KR20150037857A - 항-jagged 1/jagged 2 교차-반응성 항체, 활성화가능한 항-jagged 항체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

항-jagged 1/jagged 2 교차-반응성 항체, 활성화가능한 항-jagged 항체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20150037857A
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antibodies
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제임스 윌리암 웨스트
제이슨 개리 사거트
폴 에이치. 베세트
헨리 버나드 로우만
낸시 이. 스타글리아노
올가 바실제바
엘리자베쓰-에드나 매리 메넨데즈
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싸이톰스 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 대체로 항체, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 인식하는 완전한 인간 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체의 생성, 항체, 예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 인식하는 완전한 인간 항체를 포함하는 단일클론 항체, 및 항체를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두를 인식하는 완전한 인간 교차 반응 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 항-Jagged 항체를 제조하는 방법, 및 치료제, 예방제 및 진단제로서 항-Jagged 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대체로 차폐성 모이어티(MM), 절단가능한 모이어티(CM) 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체(AB)를 포함하는 활성화가능한 항체, 및 이러한 활성화가능한 항체의 제조 방법, 및 다양한 치료, 진단 및 예방 징후에서 이들 활성형 항-Jagged 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항-JAGGED 1/JAGGED 2 교차-반응성 항체, 활성화가능한 항-JAGGED 항체 및 이의 제조 방법{ANTI-JAGGED 1/JAGGED 2 CROSS-REACTIVE ANTIBODIES, ACTIVATABLE ANTI-JAGGED ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2012년 6월 22일 출원된 미국 가출원 제61/663,307호; 2013년 1월 4일 출원된 미국 가출원 제61/749,212호; 2013년 1월 7일 출원된 미국 가출원 제61/749,486호; 및 2013년 1월 23일 출원된 미국 가출원 제61/755,810호의 혜택을 청구하며, 이들 각각은 그 전체를 참조하여 본원에 편입시킨다.
발명의 분야
본 발명은 대체로, 항체, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 인식하는 완전한 인간 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체의 생성, 항체, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 인식하는 완전한 인간 항체를 포함하는 단일클론 항체, 및 항체를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두를 인식하는 완전한 인간 교차 반응성 항체를 포함하는 단일클론 항체를 코딩하는 핵산 분자, 및 항-Jagged 항체를 제조하는 방법, 및 치료제, 예방제 및 진단제로서 항-Jagged 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대체로 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 활성화가능한 항체, 및 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체의 제조 방법 및 다양한 치료, 진단 및 예방 증상에서 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
Notch 신호전달 경로는 다양한 세포 유형 및 세포내 과정들을 조절한다. 이러한 Notch 신호전달 경로는 예컨대 Jagged 1 및 Jagged 2와 같은 리간드를 포함하는, 리간드 결합에 의해 조절된다. 따라서, Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 포함하여, Notch 신호전달 경로를 표적으로 하는 치료제 및 진단제가 요구되고 있다.
본 발명은 암 또는 섬유성 질환의 진단 및/또는 치료를 위한 조성물을 기술한다. 구체적으로, 본 발명은 Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두에 결합하여, 이들의 Notch 수용체 결합 및 이 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 Notch 수용체에 Jagged 1의 결합, Notch 수용체에 Jagged 2의 결합, Notch 수용체에 Jagged 1 및 Jagged 2의 결합, Jaggeg 1과 Notch 수용체간 상호작용을 통한 신호전달, Jagged 2와 Notch 수용체간 상호작용을 통한 신호전달, 및/또는 Jagged 1, Jagged 2 및 Notch 수용체간 상호작용을 통한 신호전달을 조정, 예를 들면, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해한다. 이들 항체를 본원에서는 "항-Jagged 항체"라고 한다. 본 발명의 항-Jagged는 단일클론 항체, 예컨대, 예를 들면, 완전한 인간 단일클론 항체를 비롯하여, 인간화 단일클론 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 이소타입이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 이소타입이다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에 개시된 임의의 이소타입 중 한 이소타입을 갖는다.
처음에 Jagged로 동정되고 또한 JAG1, JAGL1 및/또는 HJ1이라고도 하는 Jagged 1은 Notch에 대한 경막 리간드로 보고되었다. Jagged 2는 Jagged 1과 관련된 Notch의 다른 리간드이다. Jagged 1 및 Jagged 2는 Notch-1, Notch-2, Notch-3 및 Notch-4 수용체에 대한 리간드이다. (예를 들면, [Shimizu K et al., "Binding of Delta1, Jagged 1, and Jagged 2 to Notch2 rapidly induces cleavage, nuclear translocation, and hyperphosphorylation of Notch2." Molecular Cellular Biology 20(18): 6913-6922(2000)]; [Shimizu K et al., "Physical interaction of Delta1, Jagged 1, and Jagged 2 with Notch1 and Notch3 receptors. Biochemical and Biophysical Research Communications 276(1): 385-389(2000)]; [Microvasc Res. 60(2):91-103(2000)] 참조). Jagged 단백질은 원래는 서레이트(Serrate) 단백질이라고 알려졌었다.
본 발명의 예시적인 단일클론 항체에는 예를 들면, 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체가 포함된다. 다른 적절한 항체에는4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및/또는 6F8 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다.
이들 항체는 인간 Jagged 1 및 인간 Jagged 2에 대한 특이성을 보이며, Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 억제하거나 또는 아니면 방해하는 것으로 확인되었다. 이들 항체는 또는 마우스 및 래트 Jagged 1에 대해서도 특이성을 보인다. 일부 실시양태에서, 이들 항체는 또한 마우스 및/또는 래트 Jagged 2에 대한 특이성도 보인다.
일부 실시양태에서, 본원의 항-Jagged 항체는 질환에 걸린 세포, 예를 들면, 암세포 또는 섬유증 질병에 연루된 세포 상에 발현된 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합시 내재화될 수 있다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 표 2에 도시된 조합에서 선택된 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 표 2에 도시한 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 항체의 각 CDR 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하고, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하며, 여기서 적어도 1 이상의 CDR 서열은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적얻 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 표 4에 열거된 조합에서 선택되는 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 표 4에 열거된 조합과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74를 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 76을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 76의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74를 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 54를 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 56을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 54를 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 56을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 또한 AB에 접합된 제제(agent)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 항종양제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 제제는 링커를 통해 항-Jagged 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 제제는 표 30에 열거된 군에서 선택되는 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 칼리케아미신 또는 이의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 또한 검출가능한 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 천연적으로 1 이상의 이황화 결합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 1 이상의 이황화 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 항-Jagged 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 비롯하여, 이들 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 항-Jagged 항체의 발현이 일어나게 되는 조건 하에서 세포를 배양하여 항-Jagged 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 세포는 이러한 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 차폐성 모이어티(MM)의 커플링이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 결합능을 감소시키도록, MM과 커플링되거나 또는 아니면 이에 부착된 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 활성화가능한 항체 및 활성화가능한 항체 조성물을 제공한다. 이들 활성화가능한 항체는 총칭하여 본원에서 활성화가능한 항-Jagged 항체라고 하고, 또한 본원에서 항-Jagged 활성화가능한 항체 또는 Jagged 활성화가능한 항체라고도 한다. 일부 실시양태에서, MM은 프로테아제, 예를 들면 피험체 내 진단 부위 또는 치료 부위에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 공동국재하는 프로테아제에 대한 기질을 포함하는 서열을 통해 커플링된다. 본원에서 제공되는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 순환계에서 안정하며, 목적하는 치료 및/또는 진단 부위에서 활성화되지만, 정상, 즉 건강한 조직에서는 활성화되지 않으며, 활성화되면, 상응하는 미개질 항체와 적어도 유사한 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 결합을 나타낸다.
본 발명의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 표 2에 열거한 조합에서 선택되는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 서열번호 2에 도시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 각 CDR 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하고, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하고, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동알한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 표 4에 열거된 조합에서 선택되는 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항-Jagged 항체는 표 4에 열거된 조합과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 항-Jagged 항체는 서열번호 74를 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 76을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 76의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74를 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 및 146으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 및 146으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 76 또는 서열번호 148을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 및 146으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 및 146으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76 또는 서열번호 148을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체는 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144 및 146으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 76 또는 서열번호 148의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함한다.
본원에 기술한 활성화가능한 항체는 활성화된 상태에서 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하며 (i) Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB); (ii) 활성화가능한 항체가 미절단 상태인 경우 AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 것을 억제하는 차폐성 모이어티; 및 (c) 절단가능한 모이어티(CM)가 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 폴리펩티드인, AB에 커플링된 절단가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, MM은 CM을 통해 AB에 커플링된다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 미절단 상태에서는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 구조적 배열을 갖는다: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 MM과 CM 사이에 연결 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 CM과 AB 사이에 연결 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 제1 연결 펩티드(LP1) 및 제2 연결 펩티드(LP2)를 포함하고, 여기서 활성화가능한 항체는 미절단 상태에서는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 구조적 배열을 갖는다: MM-LP1-CM-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM-LP1-MM. 일부 실시양태에서, 2개의 연결 펩티드는 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시양태에서, LP1 또는 LP2 중 1 이상은 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(서열번호 123) 및 (GGGS)n(서열번호 124)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 정수이다. 일부 실시양태에서, LP1 또는 LP2 중 1 이상은 GGSG(서열번호 125), GGSGG(서열번호 126), GSGSG(서열번호 127), GSGGG(서열번호 128), GGGSG(서열번호 129), 및 GSSSG(서열번호 130)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 또는 단일 도메인 경쇄 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 면역학적 활성 단편은 설치류(예를 들면(마우스 또는 래트), 키메라, 인간화 또는 완전한 인간 단일클론 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 활성화된 항-Jagged 항체(즉, 절단된 상태)는 질환이 있는 세포, 예를 들면, 암세포 또는 섬유증 질병에 연루된 세포 상에 발현된 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합시 내재화될 수 있다.
일부 실시양태에서, AB는 Jagged 1 및 Jagged 2와의 결합에 대한 평형 해리 상수가 약 100 nM 또는 그 이하이다.
일부 실시양태에서, MM은 AB와의 결합에 대한 평형 해리 상수가 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 평형 해리 상수보다 크다.
일부 실시양태에서, MM은 AB와의 결합에 대한 평형 해리 상수가 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 평형 해리 상수 보다 크지 않다.
일부 실시양태에서, MM은 활성화가능한 항체가 절단 상태인 경우 Jagged 1 및 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하거나 그와 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, MM는 길이가 약 2 내지 40개 아미노산인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, MM은 길이가 40개 아미노산을 넘지 않는 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, MM 폴리펩티드 서열은 Jagged 1 및 Jagged 2의 서열과는 상이하며, 여기서 MM 폴리펩티드 서열은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 50%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM 폴리펩티드 서열은 Jagged 1 및 Jagged 2의 서열과 상이하며, 여기서 MM 폴리펩티드 서열은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 25%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM 폴리펩티드 서열은 Jagged 1 및 Jagged 2의 서열과 상이하며, 여기서 MM 폴리펩티드 서열은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 10%를 넘지 않는다.
일부 실시양태에서, MM의 커플링은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 감소시켜서 MM와 커플링시 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 해리 상수(Kd)는 MM에 커플링되지 않았을 경우 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 20배 크다.
일부 실시양태에서, MM의 커플링은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 감소시켜서 MM에 커플링시 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 해리 상수(Kd)는 MM에 커플링되지 않았을 경우 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 40배 크다.
일부 실시양태에서, MM의 커플링은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 감소시켜서 MM에 커플링시 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 해리 상수(Kd)는 MM에 커플링되지 않았을 경우 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 100배 크다.
일부 실시양태에서, MM의 커플링은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 감소시켜서 MM에 커플링시 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 해리 상수(Kd)는 MM에 커플링되지 않았을 경우 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 1000배 크다.
일부 실시양태에서, MM의 커플링은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 감소시켜서 MM에 커플링시 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 해리 상수(Kd)는 MM에 커플링되지 않았을 경우 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 10,000배 크다.
일부 실시양태에서, Jagged 1 및 Jagged 2의 존재 하에서, MM은 표적 치환 어세이, 예컨대, 예를 들면, 그 전체를 참조하여 각각을 본원에 참조하여 편입시키는 PCT 국제 공개 특허 WO 2009/025846 및 WO 2010/081173에 기술된 어세이를 이용한 시험관내 어세이시 CM이 절단된 경우와 비교하여, CM이 절단되지 않은 경우, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력을 적어도 90% 만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM은 Jagged 표적에 대한 결합에 대해 절단된 상태인 활성화가능한 항체의 AB와 경쟁하거나 또는 AB를 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, MM은 표 9, 11-14, 및 20-23에 열거된 서열 군에서 선택되는 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 조직에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 공동국재하고, 프로테아제는 활성화가능한 항체가 프로테아제에 노출될시 활성화가능한 항체에서 CM을 절단한다.
일부 실시양태에서, CM은 미절단 상태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 미개질 AB 결합의 평형 해리 상수 보다 적어도 20배가 큰 평형 해리 상수로 발생되도록 Jagged 1 및 Jagged 2와 활성화가능한 항체의 결합이 감소되는 반면, 절단 상태에서는, AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하도록 활성화가능한 항체 내에 위치된다.
일부 실시양태에서, CM은 미절단 상태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 미개질 AB의 결합의 평형 해리 상수 보다 적어도 40배 큰 평형 해리 상수로 발생되도록 Jagged 1 및 Jagged 2와 활성화가능한 항체의 결합이 감소되는 반면, 절단 상태에서는, AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하도록 활성화가능한 항체 내에 위치된다.
일부 실시양태에서, CM은 미절단 상태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 미개질 AB의 결합의 평형 해리 상수 보다 적어도 50배 큰 평형 해리 상수로 발생되도록 Jagged 1 및 Jagged 2와 활성화가능한 항체의 결합이 감소되는 반면, 절단 상태에서는, AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하도록 활성화가능한 항체 내에 위치된다.
일부 실시양태에서, CM은 미절단 상태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 미개질 AB의 결합의 평형 해리 상수 보다 적어도 100배 큰 평형 해리 상수로 발생되도록 Jagged 1 및 Jagged 2와 활성화가능한 항체의 결합이 감소되는 반면, 절단 상태에서는, AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하도록 활성화가능한 항체 내에 위치된다.
일부 실시양태에서, CM은 미절단 상태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 미개질 AB의 결합의 평형 해리 상수보다 적어도 200배 큰 평형 해리 상태로 발생되도록 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 활성화가능한 항체의 결합이 감소하는 반면, 절단 상태에서, AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하도록 활성화가능한 항체 내에 위치된다.
일부 실시양태에서, CM은 길이가 최대 15 아미노산인 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, CM은 아미노산 서열 LSGRSDNH(서열번호 213)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 특이적 프로테아제, 예를 들면 활성화가능한 항체의 표적과 공동국재하는 것으로 알려진 프로테아제와 함께 사용하기 위해 선택된다. 예를 들면, 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체에서 사용하기에 적합한 절단가능한 모이어티는 적어도 프로테아제 예컨대 우로키나아제, 레구마인 및/또는 MT-SP1(마트립타아제)에 의해 절단되며, 서열 TGRGPSWV(서열번호 214); SARGPSRW(서열번호 215); TARGPSFK(서열번호 216); LSGRSDNH(서열번호 213); GGWHTGRN(서열번호 217); HTGRSGAL(서열번호 218); PLTGRSGG(서열번호 219); AARGPAIH(서열번호 220); RGPAFNPM(서열번호 221); SSRGPAYL(서열번호 222); RGPATPIM(서열번호 223); RGPA(서열번호 224); GGQPSGMWGW(서열번호 225); FPRPLGITGL(서열번호 226); VHMPLGFLGP(서열번호 227); SPLTGRSG(서열번호 228); SAGFSLPA(서열번호 229); LAPLGLQRR(서열번호 230); SGGPLGVR(서열번호 231); 및/또는 PLGL(서열번호 232)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CM은 표 33에 도시한 프로테아제로 이루어진 군에서 선택된 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및 MMP-14로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신이다. 일부 실시양태에서, CM은 uPA(우로키나아제 플라스미노겐 활성인자), 레구마인 및 MT-SP1(마트립타아제)로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 레구마인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MT-SP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP)를 포함한다.
일부 실시양태에서, CM은 2 이상의 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로테아제는 표 33에 열거된 것들로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, CM은 2 이상의 프로테아제에 대한 기질이고, 여기서 프로테아제 중 하나는 uPA, 레구마인 및 MT-SP1로 이루어진 군에서 선택되고, 다른 프로테아제는 표 33에 열거된 것으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, CM은 uPA, 레구마인 및 MT-SP1으로 이루어진 군에서 선택되는 2 이상의 프로테아제에 대한 기질이다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 적어도 제1 CM 및 제2 CM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CM 및 제2 CM은 각각 15개를 넘지 않는 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체 중 제1 CM 및 제2 CM은 미절단 상태에서 다음과 같은 N-말단에서 C-말단으로의 구조적 배열을 갖는다: MM-CM1-CM2-AB 또는 AB-CM2-CM1-MM. 일부 실시양태에서, 제1 CM 및 제2 CM 중 1 이상은 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 CM은 표적 조직에서 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군에서 선택되는 제1 절단제에 의해 절단되고 제2 CM은 표적 조직 내 제2 절단제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 다른 프로테아제는 표 33에 열거된 것으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군에서 선택되는 동일 프로테아제이고, 제1 CM 및 제2 CM은 효소에 대한 다른 기질이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 표 33에 열거된 것으로 이루어진 군에서 선택되는 동일한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 상이한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 표적 조직 내에서 공동국재한다. 일부 실시양태에서, 제1 CM 및 제2 CM은 표적 조직 내에서 1 이상의 절단제에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 프로테아제에 노출되고 그에 의해 절단되어 활성화 또는 절단 상태에서, 그 활성화된 항체는 프로테아제가 CM을 절단한 후 CM 서열 및/또는 LP2의 적어도 일부분을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, MM 및 CM은 서열번호 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 및 196으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 또한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 스페이서를 통해 활성화가능한 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 신호 펩티드 부재하에서 활성화가능한 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 활성화가능한 항체의 MM에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, 미절단 상태인 활성화가능한 항체는 MM에 직접 연결되는 스페이서를 포함하고 N-말단에서 C-말단으로 구조적 배열이 스페이서-MM-CM-AB이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 QGQSGQ(서열번호 233)을 포함한다. 일부 실시양태에서, MM 및 스페이서는 서열번호 180의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MM 및 스페이서는 아미노산 서열 QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG(서열번호 234)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 AB에 접합된 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 항종양제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 제제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 제제는 표 30에 열거된 군에서 선택되는 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 칼리케아미신 또는 이의 유도체이다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 또한 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 AB는 천연적으로 1 이상의 이황화 결합을 함유한다. 일부 실시양태에서, AB는 1 이상의 이황화 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여되는 경우 적어도 5일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 4일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 3일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 2일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 24시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 20시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 18시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 16시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 14시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 12시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 10시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 8시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 6시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 4시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여될 경우 적어도 3시간이다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 단일특이적이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다중특이적이며, 예를 들어 비제한적인 예로서, 이중특이적이거나 또는 삼중특이적이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 프로-BITE(Bispecific T Cell Engager) 분자의 일부로서 제형화된다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 프로-CAR(Chimeric Antigen Receptor) 개질된 T 세포 또는 다른 조작된 수용체의 일부로서 제형화된다.
본원은 또한 Jagged 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하고, 여기서 AB는 AB가 그 표적에 결합하는 능력을 감소시키는 차폐성 모이어티(MM)에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 프로테아제에 대한 기질인 절단가능한 모이어티(CM)를 더 포함한다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은 활성화가능한 항-Jagged 항체의 활성(예를 들면, 차폐, 활성화 또는 결합 활성)을 위태롭게 하지 않으면서 AB 내 1 이상의 시스테인 잔기에 1 이상의 제제가 부착할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은 MM 내 1 이상의 이황화 결합을 감소시키거나 또는 아니면 방해하지 않고 AB 내 1 이상의 시스테인 잔기에 1 이상의 제제가 부착할 수 있게 한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 바람직하게는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM에 접합되는 임의의 제제(들)없이, 1 이상의 제제, 예를 들면, 임의의 다양한 치료제, 진단제 및/또는 예방제에 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 생성한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 MM이 절단된 상태의 활성화가능한 항체의 AB를 효과적이고 효율적으로 차폐하는 능력을 보유하는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 생성한다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법은 CM을 절단할 수 있는 프로테아제의 존재하에서, 활성화가능한 항체가 여전히 활성화, 즉 절단되는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 생성한다.
활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 대한 1 이상의 접합점을 가지나, 본원에서 제공하는 방법 및 조성물에서는 모든 가능한 접합점이 제제와의 접합에 이용가능한 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 접합점은 이황화 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 접합점은 사슬간 이황화 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 접합점은 사슬간 황화 결합에 관여하는 황 원자이지만, 사슬간 이황화 결합에 관여하는 황 원자는 아니다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 접합점은 시스테인의 황 원자이거나 또는 황 원자를 함유하는 다른 아미노산 잔기이다. 이러한 잔기는 항체 구조에서 자연적으로 발생하거나 또는 부위 지정 돌연변이유발법, 화학 전환법, 또는 비천연 아미노산의 오편입법에 의해 항체에 도입될 수 있다.
본원에서는 또한 AB에 1 이상의 사슬간 이황화 결합 및 MM에 1 이상의 사슬간 이황화 결합을 갖는 활성화가능한 항-Jagged 항체, 및 자유 티올과 반응성인 약물의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대체로 환원제, 예컨대 예를 들면, TCEP로 활성화가능한 항체 내 사슬간 이황화 결합을 부분적으로 환원시키는 단계, 및 자유 티올과 반응성인 약물을 부분적으로 환원된 활성화가능한 항체에 접합시키는 단계를 포함한다. 본원에서 사용하는 용어 부분 환원은 활성화가능한 항-Jagged 항체가 환원제와 접촉하고, 모든 이황화 결합, 예를 들면 모든 가능한 접합 부위가 환원되는 것은 아닌 상황을 의미한다. 일부 실시양태에서, 모든 가능한 접합 부위의 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 미만 또는 5% 미만이 환원된다.
또 다른 실시양태에서, 제제의 위치에 선택성이 부여되는, 제제, 예를 들면 약물을 활성화가능한 항-Jagged 항체에 환원 및 접합시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 대체로 활성화가능한 항체의 차폐성 모이어티 또는 다른 비-AB 부분 내 임의의 접합 부위가 환원되지 않도록 활성화가능한 항-Jagged 항체를 환원제로 부분 환원시키는 단계, 및 제제를 AB 내 사슬간 티올에 접합시키는 단계를 포함한다. 접합 부위(들)는 접합이 목적하는 부위에서 발생하도록 제제가 원하는데 위치할 수 있게 선택된다. 환원제는 예를 들면, TCEP이다. 환원 반응 조건 예컨대, 예를 들면, 환원제 대 활성화가능한 항체의 비율, 항온반응 길이, 항온반응 동안의 온도, 환원 반응액의 pH 등은 MM이 미절단 상태인 활성화가능한 항체의 AB를 효율적이고 효과적으로 차폐하는 능력을 보유하는 접합된 활성화가능한 항체를 생성하는 조건을 동정하여 결정한다. 환원제 대 활성화가능한 항-Jagged 항체의 비율은 활성화가능한 항체에 의존적으로 다양하게 된다. 일부 실시양태에서, 환원제 대 활성화가능한 항-Jagged 항체의 비율은 약 20:1∼1:1, 약 10:1∼1:1, 약 9:1∼1:1, 약 8:1∼1:1, 약 7:1∼1:1, 약 6:1∼1:1, 약 5:1∼1:1, 약 4:1∼1:1, 약 3:1∼1:1, 약 2:1∼1:1, 약 20:1∼1:1.5, 약 10:1∼1:1.5, 약 9:1∼1:1.5, 약 8:1∼1:1.5, 약 7:1∼1:1.5, 약 6:1∼1:1.5, 약 5:1∼1:1.5, 약 4:1∼1:1.5, 약 3:1∼1:1.5, 약 2:1∼1:1.5, 약 1.5:1∼1:1.5, 또는 약 1:1∼1:1.5의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이러한 비율은 약 5:1∼1:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1∼1.5:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1∼1:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1∼1.5:1의 범위이다.
일부 실시양태에서, AB 상에 제제(들)를 선택적으로 위치화시키기 위해, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 AB 내 사슬간 이황화 결합을 환원시키고 제제, 예를 들면 티올-함유 제제 예컨대 약물을 얻어진 사슬간 티올에 접합시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 대체로 활성화가능한 항체 내에 모든 가능한 사슬간 티올을 형성하지 않고 2 이상의 사슬간 티올이 형성되도록 환원제로 AB를 부분 환원시키는 단계, 및 부분적으로 환원된 AB의 사슬간 티올에 제제를 접합시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 활성화가능한 항체의 AB는 환원제 : 활성화가능한 항체의 바람직한 비율로 약 1시간 동안 약 37℃에서 부분 환원된다. 일부 실시양태에서, 환원제 대 활성화가능한 항체의 비율은 약 20:1∼1:1, 약 10:1∼1:1, 약 9:1∼1:1, 약 8:1∼1:1, 약 7:1∼1:1, 약 6:1∼1:1, 약 5:1∼1:1, 약 4:1∼1:1, 약 3:1∼1:1, 약 2:1∼1:1, 약 20:1∼1:1.5, 약 10:1∼1:1.5, 약 9:1∼1:1.5, 약 8:1∼1:1.5, 약 7:1∼1:1.5, 약 6:1∼1:1.5, 약 5:1∼1:1.5, 약 4:1∼1:1.5, 약 3:1∼1:1.5, 약 2:1∼1:1.5, 약 1.5:1∼1:1.5, 또는 약 1:1∼1:1.5의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1∼1:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1∼1.5:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1∼1:1의 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1∼1.5:1의 범위이다.
티올-함유 시약은 예를 들면, 시스테인 또는 N-아세틸 시스테인일 수 있다. 환원제는 예를 들면, TCEP일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원된 활성화가능한 항체는 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 투석, 또는 투석여과를 이용해, 접합 전에 정제될 수 있다. 대안적으로, 환원된 항체는 부분 환원 후 및 접합전에 정제되지 않는다.
본 발명은 또한 활성화가능한 항체 내 1 이상의 사슬간 이황화 결합이 활성화가능한 항체 내 임의의 사슬간 이황화 결합을 파괴하지 않으면서 환원제로 환원된 부분 환원된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 제공하고, 여기서 활성화가능한 항체는 Jagged 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB), 미절단 상태인 활성화가능한 항체의 AB가 Jagged 표적에 결합하는 것을 억제하는 차폐성 모이어티(MM), 및 AB에 커플링된 절단가능한 모이어티(CM)을 포함하며, 이때 CM은 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서 MM은 CM을 통해 AB에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 1 이상의 사슬간 이황화 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체 내 MM의 1 이상의 사슬간 이황화 결합(들)은 환원제에 의해 방해받지 않는다. 일부 실시양태에서, 미절단 상태의 활성화가능한 항체는 다음과 같은 N-말단에서 C-말단의 구조적 배열을 가진다: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM. 일부 실시양태에서, 환원제는 TCEP이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 1 이상의 추가 제제 또는 추가 제제의 조합과 함께 사용된다. 적절한 추가 제제는 의도하는 용도, 예컨대 암에 대한 현행 약학제 및/또는 수술 요법을 포함한다. 예를 들면, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가의 화학요법제 또는 항종양제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 추가의 화학요법제는 젬시타빈이다.
일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 단일 치료 조성물로 제형화되며, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 동시에 투여된다. 다르게, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 서로 개별적이며, 예를 들면 각각은 개별 치료 조성물로 제형화되고, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 동시에 투여되거나, 또는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 치료 양생 동안 상이한 시점에 투여된다. 예를 들면, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가 제제의 투여 전에 투여되거나, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가 제제의 투여에 후속하여 투여되거나, 또는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 교대식으로 투여된다. 본원에 기술된 바와 같이, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 단일 용량으로 또는 다수 용량으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 비롯하여, 이들 단리된 핵산 서열을 코딩하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 활성화가능한 항체의 발현이 유도되는 조건 하에서 세포를 배양하여 활성화가능한 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 세포는 이러한 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건하에서 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성체를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하는 것인 단계, 및 (b) 활성화가능한 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 활성화 상태인 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 활성화가능한 항체를 제작하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성체를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하고, 이때 (i) CM은 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고, (ii) CM은 미절단 상태에서, MM이 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단상태에서는 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하거나 그와 경쟁하지 않도록, 활성화가능한 항체 내에 위치하는 것인 단계, 및 (b) 활성화가능한 항체를 회수하는 단계에 의한, 활성화 상태인 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 활성화가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 이상 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 활성(예를 들면, Notch 수용체를 통한 이상 신호전달을 포함한, 이상 신호전달)과 관련된 병변의 진행을 치료, 예방, 지연하거나 또는 아니면 그러한 병변의 증상을 완화시키거나, 또는 이러한 병변과 관련된 증상을 경감시키는 방법을 하고, 이러한 방법은 이러한 치료 또는 예방이 바람직한 피험체에 본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체를 투여하는 것에 의한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용해 피험체에서 혈관신생을 감소, 억제 또는 아니면 조정하는 방법을 제공한다. 치료되는 피험체는 예를 들면, 인간 또는 다른 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이외의 포유동물, 예컨대 인간 이외의 영장류, 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물, 또는 동물원 동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변과 관련된 증상을 치료, 예방 또는 완화하기에 충분한 양으로 투여된다. 피험체에서 병변을 치료 또는 예방하기에 충분한 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 양은 예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2 신호전달(예를 들면, Notch 수용체를 통한 Jagged 1 매개 신호전달 및/또는 Notch 수용체를 통한 Jagged 2 매개 신호전달)을 감소시키기에 충분한 양이다. 본원에서 사용하는 바와 같은, 용어 "감소하는"은 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 존재하에서 1 이상의 Notch 수용체를 통한 감소된 신호전달을 의미한다. Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달은 본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 존재하에서 1 이상의 Notch 수용체를 통한 신호전달 수준이 1 이상의 Notch 수용체를 통한 대조군 신호전달 수준(즉, 단일클론 항체 부재하에서 1 이상의 Notch 수용체를 통한 신호전달 수존) 보다 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 낮은 경우 감소된다. 1 이상의 Notch 수용체를 통한 신호전달 수준은 임의의 다양한 표준 기술, 예컨대 비제한적인 예로서, 하류 유전자, 예컨대 Hey 및 Hes의 활성화 측정, 및/또는 Notch 수용체 활성화에 반응하는 루시퍼라아제 리포터 어세이를 이용해 측정된다. 당분야의 숙련가는 1 이상의 Notch 수용체를 통한 신호전달 수준을 예를 들면, 시판되는 키트를 포함하는, 다양한 어세이를 이용해 측정할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용하여 그 진행을 지연시키고/시키거나 증상을 완화하기 위해 치료 및/또는 예방되는 병변은 예를 들면, 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변 예컨대, 예를 들면 T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL)을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프성 질환, 및 폐암, 직결장암, 전립선암, 췌장암 및 삼중 음성 유방암을 포함하는 유방암을 포함하는 고형 종양의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다. 또한, Notch 신호전달은 암 줄기 세포의 생존 및 성장에 중요하므로, Jagged 의존적 Notch 신호전달의 억제는 줄기 세포 성장 및 생존에 영향을 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 예를 들면, 원발성 종양 기원과 무관하게, 암에서의 전이 또는 골질환의 진행을 치료, 예방, 지연 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대, 예를 들면 비제한적인 예로, ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중 음성 유방암을 포함하는, 유방암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대, 예를 들면 직결장암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 위암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변 예를 들면, 교아세포종의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변 예를 들면, 두경부암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변 예를 들면, 비제한적인 예로, 비소세포 폐암 등과 같은 폐암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예를 들면 다발성 골수종의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 난소암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 췌장암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 전립선암의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예를 들면 육종의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예를 들면 신장암, 예컨대 비제한적인 예로서, 신장 세포 암종의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예를 들면 피부암, 예컨대 비제한적인 예로서, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 흑색종의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
암이외에도, Jagged-의존적 notch 신호경로는 섬유성 질환의 진행에서 중추적인 역할을 하는 세포인, 근섬유아세포로 상피 및 섬유아세포의 분화에 결정적이다. Jagged 의존적 notch 신호전달의 역제, 및 그에 따른 근섬유아세포 출현의 억제는 신장, 간, 폐, 및 피부의 섬유성 질환에 대한 효과적인 치료가 될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 섬유성 질환, 예컨대 특발성 폐섬유증(IPF)을 치료하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 예를 들면 섬유성 질환의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예를 들면, 특발성 폐섬유증, 신장 섬유성 질환, 간 섬유성 질환, 복막 투석-유도성 섬유증, 강피증의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 병변, 예컨대 청력 상실의 진행을 치료, 예방, 지연, 및/또는 이의 증상을 완화시키는데 사용된다.
이들 방법 및 용도의 임의 실시양태에서 사용되는 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 질환의 임의 병기에서 투여될 수 있다. 예를 들면, 이러한 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 초기 내지 전이기의 임의 병기의 암으로 고생하는 환자에게 투여될 수 있다. 피험체 및 환자라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
이들 방법 및 용도의 임의 실시양태에서 사용되는 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 신보강 요법을 포함하는 치료 양생법에 사용될 수 있다.
이들 방법 및 용도의 임의 실시양태에서 사용되는 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체는 단독으로 또는 1 이상의 화학요법제 또는 다른 생물제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 진단 및/또는 예방 징후에서 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 사용하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 (i) 활성화가능한 항-Jagged 항체를 피험체 또는 샘플과 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 절단가능한 모이어티(CM), 및 목적 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 이때 미절단된, 비활성화 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 N 말단에서 C 말단으로 MM-CM-AB 또는 AB-CM-AB 또는 AB-CM-MM의 구조적 배열을 포함하며, 여기서 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, AB의 천연 결합 파트너의 개질 형태가 아니고, (b) 미절단된, 비활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하며, 절단된, 활성화 상태에서 MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지않는 것인 단계; 및 ii) 피험체 또는 샘플에서 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 수준을 측정하는 단계로서, 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 수준은 절단제 및 Jagged 표적이 피험체 또는 샘플에 존재함을 의미하며, 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 수준이 없음은 절단제, Jagged 표적, 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 샘플 중에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않음을 의미하는 것인 단계에 의해 피험체 또는 샘풀에서 절단제 및 목적 표적의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합되는 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 수준을 측정하는 단계는 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 제2 시약을 이용해 수행하며, 이때 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 영상화제, 조영제, 효소, 형광성 표지, 발색단, 염료, 1 이상의 금속 이온, 또는 리간드 기반 표지를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 영상화제는 방사성 동위원소를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네튬이다. 이들 방법 및 키트이 일부 실시양태에서, 조영제, 요오드, 가돌리늄 또는 철 산화물을 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 또는 β-갈락토시다아제를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 형광성 표지는 황색 형광성 단백질(YFP), 청록색 형광성 단백질(CFP), 녹색 형광성 단백질(GFP), 변색된 적색 형광성 단백질(mRFP), 적색 형광성 단백질 tdimer2(RFP tdimer2), HCRED, 또는 유로퓸 유도체가 포함된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 발광성 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 표지는 Alexa Fluor® 표지, 예컨대 Alex Fluor®680 또는 Alexa Fluor®750을 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 리간드-기반 표지는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 1 이상의 햅텐을 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이외의 포유동물, 예컨대 인간이외의 영장류, 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물 또는 동물원 동물 등이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
이들 방법의 일부 실시양태에서, 이 방법은 생체내 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 이 방법은 원위치내 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 이 방법은 생체외 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 이 방법은 시험관내 방법이다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 방법 또는 키트는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하는데 적합한 환자 개체군을 확인하거나 또는 아니면 세련하는데 사용된다. 예를 들면, 두 표적 모두(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)에 대해 양성으로 검사된 환자 및 이들 방법에서 시험된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM)에서 기질을 절단하는 프로테아제는 이러한 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하는데 적합한 후보물로서 동정된다. 유사하게, 두 표적 모두(예를 들면, Jagged 1 및 Jagged 2)에 대해 음성으로 검사된 환자 및 이들 방법으로 시험된 활성화가능한 항체 중 CM에서 기질을 절단하는 프로테아제는 다른 형태의 용법에 대해 적합한 후보물로서 동정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 키트는 이를 필요로하는 피험체에게 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 투여하는 치료가 후속되는, 본원의 항-Jagged 활성화가능한 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 치료제가 접합된 활성화가능한 항체)로 치료하기에 적합한 환자 개체군을 동정 또는 아니면 세련하는데 사용된다. 예를 들면, 두 표적 모두(예를 들며, Jagged 1 및 Jagged 2)에 대해 양성으로 검사된 환자 및 이들 방법에서 시험한 활성화가능한 이들 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM) 중 기질을 절단하는 프로테아제를 이러한 CM을 포함하는 이러한 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용한 치료에 적합한 후보물로 동정하고, 이어 환자는 시험된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 의 치료 유효량을 투여받는다. 유사하게, 표적 중 하나 또는 표적 둘 모두(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)에 대해 음성으로 검사된 환자 및 이들 방법으로 시험된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 CM 중 기질을 절단하는 프로테아제는 다른 형태의 요법에 적합한 후보물로서 동정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체가 동정될 때까지 다른 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체로 검사할 수 있다(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체). 일부 실시양태에서, 환자는 이어서 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 환자가 양성으로 검사된 것과 접합된 항체의 치료 유효량을 투여받는다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, MM은 길이가 약 4 내지 40개 아미노산인 펩티드이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 링커 펩티드를 포함하고, 여기서 링커 펩티드는 MM과 CM 사이에 위치된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 링커 펩티드를 포함하며, 여기서 링커 펩티드는 AB와 CM 사이에 위치된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제1 링커 펩티드(L1) 및 제2 링커 펩티드(L2)를 포함하고, 여기서 제1 링커 펩티드는 MM과 CM 사이에 위치하고 제2 링커 펩티드는 AB와 CM 사이에 위치한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 각각은 길이가 약 1 내지 20개 아미노산인 펩티드이고, 여기서 각각의 L1 및 L2는 동일한 링커일 필요는 없다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 하나 또는 둘 모두는 글리신-세린 중합체를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 1 이상은 (GS)n,(GSGGS)n(서열번호 123) 및 (GGGS)n(서열번호 124)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 식에서 n은 1 이상의 정수이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 1 이상은 화학식 (GGS)n를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 식에서, n은 1 이상의 정수이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 1 이상은 Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 125), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 129), 및 Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호　130)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, AB는 본원에 제시된 교차 반응성 항-Jagged 항체 서열에서 선택되는 항체 또는 항체 단편 서열을 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, AB는 Fab 단편, scFv 또는 단일 사슬 항체(scAb)를 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 절단제는 Jagged 표적과 피험체 또는 샘플 중에 공동국재하는 프로테아제이고 CM은 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드이며, 여기서 폴리펩티드는 활성화가능한 항-Jagged 항체가 프로테아제에 노출시 활성화가능한 항-Jagged 항체 중 CM을 절단한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 길이가 최대 15 아미노산인 폴리펩티드이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 N 말단에 커플링된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 C 말단에 커플링된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 VL 사슬의 N 말단에 커플링된다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 절단제는 효소이고 CM은 효소에 대한 기질이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 효소는 본원에 개시된 프로테아제이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 프로테아제는 본원에 개시된 프로테아제 중 하나이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및 MMP-14로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체 및 담체를 포함한다. 이들 약학 조성물은 키트, 예컨대 진단 키트를 포함할 수 있다.
