JP2008099687A - 脊椎動物Serrate遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列およびそれらに基づく方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト、ニワトリ等の脊椎動物から取得したSerrate遺伝子と、精製されたSerrateタンパク質、その誘導体、該タンパク質に対する抗体、さらにそれらを利用する医薬組成物、および関連疾患の診断方法。
【選択図】なし
Description
1.序論
本発明は脊椎動物Serrate遺伝子およびそれらによってコードされるタンパク質産物、ならびに上記タンパク質産物の誘導体および類似体に関する。脊椎動物Serrateタンパク質、誘導体および抗体の作製もまた提供される。本発明はさらに治療用組成物、ならびに診断および治療方法に関する。
ショウジョウバエにおける遺伝子分析は、複雑な発生経路を細かく調べ、そして相互作用している遺伝子座を同定するのに極めて有用であった。しかし、遺伝子の相互作用の下に横たわるプロセスの正確な性質を理解するには、該遺伝子のタンパク質産物の知識が必要である。
本発明は脊椎動物Serrate遺伝子(ヒトSerrate遺伝子および他の種の関連する遺伝子)のヌクレオチド配列、およびそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列、ならびにそれらの誘導体(例えば断片)および類似体に関する。前記のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーション可能な、またはそれに相補的な核酸もまた提供される。特定の実施態様において、前記Serrateタンパク質はヒトタンパク質である。
3.1.定義
本明細書においては、何ら強調なしに遺伝子の名前によって示されるタンパク質産物に対し、遺伝子の名前を強調したもの、つまりイタリック体にしたものまたは下線を引いたものは遺伝子を表すものとする。例えば、「Serrate」はSerrate遺伝子を示すものとし、これに対し「Serrate」はSerrate遺伝子のタンパク質産物を示すものとする。
4.図の説明
図1。Human Serrate-1(Human Jagged-1(HJ1)としても知られている)のヌクレオチド配列(配列番号1)およびタンパク質配列(配列番号2)。
本発明は脊椎動物Serrate遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する。本発明はさらに脊椎動物Serrateタンパク質の断片および他の誘導体、および類似体に関する。このような断片または誘導体をコードする核酸もまた本発明の範囲内にある。本発明は多数の異なる種の脊椎動物Serrate遺伝子、およびそれらによってコードされるタンパク質を提供する。本発明のSerrate遺伝子は、ヒトSerrateおよび脊椎動物種における関連する遺伝子(相同体)を含む。特定の実施態様において、Serrate遺伝子およびタンパク質は哺乳動物由来である。本発明の好ましい実施態様において、Serrateタンパク質はヒトタンパク質である。最も好ましい実施態様において、Serrateタンパク質はHuman Serrate-1 またはHuman Serrate-2 である。上記タンパク質および誘導体の例えば組換え法による作製が提供される。
5.1.Serrate遺伝子の単離
本発明は、脊椎動物Serrate核酸のヌクレオチド配列に関する。特定の実施態様において、脊椎動物Serrate核酸は図1(配列番号1)、図2(配列番号3)、図3(配列番号6)に示されるcDNA配列又はそれらのコード領域、又は脊椎動物Serrateタンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号2、4又は6の配列を有する)を含む。
5.2.Serrate遺伝子の発現
脊椎動物Serrateタンパク質またはその機能的に活性な断片または他の誘導体(第5.6 節参照)をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、天然の脊椎動物Serrate遺伝子および/またはそのフランキング領域によって供給することもできる。種々の宿主−ベクター系を用いてタンパク質コード配列を発現することができる。これらは、ウイルス(例:ワクシニアウイルス、アデノウイルス、等)によって感染させた哺乳動物細胞系;ウイルス(例:バキュロウイルス)によって感染させた昆虫細胞系;酵母ベクターを含有する酵母等の微生物;またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAによって形質転換した細菌を含むが、それらだけに限定されない。ベクターの発現要素は、その強度および特異性において異なる。使用する宿主−ベクター系により、多数の適切な転写および翻訳要素のうち任意のものを用いることができる。特定の実施態様において、Serrate遺伝子の接着性部分が発現される。別の特定の実施態様において、HumanSerrate 遺伝子またはヒトSerrate遺伝子の機能的に活性な部分をコードする配列(Human Serrate-1(HJ1)またはHumanSerrate-2(HJ2)、等)が発現される。さらに別の実施態様において、細胞外ドメインを含むSerrateの断片、または他の誘導体、またはSerrateの類似体が発現される。
5.3.Serrate遺伝子産物の同定および精製
特定の側面において、本発明は脊椎動物Serrate(好ましくはヒトSerrate相同体)、および抗原決定基を含む(すなわち、抗体によって認識されうる)、または機能的に活性なその断片および誘導体のアミノ酸配列、ならびにそれらをコードする核酸配列を提供する。本明細書に用いる「機能的に活性な」物質とは、全長(野性型)Serrateタンパク質に関連する1以上の公知の機能的活性〔例えば、Notchまたはその一部との結合、他の任意のSerrateリガンドとの結合、抗原性(抗Serrate抗体との結合)、等〕を示す物質をいう。
5.4.Serrate遺伝子およびタンパク質の構造
Serrate遺伝子およびタンパク質の構造を、当分野で公知の種々の方法によって分析することができる。
5.4.1.遺伝子分析
