CN111278461A

CN111278461A - 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法

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Publication number: CN111278461A
Application number: CN201880066338.3A
Authority: CN
Inventors: S·R·小科里斯泰克; 张泳; G·D·维特; A·拉杰帕尔; C·饶-奈克; P·E·莫里恩; M·斯里尼瓦桑; Z·林; V·拉方; A·普利茨克
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2020-06-12
Also published as: EP3668545A2; US20190055321A1; WO2019036433A3; KR20200040819A; JP2020531430A; WO2019036433A2; US11623965B2; US20230295346A1

Abstract

一种前药化抗体，其具有封闭部分，该封闭部分介由具有可切割部分的接头附接于该抗体的重链或轻链上的Cys。该封闭部分抑制该抗体与其抗原的结合。所述可切割部分的切割释放所述封闭部分，并恢复所述抗体与其抗原结合的能力。

Description

可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月16日提交的美国临时申请系列号62/546,252的35 U.S.C.§119(e)下的权利，其公开内容通过提述并入本文。

序列表

通过提述将命名为“170731_SEQT_13002WOPCT_YC.txt”序列表整体并入本文，该序列表包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16，其包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列。序列表已经经由EFS-Web以ASCII文本格式提交，因此构成了其文件和计算机两种可读形式。序列表于2017年7月31日使用PatentIn 3.5首次创建，大小约为17KB。

发明背景

此发明涉及可前药化抗体、其前药，以及制备和使用此类抗体及其前药的方法。

治疗性抗体可用于治疗多种疾病，尤其是癌症和炎症性病况。已经收到监管机构上市许可的治疗性抗体的实例包括伊匹单抗(ipilimumab，

)、纳武单抗(nivolumab，

)、曲妥珠单抗(trastuzumab，

)、西妥昔单抗(cetuximab，

)、利妥昔单抗(rituximab，

)、英夫利昔单抗(infliximab，

)和阿达木单抗(adalimumab，

)。通常，治疗性抗体–像其它抗体一样–通过以高特异性和亲和力与其分子靶标(抗原)结合而起作用，从而启动与其治疗作用有关的细胞过程。

前药可用于降低治疗剂的脱靶副作用。前药是治疗剂的一种活性较低的形式，但其可以在靶组织或靶标处或附近转化为活性治疗剂。通常，通过将可降低治疗剂活性的部分共价附着于治疗剂来实现前药化。靶位点处存在的某种因素或药剂(低pH、酶、缺氧等)在靶位点处去除封闭部分，可恢复治疗剂的活性。参见，例如：Trouet等2004、Stagliano等2013、Rodeck等2010和Lauermann 2014。

与其他治疗剂(诸如小分子药物)的情况一样，对于治疗性抗体，希望通过阻碍其对疾病治疗的靶组织或器官以外的组织或器官的作用来降低或消除其副作用。经典的抗体是Y形的二聚体蛋白质，每个半二聚体都由两条链(一条重链和一条轻链)组成，如图1中所示的。通常，两个半二聚体是相同的，并且通过二硫键彼此共价连接。抗体与其抗原的结合相互作用通过抗体的互补决定区(CDR)实现，在每条重链和轻链上的可变区中有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。重链可变区和轻链可变区(在图1中分别标记为V_H和V_L)位于每个蛋白质链的氨基末端附近。

对于抗体前药化，由于V_H和V_L区存在负责抗原相互作用的CDR，因此是封闭部分的可能附着位点。例如，Polu和Lowman 2014公开了通过将掩蔽肽附着于抗体轻链的N末端来前药化抗体。涉及抗体前药化的其它公开包括：Stagliano等2016、Williams等2015、Lowman等2014、Lowman等2015b和Daugherty等2015。已经实现前药化的抗体包括针对以下这些抗原的抗体：EGFR(Desnoyers等2013、Lowman等2015a、Lowman等2017)、JAGGED 1/2(West等2015)、白介素-6受体(West等2016a)、组织因子途径抑制剂(Wang等2016)、CD3(Dennis等2016)、PDL1(West等2016b)、CD166(West等2016c)、CD71(Sagert等2016b)、PD1(Tipton等2017)和ITGA3(Sagert等2016a)。

本文讨论的文档中一部分是通过第一作者或发明人和出版年代援引的。它们的完整书目引用信息在此说明书末尾的“参考文献”部分中列出。

发明简述

此公开提供新颖的前药化抗体以及制备和使用它们的方法。简而言之，通过用半胱氨酸(Cys)位点特异性地替换重链或轻链可变区中的氨基酸来修饰抗体。替换上的Cys的侧链中的巯基(SH)基团充当化学手柄，用于附接前药化部分，所述前药化部分包含阻碍抗体与其抗原结合能力的封闭部分(BM)。BM可以是在空间上抑制抗体-抗原结合，但除此之外不与抗体或抗原特异性相互作用的基团。或者，BM可以与抗体相互作用，例如通过静电力或范德华力与抗体相互作用。前药化部分进一步包含具有可切割的基团的接头部分，在抗体的预期作用位点发现的某种因素切割释放封闭部分并恢复抗体结合其抗原的能力并发挥其治疗作用。可切割的基团优选通过预期作用位点处或附近发现的因素(低pH、酶、缺氧等，其中酶是优选的)切割。

在一些情况中，BM在通过切割接头部分释放后可具有其自身的药理活性。以这种方式，本发明的前药化抗体可以一次投递两种药理活性剂：BM和抗体。

选择Cys替代位点，使得用Cys替换原始氨基酸不会不利地影响抗体特异性强结合其抗原的能力。此外，去除前药化部分可留下仍然共价附着于Cys的残留化学基团。我们已经意外地发现，该残留的基团也不会阻止抗体-抗原结合。

在一个实施方案中，提供了根据式(I)的前药化抗体

(BM-L)_m-Ab (I)

其中

Ab是一种抗体，其重链或轻链可变区中有至少一个氨基酸被替换为Cys，其中被替换的氨基酸(a)在框架区中；(b)具有至少30％的侧链暴露且(c)距某一CDR氨基酸

内，优选

内；

BM是抑制Ab与其抗原结合的封闭部分；

每个L独立地是与BM和Ab结合的接头部分，L包含可切割部分且在前述Cys处与Ab键合；且

m是1、2、3或4。

在优选的实施方案中，抗体Ab中至少一个被替换的氨基酸在重链可变区的Kabat位置1、3、5、19、23、25、43、46、68、72、74、75、76、82a、82b、83、84、85或105处或在轻链可变区的Kabat位置1、3、5、7、8、18、20、45、57、60、63、65、66、67、69、77或100处。

在另一优选的实施方案中，抗体Ab中至少一个被替换的氨基酸在重链的Kabat位置23处或在轻链的Kabat位置67处。

在另一实施方案中，提供了在轻链的Kabat位置67处具有Cys的抗体。所述抗体可以是抗CTLA4抗体或抗CD137抗体。

在另一实施方案中，提供了在重链的Kabat位置23处具有Cys的抗体。所述抗体可以是抗CTLA4抗体或抗CD137抗体。

附图简述

图1显示了抗体的一般构造，包括重和轻链可变区(V_H和V_L)的位置，其中进行了本文公开的Cys替代。

图2显示了用于示例说明本文公开的前药化概念的抗CLTA4抗体的重链可变区V_H的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，其经过了注释以将SEQ ID NO:1和Kabat系统中的氨基酸编号相关联，并标记了理想的Cys替代位置。

图3显示了图2的抗CLTA4抗体的轻链的可变区V_L的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，其经过了注释以将SEQ ID NO:2和Kabat系统中的氨基酸编号相关联，并标记了理想的Cys替代位置。

图4显示了用于示例说明本文公开的前药化概念的抗CD137抗体的重链的可变区V_H的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，其经过了注释以将SEQ ID NO:3和Kabat系统中的氨基酸编号相关联，并标记了理想的Cys替代位置。

图5显示了图4的抗CD137抗体的轻链的可变区V_L的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，其经注释以使SEQ ID NO:4和Kabat系统中的氨基酸编号相关联，并标记了理想的Cys替代位置。

图6、图7、图8和图9显示了本发明的各种化合物的MALDI质谱。

图10A和图10B显示了抗CTLA4抗体的重链和轻链中具有大于30％的暴露且位于某一CDR氨基酸的5(或10)

