ES2333384T3

ES2333384T3 - Secuencias nucleotidos y proteinas de genes serrate de vertebrados y metodos basados en las mismas.

Info

Publication number: ES2333384T3
Application number: ES96911262T
Authority: ES
Inventors: David Ish-Horowicz; Domingos M. P. Henrique; Julian H. Lewis; Anna M. Myat; Spyridon Artavanis-Tsakonas; Robert S. Mann; Grace E. Gray
Original assignee: Imperial Cancer Research Technology Ltd; Yale University
Current assignee: Cancer Research Horizons Ltd; Yale University
Priority date: 1995-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2010-02-19
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: PT813545E; JP2010273685A; CA2214830C; AU718955B2; DE69638022D1; WO1996027610A1; CA2214830A1; ATE442381T1; US5869282A; DK0813545T3; EP0813545A1; JPH11507203A; EP0813545A4; AU5420296A; EP0813545B1; JP2008099687A; JP2013150605A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS DE GENES SERRATE DE VERTEBRADOS, A LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE LAS PROTEINAS CODIFICADAS POR LOS MISMOS, ASI COMO A DERIVADOS (P. EJ., FRAGMENTOS) Y ANALOGOS DE LOS MISMOS. EN UNA PRESENTACION ESPECIFICA, LA PROTEINA SERRATE ES UNA PROTEINA HUMANA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A FRAGMENTOS (Y DERIVADOS Y ANALOGOS DE LOS MISMOS) DE UNA SERRATE DE VERTEBRADOS QUE COMPRENDA UNO O MAS DOMINIOS DE LA PROTEINA SERRATE, INCLUIDOS, AUNQUE NO LIMITADOS A, EL DOMINIO INTRACELULAR, DOMINIO EXTRACELULAR, DOMINIO DSL, DOMINIO RICO EN CISTEINA, REGION TRANSMEMBRANA, REGION ASOCIADA A MEMBRANA, O UNA O MAS DE LAS REPETICIONES SIMILARES A EGF DE UNA PROTEINA SERRATE, O CUALQUIER COMBINACION DE LOS ANTERIORES. SE PROPORCIONAN ADICIONALMENTE LOS ANTICUERPOS CONTRA SERRATE DE VERTEBRADOS, SUS DERIVADOS Y ANALOGOS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS SERRATE DE VERTEBRADOS, DERIVADOS Y ANALOGOS, P. EJ., POR MEDIOS RECOMBINANTES. SE PROPORCIONAN METODOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS. COMO EJEMPLOS ESPECIFICOS, SE PROPORCIONAN LOS GENES SERRATE AISLADOS DE POLLO, RATON, XENOPUS Y SER HUMANO.

Description

Secuencias de nucleótidos y proteínas de genes Serrate de vertebrados y métodos basados en las mismas.

Esta invención se realizó en parte con ayuda del gobierno gracias a las subvenciones de número GM 29093 y NS 26084 concedidas por el Department of Health and Human Services. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

1. Introducción

La presente invención se refiere a los genes Serrate de vertebrado y sus productos proteicos codificados, así como a los derivados de los mismos. También se da a conocer la producción de proteínas Serrate de vertebrado, derivados y anticuerpos. La invención además se refiere a composiciones terapéuticas.

2. Antecedentes de la invención

Los análisis genéticos en Drosophila han sido muy útiles para diseccionar la complejidad de las vías de desarrollo y para identificar los locus que interaccionan. Sin embargo, la comprensión precisa de la naturaleza de los procesos que subyacen a las interacciones genéticas requiere un conocimiento de los productos proteicos de los genes en cuestión.

Las pruebas embriológicas, genéticas y moleculares indican que las etapas tempranas de la diferenciación ectodérmica en Drosophila dependen de las interacciones celulares (Doe y Goodman, 1985, Dev. Biol. 111: 206-219; Technau y Campos-Ortega, 1986, Dev. Biol. 195: 445-454; Vässin et al., 1985, J. Neurogenet. 2: 291-308; de la Concha et al., 1988, Genetics 118: 499-508; Xu et al., 1990, Genes Dev. 4: 464-475; Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4:95-100). Los análisis con mutaciones han puesto de manifiesto un grupo pequeño de genes que actúan en el cigoto, el denominado locus neurógeno, que alteran la elección que las células ectodérmicas hacen entre las vías epidérmica y neural (Poulson,1937, Proc. Natl. Acad. Sci., 23: 133-137; Lehmann et al., 1983, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 192: 62-74; Jürgens et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 283-295; Wieschaus et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 296-307; Nüsslein-Volhard et al., 1984, Wilhelm Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 267-282). Las mutaciones nulas en cualquiera de los locus neurógenos cigóticos -Notch (N), Delta (D1), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl), neuralized (neu) y big brain (bib)- dan lugar a la hipertrofia del sistema nervioso a expensas de las estructuras epidérmicas ventrales y laterales. Este efecto se debe al enrutamiento erróneo de las células precursoras epidérmicas en una vía neuronal, e implica que se necesita que los genes neurógenos funcionen para desviar las células dentro de la región neurógena de un destino neuronal a un destino epitelial. Se ha identificado que Serrate es una unidad genética capaz de interaccionar con el locus Notch (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4: 464-475). Estas observaciones genéticas y de desarrollo han conducido a la hipótesis de que los productos proteicos del locus neurógeno funcionan como componentes de un mecanismo de interacción celular necesario para el desarrollo epidérmico adecuado (Artavanis-Tsakonas, S., 1988, Trends Genet. 4:95-100).

Los análisis mutacionales también revelan que la acción de los genes neurógenos es pleótropo y no se limita únicamente a la embriogénesis. Por ejemplo, la formación del omatidio, de los pelos y de las alas, que se sabe que también depende de las interacciones celulares, está afectada por mutaciones neurógenas (Morgan et al., 1925, Bibliogr. Genet. 2: 1-226; Welshons, 1956, Dros. Inf. Serv. 30: 157-158; Preiss et al., 1988, EMBO J. 7:3917-3927, Shellenbarger y Mohler, 1978, Dev. Biol. 62: 432-446; Technau y Campos-Ortega, 1986, Wilhelm Roux's Dev. Biol. 195: 445-454; Tomlison y Ready, 1987, Dev. Biol. 120: 366-376; Cagan y Ready, 1989, Genes Dev. 3: 1099-1112).

Los análisis de secuencias (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3094-3108; Vässin et al., 1987, EMBO J. 6: 3431-3440; Kopczynsky et al., 1988, Genes Dev. 2: 1723-1735) han demostrado que dos de los locus neurógenos, Notch y Delta, codifican proteínas transmembranarias que atraviesan la membrana una única vez. El gen Notch codifica una proteína de 300 kDa (utilizamos "Notch" para denominar esta proteína) con un gran dominio extracelular en el extremo amino que incluye 36 repeticiones en tándem similares al factor de crecimiento epidérmico (FCE) seguidas de otras tres repeticiones ricas en cisteína, designadas repeticiones Noch/lin-12 (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581; Kidd y Young, 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3094-3108; Yochem et al., 1988, Nature 335: 547-550). Delta codifica una proteína de \sim100 kDa (utilizamos "Delta" para designar a DLZM, el producto proteico de los transcritos cigótico y materno predominantes; Kopczynski et al., 1988, Genes. Dev. 2: 1723-1735) que tiene nueve repeticiones similares al FCE dentro de su dominio extracelular (Vässin et al., 1987, EMBO J, 6: 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2: 1723-1735). Los estudios moleculares han conducido a sugerir que Notch y Delta constituyen elementos de un mecanismo de comunicación celular implicado en las decisiones de desarrollo temprano (Fehon et al., 1990, Cell, 61: 523-534) que interaccionan bioquímicamente.

El motivo de tipo FCE se ha encontrado en numerosas proteínas, incluidas las de la cascada de coagulación sanguínea (Furie y Furie, 1988, Cell 53: 505-518). En particular, se ha encontrado este motivo en proteínas extracelulares tales como los factores IX y X de la coagulación sanguínea (Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061; Furie y Furie, 1988, Cell 53: 505-518), en otros genes de Drosophila (Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55: 1047-1059) y en algunas proteínas receptoras de la superficie celular, tales como la trombomodulina (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6: 1891-1897) y del receptor de las LDL (Sudhof et al., 1985, Science 228: 815-822). Se ha cartografiado un sitio de unión a proteínas en el dominio de repeticiones del FCE en la trombomodulina y la urocinasa (Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4437-4440). Se ha clonado y caracterizado el gen Serrate de Drosophila (publicación de patente internacional PCT WO 93/12141 registrada el 24 de junio de 1993). Sin embargo, antes de la presente invención, a pesar de los intentos de conseguir lo mismo, no se disponía de ningún gen Serrate en los vertebrados.

La citación de las referencias anteriores no será interpretada como una admisión de que tales referencias son una técnica anterior para la presente invención.

3. Compendio de la invención

La presente invención se refiere a las secuencias nucleotídicas de genes Serrate de vertebrado (Serrate humanos y genes relacionados en otras especies) y las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas, así como derivados (por ejemplo, fragmentos) de las mismas. También se dan a conocer ácidos nucleicos hibridables o complementarios a las secuencias nucleotídicas precedentes. En una realización específica, la proteína Serrate es una proteína
humana.

La invención se refiere a los derivados de la Serrate de vertebrado de la invención que son funcionalmente activos, es decir, pueden mostrar una o más de las actividades funcionales conocidas asociadas a una proteína Serrate de longitud completa (de tipo salvaje). Tales actividades funcionales incluyen, pero sin limitarse a ellas, antigenicidad [capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a un anticuerpo anti-Serrate], inmunogenia (capacidad para generar anticuerpos que se unen a Serrate), capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a Notch u otras proteínas toporrítmicas o fragmentos de las mismas ("adherencia"), capacidad de unirse (o competir con Serrate por la unión) a un receptor para Serrate. Las "proteínas toporrítmicas" tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a los productos proteicos de Notch, Delta, Serrate, Enhancer of split y Deltex así como otros miembros de esta familia de genes interaccionantes que se pueden identificar, por ejemplo, en virtud de la capacidad de hibridarse que tienen las secuencias de sus genes, o su homología con Delta, Serrate o Notch, o la capacidad para desplegar interacciones fenotípicas que tienen sus genes.

La invención se refiere adicionalmente a fragmentos (y derivados y análogos de los mismos) de la Serrate de vertebrado que comprenden uno o más dominios de la proteína Serrate que incluye, pero sin limitarse a ellos, el dominio intracelular, el dominio extracelular, el dominio transmembranario, la región asociada a la membrana, o una o más repeticiones similares al FCE (homólogas) de una proteína, o alguna combinación de lo anterior.

Adicionalmente se dan a conocer los anticuerpos contra la Serrate de vertebrado y sus derivados.

También se dan a conocer los métodos de producción de las proteínas Serrate de vertebrado y sus derivados, por ejemplo, mediante medios recombinantes.

La presente invención también se refiere a composiciones a base de las proteínas y ácidos nucleicos de la Serrate de vertebrado.

3.1. Definiciones

Tal y como se utiliza en la presente memoria, subrayar o poner en cursiva el nombre de un gen indicará el gen, a diferencia de su producto proteico codificado, que se indica mediante el nombre del gen en ausencia de subrayado. Por ejemplo, "Serrate" querrá decir el gen Serrate, mientras que "Serrate" indicará el producto proteico del gen
Serrate.

4. Descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 1) y secuencia proteica (SEQ ID n.º 2) del Serrate-1 humano (también conocido como Jagged-1 humano [HJ1]).

Figura 2. Secuencia nucleotídica "completa" (SEQ ID n.º 3) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 4) del Serrate-2 humano (también conocido como Jagged-2 humano [HJ2]) generado en el ordenador al combinar la secuencia de los clones pBS15 y pBS3-2 aislados de las genotecas de ADNc del cerebro fetal humano. Hay una deleción de aproximadamente 120 nucleótidos en la región de esta secuencia que codifica la porción de la Serrate-2 humana entre la secuencia señal y el comienzo del dominio DSL.

Figura 3. Secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 5) de ADNc de la Serrate de pollo (C-Serrate).

Figura 4. Secuencia de aminoácidos (SEQ ID n.º 6) de la C-Serrate (que carece del extremo amino de la secuencia señal). El posible sitio de escisión que hay después de la secuencia señal (que marca el extremo amino predicho para la proteína madura) está marcado con una punta de flecha; el dominio DSL está indicado con asteriscos; las repeticiones de tipo FCE (RTF) están subrayadas con líneas discontinuas; la región rica en cisteínas entre las RTF y el dominio transmembranario está marcada entre flechas, y el único dominio transmembranario (entre los aminoácidos 1042 y 1066) se muestra en negrita.

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Figura 5. Alineamiento de las secuencias del extremo amino de Delta (SEQ ID n.º 7) y Serrate (SEQ ID n.º 8) de Drosophila melanogaster con C-Serrate (SEQ ID n.º 6). La región mostrada se extiende desde el extremo de la secuencia señal hasta el extremo del dominio DSL. El dominio DSL está señalado. Los aminoácidos idénticos en las tres proteínas están encuadrados.

Figura 6. Diagrama que muestra la estructura de los dominios de Delta de Drosophila y Serrate de Drosophila en comparación con C-Serrate. No se muestra la segunda región rica en cisteína que hay cadena abajo de las repeticiones del FCE, presentes sólo en C-Serrate y Serrate de Drosophila. Las regiones hidrófobas se muestran en negro; los dominios DSL están ajedrezados y las repeticiones similares al FCE están rayadas.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a las secuencias nucleotídicas de genes Serrate de los vertebrados y las secuencias aminoacídicas de las proteínas que codifican. La invención se refiere adicionalmente a fragmentos y otros derivados de las proteínas Serrate de los vertebrados. Los ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos o derivados también se encuentran dentro del alcance de la invención. La invención da a conocer genes Serrate de los vertebrados y las proteínas que codifican en muchas especies diferentes. Los genes Serrate de la invención incluyen el Serrate humano y otros genes relacionados (homólogos) en especies de vertebrados. En realizaciones específicas, los genes y proteínas de Serrate son de mamíferos. En una realización preferente de la invención, la proteína Serrate es una proteína humana. En las realizaciones más preferentes, la proteína Serrate es la Serrate-1 humana o la Serrate-2 humana. Se da a conocer la producción de las proteínas y derivados anteriores, por ejemplo, mediante métodos recombinantes.