脊椎動物Serrate遺伝子に対応するクローン化DNAまたはcDNAを、サザンハイブリダイゼーション(Southern,E.M.,1975,J.Mol.Biol.98:503-517)、ノーザンハイブリダイゼーション(例えば、Freemanら,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4094-4098参照)、制限エンドヌクレアーゼマッピング(Maniatis,T.,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.)およびDNA配列分析を含むがこれらだけに限定されない方法によって分析することができる。ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR;米国特許第4,683,202、4,683,195および4,889,818号; Gyllensteinら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7652-7656; Ochmanら,1988,Genetics 120:621-623; Loh ら,1989,Science 243:217-220)およびその後のSerrate特異的プローブを用いたサザンハイブリダイゼーションは、種々の細胞型由来のDNA中におけるSerrate遺伝子の検出を可能とする。PCR以外の増幅方法もよく知られており、それらも採用することができる。1つの実施態様において、サザンハイブリダイゼーションを用いてSerrateの遺伝子的連結を確認することができる。ノーザンハイブリダイゼーション分析を用いてSerrate遺伝子の発現を確認することができる。種々の発生または活性状態にある種々の細胞型をSerrate発現に関して試験することができる。そのような技法およびそれらの結果の例を後出の第6節に記述する。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの両方についてのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、用いられた特定のSerrateプローブに対して所望の程度の関連性を有する核酸の検出を確実にするように操作することができる。
5.4.2.タンパク質分析
Serrateタンパク質のアミノ酸配列は、DNA配列からの推定により、または例えば自動アミノ酸シークエンサーを用いた上記タンパク質の直接配列決定により、引き出すことができる。代表的Serrateタンパク質のアミノ酸配列は図1に実質的に示す配列を含み、そして、アミノ酸番号30〜1219によって示される代表的成熟タンパク質と共に後出の第9節に詳述されている。
5.5.Serrateタンパク質およびその誘導体に対する抗体の生成
本発明によれば、脊椎動物Serrateタンパク質、その断片または他の誘導体、またはその類似体を免疫原として用いて、そのような免疫原を認識する抗体を生成することができる。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab 断片およびFab 発現ライブラリーを含むが、これらだけに限定されない。特定の実施態様において、ヒトSerrateに対する抗体が産生される。別の実施態様において、Serrateの細胞外ドメインに対する抗体が産生される。別の実施態様において、Serrateの細胞内ドメインに対する抗体が産生される。
5.6.Serrateタンパク質、誘導体および類似体
本発明はさらに脊椎動物Serrateタンパク質、およびSerrateタンパク質の誘導体(断片を含むがそれだけに限定されない)および類似体に関する。脊椎動物Serrateタンパク質誘導体およびタンパク質類似体をコードする核酸もまた提供される。1つの実施態様において、Serrateタンパク質は後出の第5.1 節に記述される脊椎動物Serrate核酸によってコードされる。特定の側面において、上記タンパク質、誘導体または類似体はカエル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、サル、またはヒトSerrateタンパク質である。
5.6.1.Serrate タンパク質の1以上のドメインを含有するSerrate誘導体
特定の1態様において、本発明は、脊椎動物Serrate 誘導体または類似体、特に、限定するわけではないが、細胞外ドメイン、DSL ドメイン、ELR ドメイン、システインに富んだドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、膜結合領域、およびSerrate タンパク質の1以上のEGF-様リピート単位(ELR)、または前記の任意の組合せを含む、Serrate タンパク質の1以上のドメインを含むか、またはこれらからなる脊椎動物Serrate 断片および誘導体に関する。ヒトおよびヒナドリSerrate タンパク質に関する特定の例について、それぞれ実施例第9および8節においてこうしたドメインが同定される。
5.6.2.トポリスミックタンパク質ドメインへの結合を仲介するSerrate誘導体
本発明はまた、トポリスミックタンパク質への結合を仲介する(そしてここではこれらを“接着性”と称する)脊椎動物Serrate 断片、およびこうした断片の類似体または誘導体、ならびにこれらをコードする核酸配列を提供する。
5.7.Serrate タンパク質、誘導体および類似体のアッセイ
脊椎動物Serrate タンパク質、誘導体および類似体の機能的活性を各種の方法によってアッセイすることができる。
5.8.治療上の用途
本発明は、本発明の治療用化合物の投与による細胞死または分化の障害の治療を提供する。こうした治療用化合物(ここでは、“治療剤(Therapeutics)”と称する)には以下のものが含まれる;脊椎動物Serrate タンパク質ならびにその類似体および誘導体(断片を含む)(例えばここに上記したもの);(ここに上記したような)それらに対する抗体;脊椎動物Serrate タンパク質、類似体または誘導体(例えばここに上記したもの)をコードする核酸;およびSerrate アンチセンス核酸。上述したように、本発明のアンタゴニスト治療剤は脊椎動物Serrate の機能および/またはNotch の機能(Serrate はNotch の1リガンドであるから)に対してアンタゴニスト作用または阻害をする治療剤である。こうしたアンタゴニスト治療剤は(例えばショウジョウバエにおける)遺伝学的アッセイも利用することができるが、最も好ましくは既知の通常のin vitroアッセイ、例えばSerrate の別のタンパク質(例えばNotch タンパク質)への結合を阻害する、または好ましくはin vitroでまたは細胞培養物中でアッセイされる任意の既知のNotch またはSerrate の機能を阻害する能力に基づくものを使用することによって、同定される。好ましい態様において、アンタゴニスト治療剤はNotch への結合を仲介するSerrate の断片などの機能的に活性な断片を含むタンパク質またはその誘導体、もしくはそれらに対する抗体である。別の特定の態様において、こうしたアンタゴニスト治療剤はNotch に結合するSerrate の断片を含む分子を発現することができる核酸、またはSerrate アンチセンス核酸(本文の第5.11節参照)である。特定の治療剤の効果および罹病した組織の治療にとってその投与が必要かどうかを判定するために、好ましくは下記のような適当なin vitroまたはin vivo アッセイを利用すべきであることを留意すべきである。なぜならば、組織の罹病の進行経過によってアンタゴニストまたはアゴニスト治療剤のどちらが必要とされるかが決まるからである。
5.8.1.悪性疾患