内的Cys替代位点，这些位点使用Kabat编号标识。

图11A、图11B、图11C、图11D和图11E显示了前药化和随后的前药化基团的去除对在重链或轻链的多个位置处前药化的抗CTLA4抗体与激活的CD4⁺ T细胞结合的影响。

图12A、图12B、图13A和图13B显示了CTLA4抗体的前药化和去前药化对PBMC细胞分泌IL-2的影响。

图14、图15A和图15B显示了前药化对CD137抗体的活性的影响。

发明详述

定义

“抗体”是指完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链变体。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链包含重链可变区(V_H)和包含三个域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(V_L或V_k)和包含一个单一域CL的轻链恒定区。V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的框架区(FR)。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR，其以氨基到羧基末端的顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。可变区含有与抗原相互作用的结合域。恒定区可介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统(例如，效应细胞)的多种细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)。如果抗体以5x10^-8M或更少，更优选1x 10^-8M或更少，更优选6x 10^-9M或更少，更优选3x 10^-9M或更少，甚至更优选2x 10^-9M或更少的K_D结合抗原X，则称抗体“特异性结合”抗原。抗体可以是嵌合的、人源化或优选是人的。重链恒定区可经工程化以影响糖基化的类型或程度，以延长抗体的半衰期，以增强或减少与效应细胞或补体系统的相互作用，或调节一些其它性质。可通过替换、添加或缺失一个或多个氨基酸或通过用来自另一种免疫球蛋白类型的域替换域或上述的组合来完成工程化。

抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)意指抗体的一个或多个保留特异性结合抗原的能力的片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行，所述片段诸如(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和C_H1域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种二价片段，其包含通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段；(iii)Fab’片段，其基本上是具有部分铰链区的Fab(参见，例如，Cellular andMolecular Immunology,第6版,Saunders Elsevier 2007)；(iv)Fd片段，其由V_H和C_H1域组成；(v)Fv片段，其由抗体的单个臂的V_L和V_H域组成，(vi)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，其由V_H域组成；(vii)分离的互补性决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，一种含有单个可变域和两个恒定域的重链可变区。优选的抗原结合片段是Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv和Fd片段。此外，尽管Fv片段的两个域(V_L和V_H)由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头使它们成为单个蛋白链，在该单个蛋白链中V_L和V_H区对形成单价分子(被称为单链Fv，或scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。

除非另有指示–例如通过参考序列表中的编号–关于抗体重或轻链可变区(V_H或V_L)中氨基酸位置的编号是根据Kabat系统(Kabat等，"Sequences of proteins ofimmunological interest,第5版,公开号91-3242,U.S.Dept.Health&Human Services,NIH,Bethesda,Md.,1991,以下称为“Kabat”)，关于抗体重或轻链恒定区(C_H1、C_H2、C_H3或C_L)中氨基酸位置的编号根据Kabat中所述的EU索引。对于此类用法的实例，参见Lazar等，US2008/0248028 A1，其公开通过提述并入本文。此外，ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)在其网站上提供了一个标题为“IMGT Scientific Chart:Correspondence between CNumberings”的表格，该表格显示了其编号系(EU编号)和重链恒定区的Kabat编号之间的对应关系。参见，例如，Lazar等，US 2008/0248028 A1(2008)。

“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合抗原X的分离的抗体基本上不含与抗原X以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性结合抗原X的分离的抗体可具有与其它抗原(诸如来自其它物种的抗原X分子)的交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体特异性结合人抗原X，并且不与其它(非人)抗原X抗原交叉反应。而且，分离的抗体可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。

“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”意指具有单一分子组成的抗体分子制备物，其对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。

“人抗体”意指具有这样的可变区的抗体：该可变区中框架区和CDR区(以及恒定区，如果存在的话)均衍生自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括后续的修饰，包括天然或合成的修饰。人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，“人抗体”不包括另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人框架序列上的抗体。

“人单克隆抗体”意指表现出单一结合特异性、具有其中框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是通过包括从转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞的杂交瘤产生的，该B细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，且与永生化细胞融合。

“脂肪族”意指直链或支链，饱和或不饱和的非芳香族烃部分，其具有指定数目的碳原子(例如，如“C₃脂肪族”、“C_1-5脂肪族”、“C₁-C₅脂肪族”或“C₁至C₅脂肪族”，后三个短语与“具有1至5个碳原子的脂肪族部分”同义)，或者，在未明确规定碳原子数的情况下，则为1至4个碳原子(在不饱和脂族部分的情况下为2至4个碳)。类似的理解适用于其它类型中的碳的数目，如C_2-4烯烃，C₄-C₇脂环族等。以类似的方式，“(CH₂)_1-3”这样的术语应理解为下标为1、2或3的简写，因此该术语代表CH₂、CH₂CH₂和CH₂CH₂CH₂。

“烷基”意指饱和的脂肪族部分，其中适用用于指定碳原子数目的相同规则。举例来说，C₁-C₄烷基部分包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“亚烷基”意指烷基基团的二价对应物，诸如CH₂CH₂、CH₂CH₂CH₂和CH₂CH₂CH₂CH₂。

“烯基”意指具有至少一个碳-碳双键的脂肪族部分，其中适用用于指定碳原子数目的相同规则。举例来说，C₂-C₄烯基部分包括，但不限于，乙烯基(ethenyl、vinyl)、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺式-1-丙烯基、反式-1-丙烯基，E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基(丁-1,3-二烯基)等。

“炔基”意指具有至少一个碳-碳三键的脂肪族部分，其中适用用于指定碳原子数目的相同规则。举例来说，C₂-C₄炔基基团包括乙炔基(乙炔基)、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。

“脂环族”意指具有1至3个环的饱和或不饱和的非芳香族烃部分，每个环具有3至8个(优选3至6个)碳原子。“环烷基”意指其中每个环是饱和的脂肪族部分。“环炔基”意指其中至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。举例来说，脂肪族部分包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的脂肪族部分是环烷基，特别是环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“亚环烷基”意指环烷基的二价对应物。

“杂环脂族基”意指其中在其至少一个环中，多达三个(优选1-2个)碳已经被独立地选自N、O或S的杂原子取代的脂环族部分，其中N和S可任选地被氧化，且N可任选地被季铵化。优选的脂环族部分由一个大小为5至6元的环组成。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别意指其中至少一个环被如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂环脂族部分包括吖丙啶基、吖丁啶基(azetidinyl)、1,3-二恶烷基、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢硫代吡喃基(tetrahydrothiopyranyl)、四氢硫代吡喃基砜、吗啉基、硫代吗啉基亚砜基、1,3-二氧戊环基、四氢-1,1-二氧杂噻吩基、1,4-二氧杂戊基(1,4-dioxanyl)、噻四环基(thietanyl)等。“杂环亚烷基”意指杂环烷基的二价对应物。

“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别表示–O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)和-S(芳基)。实例是甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。

“卤素(halogen)”或“卤素(halo)”是指氟、氯、溴或碘，除非指明为较窄的含义。+

“芳基”意指具有单环、双环或三环系统(优选单环)的烃部分，其中每个环具有3至7个碳原子，且至少一个环是芳香族的。环系统中的环可以彼此稠合(如在萘基中)或彼此键合(如在联苯中)，并且可以与非芳香族环稠合或键合(如在茚满基或环己基苯基中)。进一步说明，芳基部分包括，但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯、菲基、蒽基和苊基(acenaphthyl)。“亚芳基”意指芳基的二价对应物，例如1,2-亚苯基、1,3-亚苯基或1,4-亚苯基。

“杂芳基”是指具有单环、双环或三环系统(优选5至7元单环)的部分，其中每个环具有3至7个碳原子，且至少一个环是含有1至4个独立地选自N、O或S的杂原子的芳香环，其中N和S可任选地被氧化，且N可任选地被季铵化。此类至少一个含有杂原子的芳香环可以与其他类型的环稠合(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基中)或直接键合至其他类型的环(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基中)。进一步说明，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、苯硫基(噻吩基)、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基，喹唑啉基、噌啉基(cinnolinyl)、喹喔啉基(quinozalinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、苯并呋喃、吲哚基、苯并噻吩基、恶二唑基(oxadiazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并三唑基，二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“亚杂芳基”意指杂芳基的二价对应物。