La invención se refiere a los derivados y análogos de la Serrate de vertebrado de la invención que son funcionalmente activos, es decir, son capaces de exhibir una o más de las actividades funcionales conocidas asociadas a una proteína Serrate completa (de tipo salvaje). Tales actividades funcionales incluyen, pero sin limitarse a ellas, antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con Serrate por la unión) a un anticuerpo anti-Serrate], inmunogenia (capacidad para generar un anticuerpo que se une a Serrate), capacidad para unirse (o competir con Serrate por la unión) a Notch u otras proteínas toporrítmicas o fragmentos de las mismas ("adherencia"), capacidad para unirse (o competir con Serrate por la unión) a un receptor de Serrate. "Proteínas toporrítmicas", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a los productos proteicos de Notch, Delta, Serrate, Enhancer of split y Deltex, así como a otros miembros de esta familia de genes que interaccionan entre sí y que se pueden identificar, por ejemplo, por medio de la capacidad que tienen sus secuencias génicas para hibridarse, o su homología a Delta, Serrate o Notch, o la capacidad que tienen sus genes para desplegar interacciones fenotípicas.

La invención se refiere adicionalmente a fragmentos (y derivados de los mismos) de una Serrate de vertebrado que comprende uno o más dominios de la proteína Serrate, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el dominio intracelular, el dominio extracelular, el dominio transmembranario, la región asociada a la membrana o una o más repeticiones similares (homólogas) al FCE de una proteína Serrate, o alguna combinación de lo anterior.

Adicionalmente, también se dan a conocer anticuerpos contra Serrate y sus derivados.

La invención se ilustra por medio de los ejemplos de más abajo que describen, entre otras cosas, la clonación de un homólogo de Serrate en ratón (sección 6), la clonación de un homólogo de Serrate en Xenopus (rana) (sección 7), la clonación de un homólogo de Serrate en pollo (sección 8) y la clonación de los homólogos de Serrate en humanos Serrate-1 humano (HJ1) y Serrate-2 humano (HJ2) (sección 9).

Para una descripción clara, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en los subapartados que siguen.

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5.1. Aislamiento de los genes Serrate

La invención se refiere a las secuencias nucleotídicas de los ácidos nucleicos de Serrate en los vertebrados. En realizaciones específicas, los ácidos nucleicos del Serrate de vertebrado comprenden las secuencias de ADNc mostradas en la figura 1 (SEQ ID n.º 1), figura 2 (SEQ ID n.º 3), figura 3 (SEQ ID n.º 6) o las regiones codificantes de las mismas, o ácidos nucleicos que codifican una proteína Serrate de vertebrado (por ejemplo, que tenga la secuencia de SEQ ID n.º 2, 4 ó 6).

La invención da a conocer ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de Serrate de vertebrado.

En una realización específica se da a conocer un ácido nucleico que es hibridable a un ácido nucleico de Serrate de vertebrado (por ejemplo, que tiene la secuencia de SEQ ID n.º 1) o a un ácido nucleico que codifica un derivado de Serrate de vertebrado, en condiciones poco rigurosas. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos que utilizan tales condiciones poco rigurosas son como sigue (véase también Shilo y Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792): se tratan los filtros que contienen el ADN durante 6 h a 40ºC con una disolución que contiene formamida al 35%, SSC a 5X, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 5 mM, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, SAB al 1% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 500 \mug/ml. Las hibridaciones se realizan en la misma disolución con las modificaciones siguientes: PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, SAB al 0,2%, ADN de esperma de salmón a 100 \mug/ml, sulfato de dextrano al 10% (p/v), y se utiliza una sonda marcada con ^{32}P a 5-20 x 10^{6} cpm. Se incuban los filtros en una mezcla de hibridación durante 18 a 20 h a 40ºC y luego se lavan durante 1,5 h a 55ºC en una disolución que contiene SSC a 2X, Tris-HCl a 25 mM (pH 7,4), EDTA a 5 mM y SDS al 0,1%. Se reemplaza la disolución de lavado por una disolución nueva y se incuba 1,5 h más a 60ºC. Los filtros se transfieren secos y se exponen a una autorradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan una tercera vez a 65-68ºC y se vuelven a exponer en una película. Se pueden utilizar otras condiciones poco rigurosas que se conocen bien en la técnica (por ejemplo, tal y como se emplea para las hibridaciones entre especies).

En otra realización específica se da a conocer un ácido nucleico que es hibridable a un ácido nucleico de la Serrate de vertebrado en condiciones muy rigurosas. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos que utilizan tales condiciones muy rigurosas son los siguientes: la prehibridación de los filtros que contienen el ADN se lleva a cabo durante 8 horas o hasta una noche a 65ºC en un tampón compuesto por SSC a 6X, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, SAB al 0,02% y ADN desnaturalizado de esperma de salmón a 500 \mug/ml. Los filtros se hibridan durante 48 h a 65ºC en la mezcla de prehibridación que contiene ADN desnaturalizado de esperma de salmón a 100 \mug/ml y 5-20 x 10^{6} cpm de la sonda marcada conP. El lavado de los filtros se realiza a 37ºC durante 1 h en una disolución que contiene SSC a 2X, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y SAB al 0,01%. A esto le sigue un lavado de 45 minutos en SSC a 0,1X a 50ºC antes de la autorradiografía. Se pueden utilizar otras condiciones muy rigurosas que se conocen bien en la técnica.

Adicionalmente se dan a conocer los ácidos nucleicos que codifican fragmentos y derivados de las proteínas Serrate de vertebrado (véase el apartado 5.6) y los ácidos nucleicos antisentido del Serrate de vertebrado (véase el apartado 5.11). Como es muy obvio, tal y como se utiliza en la presente memoria, un "ácido nucleico que codifica un fragmento o porción de una proteína Serrate" será interpretado como que se refiere a un ácido nucleico que codifica sólo el citados fragmento o porción de la proteína Serrate, y no las otras porciones contiguas de la proteína Serrate como una secuencia continua.

A continuación aparecen las realizaciones específicas para la clonación de un gen Serrate de vertebrado, presentado como un ejemplo particular pero no a modo de limitación:

Para la clonación para la expresión (una técnica conocida habitualmente en la técnica), se construye una genoteca de expresión mediante los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se aísla el ARNm (por ejemplo, de humanos), se fabrica el ADNc y se liga en un vector de expresión (por ejemplo, un derivado de bacteriófago) de tal modo que sea capaz de expresarse en la célula hospedadora en la que se introduce luego. A continuación se pueden utilizar varios ensayos de cribado para seleccionar el producto Serrate expresado. En una realización se pueden utilizar anticuerpos anti-Serrate para la selección.

En otro aspecto preferente, se utiliza la PCR para amplificar la secuencia deseada en una genoteca genómica o de ADNc, antes de la selección. Los cebadores oligonucleotídicos que representan secuencias de Serrate conocidas se pueden utilizar como cebadores para la PCR. En un aspecto preferente, los cebadores oligonucleotídicos codifican al menos una parte de los segmentos conservados de Serrate con mucha homología entre Serrate y Delta. Se pueden utilizar los oligonucleótidos sintéticos como cebadores para amplificar mediante secuencias de PCR desde una fuente (ARN o ADN), preferiblemente una genoteca de ADNc, que posiblemente resulte de interés. Se puede llevar a cabo la PCR, por ejemplo, en un termociclador Cetus de Perkin-Elmer y con Taq polimerasa (Gene Amp^{TM}). El ADN a amplificar incluye un ARNm o un ADNc o un ADN genómico de cualquier especie eucariota. Se puede optar por sintetizar varios cebadores degenerados diferentes y utilizarlos en las reacciones de PCR. También es posible variar el rigor de las condiciones de hibridación utilizadas para cebar las reacciones de PCR, para permitir una mayor o menor similitud de la secuencia nucleotídica entre la secuencia nucleotídica de Serrate conocida y el homólogo del ácido nucleico a aislar. Para la hibridación entre especies se prefieren condiciones poco rigurosas. Para la hibridación dentro de la misma especie se prefieren las condiciones moderadamente rigurosas. Después de la amplificación satisfactoria de un segmento de un homólogo de Serrate, se puede clonar y secuenciar ese segmento y utilizarlo como sonda para aislar un ADNc completo o un clon genómico. Esto, a su vez, permitirá determinar la secuencia nucleotídica completa del gen, el análisis de su expresión y la producción de su producto proteico para el análisis funcional, tal y como se describe más adelante. De este modo se pueden identificar otros genes que codifican proteínas Serrate. Se presenta tal procedimiento a modo de ejemplo en distintos apartados de ejemplo más adelante.

Los métodos anteriores no pretenden limitar la descripción general siguiente de los métodos mediante los cuales se pueden obtener clones del Serrate de vertebrado.

Cualquier célula de vertebrado puede servir en potencia como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen Serrate. Se pueden aislar secuencias de ácido nucleico que codifican la Serrate de humanos, cerdos, bóvidos, aves, caballos, perros, así como otras fuentes de primates, etc. Por ejemplo, hemos amplificado fragmentos del tamaño adecuado en ratón, Xenopus y humanos mediante PCR con genotecas de ADNc y cebadores del Serrate de Drosophila. Se puede obtener el ADN mediante los procedimientos estándares conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "genoteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc, o mediante la clonación del ADN genómico o fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: a practical approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., vol. I, II). Los clones obtenidos del ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrones además de las regiones codificantes; los clones obtenidos del ADNc contendrán sólo secuencias exónicas. De forma independiente a la fuente, se debe clonar molecularmente el gen en un vector adecuado para la propagación
del gen.

En la clonación molecular del gen del ADN genómico, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales contendrán el gen deseado. El ADN se puede escindir en sitios específicos mediante diferentes enzimas de restricción. Alternativamente se puede utilizar una ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o se puede romper físicamente el ADN por cizalladura, por ejemplo, con ultrasonidos. A continuación se pueden separar los fragmentos de ADN lineales según el tamaño mediante técnicas estándares que incluyen, pero sin limitarse a ellas, electroforesis en geles de poliacrilamida y de agarosa, y cromatografía en columna.

Una vez que se generan los fragmentos de ADN, la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado se puede llevar a cabo de varias formas. Por ejemplo, si se dispone de un gen Serrate (de cualquier especie) o su ARN específico, o un fragmento del mismo, por ejemplo, un dominio extracelular (véase el apartado 5.6), y se puede purificar y marcar, se pueden detectar selectivamente los fragmentos del ADN generados mediante la hibridación de ácidos nucleicos con la sonda marcada (Benton, W y Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. y Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961). Se hibridarán los fragmentos de ADN con una homología considerable a la sonda. También es posible identificar el fragmento adecuado mediante la(s) diges-
tión(ones) con enzima(s) de restricción y la comparación del tamaño de los fragmentos con los esperados de acuerdo con una cartografía de restricción conocida, si se dispone de ésta. Se puede llevar a cabo una selección adicional basándose en las propiedades del gen. Alternativamente se puede detectar la presencia del gen mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunitarias de su producto expresado. Por ejemplo, se pueden seleccionar clones de ADNc, o clones de ADN que se hibridan o seleccionan los ARNm adecuados, que producen una proteína que, por ejemplo, tiene migración electroforética, comportamiento en isoelectroenfoque, mapas de digestión proteolíticos, actividad de unión al receptor, actividad de agregación in vitro ("adherencia") o propiedades antigénicas similares o idénticas a las conocidas para Serrate. Si se dispone de un anticuerpo contra Serrate, se puede identificar la proteína Serrate mediante la unión del anticuerpo marcado a los posibles clones que sintetizan la Serrate, en un procedimiento de tipo ELISA (inmunoensayo enzimático).

También se puede identificar el gen Serrate por la selección del ARNm mediante la hibridación de ácidos nucleicos seguida de la traducción in vitro. En este procedimiento se utilizan fragmentos para aislar los ARNm complementarios por hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar ADN de Serrate purificado y disponible de otras especies (por ejemplo, humano, pollo). Los análisis de inmunoprecipitación o los ensayos funcionales (por ejemplo, capacidad de agregación in vitro; unión al receptor; véase más adelante) de los productos de traducción in vitro de los productos aislados de los ARNm aislados identifican el ARNm y, por lo tanto, los fragmentos de ADN complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además se pueden seleccionar los ARNm específicos mediante la adsorción de los polisomas aislados de células sobre anticuerpos inmovilizados dirigidos específicamente contra la proteína Serrate. Se puede sintetizar el ADNc radiomarcado de Serrate mediante el ARNm seleccionado (de los polisomas adsorbidos) como plantilla. A continuación se puede utilizar el ARNm o el ADNc radiomarcado como sonda para identificar los fragmentos de ADN de Serrate entre otros fragmentos de ADN genómico.

Las alternativas para aislar el ADN genómico del Serrate incluyen, pero sin limitarse a ellas, sintetizar químicamente la secuencia génica en él mismo a partir de una secuencia conocida o fabricar el ADNc a partir del ARNm que codifica la proteína Serrate. Por ejemplo, el ARN para clonar el ADNc del gen Serrate se puede aislar de las células que expresan Serrate. Dentro del alcance de la invención tienen cabida otros posibles métodos.

A continuación el gen identificado y aislado se puede introducir en un vector de clonación adecuado. Se puede utilizar un gran número de sistemas de vector y hospedador conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin limitarse a ellos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora utilizada. Tales vectores incluyen, pero sin limitarse a ellos, bacteriófagos tales como los derivados de \lambda, o plásmidos tales como los derivados de los plásmidos pBR322 o pUC. La introducción en un vector de clonación puede, por ejemplo, llevarse a cabo ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente se puede producir cualquier sitio deseado al ligarle secuencias nucleotídicas (conectores) en los extremos del ADN; estos conectores ligados pueden comprender oligonucleótidos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. En un método alternativo se puede modificar el vector escindido y el gen Serrate mediante extensión homopolimérica. Se pueden introducir moléculas recombinantes en las células hospedadoras mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de tal forma que se generan muchas copias de la secuencia génica.

En un método alternativo, el gen deseado se puede identificar y aislar después de estar insertado en un vector de clonación adecuado mediante un método "de rotura aleatoria". El enriquecimiento del gen deseado, por ejemplo, mediante fraccionamiento por tamaño, se hace antes de introducirlo en el vector de clonación.

En realizaciones específicas, la transformación de las células hospedadoras con moléculas de ADN recombinantes que incorporan el gen Serrate aislado, su ADNc o la secuencia sintetizada de su ADN permite generar numerosas copias del gen. Por lo tanto, se puede obtener el gen en gran cantidad mediante el cultivo de transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinantes de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen introducido a partir del ADN recombinante aislado.