拮抗治療薬または作用治療薬を介在させたときの効能について上述したように試験することができるとともに、治療薬の効用の徴候の観察に基づいて治療することができる悪性または前腫瘍状態としては、以下の5.8.1および5.9.1節に記載のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
5.8.2.神経系障害
拮抗治療薬または作用治療薬を介在させたときの効能について上述したように試験することができるとともに、治療薬の効用の徴候の観察に基づいて治療することができる細胞型を含む神経系障害としては、軸索の切断、ニューロンの縮小もしくは退化、または髄鞘脱落のいずれかを生じる神経系損傷および疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明にしたがって患者(ヒトおよびヒト以外の哺乳類の患者を含む)の治療が可能な神経系病変としては、中枢神経系(脊髄、脳を含む)または末梢神経系の以下の病変が挙げられるが、これらに限定されるものではない:
(i)外傷性病変(物理的損傷により生じるかまたは手術に伴う病変、例えば、神経系の一部を切断する病変または圧迫性損傷が含まれる);
(ii)虚血性病変(神経系の一部で酸素が欠乏することにより神経損傷を生じるかまたは死亡するもので、脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が含まれる);
(iii)悪性病変(神経系関連悪性疾患または非神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織によって、神経系の一部が破壊または損傷を受けたもの);
(iv)感染性病変(感染の結果として、例えば、膿瘍によって、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状庖疹ウイルス、もしくは単純庖疹ウイルスの感染と関連して、またはライム病、結核、梅毒と関連して、神経系の一部が破壊または損傷を受けたもの);
(v)変性性病変(変性過程の結果として神経系の一部が破壊または損傷を受けたもので、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症が含まれるが、これらに限定されるものではない);
(vi)栄養性疾患または障害に関連した病変(栄養障害または代謝異常によって神経系の一部が破壊または損傷を受けたもので、ビタミンB12欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、たばこ性‐アルコール性弱視、マルキアファーヴァ‐ビニャミ病(脳梁の原発性変性)及びアルコール性小脳変性が含まれるが、これらに限定されるものではない);
(vii)全身性疾患に関連した神経系病変(糖尿病(糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺)、全身性紅斑性狼瘡、癌腫、またはサルコイドーシスが含まれるが、これらに限定されるものではない);
(viii)毒性物質、例えば、アルコール、鉛、または特定の神経毒によって引き起こされる病変;及び
(ix)脱髄病変(脱髄疾患によって神経系の一部が破壊または損傷を受けたもので、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシーまたは種々の病因、進行性多病巣白質脳症、および橋中央ミエリン溶解が含まれるが、これらに限定されるものではない)。
(i)培養中のニューロンの生存時間の増大;
(ii)培養中またはin vivoでのニューロンの発芽の増大;
(iii)培養中またはin vivoでのニューロン関連分子(例えば、運動ニューロンに関するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ)の生成の増大;
(iv)in vivoでのニューロン機能不全の徴候の増大。
5.8.3.組織修復および再生
本発明のもう1つの実施態様において、組織再生および修復を促進するために、本発明の治療薬が使用される(例えば、良性異常増殖疾患の治療のために使用されるが、これに限定されるものではない)。特定の実施態様は、肝硬変(瘢痕が正常な肝臓再生過程を阻害する状態)の治療、ケロイド(過形成性瘢痕)形成(瘢痕過程により正常の更新が妨害されて皮膚の美観が損なわれた状態)、乾癬(皮膚の過剰増殖および固有細胞運命決定の遅延を特徴とするよく見かける皮膚の状態)、および禿頭症(末端分化毛包(Notchに富んだ組織)が正常に機能しない状態)の治療に関連する。もう1つの実施態様において、本発明の治療薬を使用して、内耳の感覚上皮の変性性疾患または外傷性疾患の治療を行う。
5.9.予防的使用
5.9.1.悪性疾患
本発明の治療薬は、腫瘍状態または悪性状態への進行を防止するために投与できる。これには表1に列挙した疾患が対象となるが、これらに限定されるものではない。こうした投与が行えるのは、上述したアッセイにおいて治療薬がこうした疾患の治療または防止に有効であることが示された場合である。こうした予防的使用が利用できるのは、上述したような腫瘍または癌へ進化することが知られているか、またはそうした進化の疑いのある状態のとき、具体的には、過形成、化生、または特に異形成が関与した非腫瘍性細胞成長が起こったときである(こうした異常成長状態の総説については、Robbins 及びAngell,1976,Basic Pathology,第2版.,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,pp.68-79を参照されたい)。過形成とは、組織または器官の中の細胞数の増加が関係する調節された細胞増殖の形態のことであり、構造または機能上の有意な変化は見られない。1つだけ例を挙げると、子宮内膜過形成は、しばしば子宮内膜癌へ進行する。化生とは、成人細胞(すなわち十分に分化した細胞)の1つのタイプが成人細胞のもう1つのタイプと置き換わる調節された細胞成長の形態のことである。化生は、上皮組織細胞または結合組織細胞で起こる可能性がある。非定型性化生には、いくらか障害を有する化生性上皮が含まれる。異形成とは、しばしば癌の前兆となるものであり、主に上皮に見うけられる;これは非腫瘍性細胞成長の中で最も障害を有する形態であり、それぞれの細胞の均一性および細胞の構造上の配列が失われる。異形成細胞はしばしば異常に大きくかつ強く染色された核を有し、多形性を呈する。異形成は、慢性的刺激または炎症が起こるの場合に特徴的に生じるもので、頸部、呼吸経路、口腔、および胆嚢によく見うけられる。
5.9.2.他の障害
他の実施態様において、本発明の治療薬を投与して、5.8.2.節に記載の神経系障害または5.8.3.節に記載の他の障害(例えば、肝硬変、乾癬、ケロイド、禿頭症)を防ぐことができる。
5.10.治療または予防の効用の実証
本発明の治療薬をin vivoで試験して、所望の治療活性または予防活性を調べることができる。例えば、こうした化合物を好適な動物モデル系で試験してからヒトにおいて試験することができる。好適な動物としては、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。in vivo試験に対しては、ヒトに投与する前に、当該技術分野で公知のいかなる動物モデル系を使用してもよい。
