EA027887B1 - Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающиеся с белками 191p4d12 - Google Patents

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающиеся с белками 191p4d12 Download PDF

Info

Publication number
EA027887B1
EA027887B1 EA201300411A EA201300411A EA027887B1 EA 027887 B1 EA027887 B1 EA 027887B1 EA 201300411 A EA201300411 A EA 201300411A EA 201300411 A EA201300411 A EA 201300411A EA 027887 B1 EA027887 B1 EA 027887B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
cancer
antibodies
drug
alkyl
Prior art date
Application number
EA201300411A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300411A1 (ru
Inventor
Даулет Сатпаев
Роберт Кендол Моррисон
Карен Джейн Мейрик Моррисон
Жан Гудас
Ая Джейкобовитц
Майкл Торгов
Зили Эн
Original Assignee
Эдженсис, Инк.
Сиэтл Джинетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45871300&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA027887(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Эдженсис, Инк., Сиэтл Джинетикс, Инк. filed Critical Эдженсис, Инк.
Publication of EA201300411A1 publication Critical patent/EA201300411A1/ru
Publication of EA027887B1 publication Critical patent/EA027887B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A61N5/1001—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy using radiation sources introduced into or applied onto the body; brachytherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

В изобретении описаны конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающиеся с белком 191P4D12 и его вариантами. Указанные конъюгаты входят в состав фармацевтических композиций для лечения рака.

Description

Описанное здесь изобретение относится к антителам, связывающим фрагментам и конъюгатам антитело-лекарственное средство (ЛОСУ), которые связываются с белками, названными 191Е4О12. Изобретение также относится к прогностическим, профилактическим и терапевтическим способам и композициям, пригодным для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих 191Е4О12.
Известный уровень техники
Рак является второй после ишемической болезни сердца лидирующей причиной смерти человека. Миллионы людей по всему миру умирают от рака каждый год. Ежегодно только в Соединенных Штатах, по данным Американского Онкологического Общества, рак является причиной смерти более полумиллиона человек, причем в год диагностируется более 1,2 млн новых случаев. В то время как смертность от заболеваний сердца значительно снижается, смертность от рака в целом возрастает. По прогнозам, в начале следующего столетия рак станет ведущей причиной смерти.
Некоторые формы рака выделяются как главные убийцы во всем мире. В частности, карциномы легких, предстательной железы, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, яичника и мочевого пузыря являются основными причинами смерти от рака. Эти и практически все прочие карциномы обладают общим свойством - летальностью. За очень редким исключением метастазирование карциномы приводит к смертельному исходу. Кроме того, общий опыт показывает, что жизнь, даже для тех больных раком, которые остались живы после первичного рака, кардинально изменяется. Множество больных раком испытывают сильную тревогу, обусловленную сознанием возможности рецидива или неэффективности лечения. Множество больных раком испытывают физическое истощение после лечения. Кроме того, многие больные раком подвергаются рецидивам.
По всему миру рак предстательной железы является четвертым среди наиболее распространенных видов рака у мужчин. В Северной Америке и Северной Европе он, безусловно, является самым распространенным видом рака у мужчин и второй лидирующей причиной смерти от рака у мужчин. Только в Соединенных Штатах более 30000 мужчин ежегодно умирают от этого заболевания, уступающего только раку легких. Несмотря на масштабы этих показателей, эффективного лечения метастатического рака предстательной железы все еще не существует. Хирургическое удаление предстательной железы, лучевая терапия, гормон-подавляющая терапия, хирургическая кастрация и химиотерапия по-прежнему являются основными методами лечения. К сожалению, эти методы лечения для многих не являются эффективными и часто связаны с нежелательными последствиями.
К вопросу о диагностировании, существенным ограничением в постановке диагноза и тактике ведения заболевания остается недостаток маркеров опухолей предстательной железы, которые могли бы достоверно выявлять локализованные опухоли на ранних стадиях. Несмотря на то что количественный анализ сывороточного простат-специфического антигена (ЕЗА) был очень полезным инструментом, его специфичность и универсальность по праву считаются недостаточными в некоторых важных аспектах.
Прогресс в идентификации дополнительных специфических маркеров рака предстательной железы был достигнут путем создания ксенотрансплантатов рака предстательной железы, способных повторять разные стадии заболевания у мышей. Ксенотрансплантаты ЕАЕС (рак предстательной железы ЛосАнджелес) представляют собой ксенотрансплантаты рака предстательной железы, пассаж которого выжил у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ЗСГО) и обнаружил способность имитировать переход от андрогено-зависимости к андрогено-независимости (К1ет е! а1., 1997, \а1. Меб. 3:402). Идентифицированные совсем недавно маркеры рака предстательной железы включают РСТА-1 (Зи е! а1., 1996, Ργοο. Ναί1. Асаб. Зсъ иЗА 93: 7252), простат-специфический мембранный антиген (Ρ3ΜΑ) (Ρΐηίο е! а1., С1т Сапсег Ке§ 1996 Зер 2 (9): 1445-51), 3ΤΕΑΡ (НиЪегЦ е! а1., Ργο^ Ναΐΐ. Асаб. Зсъ ϋ3Α. 1999 Вес 7; 96(25): 14523-8) и антиген стволовых клеток предстательной железы (ВЗСА) (Кейег е! а1., 1998, Вгос. Жб. Асаб. ЗсЕ иЗА 95: 1735).
Несмотря на то что обнаруженные ранее маркеры, такие как Ρ3Α, способствуют действиям, направленным на диагностирование и лечение рака предстательной железы, существует необходимость в выяв- 1 027887 лении дополнительных маркеров и терапевтических мишеней для рака предстательной железы и родственных видов рака для дальнейшего совершенствования диагностики и терапии. По оценкам, в 2000 г. в Соединенных Штатах наблюдалось 130200 случаев колоректального рака, включая 93800 случаев рака толстой кишки и 36400 случаев рака прямой кишки.
Колоректальный рак является третьим наиболее распространенным видом рака у мужчин и женщин. Заболеваемость значительно снизилась в период 1992-1996 гг. (-2.1% в год). Исследования указывают на то, что это снижение было обусловлено увеличением массового обследования и удалением полипов, предотвращающим развитие полипов в инвазивные виды рака. В 2000 г. насчитывалось 56300 смертей (47700 от рака толстой кишки, 8600 от рака прямой кишки), что составляет приблизительно 11% всех смертей от рака в США.
В настоящее время, хирургическая операция является наиболее распространенной формой лечения колоректального рака, а для неметастазирующих видов рака она зачастую является излечивающей операцией. Химиотерапия или химиотерапия плюс облучение назначается до или после хирургической операции для большинства пациентов, у которых рак привел к глубокому прободению стенки кишечника или метастазировал в лимфатические узлы. Иногда при раке толстой кишки необходима постоянная колостомия (создание брюшного отверстия для удаления экскрементов), а в некоторых случаях она требуется при раке прямой кишки. Потребность в эффективных методах диагностики и лечения колоректального рака по-прежнему сохраняется.
Рак мочевого пузыря составляет приблизительно 5% у мужчин из всех новых случаев рака в Соединенных Штатах (пятое наиболее распространенное новообразование) и 3% у женщин (восьмое наиболее распространенное новообразование). Заболеваемость медленно увеличивается одновременно с увеличением популяции пожилых людей. В 1998 г. насчитывалось 54500 случаев, включая 39500 у мужчин и 15000 у женщин. Стандартизированная по возрасту заболеваемость в Соединенных Штатах составляет 32 на 100000 для мужчин и восемь на 100000 у женщин. Исторически сложившееся соотношение заболеваемости среди мужчин и женщин (мужчины/женщины), равное 3:1, может быть снижено в связи с тенденциями табакокурения у женщин. В 1998 г. насчитывалось 11000 смертей от рака мочевого пузыря (7800 у мужчин и 3900 у женщин). Заболеваемость и смертность от рака мочевого пузыря резко увеличивается с возрастом и является растущей проблемой в связи со старением популяции.
Большинство видов рака мочевого пузыря снова возникает (рецидивирует) в мочевом пузыре. С раком мочевого пузыря справляются комбинацией трансуретральной резекции мочевого пузыря (ТИК) и внутрипузырной химиотерапии или иммунотерапии. Множественная и рецидивирующая природа рака мочевого пузыря акцентирует внимание на недостатках ТИК. Большинство видов рака, прорастающих в мышечный слой, не излечиваются только с помощью ТИК. Радикальная цистэктомия и отведение мочи являются наиболее эффективными способами устранения рака, но оказывают явное влияние на мочевую и сексуальную функцию. Таким образом, остается существенная необходимость в методах лечения, более благоприятных для больных раком мочевого пузыря.
В 2000 г. насчитывалось 164100 новых случаев рака легких и бронхов, что составило 14% всех случаев постановки диагноза рака в США. Заболеваемость раком легких и бронхов значительно снизилась у мужчин, от максимума, равного 86,5 на 100000 в 1984 г. до 70,0 в 1996 г. В 1990-х темп роста заболеваемости у женщин начал замедляться. В 1996 г. заболеваемость у женщин составляла 42,3 на 100000.
В 2000 г. насчитывалось 156,900 случаев смерти от рака легких и бронхов, что составило 28% всех смертей от рака. В период 1992-1996 гг. смертность от рака легких значительно снизилась у мужчин (-1,7% в год), в то время как показатели для женщин все еще значительно возрастали (0,9% в год). С 1987 больше женщин умирало каждый год от рака легких, чем от рака молочной железы, который более 40 лет являлся основной причиной смерти от рака у женщин. Наиболее вероятно, что снижение заболеваемости раком легких и смертности является следствием снижения уровня табакокурения в течение предыдущих 30 лет; однако снижение тенденции табакокурения у женщин отстает от такового у мужчин. Вызывает озабоченность, что, несмотря на снижение потребления табака взрослым населением, употребление табака молодежью снова растет.