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5.2. Expresión de los genes Serrate

La secuencia nucleotídica que codifica una proteína Serrate de vertebrado o un fragmento funcionalmente activo u otro derivado de la misma (véase el apartado 5.6) se puede introducir en un vector de expresión adecuado, a saber, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia introducida que codifica la proteína. También se pueden suministrar las señales transcripcionales y traduccionales necesarias mediante el gen Serrate original del vertebrado y/o sus regiones flanqueantes. Se pueden utilizar numerosos sistemas de hospedador y vector para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (por ejemplo, virus de la variolovacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos, tal como levadura, que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de los vectores tienen diferentes potencia y especificidad. Según el sistema de hospedador y vector utilizado, se puede utilizar alguno de los numerosos elementos de transcripción y traducción adecuados. En una realización específica se expresa la porción adherente del gen Serrate. En otras realizaciones específicas se expresa un gen o una secuencia del Serrate humano que codifica una porción funcionalmente activa de un gen de la Serrate humana, tal como Serrate-1 humano (HJ1) o Serrate-2 humano (HJ2). En otra realización más, se expresa un fragmento de la Serrate que comprende el dominio extracelular, u otro derivado, o análogo de Serrate.

Se pueden utilizar cualquiera de los métodos descritos previamente para introducir fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales de control transcripcional/traduccional adecuadas y la secuencia codificante de la proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína o fragmento peptídico de Serrate se puede regular mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de tal forma que la proteína o el péptido Serrate se exprese en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína Serrate se puede controlar mediante cualquier promotor/elemento potenciador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión génica toporrítmica incluyen, pero sin limitarse a ellas, la región promotora temprana del SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa herpética (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature, 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727-3731) o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242-74-94; vectores de expresión vegetales que comprenden la región del promotor de la nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) o el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120); elementos del promotor de la levadura y otros hongos tales como el promotor de Gal4, el promotor de la ADC (alcohol deshidrogenasa); promotor de la PGK (fosfoglicerato cinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina, y las regiones de control transcripcional animal siguientes, que muestran histoespecificidad y se han utilizado en los animales transgénicos: región del control del gen de la elastasa I que actúa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell, 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515), región de control del gen de la insulina que actúa en las células pancreáticas \beta (Hanahan, 1985, Nature, 315: 115-122), región de control del gen de la inmunoglobulina que actúa en los linfocitos (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), región de control del virus del tumor mamario de ratón que actúa en las células de los testículos, de la mama, los linfocitos y los mastocitos (Leder et al., 1986, Cell, 45: 485-495), región de control del gen de la albúmina que actúa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel, 1: 268-276), región de control del gen de la \alpha-fetoproteína que actúa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); región de control del gen de la antitripsina \alpha-1 que actúa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel., 1: 161-171), región de control del gen de la globina \beta que actúa en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); región de control del gen de la proteína básica de la mielina que actúa en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); región de control del gen de cadena ligera 2 de la miosina que actúa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314: 283-286) y región de control del gen de la gonadoliberina que actúa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science, 234: 1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen insertos del gen Serrate se pueden identificar mediante tres estrategias generales: a) hibridación de ácidos nucleicos, b) presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras" y c) expresión de secuencias insertadas. En la primera estrategia, se puede detectar la presencia de un gen foráneo introducido en un vector de expresión mediante hibridación de ácidos nucleicos con sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen toporrítmico insertado. En la segunda estrategia, se puede identificar el sistema de vector y hospedador recombinante, y seleccionarlo según la presencia o ausencia de determinadas funciones génicas "marcadoras" (por ejemplo, actividad de la timidina cinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en los baculovirus, etc.) originados por la introducción de genes foráneos en el vector. Por ejemplo, si el gen Serrate se introduce dentro de la secuencia del gen marcador del vector, los recombinantes que contengan el inserto de Serrate se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. En la tercera estrategia, se pueden identificar los vectores de expresión recombinantes al ensayar el producto del gen foráneo expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales del producto del gen Serrate en sistemas de ensayos in vitro, por ejemplo, agregación (unión) con Notch, unión a un receptor, unión con anticuerpo.

Una vez que se ha identificado y aislado una molécula de ADN recombinante determinada, se pueden utilizar varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez que se han establecido las condiciones adecuadas del sistema hospedador y del crecimiento, se pueden propagar vectores de expresión recombinantes y preparar una gran cantidad de ellos. Tal y como se explicó anteriormente, los vectores de expresión que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como el virus de la variolovacuna o el adenovirus; virus de insectos tales como el baculovirus; vectores de levadura; vectores bacteriofágicos (por ejemplo, \lambda) y vectores de ADN de cósmidos y plásmidos, por nombrar unos pocos.

Además, se puede escoger una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. La expresión a partir de determinados promotores puede ser elevada en presencia de determinados inductores; por lo tanto, se puede controlar la expresión de la proteína Serrate genéticamente modificada. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento traduccional y postraduccional y la modificación (por ejemplo, glucosilación, escisión [por ejemplo, de la secuencia señal]) de las proteínas. Se pueden elegir sistemas de estirpes celulares u hospedadores adecuados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína foránea expresada. Por ejemplo, se puede utilizar la expresión en un sistema bacteriano para producir el núcleo de un producto proteico sin glucosilar. La expresión en la levadura producirá un producto glucosilado. Se puede utilizar la expresión en las células de mamífero para asegurar la glucosilación "original" de una proteína toporrítmica de mamífero heteróloga. Además, los diferentes sistemas de expresión de vector y hospedador pueden efectuar reacciones de procesamiento tales como escisiones proteolíticas de diferente extensión.

En otras realizaciones específicas, la proteína, fragmento, o derivado, de Serrate se puede expresar como una fusión o un producto proteico quimérico (que comprende la proteína, fragmento, análogo o derivado, unida mediante un enlace peptídico a una secuencia proteica heteróloga [de una proteína diferente]). Se puede fabricar tal producto quimérico al ligar unas a otras las secuencias de ácido nucleico adecuadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseados mediante los métodos conocidos en la técnica, en el marco de lectura adecuado, y al expresar el producto quimérico mediante los métodos conocidos por todos en la técnica. Alternativamente, se puede fabricar un producto quimérico tal mediante técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, mediante un sintetizador de péptidos.

Se pueden clonar y expresar tanto las secuencias de ADNc como las genómicas.

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5.3. Identificación y purificación de los productos del gen Serrate

En determinados aspectos, la invención proporciona secuencias de aminoácidos de un Serrate de vertebrado, preferiblemente un homólogo humano de Serrate, y fragmentos y derivados de las mismas que comprenden un determinante antigénico (es decir, pueden ser reconocidos por un anticuerpo) o que de si no son funcionalmente activos, así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican lo anterior. Material "funcionalmente activo" tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere al material que muestra una o más de las actividades funcionales conocidas asociadas a una proteína Serrate (de tipo salvaje) de longitud completa, por ejemplo, unión a Notch o una porción de la misma, unión a cualquier otro ligando de Serrate, antigenicidad (unión a un anticuerpo anti-Serrate), etc.

En realizaciones específicas, la invención proporciona fragmentos de una proteína Serrate de vertebrado que consiste en al menos 10 aminoácidos. En otras realizaciones, las proteínas comprenden o consisten esencialmente en un dominio extracelular, dominio DSL, dominio de repetición de tipo factor de crecimiento epidérmico (RTF), una o alguna combinación de los RTF, región rica en cisteínas, dominio transmembranario, o dominio (citoplasmático) intracelular, o una porción que se une a Notch, o cualquier combinación de lo anterior, de una proteína Serrate. También se dan a conocer fragmentos, o proteínas que comprenden fragmentos, que carecen de algunas o todas las regiones anteriores de una proteína Serrate de vertebrado. Se dan a conocer los ácidos nucleicos que codifican lo
anterior.

Una vez que se ha identificado un recombinante que expresa la secuencia del gen Serrate de vertebrado, se puede analizar el producto génico. Esto se consigue mediante ensayos que se basan en las propiedades físicas o funcionales del producto, que incluyen la marcación radioactiva del producto seguida del análisis mediante electroforesis en gel, inmunoensayo, etc.

Una vez que se ha identificado la proteína Serrate, se puede aislar y purificar mediante los métodos estándares que incluyen la cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad y columna de cromatografía de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para purificar proteínas. Se pueden evaluar las propiedades funcionales con cualquier ensayo adecuado (véase el apartado 5.7).

Alternativamente, una vez que se identifica una proteína Serrate producida mediante un recombinante, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína a partir de la secuencia nucleotídica del gen quimérico contenido en el recombinante. Como resultado, se puede sintetizar la proteína mediante los métodos químicos estándares conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310: 105-111).

En una realización específica de la presente invención, tales proteínas Serrate, ya sea producidas mediante técnicas de ADN recombinante o mediante métodos de síntesis química, incluyen, pero sin limitarse a ellas, las que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos que sustancialmente se describe en las figuras 1, 2 ó 3 (SEQ ID n.º 2, 4, o 6, respectivamente), así como fragmentos y otros derivados de las mismas.

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5.4. Estructura de los genes Serrate y sus proteínas

Se puede analizar la estructura de los genes Serrate y sus proteínas mediante los diversos métodos conocidos en la técnica.

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5.4.1. Análisis genético

Se puede analizar el ADN o el ADNc clonado correspondiente al gen Serrate de vertebrado mediante los métodos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, la hibridación de tipo Southern (Southern, E. M., 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517), hibridación de tipo Northern (véase, por ejemplo, Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4094-4098), mapas de restricción con endonucleasas (Maniatis, T., 1982, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, Nueva York) y análisis de la secuencia del ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR; patente de los EE.UU. n.º 4.683.202, 4.683.195 y 4.889.818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120: 621-623; Loh et al., 1989, Science 243: 217-220) seguida de la hibridación de tipo Southern con una sonda específica de Serrate puede permitir la detección del gen Serrate en el ADN de varios tipos de células. Los métodos de amplificación diferentes a la PCR los conocen todos y también se pueden utilizar. En una realización se puede utilizar la hibridación de tipo Southern para determinar el ligamiento genético de Serrate. Se puede utilizar el análisis mediante hibridación de tipo Northern para determinar la expresión del gen Serrate. Se pueden evaluar diversos tipos de células, en distintos estados de desarrollo o de actividad en busca de la expresión de Serrate. Los ejemplos de tales técnicas y sus resultados se describen en el apartado 6, véase más adelante. Se puede manipular el rigor de las condiciones de hibridación para la hibridación de tipo Southern y la de tipo Northern de forma que
asegure la detección de los ácidos nucleicos con la relación deseada con la sonda de Serrate específica utilizada.

Se puede utilizar el mapeo con endonucleasas de restricción para determinar exhaustivamente la estructura genética del gen Serrate. En una realización particular, se puede utilizar la escisión con enzimas de restricción para conseguir el mapa de restricción mostrado en la figura 2 de más adelante. Los mapas de restricción obtenidos mediante la escisión con endonucleasas de restricción se pueden confirmar mediante el análisis de la secuencia del ADN.

Se puede llevar a cabo el análisis de la secuencia del ADN mediante muchas técnicas conocida en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a ellas, el método de Maxam y Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65: 499-560), el método de didesoxinucleótidos de Sanger (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463), el uso de la ADN polimerasa de T7 (Tabor y Richardson, patente de los EE.UU. n.º 4.795.699) o el uso de un secuenciador automático de ADN (por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA). La secuencia del ADNc de un gen Serrate representativo comprende la secuencia que sustancialmente se describe en las figuras 1 y 2, y que se describe en el apartado 9 de más adelante.

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5.4.2. Análisis de las proteínas

La secuencia de aminoácidos de las proteínas Serrate se puede obtener por deducción a partir de la secuencia del ADN o, alternativamente, mediante la secuenciación directa de la proteína, por ejemplo, con un secuenciador automático de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de una proteína Serrate representativa comprende la secuencia que sustancialmente se describe en la figura 1, y se detalla en el apartado 9, véase más adelante, con la proteína madura representativa que se muestra con los aminoácidos de número 30 a 1219.

La secuencia de la proteína Serrate se puede caracterizar adicionalmente mediante un análisis de hidropatía (Hopp, T y Wood, K., 1981, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824). Se puede utilizar un perfil de hidropatía para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas de la proteína Serrate y las correspondientes regiones de la secuencia del gen que codifican tales regiones.

Colateralmente, también se puede realizar un análisis estructural (Chou, P. y Fasman, G.,1974, Biochemistry, 13: 222) para identificar las regiones de Serrate que adquieren estructuras secundarias específicas.

Con los programas informáticos disponibles en la técnica también se puede llevar a cabo la manipulación, la traducción y la predicción de la estructura secundaria, así como la predicción y la representación gráfica del marco de lectura abierto.

También se pueden emplear otros métodos de análisis estructural. Estos incluyen, pero sin limitarse a ellos, la cristalografía de rayos X (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13) y el modelado informático (Fletterick, R. y Zoller, M. (eds.), 1986, "Computer Graphics and Molecular Modeling", en Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).

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5.5. Generación de anticuerpos contra las proteínas Serrate y los derivados de las mismas

Según la invención, se puede utilizar una proteína Serrate de vertebrado, o fragmentos de la misma, como inmunógeno para generar anticuerpos que reconozcan tal inmunógeno. Tales anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab y una genoteca de expresión de Fab. En una realización específica, se producen anticuerpos contra la Serrate humana. En otra realización, se producen anticuerpos contra el dominio extracelular de Serrate. En otra realización, se producen anticuerpos contra el dominio intracelular de Serrate.

Se pueden utilizar distintos procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos policlonales contra una proteína Serrate, o derivado o análogo de la misma. En una realización particular, se pueden obtener anticuerpos policlonales de conejo contra un epítopo de la proteína Serrate codificada por una secuencia descrita en la figura 1, o una subsecuencia de la misma. Para la producción del anticuerpo, se pueden inmunizar distintos animales anfitriones mediante la inyección con la proteína Serrate natural, o una versión sintética, o derivado de la misma (por ejemplo, un fragmento) que incluyen, pero sin limitarse a ellos, conejos, ratones, ratas, etc. Se pueden utilizar diferentes adyuvantes para aumentar la respuesta inmunitaria, según las especies hospedadoras, y que incluyen, pero sin limitarse a ellos, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Propionibacterium acnes.

Para preparar los anticuerpos monoclonales dirigidos contra una secuencia de la proteína Serrate de vertebrado o un análogo de la misma, se puede utilizar cualquier técnica que ofrezca la producción de moléculas de anticuerpos mediante el cultivo continuo de estirpes celulares. Por ejemplo, la técnica de hibridomas desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature, 256: 495-497), así como la técnica de triomas, la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma con EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pág. 77-96). En una realización adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de microorganismos mediante la tecnología reciente (PCT/US90/02545). Según la invención, se pueden utilizar anticuerpos humanos y se pueden obtener mediante hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030) o transformando los linfocitos B humanos con el virus de EBV in vitro (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96). De hecho, según la invención, se pueden utilizar las técnicas desarrolladas para la fabricación de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) mediante el ayuste de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica contra Serrate junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de una actividad biológica adecuada; tales anticuerpos se encuentran dentro del alcance de esta invención.