5.11.Serrate発現のアンチセンス調節
本発明は、脊椎動物Serrateまたはその一部をコードする遺伝子またはcDNAに対してアンチセンスである少なくとも6個または少なくとも10個のヌクレオチドの核酸の治療または予防への使用を提供する。本明細書中で使用される「アンチセンス」とは、ある種の配列相補性によって脊椎動物SerrateRNA(好ましくはmRNA)の一部とハイブリッドを形成することが可能な核酸を意味する。こうしたアンチセンス核酸は、本発明の拮抗治療薬としての効用を有し、セクション5.8およびそのサブセクションに既に記載したような障害の治療または予防に使用することができる。
5.11.1.脊椎動物Serrateアンチセンス核酸
脊椎動物Serrateアンチセンス核酸は、少なくとも6個のヌクレオチド、好ましくはオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチドの数の好ましい範囲は10個〜約50個である)から成る。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、Serrate遺伝子に対してアンチセンスである少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、または少なくとも200個のヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、DNAもしくはRNA、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体であってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはホスフェート主鎖を修飾してもよい。オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の追加基、あるいは細胞膜(例えば、Letsinger et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556; Lemaitre et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公開第WO88/09810号を参照されたい)もしくは血液脳関門(例えば、1988年4月25日公開のPCT公開第WO89/10134号を参照されたい)を通過する輸送の促進剤、ハイブリダイゼーションに起因する開裂剤(例えば、Krol et al.,1988,BioTechniques 6:958-976を参照されたい)、またはインターカレート剤(例えば、Zon,1988,Pharm.Res.5:539-549を参照されたい)が含まれていてもよい。
5.11.2.脊椎動物Serrateアンチセンス核酸の治療上の効用
脊椎動物Serrateアンチセンス核酸を使用して、SerrateまたはNotchを発現することが分かっている細胞タイプの悪性疾患または他の障害を治療(または防止)することができる。特定の実施態様において、悪性疾患とは、頸部癌、乳癌、もしくは結腸癌、または扁平上皮腺癌のことである。こうした発現を試験することができる悪性細胞、腫瘍性細胞、および前腫瘍性細胞としては、セクション5.8.1および5.9.1で既に記載した細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様において、一本鎖DNAアンチセンスSerrateオリゴヌクレオチドが使用される。
5.12.治療/予防のための投与および組成物
本発明は、有効量の本発明の治療薬を被検者に投与することによって治療(および予防)を行う方法を提供する。好ましい態様において、治療薬は実質的に精製されたものである。被検者は好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物が含まれ、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明は、医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療上有効な量の治療薬及び製剤学的に許容できる担体を含む。特定の態様において、「製剤学的に許容できる」という用語は、連邦政府又は州政府の統制機関によって認可された、ということ又は動物、より特定的にはヒトにおける使用のための米国薬局方もしくは他の一般的に認可された薬局方に記載された、ということを意味する。
5.13.診断的効用
脊椎動物Serrate タンパク質、類似体、誘導体及びその部分配列(subsequences)、脊椎動物Serrate 核酸(及びそれと相補的な配列)、抗脊椎動物Serrate 抗体は、診断における用途を有する。そのような分子は、Serrate 発現に影響する種々の病態、疾患及び障害を検出し、予知し、診断し、もしくは監視するために、又はその治療を監視するために、イムノアッセイ等のアッセイに用いることができる。特に、そのようなイムノアッセイは、患者から得られたサンプルを免疫特異的結合が生じ得るような条件下で抗Serrate 抗体と接触させ、その抗体による全特異的結合の量を検出又は測定することを含む方法によって行うことができる。特定の態様においては、好ましくは抗Notch 抗体との結合との関連における組織区分(tissue sections)でのそのような抗体の結合を用いて、疾患状態におけるNotch 及び/又はSerrate の異常な局在化又は異常なレベルのNotch-Serrate 共同局在化を検出することができる。特定の態様においては、Serrate に対する抗体を用いて、患者の組織又は血清サンプルにおけるSerrate の存在(そのSerrate の異常なレベルは疾患症状の指標になる。)をアッセイすることができる。内因性Notch タンパク質におけるSerrate 結合能力の異常なレベル、又は内因性Serrate タンパク質におけるNotch(又は他のSerrate リガンド)に対する結合能力の異常なレベルは、細胞運命(cell fate)の障害(例えば、癌等)の指標となり得る。「異常なレベル」とは、体の一部分由来の類似のサンプル又はその障害を有さない被験者由来の類似のサンプル中に存在するレベル又は該レベルを代表する標準レベルに比べて高い又は低いレベルを意味する。
M-Serrate -1と称するマウスSerrate 相同体を下記のようにして単離した:
マウスSerrate -1遺伝子
組織起源:10.5日齢マウス胎仔RNA
単離法:
a)上記のRNAに対するcDNAをランダムプライミング
b)下記を用いた上記cDNAのPCR
増幅条件:供給バッファー50μl にcDNA 50ng、プライマー各1μg、dNTP's 0.2mM、Taq 1.8U(Perkin-Elmer)を入れた液、94℃/30秒、45℃/2分、72℃/1分で40サイクル、各サイクルを2秒延長。
発現パターン:発現パターンは、発達中の中枢神経系、末梢神経系、肢、腎臓、水晶体、及び脈管系における発現を含む、C-Serrate -1(ニワトリSerrate)(下記の第11節参照)で観察されたものと同様であると決定された。
