ES2174855T5

ES2174855T5 - Metodos diagnosticos y composiciones farmaceuticas que se basan en proteinas notch y acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2174855T5
Application number: ES93923752T
Authority: ES
Inventors: Spyridon Artavanis-Tsakonas; Richard Grant Fehon; Panayiotis Zagouras; Christine Marie Blaumueller
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2013-09-30
Also published as: EP2145897A2; EP1175909A2; AU685067B2; DE69331832T3; EP0662827B2; ES2324641T3; AU5350394A; DK0662827T4; PT662827E; WO1994007474A1; EP0662827A4; EP1175909B1; EP1197220A2; EP0662827A1; EP1175909A8; EP0662827B1; EP1197220A3; EP2145897A3; ATE216225T1; EP1175909A3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES Y METODOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO BASADAS EN PROTEINAS DE INCISION Y ACIDOS NUCLEICOS. LA FIGURA 17 MUESTRA LAS SECUENCIAS DE UN DNA HUMANO DE INCISION Y LA PROTEINA HUMANA DE INCISION CODIFICADA. LA INVENCION PROPORCIONA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE DESARROLLO O DIFERENCIACION CELULAR A TRAVES DE LA ADMINISTRACION DE UN COMPUESTO TERAPEUTICO DE LA INVENCION. TALES COMPUESTOS TERAPEUTICOS (DENOMINADOS AQUI "TERAPEUTICOS") INCLUYEN PROTEINAS DE INCISION Y ANALOGOS Y DERIVADOS (INCLUYENDO FRAGMENTOS) DE LOS MISMOS, ANTICUERPOS DE LOS MISMOS, ACIDOS NUCLEICOS CODIFICANDO LAS PROTEINAS DE INCISION, ANALOGOS, O DERIVADOS, ACIDOS NUCLEICOS ANTISENSIBLES DE INCISION, TAN BIEN COMO PROTEINAS TOPORITMICAS Y DERIVADOS QUE ENLAZAN O DE OTRA MANERA INTERACCIONAN CON PROTEINAS DE INCISION, SUS ACIDOS NUCLEICOS O ANTICUERPOS CODIFICADOS. EN UNA PUESTA EN PRACTICA PREFERENTE, SE ADMINISTRA UN TERAPEUTICO DE LA INVENCION PARA TRATAR UNA CONDICION CANCEROSA, O PARA PREVENIR LA PROGRESION DESDE UN ESTADO PRE-NEOPLASTICO O NO MALIGNO DENTRO DE UN ESTADO NEOPLASTICO O MALIGNO.

Description

Métodos diagnósticos y composiciones farmacéuticas que se basan en proteínas Notch y ácidos nucleicos.

1. Introducción

La presente invención se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden proteínas Notch, análogos y derivados de las mismas, anticuerpos frente a ellos, ácidos nucleicos que codifican las proteínas Notch, derivados o análogos, ácidos nucleicos antisentido Notch. También se proporcionan usos terapéuticos y métodos de diagnóstico.

2. Antecedentes de la invención 2.1. Los genes y proteínas Notch

Las mutaciones nulas en uno cualquiera de los locus neurógenos zigóticos - Notch (N), Delta (Dl), director (mam), potenciador de escisión (E(spl), neurales (neu), y cerebro principal (bib) - dan como resultado la hipertrofia del sistema nervioso a expensas de las estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto es debido al desvío de las células precursoras epidérmicas dentro de una ruta neuronal, e implica que la función genética neurógena es necesaria para desviar las células dentro de la región neurógena desde la muerte de las neuronas hasta la muerte epitelial. Los estudios que han evaluado los efectos de la ablación con láser de neuroblastos embriónicos específicos en saltamontes (Doe and Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206-219) han demostrado que las interacciones celulares entre los neuroblastos y las células accesorias circundantes sirven para inhibir que estas células accesorias adopten la muerte de los neuroblastos. En conjunto, estas observaciones genéticas y de desarrollo han llevado a la hipótesis de los productos proteínicos de la función de los locus neurógenos como componentes de un mecanismo de interacción celular necesario para el desarrollo epidérmico apropiado. (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100).

Los análisis de secuencias (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes dev. 2, 1723-1735) han demostrado que dos de los locus neurógenos, Notch y Delta, parece que codifican las proteínas transmembranales que se extienden a través de la membrana de una sola vez. El gen Notch de la Drosophila codifica una proteína de \sim 300 kd (se usa "Notch" para denominar esta proteína) con un gran dominio extracelular N-terminal que incluye 36 repeticiones en cascada semejantes al factor de crecimiento epidérmico (EGF) seguido por otras tres repeticiones ricas en cisteína, designadas como repeticiones Notch/lin-12 (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Yochem et al., 1988, Nature 335, 547-550). También se han publicado las secuencias de Xenopus (Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441) y un homólogo Notch humano denominado TAN-1 (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-661). Delta codifica una proteína de \sim 100 kd (se usa "Delta" para indicar DLZM, el producto proteínico de las transcripciones cigóticas y maternales predominantes; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) que tiene nueve repeticiones semejantes al EGF dentro de su dominio extracelular (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Aunque se conoce poco sobre la importancia funcional de estas repeticiones, el motivo semejante al EGF se ha encontrado en una variedad de proteínas, incluyendo las implicadas en la cascada de coagulación de la sangre (Furie and Furie, 1988, Cell 53, 505-518). En particular, se ha encontrado este motivo en las proteínas extracelulares tales como los factores de coagulación sanguínea IX y X (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53, 505-518), en otros genes de Drosophila (Knust et al., 1987, EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55, 1047-1059), y en algunas proteínas receptoras de la superficie celular, tales como la trombomodulina (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6, 1891-1897) y el receptor LDL (Sudhof et al., 1985, Science 228, 815-822). Se ha dibujado el mapa de un sitio de unión de las proteínas al dominio de repeticiones EGF en la trombomodulina y uroquinasa (Kurowasa et al., 1988, J. Biol. Chem 263, 5993-5996; Apella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440).

Se han descrito una colección interesante de interacciones entre mutaciones Notch y Delta (Vassin et al., 1985, J. Neurogenet. 2, 291-308; Shepard et al., 1989, Genetics 122, 429-438; Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464-475). Una serie de estudios genéticos (resumidos en Alton et al., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272) ha indicado que las dosis de los genes Notch y Delta en relación uno con otro son cruciales para el desarrollo normal. Una reducción del 50% en la dosis de Delta en un precursor Notch natural causa un ensanchamiento de las venas de las alas que crea una "delta" en la base (Lindsley and Grell, 1968, número de publicación 627, Washington, D.C., Carnegie Institute of Washington). Un fenotipo similar es causado al incrementar un 50% la dosis de Notch en un precursor Delta natural (un fenotipo "confluente", Welshons, 1965, Science 150, 1122-1129). Este fenotipo Delta se deprime parcialmente por una reducción en la dosis de Notch. Los trabajos han demostrado que las interacciones letales entre alelos que se correlacionan con alteraciones en la repeticiones semejantes al EGF en Notch se pueden resolver reduciendo la dosis de Delta (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475). Xu et al (1990, Genes dev. 4, 464-475) encontraron que las mutaciones nulas bien en Delta o bien en mam reducen las interacciones letales entre las combinaciones heterocigóticas de ciertos alelos Notch, conocidas como mutaciones Abruptex (Ax). Los alelos Ax se asocian con mutaciones de sentido erróneo dentro de las repeticiones semejantes al EGF del dominio Notch extracelular (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417).

Estudios recientes han demostrado que Notch y Delta, y Notch y Serrate, interactúan directamente a nivel molecular (Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534; Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699).

Notch es expresado en procedimientos axonales durante el crecimiento de las neuronas embriónicas (Johansen et al., 1989. J. Cell Biol. 109: 2427-2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3: 1113-1129; Fehon et al., 1991. J. Cell Biol. 113:657-669).

Un estudio ha demostrado que ciertos alelos Ax de Notch pueden alterar gravemente la señalización de los axones durante el crecimiento nervioso sensorial en los discos de los insectos, aunque no se conoce todavía si la expresión anormal de Notch en el propio axon o en el epitelio a lo largo de su crecimiento es responsable de este defecto (Palka et al., 1990, Development 109, 167-175).

2.2. Cáncer

Un neoplasma, o tumor, es una masa neoplásica que resulta del crecimiento celular anormal incontrolado, que puede causar hinchamiento en la superficie corporal, y que puede ser benigno o maligno. Los tumores benignos permanecen generalmente localizados. Los tumores malignos se denominan colectivamente cánceres. El término "maligno" significa generalmente que el tumor puede invadir y destruir las estructuras corporales vecinas y dispersarse a sitios distantes hasta causar la muerte (para revisión, véase Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122).

El tratamiento y la prevención eficaces del cáncer permanecen como una necesidad largamente deseada, y una meta principal en la investigación biomédica.

3. Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 19 expuestas al final de la descripción.

La siguiente descripción expone detalles que se refieren tanto a realizaciones cubiertas por las reivindicaciones como a materia objeto no cubierta por las reivindicaciones. La descripción de la materia objeto no cubierta por las reivindicaciones solamente se da de manera informativa.

3.1. Definiciones

Como se usan aquí, los siguientes términos tienen los significados que se indican:

AA =: aminoácido

EGF =: factor de crecimiento epidérmico

ELR =: repetición semejante al EGF (homólogo)

IC =: intracelular

PCR =: reacción en cadena de la polimerasa

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Como se usa aquí, el subrayado del nombre de un gen indica el gen, al contrario de su producto proteínico codificado que se indica por el nombre del gen sin ningún subrayado. Por ejemplo, "Notch" significará gen Notch, mientras que "Notch" indicará el producto proteínico del gen Notch.

4. Descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia de nucleótidos primarios del cDNA Delta D11 (SEQ ID NO:1) y secuencia de aminoácidos Delta (SEQ ID NO:2). Se muestra la secuencia de DNA de la hebra 5'-3' del cDNA D11, que contiene una serie de correcciones en comparación con la presentada por Kopczynkski et al. (1988. Genes Dev. 2:1723-1735).

Figura 2. Las estructuras artificiales de expresión de Notch y el mapa de deleción del dominio de unión Delta/Serrate. Las células S2 en crecimiento en fase logarítmica fueron transfectadas transitoriamente con la serie de estructuras artificiales de expresión mostrada: los dibujos representan los productos proteínicos previsibles de los diferentes mutantes de deleción Notch creados. Todas las estructuras artificiales de expresión se derivaron de la estructura artificial #1 pMtNMg. Las células transfectadas transitoriamente se mezclaron con células que expresan Delta a partir de la línea L49-6-7 transformada permanentemente o con células que expresan Serrate transfectadas transitoriamente, inducidas con CuSO_{4}, se incubaron en condiciones de agregación y después se puntuaron en cuanto a su capacidad para agregarse usando antisuero específico y el microscopio de inmunofluorescencia. Los agregados se definieron como agrupaciones de cuatro o más células que contienen tanto células que expresan Notch como células que expresan Delta/Serrate. Los valores dados para el % de agregación se refieren al porcentaje de todas las células que expresan Notch encontrado en tales agrupaciones bien con Delta (DI) (columna izquierda) o bien con Serrate (Ser) (columna derecha). Las diferentes estructuras artificiales de deleción Notch se representan en diagrama con líneas de corte y empalme que indican las uniones de ligación. Cada repetición del EGF se indica como una caja rectangular punteada y se indican los números de las repeticiones del EGF a cada lado de las uniones de ligación. En las uniones de ligación, las repeticiones del EGF parciales producidas por diferentes deleciones se indican por cajas abiertas y corchetes cerrados (por ejemplo véase #23 \DeltaCla+EGF(10-12)). Las estructuras artificiales #3-13 representan las series de deleción ClaI. Como se muestra en el diagrama, cuatro de los sitios ClaI, en las repeticiones 7, 9, 17 y 26, rompen la repetición en el medio, inmediatamente después de la tercera cisteína (indicada por repeticiones de caja abierta; véase la Figura 3 para clarificación adicional), mientras que el sitio quinto y próximo al 3' rompen claramente entre las repeticiones 30 y 31 del EGF (indicado por la repetición 31 de caja cerrada; véase de nuevo la Figura 3). En la estructura artificial del corte #15, la repetición del EGF 14 que lleva la mutación del punto de corte, está dibujada como una caja rayada. En la estructura artificial #33 \DeltaCla+XEGF(10-13), las repeticiones del EGF derivadas de Notch de Xenopus se distinguen de las repeticiones de Drosophila por un patrón diferente de degradación. SP, péptido señal; EGF, repetición del factor de crecimiento epidérmico; N, repetición de Notch/lin-12; TM, dominio transmembranal; repeticiones cdc10, cdc10/anquirina; PA, secuencia de consenso de unión del nucleótido putativo; opa, extensión de poliglutamina llamada opa; DI, Delta; Ser, Serrate.

Figura 3. Estructura detallada de las estructuras artificiales de deleción Notch #19-24: se requieren ambas repeticiones 11 y 12 del EGF para la agregación Notch-Delta. Las repeticiones 10-13 del EGF se presentan en el diagrama en la parte superior que muestra el espaciado regular de los seis residuos de cisteína (C). Los productos de PCR generados para estas estructuras artificiales (los nombres y los números como se dan en la Figura 2) se representan por líneas negras gruesas y los puntos finales exactos se indican en relación con las diferentes repeticiones del EGF. La capacidad para agregarse con Delta se representa como (+) o (-) para cada estructura artificial. Los fragmentos de PCR o bien rompen las repeticiones del EGF en el medio, justo después de la tercera cisteína en el mismo sitio que para cuatro de los cinco sitios ClaI, o bien exactamente entre dos repeticiones en el mismo sitio que el sitio ClaI más C-terminal.

Figura 4. Comparación de la secuencia de aminoácidos de las repeticiones 11 y 12 del EGF procedentes de Notch de Drosophila y Xenopus. La secuencia de aminoácidos de las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch de Drosophila (SEQ ID NO:14) (Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094-3108) está alineada con la de las mismas dos repeticiones del EGF procedentes de Notch de Xenopus (SEQ ID NO:15) (Coffman et al., 1990, Science 249;1438-1441). Los aminoácidos idénticos están recuadrados. Los seis residuos de cisteína conservados de cada repetición del EGF y los residuos de consenso de unión de Ca^{++} (Rees et al., 1988, EMBO J. 7:2053-2061) están marcados con un asterisco (*). El cambio de leucina a prolina encontrado en el clon PCR de Xenopus que falla para agregarse está marcado por debajo.

Figura 5. Secuencia de ácidos nucleicos de las homologías entre Serrate y Delta. Se muestra una porción de la secuencia de nucleótidos Serrate de Drosophila (SEQ ID NO:3), con la secuencia de la proteína Serrate codificada (SEQ ID NO:4) escrita debajo (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201 a 2193-94). Las cuatro regiones que muestran una alta homología en la secuencia con la secuencia Delta de la Drosophila están numeradas por encima de la línea e indicadas con corchetes. La región total de la homología se extiende desde el número 627 de nucleótido hasta 1290 de la secuencia de nucleótidos Serrate (numerada como en la Figura 4 de Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201).

Figura 6. Diagrama esquemático de los clones Notch humanos. Se muestra un diagrama esquemático de Notch humano. Las líneas gruesas en negrita debajo del diagrama muestran la porción de la secuencia Notch contenida en cada uno de los cuatro clones de cDNA. La localización de los cebadores usados en PCR, y su orientación, se indican con flechas.

Figura 7. Secuencias de Notch humano alineadas con la secuencia de Notch de Drosophila. Las líneas verticales numeradas corresponden a los coordinados de Notch de Drosophila. Las líneas horizontales debajo de cada mapa muestran donde caen los clones en relación a las extensiones de la secuencia (líneas horizontales gruesas).

Figura 8. Secuencias de nucleótidos de Notch humano contenidas en el clon hN2k del plásmido de cDNA. Figura 8a: se muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO:5) de una porción del inserto Notch humano, empezando en el sitio EcoRI del extremo 3', y siguiendo en la dirección de 3' a 5'. Figura 8B: se muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO:6) de una porción del inserto Notch humano, empezando en el sitio EcoRI del extremo 5', y siguiendo en la dirección de 5' a 3'. Figura 8C: se muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO:7) de una porción del inserto Notch humano, empezando en 3' de la secuencia mostrada en la Figura 8B, y siguiendo en la dirección de 5' a 3'. Las secuencias mostradas son provisionales, sujetas a confirmación por la determinación de las secuencias que se solapan.

Figura 9. Secuencias de nucleótidos de Notch humano contenidas en el clon hN4k del plásmido de cDNA. Figura 9A: se muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO:8) de una porción del inserto Notch humano, empezando en el sitio EcoRI del extremo 5', y siguiendo en la dirección de 5' a 3'. Figura 9B: se muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO:9) de una porción del inserto Notch humano, empezando cerca del extremo 3', y siguiendo en la dirección de 3' a 5'. Las secuencias mostradas son provisionales, sujetas a confirmación por la determinación de las secuencias que se solapan.

Figura 10. Secuencias de DNA (SEQ ID NO:10) y de aminoácidos (SEQ ID NO:11) de Notch humano contenidas en el clon hN3k del plásmido de cDNA.

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Figura 11. Secuencias de DNA (SEQ ID NO:12) y de aminoácidos (SEQ ID NO:13) de Notch humano contenidas en el clon hN5k del plásmido de cDNA.

Figura 12. Comparación de hN5k con otros homólogos Notch. Figura 12A. Representación esquemática de Notch de Drosophila. Se indican la secuencia señal (señal), las 36 repeticiones semejantes al EGF, las tres repeticiones
Notch/lin-12, el dominio transmembranal (TM), las seis repeticiones CDC10, la repetición OPA, y la región PEST (rica en prolina, ácido glutámico, serina y treonina). Figura 12B. Alineamiento de la secuencia deducida de aminoácidos de hN5k con secuencias de otros homólogos Notch. Los aminoácidos están numerados en el lado izquierdo. Las regiones cdc10 y PEST enriquecida están ambas recuadradas, y las repeticiones cdc10 individuales están marcadas. Los aminoácidos que son idénticos en tres o más secuencias están señalados. Los cebadores usados para clonar hN5k se indican debajo de las secuencias a partir de las que fueron diseñados. La secuencia de localización nuclear (NLS), la caseina-quinasa II (CKII), y los sitios cdc2 (cdc2) de quinasa del motivo putativo CcN de los homólogos de Notch de vertebrados están recuadrados. La posible secuencia objetivo nuclear bipartita (BNTS) y los sitios de fosforilación próximos de Notch de Drosophila también están recuadrados.

Figura 13. Secuencias de aminoácidos alineados de proteínas Notch de diferentes especies. humN: la proteína Notch humana codificada por el homólogo hN (contenido en parte en el plásmido hN5k) (SEQ ID NO:19). TAN-1: la proteína humana Notch codificada por el homólogo TAN-1 (SEQ ID NO:20) (la secuencia mostrada se deriva en parte del trabajo de esta invención y en parte de la secuencia TAN-1 publicada por Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-661); Xen N: proteína Notch de Xenopus (Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441). Dros N: proteína Notch de Drosophila (Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581). Se indican los dominios estructurales.

Figura 14. Tinción inmunocitoquímica de tejido de cáncer de mama de un paciente humano. El tejido maligno de la mama de una muestra obtenida a partir de un paciente humano se incluyó en una sección de parafina, y se sometió a tinción inmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal P4 anti-Notch humano, dirigido contra la proteína TAN-1. El tejido no maligno de la mama presentaba mucha menos tinción (no se muestra).

Figura 15. Tinción inmunocitoquímica de tejido de colon de un paciente humano con cáncer de colon. Una muestra de tejido de colon obtenida de un paciente con cáncer de colon se incluyó en una sección de parafina, y se sometió a tinción inmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal P1 anti-Notch humano, dirigido contra la proteína codificada hN. Las áreas con aumento de tinción son aquellas áreas en las que están presentes las células malignas, como se determinó por morfología celular.

Figura 16. Tinción inmunocitoquímica de tejido de cuello uterino. Se obtuvieron muestras de tejido humano que contenían cáncer de cuello uterino (Fig. 16A) o epitelio de cuello uterino normal (Fig. 16B) del mismo paciente, incluídas en una sección de parafina, y sometidas a tinción inmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal anti-Notch humano dirigido contra la proteína TAN-1. Las áreas que contienen células malignas (como se determinó por morfología) presentaron un aumento de la tinción en relación con las células no malignas. Entre las células no malignas, el
tejido conjuntivo y la capa basal del epitelio (que contiene células madre) se tiñeron con el anticuerpo anti-Notch.

