JP3851653B2 - ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物 - Google Patents

ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物 Download PDF

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Description

１．序論
本発明は、ノッチ（Notch）タンパク質、その類似体および誘導体、これらに対する抗体、ノッチタンパク質、その誘導体および類似体をコードする核酸、ノッチアンチセンス核酸、ならびにノッチと結合するトポリズミック（toporythmic）タンパク質およびその核酸および抗体を含有する治療用組成物に関する。治療および診断方法も提供する。
２．発明の背景
2.1. ノッチ遺伝子およびタンパク質
接合体の神経形成遺伝子座、すなわちNotch(N)、Delta(Dl)、mastermind(mam)、Enhancer of split (E(spl))、neuralized(neu)およびbig brain(bib)、のいずれか１つのヌル（null）突然変異は腹側および外側の表皮構造を犠牲にして神経系の肥大をもたらす。この作用は表皮前駆細胞の神経経路へのミスルートによるものであり、神経形成遺伝子機能が神経形成領域内の細胞を神経細胞の運命から上皮細胞の運命へと向きを変える必要があることを示唆している。バッタ（grasshopper）の特定の胚性神経芽細胞のレーザー切除の成果を調べる研究（Doe and Goodman, 1985, Dev. Biol. 111, 206-219）から、神経芽細胞と周囲の補助細胞との細胞相互作用は、補助細胞が神経芽細胞の運命を運ぶのを妨げるのに役立つことが見いだされた。同時に、これらの遺伝的および発生的観察は、神経形成遺伝子座のタンパク質産物が適切な表皮発生に必要な細胞相互作用機構の成分として機能するという仮説を提起させた（Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100）。
配列解析（Whartonら, 1985, Cell 43, 567-581; Kiddら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassinら, 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynskiら, 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735）から、２つの神経形成遺伝子座、つまりノッチ（Notch）およびデルタ（Delta）、は膜を１回貫通する貫貫通タンパク質をコードしているらしいことが分かった。ショウジョウバエ（Drosophila）のノッチ遺伝子は、ノッチ／lin-12リピートと称する、３６の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様のタンデムリピートと、これに続く３つの他のシステインに富むリピートを含む大きなＮ末端細胞外ドメインを有する約３００ｋｄのタンパク質（我々はこのタンパク質を表すのに“ノッチ”を使用する）をコードしている（Whartonら, 1985, Cell 43, 567-581; Kiddら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Yochemら, 1988, Nature 335, 547-550）。ツメガエル（Xenopus）の配列（Coffmanら, 1990, Science 249: 1438-1441）およびＴＡＮ−１と名づけられたヒトノッチ相同体の配列（Ellisenら, 1991, Cell 66: 649-661）も報告されている。デルタは細胞外ドメインに９のＥＧＦ様リピートを有する約１００ｋｄのタンパク質（我々は主要な接合体および母系転写物のタンパク質産物であるＤＬＺＭを表すのに“デルタ”を使用する；Kopczynskiら, 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735）をコードしている（Vassinら, 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynskiら, 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735）。これらのリピートの機能的な意義についてはほとんど知られていないが、ＥＧＦ様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含めて、種々のタンパク質に存在している（Furie and Furie, 1988, Cell 53, 505-518）。特に、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸ（Reesら, 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53, 505-518）、他のショウジョウバエ遺伝子（Knustら, EMBO J. 761-766; Rothbergら, 1988, Cell 55, 1047-1059）、いくつかの細胞表面受容体タンパク質、例えばトロンボモジュリン（Suzukiら, 1987, EMBO J. 6, 1891-1897）およびＬＤＬ受容体（Sudhofら, 1985, Science 228, 815-822）といった細胞外タンパク質において見いだされている。トロンボモジュリンおよびウロキナーゼではＥＧＦリピートドメインにタンパク質結合部位がマップされている（Kurosawaら, 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996; Appellaら, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440）。
ノッチおよびデルタ突然変異間の数々の興味をそそる相互作用が記載されている（Vassinら, 1985, J. Neurogenet, 2, 291-308; Shepardら, 1989, Genetics 122, 429-438; Xuら, 1990, Genes Dev. 4, 464-475）。多くの遺伝子研究（Altonら, 1989, Dev. Genet. 10, 261-272に要約されている）は、ノッチおよびデルタの互いに対する遺伝子量が正常な発生にとって極めて重要であることを示した。野生型ノッチバックグラウンドにおいてデルタの量を５０％減少させると、翼の静脈の拡張が起こって基盤部で“デルタ”が作り出される（Lindsley and Grell, 1968, Publication Number 627, Washington, D.C., Carnegie Institute of Washington）。同様の表現型が、野生型デルタバックグラウンドにおけるノッチの量の５０％増加によっても生じる（“Confluens”表現型；Welshons, 1965, Science 150, 1122-1129）。このデルタ表現型はノッチ量の減少によって部分的に抑制される。ノッチのＥＧＦ様リピートにおける変異と関連がある対立遺伝子間の致死相互作用は、デルタの量を減少させることによって救済され得ることが分かっている（Xuら, 1990, Genes Dev. 4, 464-475）。Xuら（1990, Genes Dev. 4, 464-475）は、デルタまたはmamでのヌル突然変異が、Abruptex(Ax)突然変異として知られる、ノッチ対立遺伝子のヘテロ接合体組合せ間の致死相互作用を抑制することを見いだした。Ax対立遺伝子はノッチ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピート内のミスセンス突然変異と関連している（Kelleyら, 1987, Cell 51, 539-548; Hartleyら, 1987, EMBO J. 6, 3407-3417）。
最近の研究からは、ノッチとデルタ、およびノッチとセレート（Serrate）が分子レベルで直接的に相互作用していることが明らかになっている（Fehonら, 1990, Cell 61: 523-534; Rebayら, 1991, Cell 67: 687-699）。
ノッチは胚性ニューロンの成長の間に軸索で発現される（Johansenら, 1989, J. Cell Biol. 109: 2427-2440; Kiddら, 1989, Genes Dev. 3: 1113-1129; Fehonら, 1991, J. Cell Biol. 113: 657-669）。
ノッチのある種のAx対立遺伝子は、成虫原基での感覚ニューロンの成長において軸索の経路発見（pathfinding）を厳格に変更し得ることが分かっているが、軸索それ自体または上皮（これに沿って軸索が成長する）での異常なノッチ発現がこの障害の原因になるのかどうかはまだ知られていない（Palkaら, 1990, Development 109, 167-175）。
2.2. 癌
新生物、すなわち腫瘍は制御できない異常な細胞増殖により生ずる新生物形成の塊で、体表面に隆起を形成することがあり、良性または悪性であり得る。良性の腫瘍は一般に局所にとどまっている。悪性の腫瘍は集合的に癌と呼ばれている。“悪性”という用語は、一般に、腫瘍が近隣の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に広がって死を引き起こすことを意味する（再調査の際には、Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co. Philadelphia, pp. 68-122を参照されたい）。
癌の有効な治療および予防は、必要性が久しく感じられたままであり、生物医学研究の主な目標となっている。
３．発明の概要
本発明は、ノッチタンパク質および核酸に基づいた治療および診断方法ならびに組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物を投与することにより細胞の運命すなわち分化の障害を治療する方法を提供する。このような治療用化合物（ここでは“治療剤”という）として、ノッチタンパク質とその類似体および誘導体（断片を含む）、これらに対する抗体、ノッチタンパク質またはその類似体もしくは誘導体をコードする核酸、ノッチアンチセンス核酸、およびノッチタンパク質に結合するかまたはそれと相互作用するトポリズミックタンパク質とその誘導体、ならびにそれらをコードする核酸およびそれらに対する抗体を挙げることができる。好ましい実施態様において、本発明の治療剤は癌のような状態を治療するために、あるいは新生物発生前つまり非悪性の状態から新生物形成つまり悪性の状態へと進行するのを防ぐために投与される。他の特定の実施態様において、本発明の治療剤は神経系の障害を治療するために、あるいは組織の再生および修復を促進するために投与される。
一つの実施態様では、ノッチ機能に拮抗する、またはノッチ機能を抑制する治療剤（以後“アンタゴニスト治療剤”という）が治療効果を求めて投与される。こうした治療を施すことができる疾患は下記の第5.1.節に記載するようなin vitroアッセイによって確認しうる。このようなアンタゴニスト治療剤として、ノッチアンチセンス核酸、抗ノッチ中和抗体、ノッチタンパク質−タンパク質相互作用の競合的阻害剤（例えば、ノッチELR-11およびELR-12からなるタンパク質とこれらの誘導体）を挙げることができるが、これらに限らない。これら全てを以下で詳述する。
別の実施態様では、ノッチ機能を促進する治療剤（以後“アゴニスト治療剤”という）が治療効果を求めて投与される。こうした治療を施すことができる疾患は下記の第5.1.節に記載するようなin vitroアッセイによって確認しうる。このようなアゴニスト治療剤として、ノッチタンパク質および細胞内ドメインを含むその誘導体、およびノッチと相互作用するタンパク質（例えば、ショウジョウバエのデルタアミノ酸１−２３０（図１および配列番号２を参照）に相同なデルタ配列からなるタンパク質、またはショウジョウバエのセレートアミノ酸７９−２８２（図５および配列番号４を参照）に相同なセレート配列からなるタンパク質）を挙げることができるが、これらに限らない。
ノッチタンパク質の異常なまたは望ましくないレベルの発現または活性を伴う、細胞運命（cell fate）の疾患、特に高増殖性疾患（例えば、癌）または低増殖性疾患は、以下で詳しく説明するように、このようなレベルを検出することによって診断することが可能である。
好ましい面において、本発明の治療剤は、トポリズミック遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも断片（ここでは“接着性断片”という）からなるタンパク質であり、ノッチタンパク質またはその接着性断片への結合を仲介するものである。ここで用いるトポリズミック遺伝子とは、遺伝子ノッチ、デルタ、およびセレート、ならびに配列相同または遺伝子相互作用によって同定しうるデルタ／セレートファミリーの他のメンバーを意味し、一般には、分子相互作用（例えば、in vitroでの結合）または遺伝子相互作用（例えばショウジョウバエでは表現型により検出）によって同定される“ノッチカスケード（Notch cascade）”または“ノッチグループ（Notch group）”の遺伝子のメンバーを指すものとする。
その他の面において、本発明は、ヒトノッチタンパク質（特にｈＮ相同体によってコードされるもの）と、該タンパク質の細胞外ドメインを含むタンパク質およびそのサブ配列に向けられる。前述のものをコードする核酸、ならびに組換え細胞も提供する。
3.1. 定義
本明細書中で用いる次の略号は以下に示した意味を有するものである：
ＡＡ ＝ アミノ酸
ＥＧＦ ＝ 上皮増殖因子
ＥＬＲ ＝ ＥＧＦ様（相同）リピート
ＩＣ ＝ 細胞内
ＰＣＲ ＝ ポリメラーゼ連鎖反応
本明細書においては、遺伝子の名前に下線を施したものは遺伝子を表し、これに対して、遺伝子の名前で示されるそのコード化タンパク質産物には下線が引いてない。例えば、“ノッチ”はノッチ遺伝子を指し、一方“ノッチ”はノッチ遺伝子のタンパク質産物を指すものである。
４．図面の説明
図１．デルタcDNA D11の一次ヌクレオチド配列（配列番号１）およびデルタアミノ酸配列（配列番号２）。D11 cDNAの5'-3’鎖のＤＮＡ配列を示してあり、これはKopczynkskiら（1988, Genes Dev. 2: 1723-1735）により提示されたものと比べて多くの修正を含んでいる。
図２．ノッチ発現構築物およびデルタ／セレート結合ドメインの欠失マッピング。対数増殖期のＳ２細胞を図示した一連の発現構築物で一時的にトランスフェクトした。この図面は作製された種々のノッチ欠失変異体の推定タンパク質産物を示す。すべての発現構築物は構築物#1 pMtNMgに由来するものであった。一時的にトランスフェクトした細胞を、安定した形質転換系L49-6-7からのデルタ発現細胞と、または一時的にトランスフェクトしたセレート発現細胞と混合し、CuSO4で誘発させ、凝集条件下でインキュベートし、その後特異的抗血清および免疫蛍光顕微鏡検査を使ってそれらの凝集能について評価した。凝集物はノッチ発現細胞とデルタ／セレート発現細胞の両方を含む４個以上の細胞のクラスターとして定義された。凝集％として示した数値は、デルタ（Ｄ１）（左欄）またはセレート（Ｓｅｒ）（右欄）を含むクラスター中に存在する全ノッチ発現細胞のパーセンテージを指す。種々のノッチ欠失構築物は連結部を示すスプライスラインによって模式的に表してある。各ＥＧＦリピートを点描した長方形のボックスとして表し、連結部の両側のＥＧＦリピートの数字を示してある。種々の欠失によって作られた部分ＥＧＦリピートはオープンボックスと閉じたブラケットで表してある（例えば、#23 ΔCla+EGF(10-12)を参照）。構築物#3-13はClaI欠失系列を表す。図示したように、リピート７、９、17および26中の４つのClaI部位は第３システインの直後でリピートをその真ん中で破壊し（オープンボックスリピートで表される；詳細については図３を参照）、一方、第５および最も3'側の部位はＥＧＦリピート30および31間を正確に破壊する（クローズドボックスリピート31で表される；この場合も図３を参照）。構築物#15 splitでは、スプリット点突然変異を有するＥＧＦリピート１４がしま模様のボックスとして描かれている。構築物#33ΔCla+XEGF(10-13)では、ツメガエルノッチ由来のＥＧＦリピートが異なる陰影パターンによってショウジョウバエのリピートから区別されている。ＳＰ：シグナルペプチド、ＥＧＦ：上皮増殖因子リピート、Ｎ：ノッチ／lin-12リピート、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ｃｄｃ１０：ｃｄｃ１０／アンキリンリピート、ＰＡ：推定ヌクレオチド結合コンセンサス配列、ｏｐａ：ｏｐａと呼ばれるポリグルタミンの広がり、Ｄ１：デルタ、Ｓｅｒ：セレート。
図３．ノッチ欠失構築物#19-24の詳細な構造。ＥＧＦリピート11および12は両方ともノッチ−デルタ凝集にとって必要である。ＥＧＦリピート10−13を最上部に示し、６個のシステイン残基（Ｃ）の規則的間隔を示してある。これらの構築物（図２に示した名称および数字）において生成されたＰＣＲ産物は黒線で表してあり、正確な終点が種々のＥＧＦリピートに対して記してある。デルタとの凝集能は各構築物について（＋）または（−）で示してある。ＰＣＲ断片は、５つのClaI部位のうち４つと同じ位置で第３システインの直後でＥＧＦリピートを真ん中で破壊するか、または最もＣ末端のClaI部位と同じ位置で２つのリピート間を正確に破壊する。
図４．ショウジョウバエおよびツメガエルのノッチからのＥＧＦリピート11および12のアミノ酸配列の比較。ショウジョウバエのノッチのＥＧＦリピート11および12のアミノ酸配列（Whartonら, 1985, Cell 43: 567-581; Kiddら, 1986, Mol. Cell Biol. 6: 3094-3108）を、ツメガエルのノッチからの同じ２つのＥＧＦリピートのアミノ酸配列（配列番号１５）（Coffmanら, 1990, Science 249: 1438-1441）と並列化させる。同一のアミノ酸はボックスで囲ってある。各ＥＧＦリピートの６個の保存システイン残基およびＣａ++結合コンセンサス残基（Reesら, 1988, EMBO J. 7: 2053-2061）には＊印が付けてある。凝集に失敗したツメガエルのＰＣＲクローンに見られたロイシンからプロリンへの変化を下に示してある。
図５．セレートおよびデルタ間の核酸配列相同性。ショウジョウバエのセレートヌクレオチド配列（配列番号３）の一部を、その下に記載したコード化セレートタンパク質配列（配列番号４）（Flemingら, 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201, 2193-94）とともに示してある。ショウジョウバエのデルタ配列との高配列相同を示す４つの領域には配列ラインの上に番号が付けてあり、かっこで示してある。相同の全領域はセレートヌクレオチド配列のヌクレオチド番号627から1290までに及んでいる（Flemingら, 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201の図４と同じ番号付け）。
図６．ヒトノッチクローンの模式図。ヒトノッチの模式図を示してある。模式図の下の太い黒線は４つのｃＤＮＡクローンのそれぞれに含まれるノッチ配列の部分を示す。ＰＣＲで用いたプライマーの位置およびそれらの方向を矢印で示す。
図７．ショウジョウバエノッチ配列と並列化させたヒトノッチ配列。番号の付いた垂直線はショウジョウバエノッチの座標に一致する。各マップの下の水平線は、配列の広がり（太い水平線）に対してクローンがどこにあるのかを示している。
図８．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ２ｋ中に含まれるヒトノッチのヌクレオチド配列。図８Ａ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号５）を示し、3'末端のEcoRI部位で出発して、3'から5'の方向へ進む。図８Ｂ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号６）を示し、5'末端のEcoRI部位で出発して、5'から3'の方向へ進む。図８Ｃ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号７）を示し、図８Ｂに示した配列の3'で出発して、5'から3'の方向へ進む。示した配列は確定的なものではなく、重複配列の決定による確認を受ける必要がある。
図９．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ４ｋ中に含まれるヒトノッチのヌクレオチド配列。図９Ａ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号８）を示し、5'末端のEcoRI部位で出発して、5'から3'の方向へ進む。図９Ｂ：ヒトノッチ挿入物の一部のＤＮＡ配列（配列番号９）を示し、3'末端付近で出発して、3'から5'の方向へ進む。示した配列は確定的なものではなく、重複配列の決定による確認を受ける必要がある。
図10．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３ｋ中に含まれるヒトノッチのＤＮＡ（配列番号10）およびアミノ酸（配列番号11）配列。
図11．プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５ｋ中に含まれるヒトノッチのＤＮＡ（配列番号12）およびアミノ酸（配列番号13）配列。
図12．ｈＮ５ｋと他のノッチ相同体との比較。図12Ａ．ショウジョウバエノッチの模式図。シグナル配列、３６のＥＧＦ様リピート、３つのノッチ／lin-12リピート、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、６つのｃｄｃ１０リピート、ｏｐａリピート、およびＰＥＳＴ（プロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン）に富む領域を示してある。図12Ｂ．ｈＮ５ｋの推定アミノ酸配列と他のノッチ相同体の配列との並列化。アミノ酸は左側に番号を付けてある。ｃｄｃ１０とＰＥＳＴに富む領域は両方ともボックスで囲ってあり、個々のｃｄｃ１０リピートにも印が付けてある。３つ以上の配列において同一であるアミノ酸が注目される。ｈＮ５ｋのクローニングに使用したプライマーは配列の下に示してあり、これらの配列からプライマーが設計された。脊椎動物ノッチ相同体の推定ＣｃＮモチーフの核局在化配列（ＮＬＳ）、カゼインキナーゼII（ＣＫII）、およびｃｄｃ２キナーゼ（ｃｄｃ２）部位をボックスで囲ってある。ショウジョウバエノッチの可能な２分節核標的化配列（bipartite nuclear targeting sequence:ＢＮＴＳ）および近隣のリン酸化部位もボックスで囲ってある。
図13．いろいろな生物種のノッチタンパク質のアミノ酸配列の並列化。ｈｕｍＮ：ｈＮ相同体（プラスミドｈＮ５ｋに一部が含まれる）によってコードされるヒトのノッチタンパク質（配列番号19）。ＴＡＮ−１：ＴＡＮ−１相同体によってコードされるヒトのノッチタンパク質（配列番号20）（示した配列は一部が我々自身の研究から、そして一部がEllisenら, 1991, Cell 66: 649-661に発表されたＴＡＮ−１配列から誘導されたものである）。ＸｅｎＮ：ツメガエルのノッチタンパク質（Coffmanら, 1990, Science 249: 1438-1441）。ＤｒｏｓＮ：ショウジョウバエのノッチタンパク質（Whartonら, 1985, Cell 43: 567-581）。構造ドメインを示してある。
図14．ヒト患者からの乳癌組織の免疫細胞化学的染色。ヒト患者から得られた試料中の悪性乳房組織をパラフィン切片に埋め込み、ＴＡＮ−１タンパク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体Ｐ４を用いて免疫細胞化学的染色を行った。悪性でない乳房組織はほとんど染色されなかった（図示せず）。
図15．結腸癌を有するヒト患者からの結腸組織の免疫細胞化学的染色。結腸癌患者から得られた結腸組織試料をパラフィン切片に埋め込み、ｈＮコード化タンパク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体Ｐ１を用いて免疫細胞化学的染色を行った。強い染色領域は、細胞形態学的に検査して、悪性細胞が存在する領域である。
図16．子宮頸部組織の免疫細胞化学的染色。同一患者から子宮頸癌（図16Ａ）または正常な頸部の上皮（図16Ｂ）を含むヒト組織試料を採取し、パラフィン切片に埋め込み、ＴＡＮ−１タンパク質に対する抗ヒトノッチモノクローナル抗体を用いて免疫細胞化学的染色を行った。悪性細胞（形態学的に検査）を含む領域は非悪性細胞と比べて強い染色を示した。非悪性細胞のうち、結合組織と上皮の基底層（幹細胞を含む）は抗ノッチ抗体により染色された。
図17．ヒトノッチ相同体ｈＮのＤＮＡ（配列番号21）およびコード化アミノ酸配列（配列番号19に含まれる）。全ＤＮＡコード配列（ならびに非コード配列）を示してあるが、開始Ｍｅｔをコードするものは除いてある。最後の８個のヌクレオチド（番号9716-9723）はベクターであって、ｈＮ配列ではない。
５．発明の詳細な説明