7.ツメガエルSerrate 相同体の単離及び特性付け
ツメガエル Serrate-1と称するツメガエルSerrate 相同体を下記のようにして単離した:
ツメガエルSerrate -1遺伝子
組織起源:神経胚期の胚RNA
単離法:
a)上記のRNAに対するcDNAをランダムプライミング
b)下記を用いたPCR
増幅条件:供給バッファー50μl にcDNA 50ng 、プライマー各1μg 、dNTP's 0.2mM、Taq 1.8U(Perkin-Elmer)を入れた液、94℃/30秒、45℃/2分、72℃/1分で40サイクル、各サイクルを2秒延長。
8.ニワトリ(CHICK)Serrate 相同体の単離及び特性付け
本実施例では、ニワトリSerrate 相同体C-Serrate 、並びに2つのニワトリNotch 相同体C-Notch -1及びC-Notch -2の断片のクローニング及び配列を、初期胚形成中のそれらの発現パターンとともに報告する。C-Serrate の転写のパターンは胚の多くの領域におけるC-Notch -1の転写のパターンと共通点があり、これは、C-Notch-1 が、ショウジョウバエのNotch のように、Serrate の受容体であることを示唆するものである。特に、Notch 及びSerrate は、発達中の中枢及び抹消神経系の神経形成領域において発現する。
材料及び方法
胚
白レグホンニワトリの卵をパークファーム大学(University Park Farm)から入手し、38℃でインキュベートした。胚をHamburger 及びHamilton(1951,J.Exp.Zool.88:49-92)にしたがって段階づけした(staged)。
Notch のニワトリ相同体のクローニング
ニワトリNotch1及びNotch2遺伝子の約1000塩基対PCR断片を、縮重プライマー及びLardelli及びLendahl(1993,Exp.Cell.Res.204:364-372)に概説されたPCR条件を用いて、耳外植片RNA(下記参照)から増幅した。そのPCR断片をBluescript KS-にサブクローニングし、配列決定してDIGアンチセンスRNAプローブの作成用の鋳型として用いた(RNA転写キット,Stratagene; DIG RNA標識混合物,Boehringer Mannheim)。
ショウジョウバエSerrate のニワトリ相同体のクローニング
耳外植片を段階8から段階13の胚から切断した。各耳外植片は、2つの耳杯、後脳及び咽頭の間にある短い区画、並びにそれに結びついた頭外胚葉及び間葉から構成されていた。RNAを標準プロトコール(Sambrook et al.,1989,in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク)を一部変更したものを用いて抽出し、ポリA+mRNAを PolyATtractmRNA単離システム(Promega)を用いて全RNAから単離した。第1のcDNA鎖をSuperScript Preamplificationシステム(Gibco)を用いて合成した。
1)プライマー1,5-CGI(T/C)TITGC(T/C)TIAA(G/A)(G/C)AITA(C/T)CA-3'(配列番号17)は、ハエDelta タンパク質及びSerrate タンパク質のアミノ末端に位置するモチーフRLCLK(E/H)YQ(配列番号18)に相当する。
1)段階8〜13の耳外植片をランダムプライミングしたcDNAライブラリー
2)段階17のニワトリ脊髄をオリゴdTプライミングしたcDNAライブラリー
をスクリーニングすることによってより大きなcDNAクローンを回収した。共通しているcDNAを単離し、その遺伝子の全コーディング領域をいっしょにほとんどカバーする2つ(9及び3A.1という)をBluescript KS-にサブクローニングした。DNA配列を、2本鎖Nested Deletion キット(Pharmacia)、及びシークエナーゼ酵素(米国Biochemical Corporation)を用いるサンガージデオキシチェーンターミネーション法を用いて作製したネスト欠失シリーズ(nested deletion series)から決定した。配列を一列に並べてGenewarks 2.3 及びIntelligenetics を用いて分析した。相同性調査はプログラムSharq を用いて行った。
in situ ハイブリダイゼーション
遺伝子転写のパターンをDIG標識RNAプローブ、並びに:
1)高度にストリンジェントな全載(high-stringency wholemount)in situ ハイブリダイゼーションプロトコール、及び
2)Strahle ら(1994,Trends in Genet.10:7)のプロトコールに基づいたクリオスタット区画上でのin situ ハイブリダイゼーション
を用いるin situ ハイブリダイゼーションによって決定した。
結果
脊椎動物胚中のニワトリSerrate の可能性のある役割を見抜くために、Notch とSerrate の機能的結合がショウジョウバエ中で生じているということから、そのSerrate 発現とニワトリNotch の発現との関係を調べた。2つのニワトリNotch 相同体を下記のようにして得た。
C-Notch -1及びC-Notch -2は、それぞれ、齧歯類Notch -1及びNotch -2遺伝子の明白な相対物である
2日齢ニワトリ胚から調製したcDNA及び公知の齧歯類Notch 相同体と共通の保存領域に基づいた縮重プライマーを用いて、PCRによってニワトリ中のNotch 相同体を調査した。この方法において、C-Notch-1及びC-Notch -2と呼ばれている2つの別個の遺伝子のそれぞれ長さ約1000ヌクレオチド断片を得た。それらの断片は第3のNotch/lin12 リピートから最後の5つほどのEGF様リピートを含むものにまで伸長する。EGF様リピートは、非常に多くのタンパク質(その大部分は、他の点ではNotch とは関係がない)に存在する。しかしながら、3つのNotch/lin12 リピートは、Notch 遺伝子ファミリーに特有のものであり、その公知のメンバー全てで見出される。C-Notch -1は、齧歯類Notch1(Weinmasterら,1991,Development 113:199-205)と高度のアミノ酸同一性を示し、齧歯類Notch1と概ね似たようなドメインで発現する(下記参照)。齧歯類Notch 遺伝子の中で、C-Notch -2はNotch 2(Weinmasterら,1992,Development 116:931-941)とほとんど類似しているようである。