当指明某一部分可以被取代时，诸如通过使用“未取代或取代的C₁-C₅烷基”或“任选取代的杂芳基”中的“未取代或取代的”或“任选取代的”短语来指明时，此类部分可具有一个或多个独立选择的取代基，优选数目为1-5，更优选数目为1或2。取代基和取代方式可以由本领域普通技术人员在考虑取代基所附着的部分的基础上加以选择，以提供化学上稳定的、并且可以通过本领域已知的技术以及本文所述的方法合成的化合物。当某个部分被标识为“未取代或取代的”或“任选取代的”时，在优选的实施方案中，这样的部分是未取代的。

“芳烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“联芳基烷基”等意指，烷基、烯基或炔基部分(依具体情况而定)被芳基、杂脂环族、联芳基(依具体情况而定)等部分取代，且开放(未被饱和的)化合价位于烷基、烯基或炔基部分上，就像苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等那样。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等意指芳基、环烷基等部分(依具体情况而定)被烷基、烯基等部分(依具体情况而定)取代，就像甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基那样。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等意指烷基、芳基等部分(依具体情况而定)被一个或多个指明的取代基(羟基、卤素等，依具体情况而定))取代。

例如，允许的取代基包括，但不限于，烷基(尤其是甲基或乙基)、烯基(尤其是烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代基(尤其是氟代)、卤烷基(尤其是三氟甲基)、羟基、羟烷基(尤其是羟乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤烷基)(尤其是-OCF₃)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷基硫、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)、-SO₂N(烷基)₂等。

当被取代的部分是脂肪族部分时，优选的取代基是芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤素、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷基硫、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(＝O)烷基、-S(环烷基)、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基是卤素、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂和-NHC(＝NH)NH₂。尤其优选的是苯基、氰基、卤素、羟基、硝基、C₁-C₄烷氧基、O(C₂-C₄亚烷基)OH和O(C₂-C₄亚烷基)卤素。

当被取代的部分是脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基部分时，优选的取代基是烷基、烯基、炔基、卤素、卤烷基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-O(卤烷基)、-O(芳基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、烷基硫、芳硫基、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、叠氮基、-NH₂，-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NH(羟烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂、-NHC(＝NH)NH₂、-OSO₂(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO₂(烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(烷基)和-SO₂N(烷基)₂。更优选的取代基是烷基、烯基、卤素、卤烷基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO₂H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟烷基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)₂、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟烷基)、OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)₂、-NH₂，-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH₂、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)₂和-NHC(＝NH)NH₂。尤其优选的是C₁-C₄烷基、氰基、硝基、卤素和C₁-C₄烷氧基。

当陈述某个范围时，如“C₁-C₅烷基”或“5至10％”，该范围包括该范围的端点，如前一种情况中的C₁和C₅，后一种情况中的5％和10％。

除非特别指出特定的立体异构体(例如，通过结构式中相关立体中心的加粗或虚线键，通过在结构式中将双键描述为具有E或Z构型或通过使用立体化学指定的术语)，否则所有的立体异构体，以纯化合物及其混合物的形式都包括在本发明的范围内。除非另有指示，否则单个对映异构体、非对映异构体、几何异构体及其组合和混合物均被本发明涵盖。

本领域技术人员将理解，化合物可以具有与本文所用的结构式中所描述的那些等效的互变异构形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，并且该结构式涵盖此类互变异构、共振或两性离子形式。

“药学上可接受的酯”意指在体内(例如在人体中)水解以产生母体化合物或其盐或本身具有与母体化合物相似的活性的酯。合适的酯包括C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基酯，尤其是甲酯、乙酯或正丙酯。

“药学上可接受的盐”意指适合于药物制剂的化合物的盐。当化合物具有一个或多个碱性基团时，该盐可以是酸加成盐，诸如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸(embonate))、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、硫酸甲酯、延胡索酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖醛酸盐、辛二酸盐，甲苯磺酸盐等。当化合物具有一个或多个酸性基团时，该盐可以是诸如钙盐、钾盐、镁盐、葡甲胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己基胺盐、苄星盐(benzathine salt)、钠盐、四甲基铵盐等的盐。多晶型形式和溶剂合物也包括在本发明的范围内。

在本说明书的式中，横穿键的波浪线

或键末端的星号(*)表示共价附着位点。例如，在式

中R是

或R是

的陈述，意指

在本说明书的各式中，在其两个碳之间横穿芳香环的键意指附着至该键的基团可位于芳香环的任何可用位置。举例来说，式

代表

实施方案

SEQ ID NO:1(其中Xaa是Ala)和SEQ ID NO：2(其中Xaa是Ser)分别提供了一种人抗CTLA4抗体(以下简称为“CTLA4 Ab”)的全长重链和轻(κ)链氨基酸序列，可在该抗体的V_H或V_L区中进行Cys替代，以示例说明本文公开的前药化构思。其重链和轻链的可变区分别显示在图2和图3中，其中的注释将氨基酸的SEQ ID NO与Kabat编号相关联，并显示了Cys替代的理想位置。在CTLA4 Ab中，两条重链彼此相同，两条轻链彼此相同。

SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别提供了一种抗CD137抗体(以下简称为“CD137Ab”)的全长重链和轻(κ)链氨基酸序列，可在该抗体的V_H或V_L区中进行Cys替代以示例说明本文公开的前药化构思。其重链和轻链的可变区分别显示在图4和图5中，，其中的注释将氨基酸的SEQ ID NO与Kabat编号相关联，并显示了Cys替代的理想位置。在CD137 Ab中，两条重链彼此相同，两条轻链彼此相同。CD137 Ab是嵌合抗体，具有大鼠可变重链区和轻链区以及小鼠IgG1重链恒定区。

本发明的前药化抗体可以是多克隆或单克隆的，优选是单克隆的。本发明的前药化抗体可以是嵌合的、人源化或人的，优选为人的。

重链可变区和轻链可变区中适合用Cys替代的氨基酸是这样的框架氨基酸：其侧链暴露于溶剂中——优选至少30％暴露——使得替换上的Cys可被封闭部分BM达到以供附接。同样重要的是，被替换下的氨基酸应靠近CDR氨基酸，使得BM可有效地阻碍抗体-抗原的结合。优选不大于

的距离，更优选不大于

的距离。

Cys替代的优选位置包括重链可变区中的位置23和轻链可变区中的位置67(按照Kabat编号)。两个位置均在各自可变区的框架区中。可通过本领域中熟知的位点特异性替代技术将Cys替换到这些位置中。将第一个位点处的取代可以使用简写表示法称为V_LX67C，其中X表示被替换下的氨基酸。在天然抗体中，此位点是高度保守的，且通常是Ser。第二个位点处的替代可以类似地称为V_H X23C。

本发明的前药化抗体可以在V_H区、或V_L区、或两者中具有替代。如果抗体仅具有这些替代中的一个，则可附接的封闭部分-接头化合物的理论最大数目为两个；不过，前药化抗体制备物在统计学上测定得到的数目可能较之为低，反映附接过程中的化学上的低效率。如果抗体具有两个替代，则理论最大数目是四。

尽管本发明是用经典构型的抗体(即两条相同的重链和两条相同的轻链)来演示说明的，但是本发明也适用于具有两个不同的重链轻链对的双特异性抗体。因此，本发明的前药化抗体可以是其中仅有一个重/轻链对前药化的双特异性抗体，也可以是其中两个重/轻链对均前药化的双特异性抗体。

还已知用Cys取代V_H或V_L区域中的氨基酸以引入的巯基侧链，适合通过马来酰亚胺加成化学缀合来制备抗体-药物缀合物。参见，例如，Eigenbrot等2007和Bhakta等2016)。

在一个实施方案中，能够前药化的抗体，以及由该抗体制得的、在轻链的Kabat位置67处具有Cys的前药化抗体，是抗CTLA4抗体，其优选地具有

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸31-35的重链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:1的氨基酸50-66的重链CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-107的重链CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸24-35轻链CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:2的氨基酸51-57的轻链CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:2的氨基酸90-98的轻链CDR3。

更优选地，该抗CTLA4抗体具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-118(其中Xaa是Ala)的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-108(其中Xaa是Cys)的轻链可变区。

在另一实施方案中，能够前药化的抗体，以及由该抗体制得的、在重链的Kabat位置23处具有Cys的前药化抗体，是抗CTLA4抗体，其优选地具有

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸31-35的重链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:1的氨基酸50-66的重链CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-107的重链CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸24-35的轻链CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:2的氨基酸51-57的轻链CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:2的氨基酸90-98的轻链CDR3。