Варианты лечения рака легких и бронхов определяются типом и стадией рака и включают оперативное вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию. Для многих локализованных видов рака оперативное вмешательство обычно является предпочтительным видом лечения. Поскольку заболевание, как правило, распространилось к моменту его обнаружения, лучевую терапию и химиотерапию зачастую необходимо сочетать с оперативным вмешательством. Химиотерапия отдельно или комбинированная с облучением является предпочтительным вариантом лечения мелкоклеточного рака легких; при такой схеме лечения большой процент больных достигает ремиссии, в некоторых случаях длительной. Однако существует постоянная необходимость в эффективных лечебных и диагностических подходах к раку легких и бронхов.
По оценкам, в течение 2000 г. в Соединенных Штатах предполагалось возникновение 182800 новых случаев инвазивного рака молочной железы у женщин. Кроме того, в 2000 г. приблизительно 1400 новых случаев рака молочной железы предполагалось диагностировать у мужчин. После возрастания приблизительно на 4% в год в 1980-х, заболеваемость раком молочной железы у женщин выровнялась в 1990-х
- 2 027887 приблизительно до 110,6 случаев на 100000.
Только в США в 2000 г. насчитывалось 41200 смертей (40800 женщин, 400 мужчин) от рака молочной железы. Рак молочной железы занимает второе место среди смертей от рака у женщин. По самым последним данным показатели смертности значительно снизились в период 1992-1996 гг. с наибольшим снижением у молодых женщин, и белых, и черных. Это снижение, по всей видимости, стало результатом более раннего выявления и усовершенствованного лечения.
Принимая во внимание медицинское состояние и предпочтения пациента, лечение рака молочной железы может включать секторальную резекцию (локальное удаление опухоли) и удаление подмышечных лимфатических узлов; мастэктомию (хирургическое удаление молочной железы) и удаление подмышечных лимфатических узлов; лучевую терапию; химиотерапию или гормональную терапию. Во многих случаях два или более способов используются в комбинации. Многочисленные исследования показали, что на ранних стадиях заболевания показатели длительного выживания после удаления опухоли молочной железы в сочетании с лучевой терапией аналогичны показателям выживаемости после проведения модифицированной радикальной мастэктомии. Значительные достижения методов реконструкции обеспечивают несколько вариантов реконструкции молочной железы после мастэктомии. В последнее время такая реконструкция проводится одновременно с мастэктомией.
Местное удаление протоковой карциномы ίη 8Йи (ОС18) с достаточным количеством окружающей нормальной ткани молочной железы может предотвратить местный рецидив ИС18. Облучение молочной железы и/или тамоксифен могут снизить вероятность возникновения ИС18 в оставшейся ткани молочной железы. Это важно, поскольку в отсутствие лечения ИС18 может развиться в инвазивный рак молочной железы. Тем не менее, у этих видов лечения есть серьезные побочные эффекты и осложнения. Таким образом, существует необходимость в эффективных методах лечения рака молочной железы.
В 2000 г. в Соединенных Штатах насчитывалось 23100 новых случаев рака яичников. Он составил 4% всех случаев рака у женщин и занял второе место среди гинекологических видов рака. В период 1992-1996 гг. заболеваемость раком яичников была значительно снижена. В 2000 г. насчитывалось 14000 смертей вследствие рака яичника. Рак яичника является причиной большего числа смертей по сравнению с любым другим раком женской репродуктивной системы.
Методами лечения рака яичника являются оперативное вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия. Оперативное вмешательство, как правило, включает удаление одного или обоих яичников, фаллопиевых труб (сальпингоовариэктомия) и матки (гистероэктомия). При некоторых очень ранних опухолях удаляют только затронутый яичник, особенно у молодых женщин, желающих иметь детей. При прогрессирующем заболевании делаются попытки удалить всю область внутрибрюшинного поражения для усиления действия химиотерапии. Действительно, наблюдается значительная необходимость в эффективных методах лечения рака яичников.
В 2000 г. в Соединенных Штатах насчитывалось 28300 новых случаев рака поджелудочной железы. За последние 20 лет показатели рака поджелудочной железы у мужчин снизились. Показатели у женщин оставались приблизительно постоянными, но возможно начинают снижаться. По оценкам, в 2000 г. в Соединенных Штатах рак поджелудочной железы стал причиной 28200 смертей. В течение последних 20 лет наблюдается небольшое, но достоверное снижение показателей смертности у мужчин (приблизительно -0,9% в год), в то время как среди женщин показатели незначительно возросли.
Методами лечения рака поджелудочной железы являются оперативное вмешательство, лучевая терапия и химеотерапия. Эти варианты лечения могут увеличить продолжительность жизни и/или облегчить симптомы у многих пациентов, но маловероятно, что они могут излечить большинство пациентов. Имеется существенная необходимость в дополнительных терапевтических и диагностических методах в отношении рака. Они включают использование антител, вакцин и малых молекул в качестве способов лечения. Кроме того, также существует необходимость использования этих способов воздействия в качестве инструментов исследования для диагностирования, выявления, контролирования и продвижения существующего уровня техники во всех областях лечения и изучения рака.
Уже была осознана терапевтическая польза моноклональных антител (тАЬз) (О. КоЫег апб С. Μίΐ51сш. ЫаШге 256:495-497 (1975)). На сегодняшний день моноклональные антитела приняты в качестве методов лечения при пересадке органов и тканей, раке, инфекционных заболеваниях, сердечнососудистых заболеваниях и воспалении. Разные изотипы обладают разными эффекторными функциями. Такие различия в функции отражаются в различных пространственных структурах разных изотипов иммуноглобулинов (Ρ.Μ. Акал е1 а1., Аппиа1 Ксу. 1штипо1, 6:555-580 (1988)).
Поскольку мыши удобны для иммунизации и распознают большинство человеческих антигенов как чужеродные, тАЬз (моноклональные антитела) к человеческим мишеням, обладающие терапевтическим потенциалом, как правило, имеют мышиное происхождение. Однако как терапевтические средства для человека мышиные тАЬз имеют неустранимые недостатки. Их применение требует более частого введения доз, поскольку тАЬз имеют более короткое время полужизни при циркуляции в крови у людей, чем человеческие антитела. К тому же немаловажно, что неоднократное введение мышиных антител приводит к тому, что иммунная система человека отвечает распознаванием белка мыши как чужеродного и образованием человеческих антимышных антител (НАМА). Такой НАМА-ответ может приводить к ал- 3 027887 лергической реакции и быстрому устранению мышиных антител из системы, таким образом, делая лечение мышиными антителами бесполезным. Во избежание подобных явлений, были предприняты попытки создания человеческих иммунных систем у мышей.
Первоначальные попытки ставили целью создание трансгенных мышей, способных реагировать на антигены образованием антител, имеющих человеческие последовательности (см. Вгиддетапп е! а1., Ргос. Νηί1. Асаб. δα. И8А 86:6709-6713 (1989)), но ограничивались количеством ДНК, которое может стабильно поддерживаться доступными векторами для клонирования. Использование векторов для клонирования на основе искусственной хромосомы дрожжей (УАС) было первым шагом к введению крупных фрагментов зародышевой линии локуса 1д человека в трансгенных млекопитающих. В основном, большинство генов участков V, Ό и 1 человека располагалось на одинаковом расстоянии, обнаруженном в геноме человека, а константные области человека вводились мышам при помощи УАСх Одна из таких трансгенных линий мышей известна как ксеномыши ХепоМоике® и коммерчески доступна от компании Атдеп Ргетоп!, 1пс. (Ргетоп! СА).
Сущность изобретения
Изобретение предоставляет антитела, связывающие фрагменты и конъюгаты антител с лекарственными средствами (АЭСк), которые связываются с белками 191Ρ4Ό12 и полипептидными фрагментами белков 191Ρ4Ό12. В некоторых вариантах осуществления изобретение включает полностью человеческие антитела, конъюгированные с терапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления существует исключение, что полная последовательность нуклеиновой кислоты фиг. 3 не кодируется и/или полная последовательность нуклеиновой кислоты фиг. 2 не подготовлена. В определенных вариантах осуществления полная последовательность нуклеиновой кислоты фиг. 3 кодируется и/или полная последовательность нуклеиновой кислоты фиг. 2 подготовлена, любая из которых находится в соответствующей стандартной лекарственной форме, предназначенной для человека.
Изобретение также предоставляет различные иммуногенные или терапевтические композиции, такие как конъюгаты антител с лекарственными средствами, и принципы лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих 191Ρ4Ό12, таких как злокачественные опухоли тканей, перечисленные в табл. I.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена кДНК и аминокислотная последовательность 191Ρ4Ό12. Начальный метионин подчеркнут. Открытая рамка считывания простирается в пределах нуклеиновых кислот 264-1796, включая стоп-кодон.
Фиг. 2А, В - нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности 191Ρ4Ό12 антител. Фиг. 2А - кДНК и аминокислотная последовательность тяжелой цепи На22-2(2,4)6.1. Лидерная последовательность подчеркнута двойной линией, одной линией подчеркнута вариабельная область тяжелой цепи и пунктирной линией подчеркнута константная область человеческого 1дО1. Фиг. 2В - кДНК и аминокислотная последовательность легкой цепи На22-2(2,4)6.1. Лидерная последовательность подчеркнута двойной линией, одной линией подчеркнута вариабельная область легкой цепи, пунктирной линией подчеркнута каппа константная область человека.