당분야의 숙련가는 본 발명의 항체가 다양한 용도가 있음을 이해하게 될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 단백질은 다양한 진환에서 Notch 수용체를 통한 Jagged-매개 신호전달의 활성화를 예방하기 위한 치료제로서 사용된다. 본 발명의 항체는 또한 진단 도구로서 또는 진단 키트 중 시약으로서 사용되거나, 또는 이들 항체는 치료 시약을 생성하기 위한 경쟁 어세이에서 사용될 수 있다.
도 1은 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32라고 표시한 항-Jagged 항체와 인간 및 마우스 Jagged 1 및 인간 Jagged 2의 결합을 도시한 그래프이다.
도 2는 인간 Notch 1과 Jagged 1 결합을 억제하는 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32의 능력을 도시한 그래프이다.
도 3은 BxPC3 이종이식 종양의 성장을 억제하는 4D11(본원에서 또한 항-Jagged 4D11, 항-Jagged 4D11 항체, 4D11 항체, 또는 항체 4D11이라고 언급함)이라고 본원에서 언급한 항-Jagged 항체의 능력을 도시한 그래프이다.
도 4는 항-Jagged 4D11 항체가 투여된 마우스의 체중 감량을 도시한 그래프이다.
도 5는 항-Jagged 4D11 항체가 투여된 마우스에서 TSLP의 혈청 농도를 도시한 그래프이다.
도 6은 접종 후 30일 이상 동안 BxPC3 이종이식 종양의 성장을 억제하는 항-Jagged 4D11 항체의 능력을 도시한 그래프이다.
도 7은 항-Jagged 4D11 항체를 투여한 마우스의 체중 감량을 도시한 그래프이다.
도 8은 인간 골수와의 공배양물 중 다발성 골수종 세포주 RPMI 8226의 증식을 억제하는 항-Jagged 4D11의 능력을 도시한 그래프이다.
도 9A, 9B 및 9C는 TGFβ1의 존재 또는 부재하에서 래트 섬유아세포 세포주 NRK-49F에 대한 항-Jagged 항체의 효과를 도시한 일련의 사진이다. 도 9A는 100 nM 항-Jagged 4D11의 존재 하에 배양할 경우 NRK-F49의 배양물이 특징적인 단층을 유지함을 증명한다. 도 9B는 10 ng/mL TGFβ1 존재 하에 배양된 NRK-F49에 대한 특징적인 병소 형성을 증명한다. 도 9C는 TGFβ1-자극된, 섬유성 병소 형성이 10 ng/mL TGFβ1으로 처리한 배양물 중 100 nM 항-Jagged 4D11에 의해 완전하게 억제됨을 보여준다.
도 10은 항-Jagged 4D11 항체 및 Fab 단편의 존재 하에서 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝한 결과를 도시한 일련의 도면이다. 스크리닝은 1회의 MACS 및 2회의 FACS 분급법으로 이루어진다. 2차 FACS로부터의 양성 개체군은 항-Jagged 4D11 항체 및 Fab와의 결합이 재조합 Jagged 단백질에 의해 억제됨을 검증하였다.
도 11은 항-Jagged 차폐성 모이어티 JS4896의 결합을 친화성 성숙화된 항-Jagged 차폐성 모이어티 JS5340, JS5342, JS5347, 및 JS5358의 결합을 비교한 그래프이다.
도 12는 시험관내 결합 ELISA에서 Jagged 표적과 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 항-Jagged 차폐된 항체의 결합을 억제하는 MM5342의 능력을 도시한 일련의 그래프이다.
도 13은 활성화가능한 항-Jagged 항체의 단백질가수분해성 활성화를 도시한 사진 및 표이다.
도 14는 항-Jagged 항체 4D11(모항체)이 그러한 것처럼, 활성화가능한 항-Jagged 항체가 마우스에서 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제했음을 보여주는 그래프이다. 이 그래프는 종양 부피 대 초기 투약 후 일수에 대해 그래프를 그린 것이다.
도 15는 활성화가능한 항-Jagged 항체, 차폐된 항체, 또는 모항체를 투여한 마우스의 체중 감량 비교를 도시한 그래프이다.
도 16A는 마우스 TSLP의 혈청 수준을 도시한 그래프이고, 여기서 마우스 TSLP의 혈청 수준은 각 군으로부터 각 투약 전 및 최종 투약 후 10일에 개별 마우스에 대해 정량하였고 이어 평균내었다. 도 16B는 항-Jagged 항체 4D11 및 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11에 대한 TSLP 혈청 농도의 시간 경과를 도시한 도면이다.
도 17은 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 또는 항-Jagged 항체 4D11을 투여한 마우스의 혈청 중 시간 경과에 따른 평균 인간 IgG 수준을 비교한 도면이다.
도 18은 세포 상에서 항-Jagged Fab 4D11과의 발현 정규화 결합을 도시한 그래프이다.
도 19는 활성화가능한 항체의 제자리 영상화를 개략적으로 도시한 도면이다: 1. 조직 섹션을 슬라이드 상에 위치시켰다. 2. 슬라이드를 표지된 활성화가능한 항체를 함유하는 용액으로 덮고 항온반응시켰다. 3. 광범위한 세척 후, 활성화된 항체의 결합을 가시화하였다.
도 20은 원위치내 영상화를 이용하여 검증된 바와 같이 활성화되고 BxPC3 이종이식 종양 조직에 결합하는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 능력을 도시한 일련의 영상이다. 활성화가능한 항체는 Alexa Fluor®680로 표지하여 표지된 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11-AF680 및 5342-PLGL-4D11-AF680을 생성하였고, 또한 본원에서는 각각 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680이라고 한다. 또한, 표지된 항-Jagged 모항체 4D11-AF680도 검사하였다.각각의 4D11-AF680(컬럼 1, 1열), 1204-4D11-AF680(컬럼 2, 1열) 및 PLGL-4D11-AF680(컬럼 3, 1열)은 냉동된 BxPC3 이종이식 종양 조직 샘플과 항온반응시켰다. 2열의 패널은 4D11-AF680(컬럼 1), 1204-4D11-AF680(컬럼 2) 및 PLGL-4D11-AF680(컬럼 3)과 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제 칵테일의 항온반응 후 얻은 형광성 영상을 나타낸다.
도 21은 인간 췌장 암 조직의 원위치 영상화를 통해 검증된 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 활성화를 도시한 일련의 영상이다. 각각의 4D11-AF680(4D11)(컬럼 1, 1열), 1204-4D11-AF680(1204)(컬럼 1, 2열) 및 PLGL-4D11-AF680(PLGL)(컬럼 1, 3열)을 췌장암이 있는 인간 환자에서 단리한 냉동 조직 샘플과 항온반응시켰다. 각각 컬럼 2, 3, 및 4의 패널은 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680을 냉동 췌장암 환자 조직 사전처리된 항체 A11, 마트립타아제라고도 알려진 MT-SP1 프로테아제의 활성 부위와 특이적으로 결합하는 항체;(컬럼 2); MMP 억제제(도 21, 컬럼 3); 또는 광범위한 스펙트럼 프로테아제 억제제 칵테일(컬럼 4)와 항온반응 후 얻은 형광성 영상을 나타낸다.
도 22는 항-Jagged 항체의 생체내 영상화를 도시한 그래프 및 영상이다. 도 22A는 BxPC3 종양 이종이식 마우스 모델에서 주사후 48시간 경 표지된 4D11 항체 형광 신호 표지를 제공하는 영상이다. 도 22B는 항체 4D11 투약 그룹에 대한 평균 방사 효율의 평균 T/N 비율±SD를 도시한 그래프이다.
도 23은 단독으로 또는 추가 항암제, 젬시타빈과 투여시 BxPC3 이종이식 마우스 모델에서 종양의 성장을 억제하는 항-Jagged 4D11 항체의 효과를 도시한 도면이다.
도 24는 활성화(+uPA) 및 비활성화(미처리 또는 +PBS)된 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체; 활성화 및 비활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체; 및 항-Jagged 및 리툭산 항체 및 항체-제제 접합체의 활성을 도시한 BxPC3 성장 억제 곡선 그래프이다.
도 25는 항-Jagged 항체 4D11-MMAE 및 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11-MMAE 둘 모두가 그들의 미접합 대응물 보다 더욱 효과적으로 BxPC-3 이종이식 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 26은 항-Jagged 항체 4D11, 항-Jagged 항체-MMAE, 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 또는 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체 5342-1204-4D11-MMAE를 투약한 동물에서 관찰된 체중 감량을 도시한 그래프이다.
도 27A-27C는 본원의 항-Jagged 항체가 높은 친화성 및 인간/설치류 교차 반응성으로 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합함을 보여주는 일련의 표 및 그래프이다. 도 27A의 표는 항-Jagged 클론 중 특이성의 다양성을 보여준다. 도 27B의 표는 항-Jagged 항체 4D11이 모든 4종의 Jagged 리간드: 인간 Jagged 1(hJAG1), 인간 Jagged 2(hJAG2), 래트 Jagged 1(rJAG1) 및 래트 Jagged 2(rJAG2)에 대해 높은 친화성을 가짐을 보여준다. 도 27C의 그래프는 본원의 성숙화된 항-Jagged Fab 단편(상단 패널) 및 본원의 성숙화된 IgG 분자(하단 패널)가 Notch 신호전달을 억제함을 보여주는 도면이다.
도 28은 특히 인간 폐암종 세포주인, H292 세포주에 의한 내재화와 비교하여, 시간 경과에 따른 내재화 백분율로 그래프화한, BxPC3 췌장 세포주에 의한 본원의 항-Jagged 항체의 효율적인 내재화를 보여주는 그래프이다. 내재화는 [Gostring L et al, 2010, Int J Oncol 36, 757-763]에 기술된 것과 유사한 방법을 이용해 확인하였다.
도 29는 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제하는 젬시타빈과 병용된 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 능력을 도시한 도면이다.
도 30은 보다 높은 용량의 항체 및 젬시타빈을 투약한 동물은 유의한 체중 감량을 보이지만, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 젬시타빈을 투약한 동물은 젬시타빈 단독과 비교하여 체중 감량을 보이지 않음을 도시한 그래프이다.
도 31은 젬시타빈과 병용하여 오직 20 mg/kg 항-Jagged 항체를 투여한 경우 높은 혈청 mTSLP를 보여주는 그래프이다.
도 32는 항-Jagged 항체 4D11이 TRAMP 마우스에서 전립선 종양의 성장을 제한하는데 효과적임을 보여주는 그래프이다.
도 33은 항-Jagged 항체 4D11가 Her2/neu 형질전환 마우스에서 자연발생 암의 성장을 강력하게 억제함을 보여주는 도면이다.
도 34는 활성화가능한 항체의 AB에 특이적으로 결합하고 검출가능한 표지를 포함하는 제2 시약 및 미표지화(즉, 표지하지 않음)된 활성화가능한 항체를 이용하여 원위치 영상화 수행의 실현가능성을 보여주는 일련의 영상이다.
도 35는 형질전환 전립선암 모델(TRAMP)의 종양 조직에 의해 미표지화된 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 활성화를 도시한 일련의 영상이다.
도 36은 인간 Jagged 1에 결합하는 항체 4D11, 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11), 및 MT-SP1-활성화된 항체 5342-1204-4D11의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 37은 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11이 H292 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 38은 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11는 TSLP에서 상승이 없는 반면, 6.7 및 20 mg/kg의 항체가 투여된 동물은 IVIg 처리군과 비교하여 TSLP가 증가됨을 보여주는 그래프이다.
도 39는 과각화증이 항체-처리군에서 관찰된 반면, 활성화가능한 항체-처리군에서는 과각화증이 제한되거나 또는 없음을 보여주는 일련의 영상이다.
본 발명은 암의 진단 및 치료를 위한 신규 조성물을 기술한다. 구체적으로, 본 발명은 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하고 그들이 Notch 수용체에 결합하여 신호전달하는 것을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체(즉, 교차 반응성 단일클론 항체)를 제공한다. 이들 항체는 집합적으로 본원에서 "항-Jagged 항체"라고 한다.
Jagged 억제로부터 얻는 이득을 볼수 있는 증상은 암을 포함한다. 예를 들면, 증상에는 T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL)을 포함하는, 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프성 질환, 및 폐암, 직결장암, 전립선암, 췌장암 및 삼중 음성 유방암을 포함한 유방암을 포함하는 고형 종양이 포함된다. 또한, notch 신호전달은 암 줄기 세포의 생존 및 성장에 중요하므로, Jagged 의존적 notch 신호전달의 억제는 줄기 세포 성장 및 생존에 영향을 준다. 예를 들면, 증상에는 원발성 종양 기원과 무관한, 골질환 또는 암의 전이; 비제한적인 예로, ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중-음성 유방암을 포함한 유방암; 직결장암; 위암; 교아세포종; 두경부암; 폐암, 예컨대 비제한적인 예로서, 비소세포; 다발성 골수종 난소암; 췌장암; 전립선암; 육종; 신장암, 예컨대 비제한적인 예로, 신장세포 암종; 및/또는 피부암, 예컨대 비제한적인 예로, 편평 세포암, 기저세포 암종, 흑색종이 포함된다.
암이외에도, Jagged-의존적 notch 신호전달은 섬유성 질환의 진행에서 중추적 역할을 하는 세포인 근섬유아세포로의 상피 및 섬유아세포의 분화에서 핵심적이다. Jagged 의존적 notch 신호전달의 억제, 및 그에 따른 근섬유아세포 출현의 억제는 신장, 간, 폐, 및 피부의 섬유성 질환에 효과적인 치료일 수 있다. 예를 들면, 증상은 섬유성 질환, 예컨대 특발성 폐섬유증(IPF); 신장 섬유성 질환, 간 섬유성 질환, 복막 투석-유도성 섬유증, 및/또는 강피증을 포함한다.
다른 적합한 증상은 예를 들면 병변, 예컨대 청력 상실을 포함한다.
본 발명의 항체는 ≤1　μM의 평형 결합 상수(Kd)로 Jagged 1 에피토프 및/또는 Jagged 2 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Jagged 1 에피토프 및/또는 Jagged 2 에피토프와 ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, 또는 ≤ 1 nM의 Kd로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 항-Jagged 항체는 Kd가 대략 ≤ 1 nM 내지 약 1 pM 범위로 나타난다. 일부 실시양태에서, 본원의 항체는 < 10-2, < 10-3, < 10-4, 또는 < 10-5의 "오프 속도 상수"(Koff)로 Jagged 1 에피토프 및/또는 Jagged 2 에피토프와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-Jagged 항체는 < 10-4의 Koff를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-Jagged 항체는 < 10-5의 Koff를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원의 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2의 EGF 도메인에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원의 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2의 DSL 도메인에 결합한다.
본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 생물학적 활성을 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해하도록 제공된다. Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 생물학적 활성은 예를 들면, 1 이상의 Notch 수용체를 통한 신호전달을 포함한다. 예를 들면, 항-Jagged 항체는 1 이상의 Notch 수용체와 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와의 결합을 부분적으로 또는 완전하게 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화, 또는 아니면 방해하여서, 또는 아니면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달 활성을 부분적으로 또는 완전하게 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화하여, 완전하게 또는 부분적으로 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 생물학적 활성을 억제한다.
항-Jagged 항체는 항-Jagged 항체의 존재 하에 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 활성 수준이 본원에 기술된 항-Jagged 항체 부내 하의 활성 수준과 비교하여 적어도 95%, 예를 들면, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 만큼 감소하면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 생물학적 활성을 완전하게 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해한 것으로 간주한다. 항-Jagged 항체는 항-Jagged 항체 존재하에 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 활성 수준이 본원에 기술된 항-Jagged 항체 부재 하의 활성 수준과 비교하여 95% 미만, 예를 들면, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% 또는 90%로 감소하면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 활성을 부분적으로 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해한 것으로 간주한다. Jagged 활성의 예에는 제한없이, 세포 분해 및 분화, 세포 생존/아폽토시스, 상피-간엽 전이(EMT) 및 침입, 혈관신생, 암줄기 세포의 자가 재생, 및 골용해성 골병소를 포함한다. 이론에 제한되지 않고, 혈관생성에서 Jagged의 역할은 VEGF와는 다른 것으로 여겨진다.
정의
달리 정의하지 않으면, 본 발명과 관련되어 사용되는 과학 및 기술 용어는 당분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 달리 본문에서 필요로하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에서 기술하는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화법과 관련되어 이용되는 명명법은 당분야에서 통용되고 공지된 것들이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공, 리포펙션)에 대한 표준 기술이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 지시서에 따라 수행되거나 또는 당분야에서 통상적으로 수행되거나 또는 본원에 기술된 대로 수행하였다. 전술하는 기술 및 절차는 일반적으로 본 명세서 전반에서 인용하고 설명되는 다양하고 보다 구체적인 인용물에 기술되어 있는 바에 따라 그리고 당분야의 통상적인 방법에 따라 수행되었다. 예를 들면, [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))]를 참조한다. 본원과 관련되어 이용된 명명법 및 본원에 기술된 실험실 절차 및 기술, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학은 당분야에 공지이고 통용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 조제, 제형, 및 전달 및 환자 치료에는 표준 기술을 이용한다.
본원에 따라 사용되는 하기의 용어들은 달리 언급하지 않으면, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해한다:
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원과 특이적으로 결합(면역반응)하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. "특이적으로 결합하다" 또는 "면역반응하다" 또는 "면역특이적으로 결합하다"는 항체가 목적 항원의 1 이상의 항원 결정부와 반응하고 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않거나 또는 상당히 낮은 친화성(Kd > 10-6)으로 결합함을 의미한다. 제한없이, 항체는 다클론, 단일클론, 키메라, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab, 및 F(ab')2 단편, scFv, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함한다.
기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 구비한다. 각 사슬의 아미노 말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단부는 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다. 대체로, 인간에서 얻은 항체 분자는 분자 내 존재하는 중쇄의 성질이 서로 상이한, 임의의 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류와 관련된다. 일정 부류는 또한, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 다른 하위부류를 갖는다 또한, 인간에서 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 "단일클론 항체"(mAb) 또는 "단일클론 항체 조성물"은 고유한 경쇄 유전자 산물 및 고유한 중쇄 유전자 산물로 이루어진 항체 분자의 오직 한 분자종을 함유하는 항체 분자 개체군을 의미한다. 구체적으로, 단일클론 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 개체군의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그에 대한 고유한 결합 친화성으로 특징되는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N 말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "과가변성 영역"이라고 하는, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3개의 고도로 상이한 스트레치가 "프레임워크 영역" 또는 "FR"이라고 알려전 보다 보존된 측접 스트레치 사이에 끼어있다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내 과가변영역 사이 및 그 옆에서 자연적으로 존재하는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개 과가변 영역 및 중쇄의 3개 과가변 영역은 항원 결합 표면을 형성하도록 삼차원적 공간에서 서로 서로에 대하 배치된다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 삼차원 표면에 상보적이고, 각 중쇄 및 경쇄의 3개 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이라고 한다. 각 도메인에 대한 아미노산 배치는 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987), Chothia et al. Nature 342:878-883(1989)]의 정의에 따른다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프"는 면역글로불린, scFv, 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부를 포함한다. 에피토프 결정부는 일반적으로 분자 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지고 일반적으로 특이적인 삼차원 구조 특징을 비롯하여 특이적인 전하 특징을 갖는다. 예를 들면, 항체는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 대해 생성될 수 있다. 항체는 해리 상수가 ≤ 1 μM일 경우 특이적으로 결합한다고 할 수 있으며, 예를 들면, 일부 실시양태에서 ≤ 100 nM일때, 일부 실시양태에서 ≤ 10 nM일때 특이적으로 결합한다고 한다.
본원에서 사용하는 용어 "특이적 결합", "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"은 면역글로불린 분자와 그 면역글로불린이 특이적인 항체 간에 발생하는 유형의 비공유적 상호작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도, 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수(Kd)라는 용어로 표현할 수 있으며, 이때 보다 작은 Kd는 보다 큰 친화성을 나타낸다. 선별된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당분야에 공지된 방법을 이용해 정량할 수 있다. 이러한 한 방법은 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 포함하고, 여기서 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성, 및 양 방향 속도에 균등하게 영향을 미치는 기하학적 매개변수에 따라 좌우된다. 따라서, "온 속도 상수"(Kon) 및 "오프 속도 상수"(Koff)는 농도, 및 실제 해리 및 회합 속도를 측정하여 결정한다([Nature 361:186-87(1993)] 참조). Koff/Kon의 비율은 친화성과 관련없는 모든 매개변수를 취소시킬 수 있고, 해리 상수 Kd와 동일하다(대체로, [Davies et al.(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 발명의 항체는 방사성리간드 결합 어세이 또는 당분야의 숙련가에게 공지된 유사한 어세이를 통해 측정시, 평형 결합 상수(Kd)가 ≤1 μM일때, 예를 들면 일부 실시양태에서 ≤ 100 nM, 일부 실시양태에서 ≤ 10 nM, 그리고 일부 실시양태에서 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM일 때 EGFR에 특이적으로 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈의 폴리뉴클레오티드, cDNA, 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합을 의미하며, 그 기원때문에, "단리된 폴리뉴클레오티드"(1)는 "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부와 회합되지 않거나, (2) 자연적으로 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, 또는 (3) 보다 큰 서열의 부분으로서 자연계에서 발생되지 않는다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본원에 도시된 중쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자, 및 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 언급하는 용어 "단리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원의 단백질 또는 이의 일부 조합을 의미하며, 그의 기원, 또는 유도화의 공급원에 따라, "단리된 단백질"(1)은 자연계에서 발견되는 단백질과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원 유래의 다른 단백질이 없거나, 예를 들면 쥣과동물 단백질이 없거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연적으로 발생하지 않는다.
용어 "폴리펩티드"는 천연 단백질, 단편, 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 의미하기 위한 포괄적 용어로서 본원에서 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편, 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본원에서 보여주는 중쇄 면역글로불린 분자, 및 본원에서 보여주는 경쇄 면역글로불린 분자를 비롯하여, 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로불린 분자, 예컨대 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합에 의해 또는 이의 반대 조합에 의해 형성된 항체분자와, 이의 단편 및 유사체를 포함한다.
물체에 적용하는 바와 같이 본원에서 사용되는 용어 "천연적으로 발생한"은 물체가 자연계에 존재할 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들면, 자연계 공급원에서 단리할 수 있고 실험실 등에서 인간에 의해 의도적으로 개질되지 않은 유기체(바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 그렇게 기술된 성분의 위치가 의도하는 방식으로 그들이 기능할 수 있는 관계로 존재함을 의미한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 호환되는 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 획득되도록 결찰된다.
본원에서 사용되는 용어 "제어 서열"은 그들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 실행하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 제어 서열의 성질은 원핵생물 내 숙주 유기체에 따라 상이하며, 이러한 제어 서열은 대체로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 진핵생물 내 전사 종결 서열을 포함하고, 대체로 이러한 제어 서열을 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 최소한으로, 그 존재가 발현 및 프로세싱에 본질적인 모든 성분들을 포함하고자 하는 의도이며, 또한 그 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너를 포함한다. 본원에서 언급되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 10 베이스 이상인 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들 뉴클레오티드 유형의 개질형을 의미한다. 이 용어는 DNA의 단일 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본원에서 언급하는 용어 올리고뉴클레오티드는 천연 발생, 및 비천연 발생 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 발생, 및 개질된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 대체로 200 베이스 또는 그 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브셋이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60 베이스이다. 예를 들면 일부 실시양태에서 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40 베이스이다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 예를 들면, 프로브의 경우는 단일 가닥이지만, 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 유전자 돌연변이체의 구축에 사용하기 위해서는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본원에서 언급하는 용어 "천연적으로 발생한 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용하는 용어 "개질된 뉴클레오티드"는 개질되거나 또는 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급하는 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은 올리고뉴클레오티드 연결 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레로에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포론미데이트 등을 포함한다. 예를 들면, [LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209(1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al. 미국 특허 제5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)]를 참조한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하다면 검출용 표지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용하는 20개의 통상적인 아미노산 및 그 약어는 통상의 용법에 따른다. [Immunology - A Synthesis(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass.(1991))]를 참조한다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들면, D-아미노산), 비천연 아미노산 예컨대 α,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상의 아미노산도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대해 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예에는 4 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들면, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에서는, 표준 용법 및 관례에 따라서, 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고 오른쪽은 카르복시 말단 방향이다.
유사하게, 달리 특정하지 않으면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 왼쪽 말단은 5'이고 이중가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 언급된다.초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가의 방향은 전사 방향을 의미하며 RNA와 동일한 서열을 갖고 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역에서 RNA 전사체의 5' 말단을 "상류 서열"이라 하고, RNA와 동일한 서열을 가지며 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역에서 RNA 전사체의 3' 말단까지를 "하류 서열"이라고 한다.
폴리펩티드에 대해 적용되는 용어 "실질적인 동일성"은 예컨대 디폴트 갭 웨이트를 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 배열시, 2개 펩티드가 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들면 일부 실시양태에서, 적어도 90% 서열 동일성, 일부 실시양태에서 적어도 95% 서열 동일성, 및 일부 실시양태에서 적어도 99% 서열 동일성을 공유함을 의미한다.
일부 실시양태에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환과 다르다.
본원에서 설명하는 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서 소수의 변이는, 아미노산 서열 중 그러한 변이가 적어도 75%, 예를 들면, 적어도 80%, 90%, 95%, 및 일부 실시양태에서 99%를 유지하는한, 본 발명에 포함되는 것으로 간주한다. 구체적으로 보존적 아미노산 치환을 고려한다. 보존적 치환은 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 다음의 패밀리로 나뉘어진다: (1) 산성 아미노산은 아스파테이트, 글루타메이트이다; (2) 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘이다; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이다; 그리고 (4) 비하전된 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 리신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족-히드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미느 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함한다. 예를 들면, 이소류신 또는 발린으로 단리된 치환, 글루나메이트로 아스파테이트 치환, 세린으로 트레오닌 치환, 또는 구조적으로 관련있는 아미노산으로의 아미노산의 유사 치환은 특히 그러한 치환이 프레임워크 부위 내 아미노산을 포함하지 않으면, 최종 분자의 결합 또는 특성에 주요한 효과를 갖지 않을 것으로 예측하는 것이 타당하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 비활성을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다. 분석 어세이는 본원에 상세하게 기술한다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당분야의 숙련가가 쉽게 준비할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편 또는 유사체의 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 존재한다. 구조 및 기능 도메인은 공공 또는 사유 서열 데이타베이스와 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 비교하여 확인할 수 있다. 컴퓨터화된 비교 방법을 사용하여 기지의 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 존재하는 서열 모티프 또는 예상되는 단백질 입체구조 도메인을 확인한다. 기지의 삼차 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지이다. [Bowie et al. Science 253:164(1991)]를 참조한다. 따라서, 전술한 예들은 당분야의 숙련가가 본 발명에 따라 구조 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용할 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체배열을 확인할 수 있음을 보여준다.
일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 (1) 단백질가수분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경시키며, (4) 결합 친화성을 변경시키고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 개질시킨다. 유사체는 천연적으로 발생한 펩티드 서열이외 서열의 다양한 돌연변이단백질을 포함한다. 예를 들면, 단일 또는 다수 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로 발생한 서열일 수 있다(예를 들면, 분자내 접촉부를 형성하는 도메인(들) 외부 폴리펩티드 부분에). 보존적 아미노산 치환은 모서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키면 안된다(예를 들면, 치환 아미노산은 모서열 내에 존재하는 나선을 파괴하거나, 또는 모서열을 특징짓는 2차 구조의 다른 유형을 파괴하는 경향을 보여서는 안됨). 당분야에서 인식하는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 [Protein, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)); and Thornton et at. Nature 354:105(1991)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용하는 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실 및/또는 1 이상의 내부 결실(들)을 갖지만, 나머지 아미노산 서열은 예를 들면 전장 cDNA 서열로부터 추론되는 천연적으로 발생한 서열 내 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개 아미노산 길이이다. 예를 들면 일부 실시양태에서 적어도 14개 아미노산 길이, 일부 실시양태에서 적어도 20개 아미노산 길이, 일반적으로 적어도 50개 아미노산 길이, 일부 실시양태에서 적어도 70개 아미노산 길이이다. 본원에서 사용하는 용어 "유사체"는 추론된 아미노산 서열의 일부분과 실질적으로 동일하고 적절한 결합 조건 하에서 EGFR과 특이적으로 결합하는 적어도 25개 아미노산의 절편으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연적으로 발생한 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 전형적으로 유사체는 20개 이상의 아미노산 길이이다. 예를 들면 일부 실시양태에서 적어도 50개 아미노산 길이 또는 그 보다 길며, 흔히 전장의 천연적으로 발생한 폴리펩티드만큼 길수 있다.
용어 "제제"는 본원에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자 또는 생물학적 재료 유래의 추출물을 의미하고자 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "표지" 또는 "표지된"은 예를 들면 방사성표지된 아미노산의 도입에 의해 또는 표식된 아비딘에 의해 검출할 수 있는 바이오티닐 모이어티를 폴리펩티드에 부착(예를 들면, 광학 또는 열량측정 방법으로 검출할 수 있는 효소 활성 또는 형광성 마커를 함유하는 스트렙타비딘)하여 검출가능한 마커를 도입하는 것을 의미한다. 일정 상황하에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 푤리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예에는 제한없이, 다음을 포함한다: 방사성동위원서 또는 방사성핵종(예를 들면, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지(예를 들면, 형광단, 로다민, 란탄계 인광체), 효소적 표지(예를 들면, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리 포스파타아제), 화학발광제, 바이오틸기, 2차 리포터에 의해 인식되는 예정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체용 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 택). 일부 실시양태에서, 표지는 잠재적인 입체 방해를 감소시키도록 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 부착된다. 본원에서 사용되는 용어 "약학제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여시 목적하는 치료적 효능을 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다.
본원의 다른 화학 용어는 예를 들면 [McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco(1985))]에 예시된 바와 같은 당분야의 통상적인 용법에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 목적하는 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로 조성물 중 임의의 다른 개별 종 보다 더 풍부함)이고, 실질적으로 정제된 분획은 목적하는 종이 존재하는 전체 거대 분자 종의 약 50%(몰 기준) 이상을 포함하는 조성물이다.
대체로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 전체 거대분자 종의 약 80%를 넘게, 예를 들면 일부 실시양태에서 약 85%, 90%, 95%, 및 99%를 넘게 포함한다. 일부 실시양태에서, 목적 종은 실질적으로 균질하게 정제되고(오염종은 통상의 검출 방법으로 조성물 중에서 검출할 수 없음), 여기서 조성물은 실질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다.
용어 환자는 인간 및 수의학적 개체를 포함한다.
Jagged 억제로부터 혜택받는 증상은 T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL)을 포함한 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프성 질환, 및 폐암, 직결정암, 전립선암, 췌장암 및 삼중 음성 유방암을 포함한 유방암을 포함하는 고형 종양을 포함한다. 또한, notch 신호전달은 암 줄기 세포의 생존 및 성장에 중요하므로, Jagged 의존적 notch 신호전달의 억제는 줄기 세포 성장 및 생존에 영향을 줄 수 있다. 암이외에도, Jagged 의존적 notch 신호전달은 섬유성 질환의 진행에서 중추적 역할을 하는 세포인, 근섬유아세포로의 상피 및 섬유아세포 분화에서 핵심적이다. Jagged 의존적 신호전달의 억제, 및 그에 따른 근섬유아세포 출현의 억제는 신장, 간, 폐 및 피부의 섬유성 질환의 치료에 효과적일 수 있다.
항-Jagged 항체 및 활성화가능한 항-Jagged 항체
본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 억제하는 능력을 갖는다. 억제는 본원에 제공되는 실시예에 기술된 어세이를 포함하여, 다양한 당분야에서 인지되는 임의 기술을 이용해 결정된다.
본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 부가적으로, 예를 들면, 중쇄 상보성 결정 영역(VH CDR) 및 경쇄 상보성 결정 영역(VL CDR)의 조합을 포함한다. 이러한 CDR의 예는 하기 표 2에 열거하였거나 또한 제한없이 표 3 및 표 4의 것을 포함하여, 본원에 개시한 항체의 CDR이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하며, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다. .
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하며, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 예시적인 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 예를 들면, 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, 6B7 항체, 및 6F8 항체, 및 이의 변이체를 포함한다. 이들 항체는 인간 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 특이성을 보여주며, 이들은 Notch 수용체를 통한 인간 Jagged 1 및/또는 인간 Jagged 2 매개 신호전달을 억제하는 것으로 확인되었다. 이들 항체는 표 4에 열거하고 실시예 5에서 보여주는 아미노산 및 상응하는 핵산 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및/또는 활성화가능한 항체이다. 예를 들면, 본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 인간 Jagged 1에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 인간 Jagged 1 상의 1 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다(예를 들면, 수탁번호 AAC52020.1; AAB84053.1; NP_000205.1; P78504.3; AAB39007.1; EAX10341.1; AAI26208.1; AAI26206.1; AAH98393.1; CAC07198.1 및/또는 BAG35596.1로 표시된 것들). 본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 인간 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 인간 Jagged 2 상의 1 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다(예를 들면, 수탁번호 AAB61285, AAB71189.1, EAW81901.1, NP_002217.3, 및/또는 Q9Y219.3을 참조한다). 본 발명의 항체는 인간 Jagged 1 및 인간 Jagged 2 둘 모두에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 인간 Jagged 1 상의 1 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프 및 인간 Jagged 2 상의 1 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다.
당분야의 숙련가는 Jagged 1, Jagged 2 또는 Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두에 본 발명의 항체가 결합하는 것을 실험 항체가 방해하는지 여부를 확인하여 단일클론 항체(예를 들면, 완전한 인간 단일클론 항체) 및/또는 활성화가능한 항체가 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체(예를 들면, 4D11, 4B2, 4E7, 4E11, 6B7, 및/또는 6F8 및 이들 항체를 포함하는 활성화가능한 항체)와 동일하거나 또는 유사한 특이성을 갖는지에 대해 과도한 실험없이 확인하는 것이 가능함을 인지할 것이다. 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체에 의한 결합 감소를 통해 확인되는 바와 같이, 시험된 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체와 경쟁한다면, 2종의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 동일하거나, 또는 밀접하게 관련된, 에피토프에 결합한다.
단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 특이성을 갖는지 여부를 결정하는 일 실시양태는 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체를 가용성 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 단백질(정상적으로 반응함)과 사전항온반응시킨 후, 시험하려는 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합하는 그 능력이 억제되는지 확인하기 위해 시험하려는 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체를 부가하는 것이다. 시험하려는 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 모두 유사하게, 억제되면, 본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체와 동일하거나, 또는 기능적으로 동등한, 에피토프 특이성을 가질 것이다.
본 발명의 단일클론 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 스크리닝은 또한, 예를 들면 Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 측정하고 시험 단일클론 항체가 Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해할 수 있는지 여부를 결정하여 수행할 수도 있다. Jagged 활성의 예에는 제한없이, 세포 분열 및 분화, 세포 생존/아폽토시스, 상피-간엽 전이(EMT) 및 침윤, 혈관신생, 암 줄기 세포의 자가 재생, 및 골분해성 골 병소가 포함된다. 이러한 활성을 측정하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지이다.
당분야에 공지인 다양한 방법들을 사용해 인간 Jagged 1 및/또는 인간 Jagged 2에 대한 단일클론 항체, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 동족체 또는 상동체를 생산할 수 있다(예를 들면, [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]를 참조하며, 이를 참조하여 본원에 편입시킨다). 완전한 인간 항체는 CDR을 포함하여 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 전체 서열이 인간 유전자로부터 발생한 항체 분자이다. 이러한 항체를 본원에서는 "인간 항체" 또는 "완전한 인간 항체"라고 한다. 인간 단일클론 항체는 예를 들면 이하에 제공된 실시예에 기술된 과정들을 이용해 제조된다. 인간 단일클론 항체는 또한 트리오마 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); 및 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 EBV 하이브리도마 기술(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES and CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 이용해 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체는 인간 하이브리도마(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030)를 이용하거나 또는 시험관내 엡스테인 바 바이러스로 인간 B-세포를 형질전환(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES and CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)시켜 이용하고 생산할 수 있다.
항체는 주로 면역 혈청의 IgG 분획을 제공하는, 단백질 A 또는 단백질 G를 이용한 친화성 크로마토그래피 등과 같은 공지의 방법을 통해 정제된다. 후속하여, 또는 대안적으로, 찾고자하는 면역글로불린의 표적, 또는 이의 에피토프인 특이적 항원을 컬럼 상에 고정화시켜서 면역친화성 크로마토그래피를 통해 면역 특이적 항체를 정제할 수 있다. 면역글로불린의 정제는 예를 들면, D. Wilkinson이 기술한 바에 따를 수 있다[The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8(April 17, 2000), pp. 25-28)].
본 발명의 항체는 단일클론 항체이다. Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 조절, 차잔, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해하는 단일클론 항체는, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2, 예컨대, 예를 들면, 쥣과동물, 래트 또는 인간 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 또는 이의 면역 단편, 유도체 또는 변이체로 동물을 면역화시켜 생성시킨다. 다르게, Jagged 1 및/또는 Jagged 2가 발현되어 형질감염된 세포의 표면과 회합되도록 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 코딩하는 핵산 분자를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포로 동물을 면역화시킨다. 다르게, 항체는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와의 결합을 위한 항체 또는 항원 결합 도메인 서열을 함유하는 라이브러리를 스크리닝하여 얻는다. 이러한 라이브러리는 예를 들면 조립되는 파지 입자의 표면 상에서 발현되는 박테리오파지 코트 단백질과 단백질 또는 펩티드 융합물로서 박테리로파지에서 준비하고 그 코딩 DNA 서열은 파지 입자 내에 함유된다(즉, "파지 디스플레이드 라이브러리"). 골수종/B 세포 융합으로 얻은 하이브리도마를 이후 Jagged 1 및 Jagged 2와의 반응성에 대해 스크리닝한다.
단일클론 항체는 예를 들면, [Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용해 제조된다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면억제로 면역시켜서 면역제에 특이적으로 결합하게되는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도시킨다. 다르게, 림프구는 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
면역제는 전형적으로 단백질 항원, 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 인간 기원 세포가 바람직하다면 말초혈 림프구를 이용하고, 인간이외 포유동물 공급원이 바람직하면 비장 또는 림프절 세포를 이용한다. 이어 림프구는 적절한 융합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용해 불멸화 세포주와 융합시켜서 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,(1986) pp. 59-103). 불멸화 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주를 사용한다. 하이브리도마 세포는 일부 실시양태에서, 미융합된, 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지에서 배양될 수 있으며, 일부 실시양태에서, 예를 들면 모세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT 또는 HPRT)가 부족하다면, 이러한 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 성분인, 하이포잔틴, 아미노테린, 및 티미딘을 포함한다("HAT 배지").
