JPH11507203A - 脊椎動物Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列およびそれらに基づく方法 - Google Patents

脊椎動物Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列およびそれらに基づく方法

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JPH11507203A
JPH11507203A JP8527061A JP52706196A JPH11507203A JP H11507203 A JPH11507203 A JP H11507203A JP 8527061 A JP8527061 A JP 8527061A JP 52706196 A JP52706196 A JP 52706196A JP H11507203 A JPH11507203 A JP H11507203A
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エム． マイヤット，アンナ
アータヴァニス−ツァコナス，スピリドン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、脊椎動物のSerrate 遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらのコード化されたタンパク質のアミノ酸配列、さらには、それらの誘導体（例えば、断片）および類似体に関する。特定の実施の態様において、Serrate タンパク質はヒトタンパク質である。本発明は、さらに、Serrate タンパク質の１つ以上のドメイン（例えば、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、DSL ドメイン、システインに富むドメイン、膜貫通領域、膜結合領域、またはSerrate タンパク質の１つ以上のEGF 様のリピート、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられるが、それらに限定されるものではない）を含有する脊椎動物Serrate の断片（およびそれらの誘導体および類似体）に関する。脊椎動物のSerrate に対する抗体、その誘導体および類似体もさらに提供される。例えば組換え手段による脊椎動物のSerrate タンパク質、誘導体または類似体の製造方法も提供される。治療および診断方法および医薬組成物が提供される。具体例において、ニワトリ、マウス、アフリカツメガエルおよびヒトから単離されたSerrate 遺伝子が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 脊椎動物Serrate遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列 およびそれらに基づく方法 本発明は、補助金番号 GM 29093 およびNS 26084のもとに米国厚生省(Departm ent of Health and Human Services)から授与された政府援助金によって部分的 に成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。 １．序論 本発明は脊椎動物Serrate遺伝子およびそれらによってコードされるタンパク 質産物、ならびに上記タンパク質産物の誘導体および類似体に関する。脊椎動物 Serrateタンパク質、誘導体および抗体の作製もまた提供される。本発明はさら に治療用組成物、ならびに診断および治療方法に関する。 ２．発明の背景 ショウジョウバエにおける遺伝子分析は、複雑な発生経路を細かく調べ、そし て相互作用している遺伝子座を同定するのに極めて有用であった。しかし、遺伝 子の相互作用の下に横たわるプロセスの正確な性質を理解するには、該遺伝子の タンパク質産物の知識が必要である。 発生学的、遺伝子的および分子的証拠は、ショウジョウバエにおける外胚葉分 化の初期段階は細胞の相互作用に依存することを示している(Doe およびGoodman ，1985，Dev．Biol．111:206-219; TechnauおよびCampos-Ortega，1986，Dev．B iol．195:445-454; Vassinら，1985，J．Neurogenet．2:291-308; de la Concha ら，1988，Genetics 118:499-508; Xuら，1990，Genes Dev．4:464-475; Artava nis-Tsakonas，1988，Trends Genet．4:95-100)。突然変異分析は、外胚葉細胞 の表皮経路と神経経路の間の選択に影響を及ぼす、接合体的に(zygotically)作 用する遺伝子の小グループ（いわゆる神経形成遺伝子座）を明らかにしている(P oulson，1937，Proc．Natl．Acad．Sci．23:133-137; Lehmannら，1983，Wi lhelm Roux's Arch．Dev．Biol．192:62-74; Jurgensら，1984，Wilhelm Roux's Arch．Dev．Biol．193:283-295; Wieschausら，1984，Wilhelm Roux's Arch．D ev．Biol．193:296-307; Nusslein-Volhard ら，1984，Wilhelm Roux's Arch．D ev．Biol．193:267-282)。接合体性神経形成遺伝子座［Notch(N)、Delta(Dl)、m astermind(mam)、Enhancer of Split（E(spl)、neuralized(neu)、およびbig br ain(bib)］のいずれか１つにおけるヌル突然変異は、腹側および側面の表皮構造 を犠牲にして神経系の肥大をもたらす。この効果は、表皮前駆細胞を誤って神経 経路に入れたためであり、そしてこのことは、神経形成遺伝子機能は神経形成領 域内の細胞を神経になる運命から上皮になる運命に方向転換させるために必要で あることを暗示している。Serrateは、Notch 遺伝子座と相互作用することが可 能な遺伝子ユニットとして同定された(Xuら，1990，Genes Dev．4:464-475)。こ れらの遺伝子的および発生的考察は、以下の仮説に導いた。すなわち、神経形成 遺伝子座のタンパク質産物は、適切な表皮発生に必要な細胞相互作用機構の構成 要素として機能する、という仮説である(Artavanis-Tsakonas，S.，1988，Trend s Genet．4:95-100)。 突然変異分析はまた、神経形成遺伝子の作用は多面発現的であって、胚発生の みに限定されないことを明らかにしている。例えば、個眼、剛毛、羽根の形成（ これらもまた細胞相互作用に依存することが知られている）は神経形成突然変異 によって影響される(Morganら，1925，Bibliogr．Genet．2:1-226; Welsons，19 56，Dros．Inf．Serv．30:157-158; Preissら，1988，EMBO J．7:3917-3927; Sh ellenbargerおよびMohler，1978，Dev．Biol．62:432-446; TechnauおよびCampo s-Ortega，1986，Wilhelm Roux's Dev．Biol．195:445-454; Tomlson およびRea dy，1987，Dev．Biol．120:366-376; CaganおよびReady，1989，Genes Dev．3:1 099-1112)。 配列分析（Whartonら，1985，Cell 43:567-581; Kidd およびYoung，1986，Mo l．Cell．Biol．6:3094-3108; Vassinら，1987，EMBO J．6:3431-3440; Kopczyn skiら，1988，Genes Dev．2:1723-1735）は、神経形成遺伝子座の２つ、すなわ ちNotch およびDelta は、膜を一回貫く膜貫通タンパク質をコードしているよう に思われることを示した。Notch遺伝子は、Notch/lin-12リピートと称する、３ 個のシステインが豊富なリピートを後に従えた36個の表皮増殖因子（ＥＧＦ）に 似たタンデムなリピートを含む大きいＮ末端細胞外ドメインを有する約300 kdの タンパク質（本発明者らはこのタンパク質を示すために「Notch」という用語を 用いる）をコードしている（Whartonら，1985，Cell 43:567-581; Kidd およびY oung，1986，Mol．Cell．Biol．6:3094-3108; Yochemら，1988，Nature 335:547 -550)。Delta は、細胞外ドメイン内に９個のＥＧＦに似たリピートを有する約1 00 kdのタンパク質（本発明者らはDLZM、すなわち顕著な接合体および母体の転 写物のタンパク質産物を示すために「Delta」という用語を用いる; Kopczynski ら，1988，Genes Dev．2:1723-1735）をコードしている(Vassinら，1987，EMBO J．6:3431-3440; Kopczynskiら，1988，Genes Dev．2:1723-1735)。分子的研究 は以下の示唆をもたらした。すなわち、Notch およびDelta は、初期の発生的決 定に関与する細胞コミュニケーション作用機構の生化学的に相互作用する要素を 構成する、という示唆である(Fehonら，1990，Cell 61:523-534)。 ＥＧＦに似たモチーフは、血液凝固カスケードに関与するタンパク質を含む種 々のタンパク質に見いだされている(FurieおよびFurie，1988，Cell 53:505-518 )。特に、このモチーフは血液凝固因子ＩＸおよびＸ等の細胞外タンパク質(Rees ら，1988，EMBO J．7:2053-2061; FurieおよびFurie，1988，Cell 53:505-518) 、他のショウジョウバエ遺伝子(Knustら，1987，EMBO J．761-766; Rothbergら ，1988，Cell 55:1047-1059）、および幾つかの細胞表面受容体タンパク質、例 えばトロンボモジュリン(Suzukiら，1987，EMBO J．6:1891-1897)およびＬＤＬ 受容体(Sudhofら，1985，Science 228:815-822)に見いだされている。タンパク 質結合部位がトロンボモジュリンおよびウロキナーゼのＥＧＦリピートドメイン にマップされた(Kurosawa ら，J．Biol．Chem．263:5993-5996; Appella ら，19 87，J．Biol．Chem．262:4437-4440)。ショウジョウバエSerrate遺伝子はすでに クローン化され、特徴付けされている(1993年6月24日付けPCT 公開 WO 93/12141 )。しかし、脊椎動物Serrate遺伝子を得ようとする試みにもかかわらず、本発明 がなされるまで、いかなる脊椎動物Serrate遺伝子も入手不可能であった。 上記文献の引用は、それらの文献が本発明の先行技術であると承認したものと 解釈してはならない。 ３．発明の概略 本発明は脊椎動物Serrate遺伝子（ヒトSerrate遺伝子および他の種の関連する 遺伝子）のヌクレオチド配列、およびそれらの遺伝子によってコードされるタン パク質のアミノ酸配列、ならびにそれらの誘導体（例えば断片）および類似体に 関する。前記のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーション可能な、またはそれ に相補的な核酸もまた提供される。特定の実施態様において、前記Serrateタン パク質はヒトタンパク質である。 本発明は、機能的に活性な、すなわち全長（野性型）Serrateタンパク質に関 連する１以上の公知の機能活性を示すことができる、本発明の脊椎動物Serrate 誘導体および類似体に関する。このような機能活性は抗原性〔抗Serrate抗体に 結合する（またはSerrateと結合を競合する）能力〕、免疫原性（Serrateに結合 する抗体を生成する能力）、Notch または他のトポリズミック(toporythmic)な タンパク質またはその断片に結合する（またはSerrateと結合を競合する）能力 （「接着性」("adhesiveness")）、Serrate受容体に結合する（またはSerrateと 結合を競合する）能力を含むが、これらだけに限定されない。本明細書に使用す る「トポリズミックなタンパク質」とは、Notch、Delta、Serrate、Enhancer of Split およびDeltexのタンパク質産物、ならびに、例えばハイブリダイズする それらの遺伝子配列の能力、またはDelta、Serrate またはNotchとの相同性、ま たは表現型の相互作用を示す遺伝子の能力によって同定可能な、この相互に作用 する遺伝子ファミリーの他のメンバーのタンパク質産物を言う。 本発明はさらに、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜結合 領域、またはSerrateタンパク質の１以上のＥＧＦに似た（相同の）リピートま たはこれらの任意の組合せを含むがこれらだけに限定されない、Serrateタンパ ク質の１以上のドメインを含む脊椎動物Serrateの断片（およびそれらの誘導体 および類似体）に関する。 脊椎動物Serrateに対する抗体、その誘導体および類似体がさらに提供される 。 脊椎動物Serrateタンパク質、その誘導体および類似体の例えば組換え手段に よる作製方法もまた提供される。 本発明はまた、脊椎動物Serrateタンパク質および核酸に基づく治療および診 断方法ならびに組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物を投与するこ とによる細胞の運命、すなわち分化、の障害に対する治療を提供する。このよう な治療用化合物（本明細書では「治療剤」と呼ぶ）は、脊椎動物Serrateタンパ ク質ならびにそれらの類似体および誘導体（断片を含む）；それらに対する抗体 ；脊椎動物Serrateタンパク質、類似体または誘導体をコードする核酸；および 脊椎動物Serrateアンチセンス核酸を含む。好ましい実施態様において、本発明 の治療剤は癌状態を治療するため、または前腫瘍状態あるいは非悪性腫瘍状態か ら腫瘍状態または悪性腫瘍状態への進行を阻止するために投与される。他の特定 の実施態様において、本発明の治療剤は神経系の障害を治療するため、または組 織の再生及び修復を促進するために投与される。 １つの実施態様において、Notchおよび／またはSerrate機能に拮抗する、また はこれらを抑制する治療剤（以後「アンタゴニスト治療剤」と称する）が治療的 効果のために投与される。別の実施態様においては、Notchおよび／またはSerra te機能を促進する治療剤（以後「アゴニスト治療剤」と称する）が治療的効果の ために投与される。 Notchおよび／またはSerrateタンパク質の異常な、または望ましくないレベル の発現、または活性、または局在化を伴う細胞の運命に関する疾患、特に過剰増 殖性（例えば癌）または過少増殖性疾患は、後により詳しく記述するようにそれ らのレベルを検出することにより診断することができる。 好ましい側面において、本発明の治療剤は、Notchタンパク質またはその断片 への結合を媒介する脊椎動物Serrateの少なくとも断片（本明細書では「接着性 断片」と称する）からなるタンパク質である。 ３．１．定義 本明細書においては、何ら強調なしに遺伝子の名前によって示されるタンパク 質産物に対し、遺伝子の名前を強調したもの、つまりイタリック体にしたものは 遺伝子を表すものとする。例えば、「Serrate」はSerrate遺伝子を示すものとし 、これに対し「Serrate」はSerrate遺伝子のタンパク質産物を示すものとする。 ４．図の説明 図１。Human Serrate-1（Human Jagged-1(HJ1)としても知られている）のヌク レオチド配列（配列番号１）およびタンパク質配列（配列番号２）。 図２。ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーより単離したクローンpBS15 およびpB S3-2の配列を組み合わせてコンピュータを用いて作製したHuman Serrate-2（Hum an Jagged-2(HJ2)としても知られている）の「完全な」ヌクレオチド配列（配列 番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）。シグナル配列とＳＤＬドメインの 間のHuman Serrate-2 の部分をコードする領域には、約120 ヌクレオチドの欠失 がある。 図３。ニワトリSerrate(C-Serrate)ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５ ）。 図４。C-Serrate（シグナル配列のアミノ末端を欠く）のアミノ酸配列（配列 番号６）。シグナル配列（成熟タンパク質の予測されるアミノ末端を示す）に続 く推定上の開裂部位を矢印で示す；ＤＳＬドメインを星印で示す；ＥＧＦに似た リピート（ＥＬＲ）に破線を施してある；ＥＬＲと膜貫通ドメインの間のシステ インが豊富な領域を矢印の間に示す；そしてシグナル膜貫通ドメイン（アミノ酸 1042と1066の間）を太字で示す。 図５。キイロショウジョウバエDelta（配列番号７）およびSerrate（配列番号 ８）ならびにC-Serrate（配列番号６）のアミノ末端配列のアライメント。示さ れた領域はシグナル配列の末端からＤＳＬドメインの末端に伸びている。ＤＳＬ ドメインが示されている。３つのタンパク質全てにおいて同一のアミノ酸を四角 で囲んである。 図６。C-Serrateと比較したショウジョウバエDeltaおよびショウジョウバエSe rrateのドメイン構造を示す図。C-SerrateおよびショウジョウバエSerrateにの み存在する、ＥＧＦリピートのすぐ下流にある第２のシステインに富む領域は、 示されていない。疎水性領域を黒で示す；ＤＳＬドメインに碁盤模様を付し、そ してＥＧＦに似たリピートに平行線の陰影を付してある。 ５．発明の詳細な説明 本発明は脊椎動物Serrate遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらによって コードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する。本発明はさらに脊椎動物Serr ateタンパク質の断片および他の誘導体、および類似体に関する。このような断 片または誘導体をコードする核酸もまた本発明の範囲内にある。本発明は多数の 異なる種の脊椎動物Serrate遺伝子、およびそれらによってコードされるタンパ ク質を提供する。本発明のSerrate遺伝子は、ヒトSerrateおよび脊椎動物種にお ける関連する遺伝子（相同体）を含む。特定の実施態様において、Serrate遺伝 子およびタンパク質は哺乳動物由来である。本発明の好ましい実施態様において 、Serrateタンパク質はヒトタンパク質である。最も好ましい実施態様において 、Serrateタンパク質はHuman Serrate-1 またはHuman Serrate-2 である。上記 タンパク質および誘導体の例えば組換え法による作製が提供される。 本発明は機能的に活性な、すなわち全長（野性型）Serrateタンパク質に関連 する１以上の公知の機能活性を示すことができる、本発明の脊椎動物Serrate誘 導体および類似体に関する。このような機能活性は抗原性〔抗Serrate抗体に結 合する（またはSerrateと結合を競合する）能力〕、免疫原性（Serrateに結合す る抗体を生成する能力）、Notch または他のトポリズミックなタンパク質または その断片に結合する（またはSerrateと結合を競合する）能力（「接着性」）、S errate受容体に結合する（またはSerrateと結合を競合する）能力を含むが、こ れらだけに限定されない。本明細書に使用する「トポリズミックなタンパク質」 とは、Notch、Delta、Serrate、Enhancer of Split およびDeltexのタンパク質 産物、ならびに、例えばハイブリダイズするそれらの遺伝子配列の能力、または Delta、Serrate または Notchとの相同性、または表現型の相互作用を示す遺伝 子の能力によって同定可能な、この相互に作用する遺伝子ファミリーの他のメン バーのタンパク質産物を言う。 本発明はさらに、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜関連 領域、またはSerrateタンパク質の１以上のＥＧＦに似た（相同の）リピート、 またはこれらの任意の組合せを含むがこれらだけに限定されない、Serrateタン パク質の１以上のドメインを含む脊椎動物Serrateの断片（およびそれらの誘導 体および類似体）に関する。 Serrateに対する抗体、その誘導体および類似体がさらに提供される。 後に示すように、Serrateは発生および他の生理的プロセスにおいて、特にNot chへのリガンドとして重大な役割を果たす。この役割は、細胞の運命（分化）の 決定に関与している。特に、Serrateは中枢神経系における細胞の運命の決定に おいて主要な役割を果たすと思われる。分化および他の生理的プロセスの研究お よび操作において、本発明の核酸およびアミノ酸配列およびそれらに対する抗体 を、ヒトおよび他の種のSerrate ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量化 のために用いて、それらの発現を研究し、Serrateおよび断片および他の誘導体 および類似体を作製することができる。本発明はまた、Serrateタンパク質およ び核酸配列に基づく治療および診断方法、ならびに組成物に関する。本発明は、 本発明の治療用化合物を投与することによる細胞の運命（すなわち分化）の疾患 に対する治療を提供する。このような治療用化合物（本明細書では「治療剤」と 呼ぶ）は、脊椎動物Serrateタンパク質ならびにそれらの類似体および誘導体（ 断片を含む）；それらに対する抗体；脊椎動物Serrateタンパク質、類似体また は誘導体をコードする核酸；および脊椎動物Serrateアンチセンス核酸を含む。 好ましい実施態様において、本発明の治療剤は癌状態を治療するため、または前 腫瘍状態あるいは非悪性腫瘍状態から腫瘍状態または悪性腫瘍状態への進行を阻 止するために投与される。他の特定の実施態様において、本発明の治療剤は神経 系疾患を治療するため、または組織の再生及び補修を促進するために投与される 。 １つの実施態様において、Notchおよび／またはSerrate機能に拮抗する、また はこれらを抑制する治療剤（以後「アンタゴニスト治療剤」と称する）が治療的 効果のために投与される。別の実施態様においては、Notchおよび／またはSerra te機能を促進する治療剤（以後「アゴニスト治療剤」と称する）が治療的効果の ために投与される。 Notchおよび／またはSerrateタンパク質の異常な、または望ましくないレベル の発現、または活性、または局在化を伴う細胞の運命に関する疾患、特に過剰増 殖性（例えば癌）または過少増殖性疾患は、後により詳しく記述するようにそれ らのレベルを検出することにより診断することができる。 好ましい側面において、本発明の治療剤は、Notchタンパク質またはその断片 への結合を媒介する脊椎動物Serrateの少なくとも断片（本明細書では「接着性 断片」と称する）からなるタンパク質である。 本発明は、なかんずくマウスSerrate相同体のクローニング（第６節）、アフ リカツメガエル（カエル）Serrate相同体のクローニング（第７節）、ニワトリS errate相同体のクローニング（第８節）、およびヒトSerrate相同体である Huma n Serrate-1(HJ1)およびHuman Serrate-2(HJ2)のクローニング（第９節）を開示 する後述の実施例によって例証される。 開示を明確にするため、限定するためではないが、本発明の詳細な記述を以下 の分節に分ける。 ５．１．Serrate 遺伝子の単離 本発明は、脊椎動物Serrate核酸のヌクレオチド配列に関する。特定の実施態 様において、脊椎動物Serrate核酸は図１（配列番号１）、図２（配列番号３） 、図３（配列番号６）に示されるｃＤＮＡ配列又はそれらのコード領域、又は脊 椎動物Serrateタンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号２、４又は６の 配列を有する）を含む。 本発明は、脊椎動物Serrate配列の少なくとも８個のヌクレオチド（すなわち 、ハイブリダイズ可能な部分）からなる核酸を提供する。他の実施態様において 、核酸は脊椎動物Serrate配列の少なくとも10個の（連続した）ヌクレオチド、2 5個のヌクレオチド、50個のヌクレオチド、100個のヌクレオチド、150個のヌク レオチドまたは200個のヌクレオチド、または全長脊椎動物Serrateコード配列か らなる。本発明はまた、上記の配列とハイブリダイズ可能な、またはそれらに相 補的な核酸に関する。特定の側面において、Serrate遺伝子の少なくとも10、25 、50、100または200個のヌクレオチドまたは全コード領域に相補的な配列を含む 核酸が提供される。 特定の実施態様において、低ストリンジェンシー条件下で脊椎動物Serrate核 酸（例えば配列番号１の配列を有する）または脊椎動物Serrate誘導体をコード する核酸とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。非限定的な例としては、そ のような低ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下の通りである（Shiloお よびWeinberg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6789-6792 も参照された い）：ＤＮＡを含有するフィルターを、35% ホルムアミド、5X SSC、50 mM Tris -HCl(pH7.5)、5 mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSAおよび500 μg/ml変 性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で40℃で6 時間前処理する。同じ溶液に以下 の改変を加えて、その中でハイブリダイゼーションを実施する: 0.02% PVP、0.0 2% Ficoll、0.2% BSA、100 μg/ml サケ精子ＤＮＡ、10%(wt/vol)硫酸デキスト ラン、および5-20 X 106 cpmの32P標識プローブを用いる。