhibidor muy potente sobre la excrecencia de las neuritas de DRG disociado en una forma dependiente de la dosis. La actividad fue neutralizada por mAb IN-1 (p< 0.001), pero no por el mAb 01 control. El material proteína aislado de células CHO-LacZ no fue inhibidor en ninguna de las concentraciones que se utilizaron, ni la incubación con los anticuerpos tuvo ningún efecto sobre la excrecencia de las neuritas. Los ejemplos de los registros se muestran en (d) : 1 µg de RecNogo A, ningún registro o registros cortos de neuritas (flechas) : 2, y en (e) : 1 µg de CHO-LacZ, registro de neuritas largas, ramificadas (cabezas de flecha): 5-6. Se realizó el análisis estadístico con la prueba t de Student de dos colas. Barra déla escala: 280 µ.

Figura 18: Análisis funcional de los mutantes por deleción de Nogo. Las siguientes construcciones por deleción que codifican proteínas de fusión conteniendo los fragmentos de Nogo o porciones truncadas de Nogo (como se lista más adelante) fueron generadas como se describe en la sección 6.2.7 más adelante. Nogo-A: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq.aal-1162 Nogo-B: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171 + 975-1162 Nogo-C: His-tag/T7-tagNogo-C N-terminus (11 aa) + Nogo- A seq. aa 975-1162 NiAext: His-tagT7-tagvectorNogo-A seq. aal-974/T7-tag NiR: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171/vector NiG His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa L72-974/His-tag EST His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 760-1162 NiG-Dl His-tag/T7-tagNogo-A seq. aal 72-908/vector NÍG-D2 His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-866/His-tag NÍG-D3 His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 172-723His-tag NÍG-D4 His-tagT7-tagNogo-A seq. aa 172-646/vector NÍG-D5 His-tagT7-tag/Nogo-A seq. aa 291-646His-tag NÍG-D7 His-tag?7-tagNogo-A seq. aa 172-234 + 292-974/His-tag NÍG-D8 His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-628 NÍG-D9 His-tag/T7-iag/Nogo-A seq. aa 172-259 + 646-974/His-tag NiG-DlO His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 2 1-974/His-tag NiG-DH His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 172-259 NiG-Dl 5 His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 172-189 + 491-974His-tag NÍG-D16 His-tagp*7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 619-974His-tag NiG-Dl 7: His-tagT7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 257-974/His-tag NiG-Dl 8 His-tag/T7-tagNogo-A seq. aa 172-189 + 261- 74/His-tag NÍG-D20 His-tagT7-tag/Nogo-A seq. aa 542-722/Hts-tag Los números de los aminoácidos (aa) se basan en la numeración de la secuencia de aminoácidos para Nogo A (SEQ ID NO: 2) comenzando con la primera metionina. La His-tag y T7-tag consisten en 34 aminoácidos. Las secuencias vectores N y C terminales provienen del vector de expresión pET28. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos de los genes Nogo, y las secuencias de aminoácidos de sus proteínas codificadas. La invención además se refiere a los fragmentos y otros derivados y análogos de las proteínas Nogo. Los ácidos nucleicos que codifican estos fragmentos o los derivados también están dentro del alcance ' de la invención. La invención proporciona los genes Nogo y sus proteínas codificadas de múltiples especies diferentes. Los genes Nogo de la invención incluyen Nogo humano, de rata y bovino y genes relacionados (homólogos) de otras especies. Las subsecuencias de bovino descritas en Spillman y col., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19283-19293, no se reclaman como parte de la presente invención. En las modalidades específicas, los genes Nogo y las proteínas son de vertebrados, o más específicamente, de mamíferos. En una modalidad preferida de la invención, los genes Nogo y las proteínas son de origen humano. La producción de las proteínas antes mencionadas y sus derivados, por ejemplo, por los métodos recombinantes también se proporcionan. El gen Nogo como se proporciona por la presente invención, comprende moléculas de ácido nucleico que codifican tres isoformas de Nogo; a saber, Nogo A, Nogo B y Nogo C. La referencia al gen "Nogo" debe incluir moléculas de ácido nucleico que codifiquen para las tres isoformas a menos que se especifique de otro modo. De la misma manera, la referencia a la proteína Nogo debe incluir todas las tres isoformas de Nogo a menos que se especifique de otro modo. Las proteínas Nogo de la invención pueden prevenir la regeneración de las neuronas en la médula espinal o el cerebro (es decir, propiedades del sustrato no permisivas) , inhiben la excrecencia de las neuritas en los ganglios radiculares dorsales, inducen el colapso de los conos del crecimiento de los ganglios radiculares dorsales, bloquean la propagación de las células NIH 3T3, bloquean la excrecencia de las neuritas PC12, etcétera. Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de estas están libres de todo el material mielina del sistema nervioso central; en particular, estas están libres de todo el material mielina del sistema nervioso central con el cual la proteína Nogo esta asociada de manera natural.

Este material puede incluir otras proteínas mielina, lípidos y carbohidratos del CNS. Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de éstas de la invención también de preferencia están libres de los reactivos que se utilizan en la purificación de las muestras biológicas, como los detergentes. En una modalidad específica, la invención proporciona las proteínas Nogo reccmbinantes, fragmentos y derivados de éstas como se preparan por los métodos conocidos en la técnica, como puede ser la expresión del gen Nogo en una célula genéticamente manipulada. La invención también se refiere a los derivados y análogos de Nogo de la invención que tienen actividad funcional, es decir, que son capaces de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociada con una proteína Nogo (tipo silvestre) de longitud completa. Estas actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a la capacidad para interactuar (o competir para la unión) con proteínas reguladoras del crecimiento neural, antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con Nogo para la unión) a un anticuerpo anti-Nogo] , inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos que se una a Nogo) , prevención de la regeneración de neuronas en la médula espinal o cerebro, confiriendo a un sustrato la propiedad de limitar el crecimiento, propagación y migración de las células neurales, y las células neoplásicas, inhibiendo la excrecencia de las neuritas de los ganglios radiculares dorsales, incluidos el colapso de los conos de crecimiento de los ganglios radiculares dorsales, bloqueando la propagación de las células NIH 3T3 in vi tro, el bloqueo de la excrecencia de las neuritas PC12, la restricción de la plasticidad neural, etcétera . La invención además de refiere a los fragmentos (y derivados y análogos de estos) de Nogo que comprenden uno o más dominios de la proteína Nogo. Los anticuerpos para Nogo, sus derivados y análogos también se proporcionan. La presente invención también se refiere a los métodos de tratamiento y diagnostico y las composiciones basadas en las proteínas Nogo y los ácidos nucleicos y anticuerpos anti-Nogo. La invención proporciona el tratamiento de los trastornos de las células u órganos regulado por el crecimiento mediante la administración de los compuestos que favorecen la actividad de Nogo (por ejemplo, las proteínas Nogo y los análogos y derivados funcionalmente activos (incluidos los fragmentos) de éstas; los ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, los análogos o derivados, agonistas de Nogo) . La invención también proporciona los métodos del tratamiento del daño o trastorno del sistema nervioso administrando los compuestos que antagonizan, o inhiben, la función de Nogo .(por ejemplo, los anticuerpos, los ácidos nucleicos antisentido de Nogo, los derivados antagonistas de Nogo) . La invención también proporciona los modelos animales, métodos de diagnostico y métodos de detección para la predisposición a los trastornos. Para claridad de la descripción, y no como limitación, la descripción detallada de . la invención se divide en las subsecciones siguientes. 5.1 AISLAMIENTO DE LOS GENES NOGO La invención se refiere a las secuencias de nucleótidos de los genes o ácidos nucleicos de Nogo. En una modalidad, los ácidos nucleicos de Nogo comprenden la secuencia de cDNA de rata de la Figura 2a (SEQ ID NO: 1) identificada como Nogo A como se representa en la Figura Ib, o las regiones codificadoras de estos, o las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína Nogo de 1163 aminoácidos de longitud o cualquier fragmento funcional o derivado de esta (por ejemplo, una proteína que tenga la secuencia de la SEQ ID NO: 2, como se muestra en la Figura 2a. En otra modalidad, los ácidos nucleicos de Nogo comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica Nogo B, mientras que la proteína Nogo 3 es equivalente a los 172 aminoácidos amino terminales fusionados a los 188 aminoácidos carboxilo terminales ?e Nogo A, dando origen a una proteína truncada de 360 aminoácidos. Los transcritos para Nogo B surgen como resultado del traslape o empalme alternativo que elimina la secuencia codificadora de nucleótidos intervinente. En todavía otra modalidad de la presente invención, los ácidos nucleicos Nogo comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican Nogo C, mientras que la proteína Nogo C contiene 11 aminoácidos en su amino terminal que no están presentes en Nogo A, y los 188 aminoácidos carboxilo terminales de Nogo A y B. La proteína Nogo C tiene 199 aminoácidos. El transcrito que codifica Nogo C es el resultado de la transcripción de un promotor Nogo alternativo. En todavía otra modalidad específica, la presente invención proporciona las secuencias de ácidos nucleicos de Nogo de bovino (SEQ ID NO: 128). En todavía otra modalidad específica, la invención presente proporciona las secuencias de nucleótidos que codifican Nogo humano, y los fragmentos de las proteínas Nogo humanas, incluidos los equivalentes humanos para Nogo A, Nogo B y Nogo C de rata. La secuencia de ácidos nucleicos de Nogo humano se esclarecen utilizando el transcrito de Nogo A como una plantilla y empalmado entre sí las etiquetas de la secuencia expresada, humana (EST) para revelar una secuencia de nucleótidos continua. Las secuencias de aminoácidos de rata y bovino de Nogo también proporcionan información sobre el marco de lectura traduccional adecuado para que se deduzca una secuencia de aminoácidos de Nogo humana. La presente invención también proporciona las secuencias de aminoácidos de los fragmentos del gen Nogo humano. La invención también proporciona los ácidos nucleicos purificados que consisten en cuando menos 8 nucleótidos (es decir, una porción que puede hibridarse) de una secuencia de Nogo; en otras modalidades, los ácidos nucleicos consisten en cuando menos 25 nucleótidos (continuos) , 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 150 nucleótidos, 20 nucleótidos, 500 nucleótidos, 700 nucleótidos u 800 nucleótidos de una secuencia Nogo, o una secuencia codificadora de Nogo de longitud completa. En otra modalidad, los ácidos nucleicos son más pequeños de 35200 ó 500 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios . La invención también se refiere a los ácidos nucleicos que pueden hibridar a o que son complementarios para las secuencias antes mencionadas. En los aspectos específicos, se proporcionan los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia complementaria a cuando menos 20, 25, 50, 100 ó 200 nucleótidos o toda la región codificadora de un gen Nogo . En una modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que puede hibridar a un ácido nucleico Nogo (por ejemplo, que tenga la secuencia SEQ ID NO: 2; Figura 2a), o a un ácido nucleico que codifique para un derivado de Nogo, bajo condiciones de poca severidad. Por ejemplo, y no como limitación, los procedimientos que se utilizan en tales condiciones de poca severidad son como sigue: (véase también Shilo y Weinberg, 1981, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 78: 6789-6792): Filtros que contienen DNA son pretratados durante 6 horas a 40°C en una solución que contenga 35% de formamida, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 5 mM, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA y 500 µg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se realizan en la misma solución con las siguientes modificaciones: 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 µg/ml de DNA de esperma de salmón, 10% (p/v) sulfato de dextrano y 5-20 X 166 cpm de la sonda marcada son 32P. Los filtros se incuban en una mezcla para hibridación durante 18-20 horas a 40°C, y luego se lavan durante 1.5 horas a 55°C en una solución que contenga 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM y 0.1% SDS. La solución de lavado sustituye con una solución fresca y se incuba 1.5 horas adicionales a 60°C. Los filtros se secan con filtro y se exponen para auto-radiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68°C y se vuelven a exponer a la película. Otras condiciones de baja severidad que pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, como se emplean para hibridaciones de especies cruzadas como se muestra en el ejemplo en la Sección 6.1.1). En otra modalidad específica, un ácido nucleico que puede hibridar a un ácido nucleico Nogo bajo condiciones de alta severidad también se proporciona. Por ejemplo y no como limitación, los procedimientos que se utilizan con tales condiciones de alta severidad son como sigue: la prehibridación de los filtros que contienen DNA se realiza durante 8 horas hasta durante la noche a 65°C en solución amortiguadora compuesta de 6 XSSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, PVP 0.02%, Ficoll 0.02%, BSA 0.02% y 50 µg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65°C en una mezcla de prehibridación conteniendo 100 µg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada con 32P. El lavado de los filtros se realiza a 37 °C durante una hora en una solución que contiene 2X SSC, 0.01% de PVP, 0.01% de Ficoll y 0.01% BSA. Esto es seguido por un lavado en 0.1X SSC a 50°C durante 45 minutos antes de la auto-radiografía. Otras condiciones de alta severidad que pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica. En otra modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que puede hibridar a un ácido nucleico Nogo bajo condiciones de severidad moderada. Por ejemplo, pero no como limitación, los procedimientos que utilizan tales condiciones de severidad moderada son como sigue: los filtros contiene DNA son pretratados durante 6 horas a 55°C en una solución que contiene 6X SSC, 5X de una solución de Denhart, 0.5% SDS y 100 µg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución y se utiliza 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada con 32P. Los filtros se incuban en la mezcla para hibridación durante 18-20 horas a 55°C, y luego se lavan dos veces durante 30 minutos a 60°C en una solución que contiene IX SSC y 0.1% SDS. Los filtros se secan con filtro y se exponen para auto-radiografía. Otras condiciones de severidad moderada que pueden utilizarse son bien conocidas en la técnica. El lavado de los filtros se realiza a 37 °C durante una hora en una solución que contenga 2X SSC, 0.1% SDS. Estas condiciones de severidad o restrictivas son convenientes para aislar moléculas de ácido nucleico que contengan las secuencias del gen Nogo en otras especies, por ejemplo, utilizando los clones de cDNA de Nogo de rata o bovino como sonda para aislar el cDNA de Nogo humana. Varias etiquetas de secuencia expresadas (EST) humanas reportadas en las bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos publicadas muestran un alto grado de identidad de secuencias cuando se comparan con los segmentos de las secuencias del gen Nogo de la invención. La siguiente lista preliminar de las EST humanas fueron identificadas y se mencionan con sus números de acceso en Genbank: AA158636 (SEQ ID NO: 35), AA333267 (SEQ ID NO: 36), AA081783 (SEQ ID NO: 37), AA167765 (SEQ ID NO: 38), AA322918 (SEQ ID NO: 39), AA092565 (SEQ ID NO: 40), AA081525 (SEQ ID NO: 41) y AA081840 (SEQ ID NO: 42) utilizando ENTREZ Nucleotide Query. Antes de la presente invención, ninguna de las EST antes identificadas habían sido caracterizadas con respecto a las secuencias de aminoácidos que estas EST pueden codificar in vivo. Nada se conocía sobre la función de las proteínas que contienen las secuencias de aminoácidos pronosticadas de las EST humanas. Además, una EST, como puede ser la AA158636, en alineamiento con el extremo 5' del cDNA de Nogo de rata y otra EST, como puede ser la AA081840,en alineamiento con el extremo 3' del cDNA de rata, no están superpuestas y no se podría percibir como parte de la misma secuencia de cDNñ humane. Con base en las secuencias del gen Nogo de la presente invención, se considera que estas EST humanas representan porciones del gen Nogo humano que se expresan en el tejido a partir del cual se obtienen las EST. Por consiguiente, la presente invención comprende las moléculas de ácido nucleico que contienen dos o más de las EST humanas antes identificadas. Las EST pueden expresarse en el mismo tejido humano, o en diferentes tejidos humanos. De preferencia, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden las secuencias de nucleótidos de cuando menos dos EST humanas que no estén superpuestas entre sí, o que no se superpongan a una tercera o más EST humanas . El vista de que las EST humanas antes identificadas ahora están definidas como fragmentos del gen Nogo humano debido a la clonación de los ácidos nucleicos Nogo de bovino y rata, se contempla que las EST humanas tengan funciones similares con relación a otras moléculas de ácidos nucleicos de Nogo en diferentes métodos de la invención, como puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, la expresión de los polipéptidos Nogo humanos, los ensayos de hibridación y la inhibición de la expresión de Nogo como moléculas de ácidos nucleicos antisentido, etcétera.