일부 실시양태에서, 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택적인 항체 생성 세포에 의한 안정하고 높은 수준의 항체 발현을 뒷받침하며, HAT 배지 등과 같은 배지에 민감하다. 일부 실시양태에서, 불멸화 세포주는 예를 들면 미국, 캘리포니아주, 샌디에고 소재의 솔크 연구소 세포 분배 센터 및 미국, 버지니아주, 마나사스 소재의 미국 세포주 은행에서 입수할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 단일클론 항체의 생성을 위해 기술된 바 있다(Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York,(1987) pp. 51-63)).
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 이어 항원에 대해 생성된 단일클론 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 시험관내 결합 어세이, 예컨대 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소 연결된 면역흡착 어세이(ELISA)에 의해 또는 면역침강법에 의해 확인된다. 이러한 기술 및 어세이는 당분야에서 공지이다. 단일클론 항체의 결합 친화성은 예를 들면 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)]의 스캐차드 분석법으로 확인한다. 또한, 단일클론 항체의 치료적 용도에서, 표적 항원에 대해 높은 특이도 및 높은 결합 친화도를 갖는 항체를 동정하는 것이 중요하다.
원하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 그 클론은 제한 희석 방법을 통해 서브클로닝하고 표준 방법을 성장시킬 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,(1986) pp. 59-103). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, 둘베코 개질 이글 배지 및 RPMI-1640 배지이다. 다르게, 하이브리도마 세포는 포유동물 내 복수로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단일클론 항체는 통상의 면역글로불린 정제법, 예컨대 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피를 통해 복수 또는 배양 배지로부터 단리하거나 또는 정제할 수 있다.
단일클론 항체는 또한, 미국 특허 제4,816,567에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법으로 만들 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 통해 용이하게 단리 및 서열분석할 수 있다(예를 들면, 쥣과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함). 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 이어서 이를 예컨대 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 등과 같은 숙주 세포로 형질전환시켜서, 재조합 숙주 세포 내에서서 단일클론 항체의 합성을 얻을 수 있다. 쥣과동물 하이브리도마로부터 단리된 항체의 경우, 또한 DNA는 예를 들면, 상동성 쥣과동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불편 도메인을 코딩하는 서열을 치환시켜서 개질시킬 수 있다(미국 특허 제4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13(1994)). 항체-코딩 DNA는 면역글로불린 코딩 서열과 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부분과 공유적으로 연결된다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나 또는 본 발명의 항체의 항원-조합 부위의 가변 도메인을 치환시켜 키메라 이가 항체를 생성시킬 수 있다.
인간 항체 및 항체의 인간화
본 발명의 단일클론 항체는 완전한 인간 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 이들 항체는 투여된 면역글로불린에 대해 인간이 면역 반응을 일으키지 않고 인간에게 투여되지 적합하다.
항-Jagged 항체는 예를 들면 이하에 제공되는 실시예에 기술된 방법을 이용해 생성된다.
일부 방법에서, 항-Jagged 항체는 예를 들면, 오직 인간 서열을 함유하는 항체를 이용하는 파지-디스플레이 방법을 이용해 개발된다. 이러한 접근법은 당분야에 공지이며, 예를 들여 WO92/01047 및 미국 특허 제6,521,404호를 참조하며, 참조하여 본원에 편입시킨다. 이러한 접근법에서, 경쇄 및 중쇄의 무작위 쌍을 보유하는 파지의 조합적 라이브러리를 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두 또는 이의 단편의 재조합 또는 천연 공급원을 이용해 스크리닝한다. 다른 접근법에서, 항-Jagged 항체는 공정의 1이상의 단계가 형질전환된, 인간이외 동물을 인간 Jagged 1 단백질, Jagged 2 단백질 또는 Jagged 1 및 Jagged 2 단백질 둘 모두로 면역화시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 접근법에서, 이러한 이종발생성 인간외 동물의 내생성 중쇄 및/또는 카파 경쇄 유전자좌의 일부는 이용할 수 없고 항원에 대응하는 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 생성하는데 필요한 재배열이 일어날 수 없다. 또한, 1 이상의 인간 중쇄 유전자와 및 1 이상의 인간 경쇄 유전자좌는 안정하게 동물에 형질전환되었다. 따라서, 투여된 항원에 대응하여, 인간 유전자좌는 재배열되어 항원에 면역특이적인 인간 가변 영역을 코딩하는 유전자를 제공한다. 따라서, 면역화시, 이종마우스는 완전한 인간 면역글로불린을 분비하는 B-세포를 생산한다.
다양한 기술이 이종발생성 인간외 동물을 생산하는 분야에서 공지이다. 예를 들면, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다. 이러한 일반적인 전략은 1994년에 공개된 제1 XoenoMouse™ 세대와 관련하여 검증되었다. 또한, 본원에 전체로 참조하여 편입시키는 [Green et al. Nature Genetics 7:13-21(1994)]를 참조한다. 또한, 미국 특허 제6,162,963호, 제6,150,584호, 제6,114,598호, 제6,075,181호, 및 제5,939,598호, 일본 특허 제3 068 180호 B2, 제3 068 506호 B2, 및 제3 068 507호 B2 및 유럽 특허 제EP 0 463 151호 B1 및 국제 특허 출원 WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 및 관련 패밀리 구성을 참조한다.
다른 접근법에서, 다른이들은 외인성 Ig 유전자자를 Ig 유전자 유래의 조각(개별 유전자)의 내입을 통해 모방하는 "미니유전자좌" 접근법을 활용한다. 따라서, 1 이상의 VH 유전자, 1 이상의 DH 유전자, 1 이상의 JH 유전자, mu 불변 영역, 및 제2 불변 영역(예를 들면, 감마 불변 영역)을 동물에 삽입을 위한 구성체로 형성된다. 예를 들면, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,545,807호; 제5,591,669호; 제5,612,205호; 제5,625,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,643,763호; 제5,661,016호; 제5,721,367호; 제5,770,429호; 제5,789,215호; 제5,789,650호; 제5,814,318호; 제5,877,397호; 제5,874,299호; 제6,023,010호; 및 제6,255,458호; 및 유럽 특허 제0 546 073호 B1; 및 국제 특허 출원 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 관련 패밀리 구성을 참조한다.
마이크로셀 융합, 염색체의 거대 조각, 또는 전체 염색체를 통해 도입되는 마우스로부터의 인간 항체 생성도 확인되었다. 유럽 특허 출원 제773 288호 및 제843 961호를 참조한다.
인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응은 산업계가 키메라 또는 아니면 인간화 항체를 제조할 수 있게 하였다. 키메라 인간 항체가 인간 불변 영역 및 쥣과동물 가변 영역을 갖는 경우, 일정한 인간 항-키메라 항체(HACA) 반응이 특히 항체의 만성 또는 복수-투약 용도에서 관찰될 것으로 예상된다. 따라서, HAMA 또는 HACA 반응의 우려 및/또는 효과를 줄이거나 또는 없애기 위해서 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두에 대한 완전한 인간 항체를 제공하는 것이 바람직하다.
면역원성이 감소된 항체의 생산은 또한 인간화, 키메라화 및 적절한 라이브러리를 이용한 디스플레이 기술을 통해 수행된다. 쥣과동물 항체 또는 다른 종 유래의 항체는 당분야에 잘 알려진 기술을 이용해 인간화하거나 또는 영장류화시킬 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, [Winter and Harris Immunol Today 14:43 46(1993) and Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168(1992)]를 참조한다. 목적 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및/또는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환시키기 위한 재조합 DNA 기술을 통해 조작할 수 있다(WO 92102190 및 미국 특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호, 및 제5,777,085호를 참조한다). 또한, 키메라 면역글로불린 유전자의 구축을 위한 Ig cDNA의 사용은 당분야에서 공지이다(Liu et al. P.N.A.S. 84:3439(1987) and J. Immunol. 139:3521(1987)). mRNA는 하이브리도마 또는 항체를 생산하는 다른 세포로부터 단리하고 cDNA를 생산하는데 사용한다. 목적하는 cDNA는 특이적 프라이머를 사용해 중합효소 연쇄 반응을 통해 증폭시킬 수 있다(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호). 대안적으로, 라이브러리를 만들고 목적 서열을 단리하기 위해 스크리닝한다. 이어 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 인간 불변 영역 서열과 융합시킨다. 인간 불변 영역 유전자의 서열은 [Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242]에서 확인할 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 기지의 클론에서 쉽게 이용할 수 있다. 이소타입의 선택은 목적하는 이펙터 기능, 예컨대 보체 고정, 또는 항체 의존적 세포의 세포독성에서의 활성에 따라 인도될 수 있다. 적절한 이소타입은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 영역, 카파 또는 람다가 사용될 수 있다. 키마라 단백질은 통상의 방법에 의해 발현된다.
항체 단편, 예컨대 Fv, F(ab')2 및 Fab는 예를 들면 프로테아제 또는 화학적 절단을 통해 온전한 단백질을 절단하여 준비할 수 있다. 다르게, 절두형 유전자를 디자인한다. 예를 들면, F(ab')2 단편의 일부분을 코딩하는 키메라 유전자는 H 사슬의 힌지 영역 및 CH1 도메인과 후속하여 절두형 분자가 형성되도록 번역 중지 코돈을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
V 영역 절편을 인간 C 영역 절편에 후속 연결하기 위해 J 영역에 유용한 제한효소 부위를 도입하기 위한 프로이머로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 디자인하는데 H 및 L J 영역의 공통 서열을 사용할 수 있다. C 영역 cDNA는 인간 서열 내 유사한 위치에 제한효소 부위가 위치되도록 부위 지정 돌연변이유발법을 통해 변형될 수 있다.
발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, YAC, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. 편리한 벡터는 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되어 발혈될 수 있도록 조작한 적절한 제한효소 부위를 갖는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 영역 내 스플라이싱 도너 부위와 인간 C 영역에 선행하는 스플라이싱 억셉트 부위 사이에서 일어나고, 또는 인간 CH 엑손 내 존재하는 스플라이싱 영역에서 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류에 천연 염색체 부위에서 일어난다. 얻어진 항체는 레트로바이러스 LTR, 예를 들면, SV-40 초기 프로모터(Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280(1983)), 루이스 육종 바이러스 LTR(Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777(1982)), 및 몰로니 뮤라인 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl et al. Cell 41:885(1985))를 포함하여 임의의 강프로모터에 연결될 수 있다. 또한, 이해하게 되는 바와 같이, 천연 Ig 프로모터 등을 사용할 수 있다.
또한, 인간 항체 또는 다른 종 유래의 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용하여, 제한없이, 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 및 다른 기술를 포함하는, 디스플레이 유형을 통해 생성될 수 있고, 얻어진 분자는 추가의 성숙화, 예컨대 당분야에 공지된 기술 등과 같은, 친화성 성숙화가 수행될 수 있다. [Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168(1992)], [Hanes and Pluckthun PNAS USA 94:4937-4942(1997)](리보솜 디스플레이), [Parmley and Smith Gene 73:305-318(1988)](파지 디스플레이), [Scott, TIBS, vol. 17:241-245(1992)], [Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382(1990)], [Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085(1993)], [Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68(1992)], [Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A(1992)], 및 미국 특허 제5,733,743를 참조한다. 디스플레이 기술을 인간이 아닌 항체를 생산하는데 이용하는 경우, 이러한 항체는 상기 기술된 바와 같이 인간화될 수 있다.
이들 기술을 이용하여, 항체는 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두 발현 세포, Jagged 1 자체, Jagged 2 자체, Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 형태, 이의 에피토프 또는 펩티드, 및 본원에 기술된 활성에 대해 상기 기술된 바와 같이 이후 스크리닝할 수 있는 이의 발현 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 제5,703,057 참조)로 생성될 수 있다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 상기 기술된 단일 사슬 항체를 코딩하는 DNA 절편을 함유하는 벡터에 의해 발현될 수 있다.
이들은 벡터, 리포솜, 나 DNA, 면역보조제-보조 DNA, 유전자총, 카테터 등을 포함할 수 있다. 벡터는 WO 93/64701에 기술된 바와 같은, 표적화 모이어티, 및 및 핵산 결합 모이어티(예를 들면, 폴리리신)를 갖는, 화학적 접합체(예를 들면, 세포 표면 수용체에 대한 리간드), 바이러스 벡터(예를 들면, DNA 또는 RNA 바이러스 벡터), 표적 모이어티(예를 들면, 표적 세포에 특이적인 항체) 및 핵산 결합 모이어티(예를 들면, 프로타민)을 함유하는 융합 단백질인 PCT/US 95/02140(WO 95/22618)에 기술된 바와 같은 융합 단백질, 플라스미드, 파지 등을 포함한다. 벡터는 염색체, 비염색체, 또는 합성된 것일 수 있다.
적절한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤라인 백혈병 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터는 폭스 벡터 예컨대 오르쏘폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 예컨대 헤르페스 심플렉스 I 바이러스(HSV) 벡터(Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487(1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed.(Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603(1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149(1990), 아데노바이러스 벡터(LeGal LaSalle et al., Science, 259:988(1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219(1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004(1995) 및 아데노-연합 바이러스 벡터(Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8:148(1994)를 포함한다.
폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포의 세포질에 도입시킨다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산이 오직 단기 발현을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합 바이러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 벡터가 신경 세포에 핵산을 도입하는데 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 HSV 벡터보다 짧은, 아데노-연합 바이러스(약 4개월) 보다 짧은 기간 동안 발현된다(약 2 개월). 선택되는 특정 벡터는 치료되는 병태 및 표적 세포에 따라 좌우된다. 도입은 표준 기술, 예를 들면 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환에 의할 수 있다. 유전자 전이 모드의 예에는 예를 들면 나 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션, 세포 미세주입, 및 바이러스 벡터가 포함된다.
벡터는 실질적으로 임의의 바람직한 표적 세포를 표적화하는데 적용될 수 있다. 예를 들면, 입체정위 주입을 사용해 벡터(예를 들면, 아데노바이러스, HSV)를 바람직한 위치로 지정할 수 있다. 부가적으로, 입자는 미니펌프 투입 시스템, 예컨대 싱크로메드 주입 시스템을 이용해 뇌실내(icv) 투입을 통해 전달될 수 있다. 대류라고 칭하는, 대량 흐름을 기반으로 하는 방법은 또한 뇌의 확장 영역으로 거대 분자를 전달하는데 효과적인 것으로 입증되었고 벡터를 표적 세포로 전달하는데 유용할 수 있다(Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080(1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305(1994)). 사용할 수 있는 다른 방법은 카테터, 정맥내, 비경구, 복강내 및 피하 주입, 및 경구 또는 다른 공지의 투여 경로를 포함한다.
이들 벡터는 예를 들면, 샘플 내 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘모두의 존재를 검출하기 위한 다양한 방법에서 사용할 수 있는 대량의 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 Jagged 1, Jagged 2, 및/또는 Jagged 1 및 Jagged 2 둘모두와 관련된 신호전달을 결합시키고 파괴하고자 시도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항원성 단백질에 특이적인 단쇄 항체의 생성을 위해 기술들을 채택할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 단백질 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 바람직한 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 효과적인 동정이 가능하도록 Fab 발현 라이브러리(예를 들면, [Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281] 참조)의 구축을 위한 방법들을 적용할 수 있다. 단백질 항원에 대한 이디오타입을 함유하는 항체 단편은 제한없이 (i) 항체 분자의 펩신 분해를 통해 생산한 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 브릿지를 환원하여 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성된 Fab 단편; 및 (iv) Fv 단편을 포함하여 당분야에 공지된 기술을 통해 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 항체 단편, 단일 사슬 항-Jagged 항체, 이중특이적 항-Jagged 항체, 다중특이적 항-Jagged 항체, 및 이종접합체 항-Jagged 항체를 포함한다.
이중특이적 항체는 2 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 본 발명의 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 것이다. 제2 결합 표적은 임의의 다른 항원이고, 유리하게 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 공지이다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 하고, 여기서 2개 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539(1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류때문에, 이들 하이브리도마(콰드로마(quadromas))는 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하는데, 이중 오직 하나는 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계를 통해 수행된다. 유사한 방법은 1993년 5월 13일 공개된 WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.
목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)는 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합부는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합부의 1 이상에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합부 및, 바람직하다면, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 유기체에 공형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가 설명은, 예를 들면, [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986)]를 참조한다.
WO 96/27011에 기술된 다른 접근법에 따라서, 항체 분자 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로 회수되는 이종이량체의 비율이 최대화되도록 조작될 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 1 이상의 소형 아미노산 측쇄는 거대 측쇄로 치환된다(예를 들면, 타이로신 또는 트립토판). 거대 측쇄(들)와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상적인 "공동"이 거대 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환하여 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 산물 예컨대 동종이량체 보다 이종이량체의 수율을 높히기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들면, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 문헌에 기수되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학 연결을 이용해 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81(1985)]은 온전한 항체를 단백질가수분해적으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 과정을 기술한다. 이들 단편은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화 형성을 방지하도록 디티올 착체 아비산나트륨 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab' 단편은 이어 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 다른 Fab'-TNB 유도체의 등몰량과 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적인 고정화를 위한 제제로 사용될 수 있다.
부가적으로, Fab' 단편은 이.콜라이(E.coli)로부터 직접적으로 회수할 수 있고 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225(1992)]은 완전하게 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술한다. 각 Fab' 단편은 개별적으로 이.콜라이로부터 분비되고 시험관내에서 유도적 화학 커플링을 실시하여 이중특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체 및 정상 인간 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 백혈구의 용균 활성을 촉발할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553(1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합을 통해 상이한 2개 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고 이어서 재산화되어 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산을 위해 이용될 수 있다. [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)]에 기술된 "다이아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 기전을 제공한다. 단편은 너무 짧아서 동일 사슬 상의 2개 도메인 간의 페어링이 가능하지 않은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결? 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 만들어서, 2개 항원-결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(scFv, 또는 ScFv) 이량체를 이용하여 이종특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략이 또한 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368(1994)]을 참조한다.
원자가가 2보다 큰 항체를 고려한다. 예를 들면 삼중특이성 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60(1991)].
예시적인 이중특이적 항체는 2종의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이중 1 이상은 본 발명의 단백질 항원에서 유래된다. 다르게, 면역글로불린 분자의 항-항원 암(arm)은 세포 방어 기전이 특정 항원을 발현하는 세포에 집중하도록 백혈구 상의 촉발성 분자 예컨대 T-세포 수용체 분자(예를 들면, CD2, CD3, CD28, 또는 B7) 또는 IgG(FcγR)에 대한 Fc 수용체, 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 결합하는 암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 특정 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 지정하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원 결합 암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결함하는 암을 보유한다. 다른 이중특이적 항체 실시양태는 본원에 기술된 단백질 항원에 결합하고 조직 인자(TF)에 더욱 결합한다.
이종접합체 항체는 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이종접합체 항체는 2개의 공유적으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들면, 원치않는 세포에 면역계 세포를 표적화(미국 특허 제4,676,980호 참조)하고, HIV 감염의 치료(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 참조)를 위해 제안되었다. 항체는 가교제를 포함한 것을 포함하여, 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관 내에서 제조할 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들면, 면역독소는 이황화 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제작할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티리미데이트 및 예를 들면, 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것이 포함된다.
예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2 신호전달과 연관된 질환 및 질병을 치료하는데서 항체의 효능을 강화시키기 위해, 이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에 사슬간 이황화 결합 형성을 가능케할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재능 및/또는 높은 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 개선시킬 수 있다([Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195(1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922(1992)] 참조). 다르게, 항체는 이중 Fc 영역을 갖게 조작되어서 보체 용해성 및 ADCC 능력이 향상될 수 있다(Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230(1989)).
본 발명은 또한 세포독성제 예컨대 독소(예를 들면, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사능 동위원소(즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체와 관련된다. 적절한 세포독성제는 예를 들면, 돌라스타틴 및 이의 유도체(예를 들면, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE)를 포함한다. 예를 들면, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 표 30에 열거된 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 칼리케아미신 또는 이의 유도체이다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 톡소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된 항체의 생산에 이용될 수 있다. 이의 예에는 212Bi, 64Cu, 125I, 131I, 131In, 99mTc, 90Y, 186Re, 및 89Zr가 포함된다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질-커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대 디숙신이미딜 수버레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 이용해 제조된다. 예를 들면, 리신 면역독소는 [Vitetta et al., Science 238: 1098(1987)]에 기술된 대로 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO94/11026 참조).
표 30은 본원에 기술된 발명에서 채택할 수 있는 예시적인 약학제의 일부를 열거한 것이지만 배타적인 목록을 의미하는 것은 아니다.
Figure pct00001
Figure pct00002
당분야의 숙련가는 대량의 다양한 가능성있는 모이어티를 본 발명의 최종 항체에 커플링할 수 있음을 인식할 것이다(예를 들면, ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr(eds), Carger Press, New York,(1989)]를 참조하며, 이 전체 내용을 참조하여 본원에 편입시킴).
커플링은 항체 및 다른 모이어티가 그들 개별 활성을 보유하는 한 2개 분자에 결합하게 되는 임의 화학 반응을 통해 수행될 수 있다. 이러한 연결은 많은 화학 기전, 예를 들면 공유 결합, 친화성 결합, 인터칼레이션, 배위 결합 및 착체화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 존재하는 측쇄의 직접 축합에 의해서 또는 외부 가교 분자의 도입에 의해 획득될 수 있다. 많은 이가 또는 다가 연결제는 단백질 분자, 예컨대 본 발명의 항체를 다른 분자와 커플링하는데 유용하다. 예를 들면, 대표적인 커플링제는 유기 화합물 예컨대 티오에스테르, 카르보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민이 포함된다. 이 목록은 당분야에 공지된 다양한 커플링제 부류를 배제하려는 의도가 아니며, 단지 보다 일반적인 커플링제의 예이다(Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549(1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216(1982); and Vitetta et al., Science 238:1098(1987).
적합한 링커는 문헌에 기술되어 있다(예를 들면, MBS(M-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르의 용도를 기술한 [Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208(1984)] 참조). 예를 들면, 또한 올리고펩티드 링커에 의해 항체에 커플링된 할로겐화 아세틸 히드라지드 유도체의 용도를 기술한 미국 특허 제5,030,719호를 참조한다. 특히 적합한 링커는 (i) SMPT(4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat.(21558G); (ii) SPDP(숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도]헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat #21651G); 및 (iii) 설포-LC-SPDP(설포숙신이미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G)를 포함한다.
상기 기술된 링커는 상이한 속성을 갖는 성분들을 함유하여서, 상이한 물리화학적 특성을 갖는 접합체가 유도된다. 예를 들면, 링커 SMPT는 입체적으로 방해된 이황화 결합을 함유하고, 안정성이 높은 접합체를 형성할 수 있다. 이황화 연결은 대체로, 이황화 연결이 시험관내에서 절단되어, 이용가능한 접합체가 덜 생성되므로 다른 연결에 비해 덜 안정하다.
시약 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드는 카르복실산 및 1차 또는 2차 아민으로 출발하여 카르복사미드를 생성하는데 유용하다. 따라서, EDC는 항체 내 리신 잔기를 링커 또는 독소 내 카르복실산와 연결시키거나 또는 항체 내 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기를 링커 또는 톡신 내 아민을 연결하는데 사용될 수 있다. EDC를 이용하는 이러한 접합 반응은 NHS(N-히드록시숙신이미드) 또는 설포-NHS(N-히드록시-3-옥소설포닐숙신이미드)의 부가에 의해 강화될 수 있다. 이러한 접합 반응에 NHS 또는 설포-NHS의 부가는 접합 반응의 속도, 완성도, 선택성, 및/또는 재현성을 향상시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 2 이상의 링커가 존재한다. 2 이상의 링커는 모두 동일하고, 예를 들면, 절단가능하거나 또는 절단가능하지 않거나 또는 2 이상의 링커는 상이하며, 예를 들면 1 이상은 절단가능하고 1 이상은 절단가능하지 않다.
본 발명은 AB에 제제를 결합시키는 몇몇 방법을 이용한다: (a) AB의 탄화수소 모이어티에 부착, 또는 (b) AB의 설프히드릴 기에 부착, 또는 (c) AB의 아미노 기에 부착, 또는 (d) AB의 카르복실레이트 기에 부착. 본 발명에 따라서, AB는 하나는 AB와 반응하고, 하나는 제제와 반응하는 2 이상의 반응성 기를 갖는 중간 링커를 통해 제제에 공유 결합될 수 있다. 임의의 상용성 유기 화합물을 포함하는 링커는 AB(또는 제제)와의 반응이 AB 반응성 및 선택성에 부정적인 영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다. 또한, 제제와 링커의 결합은 제제의 활성을 파괴하지 않는다. 산화된 항체 또는 산화된 항체 단편과 반응하기 적합한 링커는 1차 아민, 2차 아민, 히드라진, 히드라지드, 히드록실아민, 페닐히드라진, 세미카르바지드 및 티오세미카르바지드 기로 이루어진 군에서 선택된 아민을 함유하는 것을 포함한다. 이러한 반응성 작용기는 링커의 구조의 일부분으로서 존재하거나, 또는 이러한 기를 함유하지 않는 링커의 적합한 화학적 개질에 의해 도입될 수 있다.
본 발명에 따라서, 환원된 AB에 부착하기 적합한 링커는 환원된 항체 또는 단편의 설프히드릴 기와 반응할 수 있는 일정 반응성 기를 갖는 것을 포함한다. 이러한 반응성 기는 제한없이, 반응성 할로알킬 기(예를 들면, 할로아세틸 기를 포함), p-머큐리벤조에이트 기 및 미카엘 유형 부가 반응할 수 있는 기(예를 들면, 말레이미드 및 [Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110]에 기술된 유형의 기를 포함)를 포함한다.
본 발명에 따라서, 산화되지 않거나 또는 환원되지 않은 AB와 결합하기 적합한 링커는 Ab 내 미개질 리신 잔기 내 존재하는 1차 아미노 기와 반응할 수 있는 일정 작용기를 갖는 것을 포함한다. 이러한 반응성기는 제한없이, NHS 카르복실산 또는 카본산 에스테르, 설포-NHS 카르복실산 또는 카본산 에스테르, 4-니트로페닐 카르복실산 또는 카본산 에스테르, 펜타플루오로페닐 카르복실산 또는 카본산 에스테르, 아실 이미다졸, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
본 발명에 따라서, 산화되지 않거나 또는 환원되지 않은 Ab와 결합하기에 적합한 링커는 적합한 시약으로 활성화된, Ab 내 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기에 존재하는 카르복실산 기와 반응할 수 있는 일정 작용기를 갖는 것을 포함한다. 적합한 활성화 시약은 부가된 NHS 또는 설포-NHS가 있거나 또는 없는, EDC, 및 카르복사미드 형성에 이용되는 다른 탈수화제를 포함한다. 이러한 예에서, 적합한 링커에 존재하는 작용기는 1차 및 2차 아민, 히드라진, 히드록실아민, 및 히드라지드를 포함한다.
제제는 링커가 AB가 부착되기 전 또는 후에 링커에 부착될 수 있다. 일정 용도에서, 링커가 회합된 제제가 없는 AB-링커 중간체를 먼저 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 용도에 따라서, 특이적 제제를 링커에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 다른 실시양태에서 AB는 먼저 MM, CM 및 회합된 링커에 결합된 후 접합 목적용 링커에 결합된다.
분지형 링커: 특정 실시양태에서, 제제 결합을 위한 다수 부위를 갖는 분지형 링커를 이용한다. 다수 부위 링커를 위해, AB와 단일 공유 결합으로 다수 부위에서 제제를 결합할 수 있는 AB-링커 중간체가 생성될 수 있다. 부위들은 알데히드 또는 설프히드릴 기이거나 또는 제제가 부착될 수 있는 임의의 화학 부위일 수 있다.
다르게, 보다 높은 비활성(또는 AB에 대한 제제의 보다 높은 비율)은 AB 상에 복수의 부위에서 단일 부위 링커의 결합에 의해 획득될 수 있다. 이러한 복수의 부위는 2가지 방법에 의해 AB에 도입될 수 있다. 첫번째, 동일한 AB 내에 복수의 알데히드 기 및/또는 설프히드릴 기를 생성시킬 수 있다. 두번째, 링커와의 후속 결합을 위해 복수개의 작용 부위를 갖는 "분지형 링커"를 AB의 알데히드 또는 설프히드릴에 부착시킬 수 있다. 분지형 링커 또는 복수 사이트 링커의 작용성 부위는 알데히드 또는 설프히드릴 기이거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 임의의 화학 부위일 수 있다. 여전히 보다 높은 비활성은 이들 2가지 접근법을 조합하여, 즉 AB 상의 몇몇 부위에서 복수 부위 링커를 결합하여 얻을 수 있다.
절단가능한 링커: 보체계의 효소, 예컨대 제한없이, 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 트립신, 플라스민, 또는 단백질가스분해 활성을 갖는 다른 효소에 의한 절단에 민감한 펩티드 링커를 본 발명의 일 실시예에서 사용할 수 있다. 본 발명의 한 방법에 따라서, 제제는 보체에 의한 절단에 민감한 링커를 통해 부착된다. 항체는 보체를 활성화시킬 수 있는 부류에서 선택된다. 따라서, 항체-제제 접합체는 보체 캐스캐이드를 활성화시키고 표적 부위에서 제제를 방출한다. 본 발명의 다른 방법에 따라서, 제제는 단백질가수분해 활성을 갖는 효소 예컨대 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 플라스민, 또는 트립신에 의한 절단에 민감한 링커를 통해 부착된다. 이들 절단가능한 링커는 세포외 독소, 예를 들면, 제한없이, 표 30에 도시된 임의의 세포외 독소를 포함하는 접합된 활성화가능한 항체에 유용하다.
절단가능한 링커 서열의 비제한적인 예를 표 31에 제공한다.
Figure pct00003
또한, 제제는 이황화 결합(예를 들면, 시스테인 분자 상의 이황화 결합)을 통해 AB에 결합될 수 있다. 많은 종양은 높은 수준의 글루타티온(환원제)을 자연적으로 발생하므로, 이는 전달 부위에서 제제의 후속 방출로 이황화 결합을 환언시킬 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, CM을 개질하는 환원제는 또한 접합된 활성화가능한 항체의 링커를 개질시킬 수도 있다.
스페이서 및 절단가능한 성분: 또 다른 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 AB 및 제제 사이의 간격이 최적화되도록 링커를 구축하는 것이 필수적이다. 이는 하기 일반식의 링커를 이용하여 수행될 수 있다:
W-(CH2)n-Q
상기 식에서,
W는 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩티드이며;
n은 0 내지 20의 정수이다.
또 다른 실시양태에서, 링커는 스페이서 성분 및 절단가능한 성분을 포함할 수 있다. 스페이서 성분은 절단가능한 성분이 절단을 담당하는 효소에 보다 접근가능하도록 AB의 코어로부터 멀리 절단가능한 성분이 위치하게 한다. 상기 기술된 분지형 링커의 일부는 스페이서 성분으로 기능할 수 있다.
이러한 논의 전반에서, 링커와 제제의 결합(또는 절단가능한 성분에 스페이서 결합, 또는 제제에 절단가능한 성분 결합)은 특정 방식의 결합 또는 반응을 필요로하지 않음을 이해해야 한다. 적합한 안정성 및 생물학적 상용성의 산물을 제공하는 임의의 방법이 허용가능하다.
혈청 보체 및 링커의 선택: 본 발명의 한 방법에 따라서, 제제의 방출이 바람직한 경우, 보체를 활성화시킬 수 있는 부류의 항체인 AB가 사용된다. 얻어진 접합체는 항원에 결합하는 능력 및 보체 캐스캐이드를 활성화시키는 능력 둘 모두를 보유한다. 따라서, 본 발명의 이러한 실시양태에 따라서, 제제는 절단가능한 링커 또는 절단가능한 성분의 한쪽 말단에 연결되고 링커 기의 다른 말단은 AB 상의 특이적 부위에 결합된다. 예를 들면, 제제가 히드록시 기 또는 아미노 기를 갖는다면, 각각 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 펩티드, 아미노산 또는 다른 적합하게 선택된 링커의 카르복시 말단에 결합될 수 있다. 예를 들면, 이러한 제제는 카르보디미드 반응을 통해 링커 펩티드에 결합될 수 있다. 제제가 링커와의 부착을 방해하는 작용기를 함유하면, 이들 방해적인 작용기는 생산 접합체 또는 중간체가 만들어지면 결합 및 탈차단전에 차단될 수 있다. 링커의 반대 또는 아미노 말단은 이어서 직접적으로 또는 보체를 활성화할 수 있는 AB와의 결합을 위한 추가 개질 후에 사용된다.
링커(또는 링커의 스페이서 성분)는 임의의 바람직한 길이일 수 있고, 이중 한쪽 말단은 활성화가능한 항체의 AB 상의 특이적 부위와 공유적으로 부착될 수 있다. 링커 또는 스페이서 성분의 다른 말단은 아미노산 또는 펩티드 링커에 부착될 수 있다.
따라서, 이들 접합체가 보체 존재 하에서 항원에 결합할 경우, 링커에 제제를 부착시키는 아미드 또는 에스테르 결합은 절단되어서, 활성형으로 제제의 방출이 일어난다. 이러한 접합체는 피험체에 투여시, 표적 부위에 제제의 전달 및 방출을 수행하고, 제한없이 표 30에 기술된 바와 같은 약학제, 항생제, 항대사산물, 항증식제 등의 생체내 전달에 특히 효율적이다.
보체 활성화가 없이 방출을 위한 링커: 표적화된 전달의 또 다른 용도에서, 보체 활성화없이 제제의 방출은 보체 캐스캐이드의 활성화가 궁극적으로 표적 세포를 용해시키므로 바람직하다. 따라서, 이러한 접근법은 제제의 전달 및 방출이 표적 세포를 사멸하지 않고 수행되어야 할때 유용하다. 세포 매개인자 예컨대 호르몬, 효소, 코르티코스테로이드, 신경전달인자, 유전자 또는 효소를 표적 세포로 전달하는 것이 바람직할 때 이러한 것이 목표가 된다. 이들 접합체는 혈청 프로테아제에 의한 절단에 온화하게 민감한 링커를 통해 보체를 활성화시킬 수 없는 AB에 제제를 부착시켜 제조할 수 있다. 이러한 접합체를 개체에게 투여할 때, 항원-항체 복합체는 신속하게 형성되지만, 제제의 절단은 서서히 일어나서, 표적 세포로 화합물이 방출된다.
생화학적 가교 링커: 다른 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 일정 생화학 가교 링커를 이용하여 1 이상의 치료제에 접합시킬 수 있다. 가교 결합 시약은 2종의 상이한 분자의 작용기를 함께 묶는 분자 브릿지를 형성시킨다. 단계식 방식으로 2종의 상이한 단백질을 연결하기 위해서, 이종-이중작용성 가교 링커는 원치않는 동종중합체 형성을 제거하는데 사용될 수 있다.
리소좀 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 또한 유용하고, 예를 들면, Val-Cit, Val-Ala 또는 다른 이중펩티드가 있다. 또한, 리소좀의 낮은 pH 환경에서 절단가능한 산-불안정성 링커를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 비스-시알릴 에테르가 있다. 다른 적합한 링커는 카텝신-불안정성 기질, 구체적으로 산성 pH에서 최적 기능을 보여주는 것을 포함한다.
예시적인 이종-이중작용성 가교 링커를 표 32에 언급하였다.
Figure pct00004
비절단가능한 링커 또는 직접 부착: 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 접합체는 제제가 표적에 전달되지만 방출되지 않도록 디자인될 수 있다. 이는 비절단가능한 링커를 통하거나 또는 직접적으로 AB에 제제를 부착시켜 수행할 수 있다.
이들 비절단가능한 링커는 아미노산, 펩티드, D-아미노산 또는 본원에 기술된 방법에 의해 AB와 부착하는데 이후 이용될 수 있는 작용기를 포함하도록 개질시킬 수 있는 다른 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 유기 링커에 대한 일반식은 다음의 식일 수 있다:
W-(CH2)n-Q
상기 식에서,
W는 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩티드이며;
n은 0 내지 20의 정수이다.
비절단가능한 접합체: 다르게, 화합물은 보체를 활성화시키는 않는 AB에 부착될 수 있다. 보체 활성화를 할 수 없는 AB를 이용하는 경우, 이러한 부착은 활성화된 보체에 감수성인 링커를 이용하거나 또는 활성화된 보체에 의한 절단에 비감수성인 링커를 이용하여 수행할 수 있다.
본원에서 개시된 항체는 또한 면역리포솜으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당분야에 공지된 방법, 예컨대 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기술된 방법으로 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 기술되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜은 원하는 직경을 갖는 리포솜을 산출하기 위해 정해진 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 이황화-상호교환 반응을 통해 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288(1982)]에 기술된 바와 같이 리포솜에 접합될 수 있다.
활성화가능한 항-Jagged 항체
본원에 제공된 활성화가능한 항체 및 활성화가능한 항체 조성물은 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는, 적어도 항체 또는 이의 항체 단편(집합적으로 본원 전반에서 AB라고 함)을 함유하고, 여기서 AB는 차폐성 모이어티(MM)에 의해 개질된다.
AB를 MM으로 개질시키고 Jagged 1 및/또는 Jagged 2가 존재하는 경우, 그 표적에 대한 AB의 특이적 결합은 MM으로 개질되지 않은 AB의 특이적 결합 또는 표적에 대한 모 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소되거나 또는 억제된다.
표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 MM으로 개질된 AB의 Kd는 표적에 대한 모 AB 또는 MM으로 개질되지 않은 AB의 Kd 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 또는 그 이상, 또는 5-10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 크다. 반대로, 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 MM으로 개질된 AB의 결합 친화성은 표적에 대한 모 AB 또는 MM으로 개질되지 않은 AB의 결합 친화성 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 또는 그 이상, 또는 5∼10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 낮다.
AB에 대한 MM의 해리 상수(Kd)는 대체로 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 크다. AB에 대한 MM의 Kd는 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 Kd 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000배 크다. 반대로, AB에 대한 MM의 결합 친화성은 대체로 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 결합 친화성 보다 낮다. AB에 대한 MM의 결합 친화성은 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 결합 친화성 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 심지어 10,000,000배 낮다.
AB가 MM으로 개질되고 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2가 존재하는 경우, 그 표적에 대한 AB의 특이적 결합은 MM으로 개질되지 않은 AB의 특이적 결합 또는 표적에 대한 모 AB의 특이적 결합과 비교하여, 감소되거나 또는 억제된다. MM으로 개질되지 않은 AB의 결합 또는 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2와 모 AB의 결합을 비교하는 경우, MM으로 개질시 표적에 결합하는 AB의 능력은 시험관 내 또는 생체 내 어세이로 측정할시 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간 동안, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 그 이상 동안 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 만큼 감소할 수 있다.
MM은 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2와 AB의 결합을 억제한다. MM은 AB의 항원 결합 도메인에 결합하고 AB와 Jagged 1 및 Jagged 2의 결합을 억제한다. MM은 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2와 AB의 결합을 입체적으로 억제할 수 있다. MM은 AB와 그 표적의 결합을 알로스테릭하게 억제할 수 있다. 이러한 실시양태에서, AB가 MM으로 개질되거나 또는 MM과 커플링되고, 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2가 존재하는 경우, 표적에 대한 MM으로 개질되지 않은 AB의 결합, 모 AB의 결합, 또는 MM과 커플링되지 않는 AB와의 결합과 비교시, 시험관 내 또는 생체내 어세이로 측정한 경우 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간 동안, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 그 이상동안 표적과 AB의 결합이 없거나 또는 실질적으로 결합이 없거나, 또는 표적과 AB의 결합이 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50%를 넘지 않는다.