Figura 17. Secuencia de DNA (SEQ ID NO:21) y de aminoácidos codificada (contenida en la SEQ ID NO:19) del homólogo de Notch humano, hN. Se presenta la secuencia codificadora de DNA completa (así como la secuencia no codificadora), con la exclusión de la que codifica al iniciador Met. Los 8 últimos nucleótidos mostrados (números 9716-9723) son secuencias de vector, y no de hN.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a usos terapéuticos y métodos de diagnóstico y a composiciones basadas en proteínas Notch y ácidos nucleicos. La invención proporciona un tratamiento para los trastornos por muerte o diferenciación celular mediante la administración de un compuesto terapéutico de la invención. Tales compuestos terapéuticos (denominados aquí "Compuestos Terapéuticos") incluyen: proteínas Notch y análogos y derivados de las mismas (incluyendo fragmentos); anticuerpos frente a ellos; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Notch, análogos, o derivados; y ácidos nucleicos antisentido Notch. También están incluidas proteínas y derivados y análogos de las mismas que son capaces de inhibir las interacciones de una proteína Notch con otra proteína toporrítmica. En una realización preferida, un compuesto terapéutico de la invención se puede administrar para tratar un estado canceroso, o para evitar la progresión desde un estado pre-neoplásico o no maligno (por ejemplo, estado metaplásico) hasta un estado neoplásico o maligno. En otra realización específica, un compuesto terapéutico de la invención se puede administrar para tratar un trastorno del sistema nervioso, tal como lesiones nerviosas o enfermedad degenerativa. En otra realización específica adicional, un compuesto terapéutico de la invención se puede administrar para favorecer la regeneración y reparación de los tejidos para el tratamiento de diferentes estados patológicos.

En una realización, los Compuestos Terapéuticos que antagonizan, o inhiben, la función Notch (denominados de aquí en adelante "Compuestos Terapéuticos antagonistas") se pueden administrar para un efecto terapéutico; los trastornos que se pueden tratar así se pueden identificar por ensayos in vitro tal como se describe en la sección 5.1 más adelante. Tales Compuestos Terapéuticos antagonistas incluyen, pero sin limitarse a ellos, ácidos nucleicos antisentido Notch, anticuerpos neutralizantes anti-Notch, inhibidores competitivos de las interacciones proteína Notch-proteína (por ejemplo, una proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12), y moléculas que interfieren con la función intracelular Notch tales como las mediadas por las repeticiones cdc10, como se detalla más adelante.

En otra realización, los Compuestos Terapéuticos que facilitan la función Notch (denominados de aquí en adelante "Compuestos Terapéuticos agonistas") se pueden administrar para un efecto terapéutico; los trastornos que se pueden tratar así se pueden identificar por ensayos in vitro tal como se describe en la sección 5.1 más adelante. Tales Compuestos Terapéuticos agonistas incluyen, pero sin limitarse a ellos, proteínas Notch y derivados de las mismas que comprenden el dominio intracelular, y ácidos nucleicos Notch que codifican los anteriores.

Los trastornos por muerte celular, en particular las condiciones precancerosas tales como metaplasia y displasia, y trastornos hiperproliferativos (por ejemplo, cáncer) o hipoproliferativos, que implican niveles anormales o indeseables de expresión o actividad de la proteína Notch se pueden diagnosticar detectando dichos niveles, como se describe más completamente más adelante.

En un aspecto preferido, un compuesto terapéutico de la invención es una proteína que consta de al menos un fragmento (denominado aquí "fragmento adhesivo") de las proteínas codificadas por genes toporrítmicos que son mediadores de la unión a las proteínas Notch o a los fragmentos adhesivos de las mismas. Genes toporrítmicos, como se usa aquí, significa gen Notch.

La invención proporciona además el uso, en composiciones farmacéuticas o para la fabricación de un medicamento, de una proteína Notch humana codificada por el homólogo hN, y de proteínas que comprenden el dominio extracelular de la proteína Notch y sus subsecuencias. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los anteriores y células recombinantes.

Para aclarar la descripción, pero no como limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones:

(i): Usos terapéuticos;

(ii): Usos profilácticos;

(iii): Demostración de la utilidad terapéutica o profiláctica;

(iv): Administración y composiciones terapéuticas/profilácticas;

(v): Regulación antisentido de la expresión de Notch;

(vi): Utilidad de diagnóstico;

(vii): Ácidos nucleicos Notch;

(viii): Producción recombinante de Compuestos Terapéuticos proteínicos;

(ix): Derivados y análogos de proteínas Notch y otras proteínas toporrítmicas;

(x): Ensayos de proteínas Notch, derivados y análogos, y

(xi): Anticuerpos frente a proteínas Notch derivados y análogos.

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5.1 Usos terapéuticos

Como se ha descrito antes, los compuestos terapéuticos antagonistas de la invención son los Compuestos Terapéuticos que antagonizan, o inhiben una función Notch. Tales Compuestos Terapéuticos antagonistas se identifican lo más preferiblemente por el uso de ensayos in vitro convenientes y conocidos, por ejemplo, basados en su capacidad de inhibir la unión de Notch a otras proteínas (véanse secciones 6-8 de esta memoria), o inhibir cualquier función Notch conocida que se ensaya in vitro, aunque se pueden emplear también ensayos genéticos (por ejemplo, en la Drosophila). En una realización preferida, el Compuesto Terapéutico antagonista es una proteína o derivado de la misma que comprende un fragmento funcionalmente activo tal como un fragmento adhesivo de Notch. En realizaciones específicas, dichos Compuestos Terapéuticos antagonistas pueden ser proteínas adhesivas codificadas por las estructuras artificiales apropiadas descritas en las secciones 6 y 7 más adelante, o proteínas que comprenden la región extracelular de Notch, en particular ELR-11 y ELR-12, o un anticuerpo frente a ella, o un inhibidor análogo/competitivo de una región intracelular Notch con señal de transducción, un ácido nucleico capaz de expresar un fragmento adhesivo Notch, o un ácido nucleico antisentido Notch (véase sección 5.5). Se debe observar que en ciertos casos, un fragmento adhesivo Notch (o posiblemente otros supuestos Compuestos Terapéuticos antagonistas) pueden actuar alternativamente como un Compuesto Terapéutico agonista, dependiendo de la historia de desarrollo del tejido que va a ser expuesto al Compuesto Terapéutico; preferiblemente, se deben utilizar ensayos in vitro o in vivo adecuados, como se describe más adelante, para determinar el efecto de un Compuesto Terapéutico específico y si su administración está indicada para el tratamiento del tejido afectado.

En otra realización de la invención, se usa un ácido nucleico que contiene una porción de un gen Notch, como un Compuesto Terapéutico antagonista, para favorecer la inactivación de Notch por recombinación de homólogos (Koller and Smithies, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

Los compuestos terapéuticos agonistas de la invención, como se ha descrito antes, favorecen la función Notch.

Descripciones y fuentes adicionales de compuestos terapéuticos de la invención se encuentran en las secciones de la 5.4 a la 5.8.

Los compuestos terapéuticos agonistas y antagonistas de la invención tienen utilidad terapéutica en los trastornos por muerte celular. Los Compuestos Terapéuticos agonistas se pueden administrar terapéuticamente (incluyendo profilácticamente): (1) en enfermedades o trastornos que implican una ausencia o disminución de los niveles (en relación a los normales o deseados) de la función Notch, por ejemplo, en pacientes en los que falta la proteína Notch, es genéticamente defectuosa, biológicamente inactiva o con poca actividad, o deficientemente expresada; y (2) en enfermedades o trastornos en los que los ensayos in vitro (o in vivo) (véase más adelante) indican la utilidad de la administración de un agonista de Notch. La ausencia o disminución de los niveles de la función Notch se puede detectar fácilmente, por ejemplo, obteniendo una muestra de tejido del paciente (por ejemplo, procedente de una biopsia del tejido) y ensayando in vitro los niveles de proteína, la estructura y/o actividad de la proteína Notch expresada. Se pueden emplear así muchos métodos estándar de la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Notch (por ejemplo, transferencia Western, inmunoprecipitación seguida por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, inmunocitoquímica, etc; véanse también los ensayos enumerados en la sección 5.6, más adelante), y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión de Notch detectando y/o visualizando el mRNA de Notch (por ejemplo, ensayos Northern, ensayos de transferencia, hibridación in situ, etc).

Los ensayos in vitro que se pueden usar para determinar si está indicada la administración de un específico Compuesto Terapéutico agonista o Compuesto Terapéutico antagonista, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en los que se hace crecer en cultivo una muestra de tejido del paciente, y se expone a un Compuesto Terapéutico o bien se administra éste compuesto de otro modo, y se observa el efecto de tal Compuesto Terapéutico sobre la muestra de tejido. En una realización, cuando el paciente tiene un tumor maligno, se cultiva o se hace crecer en cultivo una muestra de células procedentes de dicho tumor maligno, y las células se exponen después a un Compuesto Terapéutico. Un Compuesto Terapéutico que inhibe la supervivencia o crecimiento de las células malignas (por ejemplo, favoreciendo la diferenciación terminal) se selecciona para uso terapéutico in vivo. Se pueden usar muchos ensayos estándar en la técnica para evaluar dicha supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular se puede ensayar midiendo la incorporación de ^{3}H-timidina, por recuento celular directo, por detección de cambios en la actividad transcripcional de genes conocidos tales como los proto-oncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular se puede evaluar por tinción con azul tripán, la diferenciación se puede evaluar visualmente basándose en cambios en la morfología, etc. En un aspecto específico, los cultivos de células malignas se exponen separadamente a (1) un Compuesto Terapéutico agonista, y (2) un Compuesto Terapéutico antagonista; el resultado del ensayo puede indicar qué tipo de Compuesto Terapéutico tiene eficacia terapéutica.

En otra realización, está indicado el uso de un Compuesto Terapéutico que presenta el efecto deseado, inhibición o promoción del crecimiento celular, sobre una muestra de células de un paciente procedentes de un tejido que tiene o se sospecha que tiene un trastorno hiper- o hipoproliferativo, respectivamente. Tales trastornos hiper- o hipoproliferativos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los descritos en las secciones de la 5.1.1 a la 5.1.3 más adelante.

En otra realización específica, está indicado el uso de un Compuesto Terapéutico en el tratamiento de lesiones nerviosas o de un trastorno degenerativo del sistema nervioso (véase la sección 5.1.2) que presenta in vitro promoción de la regeneración nerviosa/extensión de las neuritas de las células nerviosas del tipo de paciente afectado.

Adicionalmente, la administración de un compuesto terapéutico antagonista de la invención está indicada también en enfermedades o trastornos de los que se ha determinado o se sabe que implican un fenotipo activado dominante Notch (mutaciones con "ganancia de función"). La administración de un Compuesto Terapéutico agonista está indicada en enfermedades o trastornos de los que se ha determinado o se sabe que implican un fenotipo negativo dominante Notch (mutaciones con "pérdida de función"). En esta invención se han investigado las funciones de diferentes dominios estructurales de la proteína Notch in vivo, por expresión ectópica de varios mutantes de deleción de Notch de Drosophila con el promotor hsp70 del shock térmico, así como los promotores específicos del ojo. Se observaron dos clases de fenotipos dominantes, uno sugiere mutaciones de Notch con pérdida de función y el otro mutaciones de Notch con ganancia de función. Los fenotipos dominantes "activados" resultaron de la sobreexpresión de una proteína que carece de la mayor parte de las secuencias extracelulares, mientras que los fenotipos dominantes "negativos" resultaron de la sobreexpresión de una proteína que carece de la mayor parte de las secuencias intracelulares. Los resultados de esta invención indican que las funciones Notch como un receptor cuyo dominio extracelular media en la unión del ligando, dan como resultado la transmisión de señales de desarrollo por el dominio citoplasmático. Los fenotipos observados también sugieren que la región de repetición cdc10/anquirina dentro del dominio intracelular juega un papel esencial en los sucesos de transducción de señales mediados por Notch (función intracelular).

En diferentes realizaciones específicas, los ensayos in vitro se pueden realizar con células o tipos de células representativas implicadas en el trastorno del paciente, para determinar si un Compuesto Terapéutico tiene el efecto deseado sobre tales tipos de células.

En otra realización, las células de una muestra de tejido de un paciente sospechosas de ser pre-neoplásicas se cultivan en placas o se hacen crecer de manera similar in vitro, y se exponen al Compuesto Terapéutico. El Compuesto Terapéutico que da como resultado un fenotipo celular que es más normal (es decir, menos representativo de un estado pre-neoplásico, estado neoplásico, estado maligno, o fenotipo transformado) se selecciona para uso terapéutico. Se pueden usar muchos ensayos estándar en la técnica para evaluar si está presente un estado pre-neoplásico, un estado neoplásico, o un fenotipo transformado o maligno (véase la sección 5.2.1). Por ejemplo, las características asociadas con un fenotipo transformado (un conjunto de características in vitro asociadas con una capacidad tumorigénica in vivo) incluyen una morfología de celulas más redondeadas, pérdida de la unión al sustrato, pérdida de inhibición de contacto, pérdida de la dependencia del anclaje, liberación de proteasas tal como el activador de plasminógeno, aumento del transporte de azúcar, disminución del requerimiento de suero, expresión de antígenos fetales, desaparición de la proteína de superficie de 250.000 dalton, etc. (véase Luria et al., 1978, General Virology, 3d Ed., John Wiley & Sons, New York pp. 436-446).

En otra realizaciones específicas, los ensayos in vitro descritos antes se pueden llevar a cabo usando una línea celular, mejor que una muestra celular derivada de un paciente específico a ser tratado, en los cuales la línea celular se deriva o muestra características asociadas con el trastorno maligno, neoplásico o pre-neoplásico que se desea tratar o prevenir, o se deriva de células neuronales u otro tipo de células sobre las que se desea un efecto, según la presente invención.

Los Compuestos Terapéuticos antagonistas se pueden administrar terapéuticamente (incluyendo profilácticamente): (1) en enfermedades o trastornos que implican aumento de los niveles de la función Notch (en relación a los normales, o deseados), por ejemplo, donde la proteína Notch está sobreexpresada o es activa en exceso; y (2) en enfermedades o trastornos en los que los ensayos in vitro (o in vivo) indican la utilidad de la administración del antagonista Notch. El aumento de los niveles de la función Notch se puede detectar fácilmente por métodos tales como los descritos antes, cuantificando la proteína y/o RNA. Los ensayos in vitro con células de una muestra de tejido de un paciente o con la línea celular o tipo de células apropiadas, para determinar la utilidad terapéutica, se pueden llevar a cabo como se ha descrito antes.

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5.1.1. Tumores malignos

Los tumores malignos y los estados pre-neoplásicos que se pueden ensayar como se ha descrito antes en cuanto a la eficacia de la intervención con Compuestos Terapéuticos antagonistas o agonistas, y que se pueden tratar de este modo observando una indicación de utilidad terapéutica, incluyen, pero sin limitarse a ellos, los descritos más adelante en las secciones 5.1.1 y 5.2.1.

Los tumores malignos y los trastornos relacionados, las células del tipo que se pueden ensayar in vitro (y/o in vivo), y después de la observación del resultado del ensayo apropiado, tratar según la presente invención, incluyen, pero sin limitarse a ellos, los listados en la tabla 1 (para una revisión de tales trastornos, véase Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia):

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TABLA 1 Tumores malignos y trastornos relacionados

\quad: Leucemia

\quad: leucemia aguda

\quad: leucemia linfocítica aguda

\quad: leucemia mielocítica aguda

\quad: mieloblástica

\quad: promielocítica

\quad: mielomonocítica

\quad: monocítica

\quad: eritroleucemia

\quad: leucemia crónica

\quad: leucemia mielocítica crónica (granulocítica)

\quad: leucemia linfocítica crónica

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TABLA 1 (continuación)

\quad: Policitemia verdadera

\quad: Linfoma

\quad: enfermedad de Hodgkin

\quad: enfermedad no-Hodgkin

\quad: Mieloma múltiple

\quad: Macroglobulinemia de Waldenström

\quad: Enfermedad de cadena pesada

\quad: Tumores sólidos

\quad: sarcomas y carcinomas

\quad: fibrosarcoma

\quad: mixosarcoma

\quad: liposarcoma

\quad: condrosarcoma

\quad: sarcoma osteogénico

\quad: cordoma

\quad: angiosarcoma

\quad: endoteliosarcoma

\quad: linfagiosarcoma

\quad: linfagioendoteliosarcoma

\quad: sinovioma

\quad: mesotelioma

\quad: tumor de Ewing

\quad: liomiosarcoma

\quad: rabdomiosarcoma

\quad: carcinoma de colon

\quad: cáncer de páncreas

\quad: cáncer de mama

\quad: cáncer de ovario

\quad: cáncer de próstata

\quad: carcinoma de las células escamosas

\quad: carcinoma de las células basales

\quad: adenocarcinoma

\quad: carcinoma de las glándulas sudoríparas

\quad: carcinoma de las glándulas sebáceas

\quad: carcinoma papilar

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TABLA 1 (continuación)

\quad: adenocarcinomas papilares

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\quad: cistadenocarcinoma

\quad: carcinoma medular

\quad: carcinoma broncogénico

\quad: carcinoma de las células renales

\quad: hepatoma

\quad: carcinoma del conducto biliar

\quad: coriocarcinoma

\quad: seminoma

\quad: carcinoma embrional

\quad: tumor de Wilms

\quad: cáncer de cuello uterino

\quad: tumor testicular

\quad: carcinoma de pulmón

\quad: carcinoma de pulmón de células pequeñas

\quad: carcinoma de vejiga

\quad: carcinoma epitelial

\quad: glioma

\quad: astrocitoma

\quad: meduloblastoma

\quad: craniofaringioma

\quad: ependimoma

\quad: pinealoma

\quad: hemangioblastoma

\quad: neuroma acústico

\quad: oligodendroglioma

\quad: menangioma

\quad: melanoma

\quad: neuroblastoma

\quad: retinoblastoma

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En realizaciones específicas, los tumores malignos o los cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) se tratan o previenen en tejidos epiteliales tales como los del cuello uterino, esófago y pulmón.

Como se detalla en los ejemplos de la sección 10.1 más adelante, los tumores malignos de mama, colon y cuello uterino muestran aumento de la expresión de Notch humano en relación con los tejidos no malignos. Por tanto, en realizaciones específicas, los tumores malignos de mama, colon o cuello uterino se tratan o previenen administrando una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico antagonista de la invención. La presencia de la expresión de Notch aumentada en el cáncer de mama, colon y de cuello uterino sugiere que muchos más estados cancerosos muestran Notch regulado por incremento. Por tanto, se considera que muchos más cánceres, por ejemplo, seminoma, melanoma y cáncer de pulmón, se pueden tratar o prevenir con la administración de un Compuesto Terapéutico antagonista.

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5.1.2. Trastornos del sistema nervioso

Los trastornos del sistema nervioso, que implican tipos de células que se pueden ensayar como se ha descrito antes en cuanto a la eficacia de la intervención con Compuestos Terapéuticos antagonistas o agonistas, y que se pueden tratar de este modo observando una indicación de utilidad terapéutica, incluyen, pero sin limitarse a ellos, lesiones del sistema nervioso, y enfermedades o trastornos que dan como resultado bien una desconexión de axones, bien una disminución o degeneración de neuronas, o bien desmielinación. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) según la invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, las siguientes lesiones del sistema nervioso central (incluyendo médula espinal, cerebro) o del sistema nerviosos periférico:

(i): lesiones traumáticas, que incluyen lesiones causadas por daño físico o asociadas con cirugía, por ejemplo, lesiones que cortan una porción del sistema nervioso, o lesiones por compresión;

(ii): lesiones isquémicas, en las que la ausencia de oxígeno en una porción del sistema nervioso da como resultado lesión o muerte de las neuronas, incluyendo infarto o isquemia cerebral, o infarto o isquemia de médula espinal;

(iii): lesiones malignas, en las que una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por tejido maligno que es o bien un tumor maligno asociado al sistema nervioso o bien un tumor maligno derivado de un tejido que no es del sistema nervioso;

(iv): lesiones infecciosas, en las que una porción del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de una infección, por ejemplo, por un abceso o asociado con la infección por el virus de inmunodeficiencia humana, herpes zoster, o el virus herpes simple o con la enfermedad de Lyme, tuberculosis, sífilis;

(v): lesiones degenerativas, en las que una porción del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de un proceso degenerativo que incluye, pero sin limitarse a ellos, degeneración asociada con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica;

(vi): lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales, en los que una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo que incluye, pero sin limitarse a ellos, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía por tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del corpus callosum), y degeneración cerebelar alcohólica;

(vii): lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas que incluyen, pero sin limitarse a ellas, diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma, o sarcoidosis;

(viii): lesiones causadas por sustancias tóxicas que incluyen alcohol, plomo, o neurotoxinas particulares; y

(ix): lesiones desmielinadas en las que una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por una enfermedad desmielinizante que incluye, pero sin limitarse a ellas, esclerosis múltiple, mielopatía asociada con el virus de inmunodeficiencia humana, leucoencefalopatía multifocal progresiva, y mielinólisis de la protuberancia central.