Además, la presente invención proporciona e incluye la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana, y los fragmentos de esta. Como se muestra en la Figura 13, la secuencia de aminoácidos de la proteína Nogo de rata (Figura 2a; SEQ ID NO: 2) está alineada con la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana (Figura 13; SEQ ID NO: 30) . En consecuencia, la presente invención comprende las proteínas Nogo humanas que comprenden la secuencia de aminoácidos pronosticada de Nogo humana, la Figura 13 y SEQ ID NO: 30, o una subsecuencia de la secuencia de aminoácidos pronosticada de Nogo humana, que consiste en cuando menos 6 residuos de aminoácido, o una o más de las secuencias de aminoácidos pronosticadas siguientes de los fragmentos Nogo humanos: MEDLDQSPLVSSS (Nogo humana, correspondiente a los aminoácidos 1-13 con la SEQ ID NO: 43) , KIMDLKEQPGNTISAG (Nogo humana, correspondiente a los aminoácidos 187-203 con la SEQ ID NO: 44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (Nogo humana, correspondiente a los aminoácidos 340-358 con la SEQ ID NO: 45), QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (Nogo humana, correspondiente a los aminoácidos 570-619 con la SEQ ID NO: 46) . Nogo humana como ocurre en la naturaleza y Nogo humana recombinante, y fragmentos de éstas teniendo la secuencia de aminoácidos prácticamente similar a las secuencias de aminoácidos antes descritas y que puedan unirse por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo están dentro del alcance de la invención. La presente invención además proporciona las moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína Nogo humana teniendo una secuencia de aminoácidos substancialmente similar a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 13 (Figura 13; SEQ ID NO: 30). En las modalidades específicas, las moléculas de ácido nucleico que codifican los fragmentos de la proteína Nogo humana teniendo una secuencia de aminoácidos prácticamente similar a la secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30) también están contempladas con la condición de que tales moléculas de ácidos nucleicos no contengan la secuencia de aminoácidos de las EST humanas antes identificadas . Se considera que una secuencia de aminoácidos es substancialmente similar a la secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína Nogo humana cuando más de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 97% de los residuos de aminoácidos en las dos moléculas son idénticos cuando se utiliza un algoritmo de cómputo en el que el alineamiento se realiza por medio de un programa de homología de cómputo conocido en la técnica, por ejemplo, se utiliza una búsqueda por cómputo BLAST (Altschul y col., 1994, Nature Genet. 6:119-129). Como un ejemplo y no como limitación, los programas de cómputo útiles para homología incluyen los siguientes: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul y col., 1990, J. of Molec. Biol. 215: 403-410 "The BLAST Algorithm; Altschul y col., 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402) un algoritmo de búsqueda heurístico diseñado para buscar similitudes de secuencias que ascribe importancia utilizando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul 1990, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87: 2264-68; 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Cinco programas BLAST específicos realizan las siguientes actividades: 1) El programa BLASTP compara una secuencia consultada de aminoácidos contra una base de datos de secuencias de proteína. 2) El programa BLASTN compara una secuencia de nucleótidos de consulta contra una base de datos de las secuencias de nucleótidos. 3) El programa BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleótidos consultada (ambas hebras) contra una base de datos de las secuencias de proteínas. 4) El programa TBLASTN compara una secuencia de proteína consultada contra una base de datos de las secuencias de nucleótidos traducida en todos los seis marcos de lectura (ambas hebras) . 5) El programa TBLASTX compara las traducciones de los seis marcos de una secuencia de nucleótidos consultada contra las traducciones de los seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. Como lo entenderán los expertos en la técnica, el programa TBLASTN es particularmente útil para identificar los ácidos nucleicos con un porcentaje de identidad deseado y el programa BLASTP es particularmente útil para identificar secuencias de aminoácidos con un porcentaje de identidad deseado. El algoritmo de Smith-Waterman (base de datos: European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/) (Smith-Waterman 1981, J. of Molec. Biol., 147: 195-1997) es un algoritmo matemático riguroso para los alineamientos de las secuencias. FASTA (véase Pearson y col., 1988, Proc. Nat'l Acadc Sci. USA, 85: 2444-2448) es una aproximación heurística al algoritmo de Smith-Waterman. Para una descripción general del procedimiento y los beneficios de los algoritmos BLAST, Smith-Waterman y FASTA, véase Nicholas y col., 1998, "A tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods" (www.psc.edu) y las referencias mencionadas en ésta. Los usos de las secuencias de aminoácidos pronosticadas de Nogo humana, o las secuencias de nucleótidos de las EST humanas, incluidas las secuencias 5 degeneradas que codifican la secuencia de aminoácidos pronosticada de Nogo humana, para aislar o identificar el gen Nogo humano, los fragmentos, mutantes naturales y variantes de éste, están dentro del alcance de la —^ invención. Tales usos que serán conocidos para el experto 10 en la técnica incluyen pero no se limitan a, utilizar la información para preparar sondas de ácido nucleico para detectar la biblioteca de DNA, amplificación del DNA, detección genética de la población humana y para preparar péptidos sintéticos para elaborar anticuerpos. La 15 descripción detallada de algunos de estos usos se proporciona en la presente en las secciones posteriores. Los ácidos nucleicos que codifican los derivados y k análogos de las proteínas Nogo, y los ácidos nucleicos antisentido de Nogo también se proporcionan. Como es bien 20 evidente, cuando se utiliza en la presente, un "ácido nucleico que codifica un fragmento o porción de una proteína Nogo" debe ser considerado referente a un ácido nucleico que codifica solo el fragmento o porción mencionado de la proteína Nogo y no otras porciones 25 adyacentes de la proteína Nogo como una secuencia continua. En este contexto, una porción significa uno o más aminoácidos. También se proporcionan los fragmentos de los ácidos nucleicos Nogo que comprenden regiones conservadas entre (con homología para) otros ácidos nucleicos Nogo, de especies iguales o diferentes. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más dominios Nogo se proporcionan en la Figura 2a, por ejemplo, el dominio carboxilo terminal conservado de Nogo de rata, que tiene aproximadamente 180 aminoácidos, y esta codificado por los últimos 540 nucleótidos de la secuencia codificadora anterior al codón antisentido. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de dos dominios hidrofóbicos dentro del dominio carboxilo terminal conservado, es decir, desde los aminoácidos 988 a 1023, y desde los aminoácidos 1090 hasta 1125, en Nogo A de rata, también se proporcionan. También se proporciona las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del dominio ácido amino terminal de Nogo A de rata, de los residuos 31 hasta 58. Para realizar un análisis funcional de las diferentes regiones de Nogo, se ha generado y clonado una serie de deleciones en el gen Nogo en un vector de expresión por las técnicas de DNA recombinante y se han expresado como proteínas de fusión. Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican un fragmento de una proteína Nogo, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoáciaos 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974 ó 975-1162 de la SEQ ID NO: 2, o combinaciones de estos; y los ácidos 5 nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos 1- 131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 y 940- 1127 de la SEQ ID NO: 30, o combinaciones de estos. Algunas de las construcciones por deleción contienen ^^ porciones truncadas de Nogo y las secuencias de 10 nucleótidos adicionales que codifican la etiqueta hexahistidina y/o una etiqueta T7. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo truncadas que carecen de residuos de aminoácidos 172-259, de los residuos aminoácidos 974-1162 o de los residuos de aminoácidos 15 172-259 y 974-1162, de la SEQ ID NO: 2, pero de otro modo contienen el resto de la SEQ ID NO: 2; o los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 fl o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30, pero de otro modo contienen el resto de la 20 SEQ ID NO: 30, también se proporcionan. En la Figura 18 se muestra la estructura de las construcciones por deleción ejemplares. Las construcciones por deleción producen fragmentos o porción (es) truncadas de Nogo cuando se introducen en una célula. Las actividades 25 biológicas de estos mutantes fueron probados en diferentes ensayos funcionales como se describe en la Tabla 2, Sección 6.2.7. • Las modalidades específicas para la clonación de un gen Nogo, presentado como un ejemplo específico pero no 5 como limitación, son las siguientes: Para clonar la expresión (un método conocido en la técnica) , se construye una biblioteca de expresión por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se ^^ aisla mRNA, (por ejemplo, humano) , se prepara y liga el 10 cDNA en un vector de expresión (por ejemplo, derivado de bacteriófago) de modo que se pueda expresar en la célula hospedadora en la cual entonces se introduce. Entonces se pueden utilizar los diferentes ensayos de detección para seleccionar el producto Nogo expresado. En una modalidad, 15 es posible utilizar los anticuerpos anti-Nogo para la selección. En otra modalidad, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencia deseada en un genoma o biblioteca de cDNA, antes de la 20 selección. Es posible utilizar como iniciadores en la PCR iniciadores o cebadores oligonucleótidos que representen las secuencias Nogo conocidas. En un aspecto preferido, los iniciadores oligonucleótidos representan cuando menos parte de los segmentos conservados de Nogo de fuerte 25 homología entre Nogo de diferentes especies. Es posible utilizar oligonucleótidos sintéticos como iniciadores para amplificar mediante las secuencias de la PCR a • partir de una fuente (RNA o DNA) , de preferencia una biblioteca de cDNA, de interés potencial. Se puede llevar 5 a cabo la PCR utilizando un ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus y Taq polimerasa (Gen Amp™) . El DNA que se esta amplificando puede incluir mRNA ó cDNA ó DNA genómico de cualquiera de las especies eucarióticas. Es posible ^^ elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes 10 para uso en las reacciones de la PCR. También es posible modificar la severidad de las condiciones de hibridación que se utilizan en el inicio de las reacciones de la PCR, para permitir grados mayores o menores de similitud de secuencias de nucleótidos entre la secuencia de 15 nucleótidos de Nogo conocida y el homólogo del ácido nucleico que se está aislando. Para hibridación de especies cruzadas se prefieren condiciones de baja severidad. Para hibridación entre las mismas especies se prefieren condiciones de severidad moderadas. 20 Después de amplificar con buenos resultados un segmento de un homólogo de Nogo, este segmento puede ser clonado y secuenciado como molécula, y utilizado como una sonda para aislar un cDNA completo o clon genómico. Este, a su vez permitirá la determinación de la secuencia de 25 nucleótidos completa del gen, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteína para el análisis funcional, como se describe infra . De este modo, es • posible identificar genes adicionales que codifiquen las proteínas Nogo y los análogos de Nogo. 5 No se debe entender que los métodos anteriores limitan la siguiente descripción general de los métodos mediante los cuales pueden obtenerse los ciónos de Nogo . Cualquier célula eucariótica potencialmente puede ^^ servir como la fuente de ácidos nucleicos para la 10 clonación molecular del gen Nogo . Las secuencias de aminoácidos que codifican Nogo pueden ser aisladas a partir de fuentes de vertebrados, .mamíferos, humanos, porcinas, murinas, bovino, felino, aviaria, equino, canino, así como fuentes de primates adicionales, 15 insectos, etc. El DNA puede ser obtenido por los procedimientos normales conocidos en la técnica a partir de DNA clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de DNA) , por síntesis química, por clonación de cDNA o por la clonación del DNA genómico o fragmentos de este, 20 purificado a partir de las células deseadas. (Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA cloning: A Pratical Approach, MRL 25 Press, Ltd. Oxford, R. U. vol. I, II.) Los clones provenientes del DNA genómico pueden contener regiones de DNA reguladoras e intron además de las regiones codificadoras; los clones provenientes del cDNA contendrán solo las secuencias exon. Cualquiera que sea la fuente, el gen debe ser clonado como molécula en un vector conveniente para la propagación del gen. Durante la clonación molecular del gen a partir de DNA genómico, los fragmentos de DNA se generan, algunos de los cuales codificará el gen deseado. El DNA puede ser disociado en sitios específicos utilizando algunas enzimas restrictivas. De otro modo, es posible utilizar DNAsa en presencia de manganeso para fragmentar el DNA, o el DNA puede ser cortado físicamente, por ejemplo, por sonificación. Los fragmentos lineales de DNA entonces pueden separarse de acuerdo con el tamaño por las técnicas normales, que incluyen pero no se limitan a, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna. Una vez que se generan los fragmentos de DNA, es posible llevar a cabo en diferentes formas la identificación del fragmento de DNA específico que contiene el gen deseado. Por ejemplo, si una cantidad de una porción de un gen Nogo (de cualquier especie) o su RNA específico, o un fragmento de este (véase la Sección 6.1.1) esta disponible y puede ser purificado y etiquetado, los fragmentos de DNA que se generan pueden ser detectados por hibridación del ácido nucleico para sonda marcada (Benton, W. y Davis. R. , 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. y Hogness, D., 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961). Hibridarán aquellos fragmentos de DNA con homología substancial a la sonda. También es posible identificar el fragmento adecuado por digestión (es) con enzimas restrictivas y la comparación de los tamaños de los fragmentos con los que se esperan de acuerdo con el mapa de restricción conocido si se tiene a la disposición. Es posible realizar otra selección con base en las propiedades del gen. De otro modo es posible detectar la presencia del gen mediante los ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los clones de cDNA o los clones de DNA que seleccionan por hibridación los mRNA adecuados puede ser seleccionados para que produzcan una proteína que, por ejemplo, tenga comportamiento con enfoque isoeléctrico, de migración electroforética similar o idéntica, mapas de digestión proteolítica, modificaciones post-traduccionales, propiedades acidas o básicas o propiedades antigénicas como se conocen para Nogo. Los anticuerpos para Nogo están a la disposición, como IN-1 e IN-2 (Patente Estadounidense No. 5,684,133), AS Bruna y AS 472. La preparación de AS Bruna y AS 472 está descrita en la Sección 6.1.7. La proteína Nogo puede ser identificada uniendo el anticuerpo rr.arcado a los clones para sintetizar Nogo de manera putativa, en un procedimiento tipo ELISA (ensayo inmunosorbente con enzimas ligadas) o por Western blot de extractos celulares purificados o completos. También es posible identificar el gen Nogo mediante selección de mRna por hibridación del ácido nucleico seguido por traducción in vi tro. Er. este procedimiento, se utilizan los fragmentos para aislar los mRNA complementarios por hibridación. Tales fragmentos de DNA pueden representar DNA de Nogo disponible, purificado de otras especies (por ejemplo, de ratón, humano) . El análisis por inmunoprecipitació o los ensayos funcionales (por ejemplo, la capacidad de agregación in vi tro) ; la unión al receptor; véase infra de los productos de la traducción in vi tro de los productos aislados de los mRNA aislados identifica el mRNA y, por tanto, los fragmentos de DNA complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además, los mRNA específicos pueden ser seleccionados por adsorción de polisomas aislados de células para anticuerpos inmovilizados específicamente dirigidos contra la proteína Nogo. Es posible sintetizar cDNA de Nogo radiomarcado utilizando el mRNA seleccionado (de los polisomas absorbidos) como una plantilla. El mRNA ó cDNA radiomarcados entonces pueden utilizarse como una sonda para identificar los fragmentos de DNA Nogo de entre 5 otros fragmentos de DNA genómico. Las alternativas para aislar el DNA genómico de Nogo incluyen, pero no se limitan a, sintetizar químicamente la propia secuencia génica a partir de una secuencia ^^ conocida, o preparar cDNA para el mRNA que codifica la 10 proteína Nogo. Por ejemplo, el RNA para clonar cDNA del gen Nogo puede ser aislado de células que expresen Nogo. Son posibles otros métodos y están dentro del alcance de la invención. El gen identificado y aislado entonces puede 15 insertarse en un vector de clonación adecuado. Es posible utilizar un gran número de sistemas vector-hospedero conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector puede ser compatible con la célula 20 hospedadora que se utiliza. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos como los derivados lambda o plásmidos como pBR322 o los derivados plásmidos pUS o el vector Bluescript (Stratagene) . En un ejemplo específico, la proteína Nogo se clona en pcDNA 3 con 25 etiquetas epítope para el análisis simplificado de la expresión de la proteína (Sección 6.1.10). La inserción en un vector de clonación puede, por ejemplo, llevarse a cabo ligando el fragmento de DNA en un vector donador que tenga términos cohesivos 5 complementarios. No obstante, si los sitios de restricción complementarios que se utilizan para fragmentar el DNA no están presentes en el vector de clonación, los términos de las moléculas de DNA pueden modificarse de manera enzimática. De otro modo, es 10 posible producir cualquier sitio deseado ligando las secuencias de nucleótidos (ligadoras) sobre las terminales del DNA; estos ligadores ligados pueden consistir en oligonucleótidos sintetizados por medios químicos específicos que codifiquen las secuencias de 15 reconocimiento de la endonucleasa restrictiva. En un método alternativo, el vector disociado y el gen Nogo pueden ser modificados mediante una cola homopolimérica. Es posible introducir las moléculas recombinantes en las células hospedadoras por transformación, transfección, 20 infección, electroporación, de modo que sea posible generar múltiples copias de la secuencia génica. En un método alternativo, el gen deseado puede ser identificado y aislado después de la inserción en un vector de clonación conveniente en un método de 25 "disparo". El enriquecimiento para el gen deseado, por ejemplo, por fraccionación de tamaño, puede realizarse antes de la inserción en el vector de clonación. En las modalidades específicas, la transformación de las células hospedadoras con moléculas de DNA recombinante que incorporan el gen Nogo aislado, cDNA, o la secuencia de DNA sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Así pues, el gen puede ser obtenido en grandes cantidades haciendo crecer los transformantes, aislando las moléculas de DNA recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperar el gen insertado del DNA recombinante aislado. Las secuencias Nogo proporcionadas por la invención presente incluyen aquellas secuencias de nucleótidos que codifican substancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que se encuentran en las proteínas Nogo, y aquellas secuencias de aminoácidos codificadas con aminoácidos funcionalmente equivalentes, así como aquellos que codifican otros derivados o análogos de Nogo, como se describe en las Secciones 6.2.1 y 6.2.2 infra para los derivados y análogos de Nogo. 5.2 EXPRESIÓN DE LOS GENES NOGO La secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína Nogo o un análogo o fragmento funcionalmente activo u otro derivado de ésta (véase las Figuras lb y 2a; Secciones 6.2.1 y 6.2.2), puede ser insertada en un • vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y 5 traducción de la secuencia que codifica la proteína, insertada. Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también pueden ser suministradas por el gen Nogo nativo y/o sus regiones flanqueadoras. La secuencia __ codificadora también puede estar etiquetada con una 10 secuencia que codifique para un antígeno o molécula biológica bien descrita que tenga propiedades de unión conocidas a una contraparte de unión (por ejemplo, la etiqueta epítope myc, la etiqueta histidina, la etiqueta epítope T7, etc., véase la Sección 6.2.6 y la Figura 11a- 15 11c) . Esta secuencia adicional puede entonces ser explotada para purificar la proteína Nogo, el fragmento de la proteína, o un derivado utilizando la interacción del grupo de unión con su contraparte correspondiente; la cual se une a una matriz sólida. 20 Se puede utilizar una variedad de sistemas hospedador-vector para expresar la secuencia codificadora de la proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a, sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, el virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas 25 de células de insecto infectadas con el virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos como vectores de levadura conteniendo levadura, o bacterias transformadas • con bacteriófago, DNA, DNA plásmido o DNA cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus 5 intensidades y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector que se utiliza, es posible utilizar cualquier número de elementos de transcripción y traducción convenientes. En las modalidades específicas, ^^ se expresa el gen Nogo humano, o una secuencia que 10 codifique una porción funcionalmente activa de Nogo humano, como un ejemplo específico, se expresa Nogo A, Nogo B ó Nogo C (Figura lb) . En otra modalidad, se expresa un fragmento de Nogo que contiene un dominio de la proteína Nogo. 15 Cuando se utiliza en la presente, una célula se "transforma" con un ácido nucleico . cuando tal célula contiene un ácido nucleico que no esta presente en forma natural en la célula, después de la introducción del ácido nucleico en la célula o su antecesor, por ejemplo, 20 por transfección, electroporación, transducción, etcétera. Las secuencias de nucleótidos que codifican los fragmentos de Nogo A humana comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los 25 residuos aminoácidos 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 y 940-1127 de la SEQ ID NO: 30 también se proporcionan. Las secuencias de nucleótidos que codifican porciones truncadas de Nogo A humana también se proporcionan; las proteínas truncadas carecen de los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30, pero de otro modo contiene el resto de la SEQ ID NO: 30. Es posible utilizar cualquiera de los métodos anteriormente descritos para la inserción de los fragmentos de DNA en un vector para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control de transcripción/traducción adecuadas y las secuencias codificadoras de la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante in vi tro y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética) . La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Nogo o fragmento péptido puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína o péptido Nogo se exprese en un hospedero transformado con la molécula de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína Nogo puede ser controlada mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Una modalidad ejemplar es utilizar uno de los promotores naturales de Noso, Pl ó P2, como se describe en la Sección 6.2.1. También es posible utilizar un promotor no • nativo. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión Nogo, incluyen, pero no se limitan 5 a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y col., y col., 1980, Cell 22: 787-797), el ^^ promotor timidina cinasa herpético (Wagner y col,, 1981, 10 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster y col., 1982, Nature 296: 39-42) ; vectores de expresión procarióticos como el promotor ß-lactamasa (Villa- Kamaroff, y col., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 15 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, y col., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific ^ American, 1980, 242: 74-94; los vectores de expresión de plantas que contienen la región promotora nopalina 20 sintetasa (Herrera-Estrella y col., Nature 303: 209-213) o el promotor 35S RNA del virus de mosaico de coliflor (Gardner, y col., 1981, Nucí. Acids. Res. 9: 2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella, y col., 1984, Nature 310: 25 115-120) ; los elementos promotores de levadura u otros hongos como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa) , el promotor PGK (fosfoglicerol cinasa) , el promotor fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional en animales, que presentan especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift y col, , 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz y col., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); la región de control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), la región control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl y col., 1984, Cell 38: 647-658; Adames y col., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), la región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en mastocitos y linfocitos testiculares, de mama (Leder y col., 1986, Cell 45: 485-495), la región de control del gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert y col., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), la región de control del gen alfa-fetoproteína que es activa en hígado (Krumlauf y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer y col., 1987, Science 235: 53-58); la región de control del gen alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey y col., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), la región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram y col., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias y col., 1986, Cell 46: 89-94); la región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocitos en el cerebro (Readhead y col., 1987, Cell 48: 703-712); la región de control del gen de las dos cadenas ligeras de miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 313: 283-286), y la región de control del gen de la hormona liberadora gonadrotópica que es activa en el hipotálamo (Masón y col., 1986, Science 234: 1272-1378).