AB를 MM과 커플링하거나 또는 MM에 의해 개질시키는 경우, MM은 AB의 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합을 '차폐'하거나 또는 감소시키거나 또는 아니면 억제한다. AB를 MM과 커플링하거나 또는 MM으로 개질시키는 경우, 이러한 커플링 또는 개질은 그 표적에 특이적으로 결합하는 AB의 능력을 감소시키거나 또는 억제시키는 구조적 변화를 실시할 수 있다.
MM과 커플링되거나 또는 MM으로 개질된 AB는 다음의 식으로 나타낼 수 있다(아미노(N) 말단 영역에서 카르복시(C) 말단 영역의 순서):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
여기서 MM은 차폐성 모이어티이고, AB는 항체 또는 이의 항체 단편이고, L은 링커이다. 많은 실시양태에서, 탄력성을 제공하기 위해 1 이상의 링커, 예를 들면 탄성 링커를 조성물에 삽입시키는 것이 바람직할 수 있다.
일정 실시양태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시양태에서 MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 상동성을 함유하지 않거나 또는 실질적으로 상동성을 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서 MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 유사성이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 25%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 50%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 20%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 10%를 넘지 않는다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 MM에 의해 개질되고 1 이상의 절단가능한 모이어티(CM)를 포함하는 AB를 포함한다. 이러한 활성화가능한 항체는 AB의 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대해 활성화가능/전환가능한 결합성을 나타낸다. 일반적으로 활성화가능한 항체는 차폐성 모이어티(MM) 및 개질가능하거나 또는 절단가능한 모이어티(CM)에 의해 개질되거나 또는 그에 커플링된 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM은 목적 프로테아제에 대해 기질로서 기능하는 아미노산 서열을 함유한다.
활성화가능한 항체의 성분은 MM 및 CM이 절단된(또는 비교적 활성인) 상태 및 표적 존재하에, AB가 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 한편, 미절단(또는 비교적 불활성)인 상태에서 표적이 존재하는 경우, 그 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합이 감소 또는 억제되도록 위치하게 배열된다. 그 표적에 대한 AB의 특이적 결합은 MM에 의해 그 표적과 특이적으로 결합하는 AB의 능력이 억제 또는 차폐됨으로 인해 감소될 수 있다.
표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 MM 및 CM으로 개질된 AB의 Kd는 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 모 AB 또는 MM 및 CM으로 개질되지 않은 AB의 Kd 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 또는 그 이상, 또는 5∼10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 크다. 반대로, 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 MM 및 CM으로 개질된 AB의 결합 친화성은 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 모 AB 또는 MM 및 CM으로 개질되지 않은 AB의 결합 친화성 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 또는 그 이상, 또는 5∼10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 낮다.
AB가 MM 및 CM으로 개질되고 표적은 존재하지만, 개질제(예를 들면, 프로테아제)는 존재하지 않는 경우, 표적, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합은 표적에 대한 모 AB 또는 MM 및 CM으로 개질되지 않은 AB의 특이적 결합에 비하여 감소되거나 또는 억제된다. 그 표적에 대한 MM 및 CM으로 개질되지 않은 AB의 결합 또는 모 AB의 결합과 비교하여, MM 및 CM으로 개질시 표적과 결합하는 AB의 능력은 시험관내 또는 생체내 측정시 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 그 이상 동안 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 만큼 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 절단된 상태는 프로테아제에 의한 CM의 개질 후 활성화가능한 항체의 상태를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 미절단 상태는 프로테아제에 의한 CM의 절단이 없는 활성화가능한 항체의 상태를 의미한다. 상기 기술된 바와 같이, 용어 "활성화가능한 항체"는 본원에서 그 미절단(천연) 상태를 비롯하여 그 절단 상태인 활성화가능한 항체를 의미한다. 일부 실시양태에서 절단된 활성화가능한 항체는 프로테아제에 의한 CM의 절단으로 인해 MM이 결여되어, 적어도 MM이 방출되게 할 수 있음은 자명하다(예를 들면, MM이 공유 결합(예를 들면, 시스테인 잔기간 이황화 결합)에 의해 활성화가능한 항체에 연결되지 않은 경우).
활성화가능한 또는 전환가능한은 활성화가능한 활성화가능한 항체가 억제, 차폐 또는 미절단 상태(즉, 제1 입체구조)인 경우, 표적, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대해 제1 결합도를 나타내고, 비억제, 비차폐 및/또는 절단 상태(즉, 제2 입체구조)에서 표적 즉, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대해 제2 결합도를 나타냄을 의미하며, 여기서 제2 표적 결합도는 제1 결합도보다 크다. 일반적으로, 활성화가능한 항체의 AB에 대한 표적의 접근성은 절단제 등의 부재시 보다 CM을 절단할 수 있는 절단제 존재시에 더 크다. 따라서, 활성화가능한 항체가 미절단 상태인 경우, AB는 표적 결합이 억제되고 표적 결합이 차폐될 수 있으며(즉, 제1 입체구조는 AB가 표적에 결합할 수 없는 것임), 절단 상태에서 표적 결합에 대해 AB는 억제되지 않거나 또는 차폐되지 않는다.
활성화가능한 항체의 CM 및 AB는 AB가 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 결합 모이어티를 대표하고, CM은 피험체 내 치료 부위 또는 진단 부위에서 Jagged 1 및 Jagged 2와 함께 국재하는 프로테아제에 대한 기질을 대표하도록 선택된다. 본원에 개시된 활성화가능한 항체는 특히 예를 들면, CM 내 부위를 절단할 수 있는 프로테아제가 비치료 부위(예를 들면, 건강한 조직 내)의 조직에서 보다 치료 부위 또는 진단 부위의 표적 함유 조직에서 비교적 높은 수준으로 존재하는 경우 특정 용도를 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 AB가 Jagged 1 및 Jagged 2 결합으로부터 차폐되거나 또는 아니면 억제되지 않는 경우 비치료 부위에서 AB의 결합으로 인해 발생될 수 있는 역효과 및/또는 독성이 감소되게 제공된다.
대체로, 활성화가능한 항체는 입체구조적으로 제한되는 경우, MM이 AB의 차폐 또는 그 표적에 대한 AB의 결합 감소를 제공하도록 활성화가능한 항체의 나머지를 구축하고 목적 AB를 선택하여 디자인될 수 있다. 구조적 디자인 기준은 이러한 기능적 특징을 제공하는 것을 고려해야 한다.
미억제된 입체구조 대비 억제시 표적 결합에 대해 바람직한 동적 범위의 전환가능한 표현형을 나타내는 활성화가능한 항체가 제공된다. 동적 범위는 일반적으로 (a) 조건 제1 세트 하에서 매개변수의 최대 검출도 대 (b) 조건 제2 세트 하에서 그 매개변수의 최소 검출값의 비율을 의미한다. 예를 들면, 활성화가능한 항체에 관한 내용에서, 동적 범위는 활성화가능한 항체의 CM을 절단할 수 있는 프로테아제 존재 하에서 활성화가능한 항체에 결합하는 표적 단백질, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2의 최대 검출도 대 (b) 프로테아제 부재 하에서 활성화가능한 항체에 결합하는 표적 단백질, 즉 Jagged 1 및 Jagged 2의 최소 검출도 비율을 의미한다. 활성화가능한 항체의 동적 범위는 활성화가능한 항체들 절단제 처리의 평형 해리 상수에 대한 활성화가능한 항체 절단제(예를 들면, 효소) 처리의 평형 해리 상수의 비율로서 산출할 수 있다. 활성화가능한 항체의 동적 범위가 클수록, 활성화가능한 항체의 전환가능한 표현형이 양호하다. 동적 범위값이 비교적 높은(예를 들면, 1 보다 큼) 활성화가능한 항체들은 보다 바람직한 전환성 표현형을 나타내어서 활성화가능한 항체에 의한 표적 단백질 결합이 절단제 부재시 보다 활성화가능한 항체의 CM을 절단할 수 있는 절단제(예를 들면, 효소) 존재히에 보다 큰 정도로 일어난다(예를 들면, 주로 일어남).
활성화가능한 항체는 다양한 구조적 입체구조로 제공될 수 있다. 활성화가능한 항체의 예시적인 식을 이하에 제공한다. AB, MM 및 CM의 N 말단에서 C 말단 순서는 활성화가능한 항체에서 반전될 수 있음을 특히 고려한다. CM 및 MM은 예를 들면, CM이 MM 내에 함유되도록 아미노산 서열 내에서 중복될 수 있음을 특히 고려한다.
예를 들면, 활성화가능한 항체는 하기 식으로 표시할 수 있다(아미노(N) 말단에서 카르복실(C) 말단 영역의 순서)
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
상기 식에서, MM은 차폐성 모이어티이고, CM은 절단가능한 모이어티이며, AB는 항체 또는 이의 단편이다. MM 및 CM이 상기 식에서 개별 성분으로 표시되었지만, 본원에 개시된 예시적인 실시양태(식 포함)에서 MM 및 CM의 아미노산 서열은 CM이 완전하게 또는 부분적으로 MM 내에 함유되도록 중복될 수 있음을 이해한다. 또한, 상기 식은 활성화가능한 항체에 대해 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있는 추가 아미노산 서열을 제공한다.
일정 실시양태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시양태에서 MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 상동성을 함유하지 않거나 또는 실질적으로 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서 MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 유사성이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 50%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와의 동일성이 25%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 20%를 넘지 않는다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 10%를 넘지 않는다.
많은 실시양태에서 MM-CM 접합부, CM-AB 접합부, 또는 둘 모두 중 1 이상에서 탄력성을 제공하도록 활성화가능한 항체 구성체에 1 이상의 링커, 예를 들면 탄성 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, AB, MM, 및/또는 CM은 목적하는 탄력성이 제공되도록 충분한 수의 잔기(예를 들면, Gly, Ser, Asp, Asn, 특히 Gly 및 Ser, 특히 Gly)를 함유하지 않는다. 이와같이, 이러한 활성화가능한 항체 구성체의 전환가능한 표현형은 탄성 링커를 제공하도록 1 이상의 아미노산의 도입으로 혜택을 얻을 수 있다. 또한, 이하 기술되는 바와 같이, 활성화가능한 항체가 입체구조적으로 제한된 구성체로서 제공되는 경우, 탄성 링커는 미절단된 활성화가능한 항체 내에 환형 구조의 형성 및 유지가 용이하도록 작동적으로 삽입될 수 있다.
예를 들면, 일정 실시양태에서 활성화가능한 항체는 하기 식 중 하나를 포함한다(하기 식은 N 말단에서 C 말단 방향 또는 C 말단에서 N 말단 방향으로의 아미노산 서열을 의미함):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
상기 식에서 MM, CM, 및 AB는 상기 정의된 바와 같으며, 이때 L1 및 L2는 각각 독립적이고 선택적으로 존재하거나 또는 부재하며, 1 이상의 탄성 아미노산(예를 들면, Gly)를 포함하는 동일하거나 또는 상이한 탄성 링커이다. 또한, 상기 식은 활성화가능한 항체 성분에 대해 N 말단에서 C 말단으로 위치될 수 있는 추가 아미노산 서열을 제공한다. 예에는 제한없이, 표적화 모이어티(예를 들면, 표적 조직에 존재하는 세포의 수용체에 대한 리간드) 및 혈청 반감기 연장 모이어티(예를 들면, 혈청 단백질, 예컨대 면역글로불린(예를 들면, IgG) 또는 혈청 알부민(예를 들면, 인한 혈청 알부민(HAS))에 결합하는 폴리펩티드)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 절단가능한 모이어티(CM)는 프로테아제, 일반적으로 세포외 프로테아제에 대한 기질로 작용할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. CM은 활성화가능한 항체의 AB의 목적 표적과 조직에 함께 국재하는 프로테아제를 기초로 선택될 수 있다. 프로테아제의 기질이 당분야에서 공지인, 프로테아제와 목적 표적이 함께 존재하는 다양한 상이한 조건이 알려져 있다. 암의 예에서, 표적 조직은 암성 조직, 특히 고형 종양의 암성 조직일 수 있다. 수많은 암, 예를 들면 고형 종양에서 기지의 기질을 갖는 높은 수준의 프로테아제에 대한 보고가 존재한다. 예를 들면, [La Rocca et al,(2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421]를 참조한다. 질환의 비제한적인 예에는 모든 유형의 암(유방암, 폐암, 직결장암, 전립선암, 흑색종, 두경부암, 췌장암 등), 류마티스성 관절염, 크론병, SLE, 심혈관 질환, 허혈 등이 포함된다. 예를 들면, 증상은 T-세포 급성 림프성 백혈병(T-ALL)을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종을 포함하는 림프성 질환, 및 폐암, 직결장암, 전립선암 및 삼중 음성 유방암을 포함하는 유방암을 포함한, 고형 종양을 포함한다. 예를 들면, 증상은 원발성 기원 무관한, 암의 전이 또는 골질환; 제한없이 ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중-음성 유방암을 포함한 유방암; 직결장암; 위암; 교아세포종; 두경부암; 제한없이, 비소세포 폐암 등과 같은 폐암; 다발성 골수종 난소암; 췌장암; 전립선암; 육종; 비제한적인 예로, 신장세포 암종등과 같은 신장암; 및/또는 비제한적인 예로, 편평 세포암, 기저세포 암종, 흑색종 등과 같은 피부암을 포함한다. 암 이외에도, Jagged-의존적 notch 신호전달은 섬유성 질환의 진행에서 중심적인 역할을 하는 세포인, 근섬유아세포로 상피 및 섬유아세포의 분화에 결정적이다. Jagged 의존적 notch 신호전달의 억제, 및 그에 따라 근섬유아세포의 출현 억제는 신장, 간, 폐, 및 피부의 섬유성 질환에 대한 효과적인 치료일 수 있다. 예를 들면, 증상은 섬유성 질환, 예컨대 특발성 폐섬유증(IPF); 신장 섬유성 질환, 간 섬유성 질환, 복막 투석-유도성 섬유증, 및/또는 강피증을 포함한다. 다른 적합한 증상은 예를 들면 병소, 예컨대 청력 상실을 포함한다.
CM은 약 0.001-1500 x 104 M-1S-1 또는 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, 또는 1500 x 104 M-1S-1의 속도로 효소에 의해 특이적으로 절단된다.
효소에 의한 특이적 절단을 위해서, 효소와 CM 간에 접촉이 일어난다. MM 및 CM에 커플링된 AB를 포함하는 활성화가능한 항체가 표적 및 충분한 효소 활성 존재하에 있을 경우, CM이 절단될 수 있다. 충분한 효소 활성은 CM과 접촉하여 절단을 실시하는 효소의 능력을 의미한다. 효소가 CM과 인접하여 존재하지만 다른 세포 인자 또는 효소의 단백질 개질때문에 절단될 수 없는 것도 쉽게 예상할 수 있다.
예시적인 기질은 제한없이 하기 표 33의 효소 또는 프로테아제 중 1 이상에 의해 절단가능한 기질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Figure pct00005
예를 들면, 일부 실시양태에서, 기질은 하기 효소 또는 프로테아제 중 1 이상에 의해 절단가능하다: uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및/또는 MMP-14. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1의 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나아제이다.
본원엔 기술한 조성물에 사용하기 적합한 링커는 대체로 표적과 AB의 결합 억제를 가능하게 하도록 개질된 AB 또는 활성화가능한 항체의 탄력성을 제공하는 것이다. 이러한 링커는 대체로 탄성 링커라고 한다. 적절한 링커는 용이하게 선택할 수 있고, 임의의 적합한 상이한 길이, 예컨대 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 7개 아미노산 내지 8개 아미노산을 포함하여, 1개 아미노산(예를 들면, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산일 수 있고, 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산일 수 있다.
예시적인 탄성 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들면,(GS)n,(GSGGS)n(서열번호 123) 및 (GGGS)n(서열번호 124)를 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 정수임), 글리신-알라닌중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 다른 당분야에 공지된 탄성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 비교적 비구조적이고 따라서, 성분간의 중성 테더로서 기능할 수 있다. 글리신은 알라닌 보다도 더욱 phi-psi 공간에 유의하게 접근하며, 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기 보다 훨씬 덜 제한적이다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142(1992)). 예시적인 탄성 링커는 제한없이, Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 125), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 129), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호 130) 등을 포함한다. 당분야의 통상적인 숙련가는 활성화가능한 항체의 디자인이, 링커가 탄성 링커를 포함할 수 있을 뿐만 아니라 목적하는 활성화가능한 항체 구조를 제공하기 위해 덜 탄성인 구조를 부여하는 1 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 전체적으로 또는 부분적으로 탄성인 링커를 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 기술된 성분 이외에도, 활성화가능한 항체는 부가적인 성분 예컨대 활성화가능한 항체의 아미노산 서열 N-말단 또는 C-말단을 함유할 수 있다. 예를 들면, 활성화가능한 항체는 목적하는 세포 또는 조직으로의 전달이 용이하도록 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 활성화가능한 항체는 제제, 예컨대 치료제, 항종양제, 독소 또는 이의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제에 접합될 수 있다. 제제의 예는 본원에 개시되어 있다.
활성화가능한 항체는 또한 비제한적인 예로, 표 30에 열거된 임의의 제제 및/또는 표 31 및/또는 표 32에 열거된 임의의 링커를 포함하여, 본 발명의 항-Jagged 항체와 함께 본원에 기술된 임의의 접합된 제제, 링커 및 다른 성분들을 포함할 수 있다.
비결합 입체 모이어티 또는 비결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너를 갖는 활성화가능한 항-Jagged 항체
본 발명은 또한 비결합 입체 모이어티(NB) 또는 비결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너(BP)를 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 제공하며, 여기서 BP는 활성화가능한 항-Jagged 항체에 NB를 동원하거나 또는 아니면 끌어들인다. 본원에서 제공하는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 예를 들면, 비결합 입체 모이어티(NB), 절단가능한 링커(CL) 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체; 비결합 입체 모이어티(BP)에 대한 결합 파트너, CL 및 AB를 포함하는 활성화가능한 항체; 및 NB가 동원된 BP, CL 및 Jagged 1과 Jagged 2에 결합하는 AB를 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 포함한다. NB가 활성화가능한 항-Jagged 항체의 AB 및 CL에 공유적으로 연결되거나 또는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 AB 및 CL에 공유적으로 연결된 BP와 상호작용에 의해 회합된 활성화가능한 항체는 본원에서 "NB-함유 활성화가능한 항-Jagged 항체"라고 한다. 활성화가능한 또는 전환가능한이란 활성화가능한 항체가 억제, 차폐 또는 미절단된 상태인 경우(즉, 제1 입체구조), 활성화가능한 항체는 표적, 즉 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와의 제1 결합도를 나타내며, 활성화가능한 항체가 미억제, 미차폐 및/또는 절단된 상태인 경우(즉, 제2 입체구조) 표적과의 제2 결합도를 나타내는 것을 의미하고, 여기서 제2 표적 결합도는 제1 표적 결합도보다 크다. 활성화가능한 항체 조성물은 높은 생체이용률을 나타낼 수 있고 통상의 항체 치료제와 비교하여 보다 호의적인 생체분포도를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 항-Jagged AB가 차폐되지 않았거나 또는 아니면 그러한 부위와의 결합이 억제되면 비치료 부위 및/또는 비진단 부위에서 항-Jagged AB의 결합으로 인해 발생할 수 있는 낮은 독성 및/또는 유해한 부작용을 제공한다.
일 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커(CL); 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하고, 여기서 NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드이고, CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이며, CL은 미절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와의 결합을 방해하고 절단 상태에서는 NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하지 않도록 위치되며, NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 본원 전반에서, 용어 폴리펩티드는 거대 폴리펩티드, 전장 단백질 및 이의 단편을 포함하여, 2 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미하며, 용어 폴리펩티드는 단쇄 폴리펩티드에 제한적이지 않고, 복수 유닛, 예를 들면, 복수 사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 길이가 짧은 경우, 예를 들면, 총 50개 아미노산 미만인 경우, 용어 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에서 상호교환적으로 사용되면, 폴리펩티드가 보다 긴 경우, 예를 들면, 50개 아미노산 또는 그 이상인 경우, 용어 폴리펩티드 및 단백질은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커(CL); 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하고, 여기서 (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 길이가 최대 50개 아미노산인 폴리펩티드이며; (iii) CL은 미절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 억제하고, 절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하지 않도록 위치되며; (iv) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 예를 들면, CL은 최대 15개 아미노산 길이, 최대 20개 아미노산 길이, 최대 25개 아미노산 길이, 최대 30개 아미노산 길이, 최대 35개 아미노산 길이, 최대 40개 아미노산 길이, 최대 45개 아미노산 길이, 최대 50개 아미노산 길이, 10-50개 범위의 아미노산 길이, 15-50개 범위의 아미노산 길이, 20-50개 범위의 아미노산 길이, 25-50개 범위의 아미노산 길이, 30-50개 범위의 아미노산 길이, 35-50개 범위의 아미노산 길이, 40-50개 범위의 아미노산 길이, 45-50개 범위의 아미노산 길이, 10-40개 범위의 아미노산 길이, 15-40개 범위의 아미노산 길이, 20-40개 범위의 아미노산 길이, 25-40개 범위의 아미노산 길이, 30-40개 범위의 아미노산 길이, 35-40개 범위의 아미노산 길이, 10-30개 범위의 아미노산 길이, 15-30개 범위의 아미노산 길이, 20-30개 범위의 아미노산 길이, 25-30개 범위의 아미노산 길이, 10-20개 범위의 아미노산 길이, 또는 10-15개 범위의 아미노산 길이를 갖는다.
일 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커(CL); 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하고, 여기서 (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (iii) CL은 미절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하고 절단 상태에서, NB는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 결합을 방해하지 않도록 위치되며; (v) 활성화가능한 항체는 미절단 상태에서 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB-CL-AB 또는 AB-CL-NB.
일 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커(CL); 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하고, 여기서 (i) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 효소에 대한 기질(S)를 포함하는 폴리펩티드이며; (iii) CL은 미절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하고, 절단 상태에서 NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하지 않도록 위치되며, 이때 미절단된 활성화가능한 항체 중 NB는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2가 AB에 결합하는 능력을 절단된 AB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 결합하는 능력과 비교하여 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 100% 만큼 감소시키며; (iv) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합하는 AB의 능력 감소는 예를 들면 본원에 기술된 어세이 또는 시험관내 표적 치환 어세이 예컨대 PCT 공개 특허 출원 WO　2009/025846 및 WO　2010/081173에 기술된 어세이를 이용해 측정된다.
일 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); 절단가능한 링커(CL); 및 Jagged 1 및 Jagged 1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함하며, 여기서 BP는 노출시 NB에 결합하는 폴리펩티드이고; NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않으며; CL은 효소에 대한 기질(S)를 포함하는 폴리펩티드이고; CL은 NB 존재 하에 미절단 상태에서, NB가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 AB의 결합을 방해하고 미절단 상태에서 NB가 Jagged 1 및/또는 Jaggged 2와 AB의 결합을 방해하지 않도록 위치되며; NB 및 BP는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 이러한 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체의 BP는 경우에 따라 NB에 결합된다. 일 실시양태에서, NB는 생체 내에서 활성화가능한 항체의 BP에 의해 동원된다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 조성물로 제형화된다. 이들 실시양태의 일부에서, 조성물은 또한 NB를 포함하며, 여기서 NB는 BP, CL 및 AB를 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체와 함께 제형화된다. 이러한 실시양태의 일부 예에서, BP는 알부민 결합 펩티드, 피브리노겐 결합 펩티드, 피브로넥틴 결합 펩티드, 헤모글로빈 결합 펩티드, 트랜스페린 결합 펩티드, 면역글로불린 도메인 결합 펩티드, 및 다른 혈청 단백질 결합 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, NB는 가용성의, 구형 단백질이다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, NB는 혈류를 순환하는 단백질이다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, NB는 알부민, 피브리노겐, 피브로넥틴, 헤모글로빈, 트랜스페린, 면역글로불린 도메인, 및 다른 혈청 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, CL은 프로테아제에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 프로테아제는 조직 내에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 공동 국재하고, 프로테아제는 활성화가능한 항체가 프로테아제에 노출될 때 활성화가능한 항-Jagged 항체 중 CL을 절단한다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, CL은 길이가 최대 50개 아미노산인 폴리펩티드이다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, CL은 길이가 최대 15개 아미노산, 예를 들면, 3개 아미노산 길이, 4개 아미노산 길이, 5개 아미노산 길이, 6개 아미노산 길이, 7개 아미노산 길이, 8개 아미노산 길이, 9개 아미노산 길이, 10개 아미노산 길이, 11 아미노산 길이, 12개 아미노산 길이, 13개 아미노산 길이, 14개 아미노산 길이, 또는 15개 아미노산 길이인 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 미절단 상태에서 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB-CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB 또는 AB-CL-BP. 활성화가능한 항-Jagged 항체가 BP를 포함하고 활성화가능한 항체가 상응하는 NB 존재 하에 있는 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 미절단 상태에서 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 갖는다: NB:BP-CM-AB 또는 AB-CM-BP:NB, 여기서 ":"는 상호작용, 예를 들면 NB 및 BP 간 결합을 의미한다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 사슬, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scab, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체이다. 일부 실시양태에서, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편은 마우스, 키메라, 인간화 또는 완전한 인간 단일클론 항체이다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 표 2에 도시된 조합에서 선택되는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 표 2에 열거된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 4D11 항체, 4B2 항체, 4E7 항체, 4E11 항체, the 6B7 항체, 및 6F8 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 항체의 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하며, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)를 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하는 항체를 포함하고, 여기서 1 이상의 CDR 서열은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 VL CDR3 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-Jagged 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열을 함유하는 항체를 포함한다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 표 4에 열거된 조합에서 선택되는 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체는 표 4에 열거된 조합과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 동일한 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 포함한다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 또한 AB에 접합된 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 항종양제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 독소 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 제제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 제제는 표 30에 열거된 군에서 선택되는 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 칼리케아미신 또는 이의 유도체이다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 또한 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 진단제이다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 또한 스페이서를 포함한다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 또한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 스페이서를 통해 활성화가능한 항체에 접합된다. 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 스페이서는 활성화가능한 항체의 MM에 직접적으로 연결된다.
임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 5일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 4일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 3일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 2일이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 24시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 20시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 18시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 16시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 14시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 12시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 10시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 8시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 6시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 4시간이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에 투여시 적어도 3시간이다.
본 발명은 또한 임의의 이들 활성화가능한 항-Jagged 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 비롯하여, 이들 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 활성화가능한 항체의 발현이 유도되는 조건 하에서 세포를 배양하여 활성화가능한 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 세포는 이러한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 이러한 벡터를 포함한다.
표적에 대한 NB-함유 활성화가능한 항체의 해리 상수(Kd)는 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우 표적에 대한 AB의 Kd 보다 크다. 표적에 대한 NB-함유 활성화가능한 항체의 해리 상수(Kd)는 표적에 대한 모 AB의 Kd 보다 크다. 예를 들면, 표적에 대한 NB-함유 활성화가능한 항체의 Kd는 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않을 경우 표적에 대한 AB의 Kd 또는 표적에 대한 모 AB의 Kd 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 또는 그 이상, 또는 5∼10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 크다. 반대로, 표적에 대한 NB-함유 활성화가능한 항체의 결합 친화성은 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 결합 친화성보다 낮거나 또는 표적에 대한 모 AB의 결합 친화성 보다 낮다. 예를 들면, 표적에 대한 NB-함유 활성화가능한 항체의 결합 친화성은 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 결합 친화성 또는 표적에 대한 모 AB의 결합 친화성 보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 또는 그 이상, 또는 5∼10, 10∼100, 10∼1,000, 10∼10,000, 10∼100,000, 10∼1,000,000, 10∼10,000,000, 100∼1,000, 100∼10,000, 100∼100,000, 100∼1,000,000, 100∼10,000,000, 1,000∼10,000, 1,000∼100,000, 1,000∼1,000,000, 1000∼10,000,000, 10,000∼100,000, 10,000∼1,000,000, 10,000∼10,000,000, 100,000∼1,000,000, 또는 100,000∼10,000,000배 낮다.
NB-함유 활성화가능한 항체가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 존재 하에 있을 경우, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합은 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 AB의 특이적 결합과 비교하여, 감소되거나 또는 억제된다. NB-함유 활성화가능한 항체가 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 존재하에 있을 경우, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합은 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 모 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소되거나 또는 억제된다. NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 AB의 결합 또는 Jagged 1 또는 Jagged 2에 대한 모 AB의 결합과 비교시, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합하는 NB-함유 활성화가능한 항체의 능력은 시험관 내 및/또는 생체내에서 측정하는 경우 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 그 이상 동안 예를 들면, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% 만큼 감소한다.
NB-함유 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2는 존재하지만 개질제(예를 들면, 프로테아제 또는 다른 효소)는 존재하는 않을 경우, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합은 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소되거나 또는 억제된다. NB-함유 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2는 존재하지만 개질제(예를 들면, 프로테아제, 다른 효소, 환원제, 또는 빛)는 존재하지 않을 경우, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합은 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 모 AB의 특이적 결합과 비교하여 감소되거나 또는 억제된다. NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 AB의 결합 또는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 모 AB의 결합과 비교하여, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합하는 NB-함유 활성화가능한 항체의 능력은 시험관 내 및/또는 생체 내에서 측정시 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일 동안, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 또는 그 이상 동안 예를 들면, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 만큼 감소된다.
임의의 이들 활성화가능한 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 활성화가능한 항체 접합체를 생산하도록 AB에 접합되는 제제를 포함한다. 활성화가능한 항체 접합체의 일부 실시양태에서, 제제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 진단제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 검출가능한 마커이다. 활성화가능한 항체 접합체의 일부 실시양태에서, 제제는 항종양제이다. 활성화가능한 항체 접합체의 일부 실시양태에서, 제제는 독소 또는 이의 단편이다. 활성화가능한 항체 접합체의 일부 실시양탠에서, 제제는 링커를 통해 AB에 접합된다. 활성화가능한 항체 접합체의 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 제제는 표 30에 열거된 군에서 선택되는 제제이다. 일부 실시양태에서, 제제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 제제는 마이탄시노이드 또는 마이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 제제는 듀오카르마이신 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 제제는 칼리케아미신 또는 이의 유도체이다.
임의의 이들 활성화가능한 항체의 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체는 이중-표적 결합 활성화가능한 항체이다. 이러한 이중 표적 결합 활성화가능한 항체는 동일하거나 또는 상이한 표적에 결합할 수 있는 2종 Ab를 함유한다. 특정 실시양태에서, 이중-표적화 활성화가능한 항체는 이중특이적 항체 또는 항체 단편을 함유한다.
이중 표적 결합 활성화가능한 항체는 활성화가능한 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적 중 하나 또는 둘 모두와 표적 조직 내에 공동 국재하는 절단제에 의해 CL을 절단할 수 있도록 디자인된다. 동일하거나 또는 상이한 표적에 대해 1 이상의 AB를 갖는 이중 표적 결합 활성화가능한 항체는 CL을 1 보다 많이 갖도록 디자인될 수 있고, 제1 CL은 제1 표적 조직에서 절단제에 의해 절단가능하고 제2 CL은 제2 표적 조직에서 절단제에 의해 절단가능하며, 1 이상의 표적이 활성화가능한 항체의 AB에 결합된다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 표적 조직은 공간적으로 분리되어 있으며, 예를 들면, 유기체에서 다른 부위에 존재한다. 일 실시양태에서, 제1 및 제2 표적 조직은 일시적으로 불리된 동일 조직, 예를 들면 상이한 2 시점에서 동일 조직, 예를 들면 제1 시점은 조직이 초기 종양일때이고, 제2 시점은 후기 종양이다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본원에 기술된 활성화가능한 항체는 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 세포를 배양하여 생산되며, 여기서 세포는 이들 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 활성화가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성체를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항체는 (i) 비결합 입체 모이어티(NB); (ii) 절단가능한 링커(CL); 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하며, 이때 (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (3) CL은 미절단 상태에서, NB가 표적과 AB의 결합을 방해하고, 절단 상태에서 NB가 표적과 AB의 결합을 방해하지 않도록 위치되며, (4) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는 것인 단계; 및 (b) 활성화가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 방법은 (a) 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성체를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항체는 (i) 비결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); (ii) 절단가능한 링커(CL); 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하고, 이때 (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이며; (3) CL은 미절단 상태에서 NB의 존저하에, NB가 표적과 AB의 결합을 방해하고 미절단 상태에서, NB가 AB와 표적의 결합을 방해하지 않으며, BP는 AB와 표적의 결합을 방해하지 않도록 위치되며; (4) NB 및 BP는 효소에 의한 CL의 절단을 방해하지 않는 것인 단계; 및 (b) 활성화가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 일부 예에서, 활성화가능한 항체의 BP는 NB에 결합된다.
항-Jagged 항체 및 활성화가능한 항-Jagged 항체의 용도
본 발명에 따른 치료제의 투여는 적절한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 내성 등을 제공하기 위한 제형에 도입되는 다른 제제와 투여됨을 이해하게 될 것이다. 복수의 적절한 제형은 모든 약사에게 알려진 처방서인 [Remington's Pharmaceutical Sciences(15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA(1975))]에서 확인할 수 있고, 특히 Blaug, Seymour의 87장에서 확인할 수 있다. 이들 제형은 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예컨대, Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 수착 페이스트, 수중유 미치 유중수 에멀션, 에멀션 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형겔, 카르보왁스를 함유하는 반고형 혼합물을 포함한다. 임의의 전술한 혼합물은 본 발명에 따른 치료 및 요법에서 적절하며, 단 제형 중 활성 성분은 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형은 투여 경로와 생리적으로 상용성이고 내성인 것을 조건으로 한다. 예를 들면, 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8(2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60(2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78(2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)] 및 약사에게 공지된 제형, 부형제 및 담체와 관련된 추가 정보에 대한 문헌내 인용부를 참조한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 단일클론 항체(예를 들면, 완전한 인간 단일클론 항체) 및/또는 활성화가능한 항체를 포함하는 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 제제는 대체로 피험체에서 Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 신호전달과 연관된 질환 또는 병변을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 완화, 및/또는 예방하는데 적용될 수 있다. 치료 양생은 표준 방법을 이용해, 백혈병 및 고형 종양, 또는 섬유성 질환을 포함하는, 암 등과 같은 질환을 앓고 있는(또는 진행 위험에 있는) 피험체, 예를 들면, 인간 환자 또는 다른 포유동물을 확인하여 수행된다. 항체 및/또는 활성화가능한 항체 조제물, 예를 들면 일부 실시양태에서 그 표적 항원에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 것을 피험체에 투여하여 대체로 표적과 그 결합에 의한 효과를 나타내게 된다. 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 투여는 표적(예를 들면, Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 매개 신호전달)의 신호전달 기능을 폐기 또는 억제 또는 방해하게 된다. 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 투여는 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)과 그것이 천연적으로 결합하는 내생성 리간드(예를 들면, Notch 수용체)의 결합을 폐기 또는 억제 또는 방해할 수 있다. 예를 들면, 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 표적에 결합하여, Notch 수용체를 통한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 매개 신호전달을 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화, 또는 아니면 방해한다.
대체로, 질환 또는 질병의 완화 또는 치료는 질환 또는 질병과 관련된 1 이상의 증상 또는 의학적 문제를 줄이는 것을 포함한다. 예를 들면, 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 다음 중 하나 또는 다음의 조합을 실행할 수 있다: 암세포수 감소; 종양 크기 감소; 주변 기관을 암세포 침윤 억제(즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지); 종양 전이 억제; 어느 정도로 종양 성장 억제; 및/또는 암과 연관된 1 이상의 증상을 어느 정도 경감. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 피험체, 예를 들면, 인간 또는 다른 포유동물, 예컨대 인간이외의 영장류, 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개, 말), 가축, 노동 동물, 또는 동물원 동물에서 질환 또는 질병의 발병 또는 재발을 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 치료 유효량은 대체로 치료적 목적을 달성하는데 필요한 양과 관련된다. 상기 언급한 바와 같이, 이는 일부 경우에서 표적의 기능을 방해하는, 항체 및/또는 활성화가능한 항체 및 그 표적 항원간 결합 상호작용일 수 있다. 투여에 필요한 양은 그 특이적 항원에 대한 항체 및/또는 활성화가능한 항체의 결합 친화성에 더욱 의존적이며 또한 투여된 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 자유 부피로부터 투여되는 다른 피험체로 격감되는 속도에 따라 좌우된다. 본 발명의 항체 및/또는 항체 단편 및/또는 활성화가능한 항체의 치료 유효적 투약을 위한 일반적인 범위는 제한없이, 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중이다. 보통의 투약 빈도는 예를 들면 1일 2회 내지 1주 1회 범위일 수 있다.
치료 효율은 특정 염증성 관련 질병을 진단 또는 치료하는 임의의 공지 방법과 관련하여 결정한다. 암 또는 섬유성 질환의 1 이상의 증상의 완화는 항체 및/또는 활성화가능한 항체가 임상적 이익을 부여함을 의미한다. 목적하는 특이성을 보유한 항체 및/또는 활성화가능한 항체를 스크리닝하는 방법은 제한없이, 효소 연결 면역흡착 어세이(ELISA) 및 당분야에 공지된 다른 면역학적 매개 기술을 포함한다.
다른 실시양태에서, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대해 유도된 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 국재화 및/또는 정량화와 관련된 분야에서 공지된 방법에서 사용된다(예를 들면, 적절한 생리적 샘플 내 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 농도 측정을 위한 용도, 진단 방법에서의 용도, 단백질 영상화의 용도 등). 소정 실시양태에서, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적인 항체 및/또는 활성화가능한 항체, 또는 항체에서 유도된 항원 결합 도메인을 함유하는, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체는 약리학적 활성 화합물(이하에서는 "치료제"라고 함)로서 사용된다.