本発明は、ノッチ（Notch）タンパク質及び核酸に基づいた治療及び診断方法ならびに組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物の投与により細胞の運命又は分化の障害の治療法を提供する。かかる治療用化合物（ここでは“治療剤”という）には、ノッチタンパク質及びその類似体及び誘導体（その断片を含む）；それらに対する抗体；ノッチタンパク質、その類似体又は誘導体をコードする核酸；ノッチアンチセンス核酸；並びにノッチタンパク質と結合するか又は他の方法で相互作用するトポリスミック（toporythmic）タンパク質及びその誘導体及び類似体、及びそれらをコードする核酸及び抗体が含まれる。ノッチタンパク質の他のトポリズミックタンパク質（例えば、デルタ（Delta）、セレート（Serrate））との相互作用を阻害できるタンパク質及びその誘導体及び類似体も含まれる。好ましい態様においては、本発明の治療剤は、癌のような状態を治療するために、あるいは新生物発生前若しくは非悪性状態（例えば、変質形成状態）から新生物形成若しくは悪性状態への進行を予防するために投与される。他の特有の態様においては、本発明の治療剤は、神経損傷又は変性性疾患の如き神経系障害を治療するために投与される。なお他の特有の態様においては、本発明の治療剤は、種々の状態の治療のための組織再生及び修復を促進するために投与される。
１つの態様においては、ノッチ機能を相殺又は阻害する治療剤（以下“アンタゴニスト治療剤”）を治療的作用のために投与する。かくして、治療され得る障害を以下の5.1節に記載するようなin vitroアッセイによって同定することができる。かかるアンタゴニスト治療剤には、ノッチアンチセンス核酸、抗ノッチ中和性抗体、ノッチタンパク質−タンパク質相互作用の競合的阻害物質（例えば、ノッチＥＬＲ−１１及びＥＬＲ−１２を含むタンパク質）、及び以下に詳記するｃｄｃ１０繰り返し体により媒介されるものの如きノッチ細胞内機能を妨害する分子が含まれるが、これらに限定されない。
他の態様においては、ノッチ機能を促進する治療剤（以下“アゴニスト治療剤”）を治療的作用のために投与する。かくして、治療され得る障害を以下の5.1節で説明するようなin vitroアッセイによって同定できる。かかるアゴニスト治療剤には、ノッチタンパク質及びその細胞内ドメインを含む誘導体、前記のものをコードするノッチ核酸、及びノッチと相互作用するトポリズミックタンパク質ドメインを含むタンパク質（例えば、ショウジョウバエ・デルタアミノ酸１〜１２３０（図１及び配列番号：２を参照のこと）と相同性のデルタタンパク質又はデルタ配列の細胞内ドメインを含むタンパク質、又はショウジョウバエ・セレートアミノ酸７９〜２８２（図５及び配列番号：４を参照のこと）と相同性のセレート配列を含むタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。
ノッチタンパク質の異常な又は望ましくないレベルの発現又は活性を包含する、細胞運命の障害、特に変質形成及び異形成の如き前癌状態、及び高増殖性（例えば、癌）又は低増殖性障害は、以下でより十分に説明するようなレベルを検出することによって診断することができる。
好ましい側面においては、本発明の治療剤は、トポリズミック遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも１断片（ここでは“接着性断片”と呼ぶ）からなるタンパク質であって、ノッチタンパク質又はその接着性断片への結合を媒介するタンパク質である。ここで用いられるトポリズミック遺伝子とは、ノッチ、デルタ及びセレート遺伝子、並びに配列相同性又は遺伝的相互作用に基づいて同定することができるデルタ／セレートファミリーの他のメンバーを意味し、より一般的には、遺伝子の“ノッチカスケード”又は“ノッチグループ”のメンバーであって、分子相互作用（例えば、in vitroでの結合）又は遺伝的相互作用（表現型で検出されるようなもの、例えば、ショウジョウバエにおけるもの）により同定されるものを意味する。
本発明は、更に、ｈＨ同族体によりコードされるヒトノッチタンパク質、及びノッチタンパク質及びそのサブ配列の細胞外ドメインを含むタンパク質を提供する。前記のものをコードする核酸、及び組換え細胞も提供する。
開示を明瞭なものにするために、限定としてではなく、本発明のこの詳細な説明を次の小節に分ける：
(i) 治療的用途；
(ii) 予防的用途；
(iii) 治療的又は予防的利用の実地；
(iv) 治療的／予防的投与及び組成物；
(v) ノッチ発現のアンチセンス調節；
(vi) 診断的利用；
(vii) ノッチ核酸；
(viii) タンパク質治療剤の組換え産生；
(ix) ノッチ及び他のトポリズミックタンパク質の誘導体及び類似体；
(x) ノッチタンパク質、誘導体及び類似体のアッセイ；及び
(xi) ノッチタンパク質、誘導体及び類似体に対する抗体。
5.1. 治療的用途
前に述べたように、本発明のアンタゴニスト治療剤は、ノッチ機能を相殺又は阻害する治療剤である。かかるアンタゴニスト治療剤は、最も好ましくは、既知の便利なin vitroアッセイの使用によって、例えば、他のタンパク質（ここの６〜８節を参照のこと）へのノッチの結合を阻害する、又はin vitroでアッセイされるあらゆる既知のノッチ機能を阻害するそれらの能力に基づいて同定することができるが、遺伝的アッセイ（例えば、ショウジョウバエにおいて）も用いることができる。好ましい態様においては、アンタゴニスト治療剤は、ノッチの接着性断片の如き機能的に活性な断片を含むタンパク質又はその誘導体である。特有の態様においては、そのようなアンタゴニスト治療剤は、以下の６節及び７節に記載する適当な構築体によってコードされる接着性タンパク質、又はノッチ細胞外領域、特にＥＬＲ−１１及びＥＬＲ−１２を含むタンパク質、又はそれらに対する抗体、又はノッチ細胞内シグナル変換（signal-transducing）領域、ノッチ接着性断片を発現できる核酸、又はノッチアンチセンス核酸（ここの5.5節を参照のこと）であってもよい。一方、一定の場合には、ノッチ接着性断片（又は他の推定し得るアンタゴニスト治療剤）が、この治療剤に曝される組織の発達経歴に依存して、アゴニスト治療剤として働くことができることに留意すべきである。好ましくは、以下に説明する適当なin vitro又はin vivoアッセイが、具体的な治療剤の作用及びその投与が害された組織の治療に必要とされているかどうかを確認するために用いられるべきである。
本発明の他の態様においては、ノッチ遺伝子の一部分を含有する核酸をアンタゴニスト治療剤として用いて、相同的組換えによってノッチ不活性化を促進する（KollerとSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935: Zijlstraら, 1989, Nature 342:435-438）。
前に記載したように、本発明のアゴニスト治療剤は、ノッチ機能を促進する。かかるアゴニスト治療剤には、ノッチへの結合を媒介するデルタ又はセレートの如きトポリズミックタンパク質の部分を含むタンパク質及び誘導体、及び前記のものをコードする核酸（投与するとそれらがコードする産物をin vivoで発現できるもの）が含まれるが、これらに限定されない。特有の態様においては、デルタのそのような部分は、Ｄ.メラノガステル（D.melanogaster）デルタアミノ酸１〜２３０（配列番号：１）又はそれに最も相同なヒトデルタの部分である。他の特有の態様においては、セレートのそのような部分は、Ｄ.メラノガステル・セレートアミノ酸７９〜２８２（配列番号：５）又はそれに最も相同なヒトセレートの部分である。他の特有の態様においては、デルタ又はセレートのそのような部分は、かかるタンパク質の細胞外部分である。
本発明の治療剤の更なる説明及び供給源は、ここの5.4節から5.8節にかけて見出される。
本発明のアゴニスト及びアンタゴニスト治療剤は、細胞の運命の障害のための治療的効用を有している。アゴニスト治療剤は、（１）ノッチ機能の不存在又は（正常な又は望ましいものに比較して）低下を包含する疾患又は障害において、例えば、ノッチタンパク質が欠如しているか、遺伝的に欠陥があるか、生物学的に不活性若しくは活性不足であるか、又は発現不足である患者において；及び（２）in vitro（又はin vivo）アッセイ（以下を参照のこと）によりノッチアゴニスト投与の利用が必要とされる疾患又は障害において、治療用に投与される（予防用も含む）。ノッチ機能の不存在又はレベルの低下は、例えば、患者組織サンプルを（例えば、生検組織から）採取して、タンパク質レベル、発現されたノッチタンパク質の構造及び／又は活性についてそれをin vitroでアッセイすることによって容易に検出できる。かくして、ノッチタンパク質を検出及び／又は可視化するイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等；以下の5.6節に掲げたアッセイも参照のこと）、及び／又はノッチｍＲＮＡを検出及び／又は可視化することによりノッチ発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション等）を含むがこれらに限定されない当該技術分野で標準的な多くの方法を用いることができる。
特定のアゴニスト治療剤又はアンタゴニスト治療剤の投与が必要とされるかどうかを確認するのに用いることができるin vitroアッセイには、患者組織サンプルを培養液中で増殖させ、治療剤に曝すか又は治療剤を投与し、そしてかかる治療剤の組織サンプルへの作用を観察するin vitro細胞培養アッセイが含まれる。１つの態様においては、患者が悪性腫瘍を有する場合、かかる悪性腫瘍からの細胞のサンプルをプレートに塗布するか又は培養液中で増殖させてから、それら細胞を治療剤に曝す。悪性細胞の生存又は増殖を（例えば、終末分化を促進することによって）阻害する治療剤をin vivoでの治療用途用に選択する。当該技術分野で標準的な多くのアッセイを用いて、かかる生存及び／又は増殖を評価することができる。例えば、細胞増殖は、3H−チミジン取り込みを測定することにより、細胞を直接計数することにより、プロトオンコジーン（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）又は細胞サイクルマーカーの如き既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによりアッセイすることができ、細胞生活能力は、トリパンブルー染色により評価することができ、分化は、形態等の変化に基づいて目視で評価することができる。特有の側面においては、悪性細胞培養物を（１）アゴニスト治療剤、及び（２）アンタゴニスト治療剤に別々に曝すと、このアッセイの結果により、どちらのタイプの治療剤が治療効力を有するかが示される。
他の態様においては、高増殖性又は低増殖性障害を有するか又は有すると考えられる組織からの患者細胞サンプルに、所期の作用、つまりそれぞれ細胞増殖の阻害又は促進を示す治療剤の使用が必要とされる。かかる高増殖性又は低増殖性障害には、以下の5.1.1節から5.1.3節にかけて記載されているものが含まれるがそれらに限定されない。
他の特有の態様においては、神経損傷又は神経系変性性障害（5.1.2節を参照のこと）の治療において、害された患者タイプの神経細胞からの神経再生／神経突起伸長のin vitro促進を示す治療剤の使用が必要とされる。
加えて、本発明のアンタゴニスト治療剤の投与は、ノッチ優性活性化表現型（“機能獲得”突然変異）を包含することが確認され又は知られている疾患又は障害においても必要とされる。アゴニスト治療剤の投与は、ノッチ優性負表現型（“機能損失”突然変異）を包含することが確認され又は知られている疾患又は障害において必要とされる。本発明者らは、ｈｓｐ７０熱ショックプロモーター並びに眼特異的（eye-specific）プロモーターの下で一連のショウジョウバエ・ノッチ欠失突然変異体を異所的に発現させることにより、in vitroでのノッチタンパク質の種々の構造ドメインの機能を調べた。２クラスの優性表現型が認められ、１つはノッチ機能欠損突然変異（Notch loss-of function mutations）を示唆するものであり、もう１つはノッチ機能獲得突然変異（Notch gain-of function mutations）を示唆するものであった。優性“活性化”表現型は、殆どの細胞外配列を欠くタンパク質の過剰発現から生じたものであり、一方、優性“負”表現型は、殆どの細胞内配列を欠くタンパク質の過剰発現から生じたものであった。本発明者らの結果は、ノッチがレセプターとして機能し、そのレセプターの細胞外ドメインがリガンド結合を媒介する結果、その細胞質ドメインにより発達シグナルが伝達されることを示している。認められた表現型は、この細胞内ドメイン内のｃｄｃ１０／アンキリンリピート領域がノッチ媒介シグナル変換事象（細胞内機能）においてある重要な役割を果たしていることも示唆した。
種々の特有の態様においては、患者の障害に関連する細胞型の代表的細胞でin vitroアッセイを行って、治療剤がかかる細胞型への所期の作用を有しているかどうかを確認することができる。
他の態様においては、新生物発生前であると考えられる患者組織サンプルの細胞を同じくプレートに塗布するか又はin vitroで増殖させて、治療剤に曝す。より正常である細胞表現型（即ち、新生物発生前状態、新生物形成状態、悪性状態、又は形質転換表現型にあまり該当しないもの）をもたらす治療剤を治療用途に選択する。当該技術分野で標準的な多くのアッセイを用いて、新生物発生前状態、新生物形成状態、又は形質転換若しくは悪性表現型が存在するかどうかを評価することができる（5.2.1節を参照のこと）。例えば、形質転換表現型に関連付けられる特徴（in vivoで催腫瘍能力に関連付けられる一組のin vitro特徴）には、より丸くなった細胞形態、よりゆるい下層付着、接触阻害の低下、足場依存性の低下、プラスミノーゲンアクチベーターの如きプロテアーゼの放出、糖輸送の増加、血清要求量の減少、胎児性抗原の発現、２５０，０００ダルトン表面タンパク質の消失等が含まれる（Luriaら, 1978, General Virology, 3d Ed., John Wiley & Sons. New York pp. 436-446を参照のこと）。
他の特有の態様においては、前記のin vitroアッセイは、治療されるべき特定の患者由来の細胞サンプルというよりむしろ細胞系を用いて行うことができ、その際、この細胞系は、治療又は予防することが望まれる悪性、新生物形成又は新生物発生前障害から誘導されるか又はその障害に関連付けられる特徴を示すものであるか、又は本発明に従いある作用が望まれる神経細胞型又は他の細胞型から誘導される。
これらアンタゴニスト治療剤は、（１）ノッチ機能の（正常な又は望ましいものに比較して）レベルの上昇を包含する疾患又は障害において、例えば、ノッチタンパク質が過剰発現されるか又は過剰活性であるである場合において；及び（２）in vitro（又はin vivo）アッセイによりノッチアンタゴニスト投与の利用が必要とされる疾患又は障害において、治療用に投与される（予防用も含む）。ノッチ機能のレベルの上昇は、上記の如き方法により、つまりタンパク質及び／又はＲＮＡを定量することにより容易に検出できる。治療的効用を確認するための患者組織サンプルの細胞又は適当な細胞系又は細胞型でのin vitroアッセイは、上記の通りに行うことができる。
5.1.1 悪性腫瘍
アンタゴニスト又はアゴニスト治療剤の介在の効力について前記のように試験され得、かくして治療的利用の必要性が認められたことに基づいて治療され得る悪性及び新生物発生前状態には、5.1.1節及び5.2.1節で以下に記載するものが含まれるが、それらに限定されない。
悪性腫瘍及び関連する障害であって、そのタイプの細胞がin vitro（及び／又はin vivo）で試験され得、そして適当なアッセイの結果に基づいて本発明に従って治療され得るものには、表１に掲げたものが含まれるが、それらに限定されない（かかる障害の委細については、Fishmanら, 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphiaを参照のこと）。
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特有の態様においては、悪性又は異常増殖性変化（変質形成及び異形成の如きもの）は、頸部、食道、及び肺の如き上皮組織において治療又は予防される。
以下の10.1節の実施例で詳記するように、乳房、結腸、及び頸部の悪性腫瘍では、同じ非悪性組織に比べてヒトノッチの発現が増加する。かくして、特有の態様においては、乳房、結腸、又は頸部の悪性腫瘍は、有効量の本発明のアンタゴニスト治療剤を投与することによって治療又は予防される。乳癌、結腸癌、及び頸癌における増加したノッチ発現の存在は、多く癌性状態で、ノッチが上方調節されることを示唆している。かくして、本発明者らは、多くの癌、例えば、精上皮腫、黒色腫及び肺癌を、アンタゴニスト治療剤を投与することによって治療又は予防することができると考える。
5.1.2. 神経系障害
アンタゴニスト又はアゴニスト治療剤の介在の効力について前記のように試験され得、かくして治療的利用の必要性が認められたことに基づいて治療され得る細胞型を含む神経系障害には、神経系損傷；及び軸策の断絶、ニューロンの減少若しくは再生、又は髄鞘脱落のいずれかをもたらす疾患又は障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従い、患者（ヒト及び非ヒト哺乳動物患者を含む）において治療され得る神経系障害には、次の中枢（脊髄、脳を含む）又は抹消神経系のいずれかの障害が含まれるが、それらに限定されない。
(i) 物理的損傷によって起こる損傷又は手術に伴う傷害を含む外傷的損傷、例えば、神経系の一部分を切断する傷害又は圧迫損傷；
(ii) 神経系の一部分における酸素の欠乏がニューロンの損傷又は死をもたらす虚血性傷害であって、大脳梗塞若しくは虚血、又は脊髄梗塞若しくは虚血を含むもの；
(iii) 神経系の一部分が、悪性腫瘍を伴う神経系又は非神経系組織から派生した悪性腫瘍のいずれかである悪性組織によって、破壊又は損傷を受ける悪性傷害；
(iv) 神経系の一部分が、例えば、菌塊による感染の結果として破壊又は損傷を受けるか、又はヒト免疫不全ウィルス、帯状疱疹ウィルス、又は単純疱疹ウィルスによる感染に関連付けられるか又はライム病、結核、梅毒に関連付けられる感染性傷害；
(v) パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、又は筋萎縮性側索硬化症に関連付けられる変性を含むがこれらに限定されない変性過程の結果として神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける変性性傷害；
(vi) ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ疾患、タバコ−アルコール性弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）、及びアルコール性小脳変性を含むがこれらに限定されない栄養性傷害又は代謝の傷害により神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける栄養性疾患又は傷害に関連付けられる傷害；
(vii) 糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル不全麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫、又はサルコイドーシスを含むがこれらに限定されない全身性疾患に関連付けられる神経系傷害；
(viii) アルコール、鉛、又は特定の神経毒を含む毒性物質により起こる傷害；
(ix) 多発性硬化症、ヒト免疫不全ウィルス関連脊髄傷害、横断脊髄傷害又は種々の病因、進行性多病巣性白質脳症、及び橋中央ミエリン溶解を含むがこれらに限定されない脱髄疾患により神経系の一部分が破壊又は損傷を受ける脱髄傷害
本発明に従い神経系傷害の治療に有用な治療剤は、ニューロンの生存又は分化を促進する生物活性について試験することによって選択することができる（5.1節も参照のこと）。例えば、限定としてではなく、次のいずれかの作用を引き出す治療剤は、本発明に従って有用であるといえる。
(i) 培養液中でのニューロンの生存時間の増加；
(ii) 培養液中又はin vivoでのニューロンの新芽形成の増加；
(iii) 培養液中又はin vivoでのニューロン関連分子、例えば、運動ニューロンに関するコリンアセチルトランスフェラーゼ又はアセチルコリンエステラーゼの産生の増加；
(iv) in vivoでのニューロン機能傷害の症状の減少。
かかる作用は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。好ましい非限定的態様においては、ニューロンの生存の増加は、Arakawaら（1990, J. Neurosci. 10:3507-3515）に記載された方法によって測定でき；ニューロンの新芽形成の増加は、Pestronkら（1980, Exp. Neurol. 70:65-82）又はBrownら（1981, Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42）に記載された方法によって測定でき；ニューロン関連分子の産生の増加は、測定される分子に依存して、バイオアッセイ、酵素的アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイ等によって測定でき；そして運動ニューロン機能傷害は、運動ニューロン障害の物理的症状発現、例えば、衰弱、運動ニューロン伝導速度、又は機能的能力障害を評価することによって測定できる。
特有の態様においては、本発明に従って治療され得る運動ニューロン障害には、運動ニューロン並びに神経系の他の成分を害し得る、亀裂骨折、感染症、毒素への暴露、外傷、手術による損傷、変性性疾患又は悪性腫瘍の如き障害、並びに筋萎縮性側索硬化症の如きニューロンを選択的に害する障害が含まれるがこれらに限定されず、また、進行性棘筋萎縮、進行性延髄麻痺、一次側索硬化症、小児及び若年筋萎縮症、幼年期の進行性延髄完全麻痺（Fazio-Londe症候群）、ポリオ及びポリオ後症候群、及び遺伝性運動知覚神経疾患（Charcot-Marie-Tooth疾患）が含まれるがこれらに限定されない。
5.1.3. 組織修復及び再生
本発明の他の態様においては、本発明の治療剤を、良性異常増殖性障害の治療を含むがこれに限定されない、組織再生及び修復の促進に用いる。特有の態様は、肝硬変（瘢痕化が正常肝臓再生過程よりも過剰に進んだ状態）の治療、ケロイド（過形成性瘢痕）形成（瘢痕化過程が正常な更新を妨害する皮膚の醜悪化）、乾癬（皮膚の過剰増殖及び適正な細胞の運命決定の遅れによって特徴付けられるよく起こる皮膚の状態）、及び禿頭症（終末分化した毛嚢（ノッチが豊富な組織）が適正に機能することができない状態）の治療に向けられている。
5.2. 予防的用途
5.2.1. 悪性腫瘍
本発明の治療剤は、表１に掲げた障害を含むがそれらに限定されない新生物形成又は悪性状態への進行を予防するために投与することができる。かかる投与は、前記のように、かかる障害の治療又は予防の効用を有することがアッセイで示される場合に必要とされる。かかる予防的用途は、新生物又は癌への進行に先行することが知られているか又は先行すると考えられる状態において、特に過形成、変質形成、最も特定的には異形成からなる非新生物形成細胞増殖が起こる場合に必要とされる（かかる異常増殖状態の委細については、RobbinsとAngell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79を参照のこと）。過形成は、構造又は機能において有意な変化なしに組織又は器官内での細胞数の増加を包含する制御された細胞増殖の一形態である。一例として、子宮内膜過形成は、子宮内膜癌に先行することが多い。変質形成は、あるタイプの成熟した又は十分に分化した細胞が別のタイプの成熟細胞と置き換わる制御された細胞増殖の一形態である。変質形成は、上皮又は結合組織細胞内で起こり得る。非定型の変質形成は、幾分無秩序な変質形成上皮を包含する。異形成は頻繁に癌の前駆症状となり、主として上皮において見出され；それは非新生物形成細胞増殖の最も無秩序な形態であって、個々の細胞統一性と細胞の構築方向性の損失に関連している。異形成細胞は、異常に大きくて濃く染色した核を有する場合が多く、多形性を示す。異形成は、慢性過敏又は炎症が存在する場合に起こり、頸部、気道、口腔、及び胆嚢で見出されることが多い。
過形成、変質形成、又は異形成として特徴付けされる異常細胞増殖の存在とは別に又はそれに加えて、患者からの細胞サンプルによりin vivoで発揮されるか又はin vitroで発揮される形質転換表現型又は悪性表現型の１又は２以上の特徴の存在は、本発明の治療剤の予防的／治療的投与が望ましいことを示すことができる。前に挙げたように、形質転換表現型のかかる特徴には、形態的変化、ゆるい下層付着、接触阻害の低下、足場依存性の低下、プロテアーゼの放出、糖輸送の増加、血清要求量の減少、胎児性抗原の発現、２５０，０００ダルトン細胞表面タンパク質の消失等が含まれる（形質転換又は悪性表現型に関連付けられる特徴については、同文献のpp. 84-90を参照のこと）。
特有の態様においては、白斑症、上皮の良性と思われる増殖性又は形成不全型傷害、又はブラウン疾患、つまりin situでの癌腫は、予防的介在が望ましいことを示す前新生物性傷害である。
他の態様においては、線維嚢胞病（嚢胞性過形成、乳房異形成、特に腺疾患（良性上皮過形成））は、予防的介在が望ましいことを示している。