ハイブリダイゼーシ ョン混合物中でフィルターを40℃で18〜20時間インキュベートし、次に2X SSC、 25 mM Tris-HCl(pH7.4)、5 mM EDTAおよび0.1% SDSを含有する溶液を用いて55℃ で1.5 時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と交換し、さらに60℃で1.5 時間イ ンキュベートする。フィルターを乾燥状態でブロットし、オートラジオグラフィ ーのため露光する。必要であれば、65〜68℃でフィルターに三回目の洗浄を施し 、フィルムに再度露光する。使用できる他の低ストリンジェンシー条件は当分野 で周知である（例えば、交差種(cross-species)ハイブリダイゼーションに用い られる条件）。 別の特定の実施態様において、高ストリンジェンシー条件下で脊椎動物Serrat e核酸とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。非限定的な例としては、その ような高ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下の通りである：ＤＮＡを含 有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを65℃で8 時間から一晩、6X S SC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BS A および500 μg/ml 変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で実施する。100 μg /ml 変性サケ精子ＤＮＡおよび5-20 X 106 cpmの32P 標識プローブを含有するプ レハイブリダイゼーション混合物中で、フィルターを65℃で48時間ハイブリダイ ズさせる。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficollおよび0.01% BSA を含有する溶液を用いて37℃で1 時間実施する。次に、オートラジオグラ フィーの前に、0.1X SSCを用いて50℃で45分間洗浄する。使用できる他の高スト リンジェンシー条件は当分野で周知である。 脊椎動物Serrateタンパク質の断片および誘導体をコードする核酸（第5.6節参 照）および脊椎動物Serrateアンチセンス核酸（第5.11節参照）がさらに提供さ れる。容易に明らかなように、本明細書に用いる「Serrateタンパク質の断片ま たは部分をコードする核酸」という表現は、Serrateタンパク質の記述された断 片または部分のみをコードする核酸をさすと解釈されるべきであって、連続した 配列としてのSerrateタンパク質の他の隣接部分をささないものとする。 他のトポリズミックタンパク質との相同領域を含む脊椎動物Serrate核酸の断 片もまた提供される。他の種のSerrateタンパク質のＤＳＬ領域（ショウジョウ バエDeltaおよびSerrateとの相同領域）もまた提供される。DeltaとSerrateの間 の保存された領域（配列番号８のSerrateアミノ酸63〜73、124〜134、149〜158 、195〜206、214〜219 および250〜259、またはＤＳＬドメインによって表され る領域、等）をコードする核酸もまた提供される。 限定するためではなく特定の例として提示される、脊椎動物Serrate遺伝子ク ローニングの特定の実施態様は以下の通りである。 発現クローニング（当分野で良く知られている技法）のため、当分野で公知の 方法により発現ライブラリーを構築する。例えば、ｍＲＮＡ（例：ヒトの）を単 離し、ｃＤＮＡを作製して、宿主細胞によって発現されうるように発現ベクター （例：バクテリオファージ誘導体）に連結し、次にこのベクターを宿主細胞に導 入する。次に、種々のスクリーニングアッセイを用いて発現されたSerrate産物 を選択することができる。１つの実施態様において、選択のために抗Serrate抗 体を用いることができる。 別の好ましい側面においては、選択に先立って、ゲノムまたはｃＤＮＡライブ ラリー中の所望の配列を増幅するためにＰＣＲが用いられる。公知のSerrate配 列を表すオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲプライマーとして用いることが できる。好ましい側面において、オリゴヌクレオチドプライマーは、SerrateとD elta の間で強い相同性を有するSerrate保存セグメント(segment)の少なくとも 一部をコードする。合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、興味の ある源（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好ましくはｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲに よって配列を増幅することができる。ＰＣＲは、例えばPerkin-Elmer Cetusサー マルサイクラーおよびTaq ポリメラーゼ(Gene AmpTM)を用いて実施することが できる。増幅されるＤＮＡは、任意の真核生物種由来のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ またはゲノムＤＮＡを含みうる。ＰＣＲ反応に用いるため、数個の異なる縮重プ ライマーの合成を選択することができる。ＰＣＲ反応を開始させる(priming)た めに用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えて、公知の Serrateヌクレオチド配列と単離される核酸相同体との間により大きい又はより 小さい度合いの核酸配列類似性をもたらすことも可能である。交差種ハイブリダ イゼーションのためには、低ストリンジェンシー条件が好ましい。同種ハイブリ ダイゼーションのためには、中程度にストリンジェントな条件が好ましい。Serr ate相同体の１セグメントを上首尾に増幅した後、このセグメントをクローン化 し、配列決定し、そして完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するための プローブとして用いることができる。次に、このクローンが、後に記述する遺伝 子の完全なヌクレオチド配列の決定、遺伝子発現の分析、および機能分析のため の遺伝子タンパク質産物の産生を可能とする。このようにして、Serrateタンパ ク質をコードするさらなる遺伝子を同定することができる。このような方法を、 後述の種々の実施例の節において例として提示する。 上記の方法は、脊椎動物Serrateのクローンを得る方法についての下記の一般 的説明を制限するものではない。 脊椎動物細胞はいずれも可能性としてSerrate遺伝子の分子クローニングのた めの核酸供給源となることができる。Serrateをコードする核酸配列はヒト、ブ タ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびにさらなる霊長類の供給源、等から 単離することができる。例えば、本発明者らはマウス、アフリカツメガエルおよ びヒトの適切な大きさの断片を、ｃＤＮＡライブラリーおよびショウジョウバエ Serrateプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡはクローン化され たＤＮＡ（例：ＤＮＡ「ライブラリー」）から当分野で公知の標準的方法により 、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または所望の細胞から精製したゲノムＤＮ Ａあるいはその断片のクローニングによって得ることができる。（例えば、Samb rookら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第２版，Cold Sprin g Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York; Glover，D.M.(編 )，1985，DNA Cloning: A Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K .， Vol．I，II 参照）。ゲノムＤＮＡから得たクローンは、コード領域に加えて調 節およびイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある。ｃＤＮＡから得たク ローンは、エキソン配列のみを含む。供給源が何であれ、遺伝子の増殖のために は、これを適切なベクター中に分子的にクローン化しなければならない。 ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローニングにおいては、ＤＮＡ断片が生成 され、そのうちのあるものが所望の遺伝子をコードしている。種々の制限酵素を 用いてＤＮＡを特定の部位で開裂することができる。または、マンガンの存在下 でDNAse を用いてＤＮＡを断片化することができる。または、例えば超音波処理 により、ＤＮＡを物理的に剪断することができる。次に、アガロースおよびポリ アクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを含むがこれらだ けに限定されない標準的技法により、直鎖状ＤＮＡ断片を大きさによって分離す ることができる。 ひとたびＤＮＡ断片を生成したならば、所望の遺伝子を含有する特定のＤＮＡ 断片の同定を種々の方法で実施することができる。例えば、（任意の種の）Serr ate遺伝子またはその特定のＲＮＡ、またはその断片（例えば細胞外ドメイン、 第5.6 節参照）が入手可能で、精製および標識することができる場合、生成され たＤＮＡ断片を標識化プローブとの核酸ハイブリダイゼーションによりスクリー ニングすることができる(Benton，W.およびDavis，R.，1977，Science 196:180; Grunstein，M．およびHogness，D.，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 72:39 61）。プローブに実質的相同性を有するＤＮＡ断片はハイブリダイズする。また 、制限酵素消化、および公知の制限地図（もしそのようなものがあるならば）に よる断片サイズの期待されるサイズとの比較によって適切な断片を同定すること も可能である。さらに、遺伝子の特性に基づいて選択を実施することができる。 または、遺伝子の発現産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセ イによって該遺伝子の存在を検出することができる。例えば、Serrateについて 公知な電気泳動における移動、等電点電気泳動挙動、加水分解消化地図、受容体 結合活性、in vitro凝集活性（「接着性」）または抗原特性に類似した、または 同一のものを有するタンパク質を産生するｃＤＮＡクローン、または適切なｍＲ ＮＡをハイブリッド選択(hybrid-select)するＤＮＡクローンを選択することが できる。Serrateに対する抗体が使用可能な場合は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イム ノソルベントアッセイ）型手順を用いて、標識化抗体を推定上のSerrate合成ク ローンと結合させることによりSerrateタンパク質を同定することができる。 Serrate遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ選択とそれに 続くin vitro翻訳によって同定することも可能である。この方法では、断片を用 いてハイブリダイゼーションにより相補的ｍＲＮＡを単離する。このようなＤＮ Ａ断片は、入手可能な、別の種（例：ヒト、ニワトリ）の精製Serrate ＤＮＡを 表してもよい。単離されたｍＲＮＡの単離された産物のin vitro翻訳産物の免疫 沈降分析または機能分析（例えば、in vitroでの凝集能；受容体との結合；後記 参照）は、ｍＲＮＡを同定し、そしてその結果、所望の配列を含む相補的ＤＮＡ 断片を同定する。さらに、Serrateタンパク質に対して特異的に誘導された固定 化抗体への細胞から単離されたポリソームの吸着により、特定のｍＲＮＡを選択 することができる。（吸着されたポリソームから）選択されたｍＲＮＡを鋳型と して用いて、放射性標識化Serrate ｃＤＮＡを合成することができる。次に、放 射性標識化ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、他のゲノムＤＮＡ 断片の中からSerrate ＤＮＡ断片を同定することができる。 SerrateゲノムＤＮＡの単離に代わるものとしては、公知の配列から遺伝子配 列それ自体を化学的に合成すること、またはSerrateタンパク質をコードするｍ ＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製すること、が含まれるが、これらだけに限定され ない。例えば、Serrate遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡを、Serra teを発現する細胞から単離することができる。他の方法も可能であり、それらは 本発明の範囲内にある。 次に、同定され単離された遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入するこ とができる。当分野で公知の多数のベクター-宿主系が使用できる。使用できる ベクターはプラスミドまたは改変されたウイルスを含むがそれらだけに限定され ない。また、ベクター系は用いられる宿主細胞と適合性のものでなければならな い。そのようなベクターは、ラムダ誘導体等のバクテリオファージ、PBR322また はpUC プラスミド誘導体等のプラスミドを含むがそれらだけに限定されない。ク ローニングベクターへの挿入は、例えばＤＮＡ断片を相補的付着末端を有するク ローニングベクターに連結することにより達成できる。しかし、ＤＮＡを断片化 するのに用いられた相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合は 、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変することができる。または、ヌクレオチド配 列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより所望の任意の部位を作製する ことができる。このような連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識 配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことがで きる。別の方法では、開裂したベクターおよびSerrate遺伝子をホモポリマー的 テーリング(tailing)により改変することができる。遺伝子配列の多数のコピー が生成されるように、組換え分子を形質転換、トランスフェクション、感染、エ レクトロポレーション、等により宿主細胞に導入することができる。 別の方法においては、所望の遺伝子を「ショットガン」法により適切なクロー ニングベクターに挿入した後に同定および単離することができる。クローニング ベクターに挿入する前に、例えばサイズ分画による所望の遺伝子の富化が実施で きる。 特定の実施態様において、単離されたSerrate遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成 ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子を用いた宿主細胞の形質転換は、遺伝 子の多数コピーの生成を可能とする。したがって、形質転換体を増殖させ、該形 質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、そして必要であれば単離された組換え ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる 。 本発明により提供されるSerrate配列は、天然のSerrateタンパク質に見いださ れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列、および 機能的に等価のアミノ酸を有するコードされたアミノ酸配列を包含する。これら すべてはSerrate誘導体に関する第5.6 節（後述）に記述されている。 ５．２．Serrate 遺伝子の発現 脊椎動物Serrateタンパク質またはその機能的に活性な断片または他の誘導体 （第5.6 節参照）をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわ ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する ベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、天然の脊 椎動物Serrate遺伝子および／またはそのフランキング領域によって供給するこ ともできる。種々の宿主−ベクター系を用いてタンパク質コード配列を発現する ことができる。これらは、ウイルス（例：ワクシニアウイルス、アデノウイルス 、等）によって感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例：バキュロウイルス） によって感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母等の微生物；また はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡによっ て形質転換した細菌を含むが、それらだけに限定されない。ベクターの発現要素 は、その強度および特異性において異なる。使用する宿主−ベクター系により、 多数の適切な転写および翻訳要素のうち任意のものを用いることができる。特定 の実施態様において、Serrate遺伝子の接着性部分が発現される。別の特定の実 施態様において、Human Serrate 遺伝子またはヒトSerrate遺伝子の機能的に活 性な部分をコードする配列（Human Serrate-1（HJ1）またはHuman Serrate-2（H J2）、等）が発現される。さらに別の実施態様において、細胞外ドメインを含む Serrateの断片、または他の誘導体、またはSerrateの類似体が発現される。 ＤＮＡ断片のベクターへの挿入のために以前に記述された任意の方法を用いて 、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺 伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vit ro組換えＤＮＡおよび合成技法およびin vivo組換え体（遺伝子組換え）を含み うる。Serrateタンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、 組換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主中で該Serrateタンパク質または ペプチドが発現されるように、第２の核酸配列によって調節することができる。 例えば、当分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー要素によってSerrat eタンパク質の発現を制御することができる。トポリズミックな遺伝子発現を制 御するために使用できるプロモーターは以下のものを含むがそれらだけに限定さ れ ない。すなわち、SV40初期プロモーター領域(Bernoist およびChambon，1981，N aure 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端リピートに含まれるプロモ ーター(Yamamotoら，1980，Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロ モーター(Wagnerら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1441-1445)、メタ ロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster ら，1982，Nature 296:39-42)、β-ラ クタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff ら，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 75:3727-3731)等の原核細胞発現ベクター、またはtac プロモーター(DeBoer ら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:21-25); Scientific American，198 0，242:74-94「組換え細菌由来の有用なタンパク質」をも参照; ノパリンシンセ ターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrellaら，Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス 35S ＲＮＡプロモーター(Ga rdnerら，1981，Nucl．Acids Res．9:2871)、および光合成酵素リブロースビス リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら，1984，Nature 31 0:115-120)；酵母または他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal 4プロモ ーター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセ ロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および 組織特異性を示し、トランスジェニック動物に使用されてきた下記の動物転写制 御領域：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swiftら， 1984，Cell 38:639-646; Ornitzら，1986，Cold Spring Harbor Symp．Quant．B iol．50:399-409; MacDonald，1987，Hepatology 7:425-515); 膵臓ベータ細胞 において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan，1985，Nature 315:115-122 )、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら， 1984，Cell 38:647-658; Adamesら，1985，Nature 318:533-538; Alexanderら， 1987，Mol．Cell．Biol．7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細 胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域(Lederら，1986，Cell 45:485- 495)、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら，1987，Genes and Devel．1:268-276)、肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領 域(Krumlaufら，1985，Mol．Cell．Biol．5:1639-1648; Hammerら，1987，Scien ce 235:53-58)、肝臓において活性なα 1-アンチトリプシン遺伝子制御領 域(Kelseyら，1987，Genes and Devel．1:161-171)、骨髄様細胞において活性な βグロビン遺伝子制御領域(Mogramら，1985，Nature 315:338-340; Kolliasら， 1986，Cell 46:89-94)、脳の稀突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパ ク質遺伝子制御領域(Readheadら，1987，Cell 48:703-712)、骨格筋において活 性なミオシンＬ鎖２遺伝子制御領域（Sani，1985，Nature 314:283-286）および 視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら， 1986，Science 234:1372-1378)である。 Serrate遺伝子挿入配列を有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチに よって同定することができる。すなわち、（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、 （ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入配列の発現 、である。第１のアプローチでは、挿入されたトポリズミックな遺伝子に相同な 配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって、発現ベクタ ーに挿入された外来遺伝子の存在を検出することができる。第２のアプローチで は、ベクターへの外来遺伝子の挿入によってもたらされる特定の「マーカー」遺 伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バ キュロウイルスにおける閉鎖体の形成、等）の存在または不在に基づいて、組換 えベクター／宿主系を同定および選択することができる。例えば、Serrate遺伝 子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、Serrate挿入配列を有す る組換え体はマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第３の アプローチでは、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現された外来遺伝 子産物をアッセイすることにより同定することができる。このようなアッセイは 、in vitroアッセイ系において、例えばSerrate遺伝子産物の物理的または機能 的特性（例えば、Notchとの凝集（結合）、受容体との結合、抗体との結合）に 基づくことができる。 特定の組換えＤＮＡ分子がひとたび同定され単離されたならば、当分野で公知 の幾つかの方法を用いてそれを増殖させることができる。