PL204293B1 - Oczyszczone białko i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy, wektor do klonowania, rekombinowana komórka, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało monoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy odpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych. - Google Patents

Oczyszczone białko i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy, wektor do klonowania, rekombinowana komórka, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało monoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy odpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.

Info

Publication number
PL204293B1
PL204293B1 PL362990A PL36299099A PL204293B1 PL 204293 B1 PL204293 B1 PL 204293B1 PL 362990 A PL362990 A PL 362990A PL 36299099 A PL36299099 A PL 36299099A PL 204293 B1 PL204293 B1 PL 204293B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nogo
protein
amino acid
nucleic acid
sequence
Prior art date
Application number
PL362990A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362990A1 (pl
Inventor
Martin E. Schwab
Maio S. Chen
Original Assignee
Univ Zuerich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22316666&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL204293(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Zuerich filed Critical Univ Zuerich
Publication of PL362990A1 publication Critical patent/PL362990A1/pl
Publication of PL204293B1 publication Critical patent/PL204293B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczone białko Nogo i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy kodujący białko Nogo, wektor do klonowania, rekombinowana komórka, sposób wytwarzania rekombinowanego białka Nogo, białko Nogo do zastosowania jako lek, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało monoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy dpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.
1. Wstęp
Zgodnie z wynalazkiem ujawniono gen Nogo, i kodowane przez niego produkty białkowe, jak również ich pochodne i analogi. Opisano także wytwarzanie białek Nogo, ich pochodnych oraz przeciwciał przeciwko takim białkom.
2. Tło wynalazku
Po uszkodzeniu w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) kręgowców wyższych nie dochodzi do regeneracji aksonów, zaś plastyczność strukturalna jest ograniczona. Inhibitory wzrostu związane z mieliną OUN wydają się odgrywać istotną rolę, co potwierdzono przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (mAb), IN-1, które neutralizuje białko mielinowe silnie hamujące wzrost neurytów, promujące tym samym odległą regenerację aksonów oraz zwiększenie kompensacyjnej plastyczności u dorosłych szczurów po uszkodzeniach mózgu i rdzenia kręgowego.
Szereg badań in vitro oraz in vivo ujawniło nowy aspekt regulacji wzrostu neurytów, którym jest obecność sygnałów oraz czynników opóźniających i hamujących (Keynes i Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5:75-82). Większość z tych sygnałów wydają się stanowić białka lub glikoproteiny. Pierwszym przełomowym odkryciem w kierunku identyfikacji tych czynników było oczyszczenie i sklonowanie cDNA pochodzącej z mózgu kurczęcia kolapsyny-1, będącej cząsteczką indukującą zanik stożka wzrostu, zwanej obecnie semaforyną 3A.
Druga grupa ostatnio oczyszczonych i klonowanych opóźniających czynników kierujących została określona jako efryny. Stanowią one ligandy dla receptora Eph rodziny kinaz tyrozynowych. Efryny A5 i A2 ulegają ekspresji w postaci gradientu w pokrywce wzrokowej (ang. optic tectum) embrionu kurczęcia, zaś ich ektopowa ekspresja lub delecja prowadzi do błędów kierowania wzrostem aksonów siatkówkowych. Podobnie jak semaforyny, rodzina efryn zawiera od 15 do 20 białek, z których każde wykazuje złożoną i dynamiczną ekspresję w obrębie układu nerwowego oraz poza nim. Funkcje większości z tych białek nie zostały jeszcze zanalizowane.
Trzecią grupę czynników kierujących, które mogą opóźniać wzrost aksonów, i które ulegają ekspresji w rozwijającym się układzie nerwowym stanowią netryny. Netryna została oczyszczona jako pochodzący z blaszki brzusznej chemoatraktant dla neuronów spoidłowych we wczesnym rdzeniu kręgowym, podobnie jak ortolog z C. elegans - unc-6. Okazało się, że netryna ma wpływ opóźniający na pewne typy neuronów, w zależności od typu receptorów znajdujących się na docelowych neuronalnych stożkach wzrostu (Tessier-Lavigne i wsp., 1996, Science 274:1123-33).
Wcześniej, Canoni i Schwab zbadali silną aktywność hamującą wzrost neurytów związaną z oligodendrocytami oraz mieliną OUN dorosłych (1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288). Głównym jej składnikiem jest ostatnio oczyszczone, białko błonowe o wysokiej masie cząsteczkowej (NI-250, z mniejszym skł adnikiem, NI-35, u szczura), spokrewnione z przedmiotem niniejszego wynalazku, i które jest wiązane przez przeciwciało neutralizują ce mAb IN-1 (Canoni i Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288; Patenty U.S. Nr. 5,684,133; 5,250,414; publikacja PCT nr WO 93/00427).
Inhibitory wzrostu neurytów związane z mieliną odgrywają istotną rolę w zapobieganiu regeneracji uszkodzonych aksonów OUN. Jeśli zablokowany zostanie rozwój oligodendrocytów i tworzenie się mieliny u kurcząt lub szczurów, wówczas wydłużeniu ulega okres pozwalający na regenerację po uszkodzeniach OUN. W istocie, tworzenie się mieliny koincyduje w czasie z końcem okresu rozwoju, podczas którego' OUN wykazuje wysoką plastyczność strukturalną oraz wysoki potencjał regeneracji.
NI-250 oraz NI-35 są prawdopodobnie głównymi składnikami związanego z mieliną hamowania wzrostu, jak wykazano poprzez podanie IN-1 in vivo do uszkodzonego rdzenia kręgowego dorosłych szczurów, co doprowadziło do indukcji regeneracji aksonów rdzeniowo-korowych na długich odcinkach oraz umożliwiło odzyskanie funkcji motorycznych i behawioralnych, w szczególności w odniesieniu do motoryki. Podobne eksperymenty na nerwie wzrokowym oraz cholinergicznym szlaku przegrodowo-hipokampalnym również wykazały udział rozpoznawanego przez IN-1 antygenu, NI-35/250 (Schnell i Schwab, 1990, Nature 343:269-272; Bregman i wsp., 1995, Nature 378:498-501).
PL 204 293 B1
Nieuszkodzone systemy włókien również odpowiadają na neutralizację inhibitorów wzrostu neurytów przez IN-1. Ostatnie eksprerymenty wykazały, że w wyniku selektywnego uszkodzenia szlaku korowo-rdzeniowego (piramidotomia), zachowane włókna rozrastają się w obecności IN-1 wzdłuż linii środkowej rdzenia kręgowego i pnia mózgu oraz tworzą dwustronny wzorzec innerwacji, któremu towarzyszy niemal całkowite odzyskanie ruchów precyzyjnych (Z' Graggen i wsp., 1998, J. Neuroscience 18 (12): 4744-4757).
Izolacja genu kodującego białko hamujące wzrost neurytów dostarcza szeregu możliwości opracowania produktów użytecznych w regeneracji neuronów oraz w leczeniu różnych chorób układu nerwowego, w tym nowotworów OUN.
Zacytowanie powyższych odniesień nie stanowi odniesienia wobec niniejszego wynalazku.
3. Podsumowanie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczone białko, charakteryzujące się tym, że wolne jest od całego materiału mielinowego z ośrodkowego układu nerwowego, z którym jest natywnie związane i obejmuje sekwencję aminokwasową , w której ponad 90% reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej jest identycznych do reszt aminokwasowych z sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29 przy przyrównaniu.
Korzystnie białko to obejmuje sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:29.
Korzystnie białko to stanowi białko ssacze.
Korzystnie białko to stanowi białko ludzkie.
Korzystnie białko to obejmuje sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:29, w której jedna lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie sekwencji jest konserwatywnie podstawiona innym aminokwasem o podobnej polarności, który działa jako funkcjonalny równoważnik, przy czym następuje cicha zmiana.
Korzystnie białko to kodowane jest przez pierwszy kwas nukleinowy, który może hybrydyzować w bardzo ostrych warunkach z drugim kwasem nukleinowym składającym się z sekwencji nukleotydowej oznaczonej SEQ ID NO:1.
Korzystnie białko to jest nieglikozylowane.
Korzystnie jego fragment obejmuje pierwszą sekwencję aminokwasową, w której ponad 95% reszt aminokwasowych w tej pierwszej sekwencji aminokwasowej jest identycznych z resztami aminokwasowymi drugiej sekwencji aminokwasowej przy przyrównaniu, przy czym druga sekwencja aminokwasowa składa się z sekwencji aminokwasowej aminokwasów 206-501 w sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29.
Korzystniej obejmuje sekwencję aminokwasową składającą się z aminokwasów 206-501 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29 lub sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:45.
Korzystniej to białko jest poddane fuzji z sekwencją aminokwasową drugiego białka.
Korzystniej jego fragment wykazuje aktywność hamującą w oznaczeniu proliferacji fibroblastów NIH 3T3.
Przedmiotem wynalazku jest także izolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że koduje białko określone powyżej.
Korzystnie kwas ten (a) jest zdolny do hybrydyzacji z drugim kwasem nukleinowym, przy czym drugi kwas nukleinowy składa się z sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd składający się z sekwencji aminokwasowej oznaczonej SEQ ID NO:29; i (b) koduje naturalnie występujące białko, które wiąże się z przeciwciałem przeciwko białku składającemu się z sekwencji aminokwasowej oznaczonej SEQ ID NO:29.
Korzystniej kwas ten koduje naturalnie występujące białko ludzkie.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor do klonowania, charakteryzujący się tym, że obejmuje kwas nukleinowy określony powyżej, operacyjnie związany z nie-natywnym promotorem.
Korzystnie wektor ten stanowi wektor ekspresyjny.
Przedmiotem wynalazku jest też rekombinowana komórka, charakteryzująca się tym, że jest transformowana kwasem nukleinowym określonym powyżej lub wektorem określonym powyżej.
Korzystnie komórka ta jest rekombinowaną komórką prokariotyczną lub eukariotyczną.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania rekombinowanego białka określonego powyżej, polegający na tym, że (a) hoduje się komórkę gospodarza transformowaną kwasem nukleinowym określonym powyżej lub wektorem określonym powyżej, w taki sposób, że określone powyżej białko kodowane przez kwas nukleinowy ulega ekspresji w komórce gospodarza; i
PL 204 293 B1 (b) odzyskuje się wyeksprymowane białko.
Korzystnie jako rekombinowaną komórkę stosuje się rekombinowana komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną.
Przedmiotem wynalazku jest też białko określone powyżej do zastosowania jako lek.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, który hamuje wytwarzanie białka określonego powyżej polegający na tym, że obejmuje etapy, w których analizuje się produkcję białka określonego powyżej w obecności i przy braku rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przy czym zmniejszona ekspresja białka w obecności rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego wskazuje, że ten rybozym lub antysensowny kwas nukleinowy hamuje ekspresję białka.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie białka określonego powyżej, do wytwarzania leku do leczenia choroby nowotworowej ośrodkowego układu nerwowego, przy czym białko to lub jego fragment wykazuje aktywność w hamowaniu proliferacji komórek u podmiotu.
Korzystnie chorobą nowotworową jest glejak, glioblastoma, rdzeniak, czaszkogardlak, wyściółczak, szyszyniak, hemangioblastoma, nerwiak nerwu słuchowego, skąpodrzewiak, oponiak, nerwiak niedojrzały, lub siatkówczak.
Korzystnie podmiotem jest człowiek.
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało monoklonalne, charakteryzujące się tym, że immunospecyficznie wiąże się z białkiem określonym powyżej.
Korzystnie przeciwciało to stanowi przeciwciało terapeutyczne.
Korzystnie przeciwciało to stanowi przeciwciało ludzkie, przeciwciało chimeryczne lub przeciwciało jednołańcuchowe.
Przedmiotem wynalazku jest też przeciwciało monoklonalne określone powyżej, do zastosowania jako lek.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała określonego powyżej, do wytwarzania leku do leczenia uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego, do indukowania regeneracji lub rozgałęziania się neuronów, lub do promowania plastyczności ośrodkowego układu nerwowego u podmiotu.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał przeciwko białku określonemu powyżej, polegający na tym, że (a) podaje się zwierzęciu nie będącemu człowiekiem immunogenną ilość biała określonego powyżej; (b) odzyskuje się poliklonalne przeciwciała ze zwierzęcia.
Przedmiotem wynalazku jest także izolowana próbka surowicy odpornościowej, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciała poliklonalne, które wiążą się immunospecyficznie z białkiem określonym powyżej.
Korzystnie surowica ta stanowi terapeutyczną surowicę odpornościową.
Korzystnie surowica ta zawiera przeciwciała, które są przeciwciałami ludzkimi, przeciwciałami chimerycznymi lub przeciwciałami jednołańcuchowymi.
Przedmiotem wynalazku jest też surowica odpornościowa określona powyżej, do zastosowania jako lek.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie surowicy odpornościowej określonej powyżej, do wytwarzania leku do leczenia uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego, do indukowania regeneracji lub rozgałęziania się neuronów, lub do promowania plastyczności ośrodkowego układu nerwowego u podmiotu.
Korzystnie podmiotem jest człowiek.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku określonemu powyżej, polegający na tym, że:
(a) wytwarza się ciągłe linie komórkowe wytwarzające cząsteczki przeciwciał monoklonalnych immunospecyficznie wiążących się z tym białkiem lub fragmentem w hodowli, z użyciem, techniki hybrydomy, techniki triomy, techniki hybrydomy ludzkich komórek B lub techniki hybrydomy EBV, (b) wytwarza się cząsteczki przeciwciała monoklonalnego, (c) odzyskuje się przeciwciała monoklonalne z hodowli.
Zgodnie z wynalazkiem opisano sekwencje nukleotydowe genów Nogo (ludzkiego, szczurzego i bydlę cego Nogo oraz homologów Nogo z innych gatunków), sekwencje aminokwasowe kodowanych przez nie białek, jak również ich pochodnych (np. fragmentów) oraz ich analogów. Opisano także kwasy nukleinowe hybrydyzujące lub komplementarne do powyższych sekwencji. Opisano białka Nogo szczurze, bydlęce i ludzkie.
PL 204 293 B1
Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób identyfikacji genów oddziałujących z Nogo.
Nogo stanowi gen zidentyfikowany z użyciem sposobu tu opisanego, który zarówno koduje, jak i oddziałuje z białkami regulującymi wzrost neuronów.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również funkcjonalnie aktywne pochodne oraz analogi Nogo, tj. wykazujące jedną lub więcej znanych aktywności związanych z naturalnie występującym białkiem Nogo. Przykładowo, zidentyfikowano główny region hamujący pomiędzy aminokwasami 542 a 722. Tego typu aktywności funkcjonalne obejmują, ale nieograniczająco, hamowanie wzrostu neurytów komórek nerwowych, rozrostu (rozgałęziania) i migracji fibroblastów lub jakiejkolwiek komórki wykazującej wzrost nowotworowy, zdolność do oddziaływania lub współzawodniczenia z białkami regulującymi wzrost neuronów, antygenowość stanowiącą zdolność do wiązania (lub kompetycji o wiązanie z Nogo) z przeciwciał em anty-Nogo, immunogenność stanowią c ą zdolność do wytwarzania przeciwciała wiążącego się z Nogo. Przeciwciała tego typu posiadają zdolność do indukowania wzrostu neurytów lub zapobiegania zanikowi stożków wzrostu zwojów korzeni grzbietowych poprzez zahamowanie działania Nogo, fragmentów funkcjonalnych Nogo lub pochodnych Nogo hamujących wzrost neurytów.
Zgodnie z wynalazkiem opisano fragmenty (pochodne lub analogi) Nogo, które zawierają jedną lub więcej domen Nogo, takich jak kwaśny N-koniec bogaty w prolinę (np. aminokwasy 31-58 z SEQ ID NO:2), wysoce konserwowany C-koniec, dwa hydrofobowe odcinki w obrębie C-końca o długości 35 i 36 aminokwasów ze szczurzego Nogo (np. aminokwasy 988-1023 oraz 1090-1125 z SEQ ID NO:2).
Dodatkowo opisano przeciwciała przeciwko różnym Nogo oraz ich pochodnym i analogom. W szczególności, na drodze przykł adu otrzymano dwa przeciwciał a. Pierwsze nazwane AS 472 zostało otrzymane przy zastosowaniu w roli immunogenu syntetycznego peptydu odpowiadającego aminokwasom 623-640 z SEQ ID NO:2, natomiast drugie przeciwciało, nazwane AS Bruna, zostało wygenerowane przeciwko C-końcowi, aminokwasom 762-1163 z SEQ ID NO:2, Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby produkcji białek Nogo, ich pochodnych i analogów, np. na drodze rekombinacji.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również terapeutyczne i diagnostyczne sposoby oraz kompozycje oparte na białkach i kwasach nukleinowych Nogo. Związki terapeutyczne tu opisane obejmują, ale nieograniczająco, białka Nogo i ich analogi oraz pochodne (w tym fragmenty), przeciwciała, kwasy nukleinowe kodujące te białka, analogi lub fragmenty Nogo, rybozymy Nogo lub antysensowne kwasy nukleinowe Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również terapeutyczne i diagnostyczne sposoby oraz związki oparte na białkach Nogo, kwasach nukleinowych Nogo oraz przeciwciałach anty-Nogo. Zgodnie z wynalazkiem opisano także zastosowanie rozwiązań tu przedstawionych do leczenia nowotworów OUN oraz nowotworów pochodzenia neuronalnego na drodze podawania związków sprzyjających aktywności Nogo (np. białek Nogo oraz funkcjonalnie aktywnych analogów i ich pochodnych, kwasów nukleinowych kodujących białka Nogo, analogi lub pochodne, agonistów Nogo).
Zgodnie z wynalazkiem opisano również zastosowanie związków tu przedstawionych do wytwarzania leku do leczenia chorób, zaburzeń lub uszkodzeń powstałych w wyniku urazów układu nerwowego; tego rodzaju choroby, zaburzenia lub uszkodzenia obejmują, ale nieograniczjąco: urazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), udary, zakażenia, nowotworzenia, ekspozycję na czynniki toksyczne, niedobory pokarmowe, zespoły paraneoplastyczne oraz choroby neurodegeneracyjne (w tym choroby Alzheimera, Parkinsona, pląsawicę Huntingtona, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, postępujące porażenia nadjądrowe). Ich leczenie polega na podawaniu związków interferujących z aktywnością Nogo (np. dominującej negatywnej pochodnej Nogo, przeciwciał przeciwko Nogo, anty-sensownych kwasów nukleinowych Nogo, rybozymów Nogo lub grup chemicznych wiążących się z miejscem aktywnym Nogo).
Zgodnie z wynalazkiem opisano również modele zwierzęce, metody diagnostyczne oraz metody przesiewowe do badania predyspozycji do tych zaburzeń oraz sposoby identyfikacji i oceny agonistów i antagonistów Nogo.
3. 1. Definicje
W sposób przedstawiony tu poniżej nazwa podkreś lona lub pisana kursywą wskazuje na gen, w przeciwień stwie do kodowanego przez niego biał ka, które jest oznaczone poprzez nazwę genu bez podkreślenia, bądź kursywy. Przykładowo, Nogo oznacza gen Nogo, podczas gdy Nogo oznacza produkt białkowy genu Nogo.
4. Opis figur
PL 204 293 B1
Figura 1a-1b: (a) klony cDNA Nogo: CWP1-3 jest bydlęcym klonem cDNA wyizolowanym poprzez przeszukiwanie biblioteki cDNA substancji białej rdzenia kręgowego za pomocą zdegenerowanych oligonukleotydów MSC5-8 (spulowane) oraz MSC9. Komplementarny RNA otrzymany z tego klonu został następnie zastosowany do przeszukiwania szczurzej biblioteki cDNA. Oli3 i Oli18 zostały wyizolowane z biblioteki oligo d(T) - szczurzych oligodendrocytów. R1-3U21, R018U1 oraz R018U37-3 zostały wyizolowane z biblioteki starterów heksanukleotydowych szczurzego pnia mózgu/rdzenia kręgowego (Stratagene). Pozycje 6 sekwencji bydlęcego peptydu NI220 (bNl220) zostały oznaczone na CWP1-3 i R13U21. Sekwencje na połączeniach różnych eksonów są zaznaczone na górze każdego z klonów. Zaznaczone znaki zapytania na R018U1 identyfikują sekwencję tego klonu, która nie odpowiada sekwencji jakiegokolwiek z klonów Nogo. R01 SU37-3 został zsekwencjonowany jedynie na 5'końcu, zaś część niezsekwencjonowana jest zaznaczona kropkami.
(b) Schemat przedstawiający hipotetyczny mechanizm powstawania trzech transkryptów Nogo. P1 oraz P2 stanowią przypuszczalną lokalizację alternatywnych promotorów. Wymagana liczba trzech eksonów jest niezbędna do wytworzenia trzech transkryptów, jak pokazano na schemacie, chociaż każdy ekson mógłby być potencjalnie rozdzielany na liczne eksony.
Figura 2a-2b: (a) Sekwencje nukleotydowe (SEQ ID NO:1) i aminokwasowe (SEQ ID NO:2) transkryptu Nogo A (sekwencja wytworzona poprzez połączenie sekwencji cDNA R018U37-3, Oli18, R1-3U21). Owal: przypuszczalna lokalizacja kodonu inicjacyjnego; podkreślone kropkami: odcinek kwaśny; □: potencjalne miejsca kinazy PKC; Δ: potencjalne miejsca kinazy kazeinowej II; grube podkreślenie: C-końcowe regiony hydrofobowe i potencjalne domeny przezbłonowe; cienkie podkreślenie: potencjalne miejsca N-glikozylacji. (b) porównanie sekwencji zsekwencjonowanego, oczyszczonego bydlęcego NI220 (bNI220; SEQ ID.NO:3-8) oraz odpowiednich sekwencji bydlęcych (SEQ ID NO:9-14) i szczurzych (SEQ ID NO:15-20) poddannych translacji ze szczurzego i bydlęcego cDNA. Sekwencje aminokwasowe: szczurze i bydlęce, które nie pasują do sekwencji peptydowej bNI220 opisane są małymi literami.
Figura 3a-3b: (a) Porównanie sekwencji aminokwasowej C-końcowych 180 aminokwasów wspólnych regionów sekwencji NSP (człowiek; SEQ ID NO:21), S-REX (szczur) (SEQ ID NO:22), CHS-REX (kurczę; SEQ ID NO:23), NOGOBOV (krowa; SEQ ID NO:24), NOGORAT (szczur; SEQ ID NO:25), klon EST z C. elegans (W06A7A; SEQ ID NO:26)oraz klon EST z D. melanogaster (US51048; SEQ ID NO:27). (b) Ewolucyjne zachowanie dwóch regionów hydrofobowych. Pokazane zostały procentowe podobieństwa wewnątrz i pomiędzy gatunkowe wspólnych regionów hydrofobowych. Cieniowane litery: konserwowane aminokwasy.
Figura 4a-4c: (a) Hybrydyzacja Northern różnych tkanek za pomocą wspólnej sondy Nogo. Wspólna sonda zawiera sekwencję transkryptu A: pomiędzy nukleotydami 2583-4678. ON, nerw wzrokowy; SC, rdzeń kręgowy; C, kora mózgowa; DRG, zwoje korzeni grzbietowych: SN, nerw kulszowy: PC12, linia komórkowa PC12. (b) hybrydyzacja Nothern RNA z rdzenia kręgowego i komórek PC12 z sondą specyficzną dla eksonu 1 (lewy panel) oraz RNA z tyłomózgowia (HB) oraz RNA z mięśnia szkieletowego (M) z sondą specyficzną dla eksonu 2 (prawy panel).
(c) Hybrydyzacja Northern ze wspólną sondą Nogo; K, nerka; B, chrząstka (z żebra); Sk, skóra; M, mięsień szkieletowy; Lu, płuco; Li, wątroba; Sp, śledziona. Zaznaczono trzy główne transkrypty (4,6 kilobazy (kb), 2,6 kb, oraz 1,7 kb). Δ: rozmyty ale stały prążek o wielkości około 1,3 kb.
Figura 5a-5f: Hybrydyzacja in situ skrawków rdzenia kręgowego i móżdżku dorosłego szczura. Można zobaczyć rzędy (a, d) wyznakowanych oligodendrocytów (OL) odpowiednio w istocie białej rdzenia kręgowego oraz w móżdżku, antysensowną „wspólną rybonukleinową sondą Nogo. Przypomina to sygnały wykryte w trakcie hybrydyzacji sąsiadującego skrawka rdzenia kręgowego z antysensowną sondą rybonukleinową. (b). (c) Neurony w istocie szarej (GM) zostały również wyznakowane antysensowną „wspólną sondą Nogo. WM: substancja biała. Obraz z pola jasnego oraz fluorescencji skrawka móżdżku podwójnie znakowanego antysensowną „wspólną sondą rybonukleinową Nogo (e) oraz przeciwciałem anty-GFAP (f). Komórki Purkinjego (podwójne groty strzałek) są silnie wyznakowane sondą Nogo, podczas gdy astrocyty (groty strzałek czarno-białe) są ujemnne. Kilka komórek z warstwy ziarnistej (GR) zostało również wyznakowanych sondą Nogo, m: warstwa cząsteczkowa. Skala: a, b, d-f: 50 p.m; c: 280 p.m.
Figura 6a-6i: Hybrydyzacja in situ nerwów wzrokowych w różnych dniach po urodzeniu (a, f: PO; b, g: P3; c, h: P7; d, e, i: P22) za pomocą sond Nogo albo plp (antysensownych lub sensownych). (a-d) antysensowna sonda Nogo; (e) sonda sensowna Nogo; (g-i) antysensowna sonda plp; (f) sensowna sonda plp. Ekspresję Nogo w prekursorach oligodendrocytów można wykryć najwcześniej
PL 204 293 B1 w PO, podczas gdy ekspresję plp można było wykryć w nerwie wzrokowym w pobliżu skrzyż owania w P3. (g).
Figura 7: AS Bruna oraz AS 472 rozpoznają białko mieliny o około 200 kD. Ekstrakt szczurzej mieliny i bydlęca pula-q zostały przygotowane według Spillmann i wsp., 1998, J. Biol. Chem., 273(30): 19283-19293. AS Bruna i AS 472 rozpoznawały prążek 200 kD, jak również kilka mniejszych prążków w bydlęcej mielinie, które mogą być produktami rozpadu bNI220. AS Bruna znakowało prążek 200 kD szczurzej mieliny. I: AS Bruna; P: AS Bruna, surowica przedodpornościowa; E: AS 472 oczyszczone z użyciem chromatografii powinowactwa.
Figura 8a-8i: Immunohistochemia szczurzego rdzenia kręgowego i móżdżku przy użyciu IN-1 (a-c), AS Bruna (d-f) oraz AS 472 (g-i), jak pokazano po lewej stronie każdego panelu. Silne znakowanie mieliny zostało zaobserwowane w obu tkankach przy użyciu wszystkich trzech przeciwciał, jeśli skrawki mrożeniowe zostały utrwalone w etanolu/kwasie octowym (a, b, d, e, g, h). Utrwalanie skrawków w metanolu prowadziło do zniesienia znakowania mieliny z wyjątkiem ciał oligodendrocytów (strzałki; c, f, i). Groty strzałek: komórki Purkinjego, WM, istota biała; GM, istota szara, DR: korzeń grzbietowy; Gr, warstwa komórek ziarnistych; m, warstwa cząsteczkowa. Skala: a, d, g: 415 μm; b, c, e, f, h, i: 143 μm.
Figura 9a-9d: Neutralizująca aktywność AS 472 oraz AS Bruna w różnych biotestach. (a) Fibroblasty NIH 3T3 wysiewano na płytki do hodowli komórkowej pokryte q-pool i traktowane uprzednio IN-1, AS Bruna, AS 472 lub odpowiednią surowicą przedodpornościową. Obie poliklonalne surowice wykazywały nawet nieco lepszą neutralizację substratu hamującego aniżeli IN-1. Surowice przedodpornościowe nie miały znaczącego wpływu na rozrost (rozgałęzianie) komórek NIH 3T3. Dodanie nadmiaru peptydu (P472) stosowanego do wzbudzenia AS 472 współzawodniczyło z aktywnością neutralizującą podczas gdy niespecyficzny peptyd (Px) nie miał żadnego wpływu, (b) wstępne traktowanie substratów inhibitora AS Bruna lub AS 472 prowadziło do wzrostu neurytów DRG porównywalnego z tym obserwowanym na substracie lamininy. Przykłady wzrostu neurytów z DRG na q-pool wcześniej traktowanej PBS (c; wynik = 0) i traktowanym AS Bruna (d; wynik = 4).
Figura 10a-10d: Nastrzyknięcie eksplantów nerwu wzrokowego AS 472 prowadzi do wzrostu aksonów. (a) Pary nerwów wzrokowych z dorosłych szczurów zostały wypreparowane, nastrzyknięte AS 472 lub surowicą przedodpornościową oraz umieszczone w komorach do hodowli, tak aby jeden koniec tych nerwów miał kontakt z wypreparowanymi w PO neuronami DRG, (b) po dwóch tygodniach in vitro, pobierano skrawki EM z nerwów 3,5 mm od miejsca cięcia (strzałki w A) oraz systematycznie badano pod kątem nienaruszonych aksonów (3 eksperymenty), (c) zregenerowane wiązki aksonów (strzałki) rosną wzdłuż degenerującego nerwu wzrokowego nastrzykniętego AS 472, (d) zregenerowane aksony mające kontakt z mieliną. Powiększenie: c - 12,000x; d - 35,000x.
Figura 11a-11c: Ekspresja rekombinowanego Nogo A w transfekowanych komórkach COS, (a) Western blot pokazujący immunoreaktywność AS Bruna wobec rekombinowanego Nogo A (ścieżka 2) i endogennego Nogo A z hodowli pierwotnych szczurzych oligodendrocytów (ścieżka 3). Ruchliwość tych białek jest prawie identyczna dla około 200 kD w 5% denaturującym żelu SDS. Próbka kontrolna transfekowana konstruktem kontrolnym LacZ (ścieżka 1) nie wykazywała immunoreaktywności wobec AS Bruna. Ten sam blot sondowano przeciwciałem anty-myc, 9E10, jak zaznaczono. Prążek, który reagował z AS Bruna również reagował z przeciwciałem znacznikowym anty-myc tag, 9E10 (ścieżka 5), podczas gdy endogenny Nogo nie reagował (ścieżka 6). Próbka kontrolna transfekowana LacZ nie wykazywała oczekiwanego prążka 118 kD (ścieżka 4). Komórki COS przejściowo transfekowane konstruktem Nogo A były podwójnie znakowane AS Bruna (b) oraz IN-1 (c). Komórki pozytywnie wyznakowane AS Bruna były również pozytywne wobec IN-1.
Figura 12: Sekwencja nukleotydowa bydlęcego cDNA dla Nogo (SEQ ID NO:28).
Figura 13: Sekwencja aminokwasowa szczurzego Nogo A (SEQ ID NO:2) przyrównana z teoretyczną sekwencją aminokwasową ludzkiego Nogo (SEQ ID NO:29). Sekwencja aminokwasowa ludzkiego Nogo została otrzymana poprzez przyłączenie ulegających ekspresji sekwencji końcowych (EST) do szczurzej sekwencji Nogo oraz translację przyłączonych ludzkich EST przy użyciu szczurzego Nogo w roli matrycy kierującej.
Figura 14: Kwas nukleinowy sekwencji szczurzego Nogo C (SEQ ID NO:31) oraz odpowiadająca mu sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO:32).
Figura 15a-15e: Nogo A jest obecny na błonie komórkowej oligodendrocytów, jak wykazano za pomocą immunocytochemii oraz biotynylacji powierzchni komórkowej oligodendrocytów w hodowli.
PL 204 293 B1
Immunocytochemia (a-d): Oligodendrocyty z nerwu wzrokowego szczurów w P10 zostały wypreparowane i hodowane przez 2 dni. Znakowanie żywych komórek: mAb IN-1 (a) lub AS 472 (c) wykazało immunoreaktywność na powierzchni ciał oligodendrocytów. W obecności peptydu kompetycyjnego P472, AS 472 wykazywało znakowanie jedynie tła (wszystkie typy komórek) (d). Podobne niespecyficzne znakowanie obserwowano po ominięciu znakowania przeciwciałami pierwszorzędowymi. (b). Ocena: opisane numerami komory były mieszane i klasyfikowane przez 3 niezależnych obserwatorów. 8/10 płytek zostało zaklasyfikowanych jako AS 472-pozytywne, mAb IN-1-pozytywne lub kontrolne przez wszystkich trzech obserwatorów.
Biotynylacja (e): Hodowle całego mózgu szczurów w P4 wzbogacone w oligodendrocyty po siedmiu dniach hodowli były znakowane biotyną za pomocą czynnika nieprzenikającego przez błonę. Następnie, homogenaty komórek poddawano działaniu kulek Dynabeads ze streptawidyną. Precypitat (Ppt) i supernatant (sup) były blotowane z AS472; wykazywały one odmienny wzorzec białkowy: Nogo A z powierzchni komórki odnajdywany w precypitacie wykazywał widocznie większą masę cząsteczkową niż wewnątrzkomórkowe Nogo A. To przesunięcie wynika najprawdopodobniej z glikozylacji. Białko BiP ze światła ER oraz znaczna większość β-tubulin były odnajdywane jedynie we frakcji wewnątrzkomórkowej.
Figura 16a-16j: Testy funkcjonalne wykazują obecność Nogo A na błonie komórkowej oligodendrocytów. Pre-inkubacja hodowli nerwu wzrokowego z AS 472 (a, b) pozwalała fibroblastom NIH 3T3 na rozrost na wysoce rozgałęzionych oligodendrocytach, znakowanych fluorescencyjnie dla przeciwciała GalC (przeciwciało 01) (a). Strzałki w odpowiednich obrazach z kontrastu fazowego (b) wskazują na rozciągające się na powierzchni oligodendrocytów fibroblasty NIH 3T3. (c, d): jeśli dodawano AS 472 razem z P472, fibroblasty NIH 3T3 wyraźnie unikały kontaktu z GalC-pozytywnymi oligodendrocytami (strzałki) (Caroni i Schwab, 1988 Neuron 1:85-96). (e, f): W obecności AS 472, wypreparowane szczurze neurony DRG w PO potrafiły rozciągać neuryty ponad terytorium zajmowanym przez rozgałęzione oligodendrocyty (strzałki w f). (g, h): Peptyd P472 wydajnie znosił neutralizującą aktywność AS 472: neuryty całkowicie unikały oligodendrocytów. AS 472 zastosowany w tych eksperymentach został wygenerowany przeciwko szczurzej sekwencji peptydu 472. (i, ,j): ocena ilościowa tych wyników (jak opisano w metodach) wykazała silną aktywność neutralizującą AS 472 w obu typach testu. Skala: 40 μm.
Figura 17a-17e: Rekombinowany Nogo A jest substratem hamującym, a jego aktywność hamująca jest neutralizowana przez mAb IN-1. Wzbogacone ekstrakty RecNogo A ze stabilnej linii komórkowej CHO-Nogo A, lub β-galaktozydazy, wyizolowanej równolegle ze stabilnej linii komórkowej CHO-LacZ, były użyte do pokrywania płytek celem testów rozrostu fibroblastów NIH 3T3 oraz wzrostu neurytów DRG. (a) żel ze srebrem znakowany myc-his tag - recLacZ (ścieżka 1) i recNogo A (ścieżka 2) pokazuje prążek Nogo A 180 kD. Tożsamość prążka Nogo A została potwierdzona poprzez Western blot inkubowany z AS Bruna (ścieżka 3) oraz przeciwciałem anty-myc 9E10 (ścieżka 4). (b) Pokryte RecNogo A płytki były widocznie hamujące dla rozrostu NIH 3T3. Pre-inkubacja z: mAb IN-1 lub AS Bruna prowadziło do wysoce znaczącej (p<0,01) neutralizacji aktywności hamującej. Kontrolne IgM mAb 01 oraz surowica przedodpornościowa były nieefektywne. Ekstrakt z CHO-LacZ miał częściowo hamujący wpływ na komórki NIH 3T3, prawdobodobnie wskutek endogennych białek CHO. Ta aktywność hamująca nie zmieniała się pod wpływem preinkubacji z przeciwciałami.
(c) W testach wzrostu neurytów DRG ten sam materiał białkowy jak w (b) mieszano z lamininą i używano do pokrywania płytek. RecNogo A miał bardzo silny wpływ hamujący na wzrost DGR w sposób zależny od dawki. Aktywność była neutralizowana przez mAb IN-1 (p<0,001), ale nie kontrolne mAb 01. Materiał białkowy wyizolowany z komórek CHO-LacZ nie był hamujący przy każdym użytym stężeniu, nie miała również wpływu inkubacja z przeciwciałami. Przykłady oceny zostały pokazane na (d): 1 μg recNogo A, brak lub krótkie neuryty (strzałki) oraz na (e): 1 μg CHO-LacZ, długie, rozgałęzione neuryty (strzałki) wynik 5-6. Analiza statystyczna została wykonana dwustronnym testem t-Studenta. Skala: 280 μm.
Figura 18: Funkcjonalna analiza mutantów delecyjnych Nogo. Następujące konstrukty delecyjne kodujące białka fuzyjne zawierające fragmenty Nogo lub skrócone fragmenty Nogo (jak podano poniżej) zostały wytworzone jak opisano w rozdziale 6.2.7.