他の態様においては、悪性腫瘍の次の素因を１又は２以上示す患者を、有効量の治療剤を投与することによって治療する：悪性腫瘍に関連付けられる染色体移動（例えば、慢性骨髄性白血病についてのフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫についてのｔ（１４，１８）等）、家族性ポリープ症又はガードナー症候群（結腸癌のあり得る前駆症状）、良性モノクローナル高ガンマグロブリン症（多発性骨髄腫のあり得る前駆症状）、及びメンデル遺伝パターンを示す癌又は前癌性疾患を有する人と一親等であること（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝性外骨腫症、多発性内分泌腺腫症、アミロイド産生及び褐色細胞腫を有する延髄甲状腺癌、ポイツ−ジェガーズ症候群、Von Recklinghausenの神経繊維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調、チェディアック・東症候群、白化症、ファンコーニ再生不良性貧血、及びブルーム症候群（RobbinsとAngell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113を参照のこと）等）。
他の特有の態様においては、本発明のアンタゴニスト治療剤をヒトの患者に投与して、乳癌、結腸癌、又は子宮頸癌への進行を予防する。
5.2.2 他の障害
他の態様においては、本発明の治療剤を投与して、5.1.2に記載した神経系障害又は5.1.3.に記載した他の障害（例えば、肝硬変、乾癬、ケロイド、禿頭症）を予防することができる。
5.3. 治療的又は予防的利用の実地
本発明の治療剤は、所期の治療的又は予防的活性についてin vivoで試験することができる。例えば、かかる化合物をヒトで試験する前に、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含むがこれらに限定されない適当な動物モデル系で試験することができる。in vivo試験には、ヒトへの投与の前に、当該技術分野で知られているあらゆる動物モデル系を用いることができる。
5.4. 治療的／予防的投与及び組成物
本発明は、被験体に有効量の本発明の治療剤を投与することによる治療（及び予防）の方法を提供する。好ましい側面においては、この治療剤は実質的に精製されている。被験体は、好ましくは、ウシ、ブタ、ニワトリ等の如き動物を含むがこれらに限定されない動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
種々の送達系が知られており本発明の治療剤を投与するのに用いることができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への被包、組換え細胞による発現、レセプター媒介飲食作用（例えば、WuとWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）、レトロウィルス又は他のベクターの部分としての治療剤核酸の構築等である。導入方法には、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、及び経口ルートが含まれるがこれらに限定されない。これら化合物は、あらゆる便利なルートにより、例えば、輸注又は濃縮塊注射（bolus injection）により、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸又は腸粘膜等）を通過する吸収により投与することができ、他の生物活性な物質と一緒に投与してもよい。投与は全身投与であっても局所投与であってもよい。加えて、本発明の医薬組成物を、脳室内及び髄腔内注射を含むあらゆる適当なルートによって中枢神経系に導入するのが望ましいといえる。脳室内注射は、脳室内カテーテル、例えば、オマヤレザバーの如きレザバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易化できる。
特有の態様においては、治療を要する部分に局所的に本発明の医薬組成物を投与するのが望ましいといえる。これは、例えば、限定としてではなく、手術中の局所輸注、手術後の例えば創傷包帯を用いた局所適用により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、又はシアラスティック（sialastic）膜の如き膜又は繊維を含む多孔性、非多孔性、又は膠状材料製の移植片により行うことができる。１つの態様においては、投与は、悪性腫瘍又は新生物形成又は新生物発生前組織の部位（又は元の部位）での直接注射によってもよい。
特有の態様においては、ノッチ発現細胞内への治療剤の投与は、デルタ（又は他のトポリズミック）タンパク質又はノッチとの結合を媒介できるデルタタンパク質の部分に治療剤を連結させることにより行われる。ノッチ発現細胞とその連結治療剤との接触により、そのデルタ部分を介して、細胞表面上のノッチへの連結治療剤の結合が行われ、その後にノッチ発現細胞内への連結治療剤の取り込みが行われる。
ノッチ細胞内シグナル変換ドメインの類似体が、ノッチシグナル変換を阻害できるように治療剤として用いられる特有の態様においては、その類似体を好ましくは細胞内に（例えば、核酸ベクターからの発現により、又はノッチに結合できるデルタの部分への連結、それに続く結合及び内在化により、又はレセプター媒介メカニズムにより）送達する。
治療剤がタンパク質治療剤をコードする核酸である特有の態様においては、その核酸をin vivoで投与してそのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。これは、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築し、それが細胞内のものとなるように、例えば、レトロウィルスベクターの使用により又は直接注射により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、又は微粒子砲撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）の使用又は脂質若しくは細胞表面レセプター若しくは形質移入剤のコーティングによりなされ、又は核に入り込むことが知られているホメオボックス様ペプチドとの連結体でそれを投与すること（例えば、Joliotら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868を参照のこと）等によりなされる。また、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして相同的組換えにより発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませてもよい。
特定の障害の治療又は予防に向けられる特有の態様においては、好ましくは次の投与形態が用いられる。
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本発明は医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療的有効量の治療剤、及び薬学的に許容できる製剤上の担体又は賦形剤を含む。そのような製剤上の担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。この製剤上の担体及び組成物は無菌であってもよい。その配合は、投与様式に適するものであるべきである。
所望により、この組成物は、僅かな量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。この組成物は、液体溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤であってもよい。この組成物をトリグリセリドの如き伝統的な結合剤及び製剤上の担体と共に坐剤として製剤してもよい。経口用製剤は、医薬用のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の如き標準的な製剤上の担体を含んでもよい。
好ましい態様においては、この組成物は、人への静脈内投与に適合した医薬組成物として日常的操作に従って製剤される。典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌等張性水性緩衝液中の溶液剤である。必要な場合には、この組成物は、可溶化剤及び注射部位における痛みを和らげるためにリグノカインの如き局所麻酔剤も含んでもよい。一般に、これら成分は別々に又は一緒に混合するかして、単位投与形態で、例えば、活性物質の量を示すアンプル又は袋の如き密封容器内の凍結乾燥粉末又は水不含濃厚物として供給される。この組成物を輸注によって投与する場合は、それを無菌医薬用水又は生理食塩水を含有する輸注ビンで調剤してもよい。この組成物を注射によって投与する場合は、注射用無菌水又は生理食塩水のアンプルを、それら成分を投与前に混合できるように提供してもよい。
本発明の治療剤は、中和形態又は塩形態として製剤されてもよい。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、ショュウ酸、酒石酸等から誘導されるものの如きフリーのアミノ基と形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるものの如きフリーのカルボキシル基と形成されるものが含まれる。
特定の障害又は状態の治療に有効であろう本発明の治療剤の量は、その障害又は状態の性質に依存するであろうが、標準的臨床技術によって決めることができる。加えて、in vitroアッセイを任意に用いて最適投与量範囲を特定する助けとしてもよい。この製剤中に用いられる正確な用量も、投与ルート及び疾患又は障害の重さに依存するであろうが、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与に適する投与量範囲は、一般的には、体重１ｋｇ当たり活性化合物約２０〜５００マイクログラムである。鼻腔内投与に適する投与量範囲は、一般的には、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効量は、in vitro又は動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から推定することができる。
坐剤は、一般には、０．５〜１０重量％の活性成分を含有し、経口用製剤は、好ましくは１０〜９５重量％の活性成分を含有する。
本発明は、本発明の医薬組成物の１又は２以上の成分を充填した１又は２以上の容器を含む医薬パック又はキットも提供する。かかる容器に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形での警告であって、製造、使用又は販売のこの機関によるヒト投与のための認可を反映したものを付するのは任意である。
5.5 アンチセンスによるノッチの発現の調節
本発明では、ノッチあるいはその一部をコードしている遺伝子あるいはｃＤＮＡのアンチセンスである、６個以上のヌクレオチドからなる核酸の、治療上あるいは予防上の使用が提供される。ここで、「アンチセンス」とは、配列のある程度の相補性ゆえに、ノッチＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部とハイブリダイズしうる核酸のことを称するものである。この種のアンチセンス核酸は、本発明のアンタゴニスト治療剤として利用することができ、さきに第５．１節やその下位の節で説明したような障害を治療したり予防したりする際に使用することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖、一本鎖、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡであるオリゴヌクレオチド、あるいはそれらを修飾したり、それらから誘導したものとすることができ、このアンチセンス核酸は、直接細胞に投与することも、外来の導入配列の転写によって細胞内で生成させることもできる。
ある具体的実施態様では、腫瘍あるいは障害に罹患した細胞が、（in vitroあるいはin vivoで）ノッチ遺伝子を発現していることを立証されうるような腫瘍あるいは他の障害を治療するにあたって、本発明によって提供されるノッチのアンチセンス核酸を使用することができる。ノッチ遺伝子が発現されていることは、ノッチＲＮＡあるいはノッチタンパク質を検出することによって立証することができる。
本発明は、さらに、さきに第５．４節で説明したような、本発明のノッチのアンチセンス核酸の有効量と、製剤学的に許容しうる担体とを含有する医薬組成物も提供するものである。（第５．１ならびに５．２節で説明したような）障害を治療ならびに予防するにあたって、本発明の医薬組成物を投与する方法も提供される。
別の実施態様では、本発明は、ノッチ核酸配列の原核あるいは真核細胞中での発現を抑制するにあたって、細胞に、本発明のアンチセンスノッチ核酸を含有する組成物を有効量与える方法に関するものとなっている。
また別の実施態様では、機能的ノッチ受容体を発現している細胞の同定を、ノッチのアンチセンス核酸が細胞に及ぼした毒性作用から、ノッチがその細胞を「救済」しえたか否かを観察することによって行うことができる。
本発明のさらに別の実施態様では、ノッチに結合する（「接着性」の）トポリズミックなタンパク質あるいは断片をコードする核酸に対してアンチセンスとなる核酸を、治療剤として想定している。
ノッチのアンチセンス核酸ならびにその使用について、以下で詳しく説明する。
5.5.1 ノッチのアンチセンス核酸
ノッチのアンチセンス核酸は、６個以上のヌクレオチドを有しており、好ましくは、オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド６−約５０個の範囲のオリゴヌクレオチド）である。本発明の具体的観点のいくつかでは、オリゴヌクレオチドは１０個以上、１５個以上、１００個以上、あるいは２００個以上のヌクレオチドを有している。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ混合物とすることも、それらの誘導体、あるいはそれらを修飾したものとすることもでき、また、一本鎖とすることも二本鎖とすることもできる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、リン酸骨格のいずれを修飾することもできる。オリゴヌクレオチドは、他の付加部分、たとえばペプチド、あるいは細胞膜をとおしての輸送を促進する物質（たとえば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556、Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 648-652、１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＷＯ８８／０９８１０号を参照のこと）、血液−脳障壁をとおしての輸送を促進する物質（たとえば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開番号第ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）、ハイブリダイゼーションが引金となる切断物質（たとえば、Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976を参照のこと）、あるいは挿入物質（たとえば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549を参照のこと）を有することもできる。
本発明の好適な観点では、ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。特に好適な観点では、このオリゴヌクレオチドは、ノッチ、特に好ましくはヒトのノッチのＥＬＲ１１およびＥＬＲ１２をコードする配列に対するアンチセンスであるような配列を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、構造中の任意の位置を、当業界で一般に公知の置換基で修飾することもできる。
ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ，および２，６−ジアミノプリンよりなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾塩基部分を含むこともできる。なお、修飾塩基部分はこれらに限定されるものではない。
別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ならびにヘキソースよりなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾糖部分を含有している。なお、修飾糖部分はこれらに限定されるものではない。
さらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールあるいはその同族体よりなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾リン酸骨格を含有している。
さらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡとともに特異的な二本鎖のハイブリッドを形成し、このハイブリッドでは、通常のβ単位とは異なり、双方の鎖が互いに平行に延在している（Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641）。
オリゴヌクレオチドは、別の分子、たとえばペプチド、ハイブリダイゼーションが引金となる架橋物質、輸送物質、ハイブリダイゼーションが引金となる切断物質などと結合させることもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界で公知の標準的な方法、たとえば、自動ＤＮＡ合成装置（たとえば、バイオサーチ（Biosearch）、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）などから入手可能な装置）を使用することによって合成することができる。たとえば、ホスホロチオエートオリゴは、スタインら（Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴは、controlled pore glassポリマー支持体（Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451）を使用することによって調製することができる。
ある具体的実施態様では、ノッチのアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒ＲＮＡあるいはリボザイム（たとえば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225を参照のこと）である。別の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148）、あるいはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330）である。
別の実施態様では、本発明のノッチのアンチセンス核酸を、外来の配列からの転写によって細胞内で生成させる。たとえば、in vivoで細胞にベクターが摂取されるようにベクターを導入すると、ベクターあるいはその一部が細胞内で転写されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生成されることになる。このベクターは、ノッチのアンチセンス核酸をコードする配列を含んでいるものであり、転写されることによって所望のアンチセンスＲＮＡが生成されるのであれば、ベクターはエピソームのままとどまっても、染色体に組み込まれてもよい。こうしたベクターは、当業界で標準となっている組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス性ベクターをはじめとする、哺乳動物の細胞中での複製ならびに発現に使用される当業界で公知のベクターとすることができる。ノッチのアンチセンスＲＮＡをコードする配列を発現させるにあたっては、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で作用することが当業界で知られている任意のプロモーターを用いることができ、このプロモーターは、誘導性のものとすることも、構成的なものとすることもできる。こうしたプロモーターとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター（Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797）、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42）などを挙げることができるが、プロモーターはこれらに限定されるものではない。
本発明のアンチセンス核酸は、ノッチ遺伝子、好ましくはヒトのノッチ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的な配列を有している。アンチセンス核酸は、ＲＮＡ転写物と完全に相補的であるのが好ましいものの、必ずしも完全に相補的でなくてもよい。ここで、「ＲＮＡの少なくとも一部との相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重螺旋を形成するのに十分な相補性を有する配列のことを意味するものであり、二本鎖のノッチアンチセンス核酸の場合には、二重螺旋のＤＮＡのうちの一本の鎖を調べるか、三重螺旋の形成について調べることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と、アンチセンス核酸の長さの双方に左右される。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ノッチＲＮＡと一致しない塩基の数が増えるものの、安定な二重螺旋（場合によっては三重螺旋）が形成されるようになる。当業者であれば、標準的な方法を使用してハイブリダイズした複合体の解離点を測定することによって、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。
5.5.2 ノッチのアンチセンス核酸の治療上の有用性
ノッチのアンチセンス核酸は、細胞がノッチＲＮＡを発現することがわかっているような種類の悪性疾患を治療（あるいは予防）する際に使用することができる。ノッチＲＮＡの発現について調べることのできる悪性細胞、新生物細胞、ならびに前新生物細胞としては、先に第5.1.1ならびに5.1.2節で説明したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある好適な実施態様では、一本鎖ＤＮＡのアンチセンスノッチオリゴヌクレオチドを使用する。
ノッチＲＮＡを発現する悪性（特に腫瘍）細胞の種類は、当業界で公知の各種の方法によって特定することができる。こうした方法としては、ノッチ特異的な核酸とのハイブリダイゼーション（たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な観点では、治療を行う前に、患者から採取した一次腫瘍組織をノッチの発現について調べておくことができる。
有効量のノッチのアンチセンス核酸と、製剤学的に許容しうる担体とを含有する本発明の医薬組成物（第5.1.4節を参照のこと）は、ノッチＲＮＡが発現されるような種類の悪性疾患に罹患した患者に投与することができる。
特定の障害あるいは状態を治療するにあたってのノッチのアンチセンス核酸の有効量は、障害あるいは状態の性状に応じて決まり、この量は、臨床上の標準的技法によって決定することができる。可能であれば、ヒトでの試験や使用を行う前に、治療を行う種類の腫瘍細胞に対するアンチセンスの毒性をin vitroで決定し、次に、有用な動物モデル系で測定しておくのが望ましい。
ある具体的実施態様では、ノッチのアンチセンス核酸を含有する医薬組成物を、リポソーム、微粒子、あるいはマイクロカプセルとして投与している。本発明の種々の実施態様では、この種の組成物を使用して、ノッチのアンチセンス核酸を持続的に放出させることが有用なこともある。ある具体的実施態様では、抗体を用いることによって特定の同定可能な腫瘍抗原まで送達されるようにしたリポソームを使用するのが望ましいことがある（Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337-16342）。
5.6. 診断上の有用性
ノッチタンパク質、類似体、誘導体、あるいはその配列の一部、ノッチ核酸（ならびにそれに対して相補的な配列）、ならびにノッチタンパク質と相互作用を生じる抗ノッチ抗体および他のトポリズミックタンパク質ならびにその誘導体および類似体、ならびにノッチタンパク質とトポリズミックタンパク質との相互反応を阻害する物質は、診断上の用途を有している。こうした分子は、種々の検定法、たとえば免疫検定法によって、ノッチの発現に影響が及ぶような各種の状態、疾病、ならびに障害を検出したり、予後を予測したり、診断したり、監視したりする際、そしてまた、その治療経過を監視したりする際に使用することができる。こうした免疫検定法は、特に、患者から採取した試料と抗ノッチ抗体とを免疫特異的な結合が生じうるような条件下で接触させ、抗体による免疫特異的な結合の量を検出あるいは測定する方法によって実施されるものである。ある具体的実施態様では、ノッチの異常なレベルが疾病状態の指標となるような場合に、ノッチに対する抗体を使用して、患者の組織あるいは血清の試料中のノッチの存在の有無を調べることができる。