ショウジョウバエにおいては、Notchに対する2つのリガンドが知られており、関連する2つの遺伝子Delta 及びSerrate によりコードされている。これらの遺伝子に対応するアミノ酸配列は、Notchに対するin vitro結合に必要でありかつ十分な領域、DSL モチ−フを含む5'末端において相同である。Sarrate のニワトリ相同体の断片を単離するために、DSL モチ−フのいずれかの側の配列を認識するように設計されたPCR 及び縮重プライマーを使用した(材料及び方法を参照)。900塩基対のPCR 断片を回収し、ライブラリーをスクリーニングするのに使用し、オーバーラップcDNAクローンを単離することができた。これらのcDNAクローンのDNA配列は、いくつかの5'塩基のみを欠く、3582ヌクレオチドの殆ど完全な単一のオープンリーディングフレームを示すものであった。ショウジョウバエ Delta及びSerrate のアミノ酸配列との比較により、ニワトリSerrate タンパク質のシグナル配列の部分をコードするコード配列の部分のみが失われていることが示された。
C-Serrate は中枢神経系、頭プラコード、腎中胚葉、脈管系、及び体肢芽間葉において発現される
ステージ4〜ステージ21の早期の胚形成の間に、約12時間の間隔で、全載標本中においてin situ ハイブリダイゼーションを行い、C-Serrateの発現を調べた。後期の段階については凍結切片についてin situ ハイブリダイゼーションを行うことにより調べた。
中枢神経系
C-Serrate の最初の検出可能な発現は、段階6(0体節/24時間)における中枢神経系において、神経板の背面部分内で見られた。段階10(9〜10体節/35.5 時間)までに、間脳予定域において強い縞状の発現が見られた。菱脳及び脊髄予定域において別の弱い染色が見られた。
頭プラコード
C-Serrate が、全ての頭プラコード、即ち水晶体プラコード、鼻プラコード、耳プラコード/耳胞及び上鰓プラコードに発現され、三叉神経プラコード(形態学的には十分に確定されていない)に対応し得る、耳プラコード前部に対する頭蓋外胚葉パッチに発現されることは驚くべきことである。
腎中胚葉
発生中の中腎細管中のステージ10及びより段階の進んだ胚(ステージ17〜21)からの中間中胚葉の細胞において発現が検出された。
体肢芽
C-Serrate mRNAは、発生中の体肢芽の遠位端における間葉のパッチに局在していた。これは体肢の成長における役割を示唆している可能性がある。
その他の部位
発現は、尾芽、尿膜柄においても見られ、後期においてはおそらくその他の組織においても見られるであろう。
C-Serrate 発現の全ての主要な部位はC-Notch-1発現のドメイン内にある
C-Serrate のDSLドメイン及び隣接するN-末端領域が保存されていることは、それがNotchファミリーに属する受容体についてのリガンドとして機能することを示唆している。従って、C-Serrate発現がNotch遺伝子の発現を伴う部位が見出されるであろうと予測された。そのような部位においては、Serrate-Notchシグナリングにより細胞が連絡を取り合っていることを示すものとして、2つの遺伝子のオーバーラップした、あるいは連続的な発現が起こり得る。実際にどのようなオーバーラップが起こるのかを発見するために、インキュベーション8日(E8)までのステージの範囲にわたって、in situ ハイブリダイゼーションにより示される、C-Serrate の発現パターンをC-Notch-1のものと比較した。C-Serrate 発現の観察された部位の全ては実際に、C-Notch-1 の発現ドメイン内あるいは非常に近い位置にあった(表III)。
考察
ショウジョウバエの発生においては、Notch遺伝子の産物を介した細胞間シグナリングが、分化した細胞型の詳細なパターンを特定する最終的な細胞の予定運命決定において主要な役割を果している。このシグナリング経路においてはNotchタンパク質がトランスメンブラン受容体として同定されており、この経路は神経発生におけるその役割において最もよく知られているものである。即ち、NotchあるいはNotchを介するシグナル伝達に必要なその他の遺伝子の任意のセットにおける機能欠失突然変異が神経外胚葉における細胞の予定運命を変え、表皮性のはずであった細胞を代わりに神経性のものにするはずである。しかしNotch-依存性シグナリングは、神経組織におけるのと同様に非神経組織においても重要である。これは例えば、卵子発生、筋発生、マルピギー管の形成、及び消化管において、そして網膜、末梢小感覚体及び中枢神経系の発生において、分化のモードの選択を制御する。これらの場合の殆どにおいて、Notchにより伝達されるシグナルは側方抑制を媒介するようであり、側方抑制とは特定の経路で分化するようになった細胞、例えば神経芽細胞が、そのごく近傍にあるものが同様な行動をとることを阻害するという細胞の相互作用の一種である。これにより隣接する細胞は異なる経路で行動するようにされ、異なる細胞種のきめこまかいパターンを形成する。
9.ヒトSerrate 相同体の単離と特徴付け
ヒトSerrate 配列のクローンを以下に記載するようにして得た。
従って、全ELR ドメインはアミノ酸番号234-896(配列番号1のヌクレオチド番号1070-3058 によりコードされる)である。細胞外ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1-1067であると予測され、配列番号1のヌクレオチド番号371-3571によりコードされる(成熟タンパク質中のアミノ酸番号30-1067;配列番号1のヌクレオチド番号458-3571によりコードされる)。細胞内(細胞質)ドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1090-1218 であると予測され、配列番号1のヌクレオチド番号3638-4024 によりコードされる。
従って、全ELR ドメインはアミノ酸番号75-735(配列番号3のヌクレオチド番号554-2536によりコードされる)である。細胞外ドメインは、配列番号4のアミノ酸番号1-912であると予測され、配列番号3のヌクレオチド番号332-3064によりコードされる。細胞内(細胞質)ドメインは、配列番号4のアミノ酸番号934-1257であると予測され、配列番号3のヌクレオチド番号3131-4102 によりコードされる。
10.微生物の寄託
完全長ヒトSerrate-1(HJ1)をコードするEcoRI 断片を含むプラスミドpBS39 は、American Type Culture Collection,1201 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、1995年2月28日に寄託し、受託番号97068 を得た。
Claims (82)
- 精製された脊椎動物のSerrateタンパク質。
- ヒトのタンパク質である請求項1に記載のタンパク質。
- 哺乳動物のタンパク質である請求項1に記載のタンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸番号30〜1218に実質的に記載されているアミノ酸配列を含有する請求項2に記載のタンパク質。
- 配列番号4のアミノ酸番号1〜1257に実質的に記載されているアミノ酸配列を含有する請求項2に記載のタンパク質。
- ATCCに寄託されて受託番号68876号を指定されたプラスミドSerFLまたは該プラスミド中のSerrate配列にハイブリダイズ可能な核酸によってコードされる精製されたヒトタンパク質。