更优选地，该抗CTLA4抗体具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-118(其中Xaa是Cys)的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-108(其中Xaa是Ser)的轻链可变区。

在一个实施方案中，可前药化抗CTLA4抗体和由该抗体制得的前药化抗体是IgG1同种型的。优选地，其具有同种异型组合R214(EU索引编号；SEQ ID NO:1中的氨基酸215)、E356(EU索引编号；SEQ ID NO:1中的氨基酸357)和M358(EU索引编号；SEQ ID NO:1中的氨基酸359)，这种组合在白种人群体中常见。

在一个实施方案中，接头包含可被这样的酶切割(即，是这样的酶的底物)的多肽：该酶(蛋白酶)在患病组织或器官中，与健康组织或器官中相比，独特表达或过表达。优选地，该酶存在于患病的组织或器官的细胞外环境中。这样的蛋白酶的实例包括：天冬氨酸蛋白酶(例如，肾素)、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、天冬氨酸组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶D、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2等)、半胱氨酸组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B)、半胱氨酸蛋白酶(例如，豆荚蛋白)、去整合素/金属蛋白酶(ADAM，例如，ADAM8、ADAM9)、具有血小板反应蛋白基序的去整合素/金属蛋白酶(ADAMTS，例如，ADAMTS1)、完整的膜丝氨酸蛋白酶(例如，蛋白裂解酶2、MT-SP1/蛋白裂解酶、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4)、激肽释放酶相关的肽酶(KLK，例如KLK4、KLK5)、基质金属蛋白酶(例如，MMP-1、MMP-2、MMP-9)，和丝氨酸蛋白酶(例如，组织蛋白酶A、凝血因子蛋白酶诸如弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶媒、凝血酶、PSA、uPA、因子VIIa、因子Xa和HCV NS3/4)。优选地，蛋白酶是成纤维细胞激活蛋白(FAP)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA，尿激酶)、MT-SP1/蛋白裂解酶、豆荚蛋白或基质金属蛋白酶(尤其是MMP-1、MMP-2和MMP-9)。本领域技术人员将理解，酶和相应的可切割的肽的选择将取决于待治疗的疾病和由受影响的组织或器官表达的蛋白酶。

多肽底物-酶对的实例提供于表I中

优选地，可切割的肽是LSGRSDNH(SEQ ID NO：5)、LSGX(SEQ ID NO：16)或LSGK(SEQID NO:16)。

合适的蛋白酶和/或其底物的公开包括：Desnoyers等2013；Stagliano等2013；Stagliano等2014；Waldmann等2013；Lauermann等2014；Lowman等2014；Daugherty等2015；Lowman等2015a；Lowman等2015b；Moore等2015；West等2016a；Wang等2016；Moore等2016；Moore等2017；和Dennis等2016；其公开通过提述并入本文。

可以用于妨碍或封闭前药化抗体与其抗原的活性的封闭部分BM包括：聚乙二醇(PEG)、白蛋白结合多肽、adnectin、肽，和可溶性球状蛋白诸如白蛋白或纤维蛋白原。

在一个实施方案中，BM是分子量为至少约2kDa的PEG，其中2kDa对应于具有约45个-(CH₂CH₂O)-重复单元的PEG，优选是分子量至少约为5kDa的PEG，其中5kDa对应于具有115个-(CH₂CH₂O)-重复单元的PEG。

具有48个-(CH₂CH₂O)-重复单元(CAS登记号32130-27-1)的氨基末端化PEG可从Quanta Biodesign公司获得。标称分子量为5kDa的氨基末端化PEG可从NOF America公司获得(CAS登记号116164-53-5)。使用MALDI-TOF-MS分析，我们确定了其分子量分布在约4.4kDa至约6.6kDa之间，对应于约100至约155个-(CH₂CH₂O)-重复单元。标称分子量为10kDa的氨基末端化PEG可从NOF America公司(CAS登记号亦为116164-53-5)获得。使用MALDI-TOF-MS分析，我们确定了其分子量分布在约9.0kDa至约12.0kDa之间，对应于约205至约275个-(CH₂CH₂O)-重复单元。末端氨基团提供用于附着至接头部分的化学官能性。

关于这些和其它封闭部分BM的公开包括：Tomasi等1988；Trouet等2004；Waldmann等2014；Lauermann等2014；Lowman等2014；Daugherty等2015；Lowman等2015a；West等2016a；和Wang等2016；将这些公开通过提述并入本文。

如上所述的具有Cys的抗体可通过Cys巯基(SH)的迈克尔加成(Michaeladdition)与具有马来酰亚胺末端基团的封闭部分-接头部分化合物缀合，如下所示。这种缀合的程序在本领域中是熟知的；参见，例如，Shepard等，WO 2017/112624 A1(2017)。

可如此用于前药化抗体的带马来酰亚胺末端的封闭部分-接头化合物的实例包括根据式(Ia)-(Ih)的化合物，其中每个化合物包含可由Matriptase这种酶切割的肽。

抗体与前述封闭部分-接头化合物(Ia)-(Ih)的缀合分别提供根据式(IIa)-(IIh)的前药化抗体，其中Ab是如上定义的抗体，m是1、2、3或4。

本领域技术人员将理解，随着时间推移，最初由于巯基加成到马来酰亚胺基团上而形成的琥珀酰亚胺结构可水解成开环而形成断裂(seco)型，并且琥珀酰亚胺和断裂型在功能上是等同的。

从上面的一些结构可以看出，可酶切割的肽可以与自消灭(self-immolating)基团结合使用。简而言之，自消灭基团的功能是在肽与抗体的其他部分、接头或封闭部分之间提供间隔，以免它们中的任何一个阻碍切割酶的作用。切割发生后，自消灭基团发生自消除反应。自消灭基团的用途和结构描述于Zhang等，US 9,527,871 B2(2016)中，其公开内容通过提述并入本文。

优选的自消灭基团是对氨基苄基氧羰基(PABC)基团，其结构如下所示

其作用方式如下反应顺序所示：

从上述反应顺序可以看出，肽的切割不能将抗体Ab恢复到其原始结构，这是因为与封闭部分-接头结合的Cys上残留有与其附着的琥珀酰亚胺残基(或其开环衍生物)。无论是否使用自消灭基团都是如此。我们已经发现，出乎意料地，该琥珀酰亚胺残基不会阻止抗体的抗原结合活性的恢复。

实施例

通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，提供这些实施例是为了举例说明而非限制。

实施例1-化合物(Ia)

使用蛋白质技术的PRELUDE^TM肽合成仪，通过标准Fmoc化学过程制备线性前体。

树脂装载：将溶于二氯甲烷(DCM，18.58mL)的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(3.34mmol，1.567g)和二异丙基乙胺(DIPEA，8.36mmol，1.457mL)添加到Biorad制备柱中的2-氯三苯甲基树脂(1.5mmol/g，2.79mmol，1.81g，用DCM预溶胀)。树脂在室温(RT)下摇动18小时。通过过滤去除溶剂，并用DCM(5x 10mL)洗涤固体树脂，然后在真空下干燥以提供树脂1(2.713g，装载0.81mmol/g)。

PRELUDE^TM装置上的标准氨基酸偶联：通过Top Wash功能用DMF溶胀树脂(8mL x10min)，且每30秒与温和的N₂流混合。排干溶剂，并用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF，10mL x 2，每次洗涤5分钟)洗涤树脂，并每30秒与温和的N₂流混合。用DMF洗涤树脂(15mL x 6，每次洗涤60秒)。将Fmoc保护的氨基酸添加到树脂中(Fmoc-AA，溶于DMF中的0.1M溶液，3当量)，然后加入HATU(溶于DMF中的0.2M溶液，3当量)和N-甲基吗啉(溶于DMF中的0.8M，5当量)。然后通过温和的氮气流搅拌反应混合物60分钟。

此标准程序用于P4-P1偶联。偶联最终的P1氨基酸后，去除Fmoc基团后，将树脂用乙酸酐/DIPEA/DMF溶液(1:1:3，5mL x 2，达10min)封端。树脂–Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(P5)-Fmoc-L-Gly-OH(P4)-Fmoc-L-Ser(三苯甲基)-OH(P3)-Fmoc-Leu-OH(P2)-Fmoc-Glu-OAll(P1)