PL 204 293 B1
Nogo-A: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal -1162
Nogo-B: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171 + 975-1162
Nogo-C: His-tag/T7-tag/Nogo-C N-terminus (11 aa) + Nogo-A seq. aa
975-1162
NiAext: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal -974/T7-tag
NiR: His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171/vector
NiG: : His-tag/T7-tag/Nogo-A : seq. aa 172-974/His-tag
EST: His-tag/T7-tag/Nogo-A : 3eq. aa ' 760-1162
NiG-D 1: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-908/vector
N1G-D2: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-866/His-tag
N1G-D3: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-723/His-tag
NiG-D4: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-646/vector
NiG-D5: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-646/His-tag
NiG-D7 : His -1ag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-234 + 292 - 974/His-tag
NiG-D8: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-628
N1G-D9: His -tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259 + 646-974/His-tag
NiG-D 10: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-974/His-tag
NiG-D14: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259
N1G-D15: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 491-974/His-tag
NiG-D 16: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 619-974/His-tag
N1G-D17: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 257 - 974/His-tag
N1G-D18: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 261-974/His-tag
NiG-D20: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 542-722/His-tag
Numery aminokwasów (aa) są oparte na numeracji sekwencji aminokwasowej szczurzego Nogo A (SEQ ID NO:2) począ wszy od pierwszej metioniny. His-tag i T7-tag składa się z 34 aminokwasów. Sekwencje C-końcowe i N-końcowe wektorów zostały otrzymane z wektora ekspresyjnego pET28.
5. Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalzkiem opisano sekwencje nukleotydowe genów Nogo oraz sekwencje aminokwasowe kodowanych przez nie białek. Zgodnie z wynalazkiem opisano także fragmenty białek Nogo, ich pochodnych lub analogów oraz kwasy nukleinowe kodujące takie fragmenty. Zgodnie z wynalazkiem opisano geny Nogo oraz kodowane przez nie białka wielu gatunków, takie jak geny Nogo człowieka, szczura oraz bydła oraz geny pokrewne (homologi) z innych gatunków. Bydlęce podsekwencje zawarte w Spillman i wsp., 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-19293, nie stanowią części niniejszego wynalazku. W specyficznych wykonaniach, geny Nogo oraz białka mogą pochodzić z kręgowców,
PL 204 293 B1 a w szczególności od ssaków. Zgodnie z wynalazkiem opisano w szczególności geny Nogo oraz białka Nogo pochodzenia ludzkiego. Produkcja powyższych białek i pochodnych, np. metodami rekombinacji, została tutaj także ujawniona.
Gen Nogo ujawniony tutaj obejmuje cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące trzy izoformy Nogo: Nogo A, Nogo B i Nogo C. Odniesienie do genu Nogo będzie dotyczyć cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących wszystkie trzy izoformy, jeśli nie zaznaczono inaczej. Podobnie, odniesienie do białka Nogo będzie oznaczało wszystkie trzy izoformy Nogo, jeśli nie zaznaczono inaczej. Białka Nogo według wynalazku mogą zapobiegać regeneracji neuronów w rdzeniu kręgowym lub mózgu (tj. mieć właściwości niepermisywnego substratu), hamować wzrost neurytów zwojów korzeni grzbietowych, indukować zanik stożka wzrostu zwojów korzeni grzbietowych, blokować rozrost NIH 3T3 oraz neurytów PC12, itd.
Białka Nogo, ich fragmenty i pochodne są pozbawione całkowicie materiału mielinowego, a w szczególności pozbawione są materiału mielinowego z ośrodkowego układu nerwowego, z którym białko Nogo jest naturalnie związane. Taki materiał może zawierać inne białka mielinowe OUN, lipidy i węglowodany. Białka Nogo, ich fragmenty lub pochodne są również dogodnie wolne od odczynników stosowanych w oczyszczaniu materiału biologicznego, takich jak detergenty.
W specyficznym wykonaniu wynalazek dostarcza rekombinowanych białek Nogo, ich fragmentów, pochodnych przygotowanych sposobami znanymi w dziedzinie, takimi jak: ekspresja genu Nogo w genetycznie zmodyfikowanej komórce.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również pochodne oraz analogi Nogo, które są funkcjonalnie aktywne, tj. zdolne są do wykazywania jednej lub więcej z ról biologicznych związanych z pełnej długości (dzikiego typu) białkiem Nogo. Takie aktywności funkcjonalne obejmują nieograniczająco: zdolność oddziaływania (lub kompetycji o związanie) z białkami regulującymi wzrost neuronalny, antygenność (zdolność do wiązania (lub kompetycji z Nogo o wiązanie) do przeciwiała anty-Nogo), immunogenność (zdolność do generowania przeciwciała wiążącego się z Nogo), zapobiegania regeneracji neuronów w rdzeniu kręgowym lub mózgu, nadawania substratowi zdolności do ograniczania wzrostu, pokrywania i migracji komórek neuronalnych oraz nowotoworowych, hamowania wzrostu neurytów zwojów korzeni grzbietowych, indukowania zaniku stożka wzrostu zwojów korzeni grzbietowych, blokowania wzrostu komórek NIH 3T3 in vitro, blokowania rozrostu neurytów PC12, ograniczania plastyczności neuronalnej itd.
W dalszej kolejnoś ci zgodnie z wynalazkiem opisano fragmenty (oraz ich pochodne i analogi) Nogo, które zawierają jedną lub więcej domen białka Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także przeciwciała przeciwko Nogo, jego pochodnym i analogom.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również terapeutyczne i diagnostyczne sposoby oraz kompozycje oparte na białkach Nogo, kwasach nukleinowych oraz przeciwciałach anty-Nogo. Zgodnie z zastosowaniami według wynalazku białek, kwasów nukleinowych i przeciwciał można leczyć zaburzenia komórek lub organów o regulowanym wzroście poprzez podawanie związków promujących aktywność Nogo (np. białek Nogo oraz ich funkcjonalnie aktywnych analogów i pochodnych (w tym fragmentów); kwasów nukleinowych kodujących białka Nogo, analogi lub pochodne agonistów Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również zastosowanie funkcjonalnych antagonistów lub inhibitorów Nogo do leczenia uszkodzeń lub chorób układu nerwowego (np. przeciwciał, antysensownych kwasów nukleinowych Nogo, pochodnych antagonistów Nogo).
Zgodnie z wynalazkiem opisano również modele zwierzęce, metody diagnostyczne i sposoby przeszukiwania pod kątem predyspozycji do takich zaburzeń.
Dla jasności opisu wynalazku oraz nie mając na celu ograniczania go, szczegółowy opis jest podzielony na następujące podrozdziały:
5.1. Izolacja genów Nogo
Zgodnie z wynalazkiem opisano sekwencje nukleotydowe genów lub kwasów nukleinowych Nogo. W jednym aspekcie kwasy nukleinowe Nogo obejmują sekwencję szczurzego cDNA z figury 2a (SEQ ID NO:1), identyfikowaną jako Nogo A jak przedstawiono na figurze 1b, lub ich sekwencje kodujące lub sekwencje nukleotydowe kodujące białko Nogo o 1163 aminokwasach długości lub jego jakikolwiek funkcjonalny fragment lub pochodną (np. białko mające sekwencję SEQ ID NO:2, jak pokazano na figurze 2a).
W innym aspekcie kwasy nukleinowe Nogo zawierają sekwencję nukleotydową kodującą Nogo B, podczas gdy białko Nogo B jest ekwiwalentem N-końcowych 172 aminokwasów Nogo A poddanych fuzji z C-końcowymi 188 aminokwasami, co prowadzi powstania skróconego, 360 aminokwasowego
PL 204 293 B1 białka. Transkrypty dla Nogo B powstają w wyniku alternatywnego składania, które usuwa zakłócające kodujące sekwencje nukleotydowe.
W jeszcze innym aspekcie kwasy nukleinowe Nogo zawierają sekwencje nukleotydowe kodują ce Nogo C, podczas gdy białko Nogo C zawiera 11 aminokwasów z N-końca, które nie występują w Nogo A, oraz C-końcowe 188 aminokwasów z Nogo A i B. Białko Nogo C ma 199 aminokwasów. Transkrypt kodujący Nogo C jest wynikiem transkrypcji z alternatywnego promotora Nogo.
W jeszcze innym aspekcie opisano sekwencje kwasu nukleinowego bydlę cego Nogo (SEQ ID NO:28).
W specyficznym wykonaniu wynalazek dostarcza sekwencji nukleotydowych kodują cych ludzkie Nogo oraz fragmenty białek ludzkiego Nogo, w tym ludzkie ekwiwalenty szczurzego Nogo A, Nogo B i Nogo C. Ludzka sekwencja nukleotydowa Nogo powstaje w wyniku zastosowania szczurzego transkryptu Nogo jako matrycy i składania wraz z ludzkimi ulegającymi ekspresji sekwencjami końcowymi (EST) z utworzeniem ciągłej sekwencji nukleotydowej. Szczurze i bydlęce sekwencje aminokwasowe Nogo dostarczyły również informacji co do właściwej ramki odczytu tak, aby można było wydedukować sekwencję aminokwasową ludzkiego Nogo. Zgodnie z wynalazkiem opisano również sekwencje aminokwasowe fragmentów ludzkiego genu Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również oczyszczone kwasy nukleinowe składające się z co najmniej 8 nukleotydów (tj. odcinka hybrydyzującego) sekwencji Nogo: w innych wykonaniach kwas nukleinowy składa się z co najmniej 25 (ciągłych) nukleotydów, 50 nukleotydów, 100 nukleotydów, 150 nukleotydów, 20 nukleotydów, 500 nukleotydów, 700 nukleotydów lub 800 nukleotydów z sekwencji Nogo lub pełnej długości sekwencji kodującej Nogo. W kolejnym wykonaniu, kwasy nukleinowe są krótsze niż 35, 200 lub 500 nukleotydów. Kwasy nukleinowe mogą być jedno- lub dwuniciowe. Zgodnie z wynalazkiem opisano także kwasy nukleinowe hybrydyzujące lub komplementarne z powyższymi sekwencjami. W specyficznych aspektach opisano kwasy nukleinowe zawierające sekwencję komplementarną do co najmniej 10, 25, 50, 100 lub 200 nukleotydów lub całej długości regionu kodującego gen Nogo.
W specyficznym wykonaniu kwas nukleinowy hybrydyzuje z kwasem nukleinowym Nogo (np. mającym sekwencję SEQ ID NO:2; figura 2a), lub z kwasem nukleinowym kodującym pochodną Nogo w warunkach łagodnych. Na drodze przykładu, nie zaś ograniczenia, procedury wykorzystujące takie łagodne warunki są następujące (patrz również Shilo i Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): Filtry zawierające DNA są wstępnie umieszczane na 6 h w 40°C w roztworze zawierającym 35% formamid, 5 X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA, oraz 500 μg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia. Hybrydyzacje są wykonywane w tym samym roztworze z następującymi modyfikacjami: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 μg/ml DNA ze spermy łososia, 10% (w/v) siarczanu dekstranu oraz 5-20 X 106 cpm sondy wyznakowanej P32. Filtry są inkubowane w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 h w 40°C, a następnie przemywane przez 1,5 h w 55°C w roztworze zawierającym 2 X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA oraz 0,1% SDS. Roztwór płuczący jest zastępowany świeżym roztworem i inkubowany dodatkowe 1,5 h w 60°C. Filtry są blotowane na sucho i poddawane autoradiografii. Jeśli zachodzi konieczność filtry są przemywane trzeci raz w 65-68°C i ponownie poddawane ekspozycji. Inne łagodne warunki, które mogą zostać zastosowane, są dobrze znane w dziedzinie (np. dokonanie hybrydyzacji pomiędzy różnymi gatunkami, jak opisano na przykładzie w części 6.1.1).
W innym specyficznym wykonaniu kwas nukleinowy ulega hybrydyzacji z kwasem nukleinowym Nogo w warunkach ostrych. Na drodze przykładu, nie zaś ograniczenia, procedury wykorzystujące takie ostre warunki są następujące: filtry są prehybrydyzowane przez 8 h w 65°C w roztworze zawierającym 6 X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA oraz 500 μg/ml zdenaturowanego DNA spermy łososia. Filtry są hybrydyzowane przez 48 h w 65°C w mieszaninie prehybrydyzacyjnej zawierającej 100 μg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia oraz 5-20 X 106 cpm sondy wyznakowanej P32. Płukanie filtrów zachodzi w 37°C przez 1 h w roztworze zawierającym 2 X SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll oraz 0,01% BSA. Potem następuje płukanie w 0,1 X SSC w 50°C przez 45 min. przed autoradiografią. Inne warunki ostrej hybrydyzacji, które także można zastosować są dobrze znane w dziedzinie.
W kolejnym specyficznym wykonaniu kwas nukleinowy ulega hybrydyzacji z kwasem nukleinowym Nogo w warunkach umiarkowanej hybrydyzacji. Na drodze przykładu, nie zaś ograniczenia, procedury wykorzystujące warunki umiarkowane są następujące: Filtry zawierające DNA są wstępnie umieszczane na 6 h w 55°C w roztwroze zawierającym 6 X SSC, 5 X roztwór Denharta, 0,5% SDS
PL 204 293 B1 oraz 100 μg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia. Hybrydyzacje są wykonywane w tym samym roztworze oraz stosowane jest 5-20 X 106 cpm sondy znakowanej P32. Filtry są inkubowane w mieszaninie hybrydyzacyjnej przez 18-20 h w 55°C, a następnie dwukrotne przemywane przez 30 minut w 60°C w roztworze zawierającym 1 X SSC oraz 0,1% SDS. Filtry są blotowane na sucho poddawane autoradiografii. Inne warunki umiarkowane, które także można zastosować są dobrze znane w dziedzinie. Przemywanie filtrów zachodzi w 37°C przez 1 h w roztworze zawierającym
X SSC, 0,1% SDS. Taka ostrość warunków hybrydyzacji jest odpowiednia do izolacji kwasów nukleinowych zawierających sekwencje genu Nogo z innych gatunków, np. stosując szczurze lub bydlęce klony cDNA Nogo jako sondy do izolacji ludzkiego cDNA Nogo.
Szereg ludzkich ulegających ekspresji sekwencji końcowych (EST) zawartych w opublikowanych bazach danych sekwencji kwasów nukleinowych wykazuje wysoki stopień identyczności sekwencji w porównaniu do segmentów genu Nogo według wynalazku. Zidentyfikowano następującą wstępną listę ludzkich EST i umieszczono w Genbank pod numerami dostępu: AA158636 (SEQ ID NO:35), AA333267 (SEQ ID NO:36), AA081783 (SEQ ID NO:37), AA167765 (SEQ ID NO:38), AA322918 (SEQ ID NO:39), AA092565 (SEQ ID NO:40), 7AA081525 (SEQ ID NO:41). oraz AA081840 (SEQ ID NO:42) przy użyciu ENTREZ Nucleotide Query. Do daty niniejszego zgłoszenia żadna z powyżej zdefiniowanych EST nie została zdefiniowana pod kątem sekwencji aminokwasowych jakie te EST mogą kodować in vivo. Nic nie wiadomo było o funkcji białek zawierających przewidywane sekwencje aminokwasowe ludzkich EST. Co więcej, EST jak na przykład AA158636, przyrównany z 5' końcem szczurzego Nogo cDNA oraz inny EST, AA081840, przyrównany z 31 końcem szczurzego cDNA, nie nakładały się na siebie i nie można ich było uważać za części tej samej sekwencji ludzkiego cDNA.
W oparciu o sekwencje genu Nogo według wynalazku uważa się, że te ludzkie EST odpowiadają fragmentom ludzkiego genu Nogo, które ulegają ekspresji w tkance, z której otrzymano te EST. Zgodnie z tym opisano cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające dwa lub więcej ze zdefiniowanych powyżej ludzkich EST. EST mogą ulegać ekspresji w tej samej lub różnych tkankach ludzkich. Dogodnie, cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku zawierają sekwencje nukleotydowe co najmniej dwóch ludzkich EST, które nie nakładają się wzajemnie, lub które nie nakładają się z trzecim lub więcej ludzkimi EST.
Ponieważ zdefiniowane powyżej ludzkie EST są obecnie identyfikowane jako fragmenty ludzkiego genu Nogo w wyniku sklonowania bydlęcych i szczurzych kwasów nukleinowych Nogo, uważa się, że ludzkie EST mają funkcje podobne do funkcji innych cząsteczek kwasów nukleinowych Nogo w odniesieniu do różnych sposobów tu opisanych, takich jak na przykład, ekspresja ludzkich polipeptydów Nogo, testy hybrydyzacji oraz hamowanie ekspresji Nogo przy użyciu antysensownych cząsteczek kwasu nukleinowego, itd.
Co więcej, zgodnie z wynalazkiem opisano przypuszczalne sekwencje aminokwasowe ludzkiego białka Nogo oraz jego fragmentów. Jak pokazano na figurze 13, sekwencja aminokwasowa szczurzego białka Nogo (fig. 2a; SEQ ID NO:2) jest przyrównana z przypuszczalną sekwencją aminokwasowa ludzkiego białka Nogo (fig. 13; SEQ ID NO:29); zgodnie z tym, niniejszy wynalazek obejmuje białka Nogo zawierające przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego Nogo, fig. 13 (SEQ ID NO:29, lub przypuszczalną sekwecję aminokwasową ludzkiego Nogo, zawierającą co najmniej 6 aminokwasów, jedną lub więcej z następujących przypuszczalnych sekwencji aminokwasowych fragmentów ludzkiego Nogo: MEDLDQSPLVSSS (ludzkie Nogo, odpowiadające aminokwasom 1-13 z SEQ ID NO:43). KIMDLKEQPGNTISAG (ludzkie Nogo, odpowiadające aminokwasom 187-203 z SEQ ID NO:44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (ludzkie Nogo, odpowiadające aminokwasom 340-358 z SEQ ID NO:45), QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (ludzkie Nogo, odpowiadające aminokwasom 570-619 z SEQ ID NO:46). Naturalnie występujące Nogo, rekombinowane ludzkie Nogo oraz ich fragmenty mogą mieć sekwencję aminokwasową zasadniczo podobną do opisanych powyżej sekwencji aminokwasowych oraz mogą być zdolne do wiązania przeciwciała przeciwko białku Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także kwasy nukleinowe kodujące ludzkie białko Nogo mające sekwencję aminokwasową zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasowej pokazanej na figurze 13 (fig. 13; SEQ ID NO:29). W specyficznych wykonaniach, cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące fragmenty ludzkiego białka Nogo mające sekwencję aminokwasową zasadniczo podobną do sekwencji aminokwasowej jak pokazano na figurze 13 (SEQ ID NO:29) są również brane tu pod uwagę z założeniem, że takie cząsteczki kwasów nukleinowych nie zawierają sekwencji nukleotydowej powyżej zdefiniowanych ludzkich EST.
PL 204 293 B1
Sekwencja aminokwasowa jest uważana za zasadniczo podobną do przewidywanej sekwencji aminokwasowej ludzkiego białka Nogo, gdy więcej niż 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, lub 97% reszt aminokwasowych w dwóch cząsteczkach jest identyczne przy zastosowaniu algorytmu komputerowego, w którym przyrównywanie jest wykonywane przy użyciu znanego w dziedzinie programu homologii, przykładowo BLAST (Altschul i wsp., 1994, Nature Genet. 6:119-129).
Na drodze przykładu, lecz nie ograniczania, zalecane programy komputerowe do badania homologii obejmują: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul i wsp., 1990, J. Of Molec. Biol., 215:403-410, The BLAST Algorithm; Altschul i wsp., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402), heurystyczny algorytm poszukiwania ułożony tak, aby wyszukiwał podobieństwa sekwencji z przypisywaniem istotności z użyciem metod statystycznych Karlin i Altschul 1990. Proc. Nat'l Acad. Sci.; USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-77. Pięć specyficznych programów BLAST wykonuje następujące zadania:
1) Program BLASTP porównuje badaną sekwencję aminokwasową z sekwencjami białkowymi w bazie danych.
2) Program BLASTN porównuje badaną sekwencją nukleotydową z sekwencją nukelotydową z bazy danych.
3) Program BLASTX porównuje sześcio-ramkowe przypuszczalne produkty translacji badanej sekwencji nukleotydowej (obu nici) z sekwencjami białkowej bazy danych.
4) Program TBLASTN porównuje badaną sekwencje białkową z sekwecją nukleotydową bazy danych po translacji we wszystkich sześciu ramkach odczytu (obie nici).
5) Program TBLASTX porównuje sześcio-ramkowe wyniki translacji badanej sekwencji nukleotydowej z sześcio-ramkowymi wynikami translacji bazy danych sekwencji nukleotydowych.
Jest zrozumiałym dla fachowców, że program TBLASTN jest szczególnie użyteczny do identyfikacji kwasów nukleinowych o wymaganym procencie identyczności, zaś program BLASTP jest szczególnie użyteczny do identyfikacji sekwencji aminokwasowych o wymaganym procencie identyczności.
Smith-Waterman (baza danych: European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bicJW/) (Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197) jest matematycznie rygorystycznym algorytmem do przyrównań sekwencji.
FASTA (patrz Pearson i wsp., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444-2448) jest heurystycznym przybliżeniem algorytmu Smitha-Watermana. Ogólne omówienie procedury i korzyści wynikających z BLAST, algorytmów Smith-Waterman i FASTA, patrz Nicholas i wsp., 1998, A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods (www.psc.edu) oraz zawarte tam odniesienia.
Zastosowania przypuszczalnych sekwencji aminowasowych ludzkiego Nogo lub sekwencji nukleotydowych ludzkich EST, w tym zdegenerowanych sekwencji kodujących przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego Nogo celem izolacji lub identyfikacji ludzkiego genu Nogo, jego fragmentów i naturalnie występujących mutantów znajdują się w zakresie niniejszego wynalazku. Tego rodzaju zastosowania znane fachowcom obejmują nieograniczająco zastosowanie tych informacji do przygotowania sond kwasu nukleinowego celem przeszukiwania bibliotek DNA, amplifikacji DNA, genetycznego przeszukiwania ludzkiej populacji oraz celem przygotowania syntetycznych peptydów do wytwarzania przeciwciał. Szczegółowy opis niektórych z tych zastosowań jest zamieszczony poniżej w dalszych rozdziałach.
Kwasy nukleinowe kodujące pochodne i analogi białek Nogo oraz antysensowne kwasy nukleinowe Nogo zostały tutaj również opisane. Jak jest tu widoczne w stosowanym tu znaczeniu przez kwas nukleinowy kodujący fragment lub cześć białka Nogo należy rozumieć kwas nukleinowy kodujący tylko cytowany fragment lub część białka Nogo, a nie zaś inne przylegające części białka Nogo jako sekwencję ciągłą. W tym kontekście, część oznacza jeden lub więcej aminokwasów.
Fragmenty kwasów nukleinowych Nogo zawierające regiony konserwowane pomiędzy (wykazujące homologię) innymi kwasami nukleinowych Nogo z tego samego lub innego gatunku są również tutaj opisane. Kwasy nukleinowe kodujące jedną lub więcej domen Nogo są umieszczone na fig. 2a, (przykładowo, konserwowana domena C-końcowa szczurzego Nogo, mająca około 180 aminokwasów jest kodowana przez co najmniej 540 nukleotydów sekwencji kodującej aż do kodonu stop). Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe dwóch hydrofobowych domen wewnątrz konserwowanej domeny C-końcowej, tj. aminokwasy 988-1023 oraz 1090-1125 w szczurzym Nogo A, są również tutaj opisane. Opisane zostały również sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe N-końcowej domeny szczurzego Nogo A, od reszty 31 do 58.
PL 204 293 B1
Celem dokonania analizy funkcjonalnej różnych regionów Nogo wykonano szereg delecji w genie Nogo oraz sklonowano do wektora ekspresyjnego technikami rekombinacji DNA oraz poddawano ekspresji jako białko fuzyjne. Ujawniono kwasy nuleinowe kodujące fragment białka Nogo, np. kwasy nukleinowe kodujące reszty aminokwasowe 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974, lub 975-1162 z SEQ ID NO:2, bądź ich kombinacje; kwasy nukleinowe kodujące reszty aminokwasowe 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 i 940-1127 SEQ ID NO:29, lub ich kombinacje. Niektóre z konstruktów delecyjnych zawierają skrócone fragmenty Nogo oraz dodatkowe sekwencje nukleotydowe kodujące znacznik heksahistydynowy oraz/lub T7. Opisano kwasy nukleinowe kodujące skrócone białka Nogo, którym brakuje reszt aminokwasowych 172-259, 974-1162, lub 172-259 oraz 974-1162, z SEQ ID NO:2, ale zawierające pozostałość SEQ ID NO:2; lub sekwencje którym brakuje reszt aminokwasowych 132-206, 939-1127, lub 132-206 oraz 939-1127, z SEQ ID NO:29, ale zawierające pozostałość SEQ ID NO:29. Struktura przykładowych konstruktów delecyjnych została przedstawiona na fig. 18. Konstrukty delecyjne produkują po wprowadzeniu do komórki fragmenty lub skrócone części Nogo. Biologiczna aktywność tych mutantów była badana w różnych testach funkcjonalnych; jak opisano w Tabeli 2 w rozdziale 6.2.7.
Specyficzne przykłady klonowania genu Nogo, przedstawione na szczególnym, ale nieograniczającym przykładzie są następujące: do klonowania celem ekspresji (technika powszechnie znana w dziedzinie), skonstruowana została biblioteka ekspresji metodami znanymi w dziedzinie. Przykładowo, izolowane jest mRNA (np. ludzkie), przepisywane na cDNA oraz ligowane z wektorem ekspresyjnym (np. pochodna bakteriofaga), w taki sposób, że zdolny jest on do ekspresji w komórkach gospodarza, do których został wprowadzony. Zastosowane mogą zostać różne techniki przeszukiwania celem selekcji ulegającego ekspresji produktu Nogo. W jednym z wykonań do selekcji stosowane są przeciwciała anty-Nogo. W kolejnym wykonaniu stosowana jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR), celem amplifikacji potrzebnej do selekcji sekwencji w bibliotece genomowej lub cDNA przed selekcją. Oligonukleotydowe startery odpowiadające znanym sekwencjom Nogo mogą zostać użyte jako startery w PCR. W preferowanym aspekcie, startery oligonukleotydowe odpowiadaj ą co najmniej części konserwowanych segmentów Nogo o wysokiej homologii pomiędzy Nogo z różnych gatunków. Syntetyczne oligonukleotydy mogą zostać zastosowane jako startery do amplifikacji z użyciem PCR potencjalnie będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji ze źródła (RNA lub DNA), w szczególności biblioteki cDNA. PCR może zostać przeprowadzony przy użyciu, np. cyklera Perkin-Elmer Cetus oraz polimerazy Taq (Gene Amp™). Amplifikowane DNA może obejmować mRNA, cDNA lub DNA genomowe z jakiegokolwiek z gatunków eukariotycznych. Celem zastosowania w reakcjach PCR można zsyntetyzować szereg różnych zdegenerowanych starterów. Można również zmieniać warunki hybrydyzacji starterów celem zwiększenia lub zmniejszenia stopnia podobieństwa sekwencji pomiędzy znaną sekwencją nukleotydową Nogo a izolowanym homologiem kwasu nukleinowego. Dla różnych gatunków preferowane są łagodne warunki hybrydyzacji, zaś w obrębie tego samego gatunku preferowane są umiarkowane warunki hybrydyzacji.
Po udanej amplifikacji segmentu homologa Nogo, segment taki może zostać molekularnie sklonowany i zsekwencjonowany oraz zastosowany w roli sondy celem wyizolowania całkowitego cDNA lub klonu genomowego. To z kolei umożliwia określenie całkowitej sekwencji nukleotydowej genu, analizę jego ekspresji oraz produkcję białka do analizy funkcjonalnej, jak opisano poniżej. W ten sposób mogą zostać zidentyfikowane dodatkowe geny kodujące białka Nogo i analogi Nogo.
Opisane powyżej metody nie mają na celu ograniczenia następującego szczegółowego opisu metod, dzięki którym otrzymano klony Nogo.
Jakakolwiek komórka eukariotyczna może potencjalnie służyć jako źródło kwasu nukleinowego do klonowania molekularnego genu Nogo. Sekwencje kwasów nukleinowych kodujące Nogo mogą zostać wyizolowane z kręgowca, ssaka, człowieka, świni, myszy, bydła, kota, ptaka, psa, naczelnych oraz owadów, itd. DNA można otrzymać z użyciem stadardowych, znanych w dziedzinie procedur z klonowanego DNA (np. biblioteka DNA), na drodze syntezy chemicznej, klonowania cDNA b ą d ź poprzez klonowanie genomowego DNA lub jego fragmentów, oczyszczania z pożądanej komórki (patrz, np. Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II.) Klony otrzymane z genomowego DNA mogą zawierać oprócz regionów kodujących regiony regulatorowe oraz introny; klony otrzymane z cDNA będą zawierać tylko sekwencje eksonów. Jakiekolwiek zastosowane zostało źródło, gen powinien zostać sklonowany do odpowiedniego wektora namnażającego w celu amplifikacji genu.
PL 204 293 B1
W klonowaniu molekularnym genu z genomowego DNA, wytwarzane są fragmenty DNA, z których niektóre będą kodować potrzebny gen. DNA może być cięty w specyficznych miejscach, przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie, zastosowana może zostać DNAza w obecności magnezu celem fragmentacji DNA, bądź DNA może zostać rozerwany fizycznie, przykładowo na drodze sonikacji. Liniowe fragmety DNA mogą zostać rozdzielone według swojej wielkości z użyciem standardowych technik, w tym bez ograniczenia elektroforezy agarozowej lub poliakrylamidowej oraz chromatografii kolumnowej.
Po wytworzeniu fragmentów DNA, identyfikacja specyficznego fragmentu DNA zawierającego pożądany gen może zostać wykonana na szereg sposobów. Przykładowo, jeśli ilość części genu Nogo (z jakiegokolwiek gatunku) lub jego specyficznego RNA albo fragmentu jest wystarczająca (patrz część 6.1.1) oraz może zostać oczyszczona i wyznakowana, powstające fragmenty DNA mogą być badane na drodze hybrydyzacji kwasu nukleinowego do wyznakowanej sondy (Benton, W. i Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. i Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Fragmenty DNA wykazujące zasadniczą homologię do sondy będą ulegać hybrydyzacji. Możliwa jest również identyfikacja odpowiedniego fragmentu na drodze trawienia enzymem restrykcyjnym (enzymamami restrykcyjnymi) i porównania wielkości fragmentów z oczekiwanymi rozmiarami wedle znanych map restrykcyjnych jeżeli są one dostępne. Dalsza selekcja może być przeprowadzona na podstawie właściwości genu.
Alternatywnie obecność genu może zostać wykryta testami opartymi na fizycznych, chemicznych lub immunologicznych właściwościach powstającego produktu. Przykładowo, zidentyfikowane mogą zostać klony cDNA lub DNA, które hybrydyzują z właściwymi mRNA i produkują białko o np. identycznych lub podobnych: ruchliwości elektroforetycznej, punkcie izoelektrycznym, mapie trawienia proteolitycznego, posttranslacyjnych modyfikacjach, właściwościach kwasowych lub zasadowych albo modyfikacjach posttranslacyjnych z właściwościami znanymi dla Nogo. Dostępne są przeciwciała anty-Nogo, przykładowo, IN-1 oraz IN-2 (Patent U.S. nr 5,684,133), AS Bruna oraz AS 472. Przygotowanie AS Bruna i AS 472 jest opisane w rozdziale 6.1.7. Białko Nogo może zostać zidentyfikowane poprzez wiązanie wyznakowanego przeciwciała do przypuszczalnie syntetyzujących Nogo klonów w procedurze typu ELISA (płytkowy test immunoenzymatyczny w fazie stałej), bądź poprzez Western blotting oczyszczonych lub surowych ekstraktów komórkowych.
Gen Nogo może również zostać zidentyfikowany poprzez selekcję mRNA na drodze hybrydyzacji kwasów nukleinowych, po której następuje translacja in vitro. W tej procedurze używa się fragmentów celem wyizolowania komplementarnych mRNA na drodze hybrydyzacji. Takie fragmenty DNA mogą stanowić dostępne, oczyszczone DNA Nogo innych gatunków (np. myszy czy człowieka). Analizy immunoprecypitacyjne lub funkcjonalne (np. zdolność do agregacji in vitro, wiązanie z receptorem; patrz poniżej) produktów translacji in vitro wyizolowanych produktów wyizolowanego mRNA identyfikują mRNA a zatem, komplementarne fragmenty DNA, które zawierają poszukiwane sekwencje. Dodatkowo, wyselekcjonowane mogą zostać specyficzne mRNA na drodze adsorpcji polisomów wyizolowanych z komórek do unieruchomionych przeciwciał, specyficznie skierowanych przeciwko białku Nogo. Wyznakowane izotopowo cDNA Nogo może zostać zsyntetyzowane przy użyciu wybranych mRNA (z adsorbowanych polisomów) jako matrycy. Wyznakowane izotopowo mRNA lub cDNA mogą być wówczas użyte jako sonda to identyfikacji fragmentów DNA Nogo spośród innych fragmentów genomowego DNA.
Alternatywnie do izolacji genomowego DNA dla Nogo zastosowana może być nieograniczająco chemiczna synteza sekwencji samego genu na podstawie już znanej sekwencji lub tworzenia cDNA z mRNA kodującego białko Nogo. Przykładowo, RNA do klonowania cDNA genu Nogo mogą zostać wyizolowane z komórek, które eksprymują Nogo. Możliwe jest zastosowanie w obrębie wynalazku innych metod.
Zidentyfikowany i wyizolowany gen może zostać wstawiony do odpowiedniego wektora do klonowania. Zastosowana może zostać znaczna ilość znanych w dziedzinie systemów wektor-gospodarz. Możliwe do zastosowania wektory obejmują nieograniczająco plazmidy i zmodyfikowane wirusy, ale system wektora musi być dostosowany do komórki gospodarza. Wektory takie nieograniczajaco obejmują bakteriofagi, takie jak pochodne lambda, lub plazmidy takie jak pochodne plazmidów pBR322 lub pUC lub wektora Bluescript (Stratagene). W specyficznym przykładzie, Nogo został sklonowany do pcDNA3 ze znacznikami epitopowymi do uproszczonej analizy ekspresji białka (Rozdział 6.1.10).
Wstawienie do wektora do klonowania może, przykładowo, być dokonane poprzez ligację fragmentu DNA do wektora do klonowania posiadającego komplementarnie lepkie końce. Jednakże, jeśli
PL 204 293 B1 zastosowane do fragmentacji DNA komplementarne miejsca restrykcyjne nie są obecne w wektorze do klonowania, końce cząsteczki DNA można enzymatycznie zmodyfikować. Alternatywnie, pożądane miejsce można wytworzyć poprzez ligację sekwencji nukleotydowych (linkerów) na końcach DNA; te zligowane linkery mogą zawierać specyficzne chemicznie zsyntetyzowane oligonukleotydy kodujące miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne. W sposobie alternatywnym, cięty wektor i gen Nogo mogą zostać zmodyfikowane poprzez przyłączenie homopolimerycznego koń ca. Rekombinowane cząsteczki mogą zostać wstawione do komórek gospodarza na drodze transformacji, transfekcji, infekcji, elektroporacji, itp., w taki sposób, że powstaje szereg kopii sekwencji genu.
W alternatywnej metodzie poszukiwany gen moż e zostać zidentyfikowany i wyizolowany po wstawieniu do odpowiedniego wektora do klonowania w technice „strzelby genowej.
Wzbogacenie pod względem docelowego genu może zostać przeprowadzone przykładowo poprzez frakcjonowanie pod względem wielkości zanim zostanie on wprowadzony do wektora do klonowania.
W specyficznych wykonaniach, transformacja komórek gospodarza rekombinowanymi cząsteczkami DNA, które zawierają wyizolowany gen Nogo, cDNA lub zsyntetyzowany DNA, umożliwia wytworzenie wielu kopii genu. A zatem, gen może zostać otrzymany w dużych ilościach poprzez hodowlę transformantów, izolację rekombinowanych cząsteczek DNA z transformantów oraz, w razie konieczności, odzyskanie wstawionego genu z wyizolowanego rekombinowanego DNA.
Sekwencje Nogo przedstawione w niniejszym wynalazku dotyczą sekwencji nukleotydowych kodujących zasadniczo te same sekwencje aminokwasowe jak te znajdowane w natywnych białkach Nogo, jak również te kodujące sekwencje aminokwasowe z funkcjonalnie równoważnymi aminokwasami, jak również te kodujące inne pochodne i analogi Nogo, jak opisano w rozdziale 6.2.1 i 6.2.2 dla pochodnych i analogów Nogo.
5.2 Ekspresja genów Nogo
Sekwencja nukleotydowa kodująca białko Nogo lub jego funkcjonalnie aktywny analog lub pochodna lub fragment (patrz figury 1b i 2a; rozdziały 6.2.1 i 6.2.2), może zostać wprowadzona do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tj. wektora zawierającego elementy niezbędne do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodują cej biał ko. Niezbę dne sygnał y transkrypcji i translacji mogą być także dostarczone przez natywny gen Nogo oraz/lub jego regiony flankujące. Sekwencja kodująca może być także znakowana sekwencją kodującą dobrze opisany antygen lub cząsteczkę biologiczną mającą znane właściwości wiązania się z ligandem (np. znacznik epitopowy myc, znacznik histydynowy, znacznik epitopowy T7, itp. patrz rozdział 6.2.6 i figury 11a-11e). Ta dodatkowa sekwencja może zostać następnie wykorzystana do oczyszczania białka Nogo, fragmentu białka lub pochodnej przy użyciu interakcji grupy wiążącej z odpowiednim ligandem, przyczepionym do stałego podłoża.