Фиг. 3А, В - аминокислотные последовательности 191Ρ4Ό12 антител. Фиг. ЗА - аминокислотная последовательность тяжелой цепи На22-2(2,4)6.1. Лидерная последовательность подчеркнута двойной линией, одной линией подчеркнута вариабельная область тяжелой цепи и пунктирной линией подчеркнута константная область человеческого 1дО1. Фиг. ЗВ - аминокислотная последовательность легкой цепи На22-2(2,4)6.1. Двойное подчеркивание - лидерная последовательность, одной линией подчеркнута вариабельная область легкой цепи, пунктирной линией подчеркнута каппа константная область человека.
Фиг. 4А, В - выравнивание На22-2(2,4)6.1 антител по отношению к зародышевой линии 1д человека. Фиг. 4А - выравнивание тяжелой цепи На22-2(2,4)6.1 по отношению к зародышевой линии 1д человека. Фиг. 4В - выравнивание легкой цепи На22-2(2,4)6.1 по отношению к зародышевой линии 1д человека.
Фиг. 5А, В - анализ связывания На22-2(2,4)6.1 МАЬ. Фиг. 5А - КАТ-контрольные и ΡΛΤ-191Ρ4Ω12 клетки были окрашены На22-2(2,4)6.1 МаЬ, полученными или от гибридомы, или клеток СНО. Связывание определяли с помощью проточной цитометрии. Результаты показывают, что На22-2(2,4)6.1 МАЬ, рекомбинантно экспрессированные в клетках СНО, секретируются и специфически связываются с 191Ρ4Ό12, расположенным на клеточной поверхности. Фиг. 5В - На22-2(2,4)6.1 МАЬ, полученные от гибридомы или СНО клеток, были проверены в отношении связывания с рекомбинантным очищенным внеклеточным белком 191Ρ4Ό12 с помощью ЕЬРЗА. Результаты показывают, что белок 191Ρ4Ό12, связавшийся с На22-2(2,4)6.1, полученными от клеток СНО и гибридомы, был одним и тем же белком.
Фиг. 6 - определение аффинности На22-2(2,4)6.1усММАЕ с помощью РАС8 с использованием ΡС3человек-191Ρ4^12 клеток. Аффинность составляет 0,69 Кд.
Фиг. 7 - определение аффинности На22-2(2,4)6.1усММАЕ с помощью РАС8 при использовании клеток РС3-циномолгус-191Р4012. Аффинность составляет 0,34 Кд.
Фиг. 8 - определение аффинности На22-2(2,4)6.1усММАЕ методом РАС8 при использовании клеток Ρί'.’3-ιψΒκ;·ι-191Ρ4Ο12. Аффинность составляет 1,6 Кд.
Фиг. 9А-Э - клеточная цитотоксичность, опосредованная На22-2(2,4)6.1усММАЕ. Фиг. 9А - анализ клеточной цитотоксичности при использовании клеток ΡС3-человек-191Р4^12. Фиг. 9В - анализ клеточ- 4 027887 ной цитотоксичности при использовании клеток РС3-циномолгус-191Р4О12. Фиг. 9С - анализ клеточной цитотоксичности при использовании клеток РС3-крыса-191Р4О12. Фиг. 9Ό - анализ клеточной цитотоксичности при использовании клеток РС3-№о.
Фиг. 10 - картирование домена На22-(2,4)6.1 МАЬ с помощью РАС8.
Фиг. 11 - картирование домена На22-2(2,4)6.1 МАЬ с помощью Вестерн-блоттинга.
Фиг. 12 - оценка На22-2(2,4)6.1 МАЬ на подкожной модели формирования опухоли с использованием ксенотрансплантата рака легкого человека АО-Ь4 на мышах линии 8СГО. Результаты показывают, что 191Р4Э12 МАЬк незначительно ингибируют рост опухоли на модели ксенотрансплантата рака легкого человека АО-Ь4 у мышей 8СГО.
Фиг. 13 - оценка На22-2(2,4)6.1 МАЬ на подкожной модели формирования опухоли с использованием ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека НРАС на мышах 8СГО. Результаты показывают, что 191Р4Э12 МАЬк не ингибировали рост опухоли ксенотрансплантата поджелудочной железы человека у мышей 8СГО по сравнению с контрольными антителами.
Фиг. 14 - оценка На22-2(2,4)6.1 МАЬ на подкожной модели формирования опухоли с использованием ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека АО-Рапе3 на мышах 8СГО. Результаты показывают, что 191Р4Э12 МАЬк не ингибировали рост опухоли ксенотрансплантата поджелудочной железы человека у мышей 8СГО по сравнению с контрольными антителами.
Фиг. 15 - эффективность На22-2(2,4)6.1-усММАЕ на подкожных ксенотрансплантатах рака легкого человека АО-Ь4 у мышей линии 8СГО. Результаты показывают, что лечение На22-2(2,4)6.1-усММАЕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов рака легкого АО-Ь4, подкожно-привитых бестимусным мышам, по сравнению с леченым и с нелеченым контролем.
Фиг. 16 - эффективность На22-2(2,4)6.1-уеММАЕ на подкожных ксенотрансплантатах рака молочной железы человека ВТ-483 у мышей линии 8СГО. Результаты показывают, что лечение На22-2(2,4)6.1уеММАЕ значительно ингибировало рост ВТ-483 ксенотрансплантатов рака молочной железы, подкожно-привитых мышам 8СГО, по сравнению с лечеными и нелечеными контрольными АЭСк.
Фиг. 17 - эффективность На22-2(2,4)6.1-уеММАЕ на подкожных ксенотрансплантатах рака мочевого пузыря человека АО-В1 на мышах 8СГО. Результаты показывают, что лечение На22-2(2,4)6.1уеММАЕ значительно ингибировало рост АО-В1 ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря по сравнению с контрольными АЭСк.
Фиг. 18 - эффективность На22-2(2,4)6.1-уеММАЕ на подкожных ксенотрансплантатах рака поджелудочной железы человека АО-Рапс2 на мышах 8СШ. Результаты показывают, что лечение На222(2,4)6.1-усММАЕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы АО-Рапс2 по сравнению с контрольными АЭСк.
Фиг. 19 - эффективность На22-2(2,4)6.1-усММАЕ на подкожных трансплантатах рака легкого человека АО-Рапс4 на мышах 8СЮ. Результаты показывают, что лечение На22-2(2,4)6.1-усММАЕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы АО-Рапс4 по сравнению с контрольными АЭСк.
Фиг. 20 - эффективность На22-2(2,4)6.1-усММАЕ в сравнительных дозировках на подкожных ксенотрансплантатах рака мочевого пузыря человека АО-В8 на мышах 8СГО. Результаты показывают, что лечение На22-2(2,4)6.1усММАЕ в дозе 10мг/кг значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря АО-В8 по сравнению с На22-2(2,4)6.1усММАЕ в дозе 5 мг/кг.
Фиг. 21А-Ы - обнаружение белка 191Р4Э12 в образцах раковых пациентов с помощью иммуногистохимического анализа (1НС). Фиг. 21А, В представляют образцы рака мочевого пузыря. Фиг. 21С, Ό представляют образцы рака молочной железы. Фиг. 21Е-Р представляют образцы рака поджелудочной железы. Фиг. 21О, Н представляют образцы рака легких. Фиг. 21Ι-Ι представляют образцы рака яичника. Фиг. 21К, Ь представляют образцы рака пищевода. Фиг. 21М, N представляют образцы рака головы и шеи.
На фиг. 22А-В представлены кривые связывания, использованные для определения аффинности На22-2(2,4)6.1 МаЬ и На22-2(2,4)6.1усММАЕ к очищенному рекомбинантному 191Р4Э12 (ЕСЭ аминокислоты 1-348).
Фиг. 23А-Э показывают связывание На22-2(2,4)6.1 с РС3 клетками, экспрессирующими 191Р4Э12 (фиг. 23А) и ортологи обезьяны циномолгус (фиг. 23В), крысы (фиг. 23С) и мыши (фиг. 23Ό).
Фиг. 24А-Э показывает, что связывание На22-2(2,4)6.1 с двойным мутантным А761, 891Ν сходно со связыванием с мышиным ортологом.
Фиг. 25 показывает модель У-домена 191Р4Э12 исходя из опубликованных данных о кристаллической структуре членов семейства 191Р4Э12 и белки, содержащие 1д-домен, с использованием РуМОЬ. Показаны положения А1а-76 (испещренное точками) и 8ег-91 (заштрихованное).
Фиг. 26А-С показывает связывание На22-2(2,4)6.1 с клетками, экспрессирующими У-домен (фиг. 26А) а также диким типом 191Р4Э12 (фиг. 26В), но не с клетками, экспрессирующими С1С2 домен, полученными ранее (фиг. 26С).
- 5 027887
Подробное описание изобретения
План разделов.
I) Определения.
II) 191Ρ4Ό12 антитела.
III) Конъюгаты антитело-лекарственное средство, в общих чертах.
ΙΙΙ(Α) Майтанзиноиды.
Ш(В) Ауристатины и долостатины.
Ш(С) Калихимицин.
Ш(О) Другие цитотоксические средства.
IV) Конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые связывают 191Ρ4Ό12.
V) Линкерные фрагменты.
VI) Фрагмент для расширения (расширитель).
VII) Аминокислотный фрагмент.
VIII) Спейсерный фрагмент.
IX) Молекула лекарственного средства.
X) Нагрузка лекарственным средством.
XI) Способы определения цитотоксического эффекта АЭСе.
XII) Лечение рака(ов), экспрессирующего 191Ρ4Ό12.
XIII) 191Ρ4Ό12 в качестве мишени для терапии на основе антител.
XIV) Смеси 191Ρ4Ό12ΑΌΟ
XV) Комбинированная терапия.
XVI) Наборы/готовые изделия.