ひとたび適切な宿主系 および増殖条件が確立されたならば、組換え発現ベクターを大量に増殖させ、調 製することができる。前に説明したように、使用できる発現ベクターは下記のベ クターまたはその誘導体を含むが、それらだけに限定されない。すなわち、２〜 ３名を挙げるならば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス等のヒトまたは 動物ウイルス；バキュロウイルス等の昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオ ファージベクター（例えばラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベ クターである。 さらに、挿入配列の発現を変調する、または所望の特定の様式で遺伝子産物を 改変しプロセシングする、宿主細胞株を選択することができる。特定のプロモー ターからの発現は、特定の誘導物質(inducer)の存在下で増大させることができ る。したがって、遺伝子工学的に作製されたSerrateタンパク質の発現を制御す ることができる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プ ロセシングおよび修飾（例えば、シグナル配列等のグリコシル化、開裂）のため の特徴的で特異的な作用機構を有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、 発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にすることが できる。例えば、細菌系における発現を用いて非グリコシル化コアタンパク質産 物を産生することができる。酵母における発現は、グリコシル化産物を産生する 。哺乳動物細胞における発現を用いて、異種哺乳動物トポリズミックタンパク質 の「天然の」グリコシル化を確実にすることができる。さらに、異なるベクター ／宿主発現系は加水分解開裂等のプロセシング反応に異なる程度の影響を及ぼし うる。 他の特定の実施態様において、Serrateタンパク質、断片、類似体、または誘 導体を融合またはキメラタンパク質産物〔ペプチド結合を介して（異なるタンパ ク質の）異種タンパク質配列に結合した上記タンパク質、断片、類似体、または 誘導体を含む〕として発現させることができる。このようなキメラ産物は、所望 のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を当分野で公知の方法により適切な コードフレーム内で相互に連結し、そして該キメラ産物を当分野で周知の方法に より発現させることにより、作製することができる。または、そのようなキメラ 産物は例えばペプチド合成機を用いて、タンパク質合成技法により作製すること ができる。 ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の両者ともクローン化し、発現させることが可 能である。 ５．３．Serrate 遺伝子産物の同定および精製 特定の側面において、本発明は脊椎動物Serrate（好ましくはヒトSerrate相同 体）、および抗原決定基を含む（すなわち、抗体によって認識されうる）、また は機能的に活性なその断片および誘導体のアミノ酸配列、ならびにそれらをコー ドする核酸配列を提供する。本明細書に用いる「機能的に活性な」物質とは、全 長（野性型）Serrateタンパク質に関連する１以上の公知の機能的活性〔例えば 、Notchまたはその一部との結合、他の任意のSerrateリガンドとの結合、抗原性 （抗Serrate抗体との結合）、等〕を示す物質をいう。 特定の実施態様において、本発明は少なくとも６アミノ酸、10アミノ酸、25ア ミノ酸、50アミノ酸、または少なくとも75アミノ酸からなる脊椎動物Serrateタ ンパク質の断片を提供する。他の実施態様において、本発明のタンパク質はSerr ateタンパク質の細胞外ドメイン、ＤＳＬドメイン、表皮増殖因子に似たリピー ト（ＥＬＲ）ドメイン、ＥＬＲの１つまたは任意の組合せ、システインに富む領 域、膜貫通ドメイン、または細胞内（細胞質）ドメイン、またはNotchに結合す る部分、または上記のものの任意の組合せを含む、または本質的にそれ（ら）か ら成る。脊椎動物Serrateタンパク質の上記領域の幾つか又は全部を欠く断片、 または断片を含むタンパク質もまた提供される。上記のタンパク質および断片を コードする核酸が提供される。 脊椎動物Serrate遺伝子配列を発現する組換え体がひとたび同定されたならば 、遺伝子産物を分析することができる。これは、該産物を放射性標識し、次にゲ ル電気泳動、イムノアッセイ、等により分析することを含む、産物の物理的また は機能的特性に基づくアッセイによって達成することができる。 Serrateタンパク質がひとたび同定されたならば、クロマトグラフィー（例え ば、イオン交換、アフィニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー） 、遠心、示差溶解性を含む標準的方法、またはタンパク質精製のための他の標準 的技法により、該タンパク質を単離し、精製することができる。機能的特性は、 任意の適切なアッセイを用いて評価することができる（第5.7 節参照）。 または、組換え体によって産生されたSerrateタンパク質がひとたび同定され たならば、組換え体に含有されているキメラ遺伝子の核酸配列から上記タンパク 質のアミノ酸配列を推定することができる。その結果、当分野で公知の標準的な 化学的方法により該タンパク質を合成することができる（例えば、Hunkapiller ，M．ら，1984，Nature 310:105-111参照）。 本発明の特定の実施態様において、組換えＤＮＡ技法により産生されたもので あれ、化学合成法により作製されたものであれ、そのようなSerrateタンパク質 は一次アミノ酸配列として図１、２または３（それぞれ配列番号２、４または６ ）に実質的に示すアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質、ならびにそ れらの断片および他の誘導体および類似体を包含するが、それらだけに限定され ない。 ５．４．Serrate 遺伝子およびタンパク質の構造 Serrate遺伝子およびタンパク質の構造を、当分野で公知の種々の方法によっ て分析することができる。 5.4.1.遺伝子分析 脊椎動物Serrate遺伝子に対応するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡを、サザ ンハイブリダイゼーション(Southern，E.M.，1975，J．Mol．Biol．98:503-517) 、ノーザンハイブリダイゼーション（例えば、Freemanら，1983，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 80:4094-4098参照）、制限エンドヌクレアーゼマッピング(Mania tis，T.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbo r，N.Y.)およびＤＮＡ配列分析を含むがこれらだけに限定されない方法によって 分析することができる。ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ；米国特許 第4,683,202、4,683,195および4,889,818号; Gyllensteinら，1988，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85:7652-7656; Ochmanら，1988，Genetics 120:621-623; Loh ら，1989，Science 243:217-220)およびその後のSerrate特異的プローブを用い たサザンハイブリダイゼーションは、種々の細胞型由来のＤＮＡ中におけるSerr ate遺伝子の検出を可能とする。ＰＣＲ以外の増幅方法もよく知られており、そ れらも採用することができる。１つの実施態様において、サザンハイブリダイゼ ーションを用いてSerrateの遺伝子的連結を確認することができる。ノーザンハ イブリダイゼーション分析を用いてSerrate遺伝子の発現を確認することができ る。種々の発生または活性状態にある種々の細胞型をSerrate発現に関して試験 することができる。そのような技法およびそれらの結果の例を後出の第６節に記 述する。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの両方についてのハイブ リダイゼーション条件のストリンジェンシーは、用いられた特定のSerrateプロ ーブに対して所望の程度の関連性を有する核酸の検出を確実にするように操作す ることができる。 制限エンドヌクレアーゼマッピングを用いてSerrate遺伝子の遺伝子構造を大 まかに決定することができる。特定の実施態様において、制限酵素による開裂を 用いて後出の図２に示す制限地図を引き出すことができる。制限エンドヌクレア ーゼ開裂によって引き出される制限地図は、ＤＮＡ配列分析によって確認するこ とができる。 ＤＮＡ配列分析は、マクサム・ギルバート法(1980，Meth．Enzyml．65:499-56 0)、サンガージデオキシ法(Sanger，F.ら，1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463)、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの使用（TaborおよびRichardson，米国特 許第4,795,699号）または自動ＤＮＡシークエネーター(例えば、Applied Biosys tems，Foster City，CA)の使用を含むが、それらだけに限定されない当分野で公 知の任意の技法により実施することができる。代表的Serrate遺伝子のｃＤＮＡ 配列は図１および２に実質的に示す配列を含み、そして後出の第９節に記述され ている。 5.4.2.タンパク質分析 Serrateタンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列からの推定により、または 例えば自動アミノ酸シークエンサーを用いた上記タンパク質の直接配列決定によ り、引き出すことができる。代表的Serrateタンパク質のアミノ酸配列は図１に 実質的に示す配列を含み、そして、アミノ酸番号30〜1219によって示される代表 的成熟タンパク質と共に後出の第９節に詳述されている。 Serrateタンパク質配列を親水性分析(Hopp，T．およびWoods，K.，1981，Proc ． Natl．Acad．Sci．USA7 8:3824)によってさらに特徴付けることができる。親水 性プロフィールを用いて、Serrateタンパク質の疎水性および親水性領域、およ びそのような領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定することができ る。 第２に、構造分析(Chou，P.およびFasman，G.，1974，Biochemistry 13:222) を実施して、特異的二次構造を取るSerrateの領域を同定することができる。 操作、翻訳、および二次構造の予測、ならびにオープンリーディングフレーム の予測およびプロッティングもまた、当分野で利用可能なコンピュータソフトウ エアプログラムを用いて達成することができる。 構造分析の他の方法もまた採用することができる。これらは、Ｘ線結晶学(Eng stom，A.，1974，Biochem．Exp．Biol．11:7-13)およびコンピュータモデリング (Fletterick，R．およびZoller，M．（編），1986，「コンピュータグラフィッ クおよび分子モデリング」，Current Communications in Molecular Biology，C old Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)を含むが、こ れらだけに限定されない。 ５．５．Serrate タンパク質およびその誘導体に対する抗体の生成 本発明によれば、脊椎動物Serrateタンパク質、その断片または他の誘導体、 またはその類似体を免疫原として用いて、そのような免疫原を認識する抗体を生 成することができる。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キ メラ、一本鎖、Fab 断片およびFab 発現ライブラリーを含むが、これらだけに限 定されない。特定の実施態様において、ヒトSerrateに対する抗体が産生される 。別の実施態様において、Serrateの細胞外ドメインに対する抗体が産生される 。別の実施態様において、Serrateの細胞内ドメインに対する抗体が産生される 。 Serrateタンパク質または誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体の 産生のために、当分野で公知の種々の方法が使用できる。特定の実施態様におい て、図１に示す配列またはそのサブ配列によってコードされるSerrateタンパク 質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を得ることができる。抗体の 産生のため、天然のSerrateタンパク質、またはその合成物、またはその誘導体 （例：断片）を注射することにより、ウサギ、マウス、ラット、等を含むがこれ らだけに限定されない種々の宿主動物を免疫感作することができる。宿主の種に よって、免疫応答を増大させるため、種々のアジュバントを用いることができる 。これらのアジュバントには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されな い。すなわち、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニ ウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール等の界面活性剤 、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニ トロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテ リウム・パルバム（Corynebacterium parvum）等の可能性として有用なヒトアジ ュバントである。 脊椎動物Serrateタンパク質配列またはその類似体に向けられたモノクローナ ル抗体の調製のため、培養されている連続的継代細胞系による抗体分子の産生を 提供する任意の技法を用いることができる。例えば、KohlerおよびMilsteinによ って最初に開発されたハイブリドーマ技法(Nature，1975，256:495-497)、なら びにトリオーマ(trioma)技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kozborら，1983 ，Immunology Today，4:72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ− ハイブリドーマ技法(Coleら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therap y，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-96)である。本発明の付加的実施態様において は、最近の技術(PCT/US90/02545)を用いて、無菌動物においてモノクローナル抗 体を産生することができる。本発明によれば、ヒト抗体が使用可能であり、そし てこれはヒトハイブリドーマ(Coteら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:2 026-2030)を用いて、またはＥＢＶウイルスを用いてin vitroでヒトＢ細胞を形 質転換して(Coleら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，pp．77-96)得ることができる。実際、本発明によれば、Serrateに特異 的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の 遺伝子と共にスプライシングすることにより「キメラ」抗体(Morrisonら，1984 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:6851-6855; Neubergerら，1984，Nature，3 12:604-608; Takedaら，1985，Nature，314:452-454)を産生するために開発され た技法を用いることができる。そのような抗体は本発明の範囲内にある。 本発明によれば、一本鎖抗体（米国特許第4,946,778号）を産生するために記 述された技法を、Serrate特異的一本鎖抗体の産生のために適合させることがで きる。本発明の付加的実施態様は、Fab 発現ライブラリー(Huseら，1989，Scien ce 246:1275-1281)の構築のために記述された技法を用いて、Serrateタンパク質 、誘導体または類似体に対し所望の特異性を有するモノクローナルFab 断片の迅 速で容易な同定を可能とする。 分子のイディオタイプを含有する抗体断片を公知の技法により生成することが できる。例えば、そのような断片は抗体分子のペプシン消化により生成されるF( ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるFa b'断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成され るFab 断片を含むが、これらだけに限定されない。 抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で公知の技法、 例えばELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）により達成することができ る。例えば、Serrateタンパク質の特定ドメインを認識する抗体を選択するため 、そのようなドメインを有するSerrate断片と結合する産物について、生成され たハイブリドーマをアッセイすることができる。脊椎動物（例：ヒト）Serrate に特異的な抗体を選択するためには、脊椎動物Serrateとの陽性結合およびショ ウジョウバエSerrateとの結合の欠如に基づいて選択することができる。別の実 施態様においては、ヒトSerrateとの結合、および他の種のSerrateとの不結合に よって選択することができる。 上記の抗体は、本発明のタンパク質配列（例えば、後出の第5.7 節参照）の局 在化と活性に関する当分野で公知の方法に、例えば診断法等においてそれらのタ ンパク質のイメージイングのため、適当な生理的サンプル中のそれらのレベルを 測定するため、に用いることができる。 Serrateタンパク質のあるドメインに特異的な抗体もまた提供される。特定の 実施態様において、SerrateのNotch結合断片に結合する抗体が提供される。 本発明の別の実施態様（後出参照）において、抗Serrate抗体および結合ドメ インを有するその断片は治療剤である。 ５．６．Serrate タンパク質、誘導体および類似体 本発明はさらに脊椎動物Serrateタンパク質、およびSerrateタンパク質の誘導 体（断片を含むがそれだけに限定されない）および類似体に関する。脊椎動物Se rrateタンパク質誘導体およびタンパク質類似体をコードする核酸もまた提供さ れる。１つの実施態様において、Serrateタンパク質は後出の第5.1 節に記述さ れる脊椎動物Serrate核酸によってコードされる。特定の側面において、上記タ ンパク質、誘導体または類似体はカエル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、 サル、またはヒトSerrateタンパク質である。 脊椎動物Serrateに関連する誘導体および類似体の作製および使用は本発明の 範囲内にある。特定の実施態様において、上記誘導体または類似体は機能的に活 性である、すなわち全長、野性型Serrateタンパク質に関連する１以上の機能的 活性を示すことができる。１例としては、所望の免疫原性または抗原性を有する そのような誘導体または類似体は、例えばイムノアッセイにおいて、免疫感作の ため、Serrate活性の抑制のため、等に用いることができる。所望のSerrate特性 （例えば、Notchまたは他のトポリズミックなタンパク質との結合、細胞表面受 容体との結合）を保持する、またはこれを抑制する、そのような分子は、それぞ れそのような特性およびその生理的相関物の誘導物質またはインヒビターとして 用いることができる。特定の実施態様は、抗Serrate抗体によって結合されうる が、Notchタンパク質または他のトポリズミックなタンパク質と結合しないSerra te断片に関する。Serrateの誘導体または類似体は、第5.7 節に記載のアッセイ を含むがそれらだけに限定されない当分野で公知の方法によって、所望の活性に ついて試験することができる。 特に、Serrate誘導体は、機能的に等価な分子をもたらす置換、付加または欠 失によりSerrate配列を変更することによって作製することができる。ヌクレオ チドコード配列の縮重により、Serrate遺伝子として実質的に同一のアミノ酸配 列をコードする他のＤＮＡ配列が本発明の実施において使用できる。これらのＤ ＮＡ配列には以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、 配列内で機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンとの置換によっ て変更された、その結果表に現れない変化(silent change)を生じているSerrate 遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列である。同様に、本発明のSerr ate誘導体は、一次アミノ酸配列として変更された配列（配列内で機能的に等価 なアミノ酸残基が置換され、表に現れない変化を生じている）を含むSerrateタ ンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含むものを包含するが、それらだけ に限定されない。例えば、配列内の１以上のアミノ酸残基を、機能的等価物とし て作用する類似の極性を有する別のアミノ酸に置換することが可能で、これは表 に現れない変更をもたらす。配列内のアミノ酸の置換物(Substitute)は、当該ア ミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極 性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン 、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ 酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、 およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リ シンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン 酸およびグルタミン酸を含む。 本発明の特定の実施態様において、Serrateタンパク質の少なくとも10個の（ 連続した）アミノ酸からなる脊椎動物Serrateタンパク質の断片からなる、また はそれを含むタンパク質が提供される。他の実施態様において、上記断片はSerr ateタンパク質の少なくとも20個または50個のアミノ酸からなる。特定の実施態 様において、そのような断片は35、100または200アミノ酸より小さい。脊椎動物 Serrateの誘導体または類似体は、脊椎動物Serrateまたはその断片に実質的に相 同な（例えば、同じ大きさのアミノ酸配列にわたって少なくとも30% 同一）ペプ チド、またはそれをコードする核酸が脊椎動物Serrateのコード配列とハイブリ ダイズ可能であるペプチドを含むが、それらだけに限定されない。 本発明のSerrate誘導体および類似体は当分野で公知の種々の方法により作製 することができる。それらの作製をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レ ベルで起こりうる。例えば、クローン化Serrate遺伝子配列を当分野で公知の多 数の戦略のうち任意のものにより改変することができる(Maniatis，T.，1990，M olecular Cloning，A Laboratory Manual，第２版，Cold Springs Harbor Labor atory，Cold Spring Harbor，New York)。上記配列を制限エンドヌクレアーゼ を用いて適切な部位で開裂し、次に所望であればさらに酵素的に改変し、そして 単離してin vitroで連結することができる。Serrateの誘導体または類似体をコ ードする遺伝子の作製においては、改変された遺伝子が、所望のSerrate活性が コードされている遺伝子領域において、翻訳停止シグナルによって中断されるこ となく、Serrateと同じ翻訳リーディングフレーム内に確実に留まるように注意 しなければならない。 さらに、Serrateをコードする核酸配列をin vitroまたはin vivoで突然変異さ せて、翻訳開始および／または停止配列を創出および／または破壊し、またはコ ード領域に変異を創出し、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を 形成し、または既存のそのような部位を破壊し、さらなるin vitro改変を容易に することができる。当分野で公知の突然変異誘発のための任意の技法を用いるこ とができる。これらの技法は、in vitro部位特異的突然変異誘発(Hutchinson，C . 含むが、それらだけに限定されない。 Serrate 配列の操作をタンパク質レベルで実施することもできる。本発明の範 囲内に含まれるものは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド 化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または 他の細胞リガンドへの連結、その他によって、翻訳中もしくは翻訳後に異なる修 飾を受けたSerrate タンパク質断片またはその他の誘導体もしくは類似体である 。既知の手法による多数の化学的修飾のどれを実施してもよく、限定するわけで はないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアー ゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元； ツニカマイシンの存在下での代謝合成；その他が含まれる。 