Do ekspresji sekwencji kodującej białko może zostać zastosowane szereg systemów gospodarz-wektor. Obejmują one nieograniczająco ssacze systemy komórkowe zakażone wirusem (np. wirusem krowianki, adenowirusem itp.); owadzie systemy komórkowe zakażone wirusem (np. bakulowirusem); mikroorganizmy takie jak drożdże zawierające wektory drożdżowe lub bakterie stransformowane bakteriofagiem, DNA, DNA plazmidowym lub DNA kosmidowym. Elementy ekspresyjne wektorów różnią się specyfiką i wydajnością. W zależności od zastosowanego systemu gospodarz-wektor użyty może zostać jeden lub więcej odpowiednich elementów transkrypcji i translacji. W specyficznym wykonaniach ekspresji ulega ludzki gen Nogo lub sekwencja kodująca część funkcjonalnie aktywną ludzkiego Nogo, przykładowo Nogo A, Nogo B lub Nogo C (figura 1b). W jeszcze innym wykonaniu, ekspresji ulega fragment Nogo zawierający domenę białka Nogo.
W stosowanym tu znaczeniu komórka jest „transformowana kwasem nukleinowym, gdy ta komórka zawiera kwas nukleinowy nie obecny natywnie w tej komórce, po wprowadzeniu tego kwasu nukleinowego do tej komórki lub jej prekursora, np. poprzez transfekcję, elektroporację, transdukcję, itp.
Sekwencje nukleotydowe kodujące fragmenty ludzkiego Nogo A zawierają sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z reszt aminokwasowych 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, i 940-1127 z SEQ ID NO:29. Sekwencje nukleotydowe kodujące skrócone wersje ludzkiego Nogo A są również tutaj opisane; skrócone białka są pozbawione reszt aminokwasowych 132-206, 939-1127, lub 132-206 oraz 939-1127, z SEQ ID NO:29 jednak zawierają pozostałą część sekwencji SEQ ID NO:29.
Każda z opisanych poprzednio metod insercji fragmentów DNA do wektora może zostać zastosowana celem konstrukcji wektorów ekspresyjnych zawierających chimeryczny gen zawierający odpowiednie sygnały kontroli transkrypcji/translacji oraz sekwencje kodujące białka. Metody te mogą
PL 204 293 B1 obejmować techniki rekombinacji DNA in vitro oraz techniki syntezy oraz rekombinantów in vivo (rekombinacja genetyczna). Ekspresja sekwencji kwasów nukleinowych kodujących białko Nogo lub fragment peptydu może być regulowana przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego w taki sposób, że białko lub peptyd Nogo może ulegać ekspresji w gospodarzu transformowanym rekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo ekspresja białka Nogo może być kontrolowana przez element promotora/wzmacniacza znany w dziedzinie. Przykładowym wykonaniem jest zastosowanie jednego z naturalnych promotorów Nogo, P1 lub P2, opisanych w rozdziale 6.2.1. Zastosowany może również zostać promotor nie-natywny. Promotory, które mogą być stosowane do kontroli ekspresji Nogo obejmują nieograniczajaco, region wczesnego promotora SV40 (Bcrnoist i Chainbon, 1981, Nature 290:304-310), promotor zawarty w 3' długim końcowym powtórzeniu z wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto, i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej z herpeswirusa (Wagner i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), sekwencję regulatorową genu metalotioneiny (Brinster i wsp.,
1982, Nature 296:39-42); prokariotyczne wektory ekspresyjne, takie jak promotor β-lakatamazy (Villa-Kamaroff, i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), lub promotor lac (DeBoer, i wsp.,
1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); patrz również Useful proteins from recombinant bacteria w Scientific American, 1980, 242:74-94; roślinne wektory ekspresyjne zawierające region promotora syntazy nopaliny (Herrera-Estrella i wsp., Nature 303:209-213) lub promotor wirusa mozaiki tytoniu 35S RNA (Gardner, i wsp., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) i promotor enzymu fotosyntezy karboksylazy rybulozodwufosfonianowej (Herrera-Estrella i wsp., 1984, Nature 310:115-120); elementy promotora z drożdży lub innych grzybów, takie jak promotor Gal 4, ADC (dehydrogenazy alkoholowej), PGK (kinazy fosfoglicerolu), promotor fosfatazy alkalicznej oraz następujące regiony kontrolujące transkrypcję u zwierząt wykazujące specyficzność tkankową i stosowane w zwierzętach transgenicznych: region kontrolny genu elastazy I, aktywny w komórkach groniastych trzustki (Swift i wsp., 1984, Cell 38:639-646; Omitz i wsp., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425 515); region kontrolny genu insuliny, aktywny w komórkach beta trzustki (Hanahan, 1985. Nature 315:115-122), region kontrolny genu dla immunoglobulin, który jest aktywny w komórkach limfoidalnych (Grosschedl i wsp., 1984, Cell 38:647-658; Adames i wsp., 1985, Nature 318:533-538; Alexander i wsp., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), region kontrolny mysiego wirusa onkogennego, który jest aktywny w jądrach, sutkach, komórkach limfoidalnych i tucznych (Leder i wsp., 1986, Cell 45:485-495), region kontrolny genu albuminy aktywny w wątrobie (Pinkert i wsp., 1987, Genes i Devel. 1:268-276), region kontrolny genu alfa-fetoproteiny aktywny w wątrobie (Krumlaufet i wsp., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer i wsp., 1987, Science 235:53-58; region kontrolny genu alfa-1-antytrypsyny aktywny w wątrobie (Kelsey i wsp., 1987, Genes i Devel. 1:161-171), region kontrolny genu beta-globiny aktywny w komórkach mieloidalnych (Mogram i wsp., 1985, Nature 315:338-20 340; Kollias i wsp., 1986, Cell 46:89-94; region kontrolny genu białka zasadowego mieliny, aktywny w komórkach oligodendrocytów mózgu (Readhead i wsp., 1987, Cell 48:703-712); region kontrolny genu lekkiego łańcucha miozyny, aktywny w mięśniach szkieletowych (Sani, 1985, Nature 314:283-286), oraz region kontrolny genu hormonu uwalniającego gonadotropinę, aktywny w podwzgórzu (Mason i wsp., 1986, Science 234:1372-1378).
W specyficznym przykładzie zastosować można wektor zawierający promotor operacyjnie połączony z kwasem nukleinowym kodującym Nogo, jednym lub więcej miejscami inicjacji replikacji i opcjonalnie, z jednym lub więcej markerami selekcyjnymi (np. genem oporności na antybiotyki).
W specyficznym wykonaniu konstrukt ekspresyjny wykonany jest poprzez subklonowanie sekwencji kodującej Nogo do miejsca restrykcyjnego EcoRI każdego z trzech wektorów pGEX (wektory ekspresyjne transferazy S-glutationu; Smith i Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Pozwala to na ekspresję produktu białkowego Nogo z subklonu w odpowieniej ramce odczytu.
Wektory ekspresyjne zawierające inserty genu Nogo mogą zostać zidentyfikowane na drodze trzech ogólnych sposobów: (a) hybrydyzacji kwasów nukleinowych (b) obecności lub nieobecności funkcji genu „markerowego oraz (c) ekspresji wstawionych sekwencji. W pierwszym sposobie, obecność genu Nogo wstawionego do wektora ekspresyjnego może zostać wykryta poprzez hybrydyzację kwasu nukleinowego z użyciem sond zawierających sekwencje homologiczne do wstawionego genu Nogo. W drugim sposobie, rekombinowany system wektor/gospodarz może zostać zidentyfikowany i wyselekcjonowany na podstawie obecności lub braku pewnych markerowych funkcji genowych (aktywności kinazy tymidynowej, oporności na antybiotyki, tworzenia ciałek okluzyjnych w bakulowirusach, fenotypu umożliwiającego transformację, itp.) wywołanych wstawieniem genu Nogo do wektora. Przykładowo, po wstawieniu genu Nogo w obrębie sekwencji genu markerowego, rekombinanty zawierające
PL 204 293 B1 insert Nogo mogą zostać zidentyfikowane poprzez brak funkcji markerowej. W trzecim sposobie, rekombinowane wektory ekspresyjne mogą zostać zidentyfikowane poprzez pomiar produktu Nogo eksprymowanego przez rekombinanta. Testy te mogą być oparte, przykładowo, na fizycznych i funkcjonalnych właściwościach białka Nogo w systemach pomiaru in vitro, np. poprzez wiązanie przeciwciała anty -Nogo.
Po zidentyfikowaniu i wyizolowaniu określonej cząsteczki rekombinowanego DNA, do jej namnożenia można zastosować kilka metod znanych w dziedzinie. Po ustaleniu odpowiedniego systemu gospodarza i warunków hodowli, rekombinowany wektor ekspresyjny może być namnażany i przygotowywany ilościowo. Jak wyjaśniono poprzednio, zastosowane wektory ekspresyjne obejmują nieograniczająco następujące wektory oraz ich pochodne: ludzkie lub zwierzęce wirusy takie jak wirus krowianki lub adenowirus, wirusy owadzie takie jak bakulowirus; wektory drożdżowe i bakteriofagowe (np. lambda) oraz wektory plazmidowego i kosmidowego DNA, żeby wspomnieć choćby kilka.
Dodatkowo, szczep komórki gospodarza może zostać wybrany w taki sposób, aby modulować ekspresję wstawionych sekwencji lub modyfikować oraz obrabiać produkt genu w oczekiwany sposób. Ekspresja z pewnych promotorów może byc zwiększona w obecności pewnych induktorów; a zatem, ekspresja genetycznie zmodyfikowanego białka Nogo może być kontrolowana. Co więcej, różne komórki gospodarza posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy modyfikacji i obróbki translacyjnej i posttraslacyjnej (np. glikozylacji, fosforylacji białek). Odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy mogą zostać wybrane celem zapewnienia pożądanej modyfikacji i obróbki eksprymowanego obcego białka. Przykładowo, ekspresja w systemie bakteryjnym może zostaż zastosowana do produkcji nieglikozylowanego białka rdzeniowego. Ekspresja w drożdżach prowadzi do produktu glikozylowanego. Ekspresja w komórkach ssaczych może zostać użyta celem zapewnienia „natywnej glikozylacji białka heterologicznego. Co więcej, różne systemy ekspresji wektor/gospodarz mogą wpływać na reakcje obróbki w różnym stopniu.
W innych specyficznych przykładach białko Nogo, jego fragment, analog lub jego pochodna mogą być eksprymowane jako produkt fuzyjny, chimeryczny (zawierający białko, fragment, analog lub pochodną połączone wiązaniem peptydowym z sekwencją białka heterologicznego (lub innego białka). Taki produkt chimeryczny może być utworzony poprzez zligowanie odpowiedniej sekwencji kodującej docelową sekwencję aminokwasową z inną, w odpowiedniej ramce odczytu, za pomocą metod znanych w dziedzinie. Alternatywnie, taki produkt chimeryczny może być utworzony technikami syntezy białek, np. poprzez użycie syntetyzatora białek.
Produkowane i klonowane mogą być zarówno sekwencje cDNA jak i sekwencje genomowe.
5.3. Identyfikacja i oczyszczanie produktów genu Nogo.
W szczególnych aspektach dostarczono sekwencje aminokwasowe Nogo, szczególnie ludzkiego Nogo, ich fragmenty i pochodne zawierające determinantę antygenową (tj. takie, które mogą być rozpoznane przez przeciwciało) lub sekwencji, które są w jakikolwiek sposób funkcjonalnie aktywne, jak również sekwencje kwasów nukleinowych kodujących wyżej wspomniane sekwencje. W stosowanym tu znaczeniu „funkcjonalnie aktywny materiał Nogo odnosi się do materiału wykazującego jedną lub więcej znanych aktywności funkcjonalnych związanych z pełnej długości białkiem Nogo A (typu dzikiego), np. niepermisywnych właściwości substratu, zaniku stożków wzrostu zwojów korzeni grzbietowych, zdolności do hamowania pokrywania przez NIH 3T3, hamowania wzrostu neurytów, wiązania do substaratu Nogo lub liganda Nogo, antygenności (wiązania do przeciwciała anty-Nogo), immunogenności, itd.
Dla przykładu fragmenty białka Nogo składają się z co najmniej 6, 10, 17, 50, 100 aminokwasów lub co najmniej 220 aminokwasów. W innych przykładach białka Nogo zawierają lub składają się zasadniczo z wysoce konserwowanej domeny C-końcowej Nogo (C-końcowe 188 aminokwasów Nogo A). Ujawnione zostały również fragmenty lub białka zawierające fragmenty nie posiadające konserwowanej domeny C-końcowej lub hydrofobowych odcinków z C-końca lub domeny kwasowej N-końca, N-końcowego regionu poli-prolinowego lub ich kombinacji. Opisane zostały także kwasy nukleinowe kodujące powyżej określone elementy.
Po zidentyfikowaniu rekombinanta z ekspresją Nogo można poddawać analizie produkt genu. Osiąga się to dzięki testom opartym na fizycznych i funkcjonalnych właściwościach produktu, w tym izotopowego znakowania produktu, po którym następuje analiza elektroforetyczna w żelu, immunotesty itp.
Po zidentyfikowaniu białka Nogo może ono być izolowane i oczyszczane standardowymi technikami obejmującymi chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa i sączenia molekularnego), wirowanie, strącanie, dyferencyjną rozpuszczalność lub jakąkolwiek standardową techniką oczyszczania białek.
PL 204 293 B1
Właściwości funkcjonalne mogą być oceniane przy użyciu odpowiedniego testu, w tym zaniku stożków wzrostu zwojów korzeni grzbietowych, hamowania rozrostu NIH 3T3, hamowania regeneracji neurytów nerwów wzrokowych (patrz 6.2.4-6.2.5).
Alternatywnie, po zidentyfikowaniu białka Nogo wyprodukowanego przez rekombinanta można wydedukować sekwencję aminowaksową białka z sekwencji nukleotydowej chimerycznego genu zawartego w rekombinancie. W wyniku tego białko można zsyntetyzować przy użyciu standardowych technik chemicznych znanych w dziedzinie (np. patrz Hunkapiller, M., i wsp., 1984, Nature 310:105-111).
W kolejnym alternatywnym przykładzie natywne białko Nogo C może zostać oczyszczone ze źródeł naturalnych, za pomocą standardowych metod, takich jak opisane powyżej (np. oczyszczanie na drodze immunopowinowactwa).
W specyficznym wykonaniu białka Nogo, bez względu na to czy są produkowane technikami rekombinacji DNA lub metodami syntezy chemicznej bądź poprzez oczyszczanie natywnych białek, obejmują one nieograniczająco białka zawierające jako pierwszorzędową sekwencję aminokwasową całość lub część sekwencji aminokwasowej zasadniczo opisanej na figurze 13 (SEQ ID NO:29), jak również ich fragmenty i inne pochodne (takie jak nieograniczająco pokazane na figurze 18), oraz ich analogi, w tym białka homologiczne do nich. Białka Nogo według wynalazku są pozbawione materiału mielinowego OUN, z którymi są normalnie związane.
5.4. Struktura genu i białka Nogo.
Struktura genu i białka Nogo może być analizowana różnymi sposobami znanymi fachowcom, a kilka z tych metod zostało opisanych w następujących podrozdziałach.
5.4.1. Analiza genetyczna
Sklonowane cDNA lub DNA odpowiadające genowi Nogo może być analizowane metodami hybrydyzacji Southern (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northern (patrz. Freeman i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4094-4098), mapowania enzymami restrykcyjnymi (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), oraz analizy sekwencji DNA. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR; Patenty U.S. nr 4,683,202, 4,683,195 i 4,889,818; Gyllenstein i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7652-7656; Ochman i wsp., 1988, Genetics 120:621-623; Loh i wsp., 1989, Science 243:217-220), po której następuje hybrydyzacja Southern ze specyficzną dla Nogo sondą może umożliwić wykrycie genu Nogo w DNA z komórek różnych typów. Metody amplifikacji inne niż PCR są powszechnie znane w dziedzinie i mogą zostać zastosowane. W jednym z wykonań, hybrydyzacja Southern może zostać użyta celem zdeterminowania genetycznego powiązania Nogo. Analiza hybrydyzacją Northern może zostać użyta do określenia ekspresji genu Nogo. Różne typy komórek, na różnych etapach rozwoju lub aktywności mogą być testowane na ekspresję Nogo. Ostrością warunków hybrydyzacji Southern i Northern można manipulować, w taki sposób aby zapewnić detekcję kwasów nukleinowych o wymaganym stopniu pokrewnieństwa wobec specyficznie użytej sondy Nogo. Zastosowane mogą zostać modyfikacje tych metod oraz metody powszechnie znanane w dziedzinie.
Mapowanie enzymami restrykcyjnymi może zostać zastosowane celem określenia genetycznej struktury genu Nogo. Mapy restrykcyjne otrzymane poprzez cięcie enzymami restrykcyjnymi mogą być określone poprzez analizę sekwencji DNA.
Analiza sekwencji DNA może zostać wykonana dowolnymi technikami znanymi w dziedzinie, w tym metodą Maxama i Gilberta (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), metodą Sangera (Sanger, P., i wsp., 1977, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74:5463), przy użyciu polimerazy DNA T7 (Tabor i Richardson, Patent U.S. nr 4,795,699), lub przy użyciu automatycznego sekwenatora DNA (patrz Applied Biosystems, Foster City,CA).
5.4.2. Analiza białka
Sekwencja aminokwasowa białka Nogo może zostać wywiedziona z sekwencji DNA, lub alternatywnie, z bezpośredniego sekwencjonowania białka, np. z użyciem automatycznego sekwenatora aminokwasowego.
Sekwencja białka Nogo może ponadto zostać scharakteryzowana poprzez analizę hydrofilowości (Hopp, T. i Woods, K., 1981, Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A. 78:3824). Profil hydrofilowości może zostać użyty do identyfikacji regionów hydrofilowych i hydrofobowych białka Nogo oraz odpowiednich regionów sekwencji genu kodujących takie regiony.
Po drugie, można również wykonać analizę strukturalną (Chou, P. i Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) celem identyfikacji regionów Nogo przyjmujących specyficzne struktury drugorzędowe.
PL 204 293 B1
Manipulację, translację i przewidywanie struktury drugorzędowej, przewidywanie otwartej ramki odczytu jak również określenie homologii sekwencji można przeprowadzić również przy użyciu dostępnych w dziedzinie programów komputerowych.
Innymi metodami analizy strukturalnej, które mogą być zastosowane jest krystalografia promieni Roentgena (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) i modelowanie komputerowe (Fletterick, R. i Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring 35 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
5.5. Wytwarzanie przeciwciał wobec białek Nogo oraz ich pochodnych
Zgodnie z wynalazkiem białko Nogo, jego fragmenty lub analogi mogą być zastosowane jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał, które immunospecyficznie wiążą taki immunogen. Przeciwciała takie obejmują, nieograniczajaco, poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, jednołańcuchowe, fragmenty Fab oraz biblioteki ekspresji Fab. Wytwarzane są przeciwciała skierowane przeciwko rekombinowanemu fragmentowi szczurzego i bydlęcego Nogo (rozdział 6.1.7). Mogą one rozpoznawać krzyżowo epitopy innych gatunków. W kolejnym wykonaniu fragmenty białka Nogo zidentyfikowane jako hydrofilowe stosowane są jako immunogeny do produkcji przeciwciał.
Do produkcji przeciwciał przeciwko białku Nogo, pochodnej i analogowi można użyć szeregu metod znanych w dziedzinie. W szczególnym wykonaniu otrzymane mogą zostać królicze przeciwciała przeciwko epitopowi białka Nogo kodowanemu przez sekwencje SEQ ID NO:2 na figurze 2a, SEQ ID NO:24 oraz na figurze 12, SEQ ID NO:32; na figurze 14, lub SEQ ID NO:29 na figurze 13, (odpowiednio szczurze Nogo A, bydlęce Nogo, szczurze Nogo C, lub ludzkie Nogo) lub ich subsekwencjom. W celu produkcji przeciwciał immunizować można różne zwierzęta poprzez wstrzyknięcie natywnego białka Nogo lub jego wersji zsyntetyzowanej bądź pochodnej (np. fragmentu) w tym nieograniczająco: króliki, myszy, szczury, itp. Celem zwiększenia odpowiedzi immunologicznej zastosowane mogą być różne adiuwanty obejmujące, nieograniczająco, adiuwant Freunda (kompletny i niekompletny), żele mineralne takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo-czynne, takie jak lizolecytyna, pluronowe poliole, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa, dinitrofenol i potencjalnie użyteczne ludzkie adiuwanty takie jak BCG (bacille Calmette-Guerin) oraz Corynebacterium parvum.
Do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko sekwencji białka Nogo lub jego analogu, zastosowana może być dowolna technika umożliwiająca produkcję cząsteczek przeciwciał w ciągłych liniach komórkowych w hodowli komórkowej, przykładowo, oryginalnie opracowana przez Kohlera i Milsteina technika hybrydomy (1975, Nature 256:495-497), jak również technika triomy, technika ludzkiej hybrydomy komórek B (Kozbor i wsp., 1983, Immunology Today 4:72) oraz technika hybrydomy EBV celem produkcji ludzkich przeciwciał monoklonalnych (Cole i wsp., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. Inc., str. 77-96) . Przeciwciała monoklonalne mogą być wyprodukowane w pozbawionych zarazków zwierzętach (PCT/US90/02545). Zgodnie z wynalazkiem ludzkie przeciwciał a zastosowane mogą zostać i mogą być one otrzymane przy uż yciu ludzkich hybrydom (Cote i wsp., 19S3, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) lub poprzez transformację ludzkich komórek B wirusem EBV in vitro (Cole i wsp., 1985, in Monoclonal Antibodies i Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77-96). W rzeczywistości zgodnie z wynalazkiem zastosowana może być technika opracowana do produkcji „chimerycznych przeciwciał (Morrison i wsp, 1984, Proc. Natl Acad. Sci, U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger i wsp., 1984, Nature 312:604-608; Takeda i wsp., 1985, Nature 314:452-454) poprzez składanie z genów mysiej cząsteczki przeciwciała specyficznego dla Nogo z genami ludzkiej cząsteczki przeciwciał o odpowiedniej aktywności biologicznej.
Opisane techniki produkcji jednołańcuchowych przeciwciał (Patent U.S. nr 4,946,778) mogą zostać zaadaptowane do produkcji specyficznych dla Nogo jednołańcuchowych przeciwciał. Techniki opisane do konstrukcji bibliotek ekspresji Fab mogą zostać również zastosowane celem szybkiej i łatwej identyfikacji monoklonalnych fragmentów Fab o poszukiwanej specyficznoś ci wobec białek, pochodnych i analogów Nogo (Huse i wsp., 1989, Science 246:1275-1281).
Fragmenty przeciwciał zawierające idiotyp cząsteczki mogą zostać skonstruowane z użyciem znanych technik. Przykładowo, fragmenty takie obejmują, nieograniczająco,: fragment F(ab')2, który może być produkowany przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała; fragment Fab', który może być produkowany poprzez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentu F(ab')2, fragmenty Fab, które mogą być produkowane poprzez działnie na cząsteczkę przeciwciała papainą i czynnikiem redukującym oraz fragmenty Fv.
W produkcji przeciwciał wyszukiwanie potrzebnego przeciwciała może zostać osiągnię te technikami znanymi w dziedzinie, np. metodą ELISA (płytkowy test immunoenzymatyczny w fazie stałej).
PL 204 293 B1
Przykładowo, celem selekcji przeciwciał rozpoznających specyficzną domenę białka Nogo można badać wytworzone hybrydomy na obecność produktu wiążącego się z fragmentem Nogo zawierającym specyficzną domenę. Do selekcji przeciwciała specyficznie wiążącego się z pierwszym homologiem Nogo, ale nie wiążącym się z innym homologiem Nogo, wybrać można to, które pozytywnie wiąże się z pierwszym homologiem, ale nie wiąże się z drugim homologiem.
Zgodnie z wynalazkiem opisano również specyficzne przeciwciała wobec domeny białka Nogo.
Powyższe przeciwciała mogą zostać użyte w metodach znanych w dziedzinie dotyczących lokalizacji i aktywności sekwencji białek Nogo, np. do obrazowania tych białek, mierzenia ich poziomu w odpowiednich próbkach biologicznych, w metodach diagnostycznych, itp.
Przeciwciała anty-Nogo oraz ich fragmenty zawierają domenę wiążącą stanowią środki terapeutyczne (terapeutyki).
5.6. Białka, pochodne i analogi Nogo.
Zgodnie z wynalazkiem opisano białka Nogo, ich pochodne (w tym fragmenty) oraz analogi białek Nogo, a także kwasy nukleinowe kodujące białko Nogo, jego pochodne i analogy. W jednym z przykładów białka Nogo są kodowane przez kwasy nukleinowe Nogo opisane w rozdziale 5.1, patrz powyżej. W szczególnych aspektach opisano białka Nogo A, Nogo B, lub Nogo C, ich pochodne, analogi pochodzące ze zwierząt, np. myszy, szczura, świni, krowy, psa, małpy, człowieka, muszki lub żab.
Opisano także produkcję oraz zastosowanie pochodnych i analogów odnoszących się do Nogo. Specyficznym przykładem jest pochodna lub analog funkcjonalnie aktywny, tj. zdolna do wykazywania jednej lub więcej aktywności funkcjonalnych związanych z pełnej długości, dzikim typem białka Nogo. Przykładowo, tego rodzaju pochodne lub analogi, mające wymaganą immunogenność lub antygenowość mogą zostać użyte do immunotestów, immunizacji, hamowania aktywności Nogo, itd. Pochodne lub analogi, które zachowują lub alternatywnie są pozbawione lub hamują, pożądaną właściwość Nogo (np. wiązanie do liganda Nogo) mogą zostać zastosowane jako odpowiednio induktory, inhibitory takiej właściwości i jej fizjologicznych korelatów. Specyficzny przykład dotyczy fragmentu Nogo, który może być związany przez przeciwciało anty-Nogo. Pochodne lub analogi Nogo mogą być testowane pod względem wymaganej aktywności z użyciem procedur znanych w dziedzinie, w tym testów opisanych w 6.10.10. do 6.1.12.
Celem zmapowania aktywnych regionów (aktywnego regionu) Nogo technikami rekombinacji DNA przygotowano szereg mutantów delecyjnych Nogo jak opisano w rozdziale 6.2.7. Fragmenty Nogo obecne w mutantach delecyjnych przedstawiono na figurze 18. W specyficznym wykonaniu dostarczono fragmenty Nogo np. fragmenty zawierające aminokwasy (lub ewentualnie składające się z nich): Nogo A (SEQ ID NO:2): 1-171,172-974, 259-542, 542-722, 722-974, 172-259, lub 975-1162, bądź kombinacje powyższych. Opisano także skrócone mutanty Nogo, którym brakuje aminokwasów 172-259 i/lub 975 1162 z SEQ ID NO:2, ponieważ wydaje się, że rejony te są nieistotne i mogą być usunięte z Nogo bez wpływania na jego aktywność biologiczną. Opisano także odpowiednie fragmenty ludzkiego Nogo A obejmujące aminokwasy (lub ewentualnie składające się z nich) 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, lub 940-1127 lub SEQ ID NO:29. Opisano także skrócone mutanty ludzkiego Nogo A nie posiadające aminokwasów 132-206, aminokwasów 939-1127, aminokwasów 132-206 oraz 939-1127, z SEQ ID NO:29.
Specyficznym przykładem są fragmenty pozbawione całego materiału mielinowego OUN i/lub wykazujące aktywność hamującą Nogo. Opisano także białka fuzyjne zawierające jeden lub więcej z powyższych fragmentów połączonych z sekwencją nie-Nogo.
Pochodne genu Nogo mogą zostać wytworzone z sekwencji Nogo przez substytucje, addycje, delecje, które zapewniają funkcjonalnie równoważne cząsteczki. Z powodu degeneracji nukleotydowych sekwencji kodujących zastosowane mogą zostać w praktyce niniejszego wynalazku inne sekwencje DNA, które kodują zasadniczo tę samą sekwencję aminokwasową co gen Nogo. Obejmują one nieograniczająco sekwencje nukleotydowe zawierające całość lub część genu Nogo, które są zmienione przez substytucję różnych kodonów, które kodują funkcjonalny równoważnik reszty aminokwasowej wewnątrz tej sekwencji, prowadząc w ten sposób do cichej zmiany. Podobnie zgodnie z wynalazkiem pochodne Nogo obejmują, nieograniczająco, te zawierające, jako pierwszorzędową sekwencję aminokwasową, całość lub część sekwencji aminokwasowej białka Nogo w tym sekwencje zmienione, w których funkcjonalnie równoważne reszty aminokwasowe są podstawione za reszty tej sekwencji, prowadząc do cichej zmiany. Przykładowo, jedna lub więcej reszt aminokwasowych wewnątrz sekwencji może zostać konserwatywnie podstawiona inną resztą aminokwasową o podobnej polarności, która działa jako funkcjonalny równoważnik, prowadząc do cichej zmiany. Do podstawienia
PL 204 293 B1 aminokwasów w sekwencji wybrane mogą zostać inne aminokwasy tej samej klasy, do której należy ten aminokwas. Przykładowo, niepolarne (hydrofobowe) aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucunę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne neutralne aminokwasy obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane (zasadowe) aminokwasy obejmują argininę, lizynę, i histydynę. Ujemnie naładowane aminokwasy (kwaśne) obejmują kwas asparaginowy i glutaminowy.
Specyficznym przykładem są białka składające się lub zawierające fragment białka Nogo, składający się z co najmniej 10 (przylegających) aminokwasów białka Nogo. Innym przykładem jest fragment składający się z co najmniej 17 lub 50 aminokwasów białka Nogo. Specyficznymi przykładami są też fragmenty, które nie są większe niż 35, 100 lub 200 aminokwasów. Pochodne lub analogi Nogo obejmują, nieograniczająco, cząsteczki zawierające regiony zasadniczo homologiczne do Nogo lub jego fragmentów (np. w różnych wykonaniach, co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% lub 95% identyczności sekwencji o jednakowej długości, lub w przypadku porównania do przyrównanej sekwencji, w którym przyrównanie wykonywane jest przez program komputerowy do badania homologii, znany w dziedznie przykładowo BLAST (Altschul i wsp., 1994, Nature Genet. 6:119-129)) lub te, które kodwane są przez kwas nukleinowy zdolny do hybrydyzacji z sekwencją kodującą Nogo w warunkach łagodnych, umiarkowanych i ostrych.
Cząsteczki zawierające fragmenty Nogo zostały tu również opisane, np. zawierające wiązania węglowodorowe z innymi resztami, w tym resztami znakującymi lub bioaktywnymi.
Pochodne i analogi Nogo tu opisane mogą być produkowane różnymi metodami znanymi w dziedzinie. Manipulacje prowadzące do ich wytworzenia mogą zachodzić na poziomie genów lub białek. Przykładowo, sklonowana sekwencja genu Nogo może być modyfikowana za pomocą jakiejkolwiek z metod znanych w dziedzinie (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 wyd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Sekwencja może być cięta w odpowiednich miejscach za pomocą endonukleazy restrykcyjnej (enzodunkleaz restrykcyjnych), po której następuje dalsza modyfikacja enzymatyczna w zależności od potrzeby, izolacja oraz ligacja in vitro. W produkcji genu kodującego pochodną lub analog Nogo należy podjąć kroki mające na celu zapewnienie by zmodyfikowany gen pozostawał w tej samej ramce odczytu translacji co Nogo, nieprzerwany przez sygnały końca translacji, w regionie genu gdzie kodowana jest wymagana aktywność Nogo.
Dodatkowo, sekwencja kwasu nukleinowego kodująca Nogo może zostać zmutowana in vitro lub in vivo, celem stworzenia i/lub zniesienia translacji, inicjacji i/oraz sekwencji terminacji, bądź w celu stworzenia zmian w regionach kodujących i/lub do wytworzenia nowych miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych bądź zniszczenia już istniejących, celem ułatwienia dalszych modyfikacji in vitro. Zastosowana może być jakakolwiek z technik znanych w dziedzinie, w tym nieograniczajaco mutageneza chemiczna, miejscowo-ukierunkowana mutageneza in vitro (Hulchinson, C, i wsp., 1978, J. Biol. Chem 253:655), zastosowanie linkerów TAB® (Pharmacia), itd.
Manipulacje sekwencją Nogo mogą być również wykonywane na poziomie białka. Zawarte w tym wynalazku są fragmenty białka Nogo lub inne pochodne i analogi dyferencyjnie modyfikowane podczas lub po translacji, tj. poprzez glikozylację, acetylacje, fosforylację, amidowanie, derywatyzację znanymi grupami blokującymi/zabezpieczającymi, cięcie proteolityczne, połączenie z cząsteczką przeciwciała lub innym ligandem komórkowym, itd. Którakolwiek z chemicznych modyfikacji może zostać przeprowadzona znanymi technikami, w tym nieograniczająco cięciem chemicznym bromkiem cyjanogenu, trypsyną, chymotrypsyną, papainą, proteazą V8, NaBH4, acetylacją, formylacją, utlenianiem, redukcją, syntezą metaboliczną w obecności tunikamycyny, itp.
Dodatkowo, analogi i pochodne Nogo mogą zostać zsyntetyzowane chemicznie. Przykładowo, peptyd odpowiadający części białka Nogo zawierającej wymaganą domenę lub, który mediuje wymaganą aktywność in vitro, może być syntetyzowany przy użyciu syntetyzatora peptydowego. Co więcej, jeśli jest to konieczne, wprowadzone mogą zostać nieklasyczne aminokwasy lub chemiczne analogi aminokwasów jako substytucje lub addycje w sekwencji Nogo. Nieklasyczne aminokwasy obejmują, nieograniczajaco, D-izomery powszechnie występujących aminokwasów, kwas α-aminoizomasłowy, kwas 4-aminomasłowy, Abu, kwas 2-aminomasłowy, γ-Abu, ε-Ahx, kwas 6-aminoheksanowy, Aib, kwas 2-aminoizomasłowy, kwas 3-aminopropionowy, ornitynę, norleucynę, norwalinę, hydroksyprolinę, sarkozynę, cytrulinę, kwas cysteinowy, t-butyloglicynę, t-butyloalaninę, fenyloglicynę, cykloheksyloalaninę, β-alaninę, fluoroaminokwasy oraz projektowane aminokwasy takie jak β-metyloaminokwasy, Ca-metyloaminokwasy, Na-metyloaminokwasy oraz generalnie analogi aminokwasów. Co więcej, aminokwas może być lewoskrętny (L) lub prawoskrętny (D).
PL 204 293 B1
Specyficznym przykładem jest pochodna Nogo, która jest białkiem chimerycznym lub fuzyjnym zawierającym białko Nogo lub jego fragment (zwłaszcza zawierającym domenę składającą się co najmniej z domeny lub motywu białka Nogo, lub co najmniej 10 aminokwasów białka Nogo) połączonych na jego N-lub C-końcu poprzez wiązanie petydowe z sekwencją aminokwasową innego białka. W jednym z wykonań białko chimeryczne jest produkowane przez ekspresję rekombinacyjną kwasu nukleinowego kodującego białko (zawierające sekwencję kodującą Nogo połączoną w ramce z sekwencją kodującą innego białka). Taki produkt chimeryczny może zostać wytworzony przez ligację odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego kodujących wymagane sekwencje aminokwasowe metodami znanymi w dziedzinie, w odpowiedniej ramce odczytu oraz produkujący produkt chimeryczny metodami znanymi w dziedzinie. Alternatywnie, taki produkt chimeryczny może być wytworzony technikami chemicznej syntezy białek, np. poprzez zastosowanie syntetyzatora białkowego. Skonstruowane mogą zostać chimeryczne geny zawierające fragmenty Nogo poddane fuzji do jakichkolwiek heterologicznych sekwencji kodujących białko heterologiczne. Takie heterologiczne sekwencje kodujące białko obejmują, nieograniczajaco, znacznik haksahistydynowy, i znacznik T7. Specyficzne wykonanie odnosi się do białka chimerycznego zawierającego fragment Nogo o co najmniej sześciu aminokwasach.
Innym przykładem specyficznym pochodnej Nogo może być cząsteczka zawierająca region homologii z białkiem Nogo.
Jeszcze innym specyficznym przykładem pochodnych Nogo (np. fragmentów) są białka, które nie występują w naturze.
Inne przykłady pochodnych i analogów są opisane wraz z przykładami w podrozdziale poniżej.
5.6.1. Pochodne Nogo zawierające jedną lub więcej domen tego białka
W specyficznym wykonaniu opisano pochodne i analogi Nogo, w szczególności fragmenty Nogo i pochodne takich fragmentów, które zawierają lub alternatywnie składają się z jednej lub więcej domen białka Nogo, w tym nieograniczajaco konserwowany C-koniec, domeny hydrofobowe lub N-końcowe domeny kwasowe lub bogate w prolinę, fragmenty funkcjonalne każdego z powyższych lub jakiejkolwiek kombinacje powyższych.
Specyficzne wykonanie dotyczy cząsteczek zawierających specyficzne fragmenty Nogo, będące w odpowiednim białku Nogo najbardziej homologiczne ze specyficznymi fragmentami szczurzego lub bydlęcego białka Nogo. Fragment zawierający domenę homologa Nogo może zostać zidentyfikowany metodami analizy białek opisanymi w rozdziałch 6.1.2, 6.1.8, 6.1.9, 6.1.10, 6.1.11 lub 6.1.12.
W kolejnym specyficznym wykonaniu ujawniono cząsteczkę zawierającą jedną lub więcej domen (lub ich części funkcjonalnych) białka Nogo, ale której brakuje jednej lub więcej domen (lub ich części funkcjonalnych) białka Nogo. W kolejnym wykonaniu ujawniono cząsteczkę zawierającą jedną lub więcej domen (lub ich części funkcjonalnych) białka Nogo oraz zawierającą jedną lub więcej zmutowanych domen (np. w skutek delecji lub mutacji punktowej) białka Nogo (np. takich domen, których funkcja jest zmniejszona).