다른 실시양태에서, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적인 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 표준 기술, 예컨대 면역친화법, 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대해 유도된 항체 및/또는 활성화가능한 항체(또는 이의 단편)는 예를 들면 소정의 치료 양생법의 효능을 결정하기 위해, 임상 검사 절차의 일부로서 조직 내에서 단백질 농도를 진단적으로 모니터링하는데 사용된다. 항체에 검출가능한 물질을 커플링(즉, 물리적으로 연결)하여 검출을 가능하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결기, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 및 방사능 물질이 포함된다. 적절한 효소의 예에는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스터라아제가 포함되며; 적절한 보결기 착체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되며; 적합한 형광성 물질의 예에는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되며; 발광성 물질의 예에는 루미놀이 포함되고, 생물발광성 물질의 예에는 루시퍼라아제, 루시페린, 및 아쿠아린이 포함되고, 적합한 방사능 물질의 예에는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 샘플 내 Jagged 1 및/또는 Jagged 2(또는 이의 단편)의 존재를 검출하기 위한 제제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 다클론이거나, 일부 실시양태에서, 단일클론이다. 온전한 항체, 또는 이의 단편(예를 들면, Fab, scFv, 또는 F(ab)2)이 사용된다. 프로브 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은 항체 또는 프로브에 검출가능한 물질을 커플링(즉, 물리적으로 연결)하여 프로브 또는 항체를 직접 표지화하는 것과, 직접적으로 표지되는 다른 시약과의 반응성을 통해 프로브 또는 항체를 간접 표지화하는 것을 포함하고자 한다. 간접 표지화의 예에는 형광 표지된 스트렙티바딘을 사용해 검출할 수 있도록 비오틴으로 항체를 말단 표지하는 것과 형광 표지된 2차 항체를 이용해 1차 항체를 검출하는 것이 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"은 피험체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체를 비롯하여 피험체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하고자 한다. 따라서 "생물학적 샘플"이라는 용어의 용법에는 혈액 및 혈청, 혈장, 또는 림프를 포함하는 혈액의 성분 또는 분획이 포함된다. 다시 말해, 본 발명의 검출 방법은 생체내 및 시험관내 생물학적 샘플에서 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 분석 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연결 면역흡착 어세이(ELISA), 웨스턴 블랏법, 면역침강법, 및 면역형광법을 포함한다. 면역어세이를 수행하는 과정은 예를 들면, 문헌 ["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther(Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]을 참조한다. 또한, 분석 단백질의 검출을 위한 생체 내 기술은 피험체에 표지된 항-분석 단백질 항체를 도입하는 것이 포함된다. 예를 들면, 항체는 피험체 내에서 그 존재 및 위치를 표준 영상법을 통해 검출할 수 있는 방사능 마커로 표지될 수 있다.
본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 또한 다양한 진단 및 예방 제형에서 사용된다. 일 실시양태에서, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 상기 언급한 암 또는 섬유성 질병 중 1 이상이 진행될 위험이 있는 환자에게 투여된다. 상기 언급한 질병에 대한 환자 또는 기관의 소인은 유전형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 이용해 결정할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 1 이상의 상기 언급한 질병과 관련된 임상 증상으로 진단된 인간 개체에게 투여된다. 진단 시, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 임상 증상의 효과를 줄이거나 또는 반전시키기 위해 투여된다.
본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 또한 환자 샘플 중에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 검출하는데 유용하고 따라서 진단제로서 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 환자 샘플에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 농도를 검출하기 위한 시험관내 어세이, 예를 들면, ELISA에서 이용된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 고형 지지체(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트의 웰(들)) 상에 고정된다. 고정된 항체 및/또는 활성화가능한 항체는 검사 샘플에 존재할 수 있는 임의의 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 포획 항체로서 기능한다. 고정된 항체와 환자 샘플을 접촉시키기 전에, 고형 지지체를 세정하고 차단제 예컨대 우유 단백질 또는 알부민을 처리하여 분석물의 비특이적 흡착을 방지한다.
후속하여 웰은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 검사 샘플로 처리하거나, 또는 항원의 표준량을 함유하는 용액으로 처리한다. 이러한 샘플은 예를 들면, 병소의 진단에 고려되는 순환 항원 농도를 가질 것으로 의심되는 환자 유래의 혈청 샘플이다. 검사 샘플 또는 표준물을 세척한 후, 고형 지지체를 검출가능하게 표지된 2차 항체로 처리한다. 표지된 2차 항체는 검출 항체로 기능한다. 검출가능한 표지의 농도를 측정하고, 검사 샘플 중 Jagged 항원의 농도는 표준 샘플로부터 얻어진 표준 곡선과 비교하여 결정한다.
시험관내 진단 어세이에서 본 발명의 항-Jagged 항체를 사용해 얻은 결과를 기초로, Jagged 항원의 발현도를 기반으로 피험체에서의 질환 병기를 확인하는 것이 가능함을 이해한다. 소정 질환의 경우, 혈액 샘플은 질환의 치료적 처치시 다양한 시점, 및/또는 질환의 진행시 다양한 병기에서 그러한 것으로 진단된 피험체로부터 채취한다. 각 진행기 또는 요법에 대해 통계적으로 유의한 결과를 제공하는 샘플 개체군을 이용하면, 각 병기의 특징으로 간주되는 항체의 농도 범위를 지정한다.
항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 또한 진단 및/또는 영상화 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 생체 내 방법이다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 동소발생 방법이다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 생체 외 방법이다. 예를 들면, 효소적으로 절단가능한 CM을 갖는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM을 절단할 수 있는 효소의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체는 소정 숙주 유기체의 조직 또는 소정 세포 내에서 활성화된 항-Jagged 항체(즉, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단으로 얻은 항체)의 측정된 축적을 통해 효소 활성(또는, 일부 실시양태에서 이황화 결합의 감소를 제공할 수 있게 하는 높은 환원 가능성의 환경)의 생체내 검출(예를 들면, 정성 또는 정량)을 포함할 수 있는 진단에서 사용될 수 있다. 활성화된 항-Jagged 항체의 이러한 축적은 조직이 효소 활성(또는 CM의 성질에 따라 죄우되는 높은 환원 가능성)을 발현할 뿐만 아니라 또한 조직이 활성화된 항체가 결합하는 표적을 발현함을 의미한다.
예를 들면, CM은 생물학적 제한 부위(예컨대 종기, 기관 등)에서 바이러스 또는 박테리아 감염 부위에서, 종양 부위에서 발견되는 프로테아제에 대한 프로테아제 기질로 선택될 수 있다. AB는 표적 항원에 결합하는 것일 수 있다. 당분야의 숙련가에게 친숙한 방법을 이용하여, 검출가능한 표지(예를 들면, 형광성 표지 또는 방사능 표지 또는 방사능 트레이서)는 AB 또는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 다른 영역에 접합될 수 있다. 적절한 검출가능한 표지는 상기 스크리닝 방법에서 기술하였고 추가의 특정 예는 이하에 제공한다. 그 활성이 대상 질환 조직에서 상승한 프로테아제와 함께, 질환 상태의 단백질 또는 펩티드에 특이적인 AB를 이용하면, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM 특이적 효소가 검출가능한 수준으로 존재하지 않거나 또는 질환 조직에서 보다 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성(예를 들면, 자이모겐 형태 또는 억제제와의 복합체로 존재하는 경우)인 조직에 비하여 질환 조직에 대한 결합 비율이 높게 나나탄다. 소형 단백질 및 펩티드는 신장 여과 시스템에 의해 혈액으로부터 신속하게 제거되고, CM에 대해 특이적인 효소가 검출가능한 수준으로 존재하지 않기 때문에(또는 비질환 조직에서는 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성 입체구조로 존재하기 때문에), 질환 조직에서 활성화된 항-Jagged 항체의 축적은 비질환 조직에 비해 강화된다.
다른 예에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 샘플 내에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 활성화가능한 항-Jagged 항체가 효소에 의한 절단에 감수성인 CM을 함유하는 경우, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 샘플 내 효소의 존재를 검출(정량적으로 또는 정성적으로)하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체가 환원제에 의한 절단에 감수성인 CM을 함유하는 경우, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 샘플 내 환원 상태의 존재를 검출(정량적으로 또는 정성적으로)하는데 사용될 수 있다. 이들 방법에서의 분석을 가능케하기 위해서, 활성화가능한 항체는 검출가능하게 표지될 수 있고, 지지체(예를 들면, 고형 지지체, 예커대 슬라이드 또는 비드)에 결합될 수 있다. 검출가능한 표지는 절단 후 방출되지 않는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치할 수 있으며, 예를 들면, 검출가능한 표지는 켄칭된 형광성 표지이거나 또는 절단이 일어나기 전까지 검출가능하지 않은 다른 표지일 수 있다. 어세이는 예를 들면, 고정화된, 검출가능하게 표지된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 효소 및/또는 환원제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시키고나서, 과량의 샘플 및 오염물이 제거되도록 세정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 샘플 내 절단제(예를 들면, 효소 또는 환원제)의 존재 또는 부재는 샘플과 접촉전 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 신호의 변화, 예를 들면 샘플 내 절단제에 의한 활성화가능한 항체의 절단에 의한 검출가능 신호의 증가 및/또는 그러한 신호의 존재에 의해 평가된다.
이러한 검출 방법은 절단되는 경우 활성화가능한 항-Jagged 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적의 존재 또는 부재의 검출을 제공하는데 적용될 수 있다. 따라서, 어세이는 절단제의 존재 또는 부재 및 목적 표적의 존재 또는 부재를 평가하는데 적용될 수 있다. 절단제의 존재 또는 부재는 상기 기술된 바와 같이 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능 표지의 증가 및/또는 존재에 의해 검출될 수 있고, 표적의 존재 또는 부재는 예를 들면 검출가능하게 표지된 항-표적 항체를 사용하여, 표적-AB 복합체의 검출을 통해 검출할 수 있다.
활성화가능한 항-Jagged 항체는 또한 예를 들면 프로테아제 절단, 및 특정 표적과의 결합에 의해, 활성화가능한 항체 활성화의 타당성에 대한 동소발생 영상화에 유용하다. 동소발생 영상화는 생물학적 샘플 예컨대 세포 배양물 도는 조직 섹션 내 표적 및 단백질가수분해 활성의 국재화를 가능하게 하는 기술이다. 이러한 기술을 이용해서, 검출가능한 표지(예를 들면, 형광성 표지)의 존재를 기반으로 소정 표적에 대한 결합 및 단백질가수분해 활성 둘 모두를 확인하는 것이 가능하다.
이들 기술은 건강한 조직 또는 질환 부위(예를 들면, 종양 조직)에서 유래된 임의의 동결 세포 또는 조직을 이용하는데 유용하다. 이들 기술은 또한 신선한 세포 또는 조직 샘플을 이용하는데 유용하다.
이들 기술에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지로 표지된다. 검출가능한 표지는 형광성 염료(예를 들면, 형광단, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민 이소티오시아네이트(TRITC), Alexa Fluor® 표지), 근적외선(NIR) 염료(예를 들면, Qdot®nanocrystals), 콜로이드 금속, 햅텐, 방사능 마커, 비오틴 및 증폭 시약 예컨대 스트렙타비딘, 또는 효소(예를 들면, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제)일 수 있다.
표지된, 활성화가능한 항-Jagged 항체와 항온반응시킨 샘플 내 표지의 검출은 샘플이 표적, 즉 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 함유하고, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 CM에 대해 특이적인 프로테아제를 함유함을 의미한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제의 존재는 본원에 기술된 바와 같은 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제, 및/또는 프로테아제에 특이적인 제제, 예를 들면 항체 예컨대 프로테아제 마트립타아제(MT-SP1)에 특이적이고 MT-SP1의 단백질가수분해 활성을 억제하는인 A11을 이용해 확인할 수 있다. 예를 들면, 2010년 11월 11일 공개된 국제 공개 특허 출원 WO 2010/129609을 참조한다. 본원에 기술된 바와 같은 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제 및/또는 보다 선택적인 억제성 제제를 이용하는 동일한 접근법을 이용해 활성화가능한 항-Jagged 항체의 CM에 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제 부류를 동정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적의 존재는 표적에 특이적인 제제, 예를 들면 다른 항-Jagged 1 및/또는 항-Jagged 2 항체를 이용해 확인하거나, 또는 검출가능한 표지는 미표지된 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미표지된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용할 수 있는데, 표지된 2차 항체 또는 보다 복잡한 검출 시스템을 이용해 검출할 수 있다.
유사한 기술 또한 피험체, 예를 들면 인간을 포함한 포유동물에서 형광성 신호의 검출은 질환 부위가 표적, 즉 Jagged 1 및/또는 Jagged 2를 함유하고, 화성화가능한 항-Jagged 항체의 CM에 특이적인 프로테아제를 함유함을 의미하는 생체내 영상화에 유용하다.
이들 기술은 또한 활성화가능한 항-Jagged 항체 내 프로테아제 특이적 CM을 기반으로 다양한 세포, 조직, 및 유기체에서 프로테아제 활성을 검출, 동정 또는 특징규명하기 위한 시약으로서 및/또는 키트에서 유용하다.
본 발명은 다양한 진단 및/또는 예방 증상에서 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 (i) 피험체 또는 샘플을 활성화가능한 항-Jagged 항체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 절단가능한 모이어티(CM), 및 대상 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 여기서 미절단된, 비활성화 상태인 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하며: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 이때 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 방해하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며 AB의 천연 결합 파트너의 개질형이 아니고, (b) 미절단된, 비활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단된, 활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는 것인 단계; 및 (ii) 피험체 또는 샘플 내 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하는 단계로서, 피험체 또는 샘플 내 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 절단제 및 Jagged 표적이 피험체 또는 샘플 내에 존재함을 의미하고 피험체 또는 샘플 내 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 없음은 절단제, Jagged 표적 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 샘플 중에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않음을 의미하는 것인 단계에 의해서 피험체 또는 샘플 내 목적 표적 및 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합되는 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행하며, 여기서 시악은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 (i) 피험체 또는 샘플을 목적하는 Jagged 표적, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 존재하에 활성화가능한 항-Jagged 항체와 접촉시키는 단계로서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 절단가능한 모이어티(CM), 및 목적 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 이때 미절단된, 비활성화 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하며: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않고, AB의 천연 결합 파터느의 개질형이 아니며, (b) 미절단된, 비활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단된, 활성화 상태에서 MM은 AB와 Jagged 표적의 특이적 결합을 방해하거나 또는 경쟁하지 않는 것인 단계; 및 (ii) 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하는 단계로서, 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 절단제가 피험체 또는 샘플에 존재함을 의미하고 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 없음은 절단제가 피험체 또는 샘플 중에 부재하고/하거나 충붕하게 존재하지 않음을 의미하는 것인 단계에 의해서 피험체 또는 샘플 중 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행하며, 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플 중에 절단제 및 목적하는 Jagged 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 적어도 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단되는 절단가능한 모이어티(CM), 목적하는 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 포함하며, 여기서 미절단된, 비활성화 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하고: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 이때 (a) MM은 표적 Jagged와 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, AB의 천연 결합 파트너의 개질형이 아니고, (b) 미절단, 비활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하며, 절단된, 활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다; (ii) 피험체에서 화성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하며, 여기서 피험체 또는 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 피험체 또는 샘플에 절단제가 존재함을 의미하고, 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 피험체 또는 샘플에 없음은 절단제가 피험체 또는 샘플에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합되는 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행되고, 여기서 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 (i) 피험체 또는 샘플을 활성화가능한 항-Jagged 항체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단가능한 모이어티(CM), Jagged 표적, 예를 들면 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(AB), 및 검출가능한 표지를 포함하고, 미절단된, 비활성화 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하고: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, AB의 천연 결합 파트너의 개질형이 아니고, 미절단된, 비활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단된, 활성화 상태에서, MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 경재하지 않으며, 여기서 검출가능한 표지는 CM의 절단 후 방출되는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치하는 것인 단계; 및 (ii) 피험체 또는 샘플 중 검출가능한 표지의 농도를 측정하는 단계로서, 피험체 또는 샘플 중 검출가능한 표지의 검출가능한 농도는 절단제가 피험체 또는 샘플 중에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않음을 의미하고 피험체 또는 샘플 중 검출가능한 표지의 검출가능한 농도가 없음은 피험체 또는 샘플에 절단제가 존재함을 의미하는 것인 단계에 의해 피험체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치된다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행되며, 여기서 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플 중에서 절단제 및 목적하는 Jagged 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 적어도, 피험체 또는 생물학적 샘플을 접촉하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 치료제가 접합된 활성화가능한 항체) 및 피험체 또는 생물학적 샘플 중에서 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하고, 여기서 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 절단제 및 Jagged 표적이 생물학적 샘플 또는 피험체에 존재함을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 없음은 절단제, Jagged 표적 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 생물학적 샘플에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않음을 의미하며, 그 결과 Jagged 표적 결합 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 프로테아제 절단은 생물학적 샘플 또는 피험체에서 검출할 수 없다.
본 발명은 또한 (i) Jagged 표적 존재하에서 활성화가능한 항-Jagged 항체와 피험체 또는 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 (ii) 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하는 단계에 의해 피험체 또는 샘플 중 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하고, 여기서 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 수준은 절단제가 피험체 또는 생물학적 샘플 중에 존재함을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 수준이 없음은 피험체 또는 또는 생물학적 샘플에 검출가능한 농도로 절단제가 충분하게 존재하지 않고/않거나 부재함을 의미하며, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 프로테아제 절단은 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없다. 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 미절단(즉, 비활성화) 상태인 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하고: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, (b) 미절단 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단(즉, 활성화) 상태인 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 방해하거나 또는 경재하지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 차폐성 모이어티에 부착된다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 프로테아제 절단 부위의 N 말단 절단가능한 모이어티에 부착된다. 일부 실시양태에서, AB의 단일 항원 결합 부위는 차폐된다. 일부 실시양태에서 본원의 항체는 2 이상의 항원 결합 부위를 가지며, 1 이상의 항원 결합 부위는 차폐되고 1 이상의 항원 결합 부위는 차폐되지 않는다. 일부 실시양태에서 모든 항원 결합 부위는 차폐된다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 검출가능한 표지를 포함하는 2차 시약의 사용을 포함한다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플에서 절단제 및 목적하는 Jagged 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 적어도 피험체 또는 생물학적 샘플을 Jagged 표적 존재 하에 활성화가능한 항-Jagged 항체와 접촉시키고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하는데서 사용하기 위한 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 포함하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 피험체 또는 생물학적 샘플 중에 절단제가 존재함을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 없음은 피험체 또는 생물학적 샘플 중에 검출가능한 농도로 절단제가 충분하게 존재하지 않고/않거나 부재함을 의미하며, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 프로테아제 절단은 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없다. 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 미절단(즉, 비활성화) 상태인 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하고: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, (b) 미절단 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단(즉, 활성화) 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적과 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 그와 경쟁하지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 차폐성 모이어티에 부착된다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 프로테아제 절단 부위에 대해 N 말단에 절단가능한 모이어티에 부착된다. 일부 실시양태에서, AB의 단일 항원 결합 부위는 차폐된다. 일부 실시양태에서 본원의 항체는 2 이상의 항원 결합 부위를 가지며, 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되고 적어도 하나의 항원 결합 부위는 차폐되지 않는다. 일부 실시양태에서 모든 항원 결합 부위는 차폐된다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 검출가능한 표지를 포함하는 2차 시약의 이용을 포함한다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에서 사용하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 커트는 적어도 생물학적 샘플 또는 피험체와 접촉시키는데 사용되는 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 피험체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하며, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM의 절단 후 방출되는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치하는 검출가능한 표지를 포함하며, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 피험체 또는 생물학적 샘플 중에 절단제가 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않아서 활성화가능한 항-Jagged 항체의 Jagged 표적 결합 및/또는 프로테아제 절단을 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없음을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도가 없음은 절단제가 검출가능한 농도로 피험체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 의미한다.
본 발명은 (i) 피험체 또는 생물학적 샘플을 활성화가능한 항-Jagged 항체와 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM의 절단 후 방출되는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치하는 검출가능한 표지를 포함하는 것인 단계, 및 (ii) 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 측정하는 단계로서, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 절단제, Jagged 표적 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 생물학적 샘플에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않아서, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 Jagged 표적 결합 및/또는 프로테아제 절단이 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없음을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 내 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도의 감소는 절단제 및 Jagged 표적이 피험체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 의미하는 것인 단계에 의해 피험체 및 샘플에서 절단제 및 Jagged 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들면, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다. 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 미절단(즉, 비활성화) 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하며: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 (a) MM은 AB와 Jagged 표적의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파터느의 아미노산 서열을 갖지 않으며, (b) 비절단 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단(즉, 활성화) 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 이와 경쟁하지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플에서 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행하고, 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플에서 절단제 및 목적하는 Jagged 표적의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 적어도 피험체 또는 생물학적 샘플을 접촉하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 피험체 또는 생물학적 샘플에서 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하고, 여기서 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 검출가능한 농도는 절단제, Jagged 표적 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 생물학적 샘플에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않으며, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 Jagged 표적 결합 및/또는 프로테아제 절단을 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없음을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 내 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 감소된 검출가능한 농도는 절단제 및 Jagged 표적이 피험체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 의미한다. 검출가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들면, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다.
본 발명은 또한 (i) 피험체 또는 생물학적 샘플을 활성화가능한 항-Jagged 항체를 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM의 절단 후 방출되는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치하는 검출가능한 표지를 포함하는 것인 단계; 및 (ii) 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출가능한 표지의 농도를 측정하는 단계로서, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 검출가능한 표지의 검출가능한 농도는 검출가능한 수준으로 피험체 또는 생물학적 샘플에 충분하게 존재하지 않고/않거나 부재하며, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 프로테아제 절단을 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없음을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 내 검출가능한 표지의 검출가능한 농도의 감소는 절단제가 피험체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 의미하는 것인 단계에 의해 피험체 또는 샘플에서 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들면, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다. 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단제에 의해 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 또는 이의 단편(AB)을 포함하고, 여기서 미절단(즉, 비활성화) 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체는 다음과 같은 N 말단에서 C 말단으로의 구조적 배열을 포함하고: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM; 여기서 (a) MM은 Jagged 표적과 AB의 결합을 억제하는 펩티드이고, MM은 AB의 천연 발생 결합 파트너의 아미노산 서열을 갖지 않으며, (b) 미절단 상태인 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단(즉, 활성화) 상태의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 MM은 Jagged 표적에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하거나 또는 그와 경쟁하지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플에서 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행하고, 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한 피험체 또는 샘플에서 목적하는 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 적어도 피험체 또는 생물학적 샘플과 접촉하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 피험체 또는 생물학적 샘플 중 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하고, 여기서 활성화가능한 항-Jagged 항체는 CM의 절단 후 방출되는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 부분 상에 위치하는 검출가능한 표지를 포함하며, 이때 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출가능한 표지의 검출가능한 농도는 절단제, Jagged 표적, 또는 절단제와 Jagged 표적 둘 모두가 피험체 또는 생물학적 샘플에 부재하고/하거나 충분하게 존재하지 않으며, 활성화가능한 항-Jagged 항체의 Jagged 표적 결합 및/또는 프로테아제 절단을 피험체 또는 생물학적 샘플에서 검출할 수 없음을 의미하고, 피험체 또는 생물학적 샘플 중 검출가능한 표지의 검출가능한 농도의 감소는 절단제 및 Jagged 표적이 피험체 또는 생물학적 샘플에 존재함을 의미한다. 검출가능한 표지의 감소된 수준은 예를 들면, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 및/또는 약 100%의 감소이다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 영상화제, 조영제, 효소, 형광성 표지, 발색단, 염료, 1 이상의 금속 이온, 또는 기란드 기반 표지를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 영상화제는 방사성 동위원소를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네늄이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 조영제는 요오드, 카돌리늄 또는 철 산화물을 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 또는 β-갈락토시다아제를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 형광성 표지는 황색 형광성 단백질(YFP), 청록색 형광성 단백질(CFP), 녹색 형광성 단백질(GFP), 개질된 적색 형광성 단백질(mRFP), 적색 형광성 단백질 tdimer2(RFP tdimer2), HCRED, 또는 유로퓸 유도체를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 발광성 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 표지는 Alexa Fluor® 표지, 예컨대 Alex Fluor® 680 또는 Alexa Fluor®750를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 리간드-기반 표지는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 1 이상의 햅텐을 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이외의 포유동물, 인간이외의 영장루, 반려 동물(예를 들면, 고양이, 개, 말), 가축, 노동 동물, 또는 동물원 동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
이들 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 생체내 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 동소발생 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 생체외 방법이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내 방법이다.
일부 실시양태에서, 동소발생 영상화 및/또는 생체내 영상화는 어떠한 환자를 치료해야하는지 확인하는 방법에 유용하다. 예를 들면, 동소발생 영상화에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 적절한 부위, 예를 들면 종양 부위에서 적절한 프로테아제(들) 및 표적(들)을 갖는 환자를 확인하기 위해 환자 샘플을 스크리닝하는데 사용된다.
일부 실시양태에서 동소발생 영상화는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용한 치료에 적합한 환자 개체군을 확인하거나 또는 아니면 세련하는데 사용된다. 예를 들면, 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2) 및 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM) 내 기질을 절단하는 프로테아제(예를 들면, 질환 부위에서 활성화된 항체를 축적) 둘 모두에 양성 판정된 환자는 이러한 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하기에 적합한 후보로서 확인된다. 유사하게, 이 방법을 이용해 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2) 및 검사된 활성화가능한 항체의 CM 내 기질을 절단하는 프로테아제 둘 모두 또는 그 중 하나에 음성으로 검사된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 활성화가능한 항-Jagged 항체에 대해 음성 판정된 환자는 치료에 적합한 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체)가 동정될 때까지다른 CM을 포함하는 다른 활성화가능한 항-Jagged 항체로 검사될 수 있다.
일부 실시양태에서 생체내 영상화는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하기에 적합한 환자 개체군을 확인하거나 또는 세련하기 위해 사용된다. 예를 들면, 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2) 및 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM) 내 기질을 절단하는 프로테아제(예를 들면, 질환 부위에서 활성화 항체를 축적) 둘 모두가 양성으로 검사된 환자는 이와 같은 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하는데 적합한 후보로 확인된다. 유사하게, 음성으로 검사된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 제1 활성화가능한 항-Jagged 항체에 대해 음성으로 검사된 환자는 치료에 적합한 활성화가능한 항체(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체)가 동정될 때까지 다른 CM을 포함하는 다른 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용해 검사할 수 있다.
이러한 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 방법 및 키트는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하기에 적합한 환자 개체군을 확인하거나 또는 세련하는데 사용된다. 예를 들면, 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2) 및 이들 방법에서 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM) 내 기질을 절단하는 프로테아제 둘 모두에 양성으로 검사된 환자는 이러한 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 유사하게, 표적(예를 들면, Jagged 1 및 Jagged 2) 및 이들 방법을 이용해 검사되는 활성화가능한 항체 내 CM 중 기질을 절단하는 프로테아제에 대해 음성으로 검사된 환자는 다른 형태의 요법에 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 다른 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체)가 동정될 때까지 다른 활성화가능한 항-Jagged 항체로 검사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적(예를 들면, Jagged 1 또는 Jagged 2) 중 어느 하나에 대해 음성으로 검사된 환자는 이러한 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용한 치료에 적합한 후보로 확인된다. 일부 실시양태에서, 표적(예를 들면, Jagged 1 또는 Jagged 2) 중 어느 하나에 대해 음성으로 검사된 환자는 이러한 CM을 포함하는 이러한 활성화가능한 항-Jagged 항체를 이용한 치료에 적합한 후보가 아닌 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체)가 동정될 때까지 다른 활성화가능한 항-Jagged 항체로 검사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 치료제가 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제제에 접합되지 않는다. 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플 중 활성화가능한 항-Jagged 항체 농도의 측정은 활성화된 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용해 수행하며, 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 키트는 본원의 항-Jagged 활성화가능한 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 치료제가 접합된 활성화가능한 항체)로 치료하기 적합한 환자 개체군을 확인 또는 세련하는데 사용되고, 이어서 이를 필요로하는 피험체에 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 투여는 치료가 후속된다. 예를 들면, 표적(예를 들면, Jagged 1 및 Jagged 2) 및 이들 방법에서 검사되는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 절단가능한 모이어티(CM) 내 기질을 절단하는 프로테아제 둘 모두에 양성으로 검사된 환자는 이러한 CM을 포함하는 이러한 항체 및/또는 이러한 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체로 치료하기에 적합한 후보로 확인되며, 이어서 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체의 치료 유효량이 투여된다. 유사하게, 표적(예를 들면, Jagged 1 및/또는 Jagged 2) 및 이들 방법을 이용해 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체 내 CM 중 기질을 절단하는 프로테아제 둘 모두 또는 그 중 하나에 대해 음성으로 검사된 환자는 다른 유형의 요법에 대해 적합한 후보로 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 치료에 적합한 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체(예를 들면, 질환 부위에서 환자에 의해 절단되는 CM을 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체)가 동정될 때까지 다른 항체 및/또는 접합된 활성화가능한 항-Jagged 항체로 검사할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 이어 환자가 양성으로 검사된 활성화가능한 항-Jagged 항체 및/또는 접합된 항체의 치료 유효량이 투여된다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, MM은 약 4 내지 40개 아미노산 길이를 갖는 펩티드이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 링커 펩티드를 포함하고, 여기서 링커 펩티드는 MM과 CM 사이에 위치된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 링커 펩티드를 포함하고, 여기서 링커 펩티드는 AB와 CM 사이에 위치한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화가능한 항-Jagged 항체는 제1 링커 펩티드(L1) 및 제2 링커 펩티드(L2)를 포함하고, 여기서 제1 링커 펩티드는 MM과 CM 사이에 위치하고 제2 링커 펩티드는 AB와 CM 사이에 위치한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 각각의 L1 및 L2는 길이가 약 1 내지 20개 아미노산인 펩티드이고, 각각의 L1 및 L2는 동일한 링커를 필요로하지 않는다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 하나 또는 둘 모두는 글리신-세린 중합체를 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 적어도 하나는 (GS)n,(GSGGS)n(서열번호 123) 및 (GGGS)n(서열번호 124)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 n은 1 이상의 정수이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 1 이상은 식 (GGS)n를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, n은 1 이상의 정수이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, L1 및 L2 중 적어도 하나는 Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 125), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호 126), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호 127), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 128), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 129), 및 Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호　130)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, AB는 본원에 개시된 교차 반응성 항-Jagged 항체 서열에서 선택된 항체 또는 항체 단편 서열을 포함한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, AB는 Fab 단편, scFv 또는 단일 사슬 항체(scAb)를 포함한다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 절단제는 피험체 또는 샘플에서 Jagged 표적과 공동 국재하고 CM은 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 폴리펩티드이며, 여기서 프로테아제는 활성화가능한 항-Jagged 항체가 프로테아제에 노출되면 활성화가능한 항-Jagged 항체 내 CM을 절단한다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 최대 15개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 N 말단에 커플링된다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 C 말단에 커플링된다. AB. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, CM은 AB의 VL 사슬의 N 말단에 커플링된다.
이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 절단제는 효소이고 CM은 효소에 대한 기질이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 효소는 본원에 개시된 프로테아제이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 프로테아제는 본원에 개시된 프로테아제 중 하나이다. 이들 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및 MMP-14로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신이다.
항-Jagged 항체의 치료적 투여 및 제형
본 발명에 따른 치료제의 투여는 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하도록 제형에 도입되는 다른 제제와 투여된다는 것을 이해할 것이다. 다수의 적절한 제형은 약사에 공지된 처방전에서 확인할 수 있다; [Remington's Pharmaceutical Sciences(15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA(1975))]를 참조하며, 특히 Blaug, Seymour의 87장을 참조한다. 이들 제형은 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예컨대 Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 흡착 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀션, 에멀션 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카르보왁스 함유 반고체 혼합물을 포함한다. 임의의 전술한 혼합물은 본 발명에 따른 치료 및 요법에서 적절하며, 단, 제형 내 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고, 제형이 투여 경로와 생리적으로 상용성이며 내성인 것을 조건으로 한다. 하기 문헌들 및 그에 언급된 약사에게 공지된 제형, 부형제 및 담체와 관련된 추가 정보를 참조한다: Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8(2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60(2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78(2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998).
일부 실시양태에서, 암 또는 섬유성 질환을 치료하는데 사용되는 항-Jagged 항체, 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 항-Jagged 항체 조성물은 1 이상의 추가 제제, 또는 추가 제제의 조합과 함께 투여된다. 적절한 추가 제제는 의도하는 용도를 위한 현행 약학 및/또는 수술 요법을 포함한다. 예를 들면, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가의 화학요법제 또는 항종양제와 함께 사용된다. 예를 들면, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 단일 치료 조성물로 제형화되고, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 동시에 투여된다. 다르게, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 서로 개별적인데, 예를 들면 각각은 개별 치료 조성물로 제형화되고, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 동시에 투여되거나, 또는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 치료 양생 동안 다른 시점에 투여된다. 예를 들면, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가 제제의 투여 전에 투여되거나, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 추가 제제의 투여 후에 투여되거나, 또는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 교대식으로 투여된다. 본원에서 기술한 바와 같이, 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 및 추가 제제는 단일 용량으로 또는 복수 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 추가 제제는 항-Jagged 항체 및/또는 활성화가능한 항-Jagged 항체와 커플링되거나 또는 이에 부착된다.
적절한 추가 제제는 의도하는 용도(즉, 사멸, 세포 증식 예방, 호르몬 요법 또는 유전자 요법)의 목적에 따라 선택된다. 이러한 제제는 제한없이, 예를 들면, 약학제, 독소, 독소의 단편, 알킬화제, 효소, 항생제, 항대사산물, 항증식제, 호르몬, 신경전달물질, DNA, RNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 앱타머, 진단제, 방사선불투과성 염료, 방사성 동위원소, 형광원 화합물, 자성 표지, 나노입자, 마커 화합물, 렉틴, 세포막 투과성을 변경하는 화합물, 광화학 화합물, 소형 분자, 리포솜, 미셀, 유전자 요법 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 마지막으로, 제제의 조합 또는 상이한 부류의 제제의 조합을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 및/또는 활성화가능한 항체(본원에서 "활성 화합물"이라고도 함), 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 상동체는 투여에 적합한 약학 조성물에 도입될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는데 관련된 원리 및 고려사항과 화합물 선택 가이드가 제공된다. 예를 들면, 하기 문헌들을 참조한다; Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; 및 Peptide and Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
이러한 조성물은 전형적으로 항체 및 약학적 허용 담체를 포함한다. 활성화가능한 항체가 AB 도메인의 단편을 포함하는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 AB의 최소 단편을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체의 가변 영역 서열을 기반으로, 펩티드 분자는 표적 단백질 서열에 결합하는 AB의 능력을 보유하게 디자인될 수 있다. 이러한 펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용해 생산되고/되거나 화학적으로 합성될 수 있다(Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(1993)).
본원에서 사용하는 용어 "약학적 허용 담체"는 약학 투여와 상용성인, 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 하는 것이다. 적절한 담체는 본원에 참조하여 포함되는 당분야의 표준 참고서인 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기술되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 적합한 예에는 제한없이, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스액 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함된다. 리포솜 및 비수성 소포체 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당분야에서 공지이다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용성이지 않은 것을 제외하고, 조성물에서 이의 사용을 고려한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과를 통해 쉽게 수행된다.
본 발명의 약학 조성물은 의도하는 투여 경로와 상용성인 제형이다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들면, 정맥, 피내, 피하, 경구(예를 들면, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내, 또는 피하 용으로 사용되는 용액 또는 현탁액응 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 물, 염수액, 고정유, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장성 조정용 제제 예컨대 염화나트류 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨을 이용해 조정할 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱츠로 제조된 앰풀, 1회용 시린지 또는 복수 용량 바이알을 내포할 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균된 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리적 염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균되어야 하고, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들면, 코팅 레시틴 등의 레시틴을 이용하고, 분산의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 이용하여 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 솔비톨, 염화 나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 적합하다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 가능할 수 있다.
멸균 주사액은 필요하면, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양으로 활성 화합물을 도입한 후, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 대체로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 소포체에 활성 화합물을 도입하여 제조할 수 있다. 멸귤 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 추가의 바람직한 성분의 분말을 얻도록 진공 건조 및 동결 건조하는 것이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 내포되어 전제로 압착된다. 경구 치료 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 도입되고 정제, 트로키, 또는 캡슐 형태로 사용된다. 경구 조성물은 또한 구강 세척제로 사용하기 위한 유동성 담체를 사용해 제조할 수 있는데. 유동성 담체 중 화합물은 경구적으로 적용되고 휙뿌려지고 ?어내거나 삼켜진다. 약학적 상용성 결합제, 및/또는 보강제 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알략, 캡슐, 트로키 등은 임의의 하기 성분들 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제 예커대 마그네슘 스테아레이트, 스테로트; 활액제 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예커대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향.
흡입 투여를 위해, 화합물은 적절한 추진제, 예를 들면 가스 예컨대 이산화탄소를 함유하는 압축 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해서, 투과되는 장벽에 적절한 투과제가 제형에 사용된다. 이러한 투과제는 당분야에 공지이고, 예를 들면 경점막 투여를 위해서, 붕해제, 담즙염, 및 후시드산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비내 분무 또는 좌제의 사용을 통해 수행된다. 경피 투여를 위해서, 활성 화합물은 당분야에 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
화합물은 또한 좌제(예를 들면, 통상적인 좌제 베이스 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 함께 사용) 또는 직장 전달용 보류 관장 형태로 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화 전달계를 포함한, 지연/제어 방출 제형 등과 같은, 체내에서의 신속한 제거로부터 화합물을 보호할 수 있는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체상용성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드리드, 폴리글리콜, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르, 및 폴리락트산 등이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당분야의 숙련가에게는 자명하다.
예를 들면, 활성 성분은 예를 들면 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에서, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미세캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 캡슐 또는 마크로에멀션에 포획될 수 있다.
서방형 조제물을 제조할 수 있다. 서방형 조제물의 적절한 예에는 매트릭스가 성형품, 예를 들면, 막 또는 미세캡슐의 형태인, 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락트산(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™M(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 동안 분자를 방출시킬 수 있고, 일부 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다.
재료는 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)은 또한 약학적 허용 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들면 미국 특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
투여 용이성 및 투약 균일성을 위해 투약 유닛으로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특이 유리하다. 본원에서 사용되는 투약 유닛 형태는 치료하려는 피험체를 위한 일원화 투약물로 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 의미하며, 각 유닛은 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투약 유닛의 상세사항은 활성 성분의 고유한 특징 및 얻고자하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 활성 성분을 배합하는 분야에서의 고유한 한계등에 직접적으로 좌우되고 이에 의해 영향받는다.
약학 조성물은 투여용 지시서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
제형은 또한 치료하려는 특정 증상에 필요한 1 이상의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 서로 악영향을 주지않는 상보적인 활성을 갖는 것들이다. 다르게, 또는 부가적으로, 조성물은 그 기능을 향상시키는 제제, 예를 들면 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
일 실시양태에서, 활성 화합물은 병용 요법으로, 즉 다른 제제, 예를 들면, 병리적 상태 또는 질병, 예컨대 자가면역 질환 및 염증성 질환을 치료하는데 유용한 치료제와 조합되어 투여된다. 이 문맥에서 용어 "조합하여"는 제제가 실질적으로 동 시발생적으로, 동시에 또는 순차적으로 주어짐을 의미한다. 순차적으로 주어지는 경우, 제2 화합물의 투여 개시시, 2종 화합물 중 제1 화합물은 치료 부위에서 효과적인 농도로 여전히 검출가능하다.