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Los compuestos terapéuticos que son útiles según la invención para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso se pueden seleccionar ensayando su actividad biológica para favorecer la supervivencia o diferenciación de las neuronas (véase también la sección 5.1). Por ejemplo, y no como limitación, los Compuestos Terapéuticos que producen cualquiera de los siguientes efectos pueden ser útiles según la invención:

(i): aumento del tiempo de supervivencia de las neuronas en cultivo;

(ii): aumento de la ramificación de las neuronas en cultivo o in vivo;

(iii): aumento de la producción de moléculas asociadas a las neuronas en cultivo o in vivo, por ejemplo colina-acetiltransferasa o acetilcolina-esterasa con respecto a las neuronas motoras; o

(iv): disminución de los síntomas de la disfunción neuronal in vivo.

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Tales efectos se pueden medir por cualquier método conocido en la técnica. En realizaciones preferidas no limitantes, el aumento de la supervivencia de las neuronas se puede medir por el método expuesto en Arakawa et al. (1990, J. Neurosci. 10:3507-3515); el aumento de la ramificación de las neuronas se puede detectar por los métodos expuestos en Pestronk et al. (1980, Exp. Neurol. 70:65-82) o Brown et al. (1981, Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42); el aumento de la producción de moléculas asociadas con las neuronas se puede medir por bioensayos, ensayo enzimático, unión de anticuerpos, ensayo de transferencia Northern, etc., dependiendo de la molécula a ser medida; y la disfunción de las neuronas motoras se puede medir evaluando la manifestación física del trastorno de las neuronas motoras, por ejemplo, debilidad, velocidad de conducción de las neuronas motoras, o discapacidad funcional.

En una realización específica, los trastornos de las neuronas motoras que se pueden tratar según la invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, traumatismo, lesiones quirúrgicas, enfermedad degenerativa o tumor maligno que puede afectar a las neuronas motoras así como a otros componentes del sistema nervioso, también trastornos que afectan selectivamente a las neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica, y que incluyen, pero sin limitarse a ellos, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la infancia (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome post-polio, y neuropatía sensorial-motora hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).

5.1.3. Reparación y regeneración de los tejidos

En otra realización de la invención, se usa un compuesto terapéutico de la invención para favorecer la regeneración y reparación de los tejidos incluyendo, pero sin limitarse a él, el tratamiento de trastornos disproliferativos benignos. Realizaciones específicas están dirigidas al tratamiento de la cirrosis hepática (un estado patológico en el que la cicatrización interfiere con los procedimientos normales de regeneración del hígado), al tratamiento de formación de queloides (cicatriz hipertrófica) (desfiguración de la piel en la que los procesos de cicatrizado interfieren con la renovación normal), psoriasis (un estado patológico común de la piel caracterizado por la proliferación excesiva de la piel y retraso en la determinación apropiada de la muerte celular), y calvicie (una condición en la que los folículos de pelo terminalmente diferenciados (un tejido rico en Notch) dejan de funcionar adecuadamente).

5.2. Usos profilácticos 5.2.1. Tumores malignos

Los compuestos terapéuticos de la invención se pueden administrar para evitar la progresión hasta un estado neoplásico o maligno, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los trastornos listados en la Tabla 1. Tal administración está indicada cuando el Compuesto Terapéutico ha demostrado en ensayos, como se ha descrito antes, que tiene utilidad para el tratamiento o prevención de dicho trastorno. Tal uso profiláctico está indicado en estados patológicos que se sabe o se sospecha que preceden a la progresión hasta una neoplasia o cáncer, en particular, cuando ha tenido lugar el crecimiento celular no neoplásico que consiste en hiperplasia, metaplasia, o lo más particularmente, displasia (para revisión de tales condiciones de crecimiento anormal, véase Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp 68-79). La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración importante en la estructura o función. Solo como un ejemplo, la hiperplasia endometrial a menudo precede al cáncer endometrial. La metaplasia es una forma controlada de crecimiento celular en el que un tipo de células adultas o totalmente diferenciadas sustituye a otro tipo de células adultas. La metaplasia puede tener lugar en células del tejido epitelial o conjuntivo. La metaplasia atípica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia es frecuentemente un precedente del cáncer, y se encuentra principalmente en el epitelio; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, que implica una pérdida de la uniformidad celular individual y de la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas a menudo tienen núcleos anormalmente grandes, intensamente teñidos, y presentan pleomorfismo. La displasia aparece de forma característica cuando existe irritación crónica o inflamación, y a menudo se encuentra en el cuello uterino, en las vías respiratorias, cavidad oral, y en la vesícula biliar.

Alternativamente o de forma adicional a la presencia de crecimiento celular anormal caracterizado como hiperplasia, metaplasia, o displasia, la presencia de una o más características de un fenotipo transformado, o de un fenotipo maligno, mostrado in vivo o mostrado in vitro por una muestra de células de un paciente, puede indicar la conveniencia de administración profiláctica/terapéutica de un compuesto terapéutico de la invención. Como se ha mencionado antes, tales características de un fenotipo transformado incluyen cambios en la morfología, pérdida de la unión al sustrato, pérdida de inhibición de contacto, pérdida de la dependencia del anclaje, liberación de proteasas, aumento del transporte de azúcar, disminución del requerimiento de suero, expresión de antígenos fetales, desaparición de la proteína de superficie de 250.000 dalton, etc. (véase también id., pp.84-90 para características asociadas con un fenotipo transformado o maligno).

En una realización específica, la leucoplasia, una lesión hiperplásica o displásica del epitelio que es benigna, o la enfermedad de Bowen, un carcinoma in situ, son lesiones pre-neoplásicas indicativas de la conveniencia de la intervención profiláctica.

En otra realización, la enfermedad fibrocística (hiperplasia cística, displasia mamaria, particularmente la adenosis (hiperplasia epitelial benigna)) es indicativa de la conveniencia de la intervención profiláctica.

En otras realizaciones, se trata por administración de una cantidad efectiva de un Compuesto Terapéutico un paciente que presenta uno o más de los siguientes factores de predisposición al tumor maligno: una translocación cromosómica asociada con un tumor maligno (por ejemplo, el cromosoma Philadelphia para la leucemia mielógena crónica, t(14;18) para el linfoma folicular, etc), poliposis familiar o síndrome de Gardner (posibles precedentes del cáncer de colon), gammapatía monoclonal benigna (un posible precedente del mieloma múltiple), y un parentesco de primer grado con personas que tienen un cáncer o una enfermedad precancerosa y que presentan un modelo hereditario Mendeliano (genético) (por ejemplo, poliposis familiar de colon, síndrome de Gardner, exostosis hereditaria, adenomatosis poliendocrina, carcinoma tiroideo medular con producción amiloide y feocromocitoma, síndrome de Peutz-Jeghers, neurofibromatosis de Von Recklinghausen, retinoblastoma, tumor del cuerpo carotídeo, melanocarcinoma cutáneo, melanocarcinoma intraocular, xeroderma pigmentoso, ataxia-telangiectasia, síndrome de Chediak-Higashi, albinismo, anemia aplásica de Fanconi, y síndrome de Bloom; véase Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113, etc).

En otra realización específica, se administra un compuesto terapéutico antagonista de la invención a un paciente humano para prevenir la progresión a cáncer de mama, colon o de cuello uterino.

5.2.2. Otros trastornos

En otras realizaciones, se puede administrar un compuesto terapéutico de la invención para prevenir un trastorno del sistema nervioso descrito en la sección 5.1.2, u otro trastorno (por ejemplo, cirrosis hepática, psoriasis, queloides, calvicie) descritos en la sección 5.1.3.

5.3. Demostración de la utilidad terapéutica o profiláctica

Los compuestos terapéuticos de la invención se pueden ensayar in vivo en cuanto a la actividad terapéutica o profiláctica deseada. Por ejemplo, tales compuestos se pueden ensayar en sistemas de modelos animales adecuados antes de ensayarlos en humanos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, etc. Para ensayos in vivo, antes de la administración a humanos, se puede usar cualquier sistema de modelo animal conocido en la técnica.

5.4. Administración y composiciones terapéuticas/profilácticas

La invención proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento (y profilaxis) por la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico de la invención. En un aspecto preferido, el compuesto terapéutico está sustancialmente purificado. El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, animales tales como vacas, cerdos, pollos, etc., y es preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente humano.

Se conocen diferentes sistemas de liberación que se pueden usar para administrar un compuesto terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, expresión por células recombinantes, endocitosis mediada por un receptor (véase por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico del compuesto terapéutico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitarse a ellas, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal y oral. Los compuestos se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de una sola embolada, por absorción a través de la capa de revestimiento epitelial o mucocutánea (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Adicionalmente, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención dentro del sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular y la intracatecal; la inyección intraventricular se puede facilitar mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya.

En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesita el tratamiento, ésta puede ser alcanzada, por ejemplo, y no como limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito en la herida después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como las membranas sialásticas, o fibras. En una realización, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio original) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.

En una realización específica, la administración de un compuesto terapéutico en una célula que expresa Notch se logra ligando el compuesto terapéutico a una proteína Delta (u otra proteína toporrítmica) o a una porción de la misma capaz de mediar en la unión a Notch. El contacto de la célula que expresa Notch con el compuesto terapéutico ligado da como resultado la unión del compuesto terapéutico ligado a través de su porción Delta a Notch en la superficie de la célula, seguido de la absorción del compuesto terapéutico ligado a la célula que expresa Notch.

En una realización específica en la que se emplea como un Compuesto Terapéutico un análogo de un dominio de transducción de la señal intracelular Notch, de tal modo que puede inhibir la transducción de la señal Notch, el análogo se libera preferiblemente intracelularmente (por ejemplo, por expresión de un vector de ácido nucleico, o por ligamiento a una proteína Delta capaz de unirse a Notch seguido por unión e internalización, o por mecanismos mediados por un receptor).

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En una realización específica en la que el Compuesto Terapéutico es un ácido nucleico que codifica un Compuesto Terapéutico proteínico, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para favorecer la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión del ácido nucleico adecuado y administrándolo de modo que se haga intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (véase la patente de Estados Unidos Nº 4.980.286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes, Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes transfectantes, o por administración del mismo en unión con un péptido similar a una homeosecuencia que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) etc. Alternativamente, un compuesto terapéutico de ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del DNA de la célula hospedante para la expresión, por recombinación del homólogo.

En realizaciones específicas dirigidas al tratamiento o prevención de trastornos particulares, se usan preferiblemente las siguientes formas de administración:

\underbar{Trastorno}: \underbar{Formas preferidas de administración}

Cáncer de cuello uterino: Tópica

Cáncer gastrointestinal: Oral; intravenosa

Cáncer de pulmón: Inhalada; intravenosa

Leucemia: Intravenosa; extracorporal

Carcinomas metastáticos: Intravenosa; oral

Tumor cerebral: Deseada: intravenosa; intratecal

Cirrosis hepática: Oral; intravenosa

Psoriasis: Tópica

Queloides: Tópica

Calvicie: Tópica

Lesión en la médula espinal: Deseada: intravenosa; intratecal

Enfermedad de Parkinson: Deseada: intravenosa; intratecal

Enfermedad de las neuronas motoras: Deseada: intravenosa; intratecal

Enfermedad de Alzheimer: Deseada: intravenosa; intratecal

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La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un Compuesto Terapéutico, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero sin limitarse a ellos, soluciones salinas, soluciones salinas tamponadas, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación deberá adecuarse al modo de administración.

La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes y emulsionantes, o agentes reguladores de pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación retardada, o polvo. La composición se puede formular como un supositorio, con vehículos y aglutinantes tradicionales tales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc, de calidad farmacéutica.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para mitigar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran bien separadamente o bien mezclados en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición se administra por infusión, se puede dispensar con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua para inyección o solución salina estériles de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.

Los compuestos terapéuticos de la invención se pueden formular como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio y férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad del compuesto terapéutico de la invención que será efectiva en el tratamiento de un trastorno o enfermedad particular dependerá de la naturaleza del trastorno o enfermedad, y se puede determinar por técnicas clínicas estándar. Adicionalmente, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a ser empleada en la formulación dependerá también de la vía de administración, y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y se deberá decidir de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para la administración intravenosa generalmente son aproximadamente 20-500 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación adecuados para la administración intranasal generalmente son aproximadamente de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de ensayos in vitro o en sistemas de modelos animales.

Los supositorios contienen generalmente el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10% en peso; las formulaciones orales contienen preferiblemente de 10% a 95% de ingrediente activo.

La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente, asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber un informe en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, el cual informe refleja la aprobación de la agencia para la fabricación, uso o venta para administración humana.

5.5. Regulación de la expresión de Notch por antisentido

La presente invención proporciona el uso terapéutico o profiláctico de ácidos nucleicos de al menos seis nucleótidos que son antisentido para un gen o cDNA que codifica Notch o una porción de la misma. "Antisentido" como se usa aquí se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridarse con una porción de RNA de Notch (preferiblemente mRNA) mediante alguna complementariedad de la secuencia. Tales ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como compuestos terapéuticos antagonistas de la invención, y se pueden usar en el tratamiento o prevención de trastornos como se ha descrito antes en la sección 5.1 y sus subsecciones.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser oligonucleótidos que son de doble hebra o de hebra sencilla, RNA o DNA o una modificación o derivado de los mismos, que se pueden administrar directamente a una célula, o que se pueden producir intracelularmente por transcripción de secuencias exógenas introducidas.

En una realización específica, los ácidos nucleicos antisentido Notch proporcionados por la presente invención se pueden usar para el tratamiento de tumores u otros trastornos, cuando se puede demostrar (in vitro o in vivo) que las células del tipo de tumor o trastorno expresan el gen Notch. Tal demostración puede ser por detección de RNA de Notch o de proteína Notch.

La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de los ácidos nucleicos antisentido Notch de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se ha descrito antes en la sección 5.4.

En otra realización, la invención se dirige al uso de un ácido nucleico antisentido Notch para la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de Notch en una célula procariota o eucariota que comprende proporcionar a la célula una cantidad efectiva de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido Notch de la invención.

En otra realización, la identificación de las células que expresan los receptores funcionales Notch se puede llevar a cabo observando la capacidad de Notch para "rescatar" tales células de los efectos citotóxicos de un ácido nucleico antisentido Notch.

Los ácidos nucleicos antisentido Notch y sus usos se describen en detalle a continuación.

5.5.1. Ácidos nucleicos Notch antisentido

Los ácidos nucleicos Notch antisentido tienen al menos seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos (variando de 6 a aproximadamente 50 oligonucleótidos). En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser de DNA o RNA o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de hebra sencilla o de doble hebra. El oligonucleótido se puede modificar en el resto de la base, en el resto del azúcar, o en el soporte de fosfato. El oligonucleótido puede incluir otros grupos unidos tales como péptidos, o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; Publication PCT Nº WO 88/09810, publicado el 15 de Diciembre, 1988) o de la barrera sangre-cerebro (véase, por ejemplo, Publication PCT Nº WO 89/10134, publicada el 25 de Abril, 1988), agentes de división que desencadenan la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al., 1988, Biotechniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo., Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).

En un aspecto preferido de la invención, se proporciona un oligonucleótido Notch antisentido, preferiblemente de DNA de hebra sencilla. En un aspecto más preferido, tal oligonucleótido comprende una secuencia antisentido de la secuencia que codifica ELR 11 y ELR 12 de Notch, lo más preferiblemente, de Notch humano. El ologonucleótido se puede modificar en cualquier posición de su estructura con sustituyentes generalmente conocidos en la técnica.

El oligonucleótido Notch antisentido puede comprender al menos un resto de base modificado que se selecciona del grupo que incluye, pero sin limitarse a ellos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiácetico (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina.

En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un resto de azúcar modificado seleccionado del grupo que incluye, pero sin limitarse a ellos, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

En otra realización adicional, el oligonucleótido comprende al menos un soporte de fosfato modificado seleccionado del grupo constituido por un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil-fosfo-triéster y un formacetal o sus análogos.

En otra realización adicional, el oligonucleótido es un oligonucleótido \alpha-anomérico. Un oligonucleótido \alpha-anomérico forma híbridos específicos de doble hebra con el RNA complementario en los que, al contrario que las unidades \beta usuales, las hebras corren paralelas una a la otra (Gautier et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).

El oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agentes de entrecruzamiento desencadenado por la hibridación, agentes de transporte, agentes de división desencadenada por la hibridación, etc.

Los oligonucleótidos de la invención se pueden sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, usando un sintetizador automático de DNA (tal como los disponibles comercialmente de Biosearch, Applied Biosystems, etc). Como ejemplos, los fosforotioato-oligos se pueden sintetizar por el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), los metilfosfonato-oligos se pueden preparar usando soportes poliméricos vítreos de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc.

En una realización específica, el ologonucleótido Notch antisentido comprende RNA catalítico, o una ribozima (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional PCT WO 90/11364, publicada el 4 de Octubre, 1990; Saber et al., 1990, Science 247:1222-1225). En otra realización, el oligonucleótido es un 2'-0-metilrribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), o un análogo RNA-DNA quimérico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

En una realización alternativa, el ácido nucleico Notch antisentido de la invención se produce intracelularmente por transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo de modo que sea recogido por una célula, dentro de la cual se transcribe el vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico antisentido (RNA) de la invención. Tal vector contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido Notch. Tal vector puede permanecer episómico o hacerse cromosómicamente integrado, siempre que se pueda transcribir para producir el RNA antisentido deseado. Tales vectores se pueden construir por métodos estándar de tecnología de DNA recombinante de la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en la técnica, usados para la replicación y expresión en las células de los mamíferos. La expresión de la secuencia que codifica el RNA antisentido Notch se puede hacer por cualquier promotor conocido en la técnica que actúa en células de los mamíferos, preferiblemente de los seres humanos. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero sin limitarse a ellos: la región promotora inicial SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina-quinasa del herpes (Wagner et al., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), etc.

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Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria al menos a una porción de un transcripto de RNA de un gen Notch, preferiblemente un gen Notch humano. Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque es preferida, no es necesaria. Una secuencia "complementaria al menos a una porción de un RNA", como se indica aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el RNA, formando un duplex estable; en el caso de ácidos nucleicos Notch antisentido de doble hebra, una hebra sencilla del DNA duplex se puede ensayar así, o se puede ensayar la formación de triplex. La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo sea el ácido nucleico que se hibrida, más desigualdad de bases contendrá con un RNA Notch y todavía formará un duplex estable (o triplex, como puede ser el caso). Un experto en la técnica puede comprobar un grado tolerable de desigualdad usando procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

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5.5.2. Utilidad terapéutica de los ácidos nucleicos Notch antisentido

Los ácidos nucleicos Notch antisentido se pueden usar para tratar (o prevenir) tumores malignos, de un tipo celular del que se que ha demostrado que expresa RNA Notch. Las células malignas, neoplásicas y pre-neoplásicas que se pueden ensayar para dicha expresión incluyen, peso sin limitarse a ellas, las descritas antes en las secciones 5.1.1 y 5.2.1. En una realización preferida, se usa un oligonucleótido Notch antisentido de DNA de hebra sencilla.

Los tipos de células malignas (particularmente, de tumores) que expresan RNA Notch se pueden identificar por diferentes métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero sin limitarse a ellos, hibridación con un ácido nucleico específico Notch (por ejemplo por hibridación Northern, hibridación por ensayos de transferencia, hibridación in situ), observando la capacidad del RNA del tipo de célula para ser traducido in vitro a Notch, etc. En un aspecto preferido, se puede ensayar tejido de tumor primario de un paciente para la expresión de Notch antes del tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la invención (véase sección 5.1.4), que comprenden una cantidad efectiva de un ácido nucleico antisentido Notch en un vehículo fartmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un paciente que tiene un tumor maligno que es de un tipo que expresa RNA Notch.

La cantidad de ácido nucleico Notch antisentido que será efectiva en el tratamiento de un trastorno o enfermedad particular dependerá de la naturaleza del trastorno o enfermedad, y se puede determinar por técnicas clínicas estándar. Cuando es posible, es deseable determinar la citotoxicidad antisentido del tipo de tumor a ser tratado in vitro, y después en sistemas de modelos animales útiles antes de ensayarlo y usarlo en humanos.

En una realización específica, las composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos antisentido Notch se pueden administrar por medio de liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En diferentes realizaciones de la invención, puede ser útil usar tales composiciones para lograr la liberación retardada de los ácidos nucleicos antisentido Notch. En una realización específica, puede ser deseable utilizar liposomas marcados por anticuerpos para antígenos específicos de un tumor identificable (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).