- ATCCに寄託されて受託番号97068号を指定されたプラスミドpBS39によってコードされる請求項2に記載のタンパク質。
- ATCCに寄託されて受託番号 号を指定されたプラスミドpBS15によってコードされるSerrateアミノ酸配列を含有する請求項2に記載のタンパク質。
- ATCCに寄託されて受託番号 号を指定されたプラスミドpBS3-2によってコードされるSerrateアミノ酸配列を含有する請求項2に記載のタンパク質。
- 請求項1のタンパク質の精製された断片であって、Serrateタンパク質の1つ以上の機能活性を示すことが可能である前記断片。
- 請求項2のタンパク質の精製された断片であって、ヒトまたはキイロショウジョウバエ(D.melanogaster)のSerrateタンパク質の1つ以上の機能活性を示すことが可能である前記断片。
- ヒトのSerrateタンパク質に対する抗体と結合可能である請求項2または7に記載のタンパク質の精製された断片。
- 請求項10に記載の断片を含有する分子。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質の精製された断片であって、前記タンパク質の細胞外ドメイン、DSLドメイン、表皮増殖因子様のリピートドメイン、システインに富むドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインからなる群から選ばれるドメインを含有する前記断片。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質の精製された断片であって、前記タンパク質のDSLドメインを含有する前記断片。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質の精製された断片であって、前記タンパク質の表皮増殖因子に相同性のリピートを含有する前記断片。
- 前記Serrateタンパク質がヒトSerrateタンパク質である請求項14に記載の断片。
- Notchタンパク質またはDeltaタンパク質に相同性の領域を含有し、かつ少なくとも10個のアミノ酸からなる脊椎動物のSerrateタンパク質の精製した断片。
- Serrateタンパク質ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列に共有結合によって融合している少なくとも10個のアミノ酸からなる脊椎動物のSerrateタンパク質の断片を含有するキメラタンパク質。
- Serrateタンパク質の前記断片が抗Serrate抗体によって結合され得る断片である請求項19に記載のキメラタンパク質。
- 前記Serrateタンパク質がヒトのタンパク質である請求項19に記載のキメラタンパク質。
- Serrateタンパク質の1つ以上の機能活性を示すことが可能である請求項19に記載のキメラタンパク質。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質の精製した断片であって、(a)抗Serrate抗体によって結合可能であり、(b)前記タンパク質の膜貫通および細胞内ドメインを欠失しており、かつ(c)前記Serrateタンパク質の少なくとも10個のアミノ酸からなる前記断片。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質の精製した断片であって、(a)抗Serrate抗体によって結合可能であり、(b)前記タンパク質の細胞外ドメインを欠失しており、かつ(c)前記Serrateタンパク質の少なくとも10個のアミノ酸からなる前記断片。
- Notchタンパク質に結合可能な脊椎動物Serrateタンパク質の精製した断片。
- 前記Serrateタンパク質の表皮増殖因子様リピートを欠失している請求項25に記載の断片。
- 前記Serrateタンパク質がヒトSerrateタンパク質である請求項23、24、25または26に記載の断片。
- 配列番号2または配列番号4の断片である請求項29に記載の断片。
- 請求項25に記載の断片を含有する分子。
- 請求項1に記載のSerrateタンパク質と結合可能であり、かつショウジョウバエ(Drosophila)のSerrateタンパク質とは結合しない抗体。
- 請求項2に記載のSerrateタンパク質と結合可能であり、かつショウジョウバエ(Drosophila)のSerrateタンパク質とは結合しない抗体。
- モノクローナルである請求項30に記載の抗体。
- 請求項32に記載の抗体の断片を含有する分子であって、該断片が脊椎動物のSerrateタンパク質と結合可能である前記分子。
- 脊椎動物のSerrateタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸。
- DNAである請求項34に記載の核酸。
- 請求項34に記載のヌクレオチド配列に完全に相補的なヌクレオチド配列を含有する単離した核酸。
- 請求項2に記載のSerrateタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸。
- ATCCに寄託して受託番号97068号を指定されたプラスミドpBS39に含有されるSerrateコード配列を含有する単離した核酸。
- ATCCに寄託して受託番号68876号を指定されたプラスミドSerFLおよび該プラスミド中のSerrate配列にハイブリダイズ可能な単離したヒト核酸。
- ATCCに寄託して受託番号 号を指定されたプラスミドpBS3-2に含有されるSerrateコード配列を含有する単離した核酸。
- ATCCに寄託して受託番号 号を指定されたプラスミドpBS15に含有されるSerrateコード配列を含有する単離した核酸。
- タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸であって、前記タンパク質が配列番号4のアミノ酸番号1〜1257を含有する前記核酸。
- 少なくとも8個のヌクレオチドからなる脊椎動物のSerrate遺伝子の断片を含有する単離された核酸。
- 請求項14、15、16または25に記載の断片をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸。
- 前記断片がヒトSerrateタンパク質の断片である請求項44に記載の核酸。
- 請求項12に記載の断片をコードするヌクレオチド配列を含有する単離された核酸。
- タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離した核酸であって、前記タンパク質が配列番号2のアミノ酸番号30〜1218を含有する前記核酸。
- 請求項21に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する単離された核酸。
- 請求項34、37または43に記載の核酸を含有する組換え細胞。
- 請求項38、40または41に記載の核酸を含有する組換え細胞。