Según la invención, las técnicas descritas para producir anticuerpos monocatenarios (patente de los EE.UU. n.º 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios específicos de Serrate. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para construir genotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada contra las proteínas, derivados, o análogos, de Serrate.

Se pueden generar fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula mediante las técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse a ellos, el fragmento F(ab')_{2} que se puede producir mediante la digestión de la pepsina de la molécula del anticuerpo; los fragmentos Fab' que se generan al reducir los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, y los fragmentos Fab que se generan al tratar la molécula del anticuerpo con papaína y un reductor.

En la producción de anticuerpos se puede llevar a cabo la detección selectiva del anticuerpo deseado mediante las técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (inmunoensayo enzimático). Por ejemplo, para seleccionar los anticuerpos que reconocen un dominio específico de una proteína Serrate, se pueden ensayar los hibridomas generados en busca de un producto que se una a un fragmento de Serrate que contiene tal dominio. Para seleccionar un anticuerpo específico contra una Serrate de vertebrado (por ejemplo, humana), se puede seleccionar basándose en la unión positiva a la Serrate de vertebrado y la ausencia de unión a la Serrate de Drosophila. En otra realización, se puede seleccionar por la unión a la Serrate humana y no a la Serrate de otras especies.

Se pueden utilizar los anticuerpos anteriores en los métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y la actividad de las secuencias de las proteínas de la invención (por ejemplo, véase el apartado 5.7 más adelante), por ejemplo, para tomar imágenes de estas proteínas, medir los niveles de las mismas en las muestras fisiológicas adecuadas, en métodos de diagnóstico, etc.

También se dan a conocer anticuerpos específicos contra un dominio de una proteína Serrate. En una realización específica, se dan a conocer los anticuerpos que se unen a un fragmento de Serrate con el que se une a Notch.

En otra realización de la invención (véase más adelante), los anticuerpos anti-Serrate y los fragmentos de los mismos que contienen el dominio de unión son medicamentos.

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5.6. Proteínas, derivados y análogos de Serrate

La invención se refiere adicionalmente a las proteínas Serrate de los vertebrados, y derivados (que incluyen, pero sin limitarse a ellos, fragmentos) de las proteínas Serrate. También se dan a conocer ácidos nucleicos que codifican derivados y análogos proteicos de la proteína Serrate de vertebrado. En una realización, las proteínas Serrate están codificadas por los ácidos nucleicos de Serrate de los vertebrados descritos en el apartado 5.1 anterior. En determinados aspectos, las proteínas, derivados o análogos son de rana, ratón, rata, cerdo, vaca, perro, mono o proteínas Serrate humanas.

La producción y el uso de los derivados y los análogos relacionados con la Serrate de los vertebrados se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En una realización específica, el derivado o análogo es funcionalmente activo, es decir, capaz de mostrar una o más actividades funcionales asociadas a una proteína Serrate completa de tipo salvaje. Como un ejemplo, se pueden utilizar tales derivados o análogos que tienen la inmunogenia o antigenia deseada, por ejemplo, en inmunoensayos, para la inmunización, para la inhibición de la actividad de Serrate, etc. Tales moléculas que conservan, o alternativamente inhiben, una propiedad deseada de Serrate, por ejemplo, la unión a Notch u otras proteínas toporrítmicas, la unión a un receptor de la superficie celular, se pueden utilizar como inductores o inhibidores, respectivamente, de tal propiedad y sus indicadores fisiológicos. Una realización específica se refiere a un fragmento de Serrate que se puede unir mediante un anticuerpo anti-Serrate, pero que no se puede unir a una proteína Notch u otra proteína toporrítmica. Se pueden evaluar la actividad deseada en los derivados o análogos de Serrate mediante los procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los ensayos descritos en el apartado 5.7.

En particular, se pueden fabricar derivados de Serrate alterando las secuencias de Serrate mediante una sustitución, que garantiza moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificantes, se pueden utilizar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen Serrate en la puesta en práctica de la presente invención. Estas incluyen, pero sin limitarse a ellas, secuencias nucleotídicas que comprenden todo o partes de los genes Serrate que están alterados por la sustitución de diferentes codones que codifican un resto aminoacídico funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, lo que produce un cambio imperceptible. Así mismo, los derivados de Serrate de la invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, los que contienen, como una secuencia de aminoácidos principal, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína Serrate, que incluye las secuencias alteradas en las que un resto aminoacídico funcionalmente activo se sustituye por un resto dentro de la secuencia que da lugar a un cambio imperceptible. Por ejemplo, un resto aminoacídico dentro de la secuencia se puede sustituir por otro aminoácido de una polaridad parecida que actúe como un equivalente funcional, lo que da lugar a un cambio imperceptible. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos apolares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En una realización específica de la invención, se dan a conocer proteínas que consisten en, o que comprenden, un fragmento de una proteína Serrate de vertebrado que consiste en al menos 20 aminoácidos (continuos) de la proteína Serrate.

Los derivados y análogos de Serrate de la invención se pueden producir mediante diferentes métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que dan lugar a su producción se pueden producir a nivel del gen o de la proteína. Por ejemplo, se puede modificar la secuencia del gen Serrate clonado mediante cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). Se puede escindir la secuencia por los sitios adecuados con endonucleasa(s) de restricción, y luego realizar una modificación enzimática adicional si se desea, aislarla y ligarla in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de Serrate se debe tener cuidado para asegurar que el gen modificado permanezca dentro del mismo marco de lectura de traducción que Serrate, sin estar interrumpido por señales de parada traduccionales, en la región del gen donde está codificada la actividad de Serrate deseada.

Adicionalmente, se puede mutar la secuencia de ácido nucleico que codifica Serrate in vitro o in vivo para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones de las regiones codificantes y/o formar nuevos sitios para endonucleasas de restricción o destruir los ya existentes, con el fin de facilitar la modificación adicional in vitro. Se puede utilizar cualquier técnica de mutagénesis conocida en la técnica que incluye, pero sin limitarse a ella, la mutagenia específica de sitio in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), el uso de conectores TAB® (Pharmacia), etc.

Además, se pueden sintetizar químicamente análogos y derivados de Serrate. Por ejemplo, mediante la utilización de un sintetizador de péptidos se puede sintetizar un péptido que corresponde a una porción de una proteína Serrate que comprenda el dominio deseado (véase el apartado 5.6.1) o que intervenga en la actividad de agregación in vitro deseada, o que se una a un receptor.

En una realización específica, el derivado de Serrate es una proteína quimérica o de fusión que comprende una proteína Serrate de vertebrado o un fragmento de la misma (preferiblemente que consiste en al menos un dominio o motivo de la proteína Serrate, o al menos 10 aminoácidos de la proteína Serrate) unido a su extremo amino o carboxilo a través de un enlace peptídico a una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En una realización, tal proteína quimérica se produce mediante la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína (que comprende una secuencia que codifica a Serrate unida en fase a una secuencia que codifica una proteína diferente). Tal producto quimérico se puede fabricar al ligar las secuencias de ácido nucleico adecuadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas unas a las otras mediante los métodos conocidos en la técnica, en el marco de lectura adecuado, y expresar el producto quimérico mediante los métodos conocidos por todos en la técnica. Alternativamente, tal producto quimérico se puede fabricar con técnicas sintéticas de proteínas, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos. En una realización específica, un ácido nucleico quimérico que codifica una proteína Serrate de vertebrado madura con una secuencia señal heteróloga se expresa de tal forma que la célula expresa y procesa tal proteína quimérica para dar la proteína Serrate madura. Como otro ejemplo, y no a modo de limitación, se puede construir una molécula recombinante de acuerdo con la invención, que comprende porciones codificantes tanto de Serrate como de otro gen toporrítmico, por ejemplo, Delta. La proteína codificada por tal molécula recombinante podría mostrar propiedades asociadas tanto a Serrate como a Delta y representar un nuevo perfil de actividades biológicas, que incluiría tanto agonistas como antagonistas. También se puede utilizar la secuencia primaria de Serrate y Delta para predecir la estructura terciaria de las moléculas mediante la simulación informática (Hopp y Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828); se podrían diseñar los genes recombinantes quiméricos Serrate/Delta en vista de las correlaciones entre la estructura terciaria y la función biológica. Así mismo se pueden construir genes quiméricos que comprenden porciones de un Serrate de vertebrado fusionado a alguna secuencia codificante de proteína heteróloga. Una realización específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de una Serrate de vertebrado de al menos diez aminoácidos.

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5.6.1. Derivados de Serrate que contienen uno o más dominios de la proteína

En una realización específica, la invención se refiere a derivados y análogos de la Serrate de vertebrado, en particular, fragmentos de la Serrate de vertebrado y derivados de tales fragmentos que comprenden, o alternativamente consisten en, uno o más dominios de la proteína Serrate que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el dominio extracelular, el dominio DSL, el dominio RTF, el dominio rico en cisteínas, el dominio transmembranario, el dominio intracelular, la región asociada a la membrana y una o más de las repeticiones de tipo FCE (las RTF) de la proteína Serrate, o alguna combinación de lo anterior. En determinados ejemplos que se refieren a las proteínas Serrate humana y de pollo, se identifican tales dominios en los ejemplos de los apartados 9 y 8, respectivamente.

En una realización específica, las moléculas que comprenden fragmentos específicos de la Serrate de vertebrado son los que comprenden fragmentos de la respectiva proteína Serrate más homóloga a los fragmentos específicos de las proteínas Serrate y/o Delta de Drosophila. En realizaciones particulares, tal molécula comprende o consiste en las secuencias de aminoácidos homólogas a las SEQ ID n.º 10, 12 ó 18. Alternativamente, se puede identificar un fragmento que comprende un dominio de un homólogo de Serrate mediante los métodos de análisis de proteínas tal y como se describen en el apartado 5.3.2.

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5.6.2. Derivados de Serrate que intervienen en la unión a los dominios de las proteínas toporrítmicas

La invención también da a conocer fragmentos de la Serrate de vertebrado, y análogos o derivados de tales fragmentos, que intervienen la unión a Notch, y secuencias de ácido nucleico que codifican lo anterior.

En una realización específica, el fragmento adherente de Serrate es el que comprende la porción de Serrate más homóloga a aproximadamente los aminoácidos de número 85 a 283 o 79 a 282 de la secuencia de Serrate de Drosophila (véase la publicación PCT de patente internacional WO 93/12141 fechada el 24 de junio de 1993).

En una realización determinada, el fragmento adherente de una proteína Serrate comprende el dominio DSL, o una porción del mismo. Los subfragmentos dentro del dominio DSL que intervienen en la unión a Notch se pueden identificar mediante el análisis de las construcciones que expresan mutantes de deleción.

La capacidad de unión a Notch se puede demostrar mediante ensayos de agregación in vitro con células que expresan Notch así como con células que expresan Serrate o un derivado de Serrate (véase el apartado 5.7). Es decir, la capacidad que tiene un fragmento de Serrate para unirse a una proteína Notch se puede demostrar al detectar la capacidad que tiene el fragmento de Serrate, cuando se expresa en la superficie de una primera célula, para unirse a una proteína Notch expresada en la superficie de una segunda célula.

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Las secuencias de ácido nucleico que codifican Notch o dominios adherentes de la misma, para utilizarlos en tales ensayos, se pueden aislar de las fuentes humana, porcina, bovina, felina, aviar, equina, canina o de insecto, así como de primates y otras especies en las que se puedan identificar los homólogos de Notch.

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5.7. Ensayos de proteínas, derivados y análogos de Serrate

Con diferentes métodos se puede ensayar la actividad funcional de las proteínas, derivados y análogos de la Serrate de vertebrado.

Por ejemplo, en una realización, en la que se ensaya la capacidad de unión o de competición con la Serrate de tipo salvaje por la unión a un anticuerpo anti-Serrate, se pueden utilizar distintos inmunoensayos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de ensayo competitivo y acompetitivo que utilizan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (inmunoensayo enzimático), inmunoensayos en "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (que utilizan marcación con oro coloidal, enzimática o radioisotópica, por ejemplo), análisis de inmunotransferencia, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de la proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión al anticuerpo se detecta al detectar una marcación en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta al detectar la unión de un reactivo anticuerpo secundario al anticuerpo primario. En otra realización más, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos modos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

En otra realización, donde se ensaya la capacidad para ayudar a la unión a una una proteína toporrítmica, por ejemplo, Notch, se puede realizar un ensayo de agregación in vitro tal como se describe en la publicación PCT de patente internacional WO 93/12141 registrada el 24 de junio de 1993 (véase también Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534; Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699).

En otra realización, donde se identifica un receptor de Serrate, se puede ensayar la unión al receptor, por ejemplo, con los medios que se conocen bien en la técnica. En otra realización, se pueden ensayar las correlaciones fisiológicas de la unión de Serrate a las células que expresan un receptor de Serrate (transducción de la señal).

En otra realización, en sistemas de insectos o de otros modelos, se pueden realizar estudios genéticos para estudiar el efecto fenotípico de un mutante de Serrate que es un derivado o análogo del Serrate de vertebrado de tipo salvaje.

El experto en la técnica conocerá otros métodos, los cuales se encuentran dentro del alcance de la invención.

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5.11. Regulación de la expresión de Serrate con antisentidos

La presente invención da a conocer ácidos nucleicos de al menos diez nucleótidos que son el antisentido de un gen o ADNc que codifica una Serrate de vertebrado o una porción de la misma. "Antisentido", tal y como se utiliza dentro de la presente memoria, se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridarse a una porción de un ARN de Serrate de vertebrado (preferiblemente ARNm) por medio de cierta complementariedad entre las secuencias.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser oligonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, ARN o ADN, o una modificación o derivado de los mismos, que se puede administrar directamente a una célula, o que se pueden producir intracelularmente mediante la transcripción de las secuencias exógenas introducidas.

En otra realización, la invención se refiere a los métodos para inhibir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de Serrate en una célula procariótica o eucariótica que comprende proporcionar a la célula una cantidad eficaz de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido del Serrate de vertebrados de la invención.

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5.11.1. Ácidos nucleicos antisentido del Serrate de vertebrado

Los ácidos nucleicos antisentido del Serrate de vertebrado son de al menos 10 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarios o bicatenarios. Se puede modificar el oligonucleótido en la base, el azúcar o el esqueleto de fosfatos. El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos, o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; publicación PCT de la patente internacional WO n.º 88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicación PCT de la patente internacional WO 89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de escisión desencadenados por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549).