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5.6. Utilidad para el diagnóstico

Las proteínas Notch, los análogos, derivados y secuencias de las mismas, los ácidos nucleicos Notch (y las secuencias complementarias de los mismos) y los anticuerpos anti-Notch tienen usos para diagnóstico. Tales moléculas se pueden usar en ensayos, tales como inmunoensayos, para detectar, pronosticar, diagnosticar, o verificar diferentes estados patológicos, enfermedades, y trastornos que afectan a la expresión de Notch, o hacer seguimiento del tratamiento de los mismos. En particular, tal inmunoensayo se lleva a cabo por un método que comprende poner en contacto una muestra derivada de un paciente con un anticuerpo anti-Notch en condiciones tales que pueda tener lugar la unión inmunoespecífica, y detectar o medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En una realización específica, se puede usar el anticuerpo frente a Notch para ensayar en un tejido de un paciente o en una muestra de suero la presencia de Notch cuando un nivel anormal de Notch es una indicación de una enfermedad.

Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitación, reacción de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de la proteína A, por nombrar unos pocos.

Los genes Notch y las secuencias y subsecuencias de ácido nucleico relacionadas, incluyendo las secuencias complementarias, y otras secuencias genéticas toporrítmicas, se pueden usar también en ensayos de hibridación. Las secuencias de ácidos nucleicos Notch, o las subsecuencias de las mismas que comprenden al menos 8 nucleótidos, se pueden usar como sondas de hibridación. Los ensayos de hibridación se pueden usar para detectar, pronosticar, diagnosticar o verificar estados patológicos, trastornos, o enfermedades asociados con cambios anormales en la expresión y/o actividad Notch como se ha descrito antes. En particular, tal ensayo de hibridación se lleva a cabo por un método que comprende poner en contacto una muestra que contiene ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con el DNA o RNA Notch, en condiciones tales que la hibridación pueda tener lugar, y detectar o medir cualquier hibridación resultante.

Como se detalla en los ejemplos de la sección 10.1 más adelante, el aumento de la expresión de Notch tiene lugar en los cánceres de mama, colon y de cuello uterino. Por consiguiente, en realizaciones específicas, los cánceres de mama, colon o de cuello uterino o los cambios premalignos en tales tejidos se diagnostican detectando el aumento de la expresión de Notch (o cantidad) en muestras de pacientes en relación al nivel de expresión de Notch (o cantidad) en una muestra análoga no maligna, o no premaligna, como pueda ser el caso (de un paciente u otra persona, que se determina experimentalmente o que se conoce como un nivel estándar en tales muestras).

En otra realización, la proteína Notch (o un derivado que tiene antigenidad Notch) que se detecta o se mide está en la superficie celular. En otra realización, la proteína Notch (o derivado) es una molécula soluble libre de células (por ejemplo, cuando se mide en una muestra de sangre o suero) o es intracelular. Sin intención de limitarse de forma mecánica, se cree que las moléculas Notch libres de células puedan provenir de la secreción o desprendimiento desde la superficie celular. En otra realización adicional, se detectan o se miden cantidades solubles, de la superficie celular e intracelulares de proteína Notch o derivados.

5.7. Ácidos nucleicos Notch

Los compuestos terapéuticos de la invención que son ácidos nucleicos Notch o ácidos nucleicos Notch antisentido, así como ácidos nucleicos que codifican Compuestos Terapéuticos proteínicos, incluyen los descritos más adelante, que se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica, y en particular, como se describe más adelante.

En aspectos particulares, la invención proporciona secuencias de aminoácidos Notch, preferiblemente Notch humano, y sus fragmentos y derivados que comprenden un determinante antigénico (es decir, que pueden ser reconocidos por un anticuerpo) o que son funcionalmente activos, así como secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores. Material "funcionalmente activo", como se usa aquí, se refiere al material que muestra una o más actividades funcionales conocidas asociadas con el producto proteínico Notch de longitud completa (tipo natural), por ejemplo, que se une a Delta, que se une a Serrate, que se une a cualquier otro ligando Notch, antigenidad (unión a un anticuerpo anti-Notch), etc.

En realizaciones específicas, la invención proporciona fragmentos de una proteína Notch que consta al menos de 40 aminoácidos, o al menos de 75 aminoácidos. En otras realizaciones, las proteínas comprenden o constan esencialmente del dominio intracelular, la región transmembranal, el dominio extracelular, la región cdc10, las repeticiones
Notch/lin-12, o las repeticiones homólogas del EGF, o cualquier combinación de los anteriores, de una proteína Notch. También se proporcionan los fragmentos, o los fragmentos que comprenden proteínas, que carecen de algunas o todas las repeticiones homólogas del EGF de Notch. Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican los anteriores.

En otras realizaciones específicas, la invención proporciona secuencias y subsecuencias de nucleótidos de Notch, preferiblemente Notch humano, que consta al menos de 25 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, o al menos 150 nucleótidos. Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican las proteínas y los fragmentos proteínicos descritos antes, así como los ácidos nucleicos complementarios a dichos ácidos nucleicos y capaces de hibridarse con los mismos. En una realización, tal secuencia complementaria puede ser complementaria de una secuencia de cDNA Notch con al menos 25 nucleótidos, o con al menos 100 nucleótidos. En un aspecto preferido, la invención utiliza secuencias de cDNA que codifican Notch humano o una de sus porciones. En una realización específica, tales secuencias del gen o cDNA Notch humano están contenidas en los plásmidos hN3k, hN4k, o hN5k (véase la sección 9, más adelante) o en el gen que corresponde a ellos; tal secuencia de la proteína Notch humana puede ser como se muestra en las Figuras 10 (SEQ ID NO: 11) o 11 (SEQ ID NO: 13). En otras realizaciones, el ácido nucleico Notch y/o su proteína codificada tiene al menos una porción de la secuencia que se muestra en una de las siguientes publicaciones: Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581 (Notch de Drosophila); Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:3094-3108 (Notch de Drosophila); Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441 (Notch de Xenopus); Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-661 (un Notch humano). En otro aspecto, las secuencias de Notch humano son las que codifican las secuencias de aminoácidos Notch humanos o una porción de las mismas como se muestra en la Figura 13. En un aspecto particular, las secuencias de Notch humano son las del homólogo hN (representado en parte por el plásmido hN5k) o del homólogo TAN-1.

En una realización de la invención, la invención se refiere a la proteína Notch humana de longitud completa codificada por el homólogo hN como se describe en la Figura 13, conteniendo ambos la secuencia señal (es decir, la proteína precursora; aminoácidos 1-2169) y careciendo de secuencia señal (es decir, la proteína madura; aminoácidos \sim26-2169), así como porciones de los anteriores (por ejemplo, el dominio extracelular, la región de repetición homóloga del EGF, las repeticiones 11 y 12 semejantes al EGF, las repeticiones cdc10/anquirina, etc) y las proteínas que comprenden los anteriores, así como los ácidos nucleicos que codifican los anteriores.

Como se puede ver fácilmente, como se usa aquí, un "ácido nucleico que codifica un fragmento o porción de una proteína Notch" se debe construir en referencia a un ácido nucleico que codifica sólo el citado fragmento o porción de la proteína Notch y no otras porciones de la proteína Notch.

En un aspecto preferido, pero no limitante, de la invención, una secuencia de DNA de Notch humano se puede clonar y secuenciar por el método descrito en la sección 9, más adelante.

En otro aspecto preferido, se usa la PCR para amplificar la secuencia deseada en la genoteca, antes de la selección. Por ejemplo, los cebadores del oligonucleótido que representan parte de los dominios adhesivos codificados por un homólogo del gen deseado se pueden usar como cebadores en la PCR.

Los métodos anteriores no pretenden limitar la siguiente descripción general de métodos por los cuales se pueden obtener clones de Notch.

Cualquier célula eucariota puede servir potencialmente como la fuente de ácidos nucleicos para la clonación molecular del gen Notch. Se puede obtener el DNA por procedimientos estándar conocidos en la técnica a partir de DNA clonado (por ejemplo, una "genoteca" de DNA), por síntesis química, por clonación de cDNA, o por clonación de DNA genómico, o sus fragmentos, purificados a partir de las células humanas deseadas (véase, por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2d. Ed., Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. I, II). Los clones derivados de DNA genómico pueden contener regiones reguladoras y de intrones de DNA además de regiones de codificación; los clones derivados de cDNA contendrán sólo secuencias de exones. Cualquiera que sea la fuente, el gen debe ser clonado molecularmente dentro de un vector adecuado para la propagación del gen.

En la clonación molecular del gen a partir de DNA genómico, se generan fragmentos de DNA, algunos de los cuales codificarán el gen deseado. El DNA puede ser escindido en sitios específicos usando diferentes enzimas de restricción. Alternativamente, se puede usar DNAsa en presencia de manganeso para fragmentar el DNA, o el DNA se puede cortar físicamente, como por ejemplo, por ultrasonidos. Los fragmentos lineales de DNA se pueden separar según el tamañó por técnicas estándar, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, electroforesis en gel de poliacrilamida y agarosa y cromatografía en columna.

Una vez que se han generado los fragmentos de DNA, la identificación del fragmento de DNA específico que contiene el gen deseado se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, si una cantidad o una porción de un gen Notch (de cualquier especie) o su RNA específico, o uno de sus fragmentos, por ejemplo, el dominio adhesivo, está disponible y se puede purificar y marcar, los fragmentos de DNA generados se pueden seleccionar por hibridación del ácido nucleico con la sonda marcada (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 3961). Los fragmentos de DNA con homología sustancial con la sonda se hibridarán. También es posible identificar el fragmento apropiado por digestión con la enzima de restricción y por comparación de los tamaños de los fragmentos con los esperados según un mapa de restricción conocido si éste está disponible. Se puede llevar a cabo una selección adicional basándose en las propiedades del gen. Alternativamente, se puede detectar la presencia del gen por ensayos basados en propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los clones de cDNA, o los clones de DNA cuyo hibrido es selector de los mRNA apropiados, se pueden seleccionar los que producen una proteína que, por ejemplo, tiene similar o idéntica migración electroforética, comportamiento por isoelectroenfoque, mapas de digestión proteolítica, actividad de agregación in vitro ("adhesividad") o propiedades antigénicas que se conocen para Notch. Si está disponible un anticuerpo frente a Notch, la proteína Notch se puede identificar uniendo el anticuerpo marcado a los clones que sintetizan Notch putativamente, en un procedimiento tipo ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas).

El gen Notch se puede identificar también por selección de mRNA por hibridación del ácido nucleico seguido por traducción in vitro. En este procedimiento, se usan fragmentos para aislar los mRNA complementarios por hibridación. Tales fragmentos de DNA pueden representar DNA Notch purificado y disponible de otras especies (por ejemplo, Drosophila). Los análisis de inmunoprecipitación o ensayos funcionales (por ejemplo, capacidad de agregación in vitro; véase los ejemplos más adelante) o los productos de traducción in vitro o de los productos aislados de los mRNA aislados identifican el mRNA y, por tanto, los fragmentos de DNA complementarios que contienen las secuencias deseadas. Adicionalmente, se pueden seleccionar mRNA específicos por adsorción de polisomas aislados a partir de células para inmovilizar anticuerpos dirigidos específicamente contra la proteína Notch o Delta. Se puede sintetizar un cDNA Notch radiomarcado usando el mRNA seleccionado (procedente de los polisomas adsorbidos) como un patrón. Se puede usar después el mRNA o cDNA radiomarcados como una sonda para identificar los fragmentos de DNA Notch de los fragmentos de DNA genómico, entre otros.

Alternativas para aislar el DNA genómico Notch incluyen, pero sin limitarse a ellas, sintetizar químicamente la propia secuencia del gen a partir de una secuencia conocida o preparar cDNA del mRNA que codifica el gen Notch. Por ejemplo, se puede aislar el RNA para la clonación del cDNA del gen Notch a partir de células que expresan Notch. Son posibles otros métodos dentro del alcance de la invención.

El gen identificado y aislado se puede insertar entonces dentro de un vector de clonación apropiado. Se pueden usar un gran número de sistemas vector-hospedante conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin limitarse a ellos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedante usada. Tales vectores incluyen, pero sin limitarse a ellos, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como los derivados plásmidos PBR322 o pUC. La inserción dentro de un vector de clonación puede lograrse, por ejemplo, ligando el fragmento de DNA a un vector de clonación que tiene terminaciones cohesivas complementarias. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el DNA no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de DNA se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (ligantes) sobre las terminaciones de DNA: estos ligantes unidos pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen Notch se pueden modificar por restos homopoliméricos. Se pueden introducir moléculas recombinantes en las células hospedantes por medio de transformación, transfección, infección, electroporación, etc, de modo que se generan muchas copias de la secuencia del gen.

En un método alternativo, el gen deseado se puede identificar y aislar después de la inserción en un vector de clonación adecuado con un método de secuenciación aleatoria "shot gun". El enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo, por fraccionamiento por tamaños, se puede realizar antes de la inserción en el vector de clonación.

En realizaciones específicas, la transformación de las células hospedantes con moléculas de DNA recombinante que incorporan el gen Notch aislado, el cDNA, o las secuencias de DNA sintetizadas permite la generación de múltiples copias del gen. Por tanto, se puede obtener el gen en grandes cantidades por cultivo de transformantes, aislamiento de las moléculas de DNA recombinante a partir de los transformantes y, cuando es necesario, recuperación del gen insertado a partir del DNA recombinante aislado.

Las secuencias Notch proporcionadas por la presente invención incluyen las secuencias de nucleótidos que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácidos que las encontradas en la proteína Notch nativa, y las secuencias de aminoácidos codificadas con aminoácidos funcionalmente equivalentes, todo como se describe en la sección 5.6 más adelante para los derivados Notch.

5.8. Producción recombinante de compuestos terapéuticos proteínicos

El ácido nucleico que codifica un compuesto terapéutico de la invención se puede insertar en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencias insertadas que codifican la proteína. Las señales de transcripción y traducción necesarias se pueden suministrar también por un gen toporrítmico nativo y/o sus regiones flanqueantes. Se pueden utilizar una variedad de sistemas hospedante-vector para expresar la secuencia que codifica la proteína. Estos incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de células de mamíferos infectadas con un virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc); sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con bacteriófagos, DNA, plásmido de DNA, o cósmido de DNA. Los elementos de expresión de los vectores varían en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema hospedante-vector utilizado, se puede usar cualquiera de una serie de elementos de transcripción y traducción. En una realización específica, se expresa la porción adhesiva del gen Notch, por ejemplo, la que codifica las repeticiones 11 y 12 semejantes al EGF (ELR). En otras realizaciones específicas, se expresa el gen Notch humano, o una secuencia que codifica una porción funcionalmente activa de Notch humano.

Se pueden usar cualquiera de los métodos descritos antes para la inserción de los fragmentos de DNA en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consta de las señales apropiadas de control transcripcional/de traducción y las secuencias que codifican la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas de DNA recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Notch o un fragmento de péptido se puede regular por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína o péptido Notch se expresa en un hospedante transformado con la molécula de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína Notch se puede controlar por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden usar para controlar la expresión del gen toporrítmico incluyen, pero sin limitarse a ellos, la región promotora inicial SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290, 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22, 787-797), el promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296, 39-429); los vectores de expresión procariotas tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242, 74-94; vectores de expresión de plantas que comprenden la región promotora de la nopalina-sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) o el promotor RNA 35S del virus de mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa-bifosfato-carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310, 115-120); los elementos promotores procedentes de levaduras o de otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol-deshidrogenasa), el promotor PGK (fosfoglicerol-quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional de animales, que presentan especificidad tisular y que se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen I de la elastasa que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38, 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7, 425-515); la región de control del gen de la insulina que es activa en la células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315, 115-122), la región de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38, 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318, 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436-1444), la región de control del virus del tumor de mama de ratón que es activa en las células testiculares, de la mama, linfoides y células cebadas, (Leder et al., 1986, Cell 45, 485-495), la región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1, 268-276), la región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235, 53-58); la región de control del gen de la alfa-1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1, 161-171), la región de control del gen de la beta-globina que es activa en la células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315, 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46, 89-94); la región de control de la proteína básica de mielina que es activa en las células oligodendrocitas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48, 703-712); la región de control del gen de la cadena-2 ligera de la miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314, 283-286), y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234, 1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen insertos del gen Notch se pueden identificar por tres métodos generales: (a) hibridación del ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones del gen "marcador", y (c) expresión de las secuencias insertadas. En el primer método, la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión se puede detectar por hibridación del ácido nucleico usando sondas que comprenden las secuencias que son homólogas a un gen toporrítmico insertado. En el segundo método, se puede identificar y seleccionar el sistema vector/hospedante basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad de la timidina-quinasa, resistencia a los antibióticos, transformación del fenotipo, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc) causadas por la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si el gen Notch se inserta en la secuencia del gen marcador del vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen el inserto Notch por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer método, los vectores recombinantes de expresión se pueden identificar ensayando el producto del gen extraño expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto del gen Notch en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, capacidad de agregación (adhesiva) (véanse secciones 6-7, más adelante).

Una vez que se identifica y se aísla una molécula de DNA recombinante particular, se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se establecen el sistema hospedante adecuado y las condiciones de crecimiento, los vectores de expresión recombinante se pueden propagar y preparar en cantidad. Como se ha explicado antes, los vectores de expresión que se pueden usar incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tal como baculovirus; vectores de levaduras; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores plásmidos y cósmidos de DNA, por nombrar unos pocos.

Adicionalmente, se puede elegir una cepa de células hospedantes que modulan la expresión de las secuencias insertadas, o que modifican y procesan el producto del gen de un modo específico deseado. Se puede elevar la expresión a partir de ciertos promotores en presencia de ciertos inductores; por tanto, se puede controlar la expresión de la proteína Notch obtenida por ingeniería genética. Además, diferentes células hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para el tratamiento y modificación de traducción y post-traducción (por ejemplo, glucosilación, escisión) de las proteínas. Se pueden elegir líneas de células o sistemas hospedantes apropiados para asegurar la modificación y tratamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, se puede usar la expresión en un sistema bacteriano para producir un producto proteínico de núcleo no glucosilado. La expresión en levaduras producirá un producto glucosilado. Se puede usar la expresión en células de mamíferos para asegurar la glucosilación "nativa" de una proteína toporrítmica de mamífero heteróloga. Además, diferentes sistemas de expresión vector/hospedante pueden efectuar reacciones de tratamiento tales como escisiones proteolíticas en diferente extensión.

En otras realizaciones específicas, la proteína Notch, fragmentos, análogos, o derivados se pueden expresar como un producto proteínico de fusión, o quimérico (que comprende la proteína, el fragmento, análogo o derivado unido por medio de un enlace peptídico a una secuencia de proteína heteróloga (de una proteína diferente)). Tal producto quimérico se puede preparar ligando unas a otras las secuencias del ácido nucleico apropiado que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación adecuado, y expresando el producto quimérico por métodos comúnmente conocidos en la técnica. Alternativamente, tal producto quimérico se puede preparar por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, usando un sintetizador peptídico.

Tanto el cDNA como las secuencias genómicas se pueden clonar y expresar.

En otras realizaciones, se puede integrar y expresar cromosómicamente una secuencia de cDNA Notch. Se pueden usar los procedimientos de recombinación homóloga conocidos en la técnica.

5.8.1. Identificación y purificación del producto génico expresado

Una vez que se ha identificado un recombinante que expresa la secuencia del gen Notch, se puede analizar el producto génico. Esto se puede lograr por ensayos basados en las propiedades físicas y funcionales del producto, incluyendo marcado radioactivo del producto seguido por análisis por electroforesis en gel.

Una vez que se ha identificado la proteína Notch, se puede aislar y purificar por métodos estándar que incluyen cromatografía (por ejemplo, de cambio iónico, de afinidad, y cromatografía de exclusión molecular en columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las propiedades funcionales se pueden evaluar usando cualquier ensayo adecuado incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ensayos de agregación (véanse las secciones 6-7).

5.9. Derivados y análogos de proteínas Notch y otras proteínas toporrítmicas

La invención proporciona además, como compuestos terapéuticos, derivados (incluyendo, pero sin limitarse a ellos, fragmentos) y análogos de proteínas Notch.

La producción y el uso de derivados y análogos relacionados con Notch está dentro del alcance de la presente invención. En una realización específica, el derivado o análogo es funcionalmente activo, es decir, capaz de mostrar una o más actividades funcionales asociadas con una proteína Notch, natural, de longitud completa. Como un ejemplo, se pueden usar derivados o análogos tales que tienen la antigenidad deseada, por ejemplo, en inmunoensayos de diagnóstico como se describe en la sección 5.3. Las moléculas que mantienen, o alternativamente inhiben, una propiedad Notch deseada, por ejemplo, unión a Delta o a otras proteínas toporrítmicas, unión a un ligando intracelular, se pueden usar terapeúticamente como inductores, o inhibidores, respectivamente, de tal propiedad y sus propiedades fisiológicas relacionadas. Se pueden ensayar los derivados y análogos de Notch en cuanto a la actividad deseada por procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los ensayos descritos más adelante. En una realización específica, se puede hacer un cribado de las genotecas de péptidos para seleccionar un péptido con la actividad deseada, tal cribado se puede realizar ensayando, por ejemplo, la unión a Notch.