I) Определения:
Если не указано иное, все термины данной области техники, обозначения и другие научные термины или терминология, использованные здесь, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники, к которой относится это изобретение. В некоторых случаях термины, имеющие обычные значения, определены здесь для ясности и/или для удобства наведения справок, и включение таких определений в описание необязательно следует интерпретировать как отражение существенных различий по сравнению с тем, что обычно подразумевается в данной области техники. Многие методы и процедуры, описанные или упомянутые здесь, являются широко распространенными, и обычно применяются специалистами в данной области техники с использованием общепринятых методик, таких как, например, широко применяемые методики молекулярного клонирования, описанные в §ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: Α ЬаЬогаЮгу Мапиа1 2иб. ебйюп (1989) Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу ΡΐΌββ. Со1б 8ргтд НагЬог, Ν.Υ. При необходимости, процедуры, затрагивающие использование коммерчески доступных наборов и реагентов, в основном проводятся в соответствии с установленным производителем протоколом и/или параметрами, если не указано иное.
В тех случаях, когда в описании используется торговое наименование, ссылка на торговое наименование также относится к составу продукта, лекарственному средству-дженерику и активному фармацевтическому ингредиенту(ам) продукта с торговым наименованием, если контекстом не указано иное.
Термины распространенный рак, местно-распространенный рак, распространившееся заболевание и местно-распространившееся заболевание подразумевают виды рака, которые распространились через капсулу соответствующей ткани, и включают стадию заболевания С по системе Американской урологической ассоциации (АИА), стадию заболевания С1-С2 по системе Уитмора-Джеветта и стадию заболевания Т3-Т4 и Ν+ по системе ΤΝΜ (опухоль, лимфатический узел, метастазирование). В целом, оперативное вмешательство не рекомендовано для пациентов с распространившимся заболеванием, и такие пациенты имеют значительно менее благоприятные перспективы по сравнению с пациентами с клинически локализованным (локализованным в рамках одного органа) раком.
Аббревиатура ΑΡΡ относится к диметилвалин-валин-долаизолейцин- долапроин-фенилаланин-рфенилендиамину (см. формулу XVI ниже).
Аббревиатура ММАЕ относится к монометил ауристатину Е (см. формулу XI ниже).
Аббревиатура АЕВ относится к сложному эфиру, полученному при взаимодействии ауристатина Е с параацетилбензойной кислотой (см. формулу XX ниже).
Аббревиатура АЕУВ относится к сложному эфиру, полученному при взаимодействии ауристатина Е с бензоилвалериановой кислотой (см. формулу XXI ниже).
Аббревиатура ММАЕ относится к довалин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланину (см. формулу XVIV ниже).
Если не указано иное термин алкил относится к насыщенному углеводороду с прямой или разветвленной цепью, имеющему от 1 до 20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода в них), предпочтительно примерно от 1 до 8 атомов углерода. Примерами алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, 2-пентил, 3-пентил, 2-метил-2-бутил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, ндецил, 3-метил-2-бутил, 3-метил-1-бутил, 2-метил-1-бутил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, 2-метил-2- 6 027887 пентил, 3-метил-2-пентил, 4-метил-2-пентил, 3-метил-3-пентил, 2-метил-3-пентил, 2,3-диметил-2-бутил и 3,3-диметил-2-бутил.
Алкильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, могут необязательно замещаться одной или более группами, предпочтительно от 1 до 3 групп (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из галогена), включая, но не ограничиваясь этим, -галоген, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К', -ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О)ЦН2, -С^ЯНК', -С(О)Ы(К')2, -ИНС(О)К', -8К', -8О3К', -8(О)2К', -8(О)К', -ОН, =О, -Ν3, -ΝΗ2, -ΝΗ(Κ'), -Ν(Κ')2 и -СЫ, где каждый К' независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила и где указанные -О(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил и -С2С8алкинильные группы необязательно могут быть дополнительно замещенными одной или более группами, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -С(О)ЫН2, -С(О)ЫНК, -С(О)Ы(К)2, -ЫНС(О)К, -8К, -8О3К, -8(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -ЫН2, -ЫН(К), -Ν(Κ)2 и -СЫ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила.
Если не указано иначе, термины алкенил и алкинил относятся к прямой и разветвленной углеродным цепям, имеющим примерно от 2 до 20 атомов углерода (и все комбинации и подкомбинации пределов и конкретных чисел атомов углерода в них), предпочтительно примерно от 2 до 8 атомов углерода. Алкенильная цепь имеет по меньшей мере одну двойную связь в цепи, а алкинильная цепь имеет по меньшей мере одну тройную связь в цепи. Примеры алкенильных групп включают, но не ограничиваются этим, этилен или винил, аллил, -1-бутенил, -2-бутенил, -изобутиленил, -1-пентенил, -2-пентенил, -3-метил-1-бутенил, -2-метил-2-бутенил и -2,3-диметил-2-бутенил. Примеры алкинильных групп включают, но не ограничиваются этим, -ацетиленовую, пропаргиловую, ацетилениловую, пропиниловую группу, -1-бутинил, 2-бутинил, -1-пентинил, -2-пентинил и -3-метил-1 бутинил.
Алкенильные и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут замещаться одной или более группами, предпочтительно группами от 1 до 3 (причем любые дополнительные заместители выбирают из галогена), включая, но не ограничиваясь этим, -галоген, -О-(С1С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К', -ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О)НН2, -С^ЯНК', -ϋ(Θ)Ν(Κ,)2, -ИНС(О)К', -8К', -8О3К', -8(О)2К', -8(О)К', -ОН, =О, -Ν3, -ЯЩ, 4УН(К'), -Ν(Κ')2 и -ΟΝ, где каждый К' независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкиенила, -С2-С8алкинила или -арила, и где указанные -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил и -С2-С8алкинильные группы могут необязательно замещаться одним или более заместителями включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -С(О)НН2, -С(О)ЯНК, -ЯНС(О)К, -8К, -8О3К, -8(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -ЯЩ, -НН(К), -Ν(Κ)2 и
-СИ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -0-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила.
Если не указано иначе, термин алкилен относится к насыщенному углеводородному радикалу с разветвленной или прямой цепью, имеющему примерно от 1 до 20 атомов углерода (и всем комбинациям и подкомбинациям пределов и конкретных чисел атомов углерода в них), предпочтительно от 1 до 8 атомов углерода, и имеющему два одновалентных радикальных центра, полученных удалением двух атомов водорода от одного и того же или разных атомов углерода исходного алкана. Типичные алкилены включают, но не ограничиваются этим, метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен, декален, 1,4-циклогексилен и т.п. Алкиленовые группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут замещаться одной или более группами, предпочтительно группами от 1 до 3 (при этом любые дополнительные заместители выбирают из галогена), включая, но не ограничиваясь этим, -галоген, -О-(С£-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К', -ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О)ХН2, -С(О)ИНК', -ОДЖЪ, -ИНС(О)К', -8К', -8О3К', -8(О)2К', -8(О)К', -ОН, =О, -Ν3, -ЯН2, -ХН(К'), -Ν(Κ')2 и -СК, где каждый К' независимо выбирают из -Н, -0-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила и где указанные -О-(С£-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенильные и -С2-С8алкинильные группы необязательно могут дополнительно замещаться одним или более заместителями, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С£-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -ССО)^, -С(О)МНК, -φ^, -МНС(О)К, -8К, -8О3К, -8(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -МН2, -МН(К), -К(К)2 и -СМ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -0С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила.
Если не указано иначе, термин алкенилен относится к необязательно замещенной алкиленовой группе, содержащей по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь. Примеры алкениленовых групп включают, например, этенилен (-СН=СН-) и пропенилен (-СН=СН-СН2-).
Если не указано иначе, термин алкинилен относится к необязательно замещенной алкиленовой группе, содержащей по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь. Примеры алкиниленовых групп включают, например, ацетилен (-С^С-), пропаргил (-СН2С^С-), и 4-пентинил (-СН2-СН2- 7 027887
СН;С СН-).
Если не указано иначе, термин арил относится к одновалентному ароматическому углеводородному радикалу из 6-20 атомов углерода (и всем комбинациям и подкомбинациям пределов и конкретных чисел атомов углерода в них), полученному удалением одного атома водорода от одного атома углерода исходной ароматической системы колец. Некоторые арильные группы представлены в структурах примеров как Аг. Типичные арильные группы включают, но не ограничиваются этим, радикалы, полученные из бензола, замещенный бензол, фенил, нафталин, антрацен, бифенил и тому подобное.
Арильная группа, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно может замещаться одной или более, предпочтительно от 1 до 5 или даже более предпочтительно от 1 до 2 групп, включая, но не ограничиваясь этим, -галоген, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К', -ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О^2, 4(Ο)ΝΗΚ', -С(ОЯ(К')2, -НИС(О)К', -8К', -8О3К', -8(О)2К', -8(О)К', -ОН, ^О2, -N3, -ΝΗ2, -ΝΗ(Κ'), -Ν(Κ')2 и -СЧ где каждый К' независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила, и где указанные -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил) и -арильные группы дополнительно необязательно могут замещаться одним или более заместителями, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -С(О)КШ, -Ο^ΝΗΚ, -С(ОЖК)2, ^С(О)К, -8К, -8О3К, -8(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -ΝΗ2, -ΝΗ(Κ), -Ν(Κ)2 и -ΟΝ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила.
Если не указано иначе, термин арилен относится к необязательно замещенной арильной группе, которая является двухвалентной (т.е. полученной удалением двух атомов водорода от одного и того же или разных атомов исходной ароматической системы колец), и может быть в орто-, мета- и параположениях, как показано в следующих структурах с фенилом в качестве примера арильной группы:
Типичные -(С1-С8алкилен)арил, -(С2-С8алкенилен)арил и -(С2-С8алкинилен)арил группы включают, но не ограничиваются этим, бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилетен фенилетен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилетен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и тому подобное.