使用しうる免疫検定法としては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈降素反応法、ゲル核酸沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体結合検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテインＡ免疫検定法をはじめとする種々の技法を使用した競合的ならびに非競合的な検定システムを挙げらことができるが、使用しうる検定法はこれらに限定されるものではない。
ノッチ遺伝子およびその関連核酸配列、ならびにその部分配列、たとえば、相補的配列ならびに他のトポリズミックな配列も、ハイブリダイゼーション検定法に使用することができる。ノッチ核酸配列、あるいは約８個以上のヌクレオチドを有するその部分配列は、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション検定法は、上述したようなノッチの発現および／または活性の異常な変化を伴う状態、障害、あるいは疾病状態を検出したり、予後を予測したり、診断したり、監視したりする際に使用することができる。こうしたハイブリダイゼーション検定法は、特に、核酸を含有する試料と、ノッチＤＮＡあるいはＲＮＡとハイブリダイズしうる核酸プローブとを、ハイブリダイゼーションが生じうるような条件下で接触させ、その結果生じたハイブリダイゼーションを検出あるいは測定する方法によって実施されるものである。
後述の第１０．１節の実施例でも詳しく説明するように、ヒトの乳癌、結腸癌、ならびに子宮頸癌では、ノッチの発現が増大する。したがって、具体的実施態様のいくつかでは、ヒトの乳癌、結腸癌、ならびに子宮頸癌、あるいはそうした組織の前悪性変化の診断を、（患者あるい別の提供者から採取した）類似した非悪性（あるいは、場合によっては非前悪性）の試料でのノッチの発現（すなわち量）（実験的に測定した発現量、あるいはこうした試料の標準的レベルとして既知の発現量）に対する、患者から採取した試料でのノッチの発現（すなわち量）の増加を検出することによって行う。
一実施態様では、検出あるいは測定を行うノッチタンパク質（あるいは、ノッチ抗原性を有しているその誘導体）が、細胞表面に存在している。別の実施態様では、ノッチタンパク質（あるいは誘導体）は、（たとえば、血液あるいは血清試料で測定されるような）無細胞の可溶性分子であったり、細胞内に存在していたりする。出願人は、無細胞ノッチは、細胞表面から分泌あるいは遊離されることによって生じたものであると考えているが、無細胞ノッチの生成機序は、こうした機序に限定されるものではない。さらに別の実施態様では、可溶性、細胞表面、ならびに細胞内のノッチタンパク質あるいは誘導体の量を検出あるいは測定する。
5.7. ノッチ核酸
ノッチ核酸またはノッチアンチセンス核酸、およびタンパク質治療剤をコードする核酸である本発明の治療剤は、下記のものを含み、それらは当分野の技術で公知の方法、特に下記の方法によって得ることができる。
本発明のある側面において、本発明は抗原決定基を含む（すなわち、抗体によって認識され得る）、または機能的に活性であるノッチ、好ましくはヒトノッチならびにそれらの断片および誘導体のアミノ酸配列、またそれらをコードする核酸配列を提供する。ここで使用される「機能的に活性な」物質とは、全長（天然型）ノッチタンパク質産物にともなう１つ以上の公知の機能的活性、例えば、デルタに結合する、セレートに結合する、他の任意のノッチリガンドに結合する、抗原性（抗ノッチ抗体に結合する）、等を示す物質をいう。
特定の態様において、本発明は少なくとも４０アミノ酸からなる、または少なくとも７５アミノ酸からなる、ノッチタンパク質の断片を提供する。他の態様において、タンパク質はノッチタンパク質の細胞内ドメイン、膜貫通領域、細胞外ドメイン、ｃｄｃ１０領域、ノッチ／ｌｉｎ−１２リピート、またはＥＧＦ−相同リピート、あるいは以上のものの任意の組み合わせを含む、または本質的にそれらからなる。ノッチのＥＧＦ−相同リピートのいくつかまたは全部を欠く断片または断片を含むタンパク質もまた提供される。以上のものをコードする核酸が提供される。
他の特定の態様において、本発明は少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも１５０ヌクレオチドからなる、ノッチ、好ましくはヒトノッチの、ヌクレオチド配列およびサブ配列を提供する。
上記のタンパク質およびタンパク質断片をコードする核酸が、そのような核酸と相補的な核酸およびそれらとハイブリダイゼーション可能な核酸と共に、提供される。１つの態様において、そのような相補的配列は、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも１００ヌクレオチドのノッチｃＤＮＡ配列と相補的であり得る。好ましい側面において、本発明はヒトノッチまたはその一部分をコードするｃＤＮＡ配列を利用する。ある特定の態様においては、ヒトノッチ遺伝子またはｃＤＮＡのこのような配列は、プラスミドｈＮ３ｋ、ｈＮ４ｋまたはｈＮ５ｋ（下記の第９節参照）あるいはそれに対応する遺伝子に含有される。このようなヒトノッチタンパク質配列は図１０（配列番号１１）または図１１（配列番号１３）に示されるものであり得る。他の態様において、ノッチ核酸および／またはそれにコードされるタンパク質は、次の刊行物のうち１つにに示される配列の少なくとも一部を有する：Whartonら、1985, Cell 43:567-581（ショウジョウバエ ノッチ）；Kiddら、1986, Mol.cell.Biol. 6:3094-3108（ショウジョウバエ ノッチ）；Coffmanら、1990, Science 249:1438-1441（ツメガエル ノッチ）；Ellisenら、1991、Cell 66:649-661（ヒトノッチ）。もう１つの側面において、ヒトノッチ配列は、図１３に示されるようなヒトノッチアミノ酸配列またはその一部をコードするものである。ある特定の側面において、ヒトノッチ配列はｈＮ相同体（プラスミドｈＮ５ｋによって部分的に表される）またはＴＡＮ−１相同体のそれである。
本発明の１つの態様において、本発明は図１３に示されるｈＮ相同体によってコードされる、信号配列（すなわち、前駆体タンパク質：アミノ酸１−２１６９）を含有するもの、および信号配列（すなわち、成熟タンパク質：アミノ酸〜２６−２１６９）を欠くもの両方の全長ヒトノッチタンパク質、その部分（つまり、細胞外ドメイン、ＥＧＦ相同リピート領域、ＥＧＦ様リピート１１および１２、ｃｄｃ−１０／アンキリンリピート、等）および前記のものを含むタンパク質ならびに前記のものをコードする核酸に向けられている。
容易に明らかなように、ここで使用される「ノッチタンパク質の断片または部分をコードする核酸」という表現は、ノッチタンパク質の他の部分ではなく記述されている断片または部分のみをコードする核酸をいうと理解されるべきものである。
本発明の好ましいが限定的ではない側面において、ヒトノッチＤＮＡ配列のクローン化および配列決定が、第９節に後述する方法によって可能である。
別の好ましい側面においては、選択に先立ち、ライブラリー中の所望の配列を増幅するのにＰＣＲが用いられる。例えば、所望の遺伝子の相同体によってコードされる付着性ドメインを部分的に表すオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲにおけるプライマーとして使用できる。
上記の方法は、ノッチのクローンを得る方法の下記の一般的記述を制限するものではない。
真核細胞は、ノッチ遺伝子の分子クローニングのための核酸供給源として役立つ可能性がある。ＤＮＡは当技術分野で公知の標準的手順によって、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または所望のヒト細胞から精製したゲノムＤＮＡあるいはその断片のクローニングによって得ることができる［例えば、Sambrookら、1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2d.Ed., Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M.（編）, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II参照］。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コード領域のほかに、調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含有する可能性がある。ｃＤＮＡから誘導されたクローンはエキソン配列のみを含有する。供給源が何であれ、遺伝子はその増殖のために適切なベクター中に分子としてクローン化されなければならない。
ゲノムＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローン化においては、ＤＮＡ断片が作成され、そのうちいくつかが所望の遺伝子をコードする。種々の制限酵素を用いて特定部位でＤＮＡを開裂することができる。または、マンガンの存在下でＤＮアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を用いてＤＮＡをばらばらにすることも可能であるし、あるいは、例えば超音波処理により、ＤＮＡを物理的に切断することも可能である。次に、線形ＤＮＡ断片を、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびにカラムクロマトグラフィーを含むがこれらのみに限定されない標準的技法により、サイズによって分離することができる。
いったんＤＮＡ断片を作成したならば、いろいろな方法で所望の遺伝子を含有する特定ＤＮＡ断片の同定を成し遂げることが可能である。例えば、（任意の種の）ノッチ遺伝子またはその特異的ＲＮＡの一部分、もしくはその断片（例えば接着性ドメイン）の量が分かっていて、精製し標識することが可能ならば、作成されたＤＮＡ断片は標識されたプローブへの核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる（Benton, W.およびDavis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M.およびHogness, D., 1975, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72. 3961参照）。プローブに対し実質的相同性を有するそれらのＤＮＡ断片はハイブリダイゼーションを行なう。また、制限酵素切断、および断片サイズと公知の制限酵素地図（もし入手可能であれば）にしたがって予想される断片サイズとの比較、によっても適切な断片を同定することができる。遺伝子の特性に基づいて、さらに選択を実施することが可能である。または、遺伝子の存在を、発現された産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイによって検出することもできる。例えば、ノッチについて知られているのと同様の、または同一の電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、in vitro凝集活性［「接着性」］または抗原特性を有するタンパク質を産生する適切なｍＲＮＡをハイブリッド選択（hybrid-select）するｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンを選択することができる。ノッチに対する抗体が入手可能ならば、ノッチタンパク質は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）タイプの手順によって、標識抗体の推定上のノッチ合成クローンとの結合により同定することができる。
ノッチ遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡ選択とそれに続くin vitro翻訳によっても同定することができる。この手順においては、断片はハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離するのに使われる。このようなＤＮＡ断片は、別の種（例えば、ショウジョウバエ）の入手可能な、精製ノッチＤＮＡを表すものであってよい。単離されたｍＲＮＡの単離された産物のin vitro翻訳産物の免疫沈殿分析または機能アッセイ（例えば、in vitroにおける凝集能力；後述の実施例を参照）は、ｍＲＮＡを同定し、したがって所望の配列を含有する相補的ＤＮＡ断片を同定する。さらに、特異的ｍＲＮＡは、細胞から単離したポリソームをノッチまたはデルタタンパク質に特異的に向けられている固定化抗体に吸着することにより、選択することができる。放射性標識ノッチｃＤＮＡは、（吸着されたポリソームから）選択したｍＲＮＡを鋳型として用いて合成することができる。次に、放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを、他のゲノムＤＮＡ断片からノッチＤＮＡ断片を同定するためのプローブとして使用できる。
ノッチゲノムＤＮＡを単離することに代わる方法は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、公知の配列から遺伝子配列それ自体を化学的に合成する、またはノッチ遺伝子をコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成する。例えば、ノッチ遺伝子のｃＤＮＡクローン化のためのＲＮＡは、ノッチを発現する細胞から単離することができる。他の方法も可能であり、それらは本発明の範囲内にある。
次に、同定され、単離された遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入することができる。当技術分野で公知の、多数のベクター−宿主系が使用できる。可能性のあるベクターはプラスミドまたは修飾されたウイルスを含むがこれらだけに限定されない。しかし、ベクター系は使用される宿主細胞と適合するものでなければならない。このようなベクターには、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、あるいはＰＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミドが含まれるが、これらだけに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えばＤＮＡ断片を相補的接着末端を有するクローニングベクターに連結することにより達成することができる。しかし、ＤＮＡを断片にするのに使用される相補的制限部位がクローニングベクターにない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素により修飾することができる。または、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより、任意の所望部位を作成することができる：これらの連結されるリンカーは、青原エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の方法では、開裂されたベクターおよびノッチまたはデルタ遺伝子を、ホモポリマーによるテーリング（tailing）によって修飾することができる。遺伝子配列のコピーが多数生じるように、組換え分子を形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、などにより宿主細胞に導入することができる。
別の方法では、所望の遺伝子を適切なクローニングベクターに「ショット・ガン」法により挿入した後に、同定し単離することができる。例えば、サイズ分別による所望遺伝子の富化を、クローニングベクターへの挿入の前に実施できる。
特定の態様において、単離されたノッチ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成されたＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数コピーの産生を可能とする。したがって、形質転換細胞を培養し、そこから組換えＤＮＡ分子を単離し、そして必要であれば単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、その遺伝子を大量に得ることができる。
本発明によって提供されるノッチ配列は、天然のノッチタンパク質に見出だされるものと実質的に同一なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および機能的に等しいアミノ酸を持つコードされたアミノ酸配列を含む。これらの配列すべては、後述の第５．６節にノッチ誘導体として記載されている。
デルタ、セレート、またはその接着性部分、あるいは他の興味のあるトポリズミック（toporythmic）遺伝子をコードする核酸を得るために、上に記述した方法と同様の方法が用い得る。特定の態様において、デルタ核酸は図１（配列番号１）に示される配列の少なくとも一部分を有する。別の特定の態様では、セレート核酸は図５（配列番号３）に示される配列の少なくとも一部分を有する。トポリズミックタンパク質をコードする核酸配列は、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマまたはイヌ、ならびに霊長目の動物から、ならびに公知のトポリズミック遺伝子［以下の遺伝子（公表された配列を持つ、括弧内に示すもの）を含むがそれらだけに限定されない：デルタ（Vassinら、1987、EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynskiら、1988, Genes Dev. 2, 1723-1735;本明細書の図１（配列番号１および配列番号２）に見出だされるKopczynskiらの配列への訂正に注意されたい）およびセレート（Flemingら, 1990, Genes & Dev. 4, 2188-2201）］の相同体を同定することができる他の任意の種から、単離することができる。そのような配列は、上に述べた機能的に等しい分子をもたらす置換、付加、または除去によって変更することができる。
5.8. タンパク質治療剤の組換え産生
本発明のタンパク質治療剤をコードする核酸は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、天然のトポリズミック遺伝子および／またはそのフランキング領域によっても供給され得る。タンパク質をコードする配列を発現するため、種々の宿主−ベクター系が使用できる。これらには以下のものが含まれるが、それだけに限定されない。すなわち、ウイルス［例えば、ワクシニアウイルス（vaccinia virus）、アデノウイルス（adenovirus）、等］に感染させた哺乳動物細胞系、ウイルス［例えば、バクロウイルス（baculovirus）］に感染させた昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母、等の微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡによって形質転換されたバクテリアである。
ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が様々である。使用する宿主−ベクター系によって、多数ある適切な転写および翻訳エレメントのうち任意の１つを使用できる。特定の態様において、ノッチ遺伝子の接着性部分、例えばＥＧＦ様リピート（ＥＬＲ）１１および１２が発現される。他の特定の態様において、ヒトノッチ遺伝子、またはヒトノッチの機能的に活性な部分をコードする配列が発現される。
ＤＮＡ断片をベクターに挿入するために上に記述した方法の任意のものを、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質をコードする配列からなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターの構築に使用できる。これらの方法は、in vitro組換えＤＮＡおよび合成技法およびin vivo組換え体（遺伝子組換え）を含むことができる。ノッチタンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、そのノッチタンパク質またはペプチドが組換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって制御され得る。例えば、ノッチタンパク質の発現を、当分野の技術で公知の、任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御することができる。トポリズミック遺伝子発現を制御するのに使用できるプロモーターは、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、ＳＶ４０初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon,1981,Nature 290,304-310）；ラウス肉種ウイルス（Rous sarcoma virus）の３′末端ＬＴＲ（long terminal repeat）に含有されるプロモーター（Yamamotoら、1980,Cell 22,787-797）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78,1441-1445）；メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら、1982,Nature,296,39-42）；β−ラクタマーゼプロモーター等の原核細胞発現ベクター（Villa-Kamaroffら、1978,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 75、3727-3731）またはｔａｃプロモーター（DeBoerら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80、21-25）；Scientific American,1980,242,74-94記載の「組換えバクテリア由来の有用タンパク質」をも参照のこと；ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Herrera-Estrellaら、Nature 303,209-213）、またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Gardnerら、1981,Nucl.Acids Res.9,2781）、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（Herrera-Estrellaら、1984、Nature 310、115-120）；酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（フォスフォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、および組織特異性を示しトランスジェニック動物に使用されてきた、下記の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら、1984,Cell 38,639-646;Ornitzら,1986,Cold spring Harbor Symp. Quant.Biol.50,399-409;MacDonald,1987,Hepatology 7,425-515）；膵臓ベータ細胞において活性のインスリン遺伝子制御領域（Hanahan,1985,Nature 315,115-122）、リンパ球において活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、1984,Cell 38,647-658;Adamesら、1985,Nature 318,533-538;Alexanderら、1987,Mol.Cell.Biol. 7,1436-1444）、精巣、胸部、リンパ球および肥満細胞（mast cell）において活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら、1986,Cell 45,485-495）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、1987,Genes and Devel. 1,268-276）、肝臓において活性なα−フェトプロテイン（fetoprotein）遺伝子制御領域（Krumlaufら、1985,Mol.Cell.Biol. 5,1639-1648;Hammerら、1987,Science 235,53-58）；肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、1987,Genes and Devel. 1,161-171）；骨髄様細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Magramら、1985,Nature 315,338-340;Kolliasら、1986,Cell 46,89-94;脳の希突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら、1987,Cell 48,703-712）；骨格筋において活性なミオシンＬ鎖−２遺伝子制御領域（Sani,1985,Nature 314,283-286）、および視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、1986,Science 234,1372-1378）である。