- 請求項34または37に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされた前記Serrateタンパク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現されたSerrateタンパク質を回収する工程とを包含するSerrateタンパク質の生成方法。
- 請求項38、40または41に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされたSerrateタンパク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現されたSerrateタンパク質を回収する工程とを包含するSerrateタンパク質の生成方法。
- 請求項45に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされたタンパク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現されたタンパク質を回収する工程とを包含するタンパク質の生成方法。
- Serrateタンパク質の断片を含有するタンパク質の生成方法であって、請求項46に記載の核酸を含有する組換え細胞を増殖させて、コードされたタンパク質が前記細胞によって発現されるようにする工程と、前記発現されたタンパク質を回収する工程とを包含する前記方法。
- 請求項51に記載の方法による生産物。
- 請求項52に記載の方法による生産物。
- 請求項53に記載の方法による生産物。
- 請求項54に記載の方法による生産物。
- 治療上有効な量の脊椎動物Serrateタンパク質と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 前記Serrateタンパク質がヒトSerrateタンパク質である請求項59に記載の組成物。
- 治療上有効な量の請求項14、15、16または25に記載の断片と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 治療上有効な量の請求項12に記載の断片と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 脊椎動物Serrateタンパク質の断片を含有する分子を治療上有効な量で含有する医薬組成物であって、その誘導体または類似体が、Notchタンパク質への結合能、またはNotchタンパク質の表皮増殖因子様リピート11および12を含有する分子への結合能により特徴付けられる前記組成物。
- 治療上有効な量の請求項34、36または37に記載の核酸と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 治療上有効な量の請求項44に記載の核酸と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 治療上有効な量の請求項46に記載の核酸と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 治療上有効な量の請求項30に記載の抗体と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 治療上有効な量の請求項30に記載の抗体の結合ドメインを含有する前記抗体の断片または誘導体と、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- 被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療または予防が望まれる被験者に、Notchタンパク質に結合可能な脊椎動物Serrateタンパク質またはその誘導体を治療上有効な量で投与することを含んでなる前記方法。
- 前記疾病または障害が、類似の非悪性腫瘍サンプルにおけるNotch活性または発現と比べて、高いNotch活性、またはNotchタンパク質または抗Notch抗体によって結合され得るNotch誘導体の高い発現によって特徴付けられる悪性腫瘍である請求項69に記載の方法。
- 前記疾病または障害が、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、精上皮腫および肺癌からなる群から選ばれる請求項69に記載の方法。
- 前記被験者がヒトである請求項69に記載の方法。
- 前記Serrateタンパク質がヒトSerrateタンパク質である請求項69に記載の方法。
- 被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の分子を投与すること含んでなり、前記分子が、(a)10個のヌクレオチドを含有し、(b)脊椎動物のSerrate遺伝子に特異的なRNA転写物の少なくとも10ヌクレオチド部分に完全に相補的な配列を含有し、かつ(c)前記RNA転写物にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである前記方法。
- 被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の請求項34、37または46に記載の核酸を投与することを含んでなる前記方法。
- 被験者の疾病または障害を治療または予防する方法であって、かかる治療または予防が望まれる被験者に、治療上有効な量の請求項32に記載の抗体を投与することを含んでなる前記方法。
- 前記疾病または障害が中枢神経系の疾病または障害である請求項73に記載の方法。
- 10個のヌクレオチドを含有し、かつ脊椎動物のSerrate遺伝子に特異的なRNA転写物の少なくとも10ヌクレオチド部分に完全に相補的な配列を含有する単離されたオリゴヌクレオチドであって、前記RNA転写物にハイブリダイズ可能である前記オリゴヌクレオチド。
- 請求項78に記載のオリゴヌクレオチドと、製剤上許容される担体とを含有する医薬組成物。
- Serrateタンパク質をコードする核酸配列の細胞における発現の抑制方法であって、前記細胞に、有効量の請求項78に記載のオリゴヌクレオチドを供給することを含んでなる前記方法。
- 患者における異常レベルのNotch-Serrateタンパク質の結合活性によって特徴付けられる疾病または障害の診断方法であって、前記患者由来のサンプル中のNotchタンパク質の、脊椎動物Serrateタンパク質への結合能を測定することを含んでなり、正常な個体由来の類似サンプルで見られる結合能と比べて、前記Notchタンパク質の、前記Serrateタンパク質への結合能の増加または減少が、前記患者における前記疾病または障害の存在を示す前記方法。
- 患者由来のサンプルにおける脊椎動物Serrateタンパク質のレベルを測定することを含んでなる、異常レベルのSerrateタンパク質によって特徴付けられる前記患者における疾病または障害の診断方法であって、正常な個体由来の類似サンプルで見られる前記Serrateタンパク質のレベルと比べて、前記Serrateタンパク質のレベルの増加および減少が、前記患者における前記疾病または障害の存在を示す前記方法。
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