Если не указано иначе, термин гетероцикл относится к моноциклической, бициклической или полициклической системе колец, имеющей от 3 до 14 кольцевых атомов (они также называются членами кольца), в которой по меньшей мере один кольцевой атом по меньшей мере в одном кольце представляет собой гетероатом, выбранный из Ν, О, Р или 8 (и всем комбинациям и подкомбинациям пределов и конкретных чисел атомов углерода и гетероатомов в них). Гетероцикл может иметь от 1 до 4 гетероатомов в кольце, независимо выбранных из Ν, О, Р или 8. Один или более атомов Ν, С или 8 в гетероцикле может быть окислен. Моноциклический гетероцикл предпочтительно имеет от 3 до 7 кольцевых членов (например, от 2 до 6 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из Ν, О, Р или 8), а бициклический гетероцикл предпочтительно имеет от 5 до 10 кольцевых членов (например, от 4 до 9 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из Ν, О, Р или 8). Кольцо, содержащее гетероатом, может быть ароматическим или неароматическим. Если не указано иначе, гетероцикл связан с его пендантной группой на любом гетероатоме или атоме углерода, что дает в результате стабильную структуру.
Гетероциклы описаны в Радиейе, Ргтщр1ез о£ Мойегп Ηеΐе^осус1^с Сйет1з1гу (\\;.А. Бегуатт, \е\у Уогк, 1968), в частности, главы 1, 3, 4, 6, 7, и 9; Тйе Сйет1з1гу о£ Ηеΐе^осус1^с Сотроипйз, А зепез о£ Моподгарйз Дойп \УПеу & 8опз, \е\у Уогк, 1950 по настоящее время), в частности Уо1итез 13, 14, 16, 19 и 28; и I. Ат. Сйет. 8ос. 82:5566 (1960).
Примеры гетероциклических групп включают, как пример и без ограничения, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолининл, декагидрохинолининл, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6Н-1,2,5-тиадиазинил, 2Н,6Н-1,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хрометил, ксантенил, феноксатинил, 2Η-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3Жиндолил, Ж-индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4Н-карбазолил, карбазолил, βкарболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинл, изохроманил, хроманил, имидазолиднил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриа- 8 027887 золил, бензиоксазолил, охиндолил, бензоксазолинил и изатиноил. Предпочтительные гетероциклические группы включают, но не ограничиваются этим, бензофуранил, бензотиофенил, индолил, бензопиразолил, кумаринил, изохинолинил, пирролил, тиофенил, фуранил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, триазолил, хинолинил, пиримидинил, пиридинил, пиридонил, пиразинил, пиридазинил, изотиазолил, изоксазолил и тетразолил.
Гетероциклическая группа, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно может замещаться одной или более группами, предпочтительно группами от 1 до 2, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2С8алкинил), -арил, -С(О)К', -ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О)ИН2, -С(О)]+НК', -С(О)Ы(К')2, -]+НС(О)К', -8К', -8О3К', -§(О)2К', -8(О)К', -ОН, -Ν3, -ΝΗ2, -ΝΗ(Κ'), -Ν(Κ')2 и -СЫ, где каждый К' независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила и где указанный -О-(С1-С8алкил), -О-(С2С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинильные и -арильные группы дополнительно необязательно могут замещаться одним или более заместителями, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -С(О)ЫН2, -С(О)ЫНК, -С(О)Ы(К)2,
-ЫНС(О)К, -8К, -8О3К, -§(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -ЫН2, -ЫН(К), -Ν(Κ)2 и -СЫ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -С1-С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или арила.
В качестве примера и без ограничения гетероциклы, связанные с углеродом, могут присоединяться в следующих положениях: положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина; положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина; положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина; положении 2, 3, 5 или 6 пиразина; положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тофурана, тофена, пиррола или тетрагидропиррола; положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола; положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола; положении 2 или 3 азиридина; положении 2, 3 или 4 азетидин; положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина. Более типично, гетероциклы, связанные с углеродом, включают 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 5-пиридил, 6-пиридил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 5-пиридазинил, 6пиридазинил, 2-пиримидинил, 4-пиримидинил, 5-пиримидинил, 6-пиримидинил, 2-пиразинил, 3пиразинил, 5-пиразинил, 6-пиразинил, 2-тиазолил, 4-тиазолил или 5-тиазолил.
В качестве примера и без ограничения, гетероциклы, связанные с азотом, могут присоединяться в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина или 1Н-индазола; в положении 2 изоиндола или изоиндолина; положении 4 морфолина и положении 9 карбазола или β-карболина. Более типично, гетероциклы, связанные с азотом, включают 1-азиридил, 1-азетедил, 1-пирролил, 1-имидазолил, 1-пиразолил и 1-пиперидинил.
Если не указано иначе, термин карбоцикл относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической моноциклической, бициклической или полициклической системе колец, имеющей от 3 до 14 атомов в кольце (и всем комбинациям и подкомбинациям пределов и конкретных чисел атомов углерода в них), где все атомы в кольце являются атомами углерода. Моноциклические карбоциклы предпочтительно имеют от 3 до 6 атомов в кольце, еще более предпочтительно 5 или 6 атомов в кольце. Бициклические карбоциклы предпочтительно имеют от 7 до 12 атомов в кольце, например, расположенных в виде бицикло [4,5], [5,5], [5,6] или [6,6] системы, или 9 или 10 атомов в кольце, расположенных в виде бицикло [5,6] или [6,6] системы. Термин карбоцикл включает, например, моноциклическое карбоциклическое кольцо, объединенное с арильным кольцом (например, моноциклическое карбоциклическое кольцо, объединенное с бензольным кольцом). Карбоциклы предпочтительно имеют от 3 до 8 атомов углерода в кольце.
Карбоциклические группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут замещаться, например, одной или более группами, предпочтительно 1 или 2 группами (и любыми дополнительными заместителями, выбранными из галогена), включая, но не ограничиваясь этим, -галоген, -С1С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К', ОС(О)К', -С(О)ОК', -С(О)]Ж2, -С(О)ННК', -€(Θ)Ν(Κ')2, -ЯНС(О)К', -8К', -8О3К', -5(О)2К', -8(О)К', -ОН, =О, -Ν3, -НН2, -МН(К'), -Ν(Κ')2 и -ΟΝ, где каждый К' независимо выбирают из -Н, -С1С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила, и где указанные -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил) и -арильные группы необязательно могут замещаться одним или более заместителями, включая, но не ограничиваясь этим, -С1-С8алкил, -С2С8алкенил, -С2-С8алкинил, -галоген, -О-(С1-С8алкил), -О-(С2-С8алкенил), -О-(С2-С8алкинил), -арил, -С(О)К, -ОС(О)К, -С(О)ОК, -ССО^, -фЖ, -φ)^, -МНС(О)К, -8К, -8О3К, -8(О)2К, -8(О)К, -ОН, -Ν3, -НН2, -НН(К), -Ν(Κ)2 и -ΟΝ, где каждый К независимо выбирают из -Н, -С1С8алкила, -С2-С8алкенила, -С2-С8алкинила или -арила.
Примеры моноциклических карбоциклических заместителей включают циклопропил, -циклобутил, -циклопентил, -1-циклопент-1-енил, -1-циклопент-2-енил, -1-циклопент-3-енил, циклогексил, -1циклогекс-1-енил, -1-циклогекс-2-енил, -1-циклогекс-3-енил, -циклогептил, -циклооктил, -1,3циклогексадиенил, -1,4-циклогексадиенил, -1,3-циклогептадиенил, -1,3,5-циклогептатриенил и -циклооктадиенил.
- 9 027887
Карбоцикло при использовании отдельно или как части другой группы относится к необязательно замещенной карбоциклической группе, как определено выше, которая является двухвалентной (т.е. полученной удалением двух атомов водорода от одного и того же или разных атомов углерода исходной карбоциклической кольцевой системы).
Если контекст не указывает иное, дефис (-) обозначает точку прикрепления пендантной молекулы. Соответственно термин ”-(С1-С8алкилен)арил или -С1-С8алкилен(арил) относится к радикалу С1С8алкилен, как определено в описании, в котором радикал алкилена присоединяется к пендантной молекуле при любом из атомов углерода радикала алкилена, а один из атомов водорода, связанный с атомом углерода радикала алкилена замещается арильным радикалом, определенным выше.
Когда определенная группа является замещенной, эта группа может иметь один или более заместителей, предпочтительно от одного до пяти заместителей, более предпочтительно от одного до трех заместителей, наиболее предпочтительно от одного до двух заместителей, независимо выбранных из списка заместителей. Однако группа может иметь любое число заместителей, выбранных из галогена. Также указываются группы, которые замещаются.
Подразумевается, что определение любого заместителя или переменной в конкретном положении в молекуле не зависит от его определений в другом месте этой молекулы. Понятно, что заместители и примеры замещения на соединениях данного изобретения могут быть выбраны средним специалистом в данной области техники, чтобы предоставить соединения, являющиеся химически устойчивыми, и которые могут быть легко синтезированы с помощью методов, известных в данной области техники, а также методов, излагаемых в данном описании.