En un aspecto preferente de la invención, se proporciona un oligonucleótido antisentido del Serrate de vertebrado, preferiblemente de ADN monocatenario. En un aspecto más preferente, tal oligonucleótido comprende una secuencia antisentido para la secuencia que codifica un dominio de Serrate de unión a SH3 o un dominio de Serrate de unión a Notch, más preferiblemente, de un homólogo de la Serrate humana. Se puede modificar el oligonucleótido en cualquier posición en su estructura con sustituyentes conocidos por lo general en la técnica.

El oligonucleótido antisentido de Serrate puede comprender al menos una base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero sin limitarse a ellos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, \beta-D-galactosilquenosina, inosina, N^{6}-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N^{6}-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, \beta-D-manosilquenosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N^{6}-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3) w y 2,6-diaminopurina.

En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un residuo de azúcar modificado que se selecciona del grupo que incluye, pero sin limitarse a ellas, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

Aún en otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un esqueleto de fosfatos modificado que se selecciona del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfosfonato, un fosfotriéster de alquilo y un formacetal o análogo de los mismos.

Aún en otra realización, el oligonucleótido es un oligonucleótido anomérico \alpha. Un oligonucleótido anomérico \alpha forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el que, al contrario que las unidades \beta habituales, las hebras corren paralelas la una a la otra (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 6625-6641).

Se puede conjugar el oligonucleótido con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente entrecruzante desencadenado por hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión desencadenado por hibridación, etc.

Los oligonucleótidos de la invención se pueden sintetizar mediante los métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la utilización de un sintetizador automático de ADN (tales como los disponibles comercialmente en Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, se pueden sintetizar oligonucleótidos de fosforotioato por el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids. Res. 16: 3209), se pueden preparar oligonucleótidos de metilfosfonato utilizando soportes poliméricos de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7488-7451), etc.

En una realización específica, el oligonucleótido antisentido de Serrate comprende ARN catalítico, o una ribozima (véase, por ejemplo, la publicación PCT de patente internacional WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225). En otra realización, el oligonucleótido es un 2'-O-metilrribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330).

En una realización alternativa, el ácido nucleico antisentido de Serrate de la invención se produce intracelularmente mediante la transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo de tal forma que sea tomado por una célula, dentro de la cual se transcribe el vector o una porción del mismo, lo que produce un ácido nucleico antisentido (ARN) de la invención. Tal vector contendría una secuencia que codifique el ácido nucleico antisentido de Serrate. Tal vector puede permanecer de forma episómica o integrarse en el cromosoma, siempre y cuando se pueda transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Se pueden construir tales vectores mediante métodos de la tecnología del ADN recombinante estándares en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virus u otros conocidos en la técnica, utilizados para la replicación y la expresión en las células de los mamíferos. La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido de Serrate puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica que funcione en las células de los mamíferos, preferiblemente humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero sin limitarse a ellos, la región del promotor temprano del SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa herpética (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42), etc.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria a, al menos, una porción de un ARN transcrito específico de un gen Serrate de vertebrado, preferiblemente un gen Serrate humano. No obstante, no se requiere una complementariedad absoluta, aunque sea preferente. Una secuencia "complementaria a, al menos, una porción de un ARN", como se cita en la presente memoria, significa una secuencia que tiene una complementariedad suficiente que le permite hibridarse al ARN y formar una doble cadena estable; en el caso de los ácidos nucleicos bicatenarios antisentido de Serrate, se puede, por lo tanto, ensayar una sola hebra del ADN bicatenario, o la formación de una hélice triple. La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Por lo general, cuanto más largo sea el ácido nucleico que se hibrida, más bases mal apareadas con el ARN de Serrate puede contener y todavía formar una doble cadena estable (o triple, como puede ser el caso). El experto en la técnica puede evaluar un grado tolerable de apareamientos erróneos mediante la utilización de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

La presente invención también da a conocer composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la terminología "farmacéuticamente aceptable" significa homologado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE.UU u otras farmacopeas generalmente reconocidas para el uso en animales y, más en particular, en los humanos. La terminología "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el medicamento. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las dextrosas acuosas y la soluciones de glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, en particular para las soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades más pequeñas de humectantes o emulsionantes, o tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adquirir la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación lenta y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. en una calidad farmacéutica. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada del vehículo de tal modo que se proporcione la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debe satisfacer el modo de administración.

En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos habituales como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a los seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un solubilizante y un anestésico local como la lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Por lo general, se suministran los ingredientes por separado o mezclándolos juntos en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un contenedor cerrado herméticamente tal como una ampolla o bolsa de dosis unitaria que indica la cantidad de agente activo. Cuando se ha de administrar la composición por infusión, se puede dispensar con un botella de infusión que contiene agua o disolución salina estériles de calidad farmacéutica. Cuando se ha de administrar la composición por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o disolución salina de tal forma que se puedan mezclar los ingredientes antes de la administración.

Los medicamentos de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como los derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxido férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol , histidina, procaína, etc.

La cantidad del medicamento de la invención que será eficaz para tratar un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección, y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos. La dosis exacta a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir de acuerdo con el juicio del médico de cabecera y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados para la administración intravenosa son generalmente de unos 20 a 500 \mug de compuesto activo por kilogramo de masa corporal. Los intervalos de dosis adecuados para la administración intranasal son generalmente de unos 0,01 pg/kg de masa corporal a 1 mg/kg de masa corporal. Se pueden extrapolar las dosis eficaces a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas con sistemas de prueba con modelos in vitro o animales.

Por lo general, los supositorios contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10% de masa; las formulaciones orales contienen preferiblemente del 10% al 95% del ingrediente activo.

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6. Aislamiento y caracterización de un homólogo de Serrate en ratón

Un homólogo de Serrate en los ratones, denominado M-Serrate-1, se aisló de la siguiente forma:

Gen de Serrate-1 de ratón:

Origen del tejido: ARN de embriones de ratón de 10,5 días

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Método de aislamiento:

a) ADNc cebado aleatoriamente frente al ARN anterior

b) PCR del ADNc anterior utilizando

Cebador de PCR 1: 100 (SEQ ID n.º 9) {que codifica RLCCK(H/E)YQ (SEQ ID n.º 10)}:

Cebador de PCR 2: 101 (SEQ ID n.º 11) {que codifica NGGTCID (SEQ ID n.º 12)}

Condiciones de amplificación: 50 ng de ADNc, 1 \mug de cada cebador, dNTP a 0,2 mM, 1,8 U de Taq (Perkin-Elmer) en 50 \mul del tampón subministrado, 40 ciclos de: 94ºC/30 segundos, 45ºC/2 min, 72ºC/1 min que se extiende 2 segundos en cada ciclo.

Se produjo un fragmento de 18, kb que se secuenció por ambos extremos y se identificó como la secuencia parcial del ADN de M-Serrate-1 que se corresponde a C-Serrate-1:

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Desde el extremo 5':

1

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Traducción de la proteína de lo anterior:

102 (SEQ ID n.º
14) (que corresponde a la secuencia del extremo amino secuencia arriba del dominio DSL)

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Desde el extremo 3' (pero es hebra codificante)

2

Traducción de la proteína de lo anterior:

103 (SEQ ID n.º 16) (dentro de las repeticiones similares al FCE distribuidas en tándem)

Patrón de expresión: se determinó que el patrón de expresión era el mismo que el observado para C-Serrate-1 (Serrate de pollo) (véase el apartado 11 más adelante), que incluye la expresión durante el desarrollo del sistema nervioso central, del sistema nervioso periférico, de las extremidades, del riñón, del cristalino y del sistema vascular.

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7. Aislamiento y caracterización de un homólogo de Serrate en Xenopus

Se aisló un homólogo de Serrate en Xenopus, denominado Xenopus Serrate-1 de la siguiente forma:

Gen Xenopus Serrate-1 :

Origen del tejido: ARN embrionario de la etapa néurula

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Método de aislamiento:

a) ADNc cebado aleatoriamente frente al ARN anterior

b) PCR utilizando:

Cebador 1: 104 (SEQ ID n.º 9) {que codifica RLCCK(H/E)YQ (SEQ ID n.º 10)}:

Cebador 2 de PCR: 105 (SEQ ID n.º 11) {que codifica NGGTCID (SEQ ID n.º 12)}

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Condiciones de la amplificación: 50 ng de ADNc, 1 \mug de cada cebador, dNTP a 0,2 mM, 1,8 U de Taq (Perkin-Elmer) en 50 \mul del tampón suministrado. 40 ciclos de: 94ºC/30 s, 45ºC/2 min, 72ºC/1 min que se extiende 2 s con cada ciclo.

Se produjo un fragmento de \sim700 pb que se secuenció parcialmente para confirmar su relación con C-Serrate-1.

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8. Aislamiento y caracterización de un homólogo de Serrate en pollo

En el presente ejemplo de la memoria, describimos la clonación y la secuencia de un homólogo de Serrate en pollo, C-Serrate, y de fragmentos de dos homólogos de Notch en pollo, C-Notch-1 y C-Notch-2, junto con sus patrones de expresión durante la embriogénesis temprana. Los patrones de transcripción de C-Serrate se solapan con el de C-Notch-1 en muchas regiones del embrión, lo que indica que C-Notch 1, al igual que Notch en Drosophila, es un receptor de Serrate. En particular, Notch y Serrate se expresan en las regiones neurógenas del sistema nervioso central y periférico en desarrollo.

Nuestros datos muestran que Serrate, un ligando conocido de Notch, se ha conservado desde los artrópodos hasta los cordatos. Los patrones de expresión solapantes sugieren la conservación de su relación funcional con Notch e implican que el desarrollo del pollo y, en particular, de su sistema nervioso central, implica la interacción de C-Notch-1 con Serrate en varias ubicaciones específicas.

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Materiales y métodos Embriones

Se obtuvieron huevos de pollo Livorno blanco de la granja universitaria y se incubaron a 38ºC. Los embriones se estadificaron de acuerdo con Hamburger y Hamilton (1951, J. Exp. Zool. 88: 49-92).

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Clonación de homólogos de Notch en pollo

Se amplificaron fragmentos de PCR de unas 1000 pares de bases de los genes Notch 1 y Notch 2 de pollo a partir de ARN de explante ótico (véase más abajo) con cebadores degenerados y condiciones de PCR como las esbozadas en Lardelli y Lendahl (1993, Exp. Cell. Res. 204: 364-372). El fragmento de PCR se subclonó en el Bluescript KS-, se secuenció y se utilizó como molde para fabricar una sonda de ARN antisentido marcado con DIG (kit de transcripción de ARN; Stratagene; mezcla de marcación de ARN con DIG, Boehringer Manheim).

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Clonación de un homólogo del Serrate de Drosophila en pollo

Se diseccionaron los explantes óticos de embriones en las etapas 8 a 13. Cada explante ótico consistía en dos fositas óticas, una sección corta de cerebro posterior y faringe interpuestos y el ectodermo y el mesénquima cefálicos asociados. Se extrajo el ARN mediante una modificación de los protocolos estándares (Sambrook et al., 1989, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) y se aisló el ARNm poliA+ a partir del ARN total utilizando el sistema de aislamiento de ARNm PoliATtract (Promega). Se sintetizó la primera hebra del ADNc mediante el sistema SuperScript Preamplification (Gibco).

Se utilizaron cebadores de PCR y degenerados para amplificar un fragmento de un gen de pollo homólogo al gen Serrate de Drosophila a partir del ADNc del explante ótico. Se diseñaron los cebadores para que reconocieran motivos peptídicos encontrados en las proteínas Serrate y Delta de la mosca:

1) cebador 1, 106 (SEQ ID n.º 17), que corresponde al motivo RLCLK(E/H)YQ (SEQ ID n.º 18) localizado en el extremo amino de las proteínas Delta y Serrate de la mosca.

2) cebador 2, 107 (SEQ ID n.º 11), que corresponde al motivo NGGTCID (SEQ ID n.º 12) encontrado en varias de las repeticiones similares al FCE. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 45ºC durante 1,5 minutos y 72ºC durante 2 minutos; seguidos de una etapa de extensión final de 72ºC durante 10 minutos. Se purificó un producto de PCR de aproximadamente 900 pares de bases de longitud, se subclonó en el Bluescript KS- (Stratagene) y se determinó parcialmente su secuencia de ADN para confirmar que era probablemente un homólogo de Serrate. Luego se utilizó para recuperar clones de ADNc más grandes mediante el cribado de dos genotecas de ADNc:

1) una genoteca de ADNc cebado aleatoriamente de explantes óticos en las etapas 8 a 13.

2) una genoteca de ADNc cebado con oligo-dT de la médula espinal de pollo en la etapa 17. Se aislaron los ADNc solapantes y se subclonaron dos de ellos (denominados 9 y 3A.1), que juntos cubren casi toda la región codificante del gen, en Bluescript KS-. Se determinó la secuencia de ADN a partir de deleciones seriadas anidadas generadas con el kit Nested Deletion (Pharmacia) para ADN bicatenario y el método de terminación de la cadena con didesoxinucleótidos de Sanger con la enzima Sequenase (US Biochemical Corporation). Se alinearon las secuencias y se analizaron utilizando Geneworks 2.3 e Intelligenetics. Se realizaron búsquedas de homología utilizando el programa Sharq.

Para obtener el extremo más en 5' del marco abierto de lectura se utilizaron otras estrategias basadas en la PCR, que incluyen la detección selectiva en muchas otras genotecas (de ADNc y genómicas) utilizando el método de Lardelli et al. (1994, Mechanisms of Development 46: 123-136).

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Hibridación in situ

Se determinaron los patrones de transcripción génica mediante la hibridación in situ utilizando sondas de ARN marcadas con DIG y:

1) protocolo de hibridación in situ muy riguroso de una muestra completa e,

2) hibridación in situ en secciones por criostato según el protocolo de Sträle et al. (1994, Trends in Genet. 10:7).

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Resultados

Para conocer más a fondo la posible función de la Serrate de pollo en el embrión de los vertebrados, examinamos su expresión en relación con la de Notch de pollo, ya que en Drosophila se produce el acoplamiento funcional de Notch y Serrate. Se obtuvieron dos homólogos de Notch de pollo, como se describe a continuación.