その他に、Serrate の類似体および誘導体を化学的に合成することもできる。 例えば、ペプチド合成装置の使用によって、所望のドメイン（第５．６．１節参 照）を含んでいる、またはin vitroで所望の凝集活性を仲介する、あるいは受容 体に結合するSerrate タンパク質の一部分に相当するペプチドを合成することが できる。さらに、所望ならば、Serrate 配列中に、置換または付加によって非古 典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を導入することもできる。非古典的ア ミノ酸として、限定するわけではないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−ア ミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン 、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン 、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、修飾アミノ酸（β−メチルアミノ酸 、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸など）が含まれる。 特定の態様において、このSerrate 誘導体は、アミノ−またはカルボキシル末 端の位置で別のタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介して結合した脊椎 動物のSerrate タンパク質または（好ましくは少なくともSerrate タンパク質の ドメインまたはモチーフ、あるいは少なくともSerrate タンパク質の10アミノ酸 からなる）それらの断片を含む、キメラ、または融合タンパク質である。一態様 において、こうしたキメラタンパク質は、このタンパク質をコードする（別のタ ンパク質をコードする配列にフレーム内連結したSerrate コード配列を含む）核 酸の組み換え発現によって製造される。こうしたキメラ産物は、当業界で既知の 方法によって、固有のコードフレーム内に所望のアミノ酸配列をコードする適当 な核酸配列同士を連結させ、当業界で通常知られた方法によってキメラ産物を発 現させることによって製造することができる。あるいはまた、例えばペプチド合 成装置の使用によるタンパク質合成技術によって、こうしたキメラ産物を製造し てもよい。特定の態様において、キメラタンパク質が発現されて、その細胞によ って成熟Serrate タンパク質に転換されるように、異種シグナル配列を有する成 熟脊椎動物Serrate タンパク質をコードするキメラ核酸を発現させる。限定する わけではないが、また別の例において、Serrate および別のトポリスミック(top orythmic)遺伝子、例えばDelta の両方をコードする部分を含む組み換え分子を 本発明にしたがって構築することができる。こうした組み換え分子中にコードさ れたタンパク質はSerrate およびDelta の両方が組み合わされた特性を示し、そ してアゴニストおよびアンタゴニストを含む新規な生物学的活性プロフィールを 表現する。また、Serrate およびDelta の一次配列はコンピュータシミュレーシ ョンを使用するこの分子の三次構造の予測に使用することもできる（Hopp and W oods,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.783824-3828）；Serrate ／Delta キメラ 組み換え遺伝子は三次構造および生物学的機能間の相関関係を参照して設計する ことができるはずである。同様に、任意の異種タンパク質をコードする配列に融 合した脊椎動物Serrate の一部分を含むキメラ遺伝子を構築することもできる。 ある特定の態様は、少なくとも10アミノ酸の脊椎動物Serrate 断片を含むキメラ タンパク質に関係するものである。 別の特定の態様において、Serrate 誘導体は別のトポリスミックタンパク質と 相同の領域を含むSerrate 断片である。第１のタンパク質のある領域を、第２の タンパク質中のこの領域に含まれるアミノ酸の数と等しい数のアミノ酸を有する ある配列に比較したとき、この領域のアミノ酸配列が、30％以上同一であるかま たは75％以上同一もしくは保存的変化に属する場合、ここではこれを“相同性” とみなすこととする。例えば、こうしたSerrate 断片として、Delta、またはDSL ドメインもしくはこれらの部分に相同な１以上の領域を含有するものがある。 誘導体および類似体のその他の特定の態様を下記の亜節および下記の実施例の 節に記載する。 ５．６．１．Serrate タンパク質の１以上のドメインを含有するSerrate誘導 体 特定の１態様において、本発明は、脊椎動物Serrate 誘導体または類似体、特 に、限定するわけではないが、細胞外ドメイン、DSL ドメイン、ELR ドメイン、 システインに富んだドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、膜結合領域、 およびSerrate タンパク質の１以上のEGF-様リピート単位（ELR）、または前記 の任意の組合せを含む、Serrate タンパク質の１以上のドメインを含むか、また はこれらからなる脊椎動物Serrate 断片および誘導体に関する。ヒトおよびヒナ ドリSerrate タンパク質に関する特定の例について、それぞれ実施例第９および ８節においてこうしたドメインが同定される。 特定の１態様において、脊椎動物Serrate の特定の断片を含む分子は、相当す るSerrate タンパク質中でショウジョウバエ(Drosophila)Serrate および／また はDelta タンパク質の特定の断片に最も相同な断片を含むものである。特定の１ 態様において、こうした分子は配列番号10、12、または18に相同なアミノ酸配列 を含むかまたはこれで構成されている。別法として、Serrate 相同体のドメイン を含む断片を第５．３．２節に記載したようなタンパク質分析法によって同定す ることができる。 ５．６．２．トポリスミックタンパク質ドメインへの結合を仲介するSerrate 誘導体 本発明はまた、トポリスミックタンパク質への結合を仲介する（そしてここで はこれらを“接着性”と称する）脊椎動物Serrate 断片、およびこうした断片の 類似体または誘導体、ならびにこれらをコードする核酸配列を提供する。 特定の１態様において、Serrate の接着性断片は、ショウジョウバエSerrate 配列のほぼ第85-283番目または第79-282番目のアミノ酸に最も相同なSerrate の 部分を含むものである（PCT 公報、国際公開公報第93/12141号、1993年６月24日 付、参照）。 特別の１態様において、Serrate タンパク質の接着性断片はDSL ドメインまた はその部分を含んでいる。Notch への結合を仲介するDSL ドメイン内のサブ断片 を、欠失性変異体を発現する構築物の分析によって同定することができる。 トポリスミックタンパク質（好ましくはNotch）への結合能力は、こうしたト ポリスミックタンパク質を発現する細胞およびSerrate またはSerrate 誘導体を 発現する細胞を使用したinv itroでの凝集アッセイによって、証明することがで きる（第５．７節参照）。すなわち、あるSerrate 断片のNotch タンパク質への 結合能力は、第１の細胞の表面に発現されたSerrate 断片の、第２の細胞の表面 に発現されたNotch タンパク質への結合能力で証明することができる。 こうしたアッセイにおいて使用するための、トポリスミックタンパク質または その接着性ドメインをコードする核酸配列は、霊長類供給源と同様にヒト、ブタ 、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、または昆虫、ならびに既知のトポリスミック 遺伝子の相同体が同定される他のどんな種からも単離することができる。 ５．７．Serrate タンパク質、誘導体および類似体のアッセイ 脊椎動物Serrate タンパク質、誘導体および類似体の機能的活性を各種の方法 によってアッセイすることができる。 例えば、抗Serrate 抗体に結合する、またはこの結合について野性型Serrate と競合する能力をアッセイする場合の１態様において、当業界で既知の各種のイ ムノアッセイを使用することができ、これらには、限定するわけではないが、ラ ジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、“サンド イッチ”イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散ア ッセイ、（例えば金コロイド、酵素または放射性同位元素標識を使用した）in s itu イムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲ ル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、 タンパク質Ａアッセイ、免疫電気泳動アッセイその他などの技術を使用する競合 および非競合アッセイシステムが含まれる。１態様において、抗体の結合を一次 抗体上の標識を検出することによって検出する。別の態様においては、一次抗体 に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって、一次抗体を検出す る。さらに別の態様においては、二次抗体を標識する。イムノアッセイにおける 結合を検出するための多くの手段が当業界で知られており、これらは本発明の範 囲内に含まれる。 トポリスミックタンパク質、例えばNotch への結合を仲介する能力をアッセイ する別の態様において、1993年６月24日付のPCT 公報、国際公開公報第93/12141 号に記載されているものなどのin vitro凝集アッセイを実施することができる（ Fehon ら、1990,Cell 61:523-534；Rebay ら、1991,Cell 67:687-699をも参照） 。 Serrate に対する受容体を同定する別の態様において、受容体の結合を例えば 当業界で周知の手段によってアッセイすることができる。別の態様において、Se rrate 受容体を発現する細胞に対するSerrate の結合の生理学的相関性（シグナ ル形質導入）をアッセイすることができる。 別の態様における、昆虫またはその他のモデルシステムにおいて、野性型脊椎 動物Serrate の誘導体または類似体であるSerrate 変異体の表現型の影響を調べ るための遺伝学的研究を実施することができる。 その他の方法は当業者が知ることができるであろうし、それらは本発明の範囲 内に含まれる。 ５．８．治療上の用途 本発明は、本発明の治療用化合物の投与による細胞死または分化の障害の治療 を提供する。こうした治療用化合物（ここでは、“治療剤(Therapeutics)”と称 する）には以下のものが含まれる；脊椎動物Serrate タンパク質ならびにその類 似体および誘導体（断片を含む）（例えばここに上記したもの）；（ここに上記 したような）それらに対する抗体；脊椎動物Serrate タンパク質、類似体または 誘導体（例えばここに上記したもの）をコードする核酸；およびSerrate アンチ センス核酸。上述したように、本発明のアンタゴニスト治療剤は脊椎動物Serrat e の機能および／またはNotch の機能（Serrate はNotch の１リガンドであるか ら）に対してアンタゴニスト作用または阻害をする治療剤である。こうしたアン タゴニスト治療剤は（例えばショウジョウバエにおける）遺伝学的アッセイも利 用することができるが、最も好ましくは既知の通常のin vitroアッセイ、例えば Serrate の別のタンパク質（例えばNotch タンパク質）への結合を阻害する、ま たは好ましくはin vitroでまたは細胞培養物中でアッセイされる任意の既知のNo tch またはSerrate の機能を阻害する能力に基づくものを使用することによって 、同定される。好ましい態様において、アンタゴニスト治療剤はNotch への結合 を 仲介するSerrate の断片などの機能的に活性な断片を含むタンパク質またはその 誘導体、もしくはそれらに対する抗体である。別の特定の態様において、こうし たアンタゴニスト治療剤はNotch に結合するSerrate の断片を含む分子を発現す ることができる核酸、またはSerrate アンチセンス核酸（本文の第５．11節参照 ）である。特定の治療剤の効果および罹病した組織の治療にとってその投与が必 要かどうかを判定するために、好ましくは下記のような適当なin vitroまたはin vivo アッセイを利用すべきであることを留意すべきである。なぜならば、組織 の罹病の進行経過によってアンタゴニストまたはアゴニスト治療剤のどちらが必 要とされるかが決まるからである。 さらに、投与の様式、例えばSerrate タンパク質または誘導体を可溶性形状で 投与するか、またはSerrate タンパク質の細胞内組み換え発現のためのこれをコ ードする核酸を介して投与するか、はそれがアゴニストまたはアンタゴニストの どちらで作用するかに影響を与える。 本発明の別の態様において、相同的組み換えによるSerrate の不活性化を促進 するために、アンタゴニスト治療剤として、脊椎動物Serrate 遺伝子の一部分を 含有する核酸を使用する（Koller and Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935；Zijlstraら、1989,Nature 342:435-438）。 上記のような本発明のアゴニスト治療剤はSerrate の機能を促進する。こうし たアゴニスト治療剤として、限定するわけではないが、Serrate への結合を仲介 するNotch の一部分を含むタンパク質および誘導体、ならびにこれらをコードす る核酸（これらがコードしている産物をin vivo で発現するように投与すること ができる）が含まれる。 本発明の治療剤のその他の記述および供給源は本文の第５．１節から第５．７ 節に見られる。 所望のSerrate 特性、例えばNotch への結合、細胞内リガンドへの結合、を保 持、あるいは阻害する分子は、こうした特性およびその生理学的相関物のそれぞ れ誘発剤または阻害剤として治療のために使用することができる。特定の１態様 において、Notch に結合する脊椎動物Serrate の一部分の配列を含有するペプチ ド（例えば第10−50番目または第15−25番目のアミノ酸；特に約10，15，20また は25アミノ酸）をNotch 機能にアンタゴニスト作用させるために使用する。特定 の１態様において、Notch の発現の増加に関連するヒトまたはその他の悪性腫瘍 （例えば、子宮頚ガン、結腸ガン、乳ガン、扁平腺ガン（下記参照））の治療ま たは予防のためにこうしたアンタゴニスト治療剤を使用する。限定するわけでは ないが、下記の実施例に記載するアッセイを含む、当業界で既知の操作法によっ て、Serrate の誘導体または類似体の所望の活性を試験することができる。例え ば、欠失変異体を発現させ、いくつかの方法（例えばinvitro 細胞凝集アッセイ 、相互作用トラップシステム）の中のいずれかによって発現産物のNotch への結 合をアッセイすることによって、Notch EGF-リピート単位（ELR）11および12に 結合し、DSLドメインよりも小さな脊椎動物Serrate 断片を含む分子を得て、選 択することができる。これらの方法のいくつかを下記の実施例の節に記載する。 特定の１態様において、所望の活性を有するペプチドを選択するために、ペプチ ドライブラリーをスクリーニングすることができる。こうしたスクリーニングは 、例えばNotch またはNotch ELR 11および12反復単位を含有する分子に対する結 合に関するアッセイによって実施することができる。 本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト治療剤は細胞死の障害に対する治療 上の有用性を有する。アゴニスト治療剤は以下の障害において治療用に（予防上 も含んで）投与される；（１）Notch またはSerrate 機能の欠落または（正常ま たは所望の数値に対する）減少が関与する疾病または障害、例えば、Notch また はSerrate タンパク質が欠失、遺伝的欠損、生物学的に不活性または過少活性、 もしくは過少発現である患者；および（２）in vitro（またはin vivo）アッセ イ（下記参照）がSerrate アゴニストの投与の有用性を示す疾病または障害。No tch またはSerrate 機能の欠落または減少は、例えば患者の組織のサンプルを（ 例えば生検組織から）取り、発現されたNotch またはSerrate タンパク質のタン パク質量、構造および／または活性についてこれをin vitroでアッセイすること によって、容易に検出することができる。当業界で標準的な多くの方法をここで 使用することができる。これらとして限定するわけではないが、Notch またはSe rrate タンパク質の検出および／または可視化のためのイムノアッセイ（例えば ウェスタンブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳 動による免疫沈降、免疫細胞化学、その他）、および／または、Notch またはSe rrate ｍＲＮＡをそれぞれ検出および／または可視化することによってNotch ま たはSerrate の発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば ノーザンアッセイ、ドットブロットin situ ハイブリダイゼーション、その他） が含まれる。 ある特定のアゴニスト治療剤またはアンタゴニスト治療剤の投与が必要とされ るかどうかを判定するために使用することができるin vitroアッセイには、患者 の組織サンプルを培養して増殖させて、治療剤に暴露するかまたは別の方法でこ れを投与し、組織サンプルに対するその治療剤の効果を観察する、in vitro細胞 培養アッセイが含まれる。患者が悪性腫瘍を有している１態様において、この悪 性腫瘍からの細胞サンプルをプレートにとり、培養して増殖させて、その後この 細胞を治療剤に暴露する。悪性腫瘍細胞の生存または増殖を（例えば終末分化を 促進することによって）阻害する治療剤をin vivo の治療用に選択する。こうし た生存および／または増殖を評価するために、当業界で標準的な多くのアッセイ を使用することができる。；例えば、細胞の増殖を、3Ｈ-チミジンの取り込みの 測定、細胞数の直接の計測、プロトオンコジーン（例えばfoc,myc）などの既知 の遺伝子の転写活性または細胞周期マーカーの変化の検出によってアッセイする ことができる。；細胞の生存度はトリパンブルー染色によって評価することがで き、分化は形態学その他における変化を基礎として視覚的に評価することができ る。特定の場合には、悪性腫瘍細胞培養物を（１）アゴニスト治療剤、および（ ２）アンタゴニスト治療剤に別々に暴露する。アッセイの結果によってどちらの 型の治療剤が治療効果を有するかが示される。 別の１態様において、それぞれ高または低増殖性障害を有する、または有する と推定される組織からの患者の細胞サンプルに対して所望の効果、細胞増殖の阻 害または促進を示す治療剤が有用なものとして示される。こうした高または低増 殖性障害には、限定するわけではないが、下記の第５．８．１節から第５．８． ３節に記載されたものが含まれる。 もう一つの特定の実施態様において、神経損傷または神経系変性障害の治療に 使用するための治療薬が提示されているが、該治療薬は、in vitroでの神経再生 の促進／罹患した患者タイプの神経細胞からの神経突起の伸展を呈する。 更に、NotchまたはSerrate優位活性化表現型（「機能獲得」突然変異）が関与 することが判明または知られている疾患または障害において、本発明の拮抗治療 薬の投与もまた提示されている。NotchまたはSerrate優位陰性表現型（「機能損 失」突然変異）が関与することが判明または知られている疾患または障害におい て、本発明の作用治療薬の投与が提示されている。hsp70熱ショックプロモータ ーならびに眼特異的プロモーターの下で一連のドロゾフィラNotch欠失突然変異 体を異所的に発現することによって、Notchタンパク質の種々の構造ドメインの 機能をin vivoで調べた（Rebay ら.，1993，Cell 74:319-329 を参照されたい） 。2つのクラスの優位表現型、すなわち、Notch機能損失突然変異を示すもの、お よびNotch機能獲得突然変異を示すものが観測された。ほとんどの細胞外配列が 欠損したタンパク質の過剰発現により優位「活性化」表現型を生じ、一方、ほと んどの細胞内配列が欠損したタンパク質の過剰発現により優位「陰性」表現型を 生じた。これらの結果から次のことを示唆された。すなわち、Notchは受容体（ この受容体の細胞外ドメインはリガンド結合を媒介する）として機能し、その結 果、細胞質ドメインは発生シグナルを伝達することが示唆された。本発明者らは 、SerrateがNotch ELR 11および12に結合することを明らかにした（PCT公開第WO 93/12141号を参照されたい）。 種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する細胞タイプの代表的細 胞を用いてin vitroアッセイを行い、治療薬がこうした細胞タイプに所望の効果 を示すかを決定することができる。 もう1つの実施態様において、患者の組織サンプルの細胞で、前腫瘍性である との疑いのあるものを、同様に、プレーティングまたはin vitroで増殖させて、 治療薬に晒す。より正常な（すなわち、前腫瘍状態、腫瘍状態、悪性状態、また は形質転換表現型の徴候がより弱い）細胞表現型を生じる治療薬を、治療用に選 択する。当該技術分野の多くのアッセイ標準を使用して、前腫瘍状態、腫瘍状態 、または形質転換もしくは悪性表現型が存在するかを評価することができる。例 え ば、形質転換表現型に関連した特徴（in vivoでの腫瘍形成能に関連した一連のi n vitroの特徴）としては、より丸形の細胞形態、より弱い基質結合、接触抑制 の欠損、固定依存性の欠損、プラスミノーゲンアクチベータなどのプロテアーゼ の放出、糖輸送の増大、血清必要量の減少、胎児性抗原の発現、250,000ダルト ンの表面タンパク質の消失などが挙げられる（Luria ら.，1978，General Virol ogy，第3版.，John Wiley & Sons，New York pp．436-446を参照されたい）。 他の特定の実施態様において、治療される特定の患者に由来する細胞サンプル を使用するのではなく、本発明に従って、次のような細胞系統を使用して、上述 のin vitroアッセイを行うことができる。すなわち、該細胞系統が、治療もしく は予防が望まれる悪性障害、腫瘍性障害、もしくは前腫瘍性障害に由来するか、 またはそれらに関連した特徴を呈するか、あるいは作用対象となることが望まれ る神経細胞タイプもしくは他の細胞タイプに由来する場合である。 拮抗治療薬は、(1)NotchまたはSerrate機能のレベルの増大（正常または所望 のレベルと比較して）が関与する疾患または障害において、例えば、Notchまた はSerrateタンパク質が過剰発現されるか、または過剰活性である疾患または障 害において、および(2)in vitro（またはin vivo）アッセイからSerrate拮抗薬 の投与の効用があることが示唆される疾患または障害において、治療のために（ 予防のために）投与される。NotchまたはSerrate機能のレベルの増大は、上述し たような方法によりタンパク質および／またはＲＮＡを定量することによって、 容易に検出することができる。患者の組織サンプルの細胞、または適切な細胞系 統もしくは細胞型を用いたin vitroアッセイを、治療薬の効用を決定するために 上述したように実施することができる。 5.8.1.悪性疾患 拮抗治療薬または作用治療薬を介在させたときの効能について上述したように 試験することができるとともに、治療薬の効用の徴候の観察に基づいて治療する ことができる悪性または前腫瘍状態としては、以下の5.8.1および5.9.1節に記載 のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 in vitro（および／またはin vivo）で試験することができるとともに、適切 なアッセイの結果を観察し、これに基づいて本発明に従った治療が行えるタイプ の細胞を含む悪性腫瘍および関連障害としては、表1に列挙したものが挙げられ るが、これらに限定されるものではない（こうした障害の総説については、Fish man ら.，1985，Medicine，第2版.，J.B．Lippincott Co.，Philadelphia を参 照されたい）。 特定の実施態様において、上皮組織（例えば、頸部、食道、および肺の上皮組 織）の悪性疾患または異常増殖変化（例えば、化成および異形成）を治療または 予防することができる。 結腸および頸部の悪性腫瘍では、それらの非悪性組織と比べると、ヒトNotch の発現が増大する（1994年4月14日公開のPCT公開番号第WO94/07474号を参照され たい。この全体を参考として本明細書に組み入れる）。従って、特定の実施態様 において、有効量の拮抗治療薬（例えば、Notch機能と拮抗するSerrate誘導体） を投与することによって、結腸または頸部の悪性疾患または前悪性疾患の変化を 治療または予防することができる。結腸癌および頸部癌の中でNotch発現の増大 が見られるということは、多数のより癌性かつ高増殖性の状態が、アップレギュ レートされたNotchを呈することを示唆する。従って、特定の実施態様において 、Notch機能と拮抗する拮抗治療薬を投与することによって、種々の癌、例えば 、乳癌、扁平上皮腺癌、セミノーマ、および肺癌、ならびにそれらの中で生じた 前悪性疾患の変化、更に他の高増殖性障害を治療または予防することができる。 5.8.2.