化合物3.用DCM(16ml)和1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFP，4ml)的混合物处理树脂2(0.956g，1.0mmol)，并在RT下摇动10min。过滤混合物，在真空中浓缩滤液。用额外的DCM(16ml)和HFP(4mL)处理树脂，并摇动10min。过滤混合物。在真空中浓缩合并的滤液。此物质溶于DCM中并在真空中浓缩(4x)以提供N²-N-(((S)-4-乙酰氨基-5-(烯丙氧基)-5-氧戊烷酰基)-L-亮氨酰)-O-三苯甲基-L-丝氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。MS(ESI⁺)(M+H)⁺957.8

化合物4.向肽3的DMF溶液(2.5ml)添加2,4,6-可力丁(198μl，1.5mmol)，随后加入(4-氨基苯基)甲醇(148mg，1.2mmol)和HATU(456mg，1.2mmol)。在RT下搅拌澄清橙色溶液20min。然后将反应物添加到H₂O(50mL)的搅拌的烧瓶中，且通过真空过滤收集所得的沉淀物(用3x 10mL H₂O洗涤)。在玻璃料上空气干燥后，用Et₂O(3x 10mL)洗涤固体。然后将固体溶解在DCM和MeOH的混合物中(总计～100mL)，经Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中浓缩以提供烯丙基N²-乙酰基-N⁵-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-1-氧代-3-(三苯氧基)丙烷-2-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-L-谷氨酰胺(785mg，0.739mmol，73.9％产率)，其为棕色固体。MS(ESI⁺)m/z 1061.8(M+H)⁺。

化合物5.向中间体4(785mg，0.739mmol)的DMF溶液(3695μl)添加二(4-硝基苯基)碳酸酯(337mg，1.108mmol)和DIPEA(193μl，1.108mmol)。在RT下搅拌反应1.5h。然后向混合物添加1-(2-氨乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(261mg，1.478mmol)和DIPEA(386μL，2.217mmol)。在RT下搅拌所得溶液30min，随后将其添加至Et₂O(50mL)。通过真空过滤收集所得沉淀物，用Et₂O(2x 5mL)洗涤，以提供烯丙基N²-乙酰基-N⁵-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((4-((((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧己基-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-1-氧代-3-(三苯氧基)丙烷-2-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-L-谷氨酰胺(1.1g)。MS(ESI⁺)m/z 1228.7(M+H)⁺。

化合物6.向MeCN(6109μl)和H₂O(1527μl)的混合物中的中间5(938mg，0.764mmol)的脱气溶液添加乙酸(218μl，3.82mmol)和4-甲基吗啉(337μl，3.05mmol)，随后添加乙酸钯(II)(86mg，0.382mmol)和三苯基膦-3,3',3”-三磺酸三钠盐(434mg，0.764mmol)。在RT下搅拌反应16h。过滤反应物，并通过反相快速色谱纯化(50g RediSep Gold C18柱；线性梯度20-100％B-A历时24min；A＝5％MeCN-H₂O w/0.05％v/v TFA；B＝5％H₂O-MeCN w/0.05％v/vTFA)以提供N²-乙酰基-N⁵-((S)-1-(((S)-1-((2-(((S)-6-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((4-((((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-1-氧代-3-(三苯氧基)丙烷-2-基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)-L-谷氨酰胺(286mg)。MS(ESI⁺)m/z 1187.6(M+H)⁺。

化合物7.向中间体6(286mg，0.241mmol)的DMF溶液(3008μl)添加HATU(101mg，0.265mmol)，随后添加m-dPEG48-胺(Quanta Biodesign，CAS#32130-271，568mg，0.265mmol)和DIPEA(84μl，0.481mmol)。在RT下搅拌反应30min。通过反相快速色谱(50gRediSep Gold C18柱；线性梯度10-100％B-A；A＝含0.05％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.05％v/v TFA的95％MeCN-H₂O)的纯化提供了化合物7(509mg)。

化合物(Ia).向化合物7(150mg，0.045mmol)的DCM溶液(724μl)添加TFA(181μl)，随后添加三异丙基硅烷(13.94μl，0.068mmol)。在RT下搅拌反应1.5h。然后浓缩反应物，并通过制备HPLC(Phenomenex Luna C18 30×100mm柱；线性梯度10-90％B-A达25min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；254nm检测)纯化以提供化合物(Ia)(86mg)，其为白色固体。MS(ESI⁺)m/z 991.2(M/3+H)⁺。

实施例2–化合物(Ib)

化合物10.向中间体6(20mg，0.017mmol)的DMF溶液(400μl)添加HATU(8.32mg，0.022mmol)。在RT下搅拌混合物5min，随后添加DMF(400μl)中的甲氧基-PEG-(CH₂)₃-NH₂溶液(NOF，目录#

MEPA-50H，CAS#：116164-53-5，168mg，0.034mmol)。然后在RT下搅拌混合物7h，然后在MeOH中稀释，并通过制备HPLC(Phenomenex Luna C18 30×100mm柱；线性梯度5-80％B-A历时25min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物10(39.1mg，6.34μmol，37.6％产率)。

化合物(Ib).向化合物10(39.1mg，5.83μmol)的乙腈(0.1mL)溶液添加20％TFA的DCM(0.5mL)。在RT下搅拌反应1h，随后在真空中浓缩。通过制备HPLC(Phenomenex Luna C1830×100mm柱；线性梯度0-80％B-A历时25min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物(Ib)(13.5mg)。MALDI质谱显示了5k PEG化合物的正确修饰，其中MS为828(图6)。

实施例3–化合物(Ic)

按照类似于制备中间体3的化学过程，在Protein Technologies公司产的Prelude肽合成仪上使用标准Fmoc化学过程制备肽11。树脂–Fmoc-L-Arg(Boc)₂-OH(P5)-Fmoc-L-Gly-OH(P4)-Fmoc-L-Ser(三苯甲基)-OH(P3)-Fmoc-Leu-OH(P2)–m-dPEG8-酸(QuantaBiodesign，CAS#1093647-41-6)(P1)。MS(ESI⁺)m/z 1269.6(M+H)⁺。

化合物12.向中间体11(89mg，0.07mmol)的DMF(175μl)溶液添加(4-氨基苯基)甲醇(10.35mg，0.084mmol)，随后添加HATU(31.9mg，0.084mmol)和2,4,6-可力丁(13.88μl，0.105mmol)。在RT下搅拌澄清橙色溶液30min，并将其添加到搅拌下一小瓶H₂O中(4mL)。通过真空过滤收集所得沉淀物(用2x1 mL H₂O洗涤)。在玻璃料上空气干燥后，用Et2O(3x5mL)洗涤固体。在真空下干燥固体以提供化合物12(69mg，72％)。MS(ESI⁺)m/z 1372.6(M+H)⁺。

化合物13.向中间体12(69mg，0.050mmol)的DMF(251μl)溶液添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(22.92mg，0.075mmol)和DIPEA(13.12μl，0.075mmol)。在RT下搅拌反应1h，随后添加1-(2-氨乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(17.74mg，0.100mmol)和DIPEA(26.2μl，0.151mmol)。在RT下再搅拌所得混合物1h，然后逐滴地添加到一小瓶Et₂O(15mL)中。通过真空过滤收集所得沉淀物，用Et₂O(3x 3mL)洗涤，并在真空下干燥以提供化合物13(60mg，78％)。MS(ESI⁺)m/z 1539.8(M+H)⁺。

化合物(Ic).向中间体13(60mg，0.039mmol)的DCM(273μl)溶液添加TFA(117μl)，随后添加三异丙基硅烷(16.01μl，0.078mmol)。反应物在RT下搅拌2h，随后在真空中浓缩。通过制备HPLC(Phenomenex Luna C18 30×100mm柱；线性梯度10-90％B-A历时20min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；254nm检测)纯化粗物质以提供化合物(Ic)(4.2mg，8.9％产率)，其为白色固体。MS(ESI⁺)m/z1096.9(M+H)⁺。

实施例4–化合物(Id)

树脂17是从适当的起始原料开始，按照针对树脂2所述的类似化学过程，在Protein Technologies公司产的PRELUDE^TM肽合成仪上使用标准Fmoc化学过程制备的。树脂–Fmoc-L-Gly-OH(P9)-Fmoc-L-His(三苯甲基)-OH(P8)-Fmoc-L-Asn(三苯甲基)-OH(P7)-Fmoc-L-Asp(tBu)-OH(P6)-Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(P5)-Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(P4)-Fmoc-L-Gly-OH(P3)-Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(P2)-Fmoc-Leu-OH(P1)。