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C-Notch-1 y C-Notch-2 son claros homólogos de los genes Notch-1 y Notch-2 de los roedores, respectivamente

Buscamos homólogos de Notch en el pollo por PCR, utilizando el ADNc preparado de dos embriones de pollo de dos días y cebadores degenerados para las regiones conservadas comunes a los homólogos conocidos de los Notch de los roedores. De este modo, obtuvimos fragmentos, cada uno de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, de dos genes diferentes, que hemos llamado C-Notch-1 y C-Notch-2. Los fragmentos se extienden desde la tercera repetición Notch/lin12 hasta, incluidas, las últimas aproximadamente cinco repeticiones similares al FCE. Las repeticiones similares al FCE se encuentran en un gran número de proteínas, la mayoría de las cuales no están relacionadas de ninguna otra manera con Notch. No obstante, las tres repeticiones Notch/lin12 son distintivas de la familia de genes de Notch y se encuentran en todos sus miembros conocidos. C-Notch-1 muestra el mayor grado de identidad de aminoácidos con el Notch1 de los roedores (Weinmaster et al., 1991, Development 113: 199-205) y se expresa en dominios ampliamente similares a los de el Notch1 de los roedores (véase más adelante). De los genes Notch de los roedores, C-Notch-2 es el más parecido a Notch2 (Weinmaster et al., 1992, Development 116: 931-941).

Examinamos los patrones de expresión de C-Notch-1 en los embriones tempranos mediante hibridación in situ. C-Notch-1 se expresaba en el embrión de pollo de 1 a 2 días en muchos dominios bien definidos, que incluyen el tubo neural, el mesodermo presomítico, el mesodermo nefrógeno (mesonefros prospectivos), la placoda nasal, la placoda/fosita ótica, la placoda del cristalino, las placodas epibranquiales, el revestimiento endotelial del sistema vascular, en el corazón, y las crestas ectodérmicas apicales (CEA) de los primordios de las extremidades. Estos sitios coinciden con los sitios descritos para la expresión de Notch1 en los roedores en etapas equivalentes (tabla II). Reuniendo los datos de las secuencias junto con los datos de expresión, concluimos que C-Notch-1 es tanto el ortólogo del Notch1 de los roedores en el pollo, como un pariente muy cercano a éste.

3

C-Serrate es un homólogo del Serrate de Drosophila, y codifica un ligando candidato de un receptor que pertenece a la familia de Notch

Se conocen dos ligandos de Notch en Drosophila, codificados por los dos genes relacionados Delta y Serrate. Las secuencias de aminoácidos que corresponden a estos genes son homólogas en sus extremos 5', lo que incluye una región, el motivo DSL, que es necesaria y suficiente para unirse a Notch in vitro. Para aislar un fragmento de un homólogo de Serrate en el pollo, utilizamos cebadores de PCR y degenerados diseñados para reconocer secuencias en cada lado del motivo DSL (véase Materiales y métodos). Se recuperó un fragmento de PCR de 900 pares de bases y se utilizó para cribar una genoteca, lo que nos permitió aislar clones de ADNc solapantes. La secuencia del ADN de los clones de ADNc reveló un marco abierto de lectura único casi completo de 3582 nucleótidos, que carecía sólo de unas pocas bases en 5'. La comparación con las secuencias de aminoácidos de Delta y Serrate de Drosophila sugiere que estamos perdiendo sólo la porción de la secuencia codificante que codifica parte de la secuencia señal de la proteína Serrate de pollo.

La traducción de la secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 5) (figura 3) predice una proteína de 1230 aminoácidos (SEQ ID n.º 6) (fig. 4). Un gráfico de hidropatía revela una única región hidrófoba característica de un dominio transmembranario (Kyte y Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132). Además, la proteína tiene 16 repeticiones similares al FCE distribuidas en tándem en su dominio extracelular. La comparación de la secuencia de pollo con las secuencias de Delta y Serrate de D. melanogaster sugiere que los clones codifican un homólogo de Serrate en pollo (fig. 5; fig. 6). Mientras que la Serrate de Drosophila contiene 14 repeticiones similares al FCE con grandes inserciones en las repeticiones 4, 6, y 10, el homólogo de pollo tiene dos repeticiones similares al FCE adicionales y sólo una pequeña inserción de 16 aminoácidos en la 10.ª repetición. Ambas proteínas tienen una segunda región rica en cisteína entre las repeticiones similares al FCE y el dominio transmembranario; la separación de las cisteínas en esta región es casi idéntica en las dos proteínas (compárese 108 de la Serrate de Drosophila con 109 en C-Serrate). El dominio intracelular de C-Serrate no porta una homología significativa a los dominios intracelulares de Delta o Serrate de Drosophila.

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C-Serrate se expresa en el sistema nervioso central, las placodas craneales, el mesodermo renal, el sistema vascular y el mesénquima del primordio de extremidad

Se llevó a cabo una hibridación in situ para examinar la expresión de C-Serrate en preparaciones de todo el organismo durante la embriogénesis temprana, de la etapa 4 a la etapa 21, a intervalos de unas 12 horas. Se estudiaron las etapas tardías mediante hibridación in situ en criosecciones.

Los principales sitios de la expresión temprana de C-Serrate, tal y como se observa en cantidades totales, se pueden agrupar en cinco destinos: sistema nervioso central, placodas craneales, mesodermo renal, sistema vascular y mesénquima del primordio de extremidad.

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Sistema nervioso central

La primera expresión detectable de C-Serrate se observó en el sistema nervioso central en la etapa 6 (0 somitas/24 h), dentro de la sección posterior de la placa neural. En la etapa 10 (9 a 11 somitas/35,5 h) se observó una fuerte banda de expresión en el diencéfalo en estudio. Se observó una tinción débil adicional en el rombencéfalo y la médula espinal en estudio.

En la etapa 13, había varias zonas de expresión en el tubo neural. En el diencéfalo, había una fuerte banda triangular de expresión que se correspondía con el neurómero D2. Había dos zonas (una a cada lado de la línea media) en el fondo del mesencéfalo anterior así como una tinción difusa en el mesencéfalo dorsal. En el rombencéfalo y la médula espinal rostral había dos bandas longitudinales de expresión a cada lado de la línea media: una a lo largo del extremo dorsal del tubo neural y una segunda más ventral, adyacente a la base del fondo. Ambas se encontraban ubicadas dentro del dominio de expresión de Notch 1 (de rata). El límite anterior de la banda ventral se encontraba en el límite entre mesencéfalo y rombencéfalo La banda dorsal se continuaba con la expresión en el mesencéfalo dorsal. En la médula espinal anterior, la expresión era más desigual, pues a las bandas les sustituyeron células dispersas aisladas que expresaban C-Serrate.

En la etapa 17 (58 h), la expresión en el diencéfalo y el mesencéfalo no cambió. En el rombencéfalo y la médula espinal había dos bandas longitudinales adicionales: una a mitad camino a lo largo del eje dorsoventral y una segunda banda más ventral y ancha; los límites anteriores de estas bandas coincidían con el borde anterior del rombómero 2. Las cuatro bandas longitudinales en el rombencéfalo continuaban en la médula espinal del embrión; disminuían hacia su extremo posterior. Estas bandas de expresión se mantuvieron al menos hasta la etapa 31 (E7), incluida esta. En la etapa 21 (84 h) se observó una expresión adicional en los hemisferios cerebrales y una fuerte expresión en la distribución en sal y pimienta de las células en el techo óptico.

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Placodas craneales

Es llamativo que C-Serrate se exprese en todas las placodas craneales: la placoda del cristalino, la placoda nasal, la placoda/vesícula ótica y las placodas epibranquiales, así como una zona del ectodermo craneal anterior a la placoda ótica que puede corresponder a la placoda del trigémino (que no está bien definida morfológicamente).

En la placoda del cristalino, ya se había observado la expresión en la etapa 11, que rápidamente se volvió muy fuerte, y continuó al menos hasta la etapa 21. La expresión fue más débil en la placoda nasal y sólo se detectó a partir de la etapa 13. De nuevo, se mantuvo la expresión al menos hasta la etapa 21.

Así mismo, para la placoda ótica, la expresión comenzó a ser visible en la etapa 10 y se hizo fuerte en la etapa 11 tempranamente (12 a 14 somitas, 42,5 h). Curiosamente, había un "agujero" en el dominio de expresión ótico -una región anteroventral de la placoda en la que el gen no se expresaba-. Posteriormente, a medida que la placoda se invagina para formar una vesícula ótica, se observó la expresión más fuerte en los polos anterolateral y posteromedial. Aún más tarde, a medida que la vesícula ótica se transforma en el laberinto membranoso del oído interno, la expresión de C-Serrate se acaba restringiendo a las zonas sensoriales.

Se observó una expresión epibranquial en la etapa 13/14 como una tinción fuerte del ectodermo alrededor de los márgenes dorsales de la primera y segunda hendiduras branquiales. Estuvo acompañada de la expresión del gen en la parte profunda del revestimiento de las hendiduras y en el revestimiento endodérmico de las bolsas branquiales, donde se juntan los dos epitelios.

Finalmente, en la etapa 11 se observó una zona de expresión grande y fuerte, si bien transitoria, en el ectodermo craneal justo anterior y ventral al rudimento auditivo. Desde su localización, sospechamos que debe ser, o debe incluir, la región de la placoda del trigémino.

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Mesodermo renal

Se detectó la expresión en las células del mesodermo intermedio desde la etapa 10 y en embriones más viejos (etapa 17 a 21) en los túbulos mesonefríticos en desarrollo.

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Primordios de extremidad

Se localizó el ARNm de C-Serrate en una zona del mesénquima en el extremo distal del primordio de extremidad en desarrollo. Esto puede sugerir que interviene en el crecimiento de la extremidad.

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Otros sitios

También se observó la expresión en el primordio de la cola, en el tallo alantoideo y posiblemente en otros tejidos en las etapas tardías.

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Todos los sitios principales de expresión de C-Serrate yacen dentro de los dominios de expresión de C-Notch-1

La conservación del dominio DSL y la región adyacente del extremo amino en la C-Serrate sugiere que funciona como un ligando para un receptor que pertenece a la familia de Notch. Por lo tanto, esperamos encontrar sitios en los que la expresión de C-Serrate esté acompañada de la expresión de un gen Notch. En estos sitios, la expresión solapante o contigua de los dos genes se puede tomar como una indicación de que las células se están comunicando mediante la señalización de Serrate y Notch. Hemos comparado el patrón de expresión de C-Serrate, tal y como se muestra mediante hibridación in situ, con el de C-Notch-1 para descubrir que, realmente, se produce solapamiento a lo largo de un intervalo de etapas hasta los 8 días de incubación (E8). Todos los sitios observados con expresión de C-Serrate realmente caen dentro , o muy cerca, de los dominios de expresión de C-Notch-1 (tabla III).

5

Debido a la importancia de Notch y sus homólogos en la neurogénesis de los insectos, para nosotros fue particularmente interesante observar si los genes homólogos están implicados en el desarrollo del SNC de los vertebrados. C-Serrate se expresa en el SNC y su patrón de expresión muestra una relación destacable con la de los homólogos de Notch.

Analizamos secciones transversales que atraviesan la médula espinal de los embriones de pollo de seis días que se hibridaron con sondas de ARN antisentido de C-Notch-1 y C-Serrate. C-Notch-1 se expresó por toda la región luminal, como se describió anteriormente; dentro de esta región hay dos zonas pequeñas en las que Serrate se expresaba fuertemente.

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Discusión

En el desarrollo de Drosophila, la señalización entre las células a través del producto del gen Notch desempeña una función cardinal en las decisiones sobre el destino final de las células que especifica el patrón detallado de los tipos de células diferenciados. Esta vía de señalización, en la que se ha identificado que la proteína Notch es un receptor transmembranario, se conoce mejor por su función en la neurogénesis: las mutaciones de pérdida de función en Notch o cualquier otro conjunto de genes requeridos para la transmisión de la señal vía Notch alteran los destinos celulares en el neuroectodermo, lo que provoca que células que debían permanecer en la epidermis se conviertan, en cambio, en neurales. No obstante, la señalización dependiente de Notch es tan importante en los tejidos no neurales como en los tejidos neurales. Regula la elección del modo de diferenciación en la ovogénesis, en la miogénesis, en la formación de los túbulos de Malpigio y en el intestino, por ejemplo, así como en el desarrollo de la retina, los sensilios periféricos y el sistema nervioso central. En la mayoría de estos casos, la señal trasmitida a través de Notch parece interviene en la inhibición lateral, un tipo de interacción mediante la cual una célula que se compromete para diferenciarse de un modo particular -por ejemplo, como un neuroblasto- inhibe a sus inmediatos vecinos para que no hagan lo mismo. Esto obliga a las células adyacentes a comportarse de maneras diferentes, lo que crea un patrón de engranaje fino de diferentes tipos de células.

No obstante, existen buenas razones para creer que no es la única función de las señales enviadas por Notch. Se han identificado dos ligandos directos de Notch. Son los productos de los genes Delta y Serrate. Ambos, al igual que el mismo Notch, codifican proteínas transmembranarias con disposiciones en tándem de las repeticiones similares al FCE en su dominio extracelular. Se ha demostrado que las proteínas Delta y Serrate se unen a Notch en un ensayo de adhesión celular, y que comparten una gran región de homología en sus extremos amino, que incluyen un motivo que es necesario y suficiente para la interacción in vitro con Notch, el denominado dominio EBD o DSL. Aún a pesar de estas similitudes bioquímicas, parecen tener unas funciones realmente diferentes en el desarrollo. Aunque Serrate se expresa en muchos sitios en la mosca, aparentemente se requiere sólo en los discos humeral, del ala y de los balancines. Cuando la función de Serrate se pierde por mutación, estas estructuras no consiguen crecer. Los estudios en el disco del ala han indicado que lo que depende de Serrate es específicamente el borde del ala; cuando falta Serrate, esta región de señalización y centro de crecimiento decisivos no consigue formarse, y cuando Serrate se expresa ectópicamente bajo un promotor con la UAS de GAL4 en la parte ventral del disco del ala, se induce el tejido ectópico del borde del ala, lo que conduce a crecimientos ectópicos. Notch actúa como receptor de Serrate en el borde del ala, ya que algunos alelos mutantes de Notch ocasionan alteraciones similares del desarrollo del borde del ala y se observan interacciones específicas de alelos en los efectos de los dos genes.

Aquí describimos la identificación y la secuencia completa de un homólogo del gen Serrate de Drosophila y la identificación y la secuencia parcial de homólogos de Notch 1 y Notch 2 de rata/ratón en pollo.

Dentro del ADNc de Serrate de pollo se encuentra un solo marco de lectura abierto predicho que codifica una proteína transmembranaria grande con 16 repeticiones del FCE en su dominio extracelular. Tiene un motivo DSL bien conservado que sugiere que interaccionaría directamente con Notch. El dominio intracelular de la Serrate de pollo no muestra homología con ninguna de las presentes en las bases de datos actuales, incluidos los dominios intracelulares de Delta y Serrate de Drosophila. No obstante, se debe apuntar aquí que los dominios intracelulares de Serrate de pollo y humano (véase el apartado 12) son casi idénticos.