En particular, los derivados Notch se pueden preparar alterando las secuencias Notch por sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias codificadoras de nucleótidos, se pueden usar en la práctica de la presente invención otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen Notch. Éstas incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias de nucleótidos que comprenden el total o porciones de genes Notch que están alterados por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo, por tanto, un cambio silencioso. Asimismo, los derivados Notch de la invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, los que contienen como secuencia de aminoácidos primaria toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína Notch incluyendo las secuencias alteradas en las que los residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos por residuos dentro de la secuencia, que dan como resultado un cambio silencioso. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden estar sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina,
lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Los derivados o análogos de Notch incluyen, pero sin limitarse a ellos, péptidos que son sustancialmente homólogos a Notch o sus fragmentos, o cuyo ácido nucleico de codificación es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico Notch.

Los derivados y análogos Notch de la invención se pueden producir por diferentes métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan como resultado su producción pueden tener lugar a nivel del gen o de la proteína. Por ejemplo, la secuencia del gen Notch clonada se puede modificar por cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). La secuencia se puede escindir en los sitios apropiados con la endonucleasa(s) de restricción, seguido de modificación enzimática adicional si se desea, aislamiento y ligamiento in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de Notch, se debe tener cuidado de asegurar que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura de traducción que Notch, ininterrumpido por señales de parada de la traducción, en la región génica donde la actividad Notch deseada está codificada.

Adicionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica Notch se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificadoras y/o formar nuevos sitios para la endonucleasa de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar además la modificación in vitro. Se puede usar cualquier método de mutagénesis conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), el uso de ligantes TAB® (Pharmacia), etc.

Las manipulaciones de la secuencia Notch se pueden preparar también a nivel de la proteína. Dentro del alcance de la invención están incluidos los fragmentos de proteína Notch u otros derivados o análogos, que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas que incluyen, pero sin limitarse a ellas, escisión química específica por bromuro cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.

Adicionalmente, los análogos y derivados de Notch se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos se puede sintetizar un péptido que corresponde a una porción de una proteína Notch que comprende el dominio deseado, que media en la actividad de agregación deseada in vitro, o que se une a un receptor. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos o análogos de aminoácidos químicos no clásicos como una sustitución o adición en la secuencia Notch. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido \alpha-amino-isobutírico, ácido 4-aminobutírico, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina, aminoácidos diseñadores tales como los \beta-metil-aminoácidos, C\alpha-metil-aminoácidos, y N\alpha-metil-aminoácidos.

En una realización específica, el derivado Notch es una proteína quimérica, o de fusión, que comprende una proteína Notch o su fragmento fusionado por medio de un enlace péptidico en su amino- y/o carboxi-terminal a una secuencia de aminoácidos no Notch. En una realización, tal proteína quimérica se produce por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína (que comprende una secuencia de codificación Notch unida en el marco a una secuencia de codificación no Notch). Tal producto quimérico se puede preparar ligando unas con otras las secuencias apropiadas de ácidos nucleicos que codifican las secuencias deseadas de aminoácidos por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación apropiado, y expresando el producto quimérico por métodos comúnmente conocidos en la técnica. Alternativamente, tal producto quimérico se puede preparar por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos. En una realización específica, un ácido nucleico quimérico que codifica una proteína Notch madura con una secuencia señal heteróloga se expresa de modo que la proteína quimérica se expresa y procesa por la célula hasta la proteína Notch madura. Como otro ejemplo, pero no a modo de limitación, se puede construir una molécula recombinante según la invención, que comprende porciones de codificación tanto de Notch como de otro gen toporrítmico, por ejemplo, Delta. La proteína codificada de tal molécula recombinante puede presentar propiedades asociadas tanto con Notch como con Delta y mostrar un nuevo perfil de actividades biológicas, incluyendo las agonistas así como las antagonistas. Se puede usar también la secuencia primaria de Notch y Delta para predecir la estructura terciaria de las moléculas usando una simulación por ordenador (Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:3824-3828); los genes recombinantes quiméricos Notch/Delta se pueden diseñar de acuerdo con las correlaciones entre la estructura terciaria y la función biológica. Asimismo, se pueden construir los genes quiméricos que comprenden porciones de Notch fusionadas con cualquier secuencia heteróloga que codifica una proteína (no Notch). Una realización específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de Notch de al menos seis aminoácidos.

En otra realización específica, el derivado Notch es un fragmento de Notch que comprende una región de homología con otra proteína toporrítmica. Como se usa aquí, una región de una primera proteína se debe considerar "homóloga" con una segunda proteína cuando la secuencia de aminoácidos de la región tiene al menos un 30% de identidad o tiene al menos un 75% de identidad o incluye cambios conservadores, cuando se compara con cualquier secuencia de la segunda proteína de igual número de aminoácidos que el número contenido en la región.

5.9.1. Derivados de Notch que contienen uno o más dominios de la proteína

En una realización específica, la invención proporciona compuestos terapéuticos que son derivados y análogos Notch, en particular fragmentos Notch y derivados de tales fragmentos, que comprenden uno o más dominios de la proteína Notch, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, el dominio extracelular, el dominio transmembranal, el dominio intracelular, la región asociada a la membrana, una o más repeticiones semejantes al EGF (ELR) de la proteína Notch, las repeticiones cdc10, y las repeticiones Notch/lin-12. En realizaciones específicas, el derivado Notch puede carecer de todas o una porción de las ELR, o de una o más de otras regiones de la proteína.

En una realización específica, que se refiere a una proteína Notch de una especie distinta de D. melanogaster, preferiblemente humana, los fragmentos que comprenden porciones específicas de Notch son los que comprenden porciones de la proteína Notch respectiva, la mayoría homólogos a fragmentos específicos de la proteína Notch de Drosophila (por ejemplo, ELR 11 y ELR 12).

5.9.2. Derivados de Notch o de otras proteínas toporrítmicas que median en la unión a dominios proteínicos toporrítmicos, y sus inhibidores

La invención proporciona también fragmentos Notch, y análogos o derivados de tales fragmentos, que median en la unión a proteínas toporrítmicas (y por tanto denominados aquí "adhesivos"), y secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anteriores.

Están incluidos también como compuestos terapéuticos de la invención inhibidores (por ejemplo, inhibidores peptídicos) de las interacciones de las proteínas toporrítmicas anteriores con Notch.

La capacidad para unirse a una proteína toporrítmica se puede demostrar por ensayos de agregación in vitro con células que expresan tal proteína toporrítmica así como con células que expresan Notch o un derivado Notch (véase la sección 6). Esto es, la capacidad de un fragmento de proteína para unirse a una proteína Notch se puede demostrar detectando la capacidad del fragmento, cuando se expresa sobre la superficie de una primera célula, de unirse a una proteína Notch expresada sobre la superficie de una segunda célula. Los inhibidores de las interacciones anteriores se pueden detectar por su capacidad de inhibir tal agregación in vitro.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas toporrítmicas o sus dominios adhesivos se pueden aislar a partir de fuentes humanas, porcinas, bovinas, felinas, avícolas, equinas, caninas o de insectos, así como de primates y cualquier otra especie en la que se pueden identificar homólogos de genes toporrítmicos conocidos.

En una realización específica, el fragmento adhesivo de Notch es el que comprende la porción de Notch más homóloga con ELR 11 y 12, es decir, los aminoácidos número 447 a 527 (SEQ ID NO:14) de la secuencia Notch de la Drosophila (véase la Figura 4).

Debido a la degeneración de las secuencias codificadoras de los nucleótidos, se pueden usar en la práctica de la presente invención otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que las secuencias adhesivas. Estas incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias de nucleótidos que comprenden todo o porciones del gen Notch que están alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo por tanto un cambio silencioso. Asimismo, los fragmentos de proteína adhesiva, o sus derivados, de la invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, los que contienen como una secuencia primaria de aminoácidos, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de los dominios adhesivos incluyendo las secuencias alteradas en las que los residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos por residuos dentro de la secuencia, dando como resultado un cambio silencioso.

Los fragmentos adhesivos de las proteínas toporrítmicas y los derivados, análogos o péptidos potenciales relacionados con las secuencias de la proteína toporrítmica adhesiva, se pueden ensayar en cuanto a la actividad de unión deseada, por ejemplo, por ensayos de agregación in vitro descritos en los ejemplos de esta memoria. Los derivados adhesivos o los análogos adhesivos de los fragmentos adhesivos de las proteínas toporrítmicas incluyen, pero sin limitarse a ellos, los péptidos que son sustancialmente homólogos con los fragmentos adhesivos, o cuyo ácido nucleico codificador es capaz de hibridarse con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica los fragmentos adhesivos, y cuyos péptidos y análogos de péptidos tienen actividad de unión positiva, por ejemplo, como se ensaya in vitro por un ensayo de agregación tal como se describe en los ejemplos de las secciones posteriores. Tales derivados y análogos se consideran como Compuestos Terapéuticos y están dentro del alcance de la presente invención.

Se pueden producir derivados, análogos y péptidos de la invención relacionados con la proteína adhesiva por diferentes métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan como resultado su producción pueden tener lugar a nivel del gen o de la proteína (véase la sección 5.6).

Adicionalmente, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína adhesiva se puede mutar in vitro o in vivo; y se pueden hacer también manipulaciones de la secuencia adhesiva a nivel de la proteína (véase la sección 5.6).

Adicionalmente, se pueden sintetizar químicamente los análogos y los péptidos relacionados con los fragmentos adhesivos.

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5.10. Ensayos de las proteínas, derivados y análogos Notch

La actividad in vitro de las proteínas, derivados y análogos Notch, y de otras proteínas toporrítmicas que se unen a Notch, se puede ensayar por diferentes métodos.

Por ejemplo, en una realización, donde se está ensayando la capacidad para unirse o competir con Notch natural en cuanto a la unión con un anticuerpo anti-Notch, se pueden usar diferentes inmunoensayos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a ellos, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, enzimas o marcado con radioisótopos, por ejemplo), transferencia Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de la proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión al anticuerpo se detecta observando una marca en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta observando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.

En otra realización, cuando se está ensayando la capacidad para mediar en la unión a Notch, se puede llevar a cabo un ensayo de agregación in vitro tal como se describe más adelante en las secciones 6 ó 7 (véase también Fehon et al., 1990, Cell 61:523-534, Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699).

En otra realización, cuando se identifica otro ligando para Notch, se puede ensayar la unión del ligando, por ejemplo, por ensayos de unión bien conocidos en la técnica. En otra realización, se pueden ensayar los efectos fisiológicos resultantes de la unión del ligando a las células que expresan un receptor Notch (señal de transducción).

En otra realización, en insectos u otros sistemas de modelos, se pueden realizar estudios genéticos para estudiar el efecto fenotípico de un mutante Notch que es un derivado o análogo de Notch natural.

Otros métodos serán conocidos para los expertos en la técnica y están dentro del alcance de la invención.

5.11. Anticuerpos frente a proteínas, derivados y análogos Notch

Según una realización de la invención, los anticuerpos y los fragmentos que contienen su dominio de unión dirigido contra Notch son Compuestos Terapéuticos. Por consiguiente, las proteínas Notch, los fragmentos o análogos o derivados de las mismas, en particular, las proteínas Notch humanas o sus fragmentos, se pueden usar como inmunógenos para generar anticuerpos anti-proteína Notch. Tales anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, o procedentes de una colección de expresión Fab. En una realización específica, se pueden preparar anticuerpos específicos de las repeticiones 11 y 12 de Notch semejantes al EGF. En otras realizaciones, se pueden generar anticuerpos reactivos con el dominio extracelular de Notch. Un ejemplo de tales anticuerpos puede evitar la agregación en un ensayo in vitro. En otra realización, se producen anticuerpos específicos frente a Notch humano.

Se pueden usar diferentes procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente a una proteína o péptido Notch. En una realización particular, se pueden obtener anticuerpos policlonales de conejo frente a un epítope de una proteína Notch humana codificada por una secuencia representada en las Figuras 10 ó 11, o una de sus subsecuencias. Para la producción del anticuerpo, se pueden inmunizar diferentes animales hospedantes por inyección con la proteína Notch nativa, o con una versión sintética, o uno de sus fragmentos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden usar diferentes auxiliares para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, que incluye, pero sin limitarse a ellos, Freund's (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa boca llave, dinitrofenol, y auxiliares humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y corinebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la secuencia de la proteína Notch, se puede usar cualquier técnica que de lugar a la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de las células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72) y la técnica del EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96).

Se pueden generar por técnicas conocidas fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo (dominio de unión) de la molécula. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse a ellos: el fragmento F(ab')_{2} que se puede producir por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, y los fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado se puede lograr por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen el dominio adhesivo de una proteína Notch, se pueden ensayar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de proteína que contiene dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo específico frente a Notch humano, se puede seleccionar basándose en la unión positiva a Notch humano y en la ausencia de unión a Notch de Drosophila.

Adicionalmente a la utilidad terapéutica, los anticuerpos anteriores tienen utilidad en inmunoensayos de diagnóstico como se describe en la sección 5.6 anterior.

Se pueden usar procedimientos similares a los descritos antes para preparar los Compuestos Terapéuticos que son anticuerpos frente a dominios de otras proteínas (particularmente proteínas toporrítmicas) que se unen o interactúan de otro modo con Notch (por ejemplo, fragmentos adhesivos de Delta o Serrate).

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6. Dominios de Notch que median en la unión con Delta

Se detectó la asociación intermolecular entre los productos de los genes Notch y Delta estudiando los efectos de su expresión en la agregación en las células (S2) 2 de Schneider de Drosophila (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523-534). Se describen aquí datos directos de las interacciones intermoleculares entre Notch y Delta, así como un sistema de ensayo que se puede usar en la disección de los componentes de esta interacción. Las células cultivadas S2 de Drosophila normalmente no adhesivas que expresan Notch se unen específicamente de una manera calcio-dependiente a células que expresan Delta. Además, mientras que las células que expresan Notch no se unen unas a otras, las células que expresan Delta se unen unas a otras, lo que sugiere que Notch y Delta puede competir por la unión a Delta en la superficie celular. Notch y Delta forman complejos solubles en detergente tanto en células cultivadas como en células embriónicas, lo que sugiere que Notch y delta interactúan directamente a nivel molecular in vitro e in vivo. Los análisis sugieren que las proteínas Notch y Delta interactúan en la superficie celular por medio de sus dominio
extracelulares.

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6.1. Procedimientos experimentales 6.1.1. Estructuras artificiales de expresión

Las estructuras artificiales de expresión se describen en Fehon et al., 1990, Cell 61:523-534. Brevemente, Notch codificado por el minigen MgIIa, un cDNA de una estructura artificial quimérica genómica (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348) se expresó después de la inserción en pRmHa-3 (Bunch et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). En la estructura artificial resultante, designada pMtNMg, el promotor de metalotioneína en pRmHa-3 se fusiona a las secuencias Notch empezando por los nucleótidos 20 hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la traducción.

La estructura artificial Notch extracelular (ECN1), se derivó de un cósmido Notch (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348), y tiene una deleción interna de las secuencias de codificación Notch desde los aminoácidos 1790 hasta 2625 inclusive (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581), y una variación del marco previsible que produce un nuevo aminoácido 59 desde carboxilo terminal.

Para la estructura artificial de expresión de Delta, el cDNA D11 (Kopcynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735; Figura 1; SEQ ID NO:1), que incluye la capacidad de codificación completa para Delta, se insertó dentro del sitio EcoRI de pRmHa-3. Esta estructura artificial se llamó pMTD11.

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6.1.2. Preparación de anticuerpos

La línea celular del hibridoma C17.9C6 se obtuvo a partir de un ratón inmunizado con una proteína de fusión basada en un fragmento SaII-HindIII de 2,1 kb que incluye secuencias de codificación para la mayoría del dominio intracelular de Notch (aminoácidos 1791-2504; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581). El fragmento se subclonó en pUR289 (Ruther and Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794), y después se tranfirió dentro del vector de expresión pATH 1 (Dieckmann and Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520) como un fragmento BgIII-HindIII. Se expresó la proteína de fusión soluble, se precipitó con (NH_{4})_{2}SO_{4} al 25%, se resuspendió en urea 6M, y se purificó por isoelectroenfoque preparativo usando un Rotofor (Bio-Rad) (para detalles, véase Fehon, 1989, Rotofor Review No. 7, Bulletin 1518, Richmond, California: Bio-Rad Laboratories).

Se produjeron antisueros policlonales de ratón contra el dominio extracelular de Notch usando cuatro fragmentos BstYI de longitud 0,8 kb (aminoácidos 237-501: Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581), 1,1 kb (aminoácidos 501-868), 0,99 kb (aminoácidos 868-1200), y 1,4 kb (aminoácidos 1465-1935), que se extienden desde la quinta repetición semejante al EGF a través del dominio transmembranal, insertados de uno en uno en el marco dentro del vector de expresión pGEX apropiado (Smith and Johnson, 1988, Gene 67, 31-40). Las proteínas de fusión se purificaron sobre perlas de glutatión-agarosa (SIGMA). Se precipitaron los antisueros de ratón y de rata con (NH_{4})_{2}SO_{4} al 50% y se resuspendieron en PBS (NaCl 150 mM, Na_{2}HPO_{4} 14 mM, NaH_{2}PO_{4} 6 mM) con NaN_{3} al 0,02%.

Se obtuvo la línea celular 201 de hibridoma a partir de un ratón inmunizado con una proteína de fusión que incluye secuencias codificadoras procedentes del dominio extracelular de Delta (Kopcynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), que incluye secuencias que se extienden desde la cuarta hasta la novena repetición semejante al EGF en Delta (aminoácidos 350-529).

Se obtuvieron los antisueros policlonales de rata después de la inmunización con antígeno derivado de la misma estructura artificial de proteína de fusión. En este caso, se preparó la proteína de fusión por lisis de células inducidas por IPTG en tampón SDS-Laemmli (Carrol and Laughon, 1987, en DNA Cloning, Volumen III, D. M. Glover, ed. (Oxford: IRL Press), pp. 89-111), separación de las proteínas por SDS-PAGE, escisión de la banda apropiada del gel, y electroelución del antígeno a partir del gel seccionado para su uso en inmunización (Harlow and Lane,1988, Antibodies: Alaboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)).

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6.1.3. Cultivo celular y transfección

Se cultivó la línea celular S2 (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) en el medio M3 (preparado por Hazleton Co.) suplementado con 2,5 mg/ml de Bacto-Peptone (Difco), 1 mg/ml de TC Yeastolate (Difco), suero vacuno fetal al 11% inactivado con calor (FCS) (Hyclone), y 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de fungizona (Hazleton). Las células que crecen en fase logarítmica a \sim 2 x 10^{6} células/ml se transfectaron con 20 \mug de DNA-fosfato de calcio coprecipitados en 1 ml por 5 ml de cultivo como se ha descrito previamente (Wigler et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373-1376), con la excepción de que se usó tampón BES (SIGMA) en lugar de tampón HEPES (Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752). Después de 16-18 horas, las células se transfirieron a tubos de centrífuga cónicos, se hicieron sedimentar en una centrífuga clínica a velocidad máxima durante 30 segundos, se lavaron una vez con ¼ de volumen del medio completo fresco, se resuspendieron en su volumen original del medio completo, y se volvieron al matraz original. Se dejó entonces que las células transfectadas se recuperaran durante 24 horas antes de la inducción.

6.1.4. Ensayos de agregación

Se indujo la expresión de las estructuras artificiales de metalotioneína Notch y Delta por la adición de CuSO_{4} hasta 0,7 mM. Se trataron similarmente las células transfectadas con la estructura artificial ECN1. Después se mezclaron las células, se incubaron en condiciones de agregación, y se puntuó su capacidad para agregarse usando antisueros específicos y un microscopio de inmunofluorescencia para visualizar las células que expresan.

Se usaron dos tipos de ensayos de agregación. En el primer ensayo, un total de 3 ml de células (5-10 x 10^{6} células/ml) se colocaron en un matraz erlenmeyer de 25 ml y se rotaron a 40-50 rpm en un agitador rotatorio durante 24-48 horas a temperatura ambiente. Para estos experimentos, las células se mezclaron 1-4 horas después de que empezase la inducción y se continuó la inducción durante todo el periodo de agregación. En el segundo ensayo, se colocaron \sim 0,6 ml de células en un tubo Eppendorf de 0,6 ml (dejando una pequeña burbuja) después de una noche de inducción (12-16 horas) a temperatura ambiente y se balancearon suavemente durante 1-2 horas a 4ºC. Se realizaron los experimentos de inhibición del anticuerpo y dependencia del Ca^{++} usando el último ensayo. Para los experimentos de dependencia del Ca^{++}, en primer lugar las células se recogieron y se lavaron con solución salina equilibrada (BSS) con FCS al 11% (BSS-FCS; FCS se dializó frente a NaCl al 0,9%, Tris 5 mM [pH 7,5]) o con BSS-FCS libre de Ca^{++} que contiene EGTA 10 mM (Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323) y después se resuspendieron en el mismo medio en el volumen original. Para los experimentos de inhibición del anticuerpo, las células Notch transfectadas se recogieron y se lavaron con el medio M3 y después se trataron antes de la agregación en el medio M3 durante 1 hora a 4ºC con una dilución 1:250 de sueros inmunes o preinmunes procedentes de cada uno de los cuatro ratones inmunizados con proteínas de fusión que contienen segmentos procedentes del dominio extracelular de Notch (véase la preparación anterior del anticuerpo).