化合物18.向树脂17(158mg，0.75mmol/g)添加6-马来酰亚胺基己酸(47.0mg，0.222mmol)和HATU(52.0mg，0.137mmol)的DMF(0.5mL)溶液，随后添加2,4,6-可力丁(0.392mL，0.359mmol)。摇动所得混合物2h，随后排干溶剂。用DMF(6mL x 3)和DCM(6mL x2)洗涤树脂，然后用20％HFP的DCM(8mL)处理15min。过滤混合物，在真空中浓缩滤液以提供N^a-(N²-((S)-4-(叔丁氧基)-2-((S)-3-(叔丁氧基)-2-((S)-2-(2-((S)-3-(叔丁氧基)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-4-甲基戊胺基)丙酰胺基)乙酰氨基)-5-(3-((2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基)磺酰基)胍基)戊酰胺基)丙酰胺基)-4-氧代丁酰基)-N⁴-三苯甲基-L-天冬酰胺基)-N^t-三苯甲基-L-组胺酰甘氨酸(33.8mg，19.37％产率)。

化合物19.向中间体18(38.3mg，0.019mmol)的DMF(200μl)溶液添加HATU(10.71mg，0.028mmol)。在RT下搅拌混合物10min，随后添加m-dPEG48-胺(72.5mg，0.034mmol)和DIPEA(3.28μl，0.019mmol)。在RT下再搅拌反应10min，然后通过制备HPLC(Phenomenex Luna C18 30×100mm柱；线性梯度25-100％B-A历时15min；A＝含0.1％v/vTFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物19，其为白色固体。MS(ESI⁺)m/z 1389.0(M/3+H)⁺。(14mg，17.9％产率)。

化合物(Id).向一小瓶中加入中间体19(14mg，3.36μmol)，随后添加TFA(50μL，0.649mmol)。在RT下搅动反应30min，随后用乙腈将其稀释，并通过制备HPLC(PhenomenexLuna C18 30×100mm柱；线性梯度5-85％B-A历时15min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物(Id)，其为白色固体。MS(ESI⁺)m/z 1087.8.0(M/3+H)⁺。(2.8mg，23.5％产率)。

实施例5–化合物(Ie)

向中间体18(21mg，0.01mmol)的DMF(200μl)溶液添加HATU(4.7mg，0.012mmol)。在RT下搅拌混合物10min，随后添加甲氧基-PEG-(CH₂)₃-NH₂(NOF，目录#

MEPA-50H，CAS#：116164-53-5，51.5mg，0.034mmol)的DMF(0.3mL)溶液和DIPEA(3.6μl，0.021mmol)。在RT下搅动反应4h，并通过制备HPLC(Phenomenex Luna C1830×100mm柱；线性梯度25-100％B-A历时15min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物20，其为白色固体。(28mg，38.7％产率)。

化合物(Ie).向一小瓶中添加中间体20(28mg)，随后添加TFA/H₂O(97:3，1mL)。在RT下搅拌反应物60min，随后在真空中将其浓缩。然后将残余物溶于水(2mL)中，并通过无菌过滤器(0.45uM)过滤。将滤液冻干以提供接头6，其为白色固体(20mg，78％产率)。MALDI质谱显示了5k PEG化合物的正确修饰(图7)。

实施例6–化合物(If)

化合物22.向树脂17(600mg，0.6mmol/g)添加(S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸(185mg，0.650mmol)(Nat.Biotech.2014，1059-1062)和HATU(185mg，0.487mmol)的DMF(0.5mL)溶液，随后添加2,4,6-可力丁(1.240mL，1.137mmol)。将反应物摇动3h，随后将其排干。用DMF(8mL x 3)、DCM(8mL x 2)洗涤树脂。然后用20％1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇的DCM(8mL)处理树脂15min。过滤混合物，并在真空中浓缩滤液以提供化合物22(136mg)，MS(ESI⁺)m/z 1057.0[M/2+H]⁺。

化合物23.向中间体22(134.2mg，0.063mmol)的DMF(0.3mL)搅动溶液添加HATU(29.0mg，0.076mmol)。在RT下搅拌混合物30min，然后添加m-dPEG48-胺(136mg，0.063mmol)的DMF(0.4mL)溶液，随后添加DIPEA(0.033mL，0.190mmol)。在RT下搅拌所得反应物2h，然后通过制备HPLC(Phenomenex Luna C18 30×100mm柱；线性梯度30-100％B-A历时15min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供化合物23(45.1mg，16.75％产率)，MS(ESI⁺)m/z 1413.8[M/3+H]⁺。

化合物(If).向一小瓶中添加中间体23(46.5mg，10.96μmol)，随后添加TFA(500μL，6.49mmol)。在RT下搅拌混合物1h，然后在真空中将其浓缩，并通过制备HPLC(PhenomenexLuna C18 30×100mm柱；线性梯度0-80％B-A历时15min；A＝含0.1％v/v TFA的5％MeCN-H₂O；B＝含0.1％v/v TFA的95％MeCN-H₂O；30mL/min；220nm检测)纯化以提供(15.3mg，38.3％产率)，MS(ESI⁺)m/z 1078.6[M/3+H]⁺。

实施例7–化合物(Ig)

按照类似用于制备化合物(If)的化学过程，从中间体22和甲氧基-PEG-(CH₂)₃-NH₂(NOF，目录#

MEPA-50H，CAS#：116164-53-5)制备了化合物(Ig)。MALDI质谱显示了5k PEG化合物的正确修饰(图8)。

实施例8–化合物(Ih)

按照类似于制备化合物(Ig)的化学过程从中间体22和甲氧基-PEG-(CH₂)₃-NH₂(NOF，目录#

MEPA-10T，CAS#：116164-53-5)制备了化合物(Ih)。MALDI质谱显示了10k PEG化合物的正确修饰(图9)。

实施例9–CDR氨基酸的暴露和距CDR氨基酸的距离的计算

使用抗体可变域(V_H和V_L)的结构或模型，计算了所有氨基酸侧链的可及表面积(ASA)。ASA定义为：使用由Lee和Richards首先开发的解决方案(Lee和Richards 1971)，一个具有水分子半径

的球体在某个结构或分子模型的表面上滚动时，该球体的中心描画出的表面。将残基X的侧链暴露(sidechain exposure)与由Gly-X-Gly三肽与主链呈延长构象确定的理想表面积(Miller等1987)进行比较。然后如由Miller等1987报告的，将ASA除以给定氨基酸类型的最大ASA来标准化暴露。侧链暴露以百分比表示，其中侧链暴露＝残基ASA/最大ASA。

为了鉴定给定抗体的CER残基的列表，我们使用了抗体的Fv区的结构(例如，抗体或抗体片段(诸如FAB)的X射线结构)或同源模型。如上所述确定所有氨基酸的侧链暴露。将侧链暴露与到最近CDR残基的距离相结合，生成了给定抗体的优选CER残基的列表。所有的计算，包括可及的表面积、CDR排布和残基至最近CDR的距离计算，均使用按照MOE.2015，使用CCG CDR定义(其是Kabat、Chothia和IMGT CDR定义的联合)进行。

Kabat方案(Kabat等，1991)是基于相同域类型序列之间高序列变异区的位置而开发的。它对抗体重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L V_k和V)编号。Chothia的方案(Al-Lazikani，1997)类似于Kabat的方案，但它纠正了在第一V_H互补性决定区(CDR)附近注释插入的位置，使之对应于一个结构环。我们将Kabat和Chothia CDR定义二者结合来定义V_H和V_LCDR。

图10A和10B显示了具有期望的侧链暴露且接近CDR氨基酸的CTLA4 Ab残基的列表。因此，在一个实施方案中，Cys替代位置在重链的Kabat编号1、3、25、46、68、72、76、82a或83处，或者在轻链的Kabat编号1、3、5、7、8、45、57、60、63、65、66、67和69处，如图10A中所示的。在另一实施方案中，Cys替代位置在重链的Kabat编号5、19、23、43、74、75、82b、84、85或105，或者在轻链的Kabat编号18、20、77或100，如图10B中所示的。