Защитные группы при использовании в описании относится к группам, которые селективно блокируют, или временно или постоянно, один реакционноспособный центр в многофункциональном соединении. Подходящие для применения в настоящем изобретении гидроксизащитные группы являются фармацевтически приемлемыми и могут нуждаться или могут не нуждаться в отщеплении от исходного соединения после введения субъекту, для того, чтобы соединение стало активным. Расщепление является совершенно нормальным метаболическим процессом в организме. Гидроксизащитные группы хорошо известны в данной области техники, смотри, РгоЮсЦуе Сгоирк ίη Отдашс ЗуШЬемк Ьу Т.А. Отееие и Р.О.М. Аи15 (ιοίιη АПеу & 8ои5, 31'1 Εάίίίοη), полностью включенную в описание путем отсылки и во всех отношениях, и включают, например, эфир (например, алкиловые эфиры и силиловые эфиры, включая, например, диалкилсилилэфир, триалкилсилилэфир, диалкилалкоксисилилэфир), сложный эфир, карбонат, карбаматы, сульфонат и фосфат защитные группы. Примеры гидроксизащитных групп включают, но не ограничиваются этим, метиловый эфир; метоксиметиловый эфир, метилтиометиловый эфир, (фенилдиметилсилил)метоксиметиловый эфир, бензилоксиметиловый эфир, р-метоксибензилоксиметиловый эфир, р-нитробензилоксиметиловый эфир, о-нитробензилоксиметиловый эфир, (4метоксифенокси)метиловый эфир, гваяколметиловый эфир, трет-бутоксиметиловый эфир, 4пентенилоксиметиловый эфир, силоксиметиловый эфир, 2-метоксиэтоксиметиловый эфир, 2,2,2трихлорэтоксиметиловый эфир, бис-(2-хлорэтокси)метиловый эфир, 2-(триметилсилил)этоксиметиловый эфир, ментоксиметиловый эфир, тетрагидропираниловый эфир, 1-метоксициклогексиловый эфир, 4метокситетрагидротиопираниловый эфир, 4-метокситетрагидротиопираниловый эфир δ,δ-диоксид, 1-[(2хлор-4-метил)фенил]-4-метоксипиперидин-4-иловый эфир, 1-(2-фторфенил)-4-метоксипиперидин-4иловый эфир, 1,4-диоксан-2-иловый эфир, тетрагидрофураниловый эфир, тетрагидротиофураниловый эфир; замещенные этиловые эфиры, такие как 1-этоксиэтиловый эфир, 1-(2-хлорэтокси)этиловый эфир, 1-[2-(триметилсилил)этокси]этиловый эфир, 1-метил-1-метоксиэтиловый эфир, 1-метил-1бензилоксиэтиловый эфир, 1-метил-1-бензилокси-2-фторэтиловый эфир, 1-метил-1феноксиэтиловый эфир, 2-триметилсилиловый эфир, трет-бутиловый эфир, аллиловый эфир, пропаргиловые эфиры, рхлорфениловый эфир, р-метоксифениловый эфир, бензиловый эфир, р-метоксибензиловый эфир, 3,4диметоксибензиловый эфир, триметилсилиловый эфир, триэтилсилиловый эфир, трипропилсилиловый эфир, диметилизопропилсилиловый эфир, диэтилизопропилсилиловый эфир, диметилгексилсилиловый эфир, трет-бутилдиметилсилиловый эфир, дифенилметилсилиловый эфир, бензоилформиат, ацетатный эфир, хлорацетатный эфир, дихлорацетатный эфир, трихлорацетатный эфир, трифторацетатный эфир, метоксиацетатный эфир, трифенилметоксиацетатный эфир, фенилацетатный эфир, бензоатный эфир, алкилметилкарбонат, алкил 9-фторенилметилкарбонат, алкилэтилкарбонат, алкил 2,2,2трихлорэтилкарбонат, 1,1-диметил-2,2,2-трихлорэтилкарбонат, алкилсульфонат, метансульфонат, бензилсульфонат, тозилат, метилен ацеталь, этилиден ацеталь и трет-бутилметилиден кеталь. Предпочтительные защитные группы представлены формулами -Ка, -§1(Ка)(Ка)(Ка), -С(О)Ка, -С(О)ОКа,
-С(О)\Н(1С). -5(О);Н':. -5(О)2ОН, Р(О)(ОН)2, и -Р(О)(ОН)ОКа, где Ка представляет собой С1-С2оалкил, С2С20алкенил, С2-С20алкинил, -С1-С20алкилен(карбоцикл), -С2-С20алкенилен(карбоцикл), -С2-С20алкинилен(карбоцикл), -С6-С10арил, -С1-С20алкилен(арил), -С2-С20алкенилен(арил), -С2-С20алкинилен(арил), -С1С20алкилен(гетероцикл), -С2-С20алкенилен(гетероцикл) или -С2-С20алкинилен(гетероцикл), где указанные алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоциклический и гетероциклические радикалы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно являются замещенными.
Изменение нативного профиля гликозилирования в описании означает удаление одного или более
- 10 027887 углеводных фрагментов, обнаруженных в нативной последовательности 191Ρ4Ό12 (или путем удаления основного участка гликозилирования или путем исключения гликозилирования химическими и/или ферментативными способами), и/или добавление одного или более участков гликозилирования, которые не присутствуют в нативной последовательности 191Ρ4Ό12. В дополнение к этому, фраза включает качественные изменения в гликозилировании нативных белков, затрагивающие изменение в природе и соотношении имеющихся различных углеводных фрагментов.
Термин аналог относится к молекуле, которая является структурно подобной или имеет сходство или имеет соответствующие свойства другой молекулы (например, белок, родственный 191Ρ4Ό12). Например, аналог белка 191Ρ4Ό12 может специфически связываться с антителом или Т-клеткой, которая специфически связывается с 191Ρ4Ό12.
Термин антитело используется в самом широком смысле слова, если явно не указано иное. Таким образом, антитело может быть природного происхождения или может быть создано человеком, таким как моноклональные антитела, полученные с помощью общепринятой гибридомной технологии. Антитела к 191Ρ4Ό12 включают моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен и/или один или более гипервариабельных участков этих антител. Использованный в описании термин антитело относится к любой форме антитела или его фрагменту, которая специфически связывает 191Ρ4Ό12 и/или проявляет желательную биологическую активность и специфически охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и фрагменты антител, при условии, что они специфически связывают 191Ρ4Ό12 и/или проявляют желательную биологическую активность. Любые специфические антитела могут быть использованы в предоставленных в описании способах и композициях. Таким образом, в одном варианте осуществления термин антитело рассматривает молекулу, включающую по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи молекулы иммуноглобулина и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи молекулы, которые в сочетании образуют специфический участок связывания антигена-мишени. В одном варианте осуществления антитело представляет собой 1дС. Например, антитело представляет собой 1дО1, Ι§02, 1дО3 или 1дО4. Антитела, пригодные в настоящих способах и композициях, могут быть получены в культуре клеток, в бактериофаге или у различных млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, коров, кроликов, коз, мышей, крыс, хомячков, морских свинок, овец, собак, кошек, обезьян, шимпанзе и человекообразных обезьян. Таким образом, в одном варианте осуществления антитело настоящего изобретения представляет собой антитело млекопитающего. Для выделения первоначального антитела или создания вариантов с измененными характеристиками специфичности или авидности могут использоваться методики с применением бактериофага. Подобные методики являются общепринятыми и хорошо известны в данной области техники. В одном варианте осуществления антитело получают рекомбинантными способами, известными в данной области техники. Например, рекомбинантное антитело может быть получено путем трансфекции клетки-хозяина вектором, содержащим последовательность ДНК, кодирующую антитело. Для трансфицирования последовательности ДНК, экспрессирующей по меньшей мере одну УЬ и одну УН-область в клетке-хозяине, может использоваться один или более векторов. Типичные описания рекомбинантных способов создания и производства антител включают Ос1ус5. ΑΝΤΙΒΟΌΥ ΡΚΟΌυΟΠΟΝ: ΕδδΕΝΤΙΑΌ ΤΙΤΊ ΙΜΟΙ,'Ηδ (№беу, 1997); 8ЬерЬатб, е1 а1., ΜΟΝΟ(Ί,ΟΧΑΙ, ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 (ОхТогб итуегейу Ρκ55, 2000); Ообшд, ΜΟΝΟΠ.ΟΝΑΙ. ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8: ΡΚΙΝΟΙΡΌΕδ ΑΝΟ ΡΚΑΟΤΙΟΕ (Лсабепнс Ρκ55, 1993) и (Ί,'ΚΚΙΑΤ ΡΚΟΤΟί'ΟΙ,δ ΙΝ ΙΜΜυΝΟΌΟΟΥ (.Ιοίιιι №беу & δοηδ, самое последнее издание). Антитело настоящего изобретения может быть модифицировано рекомбинантными способами с целью увеличения эффективности антитела при опосредовании им необходимой функции. Таким образом, в объем изобретения включается, что антитела можно модифицировать путем замен, используя рекомбинантные методы. Как правило, замены являются консервативными заменами. Например, по меньшей мере одна аминокислота в константной области антитела может быть заменена на другой остаток; см., например, патент США № 5624821, патент США № 6194551, заявку № νΟ 9958572 и Αη§;·ι1, е1 а1., Μο1. Iттиηο1. 30: 105-08 (1993). Модификация аминокислот включает делеции, вставки и замещения аминокислот. В некоторых случаях такие изменения делаются с целью снижения нежелательной активности, например комплемент-зависимой цитотоксичности. Зачастую, антитела помечают путем присоединения, ковалентного или нековалентного, вещества, обеспечивающего обнаружимый сигнал. Большое разнообразие меток и способов конъюгирования известно и подробно описано как в научной, так и в патентной литературе. Такие антитела могут быть отобраны в отношении связывания с нормальным или дефектным 191Ρ4Ό12; см., например, ΑηΙίόο6\' Нпфпееппд: Α Ρ^асι^са1 ΑρρΐΌ;κ1ι (Οχ£ογ6 ишуегЩу Ριό88. 1996). Подходящие антитела с желаемой биологической активностью могут быть установлены с помощью исследования ίη νίίτο, включая, но не ограничиваясь этим, исследования пролиферации, миграции, адгезии, роста в мягком агаре, ангиогенеза, межклеточного взаимодействия, апоптоза, транспорта, передачи сигнала, и исследований ίη νίνο, таких как ингибирование опухолевого роста. Предоставленные в описании антитела также могут быть пригодны в диагностических целях. Как захватывающие или не-нейтрализующие антитела, они могут быть отобраны по способности связываться со специфическим антигеном без ингибирования рецептор-связывающей или биологической активности
- 11 027887 антигена. Как нейтрализующие антитела, антитела могут быть пригодны в конкурентных анализах связывания. Они также могут использоваться для определения количества 191Ρ4Ό12 или его рецептора.