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6.1.5. Inmunofluorescencia

Las células se recogieron por centrifugación (3000 rpm durante 20 segundos en una microcentrífuga Eppendorf) y se fijaron en tubos Eppendorf de 0,6 ml con 0,5 ml de paraformaldehido al 2% recientemente preparado en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de fijadas, las células se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con PBS, y se tiñeron durante 1 hora con el anticuerpo primario en PBS con saponina al 0,1% (SIGMA) y suero normal de cabra al 1% (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA). Los sobrenadantes del anticuerpo monoclonal se diluyeron 1:10 y los sueros de ratón y rata se diluyeron 1:1000 en esta etapa. Después se lavaron las células una vez con PBS y se tiñeron durante 1 hora con anticuerpos secundarios específicos (anti-ratón de cabra y anti-rata de cabra de calidad de doble marcado, Jackson Immunoresearch) en suero normal de cabra con PBS-saponina. Después de esta incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se montaron sobre placas en glicerol al 90%, Tris 1 M al 10% (pH 8,0), y galato de n-propilo al 0,5%. Las células se observaron bajo epifluorescencia en un microscopio Leitz Orthoplan 2.

Se tomaron micrografías confocales usando el sistema Bio-Rad MRC 500 conectado a un microscopio compuesto Zeiss Axiovert. Las imágenes se recogieron usando los equipos de filtrado BHS y GHS, se alinearon usando el programa ALIGN, y se agregaron usando MERGE. La dispersión fluorescente desde el verde al canal rojo se redujo usando un programa BLEED (todo el software proporcionado por Bio-Rad). Las fotografías se obtuvieron directamente del monitor del ordenador usando película Kodak Ektar 125.

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6.1.6. Lisados, inmunoprecipitaciones, y transferencia western de las células

Se prepararon con detergente no desnaturalizante lisados de cultivo de tejido y embriones Canton-S naturales sobre hielo en \sim 10 volúmenes de células de tampón de lisis (NaCl 300 mM, Tris 50 mM [pH 8,0], NP-40 al 0,5%, desoxicolato al 0,5%, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM) con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) y fluorofosfato de diisopropilo diluido 1:2500 como inhibidores de proteasa. Los lisados se trituraron secuencialmente usando agujas 18 G, 21 G, y 25 G unidas a jeringas de tuberculina de 1 cc y después de centrifugaron a velocidad máxima en una microcentrífuga durante 10 minutos a 4ºC para separar el material insoluble. Se realizó la inmunoprecipitación añadiendo \sim 1 \mug de anticuerpo (1-2 \mul de antisuero policlonal) a 250-500 \mul de lisado celular e incubando durante 1 hora a 4ºC con agitación. A esta mezcla, se añadieron 15 \mug de anticuerpo anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch: estos anticuerpos reconocen tanto la IgG de ratón como la de rata) y se dejó que se incubaran durante 1 hora a 4ºC con agitación. Esto fue seguido de la adición de 100 \mul de la bacteria Staphylococcus aureus fijada (Staph A) (Zysorbin, Zymed: resuspendida de acuerdo con las instrucciones del fabricante), que se había recogido, lavado cinco veces con tampón de lisis, e incubado durante otra hora. Los complejos Staph A-anticuerpo se sedimentaron después por centrifugación y se lavaron tres veces con tampón de lisis seguido por dos lavados de 15 minutos con tampón de lisis. Después de ser transferido a un nuevo tubo, el material precipitado se suspendió en 50 \mul de tampón de la muestra para SDS-PAGE, se mantuvo a ebullición inmediatamente durante 10 minutos, se pasó por geles en gradiente al 3%-15%, se transfirió a nitrocelulosa, y se detectó usando anticuerpos monoclonales y anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra HRP-conjugados como se ha descrito antes (Johansen et al., 1989, J. Cell biol. 109, 2427-2440). Para las muestras de proteínas celulares totales usadas en los ensayos de transferencia Western, las células se recogieron por centrifugación, se lisaron en 10 volúmenes de células del tampón de la muestra que contenía PMSF 1 mM, y se pusieron a ebullición inmediatamente.

6.2. Resultados 6.2.1. La expresión de Notch y Delta en células cultivadas

Para detectar las interacciones entre Notch y Delta, se examinó el comportamiento de las células que expresan estas proteínas en sus superficies usando un ensayo de agregación. Se eligió la línea celular S2 (Schneider, 1972. J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) para estos estudios. Las células S2 expresan un mensaje Notch anormal y no hubo ningún Notch detectable debido a la reorganización del extremo 5' de la secuencia de codificacion Notch. Estas células tampoco expresan ningún Delta detectable.

Los resultados de la transferencia Western y del análisis de inmunofluorescencia demuestran claramente que las estructuras artificiales de Notch y Delta justifican la expresión de proteínas de los tamaños y localización subcelular esperados.

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6.2.2. Células que expresan agregados de Notch y Delta

Se uso un ensayo simple de agregación para detectar las interacciones entre Notch y Delta expresados sobre la superficie de las células S2.

Las células S2 con crecimiento en fase logarítmica se transfectaron separadamente con la estructura artificial del promotor de metalotioneína Notch o Delta. Después de la inducción con CuSO_{4}, se mezclaron las células transfectadas en igual número y se dejó que se agregasen durante la noche a temperatura ambiente (para detalles, véanse los procedimientos experimentales, sección 6.1). Alternativamente, en algunos experimentos que pretenden reducir la actividad metabólica, las células se mezclaron suavemente a 4ºC durante 1-2 horas. Para determinar si se habían formado agregados, las células se prepararon para microscopía de inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos para cada producto génico y anticuerpos secundarios marcados de forma diferente con fluorescencia. Las células de expresión constituyen usualmente menos del 5% del total de la población de células porque se usaron transformantes transitorios en el lugar de estables. Las células que permanecen o bien no expresan una proteína dada o la expresan a niveles demasiado bajos para detección por microscopía de inmunoflurorescencia. Como controles, se realizaron agregaciones sólo con un único tipo de célula transfectada.

Los resultados (Fehon et al., 1990, Cell 61:523-534) demostraron que mientras que las células que expresan Notch (Notch^{+}) solas no formaron agregados en el ensayo, las células que expresan Delta (Delta^{+}) si lo hicieron. La tendencia de las células Delta^{+} a agregarse fue clara incluso en muestras de control no agregadas, donde tienen lugar comúnmente agrupaciones de células de 4-8 células que probablemente proceden de la adherencia entre células hermanas mitóticas. Sin embargo, las agrupaciones fueron más comunes después de la incubación en condiciones de agregación (por ejemplo, 19% de células Delta^{+} en agregados antes de la incubación frente a 37% de células Delta^{+} en agregados después de la incubación), lo que indica que las células Delta^{+} son capaces de formar contactos estables unas con otras en este ensayo.

En notable contraste con los experimentos de control con células Notch^{+} solas, la agregación de mezclas de células Notch^{+} y Delta^{+} dio como resultado la formación de agrupaciones de hasta 20 o más células. La fracción de células de expresión encontrada en las agrupaciones de cuatro o más células teñidas después de 24 horas de agregación varió de 32%-54% en mezclas de células Notch^{+} y Delta^{+}. Este intervalo fue similar al visto para las células Delta^{+} solas (37%-40%) pero muy diferente que el de las células Notch^{+} solas (solo 0%-5%). Aunque se encontraron algunas agrupaciones que constaban solo de células Delta^{+}, las células Notch^{+} no se encontraron nunca en agrupaciones más grandes de cuatro o cinco células a no ser que las células Delta^{+} estuvieran también presentes. De nuevo, todas las células dentro de estas agrupaciones expresaron o Notch o Delta, incluso aunque las células transfectadas supusieran solo una pequeña fracción de la población total de células. A las 48 horas, el grado de agregación se mostró más alto (63%-71%), lo que sugiere que la agregación no había alcanzado todavía un máximo después de 24 horas en estas condiciones. Además, las células cotransfectadas con las estructuras artificiales de Notch y Delta (de tal modo que todas las células transfectadas expresan ambas proteínas) se agregaron de un modo similar en las mismas condiciones experimentales.

Se ensayó directamente la implicación de Notch en el proceso de agregación examinando el efecto de una mezcla de antisueros policlonales dirigidos contra las proteínas de fusión que se extienden por casi todo el dominio extracelular de Notch en agregación (véanse los procedimientos experimentales, sección 6.1). Para minimizar los artefactos que pueden aparecer debido a una respuesta metabólica a la adhesión de los antígenos de superficie, el tratamiento con anticuerpos y el ensayo de agregación se realizaron a 4ºC en estos experimentos. Las células Notch^{+} se incubaron con sueros de ratón preinmune o inmune durante 1 hora, se añadieron las células Delta^{+}, y se realizó la agregación durante 1-2 horas. Mientras que las células Notch^{+} pretratadas con suero preinmune se agregaron con las células Delta^{+} (en uno de los tres experimentos, 23% de las células Notch^{+} estaban en agregados celulares Notch^{+}-Delta^{+}), las tratadas con suero inmune no lo hicieron (sólo el 2% de las células Notch^{+} estaban en agregados). Este resultado sugiere que fue necesario el dominio extracelular de Notch para la agregación de células Notch^{+}-Delta^{+}.

6.2.3. La agregación mediada de Notch-Delta es dependiente del calcio

La capacidad de las células de expresión para agregarse en presencia o ausencia de iones Ca^{2+} se ensayó para determinar si hay un requerimiento de ión Ca^{2+} para la agregación Notch-Delta. Para minimizar los posibles efectos no específicos debidos a respuestas metabólicas a la eliminación del Ca^{2+}, estos experimentos se realizaron a 4ºC. Los resultados demostraron claramente una dependencia de la agregación mediada de Notch-Delta del Ca^{2+} exógeno.

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6.2.4. Notch y Delta interactúan dentro de una única célula

La cuestión de si Notch y Delta están asociadas dentro de la membrana de una célula que expresa ambas proteínas surgió al examinar las distribuciones de Notch y Delta en las células cotransfectadas. Para ensayar si la localización observada fue coincidente o representaba una interacción estable entre Notch y Delta, se trataron las células vivas con un exceso de antisuero policlonal anti-Notch. Este tratamiento dio como resultado la "adhesión" de Notch sobre la superficie de las células de expresión en adhesiones discretas como se detectó por inmunofluorescencia. Hubo una correlación clara entre las distribuciones de Notch y Delta sobre las superficies de estas células después de este tratamiento, lo que indica que estas proteínas se asocian dentro de la membrana.

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6.2.5. Las interacciones con Delta no requieren el dominio intracelular de Notch

Adicionalmente al gran dominio extracelular que contiene las repeticiones similares al EGF, Notch tiene un dominio intracelular (IC) de tamaño proporcionado de \sim 940 aminoácidos. El dominio IC incluye un sitio de fosforilación (Kidd et al., 1989, Genes dev. 3, 1113-1129), un dominio de unión de nucleótidos putativos, una extensión de poliglutamina (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108), y secuencias homólogas del gen cdc10 de la levadura, que está implicado en el control del ciclo celular de la levadura (Breeden and Nasmyth, 1987, Nature 329, 651-654). Se usó una variante de estructura artificial de Notch a partir de la cual se habían eliminado (dejando 25 aminoácidos próximos a la membrana y un nuevo aminoácido 59 carboxilo terminal; véanse los procedimientos experimentales) las secuencias de codificación de \sim 835 aminoácidos del dominio IC, que incluyen todas las características estructurales descritas antes.

En los ensayos de agregación, las células que expresaron la estructura artificial ECN1 formaron uniformemente agregados con células Delta^{+}, pero no con ellas mismas, igual que se había observado para las células que expresaron Notch intacto. Se observaron bandas afiladas de ECN1 que se tiñeron dentro de las regiones de contacto con células Delta^{+}, lo que indica una vez más una localización de ECN1 dentro de las regiones de contacto entre las células. Para ensayar las interacciones dentro de la membrana, se realizaron experimentos de antígeno de superficie co-adhesivo usando células cotransfectadas con las estructuras artificiales ECN1 y Delta. Como se observó para Notch intacto, cuando la ECN1 se adhirió usando antisueros policlonales frente al dominio extracelular de Notch, se localizaron ECN1 y Delta en la superficie celular. Estos resultados demuestran que las interacciones observadas entre Notch y Delta dentro de la membrana no requieren la porción separada del dominio IC de Notch y están por tanto mediadas probablemente por el dominio extracelular.

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6.2.6. Notch y Delta forman complejos intermoleculares solubles en detergente

Los resultados precedentes indicaron interacciones moleculares entre Notch y Delta presentes dentro de la misma membrana y entre estas proteínas expresadas sobre diferentes células. Un ensayo adicional para tales interacciones es si estas proteínas podrían coprecipitar a partir de extractos de células que expresan Notch y Delta con detergente no desnaturalizante. Si Notch y Delta forman un complejo intermolecular estable ya sea entre las células o dentro de ellas, entonces sería posible precipitar ambas proteínas a partir de extractos celulares usando antisueros específicos dirigidos contra una de estas proteínas. Este análisis se realizó por inmunoprecipitación de Delta con antisueros policlonales procedentes de lisados NO-40/desoxicolato (véanse los procedimientos experimentales) de células cotransfectadas con las estructuras artificiales Notch y Delta que se habían dejado agregar durante la noche o de embriones naturales de 0-24 horas.

La coprecipitación de Notch se detectó en los inmunoprecipitados de Delta procedentes de células cotransfectadas y embriones. Sin embargo, la coprecipitacion de Notch pareció estar presente en cantidades mucho menores que la de Delta y por tanto fue difícil de detectar. El hecho de que la inmunoprecipitación de Delta da como resultado la coprecipitación de Notch constituye una prueba directa de que estas dos proteínas forman complejos intermoleculares estables en las células S2 transfectadas y en las células embriónicas.

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6.2. Discusión

El uso de un ensayo de agregación in vitro que emplea normalmente células S2 no adhesivas demostró que las células que expresan Notch y Delta se adhieren específicamente unas a otras.

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7. Las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch se requieren y son suficientes para la agregación mediada de Notch-Delta

Se usó el mismo ensayo de agregación que se describe en la sección 6, junto con mutantes de deleción de Notch para identificar las regiones dentro del dominio extracelular de Notch necesarias para las interacciones con Delta. Los datos experimentales muestran que las repeticiones del EGF de Notch están implicadas directamente en esta interacción y que sólo dos (ELR 11 y 12) de las 36 repeticiones del EGF parecen necesarias. Estas dos repeticiones del EGF son suficientes para unirse a Delta y la dependencia del calcio de la agregación mediada de Notch-Delta también se asocia con estas dos repeticiones. Finalmente, las dos repeticiones correspondientes del EGF del homólogo de
Notch de Xenopus también median en la agregación con Delta, lo que implica que no sólo la estructura de Notch se ha conservado evolutivamente, sino también su función. Estos resultados sugieren que el dominio extracelular de Notch es sorprendentemente modular, y podría unirse potencialmente con una variedad de proteínas además de Delta. (véase Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699).

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7.1. Procedimientos experimentales 7.1.1. Estructuras artificiales de expresión

Las estructuras artificiales descritas se derivan todas de la estructura artificial #1 pMtNMg de expresión Notch de longitud completa (véase la sección 6, anterior), y se prepararon como se ha descrito (Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699).

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7.1.2. Cultivo de células y transfección

Se cultivó la línea celular S2 de Drosophila y se transfectó como se describe en la sección 6, anterior. La línea L-49-6-7 de células S2 transformada establemente que expresa Delta (amablemente establecida por L. Cherbas) se cultivó en medio M3 (preparado por Hazleton Co.) suplementado con suero fetal de ternera al 11% inactivado por calor (FCS) (Hyclone), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 0,25 \mug/ml de fungizona (Hazleton), metotrexato 2 x 10^{-7} M, hipoxantina 0,1 mM y timidina 0,016 mM.

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7.1.3. Ensayos de agregación e inmunofluorescencia

Los ensayos de agregación y los experimentos de dependencia del Ca^{++} fueron como se ha descrito antes, sección 6. Las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-Notch 9C6.C17 y los antisueros policlonales de rata anti-Delta (los detalles se han descrito en la sección 6, anterior). Se ensayó la expresión de superficie de las estructuras artificiales Notch en células impermeabilizadas usando los antisueros policlonales de rata producidos contra el fragmento BstYI de 0,8 kb (aminoácidos 237-501; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) procedente del dominio extracelular de Notch. Las células se observaron bajo epifluorescencia en un microscopio Leitz Orthoplan 2.

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7.2. Resultados 7.2.1. Las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch se requieren para la agregación mediada de Notch-Delta

Se realizó un análisis extenso de deleción del dominio extracelular de la proteína Notch, que se demostró (anterior, sección 6; Fehon et al., 1990, Cell 61:523-534) que estaba implicado en las interacciones Notch-Delta, para identificar el dominio preciso de Notch que media en estas interacciones. Se ensayó la capacidad de las células transfectadas con diferentes estructuras artificiales de deleción para interactuar con Delta usando el ensayo de agregación descrito en la sección 6. Brevemente, las estructuras artificiales de deleción Notch se transfectaron transitoriamente en células S2 de Drosophila, se indujeron con CuSO_{4}, y después se agregaron durante la noche a temperatura ambiente con una pequeña cantidad de células procedentes de la línea celular L49-6-7 (Cherbas) que expresa Delta transformada establemente, dando una población compuesta típicamente de \sim 1% de células que expresan Notch y \sim 5% de células que expresan Delta, no expresando las células que quedan ninguna proteína.

Se muestran en la Figura 2 dibujos esquemáticos de las estructuras artificiales ensayadas y los resultados de los experimentos de agregación. Para ensayar el grado de agregación, se tiñeron las células con antisueros específicos de cada producto génico y se examinaron por microscopía de inmunofluorescencia. Los agregados se definieron como agrupaciones de cuatro o más células que contienen tanto células que expresan Notch como Delta, y los valores mostrados en la Figura 2 representan el porcentaje de todas las células que expresan Notch encontradas en dichas agrupaciones. Todos los números reflejan el resultado medio de al menos dos experimentos de transfección separados en los que se puntuaron al menos 100 unidades celulares que expresan Notch (bien células sencillas o bien agrupaciones).

Las estructuras artificiales iniciales (#2 DSph y #3 \DeltaCla) tenían delecionadas grandes porciones de las repeticiones del EGF. Su incapacidad para favorecer la agregación Notch-Delta sugirió que las repeticiones del EGF de Notch estaban implicadas en la interacción con Delta. Se usó una serie de seis sitios de restricción ClaI en el marco para diseccionar adicionalmente la región entre las repeticiones 7 y 30 del EGF. Debido a la homología de la secuencia entre las repeticiones, cinco de los sitios ClaI aparecen en el mismo lugar relativo dentro de la repetición del EGF, justo después de la tercera cisteína, mientras que el sexto sitio aparece justo antes de la primera cisteína de la repetición 31 del EGF (Figura 3). Por tanto, realizando una digestión parcial de ClaI y volviendo a ligar después, se obtuvieron deleciones que no sólo preservan el marco de lectura abierto de la proteína Notch sino que además mantienen frecuentemente la integridad estructural y conservan el espaciamiento, al menos teóricamente, de los tres enlaces disulfuro en las repeticiones del EGF quiméricas producidas por la re-ligación (Figura 2, estructuras artificiales #4-14). Desafortunadamente, el sitio ClaI más próximo al 3' fue resistente a la digestión mientras que el siguiente sitio ClaI próximo al 3' se rompió entre las repeticiones 30 y 31 del EGF. Por tanto, cuando diferentes fragmentos de digestión de ClaI se reinsertaron en el marco de la digestión completa de ClaI (estructura artificial #3 \DeltaCla), la estructura completa de las repeticiones del EGF se interrumpió aparentemente en la unión 3'.