实施例10–缀合

将具有选定的Cys替代的抗体在Expi-CHO细胞中瞬时表达，并使用蛋白质A色谱的标准方案纯化。将经过纯化的抗体在含有2mM EDTA的pH7.2缓冲水溶液中，在37℃下，用过量(10摩尔当量)的还原剂TCEP(三(2-羧乙基)膦)处理1-3小时。将经过还原的变体抗体通过Sephadex G-25或离子交换柱来去除TCEP。在分析型反相HPLC系统上证实了抗体的还原。将经纯化、还原的抗体在缓冲的水溶液(pH 7.0)中，在4℃或室温下用过量(10倍摩尔当量)的二硫化物再氧化试剂，如dhAA(脱氢抗坏血酸)、CuSO₄(硫酸铜(II))、空气、H₂O₂(过氧化氢)、N-CS(N-氯代琥珀酰亚胺)或O₂(分子氧))处理。由280nm处的蛋白质溶液的吸收确定蛋白质浓度，由蛋白质与DTDP(二硫代二吡啶)反应确定巯基浓度，通过蛋白质浓度和巯基浓度来估计每个抗体的游离巯基的比例。在分析型反相HPLC上监测抗体的再氧化，并在分析型尺寸排阻柱上监测聚集水平。

如上所述的还原和再氧化后，用每个抗体巯基3倍摩尔当量的BM-接头处理缓冲水溶液(pH 7)中的抗体，其中BM-接头含半胱氨酸反应性官能团(马来酰亚胺，碘乙酰胺或类似反应性)。将BM-接头(通常溶解在去离子水中)加入到反应混合物中。使反应在室温下进行2小时或4℃下过夜。然后，通过蛋白A、离子交换、尺寸排阻或多种类型的色谱的组合来纯化结合物。进行了SDS-PAGE、Western印迹、HIC、反相HPLC和质谱等分析测试，以确认BM接头在工程化位置处的附着。

实施例11–接头部分的蛋白裂解酶切割

以下程序用于测定前药化抗体的matriptase酶切割，该抗体的接头部分具有matriptase酶可切割的肽序列。

前药化抗体(40μg)与1.3μg的人matriptase酶(30:1，R&D System，3946-SE-010)在100mM Tris缓冲液，pH7.6中在37℃下孵育。在每个时间点，将10μL样品与10μL淬灭缓冲液(含4M GdnCl和0.4M TCEP，pH 2.5的100mM磷酸盐缓冲液)混合，以同时使酶失活并还原前药化抗体。对淬灭的样品进行LC/MS分析。

实施例12–结合激活的CD4⁺ T细胞

测试了前药化抗体和去药前化(即，接头部分被切割)抗体的系列稀释液，通过APC标记的抗人IgG二抗检测结合。使用Canto流式细胞分析仪进行流式细胞术分析，并使用FlowJo分析软件确定几何平均荧光强度(GMFI)。将两个测试物品的结合与SEQ ID NO:1和NO:2的未前药化CTLA4 Ab的结合比较。

在图11A和11B中提供了说明性结果。在图11A中，标记为“CTLA4 Ab”的结合曲线是具有SEQ ID NO:1的天然CTLA4 Ab，没有任何Cys替代。标记为“S67C CTLA4–未切割的”的结合曲线是具有V_L S67C替代，然后用包含5kDa PEG的封闭/接头部分(Ie)前药化的CTLA4 Ab的结合曲线。从曲线可以看出，与CD4⁺T细胞的结合基本上被抑制了。最后，“S67C CTLA4-切割的”曲线显示，在matriptase酶切割封闭/接头部分后，结合基本上完全恢复，释放了5kDaPEG。

图11B显示了类似的实验的结果，该实验中CTLA4 Ab在V_H A23C处被前药化。同样，前药化后结合的丧失和接头切割后结合的恢复是明显的。

图11C至11E所示的额外的结合图。

实施例13–IL-2分泌测定

通过使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)的体外功能测定来表征前药化和去药前化抗体的活性。SEB是一种超抗原，可强烈激活T细胞并刺激细胞因子分泌。从2名健康的人类供体中分离新鲜的外周血单个核细胞(PBMC)，并用几种浓度的前药化和去药前化抗体处理。同时，添加次最佳浓度(85ng/mL)的SEB以刺激细胞。在孵育/处理的第3天后，监测T细胞激活，测量细胞因子IL-2的分泌。

使用以下程序：从斯坦福血液中心(Stanford Blood Center)的2名健康供体(分别在图12A/B和13A/B中的供体1和供体2)收集两层血沉棕黄层。使用标准的Ficoll-Paque分离方法从血沉棕黄层中分离出全部PBMC，该分离方法是在15mL Ficoll上覆盖20mL血沉棕黄层，并在2000rpm下无制动旋转20分钟。小心分离白色界面，并用PBS洗涤几次，以去除额外的Ficoll和血小板。然后用T细胞测定培养基重悬细胞。进行前药化和去前药化抗体的阳性对照抗体(CTLA4 Ab)的系列稀释，从(40μg/mL稀释至0.01μg/mL)以及从8μg/mL稀释至0.01μg/ml，并一式三份铺板于96孔平底组织培养板。将分离的PBMC以1×10⁵个细胞/孔添加到平板中，并以85ng/mL(通过滴定SEB并通过观察对T细胞增殖的刺激而确定的次最佳浓度的SEB)的超抗原SEB刺激。在37℃的培养箱中培养细胞3天。通过均相时间分辨荧光(HTRF)测量上清液中的IL-2浓度。使用Softmax Pro分析HTRF数据，并使用GraphPad Prism软件绘制图表。

图12A和图12B中显示了针对供体1的结合，且图13A和13B中显示了供体2的结果。在每种情况中，可以看到，V_L S67C或V_H A23C处前药化CTLA4Ab可导致IL-2诱导的减少，而去前药化可恢复IL-2诱导。图12A/B和13A/B中对照、前药化和去前药化抗CTLA4抗体与前述CD4⁺T细胞实施例和图11A/B中所述的那些相同。

我们观察到，与同种型抗KLH(钥孔戚血蓝蛋白)对照抗体引起的IL-2分泌相比，这些抗体在不同的供体中表现出剂量依赖性的活性。与CTLA4 Ab相比，前药化抗体显示功能活性降低。去前药化后，在前药化抗体的最高浓度下，IL-2分泌增加了约3倍，与CTLA4 Ab的阳性对照相似。此结果证实，通过附接封闭部分，减少抗体的结合，可降低在功能性T细胞测定中的活性，并且在去除封闭部分后这种活性可恢复。

实施例14–CD137抗体的前药化

在此实施例中使用了4种不同的CD137抗体：(a)CD137 Ab本身(SEQ ID NO：3和NO：4)；(b)介由V_L S67处替换上的Cys与封闭部分-接头(If)缀合的CD137 Ab，其具有2kDaPEG；(c)介由V_L S67处替换上的Cys与封闭部分-接头(Ih)缀合的CD137 Ab，其具有10kDaPEG；和(d)介由V_L S67处替换上的Cys与接头(III)(结构如下)缀合的CD137 Ab，其不具有封闭部分，充当“肽对照”。

进行了两个不同的测定。在第一个测定中，比较了CD137 Ab及其变体(u)-(d)与CD8⁺ConA激活的脾型的结合，该比较使用平均荧光单位，，用第二Alexa 488缀合的山羊抗人抗体通过流式细胞术进行。结果呈现在图14中。它们显示CD137 Ab和变体(d)有效结合，但变体(b)和(c)没有结合。(Invitrogen小鼠同种型对照抗体，目录号：MA1-10406，用作同种型对照)。因此，虽然V_L S67C位点与CDR氨基酸接近，但附接小肽(如具有(III)的肽)不足以有效地抑制结合。然而，如果存在相当大的封闭部分，诸如2kDa或10kDa PEG，确实会导致抑制。

第二个测定是功能测定。在第一方面中，如图15A所示，测量了激活的CD8 T细胞的IFNg(干扰素-γ)的分泌。与OT-1CD8⁺ T细胞SIIQFEKL肽激活的脾细胞结合的结果一样，CD137 Ab和变体(d)有效，但变体(b)和(c)无效，这表明其活性的抑制。第二方面显示在图15B中：Q4肽被添加至OT-1细胞以诱导细胞的表面上的CD137受体的表达。然后CD137与其受体的结合诱导CD8 T细胞增殖。CD137 Ab和变体(d)还诱导了抗原特异性CD8 T细胞增殖，但变体(c)和(d)并未诱导。抗KLH抗体(目录#：MA1-10406b)、“无肽”和Q4单点是阴性对照。

本发明的前述详细描述包括主要或排外地涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便起见，特定特征可能不仅在其公开的段落中是相关的，并且本文的公开内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应该理解，在特定附图或实施方案的上下文中公开了具体特征的情况下，也可以在适当的程度上在另一附图或实施方案的上下文中，与另一特征结合或总体上在本发明中使用此类特征。

此外，尽管已经根据某些优选的实施方案对本发明进行了具体描述，但是本发明不限于此类优选的实施方案。相反，本发明的范围由所附权利要求书限定。

参考文献

以下提供了在本说明书中以第一作者(或发明人)和较早日期的缩写方式引用的以下参考文献的完整引用。这些参考文献的每一个出于所有目的通过引用并入本文。

Al-Lazikani,B.et al.(1997)“Standard conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins,”J.Mol.Biol.,273,927–948.