5.7. Testy białek Nogo, ich pochodnych i analogów
Funkcjonalna aktywność białek Nogo, ich pochodnych i analogów może być testowana za pomocą różnych metod. Opis testów funkcjonalnych w następujących rozdziałach nie ma na celu ograniczania i może obejmować inne testy znane w dziedzinie.
5.7.1. Testy hamowania wzrostu neurytów przez Nogo in vitro.
W specyficznym przykładzie białka Nogo, ich pochodne i analogi mogą być testowane pod kątem hamowania rozrostu NIH 3T3 lub hamowania rozrastania neurytów PC12 z użyciem hodowli tkankowej in vitro (rozdział 6.1.10).
W alternatywnym przykładzie białka Nogo, ich pochodne i analogi mogą być zastosowane do testów pod kątem hamowania wzrostu stożków wzrostu w eksplantowanych kurzych zwojach korzeni grzbietowych indukowanego obecnością Nogo. Podobnie, funkcja Nogo może być testowana pod kątem hamowania wzrostu neurytów eksplantowanych kurzych zwojów korzeni grzbietowych (Spillman i wsp., 1998 J. Biol. Chem. 273:19283-19293).
5.7.2. Testy właściwości funkcjonalnych Nogo in vivo
W jednym z przykładów, antagoniści białek Nogo, ich pochodne i analogi mogą być użyte do testów funkcji in vivo stosujących zwierzęcy model regeneracji drogi korowo-rdzeniowej (CST) na długich odcinkach oraz odzyskiwania funkcji behawioralnych.
W preferowanym przykładzie szlak korowo-rdzeniowy gryzonia ulega uszkodzeniu poprzez chirurgiczną resekcję lub uszkodzeniu rdzenia kręgowego, zaś zwierzęciu podaje się antagonistów Nogo. Plastyczność neuronalna, regeneracja oraz odzyskiwanie funkcji, w porównaniu z nieleczonymi
PL 204 293 B1 zwierzętami kontrolnymi, jest monitorowana w kierunku plastyczności strukturalnej lub regeneracji na drodze technik anatomicznych, głównie poprzez znakowanie szlaków neuronalnych. Odzyskiwanie funkcji mierzone jest przy użyciu testów lokomotorycznych oraz elektrofizjologicznych wykonywanych przez gryzonie (np. test taśmy klejącej, zadanie sięgania po pokarm, itp. (Thallmair i wsp., 1998 Nat Neuroscience 1(2):124-131).
5.7.3. Testy hamowania wiązania liganda Nogo
W jednym z przykładów celem zbadania zdolności wiązania lub kompetycji z dzikim typem białka Nogo o wiązanie z przeciwciałem anty-Nogo zastosować można szereg znanych technik immunologicznych, obejmujących nieograniczająco systemy kompetycyjne i nie-kompetycyjne, takie jak testy radioimmunologiczne, test ELISA, immonotest typu sandwich, testy immunoradiometryczne, testy precypitacji w żelu, testy precypitacji i immunodyfuzji, immunotesty in situ (wykorzystujące jako znaczniki np. złoto koloidalne, enzymy lub radioizotopy), hybrydyzację Western, reakcje precypitacji, testy aglutynacji (np. testy aglutynacji w żelu, testy hemaglutynacji), testy wiązania dopełniacza, testy immunofluorescencyjne, testy białka A oraz testy immunoelektroforetyczne. itd. W jednym z wykonań wiązanie przeciwciała jest wykrywane poprzez wiązanie znacznika na przeciwciele pierwszorzędowym. W innym wykonaniu pierwszorzędowe przeciwciało wykrywane jest poprzez wykrywanie wiązania drugorzędowego przeciwciała lub reagentu z pierwszorzędowym przeciwciałem. W dalszym wykonaniu, znakowane jest przeciwciało drugorzędowe. Znanych jest szereg środków służących do wykrywania wiązania w immunotestach, które mogą być zastosowane zgodnie z wynalazkiem.
W innym przykładzie, w którym identyfikuje się wiązanie białka Nogo wiązanie można testować np. środkami znanymi w dziedzinie. W kolejnym wykonaniu, testować można fizjologiczne korelaty wiązania Nogo z substratami.
5.8. Zastosowania terapeutyczne
Zgodnie z wynalazkiem opisano zastosowanie związków terapeutycznych (zwanych terapeutykami) w leczeniu lub profilaktyce różnych chorób i zaburzeń. Takie „terapeutyki obejmują nieograniczajaco: białka Nogo (np. jak opisano powyżej), skierowane przeciwko nim przeciwciała (jak opisano powyżej); kwasy nukleinowe kodujące białka Nogo, jego analogi i pochodne; antysensowne kwasy nukleinowe Nogo; agonistów i antagonistów Nogo. Zaburzenia związane z deregulacją wzrostu komórkowego, np. nowotwory OUN można leczyć, lub można im zapobiegać, poprzez zastosowanie środka terapeutycznego, który promuje funkcję Nogo. Zaburzenia wzrostu neurytów, regeneracji lub utrzymywania można leczyć poprzez zastosowanie środka terapeutycznego, który antagonizuje (hamuje) funkcję Nogo. Powyższe kwestie zostały opisane poniżej.
Ogólnie, preferowane jest podawanie produktów pochodzących z danego gatunku lub produktów reaktywnych w danym gatunku (w przypadku przeciwciał), będącego tego samego gatunku co pacjent. A zatem, w preferowanym wykonaniu ludzkie białko Nogo, lub jego pochodna, lub analog, lub kwas nukleinowy lub przeciwciało przeciwko ludzkiemu Nogo mogą być zastosowane do podawania człowiekowi w celach profilaktycznych lub terapeutycznych.
5.8.1. Leczenie i profilaktyka zaburzeń związanych z deregulacją wzrostu komórkowego.
Choroby i zaburzenia związane z deregulacją wzrostu komórkowego można leczyć, lub można im zapobiegać, poprzez zastosowanie środka terapeutycznego, który promuje (tj. zwiększa lub uzupełnia) funkcje Nogo. Przykłady takich środków terapeutycznych obejmują nieograniczająco białka, pochodne lub fragmenty Nogo, które są funkcjonalnie aktywne, w szczególności te, które są aktywne w hamowaniu wydłużania neurytów lub hamowaniu wzrostu komórkowego (np. jak pokazano w testach in vitro oraz na modelach zwierzęcych) oraz obejmują kwasy nukleinowe kodujące białko Nogo lub jego funkcjonalnie aktywną pochodną lub fragment (np. do zastosowania w terapii genowej). Zgodnie z wynalazkiem białka Nogo, ich pochodne lub fragmenty są pozbawione materiału mielinowego OUN, z którym są normalnie związane. Zastosować można inne terapeutyki, np. agonistów Nogo można identyfikować z użyciem testów in vitro lub modeli zwierzęcych, co zostało opisane poniżej.
W specyficznych wykonaniach środki terapeutyczne, które promują funkcję Nogo mogą być podawane w celach terapeutycznych (w tym profilaktycznych) w (1) chorobach i zaburzeniach związanych z brakiem, bądź zmniejszonym poziomem (w stosunku do normalnego lub wymaganego) białka lub funkcji Nogo. Przykładowo, u pacjentów, u których brakuje białka Nogo, bądź jest ono genetycznie defektywne, biologicznie nieaktywne, słabo aktywne lub nie ulegające wystarczającej ekspresji, bądź w (2) chorobach lub zaburzeniach, w których testy in vitro (lub in vivo) wskazują na użyteczność podawania agonistów Nogo. Brak lub zmniejszony poziom białka Nogo lub jego funkcji można łatwo wykrywać, np. poprzez otrzymanie próbki tkanki pacjenta (np. biopsji) oraz testowanie jej in vitro pod
PL 204 293 B1 kątem poziomów mRNA i białka, struktury i/lub aktywności ulegającego ekspresji RNA lub białka Nogo. Zastosować można szereg metod znanych fachowcom, w tym testy kinazy, immunotesty celem wykrycia i/lub wizualizacji białka Nogo (np. hybrydyzacja Western, immunoprecypitacja z elektroforezą SDS-PAGE, immunocytochemia, itd.), badź testy hybrydyzacji celem wykrycia ekspresji Nogo poprzez wykrywanie i/lub wizualizację mRNa dla Nogo (np. testy Northern, dot bloty, hybrydyzacja in situ itd.), itd.
Choroby i zaburzenia związane z deregulacją wzrostu komórkowego, które można leczyć, lub którym można zapobiegać, poprzez zastosowanie środka terapeutycznego, obejmują nieograniczająco choroby proliferacyjne, nowotwory złośliwe, nowotwory układu nerwowego, itp. Przykłady zostały podane poniżej.
5.8.1.1. Choroby nowotoworowe
Choroby nowotworowe i choroby pokrewne, które można leczyć lub którym można zapobiegać, poprzez podawanie środka promującego funkcję Nogo obejmują nieograniczająco te podane w Tabeli 1 (dla przeglądu takich chorób patrz Fishman i wsp., 1985, Medicine, 5 2d Ed., J.B. Lippincott Co.Philadelphia):
TABELA 1
Choroby nowotoworowe i choroby pokrewne guzy lite mięsaki i raki glejak, glioblastoma gwiaździak rdzeniak czaszkogardlak wyściółczak szyszyniak hemangioblastoma nerwiak nerwu słuchowego skąpodrzewiak oponiak nerwiak niedojrzały siatkówczak
W specyficznych wykonanich można leczyć, lub można im zapobiegać , zezłośliwienia lub zmiany dysproliferacyjne (takie jak metaplazje i dysplazje), choroby hiperproliferacyjne w ośrodkowym układzie nerwowym, rdzeniu kręgowym lub w jakichkolwiek tkankach nerwowych.
5.8.1.2. Stany poprzedzające zezłośliwienie
Terapeutyki tu opisane promujące aktywność Nogo mogą być również podawane celem leczenia stanów poprzedzających zezłośliwienie oraz celem zapobieżenia progresji do stanu nowotoworowego lub metapazji, w tym nieograniczająco chorób wymienionych w Tabeli 1. Takie zastosowanie profilaktyczne lub terapeutyczne jest wskazane w znanych stanach poprzedzających oczekiwane lub istniejące zezłośliwienie lub nowotoworzenie, w szczególności wówczas, gdy nie-nowotoworowy wzrost komórek przejawia się hiperplazją, metaplazją i w szczególności dyspalazją (celem przeglądu takich nieprawidłowych stanów wzrostowych patrz Robbins i Angell, 1976, Basic Pathology', 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79.) Hiperplazją jest formą kontrolowanej proliferacji komórkowej, której towarzyszy wzrost liczby komórek w tkance lub organie, bez znaczącej zmiany struktury lub funkcji. Metaplazją jest formą kontrolowanego wzrostu komórkowego, w której jeden typ dojrzałych i w pełni zróżnicowanych komórek jest zastępowany innym typem komórek dojrzałych. Metaplazją może występować w komórkach tkanki łącznej lub nabłonkowej. W atypowej metaplazji występuje nabłonek metaplastyczny z zaburzoną w pewnym stopniu strukturą. Dysplazja jest często zwiastunem nowotworu i występuje głównie w nabłonkach, i stanowi najbardziej zaburzoną formę wzrostu komórek nienowotoworowych, prowadzącą do utraty jednorodności poszczególnych komórek i architekturalnej orientacji komórek. Komórki dysplastyczne są nienormalnie duże, mają mocno wybarwione jądra i wykazują pleomorfizm. Dysplazja wystę puje w sposób charakterystyczny w miejscach przewlekł ego podrażnienia i stanu zapalnego.
Alternatywnie lub oprócz obecności nienormalnego wzrostu komórkowego charakteryzowanego jako hiperplazja, metaplazja, dysplazja, obecność jednej lub więcej cech transformowanego fenotypu lub fenotypu nowotoworowego występujących in vivo lub in vitro w próbce pacjenta może wskazywać na konieczność terapeutycznego/profilaktycznego podawania terapeutyku, który promuje funkcję Nogo. Jak wspomniano powyżej, takie cechy stransformowanego fenotypu obejmują zmiany morfologii,
PL 204 293 B1 utratę zależności od kotwiczenia, utratę hamowania kontaktowego, słabszą zależność od substratu, uwalnianie proteaz, zwiększony transport cukrów, zmniejszone zapotrzebowanie na surowicę, ekspresję antygenów płodowych, zanik białek powierzchniowych o wielkości 250,000 daltonów, itd. (patrz również id. str. 84-90 celem przeglądu charakterystycznych cech związanych z fenotypem stransformowanym lub zezłośliwionym).
W innych wykonaniach, pacjent wykazujący jeden lub więcej z następujących czynników predysponujących do zezłośliwienia może być leczony poprzez podawanie efektywnej ilości terapeutyku: nerwiakowłókniakowatość Von Recklinghausena lub siatkówczak; patrz Robbins and Angeli, 1976, Basic Pathology, 2 wyd., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113) itd.)
W kolejnym wykonaniu, terapeutyk tu opisany może być podawany pacjentowi-człowiekowi celem zapobiegania przerzutowaniu czerniaka, mięsaka i inych nowotworów do nerek, chrząstki (mostka), skóry, mięśni szkieletowych, płuc lub śledziony.
5.8.1.3. Choroby hiperproliferacyjne i dysproliferacyjne
Przykładowo środek terapeutyczny tu opisany promujący aktywność Nogo może być również podawany celem leczenia lub profilaktyki zaburzeń hipeproliferacyjnych lub dysproliferacyjnych. Specyficzne przykłady obejmują leczenie lub profilaktykę marskości wątroby (stan, w którym uszkodzenie przeważa nad procesem regeneracji), leczenie powstających blizn przerostowych (deformacja skóry, w której uszkodzenie intefereruje z normalną regeneracją), łuszczycy (stan skóry charakteryzujący się nadmiernym podziałem komórek skóry i opóźnieniem właściwego określenia śmierci komórki), nowotoworów łagodnych, torbieli i hipertofii tkanek (np. przerostu prostaty).
5.8.1.4. Terapia genowa
W specyficznym przykłdzie kwasy nukleinowe zawierające sekwencję kodującą białko Nogo lub jego funkcjonalną pochodną mogą być podawane celem wzmocnienia funkcji Nogo na drodze terapii genowej. Terapia genowa dotyczy terapii wykonywanej poprzez podawanie pacjentowi kwasu nukleinowego. W tym przykładzie kwas nukleinowy produkuje kodowane przez siebie białko, które wywiera efekt terapeutyczny poprzez wzmacnianie funkcji Nogo.
Zastosowana może być jakakolwiek z metod terapii genowej dostępna w dziedzinie. Przykładowe metody są opisane poniżej.
W celu przeglądu ogólnych opisów metod terapii genowej zobacz Goldspiel i wsp., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, 10, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; i Morgan i Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993. TIBTECH 11 (5): 155-215). Metody rekombinacji DNA powszechnie znane w dziedzinie są opisane w Ausubel i wsp. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; i Kriegler, 1990. Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
W preferowanym aspekcie, terapeutyk zawiera sekwencję kwasu nukleinowego stanowiącą część wektora ekspresyjnego produkującego białko Nogo w odpowiednim gospodarzu. W szczególności taki kwas nukleinowy posiada promotor operacyjnie połączony z regionem kodującym Nogo, przy czym ten promotor jest promotorem indukowalnym lub konstytutywnym oraz, opcjonalnie, tkankowo-specyficznym. W kolejnym specyficznym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca Nogo jest flankowana regionami sprzyjającymi rekombinacji homologicznej w określonym miejscu genomu, zapewniając tym samym intrachromosomalną ekspresję kwasu nukleinowego Nogo (Roller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijistra i wsp., 1989. Nature 342:435-438).
Dostarczenie kwasu nukleinowego pacjentowi może być bezpośrednie, kiedy to pacjent jest bezpośrednio poddany ekspozycji na kwas nukleinowy lub wektor niosący kwas nukleinowy, bądź pośrednio, kiedy to komórki są najpierw transformowane kwasem nukleinowym in vitro, a następnie przeszczepiane do pacjenta. Oba podejścia są znane jako odpowiednio terapia genowa in vivo lub ex vivo.
W specyficznym przykładzie kwas nukleinowy może być podawany bezpośrednio in vivo, gdzie ulega ekspresji celem produkcji kodowanego produktu. Może to zostać osiągnięte z użyciem jakiejkolwiek ze znanych w dziedzinie metod, np. poprzez konstrukcję odpowiedniego wektora ekspresyjnego i podawanie go w taki sposób, że staje się on wewnątrzkomórkowy, np. poprzez zakażanie defektywnym lub atenuowanym lub innym wektorem wirusowym (patrz Patent U.S. nr 4,980,286), lub poprzez bezpośrednie wstrzykiwanie nagiego DNA, albo poprzez zastosowanie bombardowania mikrocząsteczkami (np. strzelba genowa; Biolistic, Dupont), bądź pokrywanie lipidami lub receptorami powierzchniowymi lub czynnikami transfekującymi, enkpasulację w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach, bądź poprzez podawanie w połączeniu w peptydem, o którym wiadomo, że wchodzi
PL 204 293 B1 do jądra komórkowego lub podawanie go w połączeniu w ligandem do endocytozy zależnej od receptorów (patrz np. Wu and Wu. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4452) (które mogą być zastosowane do nakierowania na typy komórek specyficznie eksprymujące receptory) itp. W kolejnym wykonaniu może powstać kompleks kwas nukleinowy-ligand, w którym ligand obejmuje fuzogenny peptyd wirusowy zdolny do rozrywania endosomów, co umożliwia uniknięcie przez kwas nukleinowy degradacji w lizosomach. W jeszcze innym wykonaniu kwas nukleinowy może być kierowany in vivo do komórki celem specyficznego poboru i ekspresji, poprzez nakierowanie na specyficzny receptor (patrz np. publikacje PCT nr WO 92/06180 16 kwiecień 1992 (Wu i wsp); WO 92/22635 23 grudzień 1992 (Wilson i wsp.); WO 92/20316 26 listopad 1992 (Findeis i wsp.); WO 93/14188 22 lipiec 1993 (Clarke i wsp.), WO 93/20221 14 październik 1993 (Young)). Alternatywnie, kwas nukleinowy może być wprowadzany do wnętrza komórki i włączany do DNA komórki gospodarza celem ekspresji przy użyciu rekombinacji homologicznej (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijistra i wsp., 1989, Nature 342:435-438).
W specyficznym przykładzie zastosowany może być wektor wirusowy zawierający kwas nukleinowy Nogo. Przykładowo zastosowany może zostać wektor retrowirusowy (patrz Miller i wsp., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Te wektory retrowirusowe zostały zmodyfikowane celem usunięcia sekwencji retrowirusowych, które nie są niezbędne do pakowania genomu wirusowego oraz integracji do DNA komórki gospodarza. Kwas nukleinowy Nogo do stosowania w terapii genowej jest klonowany do wektora, który ułatwia dostarczenie genu pacjentowi. Więcej szczegółów na temat wektorów retrowirusowych można znaleźć w Boesen i wsp., 1994, Biotherapy 6:291-302, gdzie opisane jest zastosowanie wektora retrowirusowego do dostarczania genu mdrl do hematopoetycznych komórek macierzystych celem zwiększenia oporności komórek macierzystych na chemioterapię. Innymi odniesieniami ilustrującymi zastosowanie wektorów retrowirusowych w terapii genowej są: Clowes i wsp., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem i wsp., 1994. Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114.
Adenowirusy są innymi wektorami wirusowymi, które mogą zostać użyte w terapii genowej. Adenowirusy są szczególnie atrakcyjnymi nośnikami genów do ośrodkowego układu nerwowego. Adenowirusy w sposób naturalny zakażają nabłonek oddechowy gdzie powodują łagodną infekcję. Innymi celami systemów opartych na adenowirusach są: wątroba, nabłonek oddechowy, komórki śródbłonka i mięśnie. Adenowirusy mają przewagę w postaci zdolności do zakażania komórek niedzielących się. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 przedstawiają przegląd terapii genowej opartej na adenowirusach. Bout i wsp. 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 pokazali wektory adenowirusowe do transferu genów do nabłonka oddechowego małp rezus. Inne przykłady użycia adenowirusów w terapii można znaleźć w Rosenfeld i wsp, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld i wsp., 1992, Cell 68:143-155; and Mastrangeli i wsp, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.
Oprócz adenowirusów zaproponowano użycie w terapii genowej wirusa towarzyszącego adenowirusom: (AAV) (Walsh i wsp., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300.
Kolejne podejście w terapii genowej obejmuje transfer genów do komórek w hodowli tkankowej metodami takimi jak elektroporacja, lipofekcja, transfekcja przy użyciu fosforanu wapnia lub zakażenie wirusowe. Zazwyczaj, metoda transferu obejmuje transfer markera selekcyjnego do komórek. Komórki są następnie poddawane selekcji celem wyizolowania tych komórek, które pobrały i które eksprymują gen. Takie komórki są następnie podawane pacjentowi. W tym przykładzie kwas nukleinowy może być wprowadzany do komórki przed podaniem in vivo powstających komórek rekombinowanych. Tego rodzaju wprowadzenie może być wykonane jakąkolwiek metodą znaną w dziedzinie, taką jak np. transfekcja, elektroporacja, mikroiniekcja, zakażanie wektorem wirusowym lub bakteriofagowym zawierającym sekwencje kwasu nukleinowego, fuzja komórkowa, transfer genów zależny od chromosomów lub mikrokomórki, fuzje sferoplastów itd. Znanych jest w dziedzinie szereg technik do wprowadzania obcych genów do komórek (patrz np. Loeffler i Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen etal, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92), które mogą być zastosowane zgodnie z wynalazkiem, pod warunkiem, że niezbędne funkcje rozwojowe i fizjologiczne komórki-biorcy nie ulegają zniszczeniu. Technika ta umożliwia stabilny transfer kwasu nukleinowego do komórki przez co kwas nukleinowy może ulegać ekspresji przez tę komórkę i może być dogodnie dziedziczony i eksprymowany w komórkach potomnych.
PL 204 293 B1
Powstające komórki rekombinowane mogą być dostarczane pacjentowi różnymi technikami znanymi w dziedzinie. W preferowanym wykonaniu komórki nabłonkowe są wstrzykiwane np. podskórnie. W kolejnym wykonaniu rekombinowane komórki skóry mogą być podawane pacjentowi jako przeszczep skóry. Rekombinowane komórki krwi (np. hematopoetyczne komórki macierzyste lub progenitorowe) są dogodnie podawane dożylnie. Ilość stosownych komórek zależy od oczekiwanego efektu, stanu pacjenta, itp. i może być określona przez fachowca.
Komórki, do których ma być wprowadzony kwas nukleinowy celem terapii genowej obejmują jakiekolwiek pożądane typy komórek i obejmują nieograniczająco komórki nabłonkowe, keranocyty, fibroblasty, komórki mięśniowe, hapatocyty, komórki krwi takie jak limfocyty T i limfocyty B, monocyty, makrofagi, neutrofile, eozynofile, megakariocyty, granulocyty, różnego rodzaju komórki macierzyste lub progenitorowe, w szczególności komórki hematopoetyczne lub progenitorowe, np. otrzymane ze szpiku kostnego, krwi pępowinowej, krwi obwodowej, wątroby płodowej, itp.
W jednym z przykładów komórka stosowana do terapii genowej jest autologiczna w stosunku do pacjenta.
W przykładzie, w którym do terapii genowej stosowane są komórki rekombinowane kwas nukleinowy Nogo może być wprowadzany do komórek w taki sposób, że ulega ekspresji w komórkach i ich potomstwie, a komórki rekombinowane są następnie podawane in vivo celem uzyskania efektu terapeutycznego. W specyficznym wykonaniu zastosowane są komórki progenitorowe lub macierzyste. Jakiekolwiek komórki progenitorowe/macierzyste, które mogą być wyizolowane i utrzymywane in vitro mogą być potencjalnie zastosowane zgodnie z tym przykładem. Takie komórki macierzyste obejmują nieograniczająco neuronalne komórki macierzyste (Stemple i Anderson, 1992, Cell 71:973-985).
W kolejnym przykładzie kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony celem terapii genowej zawiera indukowalny promotor operacyjnie połączony z regionem kodującym w taki sposób, że ekspresja kwasu nukleinowego jest kontrolowana poprzez kontrolowanie obecności lub nieobecności odpowiedniego induktora transkrypcji.
Celem dostarczenia kwasów nukleinowych kodujących białko Nogo lub jego funkcjonalną pochodną można zaadaptować dodatkowe metody.
5.8.2. Leczenie i profilaktyka chorób, w których Nogo blokuje regenerację
Choroby oraz zaburzenia, w których wymagane jest wydłużanie neurytów, ich wzrost lub regeneracja mogą być leczone poprzez podawanie terapeutyku antagonizującego (hamującego) funkcję Nogo. Choroby, zaburzenia i uszkodzenia, które w sposób nieunikniony prowadzą do uszkodzenia układu nerwowego obejmują nieograniczająco: uraz ośrodkowego układu nerwowoego (OUN) (np. uszkodzenia mózgu lub rdzenia kręgowego), udar, zakażenie, nowotworzenie, ekspozycję na czynniki toksyczne, niedobory pokarmowe, zespoły paraneoplastyczne oraz choroby neurodegeneracyjne (w tym nieograniczająco choroby Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne oraz porażenie postępujące) poprzez podawanie związków, które interferują z aktywnością Nogo (tj. dominujące negatywne pochodne Nogo, przeciwciała Nogo, antysensowne kwasy nukleinowe kodujące Nogo; rybozymy Nogo lub grupy chemiczne wiążące się z miejscem aktywnym Nogo.
Terapeutyki, które mogą być stosowane obejmują nieograniczajaco antysensowne kwasy nukleinowe Nogo, dysfunkcjonalne kwasy nukleinowe Nogo (np. w skutek heterologicznej (nie-Nogo) insercji wewnątrz sekwencji kodującej Nogo), które są stosowane do knockoutu endogennej funkcji Nogo na drodze rekombinacji homologicznej np. Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Przeciwciała anty-Nogo (oraz ich fragmenty i pochodne zawierające region wiązania) mogą być stosowane jako antagoniści Nogo.
W jednym przykładzie kwas nukleinowy zawierający część genu Nogo, w którym sekwencje Nogo flankują (są zarówno po stronie 3' jak i 5') odmienną sekwencję genową, może być stosowany jako antagonista Nogo, który powoduje inaktywację na drodze rekombinacji homologicznej (patrz również Koller i Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijistra i wsp., 1989, Nature, 342:435-438). Inne terapeutyki, które hamują funkcję Nogo mogą zostać zidentyfikowane poprzez zastosowanie odpowiednich testów in vitro np. opartych na ich zdolności do hamowania wiązania Nogo z innym białkiem, lub hamowania jakiejkolwiek znanej funkcji Nogo dogodnie testowanej in vitro lub w hodowli komórkowej, chociaż zastosowane mogą zostać również testy genetyczne. Dogodnie, odpowiednie testy in vitro lub in vivo są stosowane celem określenia efektu specyficznego terapeutyku oraz określenia czy podanie go jest wskazane przy leczeniu dotkniętej schorzeniem tkanki.
PL 204 293 B1
Przykładowo terapeutyki hamujące funkcję Nogo mogą być podawane terapeutycznie (w tym profilaktycznie): w (1) chorobach i zaburzeniach, w których występuje zwiększony poziom (w stosunku do normalnego lub wymaganego) białka lub funkcji Nogo, np. u pacjentów z nadaktywnością lub nadekspresją Nogo; albo w (2) chorobach lub zaburzeniach, w których testy in vitro (lub in vivo) (zobacz powyżej) wskazują na użyteczność podawania antagonisty Nogo. Zwiększone poziomy białka Nogo lub jego funkcji można łatwo wykrywać poprzez, np. ocenę ilościową białka i/lub RNA, poprzez otrzymanie próbki tkanki pacjenta (np. biopsji) oraz testowanie jej in vitro pod kątem poziomów mRNA i białka, struktury i/lub aktywności eksprymowanego RNA lub białka Nogo. Zastosować można zatem szereg metod znanych w dziedzinie, w tym testy kinazy, immunotesty celem wykrycia i/lub wizualizacji białek Nogo (np. Western blot, immunoprecypitacja z elektroforezą SDS-PAGE, immunocytochemia, itd.) i/lub testy hybrydyzacji celem wykrycia expresji Nogo poprzez wykrywanie i/lub wizualizację mRNa dla Nogo (np. hybrydyzacja Northern, dot bloty, hybrydyzacja in situ itd.), itd.
5.8.2.1. Antysensowna regulacja ekspresji Nogo
W specyficznym wykonaniu funkcja Nogo jest hamowana poprzez zastosowanie antysensownych kwasów nukleinowych Nogo. Zgodnie z wynalazkiem opisano terapeutyczne lub profilaktyczne zastosowanie kwasów nukleinowych o co najmniej sześciu nukleotydach długości, które są antysensowne w stosunku do genu lub cDNA kodującego Nogo, bądź jego części. „Antysensowny kwas nukleinowy Nogo w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do kwasu nukleinowego zdolnego do hybrydyzacji z częścią RNA Nogo (zwłaszcza mRNA) na zasadzie komplementarności sekwencji. Antysensowny kwas nukleinowy może być komplementarny do regionów kodujących i/lub niekodujących z mRNa dla Nogo. Takie antysensowne kwasy nukleinowe mają zastosowanie jako terapeutyki, które hamują funkcję Nogo oraz mogą być zastosowane w leczeniu lub profilaktyce chorób opisanych powyżej.
Antysensowne kwasy nukleinowe tu opisane mogą być oligonukleotydami, które są dwuniciowe albo jednoniciowe, RNA albo DNA, albo ich modyfikacją lub pochodną, i które mogą być bezpośrednio podawane do komórki, albo które mogą być wytwarzane wewnątrzkomórkowo poprzez transkrypcję egzogennych, wprowadzonych sekwencji.
W specyficznym wykonaniu antysensowne kwasy nukleinowe Nogo tu opisane mogą być stosowane do promowania regeneracji neuronów ośrodkowego układu nerwowego w szczególności, w tym regeneracji drogi piramidowej przedniej, plastyczności podczas zdrowienia, ponownego wzrostu neuronów i gojenia uszkodzenia związanego z urazami, udarami i chorobami neurodegeneracyjnymi.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość antysensownych kwasów nukleinowych Nogo tu opisanych w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, jak opisano powyżej.
W innym wykonaniu wynalazek ukierunkowany jest na sposoby hamowania ekspresj i sekwencj i kwasu nukleinowego Nogo w komórce prokariotycznej lub eukariotycznej obejmujące dostarczanie komórce skutecznej ilości kompozycji zawierającej antysensowny kwas nukleinowy Nogo tu opisany.
Antysensowne kwasy nukleinowe Nogo i ich zastosowania opisano szczegółowo poniżej.
5.8.2.1.1. Antysensowne kwasy nukleinowe Nogo
Antysensowne kwasy nukleinowe Nogo składają się z co najmniej sześciu nukleotydów i stanowią dogodnie oligonukleotydy (w zakresie od 6 do 50 oligonukleotydów). W specyficznych aspektach oligonukleotyd ma co najmniej 10 nukleotydów, co najmniej 15 nukleotydów, co najmniej 100 nukleotydów, lub co najmniej 200 nukleotydów. Oligonukleotydy mogą stanowić DNA albo RNA, albo być ich mieszaninami chimerycznymi, albo ich pochodnymi lub wersjami zmodyfikowanymi, dwuniciowymi lub jednoniciowymi.
Oligonukleotyd może być zmodyfikowany na ugrupowaniu zasadowym, ugrupowaniu cukrowym albo w szkielecie fosforanowym. Oligonukleotyd może zawierać dołączone inne grupy, takie jak peptydy lub środki ułatwiające transport przez błony komórkowe (zobacz np. Letsiunger i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Letmaitre i wsp., 1987, Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 84: 648-652; publikację PCT o numerze WO 88/09810, opublikowaną 15 grudnia 1988) albo barierę krewmózg (zobacz np. publikację PCT o numerze WO 89/10134, opublikowaną 25 kwietnia, 1988), albo środki do cięcia zależne od hybrydyzacji (zobacz np. Krol i wsp., 1988, BioTechniques, 6: 958-976), albo środki interkalujące (zobacz np. Zon, 1988, Pharm. Res., 5: 539-549).
W preferowanym aspekcie opisano antysensowny oligonukleotyd Nogo, zwłaszcza jednoniciowy DNA. W najbardziej preferowanym aspekcie taki oligonukleotyd zawiera sekwencję antysensowną do sekwencji blisko jednej z dwóch sekwencji promotorów genu Nogo, albo sekwencji kodującej C-końcową część genu Nogo. Zalecene może być selektywne hamowanie ekspresji jednej z izoform
PL 204 293 B1
Nogo. Oligonukleotyd może być zmodyfikowany w dowolnej pozycji jego struktury podstawnikami ogólnie znanymi w dziedzinie.
Antysensowny oligonukleotyd Nogo może zawierać co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę zasady, która wybrana jest z grupy obejmującej nieograniczająco 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hipoksantynę, ksantynę, 4-acetylcytozynę, 5-karboksyhydroksylmetylouracyl, 5-karboksymetylaminometyl-2-liourydynę, 5-karboksymetylaminometyluracyl, dihydrouracylu, beta-D-galaktozylokeozynę, inozynę, N6-izopentenyloadeninę, 1-metyloguaninę, 1-metyloinozynę, 2,2-dimetyloguaninę, 2-metyloadeninę, 2-metyloguaninę, 3-metylocytozynę, 5-metylocytozynę, N6-adeninę, 7-metyloguaninę, 5-metyloaminometylouracyl, 5-metoksyamino-metylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozylokeozynę, 5'-metoksykarboksy-metylouracyl, 5-metioksyuracyl, 2-metylotio-N6-izopentenyloadeninę, kwas uracylo-5-oksyoctowy, butoksozynę, pseudouracyl, keozynę, 2-tiocytozynę, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tiouracyl, 4-tiouracyl, 5-metyluracyl, kwas uracylo-5-oksyoctanowy, ester metylowy kwasu uracylo-5-oksyoctowego (v), 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-carboksypropyl) uracyl, (acp3) w, i 2,6-diaminopurynę.
W kolejnym wykonaniu, oligonukleotyd zawiera co najmniej jedną zmodyfikowaną resztę cukrową wybraną z grupy obejmującej nieograniczajaco: arabinozę, 2-fluoroarabinozę, ksylulozę i heksozę.
W jeszcze innym wykonaniu oligonukleotyd zawiera co najmniej jeden zmodyfikowany szkielet fosforanowy wybrany z grupy obejmującej: tionofosforan, ditionofosforan, tionoamidofosforan, amidofosforany, diamidofosforany, metylofosfonian, triester fosforo-alkilowy, oraz formacetal lub jego analogi.
W jeszcze innym wykonaniu, oligonukleotyd jest a-anomerycznym oligonukleotydem. a-anomeryczny oligonukleotyd tworzy specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w którym, w przeciwieństwie do zwykłych β-jednostek, nici biegną równolegle w stosunku do siebie (Gautier i wsp., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).
Oligonukleotyd może być połączony z inną cząsteczką np. peptydem, czynnikiem sieciującym zależnym od hybrydyzacji, czynnikiem transportującym, czynnikiem indukującym cięcie zależnym od hybrydyzacji itp.
Oligonukleotydy tu opisane mogą być syntetyzowane standardowymi metodami znanymi w dziedzinie, np. poprzez zastosowanie automatycznego syntezatora DNA (takiego jak komercyjnie dostępne w Biosearch. Applied Biosystems, itd.). Przykładowo, oligonukleotydy tionofosforanowe mogą być syntetyzowane wg metody Stein i wsp. (1988, Nucl. Acids Res. 35 16:3209), oligonukleotydy metylofosfonianowe mogą być przygotowywane poprzez użycie nośników polimerowych o kontrolowanej wielkości porów (Sarin i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451). itd.
W specyficznym wykonaniu, antysensowny nukleotyd Nogo zawiera katalityczny RNA lub rybozym (patrz np. publikacja PCT o numerze WO 90/11364, 4 października 1990; Sarver i wsp., 1990, Science 247:1222-1225). W innym wykonaniu oligonukleotyd jest 2'-0-metylorybonukleotydem (Inoue i wsp., 987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), lub chimerycznym analogiem RNA-DNA (Inoue i wsp., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).
W alternatywnym wykonaniu antysensowny kwas nukleinowy Nogo według wynalazku jest produkowany wewnątrzkomórkowo dzięki transkrypcji z sekwencji egzogennej. Przykładowo, wektor może zostać wprowadzony in vivo w taki sposób, że jest pobierany przez komórkę, wewnątrz której ulega transkrypcji, tworząc opisany tu antysensowny kwas nukleinowy (RNA). Wektor taki może zawierać sekwencję kodującą antysensowny kwas nukleinowy Nogo. Wektor może pozostać episomalny lub integrować do genomu, pod warunkiem, że ulega transkrypcji z wytworzeniem pożądanego antysensownego RNA. Wektory takie mogą być konstruowane technikami rekombinacji RNA znanymi w dziedzinie. Wektory mogą być plazmidami, wirusami lub innymi znanymi w dziedzinie, stosowanymi do replikacji i ekspresji w komórkach ssaczych.