神経系障害 拮抗治療薬または作用治療薬を介在させたときの効能について上述したように 試験することができるとともに、治療薬の効用の徴候の観察に基づいて治療する ことができる細胞型を含む神経系障害としては、軸索の切断、ニューロンの縮小 もしくは退化、または髄鞘脱落のいずれかを生じる神経系損傷および疾患または 障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明にしたがって患 者（ヒトおよびヒト以外の哺乳類の患者を含む）の治療が可能な神経系病変とし ては、中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系の以下の病変が挙げられ るが、これらに限定されるものではない： (i)外傷性病変（物理的損傷により生じるかまたは手術に伴う病変、例えば、 神経系の一部を切断する病変または圧迫性損傷が含まれる）； (ii)虚血性病変（神経系の一部で酸素が欠乏することにより神経損傷を生じる かまたは死亡するもので、脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が 含まれる）； (iii)悪性病変（神経系関連悪性疾患または非神経系組織由来の悪性疾患のい ずれかである悪性組織によって、神経系の一部が破壊または損傷を受けたもの） ； (iv)感染性病変（感染の結果として、例えば、膿瘍によって、あるいはヒト免 疫不全ウイルス、帯状庖疹ウイルス、もしくは単純庖疹ウイルスの感染と関連し て、またはライム病、結核、梅毒と関連して、神経系の一部が破壊または損傷を 受けたもの）； (v)変性性病変（変性過程の結果として神経系の一部が破壊または損傷を受け たもので、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、また は筋萎縮性側索硬化症が含まれるが、これらに限定されるものではない）； (vi)栄養性疾患または障害に関連した病変（栄養障害または代謝異常によって 神経系の一部が破壊または損傷を受けたもので、ビタミンB12欠乏症、葉酸欠乏 症、ウェルニッケ病、たばこ性‐アルコール性弱視、マルキアファーヴァ‐ビニ ャミ病（脳梁の原発性変性）及びアルコール性小脳変性が含まれるが、これらに 限定されるものではない）； (vii)全身性疾患に関連した神経系病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、 ベル麻痺）、全身性紅斑性狼瘡、癌腫、またはサルコイドーシスが含まれるが、 これらに限定されるものではない）； (viii)毒性物質、例えば、アルコール、鉛、または特定の神経毒によって引き 起こされる病変；及び (ix)脱髄病変（脱髄疾患によって神経系の一部が破壊または損傷を受けたもの で、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシーまたは種々の病因、 進行性多病巣白質脳症、および橋中央ミエリン溶解が含まれるが、これらに限定 されるものではない）。 ニューロンの生存または分化を促進する生物活性を試験することによって、神 経系疾患の治療に有用な本発明に係る治療薬を選択することが可能である（5.8 節を参照されたい）。例えば、以下の効果のいずれかを誘発する治療薬が本発明 に有用であるが、これらに限定されるものではない： (i)培養中のニューロンの生存時間の増大； (ii)培養中またはin vivoでのニューロンの発芽の増大； (iii)培養中またはin vivoでのニューロン関連分子（例えば、運動ニューロン に関するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ ）の生成の増大； (iv)in vivoでのニューロン機能不全の徴候の増大。 こうした効果は、当該技術分野で公知のいかなる方法によっても測定することが 可能である。好ましい実施態様において、ただし、これに限定されるものではな いが、ニューロンの生存の増大は、Arakawaら（1990，J．Neurosci．10:3507-35 15）により報告された方法により測定可能であり；ニューロンの発芽の増大は、 Pestronkら（1980，Exp．Neurol．70:65-82）またはBrownら（1981，Ann．Rev． Neurosci．4:17-42）により報告された方法により測定可能であり；ニューロン 関連分子の生成の増大は、測定される分子にもよるが、バイオアッセイ、酵素ア ッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどにより測定可能であり；運動 ニューロンの機能不全は、運動ニューロン疾患の物理的症状発現、例えば衰弱、 運動ニューロン伝導速度、または機能障害を評価することにより測定可能である 。 特定の実施態様において、本発明に従って治療可能な運動ニューロン疾患とし ては、運動ニューロンおよび神経系の他のコンポーネントに影響を与える恐れの ある梗塞、感染、毒との接触、外傷、外科的損傷、変性性疾患、または悪性疾患 、ならびにニューロンに選択的に影響を及ぼす疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症 が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、更に、進行性棘筋萎縮症、 進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児および若年筋萎縮症、小児期進行性球麻 痺（ファツィオ‐ロンド症候群）、ポリオおよびポリオ後症候群、遺伝性運動感 覚ニューロパシー（シャルコー‐マリー‐トゥース病）も含まれるが、これらに 限定されるものではない。 5.8.3.組織修復および再生 本発明のもう1つの実施態様において、組織再生および修復を促進するために 、本発明の治療薬が使用される（例えば、良性異常増殖疾患の治療のために使用 されるが、これに限定されるものではない）。特定の実施態様は、肝硬変（瘢痕 が 正常な肝臓再生過程を阻害する状態）の治療、ケロイド（過形成性瘢痕）形成（ 瘢痕過程により正常の更新が妨害されて皮膚の美観が損なわれた状態）、乾癬（ 皮膚の過剰増殖および固有細胞運命決定の遅延を特徴とするよく見かける皮膚の 状態）、および禿頭症（末端分化毛包（Notchに富んだ組織）が正常に機能しな い状態）の治療に関連する。もう1つの実施態様において、本発明の治療薬を使 用して、内耳の感覚上皮の変性性疾患または外傷性疾患の治療を行う。 5.9.予防的使用 5.9.1.悪性疾患 本発明の治療薬は、腫瘍状態または悪性状態への進行を防止するために投与で きる。これには表1に列挙した疾患が対象となるが、これらに限定されるもので はない。こうした投与が行えるのは、上述したアッセイにおいて治療薬がこうし た疾患の治療または防止に有効であることが示された場合である。こうした予防 的使用が利用できるのは、上述したような腫瘍または癌へ進化することが知られ ているか、またはそうした進化の疑いのある状態のとき、具体的には、過形成、 化生、または特に異形成が関与した非腫瘍性細胞成長が起こったときである（こ うした異常成長状態の総説については、Robbins 及びAngell，1976，Basic Path ology，第2版.，W.B．Saunders Co.，Philadelphia，pp．68-79を参照されたい ）。過形成とは、組織または器官の中の細胞数の増加が関係する調節された細胞 増殖の形態のことであり、構造または機能上の有意な変化は見られない。1つだ け例を挙げると、子宮内膜過形成は、しばしば子宮内膜癌へ進行する。化生とは 、成人細胞（すなわち十分に分化した細胞）の1つのタイプが成人細胞のもう1つ のタイプと置き換わる調節された細胞成長の形態のことである。化生は、上皮組 織細胞または結合組織細胞で起こる可能性がある。非定型性化生には、いくらか 障害を有する化生性上皮が含まれる。異形成とは、しばしば癌の前兆となるもの であり、主に上皮に見うけられる；これは非腫瘍性細胞成長の中で最も障害を有 する形態であり、それぞれの細胞の均一性および細胞の構造上の配列が失われる 。異形成細胞はしばしば異常に大きくかつ強く染色された核を有し、多形性を呈 する。異形成は、慢性的刺激または炎症が起こるの場合に特徴的に生じるも ので、頸部、呼吸経路、口腔、および胆嚢によく見うけられる。 過形成、化生、または異形成を特徴とする異常細胞成長が存在する代わりに、 またはその成長が存在することに加えて、患者の細胞サンプルがin vivoで呈す るか、またはin vitroで呈する形質転換表現型または悪性表現型のうちの1つ以 上の特徴が存在することは、本発明の治療薬を予防／治療のための投与すること が望ましいことを示唆する。先に述べたように、形質転換表現型のこうした特徴 としては、形態の変化、より弱い基質結合、接触抑制の欠損、固定依存性の欠損 、プロテアーゼの放出、糖輸送の増大、血清必要量の減少、胎児性抗原の発現、 250,000ダルトンの細胞表面タンパク質の消失などが挙げられる（形質転換表現 型または悪性表現型に関連した特徴については、同上.，pp．84-90をも参照され たい）。 特定の実施態様において、白斑症、上皮の外観上良性の過形成または異形成疾 患、またはボーエン病、in situ癌は、予防的介入が望ましいと考えられる前腫 瘍性疾患である。 もう1つの実施態様において、線維嚢胞病（嚢胞性過形成、乳房異形成、特に 腺疾患（良性上皮過形成））は、予防的介入が望ましいと考えられる。 他の実施態様において、悪性疾患に対する以下の素因のうちの1つ以上を呈す る患者を、有効量の治療薬の投与により治療する。その要因とは次の通りである ：悪性疾患に関連した染色体転座（例えば、慢性骨髄性白血病に対するフィラデ ルフィア染色体、濾胞性リンパ腫に対するt(14;18)など）、家族性ポリープ症ま たはガードナー症候群（結腸癌の恐れのある前兆）、良性単一クローン性高ガン マグロブリン血症（多発性骨髄腫の恐れのある前兆）、およびメンデル型（遺伝 的）継承様式を示す癌または前癌性病（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガー ドナー症候群、遺伝性外骨腫症、多内分泌腺腫症、アミロイド生成を伴う髄甲状 腺癌および褐色細胞腫、ポッツ‐ジェガース症候群、フォン・レックリングハウ ゼンの神経線維腫病、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内性黒色 癌、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調症、チェディアック‐東症候群、白子 症、ファンコーニ再生不良性貧血、並びにブルーム症候群；Robbins 及び Angel l，1976，Basic Pathology，第2版.，W.B．Saunders Co.，Philadelphia，pp. 112-113を参照されたい）の者と1親等の関係。 もう1つの特定の実施態様において、本発明の拮抗治療薬をヒト患者に投与し て、乳癌、結腸癌、または子宮頚癌への進行を防ぐ。 5.9.2.他の障害 他の実施態様において、本発明の治療薬を投与して、5.8.2.節に記載の神経系 障害または5.8.3.節に記載の他の障害（例えば、肝硬変、乾癬、ケロイド、禿頭 症）を防ぐことができる。 5.10.治療または予防の効用の実証 本発明の治療薬をin vivoで試験して、所望の治療活性または予防活性を調べ ることができる。例えば、こうした化合物を好適な動物モデル系で試験してから ヒトにおいて試験することができる。好適な動物としては、ラット、マウス、ニ ワトリ、ウシ、サル、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されるものでは ない。in vivo試験に対しては、ヒトに投与する前に、当該技術分野で公知のい かなる動物モデル系を使用してもよい。 5.11.Serrate発現のアンチセンス調節 本発明は、脊椎動物Serrateまたはその一部をコードする遺伝子またはcＤＮＡ に対してアンチセンスである少なくとも6個または少なくとも10個のヌクレオチ ドの核酸の治療または予防への使用を提供する。本明細書中で使用される「アン チセンス」とは、ある種の配列相補性によって脊椎動物Serrate ＲＮＡ（好まし くはmＲＮＡ）の一部とハイブリッドを形成することが可能な核酸を意味する。 こうしたアンチセンス核酸は、本発明の拮抗治療薬としての効用を有し、セクシ ョン5.8およびそのサブセクションに既に記載したような障害の治療または予防 に使用することができる。 本発明のアンチセンス核酸は、細胞に直接投与することができるか、または外 来導入配列の転写によって細胞内で生成させることができる、二本鎖または一本 鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそれらの修飾体もしくは誘導体であるオリゴヌ クレオチドであってもよい。 特定の実施態様において、本発明により提供されるSerrateアンチセンス核酸 は、腫瘍または他の障害（ただし、これらの腫瘍タイプまたは障害の細胞がSerr ate遺伝子またはNotch遺伝子を発現することを（in vitroまたはin vivoで）実 証することができるもの）の治療に使用することができる。これはＲＮＡまたは タンパク質を検出することにより実証が可能である。 本発明は更に、以下のセクション5.12に記載されているように、医薬品として 許容しうる担体中に有効量の本発明のSerrateアンチセンス核酸を含む医薬用組 成物を提供する。また、本発明の医薬用組成物の投与を含む、障害（例えば、セ クション5.8および5.9に記載の障害）の治療および予防の方法が提供される。 もう1つの実施態様において、本発明は、原核細胞または真核細胞中でのSerra te核酸配列の発現を抑制する方法に関する。この方法には、本発明のアンチセン ス脊椎動物Serrate核酸を含む有効量の組成物を細胞に供給することが含まれる 。 Serrateアンチセンス核酸およびそれらの使用については、以下で詳細に説明 する。 5.11.1.脊椎動物Serrateアンチセンス核酸 脊椎動物Serrateアンチセンス核酸は、少なくとも6個のヌクレオチド、好まし くはオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの数の好ましい範囲は10個〜約50 個である）から成る。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、Serrate遺 伝子に対してアンチセンスである少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15 個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、または少なくとも200個の ヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮ ＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体 であってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはホスフェート 主鎖を修飾してもよい。オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の追加基、 あるいは細胞膜（例えば、Letsinger et al.，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U .S.A．86:6553-6556; Lemaitre et al.，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．8 4:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公開第WO88/09810号を参照されたい）もし くは血液脳関門（例えば、1988年4月25日公開のPCT公開第WO89/10134号を参照さ れたい）を通過する輸送の促進剤、ハイブリダイゼーションに起因する開裂剤（ 例えば、Krol et al.，1988，BioTechniques 6:958-976を参照されたい）、また はインターカレート剤（例えば、Zon，1988，Pharm．Res．5:539-549を参照され たい）が含まれていてもよい。 本発明の好ましい態様において、脊椎動物Serrateアンチセンスオリゴヌクレ オチド（好ましくは一本鎖ＤＮＡ）が提供される。最も好ましい態様において、 こうしたオリゴヌクレオチドには、Serrate（最も好ましくはヒトSerrate同族体 ）のSH3結合ドメインまたはNotch結合ドメインをコードする配列に対してアンチ センスである配列が含まれる。オリゴヌクレオチドの構造の任意の位置を、当該 技術分野で一般的に知られた置換基を用いて修飾してもよい。 Serrateアンチセンスオリゴヌクレオチドには、5-フロオロウラシル、5-ブロ モウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチ ン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボ キシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウ ラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イ ソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグ アニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシ トシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5- メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メ トキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソ ペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイド ウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオ ウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチル エステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ -3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンか ら選ばれる少なくとも1つの修飾された塩基部分が含まれていてもよい。 別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロア ラビノース、キシルロース、およびヘキソースから成る群より選ばれる少なくと も1つの修飾された糖部分を含むが、糖部分がこれらに限定されるものではない 。 更に別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホ スホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジ アミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびこれら のホルムアセタールまたは類似体から成る群より選ばれる少なくとも1つの修飾 されたホスフェート主鎖を含む。 更に別の実施態様において、オリゴヌクレオチドはα-アノマーオリゴヌクレ オチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ-単位とは異なり鎖 が互いに平行に走る相補ＲＮＡと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（ Gautier et al.，1987，Nucl．Acids Res．15:6625-6641）。 オリゴヌクレオチドは他の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション に起因する架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションに起因する開裂剤など）と コンジュゲートしてもよい。 本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の標準的な方法で、例え ば、ＤＮＡ自動合成装置（例えば、Biosearch、Applied Biosystemsなどから市 販されている装置）を用いて合成することが可能である。例として、ホスホロチ オエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法で合成可能であり（1988，Nucl ．Acids Res．16:3209）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調節され た細孔のガラスポリマー担体を使用して調製可能である（Sarin et al.，1988， Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:7448-7451）。 特定の実施態様において、Serrateアンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒 ＲＮＡすなわちリボザイムを含む（1990年10月4日公開のPCT国際公開第WO90/113 64；Sarver et al.，1990，Science 247:1222-1225号を参照されたい）。別の実 施態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al.，1987，Nucl．Acids Res．15:6131-6148）またはキメラＲＮＡ‐ＤＮＡ 類似体（Inoue et al.，1987，FEBS Lett．215:327-330）である。 別の実施態様において、本発明のSerrateアンチセンス核酸が、外来配列の転 写によって細胞内で生成される。例えば、ベクターをin vivoで導入し、細胞が このベクターを捕らえ、細胞内でこのベクターまたはその一部を転写し、本発明 のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成することができる。こうしたベクターには 、Serrateアンチセンス核酸をコードする配列が含まれている。このベクターは 、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成するかぎり、エピソームの状態を 保持することができるか、または染色体と一体化することができる。これらのベ クターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技法によって得ることができる 。ベクターは、哺乳類細胞中での複製および発現のために使用されるプラスミド 、ウイルス、または当該技術分野で公知の他のものであってもよい。Serrateア ンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現を、当該技術分野で公知の任意のプロ モーターを用いて行い、哺乳動物好ましくはヒトの細胞において機能させること ができる。これらのプロモーターは誘導性または構成的であってもよい。こうし たプロモーターとしては、SV40初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon， 1981，Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3'-長末端反復配列に含ま れるプロモーター（Yamamoto et al.，1980，Cell 22:787-797）、ヘルペスチミ ジンキナーゼプロモーター（Wagner et al.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U. S.A．78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al.， 1982，Nature 296:39-42）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸には、脊椎動物Serrate遺伝子、好ましくはヒトSer rate遺伝子に対して特異的なＲＮＡ転写産物の少なくとも一部と相補的な配列が 含まれる。しかしながら、絶対的な相補性が好ましいものではあるが、それが必 要というわけではない。本明細書中に記載されている「ＲＮＡの少なくとも一部 と相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリッドを形成して安定な二本鎖を形成す るのに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖Serrateアンチセンス核酸 の場合は、二本鎖ＤＮＡのうちの一本の鎖を試験するか、または三本鎖の形成を 調べてもよい。ハイブリッド形成能は、アンチセンス核酸の相補性の度合いと長 さの両方に依存する。一般的には、ハイブリッド形成する核酸が長いほど、それ に含まれるより多くの塩基がSerrateＲＮＡとの不一致を起こすが、依然として 安定な二本鎖（または三本鎖。ただし場合による）を形成する。当業者は、標 準的な手順を使用してハイブリッド化複合体の融点を測定することにより、不一 致の許容範囲を確認することができる。 5.11.2.脊椎動物Serrateアンチセンス核酸の治療上の効用 脊椎動物Serrateアンチセンス核酸を使用して、SerrateまたはNotchを発現す ることが分かっている細胞タイプの悪性疾患または他の障害を治療（または防止 ）することができる。特定の実施態様において、悪性疾患とは、頸部癌、乳癌、 もしくは結腸癌、または扁平上皮腺癌のことである。こうした発現を試験するこ とができる悪性細胞、腫瘍性細胞、および前腫瘍性細胞としては、セクション5. 8.1および5.9.1で既に記載した細胞が挙げられるが、これらに限定されるもので はない。好ましい実施態様において、一本鎖ＤＮＡアンチセンスSerrateオリゴ ヌクレオチドが使用される。 SerrateまたはNotchＲＮＡを発現する悪性（特に腫瘍）細胞タイプは、当該技 術分野で公知の種々の方法によって同定することができる。こうした方法として は、SerrateまたはNotch特異性核酸とのハイブリダイゼーション（例えば、ノー ザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、in sit u ハイブリダイゼーション）、該細胞タイプに由来するＲＮＡがin vitroでNotc hまたはSerrateに翻訳される能力の観測、イムノアッセイなどが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。好ましい実施態様において、例えば、免疫細 胞化学によるか、またはin situハイブリダイゼーションによって、治療前にNot chまたはSerrate発現に関して患者の原発性腫瘍組織を調べる。 