En una modalidad específica, se utiliza un vector que contenga un promotor ligado de manera operante a un ácido nucleico que codifique Nogo, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores selectivos (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos) . En una modalidad específica, una construcción de expresión se prepara subclonando una secuencia codificadora de Nogo en el sitio de restricción EcoRi de cada uno de los tres vectores pGEX (los vectores de expresión glutathion S-transferasa; Smith y Jonson, 1988, Gene 7: 31-40). Esto permite que la expresión del producto de la proteína Nogo se subclone en el marco de lectura correcto. Los vectores de expresión que contienen los insertos del gen Nogo pueden ser identificados por tres procedimientos generales: (a) hibridación del ácido nucleico, (b) la presencia o ausencia de las funciones del gen "marcador" y (c) la expresión de las secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen Nogo insertado en un vector de expresión puede detectarse por la hibridación del ácido nucleico utilizando sondas que contengan secuencias que sean homologas a un gen Nogo insertado. En el segundo enfoque, se puede identificar el sistema vector/hospedador recombinante y seleccionarse con base en la presencia o ausencia de las funciones de un cierto gen "marcador" (por ejemplo, la actividad timidina cinasa, la resistencia a los antibióticos, el fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causadas por la inserción del gen Nogo en el vector. Por ejemplo, si se inserta el gen Nogo dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contengan el inserto Nogo pueden ser identificados por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer método, los vectores de expresión recombinantes pueden ser identificados ensayando el producto Nogo expresado por el recombinante. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína Nogo en sistemas de ensayos in vi tro, por ejemplo, la unión con el anticuerpo anti-Nogo. Una vez que se identifica y aisla una molécula de DNA recombinante particular, es posible utilizar algunos de los métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se establece el sistema hospedador y las condiciones de crecimiento convenientes, es posible propagar y preparar en cantidad los vectores de expresión recombinantes. Como se explicó en lo anterior, los vectores de expresión que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales como el virus de vaccinia o adenovirus; virus de insecto como baculovirus; vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda) , y los vectores DNA plásmido y cósmido, por mencionar solo algunos. Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Es posible elevar la expresión de ciertos promotores en presencia de ciertos inductores; así pues, se puede controlar la expresión de la proteína Nogo genéticamente manipulada. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento traduccional y post-traduccional y la modificación (por ejemplo, glucosilación, fosforilación de proteínas) . Las líneas de células y sistemas hospedadores adecuados pueden ser elegidos para garantizar la modificación y procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano puede utilizarse para producir un producto proteína núcleo no glucosilada. La expresión en levadura producirá un producto glucosilado. La expresión en células de mamífero puede utilizarse para garantizar glucosilación "nativa" de una proteína heteróloga. Además, diferentes sistemas de expresión vector/hospedador pueden efectuar reacciones de procesamiento en diferentes magnitudes. En otras modalidades específicas, la proteína Nogo, fragmento, análogo o derivado puede expresarse como una fusión, o producto proteína quimérica (conteniendo la proteína, fragmento, análogo o derivado unido por un enlace peptídico a una secuencia de proteínas heteróloga (de una proteína diferente) ) . Tal producto quimérico puede prepararse ligando las secuencias de ácido nucleico adecuadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por los métodos conocidos en la técnica, en el marco codificador adecuado, y expresando el producto quimérico por los métodos comúnmente conocidos en la técnica. de otrc modo, un producto quimérico así puede prepararse mediante las técnicas sintéticas de proteínas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Tanto el cDNA como las secuencia genómicas pueden ser clonadas y expresadas. 5.3 IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS GÉNICOS NOGO En aspectos particulares, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos de I-logo, de preferencia Nogo humano, y los fragmentos y derivados de éste que contienen un dominante antigénico (es decir, puede ser reconocido por un anticuerpo) en el cual son de otro modo funcionalmente activos, así como secuencias de ácidos nucleicos que codifican lo antes mencionado. Un material Nogo "funcionalmente activo" cuando se utiliza en la presente se refiere a aquel material que muestra una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína de Nogo A total (tipo silvestre) , por ejemplo, propiedades de sustrato no permisivas, colapso de los conos de crecimiento del ganglio radicular dorsal, inhibición de la propagación de NIH 3T3, inhibición de la excrecencia de las neuritas, unión a un sustrato Nogo o contraparte de unión de Nogo, antigenicidad (unión a un anticuerpo anti-Nogo), inmunogenicidad, etcétera. En las modalidades específicas, la invención proporciona los fragmentos de una proteína Nogo que contiene cuando menos 6 aminoácidos, 10 aminoácidos, 17 aminoácidos, 50 aminoácidos, 100 aminoácidos o de cuando menos 220 aminoácidos. En otras modalidades, las proteínas contienen o consisten principalmente en el dominio carboxilo terminal de Nogo altamente conservado (188 aminoácidos carboxilo terminales de Nogo A). Los fragmentos, o proteínas que contienen los fragmentos, carentes del dominio carboxilo terminal conservado, o los tramos carboxilo terminales hidrofóbicos, o el dominio ácido amino terminal, o la región poli-prolina amino terminal o cualquier combinación de estos, de una proteína Nogo también se proporcionan. Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican lo antes mencionado. Una vez que se identifica un recombinante que expresa la secuencia del gen Nogo, es posible analizar el producto génico. Esto se lleva a cabo mediante ensayos a base de las propiedades físicas o funcionales del producto, que incluye el marcado radioactivo del producto seguido por análisis por electroforesis en gel, inmunoensayos, etcétera. Una vez que se identifica la proteína Nogo, esta puede ser aislada y purificada por los métodos normales que incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, por afinidad y de columna por tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquiera de las demás técnicas normales para la purificación de proteínas. Las propiedades funcionales pueden evaluarse utilizando cualquier ensayo adecuado que incluya el colapso del cono de crecimiento de los ganglios radiculares dorsales, inhibición de la propagación de NIH 3T3, inhibición de la regeneración de las neuritas en los nervios ópticos (véase las Secciones 6.2.4-6.2.5) . De otro modo, una vez que se identifica una proteína Nogo producida por un recombinante, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede ser deducida a partir de la secuencia de nucleótidos del gen quimérico contenido en el recombinante. Como resultado, es posible sintetizar la proteína por los métodos químicos normales conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hunkapiller, M., y col., 1984, Nature 310: 105-111). En otra modalidad alternativa, Nogo C nativo, puede ser purificado a partir de fuentes naturales, por los métodos normales como los descritos en lo anterior (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad) . En una modalidad específica de la presente invención, tales proteínas Nogo, bien sea producidas por las técnicas del DNA recombinante o por los métodos químicos sintéticos o por purificación de proteínas naturales, incluyen, pero no se limitan a, aquellas que contienen como una secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos prácticamente como se presenta en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2) , de bovino en la Figura 12 (SEQ ID NO: 29), o de humano en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30), así como fragmentos y otros derivados (como pueden ser, pero no se limitan a los representados en la Figura 18), y análogos de estos, incluidas las proteínas homologas a estas. De preferencia, las proteínas Nogo de la invención están libres de todo material mielina del CNS con el cual normalmente se asocian. 5.4. ESTRUCTURA DEL GEN NOGO Y LA PROTEINA La estructura del gen Nogo y la proteína pueden ser analizadas por los diferentes métodos conocidos en la técnica y algunos de estos métodos están descritos en las siguientes subsecciones. 5.4.1. ANÁLISIS GENÉTICO El DNA o cDNA clonado correspondiente al gen Nogo pueden ser analizados por los métodos que incluyen, pero no se limitan a, hibridación Southern (Southern, E. M. , 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517), hibridación Northern (véase, por ejemplo, Freeman y col., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 4094-4098), mapeo de las endonucleasas restrictivas (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) , y el análisis de la secuencia del DNA. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Patentes Estadounidenses Nos. 4,683,202, 4,683,195 y 4,889,818; Gyllenstein y col., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7652-7656; Ochman y col., 1988, Genetics 120: 621-623; Loh y col., 1989, Science 243: 217-220) seguida por hibridación Southern con una sonda específica de Nogo puede permitir la detección del gen Nogo en DNA de diferentes tipos de células. Los métodos de amplificación diferentes de la PCR son normalmente conocidos y también se pueden emplear. En una modalidad, se puede utilizar la hibridación Southern para determinar el ligamiento genético de Nogo. Se puede utilizar el análisis de hibridación Northern para determinar la expresión del gen Nogo . Los diferentes tipos de células, en diferentes estados de desarrollo o actividad pueden ser probados por expresión de Nogo. La severidad de las condiciones de hibridación para la hibridación Southern y Northern puede manipularse para garantizar la detección de los ácidos nucleicos con el grado de relación deseado para la sonda Nogo específica que se utilice. Es posible utilizar las modificaciones de estos métodos y otros métodos comúnmente conocidos en la técnica. El mapeo de la endonucleasa de restricción puede utilizarse para determinar aproximadamente la estructura genética del gen Nogo . Los mapas de restricción provenientes de la disociación de la endonucleasa de restricción pueden confirmarse por el análisis de la secuencia del DNA. El análisis de la secuencia del DNA puede realizarse por cualquiera de las técnicas conocidas, que incluyen pero no se limitan a el método de Maxam y Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65: 499-560), el método dideoxi de Sanger (Sanger, F., y col., 1977, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463) , el uso de T7 DNA polimerasa (Tabor y Richardson, Patente Estadounidense No. 4,795,699), o el uso de un secuenciador de DNA automatizado (por ejemplo, el Applied Biosystems, Foster City, CA) . 5.4.2 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS La secuencia de aminoácidos de la proteína Nogo puede obtenerse mediante la deducción de la secuencia de DNA, o de otro modo, por secuenciación directa de la proteína, por ejemplo, con un secuenciador de aminoácidos automatizado. La secuencia de la proteína Nogo además puede ser caracterizada por un análisis de hidrofilicidad (Hopp, T. y Woods, K., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3824). Se puede utilizar el perfil de hidrofilicidad para identificar las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de la proteína Nogo y las regiones correspondientes de la secuencia génica que codifica tales regiones. En segundo lugar, el análisis estructural (Chou, P. y Fasman, G., 1974, Biochemistry 13: 222) también puede realizarse para identificar regiones de Nogo que supongan estructuras secundarias específicas. La manipulación, traducción y predicción de la estructura secundaria, la predicción y graficado del marco de lectura abierto, así como la determinación de las homologías de las secuencias también pueden llevarse utilizando programas de cómputo disponibles en la técnica . También es posible emplear otros métodos de análisis estructural. Estos incluyen, pero no se limitan a, cristalografía de rayos X (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13) y modelado en cómputo (Fletterick, R. y Zoller, M (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) . 5.5 GENERACIÓN DE ANTICUERPOS PARA PROTEÍNAS NOGO Y DERIVADOS DE ESTAS De acuerdo con la invención, la proteína Nogo, sus fragmentos u otros derivados o análogos de estos, pueden utilizarse como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unan inmunoespecíficamente a tal inmunógeno. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y una biblioteca de expresión Fab. Se producen los anticuerpos dirigidos a un fragmento recombinante de Nogo de rata y bovino (Sección 6.1.7), estos anticuerpos también presentan reacción cruzada con epítopes de otras especies. En otra modalidad, los fragmentos de una proteína Nogo identificados como hidrofílicos se utilizan como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Es posible utilizar los diferentes procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales de una proteína Nogo o derivado o análogo. En una modalidad particular, es posible obtener anticuerpos policlonales de conejo para un epítope de una proteína Nogo codificada por una secuencia de SEQ ID NO: 2 en la Figura 2A, SEQ ID NO: 29 en la Figura 12, SEQ ID NO: 32 en la Figura 14 ó SEQ ID NO: 30 en la Figura 13, (Nogo A de rata, Nogo de bovino, Nogo C de rata o Nogo humana, respectivamente) o una subsecuencia de estas.

Para la producción del anticuerpo, diferentes animales hospedadores pueden ser inmunizados por inyección con una • proteína Nogo natural, o una versión sintética, o derivado (por ejemplo, un fragmento) de esta, que 5 incluye, pero no se limita a, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden utilizar diferentes coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras, e incluye pero no se limita a, ^-^ coadyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles 10 minerales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activada como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de molusco, dinitrofenol, y los coadyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo Calmette- 15 Guerin) y corynebacterium parvum. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una secuencia de la proteína Nogo o análogo de esta, es posible utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas anticuerpos 20 mediante líneas de células continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma originalmente desarrollada por Kohier y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) , así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y col., 1983, 25 Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y col., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) . Es posible producir los anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando la tecnología reciente (PCT/US90/02545) . De acuerdo con la invención, es posible utilizar anticuerpos humanos y pueden obtenerse utilizando hibridomas humanos (Cote y col., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026- 2030) o transformando células B humanas con virus EBV in vi tro (Colé y col., 1985, In Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96) . De hecho, de acuerdo con la invención, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger y col., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda y col., 1985, Nature 314: 452-454) empalmando los genes de una molécula anticuerpo de ratón específica para Nogo junto con los genes de una molécula anticuerpo humano de actividad biológica adecuada; tales anticuerpos están dentro del alcance de esta invención. De acuerdo con la invención, las técnicas descritas para producción de anticuerpos monocatenarios (Patente Estadounidense No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos monocatenarios específicos de Nogo. Las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab tarr.bién pueden utilizarse (Huse y col., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir una rápida y fácil identificación de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para las proteínas, derivados o análogos de Nogo. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula pueden ser generados por las técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: el fragmento F(ab')2 que puede ser producido por digestión con pepsina de la molécula anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden ser generados reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2, los fragmentos Fab que pueden ser generados tratando la molécula anticuerpo con papaína y un agente reductor, y los fragmentos Fv. En la producción de anticuerpos, la detección del anticuerpo deseado puede realizarse mediante las técnicas conocidas, por ejemplo ELISA (ensayo inmunosorbente de enzimas ligadas) . Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconozcan un dominio específico de una proteína Nogo, es posible ensayar los hibridomas generados para un producto que se una a un fragmento de Nogo, conteniendo tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se una específicamente a un primer homólogo de Nogo pero que no se una específicamente a un homólogo de Nogo diferente, es posible seleccionar con base en la unión específica del primer homólogo de Nogo y una falta de unión al segundo homólogo de Nogo. Los anticuerpos específicos para un dominio de una 5 proteína Nogo también se proporcionan. Los anticuerpos antes mencionados pueden utilizarse en los métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y actividad de las secuencias de la ^~ proteína Nogo de la invención, por ejemplo, para formar 10 imágenes de estas proteínas, medir las concentraciones de estas en muestras fisiológicas adecuadas, en métodos de diagnóstico, etcétera. Los anticuerpos anti-Nogo y los fragmentos de estos que contienen el dominio de unión son terapéuticos. 15 5.6 PROTEÍNAS NOGO, LOS DERIVADOS Y ANÁLOGOS La invención además se refiere a las proteínas Nogo, A y sus derivados (incluidos pero no limitados a los fragmentos) y los análogos de las proteínas Nogo. También 20 se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican los derivados de la proteína Nogo y los análogos de la proteína. En una modalidad, las proteínas Nogo se codifican mediante los ácidos nucleicos Nogo descritos en la Sección 5.1 supra . En los aspectos específicos, las 25 proteínas Nogo A, Nogo B ó Nogo C y los derivados o análogos son de animales, por ejemplo ratón, rata, cerdo, vaca, perro, mono, humano, mosca o ranas y están dentro del alcance de la invención. La producción y uso de los derivados y análogos relacionados con Nogo también están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad específica, el derivado o análogo es funcionalmente activo, es decir, es capaz de presentar una o más actividades funcionales asociadas con una proteína Nogo tipo silvestre, de longitud completa. Como un ejemplo, tales derivados o análogos que tienen la inmunogenicidad o antigenicidad deseada pueden utilizarse, por ejemplo, en inmunoensayos, para la inmunización, para la inhibición de la actividad de Nogo, etc. Los derivados o análogos que conservan, o de otro modo carecen o inhiben una propiedad Nogo deseada que interese (por ejemplo, la unión a una contraparte de unión de Nogo, pueden utilizarse como inductores, o inhibidores, respectivamente, de tal propiedad y sus correlativos fisiológicos. Una modalidad específica se refiere a un fragmento de Nogo que puede estar unido a un anticuerpo anti-Nogo. Los derivados o análogos de Nogo pueden ser probados para la actividad deseada mediante los procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a los ensayos descritos en las Secciones 6.1.10 a la 6.1.12.

Para mapear la(s) región (es) activa de Nogo, se ha preparado una serie de mutantes por deleción de Nogo mediante las técnicas del DNA recombinante como se describe en la Sección 6.2.7. Las porciones de Nogo que 5 están presentes en los mutantes por deleción se muestran en la Figura 18. En una modalidad específica, la invención proporciona los fragmentos de Nogo, por ejemplo, los fragmentos que tienen (o que de otro modo ^A consisten en) los números de los aminoácidos 1-171, 172- ^ 10 974, 259-542, 542-722, 722-974, 172-259 ó 975-1162 de Nogo A (SEQ ID NO: 2) o combinaciones de los anteriores. Los mutantes truncados de Nogo que carecen de los números de aminoácidos 172-259 y/o 975-1162 de la SEQ ID NO: 2 también se proporcionan, en vista de que estas regiones 15 parecen no ser esenciales y pueden ser eliminadas de Nogo sin afectar la actividad biológica. Los fragmentos correspondientes del Nogo A humana comprenden (o de otro modo consisten en) los números de los aminoácidos 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 ó 940-1127 de 20 la SEQ ID NO: 30 también se proporcionan. También se proporcionan los mutantes truncados de Nogo A humana que carecen de los números de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30. 25 En una modalidad específica, los fragmentos son libres de todo el material mielina del CNS y/o muestran actividad inhibitoria de Nogo. También se proporcionan las proteínas de fusión que comprenden uno o más de los fragmentos anteriores fusionados a una secuencia no Nogo. Los derivados del gen Nogo pueden prepararse alterando las secuencias Nogo mediante sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionen moléculas con funcionalidad equivalente. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de los nucleótidos, otras secuencias de DNA que codifiquen prácticamente la misma secuencia de aminoácidos como un gen Nogo pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. Estas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que contengan todos o porciones de los genes Nogo que estén alterados por la sustitución de diferentes codones que codifiquen un residuo de aminoácido con funcionalidad equivalente dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Del mismo modo, los derivados Nogo de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína Nogo que incluya secuencias alteradas en las cuales los residuos de aminoácidos con funcionalidad equivalente están sustituidos por residuos dentro de la secuencia que dan origen a un cambio silencioso. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia puede estar sustituido de manera conservativa por otro aminoácido de polaridad similar que actúe como un equivalente funcional, originando una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados de otras moléculas de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. En una modalidad específica de la invención, se proporcionan las proteínas que consisten en o que contienen un fragmento de una proteína Nogo que consiste en cuando menos 10 aminoácidos (continuos) de la proteína Nogo. En otras modalidades, el fragmento consiste en cuando menos 17 o 50 aminoácidos de la proteína Nogo. En las modalidades específicas, tales fragmentos no son mayores que 35, 100 ó 200 aminoácidos. Los derivados o análogos de Nogo incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas que comprenden regiones que son substancialmente homologas a Nogo o fragmentos de ésta (por ejemplo, en algunas modalidades, cuando menos 60% ó 70% u 80% ó 90% ó 95% de identidad sobre una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico o cuando se compara a una secuencia alineada en la que se realiza el alineamiento por un programa de cómputo para homología conocido en la técnica, por ejemplo, la búsqueda de cómputo BLAST (Altschul y col., 1994, Nature Genet. 6: 119-129)) o cuyo ácido nucleico codificador es capaz de hibridar a una secuencia Nogo codificadora bajo condiciones extremas, moderadamente extremas o no extremas. También se proporcionan las moléculas que comprenden los fragmentos Nogo, por ejemplo, que contienen enlaces hidrocarburo a otras porciones que incluyen marcas o porciones bioactivas. Los derivados y análogos de Nogo de la invención pueden ser producidos por diferentes métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan origen a su producción pueden ocurrir a nivel del gen o de la proteína. Por ejemplo, la secuencia del gen Nogo clonado puede ser modificada por cualquiera de las diversas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) .