Ekspresja sekwencji kodujących antysensowne RNA Nogo może odbywać się dzięki jakiemukolwiek promotorowi znanemu w dziedzinie i działającemu w komórkach ssaczych, zwłaszcza ludzkich. Promotory takie mogą być indukowalne lub konstytutywne. Promotory takie obejmują nieograniczająco: wczesny promotor SV40 (Bernoist i Chambon. 1981, Nature 290:304-310), promotor zawarty w 3' długich końcowych powtórzeniach wirusa mięsaka Rousa (Yamamoto i wsp., 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej herpeswirusa (Wagner i wsp., 1981, Proc. Nati, Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), sekwencje regulatorowe z genu metalotioneiny (Brinster i wsp.; 1982, Nature 296:39-42), itd. Antysensowne kwasy nukleinowe według wynalazku obejmują sekwencję komplementarną w stosunku do co najmniej części transkryptu RNA genu Nogo, zwłaszcza ludzkiego genu Nogo. Jednakże, chociaż jest to zalecane, nie jest wymagana całkowita komplementarność. Sekwencja „komplementarna
PL 204 293 B1 do co najmniej części RNA w stosowanym tutaj znaczeniu oznacza sekwencję mającą wystarczającą komplementarność, aby hybrydyzować z RNA tworząc stabilny dupleks; w przypadku dwuniciowych antysensownych kwasów nukleinowych Nogo badana może być jedna nić z dupleksu DNA, bądź badane jest powstawanie tripleksu. Zdolność do hybrydyzacji będzie zależała zarówno od stopnia komplementarności, jak i długości antysensownego kwasu nukleinowego. Ogólnie, im dłuższy hybrydyzujący kwas nukleinowy, tym więcej niesparowanych z RNA Nogo zasad może zawierać i wciąż tworzyć stabilny dupleks (lub tripleks). Fachowiec może ocenić tolerowalny stopień niedopasowania poprzez zastosowanie standardowych procedur celem określenia punktu topnienia zhybrydyzowanego kompleksu.
5.8.2.1.2. Terapeutyczne zastosowanie antysensownych kwasów nukleinowych Nogo
Antysensowne kwasy nukleinowe Nogo mogą zostać zastosowane celem leczenia (lub profilaktyki) zaburzeń pewnych typów komórek, które eksprymują albo nadeksprymują Nogo. W specyficznym wykonaniu takim zaburzeniem jest proliferacyjne zaburzenie wzrostu. W preferowanym wykonaniu stosowany jest jednoniciowy antysensowny oligonukleotyd DNA Nogo.
Typy komórek z ekspresją lub nadekspresją RNA Nogo można zidentyfikować różnymi metodami znanymi w dziedzinie. Metody takie obejmują nieograniczajaco hybrydyzację z kwasem nukleinowym specyficznym dla Nogo (np. hybrydyzacja Northern, hybrydyzacja dot blot, hybrydyzacja in situ), obserwację zdolności RNA z danego typu komórki do translacji in vitro do Nogo, immunotesty, itd. W preferowanym aspekcie tkanki pierwotne z pacjenta mogą być badane pod kątem ekspresji Nogo przed leczeniem, np. poprzez immunocytochemię lub hybrydyzację in situ.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość antysensownego kwasu nukleinowego Nogo w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku, które mogą być podawane pacjentowi cierpiącemu na chorobę lub zaburzenie, w których dochodzi do ekspresji lub nadekspresji RNA lub białka Nogo.
Ilość antysensownego kwsu nukleinowego Nogo, który będzie efektywny w leczeniu określonego zaburzenia lub choroby lub stanu będzie zależała od charakteru choroby czy stanu i może być określona standardowymi technikami klinicznymi. Gdy jest to możliwe, zalecane jest określanie antysensownej cytotoksyczności typu nowotworowego, który ma być leczony in vitro, a następnie na dogodnych modelach zwierzęcych przed testowaniem i zastosowaniem u ludzi.
W specyficznym przykładzie kompozycje farmaceutyczne zawierające antysensowne kwasy nukleinowe Nogo są podawane w liposomach, mikrocząstkach lub mikrokapsułkach. W różnych wykonaniach użyteczne może być zastosowanie takich kompozycji celem osiągnięcia stałego uwalniania antysensownych kwasów nukleinowych Nogo. W specyficznym wykonaniu zalecane może być zastosowanie liposomów nakierowywanych przez przeciwciała do specyficznych identyfikowalnych antygenów nowotoworowych (Leonetti i wsp. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2448-2451; Renneisen i wsp., 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).
5.9. Wykazanie przydatności terapeutycznej lub prolilaktycznej
Terapeutyki tu ujawnione mogą być testowane in vitro, a następnie in vivo pod kątem wymaganej aktywności terapeutycznej lub profilaktycznej przed zastosowaniem u ludzi. Przykładowo, testy in vitro, które można zastosować do określania czy wskazane jest podanie specyficznego terapeutyku, obejmują testy na hodowlach komórkowych in vitro, w których tkanka pacjenta jest hodowana i w dowolny sposób poddawana działaniu terapeutyku, zaś wpływ terapeutyku na próbkę hodowli jest obserwowany. Przykładowo, terapeutyk stanowiący inhibitor funkcji Nogo może być testowany poprzez pomiar wzrostu neurytu lub odzyskanie kontroli motorycznej u pacjenta.
W różnych specyficznych przykładach testy in vitro mogą być przeprowadzane przy użyciu odpowiednich typów komórek zaangażowanych w zaburzenie u pacjenta, celem określenia czy terapeutyk ma pożądany wpływ na ten typ komórek.
Związki do zastosowania w terapii przed testowaniem na ludziach mogą być testowane na odpowiednich modelach zwierzęcych: szczurach, myszach, kurczakach, krowach, małpach, królikach, itd. Do testowania in vivo przed podawaniem ludziom zastosowany może być jakikolwiek model zwierzęcy znany w dziedzinie.
5.10 Podawanie terapeutyczne/profilaktyczne oraz kompozycje
Zgodnie z wynalazkiem opisano leczenie (i profilaktykę) poprzez podawanie pacjentowi efektywnej ilości terapeutyku tu opisanego. W preferowanym aspekcie terapeutyk jest zasadniczo oczyszczony. Podmiot jest w szczególności zwierzęciem, w tym zwierzęciem takim jak krowa, świnia, koń,
PL 204 293 B1 kurczę, kot, pies itd., zwłaszcza ssakiem, a w szczególności człowiekiem. W specyficznym wykonaniu podmiotem jest ssak nie będący człowiekiem.
Preparaty i sposoby podawania, które mogą być zastosowane w przypadku gdy terapeutyk zawiera kwas nukleinowy opisano powyżej, zaś dodatkowe odpowiednie preparaty i drogi podawania mogą zostać wybrane z tych opisanych poniżej.
Znanych jest szereg układów dostarczania, które można zastosować do podawania terapeutyku tu opisanego, np. enkapsulacja w liposomach, mikrocząstkach, mikrokapsułkach, komórkach rekombinowanych zdolnych do ekspresji terapeutyku, zależna od receptora endocytoza (patrz np. Wu and Wu. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), konstrukcja terapeutycznego kwasu nukleinowego jako części retrowirusa lub innego wektora, itp. Sposoby wprowadzania obejmują nieograniczająco drogę domięśniową, śródskórną, dootrzewnową, dożylną, podskórną, donosową, dooponową oraz doustną. Związki mogą być podawane jakąkolwiek wygodną metodą, przykładowo poprzez wlew lub w jednej dużej dawce, na drodze adsorpcji przez wyściółki nabłonkowe lub śluzowe (np. błona śluzowa jamy ustnej, śluzówka jelita i odbytu, itp.) oraz mogą być podawane razem z innymi czynnikami biologicznie aktywnymi. Podawanie może mieć charakter układowy lub miejscowy. Dodatkowo, zalecane może być wprowadzanie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych do ośrodkowego układu nerwowego jakąkolwiek stosowną drogą, w tym poprzez wstrzyknięcie dokomorowe i dooponowe; wstrzyknięcie dokomorowe może być ułatwione dzięki zastosowaniu cewnika dokomorowego, przykładowo połączonego ze zbiornikiem, takim jak zbiornik Ommaya. Zastosowane może zostać również podawanie dopłucne, np. poprzez inhalator lub nebulizator oraz preparowanie z czynnikiem tworzącym aerozol.
Przykładowo zalecane może być podawanie kompozycji farmaceutycznych tu opisanych miejscowo w miejscu wymagającym leczenia; można to osiągnąć nie ograniczająco a przykładowo poprzez miejscowy wlew podczas zabiegu operacyjnego, zastosowanie miejscowe, np. w połączeniu z opatrunkiem pooperacyjnym, poprzez wstrzyknię cie za pomocą cewnika, implantu, przy czym wspomniany implant jest materiałem porowatym, nieporowatym lub żelatynowym, w tym błoną taką jak błony silastikowe bądź włókna. W jednym z zastosowań podawanie może odbywać się poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do miejsca (lub poprzedniego miejsca) występowania nowotworu złośliwego lub tkanki notoworowej, bądź przednowotoworowej.
Ponadto przykładowo terapeutyk może być podawany w nośniku, w szczególności w liposomie (patrz Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat i wsp., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); LopezBerestein, ibid., pp. 317-327; patrz ibid.)
W jeszcze innym przykładzie terapeutyk może być podawany przez układ kontrolowanego uwalniania. W jednym ze specyficznych przykładów zastosowana może być pompa (Langer, poniżej, Scfton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald i wsp. Surgery 88:507 (1980); Saudck i wsp. N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)), w innym zaś materiał polimeryczny (patrz Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (wyd.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); patrz również Levy i wsp. Science 228:190 (1985); During i wsp., Ann. NeuroL 25:351 (1989); Howard i wsp., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). W jeszcze innym zastosowaniu układ do kontrolowalnego uwalniania może zostać umieszczony w pobliżu celu terapeutycznego, tj. mózgu, wymagając tym samym jedynie części dawki układowej (patrz, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, poniżej, vol. 2, str. 115-138(1984)).
Inne układy do kontrolowanego uwalniania są opisane w Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
W specyficznym przykładzie terapeutyk może być kwasem nukleinowym kodującym białko terapeutyczne, zaś kwas nukleinowy może być podawany in vivo celem promowania ekspresji kodowanego przez niego białka, poprzez konstrukcję odpowiedniego wektora ekspresyjnego dla kwasów nukleinowych i podawanie tak, aby znalazł się on wewnątrz komórki, np. poprzez zastosowanie wektora retrowirusowego (patrz Patent U.S. nr 4,980,286), bądź bezpośrednie wstrzyknięcie lub zastosowanie bombardowania mikrocząsteczkami (np. strzelbą genową), lub pokrywanie lipidami lub receptorami powierzchniowymi lub czynnikami transfekcyjnymi, bądź poprzez podawanie w połączeniu z peptydem typu homebox, który jak wiadomo wchodzi do jądra (patrz np. Joliot i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), itd.
Alternatywnie terapeutyk w postaci kwasu nukleinowego może być wprowadzany do wnętrza komórek oraz włączany do DNA gospodarza celem ekspresji, na drodze homologicznej rekombinacji.
PL 204 293 B1
Zgodnie z wynalazkiem ujawniono również kompozycje farmaceutyczne, które zawierają terapeutycznie efektywną dawkę terapeutyku oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik. Termin farmaceutycznie akceptowalny oznacza zaakceptowany przez organ regulacyjny rządowy lub stanowy lub znajdujący się w farmakopei U.S. lub w innych powszechnie uznawanych farmakopeach do zastosowania u zwierząt, a zwłaszcza u człowieka. Termin „nośnik odnosi się do rozcieńczalnika, adiuwanta, zaróbki lub podłoża, z którym podawany jest terapeutyk. Takimi farmaceutycznymi nośnikami mogą być sterylne ciecze, takie jak woda i oleje, w tym te pochodzące z ropy, zwierząt lub roślin, jak na przykład olej z orzeszków ziemnych, olej sojowy, olej mineralny, olej sezamowy i inne. Woda jest preferowanym nośnikiem jeśli kompozycja farmaceutyczna podawana jest dożylnie. Roztwory soli fizjologicznej oraz roztwory wodne dekstrozy i glicerolu mogą być również zastosowane jako nośniki płynne, zwłaszcza do wstrzyknięć. Odpowiednie zarobki farmaceutyczne obejmują skrobię, glukozę, laktozę, sacharozę, żelatynę, słód, ryż, mąkę, talk, żel krzemionkowy, stearynian sodu, monostearynian glicerolu, kredę, chlorek sodu, odtłuszczone sproszkowane mleko, glicerol, propylen, glikol, wodę, etanol i inne. Kompozycja może w razie potrzeby zawierać niewielkie ilości czynników zwilżających lub emulgujących, bądź czynników buforujących pH. Kompozycje te mogą przyjmować postać roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów o powolnym uwalnianiu i innych. Preparat doustny może zawierać standardowe nośniki, takie jak farmaceutycznej jakości mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sacharynian sodu, celuloza, węglan magnezu itp. Przykłady odpowiednich nośników są opisane w Remington's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin. Kompozycje takie będą zawierały terapeutycznie efektywną ilość terapeutyku, dogodnie w postaci oczyszczonej, wraz z odpowiednią ilością nośnika, celem zapewnienia odpowiedniego podawania pacjentowi. Preparat powinien odpowiadać sposobowi podawania.
Kompozycje mogą być preparowane zgodnie z rutynowymi procedurami jako kompozycje farmaceutyczne do podawania dożylnego ludziom. Zazwyczaj kompozycje do podawania dożylnego są roztworami w sterylnym izotonicznym buforze wodnym. Jeśli zachodzi potrzeba, kompozycja może również zawierać środek rozpuszczający oraz środek miejscowo-znieczulający, taki jak lignokaina celem zmniejszenia bólu w miejscu wstrzyknięcia. Ogólnie, składniki są dostarczane albo oddzielnie albo zmieszane w postaci jednostkowego dawkowania, przykładowo, jako liofilizowany proszek lub pozbawiony wody koncentrat w hermetycznie zamkniętym pojemniku takim jak saszetka lub ampułka, ze wskazaną ilością czynnika aktywnego. Jeśli kompozycja ma być podawana przez wlew, to może być ona podawana poprzez butelkę do wlewów zawierającą sterylną wodę o jakości farmaceutycznej lub fizjologiczny roztwór soli. Jeśli kompozycja ma być podawana poprzez wstrzyknięcie można ją dostarczyć w ampułce ze sterylną wodą do wstrzyknięć lub fizjologicznym roztworze soli w taki sposób, że składniki mogą zostać zmieszane tuż przed podaniem.
Terapeutyk tu opisany może przyjmować postać obojętną bądź postać soli. Farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują sole utworzone z wolnymi grupami aminowymi, takimi jak te pochodzące z kwasu solnego, fosforowego, octowego, winowego, szczawiowego itp. oraz te utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi, takimie jak te pochodzące z wodorotlenku sodu, potasu, amonu, wapnia, żelaza, izopropyloaminy, trietyloaminy, 2-etanoloaminy, etanolu, histydyny, prokainy itp.
Ilość terapeutyku, która będzie efektywna w leczeniu określonego zaburzenia, choroby lub stanu będzie zależała od natury zaburzenia lub choroby i może być określona zgodnie ze standardowymi procedurami klinicznymi. Ponadto do określenia optymalnych zakresów dawkowania można ewentualnie zastosować testy in vitro. Precyzyjna dawka, która ma być zastosowana w preparacie będzie także zależała od drogi podawania i ciężkości choroby lub zaburzenia i powinna być określona zgodnie z oceną lekarza prowadzącego i stanu poszczególnego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawkowania do podawania dożylnego wynoszą ogólnie 20-500 mikrogramów czynnika aktywnego na kilogram masy ciała. Odpowiednie zakresy dawkowania do podawania donosowego wynoszą ogólnie 0,01 pg/kg masy ciała do 1 mg/kg. Efektywne dawki mogą zostać określone z krzywych odpowiedźdawka pochodzących z układów testowych in vitro lub zwierzęcych modeli testowych.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także zestaw lub pakiet farmaceutyczny zawierający jeden lub więcej pojemników wypełnionych jednym lub więcej ze składników kompozycji farmaceutycznej tu opisanej. Opcjonalnie do takiego pojemnika (pojemników) dołączona może być informacja w postaci określonej przez rządowy organ regulujący wytwarzanie, sprzedaż i stosowanie farmaceutyków lub produktów biologicznych, która to informacja odzwierciedla zgodę organu na wytwarzanie sprzedaż i zastosowanie go u ludzi.
PL 204 293 B1
5.11. Diagnoza i przeszukiwanie
Białka Nogo, jego analogi, pochodne i ich podsekwencje, kwasy nukleinowe Nogo (oraz komplementarne do nich sekwencje), przeciwciała anty-Nogo znajdują zastosowanie w diagnostyce. Cząsteczki takie mogą być używane w testach takich jak immunotesty, celem wykrycia, prognozowania lub monitorowania różnych stanów, chorób i zaburzeń wpływających na ekspresję Nogo lub do monitorowania ich leczenia. W szczególności immunotest taki jest przeprowadzany sposobem obejmującym kontaktowanie próbki otrzymanej od pacjenta z przeciwciałem anty-Nogo w takich warunkach, że może dojść do immunospecyficznego wiązania oraz wykrywania lub pomiaru ilości immunospecyficznie związanego przeciwciała. W specyficznym aspekcie takie wiązanie przeciwciała, w skrawkach tkankowych może zostać użyte do wykrywania niewłaściwej lokalizacji Nogo lub niewłaściwych (tzn. niskich lub nie występujących) poziomów Nogo. W specyficznym wykonaniu przeciwciało anty-Nogo może być zastosowane celem zbadania tkanki pacjenta lub próbki surowicy na obecność Nogo, przy czym niewłaściwy poziom Nogo jest wskaźnikiem stanu chorobowego. Przez „niewłaściwy poziom należy rozumieć zmniejszony lub zwiększony poziom w odniesieniu do istniejącego lub standardowego poziomu w analogicznej próbce z części ciała pacjenta nie wykazującej zaburzenia.
Immunotesty, które można zastosować obejmują nieograniczająco testy kompetycyjne i niekompetycyjne wykorzystujące techniki typu immunhistochemia, patologia, hybrydyzację Western, ELISA, testy radioimmunologiczne, test typu sandwich, testy immunoprecypitacji, reakcje precypitacji, reakcje precypitacji i dyfuzji w żelu, testy aglutynacji, testy hemaglutynacji, testy radiometryczne, testy wiązania dopełniacza, testy immunofluorescencyjne, immunotesty białka A, testy immunohistochemiczne, żeby wymienić tylko kilka.
Geny Nogo oraz pokrewne sekwencje i podsekwencje kwasów nukleinowych, w tym sekwencje komplementarne, mogą również być użyte w testach hybrydyzacji. Sekwencje kwasów nukleinowych Nogo lub ich subsekwencje zawierające co najmniej 8 nukleotydów, mogą zostać użyte jako sondy hybrydyzacyjne. Testy hybrydyzacji mogą być użyte celem wykrywania, prognozowania, diagnozowania lub monitorowania stanów, chorób, zaburzeń związanych z niewłaściwymi zmianami ekspresji Nogo i/lub aktywności jak opisano powyżej. W szczególności, takie testy hybrydyzacji są przeprowadzane z użyciem metody polegającej na kontaktowaniu próbki zawierającej kwas nukleinowy z sondą kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzacji z DNA lub RNA Nogo, w warunkach, w których zachodzi hybrydyzacja oraz wykrywaniu lub mierzeniu powstającej hybrydyzacji.
W specyficznych przykładach choroby i zaburzenia z zaburzeniem wzrostu i rozwoju komórek mogą być diagnozowane, lub ich podejrzewane występowanie potwierdzane, poprzez wykrywanie zmniejszonych poziomów białka Nogo, RNA Nogo lub funkcjonalnej aktywności Nogo, wykazanej przez hamowanie wzrostu lub poprzez wykrywanie mutacji w RNA, DNA lub białku Nogo (np. translokacje w kwasach nukleinowych Nogo, skrócenia genu lub białka Nogo, zmiany w sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej względem Nogo dzikiego typu), które prowadzą do zmniejszonej ekspresji lub aktywności Nogo. Choroby takie i zaburzenia obejmują nieograniczająco te opisane w rozdziale 3 i rozdziale 5.8.1.1. Przykładowo, poziomy białka Nogo mogą być wykrywane poprzez immunotesty, poziomy RNA dla Nogo mogą być wykrywane testami hybrydyzacyjnymi (np. hybrydyzacje Northern, dot bioty), zaś wiązanie Nogo z komórkowymi receptorami białek hamujących wzrost może być mierzone testami wiązania powszechnie znanymi w dziedzinie, translokacje i mutacje punktowe w kwasach nukleinowych Nogo mogą być wykrywane poprzez hybrydyzację Southern, analizę RFLP, PCR z użyciem starterów dogodnie generujących fragment obejmujący co najmniej większość całego genu Nogo, sekwencjonowanie genomowego DNA Nogo lub cDNA otrzymanego od pacjentów, itp.
Opisano również zestawy do zastosowania diagnostycznego, zawierające jeden lub więcej pojemników z przeciwciałem anty-Nogo i opcjonalnie, znakowany ligand przeciwciała. Alternatywnie, przeciwciało anty-Nogo może być znakowane (wykrywalnym markerem, np. grupą chemiluminescencyjną, enzymatyczną, fluorescencyjną lub radioaktywną). Opisano również zestaw zawierający jeden lub więcej pojemników zawierających sondę kwasu nukleinowego zdolną do hybrydyzacji z RNA Nogo. W specyficznym wykonaniu zestaw może zawierać jeden lub więcej pojemników z parą starterów (np. każdy o wielkości w zakresie 6-30 nukleotydów), które można wykorzystać do amplifikacji (np. poprzez łańcuchową reakcję polimerazy (patrz np. Innis i wsp., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), łańcuchową reakcję ligazy, (patrz EP 320,308) zastosowanie replikazy QP, lub innych metod znanych w dziedzinie w warunkach odpowiednich dla co najmniej części kwasu nukleinowego Nogo. Zestaw może ponadto zawierać w pojemniku określoną ilość oczyszczonego białka lub kwasu nukleinowego Nogo, tj. w przypadku zastosowania jako standard albo kontrola.
PL 204 293 B1
5.12. Przeszukiwanie pod kątem agonistów i antagonistów Nogo.
Kwasy nukleinowe, białka, i pochodne Nogo znajdują również zastosowanie w testach przeszukiwania (skrining) celem wykrywania cząsteczek specyficznie wiążących się z kwasami nukleinowymi, białkami lub pochodnymi Nogo i przez to potencjalnie znajdować zastosowanie jako agoniści lub antagoniści Nogo, w szczególności, cząsteczki, które mogą wpływać na regulację wzrostu komórkowego. W szczególnym wykonaniu, tego typu testy są wykonywane celem wyszukania cząsteczek o potencjalnej użyteczności w roli promotorów wzrostu neuronów celem opracowania leków. Zgodnie z wynalazkiem opisano zatem testy do wykrywania cząsteczek, które specyficznie wiążą się z kwasami nukleinowymi, białkami lub pochodnymi Nogo. Przykładowo, rekombinowane komórki z ekspresją kwasów nukleinowych Nogo mogą zostać użyte w tych testach do rekombinowanej produkcji białek Nogo, celem przeszukiwania pod kątem cząsteczek wiążących się z Nogo. Cząsteczki (np. przypuszczalne ligandy Nogo) są kontaktowane z białkiem Nogo (lub jego fragmentem) w warunkach sprzyjających wiązaniu, a następnie cząsteczki specyficznie wiążące białko Nogo są identyfikowane. Podobne sposoby można wykorzystać do wyszukiwania cząsteczek wiążących się z pochodnymi lub kwasami nukleinowymi Nogo. Metody, które można zastosować w tym celu są powszechnie znane w dziedzinie.
Przykładowo, biblioteki takie jak biblioteki losowych lub kombinatorycznych peptydów mogą być przeszukiwane celem wykrycia cząsteczek specyficznie wiążących się z Nogo. W dziedzinie znanych jest wiele bibliotek, które mogą być tutaj zastosowane, np.: biblioteki zsyntezyzowane chemicznie, biblioteki rekombinowane (np. prezentacji na fagu) oraz biblioteki oparte na translacji in vitro.
Przykłady chemicznie syntetyzowanych bibliotek są opisane w Fodor i wsp., 1991, Science 251:767-773; Houghten i wsp.. 1991, Nature 354:84-86; Lam i wsp., 1991, Nature 354:82-84; Medyński, 1994, Biotechnology 12:709-710; Gallop i wsp, 1994, J. Medicinal Chemistry 37 (9):1233-1251; Ohimeyer i wsp., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb i wsp., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten i wsp., 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickreme i wsp., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon i wsp., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; publikacja PCT 10 nr WO 93/20242; i Brenner and Lemer, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383.
Przykłady bibliotek prezentacji na fagach są opisane w Scott i Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin i wsp., 1990, Science, 249:404-406; Christian, R.B., i wsp.. 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol Meth. 152:149-157; Kay i wsp., 1993, Gene 128:59-65; i publikacja PCT nr WO 94/18318 18 sierpnia 1994.
Biblioteki oparte na translacji in vitro obejmują nieograniczająco te opisane w publikacji PCT o numerze WO 91/05058 18 kwietnia 1991; i Mattheakis i wsp., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.
Przykładowo jako biblioteka niepetydowa zaadaptowana może być biblioteka benzodiazepinowa (patrz np. Bunin i wsp., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712). Zastosowane mogą zostać również biblioteki peptoidowe (Simon i wsp., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371). Kolejnym przykładem biblioteki może być biblioteka, w której amidowe grupy funkcyjne peptydów zostały permetylowane celem wytworzenia chemicznie transformowanych kombinatorycznych bibliotek, co opisano w Ostresh i wsp. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).
Przeszukiwanie bibliotek może odbywać sią jakąkolwiek z powszechnie znanych metod. Patrz następujące odniesienia, które dotyczą przeszukiwania bibliotek peptydowych: Pannley and Smith, 1989. Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes i wsp. 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg i wsp., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu i wsp., 1994, Cell 76:933-945; Staudt i wsp., 1988. Science 241:577-580; Bock i wsp, 1992, Nature 355:564-566; Tuerk i wsp. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington i wsp. 1992, Nature 355:850-852; Patent U.S. nr 5,096,815, Patent U.S. nr 5,223,409, i Patent U.S. nr 5,198,346, Ladner i wsp.; Rebar i Pabo, 1993, Science 263:671-673; i publikacja PCT o numerze WO 94/18318.
Przykładowo przeszukiwanie może być wykonywane poprzez kontaktowanie elementów biblioteki z białkiem Nogo (lub kwasem nukleinowym lub jego pochodną) unieruchomionym na stałym nośniku oraz zebraniu tych elementów biblioteki, które wiążą się z białkiem (lub kwasem nukleinowym lub pochodną). Przykłady takich technik przeszukiwania, określone jako techniki panningu, są opisane przykładowo w Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes i wsp., 1992, BioTechniques 13:422-427; publikacja PCT o numerze WO 94/18318; oraz zacytowanych powyżej odniesieniach.
PL 204 293 B1
W innym przykładzie do selekcji oddziałujących białek zastosować można drożdżowy układ dwu-hybrydowy celem identyfikacji cząsteczek specyficznie wiążących się z białkiem Nogo lub jego pochodną. (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; Chien i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582).
5.13. Modele zwierzęce
Zgodnie z wynalazkiem opisano również modele zwierzęce obejmujące nieograniczajaco modele myszy, chomików, owiec, świń, bydła a zwłaszcza ssaków nie będących ludźmi.
Przykładowo opisano modele zwierzęce dla chorób i zaburzeń związanych z wydłużaniem, wzrostem i regeneracją neurytów. Zwierzę takie może zostać początkowo wyprodukowane poprzez promowanie rekombinacji homologicznej pomiędzy genem Nogo na chromosomie a egzogennym genem Nogo, który uczyniono biologicznie nieaktywnym (zwłaszcza na skutek insercji sekwencji heterologicznej, np. genu oporności na antybiotyk). W preferowanym aspekcie rekombinacja homologiczna zachodzi poprzez transformację embrionalnych komórek macierzystych (ES) wektorem zawierającym insercyjnie zinaktywowany gen Nogo, w taki sposób, że dochodzi do rekombinacji homologicznej, a następnie wstrzyknięcie komórek ES do blastocysty. Następnie blastocysta jest wszczepiana do matki, rowija się i rodzi się zwierzę chimeryczne (knockout), w którym gen Nogo jest inaktywowany (patrz Capccchi, 1989, Science 244:1288-1292). Zwierzę chimeryczne może być rozmnażane celem produkcji kolejnych zwierząt „knockout. Tymi zwierzętami mogą być myszy, chomiki, owce, świnie, bydło, itd., a zwłaszcza ssaki nie będące człowiekiem. W specyficznym wykonaniu wytwarzania jest mysz knock-out.
Oczekuje się, że u tego rodzaju zwierząt powstają choroby i zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego, lub występuje u nich predyspozycja do tego rodzaju chorób lub zaburzeń, a zatem mogą one znaleźć zastosowanie jako modele zwierzęce tych chorób i zaburzeń, np. w celu poszukiwania lub testowania cząsteczek (np. potencjalnych czynników terapeutycznych w zaburzeniach układu nerwowego) mających zdolność do hamowania nowotworów tkanki nerwowej i leczenia i profilaktyki takich chorób lub zaburzeń.
6. Przykład: Charakteryzacja produktu nukleotydowego oraz białkowego genu Nogo.
Opisane tutaj przykłady wykazują, że sklonowany gen Nogo, koduje białko będące silnym inhibitorem wzrostu neuronów i jest także rozpoznawane przez przeciwciała monoklonalne opisane w Schwab i wsp., U.S; Patent U.S. Nr 5,684,133.
6.1. Materiały i metody
Następujące rozdziały opisują materiały i metody użyte w niniejszym wynalazku. Fachowiec rozpozna, że te materiały i metody jedynie ilustrują niniejszy wynalazek, a modyfikacje są przewidywane przez Zgłaszającego.
6.1.1. Oczyszczanie bydlęcego Nogo z mieliny
Wszystkie etapy oczyszczania były przeprowadzane w 4°C zaś aktywność hamującą substratu rutynowo określano poprzez testy wzrostu NIH 3T3 i wzrostu neurytów PC12. (Rozdział 6.1.10). Tkanka bydlęcego rdzenia kręgowego starannie oczyszczano poprzez zdjęcie opon i krojenie na drobne kawałki. Następnie mielinę ekstrahowano w buforze do ekstrakcji (60 mM CHAPS; 100 mM Tris-HCl; pH 8,0; 10 mM EDTA; pH 8,0; 2,5 mM jodoacetamid, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu; 0,1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny, 1 g/ml peptstatyny A).
Celem otrzymania ekstraktów z rdzenia kręgowego tkankę bezpośrednio homogenizowano w buforze ekstrakcyjnym CHAPS w stosunku (1:1; w:v). Homogenat dwukrotnie wirowano przy 100,000 X g (Kontron: K50.13, stały kąt) przez 1 godz. w 4°C. Czysty supernatant (ekstrakt) natychmiast nakładano na kolumnę z Q-Sefarozą (2,6 X 11,5 cm), równoważoną buforem A (20 mM Tris-HCl; pH 8,0; 0,5% (w/v) CHAPS). Związane białka eluowano pięcioma objętościami liniowego gradientu 0 do 1 M NaCl w buforze A (100 ml gradientu przez 50 minut). Frakcje aktywne zawierające bydlęcy NI220 eluowano 0,4 M NaCl i pulowano (q-pool 1) celem nałożenia następnie na kolumnę z Superdex 200 (2,6 X 60 cm), zrównoważoną buforem B (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl; pH 8,0; 0,5% (w/v) CHAPS).
Frakcje aktywne, po filtracji w żelu (s-pool 1), rozdzielano na 6% SDS-PAGE w warunkach redukujących i stałym, niskim prądzie (2 waty/żel) na całkowite 2500 Volto-godzin. Prążki na żelu zidentyfikowano po barwieniu Coomassie Blue (0,1% w/v -R250 w 50% metanolu i 10% kwasie octowym, wycięto oraz ekstrahowano w 800 μl buforu (0,5% (w/v) CHAPS; 20 mM Tris-HCl; pH 8,0; 10 mM EDTA; pH 8,0; 2,5 mM jodoacetamid, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu; 0,1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml peptstatyny przez co najmniej 48 godzin w 4°C.
PL 204 293 B1
6.1.2. Mikrosekwencjonowanie oczyszczonego Nogo
Aktywny wyeluowany z żelu materiał podlegający neutralizaji IN-1 ponownie rozdzielano na żelu 10% SDS-PAGE w warunkach redukujących i znakowano 0,1% (w/v) Coomassie Blue R250 w 50% metanolu i 10% kwasie octowym. Prążek 220 KDa wycięto i bezpośrednio na żelu poddano trawieniu endoproteinazą Lys-C (stosunek molarny 1:50). Próbkę zakwaszano i nakładano na kolumnę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą, peptydy rozdzielano w gradiencie liniowym (0-100%) 0,04% kwasu trójfluorooctowego oraz 80% acetonitrylu, zaś frakcje zawierające pojedyncze rodzaje peptydów poddawano automatycznej degradacji Edmana.
6.1.3. Elektroforeza oczyszczonego Nogo
SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości wykonywano przy użyciu 6% (w/v) żeli poliakrylamidowych SDS-PAGE (10 X 24 X 0,01 cm) w warunkach redukujących (100 mM ditiotreitol). Transfer na błony Immobilon-P (Millipore) przeprowadzano w 20 mM zasadzie Tris; 192 mM glicynie; pH 8,3; 0,037% (w/v) SDS; 20% metanolu w aparacie do pół-suchego blottingu (Bio-Rad Trans Biot SD). Czas transferu wynosił 2 godz. przy 0,8 mA/cm2. Czynnikiem blokującym (1 godz. w RT) była 3% żelatyna w PBS (fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem; pH 7,2; 8 g NaCl; 0,2 g KH2PO4; 2,8 g Na2HPO4 x 12H2O i 0,2 g KCl, rozpuszczone w 1 litrze wody), zaś roztwór do płukania zawierał 20 mM Tris-HCl; pH 7,5; 150 mM NaCl oraz 0,4% Tween (3 X 10 minut w temperaturze pokojowej (RT)) Czas inkubacji dla pierwszego przeciwciała (dla rozcieńczenia w 1% żelatynie w PBS) wynosił zazwyczaj 1 noc w 4°C. Drugorzędowe przeciwciało będące koniugatem peroksydazy chrzanowej z przeciwciałem przeciwko mysiej IgG (1:2000) inkubowano przez 1 godzinę w RT. Do detekcji stosowano system chemiluminescencyjny ECL (Amersham Phannacia Biotech).
6.1.4. Sondowanie biblioteki cDNA
Świeżo wyizolowaną istotę białą z bydlęcego rdzenia kręgowego stosowano do ekstrakcji poły(A)+ RNA przy użyciu zestawu FastTrack kit (Invitrogen). Konstrukcję bibliotek cDNA przeprowadzono przy użyciu zestawu Uni-ZAP kit (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producenta. Złożoność bibliotek była większa niż 4 x 106 PFU a przeciętna wielkość insertów wynosiła około 1,8 kilobaz.
Zdegenerowane olionukleotydy MSC5-8 (MSC5:
TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID NO:47); MSC6:
TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO:48); MSC7:
TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (:SEQ ID NO:49); MSC8:
TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:50)) zaprojektowano na podstawie sekwencji peptydu 1 bNI220 a MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID NO:51)) zaprojektowano z sekwencji peptydu 2 bNI220. Oligonukleotydy były syntetyzowane przez MWG Biotech (Munchenstein, Switzerland) i znakowane z użyciem zestawu DIG DNA 3'-end labeling kit. Sondy kwasu rybonukleinowego syntetyzowano z użyciem zestawu DIG RNA labeling kit (Boehringer Mannheim).
Warunki hybrydyzacji i płukania były takie jak opisał producent (MSC5-8 i MSC9 były używane do hybrydyzacji i płukania w temperaturze 57°C). Wykrywanie sondy zachodziło przy użyciu systemu CDP-star system (Boehringer Mannheim). Obróbkę biblioteki CDNA i przeszukiwanie przeprowadzano zgodnie z protokołami dla bibliotek lambda ZAP cDNA (Stratagene). Do przenoszenia łysinek zastosowano membrany nylonowe Gencscreen (DuPont).
6.1.5. Sekwencjonowanie DNA
Obie nici CWP1-3, Oli18, Oli3, oraz R1-3U21 sekwencjonowano z użyciem systemu Perkin Elmer AB 1377 Microsynth (Balgach, Switzerland). Sekwencje DNA analizowano z użyciem programu DNASIS (Hitachi). Poszukiwania w bazach danych przeprowadzani z użyciem programu BLAST (NCBI).
6.1.6. Analiza RNA
Całkowite RNA i poly(A)* RNA ekstrahowano przy użyciu RNAgent (Promega) lub zestawu FastTrack kit (Invitrogen), odpowiednio. RNA rozdzielano za pomocą elektroforezy w 1% żelu formaldehydowym i przenoszono na błony Genescreen. Bloty hybrydyzowano z antysensownymi sondami rybonukleinowymi wytworzonymi z użyciem zetawu DIG RNA labeling kit (Boehringer Mannheim), z odpowiednich plazmidów. Hybrdyzacja, płukanie i warunki CDP star-detection były takie jak opisał producent. „Wspólna sonda EST111410 (TIGR, ATCC. Rockville, MD, USA) zawiera sekwencję transkryptu A pomiędzy nukleotydami 2535-4678, sondę specyficzną dla eksonu 1 zawierającą sekwencję transkryptu A pomiędzy nukleotydami 65-769 oraz sondę specyficzną dla eksonu 2 zawierającą transkrypt A pomiędzy nukleotydami 815-3183.