医薬品として許容しうる担体中に有効量の脊椎動物Serrateアンチセンス核酸 を含む本発明の医薬用組成物は、NotchまたはSerrate ＲＮＡまたはタンパク質 を発現するタイプの悪性疾患を患った患者に投与することができる。 特定の障害または状態の治療に有効なSerrateアンチセンス核酸の量は、障害 または状態の特性に依存するが、標準的な臨床技術により決定することができる 。可能ならば、治療する腫瘍タイプのアンチセンス細胞毒性を、in vitroで、次 に有用な動物モデル系で測定してから、ヒトにおいて試験および使用することが 望ましい。 特定の実施態様において、脊椎動物Serrateアンチセンス核酸を含む医薬用組 成物は、リポソーム、ミクロ粒子、またはマイクロカプセルを介して投与される 。本発明の種々の実施態様において、こうした組成物を使用してSerrateアンチ センス核酸を持続的に放出することが有用である。特定の実施態様において、抗 体を介して特定の識別可能な腫瘍抗原を標的とするリポソームを利用することが 望ましい（Leonetti et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87:2448-2 451; Renneisen et al.，1990，J．Biol．Chem．265:16337-16342）。 5.12.治療／予防のための投与および組成物 本発明は、有効量の本発明の治療薬を被検者に投与することによって治療（お よび予防）を行う方法を提供する。好ましい態様において、治療薬は実質的に精 製されたものである。被検者は好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ニワトリな どの動物が含まれ、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、これら に限定されるものではない。 種々のデリバリーシステムが公知であり、これらは本発明の治療薬の投与に使 用できる。例えば、リポソーム、ミクロ粒子、マイクロカプセル中への封入、組 換え細胞による発現、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Wu and Wu，198 7，J．Biol．Chem．262:4429-4432を参照されたい）、治療薬である核酸をレト ロウイルスベクターまたは他のベクターの一部として構築することなどが使用で きる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜 外、口腔を介した経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この 化合物は、任意の便利な経路で投与してもよい。例えば、注入またはボーラス注 射によって、表皮または粘膜皮膚の内面（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および 腸粘膜など）を介した吸収によって投与してもよい。更に、この化合物を他の生 物活性薬剤と共に投与してもよい。投与は、全身的でも局所的でもよい。また、 脳室内注射および髄腔内注射などの任意の好適な経路で、本発明の医薬用組成物 を中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注射は、例えば、レザバー（オ ムヤマ・レザバーなど）に取り付けられた脳室内カテーテルを用いて容易に行え る。また、肺への投与は、例えば、吸入器または噴霧器を使用し、エアゾール剤 と共に処方することによって実施することができる。 特定の実施態様において、治療が必要な領域に本発明の医薬用組成物を局所的 に投与することが望ましい。こうした局所的投与は、例えば、外科手術中の局所 注入、局所施用（例えば、外科手術後の創傷用包帯と併用して）によって、注射 によって、カテーテルを用いて、座薬を用いて、または移植片（該移植片は、多 孔性、非多孔性、または膠状の材料から成るもので、例えば、シアラスチック(s ialastic)膜などの膜または繊維などである）を用いて行うことができるが、こ れらに限定されるものではない。1実施態様において、悪性腫瘍または腫瘍性組 織もしくは前腫瘍性組織の部位（すなわち形成部位）に直接注射を行うことによ って、投与することができる。 もう1つの実施態様において、治療薬をベシクル中に入れて、特にリポソーム に入れて送達することができる（Langer，Science 249:1527-1533(1990); Treat et al.，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，L opez-Berestein and Fidler(eds.)，Liss，New York，pp．353-365(1989); Lope z-Berestein，ibid.，pp．317-327を参照されたい；一般的な内容についてもこ れらの文献を参照されたい）。 更に別の実施態様において、制御放出システムで治療薬を送達することができ る。1実施態様では、ポンプを使用してもよい（Langer，supra; Sefton，CRC Cr it．Ref．Biomed．Eng．14:201(1987); Buchwald et al.，Surgery 88:507(1980 ); Saudek et al.，N．Engl．J．Med．321:574(1989)を参照されたい）。別の実 施態様において、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fl orida(1974); Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Pe rformance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984); Ranger and Pepp as，J．Macromol．Sci．Rev．Macromol．Chem．23:61(1983)を参照されたい；更 にLevy et al.，Science 228;190(1985); During et al.，Ann．Neurol．25:351 (1989); Howard et al.，J．Neurosurg．71:105(1989)をも参照されたい）。更 に別の実施態様において、放出制御システムを治療標的（すなわち、脳）の近傍 に配置することができる。この場合、全身用量のわずか一部が必要と なるだけである（Goodson，in Medical Applications of Controlled Release， supra，vol．2，pp．115-138(1984)を参照されたい）。 その他の放出制御システムについては、Langerの総説（Science 249:1527-153 3(1990)の中で説明されている。 治療薬が核酸であり、この核酸がタンパク質治療薬をコードする場合の特定の 実施態様において、この核酸を次のようにしてin vivoで投与し、そのコードさ れたタンパク質の発現を促進することができる。すなわち、この核酸を適切な核 酸発現ベクターの一部として構築して投与し、細胞内に取り込ませることによっ て、例えば、レトロウイルスベクターを用いて（米国特許第4,980,286号を参照 されたい）、または直接注射することによって、またはミクロ粒子衝撃（例えば 、遺伝子ガン；Dupont製Biolistic）によって、または脂質、細胞表面受容体、 もしくは移入剤を塗布することによって、または核に入り込むことが知られてい るホメオボックス様ペプチド（例えば、Joliot et al.，1991，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 88:1864-1868を参照されたい）に結合させて投与することなどによ って実施することができる。この他に、核酸治療薬を細胞内に導入し、宿主細胞 ＤＮＡ内に取り込んで相同的組換えにより発現させることができる。 個々の障害の治療または予防に関連した特定の実施態様において、以下の形態 の投与を行うのが好ましい：障害 好ましい投与形態 子宮頸癌 局所的 胃腸癌 経口；静脈内 肺癌 吸入；静脈内 白血病 静脈内；体外 転移性癌 静脈内；経口 脳癌 標的化；静脈内；髄腔内 肝硬変 経口；静脈内 乾癬 局所的 ケロイド 局所的 禿頭症 局所的 脊髄損傷 標的化；静脈内；髄腔内 パーキンソン病 標的化；静脈内；髄腔内 運動ニューロン疾患 標的化；静脈内；髄腔内 アルツハイマー病 標的化；静脈内；髄腔内 また、本発明は、医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の 治療薬及び製剤学的に許容できる担体を含む。特定の態様において、「製剤学的 に許容できる」という用語は、連邦政府又は州政府の統制機関によって認可され た、ということ又は動物、より特定的にはヒトにおける使用のための米国薬局方 もしくは他の一般的に認可された薬局方に記載された、ということを意味する。 「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形 剤又はビヒクルをいう。そのような製剤学的担体は、水及び落花生由、大豆油、 鉱油、ごま油などのような、石油、動物、植物、又は合成源由来のものを含むオ イル等の無菌液でもよい。医薬組成物が静脈内投与される場合、好ましい担体は 水である。また、生理食塩水並びに水性ブドウ糖(dextrose)及びグリセロール溶 液も、特に注射溶液用の液状担体として用いることができる。適当な製剤学的賦 形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦 芽、米、小麦、白亜(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリ ンモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロ ピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物には、所望により 少量の加湿もしくは乳化剤又はpH緩衝剤を含ませることもできる。これらの組成 物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性剤 等の剤形を取り得る。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体を 用いて坐剤として処方することができる。経口製剤としては、製剤学的グレード のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウ ムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を挙げることが できる。適当な製剤学的担体の例は、E.W.Martinによる「レミントンの薬学(Rem ington's Pharmaceutical Sciences）」に記載されている。このような組成物に は、治療上有効な量の治療薬が、好ましくは患者に適した投与剤形を提供するよ うな適量の担体とともに精製された状態で含まれる。その処方は投与様式に合わ せるのがよい。 好ましい態様においては、組成物はヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物 としてルーチン的な手順で処方される。静脈内投与用の組成物は、典型的には無 菌等張水性緩衝液に溶かした溶液である。必要ならば、組成物に可溶化剤及び注 射部位の痛みを取り除くためのリドカイン等の局所麻酔剤をも含ませることがで きる。一般的に、処方成分は、別々に、あるいは例えば凍結乾燥粉末として、又 は活性剤の量を示すアンプルもしくはサッシェ等の気密性密封容器中に入れた水 分のない濃縮液として単位剤形(unit dosage form)中に混合して提供される。組 成物を輸液によって投与する場合、組成物は無菌の製剤学的グレードの水又は生 理食塩水を含む輸液ボトルを用いて調剤され得る。組成物を注射によって投与す る場合、処方成分を投与前に混合し得るように、注射用の無菌水又は生理食塩水 のアンプルを提供することができる。 本発明の治療薬は、中性の状態又は塩の状態で処方され得る。製剤学的に許容 できる塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導される塩 のような遊離のアミノ基により形成された塩、及び水酸化ナトリウム、水酸化カ リウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピル アミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイ ン等から誘導される塩のような遊離のカルボキシル基により形成された塩が挙げ られる。 特定の障害又は病態の治療に有効である本発明の治療薬の量は、その障害又は 病態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに 、最適用量範囲を確認するのを助けるためにin vitroアッセイを任意に用い得る 。また、その処方に用いられる厳密な用量は投与経路、疾患又は障害の重篤度に も依存し、開業医の判断及び各患者の情況によって決定される。しかしながら、 静脈内投与に適した用量範囲は、一般的に、体重１kg当たり活性化合物約20〜50 0 μg である。鼻腔内投与に適した用量範囲は、約0.01pg/kg（体重）〜１mg/kg （体重）である。有効な用量はin vitro又は動物モデル試験系から得られた用量 −応答曲線から推定し得る。 坐剤には、一般的に、0.5〜10重量％の範囲の活性成分が含まれ、経口製剤に は、好ましくは10〜95％の活性成分が含まれる。 また、本発明は、本発明の医薬組成物の１以上の成分で充填された１以上の容 器を含む医薬パック又はキットも提供する。このような容器には、医薬品又は生 物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって定められたフォー ムの注意書き（この注意書きは、前記機関によるヒトへの投与のための製造、使 用又は販売の認可を示すものである）を任意に添付することができる。 5.13.診断的効用 脊椎動物Serrate タンパク質、類似体、誘導体及びその部分配列(subsequence s)、脊椎動物Serrate 核酸（及びそれと相補的な配列）、抗脊椎動物Serrate 抗 体は、診断における用途を有する。そのような分子は、Serrate 発現に影響する 種々の病態、疾患及び障害を検出し、予知し、診断し、もしくは監視するために 、又はその治療を監視するために、イムノアッセイ等のアッセイに用いることが できる。特に、そのようなイムノアッセイは、患者から得られたサンプルを免疫 特異的結合が生じ得るような条件下で抗Serrate 抗体と接触させ、その抗体によ る全特異的結合の量を検出又は測定することを含む方法によって行うことができ る。特定の態様においては、好ましくは抗Notch 抗体との結合との関連における 組織区分(tissue sections)でのそのような抗体の結合を用いて、疾患状態にお けるNotch 及び／又はSerrate の異常な局在化又は異常なレベルのNotch-Serrat e 共同局在化を検出することができる。特定の態様においては、Serrate に対す る抗体を用いて、患者の組織又は血清サンプルにおけるSerrate の存在（そのSe rrate の異常なレベルは疾患症状の指標になる。）をアッセイすることができる 。内因性Notch タンパク質におけるSerrate 結合能力の異常なレベル、又は内因 性Serrate タンパク質におけるNotch（又は他のSerrate リガンド）に対する結 合能力の異常なレベルは、細胞運命(cell fate)の障害（例えば、癌等）の指標 となり得る。「異常なレベル」とは、体の一部分由来の類似のサンプル又はその 障害を有さない被験者由来の類似のサンプル中に存在するレベル又は該レベルを 代表する標準レベルに比べて高い又は低いレベルを意味する。 使用可能なイムノアッセイとしては、少しだけ名を挙げると、ウェスタンブロ ット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、 「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降 反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線アッセ イ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイ等の技術を用いる競合及 び非競合アッセイ系が含まれるがこれらに限定されるものではない。 また、脊椎動物Serrate 遺伝子、相補配列を含む関連のある核酸配列及び部分 配列、並びにその他のトポリズミック(toporythmic)遺伝子配列も、ハイブリダ イゼーションアッセイに使用することができる。脊椎動物Serrate 核酸配列又は 少なくとも約８のヌクレオチドを含むその部分配列は、ハイブリダイゼーション プローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーションアッセイを用い て上記したようなSerrate 発現及び／又は活性における異常な変化と関連する病 態、障害又は疾患状態を検出し、予知し、診断し、又は監視することができる。 特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含むサンプルをSe rrate ＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブとハイブリダイゼ ーションが生じ得るような条件下で接触させ、結果として生じるハイブリダイゼ ーションを検出又は測定することを含む方法によって行われる。 さらに、Serrate はNotch に結合するので、脊椎動物Serrate 又はその結合部 分を用いて、例えば、結腸及び子宮頸癌のようなNotch 発現の増加を示す悪性腫 瘍のスクリーニングにおけるサンプル中のNotch の存在及び／又は量をアッセイ することができる。 ６．マウスSerrate 相同体の単離及び特性付け M-Serrate -1と称するマウスSerrate 相同体を下記のようにして単離した： マウスSerrate -1遺伝子 組織起源：10.5日齢マウス胎仔ＲＮＡ 単離法： a)上記のＲＮＡに対するｃＤＮＡをランダムプライミング b)下記を用いた上記ｃＤＮＡのＰＣＲ 増幅条件：供給バッファー50μl にｃＤＮＡ 50ng、プライマー各１μg、dNTP 's 0.2mM、Taq 1.8U(Perkin-Elmer)を入れた液、94℃／30秒、45℃／２分、72℃ ／１分で40サイクル、各サイクルを２秒延長。 両末端で配列決定された 1.8kbの断片が得られ、C-Serrate -1に相当するもの と同定された。 M-Serrate -1の部分ＤＮＡ配列： 5'末端から： 上記のタンパク質翻訳： 3'末端から（コーディング鎖を除く）： 上記のタンパク質翻訳： 発現パターン：発現パターンは、発達中の中枢神経系、末梢神経系、肢、腎臓 、水晶体、及び脈管系における発現を含む、C-Serrate -1（ニワトリSerrate） （下記の第11節参照）で観察されたものと同様であると決定された。 ７．ツメガエルSerrate 相同体の単離及び特性付け ツメガエル Serrate-1と称するツメガエルSerrate 相同体を下記のようにして 単離した： ツメガエルSerrate -1遺伝子 組織起源：神経胚期の胚ＲＮＡ 単離法： a)上記のＲＮＡに対するｃＤＮＡをランダムプライミング b)下記を用いたＰＣＲ 増幅条件：供給バッファー50μl にｃＤＮＡ 50ng 、プライマー各１μg 、dN TP's 0.2mM、Taq 1.8U(Perkin-Elmer)を入れた液、94℃／30秒、45℃／２分、72 ℃／１分で40サイクル、各サイクルを２秒延長。 部分的に配列決定されてC-Serrate -1との関係が確認された〜700bp の断片が 得られた。 ８．ニワトリ(CHICK)Serrate 相同体の単離及び特性付け 本実施例では、ニワトリSerrate 相同体C-Serrate 、並びに２つのニワトリNo tch 相同体C-Notch -1及びC-Notch -2の断片のクローニング及び配列を、初期胚 形成中のそれらの発現パターンとともに報告する。C-Serrate の転写のパターン は胚の多くの領域におけるC-Notch -1の転写のパターンと共通点があり、これは 、C-Notch-1 が、ショウジョウバエのNotch のように、Serrate の受容体である ことを示唆するものである。特に、Notch 及びSerrate は、発達中の中枢及び抹 消神経系の神経形成領域において発現する。 本発明者らのデータは、Notch の公知のリガンドであるSerrate が節足動物か らコルダートまで保存されていることを示している。共通する発現パターンは、 Notch とのその機能的な関係の保存を示唆するものであり、ニワトリの成長、特 にその中枢神経系の発達は、いくつかの特異的な位置でのC-Notch-1 とSerrate の相互作用が関与しているということを示唆する。材料及び方法 胚 白レグホンニワトリの卵をパークファーム大学(University Park Farm)から入 手し、38℃でインキュベートした。胚をHamburger 及びHamilton(1951，J．Exp ．Zool．88:49-92)にしたがって段階づけした(staged)。 Notch のニワトリ相同体のクローニング ニワトリNotch１及びNotch２遺伝子の約1000塩基対ＰＣＲ断片を、縮重プライ マー及びLardelli及びLendahl(1993，Exp．Cell．Res．204:364-372)に概説され たＰＣＲ条件を用いて、耳外植片ＲＮＡ（下記参照）から増幅した。そのＰＣＲ 断片をBluescript KS-にサブクローニングし、配列決定してＤＩＧアンチセンス ＲＮＡプローブの作成用の鋳型として用いた(ＲＮＡ転写キット，Stratagene; ＤＩＧ ＲＮＡ標識混合物，Boehringer Mannheim)。 ショウジョウバエSerrate のニワトリ相同体のクローニング 耳外植片を段階８から段階13の胚から切断した。各耳外植片は、２つの耳杯、 後脳及び咽頭の間にある短い区画、並びにそれに結びついた頭外胚葉及び間葉か ら構成されていた。ＲＮＡを標準プロトコール(Sambrook et al.，1989，in Mol ecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laborat ory Press,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク) を一部変更したものを用いて抽出し、ポリＡ+ ｍＲＮＡを PolyATtractｍＲＮＡ 単離システム(Promega)を用いて全ＲＮＡから単離した。第１のｃＤＮＡ鎖をSup erScript Preamplificationシステム(Gibco)を用いて合成した。 ＰＣＲ及び縮重プライマーを用いて、耳外植片ｃＤＮＡ由来のショウジョウバ エ遺伝子Serrate に相同性のあるニワトリ遺伝子の断片を増幅した。プライマー は、ハエのDelta タンパク質及びSerrate タンパク質の両方で見出されるペプチ ドモチーフを認識するように設計した： 1)プライマー１，5-CGI(T/C)TITGC(T/C)TIAA(G/A)(G/C)AITA(C/T)CA-3'（配列 番号17）は、ハエDelta タンパク質及びSerrate タンパク質のアミノ末端に位置 するモチーフRLCLK(E/H)YQ（配列番号18）に相当する。 2)プライマー２， 5'-TCIATGCAIGTICCICC(A/G)TT-3'（配列番号11）は、いく つかのＥＧＦ様リピートに見出されるモチーフNGGTCID（配列番号12）に相当す る。ＰＣＲ条件は下記のとおりである：94℃１分間、45℃ 1.5分間及び72℃２分 間の35サイクル；その後72℃10分間の最終伸長工程。長さ約 900塩基対のＰＣＲ 産物を精製し、Bluescript KS-(Stratagene)にサブクローニングし、そのＤＮＡ 配列を部分的に決定してそれがほぼSerrate 相同体であることを確認した。次い で、それを用いて２つのｃＤＮＡライブラリー： 1)段階８〜13の耳外植片をランダムプライミングしたｃＤＮＡライブラリー 2)段階17のニワトリ脊髄をオリゴdTプライミングしたｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングすることによってより大きなｃＤＮＡクローンを回収した。共 通しているｃＤＮＡを単離し、その遺伝子の全コーディング領域をいっしょにほ とんどカバーする２つ（９及び３Ａ．１という）をBluescript KS-にサブクロー ニングした。ＤＮＡ配列を、２本鎖Nested Deletion キット(Pharmacia)、及び シークエナーゼ酵素(米国Biochemical Corporation)を用いるサンガージデオキ シチェーンターミネーション法を用いて作製したネスト欠失シリーズ(nested de letion series)から決定した。配列を一列に並べてGenewarks 2.3 及びIntellig enetics を用いて分析した。相同性調査はプログラムSharq を用いて行った。 オープンリーディングフレームの５’最末端(the most 5’end)を得るために 、Lardelliら(1994，Mechanisms of Development 46:123-136)の方法を用いる他 の多くのライブラリー（ｃＤＮＡ及びゲノムライブラリー）のスクリーニングを 含む、多くの他のＰＣＲに基づく方法を用いた。 in situ ハイブリダイゼーション 遺伝子転写のパターンをＤＩＧ標識ＲＮＡプローブ、並びに： 1)高度にストリンジェントな全載(high-stringency wholemount)in situ ハイ ブリダイゼーションプロトコール、及び 2)Strahle ら(1994，Trends in Genet．10:7)のプロトコールに基づいたクリ オスタット区画上でのin situ ハイブリダイゼーション を用いるin situ ハイブリダイゼーションによって決定した。結果 脊椎動物胚中のニワトリSerrate の可能性のある役割を見抜くために、Notch とSerrate の機能的結合がショウジョウバエ中で生じているということから、そ のSerrate 発現とニワトリNotch の発現との関係を調べた。２つのニワトリNotc h 相同体を下記のようにして得た。 C-Notch -1及びC-Notch -2は、それぞれ、鰯歯類Notch -1及びNotch -2遺伝子の 明白な相対物である。 ２日齢ニワトリ胚から調製したｃＤＮＡ及び公知の齧歯類Notch 相同体と共通 の保存領域に基づいた縮重プライマーを用いて、ＰＣＲによってニワトリ中のNo tch 相同体を調査した。