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Tipton et al.,US 2017/0044259 A1(2017).

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Wang et al.,US 2016/0009817 A1(2016).

West et al.,US 9,127,053 B2(2015).

West et al.,US 9,487,590 B2(2016).[2016a].

West et al.,US 2016/0311903 A1(2016).[2016b].

West et al.,US 2016/0355587 A1(2016).[2016c].

Williams et al.,US 9,193,791 B2(2015).

序列表

下表总结了本说明书中公开的序列。

序列表

<110> 百时美施贵宝公司

<120> 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法

<130> 13002-WO-PCT

<150> US 62/546252

<151> 2017-08-16

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_特征

<223> 抗CTLA4抗体重链

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(118)

<223> 可变区

<220>

<221> MISC_特征

<222> (23)..(23)

<223> Xaa是Ala或Cys

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDR1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(66)

<223> CDR2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (99)..(107)

<223> CDR3

<220>

<221> MISC_特征

<222> (119)..(448)

<223> 恒定区

<220>

<221> MISC_特征

<222> (215)..(215)

<223> R214 (EU)同种异型

<220>

<221> MISC_特征

<222> (357)..(357)

<223> E356 (EU)同种异型

<220>

<221> MISC_特征

<222> (359)..(359)

<223> M358 (EU)同种异型

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_特征

<223> 抗CTLA4抗体轻(κ)链

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(108)

<223> 可变区

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(35)

<223> CDR1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (51)..(57)

<223> CDR2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (68)..(68)

<223> Xaa是Ser或Cys

<220>

<221> MISC_特征

<222> (90)..(98)

<223> CDR3

<220>

<221> MISC_特征

<222> (109)..(215)

<223> 恒定区

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Xaa Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠-小鼠嵌合的

<220>

<221> MISC_特征

<223> 抗CD137抗体重链

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(113)

<223> 可变区

<220>

<221> MISC_特征

<222> (31)..(35)

<223> CDR1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (50)..(65)

<223> CDR2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (98)..(102)

<223> CDR3

<220>

<221> MISC_特征

<222> (114)..(437)

<223> 恒定区

<400> 3

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ala Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Asp

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Tyr Asp Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Ile Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ile His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr

180 185 190

Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val

210 215 220

Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val

225 230 235 240

Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile

245 250 255

Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

260 265 270

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

275 280 285

Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu

290 295 300

Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala

305 310 315 320

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro

325 330 335

Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys

340 345 350

Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr

355 360 365

Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr

370 375 380

Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu

385 390 395 400

Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser

405 410 415

Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser

420 425 430

His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠-小鼠嵌合的

<220>

<221> MISC_特征

<223> 抗CD137抗体轻(κ)链

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(106)

<223> 可变区

<220>

<221> MISC_特征

<222> (24)..(33)

<223> CDR1

<220>

<221> MISC_特征

<222> (49)..(55)

<223> CDR2

<220>

<221> MISC_特征

<222> (88)..(96)

<223> CDR3

<220>

<221> MISC_特征

<222> (107)..(213)

<223> 恒定区

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Ile Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ala Ile Asn Thr Met Glu Thr Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Thr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 5

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 6

Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 7

Pro Leu Gly Leu Ala Gly

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 8

Val Leu Val Pro Met Ala Met Met Ala Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是Ala或Val

<220>

<221> MISC_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 9

Xaa Xaa Gln Ala Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 10

Ala Gly Pro Arg

1

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 11

Ala Ala Asn Leu

1

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 12

Pro Thr Asn Leu

1

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<400> 13

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Ala或Ser

<400> 14

Asp Glu Xaa Xaa Xaa Cys Xaa

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (3)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_特征

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Ala或Ser

<400> 15

Asp Leu Xaa Xaa Xaa Thr Xaa

1 5

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶可切割的肽

<220>

<221> MISC_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Arg或Lys

<400> 16

Leu Ser Gly Xaa

1

Claims

1.一种根据式(I)的前药化抗体

(BM-L)_m-Ab (I)

其中

Ab是一种抗体，其重链可变区或轻链可变区中有至少一个氨基酸被Cys替换，其中被替换的氨基酸(a)在框架区中；(b)具有至少30％的侧链暴露；且(c)距离CDR氨基酸

内，优选

内；

BM是抑制Ab与其抗原结合的封闭部分；

每个L独立地是与BM和Ab键合的接头部分，L包含可切割部分且在前述Cys处与Ab键合；且

M是1、2、3或4。

2.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中抗体Ab中的所述至少一个被替换的氨基酸位于所述重链可变区的Kabat位置1、3、5、19、23、25、43、46、68、72、74、75、76、82a、82b、83、84、85或105处，或者位于所述轻链可变区的Kabat位置1、3、5、7、8，18、20、45、57、60、63、65、66、67、69、77或100处。

3.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中抗体Ab中的所述至少一个被替换的氨基酸位于所述重链的Kabat位置23处或所述轻链的Kabat位置67处。

4.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中抗体Ab中的所述至少一个被替换的氨基酸位于所述重链的Kabat位置23处。

5.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中抗体Ab中的所述至少一个被替换的氨基酸位于所述轻链的Kabat位置67处。

6.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中封闭部分BM是聚(乙二醇)。

7.根据权利要求5所述的前药化抗体，其中所述聚(乙二醇)的分子量为至少约2kDa。

8.根据权利要求1所述的前药化抗体，其中L中的可切割部分是可被酶切割的肽。

9.根据权利要求8所述的前药化抗体，其中所述可被酶切割的肽可被选自下组的至少一种酶切割：成纤维细胞激活蛋白(FAP)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA，尿激酶)、MT-SP1/蛋白裂解酶、豆荚蛋白和基质金属蛋白酶。

10.根据权利要求9所述的前药化抗体，其中所述酶是matriptase。

11.根据权利要求8所述的前药化抗体，其中所述可被酶切割的肽是LSGRSDNH(SEQ IDNO:5)、LSGX(SEQ ID NO:16)或LSGK(SEQ ID NO:16)。

12.根据权利要求1所述的前药化抗体，其具有根据式(IIa)至(IIh)的结构：

13.一种抗体，其在轻链的Kabat位置67处具有Cys。

14.根据权利要求13所述的抗体，其是抗CTLA4抗体。

15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述抗CTLA4抗体具有

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸31-35的重链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:1的氨基酸50-66的重链CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-107重链CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸24-35的轻链CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:2的氨基酸51-57的轻链CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:2的氨基酸90-98的轻链CDR3。

16.根据权利要求14所述的抗体，其具有：

包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-118(其中Xaa是Ala)的重链可变区，和

包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-108(其中Xaa是Cys)的轻链可变区。

17.一种抗体，其在重链的Kabat位置23处具有Cys。

18.根据权利要求17所述的抗体，其是抗CTLA4抗体。

19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗CTLA4抗体具有

(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸31-35的重链CDR1；

(b)包含SEQ ID NO:1的氨基酸50-66的重链CDR2；

(c)包含SEQ ID NO:1的氨基酸99-107的重链CDR3；

(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸24-35的轻链CDR1；

(e)包含SEQ ID NO:2的氨基酸51-57的轻链CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO:2的氨基酸90-98的轻链CDR3。

20.根据权利要求18所述的抗体，其具有

包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-118(其中Xaa是Cys)的重链可变区，和

包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-108(其中Xaa是Ser)的轻链可变区。