PL 204 293 B1
6.1.7. Wytwarzanie surowic odpornościowych
Surowica odpornościowa 472 (AS 472) była wytworzona przez Research Genetics, Inc. (Huntsville AL; USA) wobec peptydu syntetycznego P4 72, SYDSIKLEPENPPPYEEA (sekwencja bydlęca SEQ ID NO:33), który odpowiada sekewncji aminokwasowej szczurzego Nogo 623-640 z SEQ ID NO:2, z trzema niedopasowaniami.
Surowica odpornościowa Bruna (AS Bruna) była wytworzona wobec fragmentu rekombinowanego białka Nogo, eksprymowanego w E. coli jako białko fuzyjne. Specyficznie, C-koniec szczurzej sekwencji nukleotydowej Nogo A kodującej aminokwasy 762 do 1,163 z SEQ ID NO:2 (ekspresja w E. coli przy użyciu systemu Novagen pET) użyto celem wytworzenia surowic odpornościowych AS Bruna anty-Nogo.
6.1.8. Elektroforeza i hybrydyzacja Western
SDS-PAGE i hybrydyzację Western przeprowadzano standardowymi technikami znanymi w dziedzinie. Przeciwciała rozcieńczano w następujący sposób: AS Bruna 1: 7,500; AS 472 1:2,000; anty-myc (9E10) 1:5,000 (Invitrbgen); anty-BiP 2 μg/ml (Stressgen); supernatant hybrydomy mAb IN-1 używano nierozcieńczony. Przeciwciałami drugorzędowymi były: sprzężone z HRP anty-królicze (Pierce; 1:20,000); anty-mysie IgM (1:50,000) oraz anty-mysie sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Milan Analytica AG, La Roche, Switzerland; 1:5,000).
6.1.9. Immunohistochemia
Rdzeń kręgowy lub móżdżek dorosłych szczurów szybko izolowano, umieszczano w podłożu i mrożono w 40°C. 20 skrawków post mortem wycięto i utrawalono w etanolu/kwasie octowym w -40°C. Immunoznakowanie przeprowadzono jak opisano w Rubin i wsp., 1994, J. Neurocytol. 23:209-217, z wyjątkiem tego, że ominięto etap wygaszania. Alternatywnie, skrawki tkanek utrwalano w metanolu (2 minuty w -20°C), a immnoznakowanie przeprowadzano jak w Rubin i wsp., poniżej. Przeciwciała pierwszorzędowe były następujące (Przeciwciało: (rozcieńczenie)): supernatant hybrydomy IN-1: (nierozcieńczony); AS Bruna: (1:5000); lub oczyszczone z użyciem chromatografii powinowactwa AS 472: (1:50).
6.1.10. Test wzrostu fibroblastów NIH 3T3
Fibroblasty NIH 3T3 umieszczano na płytkach do hodowli powleczonych wstępnie 5 μg/dołek (=1 cm2) q-pool. Q-pool to spulowane frakcje aktywne ekstraktu z bydlęcego rdzenia kręgowego rozdzielonego na kolumnie z Q-Sefarozą. IN-1 stosowano jako nierozcieńczony supernatant z hodowli (1-10 μg/ml), AS Bruna i surowicę przedodpornościową rozcieńczano 1:1000 w PBS, a AS 472 i surowicę przedodpornościową rozcieńczano 1:500 w PBS. W celu skompensowania różnic w aktywności w różnych preparatach q-pool liczbę hamowanych, okrągłych komórek wysianych na płytki normalizowano do 100% i do 0% dla wysianych na płytki kontrolne z buforem (Spillman i wsp., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19283-93).
6.1.11. Test wzrostu neutytów DRG
Zwoje korzeni grzbietowych (DRG) pobierano z embrionów kurcząt E16 do roztworu Hanka (HBSS), dzielono na dwie części i umieszczano na płytkach pokrytych wcześniej q-pool w 100 μl podłoża F12 z 10% FCS oraz 1% metocelem. Wzrost neutyrów z pojedyczych DRG oceniano po 24 godz. inkubacji w 37°C w sposób półilościowy z użyciem skali 0 (brak wzrostu) do 4 (wzrost maksymalny).
6.1.12 Test ko-hodowli DRG/nerw wzrokowy
Nerwy wzrokowe pobierano z dorosłych szczurów, napromieniowywano 5500 grejami (Gy) i nastrzykiwano AS 472 lub odpowiednią surowicą przedodpornościową (rozcieńczenie 1:10). Pary nerwów hodowano w 3-komorowych hodowlach tak, że jeden koniec każdego nerwu przenikał poprzez barierę ze smaru silikonowego/tłoka teflonowego do środkowej komory, gdzie umieszczano rozczłonkowane pierwotne neurony DRG od szczurów w P0. Po dwóch tygodniach hodowli nerwy utrwalano standardowymi technikami znanymi w dziedzinie i zatapiano do mikroskopii elektronowej (EMI), zaś ultracienkie skrawki pobierano na odcinku około 3,5 mm od części eksponowanej DRG. Skrawki systematycznie analizowano pod kątem obecności rosnących aksonów przy użyciu Zeiss EM 902.
6.1.13. Ekspresja Nogo w komórkach COS
Otwartą ramkę odczytu Nogo A sklonowano do wektora pcDNA3.1mychis (Invitrogen) przy użyciu standardowych technik znanych w dziedzinie. Powstały plazmid (Nogo-myc19) dostosowań do produkcji rekombinowanego białka zawierającego sekwencję Nogo A poddaną fuzji ze znacznikiem myc-his (21 aminokwasów). Nogo-myc19 (2 μg DNA na płytkę 35 mm) lub plazmid kontrolny (pcDNAmychisLacZ) wprowadzano do komórek COS stosując Superfect (Qiagen) zgodnie z protokołem producenta. Stransfekowane komórki zbierano 36-48 godzin po transfekcji. W oparciu o znakowanie immunofluorescencyjne przeciwciałem anty-myc oraz barwną reakcję enzymatyczną
PL 204 293 B1 β-galaktozydazy, przeciętny rząd transfekcji oceniono na około 20%. Strasfekowane komórki COS utrwalano 95% etanolem 5% kwasem octowym (4°C, 25 minut), blokowano w PBS/10% FCS, i inkubowano z AS Bruna (1:200) lub IN-1 (1:2) przez 2 godz. w PBS/1% FCS RT. Komórki przemywano PBS i poddawano reakcji z drugorzędowym fluorescencyjnym przeciwciałem (kozie anty-królicze-FITC dla AS Bruna oraz kozie anty-mysie -TRITC do detekcji IN-1, Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, PA).
6.1.14. Hodowle oligodendrocytów
Oligodendrocyty wyizolowane z mózgów nowonarodzonych szczurów umieszczano na pokrytych polilizyną płytkach 75 cm2 (Sigma, St. Louis, MO) i hodowano przez 10-12 dni w DMEM uzupełnionym 5% FCS. Wzbogacone, mieszane populacje oligodendrocytów i ich progenitorów uwalniano z monowarstwy astrocytów poprzez wytrząsanie przez noc przy 210 rpm w wytrząsarce orbitalnej. Komórki umieszano przy gęstości 1-2 x 106 komórek na pokrytych polilizyną 35 cm2 płytkach. Pozwalano na różnicowanie progenitorów w chemicznie zdefiniowanym podłożu (CDM) przez 3-4 dni.
6.1.15. Biotynylacja powierzchni komórkowej
Całkowite hodowle szczurzych mózgów z P4 przygotowano jak opisano w van der Haar, i wsp. (1998, J. Neurosci. Res. 51:371-81). W dniu 7 biotynylowano in vitro nieprzenikającą do komórki EZ-LINX-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) jak opisano, z wyjątkiem tego, że wszystkie kroki przeprowadzano w 15°C, zaś komórki lizowano w 1 ml buforu lizującego (0,05M NaH2PO4; pH 8,0; 0,15 M NaCl; 0,5% CHAPS (Sigma); 2,5 mM jodoacetamid, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu, 0,1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml peptstatyny A). Biotynylowane białka immunoprecypitowano z użyciem Dynabeads M-280 ze streptawidyną (Dynal) i poddano SDS-PAGE oraz przeniesiono na błony nitrocelulozowe, które sondowano AS472, alfa-BiP i αβ-tubuliną. Błony zanurzano w zestawie Re-Blot Western Blot Recycling Kit (Chemicon).
6.1.16. Immunocytochemia
Oligodendrocyty nerwu wzrokowego przygotowano jak opisano w Schwab and Caroni (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393). Dwudniowe hodowle inkubowano z AS 472 (1:200) lub mAb IN-1 (1:3) w podłożu przez 25 minut w RT. Hodowle przmywano, utrwalano 4% paraformaldehydem/5% sacharozą w PBS i blokowano w 0,1 M kwasem maleinowym/2% odczynnikiem blokującym (Boehringer Manhein) przez 1 godzinę. Drugorzędowe przeciwciała sprzężone z alkaliczną fosfatazą (Milan Analytica) stosowano w: 1:7,5000 w 0,1 M kwasie maleinowym/1% odczynniku blokującym (1 godz., RT). Stransfekowane komórki COS utrwalano w 95% etanolu /5% kwasie octowym (4°C, 25 minut), blokowano i inkubowano z AS Bruna (1:200) lub mAb 30 IN-1 przez 2 godz. w RT. Komórki poddawano reakcji z kozim anty-króliczym-FITC oraz kozim anty-mysim-TRITC (Jackson Immuno Research Lab).
6.1.17. Komora nerwu wzrokowego
Pary nerwów wzrokowych hodowano w 3-komorowym systemie jak opisano w Schwab i wsp. (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393), nastrzykiwano i poddawano ekspozycji na AS 472 lub odpowiednią surowicę przedodpornościową (1:10). Nerwy wzrokowe zatapiano do mikroskopii elektronowej (EM), zaś ultra-cienkie skrawki pobierano w odległości około 3,5 mm od części eksponowanej DRG. Skrawki systematycznie analizowano pod kątem obecności rosnących aksonów przy użyciu Zeiss EM 902.
6.2. Wyniki eksperymentalne
Następujący rozdział ujawnia wyniki eksperymentów uzyskane w metodach przedstawionych w rozdziale 6.1. i podrozdziałach.
6.2.1. Izolacja cDNA Nogo
Bydlęcy homolog szczurzego NI-250 oczyszczono, bNI220, a peptydy z oczyszczonego białka wytworzono poprzez trawienie proteazą. Wielokrotnie znakowane digoksygeniną zdegenerowane oligonukleotydy zaprojektowano zgodnie z sześcioma różnymi sekwencjami peptydowymi bNl220. Przy użyciu tych oligonukleotydów wyizolowano szereg klonów cDNA w wyniku przeszukiwania bydlęcej bibliteki istoty białej. Insert najdłuższego klonu (CWP1-3, Figura 1a) użyto do syntezy sond do kolejnego przeszukiwania szczurzych biliotek cDNA. Wybrane klony z takich przeszukiwań są pokazane na figurze 1a. Analiza sekwencji DNA tych klonów cDNA wykazała, że trzy różne transkrypty powstają z jednego genu DNA, a ten gen oznaczono Nogo. Te różne transkrypty powstają najprawdopobodniej z alternatywnego promotora i alternatywnego składania (Nogo A, Nogo B oraz Nogo C; figura 1b). Sekwencje DNA były kompilowane z klonów pokazanych na figurze 1A celem stworzenia transkryptu A, sekwencji DNA pokazanej na figurze 2a.
Koncepcyjna translacja trzech transkryptów prowadzi do produktów białkowych oznaczonych Nogo A (1163 aminokway), Nogo B (360 aminokwasy) oraz Nogo C (199 aminokwasów). Ponieważ
PL 204 293 B1
Nogo A zawiera wszystkie sześć sekwencji peptydowych otrzymywanych z oczyszczonego bN1220 (figura 2b), jest on najprawdopodobniej ekwiwalentem oczyszczonego białka, szczurzego NI-250. Nogo A, B, oraz C mają wspólny C-koniec ze 188 aminokwasów (wspólna domena), zaś Nogo A i B mają wspólny N-koniec ze 172 aminokwasów. Nogo A jest dłuższy niż Nogo B o 803 aminowasy, o wynika z alternatywnego skł adania.
Żadna z izoform Nogo nie posiada hydrofobowego odcinka aminokwasowego na N-końcu, który mógłby być używany jako konwencjonalny peptyd sygnałowy. Jednakże, opisano białka nie mające konwencjonalnego syganału peptydowego jednak mimo to ulegające trnasportowi przez błony, na przykład czynnik wzrostu fibroblastów (Florkiewicz i wsp., 1995, J. Cell. Physiology 162:388-399), rzęskowy czynnik neurotroficzny (Sendtner i wsp., 1994, J. Neurobiology 25:1436-1353) oraz interleukina-1 (Rubartelli i wsp., 1990, EMBO J. 9:1503-1510). Białka błonowe, takie jak commissureless (Tear i wsp. 1996, Neuron 16:501-514) również nie posiadają konwencjonalnego peptydu syganał owego a jednak ulegają insercji do bł ony.
Chociaż nie ma w ramce kodonu stop w hipotetycznym, nieulegającym translacji regionie 5', który mógłby jednoznacznie zdefiniować kodon start, to następujące badania sugerują, że metionina zaznaczona na figurze 2a jest kodonem start dla Nogo A i Nogo B: (1) sekwencja wokół przypuszczalnego kodonu start przypomina sekwencję konsensusową dla miejsc inicjacji translacji (GCCGCC
A/G CCATGG; SEQ ID NO:34); (2) przeprowadzono intensywne próby znalezienia większej liczby sekwencji znajdujących sią powyżej za pomocą przeszukiwania biblioteki i 5'-RACE. Żadne z tych poszukiwań nie doprowadziło do identyfikacji większej liczby sekwencji powyżej; i (3) eukariotyczne rekombinowane Nogo A eksprymowane z powyższej metioniny ma masę cząsteczkową około 200 kD, jak oceniono przez SDS-PAGE, co czyni je nieodróżnialnym od endogennego Nogo A ze szczurzych oligodendrocytów (figura 11a).
6.2.2. Analiza sekwencji Nogo
Nogo A zawiera siedem potencjalnych miejsc glikozylacji, jednak dowody biochemiczne wskazują na to, że Nogo A nie ma głównego elementu polisachrydowego. Nogo A ma również dziewiętnaście miejsc rozponania dla PKC oraz siedem miejsc dla kinazy kazeinowej II (figura 2a). Wszystkie trzy Nogo mają dwie wspólne C-końcowe domeny hydrofobowe złożone z 35 i 36 aminokwasów, odpowiednio. Dowolna z nich lub obie mogą być używane jako domeny trans- oraz wewnątrzbłonowe, co pokrywa się z charakterystyką bNI220 jako integralnego białka błonowego. Nogo A (jak również Nogo B i C) nie zawierają żadnych znanych motywów cząsteczek adhezyjnych, białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz innych cząsteczek kierujących.
Sekwencje Nogo stosowano do przeszukiwania różnych baz danych pod kątem genów homologicznych, C-końcowa wspólna domena trzech produktów Nogo jest podobna (62,5%) do zidentyfikowanego genu ludzkiego, nsp (c113 oraz s-rex u szczura, oraz chs-rex u kurczęcia) (Figura 3). EST z C. elegans i Drosophila melanogaster wykazują również znaczące podobieństwo (16,6% i 13,6%, odpowiednio) do Nogo i nsp w tym samym regionie. 180 aminokwasowe domeny C-końcowe obu Nogo oraz Nsp są wysoce konserwowane w gatunkach ssaków (98,3% i 97,3%, odpowiednio), co wskazuje, że mogą one pełnić zasadnicze i podobne funkcje. Poza tym regionem, podobieństwo dla danego białka w obrębie gatunków jest również wysokie (73% pomiędzy szczurzym a bydlęcym Nogo, 76,2% pomiędzy NSP-A a S-rexb; 50% pomiędzy Chs-rexb a NSP-A lub S-rexb). Podobieństwo pomiędzy NSP a Nogo jest jednakże ograniczone do ich C-końcowej, wspólnej domeny hydrofobowej (figura 3a), oraz do kwasowej natury tych białek poza regionem konserwowanym. NSP (NSP-A, -B i-C) opisano wcześniej jako specyficzne produkty neuroendokrynne o nieznnanych funkcjach. Hybrydyzacha in situ i immunohistologia wykazały lokalizację neuronalną NSP w układzie nerwowym. Zidentyfikowano kolejny ludzki gen typu nsp-1, który również posiada C-końcowy region hydrofobowy o 50% podobieństwie zarówno do Nsp, jak i Nogo.
6.2.3. Ekspresja tkankowa Nogo
Wzór ekspresji Nogo zbadano poprzez hybrydyzację Northern oraz hybrydyzację in situ. Kiedy zastosowano „wspólną sondę wykryto trzy główne transkrypty Nogo (oznaczone: A, 4,6 kb; B, 2,6 kb; oraz C, 1,7 kb) w nerwie wzrokowym, rdzeniu kręgowym oraz korze mózgowej (figura 4a). W zwojach korzeni grzbietowych wykryto tylko dwa większe traskrypty. 2,6 kb główny transkrypt został wykryty w komórkach PC12, podczas gdy prążek 4,6 kb można było wykryć dopiero po długiej ekspozycji (Figura 4a). W nerwie kulszowym wykryto mniejsze poziomy transkryptów, przy czym głównym transkryptem był transkrypt 2,6 kb. W przypadku gdy hybrydyzowano RNA poły (A)* z rdzenia kręgowego i komórek PC12 do sondy specyficznej dla eksonu 1 wykrywano jedynie transkrytpy 4,6 kb oraz 2,6 kb; w przyPL 204 293 B1 padu hybrydyzacji RNA poły (A)* z tyłomózgowia oraz mięśni szkieletowych do sondy specyficznej dla eksonu 2 wykryto jedynie transkrypt 4,6 kb w tyłomózgowiu. Wyniki te weryfikują mapę transkryptów przedstawioną na figurze 1B. Wyniki hybrydyzacji Northern również wykazały, że ekspresja Nogo nie jest ograniczona do układu nerwowego (Figura 4c); transkrypty Nogo są wykrywane także w mięśniach szkieletowych (1,7 kb), nerkach (2,6 kb and 1,7 kb), chrząstce z mostka (1,7 kb), skórze (1,7 kb), płucach (2,6 kb), oraz śledzionie (2,6 kb). Poza mięśniem szkieletowym, w którym transkrypty Nogo ulegają ekspresji na wysokim poziomie, poziom transkryptów Nogo poza układem nerwowym jest niższy niż w obrębie układu nerwowego. Jak dotąd wydaje się, że transkrypty 4,6 kb NogoA ulegają transkrypcji jedynie na terenie układu nerwowego.
Hybrydyzacje in situ na skrawkach tkanek z dorosłego szczurzego OUN przy użyciu wspólnej sondy pokazały średni stopień wyznakowania rzędów ciał komórek w substancji białej różnych części mózgu i rdzenia kręgowego. Ułożenie to jest typowe dla oligodendrocytów pomiędzywęzłowych (figura 5a, d). Poza oligodendrocytami kilka typów neuronów wykazuje także ekspresję transkryptów Nogo na wysokim poziomie (figura 5c, e). W móżdżku podwójnie znakowane skrawki przeciwciałem anty-GFAP oraz hybrydyzacja in situ jasno pokazały silne znakowanie komórek Purkinjego przez sondę Nogo, podczas gdy astrocyty pozostały niewyznakowane (figura 5e, f). W rozwijających się nerwach wzrokowych transkrypty Nogo były wykrywane w dniu 0 (P0), tj. kilka dni przed tym jak można wykryć główne z białek mielinowych, białko proteolipidowe (PLP) oraz zasadowe białko mieliny (MBP) (Figura 6). To zejście się w czasie jest zgodne z pojawianiem się pierwszych galaktocerebrozydo-pozytywnych oligodendrocytów oraz pojawieniem się aktywności hamującej wzrost neurytów, co może zostać zneutralizowane przy udziale IN-1.
Wytworzono surowice odpornościowe przeciwko syntetycznemu peptydowi opartemu na sekwencji specyficznej dla bydlęcego Nogo A (AS 472) oraz przeciwko 45 kDa rekombinowanemu częściowemu szczurzemu Nogo A (AS Bruna) (Rozdział 6.1.7). Zarówno AS 472, jak i AS Bruna rozpoznają białko o około 200 kDa w bydlęcej mielinie, a AS Bruna rozpoznaje ponadto 200 kDa szczurze białko mieliny w Western Biotach (figura 7). Skrawki z rdzeni kręgowych dorosłych szczurów oraz z móżdżku znakowano AS 472, AS Bruna oraz IN-1. Po utrwaleniu tych skrawków w etanolu/kwasie octowym (procedura wykazana wcześniej jako zachowująca antygeny IN-1) dochodziło do silnego znakowania mieliny/substancji białej za pomocą wszystkich trzech przeciwciał. (Figura 8). Znakowanie ciał komórek oligodendrocytów było szczególnie odmienne dla AS Bruna. Działanie na świeże skrawki mrożeniowe metanolem zamiast etanolem/kwasem octowym znosiło znakowanie mieliny za wyjątkiem oligodendrocytów.
AS Bruna i AS 472 znakowały również kilka typów neuronów, w tym neurony motoryczne z rdzenia kręgowego, warstwy ziarniakowe i molekularne móżdżku. Komórki Purkinjego znakowały się silnie AS 472 i AS Bruna, ale nie wykrywano znakowania IN-1.
6.2.4. Przeciwciała Nogo hamują indukowane przez Nogo hamowanie wzrostu in vitro.
Częściowo oczyszczone preparaty bydlęcych rdzeni kręgowych NI-220 (q-pool) mogą zapobiegać rozrostowi NIH 3T3 oraz wzrostowi neurytów w obecności surowic odpornościowych anty-Nogo, zarówno AS Bruna, AS 4 72, jak i IN-1 zredukowana była aktywność hamującą q-pool, tj. fibroblasty NIH 3T3 rozprzestrzeniały się, a embrionalne zwoje korzeni grzbietowych kurczęcia (DRG) wydłużały neuryty na płytkach pokrytych q-pool (Figura 9). Specyficzność wykazano poprzez dodanie peptydu P472, używanego do wytworzenia AS 472 (Rozdział 6.1.7). P472 blokował hamujący wpływ AS 472, zaś peptyd kontrolny nie wpływał na hamowanie.
Co więcej, obecność Nogo A na powierzchni oligodendrodytów wykazano immunocytochemicznie, funkcjonalnie i biochemicznie przy użyciu AS 472. Żywe, pierwotne hodowle oligodendrocytów ulegały znakowaniu mAb IN-1 albo AS 472 relatywnie słabo (w porównaniu do immunocytochemii galaktocerebrozydów), chociaż na zróżnicowanych oligodendrocytach obserwowano wyraźne znakowanie powierzchni (Figura 15a, c). Dodanie peptydu kompetycyjnego (P472) dla AS 472 lub pominięcie przeciwciała pierwszorzędowego znosiło to specyficzne znakowanie (Figura 15b, d). Biotynylacja powierzchni komórkowej i kolejna precypitacja streptawidyną udowodniła obecność Nogo A na powierzchni błony plazmatycznej oligodendrocytów. W precypitacie AS 472 wykrywał prążek o koło 40 kDa powyżej wewnątrzkomórkowego, prawdopobonie nieobrabianego i nieglikozylowanego immuno-pozytywnego prążka AS 472. Białko ER BiP nie mogło być wykryte we frakcji biotynylowanej (figura 15e).
Nogo A jako białko powierzchniowe oligodendrocytów było również analizowane funkcjonalnie. Ko-hodowla oligodendrocytów i fibroblastów NIH 3T3 lub oligodendrocytów i neuronów DRG wyraźnie wykazywała hamujące właściwości dojrzałych oligodendrocytów. Testy te pokazują, że fibroblasty NIH
PL 204 293 B1
3T3 oraz neuryty DRG silnie unikały terytorium oligodendrocytów, zaś efekt ten był neutralizowany przez mAb IN-1. W obecności AS 472 hamowanie to było równo zmniejszane (figura 16a, b i e, f), podczas gdy preinkubacja AS 472 z 472 przywracała hamowanie zależne od oligodendrocytów (Figura 16c, d i g, h). Ocena ilościowa wykazała wysoce istotną zdolność do neutralizacji przeciwciał mAb IN-1 oraz AS 472 w obu typach testów (Figura 16 i oraz j).
RecNogo-A (Figura 17a) produkowane przez stabilnie transfekowaną linię komórkową CHO było testowane pod kątem wpływu na rozrost fibroblastów NIH 3T3 oraz wzrost neurytów DRG. Rekombinacyjnie produkowana β-galaktozydaza wyizolowana ze stabilnej linii komórkowej CHO (CHO-LacZ) była wzbogacana równolegle w recNogo-A oraz była stosowana jako kontrola aktywności hamującej endogennych białek CHO w obu testach. W teście rozrostu fibroblastów NIH 3T3 ekstrakt CHO recNogo-A (Nogo-A: około 1-5% całkowitego białka; fig. 9a) wykazywał widoczny hamujący wpływ na rozrost komórek przy 10 μg/cm2 (Figura 17b). Efekt ten był zależny od dawki: przy 20 μg/cm2 aktywność hamująca była wyższa, podczas gdy przy 5 μg/cm2 nie miała charakteru hamującego (wyniki nie pokazane). Aktywność hamująca mogła być neutralizowana do poziomu tła poprzez preinkubację pokrytego białka z mAb IN-1 lub AS Bruna, podczas gdy kontrolne przeciwciało przeciwko galaktocerebrozydowi (mAb 01) lub surowica przedodpornościowa AS Bruna nie wywierały takiego wpływu (figura 17b).
Oprócz tego silnego wpływu na rozrost fibroblastów NIH 373 ekstrakt CHO zawierający recNogo-A, ale nie ekstrakt CHO-LacZ, wywierał silny wpływ hamujący na rozrost neurytów z hodowli pierwotnych neuronów. Wypreparowane neurony DRG były hamowane poprzez recNogo-A w sposób zależny od dawki (Figura 17c). Ta aktywność hamująca mogła być neutralizowana przez mAb IN-1, ale nie kontrolne mAb 01 (Figura 17c-e). Białko rekombinowane wyizolowane z CHO-LacZ nie działało hamująco przy 1 i 5 μg, a dodanie mAbs 01 lub IN-1 nie wywierało wpływu na wzrost neurytów.
6.2.5. Ponowny wzrost neurytów in vitro.
Badano zdolność neurytów DRG z nowonarodzonych szczurów do regeneracji i wzrostu wewnątrz tkanki dorosłego OUN. Pary nerwów wzrokowych wypreparowywano od dorosłych szczurów i hodowano w specjalnym układzie komór do hodowli tak, że neuryty DGR miały dostęp do jednego końca każdego nerwu. (Figura 10a). W każdej hodowli, jeden z dwóch nerwów był nastrzykiwany i poddawany działaniu surowicy przedodpornościowej królika, zaś drugi nerw był nastrzykiwany AS 472, który również był umieszczony w komorze wokół nerwu. Po dwóch tygodniach in vitro w obecności NGF hodowle utrwalano, rozdzielano i zatapiano do mikroskopii elektronowej (EM). Skrawki EM pobierano około 3,5 mm od końca neuronu w miejscu kontaktu z neuronami DRG. Nastrzykiwane surowicą przedodpornościową nerwy zawierały tylko kilka aksonów lub wcale (Figura 10b). Te zaś znajdowano w kontakcie z błonami podstawnymi i astrocytami na powierzchni neuronów. Dla kontrastu, większość nerwów nastrzykniętych AS 472 zawierało odpowiednią ilość aksonów, często po kilkaset. Często obserwowano kontakt z mieliną (Figura 10c, d).
6.2.6. Rozpoznawanie rekombinowanego Nogo A przez IN-1
W przypadku gdy Nogo A poddawano ekspresji jako C-końcowe rekombinowane białko ze znacznikiem myc-his w transfekowanych komórkach COS, to hybrydyzacja Western przy użyciu zarówno przeciwciała anty-myc jak i AS Bruna pokazała, że rekombinowane Nogo A ma pozorną masę cząsteczkową około 200 kDa na żelach deneturujących z SDS (figura 11a). Na tym samym blocie, wykrywano prążek o podobnej ruchliwości przez AS Bruna w szczurzych pierwotnych kulturach oligodendrocytów, sugerując, że rekombinowane Nogo ma niemal identyczną masę cząsteczkową jak endogenne Nogo A z oligodendrocytów (Figura 1a). Gdy stransfekowane komórki COS znakowano immunofluorescencyjnie IN-1 i AS Bruna, to IN-1 i AS Bruna rozpoznawały te same, stransfekowane komórki (figura 11 b, c). Większość immunoreaktywności była zlokalizowana wewnątrzkomórkowo i była dostępna jedynie po permabilizacji.
6.2.7. Mapowanie aktywnych regionów Nogo
Celem zmapowania inhibitorowych domen lub regionów Nogo wytworzono szereg mutantów delecyjnych Nogo. Konstrukty delecyjne genu Nogo wytworzono poprzez użycie wewnętrznych miejsc restrykcyjnych, trawienie egzonukleazą III z fasoli mung i poprzez łańcuchową reakcję polimerazy. Opis mutantów zamieszczono na Figurze 18 oraz w jej krótkim opisie. Większość kontstruktów ma N-końcowy znacznik T7 celem identyfikacji przeciwciałami monoklonalnymi anty T7; oraz N-i C-końcowy znacznik heksahistydynowy (His-tag) do oczyszczania przy użyciu chromatografii powinowactwa z immobilizowanym Co(II). Mutanty delecyjne Nogo, nazwane NiG-D1, NiG-D2 do NiG-D20 testowano za pomocą testu wzrostu fibroblastów NIH 3T3 celem określenia aktywności hamującej.
PL 204 293 B1
Niektóre mutanty testowano w testach na wzrost neurytów PC12, wzrost rozsianych neurytów DRG lub testach zwoju siatkówkowego (ang. retinal ganglion stripe assay). Wyniki pokazano w Tabeli 2 poniżej.
T a b e l a 2
Aktywności funkcjonalnej mutantów delecyjnych Nogo.
3T3 PC12 DRG RGC
Nogo-A + + + +
Nogo-B +
Nogo-C - -
NiAext + + + +
EST +/-
NiR +
NiG + + +
NiG-D1 +
NiG-D2 +
NiG-D3 + +
NiG-D4 +
NiG-D5 -
NiG-D7 +
NiG-D8 +
NiG-D9 +
NiG-D10 +/-
NiG-D14 -
NiG-D15 +
NiG-D16 +
NiG-D17 +
NiG-D18 +
NiG-D20 + +
Pozytywny wynik w teście fibroblastów NIH 3T3 lub teście PC12 jest punktowany jeśli wrost fibroblastów lub komórek PC12 jest hamowany na płytce pokrytej preparatem Nogo otrzymanym z mutantów delecyjnych. Pozytywny wynik w teście wzrostu neurytów embrionalnych kurzych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) lub w teście zaniku stożka wzrostu zwoju (RGC) wskazuje na zahamowanie wzrostu neurytu lub zanik stożka wzrostu w obecności preparatu otrzymanego z mutanta delecyjnego.
Dane wskazują, że główną domenę hamującą zidentyfikowno w specyficznym regionie Nogo-A, między aminokwasami 172-974, w szczególności aminokwasami 542-722. Dodatkowo, N-końcowa sekwencja z Nogo A i Nogo B (aminokwasy 1-171) była również hamująca dla wzrostu 3T3. W oparciu o te wyniki, regiony Nogo od aminokwasów 172-259 oraz od aminokwasów 975-1162 wydają się być nieistotne i mogą być usunięte bez utraty aktywności hamującej.
7. Przykład: Ludzkie kwasy nukleinowe, białka Nogo, ich pochodne i fragmenty
Zgodnie z wynalazkiem opisano sekwencje nukleotydowe kodujące ludzkie białko Nogo i fragmenty ludzkiego białka Nogo, w tym ludzkie odpowiedniki szczurzego Nogo A, Nogo B oraz części Nogo C. Ludzką sekwencję aminokwasową Nogo opisano na figurze 13 i oznaczono SEQ ID NO:29.
Zgodnie z wynalazkiem również sekwencje nukleotydowe fragmentów ludzkiego genu Nogo. Sekwencję nukleotydową ludzkiego Nogo można określić przy użyciu transkryptów szczurzego Nogo
PL 204 293 B1
A stanowiących pomoc dla przyrównania i składania ludzkich sekwencji ulegających ekspresji (EST), które są homologiczne wobec szczurzej lub bydlęcej sekwencji cDNA.
Przykładowo, EST AA081783 i AA333267 (Rozdział 5.1) nakładają się ze sobą i odpowiadają pozycjom kwasu nukleinowego 765 do 1272 szczurzego Nogo A (figura 2a; SEQ ID NO:1). EST AA322592, AA092565, i AA081525 (Rozdział 5.1) również nakładają się ze sobą a nakładające się sekwencje odpowiadają pozycjom kwasu nukleinowego 1642-2131 szczurzego Nogo. Te dwa niezależne zestawy nakładających się EST nie mogą być przyrównane celem otrzymania ludzkiej sekwencji bez porównania komputerowego z sekwencją nukleotydową szczurzego lub bydlęcego Nogo. Do początkowego porównania komputerowego zalecany jest ENTREZ Nucleotide QUERY. Inne programy do przyrównywania są wymienione w Rozdziale 5.1. jako przyłady alternatywne i nie mają na celu ograniczania zakresu niniejszego wynalazku.
8.Dyskusja
8.1. Klonowanie inhibitora wzrostu neurytów Nogo
Nogo A ma szereg właściwości, które potwierdzają, że jest ono opisanym wcześniej szczurzym NI-250, głównym białkiem mieliny OUN hamującym wzrost neurytów oraz antygenem IN-1. Na poziomie molekularnym Nogo A zawiera sześć peptydów oryginalnie otrzymanych poprzez zsekwencjonowanie bNI-220, najbardziej hamującego składnika mieliny bydlęcego rdzenia kręgowego. Na poziomie ekspresji oligodendrocyty są głównym typem komórek w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym, wykazujących ekspresję Nogo A, a regulacja czasowa ekspresji Nogo w nerwie wzrokowym odpowiada wcześniej opisanej aktywności neutralizującej hamowanie wzrostu neurytów przez IN-1. Co więcej hybrydyzacja Western wykazała obecność Nogo A w aktywnych frakcjach q-pool, a istota biała z różnych regionów OUN była znakowana zarówno AS Bruna, jak i AS 4 72 (specyficzne dla Nogo A) w sposób identyczny ze wzorem dla IN-1. Oba te fakty pozostają w zgodzie z interpretacją, że Nogo A stanowi NI-250.
Obie surowice odpornościowe wzbudzone przeciwko sekwencjom Nogo A, AS Bruna i As 472 znacznie zmniejszały aktywność hamującą częściowo oczyszczonego preparatu bydlęcego rdzenia kręgowego (q-pool). AS 472 umożliwiło także wzrost dużej ilości aksonów zwojów korzeni grzbietowych na około kilka milimetrów do eksplantów dorosłego nerwu wzrokowego, co przypomina IN-1.
Chociaż obliczona masa cząsteczkowa Nogo A wynosi około 140 kDa, posiada ono pozorną masę cząsteczkową około 200 kDa na denaturujących żelach z SDS, co mieści się w zakresie poprzedniej oceny około 250 kDa. Nieprawidłowa ruchliwość Nogo A na żelach SDS-PAGE jest raczej spowodowana naturą kwasową a nie modyfikacjami posttranslacyjnymi. Postulowano niewłaściwą ruchliwość na żelach SDS-PAGE dla innych wysoce kwaśnych białek takich jak GAP-43 oraz NSP-A. Co więcej, rekombinowane Nogo A eksprymowane w bakteriach ma taką samą masę cząsteczkową jak endogenne Nogo A eksprymowane w oligodendrocytach. Zaprzecza to głównym modyfikacjom Nogo A na drodze mechanizmów takich jak glikozylacja.
8.2. Nogo zapobiega regeneracji i ogranicza plastyczność dojrzałego OUN.
Ekspresja Nogo w szczurzych oligodendrocytach nerwu wzrokowego z PO pokrywa się z wcześniejszymi odkryciami dotycącymi zdolności IN-1 do neutralizacji aktywności hamowania wzrostu neurytów.
Co ciekawe, ekspresja ta poprzedza o kilka dni ekspresję głównych białek mieliny oraz formowanie zbitej mieliny. Pojawienie się Nogo, być może w odpowiedzi na syganały aksonalne, może zapobiegać dalszemu wzrostowi aksonów w odpowiednich szlakach włókien (szczyt liczby aksonów w nerwie wzrokowym szczura w E20). Nogo może także hamować tworzenie się włókien obocznych i tym samym stabilizować ogólną strukturę zróżnicowanego OUN. W istocie szarej różnych regionów OUN zawartość mieliny oraz immunoreaktywność IN-1 wykazuje odwrotną korelację z poziomem GAP-43 i potencjałem plastycznym tych regionów. W rzeczywistości, przeciwciała IN-1 zastosowane w dojrzałym OUN pozwalają na rozgałęzianie i plastyczność w obrębie pnia mózgu oraz rdzenia kręgowego do rozmiaru znanego uprzednio jedynie w OUN noworodków. Znaczne odzyskanie funkcji, które towarzyszy tej plastyczności wskazuje, że rozgałęziające się aksony są zdolne do tworzenia funkcjonalnie prawidłowych połączeń.
Pokazano uprzednio, że odpowiedź neuronów na hamujące Nogo różni się w zależności od wieku neuronów. Prawdopodobnie wynika to z różnej ekspresji receptorów, która jak się wydaje zostanie wkrótce scharakteryzowana. Podobnie jak dla netryn i wielu czynników wzrostu możliwym wydaje się istnienie wielu różnych receptorów dla Nogo, które mogą włączać różne odpowiedzi. Fakt, że Nogo ulegają ekspresji również w pewnych typach neuronów wskazuje na możliwe oddziaływania pomiędzy tymi samymi lub innymi izoformami Nogo.