この方法において、C-Notch -1及びC-Notch -2と呼ばれ ている２つの別個の遺伝子のそれぞれ長さ約1000ヌクレオチド断片を得た。それ らの断片は第３のNotch/lin12 リピートから最後の５つほどのＥＧＦ様リピート を含むものにまで伸長する。ＥＧＦ様リピートは、非常に多くのタンパク質（そ の大部分は、他の点ではNotch とは関係がない）に存在する。しかしながら、３ つのNotch/lin12 リピートは、Notch 遺伝子ファミリーに特有のものであり、そ の公知のメンバー全てで見出される。c-Notch -1は、齧歯類Notch 1(Weinmaster ら，1991，Development 113:199-205)と高度のアミノ酸同一性を示し、齧歯類No tch１と概ね似たようなドメインで発現する（下記参照）。齧歯類Notch 遺伝子 の中で、C-Notch -2はNotch 2(Weinmasterら，1992，Development 116:931-941) とほとんど類似しているようである。 in situ ハイブリダイゼーションによって初期胚におけるC-Notch -1の発現パ ターンを調べた。C-Notch -1は、１〜２日齢ニワトリ胚で、神経管、前原体節期 中葉胚、腎形成性中葉胚（予期中葉胚(prospective mesoderm)）、鼻プラコード 、耳プラコード／小嚢、水晶体プラコード、上鰓プラコード、心臓における脈管 系の内皮内層(endothelial lining)、及び肢芽の外胚葉性頂堤（ＡＥＲ）を含む 、多くの明瞭に定義されたドメインにおいて発現した。これらの部位は、報告さ れている齧歯類における同等の段階でのNotch１発現の部位と適合する（表２） 。発現データとともに配列データを取り上げると、C-Notch -1は齧歯類Notch１ のニワトリオルソローグ(ortholog)、又はその非常に類似した類縁物のいずれか であると結論付けられる。 C-Serrate はショウジョウバエ Serrateの相同体であり、Notchファミリーに 属する受容体のリガンドの候補をコードする ショウジョウバエにおいては、Notchに対する２つのリガンドが知られており 、関連する２つの遺伝子Delta 及びSerrate によりコードされている。これらの 遺伝子に対応するアミノ酸配列は、Notchに対するin vitro結合に必要でありか つ十分な領域、DSL モチ−フを含む5'末端において相同である。Sarrate のニワ トリ相同体の断片を単離するために、DSL モチ−フのいずれかの側の配列を認識 するように設計されたPCR 及び縮重プライマーを使用した(材料及び方法を参照) 。900塩基対のPCR 断片を回収し、ライブラリーをスクリーニングするのに使用 し、オーバーラップｃＤＮＡクローンを単離することができた。これらのｃＤＮ ＡクローンのＤＮＡ配列は、いくつかの5'塩基のみを欠く、3582ヌクレオチドの 殆ど完全な単一のオープンリーディングフレームを示すものであった。ショウジ ョウバエ Delta及びSerrate のアミノ酸配列との比較により、ニワトリSerrate タンパク質のシグナル配列の部分をコードするコード配列の部分のみが失われて いることが示された。 前記ヌクレオチド配列(配列番号5)(図3)の翻訳から、1230アミノ酸のタンパク 質(配列番号6)(図4)が予測される。ヒドロパシープロットにより、トランスメン ブランドメインに特徴的な単一の疎水性領域があることが明らかにされている(K yte and Doolittle，1982，J．Mol．Biol．157:105-132)。さらに、前記タンパ ク質は、その細胞外ドメインにタンデム配列で結合している16個のEFG-様リピー トを有する。ニワトリ配列を、D．melanogaster Delta 及びSerrate の配列と比 較することにより、前記クローンがSerrate のニワトリ相同体をコードしている ことが示されている(図5、図6)。ショウジョウバエ Serrateが14個のEFG- 様リピートを有し、リピート４、６及び10に大きな挿入物を有しているのに対し 、前記ニワトリ相同体は２つの余分なEFG-様リピートを有し、10番目のリピート 中に16アミノ酸の小さい挿入物を１つ有するだけである。両方のタンパク質は、 EFG-様リピートとトランスメンブランドメインとの間に２番目のシステインリッ チ領域を有し、この領域のシステインの間隔は２つのタンパク質において殆ど同 じである(ショウジョウバエ SerrateのCX2CXCX6CX4CX15CX5CX7CX4CX5CとC-Serra te のCX2CXCX6CX4CX9CX5CX7CX4CX5C とを比較せよ)。C-Serrate の細胞内ドメイ ンは、ショウジョウバエ Delta及びSerrate のいずれの細胞内ドメインとも有意 な相同性を有していない。 C-Serrate は中枢神経系、頭プラコード、腎中胚葉、脈管系、及び体肢芽間葉 において発現される ステージ４〜ステージ21の早期の胚形成の間に、約12時間の間隔で、全載標本 中においてin situ ハイブリダイゼーションを行い、C-Serrate の発現を調べた 。後期の段階については凍結切片についてin situ ハイブリダイゼーションを行 うことにより調べた。 全載物に見られるように、C-Serrate の早期の発現の主要な部位は、中枢神経 系、頭プラコード、腎中胚葉、脈管系、及び体肢芽間葉の５つの表題の下にグル ープ分けすることができる。中枢神経系 C-Serrate の最初の検出可能な発現は、段階６(0体節/24時間)における中枢神 経系において、神経板の背面部分内で見られた。段階10(9〜10体節/35.5 時間) までに、間脳予定域において強い縞状の発現が見られた。菱脳及び脊髄予定域に おいて別の弱い染色が見られた。 ステージ13において、神経管にいくつかの発現のパッチが見られた。間脳にお いては、神経分節D2に対応すると見える、強い三角形の縞状の発現が見られた。 前部中脳底床に２つのパッチ(正中線の各側に１つずつ)が見られ、中脳背部にお いて拡散した染色が見られた。菱脳及び吻側脊髄においては、正中線の各側に ２つの縦方向の発現の縞が見られ、１つは神経管の背部縁に沿ったものであり、 ２番目のものはより腹側のものであり、底板に隣接するものであった。両者は（ ラット）Notch 1発現のドメイン内に位置していた。腹側の縞の前部端は中脳/菱 脳境界にあった。背側の縞は背側中脳における発現に連続していた。前部脊髄に おいては、発現はより小さなスポット状となり、縞はC-Serrate を発現する離れ 離れに分散した細胞に置き変わった。 ステージ17(58 時間）においては、間脳及び中脳においては発現は変化しなか った。菱脳及び脊髄においては、別の２つの縦の縞があった。１つは背腹方向軸 に沿った中央のものであり、第２のものはより広いより腹側の縞であった。これ らの縞の前部端は菱脳の小片２の前部境界に一致していた。菱脳における４つの 縦方向の縞は全て胚の脊髄に続いており、その後部端に向かって減少していた。 これらの発現の縞は少なくともステージ31(E7)以下で維持されていた。ステージ 21(84時間)までに大脳半球に別の発現が見られ、視蓋中の細胞における入り交じ った分布で強い発現が見られた。頭プラコード C-Serrate が、全ての頭プラコード、即ち水晶体プラコード、鼻プラコード、 耳プラコード／耳胞及び上鰓プラコードに発現され、三叉神経プラコード(形態 学的には十分に確定されていない)に対応し得る、耳プラコード前部に対する頭 蓋外胚葉パッチに発現されることは驚くべきことである。 水晶体プラコードにおいては、ステージ11において既に発現がみられ、急速に 非常に強くなり、少なくともステージ21まで維持された。鼻プラコードにおいて は発現はより弱く、ステージ13から検出されたに過ぎなかった。発現はやはり少 なくともステージ21まで維持された。 耳プラコードについても同様に、発現はステージ10において見えるようになり 、ステージ11の初期(12〜14体節、42.5時間)まで強かった。奇妙なことに、耳発 現ドメイン、即ちそこでは前記遺伝子が発現されなかったプラコードの前腹側領 域中に「孔」が見られた。さらに、プラコードが陥入して耳胞を形成するに従っ て、前側部及び後内側分裂極において最も強い発現が見られた。さらに後になっ て、耳胞が内耳の膜迷路に変化するに従って、C-Serrate 発現は知覚パッチに限 定されるようになった。 鰓上発現は、ステージ13/14 において、第１及び第２の鰓裂の背側の縁周辺の 外胚葉で強い染色として見られた。これは鰓裂の内層の深部と、鰓嚢の内皮内層 とにおける遺伝子の発現を伴っており、ここでこれらの２つの上皮は互いに隣接 している。 最後に、ステージ11において、大きくて強力であるが、一時的なパッチ発現が 、耳原基に対してちょうど前部腹側の頭蓋外胚葉において見られた。その位置か ら、これは三叉神経プラコードの領域であるか、あるいはそれを含むものである と考えられた。腎中胚葉 発生中の中腎細管中のステージ10及びより段階の進んだ胚(ステージ17〜21)か らの中間中胚葉の細胞において発現が検出された。体肢芽 C-Serrate ｍＲＮＡは、発生中の体肢芽の遠位端における間葉のパッチに局在 していた。これは体肢の成長における役割を示唆している可能性がある。その他の部位 発現は、尾芽、尿膜柄においても見られ、後期においてはおそらくその他の組 織においても見られるであろう。 C-Serrate 発現の全ての主要な部位はC-Notch-1発現のドメイン内にある C-Serrate のDSLドメイン及び隣接するN-末端領域が保存されていることは、 それがNotchファミリーに属する受容体についてのリガンドとして機能すること を示唆している。従って、C-Serrate 発現がNotch遺伝子の発現を伴う部位が見 出されるであろうと予測された。そのような部位においては、Serrate-Notchシ グナリングにより細胞が連絡を取り合っていることを示すものとして、２つの遺 伝子のオーバーラップした、あるいは連続的な発現が起こり得る。実際にどのよ うなオーバーラップが起こるのかを発見するために、インキュベーション８日(E 8)までのステージの範囲にわたって、in situ ハイブリダイゼーションにより示 される、C-Serrate の発現パターンをC-Notch-1のものと比較した。C-Serrate 発現の観察された部位の全ては実際に、C-Notch-1 の発現ドメイン内あるいは非 常に近い位置にあった(表III)。 昆虫の神経発生におけるNotch 及びその相手の重要性により、前記相同遺伝子 が脊椎動物CNS の発生に関与しているかどうかを知ることは特に重要であった。 C-Serrate はCNS で発現され、その発現パターンはNotch相同体のものとの顕著 な相関を示すものである。 C-Notch-1及びC-Serrate アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズした ニワトリ６日胎児の脊髄の横断切片について分析した。C-Notch-1は先に記載し たように管腔領域全体に発現され、この領域内ではSerrate が強く発現された２ つの小さいパッチが存在した。考察 ショウジョウバエの発生においては、Notch遺伝子の産物を介した細胞間シグ ナリングが、分化した細胞型の詳細なパターンを特定する最終的な細胞の予定運 命決定において主要な役割を果している。このシグナリング経路においてはNotc hタンパク質がトランスメンブラン受容体として同定されており、この経路は神 経発生におけるその役割において最もよく知られているものである。即ち、Notc hあるいはNotchを介するシグナル伝達に必要なその他の遺伝子の任意のセットに おける機能欠失突然変異が神経外胚葉における細胞の予定運命を変え、表皮性の はずであった細胞を代わりに神経性のものにするはずである。しかしNotch-依存 性シグナリングは、神経組織におけるのと同様に非神経組織においても重要であ る。これは例えば、卵子発生、筋発生、マルピギー管の形成、及び消化管におい て、そして網膜、末梢小感覚体及び中枢神経系の発生において、分化のモードの 選択を制御する。これらの場合の殆どにおいて、Notchにより伝達されるシグナ ルは側方抑制を媒介するようであり、側方抑制とは特定の経路で分化するように なった細胞、例えば神経芽細胞が、そのごく近傍にあるものが同様な行動をとる ことを阻害するという細胞の相互作用の一種である。これにより隣接する細胞 は異なる経路で行動するようにされ、異なる細胞種のきめこまかいパターンを形 成する。 しかし、これはNotchを介して伝達されるシグナルの唯一の機能ではないとす るのに十分な理由がある。２種類のNotchの直接のリガンドが同定されている。 これらは、Delta 及びSerrate 遺伝子の産物である。両者は、Notch自身と同様 に、その細胞外ドメインにおいてEFG-様リピートのタンデム配列を有するトラン スメンブランタンパク質をコードしている。Delta 及びSerrate タンパク質の両 方は、細胞付着アッセイにおいてNotchに結合することが示されており、in vitr oにおいてNotchと相互作用するのに必要にして十分なモチーフ、いわゆるEBDあ るいはDSL ドメインを含むアミノ末端において相同性を有する大きな領域を共有 している。このような生化学的類似性にもかかわらず、それらはかなり異なる発 生上の機能を有しているようである。Serrate はハエにおいて多くの部位に発現 されるが、肩の盤、翅の盤、及び平均根盤においてのみ必要とされるようである 。Serrate の機能が突然変異により欠損された場合はこれらの構造体は成長でき なくなる。翅盤の研究により、それが特異的にSerrate に依存する翅縁であるこ とが示されている。Serrate を欠いていると、この重要なシグナリング領域及び 成長中心は形成できず、Serrate が翅盤の腹側部分でGAL4-UASプロモーターのも とに異所的に発現されると、異所性の翅縁組織が誘導され、異所性の増殖を起こ す。Notchは翅縁においてSerrate の受容体であるようであり、これはNotch の いくつかの突然変異対立遺伝子が、翅縁発生の類似した阻害をおこし、二種の遺 伝子の効果において対立遺伝子特異的相互作用が見られることによる。 本明細書においては、ショウジョウバエ遺伝子Serrate の相同体の同定及び完 全長配列、及びラット/マウスNotch1及びNotch２のニワトリ相同体の同定及び部 分配列を記載するものである。 ニワトリSerrate ｃＤＮＡ内には、その細胞外ドメインに16個のEFG リピート を有する大きいトランスメンブランタンパク質をコードすると予測される単一の オープンリーディングフレームが存在する。それは非常によく保存されたDSL モ チーフを有しており、それがNotchと直接相互作用するはずであることを示唆し ている。ニワトリSerrate の細胞内ドメインは、ショウジョウバエDelta 及びSe rrate の細胞内ドメインを含む現在のデータベースのいずれとも相同性を示さな い。しかし、ニワトリ及びヒトSerrate の細胞内ドメイン(12節を参照)は殆ど同 一であることが指摘される。 in situ ハイブリダイゼーションにより、初期胚発生の間においてC-Notch-1 及びC-Serrate の位置的分布を調べた。C-Notch-1及びC-Serrate は、それらが 同時に発現されるいくつかの領域(CNS、耳、鰓領域、水晶体、心臓、鼻プラコー ド及び中腎）を含む発現のダイナミックで複雑なパターンを示す。このオーバー ラップした発現と、C-Serrate がNotch結合ドメインに非常によく保存された領 域を有するという知見とを合わせて考えると、この受容体/リガンド相互作用が ショウジョウバエから脊椎動物まで保存されてきたことが示唆されている。 ショウジョウバエにおいてはNotch受容体はかなり広範に分布しており、その リガンドは、オーバーラップしているがより限定的なドメインにおいて見られる 。ニワトリにおいても同様な状況が見られる。 ハエNotchは、ショウジョウバエの発生の多くの段階において必要である。特 に中枢神経系及び末梢感覚器官の発生における側方抑制におけるその役割が最も よく研究された例である。しかし、Notchは多機能受容体であり、種々のシグナ リング分子(Delta及びSerrate を含む）と相互反応でき、側方抑制の枠組内には 容易には適合しない発生過程においても相互反応できる。Delta が側方抑制にお けるシグナリング分子であることを示す証拠はあるが、Serrate が側方抑制に関 与していることを示唆するデータはない。そうではなく、Serrate は幼生の背側 成虫盤、即ち肩、平均根及び翅盤の発生に必要であるようである。最後のものは これらの過程のもっともよく研究されたものであるが、これにおいては、Serrat e 及びNotchは、翅の発生の全体としての有機的結合に必要な構造、背腹側翅縁 の発生に重要である。 C-Serrate が重要な機能を有していることは、特にそのNotch-結合ドメインの その配列が保存されていることから推論できる。C-Serrate について本明細書に 記載した発現パターンは以下の情報を与えるものである。第一に、Serrate 遺伝 子はC-Notch-1が発現される部位あるいは隣接する部位において発現されるので( おそらくはその他のNotch相同体とともに)、C-Serrate はC-Notch-1(ある いは同様な発現パターンを有するその他のニワトリNotch相同体)に結合すること によりその作用を発揮する可能性が極めて高い。第二に、発生中の腎臓、脈管系 及び体肢芽における発現は中胚葉及び外胚葉間の誘導的シグナリングにおける関 与を反映しているものであり得、前記のシグナリングはこれらの器官のすべての ものの発生において重要な部分を演ずるものである。例えば体肢芽においては、 C-Serrate は遠位中胚葉において発現され、C-Notch-1は重畳する先端外胚葉隆 起において発現され、この維持は下部の中胚葉からのシグナルに依存することが 知られている。頭プラコードにおいては、同様な役割が可能であるが、誘導的シ グナリングについての証拠はより弱いものであり、C-Serrate は同様に、プラコ ード上皮内の細胞間の連絡、例えばプラコード細胞の分化の特定のモードを制御 することに関与している可能性がある。 何がCNS 内のC-Serrate の発現の奇妙に限定されたドメイン内でのその機能で あろうか？一つの可能性は、これがオリゴ樹状細胞の生産の制御に関与している ということであり、これは神経管の頭尾軸に沿って伸びる組織の狭いバンドから 始まると報告されている。 ９．ヒトSerrate 相同体の単離と特徴付け ヒトSerrate 配列のクローンを以下に記載するようにして得た。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＤ ＮＡを増幅した。この反応で使用した縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、シ ョウジョウバエSerrate 及びショウジョウバエDelta の間の相同性の高いアミノ 末端領域に基づいて設計した(図５参照)。この相同性の高い領域は5'“DSL”ド メインを含んでおり、これはDelta 及びSerrate のNotch-結合部分をコードする と考えられる。２種類のPCR 産物、350 bp断片と1.2 kb断片を単離して使用した 。これらのPCR 断片は32P により標識し、17〜18週齢の胎児から作製された市販 のヒト胎児脳ｃＤＮΛライブラリー(以前からStratageneより入手可能)をスクリ ーニングするのに使用した。ここでこのｃＤＮＡをλ-ZapベクターのEcoRI 部位 に挿入した。 前記1.2 kb断片は、106 クローン中の１つのクローンにハイブリダイズし、ス クリーニングした。単離されたファージλクローンを製造元の使用説明書に従っ てプラスミドに変換することによりλＤＮＡからこの断片を回収し、ベクターBl uescript KS-(Stratagene)のEcoRI 部位中の挿入物としてSerrate-相同ｃＤＮＡ を得た。このプラスミドは“pBS39”と命名し、このｃＤＮＡクローンに対応す る遺伝子をヒトSerrate-1 と称する(ヒトJagged-1(“HJ1”)としても知られる) 。この単離されたｃＤＮＡは6464ヌクレオチド長で、完全なオープンリーディン 定システム(U.S．Biochemical Corp.)を用いて、5及び6%Sequagelアクリルアミ ド配列決定ゲル上で配列決定を行った。 前記350 bp断片は、約1.1 及び3.1 kb長のｃＤＮＡ挿入物を含む２種類のクロ ーンとハイブリダイズした。これらの挿入物を含むプラスミド構築物はそれぞれ pBS14 及びpBS15 と称する。それぞれのクローンを単離し、そのそれぞれの挿入 物をλｃＤＮＡから回収し、上記のように配列決定した。pBS14 挿入物のヌクレ オチド配列は、pBS15 ｃＤＮＡ挿入物内に内部的に含まれている配列の1.1 kb部 分に同一であり、従ってこのクローンについてはそれ以上の特徴付けは行わなか った。3.1 kb pBS15挿入物の配列は、挿入物の5'末端の20ヌクレオチドを除く全 てにわたるオープンリーディングフレームをコードしていた。この予測されたオ ープンリーディングフレームのアミノ末端残基に位置するメチオニンはpBS39 中 のヒトSerrate-1(HJ-1)ｃＤＮＡクローンによりコードされた開始メチオニンと 相同であった。pBS15 のｃＤＮＡ挿入物をコードする遺伝子はヒトSerrate-2 と 命名し、これはヒトJagged-2C(“HJ2”)としても知られる。 前記pBS15(HJ2)3.1 kb挿入物を次に32P で標識し、別のヒト胎児脳ライブラリ ー(Clontechからのもの)をスクリーニングするのに使用した。このライブラリー は、25〜26週齢胎児から作製されたｃＤＮＡをλgt11のEcoRI 部位にクローニン グしたものである。このスクリーニングにより３種類の可能性のある陽性クロー ンが同定された。ｃＤＮＡを単離するために、液体溶解物からλgt11ＤＮＡを調 製し、DEAEカラム上で精製した。精製されたＤＮＡを次いでEcoRI で切断し、ｃ ＤＮＡ挿入物を単離し、Bluescript KS-のEcoRI 部位中にサブクローニングした 。前記のｃＤＮＡを含むBluescript構築物をpBS3-15、pBS3-2及びpBS3-20 と 命名した。これらのｃＤＮＡクローンのうちの２種類、pBS3-2及びpBS3-20はpBS 15 と部分的にオーバーラップする配列を含んでおり、さらに特徴付けした。pBS 3-2は、pBS15 ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド1210からポリアデニル化シグナル の直後にわたる3.2 kb挿入物を有していた。pBS3-20 の2.6 kb挿入物について制 限地図を作成し、部分的に配列決定して3'及び5'末端を決定した。この分析によ れば、pBS3-20 挿入物はpBS3-2ｃＤＮＡ挿入物内に完全に含まれる核酸配列を有 していることが示され、従ってpBS3-20 はそれ以上特徴付けしなかった。pBS3-1 5 の挿入物はBluescriptベクター断片夾雑物として測定した。 コンピューター上で作成された「完全」ヒトSerrate-2(HJ2)ｃＤＮＡ(配列番 号3)の推定アミノ酸配列(配列番号4)の、pBS39からのヒトSerrate-1(HJ1)の推定 アミノ酸配列(配列番号2)とのアライメントにより、pBS15(HJ2)挿入物によりコ ードされた領域内で、仮想的シグナル配列とDSL ドメインの開始部との間にある フレームシフトを生じる約120 塩基のギャップが判明した(図2)。pBS15 挿入物 のギャップ中の失われたヌクレオチドは配列番号3 のヌクレオチド240 及び241 の間に位置すべきものである。この失われた領域はおそらく、Stratageneライブ ラリー構築の際のクローニングの人工的産物により生じたものと思われる。 アンカーPCR、RACE及びTakaraの延長PCR 技術を使用したHJ2 の5'末端をクロ ーン化する試みは成功しなかった。しかし、HJ2 の5'末端を含む可能性のある３ 種類のヒトゲノムクローンがヒトゲノムコスミドライブラリーのスクリーニング から得られた。このライブラリーは、pWE15 ベクターのBamHI 部位中に導入した 単一のXhoI部位中に30 kb 断片をクローニングしたものである(未改変ベクター はStratageneより入手可能である)。このコスミドライブラリーを、pBS15(HJ2) の5'末端から増幅されたPCR 断片によりスクリーニングし、３種類の陽性コスミ ドクローンを単離した。２種類の異なるプライマーのセットを使用し、コスミド クローンをテンプレートとして使用して、pBS15 の5'末端に対応するＤＮＡを増 幅したところ、両方のセットにより単一のバンドが生成され、これをサブクロー ニングしたが、いずれもPCR人口産物を含んでいることが判明した。コスミドク ローンの部分はPCR なしに直接サブクローニングし、pBS15 において失われてい るＤＮＡの120 ヌクレオチド部分を含むコスミドクローンの部分を得た。 ヒトSerrate-1 相同体(HJ1)をコードするpBS39 ｃＤＮＡ挿入物を配列決定し たところ、その遺伝子産物の完全なコード配列を含んでいた。そのヌクレオチド (配列番号1)及びタンパク質(配列番号2)の配列を図２に示す。ヒトSerrate-1(HJ 1)のヌクレオチド配列をMacVector ソフトウェア(International Biotechnolog y Inc.，New Haven，CT)を使用して翻訳した。コード領域は配列番号１のヌクレ オチド番号371-4024からなる。DNAStar（Madison，WI）のProtean タンパク質分 析ソフトウェアプログラムを使用して単一のペプチド及びトランスメンブラン領 域を予測した(疎水性に基づいた)。シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸 14-29(配列番号１のヌクレオチド番号410-457 によりコードされる)からなると 予測され、これにより成熟タンパク質のアミノ末端はアミノ酸番号30のGly から 開始すると予測された。トランスメンブランドメインは、配列番号２のアミノ酸 番号1068-1089であると予測され、配列番号１のヌクレオチド番号3572-3637 に よりコードされる。ショウジョウバエDelta 及びSerrate と相同性を有する領域 であり、Notch(特にNotch ELR 11及び12)との結合を媒介すると予測されるコン センサス(DSL)ドメインは、配列番号２のアミノ酸185-229にわたり、配列番号１ のヌクレオチド番号923-1057によりコードされる。アミノ酸配列中の上皮成長因 子様(ELR)リピートは目視同定した。