Hay que hacer notar varios puntos sobre esta serie de estructuras artificiales. En primer lugar, la separación del fragmento de restricción ClaI que se rompe en las repeticiones 9 y 17 del EGF (estructura artificial #8 \DeltaEGF9-17) suprimió la agregación con Delta, mientras que la reinserción de esta pieza en la estructura artificial #3 \DeltaCla, que carece de las repeticiones 7-30 del EGF, restableció la agregación aproximadamente a niveles originales (estructura artificial #13 \DeltaCla + EGF9-17), lo que sugiere que la repeticiones 9 hasta 17 del EGF contienen secuencias importantes para la unión a Delta. En segundo lugar, todas las estructuras artificiales en esta serie (#4-14) fueron consistentes con el mapa del sitio de unión de las repeticiones 9 hasta 17 del EGF. Las estructuras artificiales de expresión que contienen estas repeticiones (#6, 7, 9, 10, 13) favorecieron las interacciones Notch-Delta mientras que las estructuras artificiales que carecen de estas repeticiones (#4, 5, 8, 11, 12, 14) no lo hicieron. Para confirmar que la incapacidad de agregarse con células Delta no fue simplemente debida a un fallo de la proteína Notch mutagenizada para alcanzar la superficie celular, sino que realmente reflejaba la deleción del sitio de unión necesario, se ensayó la expresión en la superficie celular de todas las estructuras artificiales por tinción con inmunofluorescencia de células vivas transfectadas con anticuerpos específicos frente al dominio extracelular de Notch. Todas las estructuras artificiales que fallan en la mediación de las interacciones Notch-Delta produjeron una proteína que parece que se expresaba normalmente en la superficie celular. En tercer lugar, aunque el ensayo de agregación no es cuantitativo, dos estructuras artificiales que contenían las repeticiones 9-17 del EGF, #9 \DeltaEGF17-26 o lo más notablemente #10 \DeltaEGF26-30, se agregaron en un nivel aparentemente inferior. Las células transfectadas con las estructuras artificiales #9 \DeltaEGF17-26 y 10 \DeltaEGF26-30 mostraron considerablemente menos tinción superficial que la normal, aunque las células fijadas y permeabilizadas reaccionaron con el mismo anticuerpo teñido normalmente, lo que indica que los epítopes reconocidos por los antisueros no se habían delecionado simplemente. Comparando el porcentaje de células transfectadas en poblaciones de células ya sean permeabilizadas o ya sean vivas, se encontró que aproximadamente 50% de las células transfectadas con la estructura artificial #9 \DeltaEGF17-26 y 10% con la estructura artificial #10 \DeltaEGF26-30 produjeron proteína detectable en la superficie celular. Por tanto, estas dos estructuras artificiales produjeron proteínas que a menudo fallan en alcanzar la superficie celular, quizás por falta de plegamiento, reduciendo de este modo, pero no suprimiendo, la capacidad de las células transfectadas para agregarse con las células que expresan Delta.

Habiendo dibujado el mapa del sitio de unión para las repeticiones 9 hasta 17 del EGF, los experimentos adicionales (Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699) revelaron que la repetición 14 del EGF de Notch no estaba implicada en las interacciones con Delta modeladas por el ensayo del cultivo del tejido.

Para dibujar el mapa de forma adicional del dominio de unión de Delta dentro de las repeticiones 9-17 del EGF, se usaron cebadores de oligonucleótidos y la técnica de PCR para generar varios subfragmentos de esta región. Se produjeron tres estructuras artificiales de solapamiento, #16, 17 y 18, de las cuales sólo una, #16 \DeltaCla + EGF9-13, cuando se transfectó dentro de las células S2, permitió la agregación con las células Delta. La estructura artificial #19 \DeltaCla + EGF(10-13), que carece de la repetición 9, definió de forma adicional las repeticiones 10-13 del EGF como la región necesaria para las interacciones Notch-Delta.

Las estructuras artificiales #20-24 representaron intentos de romper este dominio incluso usando además la misma estrategia PCR (véase la Figura 3). Las estructuras artificiales, #20 \DeltaCla + EGF(11-13), en la que la repetición 12 del EGF es la única repetición entera añadida, y #21 \DeltaCla + EGF(10-12), en la que la repetición 11 del EGF es la única repetición entera añadida, fallaron en la mediación de la agregación, lo que sugiere que la presencia de la repetición bien 11 o bien 12 del EGF solas no era suficiente para las interacciones Notch-Delta. Sin embargo, ya que la junta de unión 3' de estas estructuras artificiales interrumpió la estructura completa de las repeticiones del EGF, fue posible que se necesitase una corta zona "buffer" para permitir que la repetición crucial funcione normalmente. Por tanto, por ejemplo en la estructura artificial #19 \DeltaCla + EGF(10-13), la repetición 12 del EGF podría no estar directamente implicada en la unión a Delta pero en cambio podría contribuir con la cantidad mínima de secuencia buffer necesaria para proteger la estructura de la repetición 11 del EGF, permitiendo de este modo las interacciones con Delta. Las estructuras artificiales #22-24 se ocupan de este asunto. Las estructuras artificiales, #22 \DeltaCla + EGF(10-11), que no media en la agregación, y #23 \DeltaCla + EGF(10-12), que si lo hace, otra vez sugirieron que se requieren ambas repeticiones 11 y 12 mientras que la secuencia flanqueante de la repetición 13 claramente no se requiere. Finalmente, la estructura artificial #24 \DeltaCla + EGF(11-12), aunque ahora está rota estructuralmente de forma potencial en la unión 5', demostró convincentemente que las secuencias de la repetición 10 del EGF no son cruciales. Por tanto, basándose en datos totalmente consistentes procedentes de 24 estructuras artificiales, las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch juntas definen la unidad funcional más pequeña obtenible por este análisis que contiene los sitios necesarios para la unión con Delta en las células S2 transfectadas.

7.2.2. Las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch son suficientes para la agregación mediada de Notch-Delta

La gran deleción ClaI dentro de la que se insertaron los fragmentos PCR (#3 \DeltaCla) retiene aproximadamente 1/3 de las 36 repeticiones originales del EGF así como las tres repeticiones Notch/lin-12. Aunque éstas claramente no son suficientes para favorecer la agregación, es posible que formen un marco necesario dentro del cual las repeticiones del EGF específicas pueden interactuar con Delta. Para ensayar si sólo algunas repeticiones del EGF eran de hecho suficientes para favorecer la agregación, se diseñaron dos estructuras artificiales, #25 \DeltaEGF que delecionó las 36 repeticiones del EGF en su totalidad excepto los dos primeros tercios de la repetición 1, y #30 \DeltaECN que delecionó la porción extracelular entera de Notch excepto para el primer tercio de la repetición 1 del EGF y \sim 35 aminoácidos justo antes del dominio transmembranal. Los fragmentos que habían mediado en la agregación Notch-Delta en el precursor de la estructura artificial #3 \DeltaClaI, cuando se insertaron en la estructura artificial #25 \DeltaEGF, fueron otra vez capaces de favorecer las interacciones con Delta (estructuras artificiales #26-30). Estructuras artificiales análogas (#31-32) en las que las repeticiones Notch/lin-12 estaban también ausentes, mediaron otra vez satisfactoriamente en la agregación Notch-Delta. Por tanto, las repeticiones 11 y 12 del EGF parece que funcionan como unidades modulares independientes que son suficientes para mediar en las interacciones Notch-Delta en las células S2, incluso en ausencia de la mayor parte del dominio extracelular de Notch.

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7.2.3. Las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch mantienen la dependencia del calcio de la agregación mediada de Notch-Delta

La capacidad de las células que expresan ciertas estructuras artificiales de deleción para agregarse con Delta se examinó en presencia o ausencia de iones Ca^{++}. La dependencia del calcio de la interacción se conservó incluso en la estructura artificial más pequeña, de acuerdo con la noción de que las estructuras artificiales mínimas que contienen las repeticiones 11 y 12 del EGF se unen a Delta de una manera similar que la de Notch de longitud completa.

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7.2.4. La función de unión a delta de las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch se conserva en el homólogo de Notch de Xenopus

Se usaron los cebadores de PCR basados en la secuencia Notch de Xenopus (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441) para obtener un fragmento de \sim 350 bp de una genoteca de cDNA del punto 17 de Xenopus que incluye las repeticiones 11 y 12 del EGF flanqueadas por la mitad de las repeticiones 10 y 13 a cada lado. Este fragmento se clonó en la estructura artificial #3 \DeltaCla, y se ensayaron tres clones independientes en cuanto a su capacidad para interactuar con Delta en el ensayo de agregación del cultivo celular. Dos de los clones, #33a&b\DeltaCla + XEGF(10-13), cuando se transfectaron en las células S2 fueron capaces de mediar en las interacciones Notch-Delta a un nivel aproximadamente equivalente al de la estructura artificial de Notch análoga de Drosophila #19\DeltaCla + EGF(10-13), y otra vez de una manera dependiente del calcio (Tabla III). Sin embargo, el tercer clon #33c\DeltaCla + XEGF(10-13) falló en la mediación de las interacciones Notch-Delta aunque la proteína se expresó normalmente en la superficie celular como se demostró por la tinción de las células vivas impermeabilizadas. La comparación de la secuencia del producto PCR de Xenopus en las estructuras artificiales #33a y 33c reveló una mutación sin sentido que da como resultado un cambio de leucina a prolina (aminoácido #453, Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441) en la repetición 11 del EGF de la estructura artificial #33c. Aunque este residuo no se conserva entre el Notch de Drosophila y Xenopus (Figura 8) la introducción de un residuo de prolina podría romper fácilmente la estructura de la repetición del EGF, y por tanto impedir que interactúe adecuadamente con Delta.

La comparación de la secuencia de aminoácidos de las repeticiones 11 y 12 del EGF del Notch de Drosophila y Xenopus revela un alto grado de identidad de aminoácidos, incluyendo la secuencia de consenso de unión al calcio (Figura 4, SEQ ID NO:1 y NO:2). Sin embargo el nivel de homología no es notablemente diferente del alcanzado entre la mayoría de las otras repeticiones del EGF, que en total presentan aproximadamente 50% de identidad en el nivel de aminoácidos. Esta correspondencia uno a uno entre las repeticiones del EGF individuales del Notch de Drosophila y Xenopus, junto con la conservación funcional de ELR 11 y 12, sugiere que las 36 repeticiones del EGF de Notch comprenden un área en tándem de unidades funcionales conservadas.

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7.3. Discusión

Se usó un análisis extenso de deleción del dominio extracelular de Notch para demostrar que las regiones de Notch que contienen las repeticiones 11 y 12 homólogas del EGF son ambas necesarias y suficientes para la agregación mediada de Notch-Delta, y que esta capacidad de unión a Delta se ha conservado en las mismas dos repeticiones del EGF del Notch de Xenopus. El hallazgo de que el mapa de agregación de las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch demuestra que las repeticiones del EGF de Notch también funcionan como dominios específicos de unión a proteínas. Las repeticiones 11 y 12 del EGF solas (#32 \DeltaECN + EGF(11-12)) fueron suficientes para mantener la dependencia del Ca^{++} de las interacciones Notch-Delta.

Las diferentes estructuras artificiales de deleción sugieren que ELR 11 y ERL 12 funcionan como una unidad modular, independiente del contexto inmediato dentro del que están situadas. Por tanto, ni las 34 repeticiones del EGF que quedan ni las tres repeticiones Notch/lin-12 parecen necesarias para establecer un marco estructural requerido para que las repeticiones 11 y 12 del EGF funcionen. De modo interesante, se observó casi el efecto opuesto: aunque el ensayo de agregación no mide la fuerza de la interacción, ya que el sitio de unión fue estrechándose hasta fragmentos más y más pequeños, se observó un aumento de la capacidad de las células transfectadas para agregarse con las células que expresan Delta, lo que sugiere que las secuencias normales que flanquean EGF realmente impiden la asociación entre las proteínas. Las 34 repeticiones del EGF restantes pueden formar también dominios de unión modulares para otras proteínas que interactúan con Notch en diferentes momentos durante el desarrollo.

El hallazgo de que las repeticiones 11 y 12 del EGF de Notch forman una unidad de unión a Delta discreta representa la primera prueba concreta que apoya la idea de que cada repetición del EGF o pequeño subconjunto de repeticiones puede desempeñar un único papel durante el desarrollo, posiblemente a través de interacciones directas con otras proteínas. Las homologías vistas entre el dominio adhesivo de Delta y Serrate (Figura 5) sugieren que la porción homóloga de Serrate es "adhesiva" porque media la unión a otras proteínas toporrítmicas (véase la sección 8, más adelante). Adicionalmente, el gen scabrous, que codifica una proteína secretada con similitud al fibrinógeno, puede interaccionar con Notch.

Además de la repetición del EGF, comúnmente tienen lugar, en una variedad de proteínas, copias múltiples de otros motivos estructurales. Un ejemplo relevante es el motivo cdc10/anquirina, seis copias del cual se encontraron en el dominio intracelular de Notch. La anquirina contiene 22 de estas repeticiones. Quizás las matrices repetidas de motivos estructurales pueden representar en general un conjunto lineal de una serie de unidades de unión de proteínas modulares. Dados estos resultados junto con la complejidad estructural, genética y de desarrollo conocida de Notch, Notch puede interactuar con una serie de diferentes ligandos en un modelo temporal y espacial regulado con precisión a lo largo del desarrollo. Tales interacciones de un contexto específico con las proteínas extracelulares pueden estar mediadas por las repeticiones del EGF y Notch/lin-12, mientras que las interacciones con proteínas citoesqueléticas y citoplásmicas pueden estar mediadas por los motivos intracelulares cdc10/anquirina.

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8. Secuencias que median las interacciones Notch-Serrate

Como se describe aquí, las dos repeticiones del EGF de Notch que median en las interacciones con Delta, especialmente las repeticiones 11 y 12 del EGF, también constituyen un dominio de unión a Serrate (véase Rebay et al., 1991, Cell 67:687-699).

Para ensayar si Notch y Delta interactúan directamente, se transfectaron las células S2 con una estructura artificial de expresión de Serrate y se mezclaron con las células que expresan Notch en un ensayo de agregación. Para la estructura artificial de expresión de Serrate, un cebador sintético que contiene un sitio artificial BamHI inmediato a 5' para el iniciador AUG en la posición 442 (todos los números de secuencia están de acuerdo con Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201) y homólogo hasta la posición 464, se usó junto con un segundo cebador desde la posición 681-698 para generar un fragmento de DNA de \sim 260 pares de bases. Este fragmento se cortó con BamHI y KpnI (posición 571) y se unió a Bluescript KS + (Stratagene). Esta estructura artificial, BTSer5'PCR, se comprobó por secuenciación, y después se cortó con KpnI. Se insertó el fragmento KpnI de Serrate (571-2981) y se seleccionó la orientación apropiada para generar BTSer5'PCR-Kpn. Se aisló el fragmento 5' SacII de BTSer5'PCR-Kpn (los sitios SacII en el poliligante Bluescript y en Serrate (1199)) y se usó para reemplazar al fragmento 5' SacII de cDNA C1 (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4:2188-2201), regenerando de este modo el cDNA de Serrate de longitud completa menos las regiones sin traducir en 5'. Se aisló este inserto por una digestión de SaII y parcial de BamHI y se incluyó dentro de los sitios BamHI y SaII de pRmHa-3 para generar la estructura artificial final de expresión, Ser-mtn.

Las células que expresan Serrate se adhirieron a las células que expresan Notch de una manera dependiente del calcio (Figura 2 y Rebay et al., 1991, anterior). Sin embargo, al contrario que Delta, en las condiciones experimentales del ensayo, no parece que Serrate interactúe homotípicamente. Adicionalmente, no se detectaron interacciones entre Serrate y Delta.

Se ensayó un subconjunto de estructuras artificiales de deleción de Notch, y se demostró que las repeticiones 11 y 12 del EGF, además de unirse con Delta, también median en las interacciones con Serrate (Figura 2; estructuras artificiales #1, 7-10, 13, 16, 17, 19, 28 y 32). Además, la función de unión a Serrate de estas repeticiones también parece que se había conservado en las dos repeticiones del EGF correspondientes de Notch de Xenopus (#33\DeltaCla + XEGF(10-13)). Estos resultados demuestran sin ambigüedad que Notch interactúa tanto con Delta como con Serrate, y que las dos mismas repeticiones del EGF de Notch median en ambas interacciones. También se definió la región Serrate que es esencial para la agregación de Notch/Serrate. La deleción de los nucleótidos 676-1287 (es decir, aminoácidos 79-282) (véase la Figura 5; SEQ ID NO:3 y NO:4) elimina la capacidad de la proteína Serrate para agregarse con Notch.

Parece que Notch y Serrate se agregan con menos eficiencia que Notch y Delta, quizás debido a que la interacción Notch-Serrate es más débil. Una explicación trivial para esta cantidad reducida de agregación puede ser que la estructura artificial de Serrate simplemente no expresa tanta proteína en la superficie celular como la estructura artificial de Delta, disminuyendo de este modo la fuerza de la interacción. Alternativamente, la diferencia en la fuerza de la interacción puede indicar una diferencia funcional fundamental entre las interacciones Notch-Delta y Notch-Serrate que puede ser importante in vivo.

9. La clonación, secuenciación y expresión de Notch humano 9.1. Aislamiento y secuenciación de Notch humano

Los clones para la secuencia de Notch humano se obtuvieron originalmente usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el DNA procedente de una genoteca de cDNA de cerebro fetal humano de 17-18 semanas en el vector Lambda Zap II (Stratagene).

El fragmento de 400 bp obtenido de esta manera se usó después como una sonda con la que se criba la misma genoteca para los clones de Notch humano. El cribado original dio tres únicos clones, hN3k, hN2k y hN5k, de todos los cuales se demostró por el subsiguiente análisis de secuencias que caen en el extremo 3' de Notch humano (Figura 6). Se realizó un segundo cribado usando el extremo 5' de hN3k como sonda para buscar los clones que rodean el extremo 5' de Notch humano. De este cribado se obtuvo un único clon, hN4k, y los datos de secuenciación preliminares indican que contiene la mayor parte del extremo 5' del gen (Figura 6). Juntos, los clones hN4k, hN3k y hN5k engloban aproximadamente 10 kb del homólogo(s) de Notch humano, empezando inicialmente en las repeticiones del EGF y extendiéndose en la región 3' sin traducir del gen. Todos los tres clones son insertos de cDNA en el sitio EcoRI de pBluescript SK (Stratagene). La cepa hospedante de E. Coli es XL1-Blue (véase Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Habor, New York, p A12). Se muestra en la Figura 7 un alineamiento de las secuencias de Notch humano con Notch de Drosophila.

Se determinó la secuencia de diferentes porciones de Notch contenidas en los clones de cDNA (usando un
Sequenase®, U. S. Biochemical Corp.) y se muestra para hN2k y hN4k en las Figuras 8 (SEQ ID NO:5-7) y 9 (SEQ ID NO:8, 9), respectivamente. Un análisis adicional de secuencias de hN2k reveló que codifica una secuencia de Notch humano que solapa la contenida en hN5k.

Se determinaron las secuencias completas de nucleótidos del cDNA de Notch humano contenidas en hN3k y hN5k por el método de terminación de la cadena de didesoxi usando el kit Sequenase® (U. S. Biochemical Corp.). Las secuencias de nucleótidos que codifican Notch humano, en el marco de lectura apropiado, se identificaron fácilmente ya que no hay intrones y la traducción en sólo uno de los tres posibles marcos de lectura da una secuencia que, después de comparación con la secuencia publicada de aminoácidos deducida de Notch de Drosophila, da una secuencia con un grado sustancial de homología con la secuencia de Notch de Drosophila. Las secuencias de DNA y de las proteína deducidas del cDNA de Notch humano en hN3k y hN5k se presentan en las Figuras 10 (SEQ ID NO:10,11) y 11 (SEQ ID NO:12,13), respectivamente. El clon hN3k codifica una porción de un polipéptido Notch que empieza en aproximadamente la tercera repetición Notch/lin-12 hasta varios aminoácidos cerca del aminoácido del carboxilo terminal. El clon hN5k codifica una porción de un polipéptido Notch que empieza aproximadamente antes de la región cdc10 y llega hasta el extremo del polipéptido, y contiene también una región 3' sin traducir.

La comparación de las secuencias de DNA y de proteínas presentadas en la Figura 10 (SEQ ID NO:10, 11) con las de la Figura 11 (SEQ ID NO:12,13) revela diferencias importantes entre las secuencias, lo que sugiere que hN3k y hN5k representan parte de dos genes homólogos Notch distintos. Los datos sugieren así que el genoma humano alberga más de un gen homólogo Notch. Esto difiere de la Drosophila, donde Notch parece ser un gen de copia
única.

La comparación de las secuencias de DNA y de aminoácidos de los homólogos de Notch humano contenidas en hN3k y hN5k con las correspondientes secuencias Notch de Drosophila (como se publica en Wharton et al., 1985, Cell 43:567-581) y con las correspondientes secuencias de Notch de Xenopus (como se publica en Coffman et al., 1990, Science 249:1438-1441 o disponible de Genbank® (número de registro M33874)) también revela
diferencias.