PL 204 293 B1
8.3 Nogo należy do nowej rodziny neurytowych częsteczek regulatorowych
Analiza sekwencji Nogo nie ujawnia żadnych znanych motywów białek powierzchniowo-komórkowych lub białek macierzy zaangażowanych w kierowanie aksonalne (odpychające lub przyciągające), tzn. nie można było zidentyfikować żanych domen immunoglobulinowych, fibronektyny typu III lub EGF. Nie występowała homologia ani do opisanych inhibitorów wzrostu neuronów, semaforyn, netryn, ani efryn.
Wraz z grupą ostatnio opisanych białek NSP/s-rex i białek typu NSP 1 Nogo tworzą nową rodzinę w oparciu o podobieństwo ich C-końcowych 180 aminokwasów. Tak jak w przypadku Nogo, zarówno wykorzystywanie alternatywnego promotora (zarówno gen Nsp, jak i typu Nsp 1 (ang. NSPlike 1), jak i alternatywnego składania (tylko Nsp) są odpowiedzialne za wytwarzanie alternatywnych produktów białkowych o wspólnych C-końcach zawierających dwa odcinki hydrofobowych aminokwasów. Jak to wskazuje nazwa, NSP (białka specyficzne dla komórek neuronalnych i endokrynnych, ang. Neuroendocrine-specific cells) ulegają ekspresji głównie w neuronach i kilku typach komórek endokrynnych. Ich lokalizacja jest głównie wewnątrzkomórkowa w połączeniu z retikulum endoplazmatycznym. Gen typu NSP 1 ulega ekspresji głównie w mózgu i mięśniach. Nie są znane funkcje ani rodzin NSP ani typu Nsp 1. Fakt, że potencjalne ortologi występują zarówno w C. elegans, jak i Drosophilla melanogaster sugeruje, że Nogo, przy jego aktywności hamującej regenerację nerwów i rozprzestrzenianie się, może być nowo powstałym i dotąd nieopisanym członkiem rodziny NSP.
8.4. Nogo w tkankach nieneuronalnych
Transktypt Nogo C ulega ekspresji w mięśniu szkieletowym na poziomie porównywalnym do układu nerwowego. Jedną z ewentualnych funkcji Nogo C w mięśniu jest odpychanie aksonów motorycznych i ograniczanie ich do regionu połączenia synaptycznego neuronu motorycznego (ang. motor endplate region). Niskie poziomy ekspresji Nogo można także wykryć w innych tkankach nie-nerwowych. Obserwowane hamowanie rozprzestrzeniania się fibroblastów i astrocytów przez ekstrakt mielinowy i NI-250 wiąże się z obecnością receptorów i mechanizmów odpowiedzi dla białek Nogo w tych komórkach. Sugeruje to potencjalną ogólną funkcję Nogo w hamowaniu kontaktowym ruchu komórek.
PL 204 293 B1
LISTA SEKWENCJI <11O> Schwab, M.
Chen, M.
<120» Oczyszczone białko i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy, wektor do klonowania, rekom binowana komórka, sposób wytwarzania rekom binowanego białka, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało m onoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy odpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzani a przeciwciał m onoklonalny ch
<130> 10200-003-227
<150> 99972673.0
<151> 1999-11-05
<150> PCT/US99/26160
<151> 1999-11-05
<150> 60/107,446
<151» 1998-11-06
<160 51
<170» FastSEQ for Windowa Veraion 3.0
<210> 1 -
<211» 3741
<212» DNA
<213» Rattus sp.
<220»
<221» CDS
<222» (253)...(3741)
<400» 1
attgctcgtc tgggeggcgg óggcggctgc agcctgggao agggcgggtg gcacatctcg 60
atcgcgaagg cagcagaago agtctcattg ttccgggagc cgtcgcctcc gcaggttctt 120
cggcccggct oggcacgact cggcctgcct ggcccctgoc agtcttgccc aacccccaca 180
accgcccgcg actctgagga gaagcggccc cgcggcggct gtagctgcag catcgtcggc 240
gacccgccag oo atg gaa gao ata gac cag tog tog ctg gtc tcc tcg tcc 291
Met Glu Asp Ile Aap Gin Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser
5 10
aog gac agc ccg ccc cgg cct ccg ccc gcc ttc aag tac cag ttc gtg Gin Phe Val 339
Thr Asp Ser Pro Pro Arg Pro Pro 20 Pro Ala Phe Lys 25 Tyr
15
acg gag CCC gag gac gag gag gac gag gag gag gag gag gac gag gag 387
Thr Glu Pro Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
30 35 40 45
gag gac gac gag gac eta gag gaa ctg gag gtg ctg gag agg aag CCC 435
Glu Asp ASP Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro
50 55 60
gca gcc ggg ctg tcc gca gct gcg gtg ccg ccc gcc gcc gcc gcg ccg 483
PL 204 293 B1
531
Ala Ala Gly ctg ctg gac Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro ccg Pro
65 ttc agc agc gac 70 tcg gtg 75 cgc Arg ggg Gly
CCC ccc gcg Ala ccc Pro 90
Leu Leu Asp 80 Phe Ser Ser Asp Ser 85 Val Pro Pro
ctg ccg gcc gcg ccc cct gcc gct cct gag agg cag cca tcc tgg gaa
Leu Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Glu
95 100 105
cgc agc ccc gcg gcg ccc gcg cca tcc ctg ccg ccc gct gcc gca gtc
Arg Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val
110 115 120 125
ctg ccc tcc aag ctc cca gag gac gac gag cct ccg gcg agg ccc ccg
Leu Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
130 135 140
cct ccg ccg cca gcc ggc gcg agc ccc ctg gcg gag ccc gcc gcg ccc
Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro
145 150 155
cct tcc acg ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc ggc tca gtg gat
Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser vai Asp
160 165 170
gag acc ctt ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata ccc tcc
Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser
175 180 185
tct gca gaa aaa att atg gat ttg atg gag cag cca ggt aac act gtt
Ser Ala Glu Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gin Pro Gly Asn Thr Val
190 195 200 205
tcg tct ggt caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gcc
Ser Ser Gly Gin Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala
210 215 220
tct ctt cct tct eta tct cct ctc tca act gtt tct ttt aaa gaa cat
Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His
225 230 235
gga tac ctt ggt aac tta tca gca gtg tca tcc tca gaa gga aca att
Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile
240 245 250
gaa gaa act tta aat gaa gct tct aaa gag ttg cca gag agg gca aca
Glu Glu Thr Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr
255 260 265
aat cca ttt gta aat aga gat tta gca gaa ttt tca gaa tta gaa tat
Asn Pro Phe Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr
270 275 280 285
tca gaa atg gga tca tct ttt aaa ggc tcc cca aaa gga gag tca gcc
579
627
675
723
771
819
867
915
963
1011
1059
1107
1155
PL 204 293 B1
Ser Glu ata tta Met Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser 300 aaa Lys Ala
290 gta gaa aac Val Glu Asn 305 act Thr aag gaa 295 gaa gta att gtg agg agt
gac Asp 1203
Ile Leu Lys Glu Glu 310 Val Ile Val Arg Ser 315
aaa gag gat tta gtt tgt agt gca gcc ctt cac agt cca caa gaa tca 1251
Lys Glu Asp Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gin Glu Ser
320 325 330
cct gtg ggt aaa gaa gac aga gtt gtg tet cca gaa aag aca atg gac 1299
Pro Val Gly Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp
335 340 345
att ttt aat gaa atg cag atg tca gta gta gca cct gtg agg gaa gag 1347
Ile Phe Asn Glu Met Gin Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu
350 355 360 365
tat gca gac ttt aag cca ttt gaa caa gca tgg gaa gtg aaa gat act 1395
Tyr Ma Asp Phe Lys Pro Phe Glu Gin Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr
370 375 380
tat gag gga agt agg gat gtg ctg gct gct aga gct aat gtg gaa agt 1443
Tyr Glu Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser
385 390 395
aaa gtg gac aga aaa tgc ttg gaa gat agc ctg gag caa aaa agt ctt 1491
Lys Val Asp Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gin Lys Ser Leu
400 405 410
ggg aag gat agt gaa ggc aga aat gag gat gct tet ttc ccc agt acc 1539
Gly Lys Asp Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr
415 420 425
cca gaa cct gtg aag gac agc tcc aga gca tat att acc tgt gct tcc 1587
Pro Glu Pro Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser
430 435 440 445
ttt acc tca gca acc gaa agc acc aca gca aac act ttc cct ttg tta 1635
Phe Thr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu
450 455 460
gaa gat cat act tca gaa aat aaa aca gat gaa aaa aaa ata gaa gaa 1683
Glu Asp His Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu
465 470 475
agg aag gcc caa att ata aca gag aag act agc ccc aaa acg tca aat 1731
Arg Lys Ala Gin Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser pro Lys Thr Ser Asn
480 485 490
cct ttc Ctt gta gca gta cag gat tet gag gca gat tat gtt aca aca 1779
Pro Phe Leu Val Ala Val Gin Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr
495 500 505
gat acc tta tca aag gtg act gag gca gca gtg tca aac atg cct gaa 1827
PL 204 293 B1
Asp 510 ggt Gly Thr ctg Leu Leu Ser Lys Val Thr 515 Glu Ala Ala cag gaa gca Val S20 tgt Cys Ser gaa Glu Asn Met agt gaa Pro ctg Leu 540 Glu 525 aat Asn 1875
acg Thr cca Pro
gat Asp 530 tta gtt Leu Val
Gin Glu Ala 535 Ser Glu
gaa gcc aca ggt aca aag att gct tat gaa aca aaa gtg gac ttg gtc 1923
Giu Ala Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val
545 550 555
caa aca tca gaa gct ata caa gaa tca ctt tac ccc aca gca cag ctt 1971
Gin Thr Ser Glu Ala Ile Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gin Leu
560 565 570
tgc cca tca ttt gag gaa gct gaa gca act ccg tca cca gtt ttg cct 2019
Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro val Leu Pro
575 580 5B5
gat att gtt atg gaa gca cca tta aat tct ctc ctt cca agc gct ggt 2067
Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly
590 595 600 605
gct tct gta gtg cag ccc agt gta tcc cca ctg gaa gca cct cct cca 2115
Ala Ser val vai Gin Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro
610 615 620
gct agt tat gac agc ata aag ctt gag cct gaa aac ccc cca cca tat 2163
Val Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr
625 630 635
gaa gaa gcc atg aat gta gca eta aaa gct ttg gga aca aag gaa gga 2211
Glu Glu Ala Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly
640 645 650
ata aaa gag cct gaa agt ttt aat gca gct gtt cag gaa aca gaa gct 2259
Ile Lys Glu Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gin Glu Thr Glu Ala
655 660 665
cct Pro 670 tat 7yr ata tcc att gcg tgt gat Cys Asp tta Leu att aaa gaa aca aag ctc tcc Ser 685 2307
Ile Ser Ile Ala 675 Ile Lys 680 Glu Thr Lys Leu
act gag cca agt cca gat ttc tct aat tat tca gaa ata gca aaa ttc 2355
Thr Glu Pro Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe
690 695 700
gag aag teg gtg ccc gaa cac gct gag eta gtg gag gat tcc tca cct 2403
Glu Lys Ser Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro
705 710 715
gaa tct gaa cca gtt gac tta ttt agt gat gat teg att cct gaa gtc 2451
Glu Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val
720 72S 730
PL 204 293 B1
cca caa aca caa Pro Gin Thr Gin 735 gag gag get gtg atg ctc atg aag gag agt ctc act 2499
Glu Glu Ala 740 Val Met Leu Met Lys 745 Glu Ser Leu Thr
gaa gtg tct gag aca gta gee cag cac aaa gag Sag aga ctt agt gee 2547
Glu Val Ser Glu Thr Val Ala Gin His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala
750 755 760 765
tca ocE cag gag eta gga aag cca tat tta sag tct ttt cag ccc aat 2595
Ser Pro Gin Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gin Pro Asn
770 775 780
tta car agt aca aaa gat get gca tct aat gac att cca aca ttg acc 2643
Leu His Ser Thr Lys ASp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr
785 790 795
aaa aag gag aaa att tct ttg caa atg gaa sag ttt aat act gca att 2691
Lys Lys Glu Lys Ile Ser Leu Gin Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile
800 805 810
tat Eca aat gat gac tta ctt tct tct aag gaa gac aaa ata aaa gaa 2739
Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu
815 820 825
agt gaa aca tCC tca gat tca tct ccg att gag ata ata gat gaa ttt 2787
Ser Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe
830 835 840 845
ccc acg ttt gtc agt get aaa gat gat tct cct aaa tta gee aag gag 2835
Pro Thr Phe Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu
850 855 860
tac act gat eta gaa gta tcc gac aaa agt gaa att get aat atc caa 2883
Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gin
865 870 875
age ggg gca gar tca ttg cct tgc tta gaa ttg ccc tgt gac ctt tct 2931
Ser Gly Ala Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser
880 885 890
ttc aag aat ata tat cct aaa gat gaa gta cat gtt tca gat gaa ttc 2979
Phe Lys Asn Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe
895 900 905
tcc gaa aat agg tcc agt gta tct aag gca tcc ata teg cct tca aat 3027
Ser Glu Asn Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn
910 915 920 925
gtc tct get ttg gaa cct cag aca gaa atg ggc age ata gtt aaa tcc 3075
Val Ser Ala Leu Glu Pro Gin Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser
930 935 940
aaa tca ctt acg aaa gaa gca gag aaa aaa ctt cct tct gac aca gag 3123
Lys Ser Leu Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu
945 950 955
PL 204 293 B1
aaa gag gac aga tcc ctg Leu tca gct Ser Ala 965 gta ttg tca gca gag ctg agt aaa Lys 3171
Lys Glu Asp 960 Arg Ser Val Leu Ser Ala Glu 970 Leu Ser
act tca gtt gtt gac ctc ctc tac tgg aga gac att aag aag act gga 3219
Thr Ser 975 vai Val Asp Leu Leu Tyr 980 Trp Arg Asp Ile Lys 985 Lys Thr Gly
gtg gtg ttt ggt gcc agc tta ttc ctg ctg ctg tet ctg aca gtg ttc 3267
Val Val 990 Phe Gly Ala Ser Leu Phe 995 Leu Leu Leu Ser Leu 1000 Thr Val Phe 1005
agc att gtc agt gta acg gcc tac att gcc ttg gcc ctg ctc teg gtg 3315
Ser Ile Val Ser Val Thr 1010 Ala Tyr Ile Ala Leu 1015 Ala Leu Leu Ser Val 1020
act atc agc ttt agg ata tat aag ggc gtg atc cag gct atc cag aaa 3363
Thr Ile Ser Phe Arg 1025 Ile Tyr Lys Gly Val 1030 Ile Gin Ala Ile Gin 1035 Lys
tca gat gaa ggc cac cca ttc agg gca tat tta gaa tet gaa gtt gct 3411
Ser Asp Glu Gly 1040 His Pro Phe Arg Ala Tyr 1045 Leu Glu Ser Glu Val 1050 Ala
a ta tca gag gaa ttg gtt cag aaa tac agt aat tet gct ctt ggt cat 3459
Ile Ser Glu 1055 Glu Leu val Gin Lys 1060 Tyr Ser Asn Ser Ala 1065 Leu Gly His
gtg aac agc aca ata aaa gaa ctg agg cgg ctt ttc tta gtt gat gat 3507
Val Asn 1070 Ser Thr Ile Lys Glu Leu 1075 Arg Arg Leu Phe Leu 1080 Val Asp Asp 1085
tta gtt gat tcc ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gtg ttt act tat 3555
Leu Val Asp Ser Leu Lys 1090 Phe Ala Val Leu Met 1095 Trp Val Phe Thr Tyr 1100
gtt ggt gcc ttg ttc aat ggt ctg aca eta ctg att tta gct ctg atc 3603
Val Gly Ala Leu Phe 1105 Asn Gly Leu Thr Leu 1110 Leu Ile Leu Ala Leu 1115 Ile
tca ctc ttc agt att cct gtt att tat gaa cgg cat cag gtg cag ata 3651
Ser Leu Phe Ser 1120 Ile Pro Val Ile Tyr Glu 1125 Arg His Gin Val Gin 1130 Ile
gat cat tat eta gga ctt gca aac aag agt gtt aag gat gcc atg gcc 3699
Asp His Ty*· Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala
1135 1140 1145 aaa atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag cgc aaa gca gat 3741
Lys lla Gin Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp 1150 1155 1160 <210> 2
PL 204 293 B1 <211> 1163 <212* PRT <213* Rattus sp <400> 2
Met Glu Asp Ile Asp Gin Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser
1 5 10 15
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gin Phe Val Thr Glu Pro
20 25 30
Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp
35 40 45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly
50 55 60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu
165 170 175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu
180 185 190
Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gin Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly
195 200 205
Gin Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225 230 235 240
Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe
260 265 270
val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met
275 280 285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val
290 295 300
Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp
305 310 315 320
Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gin Glu Ser Pro val Gly
325 330 335
Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn
340 345 350
Glu Met Gin Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp
355 360 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gin Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly
370 375 380
Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp
385 390 395 400
PL 204 293 B1
Arg Lys Cys Leu Glu 405 Asp Ser Leu Glu Gin Lys Ser Leu Gly Lys Asp
410 415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro
420 425 430
Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser
435 440 445
Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His
450 455 460
Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala
465 470 475 480
Gin Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Val Ala Val Gin Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu
500 505 510
Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr
515 520 S25
Pro Asp Leu Val Gin Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
530 535 540
Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gin Thr Ser
545 550 555 560
Glu Ala Ile Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gin Leu Cys Pro Ser
565 570 575
Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val
580 585 590
Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val
595 600 605
Val Gin Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr
610 615 620
Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala
625 630 635 640
Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu
645 650 655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gin Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile
660 665 670
Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro
675 680 685
Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser
690 695 700
Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu
705 710 715 720
Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gin Thr
725 730 735
Gin Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser
740 745 750
Glu Thr Val Ala Gin His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gin
755 760 765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gin Pro Asn Leu His Ser
770 775 780
Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Ser Leu Gin Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn
805 810 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr
820 825 830
Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
PL 204 293 B1
835 840 845
Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp
850 855 860
Leu Glu Val Ser A$p Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gin Ser Gly Ala
865 870 875 880
Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn
885 890 895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn
900 905 910
Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala
915 920 925
Leu Glu Pro Gin Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu
930 935 940
Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu ASp
945 950 955 960
Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser val
965 970 975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe
980 985 990
Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser ile Val
995 1000 1005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser
1010 1015 1020
Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gin Ala Ile Gin Lys Ser Asp Glu
1025 1030 1035 1040
Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu
1045 1050 1055
Glu Leu Val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser
1060 1065 1070
Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp
1075 1080 1085
Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala
1090 1095 1100
Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe
1105 1110 1115 1120
Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gin Val Gin Ile Asp His Tyr
1125 1130 1135
Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin
1140 1145 1150
Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
1155 1160
<210» 3
<211» 13
<212» PRT
<213» Bos sp.
<400» 3
Glu Tyr Leu Gly Asp Leu Pro Ala Val Leu Pro Thr Glu
5 10 <210» 4 <211» 11 <212» PRT <213» Bos sp.
PL 204 293 B1 <400> 4
Glu Ile Ala Glu Ile Gin Asp Gly Glu Ser Leu 15 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Bos sp.
<220>
<221> WARIANT <222> (2)...(2) <223> xaa = dowolny aminokwas <400> 5
Lys Xaa Tyr Leu Glu Ser Ile Gin Pro Ser Leu Gly Ile Thr Lys 15 10 15 <210> 6 <2ll> 9 <212> PRT <213> Bos sp.
<22 0>
<221> WARIANT <222> 2,5 <223> Xaa = dowolny aminokwas <400> 6
Lys Xaa Phe Glu Xaa Val Trp Glu Val 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Bos sp.
<400> 7
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys 15 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Bos sp.
<400> 8
Lys Ala Val Ala Ala Glu Ala Ser Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe 15 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Bos sp.
PL 204 293 B1 <400> 9
Glu Tyr Leu Gly Asp Leu Pro Ala Val Leu Pro Thr Glu
1 <210» 10 5 10
<211» 12
<212» PRT
<213» BOS sp.
<400> 10
Glu Ile Ala Asp Ile Gin Asp Gly Ala Gly Ser Leu
1 <210» 11 5 10
<211> 15
<212» PRT
<213» Bos sp.
<400» 11
Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gin Pro Ser Leu Gly Ile Thr Lys
1 <210» 12 5 10 15
<211> 9
<212> PRT
<213» BOS sp.
<400» 12
Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val
1 <210> 13 5
<211> 11
<212» PRT
<213> Bos sp.
<400» 13
Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys
1 <210» 14 5 10
<211» 16
<212» PRT
<213» Bos sp.
<400> 14
Lys Gly Val Ala Ala Glu Ala Ser Met Gly Glu Glu Tyr Ala Asp
1 5 10 15
<210» 15 <211> 13 <212> PRT <213» Rattus sp.
PL 204 293 B1 <400» 15
Gly 1 Tyr Leu Gly Asn Leu 5 Ser Ala Val Ser 10 Ser Ser Glu
<210» <211» <212» <213» 16 12 PRT Rattus sp.
Glu 1 <400» Ile Ala 16 Asn Ile Gin 5 Ser Gly Ala Asp 10 Ser Leu
<210» <211» <212» <213» 17 15 PRT Rattus sp.
Lys 1 <400» Pro Tyr 17 Leu Glu Ser 5 Phe Gin Pro Asn 10 Leu His Ser Thr Lys 15
<210> <211» <212» <213» 18 9 PRT Rattus sp.
Lys 1 <400» Pro Phe 18 Glu Gin Ala 5 Trp Glu Val
<210» <211> <212» <213» 19 11 PRT Rattus sp.
Vai 1 <400» Val Asp 19 Leu Leu Tyr 5 Trp Arg ASp Ile 10 Lys
<210» <211» <212> <213» 20 16 PRT Rattus sp.
Met 1 <400> Gin Met 20 Ser Val Val 5 Ala Pro Val Arg 10 Glu Glu Tyr Ala Asp 15
<210> 21 <211» 186 <212> PRT <213» Homo sapiens <400» 21
PL 204 293 B1
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gin Thr Gly Ile Val Phe Gly
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gin Phe Ser Val Val Ser
20 25 30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gin Ala Val Gin Lys Thr Asp Glu Gly
50 55 60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gin Glu
65 70 75 80
Gin Ile Gin Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gin Phe Tyr Val Asn Ser Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gin Asp Leu Val Asp Ser
100 105 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr Val Gly Ala Leu
115 120 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Leu Met Ala Val Val Ser Met Phe Thr
130 135 140
Leu Pro Val Val Tyr Val Lys His Gin Ala Gin Ile Asp Gin Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Ala Val Val Ala Lys Ile Gin Ala
165 170 175
Lys Ile Pro Gly Ala LyS Arg His Ala Glu
180 185
<210> 22
<211> 186
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 22
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gin Thr Gly Ile Val phe Gly
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gin Phe Ser Val Val Ser
20 25 30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gin Ala Val Gin Lys Thr Asp Glu Gly
50 55 60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Glu Ile Thr Leu Ser Gin Glu
65 70 75 80
Gin Ile Gin Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gin Leu Tyr Val Asn Ser Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gin Asp Leu Val Asp Ser
100 105 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr Val Gly Ala Leu
115 120 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Leu Met Ala Val Val Ser Met phe Thr
130 135 140
Leu Pro Val Val Tyr Val Lys His Gin Ala Gin Val Asp Gin Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Thr Val Val Ala Lys Ile Gin Ala
165 170 175
Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg His Ala Glu
PL 204 293 B1
180 185
<210» 23
<211» 186
<212> PRT
<213» Gallus gallus
<400» 23
Asn Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Gin Thr Gly Ile Val Phe Gly
1 5 10 15
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Thr Gin Phe Ser Val Val Ser
20 25 30
Val Val Ala Tyr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Ala Thr Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ile Tyr Lys Ser Val Leu Gin Ala Val Gin Lys Thr Asp Glu Gly
SO 55 60
His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Asp Met Glu Met Asn Leu Ser Gin Asp
65 70 75 80
Gin Ile Gin Lys Tyr Thr Asp Cys Leu Gin Leu Tyr Val Asn Ser Thr
85 90 95
Val Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Gin Asp Leu Val Asp Ser
100 105 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Leu Leu Thr Tyr val Gly Ala Leu
115 120 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Met Ala Val Val Ser Met Phe Thr
130 135 140
Leu Pro Val val Tyr Asp Lys Tyr Gin Ala Gin Ile Asp Gin Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Leu Val Arg Thr His Ile Asn Thr Val Val Ala Lys Ile Gin Ala
165 170 175
Lys Ile Pro Gly Ala Lys Arg Lys Ala Glu
180 185
<210» 24
<211» 186
<212» PRT
<213» Bos sp.
<400» 24
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly
1 5 10 15
Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser
20 25 30
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gin Ala ile Gin Lys Ser Asp Glu Gly
50 55 60
His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu
65 70 75 80
Leu Val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr
85 90 95
Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser
100 105 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu
115 120 125
PL 204 293 B1
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser
130 135 140
Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gin Ala Gin Ile Asp His Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys ile Gin Ala
165 170 175
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu
180 185
<210> 25
<211> 186
<212> PRT
<213* Rattus sp.
<400> 25
Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly val Val Phe Gly
1 5 10 15
Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser
20 25 30
Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe
35 40 45
Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gin Ala Ile Gin Lys Ser Asp Glu Gly
50 55 60
His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu val Ala Ile Ser Glu Glu
65 70 75 80
Leu Val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser Thr
85 90 95
Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser
100 105 110
Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu
115 120 125
Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser
130 135 140
Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gin Val Gin Ile Asp His Tyr Leu
145 150 155 160
Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin Ala
165 170 175
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
180 185
<210> 26
<211> 194
<212> PRT
<213> C. elegans
<400> 26
Asp Val Ile Tyr Trp Arg Asp Ala Lys Lys Ser Ala Ile Val Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Leu Phe Val Leu Ala Lys Tyr Pro Leu Leu Thr
20 25 30
Val Val Thr Tyr Ser Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Ala Gly Phe
35 40 45
Arg val Phe Lys Lys Val Glu Ala Gin Ile Lys Lys Thr Asp Ser Glu
50 55 60
His Pro Phe Ser Glu Ile Leu Ala Gin Asp Leu Thr Leu Pro Gin Glu
PL 204 293 B1
65 70 75 80
Lys Val His Ala Gin Ala Asp Val Phe Val Glu His Ala Thr Cya Ile
85 90 95
Ala Asn Lys Leu Lys Lys Leu Val Phe Val Glu Ser Pro Leu Glu Ser
100 105 110
Ile Lys Phe Gly Leu Val Leu Trp Ser Leu Thr Tyr Ile Ala Ser Trp
115 120 125
Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ala Ile Leu Gly Leu Leu Gly Val Phe Ser
130 135 140
Val Pro Lys Val Tyr Glu Ser Asn Gin Glu Ala Ile Asp Pro His Leu
145 150 155 160
Ala Thr Ile Ser Gly His Leu Lys Asn Val Gin Aen Ile Ile Asp Glu
165 170 175
Lys Leu Pro Phe Leu Arg Ser Ala Pro Val Ala Ala Glu Glu Lys Lys
180 185 190
Asp Gin
<210» <211» <212» <213» 27 150 PRT D. melanogaster
<400» 27
Asn Leu Leu Leu Trp Arg Asn Ser Arg Lys Thr Leu Ile Val Phe Thr
1 5 10 15
Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu Asp val Met Val His Ser Val Ile Ser
20 25 30
Val Ile Ser Met Val Gly Ile Thr Val Leu Ile Ala Ala Ile Gly His
35 40 45
Arg Leu Leu Val Gin Phe Trp Ser ile Trp Lys Lys Asp Glu Asn Lys
50 55 60
Asp Gin Ile Leu Arg Phe Tyr Pro His Pro Lys Ile Glu Ile Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Thr Leu Tyr Leu Ala Gly Lys Ala val Ser His Ile Asn Leu
85 90 95
Ile Leu Asn Arg Met Ile Glu Leu Leu Leu Val Glu Lys Trp Glu Asp
100 105 110
Ser Leu Lys Phe Leu Val Leu Leu Cys Gly Ile Asn Leu Leu Gly Asp
115 120 125
Cys Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Phe Gly Met Cys Ile Cys Cys
130 135 140
Leu Thr Leu Leu Tyr Leu 145 150 <210» 28 <211» 3833 <212» DNA <213» Sos sp.
<400> 28 ctatctcotc tctcagccgc tgcctttaaa gaacgtgaat accttggtga tttaccagca 60 gtactgccca ctgaaggaac acttccagca acttcaaatg aagcttctaa agcattctca 120 gagaaggcaa aaaatccatt tgtagagaga aatttaacag aattttcaga attggaatat 180
PL 204 293 B1 tcagaaatgg aatcatcatt cagtggctct caaaaggcag aacctgccgt aacagtagcg 240 aatcctaggg acgaaatagt tgtgaggagt agagataaag aagaggactt agttagtctt 300 aacatccttc atactcagca ggagttatct acagtcctta cgaaatcagt tgaagaagaa 360 gatagagttc tgtctccaga aaaaacaaag gacagtttta aggaaaaggg agttgcagca 420 gaagcttcta tgggggagga atatgcagac ttcaaaccat ttgagcgagt atgggaagtg 480 aaagatactt acaagcaaga tagtgatgtt ttgattgctg gaggtaatat agagagcaaa 540 ttggaaggta aagtggataa gaaacacttt tcagatagcc ttgaacaaac aaatcgtgaa 600 aaagatagtg aaagcagtaa tgatgacact tcatttccca gtacaccaga agctgtaaga 660 ggtggttccg gagcgtacat cacgtgtgct ccctttaacc caacaactga gaatgtttca 720 acaaacattt ttcccttgtt ggaagatcat acttcggaaa ataagacaga tgaaaaaaag 780 atagaaaaaa aaaggcacaa attgtaacag agaagaatgc aagtgtcaag acatcaaacc 840 ctttccttat ggcagcacag gagtctaaga cagattacgt tacaacagat catgtgtcaa 900 aggtgaccga ggaagtagtg gcaaacatgc ctgaaggtct aaccccagat ttggttcagg 960 aagcatgtga aagtgaattg aatgaagcta ctggtacaaa aattgccttt gaaacaaaaa 1020 tggacctggt tcaaacttca gaagctgtgc aggagtcact ttaccctgta acacagcttt 1080 gcccatcttt tgaagaatct gaagctactc cgtcaccggt tttgcctgac attgtcatgg 1140 aagcaccatt aaattctgta gttcctagtg ctggtgcttc tgcagtgcag ctcagttcat 1200 caccattaga aactcttcct tcagttaatt atgaaagcat aaagtttgag cctgaaaatc 1260 ccccaccata tgaggaggcc atgaatgtat cactaaaaaa agaatcagga atgaatgaag 1320 aaatcacaga gcctgaaggt attagtgtag ctgttcagga aacagaagct ccttatatat 1380 ctattgcatg tgatttaatt aaagaaacaa agatctctac tgaaccgact ccagatttct 1440 ctagttattc agaaatagća gaagttgcac agccagtgcc cgagcattct gagctagttg 1500 aagattcctc ccccgattct gaaccagttg acttatttag tgatgattca atacccgaag 1560 ttccacaaaa acaagatgaa gctgtaatac ttgtgaaaga aaacctcact gaaatttcat 1620 ctgagtcaat gacaggacat gacaataagg gaaaactcag tgcttcacca tcacctgagg 1680 gaggaaaacc gtatttggag tcttttcagc ccagtttagg catcacaaaa gataćcttag 1740 cacctgatga agtttcagca ttgacccaaa aggagaaaat ccctttgcag atggaggagc 1800 tcaatactgc agcttattca agtgatggct tattcattgc tcaggaagca aacctaagag 1860 aaagcgaaac attttcagat ccatctccga ttgagattat agatgagttc ccgacctttg 1920 tcagttctaa agcagattct tctcctacat tagccaggga atacactgac ctagaagtag 1980 cccacaaaag tgaaattgct gacatccagg atggagctgg gtcattggct tgtgcaggat 2040 tgccccatga cctttctttc aagagtatac aacctaaaga ggaagttcat gtcccagatg 2100 agttctccaa agataggggt gatgtttcaa aggtgcccgt actgcctcca gatgtttctg 2160 ctttggatgc tcaagcagag ataggcagca tagaaaaacc caaagttctt gtgaaagaag 2220 ccgagagaaa acttccttct gatacagaaa aagagcgaag atctccatct gctatatttt 2280 cagcagagct gagtaaaact tcagttgttg acctcctcta ctggagagac attaagaaga 2340 ctggagtggt gtttggtgcc agcttgttcc tgctgctctc gctgacagta ttcagcattg 2400 tgagtgtaac ggcctacatt gccttggccc tgctctctgt gactatcagc tttaggatat 2460 ataagggcgt gatccaggct atccagaaat ctgatgaagg ccacccattc agggcatatt 2520 tggaatctga agttgctata tctgaggagt tggttcagaa gtacagcaat tctgctcttg 2580 gtcatgttaa ctgcacaata aaagaactca gacgcctctt cttagttgat gatttagttg 2640 attctctgaa gtttgcagtg ttgacgtggg tatttaccta tgttggtgcc ttgttcaatg 2700 gtctgacact accaattttg gctctgattt cactctccag tgttcctgCt atttatgaac 2760 ggcaccaggc gcaaatagat cattatctgg gacttgcaaa taagaatgtt aaagatgcta 2820 tggctaaaat ccaagcaaaa atccctggat tgaagcgtaa agctgaatga gaaagcctga 2880 aagagttaac aatagaggag tttatcttta aaggggatat tcatttgatt ccattgggga 2940 gggtcaggga agaacaaagc cttgacattg cagtgcagtt tcacagatct ttatttttag 3000 caacgcagtg tctgaggaaa aatgacctgt cttgactgcc ctgtgttcat catcttaagt 3060 attgtaagct gctatgtatg gatttaaatc gtaatcatat ctgttcttcc tgtatgaggc 3120 actggtgaat aaacaaagat ctgagaaagc tgtatattac actttgtcgc aggtagtctt 3180 gctgtatttg gggaattgca aagaaagtgg agctgacaga aataaccctt ttcacagttt 3240 gtgcactgtg tacggtctgt gtaggttgat gcagattttc tgaaatgaaa tgtttagacg 3300 agatcatgcc accaaggcag gagtgaaaaa gcttgccttt cctggtatgt tctaggtgta 3360 ttgtgaaatt tactgttgta ttaattgcca atataagtaa atatagatta tatatatcta 3420 tatatagtgt ttcacgaagc ttagcccttt accttcccag ctgccccaca gtgcttgata 3480
PL 204 293 B1 cttctgtcat gggtcttatg tgtgtagtcc caaagcacat aagctaggga gaaacgtact 3540 tctaggcgca ctaccatctg ttttcaacac gaaccgacgc catgcaaaca gaactcctca 3600 acataaactt cactgcacag acttactgta gttaatttta tcacaaactc tggactgaat 3660 ctaatgcttc caaaaatgtt tgcaaatatc aaacattgtt atgtaagaaa atataaatga 3720 cgatttatac aattgtggtt taagctgtat tgaactaaat ctgtggaatg cattgtgaac 3780
Cgtaaaagca aagtatcaat aaagcttata gacttaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3833 <210» 29 <211» 1178 <212» PRT <213» Homo sapiens <220» <221» Wariant <222» (1) . , . (1178) w każdej pozycji Xaa <223» Xaa = dowolny aminokwas <400» 29
Met Glu Asp Leu Asp Gin Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro
1 5 10 15
Pro Arg Pro Gin Pro Ala Phe Lys Tyr Gin Phe Val Arg Glu Pro Glu
20 25 30
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp
35 40 45
Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser
50 55 60
Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp
65 70 75 80
Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro
100 105 110
Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val
115 120 125
Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Ala Ser val Ser pro Gin Ala Glu Pro Val Trp Thr
145 150 155 160
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro
165 170 175
Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ala Val Val Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Ile
180 185 190
Met Asp Leu Lys Glu Gin Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gin Glu
195 200 205
Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Xaa Pro Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ser Thr val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gin Glu Asn Val Ser
245 250 255
Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp
260 265 270
Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser
275 280 285
Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn
PL 204 293 B1
290 295 300
Pro Arg Glu Glu Ile Ile val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu
305 310 315 320
Val Ser Asn Asn Ile Leu His Xaa Gin Gin Glu Leu Pro Thr Ala Leu
325 330 335
Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys
340 345 350
Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu
355 360 365
Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Aep
370 375 380
Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser
385 390 395 400
Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu
405 410 415
Gin Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser
420 425 430
Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile
435 440 445
Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn
450 455 460
Ile Phe Pro Leu Leu Glu Asp Pro Thr Ser Glu Asn Xaa Thr Asp Glu
465 470 475 480
Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gin Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr
485 490 495
Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Phe Val Ala Ala Gin Asp Ser Glu
500 505 510
Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val
515 520 525
Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu val Gin Glu Ala
530 535 540
Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu
545 550 555 560
Thr Lys Met Asp Leu Val Gin Thr Ser Glu Val Met Gin Glu Ser Leu
565 570 575
Tyr Pro Ala Ala Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr
580 585 590
Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser
595 600 605
Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gin Pro Ser Ser Ser Pro
610 615 620
Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu
625 630 635 640
Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Val Ser
645 650 655
Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu
660 665 670
Gin Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys
675 680 685
Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser
690 695 700
Glu Met Ala Lys Val Glu Gin Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val
705 710 715 720
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp
725 730 735
PL 204 293 B1
Ser Ile Pro Asp Val Pro Gin Lys Gin Asp Glu Thr Val Met Leu Val
740 745 750
Lys Glu Ser Leu Thr 755 Glu Thr Ser 760 Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu 765
Asn Lys Glu Lys Leu 770 Ser Ala 775 Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr 780
Leu 7 85 Glu Ser Phe Lys Leu 790 Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu 795 800
Pro Asp Glu Val Ser 805 Thr Leu Ser Lys Lys Glu LyS Ile Pro Leu Gin 810 815
Met Glu Glu Leu Ser 820 Thr Ala Val Tyr 825 Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile 830
Ser Lys Glu Ala Gin 835 Ile Arg Glu 840 Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser 845
Pro Ile Glu Ile Ile 850 Asp Glu 855 Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr 860
Asp 865 Ser Phe Ser Lys Leu 870 Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser 875 880
His Lys Ser Glu Ile 885 Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro 890 895
Cys Thr Glu Leu Pro 900 His Asp Leu Ser 905 Leu Lys Asn Ile Gin Pro Lys 910
Val Glu Glu Lys Ile 915 Ser Phe Ser 920 Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser 925
Ala Thr Ser Lys Val 930 Leu Leu 935 Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Gly 940
His 945 Thr Gin Ala Glu Ile 950 Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Glu 955 960
Lys Glu Ala Glu Lys 965 Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg 970 975
Ser Pro Ser Ala Ile 980 Phe Ser Ala Asp 985 Leu Gly Lys Thr Ser Val Val 990
Asp Leu Leu Tyr Trp 995 Arg Asp Ile Lys 1000 Lys Thr Gly Val Val Phe Gly 1005
Ala Ser Leu Phe Leu 1010 Leu Leu Ser 1015 Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 1020
Val Thr Ala Tyr Ile 1025 Ala Leu 1030 Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe 1035 1040
Arg Ile Tyr Lys Gly Val 1045 Ile Gin Ala Ile Gin Lys Ser Asp Glu Gly 1050 1055
His Pro Phe Arg Ala 1060 Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu 1065 1070
Leu Val Gin Lys Tyr 1075 Ser Asn Ser Ala 1080 Leu Gly His Val Asn Cys Thr 1085
Ile Lys Glu Leu Arg 1090 Arg Leu Phe 1095 Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser 1100
Leu Lys Phe Ala Val 1105 Leu Met 1110 Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu 1115 1120
Phe Asn Gly Leu Thr Leu 1125 Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser 1130 1135
Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gin Ala Gin Ile Asp His Tyr Leu
1140 1145 1150
Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin Ala
1155 1160 1165
Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu
PL 204 293 B1
1170 1175 <210> 30 <211> 1163 <212> PRT <213> Rattus sp.