ノッチ遺伝子挿入配列を含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチによって同定することができる。すなわち、（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および（ｃ）挿入された配列の発現、である。第１のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入されたトポリズミック遺伝子と相同的な配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより、検出することができる。第２のアプローチにおいては、外来遺伝子のベクターへの挿入によって生じた、ある「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体の形成、等）の存在または不在に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、ノッチ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、ノッチ挿入配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定され得る。第３のアプローチにおいては、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現された外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えばin vitroアッセイ系におけるノッチ遺伝子産物の物理的または機能的特性、例えば凝集（接着）能力、に基づいて行ない得る（後述の第６〜７節参照）。
ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されたならば、それを増殖させるため、当分野の技術で公知のいくつかの方法を用いることができる。適切な宿主系および増殖条件が確立されたならば、組換え発現ベクターを増殖させ、大量に調製することが可能である。前に説明したように、発現ベクターは下記のベクターおよびその誘導体を含むが、それらだけに限定されない。すなわち、例を少し挙げれば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス等のヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルス等の昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドならびにコスミドＤＮＡベクターである。
さらに、宿主細胞株は、所望の特定の方法で挿入された配列の発現を調節し、または遺伝子産物を修飾し処理するものを選択することができる。あるプロモーターからの発現は、特定のインデューサー（inducer）の存在下で高めることができる。したがって、遺伝子操作されたノッチタンパク質の発現は制御可能である。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳および翻訳後のタンパク質のプロセシングおよび修飾（例えば、グリコシル化、開裂、等）についてそれぞれ特徴的で特異的なメカニスムを有する。発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にする、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、グリコシル化されていない、コアタンパク質産物を産生するためには、バクテリア系による発現が使用できる。酵母における発現は、グルコシル化された産物を産生する。哺乳動物細胞における発現は、異種哺乳動物トポリズミックタンパク質の「天然の」グリコシル化を確実にするために使用できる。さらに、異なるベクター／宿主発現系はタンパク質分解開裂などのプロセシング反応をそれぞれ異なる度合で行なうことができる。
他の特定の態様において、ノッチタンパク質、断片、類似体、または誘導体は、［ペプチド結合によって異種タンパク質配列（または異なる蛋白質）に結合した上記のタンパク質、断片、類似体、または誘導体を含む］融合またはキメラタンパク質産物として発現することができる。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を当技術分野の公知の方法によって適切なコーディングフレーム（coding frame）の中で相互に連結し、そして当分野の技術で周知の方法によりキメラ産物を発現することにより、作成できる。または、このようなキメラ産物は、例えばペプチドシンセザイザーを用いるタンパク質合成技法によって作製することも可能である。
ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方ともクローン化し、発現することができる。
他の態様においては、ノッチｃＤＮＡ配列を染色体上で統合し、発現することが可能である。当分野の技術で公知の相同組換え手順が使用できる。
5.8.1. 発現された遺伝子産物の同定および精製
ノッチ遺伝子配列を発現する組換え体が同定されたならば、遺伝子産物を分析することができる。これは、産物の物理的または機能的特性に基づくアッセイによって達成することができる。ここには、産物の放射性標識とそれに続くゲル電気泳動による分析が含まれる。
ひとたびノッチタンパク質が同定されたならば、クロマトグラフィー［例、イオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー］、遠心、示差溶解性を含む標準的な方法、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的技法により、このタンパク質を単離し、精製することができる。その機能的特性は、凝集アッセイを含むがこれだけに限定されない、任意の適切なアッセイを用いて評価することができる（第６〜７節参照）。
5.9. ノッチおよび他のトポリズミックタンパク質の誘導体および類似体
本発明はさらに治療剤としてノッチタンパク質の誘導体（断片を含むがそれだけに限定されない）および類似体を提供する。また、治療剤として、他のトポリズミックタンパク質ならびにその誘導体および類似体、または、特にこのような他のトポリズミックタンパク質とノッチとの相互作用を促進、または阻害するノッチリガンドをも提供する。
ノッチに関連する誘導体および類似体の作成および使用は、本発明の範囲内にある。ある特定の態様において、その誘導体または類似体は機能的に活性である。つまり、全長、天然型のノッチタンパク質に伴なう１つ以上の機能的活性を示すことができる。１例として、所望の抗原性を有するこのような誘導体または類似体は、例えば第５．３節に記述されたように診断的イムノアッセイに使用できる。所望のノッチ特性（例えば、デルタまたは他のトポリズミックタンパク質に結合する、細胞内リガンドに結合する、等）を保有する、またはこれを阻害する分子は、このような特性のそれぞれインデューサーまたはインヒビターとして、およびその生理学的相関物として治療に使用できる。ノッチの誘導体または類似体は、後述するアッセイを含むがそれらだけに限定されない当分野の技術で公知の手順により、所望の活性について、試験することができる。ある特定の態様においては、ペプチドライブラリーをスクリーニングして、所望の活性を有するペプチドを選択することができる：このようなスクリーニングは、例えばノッチ、またはデルタなどのノッチ結合パートナーとの結合についてアッセイすることにより実施できる。
特に、ノッチ誘導体は、機能的に等しい分子をもたらす置換、付加または除去によってノッチ配列を変更することにより作成できる。ヌクレオチドをコードする配列の縮重により、ノッチ遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使用し得る。これらの配列は、次のものを含むがそれだけに限定されない。すなわち、ノッチ遺伝子の全部または一部を含む、機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの配列内での置換によって変更されており、したがってサイレント変化（silent change）を生じているヌクレオチド配列である。同様に、本発明のノッチ誘導体は、一次アミノ酸配列として、配列内で機能的に等しいアミノ酸残基が置換され、その結果サイレント変化を生じている変更された配列を含めて、ノッチタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含有する誘導体を包含するが、それだけに限定されない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、機能的等価物として働く、同様の極性をもつ別のアミノ酸によって置換することが可能であり、その結果サイレント変化が生じる。配列内のあるアミノ酸の置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性のアミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽性に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。陰性に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパルギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
ノッチの誘導体または類似体は、ノッチまたはその断片に実質的に相同的なペプチド、またはそれをコードする核酸がノッチ核酸配列とハイブリダイゼーションを行なうことができるペプチドを含むが、それらだけに限定されない。
本発明のノッチ誘導体および類似体は、当分野の技術で公知の種々の方法によって作成することができる。それらの作成をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質のレベルで起こり得る。例えば、クローン化されたノッチ遺伝子配列は、当分野の技術で公知の多くの方策のうち任意のものによって修飾することができる（Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor、New York）。上記の配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で開裂し、続いて所望であればさらに酵素的修飾を行ない、単離し、そしてin vitroで連結することができる。ノッチの誘導体または類似体をコードする遺伝子を作成する際は、修飾された遺伝子が、所望のノッチ活性がコードされている遺伝子領域で、翻訳停止シグナルに中断されずに、ノッチと同一の翻訳リーディングフレーム内に確実にとどまるように注意しなければならない。
さらに、ノッチをコードする核酸配列をin vitroまたはin vivoで突然変異させて、翻訳、開始、および／または終始配列を創製および／または破壊し、またはコード領域内で変化を創製し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、または既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊し、それによってさらなるin vitro修飾を容易にすることが可能である。in vitro部位特異的突然変異誘発法（Hutchinson, C.,ら、1978,J.Biol.Chem. 253:6551）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用、等を含むがこれらだけに限定されない、当分野の技術で公知の任意の突然変異誘発技法が使用できる。
ノッチ配列の操作は、タンパク質レベルでも行ない得る。翻訳中または翻訳後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解開裂、抗体分子またはの他の細胞リガンドとの結合、等により示差的に修飾されたノッチタンパク質の断片または他の誘導体もしくは類似体は、本発明の範囲に含まれる。多数の化学修飾の任意のものが、公知の技法により実施できる。これらの技法は以下のものを含むが、それだけに限定されない。すなわち、臭素化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；等である。
さらに、ノッチの誘導体および類似体は、化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含む、または所望のin vitroでの凝集活性または受容体との結合を仲介する、ノッチタンパク質の一部に対応するペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用によって合成することができる。さらに、所望であれば、ノッチ配列に、置換物または付加物として、ノンクラシカル（nonclassical）アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を導入することもできる。ノンクラシカルアミノ酸には、以下のものが含まれるがそれらだけに限定されない。すなわち、普通のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、たとえばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸、等のデザイナー（designer）アミノ酸である。
ある特定の態様において、ノッチ誘導体は、ペプチド結合によってアミノ−および／またはカルボキシ−末端で非ノッチアミノ酸配列と融合したノッチタンパク質またはその断片を含むキメラまたは融合タンパク質である。ある態様では、このようなキメラ蛋白質は、そのタンパク質をコードする核酸（フレーム内で非ノッチコード配列に結合している、ノッチをコードする配列を含む）の組換え発現によって産生される。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を公知の方法により適切なコーディング・フレーム（coding frame）内で相互に連結し、そして当分野の技術で周知の方法によりキメラ産物を発現させることにより作成される。または、このようなキメラ産物は、例えばペプチドシンセサイザーの使用によるタンパク質合成技法によって作成することができる。ある特定の態様において、異種シグナル配列をもつ成熟ノッチタンパク質をコードするキメラ核酸は、キメラタンパク質が細胞によって発現されて、成熟ノッチタンパク質へと処理されるように、発現される。本発明を制限するものではない別の例として、ノッチおよび他のトポリズミック遺伝子（例えばデルタ）の両方のコード部分を含む組換え分子を、本発明にしたがって構築することができる。このような組換え分子のコードされたタンパク質は、ノッチおよびデルタの両方に伴なう特性を示すことができるだろう。そして、アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的活性の新しい特徴を表すことができるであろう。ノッチおよびデルタの第１次配列は、コンピュータ・シミュレーションを用いて分子の３次構造を予測するのにも使用できる（HoppおよびWoods,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:3824-3828）；ノッチ／デルタキメラ組換え遺伝子は、３次構造と生物学的機能の相関性を考慮して設計することができるだろう。同様に、異種（非ノッチ）タンパク質をコードする任意の配列と融合したノッチ部分を含むキメラ遺伝子を構築することができる。ある特定の態様は、少なくとも６個のアミノ酸からなるノッチの断片を含むキメラタンパク質に関する。
別の特定の態様では、ノッチ誘導体は別のトポリズミックタンパク質との相同領域を含むノッチの断片である。本明細書中では、第１のタンパク質のある領域のアミノ酸配列を、その領域に含まれるアミノ酸の数と同数のアミノ酸からなる第２のタンパク質の任意の配列と比較した時、少なくとも３０％同じ場合、または少なくとも７５％同じかコンサーバティブ（conservative）な変化を含む場合、第１のタンパク質のその領域は第２のタンパク質と「相同的である」と考慮されるものとする。
セレート、デルタ、および他のトポリズミックタンパク質の誘導体、ならびにそれらの接着性部分は、上に記述した方法と同様の方法で作成することができる。
5.9.1 ノッチタンパク質の１つ以上のドメインを含有するノッチの誘導体
特定の態様において、本発明はノッチタンパク質の１つ以上のドメインを含むノッチ誘導体および類似体、特にノッチ断片およびその断片の誘導体である治療剤を提供する。これらのドメインは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、ノッチタンパク質の膜結合領域、１つ以上のＥＧＦ様リピート（ＥＬＲ）、ｃｄｃ１０リピート、およびノッチ／ｌｉｎ−１２リピートを含むが、これらだけに限定されない。特定の態様において、ノッチ誘導体はＥＬＲの全部または一部、あるいはノッチタンパク質の他の領域の１つ以上を欠くことがある。
キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）以外の種、好ましくはヒトのノッチタンパク質に関連したある特定の態様において、ノッチの特定部分を含む断片は、各ノッチタンパク質におけるショウジョウバエノッチタンパク質の特定断片（例えば、ＥＬＲ１１およびＥＬＲ１２）と最も相同的な部分を含む断片である。
5.9.2 トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を仲介するノッチまたは他のトポリズミックタンパク質の誘導体、ならびにそのインヒビター
本発明はまた、トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を仲介する、（したがって本明細書では「接着性」と表現される）ノッチ断片およびその断片の類似体または誘導体、ならびにそれらをコードする核酸配列を提供する。
本発明の治療剤として包含されるものには、また、トポリズミック（例えば、デルタ、セレート）タンパク質断片およびその類似体又は誘導体があり、それらはノッチへのヘテロタイプの結合（したがって本明細書では「接着性」と表現される）及び上記のものに関連する核酸配列を仲介する。
本発明の治療剤として包含されるものには、また、上記のトポリズミックタンパク質とノッチとの相互作用のインヒビター（例えば、ペプチドインヒビター）がある。
トポリズミックタンパク質に結合する能力は、そのようなトポリズミックタンパク質を発現する細胞と、ノッチまたはノッチ誘導体を発現する細胞を用いたin vitro凝集アッセイによって実証することができる（第６節参照）。すなわち、あるタンパク質断片のノッチタンパク質に結合する能力は、第１の細胞の表面で発現された時に、第２の細胞の表面で発現されたノッチタンパク質に結合するその断片の能力を検出することにより実証できる。上記の相互作用のインヒビターは、このようなin vitroでの凝集を阻止する能力によって検出が可能である。
このようなアッセイに使用される、トポリズミックタンパク質またはその接着性ドメインをコードする核酸配列は、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、または昆虫、および霊長目の動物から、ならびに公知のトポリズミック遺伝子の相同体を同定することができるその他の任意の種から、単離することができる。
ある特定の態様では、ノッチの接着性断片は、ＥＬＲ１１および１２、すなわちショウジョウバエノッチ配列のアミノ酸番号４４７から５２７（配列番号１４）と最も相同的なノッチの部分を含む断片である（図４参照）。また別の特定の態様においては、ノッチへの結合を仲介するデルタの接着性断片は、ショウジョウバエデルタ配列（配列番号２）のアミノ酸番号１〜２３０あたりと最も相同的なデルタの部分を含む断片である。セレートの接着性断片に関連する特定の態様においては、そのような断片は、ショウジョウバエセレート配列［図５（配列番号４）参照］のアミノ酸番号８５〜２８３または７９〜２８２あたりと最も相同的なセレートの部分を含む断片である。
ヌクレオチドコード配列の縮重により、接着性配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施に使用することができる。これらのＤＮＡ配列には以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、ノッチ、デルタまたはセレート遺伝子の全部または一部を含む、機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの配列内での置換によって変更され、したがってサイレント変化を生じているヌクレオチド配列である。同様に、本発明の接着性タンパク質断片またはその誘導体は、一次アミノ酸配列として、配列内で機能的に等しいアミノ酸残基が置換され、その結果サイレント変化を生じている変更された配列を含めて、接着性ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含有する誘導体を包含するが、それらだけに限定されない。
トポリズミックタンパク質の接着性断片、および接着性トポリズミックタンパク質配列に関連した考えうる誘導体、類似体、またはペプチドは、所望の結合活性について、例えば本明細書の実施例に記述されているin vitro凝集アッセイによって試験することができる。トポリズミックタンパク質の接着性断片の接着性誘導体または接着性類似体は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、上記の接着性断片と実質的に相同なペプチド、またはそのコードする核酸が上記の接着断片をコードする核酸配列とハイブリダイゼーションを行うことができるペプチドで、これらのペプチドおよびペプチド類似体は、実施例の節に記述されているような凝集アッセイによりin vitroで試験すると、積極的な結合活性を有する。このような誘導体および類似体は、治療剤として考えられており、本発明の範囲内にある。
本発明の接着性タンパク質に関連した誘導体、類似体およびペプチドは、当分野の技術で公知の種々の方法により作成できる。それらの作成をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こりうる（第５．６節参照）。
さらに、上記の接着性のものをコードする核酸配列は、in vitroまたはin vivoで突然変異させることができる；そして、接着性配列の操作もまた、タンパク質レベルで行ないうる（第５．６節参照）。
さらに、接着性断片に関連する類似体およびペプチドは化学的に合成することができる。
5.10. ノッチタンパク質、誘導体および類似体のアッセイ
ノッチタンパク質、誘導体および類似体、ならびにノッチに結合する他のトポリズミックタンパク質のin vitro活性を、様々な方法でアッセイすることができる。
例えば、抗ノッチ抗体への結合能力、または抗ノッチ抗体への結合について天然型ノッチと競合する能力をアッセイする１つの態様においては、当分野の技術で公知の種々のイムノアッセイを使用することができる。そこには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技法を用いる競合的および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらだけに限定されない。１つの態様においては、第１の抗体上の標識を検出することによって、抗体結合が検出される。別の態様においては、第２の抗体または試薬の、第１の抗体への結合を検出することによって第１の抗体が検出される。さらに別の態様においては、第２の抗体が標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が公知であり、これらは本発明の範囲内にある。
ノッチへの結合を仲介する能力をアッセイするもう１つの態様においては、第６節または７節に記述されているような、in vitro凝集アッセイを実施することができる（Fehonら、1990, Cell 61:523-534;Rebayら、1991, Cell 67:687-699も参照されたい）。
ノッチに対する別のリガンドが同定されるもう１つの態様においては、リガンド結合を、例えば当分野の技術で周知の結合アッセイによってアッセイすることができる。別の態様においては、ノッチ受容体（シグナル変換）を発現する細胞へのリガンド結合の生理学的相関物をアッセイすることができる。
別の態様においては、昆虫または他のモデル系で、天然型ノッチの誘導体または類似体であるノッチ変異体の表現型効果を研究する遺伝子研究を実施することができる。
当業者には他の方法がわかるであろう。そして、それらは本発明の範囲内にある。
5.11. ノッチタンパク質、誘導体および類似体に対する抗体
本発明の１つの態様によれば、ノッチに対して向けられた抗体およびその結合ドメインを含有する断片は、治療剤である。したがって、ノッチタンパク質、その断片、類似体または誘導体、特にヒトノッチタンパク質またはその断片は、抗ノッチタンパク質抗体を産生するための免疫原として使用できる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリー由来でありうる。特定の態様においては、ノッチのＥＧＦ様リピート１１および１２に対して特異的な抗体を調製することができる。他の態様においては、ノッチの細胞外ドメインと反応する抗体を産生することができる。このような抗体の１例は、in vitroアッセイにおける凝集を妨げることができる。別の態様においては、ヒトノッチに特異的な抗体が産生される。