La secuencia puede ser disociada en sitios adecuados con endonucleasa (s) de restricción seguida por otra modificación enzimática si se desea, puede ser aislada y ligada in vi tro . Durante la producción del gen que 5 codifica un derivado o análogo de Nogo, debe asegurarse que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura traduccional como Nogo, o interrumpido por señales antisentido traduccionales er. la región del gen donde se codifica la actividad de Noso. ^^ 10 Además, la secuencia del ácido nucleico que codifica Nogo puede ser mutada in vi tro o in vivo para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificantes y/o para formar nuevos sitios de la 15 endonucleasa de restricción o destruir las ya existentes, para facilitar además la modificación in vi tro . Es posible utilizar cualquiera de las técnicas para ^ mutagénesis ya conocidas, que incluyen pero no se limitan a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in 20 vi tro (Hutchinson, C, y col., 1978, J. Biol. Chem 253: 6551), el uso de ligadores TAB® (Pharmacia), etcétera. También es posible hacer las ranipulaciones de la secuencia Nogo a nivel de la proteína. Se incluyen dentro del alcance de la invención los fragmentos de la proteína 25 Nogo u otros derivados o análogos que estén modificados de manera diferente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por los grupos protectores/bloqueadores conocidos, disociación proteolítica, enlace a una molécula anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por las técnicas conocidas, que incluyen pero no se limitan a la disociación química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etcétera. Además, los análogos y derivados de Nogo pueden ser sintetizados químicamente. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una proteína Nogo que comprenda el dominio deseado o que medie la actividad deseada in vi tro, puede ser sintetizado mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, los aminoácidos no clásicos o los análogos aminoácidos químicos pueden ser producidos como una sustitución o adición en la secuencia Nogo. Los aminoácidos no tradicionales incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, ?-Abu, e-Ahx, ácido 6-aminohexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, • sarcosina, citrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, ß-alanina, 5 fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseñador cómo pueden ser los ß-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na- metil aminoácidos y los análogos aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) ó L (levorrotatorio) . ^ 10 En una modalidad especifica, el derivado Nogo es una proteína quimérica o de fusión, que comprende una proteína Nogo o fragmento de esta (de preferencia consistente en cuando menos un dominio o motivo de la proteína Nogo, o cuando menos 10 aminoácidos de la 15 proteína Nogo) unidos en sus amino o carboxilos terminales por un enlace peptídico a una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En una modalidad, tal proteína quimérica se produce por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la 20 proteína (comprendiendo una secuencia codificante de Nogo unida en marco a una secuencia codificante para una proteína diferente) . Un producto quimérico así puede prepararse ligando las secuencias de ácidos nucleicos adecuadas que codifiquen las secuencias de aminoácidos 25 deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco codificante adecuado, y expresando el producto quimérico por los métodos comúnmente conocidos en la técnica. De otro modo, tal producto quimérico puede prepararse por técnicas sintéticas de proteínas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Es posible construir genes quiméricos que contengan porciones de Nogo fusionadas a cualquiera de las secuencias que codifican proteínas heterólogas. Tales secuencias que codifican proteínas heterólogas incluyen, por ejemplo, la etiqueta hexahistidina y la etiqueta T7. Una modalidad específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de Nogo de cuando menos 6 aminoácidos. En otra modalidad específica, el derivado Nogo es una molécula que comprende una región de homología con una proteína Nogo. En una modalidad preferida, los derivados Nogo (por ejemplo, los fragmentos) son proteínas que no se encuentran en la naturaleza. Otras modalidades específicas de los derivados y análogos están descritas en la subsección siguiente y las secciones de los ejemplos infra . 5.6.1 DERIVADOS DE NOGO QUE CONTIENEN UNO O MAS DOMINIOS DE LA PROTEÍNA En una modalidad específica, la invención se refiere a los derivados y análogos de Nogo, en particular los fragmentos de Nogo y los derivados de estos fragmentos, que comprenden, o de otro modo consisten en, uno o más dominios de una proteína Nogo, que incluye pero no se limita a dominios carboxilo terminales e hidrofóbicos conservados o los dominios ácidos amino terminales o ricos en poliprolina, fragmentos funcionales (por ejemplo de unión) de cualquiera de los anteriores, o cualquier combinación de lo anterior. Una modalidad específica se refiere a las moléculas que contienen los fragmentos específicos de Nogo que son aquellos fragmentos en la proteína Nogo respectiva más homólogos para los fragmentos específicos de una proteína Nogo de rata o bovino. Un fragmento que comprende un dominio de un homólogo de Nogo puede ser identificado por métodos de análisis de proteínas como se describe en las Secciones 6.1.2, 6.1.8, 6.1.9, 6.1.10, 6.1.11 ó 6.1.12. En otra modalidad específica, se proporciona una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo pero que también carece de uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo. En otra modalidad, se proporciona una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo, y • que tiene uno o más dominios mutantes (por ejemplo, debido a mutación (es) por deleción o puntual) de una 5 proteína Nogo (por ejemplo, de modo que el dominio mutante tenga función disminuida) . 5.7 ENSAYOS DE PROTEÍNAS NOGO, SUS DERIVADOS Y ANÁLOGOS La actividad funcional de las proteínas Nogo, sus 10 derivados y análogos puede evaluarse por algunos métodos. La descripción de los ensayos funcionales en las siguientes secciones no se deben entender como limitantes, y pueden incluir otros ensayos conocidos para el trabajador experto. 15 5.7.1 ENSAYOS DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS NEURITAS IN VITRO CON NOGO En una modalidad específica, las proteínas Nogo, los derivados y análogos pueden ser valorados para la 20 inhibición de la propagación de NIH 3T3 o inhibición de la excrecencia o formación de tumor de las neuritas PC12 utilizando un cultivo tisular in vi tro (Sección 6.1.10). En una modalidad alternativa, las proteínas Nogo, los derivados y análogos pueden utilizarse para valorar 25 el colapso de los conos de crecimiento de los ganglios radiculares dorsales de pollo, explantados, inducido por la presencia de Nogo. Del mismo modo, es posible valorar la función de Nogo para la inhibición de la excrecencia de las neuritas de los ganglios radiculares dorsales de pollo explantados (Spillman y col., 1988 J. Biol. Chem. 273: 19283-19293). 5.7.2 ENSAYO DE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE NOGO IN VIVO En un ejemplo, los antagonistas de las proteínas, derivados y análogos • de Nogo pueden utilizarse para ensayos in vivo de la función utilizando un modelo animal para la regeneración del tracto corticoespinal (CST) sobre la recuperación de distancias prolongadas y el comportamiento. En una modalidad preferida, se daña el tracto corticoespinal de roedor mediante resección quirúrgica o contusión de la médula espinal, y se administran al animal los antagonistas de Nogo. Se supervisa la plasticidad neural, la regeneración y recuperación de la función, en comparación con animales control no tratados o animales tratados con anticuerpos control para la plasticidad estructural o la regeneración por las técnicas anatómicas, principalmente marcando las vías neurales definidas. Se mide la recuperación de la función por locomoción y por pruebas de habilidades por electrofisiología ejecutadas por el roedor (por ejemplo, la prueba del papel pegajoso, la actividad de alcanzar granulos de alimento, etc.) (Thallmair y col., 1988 Nat. Neuroscience 1(2): 124-131). 5.7.3 INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DEL LIGANDO NOGO Y ENSAYOS DE ÉSTA En una modalidad, para el ensayo de la capacidad para unir o competir con Nogo tipo silvestre para la unión a un anticuerpo anti-Nogo, es posible utilizar diversos inmunoensayos conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a los sistemas de ensayos competitivos y no competitivos utilizando las técnicas como los radioinmunoensayos ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas) , inmunoensayos "sandwich", ensayos inmuno-radiométricos, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in si tu (el uso de oro coloidal, enzimas o marcas radioisotópicas, por ejemplo), análisis Western blot, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayo de hemaglutinación) , ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de la proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una modalidad, la unión al anticuerpo se detecta detectando una marca en el anticuerpo primario. En otra modalidad, se detecta el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En otra modalidad, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen algunos medios para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad, cuando se identifica una proteína de unión a Nogo, la unión puede valorarse, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica. En otra modalid d, es posible valorar las correlaciones fisiológicas de la unión de Nogo a sus sustratos. Otros métodos serán conocidos para los expertos en la técnica y están dentro del alcance de la invención. 5.8 USOS TERAPÉUTICOS La invención ofrece el tratamiento o prevención de diversas enfermedades y trastornos mediante la administración de un compuesto terapéutico (en la presente invención denominado "terapéutico") . Tales "terapéuticos", incluyen pero no se limitan a: proteínas Nogo y análogos y derivados (incluidos los fragmentos) de estas (por ejemplo, como ya se describió) ; los anticuerpos para estas (como ya se describió) ; los ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, los análogos, o derivados (por ejemplo, como ya se describió) ; los ácidos nucleicos antisentido Nogo, y los agonistas y • antagonistas de Nogo. Los trastornos que incluyen el crecimiento celular desregulado, por ejemplo, tumores en 5 el CNS, se tratan o previenen mediante la administración de un terapéutico que favorece la función de Nogo. Los trastornos en los cuales hay deficiencia o se desea crecimiento, regeneración o mantenimiento de las neuritas se tratan mediante la administración terapéutico que 10 antagoniza (inhibe) la función de Nogo. Lo anterior esta descrito con detalle en las subsecciones siguientes. En general, se prefiere la administración de los productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de los anticuerpos) que sea la misma 15 especie que la del paciente. Así pues, en una modalidad preferida, una proteína Nogo humana, derivado o análogo, o ácido nucleico o un anticuerpo para una proteína Nogo humana, se. administra de manera terapéutica o profiláctica a un paciente humano. 20 5.8.1 TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE LOS TRASTORNOS QUE INVOLUCRAN LA DESREGULACIÓN DEL CRECIMIENTO CELULAR Los trastornos y enfermedades que involucran la desregulación del crecimiento celular se tratan o 25 previenen mediante la administración de un terapéutico que favorece (es decir, aumenta o suministra) la función de Nogo. Los ejemplos de tal terapéutico incluyen, pero no se limitan a, las proteínas Nogo, derivados o fragmentos que sean funcionalmente activos, en particular que sean activos en la inhibición de la extensión de las neuritas o la inhibición del crecimiento celular (por ejemplo, como se demuestra en los ensayos in vi tro o en modelos animales) , y los ácidos nucleicos que codifican una proteína Nogo o derivado o fragmento funcionalmente activo de esta (por ejemplo, para uso en terapia génica) . De preferencia, las proteínas Nogo, derivados o fragmentos de estas libres de todo material mielina del CNS con el cual se asocia en forma natural. Otros terapéuticos que pueden utilizarse, por ejemplo, los agonistas de Nogo, pueden ser identificados utilizando ensayos in vi tro o modelos animales, ejemplos de los cuales se describen infra . En las modalidades específicas, los terapéuticos que favorecen la función Nogo se administran terapéuticamente (incluyendo la administración profiláctica): (1) en enfermedades o padecimientos que incluyen una ausencia o nivel disminuido (con relación al normal o deseado) de la proteína o función de Nogo, por ejemplo, en pacientes donde la proteína Nogo esta ausente, genéticamente defectuosa, biológicamente inactiva o subactiva, o subexpresada; o (2) en enfermedades o padecimientos en donde los ensayos in vi tro ( o in vivo) (véase, infra ) • indican la utilidad de la respuesta del agonista de Nogo. La ausencia o nivel disminuido de la proteína Nogo o su 5 función puede detectarse fácilmente, por ejemplo, obteniendo una muestra del tejido del paciente (por ejemplo, de una biopsia de tejido) y valorándola in vi tro para RNA o niveles de proteínas, la estructura y/o actividad de RNA o la proteína Nogo expresada. Así pues, 10 es posible emplear algunos métodos normales en la técnica que incluyen pero no se limitan a los ensayos con cinasas, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, Western blot, inmunoprecipitación seguida por electroforesis en gel de 15 diacrilamida dodecilsuifato de sodio, inmunocitoquímica, etcétera) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión de Nogo detectando y/o visualizando el mRNA de Nogo (por ejemplo, los ensayos Northern, las absorciones, hibridación in situ, etcétera) . 20 Las enfermedades y padecimientos que involucran la desregulación del crecimiento celular que pueden ser tratados o prevenidos incluyen, pero no se limitan a, trastornos proliferativos, tumores malignos, tumores del sistema nervioso, etc. Los ejemplos de estos se detallan 25 más adelante. 5.8.1.1 CRECIMIENTO NEOPLASICO El crecimiento neoplásico y los trastornos • relacionados pueden ser tratados o prevenidos mediante la administración de un terapéutico que favorezca la función 5 de Nogo que incluye, pero no se limita a, los que se mencionan en la Tabla 1 (para una revisión de tales padecimientos, véase Fishman y col,, 1985, Medicin, 2a Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia): 10 TABLA 1 CRECIMIENTOS NEOPLÁSICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS Tumores sólidos Sarcomas y carcinomas Glioma, glioblastoma 15 Astrocitoma Méduloblastoma Cráneo faringoma Ependimoma Pinealoma 20 Hemangioblastoma Neuroma acústico Oligodendroglioma Menangioma Neuroblastoma 25 Retinoblastoma En las modalidades específicas, la malignidad o cambios disproliferativos (como puede ser las • metaplascias y displacías) o los trastornos hiperproliferativos, se tratan o previenen en el sistema 5 nervioso central, médula espinal o cualquier tejido neural . 5.8.1.2 CONDICIONES PREMALIGNAS Los terapéuticos de la invención que favorecen la 10 actividad de Nogo también pueden ser administrados para tratar condiciones premalignas y para prevenir el progreso a un estado neoplásico o maligno, que incluye pero no se limita a aquellos trastornos que se mencionan en la Tabla 1. El uso profiláctico o terapéutico se 15 indica en los estados conocidos o que se sospecha preceden el progreso a neoplásia o cáncer, en particular, donde ha ocurrido crecimiento celular no neoplásico A consistente en hiperplasia, metaplasia o, más específicamente, displasia (para una revisión de tales 20 condiciones de crecimiento anormal véase Robbins y Angelí, 1976, Basic Pathology, 2a ed. W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79) . La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que involucra un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin 25 alteración significativa en la estructura o función. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el que un tipo de células adultas o completamente diferenciadas sustituye a otro tipo de células adultas. La metaplasia puede ocurrir en células de tejido epitelial o conectivo. Una metaplasia atípica involucra un epitelio algo desordenadamente metaplasico. La displacía suele ser un precursor del cáncer, y se encuentra principalmente en el epitelio; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, e incluye una pérdida en la uniformidad de las células individuales y en la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas suelen tener núcleos anormales grandes, con tinción profunda, y presentan pleomorfismo. La displasia normalmente ocurre cuando existe irritación o inflamación crónica. De otro modo, o además de la presencia del crecimiento celular anormal caracterizado como hiperplasia, metaplasia o displasia, la presencia de una o más características de un fenotipo transformado, o de un fenotipo maligno, mostrado in vivo o mostrado in vi tro por una muestra celular de un paciente, puede indicar la necesidad de administración profiláctica o terapéutica de un terapéutico que favorezca la función Nogo. Como se mencionó supra , tales características de un fenotipo transformado incluyen cambios en la morfología, unión más suelta a un sustrato, pérdida de inhibición del contacto, pérdida de la dependencia del anclaje, liberación de proteasas, aumento en el transporte de azúcares, disminución en los requisitos del suero, expresión de antígenos fetales, desaparición de la proteína de la superficie celular de 250,000 dalton, (véase también id. , en la página 84-90 para las características asociadas con un fenotipo transformado o maligno) . En otras modalidades, un paciente que muestra uno o más de los siguientes factores predisponentes para malignidad se trata mediante la administración de una cantidad eficaz de un terapéutico: neurofibromatosis de Von Recklinghausen o retinoblastoma; véase Robbins y Angelí, 1976, Basic Pa thology, 2a Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113) etcétera). En otra modalidad específica, un terapéutico de la invención se administra a un paciente humano para prevenir el progreso de cáncer, melanoma o sarcoma de riñon, cartílago (o de hueso del tórax) , piel, músculo esquelético, pulmón o bazo) . 5.8.1.3. TRASTORNOS HIPERPROLIFERATIVOS Y DISPROLIFERATIVOS En otra modalidad de la invención, un terapéutico que favorece la actividad Nogo se utiliza para tratar o prevenir los trastornos hiperproliferativos o disproliferativos benignos. Las modalidades específicas • dirigen al tratamiento o prevención de cirrosis hepática (o estado en el que la cicatrización ha sustituido los 5 procesos de regeneración hepática normales) , el tratamiento de formación queloide (cicatriz hipertrófica) (desfiguración de la piel) en la que el proceso de cicatrización interfiere con la renovación normal) , soriasis (un estado de la piel común caracterizado por 10 proliferación excesiva de la piel y retrazo en la determinación del destino celular adecuado) , tumores benignos, estados fibrocísticos e hipertrofia del tejido (por ejemplo, hiperplasia prostática). 15 5.8.1.4 TRATAMIENTO GÉNICO En una modalidad específica, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una proteína Nogo o derivado funcional de esta, se administran para favorecer la función Nogo por medio de tratamiento 20 génico. El tratamiento génico se refiere al tratamiento realizado mediante la administración de un ácido nucleico a un individuo. En esta modalidad de la invención, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico favoreciendo la función Nogo. 25 Cualquiera de los métodos para tratamiento génico disponible en la técnica puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos ejemplares están descritos a continuación. Para revisiones generales de los métodos de la terapia génica véase Goldspiel y col., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 85) : 155-215) . Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del DNA recombinante que pueden utilizarse están descritos en Ausubel y col., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. En un aspecto preferido, el terapéutico consiste en un ácido nucleico Nogo que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína Nogo o fragmento o proteína quimérica de este en un hospedador adecuado. En particular, este ácido nucleico tiene un promotor ligado de manera operante a la región codificadora de Nogo, siendo el promotor inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico del tejido. En otra modalidad específica, se utiliza una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificadoras de Nogo y cualquiera de otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que favorecen la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así expresión intracromosómica del ácido nucleico Nogo (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. IUSA 86: 8932-8935; Zijlstra y col., 1989, Nature 342: 435-438). El suministro del ácido nucleico en un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o el vector que lleva el ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso, primero se transforman las células con el ácido nucleico in vi tro, después se trasplantan en el paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo . En una modalidad específica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, donde este se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede llevar a cabo por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante infección utilizando un vector retroviral defectivo o atenuado u otro vector viral (véase la Patente Estadounidense No. 4,980,286), o por inyección directa del DNA desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, la pistola génica; Biolistic, Dupont), o revistiendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolo en un enlace a un péptido del cual se sabe entra al núcleo, administrándolo en un enlace a un ligando objeto para endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (que puede utilizarse para elegir tipos de células que expresen específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, es posible formar un complejo ligando-ácido nucleico en el que el ligando consiste en un péptido viral fusogénico para romper los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En todavía otra modalidad, el ácido nucleico puede ser orientado in vivo para captación y expresión específica de la célula, mediante la orientación de un receptor específico (véase, por ejemplo, las Publicaciones del PCT WO 92/06180 del 16 de abril de 1992 (Wu y col.); WO 92/22635 del 23 de diciembre de 1992, (Wilson y col.); WO 92/20316 del 26 de noviembre de 1992 (Findeis y col.); WO 93/14188 del 22 de julio de 1993, (Clarke y col.), WO 93/20221 del 14 de octubre de 1993 (Young) ) . De otro modo, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del DNA de la célula hospedadora para la expresión, mediante recombinación homologa (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci USA 86: 8932-8935; Zijstra y col., 1989, Nature 342: 435-438). En una modalidad específica, se utiliza un vector viral que contenga el ácido nucleico Nogo. Por ejemplo, es posible utilizar un vector retroviral (véase Miller y col., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estos vectores retrovirales han sido modificados para deleción de las secuencias retrovirales que no son necesarias para e empacado del genoma viral e integración en el DNA de la célula hospedadora. El ácido nucleico Nogo que va a ser utilizado en el tratamiento génico se clona en el vector, lo cual se facilita el suministro del gen en un paciente. Más detalles acerca de los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen y col., 1994, Biotherapy 6: 291-302, que describe el uso de un vector retroviral para el suministro del gen mdrl a las células primordiales hematopoyéticas para preparar células primordiales más resistentes a quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en tratamientos génicos son: Clowes y col., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem y col., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opir.. in Genetics and Devel. 3: 110-114. Los adenovirus son otros vectores víricos que pueden utilizarse en tratamientos génicos. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para el suministro de genes al sistema nervioso central. Los adenovirus infectan en forma natural el epitelio respiratorio donde causan una enfermedad moderada. Otros objetivos para los sistemas de suministro a base de adenovirus son el hígado, el epitelio respiratorio, células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no están en división. Korzarsky y Wilson, 1993, Current Opinión in Genetics and Development 3: 499-503 presentan una revisión del tratamiento génico a base de adenovirus. Bout y col., 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10 demostraron el uso de vectores adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en tratamiento génico pueden encontrarse en Rosenfeld y col., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld y col., 1992, Cell 68: 143-155; y Mastrangeli y col., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234. Además de los adenovirus, también se han propuesto los virus adeno-asociados o adeno-afines para uso en tratamiento génico (Walsh y col., 1S93, Proc. Soc. Exp.