예를 들면, 병용 요법은 이하에 상세하게 기술하는 바와 같이, 1 이상의 추가 치료제, 예를 들면 1 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독성제 또는 세포분열 억제제와 공동제형화, 및/또는 공동투여되는 본 발명의 1 이상의 항체를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 1 이상의 항체는 본원에 기술된 2 이상의 치료제와 조합하여 사용된다. 이러한 병용 요법은 투여되는 치료제의 보다 낮은 용량을 유리하게 이용할 수 있어서, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 1 이상의 항체는 1 이상의 항염증 약물, 면역억제제, 또는 대사 또는 효소 억제제와 공동제형화, 및/또는 공동투여될 수 있다. 본원에 기술된 항체와 조합하여 사용할 수 있는 약물 및 억제제의 비제한적인 예는 제한없이, 비스테로이드성 항염증 약물(들)(NSAID), 예를 들면, 이부프로펜, 테니답, 나프록센, 멜록시캄, 피록시캄, 디클로페낙, 및 인도메타신; 설파살라진; 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니솔론; 사이토카인 억제성 항염증 약물(들)(CSAID); 뉴클레오티드 생합성의 억제제, 예를 들면, 퓨린 생합성 억제제, 폴레이트 길항제(예를 들면, 메토트렉세이트(N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸] 메틸아미노] 벤조일]-L-글루탐산); 피리미딘 생합성 억제제, 예를 들면, 디히드로오로테이트 디히드로게나아제(DHODH) 억제제를 포함한다. 본 발명의 항체와 조합하여 사용하는데 적합한 치료제는 NSAID, CSAID, (DHODH) 억제제(예를 들면, 레플루노미드), 및 폴레이트 길항제(예를 들면, 메토트렉세이트) 중 1 이상을 포함한다.
추가 억제제의 예에는 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사); 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 타클로리무스(FK-506); 및 mTOR 억제제, 예를 들면, 시롤리무스(라파마이신 - RAPAMUNE™ 또는 라파마이신 유도체, 예를 들면, 가용성 라파마이신 유도체(예를 들면, 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들면, CCI-779); 프로염증성 사이토카인 TNFα 또는 IL-1(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나아제 억제제)에 의한 신호전달을 억제하는 제제; COX2 억제제, 예를 들면, 셀레콕시브, 로페콕십 및 이의 변이체; 포스포디에스터라아제 억제제, 예를 들면, R973401(포스포디에스터라아제 IV형 억제제); 포스포리파아제 억제제, 예를 들면, 세포질 포스포리파아제 2(cPLA2)의 억제제(예를 들면, 트리플루오로메틸 케톤 유사체); 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 성장 인자 수용체의 억제제, 예를 들면, VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제; 및 혈관신생의 억제제 중 1 이상이 포함된다. 본 발명의 항체와 조합하여 사용하기 적합한 치료제는 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 카를로리무스(FK-506); mTOR 억제제, 예를 들면, 시롤리무스(라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예를 들면, 가용성 라파마이신 유도체(예를 들면, 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들면, CCI-779); COX2 억제제, 예를 들면, 셀로콕십 및 이의 변이체; 및 포스포리파아제 억제제, 예를 들면, 세포질 포스포리파아제 2(cPLA2)의 억제제, 예를 들면, 트리플루오로메틸 케톤 유사체를 포함한다.
본 발명의 항체와 조합할 수 있는 치료제의 추가예에는 6-머캅토퓨린(6-MP); 아자티오프린, 설파살라진; 메살라진; 올살라진; 클로로퀸/히드록시클로로퀸(PLAQUENIL®; 펜실라민; 아우로티오르날레이트(근육내 및 경구); 아자티오프린; 코이키신; 베타-2 아드레날린수용체 작동제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄); 잔틴(테오필린, 아르니노필린); 크로모글리케이트; 네도크로밀; 케토티펜; 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸; 마이코페놀레이트 모페틸; 아데노신 작동제; 항트롬빈제; 보체 억제제; 및 아드레날린 작용제 중 1 이상을 포함한다.
다른 치료제의 디자인 및 생성
Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대해 본원에서 생산하고 특징규명한 항체의 활성을 기반으로 본 발명에 따르면, 항체 모이어티 이외에 다른 치료 양식의 디자인이 용이하다. 이러한 양식은 제한없이, 진보된 항체 치료제, 예컨대 이중특이적 항체, 면역독소, 및 방사성표지된 치료제, 펩티드 치료제의 생성, 유전자 요법, 특히 인트라바디, 안티센스 요법 및 소형 분자를 포함한다.
예를 들면, 이중특이적 항체와 관련하여, Jagged 1 및 Jaggde 2에 대한 특이성을 갖는 항체 및 함께 접합된 제2 분자에 특이성을 갖는 항체의 2가지 항체, (ii) Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적인 하나의 사슬, 및 제2 분자에 특이적인 제2 사슬을 갖는 단일 항체, 또는 (iii) Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 특이성 및 제2 분자를 갖는 단일 사슬 항체를 포함하는 이중특이적 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 이중특이적 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용할 수 있으며, 예를 들면, (i) 및 (ii)와 관련하여 문헌 [Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81(1994)] 및 [Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168(1992)]를 참조하고, (iii)과 관련하여 [Traunecker et al. Int. J. Cancer(Suppl.) 7:51-52(1992)]를 참조하여 생성시킬 수 있다.
면역독소와 관련하여, 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용해 면역독소로 작용하도록 개질될 수 있다. 문헌 [Vitetta Immunol Today 14:252(1993)]을 참조한다. 또한, 미국 특허 제5,194,594호를 참조한다. 방사성표지된 항체와 관련하여, 이러한 개질 항체는 또한 당분야에 공지된 기술을 이용해 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven(1996))]를 참조한다. 또한, 미국 특허 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호, 및 제5,697,902호를 참조한다. 면역독소 및 방사성표지 분자 각각은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다.
치료 펩티드의 생성과 관련하여, Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두 및 이의 항체, 예컨대 본 발명의 항체 또는 펩티드 라이브러리의 스크리닝과 관련된 구조적 정보를 이용하여, 치료 펩티드는 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두에 대해 생성시킬 수 있다. 펩티드 치료제의 디자인 및 스크리닝은 문헌 [Houghten et al. Biotechniques 13:412-421(1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135(1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905(1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513(1992)]을 참조한다. 면역독소 및 방사성표지 분자를 또한 항체와 관련하여 상기 기술된 바와 같은 펩티드 모이어티와 관련하여, 유사한 방식으로 준비할 수 있다. Jagged 1 분자, Jagged 2 분자 및/또는 Jagged 1 분자와 Jagged 2 분자 둘 모두(또는 스플라이스 변이체 또는 교대형 등과 같은 형태)가 질환 프로세스에서 기능적으로 활성일 것으로 가정하면, 통상의 기술을 통해 유전자 및 이의 안티센스 치료제를 디자인하는 것이 가능하다. 이러한 양식은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 기능을 조정하는데 이용될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 항체는 이와 관련된 기능적 어세이의 디자인 및 사용이 가능하게 한다. 안티센스 치료제에 대한 디자인 및 전략은 국제 공개 특허 출원 WO 94/29444에 상세하게 기술되어 있다. 유전자 요법에 대한 디자인과 전략도 공지이다. 하지만, 구체적으로, 인트라바디를 포함한 유전자 치료 기술의 사용은 특이 유리한 것으로 판명되었다. 예를 들면, 문헌 [Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601(1994)] 및 [Marasco Gene Therapy 4:11-15(1997)]를 참조한다. 유전자 치료와 관련된 일반적인 디자인 및 고려사항은 또한 국제 공개 특허 출원 WO 97/38137에 기술되어 있다.
Jagged 1 분자, Jagged 2 분자 및/또는 Jagged 1 분자와 Jagged 2 분자 둘 모두의 구조 및 본 발명에 따른 다른 분자, 예컨대 본 발명의 항체와 이의 상호작용에 대한 지식, 및 다른 것들은 추가적인 치료 양식을 합리적으로 디자인하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여 합리적인 약물 디자인 기술 예컨대 X-선 결정학, 컴퓨터-지원(또는 보조) 분자 모델링(CAMM), 정량 또는 정성적 구조-활성 관계(QSAR), 및 유사한 기술을 이용해 약물 발견 노력을 집중시킬 수 있다. 합리적인 디자인은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두를 개질 또는 조정하는데 이용할 수 있는 분자 또는 이의 특정형과 상호작용할 수 있는 단백질 또는 합성 구조를 예측할 수 있게 한다. 이러한 구조는 화학적으로 합성하거나 또는 생물학적 시스템에서 발현시킬 수 있다. 이러한 접근법은 [Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs(Stockton Press, NY(1988))]를 참조한다. 또한, 조합 라이브러리를 디자인하고 합성하여 스크리닝 프로그램, 예컨대 고수율 스크리닝 노력에서 이용할 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 조절인자, 즉 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두와 그들의 선천적 수용체의 결합을 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해하는 후보물 또는 시험 화합물 또는 제제(예를 들면, 펩티드, 펩티드모방체, 소형 분자 또는 다른 약물), 또는 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달 기능을 조정, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 아니면 방해하는 후보물 또는 시험 화합물 또는 제제를 동정하는 방법(본원에서는 또한 "스크리닝 어세이"라고 함)을 제공한다. 또한 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달과 관련된 질환을 치료하는데 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 스크리닝 어세이에서 동정된 화합물을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달 기능을 조정하는 후보물 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 어세이를 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적 위치지정가능한 평형 고체상 또는 액상 라이브러리; 디콘볼루션을 필요로하는 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법을 포함한, 당분야에 공지된 조합 라이브러리 방법에서 다양한 임의의 접근법을 이용해 얻는다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 제한되지만, 다른 접근법은 펩티드, 펩티드외 올리고머 또는 화합물의 소형 분자 라이브러리에 적용할 수 있다(Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145).
본원에서 사용되는 "소형 분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 일부 실시양태에서는 약 4 kD 미만인 조성물을 의미하는 것이다. 소형 분자는 예를 들면, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 화학 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대 진균, 박테리아 또는 조류 추출물의 라이브러리는 당분야에서 공지이고, 본 발명의 임의의 어세이를 이용해 스크리닝할 수 있다.
분자 라이브러리를 합성하는 방법의 예는 당분야에서 확인할 수 있고, 예를 들면, 다음의 문헌들을 참조한다: [DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233].
화합물의 라이브러리는 용액(Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421) 내에, 또는 비드(Lam, 1991. Nature 354: 82-84) 상, 칩(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556) 상에, 박테리아(미국 특허 제5,223,409호), 포자(예를 들면, 미국 특허 제5,233,409호), 플라스미드(Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) 또는 파지(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; 및 미국 특허 제5,233,409호)로 존재할 수 있다.
일 실시양태에서, 후보 화합물을 항체-항원 복합체에 도입하고 후보 화합물이 항체-항원 복합체를 파괴하는지 여부를 확인할 수 있고, 여기서 복합체의 파괴는 후보 화합물이 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달 기능을 조절함을 의미한다.
다른 실시양태에서, Jagged 1 및 Jagged 2 둘 모두를 제공하고 1 이상의 단일클론 항체에 노출시킨다. 항체-항원 복합체의 형성을 검출하고, 1 이상의 후보 화합물을 복합체에 도입한다. 항체-항원 복합체가 1 이상의 후보 화합물의 도입 후 파괴되면, 후보 화합물은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달과 관련된 질환을 치료하는데 유용하다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 가용성 단백질을 제공하고 1 이상의 중화성 단일클론 항체에 노출시킨다. 항체-항원 복합체의 형성을 검출하고, 1 이상의 후보 화합물을 복합체에 도입시킨다. 항체-항원 복합체가 1 이상의 후보 화합물을 도입후 파괴되면, 후보 화합물은 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두의 신호전달과 관련된 질환을 치료하는데 유용하다.
항체-항원 복합체를 방해하거나 또는 이를 파괴하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 예를 들면 항원 또는 생물학적 활성 부분에 시험 화합물의 결합을 복합체 내 표지된 화합물을 검출하여 확인할 수 있도록 시험 화합물을 방사성동위원소 또는 효소 표지로 커플링하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C, 또는 3H로 표지할 수 있고, 방사성동위원소는 섬광 계측에 의해 또는 전파 방출의 직접 계측을 통해 검출한다. 다르게, 시험 화합물은 예를 들면 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타제, 루시퍼라아제로 효소적으로 표지하고, 효소 표지는 적절한 기질의 생성물로의 전환을 측정하여 검출한다.
일 실시양태에서, 어세이는 시험 화합물과 항체-항원 복합체를 접촉시키는 단계, 및 항원과 상호작용하거나 또는 아니면 존재하는 항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 항운과 상호작용 및/또는 항체-항원 복합체를 파괴하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 항체와 비교하여 시험 화합물이 우선적으로 항원 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 능력을 측정하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 어세이는 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 항체-항원 복합체를 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 단계를 포함한다. 항체-항원 복합체를 조정하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 예를 들면, 시험 화합물 존재하에서, 항체와 결합하거나 또는 항체와 상호작용하는 능력을 측정하여 수행할 수 있다.
본원에 개시된 스크리닝 방법은 세포 기반 어세이 또는 세포 무함유 어세이로서 수행할 수 있다. 본 발명의 세포 무함유 어세이는 가용성 Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두, 및 이의 단편을 이용하여 처리할 수 있다.
실시양태에서, 후보 화합물의 도입 후 하나 또는 둘의 미복합형에서 복합형 분리를 용이하게 하고, 또한 언세이의 자동화를 수용하기 위해 항체 또는 항원을 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물 존재 및 부재 하에서 항체-항원 복합체의 관찰은 반응물을 함유하는데 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 용기는 마이크로타이터 평판, 시험관, 미세원심분리관을 포함한다. 일 실시양태에서, 1 또는 2 단백질을 매트릭스에 결합시킬 수 있는 도메인을 부가한 융합 단백질을 제공한다. 예를 들면, GST-항체 융합 단백질 또는 GST-항원 융합 단백질은 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온 유도체화된 마이크로타이터 평판 상에 흡착되고, 이어서 시험 화합물과 배합하여, 그 혼합물을 복합체 형성이 유도되는 조건(예를 들면, 염 및 pH에 대한 생리적 조건)에서 항온반응시킨다. 항온 반응 후, 비드 또는 마이크로타이터 평판 웰을 세척하여 임의의 미결합 성분을 제거하며, 비드의 경우에는 매트릭스를 고정시키고, 복합체를 간접적으로 또는 직접적으로 측정한다. 다르게, 복합체는 매트릭스로부터 해리시킬 수 있고, 항체-항원 복합체 형성 수준은 표준 기술을 이용해 측정할 수 있다.
매트릭스 상에 단백질을 고정하는 다른 방법을 또한 본 발명의 스크리닝 어세이에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 항원(예를 들면, Jagged 1, Jagged 2 및/또는 Jagged 1과 Jagged 2 둘 모두)은 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 이용해 고정시킬 수 있다. 비오틴화된 항체 또는 항원 분자는 당분야에 공지된 기술(예를 들면, 비오틴화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, Ill)을 이용해 비오틴-NHS(N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하루 수 있고, 스트렙타비딘 코팅된 96웰 평판(Pierce Chemical)의 웰에 고정시킨다. 다르게, 목적하는 항체 또는 항원과 반응하지만, 목적하는 항체-항원 복합체의 형성을 방해하지 않는 다른 항체를 평판의 웰에 유도체화시킬 수 있고, 미결합 항체 또는 항원은 항체 접합에 의해 웰 내에 포획시킨다. GST-고정화 복합체에 대해 상기 기술한 것 이외에도, 이러한 복합체를 검출하는 방법은 항체 또는 항원과 반응하는 이러한 다른 항체를 이용하는 복합체의 면역검출법을 포함한다.
본 발명은 임의의 상기 언급한 스크리닝 어세이에 의해 동정된 신규한 제제 및 본원에 기술된 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
본원에 인용된 모든 공개물 및 특허 문서는 각각의 그러한 공개물 또는 문서를 구체적이고 개별적으로 참조하여 본원에 편입시킨다고 표시한 바와 같이 본원에 편입된다. 공개물 및 특허 문서의 인용은 이들 중 어느것이 적절한 종래 기술이라고 인정하려는 것이 아니거나, 또는 동일 내용 또는 동일 일자로서 임의 승인을 포함하려는 것이 아니다. 기재된 설명으로 기술한 발명을 통해, 본 발명은 다양한 실시양태로 실시될 수 있고 전술한 설명 및 이하 실시예는 예시를 위한 목적이고 이하 청구항을 제한하려는 것이 아님을 당분야의 숙련가는 이해할 것이다.
실시예
실시예 1. 인간 Jagged 1에 결합하는 실시양태의 인간 ScFv의 선별
이 실시예는 Jagged 1에 결합하는 실시양태의 ScFv(단쇄 가변 단편)를 다양한 CDR 서열을 갖는 ScFv의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택할 수 있고, 이러한 결합은 Notch 1에 의해 억제될 수 있음을 보여준다.
ScFv는 M13 박테리아파지 상에 표현된 완전한 인간 ScFv 라이브러리로부터 선택하였다. ScFv 파지 선별은 Creative Biolabs(미국, 뉴욕, 셜리 소재)과의 계약에 의해 수행하였다. 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 Jagged 1의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 융합 단백질(R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat #1277-JG-050)을 인간 Jagged 1에 결합하는 M13 박테리아파지 상에 표현된 ScFv에 대한 3회 선별 과정에서 항원으로 사용하였다. 선별은 인간 IgG1이 인간 Fc에 결합하는 것을 방해하고, Jagged 1의 천연 입체구조에 필요한 CA2 ++ 존재 하에서 수행하였다. 제1회에서, 결합된 파지는 트립신 분해를 통해 방출시키고, 후속 회차에서, 파지는 인간 Notch 1-Fc 융합 단백질(R&D Systems; Cat # 3637-TK-050) 경쟁을 통해 용리하였다. 인간 Jagged 1에 결합하는 다섯(5)개의 고유한 ScFv가 단리되었다. 표 1은 5종의 ScFv 및 그들 개별 핵산 서열 및 아미노산의 서열번호을 열거한 것이다.
Figure pct00006
항-Jagged ScFv 각각의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같다:
서열번호 1
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggagggctggagtgggtctcagcgattgcggagctgggtgcgcttacatagtacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgagagctcatactagttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctataaggcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacaggctatggatcagcctcctacgttcggccaa gggaccaaggtggaaatcaaacgg-3'
서열번호 2
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서열번호 3
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggagggctggagtgggtctcaacgattgctgcttagggtaagcatacagattacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagctagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaatcgatgcgtggttttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcgggggggtcgacggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaccgggaaagcccctaagctcctgatctatcgggcatcctctttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaaatttgcaacttactactgtcaacaggatgcgactggtcctgcgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg-3'
서열번호 4
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서열번호 5
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서열번호 6
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서열번호 7
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서열번호 8
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서열번호 9
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서열번호 10
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인간 Jagged 1에 대한 Jagged 13 ScFv-파지 및 Jagged 32 ScFv-파지의 ELISA-기반 결합은 인간 Notch 1에 의해 억제됨을 보여주었다. 간략하게, 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.)를 96웰 ELISA 평판의 웰에 흡착시켰다. 파지를 인간 notch 1-Fc의 존재 또는 부재하에 평판에 도포하고 결합되게 하였다. 결합된 파지를 항-M13-HRP 접합체(GE Healthcare, Piscataway, NY)로 가시화하고 발색성 기질 테트라메틸 벤지딘(TMB)(Thermo Scientific, Rockford, IL)으로 현상하였다.
실시예 2. 실시양태의 완전한 인간 Jagged IgG 항체의 생산 및 검사
이 실시예는 인간 Jagged 1에 결합하는 Jagged ScFv-파지를 인간 Jagged 1 및 인간 Jagged 2 둘 모두를 비롯하여, 마우스 Jagged 1에도 결합하는 완전한 인간 인간 IgG 항체로 전환됨을 보여준다. 인간 Notch 1은 이러한 결합을 억제할 수 있다.
Jagged 13 및 Jagged 32의 가변 도메인을 포함하는 완전한 인간 IgG의 생산은 PCT 공개 특허 WO 2010/081173에 기술된 것과 유사한 기술을 이용해 수행하였다. Jagged 13 ScFv-파지 및 Jagged 32 ScFv-파지의 Jagged 13 및 32 가변 도메인을 코딩하는 DNA를 완전한 인간 IgG의 발현을 위한 발현 벡터에 클로닝하였다. 경쇄(Lc) 가변 도메인은 프라이머 CX1197(cacttgtcacgaattcggacatccagatgacccagtc)(서열번호 83) 및 CX1198(gtgcagccaccgtacgtttgatttccaccttggtccc)(서열번호 84)를 이용하여 ScFv 주형으로부터 증폭하였다. 벡터(LcpOP(pCDNA3로부터 변형, Invitrogen, Carlsbad, CA)) 및 증폭된 DNA를 BsiWI 및 EcoRI로 밤새 절단하고 결찰하여 조합시키고 이.콜라이 MC1061 세포를 형질전환시켰다. 중쇄(Hc) 가변 도메인은 ScFv 주형으로부터 프라이머 CX1199(ttgcacttgtcacgaattcggaggtgcagctgttggagtc)(서열번호 85) 및 프라이머 CX1202(ggcccttggtgctagcgctcgagacggtgaccagggttc)(서열번호 86)를 이용해 증폭시켰다. 인터루킨 2(IL2) 신호 서열을 코딩하는 DNA는 HcpPOP(pCDNA3에서 변형, Invitrogen)로부터 프라이머 CX1184(gaaccgtcagatcactagaagc)(서열번호 81) 및 프라이머 CX1185(cgaattcgtgacaagtgcaagacttagtg)(서열번호 82)를 이용해 증폭시키고, Hc 가변 도메인과 어닐링하였다. 벡터(HcpOP(pCDNA3로부터 변형, Invitrogen)) 및 IL2-Hc-가변 도메인을 밤새 HindIII 및 NheI로 절단하였고, 결찰로 조합시키고 이.콜라이 MC1061 세포를 형질전환시켰다. 완전한 인간 IgG(즉, Jagged 13 IgG 및 Jagged 32 IgG, 또한 본원에서 각각 항-Jagged 13(또는 항-Jag 13) 및 항-Jagged 32(또는 항-Jag 32)라고 함)를 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피를 통해 배양 상등액으로부터 정제하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, ELISA-결합 실험은 항-Jagged 13 IgG 및 항-Jagged 32 IgG가 30 nM 보다 높은 친화성으로 인간 및 마우스 Jagged 1 및 인간 Jagged 2에 결합함을 보여준다: 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.), 인간 Jagged 2-Fc(R&D Systems; Cat #1726-JG-050), 또는 래트 Jagged 1-Fc(R&D Systems; Cat #599-JG-100)를 96웰 ELISA 평판의 웰에 흡착시켰다. 정제된 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32 항체를 평판에 도포하고 결합되게 하였다. 결합된 항체를 Fab 특이적인, 항-인간 IgG-HRP 접합체(Sigma, St Louis, MO; Cat #A0293-1ML)를 이용해 가시화하고 발색성 기질 TMB로 현상시켰다.
도 2에 도시된 바와 같이, ELISA-결합 실험은 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32 결합에 의한 Jagged 1 결합은 인간 Notch 1에 의해 억제됨을 보여준다: 경쟁 실험을 위해서, Notch 1-Fc(R&D Systems; ibid.)을 96웰 ELISA 평판의 웰에 흡착시켰다. 비오틴화된 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.)를 높은 농도의 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32 항체 중에 평판에 도포하고, 결합되게하였다. 결합된 Jagged 1을 스트렙타비딘-HRP(Thermo Scientific)으로 가시화하고 발색성 기질 TMB로 현상하였다. 항-Jagged MAB-12771(R&D Systems; Cat" MAB12771)를 억제에 대한 양성 대조군으로 사용하고 베바시주맙을 음성 대조군으로 사용하였다. 용어 "구형" 및 "신형"은 항체 생산의 상이한 로트를 의미한다. 항체 32/13은 항-Jagged 32 경쇄 및 항-13 중쇄를 갖는다. 항체 32/32은 항-Jagged 32 경쇄 및 중쇄를 갖는다.
실시예 3. 실시양태의 항-Jagged 항체의 친화성 성숙화
결합 동역학 및 Jagged 결합 특이성이 개선된 실시양태의 항체의 단리를 보여준다.
항-Jagged 항체는 항-Jagged 32로부터 개질된 CDR을 갖는 라이브러리로부터 단리하였다. 이러한 라이브러리는 표 2에 도시한 대로 디자인하였다. 항-Jagged 32의 서열을 기반으로, 항체의 6 라이브러리를 Dut/Ung 돌연변이유발법(Kunkel TA, 1985, Proc Natl Acad Sci 82, 488-492)을 이용해 구축하였다. 잔기는 원래 뉴클레오티드 70%와 10%의 각각의 다른 3개의 가능한 뉴클레오티드(표 2의 첨자 1)를 보유하거나, 또는 전체 무작위화(표 2의 첨자 2)하여 각 표시된 뉴클레오티드에서 가볍게 무작위화하여 다양하게 하였다. 또한, 라이브러리 3 및 6 내에서, 추가 잔기를 중쇄의 CD3에 부가하였다. 라이브러리를 이.콜라이 TG1 균주에 형질감염시키고 M13KO7(Invitrogen)로 중복감염시킨 후 파지를 준비하였다.
엄격성을 증가시킴으로써 각 라이브러리에 대해 제3회의 선별을 수행하였다. 3회차의 경우, 인간 Jagged 1(R&D Systems; ibid.)를 mL 당 5 ㎍(㎍/mL)으로 면역튜브(Nunc, Denmark)에 흡착시켰다. 파지를 트리스-완충된 염수(TBS; 40 mM Tris, 129 mM NaCl, pH 7.4) 중 100 ㎍/mL 수집된 인간 IgG(huIgG, 또는 hIgG) 및 2% 탈지 건조유(NFDM)로 차단시킨 후, 결합을 위해 코팅된 튜브에 부가하였다. 결합 후, 튜브를 광범위하게 각각 30분간 37℃에서 세척 4회를 포함하여, 세척하였다. 세척 후, 나머지 결합된 파지를 100 mM 트리에탄올아민(TEA)(Sigma, St. Louis, MO)로 용리하고 이.콜라이 TG1을 통해 증폭시켰다. 라이브러리 1, 2 및 5를 배합하여 라이브러리 125를 형성시키고, 라이브러리 3, 4 및 6을 배합하여 라이브러리 346을 형성시켰으며, 각 라이브러리에 대해서 추가의 선별 회차를 수행하였고, 본원에서 또한 3회차에 대해 기술된 바와 같이, 각각 라이브러리 125의 4회차 선별 및 라이브러리 346의 4회차 선별이라고 한다.
Figure pct00007
첨자 1은 원래 뉴클레오티드의 70% 및 각각 다른 3개의 가능한 뉴클레오티드의 10%를 보유하여, 각 표지된 뉴클레오티드에서 가볍게 무작위화하여 다양화시킨 잔기를 표시하고, 첨자 2는 전체 무작위화하여 다양화된 잔기를 표시한다.
실시예 4: 친화성 성숙된 항-Jagged 항체의 결합 특징
이 실시예는 친화성 성숙화 과정을 통해 단리된 실시양태의 친화성 성숙화된 항-Jagged 항체의 결합 특징을 보여준다.
각각 라이브러리 125의 4회차 선별 및 라이브러리 346의 4회차 선별에서 얻은 마흔 여덟(48) 클론을 성장시키고 M13KO7을 감염시켜 파지를 생성시켰다. 각 파지는 파지 ELISA를 통해서 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.), 래트 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.), 및 인간 Jagged 2-Fc(R&D Systems; ibid.)에 결합하는 그 능력에 대해 분석되었다. Jagged 리간드는 96웰 ELISA 평판의 웰에 흡착되었고, 각 리간드는 개별 평판 상에 흡착시켰다. 파지는 각 평판 상의 상관있는 웰에 도포하여 결합되게 하였다. 결합된 파지는 항-M13-HRP 접합체로 가시화하였고 발색성 기질 TMB로 현상하였다. 개별 단리물은 분기적인 결합 특이성을 나타냈다. 이들 특이성은 표 3에 도시하였다. 또한, 각 단리물에 대한 서열번호를 도시하였다.
Figure pct00008
표 3의 각 클론의 아미노산 서열을 하기에 도시하였다:
서열번호 11 Lc4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호12 Hc4
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 13 Lc5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 14 Hc5
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 15 Lc7
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 16 Hc7
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 17 Lc8
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 18 Hc8
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 19 Lc13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 20 Hc13
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 21 Lc16
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 22 Hc16
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYYGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 23 Lc19
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 24 Hc19
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 25 Lc21
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 26 Hc21
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 27 Lc24
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 28 Hc24
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 29 Lc26
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 30 Hc26
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 31 Lc27
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 32 Hc27
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFYGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 33 Lc28
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 34 Hc28
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 35 Lc30
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 36 Hc30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 37 Lc31
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 38 Hc31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 39 Lc32
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 40 Hc32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 41 Lc37
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 42 Hc37
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 43 Lc39
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 44 Hc39
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 45 Lc40
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 46 Hc40
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 47 Lc47
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR
서열번호 48 Hc47
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS
실시예 5: 실시양태의 친화성 성숙화된 항-Jagged 1 및 항-Jagged 2 항체의 단리 및 시험
이 실시예는 Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 대한 결합 친화성이 향상된 실시양태의 항체를 단리하기 위해 CDR 셔플링을 이용하는 것을 기술한다.
라이브러리 125의 4회차 선별 유래의 경쇄 및 라이브러리 346의 4회차 선별유래의 중쇄를 조합하여 7번째 라이브러리를 구축하였다. 이 H/L 라이브러리는 추가 2회 선별을 통해 선택하였다. 1회차에서, 라이브러리는 2개 부분으로 나뉜다. 한 부분은 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.)와의 결합에 대해 선별되고 제2 부분은 인간 Jagged 2-Fc(R&D Systems, ibid.)와의 결합에 대해 선별된다. 2회차에서, 각각 Jagged 1/1 및 Jagged 1/2라고 표시된, 2개 풀을 얻은, 개별 결합 반응으로 1회차 유래의 인간 Jagged 1-선별 파지를 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.) 또는 인간 Jagged 2-Fc(R&D Systems, ibid.)와의 결합에 대해 선별하였다. 유사하게, 각각 Jagged 2/1 및 Jagged 2/2로 표시된 2개 풀을 얻은, 개별 결합 반응으로 1회차 유래 인간 Jagged 2-선별 파지를 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.) 또는 인간 Jagged 2(R&D Systems; ibid.)에 대한 결합에 대해 선별하였다.
구십오(95) 개별 단리물을 각각 4개 풀에서 선택하였다. 파지는 각 단리물에서 유도시켰고 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.) 또는 인간 Jagged 2-Fc(R&D Systems; ibid)에 대한 결합에 대해 어세이하였다. Jagged 리간드는 96웰 ELISA 평판의 웰에 흡착시켰으며, 각 리간드는 개별 평판 상에 흡착시켰다. 파지를 각 평판 상의 상관있는 웰에 도포하고 결합시켰다. 결합된 파지는 항-M13-HRP 접합체로 가시화시켰고 발색성 기질 TMB로 현상하였다. ELISA 및 DNA 서열 결과를 기초로, 6개의 고유한 클론을 추가 실험을 위해 선택하였다. 표 4는 6개 클론에 의해 코딩되는 항체 및 그들 각각의 경쇄 및 중쇄의 핵산 서열 및 아미노산 서열의 서열번호를 열거하였다.
Figure pct00009
사슬 셔플 이후 표 4의 최종 클론 각각의 아미노산 서열을 하기에 도시하였다:
4B2
경쇄
서열번호 49
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGCTAGACGCTCCTCCGCAATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT
서열번호 50
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T L D A P P Q F G Q G T K V E I K R
중쇄
서열번호 51
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTGAGCAGATGGGTTGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 52
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E Q M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V S S
4D11
경쇄
서열번호 53
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT
서열번호 54
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T V V A P P L F G Q G T K V E I K R
중쇄
서열번호 55
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 56
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D P E G R Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V S S
4E7
경쇄
서열번호 57
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCGCTGGTGGCGCCTCTTACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT
서열번호 58
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S L V A P L T F G Q G T K V E I K R
중쇄
서열번호 59
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGAAGAGATGGGTTGGCAGACAAAGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCTGCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 60
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E E M G W Q T K Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S
4E11
경쇄
서열번호 61
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGTTAGATGCCCCTCTGATGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT
서열번호 62
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L D A P L M F G Q G T K V E I K R
중쇄
서열번호 63
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGAGCCTATGGGTTGACTAACAGAATACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 64
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I E P M G Q L T E Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D I G G R S A F D Y W G Q G T L V T V SS
6B7
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서열번호 65
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGCTTGTCGCCCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT
서열번호 66
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L V A P L T F G Q G T K V E I K R
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서열번호 67
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGATGAGATGGGTTGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCTGCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 68
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D E M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S
6F8
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서열번호 69
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGCGCTTGTCGCCCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTAC
서열번호 70
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S S Y L N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A L V A P L T F G Q G T K V E I K R
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서열번호 71
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGATGAGATGGGTTGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCGGCTGCTGCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
서열번호 72
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S S I D E M G W Q T Y Y A D S V K G R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S A A A F D Y W G Q G T L V T V S S
라이브러리를 Fab에 대해 카르복시에 His 택을 배열시키고, His 택의 카르복시에 앰버 중지 코돈을 배열하여서, 6종의 친화성 성숙화된 항체를 코딩하는 파지미드가 비앰버 억제인자 균주에 존재하는 경우, 파지미드는 이.콜라이의 주변세포질 공간에서 정제할 수 있는 C 말단 His 태깅된 Fab의 발현을 유도한다. 6종의 성숙화 단리물의 친화성과 항-Jagged 13 및 항-Jagged 32 Fab의 친화성을 측정하기 위해서, Fab는 이.콜라이 DH12b에서 발현 및 정제하였다.
개별 Fab에 대한 오프 속도는 Octet(ForteBio, Menlo Park, CA)를 이용해 측정하였다. 항-인간 Fc Octet 팁(ForteBio, Cat #18-5060)을 비오사이틴 및 100 ㎍/mL BSA로 차단한 후 25 마이크로몰(25 μM) Jagged 리간드, 즉 인간 Jagged 1-Fc(R&D Systems; ibid.), 인간 Jagged2-Fc(R&D Systems; ibid.) 또는 쥣과동물 Jagged 2-Fc(R&D Systems, ibid.)를 적재하였다. 세척 후, 적재된 팁을 결합이 형평에 도달할 때까지 25 μM Fab에 노출시켰다. 이어 팁을 Fab가 없는 신선한 용액으로 제거하고, Fab 해리 속도를 측정하였다. 표 5에 표시한 해리 상수는 친화성 성숙화된 항체의 오프 속도가 ScFv 항체 Jagged 13 및 Jagged 32와 비교하여 10배 내지 100배 감소되었음을 보여준다.
Figure pct00010
실시예 6: 실시양태의 항-Jagged 항체의 생산
이 실시예는 실시양태의 항-Jagged 항체의 발현 및 정제를 보여준다.
벡터는 다음의 방식으로 제조하였다: IL2 신호 서열 코딩 영역을 KasI/NcoI 단편으로서 pINFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen, San Diego, CA)에서 pFUSE2-CLIg-hk(InvivoGen)로 옮겨 플라스미드 pFIL2-CL-hk를 얻었다. IL2 신호 서열 코딩 영역을 또한 KasI/EcoRI 단편으로서 pINFUSE-hIgG1-Fc2에서 KasI/EcoRI로 효소분해한pFUSE-CHIg-hG1(InvivoGen)(큰 단편 및 중간 단편)에 3방식 결찰하여 플라스미드 pFIL-CHIg-hG1를 얻었다.
pFIL2-CL-hk 벡터로부터 경쇄 코딩 영역은 프라이머 CX1170 및 CX1168을 이용해 증폭하고 과정에서 NotI 부위가 돌연변이되는, 주입 클로닝 시스템(HD EcoDry, Clontech, Mountain View, CA)을 이용하고 NheI 및 NotI 부위를 이용해 pOP Neo 벡터에 클로닝하였다. 4D11 가변 경쇄 코딩 영역은 프라이머 CX1197 및 CX1198를 이용하여 단리된 4D11 코딩 서열로부터 PCR 증폭하였고 EcoRI 및 BsiWI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 프라이머는 표 6에 제공하였다. 4D11 경쇄 핵산 서열은 서열번호 73으로 표시하였고, 아미노산 서열은 서열번호 74로 표시하였다.
4D11 경쇄 서열:
서열번호 73
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgttattcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
서열번호 74
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
pFIL-CHIg-hG1 벡터로부터의 중쇄 코딩 영역을 다음과 같이 pOP Hygr 벡터(pCDNA3의 변형, Invitrogen)에 클로닝하였다: 2개의 중첩 단편을 증폭하였고, 제1 단편은 프라이머 CX1184 및 CX1185를 이용한 pOP Hygr 벡터 유래의 5' 비코딩 영역이고 제2 단편은 프라이머 CX1172 및 CX1169를 이용한 pFIL-CHIg-hG1 유래의 코딩 영역이다. 이들 PCR 생성물을 이어 프라이머 CX1184 및 CX1169를 이용한 최종 증폭을 위해 조합하였고 HindIII 및 NotI 제한효소 부위를 이용해 pOP Hygr 벡터에 클로닝하였다. 4D11 가변 중쇄 코딩 영역은 단리된 4D11 코딩 서열로부터 프라이머 CX1199 및 CX1202를 이용해 증폭한 동일한 제1 DNA 단편 및 제2 단편을 이용해, 유사한 방식으로 클로닝하였다. 2개 단편은 프라이머 CX1184 및 CX1202를 이용해 증폭하고 HindIII 및 NheI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 프라이머를 표 6에 제공하였다. 4D11 경쇄 핵산 서열은 서열번호 75로 나타내었고, 아미노산 서열은 서열번호 76으로 나타내었다.
4D11 중쇄 서열:
서열번호 75
agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
서열번호 76
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Figure pct00011
완전한 인간 IgG는 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피를 통해 배양 상등액으로부터 정제하였다.
실시예 7. 실시양태의 항-Jagged 항체는 마우스의 BxPC-3 종양을 감소시킨다
이 실시예에서, 항-Jagged 4D11을 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 능력에 대해 분석하였다.
인간 췌장암 세포주 BxPC-3는 중국 과학원 상하이 생물과학 연구소의 세포 은행에서 얻었다. BxPC-3 이종이식은 BxPC3 세포를 Balb/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 발생시켰다. 500-700 ㎣에 도달하면, 종양을 시험관내 세포 배양을 위해 회수하고 연속 계대하였다. 생체 내 적응된 BxPC-3 세포(이종이식 유도된 세포)를 공기 중 5% CO2 대기 하에 37℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640에서 성장시켰다. 종양 세포는 통상적으로 주당 2회 서브배양하였다. 세포는 대수기 동안 회수하여 적절한 세포 농도로 생리적 PBS에 현탁하고, 종양 유도를 위해 얼음에 유지시켰다.
각 마우스는 종양 발병을 위해서 0.1 mL PBS 중 5X106 의 BxPC-3 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 접종하였다. 평균 종양 크기가 대략 150 ㎣에 도달하면 치료를 시작하였다. 칼리퍼를 이용해 2차원으로 주당 2회씩 종양 크기를 측정하였고, 부피는 다음의 식을 이용해 ㎣로 표시하였다: V = 0.5 a x b 2, 이 식에서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이다.
마우스를 그룹으로 나누고 표 7에 기재한 대로 투약하였다.