Термин антигенсвязывающий участок или фрагмент антитела (или просто участок антитела) в данном контексте относится к одному или более фрагментам антитела к 191Ρ4Ό12, который сохраняет способность специфически связываться с антигеном (например, 191Ρ4Ό12 и его вариантами; фиг. 1). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин антигенсвязывающий участок антитела, включают (ί) РаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из Уь, νΗ, Сь и СН1 доменов; (ίί) Р(аЬ')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) Рб-фрагмент, состоящий из νΗ и СН1 доменов; (ίν) Ρνфрагмент, состоящий из У2 и νΗ доменов одного плеча антитела, (ν) бАЬ-фрагмент (\Уагб с1 а1., (1989) №йиге 341:544-546), который состоит из νΗ домена; и (νί) изолированный гипервариабельный участок (СИК). Кроме того, несмотря на то, что два домена Ρν-фрагмента, У2 и νΗ, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, с помощью рекомбинантных методов, синтетическим линкером, который обеспечивает им возможность представлять собой одну белковую цепь, в которой У2 и νΗ участки спарены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ρν (δεΡν); см., например, Βίτά εΐ а1. (1988) δείεηεε 242:423-426; апб ΗιΐδΙοη εΐ а1. (1988) Ргос. Паб. Асаб. δει. И8А 85:58795883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающий участок антитела. Эти фрагменты антитела получают при помощи общепринятых методов, известных специалистам в данной области техники, при этом фрагменты отбирают в отношении полезности таким же образом, как и интактные антитела.
В данном контексте любая форма антигена может использоваться для создания антитела, специфичного к 191Ρ4Ό12. Таким образом, выявленный антиген может представлять собой единичный эпитоп, множественный эпитоп (несколько эпитопов) или полный белок отдельно или в сочетании с одним или более усиливающим иммуногенность агентом, известным в данной области техники. Выявленный антиген может представлять собой выделенный полноразмерный белок, белок клеточной поверхности (например, при иммунизации клетками, трансфицированными, по меньшей мере, участком антигена), или растворимый белок (например, при иммунизации только частью внеклеточного домена белка). Антиген может быть получен в генетически модифицированной клетке. ДНК, кодирующая антиген, может быть геномной или негеномной (например, кДНК) и кодировать по меньшей мере часть внеклеточного домена. В данном контексте термин часть относится к минимальному числу аминокислот или нуклеиновых кислот, в зависимости от конкретного случая, составляющему иммуногенный эпитоп представляющего интерес антигена. Могут быть использованы любые генетические векторы, подходящие для трансформации соответствующих клеток, включая, но не ограничиваясь этим, аденовирусные векторы, плазмиды и невирусные векторы, такие как катионные липиды. В одном варианте осуществления антитело, используемое в методах и композициях описания, специфически связывает по меньшей мере часть внеклеточного домена представляющего интерес 191Ρ4Ό12.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предоставленные в описании, могут быть коньюгированы с биоактивным средством. Используемый здесь термин биоактивное средство относится к любому синтетическому или встречающемуся в природе соединению, которое связывает антиген и/или увеличивает или опосредует необходимый биологический эффект для того, чтобы усилить действие токсинов, уничтожающих клетки. В одном варианте осуществления, связывающие фрагменты, используемые в настоящем изобретении, представляют собой биологически активные фрагменты. Используемый в этом описании термин биологически активный относится к антителу или фрагменту антитела, способному связываться с целевым эпитопом антигена и прямо или косвенно оказывать биологическое действие. Прямые воздействия включают, но не ограничиваются этим, модулирование, стимулирование и/или ингибирование ростового сигнала, модулирование, стимулирование и/или ингибирование антиапоптотического сигнала, модулирование, стимулирование и/или ингибирование апоптотического или некротического сигнала, модулирование, стимулирование и/или ингибирование АИСС-каскада и модулирование, стимулирование и/или ингибирование СИС-каскада.
Биспецифические антитела также используются в настоящих способах и композициях. Использованный в этом описании термин биспецифическое антитело относится к антителу, как правило, моноклональному антителу, обладающему специфичностью связывания по меньшей мере к двум различным эпитопам антигена. В одном варианте осуществления эпитопы являются эпитопами одного и того же антигена. В другом варианте осуществления - это эпитопы двух различных антигенов. В данной области техники известны методы создания биспецифических антител. Например, биспецифические антитела можно получить рекомбинантно путем коэкспрессии пар легкой и тяжелой цепей двух иммуноглобулинов; см., например, Μίϊδίείη εΐ а1., №йигс 305:537-39 (1983). Альтернативно, биспецифические антитела можно получить с помощью химической связи; см., например, Вгеппап, εΐ а1., δείεηεε 229:81 (1985). ΒίδресШс аηί^Ьοб^еδ 1ис1ибе ΝδρεείΠε аиОЬобу ГгащпеиЪ; Ηοΐΐίη^ετ, εΐ а1., Ρτοε. №Ш. Асаб. δει. υ.δ.Λ. 90:644448 (1993), ОтиЬет, е1 а1., ί. 1шшнпо1. 152:5368 (1994).
В частности, моноклональные антитела, описанные в этом документе, включают химерные или
- 12 027887 гибридные антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям антител, полученных из определенных видов или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи(ей) является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям антител, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител так же, как и фрагменты таких антител, при условии, что они специфически связывают целевой антиген и/или проявляют желательную биологическую активность (патент США № 4816567; и Моткоп е! а1., Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А 81: 68516855 (1984)).
Термин химиотерапевтическое средство относится ко всем химическим соединениям, эффективно ингибирующим рост опухоли. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие соединения; например азотистые иприты, соединения этиленимина и алкилсульфонаты; антиметаболиты, например фолиевую кислоту, антагонисты пурина или пиримидина; ингибиторы митоза, например антитубулиновые препараты, такие как винкаалкалоиды, ауристатины и производные подофиллотоксина; цитотоксические антибиотики; соединения, повреждающие ДНК или препятствующие экспрессии или репликации ДНК, например вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК; антагонисты рецепторов ростовых факторов. Кроме этого, химиотерапевтические средства включают цитотоксические средства (указанные в данном документе), антитела, биологические молекулы и малые молекулы.
Термин соединение относится к и включает собственно химическое соединение, а также прописано четко или нет, и если они прямо не исключены контекстом, включает следующее: аморфные и кристаллические формы соединения, включая полиморфные формы, где эти формы могут являться частью смеси или быть в чистом виде; свободные кислотные и свободные основные формы соединения, которые, как правило, представляют собой формы, показанные в виде структурных формул, представленных в этом описании; изомеры соединения, относящиеся к оптическим изомерам и таутомерным изомерам, где оптические изомеры включают энантиомеры и диастереомеры, хиральные изомеры и нехиральные изомеры, и оптические изомеры включают изолированные оптические изомеры, а также смеси оптических изомеров, включая рацемические и нерацемические смеси; где изомер может быть в изолированной форме или в смеси с одним или более другими изомерами; изотопы соединения, включая дейтерий- и тритий-содержащие соединения, и включая соединения, содержащие радиоизотопы, включая терапевтически и диагностически эффективные радиоизотопы; мультимерные формы соединения, включая димерные, тримерные, и т.д. формы; соли соединения, предпочтительно фармацевтически приемлемые соли, включая соли присоединения кислоты и соли присоединения основания, включая соли, имеющие органические противоионы и неорганические противоионы, и включая цвиттерионные формы, в которых, если соединение связано с двумя или более противоионами, два или более противоиона могут быть одинаковыми или разными; и сольваты соединения, включая гемисольваты, моносольваты, дисольваты и т.д., включая органические сольваты, неорганические сольваты, указанные неорганические сольваты, включая гидраты; в которых, если соединение связано с двумя или более молекулами растворителя, две или более молекулы растворителя могут быть одинаковыми или разными. В некоторых случаях ссылка, сделанная в описании на соединение изобретения, будет включать прямую ссылку на одну из вышеупомянутых форм, например соли и/или сольваты; однако эта ссылка представляет собой только акцентирование внимания и не должна рассматриваться как исключающая другие из вышеупомянутых форм, установленных выше.
В данном контексте термин консервативная замена относится к замещениям аминокислот, известным специалистам в данной области техники и, которые, как правило, могут быть сделаны без изменения биологической активности получаемой молекулы. В общем, специалистам в данной области техники понятно, что замещения единичных аминокислот в несущественных участках полипептида незначительно изменяют биологическую активность (см., например, \Уа150п. е! а1., МОЬЕСиЬАК. ВЮЬООУ ОР ТНЕ ΟΕΝΕ, ТЬе Вещатш/Ситтшдк РиЬ. Со., р. 224 (4ΐΗ Εάίΐίοη 1987)). Такие приводимые в качестве примера замещения предпочтительно делаются в соответствии с представленными в табл. II и 111(а-Ь). Например, такие изменения включают замещение любого изолейцина (I), валина (V) и лейцина (Ь) на любую другую из этих гидрофобных аминокислот; глутаминовой кислоты (Е) на аспарагиновую кислоту (Ό) и наоборот; глутамина (О) на аспарагин (Ν) и наоборот; и серина (8) на треонин (Т) и наоборот. Другие замещения также могут рассматриваться как консервативные, в зависимости от окружения определенной аминокислоты и ее роли в третичной структуре белка. Например, глицин (О) и аланин (А) часто могут быть взаимозаменяемыми так же, как аланин (А) и валин (V). Метионин (М), являющийся относительно гиброфобным, зачастую может быть заменен лейцином и изолейцином, и иногда валином. Лизин (К) и аргинин (К) часто являются взаимозаменяемыми в местоположениях, в которых важным свойством аминокислотного остатка является его заряд, а различие рК этих двух аминокислотных остатков не являются значительными. Также другие изменения могут считаться консервативными в определенной окружающей обстановке, например табл. 111(а) в описании; с. 13-15 ВюсЬет181ту 2ηά ΕΌ. ЬиЬег! 81тует еб (81ап&гб ишуеткЬу); НешкоЛ е! а1., ΡΝΑ8 1992 ^1. 89 10915-10919; Ье1 е! а1., I. Вю1 СЬет 1995 Мау 19; 270(20):1 1882-11886). Другие замещения также являются допустимыми и могут быть определены
- 13 027887 эмпирически или согласно известным консервативным замещениям.