Biol. Med. 204: 289-300. Otro método de tratamiento génico incluye transferir un gen a las células en cultivo tisular mediante métodos tales como la electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Por lo común, el método para transferir incluye la transferencia de un marcador selectivo a las células. Las células entonces se colocan bajo selección para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Aquellas células entonces son suministradas a un paciente. En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce en una célula para administración in vivo de la célula recombinante resultante. Esta introducción puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye pero no se limita a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, la fusión celular, la transferencia del gen mediada por cromosoma, transferencia del gen mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Numerosas técnicas son conocidas para la introducción de los genes extraños en células (véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohén y col., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) y pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, siempre que no se interrumpa el desarrollo necesario y las funciones fisiológicas de las células recipientes. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico sea expresable mediante la célula y de preferencia que pueda ser heredado y expresado por las células hijas. Las células recombinantes resaltantes pueden ser suministradas a un paciente per diversos métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, se inyectan células epiteliales, por ejemplo, por vía subcutánea. En otra modalidad, las células de piel, recombinantes, pueden ser aplicadas como un injerto de piel sobre el paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células primordiales o progenitoras hematopoyéticas) , ce preferencia se administran por vía intravenosa. La cantidad de células que pueden utilizarse dependen del efecto deseado, el estado del paciente, etc., y puede ser determinada por un experto en la técnica. Las células en las cuales se puede introducir un ácido nucleico para propósitos de tratamiento génico comprende cualquier tipo de célula disponible, deseado, e incluye pero no se limita a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, células sanguíneas como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrofagos, neutrófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células primordiales o progenitoras, en particular células primordiales o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etcétera. En una modalidad preferida, la célula utilizada para tratamiento génico es autóloga para el paciente. En una modalidad en la que se utilizan células recombinantes en tratamiento génico, se introduce un ácido nucleico Nogo en las células de modo que sea expresado por las células o su progenie, y las células recombinantes entonces se administran ín vivo para el efecto terapéutico. En una modalidad específica, se utilizan células primordiales o progenitoras. Cualquiera de las células primordiales y/o progenitoras que pueda aislarse y mantenerse in vi tro puede ser utilizada potencialmente de acuerdo con esta modalidad de la presente invención. Estas células primordiales incluyen, pero no se limitan a, células primordiales neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71: 973-985). En una modalidad específica, el ácido nucleico que se introduce para propósitos de tratamiento génico consiste en un promotor inducible ligado de manera • operante a la región codificadora, de modo que la expresión del ácido nucleico pueda ser controlada 5 regulando la presencia o ausencia del inductor de la transcripción adecuado. Es posible adaptar métodos adicionales para el suministro de un ácido nucleico que codifique una proteína Nogo o derivado funcional. • 10 5.8.2 TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE LOS TRASTORNOS EN LOS CUALES NOGO BLOQUEA LA REGENERACIÓN Las enfermedades y trastornos en los cuales se desea extensión, crecimiento o regeneración de las neuritas son 15 tratados mediante la administración de un terapéutico que antagonice (inhiba) la función Nogo. Las enfermedades, trastornos o daño que finalmente dará origen al daño del sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a, trauma del sistema nervioso central (CNS) (por ejemplo, lesiones 20 de la médula espinal o el cerebro) , infarto, infección, malignidad, exposición a agentes tóxicos, deficiencia nutricional, síndromes paraneoplásicos y enfermedades nerviosas degenerativas (que incluye pero no se limita a enfermedades de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Corea 25 de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica y parálisis supra-nuclear progresiva) ; administrando los compuestos que interfieren con la actividad Nogo (por ejemplo, un derivado Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos nucleicos anti- 5 sentido que codifiquen Nogo; ribozimas Nogo o grupos químicos que se unan a un sitio activo de Nogo) . Los terapéuticos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ácidos nucleicos anti-sentido Nogo ^^ y ácidos nucleicos Nogo que sean disfuncionales (por ^^ 10 ejemplo, debido a inserción heteróloga (secuencia diferente de Nogo) dentro de la secuencia codificadora de Nogo) que se utilizan para "knockout" la función Nogo endógena mediante la recombinación homologa (véase, por ejemplo, Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292). Los 15 anticuerpos anti-Nogo (y fragmentos y derivados de estos que contienen la región de unión de estos) pueden utilizarse como un antagonista de Nogo. En una modalidad específica de la invención, se utiliza un ácido nucleico que contenga una porción de un gen Nogo en el que las 20 secuencias Nogo flanquean (son 5' y 3' para) una secuencia génica diferente, como un antagonista de Nogo, para favorecer la inactivación de Nogo por recombinación homologa (véase también Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra y col., 25 1989, Nature 342: 435-438). Otros terapéuticos que inhiben la función de Nogo pueden ser identificados por el uso de ensayos in vi tro convenientes, conocidos, por ejemplo, basados en su capacidad para inhibir la unión de Nogo a otra proteína, o de inhibir cualquier función Nogo 5 conocida, cuando de preferencia se ensaya in vi tro o en cultivo celular, aunque también pueden emplearse ensayos genéticos. De preferencia, los ensayos in vi tro ó in vivo adecuados se utilizan para determinar el efecto de un terapéutico específico y si su administración esta 10 indicada para el tratamiento del tejido afectado. En las modalidades específicas, los terapéuticos que inhiben la función Nogo se administran en forma terapéutica (incluida profiláctica) : (1) en enfermedades o trastornos que incluyen una mayor concentración (con 15 relación a la concentración normal o deseada) de la proteína Nogo o su función, por ejemplo, en pacientes donde la proteína Nogo es activa en exceso o sobre áfe expresada; o (2) en enfermedades o padecimientos en donde los ensayos in vi tro ( o in vivo) (véase infra ) indican 20 las utilidad de la administración de los antagonistas de Nogo. Las concentraciones incrementadas de la proteína Nogo o su función puede detectarse fácilmente, por ejemplo, cuantificando la proteína y/o el RNA, obteniendo una muestra de tejido del paciente (por ejemplo, a partir 25 de una biopsia de tejido) y ensayándola ín vi tro para el RNA o las concentraciones de proteína, la estructura y/o actividad del RNA o proteína Nogo expresada. Algunos métodos normales en la técnica pueden utilizarse que incluyen, pero no se limitan a, los ensayos de cinasas, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, el análisis Western blot, inmunoprecipitación seguida por electroforesis en gel de poliacrialamida dodecilsulfato de sodio, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión de Nogo detectando y/o visualizando respectivamente el mRNA de Nogo (por ejemplo, ensayos Northern, absorciones, hibridación in situ), etcétera. 5.8.2.1. REGULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE NOGO En una modalidad específica, la función de Nogo se inhibe mediante el uso de ácidos nucleicos antisentido Nogo . La presente invención proporciona el uso terapéutico o profiláctico de los ácidos nucleicos de cuando menos seis nucleótidos que sean antisentido para un gen o cDNA que codifique Nogo o una porción de esta. Un ácido nucleico "antisentido" Nogo cuando se utiliza en la presente se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridar a una porción de un RNA de Nogo (de preferencia mRNA) en virtud de alguna complementariedad de la secuencia. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario para una región codificante y/o no codificante de un mRNA de Nogo. Estos ácidos nucleicos • antisentido tienen utilidad como terapéuticos que inhiben la función Nogo, y pueden ser utilizados en el 5 tratamiento o prevención de trastornos como se describe supra . Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser oligonucleótidos bicatenarios o monocatenarios, RNA ó DNA o una modificación o derivado • 10 de estos, que pueden ser administrados directamente a una célula, o que pueden ser producidos en forma intracelular por transcripción de las secuencias exógenas, introducidas . En una modalidad específica, los ácidos nucleicos 15 antisentido Nogo proporcionados por la presente invención pueden ser utilizados para favorecer la regeneración de las neuronas del sistema nervioso central en particular, incluida la regeneración del tracto corticoespinal, la plasticidad durante recuperación, nuevo crecimiento de 20 las neuronas y curación del daño asociado con lesiones traumáticas, accidente cerebro vascular y enfermedades neuro-degenerativas . La invención además proporciona las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de los 25 ácidos nucleicos antisentido Nogo de la invención en un portador aceptable para uso farmacéutico, como se describe infra . En otra modalidad, la invención se dirige a los métodos para inhibir la expresión de una secuencia de ácido nucleico Nogo en una célula procariótica o eucariótica que consiste en proporcionar a la célula una cantidad eficaz de una composición que contenga un ácido nucleico antisentido Nogo de la invención. Los ácidos nucleicos antisentido Nogo y sus usos están descritos con mayor detalle a continuación. 5.8.2.1.1 ÁCIDOS NUCLEICO ANTISENTIDO NOGO Los ácidos nucleicos antisentido Nogo son de cuando mens seis nucleótidos y de preferencia son oligonucleótidos (en el intervalo desde 6 hasta aproximadamente 50 oligonucleótidos) . En los aspectos específicos, el oligonucleótido es de cuando menos 10 nucleótidos, cuando menos 15 nucleótidos, cuando menos 100 nucleótidos o cuando menos 200 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser DNA ó RNA o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de estos, monocatenarios o bicatenarios . El oligonucleótido puede ser modificado en la porción base, la porción azúcar o la cadena fosfato. El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos como péptidos o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger y col., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre y col., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci 84: 648-652; publicación PCT No. WO 89/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la Publicación del PCT No. WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988); agentes de disociación accionados por hibridación (véase, por ejemplo, Krol y col., 1988, BioTechniques 6: 958-976) or intrecalating agents (véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549) . En un aspecto preferido de la invención, se proporciona un oligonucleótido antisentido Nogo, de preferencia un DNA monocatenario. En un aspecto más preferido, un oligonucleótido así consiste en una secuencia antisentido para la secuencia más cercana a una de las dos secuencias promotoras del gen Nogo, o una secuencia que codifica la porción carboxilo terminal del gen Nogo. Puede ser deseable inhibir de forma selectiva la expresión de una de las isoformas de Nogo. El oligonucleótido puede ser modificado en cualquier posición en su estructura con sustituyentes generalmente conocidos en la técnica. El oligonucleótido antisentido Nogo puede contener cuando menos una porción base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manocilqueosina, 5' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metil éster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2, 6-diaminopurina . En otra modalidad, el oligonucleótido comprende cuando menos una porción azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluorarabinosa, xilulosa y hexosa. En todavía otra modalidad, el oligonucleótido comprende cuando menos una cadena principal fosfato modificada seleccionada del grupo que consiste en un fósforotioato, un fósforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquilfosfotriéster y un formacetal o análogo de 5 estos. En todavía otra modalidad, el oligonucleótido es un oligonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a- anomérico forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en el cual, contrario a las unidades ß • 10 normales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier y col., 1987, Nucí. Acids. Res. 15: 6625-6641). El oligonucleótido puede ser conjugado a otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente reticulador accionado por hibridación, agente de transporte, agente 15 de disociación activada por hibridación, etcétera. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser sintetizados por los métodos normales conocidos en la ?^^ técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de DNA automatizado (como pueden ser los que están a la 20 disposición en el comercio de Biosearch Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos fósforotioato pueden ser sintetizados por el método de Stein y col., (1988, Nucí. Acids. Res. 16: 3209), los oligonucleótidos metilfosfonato pueden ser preparados 25 mediante el uso de soportes de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin y col., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451), etcétera. En una modalidad preferida, el oligonucleótido antisentido Nogo comprende un RNA catalítico, o una ribozima (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional del PCT WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver y col., Science 247: 1222-1225). En otra modalidad, el oligonucleótido es un 2'-0-metilribonucleótido (Inoue y col., 1987, Nucí. Acids. Res. 15: 6131-6148), o un análogo RNA-DNA quimérico (Inoue y col., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330). En una modalidad alternativa, el ácido nucleico antisentido Nogo de la invención se produce de manera intracelular por transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, es posible introducir un vector in vivo de modo que sea captado por una célula, dentro de cuya célula el vector o una porción de este se transcribe produciendo un ácido nucleico antisentido (RNA) de la invención. Tal vector contendrá una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido Nogo. Este vector puede permanecer episomal o integrarse al cromosoma, siempre que pueda ser transcrito para producir el RNA antisentido deseado. Estos vectores pueden ser construidos por los métodos de la tecnología del DNA recombinante normales en la técnica. Los vectores pueden ser plasmídicos, virales u otros conocidos en la técnica, que se utiliza para la replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica el RNA antisentido Nogo puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica que actúe en células de mamífero, de preferencia humano. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen, pero no se limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y col., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor timidina cinasa herpético (Wagner y col., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster y col., 1982, Nature 296: 39-42), etcétera. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria para cuando menos una porción de un transcrito de RNA de un gen Nogo, de preferencia un gen Nogo humano. No obstante, aunque se prefiere, no se requiere complementariedad absoluta. Una secuencia "complementaria" a cuando menos una porción de un RNA" cuando se menciona en la presente, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridar con el RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido Nogo bicatenarios, de este modo puede probarse una sola hebra del DNA dúplex, o se puede ensayar la formación del triplex. La capacidad para hibridar dependerá del grado de complementariedad y la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto más largo sea el ácido nucleico hibridante, más desacoplamientos de bases con un RNA Nogo puede contener y todavía formar un dúplex estable (o triplex, según puede ser el caso) . Un experto en la técnica puede averiguar un grado tolerable de desacoplamiento mediante el uso de procedimientos normales para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. 5.8.2.1.2 USO TERAPÉUTICO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ANTISENTIDO NOGO Los ácidos nucleicos antisentido Nogo pueden utilizarse para tratar (o prevenir) trastornos de un tipo de célula que expresa, o de preferencia sobre expresa, Nogo . En una modalidad específica, tal trastorno es un trastorno proliferativo del crecimiento. En una modalidad preferida, se utiliza el oligonucleótido Nogo antisentido de DNA monocatenario. Los tipos de célula que expresan o sobre expresan el RNA Nogo pueden ser identificados por algunos métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, hibridación con un ácido nucleico específico de Nogo (por ejemplo, por hibridación Northern, hibridación por absorción, hibridación in situ) , observando la capacidad del RNA del tipo de células que va a ser traducido in vi tro en Nogo, inmunoensayo, etc. En un aspecto preferido, el tejido primario de un paciente se puede ensayar para la expresión de Nogo antes del tratamiento, por ejemplo, por inmunocitoquímica o hibridación in si tu . Las composiciones farmacéuticas de la invención, que contienen una cantidad eficaz de un ácido nucleico antisentido Nogo en un vehículo aceptable para uso farmacéutico, pueden ser administradas a un paciente que tenga un trastorno o enfermedad que sea del tipo que exprese o sobre exprese RNA Nogo o la proteína. La cantidad del ácido nucleico antisentido Nogo que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o estado particular dependerá de la naturaleza del estado o trastorno, y puede determinarse por las técnicas clínicas normales. Donde sea posible, es deseable determinar la citotoxicidad antisentido del tipo de tumor que va a ser tratado in vi tro, y luego en sistemas de modelos animales útiles antes de probar y utilizar en humanos. En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas que contienen ácidos nucleicos antisentido Nogo se administran a través de liposomas, micropartículas o microcápsulas. En algunas modalidades de la invención, puede ser útil utilizar estas composiciones para obtener libración prolongada de los ácidos nucleicos antisentido Nogo. En una modalidad específica, puede ser deseable utilizar liposomas orientados por anticuerpos a los antígenos de tumor que puedan ser identificados, específicos (Leonetti y col., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2448-2451; Renneisen y col., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337-16342). 5.9 DEMOSTRACIÓN DE LA UTILIDAD TERAPÉUTICA O PROFILÁCTICA Los terapéuticos de la invención de preferencia se prueban in vi tro, y luego in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de utilizarlos animales. Por ejemplo, los ensayos in vi tro que pueden utilizarse para determinar si esta indicada la administración de un terapéutico específico incluyen ensayos de cultivos celulares in vi tro en los cuales se hace crecer en un cultivo una muestra de tejido del paciente, y se expone a o de otra manera se administra un terapéutico, y se observa el efecto de este terapéutico sobre la muestra del tejido. Por ejemplo, un terapéutico que sea inhibidor de la función Ñoco puede ser valorado midiendo el nuevo crecimiento de las neuritas o la recuperación funcional del control motor en el paciente.

En algunas modalidades específicas, es posible realizar los ensayos in vi tro con células representativas de los tipos de células involucrados en el trastorno de un paciente, para determinar si un terapéutico tiene un efecto deseado sobre estos tipos de células. Los compuestos para uso en tratamiento pueden ser probados en sistemas de modelos animales convenientes antes de probarlos en humanos, que incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, etc. Para las pruebas in vivo, antes de la administración a humanos, es posible utilizar cualquier sistema de modelo animal conocido en la técnica. 5.10 ADMINISTRACIÓN TERAPÉUTICA/PROFILÁCTICA Y COMPOSICIONES La composición proporciona los métodos de tratamiento (y profilaxis) mediante la administración a un individuo de una cantidad eficaz de un terapéutico de la invención. En un aspecto preferido, el terapéutico es substancialmente purificado. El individuo de preferencia es un animal, que incluye pero no se limita a animales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc. y, de preferencia, es un mamífero, y de mayor preferencia un humano. En una modalidad específica, el individuo es un mamífero no humano. Las formulaciones y métodos de administración que pueden emplearse cuando el terapéutico contiene un ácido nucleico están descritos en lo anterior; las formulaciones y vías de administración adecuadas, adicionales, pueden seleccionarse de entre las descritas en lo siguiente. Los diferentes sistemas de suministro son conocidos y pueden utilizarse para administrar un terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el terapéutico, endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-44432), la construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden ser administrados por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administrados junte con otros agentes con actividad biológica. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía conveniente, que incluye inyección intraventricular a intratecal; la inyección intrventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventicular, por ejemplo, unido a un depósito, como puede ser un depósito Ommaya. También es posible emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente pulverizador. En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención en forma local en el área que necesita el tratamiento; esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante, y no como limitación, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas después de cirugía, por inyección, por medio de un catéter o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, como pueden ser las membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un tumor maligno o tejido neoplásico o preneoplásico. En otra modalidad, el terapéutico puede ser suminsitro en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat y col., in Liposomes in the therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327; véase generally ibíd) . En todavía otra modalidad, el terapéutico puede ser suministrado en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, es posible utilizar una bomba (véase Langer, supra ; Sefton, CRC Crit. ?ef. Biomed. Eng. 14. 201 (1987); Buchwaid y col., Surgery 88: 507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). En otra modalidad, es posible utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase, Langer and Wise (eds.), CRC Pre., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Products Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York 81984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). En todavía otra modalidad, es posible colocar un sistema de liberación controlada en proximidad al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra , vol, 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533) (1990) ) . En una modalidad específica donde el terapéutico es un ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para favorecer la expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un vector de expresión ácido nucleico adecuado y administrándola de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase la Patente Estadounidense No. 4,980,286), o por inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) , o revestimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, o mediante la administración en unión a un péptido tipo homeocaja del cual se conoce entra al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot y col., 1991, Proc. Nati.

Acad. Sci. EU 88: 1864-1868), etc. De otro modo, es posible introducir intracelularmente el ácido nucleico terapéutico e incorporarlo dentro del DNA de la célula hospedadora para expresión por recombinación homologa.

La invención presente también proporciona las composiciones farmacéuticas. Estas composiciones • farmacéuticas contienen una cantidad eficaz para uso terapéutico de un terapéutico, y un vehículo aceptable 5 para uso farmacéutico. En una modalidad específica, el término "aceptable para uso farmacéutico" significa aprobado por una agencia de regulaciones del Gobierno Federal o estatal o listado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida 10 para uso en animales, y más específicamente en humanos. El término "vehículo o portador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el terapéutico. Tales .portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles como agua y 15 aceites, incluidos los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, como puede ser el aceite de cacahuate, aceite de frijol de soya, aceite mineral, f aceite de sésamo y similares. El agua de preferencia es un portador cuando la composición farmacéutica se 20 administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden ser empleadas como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos convenientes incluyen almidón, glucosa, 25 lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, sulfato de calcio, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada, deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición 5 también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificadores, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, ^^ cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada 10 y similares. La formulación oral puede incluir portadores normales como los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplos de los portadores farmacéuticos convenientes están descritos en 15 "Remington's Pharmaceutial Sciences" de E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad eficaz para uso terapéutico del terapéutico, de preferencia en forma w purificada, junto con una cantidad conveniente del portador para proporcionar la forma para la 20 administración adecuada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos normales como una composición farmacéutica adaptada para administración 25 intravenosa a los seres humanos. Por lo común, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en solución amortiguadora acuosa isotónica, estéril. Según sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico 5 local como lignocaína [sic] para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes son suministrados por separado o en mezclas entre sí en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, como un ^^ polvo liofilizado anhidro o concentrado sin agua en un 10 recipiente con sello hermético como puede ser una ampolleta o sachet indicando la cantidad del ingrediente activo. Cuando la composición sea para administración por infusión, esta puede ser dosificada con una botella para infusión conteniendo agua o salina estéril grado 15 farmacéutico. Cuando la composición se administre por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o salina puede proporcionarse de modo que los ingredientes k puedan ser mezclados antes de la administración. Los terapéuticos de la invención pueden ser 20 formulados como formas neutras o sales. Las sales aceptables para uso farmacéutico incluyen aquellas que se forman con grupos amino libres como las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo 25 libres como las provenientes de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etcétera. La cantidad del terapéutico de la invención que será 5 eficaz en el tratamiento de un trastorno o padecimiento particular dependerá de la naturaleza del padecimiento o trastorno, y puede ser determinada por las técnicas clínicas normales. Además, los ensayos in vi tro pueden ^^ opcionalmente emplearse para ayudar a identificar los 10 intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que va a ser empleada en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la seriedad de la enfermedad o padecimiento, y debe ser decidida de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. 15 No obstante, los intervalos de dosificación convenientes para administración intravenosa son en general aproximadamente 20-500 microgramos del compuesto activo flft por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación convenientes para administración intranasal 20 son generalmente cerca de 0.01 pg/kg de peso corporal hasta 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se extrapolan a partir de curvas de dosis-respuesta provenientes de sistemas de prueba en modelos animales o in vi tro . 25 La invención también proporciona un paquete farmacéutico o kit que contiene uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las • composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociados con tales recipiente (s) puede ser una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental regulando la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, cuya instrucción refleje la aprobación de la agencia a la fabricación, uso o venta para administración humana. 10 5.11 DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN Las proteínas Nogo, análogos, derivados y subsecuencias de esta, los ácidos nucleicos Nogo ( y las secuencias complementarias para estos) , los anticuerpos 15 anti-Nogo, tienen uso en diagnóstico. Estas moléculas pueden utilizarse en ensayos, como pueden ser los inmunoensayos, para detectar, pronosticar, diagnosticar o k supervisar las diferentes condiciones, enfermedades y trastornos que afectan la expresión de Nogo, o supervisar 20 el tratamiento de estas. En particular, un inmunoensayo se realiza mediante un método que consiste en poner en contacto una muestra proveniente de un paciente con un anticuerpo anti-Nogo bajo condiciones tales que pueda ocurrir la unión inmunoespecífica, y detectar o medir la 25 cantidad de cualquier unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En un aspecto específico, tal unión del anticuerpo, en secciones de tejido, puede utilizarse para • detectar la localización aberrante de Nogo o niveles aberrantes de Nogo (por ejemplo, bajos o ausentes) . En 5 una modalidad específica, el anticuerpo para Nogo puede ser utilizado para ensayar en un tejido o muestra sérica del paciente la presencia de Nogo donde una concentración aberrante de Nogo es un indicio de un estado de enfermedad. Por "niveles o concentraciones aberrantes" se 10 entiende concentraciones aumentadas o disminuidas con relación a la presente, o a un nivel normal representando el presente, en una muestra análoga de una porción del cuerpo o de un individuo que no presente el trastorno. Los inmunoensayos que pueden utilizarse incluyen, 15 pero no se limitan a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos utilizando las técnicas como inmunohistoquímica, patología, análisis western blot, fl radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas) , inmunoensayos "sandwich", ensayos de 20 inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmuno-radiométricos, inmunoensayos fluorescentes, ensayos inmunohistoquímicos, 25 inmunoensayos de proteína A, por mencionar solo algunos.

Los genes Nogo y las secuencias y subsecuencias de ácidos nucleicos relacionados, incluidas las secuencias complementarias, también pueden utilizarse en ensayos de hibridación. Las secuencias del ácido nucleico Nogo o subsecuencias de estas que contienen aproximadamente cuando menos 8 nucleótidos, pueden utilizarse como sondas de hibridación. Los ensayos de hibridación pueden utilizarse para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorear condiciones, trastornos o estados de enfermedad asociados con cambios aberrantes en la expresión de Nogo y/o la actividad como se describe supra . En particular, un ensayo de hibridación así se realiza por un método que consiste en poner en contacto una muestra que contenga el ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar a DNA o RNA Nogo, bajo condiciones tales que pueda ocurrir la hibridación, y detectar o medir cualquier hibridación resultante. En las modalidades específicas, las enfermedades y padecimientos que involucran trastornos en el crecimiento y desarrollo celular pueden ser diagnosticados, o se puede detectar su presencia sospechada para, o puede detectarse una predisposición a desarrollar tales padecimientos, detectando los niveles disminuidos de proteína Nogo, RNA Nogo o la actividad funcional Nogo como se demuestra por la inhibición del crecimiento, o detectando mutaciones en el RNA, DNA o proteína Nogo (por ejemplo, translocaciones en los ácidos nucleicos de Nogo, truncaciones en el gen o proteína Nogo, cambios en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos con relación a Nogo tipo silvestre) que causen expresión o actividad disminuida de Nogo. Tales trastornos y enfermedades incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la Sección 3 y la Sección 5.8.1.1. Por ejemplo, es posible detectar las concentraciones de la proteína Nogo mediante inmunoensayo, los niveles de RNA de Nogo pueden ser detectados por ensayos de hibridación (por ejemplo Northern blot, dot blot) , la unión de Nogo a los receptores de la proteína inhibidora del crecimiento celular puede realizarse por ensayos de unión los comúnmente conocidos en la técnica, las translocaciones y mutaciones puntuales en los ácidos nucleicos Nogo pueden ser detectados por Southern blot, análisis RFLP, PCR utilizando los cebadores que de preferencia generan un fragmento que abarque cuando menos la mayor parte del gen Nogo, la secuenciación del DNA o cDNA genómico de Nogo obtenido del paciente, etcétera. También se proporcionan los equipos para uso de diagnóstico que comprenden en uno o más recipientes un anticuerpo anti-Nogo y, opcionalmente, una contraparte de unión etiquetada para el anticuerpo. De otro modo, es posible marcar el anticuerpo anti-'.ogo (con un marcador que pueda ser detectado, por ejemplo, una porción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente o radioactiva) . También se proporciona un kit o equipo que contiene en uno o más recipientes una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar a RNA de Nogo . En una modalidad específica, un kit puede contener en uno o más recipientes un par de iniciadores o cebadores (por ejemplo, cada uno en un intervalo de tamaño de 6-30 nucleótidos) que sea capaz de iniciar la amplificación [por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa (véase, por ejemplo, Innis y col., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA) , reacción en cadena de la ligasa (véase EP 320,308) el uso de Qß replicasa, la reacción de la sonda cíclica u otros métodos conocidos en la técnica] bajo condiciones de reacción adecuadas de cuando menos una porción del ácido nucleico Nogo . Un kit puede además contener opcionalmente en un recipiente una cantidad predeterminada de una proteína o ácido nucleico Nogo purificado, por ejemplo, para uso como un estándar o control . 5.12 DETECCIÓN PARA AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE NOGO Los ácidos nucleicos Nogo, proteínas y derivados también se utilizan en ensayos de detección para detectar moléculas que se unen específicamente a los ácidos nucleicos Nogo, proteínas o derivados y así tienen uso potencial como agonistas o antagonistas de Nogo, en particular, moléculas que así afectan la regulación del crecimiento celular. En una modalidad preferida, tales ensayos se realizan para detectar moléculas con utilidad potencial como promotores del crecimiento neural para el desarrollo de medicamentos. La invención así proporciona ensayos para detectar moléculas que se unan específicamente a los ácidos nucleicos Nogo, proteínas o derivados. Por ejemplo, las células recombinantes que expresan los ácidos nucleicos Nogo pueden ser utilizadas para producir de manera recombinante proteínas Nogo en estos ensayos, para detectar moléculas que se unan a una proteína Nogo. Las moléculas (por ejemplo, contrapartes de unión putativas de Nogo) se ponen en contacto con la proteína Nogo (o fragmento de esta) bajo condiciones que conducen la unión, y luego se identifican las moléculas que se unen específicamente a la proteína Nogo. Es posible utilizar métodos similares para detectar moléculas que se unan a derivados o ácidos nucleicos Nogo. Los métodos que pueden utilizarse para realizar lo anterior son comúnmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las bibliotecas de diversidad, como pueden ser las bibliotecas peptídicas y no peptídicas al azar o combinatorias pueden ser detectadas para moléculas que se unan específicamente a Nogo. En la técnica se conocen múltiples bibliotecas que pueden utilizarse, por ejemplo, las bibliotecas de síntesis química, bibliotecas recombinantes (por ejemplo, bibliotecas de presentación de fago) y bibliotecas a base de traducción in vi tro . Los ejemplos de bibliotecas que se sintetizan químicamente están descritas en Fodor y col., 1991, Science 251: 767-773; Houghten y col., 1994, Bio/Technology 12: 709-710; Gallop y col., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9): 1233-1251; Ohlmeyer y col., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 90: 10922-10926; Erb y col., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 91: 11422-11426; Houghen y col., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme y col., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 91: 1614-1618; Salmón y col., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 90: 11708-11712; Publicación del PCT No. WO 93/20242; y Brenner y Lerner, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 89: 5381-5383. Los ejemplos de las bibliotecas presentadoras de fago están descritas en Scott y Smith, 1990, Science 249: 386-390; Devlin y col., 1990, Science, 249:404-406; Christian, R. B., y col., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149-157; Kay y col., 1993, Gene 128: 59-65; y Publicación del PCT No. WO 94/18318 presentada el 18 de agosto de 1994.