Se investigó la distribución espacial de C-Notch-1 y C-Serrate durante el comienzo de la embriogénesis mediante hibridación in situ. C-Notch-1 y C-Serrate muestran unos patrones dinámicos y complejos de expresión, que incluyen varias regiones en las que se expresan simultáneamente (SNC, oído, región branquial, cristalino, corazón, placodas nasales y mesonefros). La expresión solapante junto con el hallazgo de que C-Serrate tiene un dominio de unión a Notch bien conservado sugiere que esta interacción entre receptor y ligando se ha conservado desde Drosophila hasta los vertebrados.

En Drosophila, el receptor de Notch está ampliamente distribuido y sus ligandos se encuentran en dominios solapantes pero más restringidos. Se observa una situación similar en el pollo.

La Notch de la mosca se necesita en muchas etapas del desarrollo de Drosophila; su función en la inhibición lateral, especialmente en el desarrollo del sistema nervioso central, y los órganos sensoriales periféricos son los ejemplos mejor estudiados. No obstante, Notch es un receptor multifuncional y puede interaccionar con diferentes moléculas señalizadoras (incluidas Delta y Serrate) y en los procesos de desarrollo que no encajan fácilmente dentro del esquema de la inhibición lateral. Mientras que las pruebas disponibles indican que Delta es la molécula señalizadora en la inhibición lateral, no hay datos que sugieran que Serrate participa en la inhibición lateral. Es más, Serrate parece ser necesaria para el desarrollo de los discos imaginales dorsales de la larva; es decir, los discos humeral, de los balancines y del ala. En los últimos, los mejor estudiados de estos procesos, Serrate y Notch son importantes para el desarrollo del borde del ala dorsoventral, una estructura necesaria para la organización del desarrollo del ala en su conjunto.

Que C-Serrate tiene una función significativa se puede inferir de la conservación de su secuencia, en particular, de su dominio de unión a Notch. Los patrones de expresión descritos para C-Serrate en este artículo proporcionan la información siguiente. Primero, dado que el gen Serrate se expresa en los sitios en los que se expresa C-Notch-1 (posiblemente junto con otros homólogos de Notch) o próximo a ellos, es muy probable que C-Serrate ejerza su acción al unirse a C-Notch-1 (o a otro homólogo de Notch en pollo con un patrón de expresión similar). Segundo, la expresión durante el desarrollo del riñón, del sistema vascular y de los primordios de extremidades podría reflejar que está implicado en la señalización inductiva entre el mesodermo y el ectodermo, que desempeña una parte importante del desarrollo de todos estos órganos. En los primordios de extremidades, por ejemplo, C-Serrate se expresa en el mesodermo distal, y C-Notch-1 se expresa en la cresta ectodérmica apical subyacente, cuyo mantenimiento se sabe que depende de una señal desde el mesodermo que hay debajo. En las placodas craneales es posible que su función sea parecida, pero las pruebas para la señalización inductiva son más débiles, y C-Serrate podría igualmente estar implicada en las comunicaciones entre las células dentro del epitelio de la placoda, por ejemplo, regulando los modos especializados de diferenciación de las células de la placoda.

¿Cuál podría ser la función de C-Serrate dentro de sus dominios de expresión curiosamente restringidos en el SNC? Una posibilidad es que está implicado en la regulación de la producción de los oligodendrocitos que, de igual modo, se ha descrito que se originan a partir de las bandas estrechas de tejido que se extienden a lo largo del eje cráneo-caudal del tubo neural.

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9. Aislamiento y caracterización de los homólogos de Serrate en los humanos

Los clones con la secuencia de Serrate en humano se obtuvieron como se describe a continuación.

Se empleó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de una genoteca de ADNc de placenta humana. Los cebadores oligonucleotídicos degenerados utilizados en esta reacción se diseñaron basándose en las regiones aminoterminales de gran homología entre la Serrate de Drosophila y la Delta de Drosophila (véase la figura 5); esta región de gran homología incluye el dominio "DSL" en 5', que se cree que codifica la porción de Delta y Serrate que se une a Notch. Se aislaron y utilizaron dos productos de PCR: un fragmento de 350 pb y un fragmento de 1,2 kb. Se marcaron estos fragmentos de PCR con ^{32}P y se utilizaron para cribar una genoteca de ADNc de cerebro fetal humano comercial fabricada a partir de un feto de 17 a 18 semanas de edad (disponible anteriormente en Stratagene), en la que se introdujeron los ADNc en el sitio EcoRI de un vector \lambda-Zap.

El fragmento de 1,2 kb se hibridó a un solo clon de los 10^{6} clones rastreados. Rescatamos este fragmento del ADN de \lambda mediante la conversión del clon del fago \lambda aislado a un plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante, lo que produjo el ADNc del homólogo de Serrate como un inserto en el sitio EcoRI del vector Bluescript KS- (Strategene). Este plásmido se denominó "pBS39" y el gen correspondiente a este clon del ADNc se denominó Serrate-1 humano [también conocido como Jagged-1 humano ("HJ1")]. El ADNc aislado tenía 6464 nucleótidos de longitud y contenía un marco de lectura abierto completo así como regiones sin traducir en 5' y 3' (fig. 1). Se realizó la secuenciación con el sistema de secuenciación Sequenase® (U.S. Biochemical Corp.) en geles de secuenciación de acrilamida de Sequagel al 5 y al 6%.

El fragmento de 350 pb se hibridó con dos clones, que contenían insertos de ADNc de aproximadamente 1,1 y 3,1 kb de longitud; las construcciones plasmídicas que contenían estos insertos se denominaron pBS14 y pBS15, respectivamente. Se aisló cada clon, se rescató su respectivo inserto de ADNc en \lambda y se secuenció como antes. La secuencia nucleotídica del inserto del pBS14 era idéntica a una fracción de 1,1 kb de la secuencia contenida internamente dentro del inserto de ADNc del pBS15 y, por lo tanto, no se caracterizó más este clon. La secuencia del inserto del pBS15 de 3,1 kb codificaba un único marco de lectura abierto que se abarcaba todos los nucleótidos del inserto excepto 20 en 5'. La metionina ubicada en el resto del extremo amino de este marco de lectura predicho era homóloga a la metionina iniciadora codificada por el clon de ADNc del Serrate-1 humano (HJ1) en el pBS39. El gen que codifica el inserto de ADNc del pBS15 se denominó Serrate-2 humano y también se conoce como Jagged-2 humano ("HJ2").

A continuación, el inserto de 3,1 kb del pBS15 (HJ2) se marcó con ^{32}P y se utilizó para cribar otra genoteca de cerebro fetal humano (de Clontech), en la que el ADNc generado a partir de un feto de 25 a 26 semanas de edad se clonó en el sitio EcoRI del \lambdagt11. Este cribado identificó tres posibles clones positivos. Para aislar los ADNc, se preparó el ADN del \lambdagt11 a partir de un lisado líquido y se purificó en una columna de DEAE. A continuación, se cortó el ADN purificado con EcoRI y se aislaron los insertos de ADNc y se subclonaron en el sitio EcoRI del Bluescript KS-. Las construcciones del Bluescript que contienen estos ADNc se denominaron pBS3-15, pBS3-2 y pBS3-20. Dos de estos clones de ADNc, pBS3-2 y pBS3-20, contenían secuencias que se solapaban parcialmente con el pBS15 y se caracterizaron adicionalmente. El pBS3-2 tenía un inserto de 3,2 kb que se extendía desde el nucleótido 1210 del inserto de ADNc del pBS15 hasta justo después de la señal de poliadenilación. El inserto del pBS3-20 de 2,6 kb se cartografió con enzimas de restricción y se secuenció parcialmente para determinar sus extremos 3' y 5'. Este análisis indicó que el inserto del pBS3-20 tenía una secuencia de ácido nucleico que estaba contenida totalmente dentro del inserto de ADNc del pBS3-2 y, por lo tanto, no se caracterizó más el inserto del pBS3-20. Se determinó que el inserto del pBS3-15 era una contaminación con un fragmento del vector Bluescript.

El alineamiento de la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID n.º 4) del ADNc de Serrate-2 humano (HJ2) "completo" (SEQ ID n.º 3) generada en el ordenador con la secuencia de aminoácidos deducida para la Serrate-1 humana (HJ1) a partir del pBS39 (SEQ ID n.º 2) reveló un hueco de unas 120 bases, lo que condujo a un cambio de fase en la región codificante del inserto del pBS15 (HJ2), entre la posible secuencia señalizadora y el comienzo del dominio DSL (fig. 2). Los nucleótidos que faltan en el hueco del inserto del pBS15 se encontrarían ubicados entre los nucleótidos 240 y 241 de SEQ ID n.º 3. Esta región ausente probablemente fue el resultado de un artefacto de clonación en la construcción de la genoteca de Stratagene.

Los intentos por clonar el extremo 5' de HJ2 utilizando PCR anclada, RACE y las técnicas de PCR extendida de Takara no tuvieron éxito. No obstante, se obtuvieron tres clones genómicos humanos que contenían posiblemente el extremo 5' de HJ2 a partir del cribado de una genoteca genómica humana en cósmidos en la que se clonaron fragmentos de 30 kb en un único sitio XhoI introducido en el sitio BamHI de un vector pWE15 (el vector sin modificar está disponible en Stratagene). Se rastreó esta genoteca en cósmidos con un fragmento de PCR que se había amplificado a partir del extremo en 5' del pBS15 (HJ2) y se aislaron tres clones de cósmidos positivos. Se utilizaron dos conjuntos diferentes de cebadores para amplificar el ADN que corresponde al extremo 5' del pBS15 utilizando los clones de cósmidos como molde, y ambos conjuntos generaron bandas únicas que se subclonaron pero que se determinó que contenían artefactos de PCR. Las porciones de los clones de cósmidos se están subclonando directamente sin PCR para obtener una porción de los clones de cósmidos que contiene la región de ADN de 120 nucleótidos que falta en el pBS15.

El inserto de ADNc del pBS39, que codifica el homólogo Serrate-1 humano (HJ1), se ha secuenciado y contiene la secuencia codificante completa del producto génico. Las secuencias nucleotídicas (SEQ ID n.º 1) y de aminoácidos (SEQ ID n.º 2) se muestran en la figura 1. Se tradujo la secuencia nucleotídica del Serrate-1 humano (HJ1) con el programa informático MacVector (International Biotechnology Inc., New Haven, CT). La región codificante consiste en los nucleótidos de número 371 a 4024 de SEQ ID n.º 1. Se utilizó el programa informático de análisis de proteínas Protean de DNAStar (Madison, WI) para predecir los péptidos señal y las regiones transmembranarias (según la hidrofobia). Se predijo que el péptido señal consistía en los aminoácidos 14 a 29 de SEQ ID n.º 2 (codificados por los nucleótidos de número 410 a 457 de SEQ ID n.º 1), por lo que se predijo que el extremo amino de la proteína madura comenzaría con Gly en el aminoácido número 30. Se predijo que el dominio transmembranario se encontraba entre los aminoácidos de número 1068 a 1089 de SEQ ID n.º 2, codificados por los nucleótidos de número 3572 a 3637 de SEQ ID n.º 1. El dominio de consenso (DSL), la región de homología con Delta y Serrate de Drosophila, que se predijo que intervenía en la unión con Notch (en particular, RTF 11 y 12 de Notch), abarca los aminoácidos 185 a 229 de SEQ ID n.º 2, codificados por los nucleótidos de número 923 a 1057 de SEQ ID n.º 1. Se identificaron visualmente las repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (RTF) en la secuencia de aminoácidos; se identificaron 15 RTF (de longitud completa) y 3 RTF parciales como sigue:

RTF 1: aminoácidos de número 234 a 264

RTF 2: aminoácidos de número 265 a 299

RTF 3: aminoácidos de número 300 a 339

RTF 4: aminoácidos de número 340 a 377

RTF 5: aminoácidos de número 378 a 415

RTF 6: aminoácidos de número 416 a 453

RTF 7: aminoácidos de número 454 a 490

RTF 8: aminoácidos de número 491 a 528

RTF 9: aminoácidos de número 529 a 566

RTF parcial: aminoácidos de número 567 a 598

RTF parcial: aminoácidos de número 599 a 632

RTF 10: aminoácidos de número 633 a 670

RTF 11: aminoácidos de número 671 a 708

RTF 12: aminoácidos de número 709 a 747

RTF 13: aminoácidos de número 748 a 785

RTF 14: aminoácidos de número 786 a 823

RTF 15: aminoácidos de número 824 a 862

RTF parcial: aminoácidos de número 863 a 879

RTF parcial: aminoácidos de número 880 a 896

\newpage

Por lo tanto, el dominio de RTF total son los aminoácidos de número 234 a 896 (codificados por los nucleótidos de número 1070 a 3058 de SEQ ID n.º 1). El dominio extracelular quedaba así predicho que eran los aminoácidos de número 1 a 1067 de SEQ ID n.º 2, codificados por los nucleótidos de número 371 a 3571 de SEQ ID n.º 1 (aminoácidos de número 30 a 1067 en la proteína madura; codificados por los nucleótidos de número 458 a 3571 de SEQ ID n.º 1). Por lo tanto, se predijo que el dominio intracelular (citoplasmático) era los aminoácidos de número 1090 a 1218 de SEQ ID n.º 2, codificados por los nucleótidos de números 3638 a 4024 de SEQ ID n.º 1.

Se estableció la expresión de HJ1 en determinados tejidos humanos al hibridar con una sonda del pBS39 radiomarcado una transferencia Northern de múltiples tejidos humanos de Clontech. La sonda se hibridó a una sola banda de unos 6,6 kb, y se expresó en todos los tejidos analizados que incluían corazón, cerebro, placenta, pulmón, músculo esquelético, páncreas, hígado y riñón. Era particularmente interesante la observación de que HJ1 se expresaba en el músculo esquelético y cardíaco adulto, porque las fibras del músculo adulto están completamente rodeadas por una lámina de matriz extracelular y, por lo tanto, es poco probable que la función de HJ1 en estas células esté en la comunicación directa entre las células.