Figure pct00012
초기 투약 후 일수에 대한 종양 부피를 나타낸 도 3은 항-Jagged AD11 항체가 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여준다. 도 4는 그룹 1 및 2에서 동물의 체중 감량을 나타낸다. 마우스 흉선 기질 림포포이어틴(TSLP)의 혈청 농도는 제조사의 프로토콜에 따라서 Quantikine 마우스 TSLP 면역어세이(R&D Systems)를 이용해 측정하였다. 마우스 TSLP의 혈청 농도는 각 그룹의 개별 마우스에 대해 정량하고 평균 내어 도 5에 나타내었다.
항-Jagged 4D11은 또한 하기 표 8에 기재한 그룹 및 투약을 이용해, 상기 기술된 바와 유사한 방식을 사용하여, 용량 의존적 방식으로 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 능력에 대해 검사하였다.
Figure pct00013
초기 투약 후 일수에 대한 종양 부피를 표시한 도 6은 항-Jagged AD11 항체가 BxPC-3 이종이식 종양을 억제함을 보여준다. 도 7은 동물의 체중 감량을 표시한 것이다.
2차 실험에서, 항-Jagged 4D11은 또한 제2 항암제와 조합하여 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 능력에 대해 검사하였다. 이 실험에서, 도 23에 개시한 용량을 이용하고, 상기 기술된 것과 유사한 방법을 이용해, 항-Jagged 4D11을 단독으로 또는 현재 췌장암의 치료 기준 화학요법제인 젬시타빈과 조합하여 투여하였다. 이 실험에서, 체중 감량 및 폐사율을 통해 항체 독성이 분명하였다. 이들 실험은 항-Jagged 4D11 및 젬시타빈의 조합이 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여주었다. 도 23에 도시한 바와 같이, 항-Jagged 항체 및 젬시타빈의 조합은 BxPC3 췌장 이종이식 모델에서 부가 효과를 생성하였다.
실시예 8 . 실시양태의 항-Jagged 항체는 인간 골수 공배양물 중 RPMI 8226의 성장을 억제한다.
이 실시예는 항-Jagged 4D11이 인간 골수 공배양물 중 RPMI 8226의 성장을 억제함을 보여준다.
다발성 골수종에서, 골수종 세포와 골수의 기질 세포 간 상호작용은 골수종 세포의 생존 및 증식 그리고 수반되는 골용해성 질환의 발생에서 중요하다. Notch 수용체 및 리간드는 다발성 골수종에서 상향조절된다. 다발성 골수종 세포주 RPMI 8226의 증식을 억제하는 항-Jagged 4D11의 능력을 RPMI 8226 및 인간 골수 흡입물의 공배양물에서 시험관내 측정하였다. 인간 골수는 AllCells, LLC(Emeryville, CA)에서 구매하였다. RPMI 8226 세포는 제조사 지시(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라 CFSE로 표지하였다. 간략하게, 골수는 RPMI-1640, 10% FBS에 2배 희석하였고, 2 mL을 6웰 조직 배양 디쉬의 웰에 플레이팅하였다. 1 mL RPMI, 10% FBS 중 50,000 CFSE-표지된 RPMI 8226 세포를 골수를 함유하는 웰에 플레이팅하였다. 시험물, 즉 항-Jagged 4D11, anti-EGFR(항체 c225, 세툭시맙 UCSF Pharmacy, Bristol-Myers Squibb에서 제조 및 판매, NY, NY) 또는 감마 세크리타아제 억제제 BMS299897(Sigma, St. Louis, MO)를 부가하고, 배양물을 5일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온배양하였다. 항온배양 후, 적혈구르 용해시키고, 생존 세포를 원심분리로 회수하였다. 세포의 형광 강도를 FACS를 통해 측정하였다.
결과를 도 8에 도시하였다. 증식을 표시하는 감소된 형광성은 항-EGFRR 존재시 또는 임의의 치료 부재시에 측정하였다. 대조적으로, BMS299897(GSI) 및 항-Jagged 4D11 둘 모두는 CFSE-표지된 RPMI 8226의 증식을 억제하였다.
실시예 9 . 실시양태의 항-Jagged 항체는 시험관내에서 섬유증의 발병을 억제한다.
이 실시예는 항-Jagged 4D11가 시험관내에서 섬유증 발병을 억제함을 보여준다.
래트 섬유아세포 세포주 NRK-49F(ATCC, Manassas, VA)는 세포-세포 접촉 손실, 콜라겐의 높은 생산 및 침착, 및 병소 발생에 의해 인간 형질전환 성장 인자 베타 1(TGFβ1)에 반응한다. NRK-F49 세포를 6웰 조직 배양 디쉬에 50,000 세포/웰로 플레이팅하고 부착 및 단층 형성을 위해, RPMI-1640, 10% 소태아 혈청(FBS) 중에서 밤새 배양하였다. 배지를 제거하고 세포를 RPMI-1640, 1% 열불활성화된 FBS로 세척하고, 밤새 RPMI-1640, 1% 열불활성화된 FBS에서 배양하였다. 밤샘 항온배양 후, 항-Jagged 4D11, TGFβ1, 또는 TGFβ1과 항-Jagged 4D11의 조합을 배양 중인 세포에 부가하였다. 세포를 5일간 배양하고 TGFβ1에 대한 반응을 관찰하였다.
결과를 도 9에 도시하였다. 패널 A는 NRK-F49 배양물이 100 nM 항-Jagged 4D11 존재 하에 배양시 특징적인 단층을 유지함을 보여준다. 패널 B는 10 ng/mL TGFβ1 존재 하에 배양된 NRK-F49에 대한 특징적인 병소 형성을 보여준다. 패널 C는 TGFb1-자극된, 섬유성 병소 형성이 10 ng/mL TGFβ1 처리된 배양물 중 100 nM 항-Jagged 4D11에 의해 완전하게 억제됨을 보여준다.
실시예 10 . 활성화가능한 항-Jagged 항체 차폐성 모이어티
이 실시예는 활성화가능한 항-Jagged 항체와 그 표적에 대한 결합이 감소되는 차폐성 모이어티(MM)의 동정을 기술한다.
2010년 7월 15일 공개된 PCT 국제 공개 특허 출원 WO 2010/081173에 기술된 것과 유사한 방법을 이용하여, 2x1010의 전체 다양성으로 무작위 X15 펩티드(X는 아미노산임) 라이브러리를 스크리닝하는데 항-Jagged 4D11 항체 및 Fab를 시용하였다. 스크리닝은 1회 MACS 및 2회 FACS 분급으로 이루어진다. 초기 MACS는 250 nM의 농도로 단백질-A Dynabeads(Invitrogen) 및 항-Jagged 4D11 항체를 이용해 수행하였다. MACS의 경우, 대략 1x1011 세포를 결합에 대해 스크리닝하고 6x106 세포를 회수하였다. 스트렙타비딘-PE는 초기 FACS에 대한 형광 프로브로서 사용하였고 항-비오틴-PE(Miltenyi)은 2차 FACS에 대해 사용하였다. 비오틴화 항-Jagged 4D11 항체는 각가 1차 및 2차 FACS에서 100 nM 및 10 nM 농도로 사용하였다. 2차 FACS로부터의 양성 개체군은 재조합 Jagged 단백질에 의해 항-Jagged 4D11 항체 및 Fab에 대한 결합이 억제되는 것으로 검증되었다. 개별 펩티드 클론은 서열 분석으로 확인하였고 도 10에 도시한 바와 같이, 이후 항-Jagged 4D11 항체 및 Fab에 결합하는 능력에 대해 검증하였다.
항-Jagged 차폐성 모이어티의 서열은 표 9에 나타내었다.
Figure pct00014
실시예 11 . 항-Jagged 차폐성 모이어티의 친화성 성숙화
이 실시예는 항-Jagged 차폐성 모이어티의 친화성 성숙화를 기술한다.
항-Jagged 결합 펩티드 JS4874, JS4896, JS4899, 및 JS4906은 가벼운 무작위 접근법을 이용해 친화성 성숙화하였다. 예컨대 PCT 국제 공개 특허 출원 WO 2009/014726에 기술된 바와 같은 eCPX 세포 디스플레이 라이브러리를 표 10에 나타낸 뉴클레오티드 비율을 사용해 구축하였다. 4개 라이브러리를 구축하였다: 4874SR, 4896SR, 4899SR, 및 4906SR. 각 라이브러리에 대한 최종 다양성은 대략 5 x 109였다.
Figure pct00015
각각의 친화성 성숙화 라이브러리를 개별적으로 스크리닝하였다. 초기 MACS 회차는 라이브러리의 100X 보다 많은 과샘플링을 제공하는 많은 세포를 사용해 수행하였다. 모든 표지화는 일정하게 부드럽게 교반하면서 4℃에서 수행하였다. 세포를 25 nM 항-Jagged Fab(라이브러리 4896SR) 또는 50 nM 항-Jagged 항체(라이브러리 4874SR, 4899SR, 및 4906SR)로 표지화하고 대략 500 ㎍ 스트렙타비딘 또는 단백질-A 표지된 자성 비드(Dynabeads Invitrogen)에 결합시켰다. 이어서 비드를 광범위하게 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세척하였다. 각 라이브러리로부터 대략 2 x 106 내지 2 x 107 세포를 초기 MACS 회차로부터 회수하였다.
모든 FACS 회차에 대한 박테리아 세포를 비오틴화 항-Jagged Fab로 표지화하였다. 사용된 2차 형광성 표지는 2차 표지 단독의 관찰되는 배경 결합에 따라서 항-비오틴-PE(Miltenyi)이거나 또는 스트렙타비딘-PE(Invitrogen)였다. 모든 FACS 회차의 경우, 양성 세포의 최고밝음 2%를 분급하였다. 라이브러리 4896SR의 경우, FACS 1회차(F1) 및 FACS 2회차(F2)에 대한 세포는 각각 2 nM 및 1 nM Fab로 표지하였다. 라이브러리 4874SR, 4899SR, 및 4906SR의 경우, F1에 대한 세포는 100 nM Fab로 표지하였다. 4874SR 라이브러리의 경우, F2에 대한 세포는 1 nM Fab로 표지하는 한편 라이브러리 4899SR 및 4906SR에 대한 세포는 10 nM Fab로 표지하였다. 각 라이브러리로부터의 2회차 FACS에서 얻은 서열을 표 11 내지 14에 나타내었다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
모 차폐성 모이어티 펩티드 JS4896의 결합을 4896SR 라이브러리(클론 JS5340, JS5342, JS5347, 및 JS5358)에서 선택된 차폐성 모이어티 펩티드의 결합과 비교하였다. 표시된 클론을 함유하는 세포를 3가지 상이한 농도의 비오틴화 항-Jagged Fab, 즉 1 nM, 10 nM, 100 nM에서 FACS 분석하였다. 스트렙타비딘-PE는 2차 형광성 표지로 사용하였다. 펩티드 발현은 PCR WO 2007/027935에 기술된 바와 유사한 방법을 이용해 yPet-MONA로 표지하여 정량하였다. 결과를 도 11에 나타내었다.
실시예 12. 활성화가능한 항-Jagged 항체
이 실시예는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 예를 개시한다.
본원의 항-Jagged 차폐성 모이어티, 절단가능한 모이어티, 및 항-Jagged 항체를 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체는 PCT 공개 특허 출원 WO 2009/025846 및 WO 2010/081173에 기술된 바와 유사한 방법에 따라 생산하였다. 얻어진 활성화가능한 항체의 품질 제어는 대부분 95% 이상의 단량체를 포함하는 것으로 나타났다. 본원의 몇몇 활성화가능한 항-Jagged 항체의 아미노산 및 핵산 서열을 이하에 제공하였다.
차폐성 모이어티 JS5342(본원에서는 MM 5342 또는 5342라고도 함), 1 이상의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 CM, 및 AB 4D11의 경쇄를 포함하는 몇몇 활성화가능한 항-Jagged 항체의 경쇄(Lc)의 핵산 및 아미노산 서열을 이하에 도시한다.
5342-1203-4D11 Lc
아미노산
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 132)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAATGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGCCGTGGTCCAAGCTGGGTTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 131)
5342-1204-4D11 Lc
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEXFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 134)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 133)
5342-1214-4D11 Lc
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSPLTGRSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLXIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 136)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCACCACTGACTGGTCGTTCCGGTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 135)
5342-PLGL-4D11 Lc
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSGGGSPLGLGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 138)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGCCACTGGGCCTGGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 137)
차폐성 모이어티 5342, 비절단가능한 링커, 및 AB 4D11의 경쇄를 포함하는 차폐 항체의 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열을 이하에 도시하였다:
5342-NSub-4D11 Lc
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSSGSGGSGGGSGGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 140)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCAGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGGGCGGTGGGAGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 139)
본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체를 생산하기 위해 본원에서 기술한 바와 같은 방법을 이용해 본원의 항-Jagged 항체에 연결할 수 있는 CM 및 MM5342를 포함하는 몇몇 폴리펩티드의 핵산 및 아미노산 서열을 이하에 제공한다:
5342-Cath.E
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSAGFSLPAGGGS(서열번호 142)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGCTGGCTTCTCCCTCCCCGCAGGTGGCGGTTCT(서열번호 141)
5342-MMP-14
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGSLAPLGLQRRGGS(서열번호 144)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTAGCCTGGCACCTCTGGGTCTGCAACGCCGTGGCGGTTCT(서열번호 143)
5342-panMMP
아미노산 서열
QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQGGSSGGSGGSGGSGGPLGVRGGGS(서열번호 146)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGACCTTTGGGAGTCAGAGGTGGCGGTTCT(서열번호 145)
이들 폴리펩티드를 생산하는데 사용된 카텝신 E(Cath E), MMP-14, 및 panMMP 기질(CM)은 하기 문헌에 보고되어 있다: Cruz-Monserrate Z et al., 2011, Gut, doi:10.1136/gutjnl-2011-300544; Abeer J et al., 2011, Chem. Biol. 18, 392-401; Zhu L et al., 2011, Theranostics 1, 18-27.
이러한 MM 및 CM 함유 폴리펩티드가 연결될 수 있는 항체의 예는 항-Jagged 항체 4D11 또는 이의 변이체를 포함한다. 4D11 Hc QΔH라고 하는, 4D11 변이체의 중쇄의 아미노산 및 핵산 서열을 하기에 제공하였다.
4D11 Hc QΔH
아미노산
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 148)
뉴클레오티드
AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(서열번호 147)
실시예 13 . 활성화가능한 항-Jagged 항체의 시험관내 특징규명
이 실시예는 이러한 차폐성 모이어티를 포함하는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 Jagged 표적에 결합하는 능력을 감소시키는 본원의 차폐성 모이어티의 능력을 기술한다. 이 실시예는 또한 이러한 활성화가능한 항체의 단백질가수분해성 활성화를 기술한다.
인간 Jagged 1 표적에 결합하는 활성화가능한 항체 5342-1203-4D11, 5342-1204-4D11, 5342-1214-4D11, 및 5342-PLGL-4D11을 비롯하여, 차폐된 항체 5342-NSub-4D11의 능력을 본원에 기술된 바와 같이 시험관내 결합 어세이에서 동일 표적에 결합하는 항-Jagged 항체 4D11의 능력과 비교하였다. 이러한 표적 결합을 억제하는 MM 5342의 능력을 도 12 및 표 15에 나타내었다.
표 15는 항-Jagged 항체 4D11 및 차폐된 항체 및 이의 활성화가능한 항체의 Jagged 표적 결합을 비교한 것이다. 차폐 배수는 (활성화가능한 항체에 대해 명확한 KD/항체 4D11에 대해 명확한 KD)로서 계산하였다.
Figure pct00020
활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1203-4D11, 5342-1204-4D11, 5342-1214-4D11, 및 5342-PLGL-4D11을 비롯하여, 차폐된 항체 5342-NSub-4D11는 프로테아제에 의해 절단되는 그 능력에 대해 평가하였다. 간략하게, 250 ng의 활성화가능한 항체를 적절한 완충액(uPA의 경우: HBSS 중 0.1M Tris pH 8.0; MMP-2의 경우: TCNB(50mM Tris, 150mM NaCl, 0.05% Brij, 10mM CaCl2, pH 9.5)) 중에 37℃에서 24시간 동안 1 uM uPA 또는 387 nM MMP-2로 분해하였다. 분해된 물질을 이어서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅으로 분석하였고, 검출제로서는 염소 항-인간 IgG Fab'2 HRP를 이용하였다. 도 13은 단백질가수분해성 분해가 모(즉, 항체 4D11) 경쇄와 유사한 이동성을 갖는 단백질을 생성함을 보여주며, 각각의 활성화가능한 항체가 각각 uPA 또는 MMP-2 프로테아제에 의해 절단되었음을 의미한다.
실시예 14 . 활성화가능한 항-Jagged 항체의 생체내 특징규명
이 실시예는 마우스 BxPC3 종양 모델에서 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 생체 내 효율 및 안정성을 기술한다.
활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1203-4D11, 5342-1204-4D11, 5342-1214-4D11, 및 5342-PLGL-4D11을 비롯하여, 차폐된 항체 5342-NSub-4D11을 본원에 기술된 바와 유사한 방법을 이용해, 마우스로 이식된 BxPC3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 그 능력을 검사하였다. 또한, 항-Jagged 항체 4D11에 의해 야기된 체중 감량과 비교하여 종양 모델에서 체중 감량을 감소시키는 이들 활성화가능한 항체 및 차폐된 항체의 능력을 검사하였다. 그룹, 용량, 투약 경로 및 투약 스케쥴은 표 16에 기재하였다. 효율 결과(종양 크기 감소)는 도 14에 도시하였다. 안정성 결과(체중 감량 감소)는 도 15에 도시하였다. 마우스 흉선 기질 림포포이어틴(TSLP)의 혈청 농도는 도 16A에 나타내었다.
Figure pct00021
초기 투약 후 일수에 대해 종양 부피를 그린 도 14는 활성화가능한 항-Jagged 항체가 항-Jagged 항체 4D11(모 항체)가 그러한 것처럼 마우스에서 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여준다.
도 15는 투여된 활성화가능한 항-Jagged 항체, 차폐된 항체, 또는 모 항체가 투여된 마우스의 체중 감량을 비교한 것이다. 모 항체 4D11을 투약한 동물이 유의한 체중 감량을 보인 반면, 활성화가능한 항-Jagged 항체를 투약한 동물은 유의한 체중 감량을 보이지 않았다.
마우스 흉선 기질 림포포이어틴(TSLP)의 혈청 농도는 본원에 기술된 대로 측정하였다. 마우스 TSLP의 혈청 농도는 개별 마우스에 대해서 각 투약 전 및 각 그룹의 최종 투약 후 10일에 정량하고 평균내어 도 16A에 나타내었다. 도 16B는 항-Jagged 항체 4D11 및 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11의 TSLP 혈청 농도의 시간 경과를 도시한 것이다. 혈청 마우스 TSLP는 활성화가능한 항-Jagged 항체를 투여한 군에서의 혈청 마우스 TSLP와 비교하여 비경구 항-Jagged 항체 4D11 그룹에서 상승하였다.
실시예 15 . 활성화가능한 항-Jagged 항체의 약동학 데이타
이 실시예는 각 항체를 투여한 마우스의 혈청에서 항-Jagged 모 항체 및 활성화가능한 항체의 약동력학을 비교한다.
항-Jagged 항체 4D11 또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11를 투여한 종양 미보유 암컷 Balb/c 누드 마우스에서의 단일 용량 약동력학을 평가하였다. 마우스는 표 17에 개략적으로 나타낸 바와 같이 투약하였다. 5마리 쥐 코호트를 0.5, 3, 8, 24, 72, 168, 및 240시간 회전으로 채혈하였다. 항-hFc 포획과 항-hIgG Fab'2 HRP 접합체를 사용한 후속 검출을 이용해 혈장 샘플을 hIgG 함량에 대해 분석하였다.
Figure pct00022
도 17은 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11(본원에서 5342-1204라고도 함) 또는 항-Jagged 항체 4D11의 복강내 투여 후 마우스 혈청에서 시간 경과에 따른 평균 인간 IgG 농도를 비교하였다. 정맥으로 항-Jagged 항체 4D11을 투여한 마우스는 동일한 항체를 복강내 투여한 마우스처럼 시간 경과에 따라 유사한 인간 IgG 농도를 보였다.
표 18은 7일 동안 예비적인 비구획화 분석 결과를 제공한다. 데이타는 Phoenix WinNonlin 버전 6.3, 드문 샘플링 모드를 이용해 분석하였다.
Figure pct00023
실시예 16 . 항-Jagged 차폐성 모이어티의 추가 성숙화
이 실시예는 본원의 추가적인 항-Jagged 차폐성 모이어티의 생산을 기술한다.
차폐성 모이어티 펩티드 패밀리 JS4896(본원에서 또한 MM 4896 또는 4896라고 함)를 더욱 친화성 성숙화하기 위해서, 상기 기술된 SR 라이브러리 스크리닝에 의한 서열을 사용하여 4종의 지정된 친화성 성숙화 라이브러리를 디자인하였다. PCR 국제 공개 특허 출원 WO 2009/014726에 기술된 바와 같이, eCPX 세포 디스플레이 라이브러리를 표 19에 도시한 뉴클레오티드 서열을 이용해 구축하였다. 각 라이브러리에 대한 최종 다양성은 대략 5 x 109 세포였다.
Figure pct00024
라이브러리 1517/1519 및 1518/1521
각 친화성 성숙화 라이브러리를 개별적으로 그러나 동일한 방식으로 스크리닝하였다. 초기 MACS 회차는 100X 보다 큰 라이브러리의 과샘플링을 제공하는 많은 세포를 이용해 수행하였다. 모든 표지화는 일정하게 부드럽게 교반하면서 4℃에서 수행하였다. 세포는 비오틴으로 표지된 25 nM Fab 4D11로 표지하였다. Fab에 결합된 세포는 스트렙타비딘-표지된 자성 비드(Dynabeads, Invitrogen)를 이용해 포획하였다. 비드를 이어서 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 광범위하게 세척하였다. 각 라이브러리로부터 대략 1 x 106 세포가 초기 MACS 회차에서 회수되었다.
모든 FACS 회차에 대한 박테리아 세포는 DyLight-488 표지된 항-Jagged Fab 4D11(즉, 항-Jagged IgG 항체 4D11의 Fab)로 표지하였다. 모든 FACS 회차에 대해서, 양성 세포의 최대밝기 0.1% 내지 0.2%를 분급하였다. FACS 1회차(F1) 및 FACS 2회차(F2)에 대한 세포를 각각 1 nM 및 100 pM Fab 4D11로 표지하였다. FACS 3회차 및 4회차의 경우, 세포를 500 ㎕ PBS에 현탁된 1 nM DyLight-표지된 항-Jagged Fab 4D11로 표지하고 37℃에서 5 내지 10분간 항온반응하였다. FACS 4회차에 분급된 클론을 서열분석하고 표 20 및 21에 그 결과를 나타내었다.
Figure pct00025
Figure pct00026
개별 클론은 Fab 결합에 대해 FACS를 통해 평가하였다. 예는 도 18에 나타내었다. 지정된 라이브러리(MM 5872, 5877, 5885, 및 5887) 유래의 차폐성 모이어티를 발현하는 클론은 SR 라이브러리 분급 유래의 MM 5342 발현 단일 클론 보다 양호하게 Fab 4D11에 결합하였다.
라이브러리 1559 및 1561
친화성 성숙화 라이브러리 1559 및 1561을 개별적으로 그러나 동일한 방식으로 스크리닝하였다. 초기 MACS 회차는 상기와 같지만 비오틴 표지된 50 nM Fab 4D11을 이용해 수행하였다. 각 라이브러리로부터 대략 1 x 106 세포를 초기 MACS 회차에서 회수하였다.
모든 FACS 회차에 대한 박테리아 세포는 DyLight-488 표지된 항-Jagged Fab 4D11로 표지하였다. 모든 FACS 회차의 경우, 양성 세포의 최대밝기 0.2%를 분급하였다. FACS 1회차(F1) 및 FACS 2회차(F2)에 대한 세포는 1 nM Fab 4D11로 표지하였다. FACS 3회차 및 4회차의 경우, 세포를 500 ㎕ FBS에 현탁된 1 nM DyLight-labeled 항-Jagged Fab 4D11로 표지하고 분급전에 37℃에서 5 내지 10분간 항온반응시켰다. FACS 4회차에서 분급된 클론을 서열분석하고 그 결과를 표 22 및 23에 나타내었다.
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 17. 추가의 활성화가능한 항-Jagged 항체
이 실시예는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 추가예를 기술한다.
본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체를 생산하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 방법을 이용해 본원의 항-Jagged 항체에 연결할 수 있는 CM 및 차폐성 모이어티 JS5894(본원에서 또한 MM 5894 또는 5894라고 함)를 포함하는 몇몇 폴리펩티드의 핵산 및 아미노산 서열을 이하에 제공한다.
Mask 5894는 또한 6-아미노산 N-말단 스페이서를 포함한다.
아미노산 서열
QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG(서열번호 180)
핵산 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATTGCCGCGGGTGGAATGGT(서열번호 179)
5894-1203
아미노산 서열
QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGS(서열번호 182)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGCCGTGGTCCAAGCTGGGTTGGCGGCGGTTCT(서열번호 181)
5894-1203-4D11 Lc
아미노산 서열
QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGTGRGPSWVGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 263)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTACTGGCCGTGGTCCAAGCTGGGTTGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 264)
5894-1204
아미노산 서열
QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNGGSSGGSGGSGGLSGRSDNHGGGS(서열번호 184)
뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCT(서열번호 183)
5894-1204-4D11 Lc
아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
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5894-1214
아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
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아미노산 서열
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5894-PLGL
아미노산 서열
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아미노산 서열
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아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
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아미노산 서열
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아미노산 서열
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아미노산 서열
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5894-panMMP
아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
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5894- panMMP -4D11 Lc
아미노산 서열
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차폐된 항체를 형성하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 방법을 이용해 항-Jagged 항체에 연결할 수 있는 비절단가능한 링커 및 차폐성 모이어티 JS 5894를 포함하는 폴리펩티드의 핵산 및 아미노산 서열을 이하에 제공한다:
5894-NSUB
아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
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5894-NSUB-4D11 Lc
아미노산 서열
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뉴클레오티드 서열
CAAGGCCAGTCTGGCCAGGGTCAGCAGCAGTGGTGCAATATTTGGATCAATGGTGGTGATTGCCGCGGGTGGAATGGTGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGCTCAGGTGGAGGCTCGGGCGGTGGGAGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(서열번호 279)
이러한 MM 및 CM 함유 폴리펩티드가 연결될 수 있는 항체의 예에는 항-Jagged 항체 4D11 또는 이의 변이체, 예컨대 상기 기술된 바와 같은 4D11 QΔH 변이체가 포함된다.
실시예 18. 활성화가능한 항-Jagged 항체의 동소 발생 영상화
본 실시예는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체의 활성화 및 결합의 동소발생 영상화 용도를 기술한다. 결과는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체를 조직이 발현하는 프로테아제에 의해 활성화할 수 있고 그 조직 상의 Jagged 표적에 결합할 수 있음을 보여준다.
활성화가능한 항체의 동소발생 영상화는 세포 및 조직에서 프로테아제 활성을 특징규명하는 고유한 접근법을 의미한다. 이러한 기술은 활성화가능한 항체를 절단할 수 있는 프로테아제를 발현하는 세포 및 조직의 조직학적 샘플에서 활성화가능한 항체 활성화 및 표적과의 결합을 검증할 수 있다. 이러한 동소발생 접근법의 개략도를 도 19에 나타내었다.
활성화된 항체체 의해 인식되는 표적과 공동 국재하는 부위에서 활성화가능한 항체를 절단할 수 있는 세포 또는 조직에 의한 활성화가능한 항-Jagged 항체의 활성화 및 결합의 동소발생 영상화(본원에서 또한 동소발생 영상화라함)는 다음과 같이 수행하였다: 동결 조직 섹선을 유리 슬라이드 상에 위치시켰다. 표지된 활성화가능한 항-Jagged 항체를 포함하는 용액(예를 들면 형광성 택으로 표지됨)을 조직 상에 도포하고 150 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 5 mM CaCl2 및 0.05% Tween 20을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)의 항온반응 완충액 중에 실온(약 22-24℃)에서 예를 들면 1시간 동안 항온반응시킨다. 활성화가능한 항체는 약 1 ㎍/mL 농도이다. 이어서 조직을 광범위하게 세척하여 미결합된 물질을 제거하고 검출가능한 표지를 측정하였다. 예를 들면, 형광성 택을 사용하는 경우, 조직은 형광 현미경에서 확인할 수 있다. 조직 상의 활성화된 항체의 검출은 조직이 활성화가능한 항체를 절단하는 프로테아제를 발현하고 또한 활성화된 항체가 결합하는 Jagged 표적을 발현함을 의미한다.
활성화되고 BxPC3 이종이식 종양 조직에 결합하는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 능력은 동소발생 영상화를 이용해 평가하였다. 활성화가능한 항체를 Alexa Fluor®680(Invitrogen)로 표지하여 표지된 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11-AF680 및 5342-PLGL-4D11-AF680를 만들고, 이들을 각각 본원에서 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680이라고 하였다. 또한, 표지된 항-Jagged 모 항체 4D11-AF680도 검사하였다. 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680 각각을 상기 기술된 바와 같이 동결된 BxPC3 이종이식 종양과 항온반응시켰다. 결과를 각각 도 20, 패널 A, B, 및 C에 나타내었다. 적색 형광성 조직 영상은 각각 Jagged에 대한 활성화가능한 항체의 조직 유도된 단백질가수분해 절단에 의해 활성화된 4D 11 항체 및 4D11 항체의 결합을 보여준다. 패널 D, E, 및F는 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(Catalog No. 539134, EMD Millipore) 및 50 mM EDTA의 1:100 희석물을 사전처리한 동결 BxPC3 이종이식 종양 조직과 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680의 항온반응 후 얻은 형광성 영상을 보여준다. 패널 E 및 F에서 감소된 적색 형광성은 패널 B 및 C에서 보여준 활성화가능한 항체 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680의 결합이 조직 유도된 프로테아제에 의한 활성화가능한 항체의 절단에 의해 실시되었음을 의미하고, 프로테아제 억제제 칵테일은 이러한 단백질가수분해를 억제하였다. 청색 염색은 DAPI 핵 염색을 의미한다. 동결 BxPC3 이종이식 종양 조직에 대한 항-Jagged 모 항체 4D11 또는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 결합은 이러한 조직을 미표지된 항-Jagged 모 항체 4D11로 사전저리하거나 또는 이러한 조직을 Jagged 1, Jagged 2, 또는 이의 조합으로 사전처리하여 억제하였다.
활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 활성화를 또한 인간 췌장암 조직의 동소발생 영상화를 통해 평가하였다. 각각의 4D11-AF680 4D11), 1204-4D11-AF680(1204) 및 PLGL-4D11-AF680(PLGL)을 췌장암을 갖는 인간 환자에서 단리한 동결 조직 샘플과 항온반응시켰다. 결과는 각각 도 21의 컬럼 1의 패널, 1, 2, 및 3열에 나타내었다. 컬럼 2, 3, 및 4의 각 패널은 10 ㎍/mL의 항체 A11(A11은 마트립타아제라고도 알려진 MT-SP1 프로테아제의 활성 부위에 특이적으로 결합하는 항체임)(도 21, 컬럼 2), 50 μM의 광범위 스펙트럼 MMP 억제제 갈라르딘(Calbiochem, Millipore)(도 21, 컬럼 3) 또는 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(Cat. No. 539134, EMD Millipore)의 1:100 희석물 및 50 μM 광범위 스펙트럼 MMP 억제제 갈라르딘(Calbiochem, Millipore)(도 21, 컬럼 4)로 사전처리한 동결 췌장암 환자 조직과 4D11-AF680, 1204-4D11-AF680 및 PLGL-4D11-AF680를 항온반응시킨 후 얻은 형광성 영상을 나타낸다. 청색 염색은 DAPI 핵 염색을 나타낸다. 결과는 췌장 조직 샘플이 활성 마트립타아제 및 메탈로프로테아제를 생산하고, 그 존재가 각각의 활성화가능한 항체 절단가능한 모이어티의 절단을 실시하여서, 차폐성 모이어티를 방출하고 활성화된 항체와 조직 상의 Jagged 표적의 안정한 결합이 가능케 함을 시사한다.
실시예 19. 항-Jagged 항체의 생체내 영상화
본 실시예는 본원에 기술된 항-Jagged 항체의 생체내 영상화를 기술한다.
항-Jagged 항체 4D11는 Alexa Fluor®750로 표지하고 40 kDa 써모 사이언티픽 제바 스핀 탈염 컬럼을 이용해 미접합 염료로부터 정제하였다. 종양 부피가 대략 400-600 ㎣인 BxPC3-luc 인간 췌장암 종양을 갖는 3마리의 마우스 그룹을 복강내(i.p.)로 단일 10-mg/kg 용량의 Alexa Fluor®750-표지된 4D11 항체(n=3)를 투여하였다. 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 Caliper IVIS SpectrumCT 영상화 시스템(Caliper, Perkin Elmer, Hopkinton MA)을 이용해 주사전 및 24h, 48h 및 72h에 750 mm 근적외선(NIR) 형광에 대해 영상화하였다. 마지막 영상화 시점 후 마우스를 안락사시켰다. 도 22A는 BxPC3 종양 이종이식 마우스 모델에서 주사 후 48시에 표지된 4D11 항체 형광 신호를 나타내는 도면을 제공한다.
생체내 영상화 데이타는 Living Image®4.1 소프트웨어를 이용해 정규화하고 분석하였다. 정량 비교를 위해서, 목적 영역(ROI)은 종양(T) 및 정상 조직(N)으로 표시하였다. 각 영역에 대해 평균 방사 효율(광자×㎝-2×s-1)로서 정량된 형광 신호를 측정하였다. 정상 조직 ROI(T/N)과 비교한 종양 ROI에서의 신호 비율을 계산하여 정상 조직 대비 종양에서 항-Jagged 항체 4D11 축적 속도 측정치를 제공하였다. 도 22B는 항체 4D11 투약 그룹에 대한 평균 방사 효율의 평균 T/N 비율 ± SD를 도시한 그래프를 제공한다.
실시예 20. 활성화가능한 항-Jagged 항체의 동소발생 영상화
본 실시예는 활성화가능한 항-Jagged 항체의 활성화 및 결합에 대해 췌장암 이종이식 종양 조직 및 인간 췌장암 조직을 스크리닝하기 위한 동소발생 영상화의 사용을 기술한다. 이 결과는 본원의 활성화가능한 항-Jagged 항체가 이러한 조직에 의해 발현되는 프로테아제에 의해 활성화되고 이러한 조직 상의 Jagged 표적과 결합함을 의미한다.
BxPC3 종양 샘플 및 인간 췌장암 조직 샘플을 각각 1 ㎍/mL 및 5 ㎍/mL의 표지된 항-Jagged 항체 4D11 및 항-마트립타아제 A11 항체로 동결 조직을 1시간 처리하여 Jagged 및 MT-SP1 발현을 프로파일링하였다. 결과를 각각 표 24의 컬럼 2 및 3에 나타내었다.
또한, 활성화되고 BxPC3 이종이식 및 인간 췌장암 조직에 결합하는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 및 5342-PLGL-4D11의 능력은 동소발생 영상화를 이용해 평가하였다. 활성화가능한 항체는 상기(실시예 18)에 기술된 바와 같이 Alexa Fluor®680(Invitrogen)로 표지하였다. 이들 활성화가능한 항체, 즉, 5342-1204-4D11-AF680(본원에서는 1204-4D11-AF680라고도 함) 및 5342-PLGL-4D11-AF680(또한 본원에서는 PLGL-4D11-AF680라고도 함)를 상기(실시예18)에 기술된 동소발생 영상화 프로토콜에 따라서 4명의 환자에서 단리한 인간 췌장암 조직 샘플 또는 동결된 BxPC3 이종이식 조직과 항온반응시켰다. 표 24는 활성화되고 활성화된 활성화가능한 항-Jagged 항체에 결합하는 췌장암 환자의 조직 샘플 및 BxPC3 종양의 능력을 확인해준 결과를 요약한다. 표 24에서, 조직 샘플에 결합하는 항-Jagged 항체 4D11 또는 항-마트립타아제 항체 A11의 양을 측정하는 IHC 염색은 0 내지 3+: 0, 무염색; 1+, 약한 염색; 2+, 중간 염색; 및 3+, 강한 염색으로 점수매겼다. 동소발생 영상화염색(컬럼 4 및 5) 점수화는 4D11 항체 염색과의 비교를 기초로 하며 다음과 같이 정의된다: 0, 무염색; 1+, 모 항체와 비교하여 약한 염색; 2+, 모항체와 비교하여 중간 염색; 및 3+, 모항체와 비교하여 유사한 염색. BxPC3 결과는 또한 도 20에 도시하였다.
표 24는 Jagged 및 MT-SP1 발현 스크리닝 및 BxPC3 이종이식 및 인간 췌장암 조직에서 활성화가능한 항-Jagged 항체의 동소발생 영상화에 관한 것이다.
Figure pct00029
실시예 21. 제제에 접합된 활성화가능한 항체의 시험관내 특징규명
이 실시예는 배양중인 BxPC3 세포의 증식을 억제하는 본원의 활성화가능한 항체-제제 접합체의 능력을 기술한다.
활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11, 항-Jagged 항체 4D11, 및 리툭산을 각각 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 합성 항-유사분열 튜블린 중합 억제제와 접합시켜서, 활성화가능한 항체-제제 접합체 5342-1204-4D11-MMAE 및 항체-제제 접합체 4D11-MMAE 및 리툭산-MMAE를 생성시켰다.
세포 배양되는 BxPC3 세포 증식을 억제하는 하기 화합물의 능력을 측정하였다: 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체 5342-1204-4D11-MMAE; uPA에 의해 활성화되는 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체 5342-1204-4D11-MMAE; 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11; uPA에 의해 활성화되는 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11; 항-Jagged 항체 4D11; 항-Jagged 항체-제제 접합체 4D11-MMAE; 리툭산; 및 리툭산-MMAE. 활성화가능한 항체 및 활성화가능한 항체-제제 접합체의 활성화는 Tris pH 8.5 중에서 활성 부위-적정 uPA(500 nM)로 37℃에서 밤새 분해하여 실시하였다. 활성화는 CE 분석(LabChip GXII)으로 측정하였다. uPA-활성화된 활성화가능한 항체 및 uPA-활성화된 활성화가능한 항체-제제 접합체는 단백질 A를 이용해 정제한 후 실험 전에 4℃에 보관하였다.
인간 췌장암 세포주 BxPC-3을 ATCC에서 입수하였다. BxPC-3 세포를 완전 배지(10% 소태아 혈청이 보충된 RPMI-1640)에 37℃에서 공기 중 5% CO2 대기에서 성장시켰다. BxPC-3 세포를 대수기 동안 회수하고 완전 배지에 재현탁시키고 96웰 백색 벽 침니 평판의 웰 당 5000 세포 밀도로 플레이팅하였다. 밤새 항온반응시킨 후, 각 화합물을 10 ㎍/mL에서 출발하여 0에서 종결하는, 10-지점 1:3 연속 희석물을 중복하여 배양중인 세포에 부가하였다. 세포를 3일간 배양하고 세포 생존능은 제조하의 프로토콜에 따라 CellTiterGlo(Promega) 및 광도계(Tecan)를 이용해 측정하였다. 데이타를 Prism GraphPad를 이용해 분석하였다. 결과를 도 24에 나타내었다.