Las bibliotecas a base de traducción in vi tro incluyen, pero no se limitan a, aquellas que están descritas en la publicación del PCT No. WO 91/05058 con fecha 18 de abril de 1991; y en Mattheakis y col., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 91: 9022-9026. Por medio de ejemplos de bibliotecas no peptídicas, una biblioteca benzodiazepina (véase, por ejemplo Bunin y col., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 91: 4708-4712) puede ser adaptada para uso. Las bibliotecas de peptoides (Simón y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 89: 9367-9371) también pueden ser utilizadas. Otro ejemplo de una biblioteca que puede ser utilizada, en la que las funcionalidades amida en los péptidos han sido permetiladas para generar una biblioteca combinatoria transformada por medios químicos está descrita por Ostresh y col. (1994, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 91: 11138-11142) . La detección de las bibliotecas puede llevarse a cabo por cualquiera de una variedad de métodos comúnmente conocidos. Véase, por ejemplo, las siguientes referencias que describen la detección de bibliotecas de péptidos: Parmley y Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott y Smith, 1990, Science 249: 386-390; Fowlkes y col., 1992; BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 89: 5393-5397; Yu y col., 1994, Cell 76: 933-945; staudt y col., 1988, Science 241: 577-580; Bock y col., 1992, Nature 355: 564-566; Tuerk y col., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 89: 6988-6992; Ellington y col., 1992, Nature 355: 850-852; Patente Estadounidense No. 5,096,815, Patente Estadounidense No. 5,223,409 y Patente Estadounidense No. 5,198,346 de Lardner y col.; Rebar y Pabo, 1993, Science 263: 671-673; y la publicación del PCT No. WO 94/18318. En una modalidad específica, la detección puede realizarse poniendo en contacto los miembros de la biblioteca con una proteína Nogo (o ácido nucleico o derivado) inmovilizada en una fase sólida y cosechando estos miembros de la biblioteca que se unan a la proteína (o ácido nucleico o derivado) . Los ejemplos de estos métodos de detección, denominados técnicas de "toma panorámica" están descritos como ejemplo en Parmley y Smith, 1988, Gene 73: 305-318; Fowlkes y col., 1992, BioTechniques 13: 422-427; publicación del PCT No. WO 94/18318; y las referencias mencionadas en las anteriores. En otra modalidad, el sistema de dos híbridos para seleccionar proteínas interactuantes en levadura (Fields y Song, 1989, Nature 340: 245-246; Chien y col., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 88: 9578-9582) pueden utilizarse para identificar moléculas que se unan específicamente a una proteína o derivado Nogo. 5.13 MODELOS ANIMALES La invención también proporciona modelos animales que incluyen, pero no se limitan a, modelos en ratones, hámsters, ovejas, cerdos, ganado y de preferencia mamíferos no humanos. En una modalidad, se proporcionan los modelos animales para enfermedades y padecimientos que involucran la extensión, crecimiento y regeneración de las neuritas. Tal animal puede ser inicialmente producido promoviendo la recombinación homologa entre un gen Nogo en su cromosoma y un gen Nogo exógeno que se haya vuelto biológicamente inactivo (de preferencia por inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). En ur. aspecto preferido, esta recombinación homologa se realiza transformando células primordiales provenientes de embrión (ES) con un vector que contenga el gen Nogo inactivado por inserción, de modo que ocurra recombinación homologa, seguido por inyección de las células ES en un blastocisto, e implantando el blastocisto en una madre adoptiva, seguido por el nacimiento del animal quimérico (animal "knockout") en el cual se ha inactivado un gen Nogo (véase Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292). El animal quimérico puede ser reproducido para producir animales knockout adicionales. Tales animales pueden ser ratones, hámsters, ovejas, cerdos, ganado, etc. y de preferencia mamíferos no humanos. En una modalidad específica, se produce un ratón knockout. Se espera que estos animales knockout se desarrollen o estén predispuestos para desarrollar enfermedades o padecimientos que involucren el sistema nervioso central y así puedan tener uso como modelos animales para estas enfermedades y padecimientos, por ejemplo, para detectar o probar moléculas (por ejemplo, terapéuticos potenciales para trastornos del sistema nervioso) para la capacidad para inhibir tumores del tejido nervioso y así tratar o prevenir tales trastornos o enfermedades. La presente invención no debe ser limitada en el alcance por el microorganismo depositado o las modalidades específicas descritas en la presente. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y las figuras que el acompañan. Tales modificaciones están propuestas para entrar dentro del alcance de las cláusulas anexas. Algunas referencias se mencionan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus enterezas. 6. EJEMPLO: CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO NUCLEÓTIDO Y PROTEÍNA DEL GEN NOGO Los ejemplos descritos en la presente demuestran que el gen clonado, Nogo, codifica una proteína que es un inhibidor potente del crecimiento de las células neurales y también es reconocido por los anticuerpos monoclonales descritos en Schwab y col., Patente Estadounidense No. 5,684,133. 6.1 MATERIALES Y MÉTODOS Las siguientes secciones describen materiales y métodos que se utilizan en la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá que estos materiales y métodos son simplemente ilustrativos de la invención actualmente reclamada y se consideran las modificaciones por los presentes inventores. Tales modificaciones están propuestas para entrar dentro del alcance de las cláusulas anexas. 6.1.1 PURIFICACIÓN DE NOGO DE BOVINO A PARTIR DE MIELINA Todos los pasos de purificación fueron realizados a 4°C y la actividad inhibitoria del sustrato de las fracciones obtenidas fueron determinadas de manera rutinaria por la propagación de NIH 3T3 y los ensayos de excrecencia de neuritas PC12 (Sección 6.1.10). El tejido de la médula espinal de bovino fue cuidadosamente limpiado separando las meninges y cortado en trozos pequeños. La mielina luego fue extraída en solución amortiguadora para extracción (CHAPS 60 mM, Tris-Cl 100 mM, pH 8.0, solución amortiguadora de EDTA 10 mM, pH 8.0, yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A) . Para obtener el extracto de la médula espinal, el tejido fue homogenizado directamente en solución amortiguadora para extracción CHAPS en una proporción de (1:1; p:v). El homogenado fue centrifugado dos veces a 100,000 X g (tipo Kontron: K50.13, ángulo fijo) durante una hora a 4°C. el sobrenadante claro (extracto) inmediatamente fue aplicado a una columna Q-Sepharose (2.6 X 11.5 cm) equilibrada en buffer A (Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, 0.5% de CHAPS (p/v)). Las proteínas unidas fueron eluidas con un gradiente lineal del volumen del lecho 5 [sic] de NaCl desde 0 hasta 1 M en buffer A (gradiente 100 ml en 50 minutos) . Las fracciones activas que contenían NI220 de bovino eluyeron aproximadamente a NaCl 0.4 M y fueron combinadas (q-pool 1) para aplicaciones subsiguientes sobre una columna Superdex 200 (2.6 x 60 cm) , equilibrada en buffer B (NaCl 150 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, CHAPS 0.5% (p/v) ) . Las fracciones activas, después de filtración en gel (s-pool 1) , fueron separadas por SDS-PAGE al 6% bajo condiciones reductoras y energía constante baja (2 watts/gel) durante un total de 2500 voltios-hora. Las bandas y las regiones del gel fueron identificadas después de tinción con azul de Coomoassie (0.1% p/v R250 en 50% metanol y 10% ácido acético) , cortadas y extraídas en 800 µl de buffer para elusión en gel (CHAPS 0.5% (p/v), Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM, pH 8.0, yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo lmM, 0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A) durante cuando menos 48 horas a 4°C. 6.1.2 MICROSECUENCIACIÓN DE NOGO PURIFICADO El material eluido en gel, activo, neutralizable IN-1 de varios geles fue nuevamente corrido sobre un gel de SDS al 10% en poliacrilamida bajo condiciones reductoras, y teñido con 0.1% (p/v) con azul de Coomassie R250 en 50% metanol y 10% ácido acético. La banda de 220 KDa fue cortada y se realizó la digestión con endoproteinasa lys-c (relación molar 1:50) directamente en el gel. La muestra fue acidificada y aplicada a una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento, en fase inversa, los péptidos fueron separados con un gradiente lineal (0-100%) de 0.04% de ácido trifluoracético y 80% de acetonitrilo, y fracciones que contienen especies peptídicas individuales fueron sometidas a degradación automatizada de Edman. 6.1.3 ELECTROFORESIS DE NOGO PURIFICADO Se realizó SDS-PAGE en alta resolución utilizando 6% (p/v) de SDS-geles de poliacrilamida (10 X 24 X 0.01 cm) bajo condiciones reductoras (ditiotreitol 100 mM) . La transferencia sobre membranas Immobilon-P (Millipore) se realizó en Tris base, 20 mM, glicina 192 mM, pH 8.3, 0.037% (p/v) SDS, 20% metanol con un aparato de transferencia semihidratada (Bio-Rad) , Trans Blot SD) . El tiempo de transferencia fue de 2 horas a 0.8 mA/cm2. El reactivo bloqueador (una hora a temperatura ambiente) fue 3% de gelatina en PBS (salina amortiguada con fosfatos, pH 7.2, 8 g de NaCl, 0.2 g de kH2P04, 2.8 g de Na2HP04 12H20, y 0.2 g de KCl, disueltos en 1 litro de agua (y la solución de lavado contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM y 0.4% de Tween (3 X 10 minutos a temperatura ambiente) . El tiempo de incubación para el para el primer anticuerpo (para la dilución con 1% de gelatina en PBS) normalmente fue durante la noche a 4°C. El segundo anticuerpo IgG antiratón conjugado con peroxidasa de rábano (1:2000) fue incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. El sistema de quimioluminiscencia ECL se utilizó para la detección (Amersham Pharmacia Biotech) . 6.1.4 SONDEO DE LA BIBLIOTECA DE cDNA La materia blanca recién disecada de la médula espinal de bovino y poli(A)+RNA fue extraída utilizando el equipo FastTrack (Invitrogen) . Se realizó la construcción de la bibliotecas de cDNA utilizando el kit Uni-ZAP (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. La complejidad de las bibliotecas fue mayor que 4 x 106 unidades formadoras de placas en total, y el tamaño promedio de los insertos fue de aproximadamente 1.8 kilobases . Oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (MSC5 TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID NO 47) MSC6 TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO 48) MSC7 TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO 49) MSC8 TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO: 50)) fueron diseñados a partir de la secuencia del péptido uno bN1220, y MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID NO: 51) ) fue diseñado a partir de la secuencia del péptido 2 bNI220. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por MWG Biotech (Munchenstein, Suiza) y marcados con el kit de etiquetado en el extremo 3' DIG DNA. Las ribosondas fueron sintetizadas utilizando el kit de etiquetado DIG • RNA (Boehringer Mannheim) . La hibridación de las sondas y las condiciones de 5 lavado fueron como se describió por el fabricante (MSC5-8 y MSC9 fueron utilizados con una temperatura de hibridación y lavado de 57 °C) . La detección de la sonda se realizó utilizando el sistema SDP-star (Boehringer Mannheim) . El manejo y detección de la biblioteca de cDNA 10 se realizo con los protocolos para las bibliotecas lambda ZAP cDNA (Stratagene). Se utilizaron membranas de nailon Genescreen (DuPOnt) para elevar las placas. 6.1.5 SECUENCIACIÓN DEL DNA 15 Ambas hebras de CWP1-3, 01Í18, 01i3 y R1-3U21 fueron secuenciadas con el sistema Perkmin Elmer AB1377 de Microsynth (Balgach, Suiza) . Las secuencias del DNA fueron analizadas por el programa DNASIS (Hitachi) . Las búsquedas en las bases de datos fueron realizadas con el 20 programa BLAST (NCBI) . 6.1.6 ANÁLISIS DEL RNA El RNA total y poli(A)+RNA fueron extraídos de los tejidos utilizando el kit RNAgent (Promega) o Fast Track 25 (Invitrogen), respectivamente. Los RNA fueron separados por electroforesis en 1% geles de formaldehído y transferidos a membranas Genescreen. Las bandas fueron hibridadas con ribosondas antisentido, que fueron generadas con el kit DIG RNA labeling (Boerhinger Mannheim), a partir de los plásmidos pertinentes. Las concidiones de hibridación por absorción, lavado y detección por CDP star fueron como se describió por el fabricante. La sonda "común" EST111410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD EU) contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 2535-4678, la sonda específica del exon 1 contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 65-769 y la sonda específica del exon 2 contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 815-3183. 6.1.7 PRODUCCIÓN DE ANTISUEROS El antisuero 472 (AS 472) fue generado por Research Genetics, Inc. (Huntsville AL, EU) contra el péptido sintético P472, SYDSIKLEPENPPPYEEA (secuencia de bovino; SEQ ID NO: 33), que corresponde a una secuencia de aminoácido Nogo de rata en 623 hasta 640 de la SEQ ID NO: 2, con tres desacoplamientos. El antisuero Bruna (AS Bruna) fue generado contra un fragmento de proteína Nogo recombinante, expresada en E . Coli como una proteína de fusión. Específicamente, el carboxilo terminal de la secuencia de nucleótidos de Nogo A de rata que codifica los aminoácidos 762 a 1163 de la SEQ ID NO: 2 (expresada en E. coli utilizando el sistema Novagen pET) fue utilizado para generar los antisueros anti-Nogo AS Bruna. 6.1.8 ELECTROFORESIS Y ABSORCIÓN WESTERN Los análisis en SDS-PAGE y Western blot se realizaron por los métodos normales bien conocidos para los trabajadores expertos. Los anticuerpos fueron diluidos como sigue: AS Bruna 1: 7,500; AS 472 1: 2,000; anti-myc (9E10) 1: 5,000 Invitrogen); anti-BiP 2 µg/ml (Stressgen) ; mAb IN-1 sobrenadante del hibridoma se utilizó no diluido. Los anticuerpos secundarios fueron: anti-conejo conjugado con HRP (Pierce; 1: 2,000); IgM anti-ratón (1: 50,000); y anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Milan Analytica AG, LaRoche, Suiza; 1: 5,000) . 6.1.9 INMUNOHISTOQUÍMICA La médula espinal o cerebelo de rata adulta fueron rápidamente disecados, introducidos en un compuesto OTC y congelados a -40°C. Se cortaron 20 secciones post-mortem y fueron fijadas en etanOl/ácido acético a 40°C. Se realizó la inmunotinción como se describe en Rubin y col., 1994, J. Neuorocytol. 23: 209-217, excepto que se omitió el paso de extinción. De otro modo, las secciones de tejido fueron fijadas en metanol (2 minutos a -20°C), y la inmunotición se realizó como en Rubin y col., supra . Los anticuerpos primarios utilizados fueron (anticuerpo: (dilución)): sobrenadante de hibridoma de IN-1: (no diluidos); AS Bruna: (1: 5,000); o AS 472 purificado por afinidad: (1: 50) . 6.1.10 ENSAYO DE PROPAGACIÓN DEL FIBROBLASTO NIH 3T3 Los fibroblastos NIH 3T3 fueron plaqueados en cajas de cultivo precubiertas con 5 µg/pozo (=1 cm2) q-pool. Q-pool es las fracciones activas combinadas del extracto de la médula espinal de bovino separadas en una columna (Q sepharose. Se utilizó IN-1 como sobrenadante de cultivo no diluido (1-10 µg/ml), AS Bruna y suero preinmune fueron diluidos 1: 1000 en PBS, y AS 472 y suero preinmune fueron diluidos 1: 500 en PBS. Para compensar variaciones en la actividad en diferentes preparaciones de q-pool el número de las células inhibidas, redondas plaqueadas en q-pool fue normalizado al 100% y hasta 0% plaqueadas en control de solución amortiguadora (Spillman y col., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19283-93). 6.1.11 ENSAYO DE EXCRECENCIA DE NEURITAS DRG Los ganglios radiculares dorsales (DRG) fueron disecados de pollos embriónicos E16 en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) , divididos en dos partes y plaqueados sobre cajas precubiertas con q-pool en 100 µl de medio F12 con 10% FCS y 1% de metocel. La excrecencia de las neuritas a partir de los DRG individuales fue clasificada después de 24 horas de incubación a 37 °C en una forma semicuantitativa utilizando una escala de 0 (sin excrecencia) hasta 4 (máxima excrecencia) . 6.1.12 ENSAYO DE CO-CULTIVO DRG/NERVIO ÓPTICO Los nervios ópticos fueron disecados de ratas adultas, irradiados con 5500 Grays e inyectados con AS 472 o el suero preinmune correspondiente (dilución 1:10). Los pares de nervios fueron cultivados en tres cámaras de cultivo de modo que un extremo de cada nervio llegara a través de una barrera de grasa de silicona/anillo de teflón hasta la mitad de la cámara, donde se colocaron neuronas DRG primarias cultivadas y disociadas de ratas P0. Después de dos semanas en cultivo, los nervios fueron fijados por las técnicas normales conocidas e incrustados para microscopía electrónica (EM) , y secciones ultradelgadas fueron tomadas a una distancia de aproximadamente 3.5 mm del resto expuesto de los DRG. Las secciones fueron analizadas de manera sistemática para la presencia de axones en nuevo crecimiento utilizando un aparato Zeiss EM 902. 6.1.13 EXPRESIÓN DE NOGO A EN CÉLULAS COS El marco de lectura abierto de Nogo A fue subclonado en el vector pcDNA3. lmychis (Invitrogen) utilizando las técnicas de clonación normales conocidas. El plásmido resultante (Nogo-mycl9) dio origen a una proteína recombinante que contenía la secuencia Nogo A fusionada a la etiqueta myc-his (21 aminoácidos) . El plásmido Nogo-mycl9 (2 µg DNA por placa de 35 mm) o el plásmido control (pcDNAmychisLacZ) fueron transfectados en células COS utilizando superfect (Quiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas fueron cosechadas 36-48 horas después de a transfección. Con base en la tinción inmunofluorescente con anticuerpo anti-myc y la reacción enzimática de color con ß-galactosidasa, se estimó el promedio de lactasa de transfección en aproximadamente 20%. Las células COS transfectadas fueron fijadas con 95% etanol/5% ácido acético (4°C, 25 minutos), bloqueadas en PBS/10% FCS, e incubadas con AS Bruna (1: 200) o IN-1 (1: 2) durante 2 horas en PBS/1% FCS a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas con PBS y reaccionaron con anticuerpos secundarios fluorescentes (FITC anti-conejo de cabra para AS Bruna y TRITC anti-ratón de cabra para detección de IN-1, Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, PA) . 6.1.14 CULTIVOS DE OLIGODENDROCITOS Los oligodendrocitos aislados de cerebro de rata recién nacida fueron plaqueados en matraces con polilisina de 75 cm2 (Sigma, St. Louis, MO) y cultivados durante 10-12 días en DMEM complementado con 5% FCS. Las poblaciones enriquecidas, combinadas de los oligodendrocitos y sus progenitores fueron liberados de la monocapa astrocito agitado durante la noche a 210 rpm en un agitador orbital. Las células fueron plaqueadas a una densidad de 1-2 x 106 células en cajas de 35 cm2 cubiertas con poli-lisina. Se permitió que los progenitores se diferenciaran en medio químicamente definido (CDM) durante 3-4 días. 6.1.15 BIOTINILACIÓN DE LA SUPERFICIE CELULAR Los cultivos de cerebros completos de rata P4 fueron preparados como se describe en van der Haar, y col., (1998, J. Neurosci. Res. 51: 371-81). El día 7 in vi tro estos fueron biotinilados con EZ-LINK-sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) impermeable para las células como se describe, excepto que todos los pasos fueron realizados a 15°C y las células lisadas en 1 mí de buffer de lisis (NaH2P04 0.05M, pH 8.0, NaCl 0.15M, CHAPS al 0.5% (Sigma), yodacetamida 2.5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 0.1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina A) . Las proteínas biotiniladas fueron inmunoprecipitadas con Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) sometidas a SDS-PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa que fueron sondeadas con AS 472, a-BiP y a-ß-tubulina. Las membranas fueron tratadas con el kit Re-Blot Western blot Recycling (Chemicon) . 6.1.16 INMUNOCITOQUÍMICA Oligodendrocitos de nervio óptico fueron preparados como se describe en Schawab y Caroni (1988, J. Neurosci. 8: 2381-2393). Los cultivos de dos días fueron incubados con AS 472 (1: 200) o mAb IN-1 (1: 3) en medio durante 25 minutos a temperatura ambiente (ta) . Los cultivos fueron lavados, fijados con 4% para formaldehído/5% sacarosa en PBS, y bloqueados en ácido maléico 0.1 M/2% reactivo bloqueador (Boehringer Mannheim) durante 1 hora. Los anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina, secundarios (Milan Analytica) fueron utilizados en una dilución 1: 7500 en ácido maléico 0.1 M/1% reactivo bloqueador (1 hora, ta) . Las células COS transfectadas fueron fijadas con 95% etanol/5% ácido acético (4°C, 25 minutos), bloqueadas e incubadas con AS Bruna (1: 200) o mAb IN-1 durante 2 horas a ta. Las células reaccionaron con FITC anticonejo de cabra y TRITC anti-ratón de cabra (Jackson Immuno Research Lab) . 5 6.1.17 CÁMARA DEL NERVIO ÓPTICO Los pares de nervios ópticos fueron cultivados en un sistema de tres cámaras de cultivo como se describió en Schwab y col., (1988, J. Neurosci. 8. 2381-2393), • 10 inyectados con y expuestos a AS 472 o el suero preinmune correspondiente (1: 10). Los nervios ópticos fueron incrustados para microscopía electrónica (EM) y se tomaron secciones ultradelgadas a una distancia de aproximadamente 3.5 mm a partir del muñón expuesto de los 15 DRG. Las secciones fueron analizadas de manera sistémica para la presencia de axones en recrecimiento utilizando un microscopio Zeiss EM 902. • 6.2 RESULTADOS EXPERIMENTALES 20 La siguiente sección describe los resultados experimentales que se obtuvieron de las secciones de los métodos establecidas en 6.1 y subsecciones. 6.2.1 AISLAMIENTO DE cDNA DE NOGO 25 El homólogo bovino de NI-250 de rata fue purificado, bNI220, y los péptidos de la proteína purificada fueron generados por digestión con proteasa. Los oligonucleótidos degenerados marcados con digoxigenina múltiple fueron diseñados de acuerdo con seis diferentes 5 secuencias del péptido bNI220. Algunos clones de cDNA fueron aislados a partir de la detección de una biblioteca de materia blanca de bovino utilizando estos oligonucleótidos. El inserto del clon más largo (CWP1-3, —^ Figura la) se utilizó para sintetizar sondas para la 10 detección ulterior de bibliotecas de cDNA de rata. Los clones seleccionados de tales detecciones se muestran en la Figura la. El análisis de la secuencia de DNA de estos clones cDNA sugirió que tres diferentes transcritos se originan de un gen, y este gen fue denominado Nogo. Los 15 transcritos diferentes probablemente resultan del uso de un promotor alternativo y empalme alternativo (Nogo A, Nogo B y Nogo C; Figura lb) . Las secuencias de DNA fueron f? compiladas a partir de los clones que se muestran en la Figura ÍA para crear el transcrito A, la secuencia de DNA 20 del cual se muestra en la Figura 2a. La traducción conceptual de los tres transcritos da origen a productos proteínas denominadas Nogo A (1163 aminoácidos), Nogo B (360 aminoácidos) y Nogo C (199 aminoácidos) . Dado que Nogo A contiene las seis 25 secuencias peptídicas obtenidas de bNI220 purificado (Figura 2b), probablemente sea equivalente a la proteína purificada, NI-250 de rata. Nogo A, Nogo B y C tienen un • carboxilo terminal común de 188 aminoácidos (el dominio común) y Nogo A y B comparten un amino terminal de 172 5 aminoácidos. Nogo A es más grande que Nogo B por 803 aminoácidos debido al empalme alternativo. Ninguna de las isoformas de Nogo posee un tramo hidrofóbico de aminoácidos en el N-terminal, que puede —^ utilizarse como un péptido señal tradicional. No 10 obstante, se han descrito las proteínas con ausencia de un péptido señal tradicional pero todavía son transferidas a través de membranas, por ejemplo, el factor de crecimiento del fibroblasto (Florkiewicz y col., 1995, J. Cell. Physiology, 162: 388-399), el factor 15 neurotrófico siliar (Sendtner y col., 1994, J. Neurobiology 25: 1436-1353) e interleucina-1 (Rubartelli y col., 1990, EMBO J. 9: 1503-1510). Las proteínas de la w? membrana como pueden ser sin comisuras (Tear y col., 1996, Neuron 16: 501-514) también carecen de un péptido 20 señal tradicional pero se insertan en la membrana. Aunque no hay un codon antisentido en marco en la región 5' no traducida, putativa que defina de manera inequívoca el codón de inicio. La siguiente evidencia sugiere que la metionina indicada en la Figura 2A es el 25 codón de inicio para Nogo A y Nogo B: (1) la secuencia alrededor de este codón de inicio supuesto conforma bien con la secuencia consenso para los sitos de inicio de la traducción (GCCGCC A/G CCATGG; SEQ ID NO: 39); (2); se han hecho grandes esfuerzos para buscar más secuencias 5 corriente arriba mediante detección de bibliotecas y 5'- RACE. Ninguna de estas búsquedas ha dado origen a la identificación de más secuencias corriente arriba, y (3) Nogo A recombinante, eucariótico expresado a partir de la metionina antes mencionada tiene un peso molecular • 10 aparente de aproximadamente 200 kD, como se estima por SDS-PAGE, que no puede distinguirse de Nogo A endógeno proveniente de oligodendrocitos de rata (Figura lia) . 6.2.2 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE NOGO 15 Nogo A contiene 7 sitios de N-glucosilación potenciales, no obstante, evidencia química indica que Nogo A no tiene un componente polisacárido principal. flB Nogo A también tiene 19 sitios de reconocimiento para PKC, y siete sitios de reconocimiento para caseína cinasa 20 II (Figura 2a) . Los tres Nogos tienen dos dominios hidrofóbicos carboxilo terminales comunes de 35 y 36 aminoácidos, respectivamente. Cualquiera de estos o ambos puede utilizarse como dominios de trans o intramembrana, lo cual es consistente con la caracterización de bNl220 25 como una proteína de membrana integral. Nogo A (así como Nogo B y C) no contiene motivos de moléculas de adhesión a la célula, proteínas de la matriz extracelular u otras moléculas guía conocidas. Se utilizaron las secuencias de Nogo para buscar genes homólogos en diferentes bases de datos, el dominio común carboxilo terminal de los tres productos Nogo es similar (62.5%) a un gen humano identificado, nsp ( cll3 y s-rex en rata y chs-rex en pollo) (Figura 3) . Una EST de C. elegans y una EST de Drosophila melanogaster también tienen similitud importante (16.6% y 13.6%, respectivamente) a Nogo y nsp en esta misma región. Los dominios carboxilo terminales de 180 aminoácidos de los Nogo y nsp son altamente conservados a través de las especies de mamíferos (98.3% y 97.3%, respectivamente), lo cual sugiere que estos pueden realizar funciones similares y esenciales. Fuera de esta región, la similitud para una proteína determinada entre especies también es alta (73% entre Nogo A de rata y bovino; 76.2% entre NSP-A y S-rexb; 50% entre Chs-rexb y NSP-A o S-rexb) . La similitud entre los nsp y los Nogo es, no obstante, limitada a su dominio común carboxilo terminal, hidrofóbico (Figura 3a), y a la naturaleza acida de las proteínas fuera de esta región conservada. Los NSP (NSP-A, -B y C) han sido descritos con anterioridad como productos específicos neuroendocrinos con funciones desconocidas. La hibridación in situ e inmuno histología mostró una ubicación neuronal de los NSP en el sistema • nervioso. Otro gen humano, 1 tipo NSP, que también tiene una región hidrofóbica carboxilo terminal con 50% de 5 similitud para Nsp y Nogo ha sido identificado en fechas recientes . 6.2.3 EXPRESIÓN TISULAR DE NOGO —^ Se examinó el patrón de expresión de Nogo por 10 Northern blot e hibridación in situ. Cuando se utilizó una sonda "común" (Sección 6.1.6), se detectaron tres transcritos de Nogo principales (denominados: A, 4.6 kb; B, 2.6 kb; y C, 1.7 kb) en el medio óptico, médula espinal y la corteza cerebral (Figura 4a) . En los 15 ganglios radiculares dorsales solo se detectaron dos transcritos más grandes. Se detectó un transcrito principal de 2.6 kb en células PC12, mientras que se k detectó una banda de 4.6 kb solo después de exposiciones prolongadas (Figura 4a) . En el nervio sciático se 20 detectaron menores niveles de los transcritos siendo la banda de 2.6 kb el transcrito principal. Cuando la médula espinal y poli(A)+RNA de células PC12 fueron hibridados para una sonda específica del exon 1, solo se detectaron los transcritos de 4.6 kb y de 2.6 kb; cuando los 25 poli(A)+RNA del rombencéfalo y músculo esquelético fueron hibridados a una sonda específica ael exon 2, solo se detecto el transcrito de 4.6 kb en rombencéfalo (Figura • 4b) . Estos resultados comprueban el mapa del transcrito que se muestra en la Figura IB. Los resultados del 5 análisis Northern blot, no obstante, también demostraron que la expresión de Nogo no esta limitada al sistema nervioso (Figura 4c) ; los transcritos Nogo también fueron detectados en músculo esquelético (1.7 kb) , riñon (2.6 kb y 1.7 kb) cartílago (del tórax, 1.7 kb) , piel (1.7 kb) , 10 pulmón (2.6 kb) y bazo (2.6 kb) . Salvo para el músculo esquelético, que expresa los transcritos de Nogo C en un alto nivel, el nivel de los transcritos de Nogo fuera del sistema nervioso es menor que el ael sistema nervioso. Hasta ahora, los transcritos de Nogc A de 4.6 kb parecen 15 ser únicamente transcritos en el sistema nervioso. Las hibridaciones in situ en secciones de tejido de CNS de rata adulta utilizando la sonda común mostró marcado moderado de filas de cuerpos celulares en la materia blanca de algunas partes del cerebro y la médula 20 espinal. Este arreglo es común de los oligodendrocitos interfasciculares (Figura 5a, d, . Además de los oligodendrocitos, algunos tipos ae neuronas también expresan los transcritos de Nogo a niveles altos (Figura 5c, e) . En cerebelo, la doble tinción de las secciones 25 con un anticuerpo anti-GFAP y la hibridación in situ mostraron claramente un fuerte marcado de las células de Purkinje mediante la sonda Nogo, mientras que los • astrocitos no fueron marcados (Figura 5e, f) . En los nervios ópticos en desarrollo, los transcritos de Nogo 5 fueron detectados tan pronto como en el día 0 posterior al nacimiento (PO), es decir, algunos días antes de que se pudieran detectar los mRNA de la proteína proteolipídica (PLP) de las proteínas principales de mielina y la proteína básica de mielina (MBP) (Figura 6) . 10 El tiempo es consistente con la aparición de los primeros oligodendrocitos positivos para galactocerebrósidos y la expresión de la actividad de inhibición del crecimiento de las neuritas, que puede ser neutralizada por IN-1. Los antisueros fueron generados contra un péptido 15 sintético basado en una secuencia específica de Nogo A de bovino (AS 472), y contra un Nogo A de rata, parcial, recombinante de 45 kD (AS Bruna) (Sección 6.1.7). AS 472 flB y AS Bruna cada uno reconoció una proteína de aproximadamente 200 kD en mielina de bovino, y AS Bruna 20 además reconoció una proteína mielina de rata de 200 kD en Western blot (Figura 7). Las secciones de la médula espinal y cerebelo de rata adulta fueron teñidas con AS 472, AS Bruna e IN-1. Cuando se fijaron las secciones con etanol/ácido acético (un procedimiento que al principio 25 mostró ser necesario para la preservación y accesibilidad de los antígenos de IN-1) se observó fuerte tinción de la materia blanca/mielina con los tres anticuerpos (Figura • 8) . La tinción de los cuerpos celulares oligodendrocitos fue particularmente distinta con AS Bruna. El tratamiento 5 de las secciones recién congeladas con metanol en lugar de etanol/ácido acético inhibió la tinción de mielina excepto para los cuerpos celulares de los oligodendrocitos . ^^ AS Bruna y AS 472 también tiñeron algunos tipos de 10 neuronas incluidas las neuronas motoras en la médula espinal, y las capas granulares y moleculares en el cerebelo. Las células de Purkinje se tiñeron fuertemente con AS 472 y AS Bruna, pero no hubo tinción detectable con IN-1. 15 6.2.4 LOS ANTICUERPOS DE NOGO INHIBEN LA INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO INDUCIDA POR NOGO IN VITRO flB Las preparaciones de NI-220 de la médula espinal de bovino, semipurificadas (q-pool) pueden evitar la 20 propagación del fibroblasto NIH 3T3 y la excrecencia de las neuritas. En presencia de antisueros de Nogo, como AS Bruna, AS 472 o IN-1, se redujo la actividad inhibitoria de q-pool, es decir, los fibroblastos NIH 3T3 sufrieron propagación y los ganglios radiculares dorsales (DRG) de 25 pollo embriónico extendieron las neuritas sobre las placas cubiertas con q-pool (Figura 9). La especificidad se demostró mediante la adición del péptido p472, que fue el péptido que se utilizó para aumentar AS 472 (Sección 6.1.7). P472 bloqueó con buenos resultados el efecto 5 inhibidor de AS 472 mientras que, un péptido control no tuvo efecto sobre la inhibición. Además, la presencia de Nogo A sobre la superficie celular de los oligodendrocitos se demostró por medio inmunocitoquímico, funcional y bioquímico utilizando AS 10 472. Cuando los oligodendrocitos de un cultivo primario de hígado fueron teñidos con mAb IN-1 o AS 472 se observó una tinción superficial relativamente débil (en comparación con la inmunocitoquímica para galactocerebrósido) pero clara sobre los oligodendrocitos 15 diferenciados (Figura 15a, c) . La adición del péptido competente (P472) para AS 472 o la omisión del anticuerpo primario inhibió la tinción específica (Figura 15b, d) . fl| La biotinilación de la superficie celular y la ulterior precipitación con estreptavidina además probó la 20 presencia de Nogo A sobre la membrana plasmática de los oligodendrocitos. En el precipitado, AS 472 detectó una banda que corría aproximadamente 40 kD sobre la banda inmunopositiva de AS 472 intracelular, probablemente no procesada y no glucosilada. La proteína ER BiP no pudo 25 ser detectada en la fracción biotilinada (Figura 15e) .