ノッチタンパク質またはペプチドに対するポリクローナル抗体の産生のために、当分野の技術で公知の種々の手順が使用できる。特定の態様においては、図１０または１１に示される配列またはそのサブ配列によってコードされるヒトノッチタンパク質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を得ることができる。抗体産生のために、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらだけに限定されない種々の宿主動物を、天然のノッチタンパク質、または合成したノッチタンパク質、またはそれらの断片の注射により免疫感作することができる。宿主の種により、免疫応答を増大させるため様々なアジュバントを使用することができる。これらのアジュバントには以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、（完全および不完全）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性剤、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールド（keyhold）リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）、コリネバクテリウム・パルバム（corynebacterium parvum）等の可能性として有用なヒトのアジュバントである。
ノッチタンパク質配列に向られたモノクローナル抗体の調製のためには、培養の連続細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技法が使用できる。例としては、KohlerおよびMilstein（1975,Nature 256,495-497）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、ならびにトリオーマ（trioma）技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozborら、1983,Immunology Today 4,72）、ヒトモノクロ−ナル抗体産生のためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Coleら、1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96）が挙げられる。
抗体分子のイディオタイプ（結合ドメイン）を含有する抗体断片は、公知の技法により作成することができる。例えば、そのような断片は以下のものを含むが、それらだけに限定されない。すなわち、抗体分子のペプシン消化により産生することができるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより産生することができるFab'断片、および抗体分子をパパインならびに還元剤で処理することによって産生できるＦａｂ断片である。
抗体の産生にあたっては、所望の抗体を得るためのスクリーニングを、当分野の技術で公知の技法、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）によって達成することができる。例えば、ノッチタンパク質の接着性ドメインを認識する抗体を選択するため、そのようなドメインを含有するタンパク質断片に結合する産物について、産生されたハイブリドーマをアッセイすることができる。ヒトノッチに特異的な抗体を選択するためには、ヒトノッチへの陽性結合およびショウジョウバエノッチへの結合の欠如に基づいて、選択することができる。
治療上の有用性に加えて、上記の抗体は第５．６節に記述した診断的イムノアッセイにおいても有用である。
先に記述した手順と同様の手順が、ノッチと結合もしくは別な相互作用をする、他のタンパク質（特にトポリズミックタンパク質）のドメイン（例：デルタまたはセレートの接着性断片）に対する抗体である治療剤を作成するのに使用できる。
6. ノッチのドメインはデルタとの結合を仲介する
ノッチおよびデルタ遺伝子の産物間の分子間会合を、Drosophila Schneider's（S2）細胞（Fehonら, 1990, Cell 61, 523-534）における凝集に対するそれらの発現の効果を検討することにより、検出した。この相互作用の成分を分析する際に使用することができるアッセイ系のみならず、ノッチおよびデルタ間の分子間相互作用の直接的な証拠もここに記載する。ノッチを発現する通常非接着性のDrosophila S2培養細胞は、カルシウムに依存する様式で、デルタを発現する細胞に特異的に結合する。さらに、ノッチを発現する細胞は互いに結合しないが、デルタを発現する細胞は互いに結合し、このことから、ノッチとデルタは細胞表面でデルタへの結合に関して競合しうることが示唆される。ノッチとデルタは、培養細胞および胚細胞の両方において、界面活性剤可溶性の複合体を形成し、このことからノッチとデルタは分子レベルでin vitroおよびin vivoで直接相互作用することが示唆される。上記の分析は、ノッチおよびデルタタンパク質が細胞表面でそれらの細胞外ドメインを介して相互作用することを示唆している。
6.1. 実験方法
6.1.1. 発現構築物
発現構築物はFehonら, 1990, Cell 61: 523-534に記載されている。簡単に説明すると、pRmHa-3（Bunchら, 1988, Nucl. Acid Res. 16, 1043-1061）への挿入に続いて、MgIIaミニ遺伝子cDNA/ゲノムキメラ構築物（Ramosら, 1989, Genetics 123, 337-348）によりコードされたノッチを発現させた。pMtNMgと命名された得られた構築物において、pRmHa-3のメタロチオネインプロモーターは、翻訳開始部位の20ヌクレオチド上流で始まるノッチに融合している。
細胞外ノッチ構築物（ECN1）はノッチコスミド（Ramosら, 1989, Genetics 123, 337-348）から誘導され、アミノ酸1790から2625までのノッチコード配列の内部欠失（Whartonら, 1985, Cell 43,567-581）、および新規な59アミノ酸カルボキシル末端を産生する予測されたフレームシフトを有する。
このデルタ発現構築物について、D11 cDNA（Kopczynskiら, 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735;図１；SEQ ID NO:1）（これはデルタに対して完全なコード能力を含む）をpRmHa-3のEcoRI部位へ挿入した。この構築物をpMTD11と称した。
6.1.2. 抗体の作製
ノッチの分子内ドメイン（アミノ酸1791-2504；Whartonら, 1985, Cell 43, 567-581）の大半をコードする配列を含む2.1kbのSalI-HindIII断片をベースとする融合タンパク質で免疫感作したマウスから、ハイブリドーマ細胞系C17.9C6を得た。上記の断片をpUR289（RutherおよびMuller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794）にサブクローニングした後、pATH1発現ベクター（DieckmannおよびTzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520）へBglII-HindIII断片として移入した。可溶性融合タンパク質が発現され、6M尿素中に再懸濁させた25%(NH4)2SO4で沈殿させ、Rotofor（Bio-Rad）を用いる分取等電点電気泳動により精製した（詳細については、Fehonら, 1989, Rotofor Review No. 7, Bulletin 1518, Richmond, California: Bio-Rad Laboratoriesを参照のこと）。
個々にin-frameで適当なpGEX発現ベクター（SmithおよびJohnson, 1988, Gene 67,31-40）に挿入された、0.8kb（アミノ酸237-501: Whartonら, 1985, Cell 43, 567-581）、1.1kb（アミノ酸501-868）、0.99kb（アミノ酸868-1200）および1.4kb（アミノ酸1465-1935）の長さの４つのBstY1断片を用いて、ノッチの細胞外ドメインに対して、マウスポリクローナル抗血清を生産させた。上記の断片は、膜貫通ドメインを横切って第５のEGF様リピートから伸びていた。融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズ（SIGMA）上で精製した。マウスおよびラットの抗血清を50%(NH4)2SO4で沈殿させ、0.02% NaN3とともにPBS（150mM NaCl, 14mM Na2HPO4, 6mM NaH2PO4）に再懸濁させた。
デルタの４番目から９番目のEGF様リピートまで伸びている配列（アミノ酸350-529）を含む、デルタの細胞外ドメイン（Kopczynskiら, 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735）由来のコード配列を含む融合タンパク質で免疫感作したマウスから、ハイブリドーマ細胞系201を得た。
同じ融合タンパク質構築物から誘導された抗原での免疫感作に続いて、ラットポリクローナル抗血清を得た。この場合、IPTG誘導細胞をSDS-Laemmli緩衝液（CarrollおよびLaughon, 1987, in DNA Cloning, III巻, D.M. Glover編（Oxford: IRL Press）,pp. 89-111）に溶解し、SDS-PAGEでタンパク質を分離し、そのゲルから適当なバンドを切り出し、そして、そのゲル切片から免疫感作に使用するための抗原を電気溶出する（HarlowおよびLane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory））ことにより、融合タンパク質を調製した。
6.1.3. 細胞培養およびトランスフェクション
S2細胞系（Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365）を、2.5mg/mlバクトペプトン（Difco）、１mg/ml TCYeastolate（Difco）、11%熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone）および100U/mlペニシリン−100μg/mlストレプトマイシン−0.25μg/ml fungizone（Hazleton）を補充したM3培地（Hazleton社により調製）中で増殖させた。HEPES緩衝液（ChenおよびOkayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752）の代わりにBES緩衝液（SIGMA）を使用した他は前記したように（Wiglerら, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373-1376）、対数期の約2 x 106個/mlで増殖している細胞を培養物５ml当たり１mlの量で20μgのDNA-リン酸カルシウム共沈殿物によりトランスフェクトした。16〜18時間後、細胞をコニカル遠心管に移し、臨床用遠心機にてフルスピードで30秒間ペレット化し、1/4体積の新鮮な完全培地で１回すすぎ、もとの体積の完全培地に再懸濁し、そして、もとのフラスコに戻した。その後、トランスフェクトした細胞を誘導の前に24時間回復させた。
6.1.4. 凝集アッセイ
CuSO4を0.7mMまで添加することにより、ノッチおよびデルタメタロチオネイン構築物の発現を誘導した。ECN1構築物でトランスフェクトした細胞も同様に処理した。その後、細胞を混合し、凝集条件下でインキュベートし、特異的抗血清および発現細胞を視覚化する免疫蛍光鏡検法を用いてそれらの凝集能を採点した。
２種類の凝集アッセイを用いた。第１のアッセイにおいては、全量3mlの細胞（5-10 x 106個/ml）を25ml三角フラスコに入れ、40〜50rpmで回転振盪機上で24〜48時間室温にて回転させた。これらの実験のために、誘導が始まった後、細胞を１〜４時間混合して、凝集期間中ずっと誘導を続けた。第２のアッセイにおいては、室温で一晩誘導させた（12〜16時間）後、約0.6mlの細胞を0.6mlエッペンドルフ管（小さな泡が残っている）に入れ、１〜２時間４℃で穏やかに振動させた。抗体阻止およびCa2+依存性の実験は後者のアッセイを用いて行った。Ca2+依存性の実験のために、まず細胞を回収して、11% FCSを添加した平衡塩類溶液（BSS）（BSS-FCS; FCSは0.9% NaCl、5mM Tris［pH 7.5］で透析した。）中で、あるいは、10mM EGTAを含有するCa2+不含BSS-FCS（Snowら, 1989, Cell 59, 313-323）中ですすいだ後、同じ培地にもとの体積で再懸濁させた。抗体阻止の実験のために、ノッチでトランフェクトした細胞を回収し、M3培地中ですすいだ後、凝集の前に、M3培地中で１時間４℃で、ノッチの細胞外ドメイン由来のセグメントを含む融合タンパク質で免疫感作した４匹のマウスの各々由来の1：250希釈の免疫血清または免疫前血清で処理した（上記の抗体の作製を参照のこと）。
6.1.5. 免疫蛍光法
細胞を遠心分離で（3000rpmで20分間エッペンドルフ微量遠心機にて）回収し、0.6mlエッペンドルフ管にて0.5mlの新たに調製した2%パラホルムアルデヒドのPBS溶液で10分間室温で固定した。固定後、細胞を遠心分離で回収し、PBS中で２回すすぎ、そして、１時間PBS中の一次抗体にて0.1%サポニン（SIGMA）および1%正常ヤギ血清（Pocono Rabbit Farm. Canadensis, PA）で染色した。モノクローナル抗体上清を1:10に希釈し、この工程のためにマウスまたはラット血清を1：1000に希釈した。その後、細胞をPBS中で１回すすぎ、１時間PBS-サポニン-正常ヤギ血清中の特異的二次抗体（二重標識グレードのヤギ抗マウスおよびヤギ抗ラット, Jackson Immunoresearch）にて染色した。このインキュベーションの後、細胞をPBS中で２回すすぎ、90%グリセロール、10% 1M Tris（pH 8.0）および0.5%没食子酸n-プロピル中でスライド上に載せた。エピ蛍光（epifluorescence）下、Leitz Orthoplan 2顕微鏡上で、細胞を検視した。
Zeiss Axiovert複合顕微鏡に接続したBio-Rad MRC 500システムを用いて、共焦点顕微鏡写真を撮った。ALIGNプログラムを用いて配列させ、MERGEを用いて合わせた、BHSおよびGHSフィルターセットを用いて、画像を修正した。グリーンからレッドチャンネルへの蛍光ブリードスルーは、BLEEDプログラム（Bio-Radにより提供された全ソフトウェア）を用いて減少させた。写真は、Kodak Ektar 125フィルムを用いてコンピューターモニターから直接得た。
6.1.6. 細胞溶解産物、免疫沈降、およびウェスタンブロット
組織培養物および野生型Canton-S胚の非変性界面活性剤溶解産物を、氷上で、約10細胞体積の溶解緩衝液（300mM NaCl, 50mM Tris（pH 8.0）, 0.5% NP-40, 0.5% デオキシコール酸, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2）にて、プロテアーゼ阻害物質としての1：2500に希釈した、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）およびジイソプロピルフルオロホスフェートを用いて調製した。1ccツベルクリンシリンジにとりつけた18G、21Gおよび25G針を用いて、溶解産物を順次トリチュレートした後、フルスピードで微量遠心機（microfuge）にて10分間４℃で遠心分離し、不溶性物質を除去した。約１μgの抗体（１〜２μｌのポリクローナル抗血清）を250〜500μｌの細胞溶解産物に添加し、１時間４℃で攪拌しながらインキュベートすることにより、免疫沈降を行った。この混合物に、15μgのヤギ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch: これらの抗体は、マウスおよびラットIgGの両方を認識する。）を添加し、１時間４℃で攪拌しながらインキュベートした。これに続いて、100μlの固定したStaphylococcus aureus（Staph A）バクテリア（Zysorbin, Zymed:製造業者の使用説明書に従って再懸濁した）を添加した。これらは、前もって回収され、溶解緩衝液中で５回洗浄され、もう１時間インキュベートされていた。その後、Staph A−抗体複合体を遠心分離によりペレット化し、溶解緩衝液中で３回洗浄し、続いて２回15分間溶解緩衝液中で洗浄した。新たな管に移した後、沈殿した物質を50μlのSDS-PAGE試料緩衝液に懸濁させ、直ちに10分間煮沸し、3%-15%勾配ゲルにかけ、ニトロセルロースにブロットし、前記したように（Johansenら, 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440）、モノクローナル抗体およびHRP-複合（conjugated）ヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。ウェスタンブロットに使用した全細胞タンパク質試料については、細胞を遠心分離で回収し、1mM PMSFを含む10細胞体積の試料緩衝液に溶解させ、直ちに煮沸した。
6.2. 結果
6.2.1. 培養細胞におけるノッチおよびデルタの発現
ノッチおよびデルタ間の相互作用を検出するために、凝集アッセイを用いて、これらのタンパク質をその表面上に発現している細胞の挙動を調べた。これらの検討のために、S2細胞系（Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365）を選択した。S2細胞は、ノッチコード配列の5'末端の再配列のために、異常なノッチメッセージを発現し、検出可能なノッチを発現しない。これらの細胞は検出可能なデルタも発現しない。
ウェスタンブロットおよび免疫蛍光分析の結果は、ノッチおよびデルタ構築物が予想される大きさのタンパク質の発現および細胞下の局在化を支持することを明らかに示した。
6.2.2. ノッチおよびデルタ凝集物を発現する細胞
単純な凝集アッセイを用いて、S2細胞の表面に発現したノッチおよびデルタ間の相互作用を検出した。
対数期増殖のS2細胞を、ノッチまたはデルタメタロチオネインプロモーター構築物のいずれかで、別々にトランスフェクトした。CuSO4での誘導の後、トランスフェクトした細胞を同じ数で混合し、一晩室温で凝集させた（詳細については、実験方法、第6.1節を参照のこと）。あるいはまた、代謝活性を減少させることを意図したいくつかの実験において、細胞を４℃で１〜２時間穏やかに混合した。凝集物が生成したかどうかを決定するために、各遺伝子産物に特異的な抗体および標識の異なる蛍光二次抗体を用いる免疫蛍光鏡検法用に細胞を処理した。安定というより一過性の形質転換体を使用したので、発現細胞は、通常、全細胞集団の5%未満を構成した。残りの細胞は、ある種のタンパク質を発現しないか、免疫蛍光鏡検法により検出できない程低いレベルで発現していた。対照として、シングルタイプのトランスフェクトした細胞だけを用いて、凝集を行った。
その結果（Fehonら, 1990, Cell 61:523-534）は、ノッチ発現（ノッチ+）細胞は単独ではこのアッセイにおいて凝集物を形成しなかったが、デルタ発現（デルタ+）細胞は形成したことを示した。有糸分裂姉妹細胞間の接着からおそらく生じるであろう４〜８細胞の細胞塊が普通に生じる場合、デルタ+細胞が凝集する傾向は、非凝集対照試料においても見られた。しかしながら、塊は凝集条件下でのインキュベーション後にはよりよく生じ（例えば、インキュベーション前には19%のデルタ+細胞が凝集物にあるのに対し、インキュベーション後には37%のデルタ+細胞が凝集物にある）、このことは、デルタ+細胞がこのアッセイにおいて互いに安定な接触を形成できることを示している。
ノッチ+細胞単独での対照実験とは著しく対照的に、ノッチ+およびデルタ+細胞の混合物の凝集は、20個の細胞またはそれ以上までの塊を形成する結果となった。24時間の凝集の後に、４個以上の染色細胞の塊に見出される発現細胞の画分は、ノッチ+およびデルタ+細胞の混合物の32%〜54%の範囲に及んだ。この範囲は、デルタ+細胞単独（37%〜40%）に見られるものと類似であったが、ノッチ+細胞単独のもの（たった0%〜5%）とは非常に異なっていた。デルタ+細胞のみからなる数個の塊が見出されたが、デルタ+細胞も存在しない限り、ノッチ+細胞は４〜５個より多くの細胞の塊に見出されることはなかった。さらにまた、トランスフェクトした細胞は全細胞集団の小さな画分のみを構成していたが、これらの塊内の全ての細胞はノッチまたはデルタのいずれかを発現した。48時間で、凝集の程度はより高くなった（63%〜71%）ようであり、このことは、凝集が24時間後にこれらの条件下でまだ最大に達していなかったことを示唆している。また、ノッチおよびデルタ構築物で同時トランスフェクトした細胞（その結果、すべてのトランスフェクトした細胞は両方のタンパク質を発現する）は、同じ実験条件下で同様の様式で凝集した。
凝集に対する、ノッチのほぼ全細胞外ドメインに伸びる融合タンパク質に対するポリクローナル抗血清の混合物の効果を調べることにより、凝集プロセスにノッチが関与することを直接試験した（実験方法、第6.1節を参照のこと）。表面抗原のパッチングに対する代謝応答のために生じるかもしれない人工産物を最小にするために、これらの実験において、抗体処理および凝集アッセイを４℃で行った。ノッチ+細胞を免疫前または免疫マウス血清のいずれかとともに１時間インキュベートし、デルタ+細胞を添加し、凝集を１〜２時間行った。免疫前血清で前処理したノッチ+細胞はデルタ+細胞により凝集した（３回の実験のうち１回において、23%のノッチ+細胞がノッチ+−デルタ+細胞凝集物に存在した）が、免疫血清で処理したものは凝集しなかった（たった2%のノッチ+細胞が凝集物に存在した）。この結果は、ノッチの細胞外ドメインがノッチ+−デルタ+細胞凝集に必要であることを示唆した。
6.2.3. ノッチ−デルタ仲介凝集はカルシウム依存性である
発現細胞がCa2+イオンの存在または不存在下で凝集する能力を試験して、ノッチ−デルタ凝集にCa2+イオンが要求されるかどうかを決定した。Ca2+の除去に対する代謝応答のためにありうる非特異的効果を最小にするために、これらの実験を４℃で行った。その結果は、ノッチ−デルタ仲介凝集が外因性Ca2+に依存することを明らかに実証した。
6.2.4. ノッチおよびデルタは単一の細胞内で相互作用する
同時トランスフェクトした細胞におけるノッチおよびデルタの分布を調べることにより、ノッチおよびデルタが、両方のタンパク質を発現する１個の細胞の膜内で会合するかどうかの問題が提起された。観察された同時局在化がノッチおよびデルタ間の安定な相互作用と一致するのか、あるいは、かかる相互作用を提示するのかどうかを試験するために、生細胞を過剰のポリクローナル抗ノッチ抗血清で処理した。この処理により、免疫蛍光法により検出されるような、分離したパッチへの発現細胞の表面上でのノッチの“パッチング（patching）”が生じた。この処理の後、これらの細胞の表面上でノッチおよびデルタの分布には明瞭な相関関係があり、このことは、これらのタンパク質が膜内で会合することを示している。
6.2.5. デルタとの相互作用はノッチの細胞内ドメインを必要としない
EGF様リピートを含む大きな細胞外ドメインに加えて、ノッチは約940アミノ酸のかなり大きな細胞内（IC）ドメインを有する。このICドメインは、リン酸化部位（Kiddら, 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129）、推定上のヌクレオチド結合ドメイン、ポリグルタミンの広がり（Whartonら, 1985, Cell 43, 567-581; Kiddら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108）、および酵母cdc 10遺伝子に相同の配列（これは、酵母の細胞周期制御に関与している）（BreedenおよびNasmyth, 1987, Nature 329, 651-654）を含んでいる。上で特筆した構造上の特徴をすべて含んでいるが、ICドメインの約835アミノ酸をコードする配列を欠失させた（25の膜に近位のアミノ酸および新規な59のアミノ酸カルボキシル末端を残している；実験方法を参照のこと）変異型ノッチ構築物を使用した。
凝集アッセイにおいて、ECN1構築物を発現している細胞は、完全なノッチを発現している細胞について観察されたように、デルタ+細胞と凝集物を常時形成したが、自分自身とは凝集物を形成しなかった。ECN1の鋭いバンドがデルタ+細胞との接触部位内に観察され、さらに、このことは、ECN1が細胞間の接触部位内に局在化すること示している。膜内の相互作用について試験するために、ECN1およびデルタ構築物で同時トランスフェクトした細胞を用いて、表面抗原コパッチング実験を行った。完全なノッチで観察されたように、ノッチの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗血清を用いてECN1をパッチした時、ECN1およびデルタは細胞表面に同時局在化した（colocalize）。これらの結果は、膜内のノッチおよびデルタ間の観察された相互作用はノッチのICドメインの欠失部分を必要とせず、従って、おそらく細胞外ドメインにより仲介されることを実証している。