以下の15の(完全長)ELR及び３の部分ELRが 同定された。 ELR 1: アミノ酸番号234-264 ELR 2: アミノ酸番号265-299 ELR 3: アミノ酸番号300-339 ELR 4: アミノ酸番号340-377 ELR 5: アミノ酸番号378-415 ELR 6: アミノ酸番号416-453 ELR 7: アミノ酸番号454-490 ELR 8: アミノ酸番号491-528 ELR 9: アミノ酸番号529-566 部分ELR: アミノ酸番号567-598 部分ELR: アミノ酸番号599-632 ELR 10: アミノ酸番号633-670 ELR 11: アミノ酸番号671-708 ELR 12: アミノ酸番号709-747 ELR 13: アミノ酸番号748-785 ELR 14: アミノ酸番号786-823 ELR 15: アミノ酸番号824-862 部分ELR: アミノ酸番号863-879 部分ELR: アミノ酸番号880-896 従って、全ELR ドメインはアミノ酸番号234-896(配列番号１のヌクレオチド番 号1070-3058 によりコードされる)である。細胞外ドメインは、配列番号２のア ミノ酸番号1-1067であると予測され、配列番号１のヌクレオチド番号371-3571に よりコードされる(成熟タンパク質中のアミノ酸番号30-1067;配列番号１のヌク レオチド番号458-3571によりコードされる)。細胞内(細胞質)ドメインは、配列 番号２のアミノ酸番号1090-1218 であると予測され、配列番号１のヌクレオチド 番号3638-4024 によりコードされる。 特定の種類のヒト組織中におけるHJ1 の発現は、放射性標識pBS39 でClontech Human Multiple Tissue Northern Blotをプローブすることにより確認した。前 記プローブは約6.6 kbの単一のバンドとハイブリダイズし、心臓、脳、胎盤、肺 、骨格筋、膵臓、肝臓及び腎臓を含むアッセイした全ての組織において発現され た。HJ1 が成人骨格筋及び心筋において発現されたという観察は特に興味深いも のであり、これは成人の筋肉繊維は細胞外マトリックスの層により完全に包囲さ れており、従ってこれらの細胞におけるHJ1の役割が直接の細胞間伝達にあると いうことはありそうにないからである。 コンピュータ上で作成した「完全」（内部欠失を含む）ヒトSerrate-2(HJ2)ｃ ＤＮＡヌクレオチド配列(配列番号3)及びアミノ酸配列(配列番号4)を図２に示す 。ヌクレオチド配列はMacVector ソフトウェア(International Biotechnology I nc.，New Haven，CT)を使用して翻訳した。コード領域は配列番号３のヌクレ オチド番号332-4102からなる。DNAStar（Madison，WI）のProtean タンパク質分 析ソフトウェアプログラムを使用してシグナルペプチド及びトランスメンブラン 領域を予測した(疎水性に基づいた)。トランスメンブランドメインは、配列番号 ４のアミノ酸番号912-933 であると予測され、配列番号３のヌクレオチド番号30 65-3130 によりコードされる。ショウジョウバエDelta 及びSerrate と相同性を 有する領域であり、Notch(特にNotch ELR 11及び12)との結合を媒介すると予測 されるコンセンサス(DSL)ドメインは、配列番号４のアミノ酸26-70にわたり、配 列番号３のヌクレオチド番号407-541によりコードされる。アミノ酸配列中の上 皮成長因子様(ELR)リピートは目視同定した。以下の15の(完全長)ELR及び３の部 分ELRが同定された。 ELR 1: アミノ酸番号75-105 ELR 2: アミノ酸番号106-140 ELR 3: アミノ酸番号141-180 ELR 4: アミノ酸番号181-218 ELR 5: アミノ酸番号219-256 ELR 6: アミノ酸番号257-294 ELR 7: アミノ酸番号295-331 ELR 8: アミノ酸番号332-369 ELR 9: アミノ酸番号370-407 部分ELR: アミノ酸番号408-435 部分ELR: アミノ酸番号436-469 ELR 10: アミノ酸番号470-507 ELR 11: アミノ酸番号508-545 ELR 12: アミノ酸番号546-584 ELR 13: アミノ酸番号585-622 ELR 14: アミノ酸番号623-660 ELR 15: アミノ酸番号664-701 部分ELR: アミノ酸番号702-718 部分ELR: アミノ酸番号719-735 従って、全ELR ドメインはアミノ酸番号75-735(配列番号３のヌクレオチド番 号554-2536によりコードされる)である。細胞外ドメインは、配列番号４のアミ ノ酸番号1-912であると予測され、配列番号３のヌクレオチド番号332-3064によ りコードされる。細胞内(細胞質)ドメインは、配列番号４のアミノ酸番号934-12 57であると予測され、配列番号３のヌクレオチド番号3131-4102 によりコードさ れる。 ヒトSerrate-1(HJ1)と同様に、コンピュータ上で作成した「完全」（内部欠失 を有する）ヒトSerrate-2(HJ2)ｃＤＮＡ(配列番号3)は、16の完全なEGF リピー ト及び２つの中断されたEGF リピート、並びに仮想的Notchリガンド中にのみ見 られたDSL ドメインとして知られる診断的には陰性のEFG リピートを含むタンパ ク質をコードする。コンピュータで作成された「完全」ヒトSerrate-2(HJ2)のオ ープンリーディングフレームは約1400アミノ酸長であり、HJ1及びラットSerrate 相同体Jaggedのカルボキシ末端よりも約182 アミノ酸だけ長い。完全HJ2 及びH J1 の間にはタンパク質のアミノ末端部分において有意な相同性が存在するが、 この相同性はHJ1 のアミノ酸番号1029付近の仮想的トランスメンブランドメイン の直前で失われる。長いCOOH-末端テイルの存在はHJ2 の何らかの別の機能ある いは調節の可能性を意味するものであることから、この結果は、特に興味深いも のである。 「完全」（内部欠失を有する）ヒトSerrate-2(HJ2)ｃＤＮＡ(配列番号3)配列 は、pBS15 及びpBS3-2の配列オーバーラップ中に存在するAccI、DraIIIあるいは BamHI のための唯一の制限部位を利用して構築することができ、これらの酵素は それぞれヌクレオチド1431、2648及び2802においてpBS15 挿入物を切断する。 特定の種類のヒト組織中におけるHJ2 の発現を、放射性標識クローンpBS15 で Clontech Human Multiple Tissue Northern Blotをプローブすることにより確認 した。このプローブは約5.2 kbの単一のバンドとハイブリダイズし、心臓、脳、 胎盤、肺、骨格筋及び膵臓において発現されたが、肝臓及び腎臓においては存在 しないかあるいは殆ど検出できなかった。上述したHJ1 発現の場合と同様に、HJ 2 のpBS15 挿入物成分が成人の骨格筋及び心筋において発現されたという観察は 特に興味深いものであり、これは成人筋肉繊維は細胞外マトリックスの層により 完全に包囲されており、従ってこれらの細胞におけるHJ2の役割が直接の細胞間 伝達にあるということことはありそうにないからである。 発現構築物を単離されたクローンを使用して作製した。クローンをそのベクタ ーからEcoRI 制限断片として切り出し、発現ベクターのEcoRI 制限部位中にサブ クローニングした。これにより正しいリーディングフレーム中のサブクローンか らのヒトSerrate タンパク質産物の発現が可能となった。この方法を使用して、 サイトメガロウイルスプロモーターの制御下での発現用の発現ベクター中にpBS3 9 のHJ1 ｃＤＮＡ挿入物をクローニングした発現構築物を作製し、3T3 及びHAKA T ヒトケラチノサイト系の両方においてHJ1を発現させた。 10．微生物の寄託 完全長ヒトSerrate-1(HJ1)をコードするEcoRI 断片を含むプラスミドpBS39 は 、American Type Culture Collection，1201 Parklawn Drive，Rockville，Mary land 20852に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 の規定に基づき、1995年２月28日に寄託し、受託番号97068 を得た。 Bluescript KS-のEcoRI部位にクローニングしたヒトSerrate-2(HJ2)のアミノ 末端をコードする3.1 kb EcoRI断片を含むプラスミドpBS15 は、American Type Culture Collection，1201 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852に、特 許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、 1995年３月５日に寄託し、受託番号 を得た。 Bluescript KS-のEcoRI部位にクローニングしたヒトSerrate-2(HJ2)のカルボ キシ末端をコードする3.2 kb EcoRI断片を含むプラスミドpBS3-2は、American T ype Culture Collection，1201 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852に 、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づ き、1995年３月５日に寄託し、受託番号 を得た。 本発明は、寄託された微生物あるいは本明細書に記載した特定の態様によりそ の範囲を限定されるものではない。実際に、これまでの記載及び添付の図面から 、本明細書に記載したものに加えて本発明の種々の改変が当業者に明らかとなる であろう。そのような改変は添付の請求の範囲の範囲内に含まれるものである。 本明細書に引用した種々の文献は、引用によりその全体を本明細書の一部とす るものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/47 16/18 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｇ０１Ｎ 33/15 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 イッシュ−ホロウィッツ，デイヴィッド イギリス国 オーエックス１ １ジェイワ イ オックスフォード，ロウアー フィッ シャー ロウ ２ (72)発明者 ヘンリク，ドミンゴス エム．ピー. イギリス国 オーエックス２ ７ジェイワ イ オックスフォード，サマーヒル ロー ド １エイ (72)発明者 ルイス，ジュリアン エイチ. イギリス国 オーエックス３ ７アールジ ェイ オックスフォード，サンドフィール ド ロード 60 (72)発明者 マイヤット，アンナ エム. イギリス国 オーエックス２ ９ピーエッ クス オックスフォード，カムナー ヒ ル，チョーリー レーン ４ (72)発明者 アータヴァニス−ツァコナス，スピリドン アメリカ合衆国 06517 コネティカット 州 ハムデン，リッジウッド アベニュー 192 (72)発明者 マン，ロバート エス. アメリカ合衆国 06514 コネティカット 州 ハムデン，タウン ハウス ロード 21 (72)発明者 グレイ，グレース イー. アメリカ合衆国 06511 コネティカット 州 ニューヘブン，ホイットニー アベニ ュー 815 アパートメント ４ 【要約の続き】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．精製された脊椎動物のSerrate タンパク質。 ２．ヒトのタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。 ３．哺乳動物のタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。 ４．配列番号２のアミノ酸番号３０〜１２１８に実質的に記載されているアミノ 酸配列を含有する請求項２に記載のタンパク質。 ５．配列番号４のアミノ酸番号１〜１２５７に実質的に記載されているアミノ酸 配列を含有する請求項２に記載のタンパク質。 ６．ATCCに寄託されて受託番号68876 号を指定されたプラスミドSerFL または該 プラスミド中のSerrate 配列にハイブリダイズ可能な核酸によってコードされる 精製されたヒトタンパク質。 ７．ATCCに寄託されて受託番号97068 号を指定されたプラスミドpBS39 によって コードされる請求項２に記載のタンパク質。 ８．ATCCに寄託されて受託番号 号を指定されたプラスミドpBS15 によって コードされるSerrate アミノ酸配列を含有する請求項２に記載のタンパク質。 ９．ATCCに寄託されて受託番号 号を指定されたプラスミドpBS3-2によって コードされるSerrate アミノ酸配列を含有する請求項２に記載のタンパク質。 １０．請求項１のタンパク質の精製された断片であって、Serrate タンパク質の １つ以上の機能活性を示すことが可能である前記断片。 １１．請求項２のタンパク質の精製された断片であって、ヒトまたはキイロショ ウジョウバエ(D.melanogaster)のSerrate タンパク質の１つ以上の機能活性を示 すことが可能である前記断片。 １２．ヒトのSerrate タンパク質に対する抗体と結合可能である請求項２または ７に記載のタンパク質の精製された断片。 １３．請求項１０に記載の断片を含有する分子。 １４．脊椎動物のSerrate タンパク質の精製された断片であって、前記タンパク 質の細胞外ドメイン、DSL ドメイン、表皮増殖因子様のリピートドメイン、シ ンテインに富むドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインからなる群から 選ばれるドメインを含有する前記断片。 １５．脊椎動物のSerrate タンパク質の精製された断片であって、前記タンパク 質のDSL ドメインを含有する前記断片。 １６．脊椎動物のSerrate タンパク質の精製された断片であって、前記タンパク 質の表皮増殖因子に相同性のリピートを含有する前記断片。 １７．前記Serrate タンパク質がヒトSerrate タンパク質である請求項１４に記 載の断片。 １８．Notch タンパク質またはDelta タンパク質に相同性の領域を含有し、かつ 少なくとも１０個のアミノ酸からなる脊椎動物のSerrate タンパク質の精製した 断片。 １９．Serrate タンパク質ではない第２のタンパク質のアミノ酸配列に共有結合 によって融合している少なくとも１０個のアミノ酸からなる脊椎動物のSerrate タンパク質の断片を含有するキメラタンパク質。 ２０．Serrate タンパク質の前記断片が抗Serrate 抗体によって結合され得る断 片である請求項１９に記載のキメラタンパク質。 ２１．前記Serrate タンパク質がヒトのタンパク質である請求項１９に記載のキ メラタンパク質。 ２２．Serrate タンパク質の１つ以上の機能活性を示すことが可能である請求項 １９に記載のキメラタンパク質。 ２３．脊椎動物のSerrate タンパク質の精製した断片であって、(a)抗Serrate 抗体によって結合可能であり、(b)前記タンパク質の膜貫通および細胞内ドメイ ンを欠失しており、かつ(c)前記Serrate タンパク質の少なくとも１０個のアミ ノ酸からなる前記断片。 ２４．脊椎動物のSerrate タンパク質の精製した断片であって、(a)抗Serrate 抗体によって結合可能であり、(b)前記タンパク質の細胞外ドメインを欠失して おり、かつ(c)前記Serrate タンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸からなる 前記断片。 ２５．Notch タンパク質に結合可能な脊椎動物Serrate タンパク質の精製した断 片。 ２６．前記Serrate タンパク質の表皮増殖因子様リピートを欠失している請求項 ２５に記載の断片。 ２７．前記Serrate タンパク質がヒトSerrate タンパク質である請求項２３、２ ４、２５または２６に記載の断片。 ２８．配列番号２または配列番号４の断片である請求項２９に記載の断片。 ２９．請求項２５に記載の断片を含有する分子。 ３０．請求項１に記載のSerrate タンパク質と結合可能であり、かつショウジョ ウバエ(Drosophila)のSerrate タンパク質とは結合しない抗体。 ３１．請求項２に記載のSerrate タンパク質と結合可能であり、かつショウジョ ウバエ(Drosophila)のSerrate タンパク質とは結合しない抗体。 ３２．モノクローナルである請求項３０に記載の抗体。 ３３．請求項３２に記載の抗体の断片を含有する分子であって、該断片が脊椎動 物のSerrate タンパク質と結合可能である前記分子。 ３４．脊椎動物のSerrate タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する 単離した核酸。 ３５．ＤＮＡである請求項３４に記載の核酸。 ３６．請求項３４に記載のヌクレオチド配列に完全に相補的なヌクレオチド配列 を含有する単離した核酸。 ３７．請求項２に記載のSerrate タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含 有する単離した核酸。 ３８．ATCCに寄託して受託番号97068 号を指定されたプラスミドpBS39 に含有さ れるSerrate コード配列を含有する単離した核酸。 ３９．ATCCに寄託して受託番号68876 号を指定されたプラスミドSerFL および該 プラスミド中のSerrate 配列にハイブリダイズ可能な単離したヒト核酸。 ４０．ATCCに寄託して受託番号 号を指定されたプラスミドpBS3-2に含有さ れるSerrate コード配列を含有する単離した核酸。 ４１．ATCCに寄託して受託番号 号を指定されたプラスミドpBS15 に含有さ れるSerrate コード配列を含有する単離した核酸。 ４２．タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸であっ て、前記タンパク質が配列番号４のアミノ酸番号１〜１２５７を含有する前記核 酸。 ４３．少なくとも８個のヌクレオチドからなる脊椎動物のSerrate 遺伝子の断片 を含有する単離された核酸。 ４４．請求項１４、１５、１６または２５に記載の断片をコードするヌクレオチ ド配列を含有する単離した核酸。 ４５．前記断片がヒトSerrate タンパク質の断片である請求項４４に記載の核酸 。 ４６．請求項１２に記載の断片をコードするヌクレオチド配列を含有する単離さ れた核酸。 ４７．タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸であっ て、前記タンパク質が配列番号２のアミノ酸番号３０〜１２１８を含有する前記 核酸。 ４８．請求項２１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する 単離された核酸。 ４９．請求項３４、３７または４３に記載の核酸を含有する組換え細胞。 ５０．請求項３８、４０または４１に記載の核酸を含有する組換え細胞。 ５１．請求項３４または３７に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、 コードされた前記Serrate タンパク質が前記細胞によって発現されるようにする 工程と、前記発現されたSerrate タンパク質を回収する工程とを包含するSerrat e タンパク質の生成方法。 ５２．請求項３８、４０または４１に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖さ せて、コードされたSerrate タンパク質が前記細胞によって発現されるようにす る工程と、前記発現されたSerrate タンパク質を回収する工程とを包含するSerr ate タンパク質の生成方法。 ５３．請求項４５に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされ たタンパク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現された タンパク質を回収する工程とを包含するタンパク質の生成方法。 ５４．Serrate タンパク質の断片を含有するタンパク質の生成方法であって、請 求項４６に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされたタンパ ク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現されたタンパク 質を回収する工程とを包含する前記方法。 ５５．請求項５１に記載の方法による生産物。 ５６．請求項５２に記載の方法による生産物。 ５７．請求項５３に記載の方法による生産物。 ５８．請求項５４に記載の方法による生産物。 ５９．治療上有効な量の脊椎動物Serrate タンパク質と、製剤上許容される担体 とを含有する医薬組成物。 ６０．前記Serrate タンパク質がヒトSerrate タンパク質である請求項５９に記 載の組成物。 ６１．治療上有効な量の請求項１４、１５、１６または２５に記載の断片と、製 剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。 ６２．治療上有効な量の請求項１２に記載の断片と、製剤上許容される担体とを 含有する医薬組成物。 ６３．脊椎動物Serrate タンパク質の断片を含有する分子を治療上有効な量で含 有する医薬組成物であって、その誘導体または類似体が、Notch タンパク質への 結合能、またはNotch タンパク質の表皮増殖因子様リピート１１および１２を含 有する分子への結合能により特徴付けられる前記組成物。 ６４．治療上有効な量の請求項３４、３６または３７に記載の核酸と、製剤上許 容される担体とを含有する医薬組成物。 ６５．治療上有効な量の請求項４４に記載の核酸と、製剤上許容される担体とを 含有する医薬組成物。 ６６．治療上有効な量の請求項４６に記載の核酸と、製剤上許容される担体とを 含有する医薬組成物。 ６７．治療上有効な量の請求項３０に記載の抗体と、製剤上許容される担体とを 含有する医薬組成物。 ６８．治療上有効な量の請求項３０に記載の抗体の結合ドメインを含有する前記 抗体の断片または誘導体と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。 ６９．被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療 または予防が望まれる被験者に、Notch タンパク質に結合可能な脊椎動物Serrat e タンパク質またはその誘導体を治療上有効な量で投与することを含んでなる前 記方法。 ７０．前記疾病または障害が、類似の非悪性腫瘍サンプルにおけるNotch 活性ま たは発現と比べて、高いNotch 活性、またはNotch タンパク質または抗Notch 抗 体によって結合され得るNotch 誘導体の高い発現によって特徴付けられる悪性腫 瘍である請求項６９に記載の方法。 ７１．前記疾病または障害が、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、精上皮腫およ び肺癌からなる群から選ばれる請求項６９に記載の方法。 ７２．前記被験者がヒトである請求項６９に記載の方法。 ７３．前記Serrate タンパク質がヒトSerrate タンパク質である請求項６９に記 載の方法。 ７４．被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療 または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の分子を投与すること含んでな り、前記分子が、(a)１０個のヌクレオチドを含有し、(b)脊椎動物のSerrate 遺 伝子に特異的なＲＮＡ転写物の少なくとも１０ヌクレオチド部分に完全に相補的 な配列を含有し、かつ(c)前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイズ可能なオリゴヌク レオチドである前記方法。 ７５．被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療 または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の請求項３４、３７または４６ に記載の核酸を投与することを含んでなる前記方法。 ７６．被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療 または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の請求項３２に記載の抗体を投 与することを含んでなる前記方法。 ７７．前記疾病または障害が中枢神経系の疾病または障害である請求項７３に記 載の方法。 ７８．１０個のヌクレオチドを含有し、かつ脊椎動物のSerrate 遺伝子に特異的 なＲＮＡ転写物の少なくとも１０ヌクレオチド部分に完全に相補的な配列を含有 する単離されたオリゴヌクレオチドであって、前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイ ズ可能である前記オリゴヌクレオチド。 ７９．請求項７８に記載のオリゴヌクレオチドと、製剤上許容される担体とを含 有する医薬組成物。 ８０．Serrate タンパク質をコードする核酸配列の細胞における発現の抑制方法 であって、前記細胞に、有効量の請求項７８に記載のオリゴヌクレオチドを供給 することを含んでなる前記方法。 ８１．患者における異常レベルのNotch-Serrate タンパク質の結合活性によって 特徴付けられる疾病または障害の診断方法であって、前記患者由来のサンプル中 のNotch タンパク質の、脊椎動物Serrate タンパク質への結合能を測定すること を含んでなり、正常な個体由来の類似サンプルで見られる結合能と比べて、前記 Notch タンパク質の、前記Serrate タンパク質への結合能の増加または減少が、 前記患者における前記疾病または障害の存在を示す前記方法。 ８２．患者由来のサンプルにおける脊椎動物Serrate タンパク質のレベルを測定 することを含んでなる、異常レベルのSerrate タンパク質によって特徴付けられ る前記患者における疾病または障害の診断方法であって、正常な個体由来の類似 サンプルで見られる前記Serrate タンパク質のレベルと比べて、前記Serrate タ ンパク質のレベルの増加および減少が、前記患者における前記疾病または障害の 存在を示す前記方法。
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