Nogo A como una molécula de la superficie celular de los oligodendrocitos también fue analizada funcionalmente. El co-cultivo de los oligodendrocitos y los fibroblastos NIH 3T3 o los oligodendrocitos y las 5 neuronas DRG mostró claramente las propiedades inhibitorias de los oligodendrocitos maduros. Estos ensayos demuestran que los fibroblastos NIH 3T3 y las neuritas DRG evitaron fuertemente el territorio de los ^^ oligodendrocitos, un efecto que fue neutralizado por el 10 mAb IN-1. En presencia de AS 472, esta inhibición se redujo de igual manera (Figura 16a, b y e, f) , mientras que la preincubación de AS 472 con P472 restableció la inhibición mediada por los oligodendrocitos (Figura 16c, d y g, h) . La cuantificación mostró la capacidad 15 neutralizante altamente importante de mAb IN-1 y de AS 472 en ambos tipos de ensayos (Figura 16i y j). RecNogo-A (Figura 17a) producidos por una línea de w? células CHO transfectadas de manera estable fue probado para su actividad en la propagación de los fibroblastos 20 NIH 3T3 y la excrecencia de las neuritas DRG. La beta- galactosidasa producida de manera recombinante aislada de una línea de células CHO estable (CHO-LacZ) fue enriquecida en paralelo con RecNogo A y se utilizó como control para la actividad inhibitoria de las proteínas 25 CHO endógenas en ambos ensayos. En el ensayo de propagación de los fibroblastos NIH 3T3, el extracto de CHO conteniendo RecNogo-A (Nogo A: aproximadamente 1-5% • de la proteína total; Figura 9a) mostró claros efectos inhibitorios sobre la propagación celular a 10 µg/cm2 5 (Figura 17b). Este efecto fue dependiente de la dosis: a 20 µg/cm2 la actividad inhibitoria fue mayor, mientras que 5 µg/cm2 no fue inhibitorio (no se muestran los datos) . La actividad inhibitoria se pudo neutralizar a niveles del fondo mediante preincubación de la proteína 10 recubierta con mAb IN-1 o AS Bruna, mientras que un anticuerpo control contra galactocerebrósido (mAb 01) o AS Bruna suero preinmune no tuvieron efecto (Figura 17b) . Además de su efecto fuerte sobre la propagación de los fibroblastos NIH 3T3, el extracto CHO conteniendo 15 RecNogo-A, pero no el extracto CHO-LacZ tuvo un efecto inhibidor potentes sobre la excrecencia de las neuritas de las neuronas cultivadas primarias: las neuronas DRG disociadas fueron inhibidas por RecNogo-A en una forma dependiente de la dosis (Figura 17c) . Esta actividad 20 inhibitoria pudo ser neutralizada por mAb IN-1, pero no por el control mAb 01 (Figura 17c-e) . La proteína recombinante aislada de CHO-LacZ no fue inhibitoria a 1 y 5 µg, y la adición de mAbs 01 o IN-1 no tuvo efecto sobre la excrecencia de las neuritas. 25 6.2.5. NUEVO CRECIMIENTO DE LAS NEURITAS IN VITRO Se investigó la capacidad de las neuritas DRG de rata recién nacida para regenerarse y crecer a través del tejido del CNS adulto. Pares de nervios ópticos fueron 5 disecados de ratas adultas y cultivados en sistemas de cámaras de cultivo especiales de modo que las neuritas DRG tuvieran acceso a un extremo de cada nervio (Figura 10a) . En cada cultivo, uno de los dos nervios fue —^ inyectado con y expuesto a suero de conejo preinmune, el 10 segundo nervio fue inyectado con AS 472, el cual también estuvo presente en la cámara lateral alrededor del nervio. Después de dos semanas in vi tro en presencia de NGF, los cultivos fueron fijados, desensamblados e incrustados para microscopía electrónica (EM) . Se tomaron 15 secciones para EM aproximadamente 3.5 mm desde el extremo del nervio en contacto con las neuronas DRG. Los nervios inyectados con suero preinmune no contenían o solo flB contenían algunos axones (Figura 10b) . Estos últimos se encontraron exclusivamente asociados con membranas 20 básales y astrocitos en la superficie de los nervios. Por el contrario, la mayor parte de los nervios ópticos inyectados con AS 472 contenían números considerables de axones, con frecuencia hasta de varios cientos. Se pudo observar con frecuencia contacto con mielina (Figura 10c, 25 d) . 6.2.6 RECONOCIMIENTO DE NOGO A RECOMBINANTE POR IN-1 Cuando Nogo A fue expresado como una proteína recombinante etiquetada con myc-his carboxilo terminal en células COS transfectadas, el análisis Western blot utilizando el anticuerpo anti-myc y AS Bruna demostró que el Nogo A recombinante tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD en geles SDS desnaturalizantes (Figura lia) . En la misma banda, se detectó una banda de movilidad similar mediante AS Bruna en oligodendrocitos cultivo primario de rata, sugiriendo que Nogo A recombinante tiene un peso molecular casi idéntico como Nogo A endógeno de oligodendrocitos (Figura la) . Cuando las células COS transfectadas fueron teñidas por inmunofluorescencia con IN-1 y AS Bruna, IN-1 y AS Bruna reconocieron las mismas células transfectadas (Figura llb, c) . La mayor parte de la inmunorreactividad fue ubicada en forma intracelular y fue accesible solo después de permeabilización. 6.2.7 MAPEO DE LA(S) REGIÓN (ES) ACTIVA DE NOGO Se generó una serie de mutantes por deleción de Nogo con el fin de determinar el (los) dominio (s) o región (es) inhibitoria (s) de Nogo. Las construcciones por deleción del gen Nogo fueron generadas utilizando sitios de restricción internos, digestiones con exonucleasa III-frijol de garbanzo y reacciones en cadena de la polimerasa. Una descripción de los mutantes se proporciona en la Figura 18 y su Breve Descripción. La mayor parte de las construcciones tienen una etiqueta T7 N-terminal para identificación con anticuerpos monoclonales anti-T7; y una etiqueta exahistidina N ó C terminales ("etiqueta-His") para purificación utilizando cromatografía por afinidad con Co(II) inmovilizado. Los mutantes por deleción de Nogo, denominados NiG-Dl, NiG-D2, hasta NÍG-D20, todos fueron probados utilizando el ensayo de propagación de los fibroblastos NIH 3T3 para determinar la actividad inhibitoria. Algunos mutantes fueron probados en ensayos de excrecencia de neuritas PC12, ensayos de excrecencia de neuritas DRG de rata, disociadas o la franja del ganglio retinal. Los resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente.