La secuencia nucleotídica (SEQ ID n.º 3) y de aminoácidos (SEQ ID n.º 4) del ADNc del Serrate-2 humano (HJ2) "completo" (que contiene una deleción interna) generadas por ordenador se muestran en la figura 2. La secuencia nucleotídica se tradujo utilizando el programa informático MacVector (International Biotechnology Inc., New Haven, CT). La región codificante consiste en los nucleótidos de número 332 a 4102 de SEQ ID n.º 3. Se empleó el programa informático de análisis de proteínas Protean de DNAStar (Madison, WI) para predecir los péptidos señal y las regiones transmembranarias (según la hidrofobia). Se predijo que el dominio transmembranario eran los aminoácidos de número 912 a 933 de SEQ ID n.º 4, codificados por los nucleótidos de número 3065 a 3130 de SEQ ID n.º 3. El dominio de consenso (DSL), la región de homología con Delta y Serrate de Drosophila, que se predijo que intervenía en la unión con Notch (en particular, RTF 11 y 12 de Notch), abarca los aminoácidos 26 a 70 de SEQ ID n.º 4, codificados por los nucleótidos de número 407 a 541 de SEQ ID n.º 3. Se identificaron visualmente las repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico (RTF) en la secuencia de aminoácidos; se identificaron 15 RTF (de longitud completa) y 3 RTF parciales como sigue:

RTF 1: aminoácidos de número 75 a 105

RTF 2: aminoácidos de número 106 a 140

RTF 3: aminoácidos de número 141 a 180

RTF 4: aminoácidos de número 181 a 218

RTF 5: aminoácidos de número 219 a 256

RTF 6: aminoácidos de número 257 a 294

RTF 7: aminoácidos de número 295 a 331

RTF 8: aminoácidos de número 332 a 369

RTF 9: aminoácidos de número 370 a 407

RTF parcial: aminoácidos de número 408 a 435

RTF parcial: aminoácidos de número 436 a 469

RTF 10: aminoácidos de número 470 a 507

RTF 11: aminoácidos de número 508 a 545

RTF 12: aminoácidos de número 546 a 584

RTF 13: aminoácidos de número 585 a 622

RTF 14: aminoácidos de número 623 a 660

RTF 15: aminoácidos de número 664 a 701

RTF parcial: aminoácidos de número 702 a 718

RTF parcial: aminoácidos de número 719 a 735

\newpage

Por lo tanto, el dominio de RTF total son los aminoácidos de número 75 a 735 (codificados por los nucleótidos de número 554 a 2536 de SEQ ID n.º 3). Por lo tanto, se prevé que el dominio extracelular sean los aminoácidos de número 1 a 912 de SEQ ID n.º 4, codificados por los nucleótidos de número 332 a 3064 de SEQ ID n.º 3. Por consiguiente, se predice que el dominio intracelular (citoplasmático) sean los aminoácidos de número 934 a 1257 de SEQ ID n.º 4, codificados por los nucleótidos de número 3131 a 4102 de SEQ ID n.º 3.

Al igual que Serrate-1 humano (HJ1), el ADNc de Serrate-2 humano (HJ2) "completo" (con una deleción interna) (SEQ ID n.º 3) generado por ordenador codifica una proteína que contiene 16 repeticiones del FCE completas y 2 repeticiones interrumpidas así como la repetición del FCE críptica de diagnóstico conocida como el dominio DSL, que se ha encontrado sólo en los posibles ligandos de Notch. El marco de lectura abierto de la Serrate-2 humana (HJ2) "completa" generada por ordenador es de unos 1400 aminoácidos de longitud, aproximadamente 182 aminoácidos más larga que el extremo carboxilo de HJ1 y el Jagged homólogo de Serrate en las ratas. Mientras que existe una homología significativa entre la HJ2 y HJ1 completas en la porción del extremo amino de la proteína, esta homología se pierde justo antes del posible dominio transmembranario en aproximadamente el aminoácido de número 1029 de HJ1. Este resultado es particularmente interesante debido a que la presencia de una gran cola en el extremo COOH implica la posibilidad de cierta función o regulación adicional de HJ2.

La secuencia del ADNc de Serrate-2 humano (HJ2) "completo" (con una deleción interna) (SEQ ID n.º 3) se puede construir aprovechándose de los sitios de restricción únicos para AccI, DraIII o BamHI presentes en el solapamiento de secuencia de pBS15 y pBS3-2, y cuyas enzimas escinden el inserto del pBS15 en los nucleótidos 1431, 2648 y 2802, respectivamente.

Se estableció la expresión de HJ2 en determinados tejidos humanos al hibridar con una sonda una transferencia Northern de varios tejidos humanos de Clontech con el clon radiomarcado de pBS15. Esta sonda se hibridó a una única banda de unos 5,2 kb y se expresaba en el corazón, el cerebro, la placenta, los pulmones, el músculo esquelético y el páncreas, pero estaba ausente o fue casi indetectable en el hígado y el riñón. Al igual que en el caso de la expresión del HJ1 descrita anteriormente, fue particularmente interesante la observación de que el componente HJ2 del inserto del pBS15 se expresara en los músculos esquelético y cardíaco adultos, porque las fibras del músculo adulto están rodeadas completamente por una lámina de matriz extracelular y, por lo tanto, es poco probable que la función de HJ2 en estas células se encuentre en la comunicación directa entre células.

Las construcciones de expresión se fabrican utilizando clones aislados. Se escinde el clon de su vector como uno o varios fragmentos de restricción de EcoRI y se subclonan en el sitio de restricción de EcoRI de un vector de expresión. Esto permite la expresión del producto proteico de la Serrate humana a partir del subclón en el marco de lectura correcto. Con esta metodología se han generado construcciones de expresión en las que el inserto del ADNc de HJ1 del pBS39 se clonó en un vector de expresión para que se expresara bajo el control de un promotor del citomegalovirus, y HJ1 se expresó en las estirpes celulares de queratinocitos humanos 3T3 y HAKAT.

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10. Depósito de los microorganismos

El plásmido pBS39, que contiene un fragmento de EcoRI que codifica una Serrate-1 humana completa (HJ1), se depositó el 28 de febrero de 1995 en la American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento en Materia de Patentes, y se le asignó el n.º de acceso 97068.

El plásmido pBS15, que contiene un fragmento de EcoRI de 3,1 kb que codifica el extremo amino de la Serrate-2 humana (HJ2), clonado en el sitio de EcoRI del Bluescript KS-, se depositó el 5 de marzo de 1996 en la American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento en Materia de Patentes, y se le asignó el n.º de acceso 97459.

El plásmido pBS3-2 que contiene un fragmento de EcoRI de 3,2 kb que codifica el extremo carboxilo de la Serrate-2 humana (HJ2), clonado en el sitio de EcoRI del Bluescript KS-, se depositó el 5 de marzo de 1996 en la American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento en Materia de Patentes, y se le asignó el n.º de acceso 97460.

El alcance de la presente invención no pretende quedar limitado por los microorganismos depositados, ni por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas en la presente memoria resultarán evidentes a los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos acompañantes. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: ISH-HOROWICZ, DAVID

\hskip3.9cm

HENRIQUE, DOMINGOS MANUEL PINTO

\hskip3.9cm

LEWIS, JULIAN HART

\hskip3.9cm

MYAT, ANNA MARY

\hskip3.9cm

ARTAVANIS-TSAKONAS, SPYRIDON

\hskip3.9cm

MANN, ROBERT S.

\hskip3.9cm

GRAY, GRACE E.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y PROTEÍNAS DE GENES SERRATE DE VERTEBRADOS Y MÉTODOS BASADOS EN LAS MISMAS.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Pennie & Edmonds

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(B): CALLE: 1155 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: New York

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(D): ESTADO: New York

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(E): PAÍS: USA

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(F): CÓDIGO: 10036-2711

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITANTE: Se asignará

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: En la misma fecha que ésta.

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(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Misrock, S. Leslie

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 18,872

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7326-037-228

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 790-9090

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 869-9741/8864

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 66141 PENNIE

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6464 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 371..4027

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

10

11

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1219 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4483 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 332..4483

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

17

18

19

20

21

22

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1384 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

23

24

25

26

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3582 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..3582

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1194 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 236 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1405 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

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(B): SITUACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGNYTTTGCY TNAARSANTA YCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio_modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marca= A

\hskip6.55cm

/nota= "X=histidina o ácido glutámico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCNATGCANG TNCCNCCRTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 163 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 2..163

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..135

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15:

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: base_modificada

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGNYTNTGCY TNAARSANTA YCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio_modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marca= A

\hskip6.55cm

/nota= "X=histidina o ácido glutámico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

Claims

1. Proteína Serrate purificada de vertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un primer ácido nucleico, hibridándose dicho primer ácido nucleico en condiciones de hibridación a un segundo ácido nucleico o su complemento, consistiendo dicho segundo ácido nucleico en la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos humana representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1), la secuencia de nucleótidos de pollo representada en las figuras 3A a 3B (SEQ ID n.º 5), la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 13 y la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 15, siendo dichas condiciones de hibridación unas condiciones muy rigurosas que comprenden la hibridación en un tampón que consiste en SSC a 6X, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,5), EDTA a 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, SAB al 0,02% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 100 \mug/ml, durante 48 horas a 65ºC, el lavado en una disolución que consiste en SSC a 2X, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01% y SAB al 0,01%, durante 1 hora a 37ºC, y el lavado en una disolución que consiste en SSC a 0,1 X, durante 45 minutos a 50ºC, y en la que dicha proteína es capaz de unirse a una proteína Notch.

2. Proteína según la reivindicación 1, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2), la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 4A a 4B (SEQ ID n.º 6), la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 14 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 16.

3. Proteína según la reivindicación 1, que es una proteína de mamífero.

4. Proteína según la reivindicación 1, que es una proteína de humano.

5. Proteína según la reivindicación 1, cuyo segundo ácido nucleico es la secuencia de nucleótidos humana representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1).

6. Proteína según la reivindicación 4, comprendiendo la proteína de humano la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2).

7. Proteína según la reivindicación 4, comprendiendo la proteína de humano la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 2A a 2G (SEQ ID n.º 4).

8. Proteína según la reivindicación 4, consistiendo la proteína de humano en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 2).

9. Proteína según la reivindicación 4, consistiendo la proteína de humano en la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 2A a 2G (SEQ ID n.º 4).

10. Proteína según la reivindicación 1, cuyo segundo ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos de humano del plásmido pBS39, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

11. Proteína según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de Serrate codificada por el plásmido pBS15, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97459.

12. Proteína según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de Serrate codificada por el plásmido pBS3-2, estando depositado dicho plásmido en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97460.

13. Fragmento purificado de la proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 8 y 10, consistiendo dicho fragmento en al menos 10 aminoácidos y siendo dicho fragmento capaz de unirse a una proteína Notch.

14. Fragmento según la reivindicación 13, en el que el fragmento consiste en al menos 20 aminoácidos.

15. Fragmento según la reivindicación 14, en el que la proteína Serrate de vertebrado es la proteína según la reivindicación 6.

16. Fragmento según la reivindicación 13 ó 14, que consiste en el dominio extracelular o el dominio DSL.

17. Molécula que comprende el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

18. Proteína purificada que comprende el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

19. Fragmento según la reivindicación 13, careciendo dicho fragmento del dominio transmembranario y del dominio intracelular de la proteína.

20. Fragmento según la reivindicación 13, que carece de las repeticiones de tipo factor de crecimiento epidérmico de la proteína.

21. Proteína quimérica purificada que comprende la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10, o el fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, fusionada mediante un enlace covalente a una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína, en la que la segunda proteína no es una proteína Serrate de vertebrado.

22. Proteína quimérica según la reivindicación 21, cuyo fragmento es un fragmento de una proteína Serrate humana.

23. Ácido nucleico aislado que codifica una proteína Serrate de vertebrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8, 10, un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20 o una proteína quimérica según la reivindicación 21 o 22.

24. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos de humano representada en las figuras 1A a 1G (SEQ ID n.º 1), la secuencia de nucleótidos de pollo representada en las figuras 3A a 3B (SEQ ID n.º 5), la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 13 y la secuencia de nucleótidos de ratón de SEQ ID n.º 15.

25. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que consiste en la secuencia de nucleótidos de humano en el plásmido pBS39, estando dicho plásmido depositado en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

26. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 23, que comprende la secuencia de nucleótidos de Serrate de humano contenida en el plásmido pBS39, estando dicho plásmido depositado en la ATCC y habiéndosele asignado el número de acceso 97068.

27. Vector de expresión de ácido nucleico, que comprende el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.

28. Célula recombinante transformada con el vector de ácido nucleico según la reivindicación 27.

29. Método para producir una proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8, 10, un fragmento de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20 o una proteína quimérica según la reivindicación 21 o 22, que comprende cultivar la célula recombinante según la reivindicación 28 de tal forma que la proteína, fragmento o proteína quimérica sea expresada por la célula, y recuperar la proteína, fragmento o proteína quimérica expresada.

30. Anticuerpo purificado que se une a la proteína Serrate de vertebrado según la reivindicación 8, o que se une al fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, si depende de la reivindicación 8.

31. Anticuerpo según la reivindicación 30, que es monoclonal.

32. Anticuerpo según la reivindicación 30, que es policlonal.

33. Método para producir un anticuerpo según la reivindicación 30, que comprende inmunizar un animal hospedador con una proteína según la reivindicación 8 o un fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, si es dependiente de la reivindicación 8, y seleccionar un anticuerpo que se une a dicha proteína o fragmento.

34. Fragmento del anticuerpo de la reivindicación 30, uniéndose dicho fragmento a la proteína Serrate de vertebrado.

35. Anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 y 34, que no se une a una proteína Serrate de Drosophila.

36. Anticuerpo purificado o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína Serrate de humano según la reivindicación 9, siendo dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico contra dicha proteína Serrate de humano.

37. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 36, uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo al dominio extracelular o DSL de dicha proteína Serrate de humano.

38. Derivado de una proteína Serrate de vertebrado según la reivindicación 8, o de un fragmento de una proteína Serrate de vertebrado según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y 19 a 20, cuyo derivado tiene la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, o fragmento, Serrate de vertebrado, en la que se sustituye un resto de aminoácido dentro de la secuencia por otro aminoácido de una polaridad parecida que actúa como un equivalente funcional que da lugar a una modificación silenciosa, siendo dicho derivado capaz de unirse a una proteína Notch.

39. Anticuerpo según la reivindicación 30, que no se une a una proteína Serrate de Drosophila.

40. Anticuerpo según la reivindicación 30 o 31, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo humano o quimérico.

41. Anticuerpo según la reivindicación 36, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo de humano o quimérico.

42. Oligonucleótido aislado que es antisentido y complementario a una porción de al menos 10 nucleótidos de SEQ ID n.º 1.

43. Método para inhibir la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína Serrate de vertebrado en una célula, que comprende dotar a la célula in vitro de una cantidad del oligonucleótido según la reivindicación 42 eficaz para inhibir la expresión de dicho ácido nucleico, estando dicha proteína Serrate de vertebrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10.

44. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, 34, 35, 39 y 40, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

45. Composición según la reivindicación 44, para utilizarla como un medicamento.

46. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 36, 37 y 41, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

47. Composición según la reivindicación 46, para utilizarla como un medicamento.