6.2.6. ノッチおよびデルタは界面活性剤可溶性の分子間複合体を形成する
先の結果は、同じ膜内に存在するノッチおよびデルタ間、ならびに異なる細胞上に発現したこれらのタンパク質間の分子相互作用を示した。そのような相互作用についてのさらなる試験は、これらのタンパク質が、ノッチおよびデルタを発現する細胞の非変性界面活性剤抽出物から共沈するかどうかである。もしノッチおよびデルタが、細胞間で、あるいは細胞内のいずれかで、安定な分子間複合体を形成するならば、これらのタンパク質のひとつに対する特異的な抗血清を用いて、細胞抽出物から両方のタンパク質を沈殿させることができるはずである。一晩凝集させた、ノッチおよびデルタ構築物で同時トランスフェクトした細胞、または０〜24時間の野生型胚のNP-40/デオキシコール酸溶解産物由来のポリクローナル抗血清（実験方法を参照のこと）でデルタを免疫沈降させることにより、この分析を行った。
ノッチの共沈は、同時トランスフェクトした細胞および胚由来のデルタ免疫沈降物において、検出された。しかし、共沈しているノッチは、デルタよりはるかに少ない量で存在するようであり、従って、検出するのが困難であった。デルタの免疫沈降によりノッチの共沈が生じた事実は、これらの２つのタンパク質が、トランスフェクトしたS2細胞において、また、胚細胞において、安定な分子間複合体を形成することの直接的な証拠となる。
6.3. 考察
通常非接着性のS2細胞を用いるin vitro凝集アッセイを用いたところ、ノッチおよびデルタを発現する細胞は互いに特異的に接着することが示された。
7.ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ−仲介凝集のために必要であり、かつ十分である。
デルタとの相互作用のために必要なノッチの細胞外ドメイン中の領域を同定するため、ノッチの欠失変異体とともに、第６節に記載したのと同一の凝集試験を行った。その結果は、ノッチのＥＧＦリピートが直接この相互作用に関与し、36のＥＧＦリピートの２個（ＥＬＲ11および12）のみが必要らしいことを示す。これら２つのＥＧＦリピートはデルタに結合するのに十分であり、ノッチ−デルタ仲介凝集のカルシウム依存性もまた、これら２つのリピートと関係する。最後に、ノッチのツメガエル相同物からの２つの対応するＥＧＦはまた、デルタとの凝集も仲介し、ノッチの構造が進化において保存されているのみならず、その機能をも有していることを意味する。これらの結果は、ノッチの細胞外ドメインは驚くほどにモジュール（modular）であり、かつ、デルタに加えて潜在的に種々のタンパク質を結合することができることを示す（Rebay et al.,1991,Cell 67:687-699参照）。
7.1 実験方法
7.1.1. 発現構築物
記載された構築物は全てが全長のノッチ発現構築物＃１pMtNMgの誘導体であり（第６節参照，上掲）、上記のようにして作製した（Rebay et al.,1991,Cell 67:687-699）。
7.1.2. 細胞培養およびトランスフェクション
ショウジョウバエＳ２細胞系を増殖させ、第６節（上掲）に記載されたようにトランスフェクトした。デルタを発現している、安定に形質転換されたＳ２細胞系L-49-6-7（L.Cherbasが樹立したもの）を、11％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Hyclone）、100U/mlペニシリン-100μg/mlストレプトマイシン-0.25μg/mlファンギゾン（Hazleton）、２×10-7Ｍメトトレキセート、0.1mMヒポキサンチン、および0.016mMチミジンを補ったＭ３培地（Hazleton社によって調製された）中で増殖させた。
7.1.3. 凝集試験および免疫蛍光
凝集試験およびCa++依存性実験は第６節（上掲）に記載の通りである。細胞を、抗ノッチモノクローナル抗体9C6.C17および抗デルタラットポリクローナル抗血清（詳細は第６節に記載，上掲）で染色した。ノッチの細胞外ドメインからの0.8kb（アミノ酸237-501;Wharton et al.,1985,Cell 43,567-581）BstYI断片に対するラットポリクローナル抗血清を用いて、非透過細胞中のノッチ構築物の表面発現を試験した。細胞は、蛍光発色下、Leitz Orthoplan 2顕微鏡で観察した。
7.2 結果
7.2.1. ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のために必要である。
ノッチ−デルタ相互作用に関与することが示された（第６節，上掲；Fehon et al.,1990,Cell 61: 523-534）ノッチタンパク質の細胞外ドメインの広範囲な欠失分析を実施し、これらの相互作用を仲介するノッチの正確なドメインを同定した。様々な欠失構築物でトランスフェクトされた細胞のデルタとの相互作用能を、第６節に記載された凝集試験を用いて試験した。簡単に述べると、ノッチ欠失構築物を一時的にショウジョウバエＳ２細胞にトランスフェクトし、CuSO4で誘導し、次いで、安定に形質転換されたデルタ発現細胞系L-49-6-7（Cherbas）から得られた少量の細胞を用いて室温で一晩凝集させた。典型的に約１％のノッチ発現細胞および約５％のデルタ発現細胞を含むものの、残りの細胞はどちらのタンパク質も発現していない集団が得られた。
試験した構築物の模式図および凝集試験の結果を図２に示す。凝集の程度を調べるため、細胞を各遺伝子産物に特異的な抗血清で染色し、免疫蛍光顕微鏡検査法で検査した。ノッチおよびデルタの両方を発現している細胞を含む４個以上の細胞クラスターを凝集物と定義し、そして、図２に示した値は、かかるクラスター中に見られる全てのノッチ発現細胞の百分率を表す。全ての数字は、少なくとも100個のノッチ発現細胞単位（単一の細胞又はクラスター）に評点をつけるという、少なくとも２つの別々のトランスフェクション実験からの平均の結果を表す。
初期の構築物（＃２ DSphおよび＃３ΔCla）は、ＥＧＦリピートの広範な部分を欠失したものである。ノッチ−デルタ凝集を促進することができないこれらの能力は、ノッチのＥＧＦリピートがデルタとの相互作用に関係があることを示唆した。フレーム内における一連の６か所のClaI制限部位を用いて、ＥＧＦリピートの７〜30間の領域をさらに切断した。リピート間の配列の相同性のために、５か所のClaI部位がＥＧＦリピート中の同一の相対的な場所、ちょうど第３番目のシステインの後に存在するのに対し、６番目の部位は、ＥＧＦリピート31の最初のシステインの直前に存在する（図３）。従って、部分的ClaI消化、次いで再連結を行うことによって、ノッチタンパク質のオープンリーディングフレームを保存するのみならず、さらに、少なくとも理論的には再連結によって作製されたキメラＥＧＦリピート中の３つのジスルフィド結合の構造的完全性を頻繁に維持し、空間を保存する欠失体が得られた（図２，構築物＃４〜14）。残念ながら、最も３’側のClaI部位は消化に抵抗性であったが、その隣の３’側のClaI部位はＥＧＦリピート30と31との間で壊れた。したがって、種々のClaI消化断片が完全なClaI消化物（構築物＃３ΔCla）の骨格内に再挿入されると、ＥＧＦリピートの全体にわたる構造は、明らかに３’連結部で中断された。
この一連の構築物についていくつかの点は特に言及する価値がある。第一に、ＥＧＦリピート９および17内で壊れるClaI制限断片を除去する（構築物＃８ΔＥＧＦ９−17）と、デルタとの凝集が失われ、一方、この断片を構築物＃３ΔCla（ＥＧＦリピート７−30を欠く）に再挿入する（構築物＃13ΔCla＋ＥＧＦ９−17）と、おおむね野生型レベルにまで凝集が回復し、ＥＧＦリピート９から17までがデルタに結合するために重要な配列を含むことを示唆する。第二に、このシリーズ（＃４−14）の全ての構築物は、ＥＧＦリピート９から17への結合部位マッピングと一致した。これらのリピートを含む発現構築物（＃6,7,9,10,13）はノッチ−デルタ相互作用を促進するが、これらのリピートを欠く構築物（＃4,5,8,11,12,14）は促進しない。デルタと凝集できない能力が、単に細胞表面に達することができない突然変異ノッチタンパク質によるのではなく、実際には必要な結合部位の欠失によるものであることを確認するため、ノッチの細胞外ドメインに対して特異的な抗体を用いて、トランスフェクトされた生細胞を免疫蛍光染色することにより、全ての構築物の細胞表面発現を試験した。ノッチ−デルタ相互作用を仲介することができない全ての構築物は、細胞表面で通常発現すると思われるタンパク質を生産した。第三に、凝集試験は定量的ではないが、ＥＧＦリピート９−17を含む２個の構築物、＃９ΔＥＧＦ17−26又は最も顕著には＃10ΔＥＧＦ26−30が外観上低レベルで凝集した。構築物＃９ΔＥＧＦ17−26及び10ΔＥＧＦ26−30でトランスフェクトした細胞は、標準よりも表面染色が極めて少ないことを示した。しかし、固定して透過性をもたせた細胞は同一の抗体と反応し、普通に染色された。これは、抗血清によって認識されるエピトープが単に欠失されていなかったことを示す。透過性をもたせた細胞、または生細胞の集団中のトランスフェクトされた細胞の百分率を比較することにより、構築物＃９ΔＥＧＦ17−26についてはトランスフェクトされた細胞の約５０％および構築物＃10ΔＥＧＦ26−30については10％が、細胞表面で検出可能なタンパク質を生産することがわかった。したがって、これら２つの構築物はタンパク質を生産するが、そのタンパク質は、恐らく折り畳みの間違いのためにあまり細胞表面に達することができず、このため、トランスフェクトされた細胞がデルタ発現細胞と凝集する能力を、消去されないまでも、減少させたと思われる。
ＥＧＦリピート９から17までに結合部位をマッピングしたので、別の実験では（Rebay et al.,1991,Cell 67: 687-699）、ノッチのＥＧＦリピート14が、組織培養試験によりモデル化したデルタとの相互作用に関与しないことを明らかにした。
ＥＧＦリピート９−17内のデルタ結合ドメインをさらにマッピング（位置決定）するため、特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ技術を用いて、この領域のいくつかのサブ断片を作製した。３つの重なった構築物である＃16、17および18が作製され、このうちただ一つの＃16ΔCla＋ＥＧＦ９−13が、Ｓ２細胞にトランスフェクトされたときにデルタ細胞との凝集を起こした。ＥＧＦリピート９を欠く構築物の＃19ΔCla＋ＥＧＦ（10−13）は、ノッチ−デルタ相互作用に必要な領域であるとしてＥＧＦリピート10−13をさらに規定した。
構築物＃20−24は、同じＰＣＲ戦略をさらに用いて、このドメインを破壊しようとする試みを提示するものであった（図３参照）。ＥＧＦリピート12が添加された唯一の完全なリピートである構築物＃20ΔCla＋ＥＧＦ（11−13）、および、ＥＧＦリピート11が添加された唯一の完全なリピートである＃21ΔCla＋ＥＧＦ（10−12）は、凝集を仲介することができなかった。これは、ＥＧＦリピート11又は12のいずれかが単独で存在しても、ノッチ−デルタ相互作用に十分でないことを示唆する。しかしながら、これら構築物の３’連結部がＥＧＦリピートの全体の構造を中断するため、極めて重要なリピートを正常に機能させるのに短い“バッファー”ゾーンが必要でありうる。従って、例えば構築物＃19ΔCla＋ＥＧＦ（10−13）において、ＥＧＦリピート12は直接デルタとの結合に関係しないのかもしれないが、その代わりに、ＥＧＦリピート11の構造を保護するために必要とされる最小量のバッファー配列に寄与し、それにより、デルタとの相互作用を可能にするのかもしれない。構築物＃22−24はこの問題を解決した。凝集を仲介しなかった構築物＃22ΔCla＋ＥＧＦ（10−11）、および仲介した＃23ΔCla＋ＥＧＦ（10−12）は、リピート11および12の両方が必要とされるが、リピート13からのフランキング配列は明らかに必要とされないことを再度示唆した。最後に、構築物＃24ΔCla＋ＥＧＦ（11−12）は、５’連結部で潜在的に構造的に破壊されるが、ＥＧＦリピート10からの配列が最重要でないことを納得いくように実証した。従って、24個の構築物からの完全に矛盾のないデータに基づくと、ノッチのＥＧＦリピート11および12は、一緒になって、トランスフェクトされたＳ２細胞においてデルタと結合するための必要な部位を包含する、この分析から得ることができる最も小さい機能単位を規定するものである。
7.2.2 ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のために十分である。
ＰＣＲ断片が挿入された大きなClaI欠失体（＃３ΔCla）は、もとの36のＥＧＦリピートの約１／３および３つのノッチ／lin-12リピートを保持する。これらは、明らかに凝集を促進するには十分でないが、特定のＥＧＦリピートがデルタと相互作用できる必要なフレームワークを形成するかもしれない。わずかのＥＧＦリピートのみが実際に凝集を促進するのに十分であるかどうかを試験するため、２つの構築物を設計した。リピート１の最初の２／３を除く全ての36のＥＧＦを欠失した＃25ΔＥＧＦ、並びにＥＧＦリピート１の最初の１／３を除くノッチの全細胞外部分及び膜貫通ドメインの直前の約35アミノ酸を欠失した＃30ΔＥＣＮである。構築物＃３ΔClaのバックグラウンドでノッチ−デルタ凝集を仲介した断片は、構築物＃25ΔＥＧＦ内に挿入されたときは、再びデルタとの相互作用を促進することができた（構築物＃26−30）。ノッチ／lin-12リピートも存在しない類似の構築物（＃31,32）は、ノッチ−デルタ凝集をうまく仲介した。従って、ＥＧＦリビート11及び12は、ノッチの細胞外ドメインの大半がなくても、Ｓ２細胞におけるノッチ−デルタ相互作用を仲介するのに十分である独立のモジュール単位として機能するようである。
7.2.3. ノッチのＥＧＦリピート11および12は、ノッチ−デルタ仲介凝集のカルシウム依存性を維持する
いくつかの欠失構築物を発現する細胞がデルタ発現細胞と凝集する能力を、Ca++イオンの存在下又は非存在下で調べた。相互作用のカルシウム依存性は、最も小さい構築物においてさえも保存され、ＥＧＦリピート11および12を含む最小の構築物が全長ノッチの様式と同様の様式でデルタに結合するという考えと一致した。
7.2.4. ノッチのＥＧＦリピート11および12のデルタ結合機能は、ノッチのツメガエル相同物において保存されている
ツメガエルノッチ配列（Coffman et al.,1990, Science 249,1438-1441）に基づくＰＣＲプライマーを用いて、リピート10および13の半分によってそれぞれの側が隣接されたＥＧＦリピート11および12を含むツメガエルステージ17のｃＤＮＡライブラリーから、約350bpフラグメントを得た。この断片を構築物＃３ΔClaにクローニングし、３つの独立のクローンを、細胞培養凝集試験においてデルタとの相互作用能について試験した。クローンの２つ、＃33ａおよびｂΔＣla＋ＸＥＧＦ（10−13）は、Ｓ２細胞にトランスフェクトされたときは、類似のショウジョウバエノッチ構築物である＃19ΔＣla＋ＥＧＦ（10−13）とほぼ等しいレベルで、そしてさらにカルシウム依存性の様式でノッチ−デルタ相互作用を仲介することができた（表III）。しかしながら、３番目のクローン＃33ｃΔＣla＋ＸＥＧＦ（10−13）は、非透過性の生細胞を染色することにより判定して、細胞表面で普通にタンパク質を発現したが、ノッチ−デルタ相互作用を仲介することができなかった。構築物＃33ａおよび33ｃにおけるツメガエルＰＣＲ産物の配列比較により、構築物＃33ｃのＥＧＦリピート11中のロイシンからプロリンへの変化をもたらすミスセンス突然変異（アミノ酸＃453, Coffman, et al.,1990, Science 249, 1438-1441）が明らかになった。この残基はショウジョウバエおよびツメガエルノッチ間で保存されていないが（図８）、プロリン残基の導入は容易にＥＧＦリピートの構造を破壊し、このためデルタとの相互作用を妨げるのかもしれない。
ショウジョウバエおよびツメガエルノッチのＥＧＦリピート11および12のアミノ酸配列の比較により、カルシウム結合コンセンサス配列（図４，配列番号１および２）を含むアミノ酸の高度の同一性が明らかになった。しかしながら、相同性のレベルは、他のほとんどのＥＧＦリピート間で共有されるものと著しく異なっていない（アミノ酸レベルで、全体が約５０％の同一性を示す）。ショウジョウバエおよびツメガエルノッチの個々のＥＧＦリピートの１対１の対応は、ＥＬＲ11および12の機能的保存とともに、ノッチの36のＥＧＦリピートが保存された機能的単位のタンデム（tandem）領域から成ることを示唆する。
7.3. 考察
ノッチの細胞外ドメインの広範囲な欠失分析を用いて、ＥＧＦ相同リピート11および12を含むノッチの領域がノッチ−デルタ仲介凝集のために必要かつ十分であり、そして、このデルタ結合能は、ツメガエルノッチの同じ２つのＥＧＦリピートにおいて保存されていることが分かった。凝集がノッチのＥＧＦリピート11および12にマッピングされるという発見は、ノッチのＥＧＦリピートも特定のタンパク質結合ドメインとして機能することを示す。ＥＧＦリピート11および12のみ（＃32ΔＥＣＮ＋ＥＧＦ（11−12））で、ノッチ−デルタ相互作用のCa++依存性を維持するために十分であった。
様々な欠失構築物は、ＥＬＲ11およびＥＬＲ12がモジュール単位として機能して、それらが置かれた直接的状況とは無関係であることを示唆する。従って、残りの34のリピートも、３つのノッチ／lin-12も、ＥＧＦリピート11および12が、機能するために必要とされる構造的骨格を確立するのに必要ではなさそうである。おもしろいことに、ほとんど逆の効果が観察された。すなわち、凝集試験は相互作用の強さを測定するものではないが、結合部位が次第に小さい断片に制限されるにつれて、トランスフェクトされた細胞がデルタ発現細胞と凝集する能力の増加が観察された。これは、通常のフランキングＥＧＦ配列が、実際にタンパク質との間の会合を妨げることを示唆する。残りの34のＥＧＦリピートはまた、発生のいろいろな時期にノッチと相互作用する他のタンパク質のためのモジュール結合ドメインを形成するのかもしれない。
ノッチのＥＧＦリピート11および12が別々のデルタ結合単位を形成するという知見は、各ＥＧＦリピート又はリピートの小さいサブセットが、発生の間、恐らく他のタンパク質との直接の相互作用を通して、特有の役割を果たすのかもしれないという考えを支持する最初の具体的な証拠を提示するものである。デルタおよびセレート（Serrate）の接着性ドメイン間で見られる相同性（図５）は、セレートの相同な部分が他のトポリズミック（toporythmic）タンパク質への結合を仲介するという点で“接着性”であることを示唆する（下記の第８節参照）。さらに、フィブリノーゲンに対する類似性を有する分泌タンパク質をコードする遺伝子スカブラス（scabrous）は、ノッチと相互作用するかも知れない。
ＥＧＦリピートに加えて、他の構造的モチーフの多重コピーが共通して種々のタンパク質に存在する。一つの適当な例は、ｃｄｃ10／アンキリン（ankyrin）モチーフであり、その６コピーがノッチの細胞内ドメインに存在している。アンキリンは、22のこれらリピートを含む。恐らく、構造的モチーフの反復配列は、一般に、一連のモジュールタンパク質結合単位の線状アセンブリーを表すのかも知れない。これらの結果をノッチの既知の構造、遺伝的および発生的複雑性と合わせると、ノッチは、発生を通して正確に調節された時間的および空間的なパターンにおいて、多くの異なるリガンドと相互作用するのかも知れない。かかる状況であれば、細胞外タンパク質との特異的相互作用は、ＥＧＦおよびノッチ／lin-12リピートによって仲介され、一方、細胞骨格および細胞質タンパク質との相互作用は、細胞内ｃｄｃ10／アンキリンモチーフによって仲介されるであろう。
8. ノッチ−セレート相互作用を仲介する配列
ここに記載するように、デルタとの相互作用を仲介するノッチの２つのＥＧＦリピート、すなわち、ＥＧＦリピート11および12は、セレート結合ドメインをも構成する（Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699参照）。
ノッチおよびセレートが直接相互作用するかどうか試験するため、Ｓ２細胞をセレート発現構築物でトランスフェクトし、凝集試験においてノッチ発現細胞と混合した。セレート発現構築物のために、442位（全ての配列番号は、Fleming et al.,1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201に従う）のイニシエーターＡＵＧのすぐ５’側に人工的BamHI部位を含み、かつ464位まで相同である合成プライマーを、681-698の位置からの第２のプライマーとともに用いて、約260塩基対のＤＮＡ断片を作製した。この断片をBamHIおよびKpnIで切断し（571位）、Bluescript KS+(Stratagene)に連結した。この構築物であるBTSer5'PCRを配列決定により確認し、次いでKpnIで切断した。セレートKpnI断片（571-2981）を挿入し、適正な方向を選択してBTSer5'PCR-Kpnを作製した。BTSer5'PCR-Kpnの５’SacII断片（Bluescriptポリリンカーおよびセレート（1199）中のSacII部位）を単離し、ｃＤＮＡ Ｃ１の５’SacII断片を置き換えるために用いた（Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201）。次いで、５’非翻訳領域を除いた全長セレートｃＤＮＡを再形成させた。この挿入物は、SalI及び部分的BamHI消化により単離され、pRmHa-3のBamHIおよびSalI部位に挿入して、最終発現構築物であるSer-mtnを作製した。
セレート発現細胞は、カルシウム依存性様式でノッチ発現細胞に接着した（図２及びRebay et al.,1991,上掲）。しかしながら、試験した実験条件のもとではデルタとは違って、セレートはホモタイプ的に相互作用するようには思われなかった。さらに、セレートとデルタとの間に相互作用は検出されなかった。
ノッチ欠失構築物のサブセットを試験したところ、デルタへの結合に加えてＥＧＦリピート11および12はまた、セレートとの相互作用を仲介することが分かった（図２；構築物＃1,7-10,13,16,17,19,28および32）。さらに、これらのリピートのセレート結合機能もまた、ツメガエルノッチの対応する２つのＥＧＦ（＃33）ΔＣla＋ＸＥＧＦ（10−13））において保存されていたようである。これらの結果は、ノッチがデルタおよびセレートの両者と相互作用し、ノッチの同じ２つのＥＧＦリピートが両方の相互作用を仲介することを明確に示す。ノッチ／セレート凝集に不可欠なセレート領域も規定された。ヌクレオチド676-1287（すなわち、アミノ酸79-282）（図５；配列番号３および４参照）の欠失は、ノッチと凝集するセレートタンパク質の能力を消去する。
ノッチとセレートの凝集は、ノッチとデルタよりも効率的ではないようである。おそらく、ノッチ−セレート相互作用が弱いためであろう。この減少した量の凝集についての一つのありふれた説明は次のようなものだろう。セレート構築物は単にデルタ構築物ほど細胞表面で多くのタンパク質量を発現せず、それにより、相互作用の強さが低下したのだろう。あるいは、相互作用の強さの違いは、in vivoで顕著であるかもしれないノッチ−デルタおよびノッチ−セレート相互作用間の基本的な機能的差異を示すのかも知れない。
9. ヒトノッチのクローニング、配列決定及び発現
9.1 ヒトノッチの単離及び配列決定
ヒトノッチ配列についてのクローンは、最初にLambda Zap IIベクター（Stratagene）中の17〜18週ヒト胎児脳cDNAライブラリーからのDNAを増幅するポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）を使用して得た。
この方法により得た400bp断片を次にプローブとして使用し、これにより同じライブラリーをヒトノッチクローンについてスクリーニングした。最初のスクリーニングにより３種のユニークなクローン、hN3k、hN2k及びhN5kを得たが、その後の配列分析によりこれらは全てヒトノッチの3'末端にあるものであることが判明した（図６）。hN3kの5'末端をプローブとして使用する２番目のスクリーニングを行い、ヒトノッチの5'末端を包含するクローンを探した。１つのユニークなクローン、hN4kがこのスクリーニングから得られ、予備的な配列決定データによりそれが前記遺伝子の5'末端の殆どを含んでいることが判明した（図６）。クローンhN4k、hN3k及びhN5kはこれら全部で、EGF-リピートの初期から始まり前記遺伝子の3'非翻訳領域に伸びるヒトノッチ相同体の約10kbを包含するものである。３種のクローンの全てはpBluescript SK-（Stratagene）のEcoRI部位中のcDNA挿入物である。宿主E.Coli株はXL1-Blueである（Maniatis,T.,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. A12参照）。ヒトノッチ配列をショウジョウバエノッチと並べたものを図７に示す。