Tabla 2 . Actividades funcionales de los mutantes por deleción de Nogo .

Se registra un resultado positivo en el ensayo de los fibroblastos NIH 3T3 (3T3) o el ensayo PC12 cuando los fibroblastos o las células PC12 son inhibidos de propagación sobre la placa cubierta con una preparación de Nogo obtenida de un mutante por deleción. Un resultado positivo en el ensayo de excrecencia de las neuritas del ganglio radicular dorsal (DRG) de pollo embriónico o el ensayo del colapso del cono de crecimiento ganglionar (RGC) indica que la excrecencia de las neuritas es inhibida o que el cono de crecimiento se colapsa en presencia de una preparación de Nogo obtenida de un mutante por deleción.

Los datos indican que se identificó un dominio inhibitorio principal en la región específica de Nogo A a partir de los números de aminoácidos 172-974, particularmente los números de los aminoácidos 542-722. Además, la secuencia N-terminal de Nogo A y Nogo B (números de aminoácidos 1-171) también fue inhibitoria para la propagación 3T3. Con base en los resultados, las regiones de Nogo de los números de aminoácidos 172-259, y de los números de aminoácidos 975-1162 parecen ser no esenciales y pueden ser eliminados sin pérdida de la actividad inhibitoria. 7. EJEMPLO: ÁCIDOS NUCLEICOS NOGO HUMANOS Y PROTEÍNAS, DERIVADOS Y FRAGMENTOS La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Nogo humana, y los fragmentos de las proteínas Nogo humanas, incluidos los equivalentes humanos para Nogo A, Nogo B y parte de Nogo C de rata. La secuencia de aminoácidos Nogo humana esta representada en la Figura 13 y ha sido asignada con la SEQ ID NO: 30. La presente invención también proporciona las secuencias de nucleótidos de los fragmentos del gen Nogo humano. La secuencia de nucleótidos Nogo humana puede ser determinada utilizando el transcrito Nogo A de rata como un auxiliar para alinear y empalmar entre sí etiquetas de la secuencia expresada (EST) humanas que sean homologas a la secuencia de cDNA de rata o bovino. Por ejemplo, las EST AA081783 y AA333267 (Sección 5.1) se superponen entre sí y corresponden a las posiciones de los ácidos nucleicos 765 a 1272 de Nogo A de rata (Figura 2a; SEQ ID NO: 1) . Las EST AA322592, AA092565 y AA081525 (Sección 5.1) también se superponen entre sí y las secuencias que se superponen corresponden a los ácidos nucleicos 1642 hasta 2131 de Nogo de rata. Estas dos series independientes de las EST traslapantes no pueden ser alineadas para obtener la secuencia humana sin comparación de computo directa con la secuencia de nucleótidos Nogo de rata o bovino de la presente invención. Para el alineamiento de computo inicial, es preferible ENTREZ Nucleotide QUERY. Otros programas para alineamiento por cómputo se mencionan en la Sección 5.1, como ejemplos alternativos y no se entienden para limitar el alcance de los programas de cómputo que pueden utilizarse. 8. DISCUSIÓN 8.1. CLONACIÓN DE NOGO INHIBIDOR DEL CRECIMIENTO DE LAS NEURITAS Nogo A tiene múltiples propiedades que lo soportan como NI-250 de rata anteriormente aescrita, una proteína inhibitoria importante para la excrecencia de las neuritas de mielina del CNS y el antígeno del IN-1. A nivel molecular, Nogo A contiene todos los 6 péptidos originalmente obtenidos mediante secuenciación de bNI-220, el componente más inhibidor de mielina de la médula espinal de bovino. A nivel de expresión, los oligodendrocitos son el tipo de célula principal en el CNS de adulto para la expresión de Nogo A, y el tiempo de expresión de Nogo en el nervio óptico coincide con la descripción anterior de una actividad inhibitoria de mielina neutralizada por IN-1 para el crecimiento de las neuritas. Además, el análisis Western blot reveló la presencia de Nogo A en fracciones q-pool activas, y la materia blanca de diferentes regiones del CNS fue teñida con AS Bruna así como AS 472 (específico para Nogo A) en un modelo idéntico al de IN-1. Ambos hechos concuerdan con la interpretación que Nogo A es NI-250. Dos antisueros aumentados contra las secuencias de Nogo A, AS Bruna y AS 472, disminuyeron en gran medida la actividad inhibitoria de una preparación de médula espinal de bovino parcialmente purificada (q-pool) . AS 472 también permitió el crecimiento hacia adentro de grandes números de axones de los ganglios radiculares dorsales por algunos milímetros en explantes de nervio óptico adulto, muy similar a IN-1. Aunque el peso molecular calculado de Nogo A es aproximadamente 140 kD, éste tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD en geles de SDS desnaturalizantes, lo cual está en el intervalo de la estimación previa de aproximadamente 250 kD. La movilidad aberrante de Nogo A en geles SDS probablemente es causada por su naturaleza acida más que por modificaciones posteriores a la traducción. La movilidad aberrante de las proteínas en SDS-PAGE ha sido postulada para proteínas altamente acidas como la proteína asociada al crecimiento GAP-43, así como NSP-A. Además, Nogo A recombinante expresada por medios bacterianos tiene el mismo peso molecular aparente como el de Nogo A endógena expresada por oligodendrocitos de rata. Esto argumenta contra modificaciones importantes de Nogo A mediante mecanismos como glucosilación. 8.2 NOGO IMPIDE LA REGENERACIÓN Y LIMITA LA PLASTICIDAD DEL CNS ADULTO La expresión de Nogo en los oligodendrocitos del nervio óptico de rata de P0 esta de acuerdo con los hallazgos tempranos de una actividad inhibitoria del crecimiento de las neuritas que puede ser neutralizada por IN-1. Es interesante señalar que esta expresión precede la de las proteínas mielina principales, y la formación de mielina compacta por varios días. La aparición de Nogo, posiblemente en respuesta a las señales axonales, podría impedir crecimiento adicional 5 del axon en tractos de fibras correspondientes (números máximos del axon en E20 en nervios ópticos de rata) . Nogo también podría inhibir la formación colateral y por este medio estabilizar la estructura general del CNS ^^ diferenciado. En materia gris de diferentes regiones del 10 CNS, el contenido de mielina y la inmunorreactividad de IN-1 se correlaciona de manera inversa con el nivel de GAP-43 y el potencial plástico de las regiones determinadas. En realidad, los anticuerpos IN-1 aplicados al CNS adulto permiten que ocurra el retoño y plasticidad 15 en el tronco encefálico y la médula espinal hasta un grado conocido anteriormente solo del CNS del recién nacido. La gran recuperación funcional que se asemeja a P esta plasticidad indica que los axones que retoñan pueden formar conexiones con función adecuada. 20 Ya se ha demostrado que la respuesta de las neuronas a los Nogo inhibidores difiere entre neuronas de diferentes edades. Se supone que esto se debe a una expresión diferencial de los receptores, lo cual será caracterizado pronto. Al igual que para las netrinas y 25 muchos factores de crecimiento, sigue siendo una posibilidad la existencia de diferentes receptores de Nogo, los cuales activan diferentes respuestas. El hecho de que los Nogos también se expresen en algunos tipos de neuronas señala posibles interacciones entre las mismas y/o diferentes isoformas de Nogo. 8.3 NOGO PERTENECE A UNA NUEVA FAMILIA DE MOLÉCULAS REGULADORAS DE NEURITAS El análisis de la secuencia de Nogo no revela motivos conocidos de las proteínas de la superficie celular o matriz involucradas en la guía axonal (repulsiva o atractiva) ; es decir, no se pudieron identificar inmunoglobulina, fibronectina tipo III o dominios EGF. Ni hubo homología para los inhibidores del crecimiento neural descritos, las semaforinas, las netrinas o las efriñas. Los Nogos forman una familia novedosa con un grupo de proteínas recién descritas, las proteínas NSP/srex y las proteínas 1 tipo NSP, con base en la similitud de sus 180 aminoácidos carboxilo terminales. Igual que en el caso de Nogo, el uso de promotor alternativo (el gen Nsp y uno tipo Nsp) y el empalme alternativo (solo Nsp) son responsables de la producción de productos proteínas alternativos con carboxilos terminales comunes conteniendo dos tramos de aminoácidos hidrofóbicos. Como su nombre lo indica, las NSP (proteínas específicas neuroendocrinas) se expresan principalmente en las neuronas y en los diferentes tipos de células endocrinas. Estas se localizan principalmente intracelulares en asociación con el retículo endoplásmico. El gen 1 tipo NSP se expresa principalmente en cerebro y músculo. No se conocen las funciones de las familias NSP ni de las familias 1 tipo NSP. El hecho de los ortólogos potenciales existen en C. elegans y Drosophila melanogaster sugiere que Nogo, con su regeneración del nervio y actividad inhibitoria del retoño, puede ser un miembro recién desarrollado y hasta ahora no descrito de la familia de las NSP. 8.4 NOGO EN TEJIDOS NO NEURONALES El transcrito de Nogo C se expresa en músculo esquelético en un nivel comparable con el del sistema nervioso. Una función posible de Nogo C de músculo es repeler los axones motores y limitarlos a la región de la placa terminal motora. Los bajos niveles de expresión de Nogo también pueden ser detectados en otros tejidos no nerviosos. La inhibición observada de la propagación de los fibroblastos y astrocitos por extracto de mielina y NI-250 alude a la presencia de los receptores y mecanismos de respuesta para las proteínas Nogo en estas células. Esto sugiere una posible función general de los Nogo en contacto con la inhibición del movimiento celular. La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. En realidad, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y las figuras que le acompañan. Tales modificaciones están propuestas para entrar dentro del alcance de las cláusulas anexas. Algunas referencias están mencionadas en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en sus enterezas.

Claims (62)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína Nogo que está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central con el cual se asocia en forma natural.

2. La proteína de la reivindicación 1 que se selecciona del grupo que consiste en: Nogo A y Nogo B.

3. La proteína de la reivindicación 2 la cual comrepnde la secuencia de aminoácidos de la Figura 2a (SEQ ID NO: 2) .

4. La proteína de la reivindicación 2, la secuencia de aminoácidos de la cual consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1-1163 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), y los residuos 1-172 fusionados a 975-1163 representados en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) .

5. Una proteína Nogo C purificada.

6. La proteína de la reivindicación 5, la cual comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32 representada en la Figura 14.

7. La proteína de la reivindicación 5, la secuencia de aminoácidos de la cual consiste en la SEQ ID NO: 32 representada en la Figura 14.

8. La proteína de la reivindicación 2 ó 5, la cual se produce de manera recombinante.

9. La proteína de la reivindicación 2 ó 5, la cual tiene la secuencia de una proteína de mamífero.

10. La proteína de la reivindicación 1, 2 ó 5 que tiene la secuencia de una proteína humana.

11. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos una sustitución de aminoácidos conservativa en la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30) o la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 14 (SEQ ID NO: 32), y que puede estar unida por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo que tenga una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1-1163 de la SEQ ID NO: 2, los residuos 1-72 fusionados a los 975-1163 de la SEQ ID NO: 2 y los residuos 1-199 de la SEQ ID NO: 32.

12. La proteína de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que está mostrando una homología mayor que 50% para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, según se determina por un algoritmo de cómputo BLAST.

13. La proteína de la reivindicación 1 que es codificada por un primer ácido nucleico que puede hibridar a un segundo ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 12 (SEQ ID NO: 28) .

14. Un fragmento purificado de la proteína de la reivindicación 1 que puede ser unido por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo, y en donde el fragmento purificado está libre de todo material mielina del sistema nervioso central.

15. Un fragmento purificado de la proteína de la reivindicación 5 u 11 que puede ser unido por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo.

16. Una proteína purificada que comprende un fragmento de una proteína Nogo que contiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 31-57 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), los residuos 11-191 representados en la Figura 14 (SEQ ID NO: 32), los residuos 988-1023 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), y los residuos 1090-1125 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), los residuos 994-1174 representados en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30) , los residuos 977-1012 representados en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30), y los residuos 1079-1114 representados en la Figura 13 (SEQ ID NO: 30) .

17. Una proteína purificada, no glucosilada que se selecciona del grupo que consiste en: Nogo A, Nogo B y Nogo C.

18. Una proteína purificada que está libre del material mielina del sistema nervioso central y que es codificada por una primera secuencia de nucleótidos que puede hibridar a un segundo ácido nucleico, el segundo ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 1) o una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 12 (SEQ ID NO: 28), cuya proteína puede ser unida por un anticuerpo dirigido contra una segunda proteína que tenga una secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2) .

19. Una proteína quimérica que comprende un fragmento de la proteína de la reivindicación 2, 5 u 11 que puede ser unida por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo, fusionada por un enlace covalente a cuando menos una porción de una segunda proteína, cuya segunda proteína es diferente del fragmento de la proteína de la reivindicación 2, 5 u 11.

20. Una molécula purificada que comprende un fragmento de la proteína de la reivindicación 1 que puede ser unida por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo, y en donde la molécula purificada está libre de todo material mielina del sistema nervioso central.

21. Una molécula purificada que comprende un fragmento de la proteína de la reivindicación 5 u 11, que puede ser unida por un anticuerpo dirigido contra una ? proteína Nogo.

22. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que 5 consiste en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 33.

23. Un ácido nucleico aislado que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que 10 consiste en los residuos 1-1163 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), los residuos 1-172 fusionados a 975- 1163 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), y los residuos 1-199 representados 15 en la Figura 14 (SEQ ID NO: 32); ó (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) .

24. Un primer ácido nucleico aislado capaz de hibridar a un segundo ácido nucleico, el segundo ácido 20 nucleico tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1- 1163 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2), los

25 residuos 1-172 fusionados a 975-1163 representados en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2) y los residuos 1-199 representados en la Figura 14 (SEQ ID NO: 32); y codifica una proteína que ocurre en la naturaleza y que es capaz de ser unida por un anticuerpo a una proteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. 25. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 24 el cual codifica una proteína Nogo humana que ocurre en la naturaleza.

26. Un primer ácido nucleico aislado que puede hibridar a un segundo ácido nucleico, el segundo ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 1) o una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 12 (SEQ ID NO: 28), y en donde el primer ácido nucleico codifica una primera proteína que puede ser unida por un anticuerpo dirigido contra una segunda proteína que tenga una secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2a (SEQ ID NO: 2) .

27. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína natural que puede ser unida por un anticuerpo a una proteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una homología de la secuencia de nucleótidos mayor que 70% a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 1-1163 de la SEQ ID NO: 2, los residuos 1-172 fusionados a los 975-1163 de la SEQ ID NO: 2 y los residuos 1-199 de la SEQ ID NO: 32, según se determina por un algoritmo de cómputo BLAST.

28. El ácido nucleico de la reivindicación 27, en el cual la proteína que ocurre en la naturaleza es una proteína humana.

29. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de una proteína Nogo que muestra una o más actividades funcionales de la proteína Nogo, en donde la proteína Nogo no es una proteína Nogo humana, una proteína Nogo de Drosophila o una proteína Nogo de Caenorhabditis elegans.

30. Un ácido nucleico aislado que comrpende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con una homología mayor que 50% para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, según se determina por un algoritmo de cómputo BLAST .

31. Un ácido nucleico aislado que codifica cuando menos 220 residuos de aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

32. Un ácido nucleico aislado que comprende las secuencias de nucleótidos de cuando menos dos etiquetas de secuencias expresadas humanas, no traslapantes seleccionadas del grupo que consiste en: AA158636 (SEQ ID NO: 35), AA333267 (SEQ ID NO: 36), AA081783 (SEQ ID NO: 37), AA167765 (SEQ ID NO: 38), AA322918 (SEQ ID NO: 39), AA092565 (SEQ ID NO: 40), AA081525 (SEQ ID NO: 41) y AA081840 (SEQ ID NO: 42). 5

33. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicación 22, 23, 24 y 25 ligado de manera operante a un promotor no nativo.

34. Un vector de expresión que comprende el ácido ( nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 22, 23, 24 10 y 25.

35. Una célula recombinante transformada con el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 22, 23, 24 y 25.

36. La célula recombinante de la reivindicación 35 15 que es una célula recombinante procariótica.

37. La célula recombinante de la reivindicación 35 que es una célula recombinante eucariótica. •

38. Un método de producción de una proteína recombinante que consiste en cultivar una célula 20 recombinante transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 22, 23, 24 ó 25 de modo que una proteína codificada por el ácido nucleico sea expresada por la célula, y la recuperación de la proteína expresada.

39. El método de la reivindicación 38, en donde la 25 célula recombinante es una célula recombinante procariótica .

40. El método de la reivindicación 38, en donde la célula recombinante es una célula recombinante eucariótica . 5

41. Un método de tratamiento a un individuo con una enfermedad neoplásica del sistema nervioso central consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de una proteína Nogo o un fragmento de — ! ésta, que esté libre de todo el material mielina del 10 sistema nervioso central con el cual la proteína Nogo se asocia de forma natural, siendo el fragmento activo para inhibir la proliferación celular.

42. El método de la reivindicación 42 [sic] en el cual la enfermedad neoplásica es glioma, glioblastoma, 15 meduloblastoma, cráneofarigeoma, ependioma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma o retinoblastoma. •

43. El método de la reivindicación 42, en el cual el individuo es un humano. 20

44. Un método de tratamiento a un individuo con daño al sistema nervioso central consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de una ribozima o un ácido nucleico Nogo antisentido que inhibe la producción de Nogo en el individuo. 25

45. Un método para inducir la regeneración o retoño de las neuronas en un individuo consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de una ribozima o un ácido nucleico Nogo antisentido que inhibe la producción de Nogo en el individuo. 5

46. Un método para favorecer la plasticidad estructural del sistema nervioso central de un individuo consiste en administrar a un individuo en quien se desea plasticidad estructural del sistema nervioso central una ?^^ cantidad terapéutica eficaz de una ribozima o un ácido 10 nucleico Nogo antisentido que inhibe la producción de Nogo en el individuo.

47. Un animal no humano, recombinante que es el producto de un proceso que consiste en introducir un ácido nucleico que codifica cuando menos un dominio de 15 una proteína Nogo en el genoma del animal, o la progenie del animal.

48. Un animal no humano, recombinante en el cual un gen Nogo ha sido inactivado o delecionado.

49. El animal de la reivindicación 48 en el cual el 20 gen Nogo ha sido inactivado por un método que consiste en introducir un ácido nucleico en el animal o un antecesor de éste, con el ácido nucleico que contiene una secuencia del gen no-Nogo flanqueada por las secuencias del gen Nogo que favorecen la recombinación homologa. 25

50. Un fragmento purificado de la proteína Nogo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974 y 975-1162 de la SEQ ID NO: 2, que está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

51. Un fragmento purificado de una proteína Nogo que carece de los residuos de aminoácidos 172-259, los residuos de aminoácidos 974-1162 o los residuos de aminoácidos 172-259 y 974-1162, de la SEQ ID NO: 2, pero de otro modo comrepnde el resto de la SEQ ID NO: 2, y que está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

52. Un fragmento purificado de la proteína Nogo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 y 940-1127 de la SEQ ID NO: 30, que está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

53. Un fragmento purificado de una proteína Nogo que carece de los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30, pero de otro modo comprende el uso de la SEQ ID NO: 30, y que está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

54. Una proteína purificada que comprende un ^^ fragmento de una proteína Nogo, cuya proteína (a) carece de los residuos de aminoácidos 172-259, los residuos de aminoácidos 974-1162 o los residuos de aminoácidos 172- 5 259 y 974-1162 de la SEQ ID NO: 2; y (b) muestra la actividad inhibitoria del crecimiento de las neuritas de la proteína Nogo, y está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

55. Una proteína purificada que comprende un 10 fragmento de una proteína Nogo, cuya proteína (a) carece de los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 o los residuos de aminoácidos 132- 206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30; y (b) muestra la actividad inhibitoria del crecimiento de las neuritas de 15 la proteína Nogo, y está libre de todo el material mielina del sistema nervioso central.

56. Un ácido nucleico aislado que codifica una ™ proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos de 20 aminoácidos 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974 y 975-1162 de la SEQ ID NO: 2.

57. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que carece de los residuos de aminoácidos 172- 259, los residuos de aminoácidos 974-1162 o los residuos 25 de aminoácidos 172-259 y 974-1162 de la SEQ ID NO: 2, pero de otro modo, comprende el resto de la SEQ ID NO: 2.

58. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 y 940-1127 de la SEQ ID NO: 30.

59. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína que carece de los residuos de aminoácidos 132-206, los residuos de aminoácidos 939-1127 o los residuos de aminoácidos 132-206 y 939-1127 de la SEQ ID NO: 30, pero de otro modo comprende el reesto de la SEQ ID NO: 30.

60. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56, 57, 58 y 59.

61. Una célula recombinante transformada con el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 56, 57, 58 y 59.

62. Una proteína de fusión que comprende el fragmento de la reivindicación 52, 53 ó 55 fusionada a una secuencia de aminoácidos de una proteína no-Nogo.