실시예 22. 활성화가능한 항체-제제 접합체의 생체내 효능 및 안정성
이 실시예는 생체내에서 BxPC3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 본원의 활성화가능한 항체-제제 접합체의 능력을 기술한다.
활성화가능한 항-Jagged 항체 및 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체는 표 25에 기재한 화합물, 그룹, 및 용량을 이용하고, 상기 기술한 것과 유사한 방법을 이용해, BxPC3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 그 능력을 검사하였다.
Figure pct00030
초기 투약 후 일수 대비 종양 부피를 도시한 도 25는 항-Jagged 항체 4D11-MMAE 및 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11-MMAE 둘 모두가 그들의 미접합된 대응물에 비해 보다 효과적으로 BxPC-3 이종이식 종양을 억제함을 보여준다.
도 26은 다양한 그룹의 체중 감량을 도시한 도면이다. 항-Jagged 항체 4D11 또는 항-Jagged 항체-MMAE가 투약된 동물은 유의한 체중 감량을 보인 반면, 활성화가능한 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11 또는 활성화가능한 항-Jagged 항체-제제 접합체 5342-1204-4D11-MMAE가 투약된 동물은 유의한 체중 감량을 보이지 않았다.
실시예 23. BxPC3 종양 모델에서 젬시타빈과 조합한 항-Jagged 항체 및 활성화가능한 항체의 생체내 효능 및 안정성
항-Jagged 활성화가능한 항체는 표 26에 기재한 항체, 활성화가능한 항체, 그룹, 및 용량을 이용하고, 상기 기술된 바와 유사한 방법을 사용해, BxPC3 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 그 능력을 검사하였다.
Figure pct00031
종양 접종 후 일수 대비 종양 부피를 도시한 도 29는 젬시타빈과 조합한 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11이 BxPC-3 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여준다. 제1 용량은 30일에 투약되었다. 도 30은 젬시타빈 단독 그룹 및 젬시타빈과 조합하여 항체를 투여한 그릅에서의 체중 감량을 보여준다. 고용량의 항체 및 젬시타빈을 투약한 동물은 유의한 체중 감량을 보인 반면, 활성화가능한 항체 및 젬시타빈을 투약한 동물은 젬시타민 단독에 비해 체중 감량을 보이지 않았다. 20 mg/kg의 항체는 젬시타빈과 주어졌을때 견디지 못했고, 체중 감량으로 인해 49일에 그 그룹을 희생시켰다. 그러나, 젬시타빈과 조합된 20 mg/kg의 활성화가능한 항체는 견뎠고 젬시타빈과 조합한 6.7 및 20 mg/kg의 항체와 균등한 효능을 보였다. 마우스 흉선 기질 림포포이어틴(TSLP)의 혈청 농도는 상기 기술된 대로 측정하였다. 마우스 TSLP(mTSLP)의 혈청 농도는 제2 투약 전에 개별 마우스에 대해 정량하였다. 젬시타빈과 조합된 오직 20 mg/kg 항체 그룹만 도 31에 도시한 바와 같이, 높은 혈청 mTSLP를 보였다.
실시예 24. 전립선 및 유선 종양 모델에서 항-Jagged 항체의 생체내 효능
항-Jagged 4D11 항체의 효능을 전립선 및 유선 암에 대한 자생 종양 모델에서 평가하였다. 생성된 조양은 구별되는 종양 진행기를 겪고, 중요하게, 면역능력이 있는 마우스를 이용하므로 이들 모델은 인간 상태를 모방한다.
전립선암 모델. TRAMPS 마우스 라인은 전립선암 모델로 광범위하게 사용된다(Greenberg NM et al, 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3439-3443). 초기 병소는 전립선 상피내 과형성증(PIN)이고 약 12주령에 충분히 분화된 선암종으로 진행하였다. 약하게 분화된 선암종이 24주령 TRAMP 동물에서 발생하였다. 18-24주령에, TRAMP 마우스를 각 6마리씩 2개 그룹, 대조군 및 치료군으로 나누었다. 항-Jagged 항체 4D11 및 IVIg 대조 분취액 각각을 개별 그룹에 20 mg/Kg으로, q7DX5로 IP 투약하였다. 최종 투약 후 7일에 동물을 희생시키고, 종양 존재량을 비뇨생식관의 무게로 측정하고 대조군 야생형 C57/Bl6 마우스와 비교하였다. 도 32는 항-Jagged 항체 4D11이 TRAMP 마우스내 전립선 종양의 성장을 제한하는데 효과적임을 보여준다.
유방암 모델. HER2/neu 형질전환주는 20주령의 출산경험있는 암컷에서 유선 종양을 발병시켰고 25주령에 100%는 폐전이가 존재하였다(Siegel PM et al., 1999, The EMBO Journal 18, 2149-2164). 유방암에 대한 요법을 검사하는 실험을 위해, HER2/neu 숫컷 마우스를 FVB 야생형 암컷과 교배하고 그들 자손을 유전자분석하여 HER2/neu 암컷을 선별하였다. 20주령에 HER2/neu 암컷을 대조 및 치료의 2개 그룹으로 분리하였다. 항-Jagged 항체 4D11 및 IVIg 대조군 분취액 각각을 20 mg/Kg에 q7DX5로, IP 투약하였다. 도 33은 항-Jagged 항체 4D11이 Her2/neu 형질전환 마우스에서 자발적 종양의 성장을 강력하게 억제함을 보여준다.
실시예 25. 2차 항체를 통해 검출하는 표지 또는 미표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체의 동소발생 영상화
본 실시예는 표지되거나 또는 표지되지 않은 항-Jagged 활성화가능한 항체의 동소발생 영상화의 사용을 기술하고, 여기서 절단 및 결합은 활성화가능한 항체의 AB 부분에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 이용해 검출하였다. 결과는 비표지된 활성화가능한 항체의 활성화 및 결합을 평가하는 능력을 보여준다.
TRAMP 전립선암 종양 조직 상에서 Alexa680-표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 활성화 및 결합의 동소발생 영상화를 다음과 같이 수행하였다: 동결 조직 섹션을 유리 슬라이드 상에 위치시켰다. Alexa680-표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체를 함유하는 용액을 조직에 도포하고 예를 들면 150 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 5 mM CaCl2 및 0.05% Tween 20를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)의 항온반응 완충액 중에 실온(약 22-24℃)에서 1시간 동안 항온반응시켰다; 활성화가능한 항체는 약 4 ㎍/mL 농도이다. 이러한 항온반응 조건은 예를 들면 용액의 pH(예를 들면, 약 pH 7 내지 약 pH 8.5 범위), 항온반응 온도(예를 들면, 약 20℃ 내지 약 40℃, 예를 들면 실온 또는 37℃), 항온반응 시간(예를 들면, 약 15분 내지 약 150분 범위), 및/또는 활성화가능한 항체 농도(예를 들면, 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL 범위)을 변화시켜, 조직 섹션 내 절단제에 전도적이게 조정할 수 있다. 조직을 이어 광범위하게 세척하여 미결합 물질을 제거한다. 조직 상에 활성화된 항체의 존재는 680 nm 및 AlexaFluor 488로 표지된 2차 항-인간 IgG 항체를 이용해 검출하였다. 이러한 검출 조건은 검출 시약 및 검출 양상(예를 들면, 형광 표지)에 맞출 수 있다. 예를 들면, 형광성 택이 사용되는 경우, 조직은 형광 현미경에서 확인한다. 도 34에 도시된 바와 같이, 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11는 Alexa 680(항-Jagged 활성화가능한 항체의 표지) 및 FITC 채널(항-인간 IgG 항체의 표지) 둘 모두에서 동일한 염색은 비표지된 활성화가능한 항체 및 활성화가능한 항체에 특이적으로 결합하는 2차 시약, 예컨대 표지된 항체를 이용해 동소발생 영상화를 수행하는 것이 가능함을 의미한다. 양쪽 채널에서 보여지는 형광 신호는 도 34의 하단 열에 도시된 바와 같이, 광범위 스펙트럼 억제제 칵테일 세트 III(BSPI)(539134, EMD Millipore, Billerica, MA) 및 50 μM의 광범위 스펙트럼 MMP 억제제 갈라르딘(Calbiochem, Millipore)의 1:100 희석물로 조직을 사전 처리하여 억제하였다.
실시예 26. 미표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체의 동소발생 영상화
본 실시예는 미표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체의 동소발생 영상화 이용을 기술한다. 절단 및 결합은 활성화가능한 항체의 AB 부분에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 이용해 검출하였다.
TRAMP 전립선암 조양 상에서 미표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 활성화 및 결합의 동소발생 영상화는 다음과 같이 수행하였다: 동결 조직 섹션을 유리 슬라이드 상에 위치시킨다. 미표지된 항-Jagged 활성화가능한 항체를 함유하는 용액을 조직 상에 도포하고 예를 들면, 150 mM NaCl, 100 μM ZnCl2, 5 mM CaCl2 및 0.05% Tween 20을 함유하는 50 mM Tri-HCl 완충액(pH 7.4)의 항온반응 완충액 중 실온(약 22-24℃)에서 1시간 동안 항온반응시킨다; 활성화가능한 항체의 농도는 약 4 ㎍/mL이다. 이러한 항온반응 조건은 예를 들면, 용액의 pH(예를 들면, 약 pH 7 내지 약 pH 8.5 범위), 항온반응 온도(예를 들면, 약 20℃ 내지 약 40℃의 범위, 예를 들면 실온 또는 37℃), 항온반응 시간(예를 들면, 약 15분 내지 약 150분 범위), 및/또는 활성화가능한 항체 농도(예를 들면, 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL 범위)를 변화시켜 조직 섹션 중 절단제에 대해 전도성이게 조절할 수 있다. 조직을 이어 광범위하게 세척하여 미결합 물질을 제거한다. 조직 상에 활성화된 항체의 존재는 AlexaFluor 488로 표지된 2차 항-인간 IgG 항체를 이용해 검출하였다. 이러한 검출 조건은 검출 시약 및 검출 양식(예를 들면, 형광 표지)에 대해 조정할 수 있다. 예를 들면, 형광성 택을 사용하는 경우, 조직은 형광 현미경으로 확인한다. 도 35에 도시한 바와 같이, 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11은 모 항-Jagged 항체(각각 컬럼 2 및 1)와 비슷한 강도 및 패턴으로 염색됨을 보여준다. 도 35의 컬럼 3에 도시된 바와 같이, 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 형광 신호는 광범위 스펙트럼 억제제 칵테일 세트 III(BSPI)(539134, EMD Millipore, Billerica, MA) 및 50 μM의 광범위 스펙트럼 MMP 억제제 갈라르딘(Calbiochem, Millipore)의 1:100 희석물로 조직을 사전 처리하여 억제되었다. 데이타는 비표지(즉, 표지되지 않은) 활성화가능한 항체 및 검출가능한 표지를 포함하고 활성화가능한 항체의 AB에 특이적으로 결합하는 2차 시약을 이용한 동소발생 영상화의 실현가능성을 보여주었다.
인간 삼중-음성 유방암(TNBC) 및 췌장암 조직 샘플을 동소발생 영상화를 이용하여 활성화되고 인간 종양에 결합하는 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 능력을 프로파일링하였다. 활성화가능한 항체를 상기 기술된대로 Alexa Fluor®680(Invitrogen)으로 표지하였다. 얻어진 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11-AF680을 본원에 기술된 동소발생 영상화 프로토콜에 따라서 동결 환자 조직 샘플과 항온반응시켰다. 활성화되고 항-Jagged 활성화가능한 항체에 결합하는 TNBC 및 췌장암 환자의 능력에 대한 결과는 표 27 및 표 28에 요약하였다. 조직 샘플에 대한 항-Jagged(4D11) 항체 결합 양을 측정하는 IHC 염색은 - 내지 3+: -, 무염색; 1+(즉, "+"), 약한 염색; 2+(즉, "++"), 중간 염색; 및 3+(즉, "+++"), 강한 염색으로 점수매겼다. 항-Jagged 활성화가능한 항체 염색의 동소발생 영상화는 항-Jagged 항체 염색과 비교를 기초로 정량하였다. 표 27은 4D11 결합에 의해 검출된 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 발현도 및 활성화되고 항-EGFR 활성화가능한 항체가 결합하는 삼중-음성 유방암(TNBC)의 능력을 보여준다. 표 28은 4D11 결합에 의해 검출된 Jagged 1 및/또는 Jagged 2의 발현도 및 활성화되고 항-EGFR 활성화가능한 항체에 결합하는 췌장암 조직의 능력을 보여준다.
표 27은 항-Jagged 항체 4D11를 이용한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 발현에 대한 스크리닝 및 TNBC 암 환자의 종양 조직 내에서 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 동소발생 영상화 결과이다.
Figure pct00032
표 28은 항-Jagged 항체 4D11를 이용한 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 발현에 대한 스크리닝 및 췌장암 환자의 종양 조직에서 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11의 동소발생 영상화 결과를 보여준다.
Figure pct00033
실시예 27. 항-Jagged 활성화가능한 항체의 프로테아제 화성화 및 결합
이 실시예는 시험관내에서 활성화되는 항-Jagged 항체 5342-1204-4D11의 능력을 검증하였다.
항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11는 각각 58,5 μM 및 570 nM의 최종 농도에서 PBS 중에서 활성화가능한 항체 및 활성 부위 적정된 MT-SP1을 배합하여 활성화되었다. 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 항온반응시켰다. 단백질 A 정제 전에, 분취액을 불리하여 SDS-PAGE를 통해 분석하여 5342-1204-4D11의 단백질가수분해적 분해가 완전하게 수행되었음을 확인하였다.
MT-SP1 및 절단된 차폐성 모이어티를 제거하기 위해서, 활성화된 5342-1204-4D11을 표준 단백질 A 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. 간략하게, 1 mL Hi-Trap 단백질 A 컬럼(GE Healthcare life sciences)을 PBS로 평형화시켰다. 분해된 단백질을 컬럼에 결합시키고 광범위하게 PBS로 세척하였다. 결합된 단백질을 1 M 글리신, pH 3.0으로 용리하고 0.1 M Tris, pH 8.0으로 중화시키고, 이어서 밤새 PBS에서 투석하였다.
재조합 인간 1-Fc에 대한 항-Jagged 항체 4D11, 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11, 및 항-Jagged 활성화된 항체 5342-1204-4D11의 결합은 효소-연결 면역흡착 어세이(ELISA)로 측정하였다. 간략하게, 재조합 hJag1-Fc(R&D Systems)를 HANKS 완충액 중 1 ㎍/mL의 농도로 96웰 ELISA 평판의 웰에 밤새 4℃에서 흡착시켰다. 모든 후속 단계는 실온에서 수행하였다. 평판을 HANKS, 0.05% Tween, 4.0% 탈지 건조유로 1시간 동안 차단하였다. 4D11 항체 및 활성화된 항체 5342-1204-4D11를 평판에 100, 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1, 및 0.03 nM로 부가하고 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11를 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 nM 및 로 평판에 부가하고 1시간 동안 항온반응시켰다. 모든 측정은 삼중으로 수행하였다. 평판을 5x로 HANKS, 0.05% Tween을 사용해 세척하고 항-인간 FAB-염소-HRP 1차 항체(Sigma)를 HANKS, 0.05% Tween, 4.0% 탈지 건조유 중 1:5000의 농도로 평판에 부가하고 1시간 동안 항온반응 시키고, 이전처럼 5x 세척하고 1-STEP-TMB1 ELISA 용액(Thermo Scientific)으로 현상하였다. TECAN 평판 리더를 이용해 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 도 36은 Jagged 1에 결합하는 활성화된 항체 5342-1204-4D11의 능력이 Jagged 1에 결합하는 4D11 항체와 구별되지 않음을 보여준다.
실시예 28. H292 종양 모델에서 항-Jagged 활성화가능한 항체의 생체내 효능 및 안정성
항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11는 하기 방법을 이용해 H292 이종이식 종양의 성장을 감소시키는 능력에 대해 검사하였다. 6-8주령 암컷 nu/nu 마우스는 마트리겔과 무혈청 배지(1:1) 중 5x106 H292 세포를 피하 이식하였다. 평균 종양 크기가 150 내지 200 ㎣에 도달했을때 표적 범위(∼100 내지 250 ㎣)내 종양을 갖는 48 내지 60마리 마우스를 동일한 평균 종양 부피의 그룹(n=8-10/그룹)으로 임의추출할때까지 종양을 이틀에 한번씩 측정하였다. 동물들은 하기 표 29에 열거한 용량을 사용해 처리하였다.
Figure pct00034
종양 부피를 보여주는 도 37은 항-Jagged 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11가 H292 이종이식 종양의 성장을 억제함을 보여준다. 마우스 흉선 기질 림포포이어틴(TSLP)의 혈청 농도는 상기 기술된 대로 측정하였다. 마우스 TSLP(mTSLP)의 혈청 농도는 희생시 개별 마우스에 대해 정량하였고, 결과는 도 38에 도시하였다. 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11는 TSLP의 상승을 보이지 않은 반면 6.7 및 20 mg/kg 항체의 동물은 IVIg 처리군과 비교하여 높은 TSLP를 나타냈다.
희생시, 피부는 20 mg/kg의 IVIg, 항체 4D11, 또는 활성화가능한 항체 5342-1204-4D11로 처리한 동물의 복부로부터 채취하였다. 이 피부를 포르말린 고정하고, 파라핀에 삽입하여 H&E 염색하였다. 도 39에 도시한 바와 같이, 항체 처리군에서 과각화증이 관찰되었지만, 활성화가능한 항체-처리군은 과각화증이 제한되거나 또는 보이지 않았다. 화살표는 상당한 과각화증을 보여주는 모공을 가리킨다.
다른 실시양태
본 발명을 구체적인 내용과 관련하여 기술하였지만, 전술한 내용은 예시를 위한 것이며 첨부된 청구항의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 다른 측면, 장저, 및 변형은 이하 청구항의 범주에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> CytomX Therapeutics, Inc. <120> Anti-Jagged 1/Jagged 2 Cross-Reactive Antibodies, Activatable Anti-Jagged Antibodies and Methods of Use Thereof <130> 42652-519001WO <140> PCT/US2013/047109 <141> 2013-06-21 <150> US 61/663,307 <151> 2012-06-22 <150> US 61/749,212 <151> 2013-01-04 <150> US 61/749,486 <151> 2013-01-07 <150> US 61/755,810 <151> 2013-01-23 <160> 279 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaggg ctggagtggg tctcagcgat tgcggagctg ggtgcgctta catagtacgc 180 agactccgtg aagggccggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct 240 gcaaatgaac agctagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga gctcatacta 300 gttttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga ggcggttcag 360 gcggaggtgg cagcggcggg ggggtcgacg gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 480 agctatttaa attggtatca gcagaaccgg gaaagcccct aagctcctga tctataaggc 540 atccactttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt 600 cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga aatttgcaac ttactactgt caacaggcta 660 tggatcagcc tcctacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 710 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ala Glu Leu Gly Ala Leu Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala His Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 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tcgatgcgtg 300 gttttgacaa ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga ggcggttcag 360 gcggaggtgg cagcggcggg ggggtcgacg gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 480 agctatttaa attggtatca gcagaaccgg gaaagcccct aagctcctga tctatcgggc 540 atcctctttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt 600 cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga aatttgcaac ttactactgt caacaggatg 660 cgactggtcc tgcgacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 710 <210> 4 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ala Ala Gly Lys His Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 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ggtccgacta cactgtacgc 180 agactccgtg aagggcaggt tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct 240 gcaaatgaac agctagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa acgtctagtg 300 cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga ggcggttcag 360 gcggaggtgg cagcggcggg ggggtcgacg gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc 480 agctatttaa attggtatca gcagaaccgg gaaagcccct aagctcctga tctatcatgc 540 atcctcgttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt 600 cactctcacc atcggcagtc tgcaacctga aatttgcaac ttactactgt caacagaatg 660 ttgctactcc tctgacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg 710 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Thr Gln Gly Pro Thr 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Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 186 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser <210> 187 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 187 caaggccagt ctggccaggg tcagcagcag tggtgcaata tttggatcaa tggtggtgat 60 tgccgcgggt ggaatggtgg ctcgagcggt ggcagcggtg gctctggtgg ctcaggtgga 120 ggctcgccac tgggcctggg cggttct 147 <210> 188 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 188 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Gly Gly 35 40 45 Ser <210> 189 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 189 caaggccagt ctggccaggg 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gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 540 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 600 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 267 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 267 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 50 55 60 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 85 90 95 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Ser 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cccagtctcc atcctccctg 180 tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 240 tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgcggca 300 tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 360 actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagacg 420 gttgtggcgc ctccgttatt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg tacggtggct 480 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 540 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 600 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 269 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 269 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Gly Gly 35 40 45 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 50 55 60 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 85 90 95 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 115 120 125 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Val Ala Pro 130 135 140 Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 195 200 205 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 210 215 220 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 225 230 235 240 Tyr Ala Cys Glu Val Thr 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actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 271 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 271 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Phe Ser Leu Pro Ala Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 50 55 60 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 85 90 95 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 115 120 125 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Val Ala Pro 130 135 140 Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 195 200 205 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 210 215 220 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 225 230 235 240 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 245 250 255 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 <210> 272 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 272 caaggccagt ctggccaggg tcagcagcag tggtgcaata tttggatcaa tggtggtgat 60 tgccgcgggt ggaatggtgg ctcgagcggt ggcagcggtg gctctggtgg ctcagctggc 120 ttctccctcc ccgcaggtgg cggttctgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 180 tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 240 tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgcggca 300 tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 360 actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagacg 420 gttgtggcgc ctccgttatt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg tacggtggct 480 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 540 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 600 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 273 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 273 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Gln Arg Arg Gly Gly 35 40 45 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 50 55 60 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 85 90 95 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 115 120 125 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Val Ala Pro 130 135 140 Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 195 200 205 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 210 215 220 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 225 230 235 240 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 245 250 255 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 <210> 274 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 274 caaggccagt ctggccaggg tcagcagcag tggtgcaata tttggatcaa tggtggtgat 60 tgccgcgggt ggaatggtgg ctcgagcggt ggcagcggtg gctctggtag cctggcacct 120 ctgggtctgc aacgccgtgg cggttctgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 180 tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 240 tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgcggca 300 tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 360 actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagacg 420 gttgtggcgc ctccgttatt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg tacggtggct 480 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 540 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 600 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 275 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 275 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp 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aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789 <210> 277 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 277 000 <210> 278 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 278 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 50 55 60 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 85 90 95 Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 115 120 125 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Val Val Ala Pro 130 135 140 Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 165 170 175 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 180 185 190 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 195 200 205 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 210 215 220 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 225 230 235 240 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 245 250 255 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 260 <210> 279 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 279 caaggccagt ctggccaggg tcagcagcag tggtgcaata tttggatcaa tggtggtgat 60 tgccgcgggt ggaatggtgg ctcgagcggt ggcagcggtg gctctggtgg ctcaggtgga 120 ggctcgggcg gtgggagcgg cggttctgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 180 tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 240 tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgcggca 300 tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 360 actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagacg 420 gttgtggcgc ctccgttatt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg tacggtggct 480 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 540 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 600 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 660 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 720 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 780 ggagagtgt 789

Claims (48)

  1. Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 단리된 완전한 인간 단일클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체는 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체는 표 2에 열거된 조합에서 선택되는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함하는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서, 항체는 표 4에 열거된 조합으로부터의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 항체는 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하고, Jagged 1 또는 Jagged 2 중 1 이상이 Notch 수용체에 결합하는 것을 방해하는 것인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG 이소타입인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체는 IgG1 이소타입인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항체에 접합되는 제제를 포함하는 항체.
  9. 제8항에 있어서, 제제는 치료제, 항종양제, 톡신 또는 이의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제인 항체.
  10. 제8항에 있어서, 제제는 링커를 통해 항체에 접합되는 것인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 담체를 포함하는 약학 조성물.
  13. 활성화 상태에서 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 활성화가능한 항체로서,
    Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB);
    활성화가능한 항체가 미절단 상태일때 Jagged 1 및 Jagged 2와 AB의 결합을 억제하는 차폐성 모이어티(masking moiety)(MM); 및
    AB에 결합된 절단가능한 모이어티(CM)로서, 이때 CM은 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 폴리펩티드인 절단가능한 모이어티
    를 포함하는 활성화가능한 항체.
  14. 제13항에 있어서, MM은 AB와의 결합에 대한 평형 해리 상수가 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 평형 해리 상수보다 큰 것인 활성화가능한 항체.
  15. 제13항에 있어서, MM은 활성화가능한 항체가 절단 상태일때 Jagged 1 및 Jagged 2와의 결합에 대해 AB를 방해하지 않거나 또는 AB와 경쟁하지 않는 것인 활성화가능한 항체.
  16. 제13항에 있어서, 프로테아제는 조직에서 Jagged 1 및/또는 Jagged 2와 공동국재하고, 이때 프로테아제는 활성화가능한 항체가 프로테아제에 노출된 경우 활성화가능한 항체에서 CM을 절단하는 것인 활성화가능한 항체.
  17. 제13항에 있어서, 미절단 상태의 활성화가능한 항체는 N-말단에서 C-말단으로 다음과 같은 구조적 배열을 갖는 것인 활성화가능한 항체: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM.
  18. 제13항에 있어서, 활성화가능한 항체는 MM과 CM 사이에 연결 펩티드를 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  19. 제13항에 있어서, 활성화가능한 항체는 CM과 AB 사이에 연결 펩티드를 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  20. 제13항에 있어서, 활성화가능한 항체는 제1 연결 펩티드(LP1) 및 제2 연결 펩티드(LP2)를 포함하고, 여기서 활성화가능한 항체는 미절단 상태일 경우 N-말단에서 C-말단으로 MM-LP1-CM-LP2-AB 또는 AB-LP2-CM-LP1-MM과 같은 구조적 배열을 갖는 것인 활성화가능한 항체.
  21. 제20항에 있어서, 2종의 연결 펩티드는 서로 동일할 필요가 없는 것인 활성화가능한 항체.
  22. 제20항에 있어서, LP1 및 LP2는 각각이 약 1 내지 20개 아미노산 길이의 펩티드인 활성화가능한 항체.
  23. 제13항에 있어서, MM은 약 2 내지 40개 아미노산 길이의 폴리펩티드인 활성화가능한 항체.
  24. 제13항에 있어서, MM 폴리펩티드 서열은 Jagged 1 및 Jagged 2의 서열과 상이하고, MM 폴리펩티드 서열은 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 동일성이 50%가 넘지 않는 것인 활성화가능한 항체.
  25. 제13항에 있어서, CM은 15개 이하의 아미노산 길이의 폴리펩티드인 활성화가능한 항체.
  26. 제13항에 있어서, 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scab, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 활성화가능한 항체.
  27. 제13항에 있어서, CM은 uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13 및 MMP-14로 이루어진 군에서 선택된 효소에 대한 기질인 활성화가능한 항체.
  28. 제13항에 있어서, AB에 접합된 제제를 포함하는 활성화가능한 항체.
  29. 제28항에 있어서, 제제는 치료제, 항종양제, 톡신 또는 이의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제인 활성화가능한 항체.
  30. 제28항에 있어서, 제제는 링커를 통해 AB에 접합되는 것인 활성화가능한 항체.
  31. 제30항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 활성화가능한 항체.
  32. 제13항에 있어서, MM은 표 9, 표 11, 표 12, 표 13, 표 14, 표 19, 표 20, 표 21, 표 22 또는 표 23에 열거된 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  33. 제13항에 있어서, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 200)을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 208)을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 209)을 포함하는 VH CDR3 서열; 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 210)을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 211)을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 212)을 포함하는 VL CDR3 서열을 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  34. 제13항에 있어서, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 열거된 조합에서 선택되는 VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열 및 VL CDR3 서열의 조합을 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  35. 제13항에 있어서, Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 4에 열거된 조합으로부터의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 조합을 포함하는 것인 활성화가능한 항체.
  36. 제13항에 있어서, 서열번호 74, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194 및 196으로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 76 및 148로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 활성화가능한 항체.
  37. 제1항의 항체 또는 제13항의 활성화가능한 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  38. 제37항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  39. 항체 또는 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 세포를 배양하여 항체 또는 활성화가능한 항체를 생산하는 방법으로서, 여기서 세포는 제37항의 핵산 분자를 포함하는 것인 생산 방법.
  40. 활성화 상태에서 Jagged 1 및 Jagged 2에 결합하는 활성화가능한 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 활성화가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 활성화가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성체를 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 여기서 활성화가능한 항체는 차폐성 모이어티(MM), 절단가능한 모이어티(CM), 및 Jagged 1 및 Jagged 2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(AB)을 포함하는 것인 단계, 및
    (b) 활성화가능한 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, CM은 프로테아제에 대한 기질로 기능하는 폴리펩티드인 제조 방법.
  42. 제40항에 있어서, CM은 미절단 상태에서, MM이 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합을 방해하고, 절단 상태에서 MM은 Jagged 1 및 Jagged 2에 대한 AB의 특이적 결합을 방해 또는 경쟁하지 않도록 활성화가능한 항체에 위치되는 것인 제조 방법.
  43. 피험체에서 암과 연관된 임상 징후의 증상을 완화시키는 방법으로서, 이를 필요로하는 피험체에게 암과 연관된 임상 징후의 증상을 완화시키기에 충분한 양으로 제1항의 항체 또는 제13항의 활성화가능한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 완화 방법.
  44. 혈관신생을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로하는 피험체에게 혈관신생을 감소시키기에 충분한 양으로 제1항의 항체 또는 제13항의 활성화가능한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 감소 방법.
  45. Jagged 1 및/또는 Jagged 2 신호전달을 감소시키는 방법으로서, 이를 필요로하는 피험체에게 Jagged 1 및/또는 Jagged 2 신호전달을 감소시키기에 충분한 양으로 제1항의 항체 또는 제13항의 활성화가능한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 감소 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 인간인 방법.
  47. 섬유성 질병 증상을 완화시키는 방법으로서, 이를 필요로하는 피험체에게 피험체의 섬유성 질병 증상을 완화시키기에 충분한 양으로 제1항의 항체 또는 제13항의 활성화가능한 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 완화 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 피험체는 인간인 완화 방법.
KR1020157001567A 2012-06-22 2013-06-21 항-jagged 1/jagged 2 교차-반응성 항체, 활성화가능한 항-jagged 항체 및 이의 제조 방법 KR20150037857A (ko)

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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012319150B2 (en) 2011-10-05 2017-08-17 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using Notch2 antagonists
GB201203442D0 (en) 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
RU2018130986A (ru) 2012-08-13 2018-10-09 Дженентек, Инк. Антитела к jagged и способы их применения
CN112162094A (zh) 2013-01-04 2021-01-01 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法
US10350216B2 (en) * 2013-01-14 2019-07-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating, preventing and diagnosing leukemia and other blood diseases and disorders
GB201300706D0 (en) * 2013-01-15 2013-02-27 Cancer Rec Tech Ltd Antibody
EP2970476A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
AU2014274215B2 (en) 2013-05-28 2019-02-28 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
CA2913732A1 (en) 2013-06-04 2014-12-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions and methods for conjugating activatable antibodies
WO2015013671A1 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
US20150087810A1 (en) * 2013-09-25 2015-03-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix Metalloproteinase Substrates And Other Cleavable Moieties And Methods Of Use Thereof
DK3628328T3 (da) * 2014-01-31 2022-12-05 Cytomx Therapeutics Inc Matriptase- og u-plasminogen-aktivatorsubstrater og andre spaltelige dele og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA2936565C (en) * 2014-02-12 2020-08-11 Genentech, Inc. Anti-jagged1 antibodies and methods of use
MX368664B (es) 2014-04-29 2019-10-10 Novartis Ag Células novedosas de vertebrados y métodos para la expresión recombinante de un polipéptido de interés.
JP2017526641A (ja) 2014-07-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ経路阻害
EP3172235A2 (en) 2014-07-25 2017-05-31 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
GB2532619A (en) * 2014-08-08 2016-05-25 Alexo Therapeutics Int Sirp-Alpha Variant Constructs And Uses Thereof
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
JP6730705B2 (ja) * 2015-02-12 2020-07-29 国立大学法人岩手大学 哺乳動物細胞に対する外来遺伝子の導入効率の向上剤
MA41613A (fr) * 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
EP3292149B1 (en) * 2015-05-04 2021-12-01 CytomX Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof
CN113603784A (zh) 2015-05-29 2021-11-05 艾吉纳斯公司 抗-ctla-4抗体及其使用方法
EP3310811B1 (en) 2015-06-16 2021-06-16 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
BR102016018074A2 (pt) * 2015-08-07 2021-11-16 ALX Oncology Inc. Construção variante de sirp-alfa, seu método de preparação e seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, e composição farmacêutica
SG10201912905VA (en) 2015-08-07 2020-02-27 Alx Oncology Inc Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
CN106519037B (zh) * 2015-09-11 2019-07-23 科济生物医药（上海）有限公司 可活化的嵌合受体
CA3002674A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
MA43134A (fr) 2015-10-30 2018-09-05 Aleta Biotherapeutics Inc Compositions et méthodes de transduction tumorale
ES2873846T3 (es) 2015-11-19 2021-11-04 Revitope Ltd Complementación de fragmento de anticuerpo funcional para un sistema de dos componentes para eliminación redirigida de células no deseadas
KR102493894B1 (ko) 2016-02-29 2023-01-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 tmprss 유전자를 갖는 설치류
JP7039582B2 (ja) 2016-11-03 2022-03-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 活性化可能な抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
TWI797097B (zh) 2016-11-28 2023-04-01 日商中外製藥股份有限公司 包含抗原結合域與運送部分的多胜肽
JP7106538B2 (ja) 2016-12-07 2022-07-26 アジェナス インコーポレイテッド 抗体およびその使用方法
MD3551660T2 (ro) 2016-12-07 2024-03-31 Agenus Inc Anticorpi anti-CTLA-4 și procedee de utilizare a acestora
MX2019006624A (es) 2016-12-09 2019-08-01 Seattle Genetics Inc Anticuerpos bivalentes enmascarados por helices superenrolladas.
JOP20190259A1 (ar) * 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1
CN111278461A (zh) 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
IL302614A (en) 2017-09-08 2023-07-01 Maverick Therapeutics Inc Binding proteins are activated under limited conditions
WO2019075187A1 (en) * 2017-10-12 2019-04-18 The Trustees Of Princeton University METHODS OF TREATING OR PREVENTING BREAST CANCER METASTASES USING ANTIBODIES AGAINST JAGGED1 AND CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS
TW201927816A (zh) 2017-10-14 2019-07-16 美商Ｃｙｔｏｍｘ生物製藥公司 抗體、可活化之抗體、雙特異性抗體、和雙特異性可活化之抗體、及其使用方法
WO2019148445A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
US11866498B2 (en) 2018-02-08 2024-01-09 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
US20200405890A1 (en) * 2018-02-21 2020-12-31 Cytomx Therapeutics, Inc. Positron emission tomography imaging of activatable binding polypeptides and related compositions thereof
WO2019183218A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Systems and methods for quantitative pharmacological modeling of activatable antibody species in mammalian subjects
EP3794022A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
SG11202011349PA (en) 2018-05-14 2020-12-30 Werewolf Therapeutics Inc Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
JP7412409B2 (ja) 2018-07-31 2024-01-12 アムジェン インコーポレイテッド マスクされた抗体の医薬製剤
CN114390938A (zh) 2019-03-05 2022-04-22 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
WO2020186090A2 (en) * 2019-03-12 2020-09-17 The Regents Of The University Of California Activatable specific binding member complexes, and methods of making and using same
CA3137512A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
AU2020282791A1 (en) 2019-05-31 2021-12-09 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer with SIRP alpha Fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor
US20220251206A1 (en) 2019-06-11 2022-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
AU2020403145A1 (en) 2019-12-13 2022-07-07 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
US20210317188A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions containing activatable antibodies
US20230174995A1 (en) 2021-10-15 2023-06-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
US11958906B2 (en) 2022-04-13 2024-04-16 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of mosunetuzumab and methods of use

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US6004924A (en) 1991-12-11 1999-12-21 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Protein sequences of serrate gene products
US5869282A (en) 1991-12-11 1999-02-09 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6025130A (en) 1996-04-04 2000-02-15 Mercator Genetics, Inc. Hereditary hemochromatosis gene
EP0921818A4 (en) 1996-05-31 2002-09-25 Nat American Red Cross THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC METHODS AND COMPOSITIONS BASED ON JAGGED / NOTCH PROTEINS AND AMINO ACIDS
US6291210B1 (en) 1996-07-16 2001-09-18 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation inhibitor
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
GB9722131D0 (en) * 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6562958B1 (en) 1998-06-09 2003-05-13 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Acinetobacter baumannii for diagnostics and therapeutics
US7504490B1 (en) * 1998-10-16 2009-03-17 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Apergillus fumigatus for diagnostics and therapeutics
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
EP1286700A2 (en) 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
CA2423850C (en) 2000-10-09 2017-07-04 Isis Innovation Limited Therapeutic antibodies
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
WO2003006990A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 Exelixis, Inc. Modifiers of the p21 pathway and methods of use
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
WO2004021861A2 (en) 2002-09-03 2004-03-18 Vit Lauermann Targeted release
EP2233926A3 (en) 2003-04-01 2011-01-12 The Johns Hopkins University Breast Endothelial Cell Expression Patterns
WO2004099379A2 (en) 2003-05-02 2004-11-18 Health Research, Inc. Use of jag2 expression in diagnosis of plasma cell disorders
JP2007512348A (ja) 2003-11-26 2007-05-17 ヘルス　リサーチ　インコーポレイテッド 形質細胞の治療のためのノッチ経路干渉剤の使用
EA200801515A1 (ru) * 2006-01-24 2009-02-27 Домантис Лимитед Лиганды, которые связывают il-4 и/или il-13
CA2645347A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Diatos Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker
US8802103B2 (en) 2007-05-15 2014-08-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US8293685B2 (en) 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009091518A2 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Monsanto Technology, Llc Isolated novel nucleic acid and protein molecules from corn and methods of using those molecules to generate transgenic plant with enhanced agronomic traits
US20110178279A1 (en) * 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
EP3543256A1 (en) 2009-01-12 2019-09-25 Cytomx Therapeutics Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US9309325B2 (en) 2009-05-07 2016-04-12 The Regents Of The University Of California Antibodies and methods of use thereof
WO2011063237A2 (en) 2009-11-19 2011-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof
MX2014011608A (es) 2012-03-29 2015-05-11 Robert J Fleming Metodos y composiciones para modular la actividad notch.
RU2018130986A (ru) 2012-08-13 2018-10-09 Дженентек, Инк. Антитела к jagged и способы их применения
CN112162094A (zh) * 2013-01-04 2021-01-01 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法

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