前記cDNAクローンに含まれるノッチの種々の部分の配列を決定したが（Sequenase▲Ｒ▼,U.S. Biochemical Corp.を使用することにより）、hN2k及びhN4kについて図８（配列番号５〜７）及び図９（配列番号８、９）にそれぞれ示す。さらにhN5kの配列分析を行った結果、hN5kに含まれるものとオーバーラップするヒトノッチ配列をコードすることが判った。
hN3k及びhN5kに含まれるヒトノッチcDNAの全ヌクレオチド配列を、Sequenase▲Ｒ▼キット（U.S.Biochemical Corp.）を使用してジデオキシチェーンターミネーション法により決定した。これらのヒトノッチをコードするヌクレオチド配列は、適当なリーディングフレーム内で容易に同定することができ、これはそこにイントロンがなく、３つの可能性のあるリーディングフレームのうち１つのみにおける翻訳が、刊行物に記載されたショウジョウバエノッチの推定アミノ酸配列との比較においてショウジョウバエノッチ配列に対して実質的な相同度を有する配列を生成する配列を生成するからである。hN3k及びhN5kにおけるヒトノッチcDNAのDNA及び推定タンパク質配列は、図10（配列番号10、11）及び図11（配列番号12、13）にそれぞれ示した。クローンhN3kは、３番目のノッチ／lin-12リピート付近から始まり、カルボキシ末端アミノ酸に数アミノ酸届かない位置まで伸びるノッチポリペプチドの部分をコードする。クローンhN5kは、cdc10領域の前付近から始まりポリペプチドの末端までのノッチポリペプチドの部分をコードし、3'非翻訳領域も含む。
図10に示したDNA及びタンパク質配列（配列番号10、11）を図11のもの（配列番号12、13）と比較すると、配列間の有意な相違が明らかであり、これはhN3k及びhN5kが２つの別のノッチ-相同遺伝子の部分を表すことを示している。従って、データはヒトゲノムが１より多いノッチ-相同遺伝子を含んでいることを示している。これはノッチが単一コピー遺伝子であるように見えるショウジョウバエとは異なるものである。
hN3k及びhN5kに含まれるヒトノッチ相同体のDNA及びアミノ酸配列と、対応するショウジョウバエノッチ配列（Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581に記載されたもの）及び対応するアフリカツメガエルノッチ配列（Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441に記載されたもの、あるいはGenbank▲Ｒ▼から入手可能なもの（受託番号M33874））との比較においても相違が示された。
図10（hN3k）に示したアミノ酸配列を、Ellisen et al.,1991年8月,Cell 66:649-661の図２に示されたTAN-1ポリペプチドの予想配列と比較した。推定アミノ酸配列間にいくらかの相違が見られたが、全体としてhN3kノッチポリペプチド配列は対応するTAN-1領域（TAN-1アミノ酸1455〜2506）と99%同一であった。４つの相違が挙げられる：３番目のノッチ／lin-12リピート及び最初のcdc10モチーフの間の領域において、Ｘ（TAN-1，アミノ酸1763）の代わりにアルギニンが存在する（hN3k）；（２）Ｘ（TAN-1アミノ酸1787）の代わりにプロリンが存在する（hN3k）；（３）グルタミン酸残基（TAN-1アミノ酸2495）の代わりにアスパラギン酸の保存的変化が存在する（hN3k）；及び（４）TAN-1アミノ酸2507及び2535の間でカルボキシ末端領域が実質的に異なる。
図11に示したアミノ酸配列（hN5k）を、Ellisen et al., 1991年8月, Cell 66:649-661の図２に示されたTAN-1ポリペプチドの予想配列と比較した。推定アミノ酸配列間に相違が見られた。hN5kの推定ノッチポリペプチドは、cc10モチーフ（TAN-1アミノ酸1860〜2217）及びよく保存されたフランキング領域の両方を包含するcdc10領域中のTAN-1ポリペプチド（ショウジョウバエノッチに64%同一）に79%同一である（図12）。cdc10領域はTAN-1配列のアミノ酸1860〜2217をカバーする。さらに、hN5kがコードするポリペプチドは、PEST（プロリン、グルタミン酸、セリン、スレオニン）リッチ領域（TAN-1アミノ酸2482〜2551）を含む分子のカルボキシ末端において、TAN-1ポリペプチド（ショウジョウバエノッチに44%同一）に65%同一である（図12B）。前記領域の間にある215アミノ酸鎖は、hN3k、hN5k及びTAN-1により示されるノッチ相同クローンのいずれの間においてもよく保存されていない。hN5kポリペプチド及びショウジョウバエノッチはいずれも、この領域中の他のタンパク質に対するアミノ酸同一性の有意なレベルを示さない（例えば、hN5k/TAN-1=24%同一性；hN5k／ショウジョウバエノッチ=11%同一性；TAN-1/ショウジョウバエノッチ=17%同一性）。これに対し、アフリカツメガエルノッチ（Xotch）（配列番号16）、ラットノッチ（配列番号17）、及びTAN-1（配列番号18）は互いに配列同一性の有意なレベルを共有し続けている（例えば、TAN-1/ラットノッチ=75%同一性、TAN-1/アフリカツメガエルノッチ=45%同一性、ラットノッチ/アフリカツメガエルノッチ=50%同一性）。
図12Bに示した脊椎動物ノッチ相同体の細胞内領域の配列の調査により、予測されなかった知見が示された。即ち、hN5kを含むこれらのタンパク質の全てが、６個のcdc10リピートの最後に続く保存領域において、核標的化機能に関連する推定CcNモチーフを含む（図12B）。ショウジョウバエノッチはそのような明確なモチーフを欠くものの、その配列をより詳細に観察することにより、可能性のある２つに分かれた核局在性配列（Robbins et al., 1991,Cell 64:615-623）、並びに可能性のあるCK II及びcdc2リン酸化部位の存在が明らかにされ、これらは全て互いに近接しており、従って別のタイプのCcNモチーフを規定している可能性がある（図12B）．
hN（一部hN5kに含まれているヒトノッチ相同体）の5'末端をカバーするクローンを単離するために、クローンhN2kをプローブとして使用して、Stratageneから市販されているヒト胎児脳ファージライブラリーの260,000プラークを交差ハイブリダイズするクローンについてスクリーニングした。標準的な方法（Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York）を用いて、４つのクローンを同定し、そして単離した。４つのクローンは、ＡＴＣＣから得たAdams et al., 1992,Nature 355:632-655のノッチ-相同配列に対するハイブリダイゼーションによっても単離された。
TAN-1の5'末端をカバーするクローンを単離するため、Stratageneから市販されているヒト胎児脳ライブラリーを、配列を5'末端に延長するクローンについてスクリーニングした。880,000プラークをスクリーニングし、hN3k配列と交差ハイブリダイズする４つのクローンを同定した。配列決定によりこれらの配列のTAN-1によりコードされたノッチタンパク質内での相対的位置を確認した。
我々が単離したTAN-1相同体の5'配列をヌクレオチド番号972（ヌクレオチド番号１はATG開始コドンのAである）まで決定し、Ellisen et al(1991, Cell 66:649-661)により記載された配列と比較した。ヌクレオチド559において、我々のTAN-1相同体はＧを有しており、一方Ellisen et al.はＡと記載しており、この変化の結果異なるアミノ酸がコードされている。即ち、最初の324アミノ酸内で、我々のTAN-1コード化タンパク質はEllisen et al.により教示されたものとは異なっており、我々のタンパク質は187位置にGlyを有するのに対し、Ellisen et al.はその位置においてArgと記載している（図13に示した通り）。
hN（配列番号19）及びTAN-1-コード化（配列番号20）タンパク質の両方、並びにアフリカツメガエル及びショウジョウバエノッチタンパク質の完全長アミノ酸配列を図13に示す。hNの完全長DNAコード配列（イニシエーターMetをコードするものを除く）（配列番号21中に含まれる）及びコードされたアミノ酸配列（但しイニシエーターMetは示していない）（配列番号19中に含まれる）を図17に示す。
9.2 ヒトノッチの発現
上記9.1の項に記載したヒトノッチcDNAクローンを使用して発現構築物を作製した。hN3k及びhN2kの場合、クローン全体をそのベクターからEcoRI制限断片として切り出し、３つのpGEXベクター（グルタチオンS-トランスフェラーゼ発現ベクター；Smith and Johnson, 1988, Gene 7, 31-40）のそれぞれのEcoRI制限部位にサブクローン化した。これにより、正確なリーディングフレーム中のサブクローンからのノッチタンパク質生成物の発現の可能性が与えられる。hN5kの場合は、クローンは２つの内部EcoRI制限部位を含んでおり、2.6、1.5及び0.6kb断片を生成する。前記2.6及び1.5kb断片の両方もpGEXベクターのそれぞれにサブクローン化した。
前記pGEXベクター系を使用して、以下に記載する構築物からのヒトノッチ融合（キメラ）タンパク質の発現を得た。クローン化されたノッチDNAをそれぞれの場合について同期させて適当なpGEXベクター中に挿入した。それぞれの構築物をエレクトロポレーションにより細菌（E.Coli）中に導入し、グルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシ末端に融合したノッチタンパク質配列を含む融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質の発現は、細菌タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、挿入されたノッチDNAを有するpGEXプラスミド及び有さないpGEXプラスミドを含む細菌からのタンパク質抽出物を比較することによって確認した。融合タンパク質は水性溶液中に可溶であり、グルタチオン被覆アガロースを使用したアフィニティークロマトグラフィー（グルタチオンS-トランスフェラーゼのカルボキシ末端はグルタチオンに結合するため）により細菌溶解物から精製した。発現した融合タンパク質は、ウェスタンブロットによりアッセイしたところ、ショウジョウバエノッチに対する抗体に結合した。
ヒトノッチ-グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質を生成するのに使用した構築物は以下の通りである。
hNFP#2-PCRを使用して、cdc10リピートの直前のhN5k挿入物のヌクレオチド192に始まって、PESTリッチ領域のヌクレオチド1694の直前に至る断片を得た。次にこのDNAをBamHI及びSmaIにより消化し、得られた断片をpGEX-3中に結合した。発現の後、融合タンパク質をグルタチオンアガロースに結合することにより精製した。精製したポリペプチドについて4-15%勾配のポリアクリルアミドゲル上で分子量を測定した。得られた融合タンパク質は83kDの概算分子量を有していた。
hN3FP#1-EcoRIで消化することにより、全hN3k DNA挿入物（ヌクレオチド１〜3235）をBluescript（SK）ベクターから切り出した。該DNAをpGEX-3中に結合した。
hN3FP#2-XmaIで消化することにより、hN3k DNAの3'セグメント（ヌクレオチド1847〜3235）とポリリンカーのいくつかをBluescript（SK）ベクターから切り出した。該断片をpGEX-1中に結合した。
精製の後、これらの融合タンパク質を使用してヒトノッチに対するポリクローナル及び／またはモノクローナル抗体を作製した。
10. 正常及び悪性細胞におけるノッチ発現
正常及び広範な種類の悪性細胞を示す、種々のヒト患者組織サンプル及び細胞系をアッセイしてノッチの発現を検出及び／または定量した。患者組織サンプルは、エール大学医学部病理学教室から得た。
以下のアッセイを、患者組織サンプルにおけるノッチ発現を測定するのに使用した；（ａ）ノーザンハイブリダイゼーション、（ｂ）ウェスタンブロット、（ｃ）in situハイブリダイゼーション及び（ｄ）免疫細胞化学測定。アッセイは標準的な技術を使用して行った。ノーザンハイブリダイゼーション及びin situハイブリダイゼーションは、（i）クローンhN3kのノッチ配列に特異的なDNAプローブを使用し、また（ii）クローンhN5kのノッチ配列に特異的なDNAプローブを使用して行った。ウェスタンブロット及び免疫細胞化学測定は、ショウジョウバエノッチタンパク質に対する抗体（これはヒトノッチタンパク質も認識する）を使用して行った。
ノーザンハイブリダイゼーション及びウェスタンブロットは、上記したように、種々の正常又は癌組織を示す多くのヒト細胞系を分析するのにも使用した。試験した細胞系を表２に挙げる。
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
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上記のようにノッチを特異的に発現することが示された悪性細胞組織タイプの悪性度は5.1の項以下に記載したように処置できる。
10.1 ヒトノッチタンパク質の発現は種々の悪性度において増加される
以下に記載するように、我々はヒトノッチタンパク質発現は少なくとも３種のヒト癌、即ち、子宮頸癌、乳癌及び結腸癌において増加することを見出した。ヒト患者の子宮頸癌、乳癌及び結腸癌からの組織サンプルの免疫細胞化学染色により、悪性組織が、相対的に非悪性組織切片に対して増加したレベルで、高いレベルのノッチを発現することが明らかに示された。この高いノッチ発現を示す種々の新生形成の広いスペクトルは、多くのより癌性の強い条件がノッチを高める方向に調整するのが観察されるであろうことを示している。
ヒト腫瘍サンプルのスライド（乳癌、結腸癌及び子宮頸癌についてのもの）は、エール大学医学部病理学教室の組織バンクから得た。染色は、hN及びTAN-1の配列からそれぞれ生成したP1及びP4融合タンパク質に対して作製されたモノクローナル抗体を使用して行った。
P1及びP4融合タンパク質は、所望のヒトノッチ配列を適当なpGEX発現ベクター（Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40; AMRAD Corp.,Melbourne,Australia）に挿入することにより得、製造者（AMRAD Corp.）の説明書に従ってアフィニティー精製した。P1融合タンパク質の製造については、pGEX-2をBamHIにより切断し、hNの518bp BamHI-BgIII断片の３つのコピーからなるコンカテマー（concatamer）に連結した。ラットを発現されたタンパク質で免疫し、標準的な方法によりモノクローナル抗体を製造した。P4融合タンパク質の製造については、pGEX-2をBamHIにより切断し、TAN-1の473bp BamHI-BgIII断片の３つのコピーからなるコンカテマーに連結した。ラットを発現されたタンパク質で免疫し、標準的な方法によりモノクローナル抗体を製造した。
試験した全ての腫瘍において、ヒトノッチ相同体TAN-1及びhNによりコードされるノッチタンパク質は両方とも、正常な部分と比較して、組織の悪性部分において増加したレベルで存在した。代表的な染色を添付した写真に示す（図14-16）。
染色の手順は以下の通りである。組織はパラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に埋め込み、５マイクロメーターの厚さの切片に切断し、ガラススライド上に置いた。そして以下の段階を行った。
1. 各４分間、キシレンを４回交換することによる脱パラフィン。
2. 各４分間、無水エタノールを３回交換することによるキシレンの除去。
3. スライドを95%、90%、80%、60%及び30%エタノールに各４分間浸漬することによる組織の漸次の再水和。最後にスライドを蒸留水中で５分間リンスした。
4. メタノール中の0.3%過酸化水素中で30分間インキュベートすることによる内因的ペルオキシダーゼのクエンチング。
5. PBS（10mMリン酸ナトリウム，pH 7.5, 0.9% NaCl）中での20分間の洗浄。
6. ブロッキング溶液（ブロッキング溶液：4%正常ウサギ血清及び0.1 Triton X-100を含むPBS）中での１時間のインキュベーション。
7. ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体との４℃での一晩のインキュベーション。一次抗体の最終濃度は20〜50μg/ml。
8. PBS+0.1% Triton X-100での20分間の洗浄（３回交換）。
9. ビオチニル化ウサギ抗ラット抗体：10mlのブロッキング溶液中の50μlのビオチニル化抗体（VECTOR）との30分間のインキュベーション。
10. PBS+0.1% Triton X-100での20分間の洗浄（３回交換）。
11. ABC試薬（VECTOR）との30分間のインキュベーション（試薬はPBS+0.1% Triton X-100中で作製）。
12. PBS+0.1% Triton X-100での20分間の洗浄。続いてのPBS+0.5% Triton X-100中での２分間のインキュベーション。
13. ペルオキシダーゼ基質溶液中での2-5分間のインキュベーション。ペルオキシダーゼ基質溶液：等容量の、蒸留水中の0.02%過酸化水素及び0.1Mトリスバッファー，pH 7.5中の0.1%ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB）を組織とのインキュベーションの直前に混合する。Triton X-100を0.5%の濃度の最終溶液まで添加する。
14. 水道水中での15分間の洗浄。
15. マイヤーのヘマトキシリンによる10分間のカウンター染色。
16. 水道水中での15分間の洗浄。
17. 30%、60%、80%、90%、95%及び無水エタノール中での交換（各４分間）による脱水。
18. キシレンへの浸漬（２回交換、各４分間）。
19. マウンティング、光学顕微鏡。
11. 微生物の寄託
それぞれヒトノッチの部分をコードするプラスミドを有する下記の組換え細菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条文に基づき、1991年５月２日にAmerican Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852に寄託された。
Figure 0003851653
本発明は、その範囲において寄託された微生物あるいは本明細書中に記載した特定の態様に限定されるものではない。実際に、本明細書中に記載したものに加えて、本発明の種々の改変が上記の記載及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような改変は添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図されるものである。
本明細書中においては種々の刊行物が引用されるが、これらの開示はその全体として引用により本明細書に含まれるものとする。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：2892
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：142..2640
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：２
配列の長さ：833
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：３
配列の長さ：1320
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：442..1320
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：４
配列の長さ：293
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
Figure 0003851653
配列番号：５
配列の長さ：267
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
Figure 0003851653
配列番号：６
配列の長さ：574
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
Figure 0003851653
配列番号：７
配列の長さ：295
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
Figure 0003851653
配列番号：８
配列の長さ：248
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
Figure 0003851653
配列番号：９
配列の長さ：323
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
Figure 0003851653
配列番号：１０
配列の長さ：3234
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：1..3234
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：11
配列の長さ：1078
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：12
配列の長さ：4268
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：2..1972
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：13
配列の長さ：657
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：14
配列の長さ：77
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
配列番号：15
配列の長さ：78
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
配列番号：16
配列の長さ：654
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：17
配列の長さ：666
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：18
配列の長さ：681
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：19
配列の長さ：2471
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
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Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：20
配列の長さ：2556
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ペプチド
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
配列番号：21
配列の長さ：9723
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：10..7419
配列
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
Figure 0003851653
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Figure 0003851653
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Figure 0003851653
Figure 0003851653

Claims (2)

  1. 患者から得られた試料のノッチタンパク質の発現または活性レベルを測定することからなる、患者におけるノッチタンパク質の発現または活性の異常なレベルによって特徴づけられる子宮頸癌、乳癌または結腸癌の存在を検出する方法であって、患者の試料中のノッチタンパク質の発現または活性レベルが、正常なレベルと比べて、増加していることがその患者の子宮頸癌、乳癌または結腸癌の存在を示すこととなる、上記方法。
  2. 悪性細胞を含むかまたはその疑いがある患者由来の試料中のノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッチ誘導体のノッチ活性レベルまたは発現レベルを測定することからなる、ノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッチ誘導体の増大したノッチ活性または増大した発現によって特徴づけられる子宮頸癌、乳癌または結腸癌の存在を検出する方法であって、患者の試料中のノッチタンパク質または抗ノッチ抗体によって結合され得るノッチ誘導体のノッチ活性または発現が、非悪性細胞の同様の試料中において見られる該レベルと比べて、増加していることがその患者の子宮頸癌、乳癌または結腸癌の存在を示すこととなる、上記方法。
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