La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 10 (hN3k) se comparó con la secuencia previsible del polipéptido TAN-1 mostrada en la Figura 2 de Ellisen et al., agosto de 1991, Cell 66:649-661. Se encontraron algunas diferencias entre las secuencias de aminoácidos deducidas; sin embargo, la secuencia completa del polipéptido Notch hN3k es 99% idéntica a la región TAN-1 correspondiente (aminoácidos de TAN-1 1455 a 2506). Se observaron cuatro diferencias: en la región entre la tercera repetición Notch/lin-12 y el primer motivo cdc10, hay una arginina (hN3k) en vez de un X (aminoácido de TAN-1 1763); (2) hay una prolina (hN3k) en vez de un X (aminoácido de TAN-1 1787); (3) hay un cambio conservador de un residuo de ácido aspártico (hN3k) en vez de un residuo de ácido glutámico (aminoácido de TAN-12495); y (4) la región carboxilo terminal difiere sustancialmente entre los aminoácidos de TAN-1 2507 y 2535.

La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 11 (hN5k) se comparó con la secuencia previsible del polipéptido TAN-1 mostrada en la Figura 2 de Ellisen et al., agosto de 1991, Cell 66:649-661. Se encontraron diferencias entre las secuencias de aminoácidos deducidas. El polipéptido Notch deducido de hN5k es 79% idéntico al polipéptido TAN-1 (64% idéntico a Notch de Drosophila) en la región cdc10 que engloba tanto el motivo cc10 (aminoácidos de TAN-1 1860 a 2217) como las regiones flanqueantes bien conservadas (Fig. 12). La región cdc10 cubre los aminoácidos de 1860 hasta 2217 de la secuencia TAN-1. Adicionalmente, el polipéptido codificado hN5k es 65% idéntico al polipéptido TAN-1 (44% de idéntidad con el Notch de Drosophila) en el extremo carboxilo terminal de la molécula que contiene una región PEST (rica en prolina, ácido glutámico, serina y treonina) (aminoácidos de TAN-1 2482 a 2551) (Fig. 12B). El alargamiento de los 215 aminoácidos que caen entre las regiones antes mencionadas no se conserva bien entre cualquiera de los clones homólogos Notch representados por hN3k, hN5k y TAN-1. Ni el polipéptido hN5k ni Notch de Drosophila muestran niveles importantes de identidad de aminoácidos con las otras proteínas en esta región (por ejemplo, hN5k/TAN-1 = 24% de identidad; hN5k/Notch de Drosophila = 11% de identidad; TAN-1/Notch de Drosophila = 17% de identidad). En contraste, Notch de Xenopus (Xotch) (SEQ ID NO:16), Notch de rata (SEQ ID NO:17), y TAN-1 (SEQ ID NO:18) continúan compartiendo niveles importantes de identidad de secuencia unos con otros (por ejemplo, TAN-1/Notch de rata = 75% de identidad, TAN-1/Notch de Xenopus = 45% de identidad, Notch de rata/Notch de Xenopus =50% de identidad).

El examen de la secuencia de los dominios intracelulares de los homólogos Notch de vertebrados mostrados en la Figura 12B revela un hallazgo inesperado: todas estas proteínas, incluyendo hN5k, contienen un motivo CcN putativo, asociado con la función de fijar el objetivo nuclear, en la región conservada que sigue a la última de las seis repeticiones cdc10 (Fig. 12B). Aunque el Notch de Drosophila carece de tal motivo definido, una inspección más rigurosa de sus secuencias revela la presencia de una posible secuencia de localización nuclear bipartita (Robbins et al., 1991, Cell 64:615-623), así como de posibles sitios de fosforilación CK II y cdc2, todos en proximidad relativa unos con otros, definiendo, por tanto, posiblemente un tipo alternativo de motivo CcN (Fig. 12B).

Para aislar los clones que cubren el extremo 5' de hN (el homólogo Notch humano contenido en parte en hN5k), se usó el clon hN2k como una sonda para el cribado de 260.000 placas de la genoteca del fago de cerebro fetal humano, disponible comercialmente de Stratagene, para buscar clones hibridados por cruce. Se identificaron y aislaron cuatro clones usando procedimientos estándar (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Se aislaron también cuatro clones por hibridación con la secuencia homóloga Notch de Adams et al., 1992, Nature 355.632-655, que se obtuvo a partir de ATCC.

Para aislar los clones que cubren el extremo 5' de TAN-1, la genoteca del cerebro fetal humano que está comercialmente disponible de Stratagene se cribó para los clones que extenderían la secuencia hasta el extremo 5'. Se cribaron 880.000 placas y se identificaron cuatro clones que se hibridaron por cruce con las secuencias hN3k. La secuenciación confirmó la posición relativa de estas secuencias dentro de la proteína Notch codificada por TAN-1.

La secuencia 5' del homólogo TAN-1 aislado de la invención se ha determinado hasta el nucleótido número 972 (siendo el nucleótido número 1 la A en el codón de iniciación ATG), y se comparó con la secuencia publicada por Ellisen et al (1991, Cell 66:649-661). En el nucleótido 559, el homólogo TAN-1 de la invención tiene una G, mientras que Ellisen et al describen una A, cuyo cambio da como resultado un aminoácido codificado diferente. Por tanto, dentro de los primeros 324 aminoácidos, la proteína codificada por TAN-1 de la invención difiere de la mostrada por Ellisen et al., ya que la proteína de la invención tiene una Gly en la posición 187, mientras que Ellisen et al describen una Arg en esta posición (como se presenta en la Figura 13).

Las secuencias de aminoácidos de longitud completa tanto de hN (SEQ ID NO:19) como de las proteínas codificadas por TAN-1 (SEQ ID NO:20), así como las proteínas Notch de Xenopus y Drosophila, se muestran en la Figura 13. La secuencia de codificación de DNA de longitud completa (excepto para la que codifica el iniciador Met) (contenida en SEQ ID NO:21) y la secuencia de aminoácidos codificada (excepto la del iniciador Met que no se muestra) (contenida en SEQ ID NO:19) de hN se muestran en la Figura 17.

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9.2. Expresión de Notch humano

Se prepararon estructuras artificiales de expresión usando clones de cDNA Notch humano discutidos en la sección 9.1 anterior. En los casos de hN3k y hN2k, el clon entero se escindió de su vector como un fragmento de restricción y se subclonó en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de la glutatión-S-transferasa; Smith and Johnson, 1988, Gene 7, 31-40). Esto permite la expresión del producto proteínico Notch a partir del subclon en el marco de lectura adecuado. En el caso de hN5k, el clon contiene dos sitios de restricción EcoRI internos, que producen fragmentos de 2,6, 1,5 y 0,6 kb. Los dos fragmentos de 2,6 y de 1,5 kb se habían subclonado también dentro de cada vector pGEX.

Se usó el sistema vector pGEX para obtener la expresión de las proteínas de fusión Notch humanas (quiméricas) desde las estructuras artificiales descritas más adelante. El DNA Notch clonado en cada caso se insertó, en fase, en el vector pGEX apropiado. Cada estructura artificial se electroporó después en la bacteria (E. coli), y se expresó como una proteína de fusión que contiene las secuencias de proteína Notch fusionadas al carboxilo terminal de la proteína glutatión S-transferasa. La expresión de las proteínas de fusión se confirmó por análisis de los extractos de proteínas bacterianas por electroforesis en gel de poliacrilamida, comparando los extractos de proteína obtenidos de las bacterias que contienen los plásmidos pGEX con y sin DNA Notch insertado. Las proteínas de fusión eran solubles en solución acuosa, y se purificaron de los lisados de bacterias por cromatografía de afinidad usando agarosa recubierta con glutatión (ya que el carboxilo terminal de la glutatión-S-transferasa se une a la glutationina). Las proteínas de fusión expresadas se unieron por medio de un anticuerpo a Notch de Drosophila, como se ensayó por transferencia Western.

\newpage

Las estructuras artificiales usadas para preparar las proteínas de fusión glutatión-S-transferasa de Notch humano fueron como sigue:

hNFP#2- se usó PCR para obtener un fragmento que empieza justo antes de las repeticiones cdc10 en el nucleótido 192 del inserto hN5k hasta justo antes de la región PEST enriquecida del nucleótido 1694. El DNA se digirió después con BamHI y SmaI y el fragmento resultante se ligó con pGEX-3. Después de la expresión, se purificó la proteína de fusión por unión con la glutatión-agarosa. El polipéptido purificado se cuantificó con gradiente 4-15% en gel de poliacrilamida. La proteína de fusión resultante tuvo un peso molecular aproximado de 83 kD.

hN3FP#1- el inserto de DNA de hN3k entero (nucleótidos 1 a 3235) se escindió del vector Bluescript (SK) por digestión con EcoRI. El DNA se ligó con pGEX-3.

hN3FP#2- un segmento 3' de DNA de hN3k (nucleótidos 1847 a 3235) más algo del poliligante se cortó del vector Bluescript (SK) por digestión con XmaI. El fragmento se ligó con pGEX-1.

Después de la purificación, estas proteínas de fusión se usan para preparar anticuerpos policlonales y/o monoclonales frente a Notch humano.

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10. Expresión de Notch en células normales y malignas

Se ensayaron diferentes muestras de tejido de pacientes humanos y líneas celulares, que representan tanto células normales como una amplia variedad de células malignas para detectar y/o cuantificar la expresión de Notch. Las muestras de tejido de pacientes se obtuvieron del Pathology Department de la Yale University School of Medicine

Los siguientes ensayos se usan para medir la expresión de Notch en muestras de tejido de pacientes: (a) hibridación Northern; (b) transferencia Western; (c) hibridación in situ; y (d) inmunocitoquímica. Los ensayos se llevaron a cabo usando técnicas estándar. La hibridación Northern y la hibridación in situ se llevaron a cabo (i) usando una sonda de DNA específica para la secuencia Notch del clon hN3k; y (ii) usando una sonda de DNA específica para la secuencia Notch del clon hN5k. La transferencia Western y la inmunocitoquímica se llevaron a cabo usando un anticuerpo frente a la proteína Notch de Drosophila (que también reconoce proteínas Notch humanas).

La hibridación Northern y la transferencia Western, como se ha descrito antes, se usan también para analizar numerosas líneas celulares humanas, que representan diferentes tejidos normales o cancerosos. Las líneas celulares ensayadas están listadas en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Líneas celulares humanas

4

5

Los tumores malignos de los tipos de tejidos con células malignas de los que se demuestra, por tanto, que expresan Notch específicamente se pueden tratar como se describe en la sección 5.1 y siguientes.

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10.1. La expresión de proteínas Notch humanas está aumentada en diferentes tumores malignos

Como se describe más adelante, se ha encontrado en esta invención que la expresión de proteínas Notch humanas está aumentada en al menos tres cánceres humanos, especialmente cáncer de cuello uterino, de mama, y de colon. La tinción inmunocitoquímica de las muestras de tejido de cáncer de cuello uterino, de mama y de colon de pacientes humanos demostró claramente que el tejido maligno expresa altos niveles de Notch, con aumento del nivel en relación con secciones de tejidos no malignos. Este amplio espectro de diferentes neoplasias en las que hay una elevada expresión de Notch sugiere que podrían verse muchos más estados cancerosos que regulan Notch por incremento.

Se obtuvieron cortes de muestras de tumores humanos (de tumores de mama, colon y de cuello uterino) del banco de tejidos del Pathology Department, Yale Medical School. Las tinciones se realizaron usando anticuerpos monoclonales producidos contra las proteínas de fusión P1 y P4 que se generaron a partir de las secuencias de hN y TAN-1, respectivamente.

Las proteínas de fusión P1 y P4 se obtuvieron por inserción de la secuencia Notch humana deseada en el vector de expresión pGEX apropiado (Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40; AMRAD Corp., Melbourne, Australia) y se purificaron por afinidad según las instrucciones del fabricante (AMRAD Corp.). Para la producción de la proteína de fusión P1, se cortó de pGEX-2 con BamHI y se ligó a un concatémero que consta de tres copias de un fragmento de hN, BamHI-BgIII de 518 bp. Se inmunizaron ratas con la proteína expresada y se produjeron los anticuerpos monoclonales por procedimientos estándar. Para la producción de la proteína de fusión P4, se cortó el pGEX-2 con BamHI y se ligó a un concatémero que costa de tres copias de un fragmento de TAN-1, BamHI-BgIII de 473 bp. Se inmunizaron ratas con la proteína expresada y se produjeron los anticuerpos monoclonales por procedimientos estándar.

En todos los tumores examinados, las proteínas Notch codificadas por ambos homólogos Notch humanos, TAN-1 y hN estaban presentes en niveles aumentados en la parte maligna del tejido en comparación con la parte normal. Se muestran tinciones representativas en los dibujos que se proporcionan (Fig. 14-16).

El procedimiento de tinción fue como sigue: los tejidos se fijaron en paraformaldehido, se embebieron en parafina, se cortaron en secciones de un espesor de 5 micrómetros y se colocaron en placas de vidrio. Después se llevaron a cabo los siguientes pasos:

1. Desparafinación por medio de 4 cambios de xileno, 4 minutos cada uno.

2. Eliminación del xileno por medio de 3 cambios en etanol absoluto, 4 minutos cada uno.

3. Rehidratación gradual de los tejidos por inmersión de las placas en etanol al 95%, al 90%, al 80%, al 60% y al 30%, 4 minutos cada uno. Al final las placas se lavaron con agua destilada durante 5 minutos.

4. Sofocamiento de la peroxidasa, endógena incubando durante 30 minutos en peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol.

5. Lavado con PBS (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5, NaCl 0,9%) durante 20 minutos.

6. Incubación durante 1 hora en solución de bloqueo. (Solución de bloqueo: PBS que contiene suero normal de conejo al 4% y Triton X-100 al 0,1%).

7. Incubación durante toda la noche a 4ºC con anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Concentración final del anticuerpo primario 20-50 \mug/ml.

8. Lavado durante 20 minutos con PBS + Triton X-100 al 0,1% (3 cambios).

9. incubación durante 30 minutos con anticuerpo de conejo anti-rata biotinilado: 50 \mul de anticuerpo biotinilado (VECTOR) en 10 ml de solución de bloqueo.

10. Lavado durante 20 minutos con PBS + Triton X-100 al 0,1% (3 cambios).

11. Incubación con reactivo ABC (VECTOR) durante 30 minutos (el reactivo se prepara en PBS + Triton X-100 al 0,1%).

12. Lavado durante 20 minutos con PBS + Triton X-100 al 0,1%. Seguido por incubación durante 2 minutos en PBS + Triton X-100 al 0,5%.

13. Incubación durante 2-5 minutos en solución de sustrato de peroxidasa. Solución de sustrato de peroxidasa: se mezclan volúmenes iguales de peróxido de hidrógeno al 0,02% en agua destilada y tetrahidrocloruro de diaminobencidina al 0,1% (DAB) en tampón Tris 0,1 M, pH 7,5 justo antes de la incubación con los tejidos. Se añade Triton X-100 a la solución final a una concentración de 0,5%.

14. Lavado durante 15 minutos con agua del grifo.

15. Tinción de contraste durante 10 minutos con hematoxilina de Mayer.

16. Lavado durante 15 minutos con agua del grifo.

17. Deshidratación por medio de cambios en etanol al 30%, al 60%, al 80%, al 90%, al 95% y etanol absoluto (4 minutos cada uno).

18. Inmersión en xileno (2 cambios, 4 minutos cada uno).

19. Montaje, microscopio óptico.

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11. Depósito de microorganismos

Las siguientes bacterias recombinantes, que lleva cada una un plásmido que codifica una porción de Notch humano, se depositaron el 2 de mayo, 1991, ante American Type Culture Collection, 1201 Parklawn drive, Rockville, Maryland 20852, cumpliendo las condiciones del tratado de Budapest sobre la International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent procedures.

6

Se citan aquí diferentes publicaciones, en las cuales el experto en la técnica puede buscar más información sobre el problema discutido.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Artevanis-Tsakonas, S. et al.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones basadas en proteínas y ácidos nucleicos Notch

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Pennie & Edmonds

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1155 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD:New York

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(D): ESTADO: New York

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(E): PAÍS: U.S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 10036

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25

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(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: A designar

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(B): FECHA DE SOLICITUD: En fecha fija

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:

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(A): NOMBRE: Misrock, S. Leslie

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 18.872

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7326-018

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(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 212 790-9090

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(B): TELEFAX: 212 8698864/9741

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 66141 PENNIE

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2892 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 142..2640

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

7

8

9

10

11

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 833 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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12

13

14

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1320 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 442..1320

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

15

16

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 293 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

19

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 574 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

20

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 295 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

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21

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 248 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 323 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

24

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3234 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...3234

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1078 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

30

32

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4268 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 657 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 77 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: único

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 654 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

42

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

45

46

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 18:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 681 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENAS: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

47

48

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2471 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENAS: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

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49

50

51

52

53

54

55

56

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 20:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2556 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENAS: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

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57

58

59

60

61

62

63

64

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(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9723 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENAS: doble

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 10...7419

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

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65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo neutralizante anti-Notch; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento o derivado de un anticuerpo frente a una proteína Notch que contiene el idiotipo del anticuerpo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Uso de una composición que comprende una molécula que antagoniza la función de una proteína Notch, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno canceroso o para evitar la progresión desde un estado pre-neoplásico o no maligno, hasta un estado neoplásico o maligno, donde la molécula se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico antisentido Notch, un anticuerpo neutralizante anti-Notch, un fragmento que contiene el dominio de unión de un anticuerpo dirigido contra Notch y una proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que el trastorno canceroso o estado neoplásico o maligno es cáncer de cuello uterino, cáncer de mama o cáncer de colon.

5. Uso de una molécula, cuya molécula antagoniza la función de una proteína Notch, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno en un sujeto, cuyo tumor maligno se caracteriza por (i) aumento de la actividad Notch o (ii) aumento de la expresión de una proteína Notch o (iii) aumento de la expresión de un derivado Notch capaz de ser unido por un anticuerpo anti-Notch, en relación con dicha actividad o expresión Notch en una muestra análoga no maligna, donde la molécula se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico antisentido Notch, un anticuerpo neutralizante anti-Notch, un fragmento que contiene el dominio de unión de un anticuerpo dirigido contra Notch y una proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que el sujeto es un ser humano.

7. Uso según la reivindicación 4, en el que la molécula es un anticuerpo neutralizante anti-Notch o una porción de dicho anticuerpo que contiene su dominio de unión.

8. Uso según la reivindicación 4, en el que la proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12 es un fragmento Notch que comprende el dominio extracelular de una proteína Notch o una porción de la misma capaz de unirse a un ligando Notch.

9. Uso según la reivindicación 4, en el que la proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12 es un fragmento Notch que comprende las repeticiones homólogas del EGF de una proteína Notch.

10. Uso según la reivindicación 4, en el que la proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12 es un fragmento Notch que comprende un fragmento adhesivo de una proteína Notch.

11. Uso según la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico antisentido Notch es un oligonucleótido que (a) consta de al menos seis nucleótidos; (b) comprende una secuencia complementaria a al menos una porción de un RNA transcrito de un gen Notch; y (c) es hibridable con el RNA transcrito.

12. Uso de un anticuerpo neutralizante anti-Notch para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un tumor maligno en un sujeto.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo es monoclonal.

14. Método para diagnosticar un tumor maligno caracterizado por un aumento de la cantidad de una proteína Notch o de un derivado de Notch capaz de ser unido por un anticuerpo anti-Notch, que comprende medir la cantidad de una proteína Notch o de un derivado de Notch capaz de ser unido por un anticuerpo anti-Notch, en una muestra que contiene o se sospecha que contiene células malignas de un paciente, en el cual un aumento en la cantidad de la proteína Notch o del derivado de Notch capaz de ser unido por un anticuerpo anti-Notch en la muestra, en relación con dicha cantidad encontrada en una muestra equivalente de células no malignas, indica la presencia de la enfermedad o trastorno en el paciente.

15. El método según la reivindicación 14, en el que el tumor maligno es cáncer de cuello uterino.

16. El método según la reivindicación 14, en el que el tumor maligno es cáncer de mama.

17. El método según la reivindicación 14, en el que el tumor maligno es cáncer de colon.

18. El método según la reivindicación 14, en el que la cantidad de la proteína o derivado Notch se mide por un método que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Notch de modo que pueda tener lugar la unión inmunoespecífica, y medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica con el anticuerpo que tenga lugar.

19. Una composición que comprende una cantidad eficaz terapéuticamente de una molécula que antagoniza la función de una proteína Notch, para usar como medicamento, en la que la molécula se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico antisentido Notch, un anticuerpo neutralizante anti-Notch, un fragmento que contiene el dominio de unión de un anticuerpo dirigido contra Notch y una proteína que comprende Notch ELR-11 y ELR-12.