<220>
<221> WARIANT <222> (1) ... (1163) we wszystkich pozycjach η <223> Xaa =dowolny aminokwas <400> 30
Met Glu Asp Ile Asp Gin Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp
1 5 10 15
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gin Phe Val Thr Glu
20 25 30
Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp
35 40 45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly
50 55 60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gin Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu
165 170 175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu
180 185 190
Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gin Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly
195 200 205
Gin Glu Asp Phe Pro Ser val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225 230 235 240
Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met
275 280 285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val
290 295 300
Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp
305 310 315 320
Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gin Glu Ser Pro Val Gly
32S 330 335
PL 204 293 B1
Lys Glu Asp Arg Val 340 Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn
345 350
Glu Met Gin Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp
355 360 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gin Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly
370 375 380
Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp
185 390 395 400
Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gin Lys Ser Leu Gly Lys Asp
405 410 415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro
420 425 430
Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser
435 440 445
Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His
450 455 460
Thr Ser Glu Asn Xaa Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys Ala
465 470 475 480
Gin Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Val Ala Val Gin Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu
500 505 510
Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr
515 520 525
Pro Asp Leu Val Gin Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
530 535 540
Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gin Thr Ser
545 550 555 560
Glu Ala Ile Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gin Leu Cys Pro Ser
565 570 575
Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val
580 585 590
Ket Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val
595 600 605
Val Gin Pro Ser Val Ser Pro Leu Glu Ala Pro Pro Pro Val Ser Tyr
610 615 620
Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala
625 630 635 640
Met Asn Val Ala Leu Lys Ala Leu Gly Thr Lys Glu Gly Ile Lys Glu
645 650 655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala val Gin Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile
660 665 670
Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro
675 680 685
Ser Pro Asp Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys Ser
690 695 700
Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu
705 710 715 720
Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gin Thr
725 730 735
Gin Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser
740 745 750
Glu Thr Val Ala Gin His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gin
755 760 765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gin Pro Asn Leu His Ser
PL 204 293 B1
770 775 780
Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Ser Leu Gin Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn
805 810 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr
820 825 830
Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
835 840 845
Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp
850 855 860
Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gin Ser Gly Ala
865 870 875 880
Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn
885 890 895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn
900 905 910
Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala
915 920 925
Leu Glu Pro Gin Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu
930 935 940
Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp
945 950 ' 955 960
Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val
965 970 975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe
980 985 990
Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val
995 1000 1005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser 1010 1015 1020
Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gin Ala Ile Gin Lys Ser Asp Glu
1025 1030 1035 1040
Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu val Ala Ile Ser Glu
1045 1050 1055
Glu Leu Val Gin Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser
1060 1065 1070
Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val ASP
1075 1080 1085
Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala
1090 1095 1100
Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe
1105 1110 1115 1120
Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gin Val Gin Ile Asp His Tyr
1125 1130 1135
Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin
1140 1145 1150
Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
1155 1160 <210> 31 <211> 1568 <212> DNA <213> Rattus sp
PL 204 293 B1 <400» 31 caggcttagt ctggggaagc gggtgtttca tgtctcaggg agaattttgc agtttacagc 60 gtttctgttg gtatgcataa tttgtaattg ctgctggagg gcagatcgtg gcaagaaatg 120 gacggacaga agaaacattg gaaggacaag gttgttgacc tcctctactg gagagacatt 180 aagaagactg gagtggtgtt tggtgccagc ttattcctgc tgctgtctct gacagtgttc 240 agcattgtca gtgtaacggc ctacattgcc ttggccctgc tctcggtgac tatcagcttt 300 aggatatata agggcgtgat ccaggctatc cagaaatcag atgaaggcca cccattcagg 360 gcatatttag aatctgaagt tgctatatca gaggaattgg ttcagaaata cagtaattct 420 gctcttggtc atgtgaacag cacaataaaa gaactgaggc ggcttttctt agttgatgat 480 ttagttgatt ccctgaagtt tgcagtgttg atgtgggtgt ttacttatgt tggtgccttg 540 ttcaatggtc tgacactact gattttagct ctgatctcac tcttcagtat tcctgttatt 600 tatgaacggc atcaggtgca gatagatcat tatctaggac ttgcaaacaa gagtgttaag 660 gatgccatgg ccaaaatcca agcaaaaatc cctggattga agcgcaaagc agattgaaaa 720 agccccaaac agaagttcat ctttaaaggg gacactcact tgattacggg ggtgggaggt 780 caggggtgag cccttggtgg ccgtgcggtt tcagctcttt atttttagca gtgcactgtt 840 tgaggaaaaa ttacctgtct tgacttcctg tgtttatcat cttaagtatt gtaagctgct 900 gtgtatggat ctcattgtag tcacacttgt cttccccaat gaggcgcctg gtgaataaag 960 gactcgggga aagctgtgca ttgtatctgc tgcagggtag tctagctgta tgcagagagt 1020 tgtaaagaag gcaaatctgg gggcagggaa aacccttttc acagtgtacc gtgtttggtc 1080 agtgtaaaac tgatgcagat ttttctgaaa tgaaatgtct agatgagagc atactactaa 1140 agcagagtgg aaaactctgt ctttatggtg tgttctaggt gCattgtgaa tttactgtta 1200 cattgccaat ataagtaaat atagacctaa tctatatata gtgtttcaca aagcttagat 1260 ctctaacctt gcagctgccc cacagtgctt gacctctgag tcattggtta tgcagtgtag 1320 tcccaagcac ataaactagg aagagaaatg tatttgtagg agtgctacct accacctgtt 1380 ttcaagaaaa tatagaactc caacaaaaat atagaatgtc atttcaaaga cttactgtat 1440 gtatagttaa ttttgtcaca gactctgaaa ttctatggac tgaatttcat gcttccaaat 1500 gtccgcagtt atcaaacatt gttatgcaag aaatcataaa atgaagactt ataccattgt 1560 ggtttaag 1568 <210» 32 <211» 199 <212» PRT <213» Rattus sp.
<400» 32
Met Asp Gly Gin Lys Lys His Trp Lys Asp Lys Val Val Asp Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala Ser Leu
20 25 30
Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser Val Thr Ala
35 40 45
Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr
50 55 60
Lys Gly Val ile Gin Ala Ile Gin Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe
65 70 75 80
Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gin
85 90 95
Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser Thr Ile Lys Glu
100 105 110
Leu Arg Arg Leu Phe Leu val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Phe
115 120 125
Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn Gly
130 135 140
Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Ile Pro Val
PL 204 293 B1
145 150 155 160
Ile Tyr Glu Arg His Gin Val Gin ile Asp His Tyr Leu Gly Leu Ala
165 170 175
Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gin Ala Lys Ile Pro
180 185 190
Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
195 <210» 33 <211» 18 <212» PRT <213» Bos sp.
<400» 33
Ser Tyr Asp Ser Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu 15 10 15
Glu Ala <210» 34 <211» 13 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 34 gccgccrcca tgg 13
<210» 35
<211» 248
<212» DNA
<213» Homo sapiens
<220»
<221» mi sc_ _feature
<222» (1) · , . (248) wa wszystkich pozycjach n
<223» n=a, G, g lub t
<400» 35
gagccgtcac cacagtaggt ccctcggctc agtcggccca gcccctctca gtectcccca 60 acccccacaa ccgcccgcgc tcctgagacg cgccccggcg gcggcggcan agctgcagca 120 ccatctccac octccagoca tggaagacct ggaccagtct cctctggtct cgtcctcgga 180 cagcccaccc cggccgcagc ccgcgttcaa gtaccagttc gtgagggagc ccgaggacga 240 ggaggaag 248 <210» 36 <211» 379 <212» DNA <213» Homo sapiens <220» <221» misc_£eature <222» (1) . . . (36) we wszystkich pozycjach n <223» n=a, c, g lub t
PL 204 293 B1 <400» 36 gaaaatatgg acttgaagga gcagccaggt aacactattt cggctggtca agaggatttc 60 ccatctgtcc tgcttgaaac tgctgcttct nttccttctc tgtctcctct ctcagccgct 120 tctttcaaag aacatgaata ccttggcaat ttgtcaacag tattacccac tgaaggaaca 180 cttcaagaaa atgtcagtga agcttcCaaa gaggtctcag agaaggcaaa aactccactc 240 atagacagag atttaacaga gttttcagaa ttaggaatac tcagaaatgg gatcatcgtt 300 cagtgtctct ccaaaagcag aatctgccgt aaatagtagg caaatcctag gggaagaaat 360 aattcgtgga aaaataaag 379 <210» 37 <211» 281 <212» DNA <213» Homo sapiens <220» <221» misc_£eature <222» (1) . . . (281) we wszystkich pozycjach n <223» n=a, c, g lub t <400» 37 gatagagatt taacagagtt ttcagaatta gaatactcag aaatgggatc atcgttcagt 60 gtctccccaa aagcagaatc tgccgtaata gtagcaaatc ctagggaaga aataatcgtg 120 aaaaataaag atgaagaaga gaagttagtt agtaataaca tccttcatan tcaacaagag 180 ttacctacag ctcteactaa atcggttaaa gaggatgaag ttgtgtottc agaaaaagca 240 aaagacagtt ttatgaaaga gagttgcagt ggaantcctt g 281 <210» 38 <211» 640 <212» DNA <213» Homo sapiens <220» <221» misc_£eature <222» (1) . . . (640) we wszystkich pozycjach n <223» n=a, c, g lub t <400» 38 ttaaagagga tgaagttgtg tcttcagaaa aagcaaaaga cagttttaat gaaaagagag 60 ttgcagcgga agctcctatg agggaggaat atgoagactt oaaaccattt gagcgagtat 120 gggaagtgaa agatagtaag gaagatagtg atatgttggc tgctggaggt aaaatcgaga 180 gcaacttgga aagtaaagtg gataaaaaat gttttgcaga tagccttgag caaactaatc 240 acgaaaaaga tagtgagagt agtaatgatg atacttcttt ccccagtacg ccagaaggta 300 taaaggatcg ttcaggagca tatatcacat gtgctccctt taacccagca gcaactgaga 360 gcattgcaac naacatttct cctttgttgg agatcctact tcagaaaatt agaccgtgaa 420 aaaaaataga agaaaagaag gccnaatgtt accgagaaga atactagcac aaanctcaac 480 cctttottgt gcagcacagg ntotgngaca gatatgtccc acgnttatta ccaagtgotg 540 agantcttgc aacatcctga ngctgactcc gattgttccn gagctttgaa tggattgtgg 600 ttctggtcaa gttntttgan caaatggctt gtcactcgat 640
<210» 39
<211» 346
<212» DNA
<213» Homo sapiens
<220»
PL 204 293 B1 <221» misc_£eature <222> (1) . . . (346) we wszysktich pozycjach n <22 3> n—a, c, g lub t <400> 39 ctgtgcccgg ccccaccccc tgggcagatg tcccccactg ctaaggctgc tggcttcagg 60 gagggttagc ctgcaccgcc gccaccotgc ccctaagtca ttacctctcc agttcctacc 120 gtactccctg .caccgtctca ctgtgtgtnt ogtgtcagta atttatatgg tgttaaaatg 180 tgtatatttt tgtatgtnac tattttnact agggctgagg ggcctgcgcc cagagctggc 240 ctcccncaac acctgctgcg cttggtaggt gtggtggcgt tatggcagcc cggctgctgc 300 ttggatgcga gnttggnctt gggccggtgc tggggggcac agttgt 346
<210> 40
<211> 325
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
gtggcaaaca tgcctgaagg cctgactcca gatttagtac aggaagcatg tgaaagtgaa 60 ttgaatgaag ttactggtac aaagattgct tatgaaacaa aatggacttg gttcaaacat 120 cagaagttat gcaagagtca ctctatcotg cagcacagct ttgcccatca tttgaagagt ISO cagaagctao toctccacca gttttgcctg acattgttat ggaagcacca ttgaattctg 240 cagttcctag tgctggtgct tccgtgatac agcccagctć atcaccatta gaggctcctt 300 cagttaatta tgaagcataa acatg 325 <210> 41 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gcatgtgaaa gtgaattgaa tgaagttact ggtacaaaga ttgcttatga aacaaaaatg 60 gacttggtto aaacatoaga agttatgcaa gagtoactct atcctgcagc acagctttgo 120 ccatcatttg aagagtcaga agctactcct tcaccagttt tgcctgacat tgttatggaa 180 gcaccattga attctgcagt tcotagtgct ggtgcttccg tgataoagcc cagotcatca 240 ccattagaag cttcttcagt taattatgaa agcataaaac atgagcotga aaacccccca 300 ccatatgaag aggccatgag tgtatcacta aaaaaagt 338
<210> <211> <212> <213> 42 480 DNA Homo sapiens
<220>
<221> mi sc. „feature
<222> (1) , . (480) we wszysktich pozycjach n
<223» n=a, c, g lub t
<400> 42
aagactggag tggtgtttgg tgccagccta ttcctgctgc tttcattgac agtattcagc 60 attgtgagog taacagccta cattgccttg gccctgctot ctgtgaccat cagctttagg 120 atatacaagg gtgtgatcca agctatccag aaatcagatg aaggccaccc attcagggca ISO tatctggaat ctgaagttgo tatatctgag gagttggttc agaagtacag taattctgct 240 cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgactta 300 gttgattctc tgaagtttgc agtgttgatg tgggtattta cctatgttgg tgccttgttC 360
PL 204 293 B1 aatggtctga cactactgat ttnggctctc attcoactcc tncaagtgtt cctggtattt 420 ntgaacggca tcnggcacag ntagatcatt atocaggact tgcaaatagg aatgtaaaga 480 <210» 43 <211> 13 <212» PRT <213» Homo sapiens <400> 43
Met Glu Asp Leu Asp Gin Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser 15 10 <210» 44 <211» 16 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 44
Lys Ile Met Asp Leu Lys Glu Gin Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly
1 5 10 15
<210» 45
<211» 19
<212» PRT
<213» Komo sapiens
<400» 45
Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn
1 5 10 15
Glu Lys Arg
<210» 46
<211» 50
<212» PRT
<213» Homo sapiens
<400» 46
Gin Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gin Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu
1 5 10 15
Ser Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala
20 25 30
Pro Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gin Pro
40 45
Ser Ser 50 <210» 47 <211» 26 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» zdegenerowane olinukleotydy zaprojektowane z sekwencji bydlęcego peptydu 1 NI220
PL 204 293 B1 <220>
<221> modyfikowana zasada <222> (1) . . . (26) we wszystkich pozycjach n <223> n= inozyna <400> 47 tcngtnggya anacngcngg yaartc 26 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> zdegenerowane oligonukleotydy zaprojektowane z sekwencji bydlęcego peptydu 1 NI220 <220>
<221> modyfikowana zasada <222> (1) . . . (23) we wszystkich pozycjach n <223> n=inozyna <400> 48 tcngcnggna gnacnggyaa ytc 23 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <2l3> Sekwencja sztuczna <220>
<223> zdegenerowane oligonukleotydy zaprojektowane z sekwencji bydlęcego peptydu 1 NI220 <220>
<221> modyfikowana zasada <222> (1),.. (25) we wszystkich pozycjach n <223> n=inozyna <400> 49 tcngtnggya anacngcggn agrtc 25 <210> 50 <211» 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> zdegenerowane oligonukleotydy zaprojektowane z sekwencji bydlęcego peptydu 1 NI220 <220> , <221> modyfikowana zasada
PL 204 293 B1 <222>
<223>
(1) ... ¢26] we wszystkich pozycjach η n=inosyna <400>
<40Q> 50 tcngtnggna gnacngcngg nagrtc <210> 51 <2łl> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> zdegenerowane olinukleotydy zaprojektowane z sekwencji bydlęcego peptydu 2 NI22O <220>
<221> modyfikowana zasada <222> (1) . . . (26) we wszystkich pozycjach n <223» n-inozyna <400> 51 garathgcng anatbcarga yggnga 26

Claims (38)

1. Oczyszczone białko, znamienne tym, że wolne jest od całego materiału mielinowego z ośrodkowego układu nerwowego, z którym jest natywnie związane i obejmuje sekwencję aminokwasową, w której ponad 90% reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej jest identycznych do reszt aminokwasowych z sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29 przy przyrównaniu.
2. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:29.
3. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi białko ssacze.
4. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi białko ludzkie.
5. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:29, w której jedna lub więcej reszt aminokwasowych w obrębie sekwencji jest konserwatywnie podstawiona innym aminokwasem o podobnej polarności, który działa jako funkcjonalny równoważnik, przy czym następuje cicha zmiana.
6. Białko według zastrz. 1 albo 5, znamienne tym, że kodowane jest przez pierwszy kwas nukleinowy, który może hybrydyzować w bardzo ostrych warunkach z drugim kwasem nukleinowym składającym się z sekwencji nukleotydowej oznaczonej SEQ ID NO:1.
7. Białko według zastrz. 1 albo 5, znamienne tym, że jest nieglikozylowane.
8. Białko według zastrz. 1, znamienne tym, że jego fragment obejmuje pierwszą sekwencję aminokwasową, w której ponad 95% reszt aminokwasowych w tej pierwszej sekwencji aminokwasowej jest identycznych z resztami aminokwasowymi drugiej sekwencji aminokwasowej przy przyrównaniu, przy czym druga sekwencja aminokwasowa składa się z sekwencji aminokwasowej aminokwasów 206-501 w sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29.
9. Białko według zastrz. 8, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową składającą się z aminokwasów 206-501 sekwencji oznaczonej SEQ ID NO:29 lub sekwencję aminokwasową oznaczoną SEQ ID NO:45.
10. Białko według zastrz. 8 albo 9, znamienne tym, że to białko jest poddane fuzji z sekwencją aminokwasową drugiego białka.
11. Białko według jednego z zastrz. 8-10, znamienne tym, że jego fragment wykazuje aktywność hamującą w oznaczeniu proliferacji fibroblastów NIH 3T3.
12. Izolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje białko określone w jednym z zastrz. 1-11.
13. Kwas nukleinowy według zastrz. 12, znamienny tym, że (a) jest zdolny do hybrydyzacji z drugim kwasem nukleinowym, przy czym drugi kwas nukleinowy składa się z sekwencji nukleotydowej
PL 204 293 B1 komplementarnej do sekwencji nukleotydowej, która koduje polipeptyd składający się z sekwencji aminokwasowej oznaczonej SEQ ID NO:29; i (b) koduje naturalnie występujące białko, które wiąże się z przeciwciałem przeciwko białku składającemu się z sekwencji aminokwasowej oznaczonej SEQ ID NO:29.
14. Kwas nukleinowy według zastrz. 13, znamienny tym, że koduje naturalnie występujące białko ludzkie.
15. Wektor do klonowania, znamienny tym, że obejmuje kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. 12 - 14, operacyjnie zwią zany z nie-natywnym promotorem.
16. Wektor według zastrz. 15, znamienny tym, że stanowi wektor ekspresyjny.
17. Rekombinowana komórka, znamienna tym, że jest transformowana kwasem nukleinowym określonym w jednym z zastrz. 12 - 14 lub wektorem określonym w jednym z zastrz. 15 i 16.
18. Komórka według zastrz. 17, znamienna tym, że jest rekombinowaną komórką prokariotyczną lub eukariotyczną.
19. Sposób wytwarzania rekombinowanego białka określonego w jednym z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że (a) hoduje się komórkę gospodarza transformowaną kwasem nukleinowym określonym w jednym z zastrz. 12 - 14 lub wektorem okreś lonym w jednym z zastrz. 15 i 16, w taki sposób, że białko kodowane przez kwas nukleinowy ulega ekspresji w komórce gospodarza; i (b) odzyskuje się wyeksprymowane białko.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako rekombinowaną komórkę stosuje się rekombinowaną komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną.
21. Białko określone w jednym z zastrz. 1 do 11, do zastosowania jako lek.
22. Sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, który hamuje wytwarzanie białka określonego w jednym z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których analizuje się produkcję białka określonego w jednym z zastrz. 1 do 11 w obecności i przy braku rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przy czym zmniejszona ekspresja białka w obecnoś ci rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego wskazuje, ż e ten rybozym lub antysensowny kwas nukleinowy hamuje ekspresję białka.
23. Zastosowanie białka określonego w jednym z zastrz. 1 do 11, do wytwarzania leku do leczenia choroby nowotworowej ośrodkowego układu nerwowego, przy czym białko lub jego fragment wykazuje aktywność w hamowaniu proliferacji komórek u podmiotu.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że chorobą nowotworową jest glejak, glioblastoma, rdzeniak, czaszkogardlak, wyściółczak, szyszyniak, hemangioblastoma, nerwiak nerwu słuchowego, skąpodrzewiak, oponiak, nerwiak niedojrzały, lub siatkówczak.
25. Zastosowanie według zastrz. 23 albo 24, znamienne tym, że podmiotem jest człowiek.
26. Przeciwciało monoklonalne, znamienne tym, że immunospecyficznie wiąże się z białkiem określonym w jednym z zastrz. 1-11.
27. Przeciwciało według zastrz. 26, znamienne tym, że stanowi przeciwciało terapeutyczne.
28. Przeciwciało według zastrz. 26 albo 27, znamienne tym, że stanowi przeciwciało ludzkie, przeciwciało chimeryczne lub jednołańcuchowe przeciwciało.
29. Przeciwciało monoklonalne określone w jednym z zastrz. 26 do 28, do zastosowania jako lek.
30. Zastosowanie przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 26 do 28, do wytwarzania leku do leczenia uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego, do indukowania regeneracji lub rozgałęziania się neuronów, lub do promowania plastyczności ośrodkowego układu nerwowego u podmiotu.
31. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał przeciwko białku określonemu w jednym z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że (a) podaje się zwierzęciu nie będącemu człowiekiem immunogenną ilość biała określonego w jednym z zastrz. 1 do 11; (b) odzyskuje się poliklonalne przeciwciała ze zwierzęcia.
32. Izolowana próbka surowicy odpornościowej, znamienna tym, że zawiera przeciwciała poliklonalne, które wiążą się immunospecyficznie z białkiem określonym w jednym z zastrz. 1 do 11.
33. Surowica według zastrz. 32, znamienna tym, że stanowi terapeutyczną surowicę odpornościową.
34. Surowica według zastrz. 32 albo 33, znamienna tym, że zawiera przeciwciała, które są przeciwciałami ludzkimi, przeciwciałami chimerycznymi lub przeciwciałami jednołańcuchowymi.
35. Surowica odpornościowa określona w jednym z zastrz. 32 do 34, do zastosowania jako lek.
PL 204 293 B1
36. Zastosowanie surowicy odpornościowej określonej w jednym z zastrz. 32 do 34, do wytwarzania leku do leczenia uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego, do indukowania regeneracji lub rozgałęziania się neuronów, lub do promowania plastyczności ośrodkowego układu nerwowego u podmiotu.
37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że podmiotem jest człowiek.
38. Sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku określonemu w jednym z zastrz. 1 do 11, znamienny tym, że:
(a) wytwarza się ciągłe linie komórkowe wytwarzające cząsteczki przeciwciał monoklonalnych immunospecyficznie wiążących się z tym białkiem lub fragmentem w hodowli, z użyciem, techniki hybrydomy, techniki triomy, techniki hybrydomy ludzkich komórek B lub techniki hybrydomy EBV, (b) wytwarza się cząsteczki przeciwciała monoklonalnego, (c) odzyskuje się przeciwciała monoklonalne z hodowli.
PL362990A 1998-11-06 1999-11-05 Oczyszczone białko i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy, wektor do klonowania, rekombinowana komórka, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało monoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy odpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych. PL204293B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10744698P 1998-11-06 1998-11-06
PCT/US1999/026160 WO2000031235A2 (en) 1998-11-06 1999-11-05 Nucleotide and protein sequences of nogo genes and methods based thereon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362990A1 PL362990A1 (pl) 2004-11-15
PL204293B1 true PL204293B1 (pl) 2009-12-31

Family

ID=22316666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362990A PL204293B1 (pl) 1998-11-06 1999-11-05 Oczyszczone białko i jego zastosowanie, izolowany kwas nukleinowy, wektor do klonowania, rekombinowana komórka, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób identyfikacji rybozymu lub antysensownego kwasu nukleinowego, przeciwciało monoklonalne, zastosowanie przeciwciała, sposób wytwarzania przeciwciał poliklonalnych, izolowana próbka surowicy odpornościowej, zastosowanie surowicy odpornościowej i sposób wytwarzania przeciwciał monoklonalnych.

Country Status (27)

Country Link
US (4) US7781188B1 (pl)
EP (3) EP2333064A1 (pl)
JP (2) JP2003531566A (pl)
KR (1) KR100728405B1 (pl)
CN (3) CN1721444A (pl)
AT (1) ATE435232T1 (pl)
AU (1) AU774367C (pl)
BR (1) BR9915137A (pl)
CA (1) CA2350395C (pl)
CY (1) CY1110679T1 (pl)
CZ (1) CZ304224B6 (pl)
DE (1) DE69941059D1 (pl)
DK (1) DK1124846T3 (pl)
ES (2) ES2529196T3 (pl)
HK (1) HK1038027A1 (pl)
HU (1) HUP0301829A3 (pl)
IL (3) IL142989A0 (pl)
MX (1) MXPA01004598A (pl)
NO (1) NO332460B1 (pl)
NZ (1) NZ511683A (pl)
PL (1) PL204293B1 (pl)
PT (1) PT1124846E (pl)
RU (3) RU2304585C2 (pl)
SK (1) SK287323B6 (pl)
TR (1) TR200700740T2 (pl)
WO (1) WO2000031235A2 (pl)
ZA (1) ZA200103714B (pl)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020072493A1 (en) * 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
PT1098972E (pt) * 1998-07-22 2010-12-14 Smithkline Beecham Ltd Proteína semelhante a proteína especificamente neuroendócrina e adnc codificante
US7781188B1 (en) 1998-11-06 2010-08-24 University Of Zurich Nucleotide and protein sequences of Nogo genes and methods based thereon
US7186530B1 (en) 2000-04-07 2007-03-06 Chiron Corporation Protein associated with cell stress response
WO2000060083A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-12 Chiron Corporation Novel protein associated with cell stress response
CZ20022438A3 (cs) * 2000-01-12 2002-10-16 Yale University Nukleová kyselina kódující receptor Nogo, izolovaný polypeptid a farmaceutický přípravek pro stimulaci růstu axonů
US7119165B2 (en) * 2000-01-12 2006-10-10 Yale University Nogo receptor-mediated blockade of axonal growth
US7049395B2 (en) 2000-05-02 2006-05-23 Yale University Anti-inflammatory compounds and uses thereof
ATE458815T1 (de) 2000-10-06 2010-03-15 Univ Yale Homologe des nogo rezeptors
GB0101312D0 (en) * 2001-01-18 2001-02-28 Glaxo Group Ltd Assay
GB0101313D0 (en) * 2001-01-18 2001-02-28 Glaxo Group Ltd Assay
AR040778A1 (es) 2002-08-06 2005-04-20 Glaxo Group Ltd Anticuerpos alterados o fragmentos funcionales que se unen a mag (glicoproteina asociada a mielina).
GB0228832D0 (en) 2002-12-10 2003-01-15 Novartis Ag Organic compound
US20060287501A1 (en) * 2002-10-31 2006-12-21 Pieris Proteolab Ag Soluble truncated polypeptides of the nogo-a protein
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment
RS54160B1 (sr) 2003-03-19 2015-12-31 Biogen Idec Ma Inc. Protein koji se vezuje za nogo receptor
TWI329649B (en) * 2003-12-22 2010-09-01 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
CA2572193A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving oligodendrocytes with sp35 based agents
KR100659820B1 (ko) 2004-11-17 2006-12-19 삼성에스디아이 주식회사 리튬 이온 이차 전지
SG157418A1 (en) * 2004-12-01 2009-12-29 Univ Singapore Nogo a protein fragments as neuronal network- interacting peptides
WO2007008732A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Yale University Compositions and methods for suppressing axonal growth inhibition
EP2238986A3 (en) 2005-07-08 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
WO2007014382A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Wyeth Compositions and methods of mutant nogo-66 domain proteins
KR20080073748A (ko) 2005-11-16 2008-08-11 노파르티스 아게 척수 손상에서의 항-ｎｏｇｏ-ａ 항체 치료를 위한바이오마커
GB0525662D0 (en) 2005-12-16 2006-01-25 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
CA2653456A1 (en) * 2006-05-24 2007-11-29 Richard Daneman Permeability of blood-brain barrier
CN101015683B (zh) * 2007-01-18 2010-07-21 复旦大学 人rtn4b蛋白在制备创伤愈合药物中的应用
BRPI0818928B1 (pt) * 2007-11-02 2021-12-07 Novartis Ag Moléculas de ligação a nogo-a isoladas, seu método de produção e seu uso, polinucleotídeo isolado, vetor e sistema de expressão, célula hospedeira isolada, e composição farmacêutica
US20090186423A1 (en) * 2007-11-22 2009-07-23 Symphogen A/S Method for Characterization of a Recombinant Polyclonal Protein
AU2009269099B2 (en) 2008-07-09 2016-03-10 Biogen Ma Inc. Compositions comprising antibodies to LINGO or fragments thereof
AU2010256880B2 (en) * 2009-06-02 2015-01-22 Opko Health, Inc. Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases
US8828390B2 (en) 2010-07-09 2014-09-09 Universitat Zurich Uses of NOGO-A inhibitors and related methods
RU2478646C1 (ru) * 2011-11-28 2013-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) Способ получения высокоаффинных поликлональных антител
JP2015518829A (ja) 2012-05-14 2015-07-06 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 運動ニューロンに関する状態の処置のためのｌｉｎｇｏ−２アンタゴニスト
EA032285B1 (ru) * 2013-08-08 2019-05-31 Глобал Био Терапьютикс, Инк. Прибор для инъекций с минимальным захватом и его использование
KR101685109B1 (ko) * 2014-12-22 2016-12-09 경북대학교 산학협력단 근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도
CA2973266A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 Biogen Ma Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
US20180015144A1 (en) * 2015-01-27 2018-01-18 Universitat Zurich Agonists of the nogo-a s1pr pathway for the treatment of glioblastoma

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) * 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
CA1173823A (en) 1980-08-26 1984-09-04 Leonard M. Hjelmeland Nondenaturing zwitterionic detergent for membrane biochemistry
EP0155433A1 (en) 1984-03-23 1985-09-25 Adriano Fontana Immunosuppressant factor
CA1341401C (en) 1984-03-23 2002-11-26 Adriano Fontana Immunosuppressant factor derived from human glioblastoma cells
EP0233838A3 (en) 1986-02-04 1990-01-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neurite-promoting factor and process for the manufacture thereof
DE68927438T2 (de) 1988-06-13 1997-03-20 American Biogenetic Sciences Verfahren zur herstellung monoklonaler antikörper mit hilfe eines keimfreien tieres
US5250414A (en) 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
CA1341050C (en) * 1988-11-04 2000-07-11 Martin E. Schwab Neurite growth regulatory factors
EP0396719B1 (en) 1988-11-04 1995-07-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
WO1993000427A2 (en) * 1991-06-24 1993-01-07 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
US5858708A (en) * 1996-08-12 1999-01-12 Bandman; Olga Polynucleotides encoding two novel human neuroendocrine-specific proteins
WO1998017687A2 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
EP1042470A2 (en) * 1997-12-30 2000-10-11 Chiron Corporation Bone marrow secreted proteins and polynucleotides
US6607879B1 (en) * 1998-02-09 2003-08-19 Incyte Corporation Compositions for the detection of blood cell and immunological response gene expression
US20020072493A1 (en) * 1998-05-19 2002-06-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Activated T cells, nervous system-specific antigens and their uses
PT1098972E (pt) 1998-07-22 2010-12-14 Smithkline Beecham Ltd Proteína semelhante a proteína especificamente neuroendócrina e adnc codificante
EP1107978A1 (en) * 1998-08-24 2001-06-20 Alphagene, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US7781188B1 (en) 1998-11-06 2010-08-24 University Of Zurich Nucleotide and protein sequences of Nogo genes and methods based thereon
WO2001036631A1 (en) * 1999-11-15 2001-05-25 Smithkline Beecham P.L.C. Human nogo-c polynucleotide and polypeptide and their uses
US20030134301A1 (en) * 2001-07-27 2003-07-17 Brooksbank Robert Alan Identification and use of molecules implicated in pain

Also Published As

Publication number Publication date
CA2350395C (en) 2014-07-08
SK6222001A3 (en) 2001-12-03
ES2529196T3 (es) 2015-02-17
CN1721444A (zh) 2006-01-18
AU1469200A (en) 2000-06-13
ES2329635T3 (es) 2009-11-27
HUP0301829A2 (hu) 2003-08-28
BR9915137A (pt) 2004-06-08
RU2009103533A (ru) 2010-11-10
NO20012223L (no) 2001-07-02
CA2350395A1 (en) 2000-06-02
CN101684155A (zh) 2010-03-31
US7781188B1 (en) 2010-08-24
ATE435232T1 (de) 2009-07-15
HUP0301829A3 (en) 2009-03-30
US20090162367A1 (en) 2009-06-25
RU2004103555A (ru) 2005-07-20
US20110086034A1 (en) 2011-04-14
CN1354755B (zh) 2010-06-02
WO2000031235A3 (en) 2000-11-09
EP2093294A1 (en) 2009-08-26
NZ511683A (en) 2004-06-25
KR100728405B1 (ko) 2007-06-13
RU2358982C2 (ru) 2009-06-20
EP1124846A2 (en) 2001-08-22
IL142989A0 (en) 2002-04-21
RU2304585C2 (ru) 2007-08-20
PT1124846E (pt) 2009-10-08
IL198027A (en) 2011-10-31
DK1124846T3 (da) 2009-10-26
RU2432364C2 (ru) 2011-10-27
US20050260616A1 (en) 2005-11-24
ZA200103714B (en) 2004-06-25
AU774367C (en) 2005-04-21
RU2001115705A (ru) 2004-03-10
EP1124846A4 (en) 2002-06-12
AU774367B2 (en) 2004-06-24
WO2000031235A2 (en) 2000-06-02
KR20020003353A (ko) 2002-01-12
DE69941059D1 (de) 2009-08-13
EP2333064A1 (en) 2011-06-15
MXPA01004598A (es) 2002-04-24
IL142989A (en) 2010-12-30
EP1124846B1 (en) 2009-07-01
CZ20011608A3 (cs) 2001-10-17
NO332460B1 (no) 2012-09-24
CN1354755A (zh) 2002-06-19
TR200700740T2 (tr) 2007-04-24
CZ304224B6 (cs) 2014-01-15
NO20012223D0 (no) 2001-05-04
CY1110679T1 (el) 2015-06-10
US7425334B2 (en) 2008-09-16
SK287323B6 (sk) 2010-07-07
PL362990A1 (pl) 2004-11-15
EP2093294B1 (en) 2014-10-29
HK1038027A1 (en) 2002-03-01
JP2012213406A (ja) 2012-11-08
JP2003531566A (ja) 2003-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7425334B2 (en) Methods of making antibodies that bind Nogo
US7118890B2 (en) Antibodies to vertebrate delta proteins and fragments
RU2131926C1 (ru) Днк-фрагмент, кодирующий нейротропный фактор мозга (bdnf), белок bdnf и способ его получения
US5229500A (en) Brain derived neurotrophic factor
JPH11507203A (ja) 脊椎動物Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列およびそれらに基づく方法

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
RECP Rectifications of patent specification