Термин цитотоксическое средство относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает экспрессионную активность клеток, функции клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин включает радиоактивные изотопы, химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты. Примеры цитотоксических средств включают, но не ограничиваются этим, ауристатины (например, ауристатин Е, ауристатин Р, ММАЕ и ММЛЕ), ауромицины, майтанзиноиды, рицин, А-цепь рицина, комбрестатин, дуокармицины, доластатины, доксорубицин, даунорубицин, таксолы, цисплатин, сс1065, бромистый этидий, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидрокси антрацин дион, актиномицин, дифтерийный токсин, эндотоксин Ркеийошопак (РЕ) А, РЕ40, абрин, А-цепь абрина, А-цепь модеккина, альфа-сарцин, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, курицин, кротин, калихимицин, ингибитор Зараопапа оГПстаПх. глюкокортикоиды и другие химиотерапевтические средства, а также радиоизотопы, такие как Άΐ211, I131, I125, Υ90, Ре186, Ре188, Зт153, Βί212 или 32Р и радиоактивные изотопы Ьи включая Ьи177. Антитела также могут быть конъюгированы с ферментом, активирующим противоопухолевое пролекарственное средство, способным превращать пролекарственное средство в его активную форму.
При использовании в описании термин диантитела относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, фрагменты которых содержат вариабельный домен тяжелой цепи (νΗ), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (Уъ) в одну полипептидную цепь (Ун-Уъ). При использовании линкера, слишком короткого для обеспечения соединения двух доменов одной цепи, домены вынуждены соединяться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антиген-связывающих сайта. Диантитела описаны более полно, например, в ЕР 404097; \УО 93/11161 и Но11шдег е1 а1., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сг И8А 90:6444-48 (1993).
Термин истощение в контексте воздействия 191Р4О12-связывающего средства на 191Ρ4Ό12экспрессирующие клетки, относится к уменьшению количества или устранению 191Р4Ш12экспрессирующих клеток.
Термин продукт гена используется в данном описании для обозначения пептида/белка или мРНК. Например, продукт гена изобретения в этом описании иногда называется раковая аминокислотная последовательность, раковый (злокачественный) белок, белок злокачественных новообразований, перечисленных в табл. I, раковая мРНК, мРНК злокачественных новообразований, перечисленных в табл. I и т.д. В одном варианте осуществления раковый белок кодируется нуклеиновой кислотой, представленной на фиг. 1. Раковый белок может быть фрагментом, или альтернативно, полноразмерным белком, кодируемым нуклеиновыми кислотами, представленными на фиг. 1. В одном варианте осуществления раковая аминокислотная последовательность используется для определения идентичности или сходства последовательности. В другом варианте осуществления последовательности представляют собой встречающиеся в природе аллельные варианты белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, представленной на фиг. 1. В другом варианте осуществления последовательности представляют собой варианты последовательностей, описанные в этом документе в дальнейшем.
В настоящих способах и композициях используется гетероконъюгат антитела. В данном контексте термин гетероконъюгат антитела относится к двум ковалентно связанным антителам. Такие антитела могут быть получены с помощью методов, известных в химии белкового синтеза, включая использование веществ, образующих поперечные связи; см., например, патент США № 4676980.
Термин гомолог относится к молекуле, которая проявляет гомологию с другой молекулой, например, благодаря наличию последовательностей химических остатков, одинаковых или аналогичных в соответствующих положениях.
В одном варианте осуществления предоставленное в этом описании антитело представляет собой человеческое антитело. В данном контексте термин человеческое антитело относится к антителу, в котором практически полные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, включая гипервариабельные участки (СЭРк), происходят из генов человека. В одном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела создаются с помощью триомной технологии, технологии В-клеток человека (см., например, Ко/Ьог е1 а1., Iттиηо1. Тойау 4: 72 (1983), технологии трансформации ΕΒν (см., например, Со1е е1 а1. Мопос1опа1 АпйЪоФек Апй Сапсег ТЬегару 77-96 (1985)) или с использованием фагового дисплея (см., например, Магкъ е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 222:581 (1991)). В отдельном варианте осуществления человеческие антитела вырабатываются в трансгенных мышах. Методы создания таких частично или полностью человеческих антител известны в данной области техники и могут использоваться любые подобные методы. В частности, в соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, полная последовательность человеческого антитела получена в трансгенной мыши, созданной для экспрессии генов тяжелой и легкой цепей антитела человека. Приводимое в качестве примера описание создания трансгенных мышей, продуцирующих человеческие антитела, можно найти в заявке № \УО 02/43478 и патенте США 6657103 (АЪдешх). В-клетки тренсгенных мышей, продуцирующих желаемое антитело, затем могут быть слиты для получения гибридомных клеточных линий, предназначенных для постоянной выработки антител; см., например, патенты США №№ 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и
- 14 027887
5545806 и ,1акоЬо\П5. Абу. 1)пщ ΙΑΊ. Кеу. 31:33-42 (1998); Отееп, е! а1., 1. Ехр. Меб. 188:483-95 (1998).
В данном контексте термин гуманизированное антитело относится к формам антител, содержащим последовательности нечеловеческих (например, мышиных) антител, а также человеческих антител. Такие антитела представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. В большинстве случаев, гуманизированное антитело будет содержать существенную часть по меньшей мере одного, и в основном двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или практически все РК-участки представляют собой такие участки последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Рс), обычно человеческого иммуноглобулина; см., например, СаЬШу патент США №№ 4816567; Циееп е! а1. (1989) Ргос. ΝαΙ'1 Асаб. 8с1. И8А 86:10029-10033 и АпбЬобу Епдшеетшд: А Ртасйса1 АрргоасЬ (ОхГогб Ишуегвйу Рте88 1 996).
Термин ингибирует или ингибирование, использованный в данном описании, подразумевает уменьшение измеряемого количества или полное предотвращение.
Фразы изолированный (выделенный) или биологически чистый относятся к веществу, которое в значительной степени или в основном не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют веществу в его естественном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды в соответствии с изобретением предпочтительно не содержат веществ, обычно связанных с пептидами в их окружающей среде ίη δίίπ. Например, полинуклеотид называется выделенным, когда он в значительной степени отделен от загрязняющих полинуклеотидов, которые соответствуют или комплементарным генам, отличным от генов 191Ρ4Ό12, или от генов, кодирующих полипептиды, отличных от продукта гена 191Ρ4Ό12 или его фрагментов. Специалист в данной области может легко применять методы выделения нуклеиновых кислот для получения изолированного 191Ρ4Ό12 полинуклеотида. Например, белок называется выделенным, когда физические, механические или химические методы применяются для отделения белков 191Ρ4Ό12 от клеточных компонентов, обычно связанных с белком. Специалист в данной области может легко применять стандартные методы очистки для получения выделенного белка 191Ρ4Ό12. Альтернативно, выделенный белок можно получить с помощью химических методов.
Подходящие метки включают радиоактивные вещества, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, магнитные частицы и тому подобное. Патенты, сообщающие об использовании таких меток, включают патенты США № 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Кроме того, антитела, предоставленные в этом описании, могут использоваться в качестве антигенсвязывающего компонента флюоротел (йиотоЬоб1е8); см., например, 2еу1ип е! а1., №1. Вю1есЬпо1. 21:1473-79 (2003).
Термин млекопитающее относится к любому организму, классифицированному как млекопитающее, включая мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, коров, лошадей и человека. В одном варианте осуществления изобретения млекопитающее является мышью. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее является человеком.
Термины метастатический рак и метастатическая болезнь подразумевают злокачественные новообразования, которые распространились в регионарные лимфатические узлы или в отдаленные участки тела, и включают стадию Ό заболевания по системе АИА и стадию ΤχΝχΜ+ по системе ΤΝΜ.
Термин модулятор или испытываемое соединение или потенциальное лекарственное средство или их грамматические эквиваленты в данном контексте описывают любую молекулу, например белок, олигопептид, небольшую органическую молекулу, полисахарид, полинуклеотид и т.д., который необходимо проверить в отношении его способности прямо или косвенно изменять раковый фенотип или экспрессию раковой последовательности, например последовательности нуклеиновой кислоты или белка, или эффекты раковых последовательностей (например, передачу сигнала, экспрессию генов, белковое взаимодействие и т.д.). В одном аспекте модулятор будет нейтрализовать воздействие ракового белка изобретения. Под термином нейтрализовать подразумевается, что активность белка ингибируется или блокируется наряду с последующим воздействием на клетку. В другом аспекте модулятор будет нейтрализовать действие гена и его соответствующего белка, путем нормализации уровней указанного белка. В предпочтительных вариантах осуществления модуляторы изменяют профили экспрессии или профиль экспрессии предоставленных в этом описании нуклеиновых кислот или белков или нижележащие эффекторные пути. В одном варианте осуществления модулятор подавляет раковый фенотип, например, до характерного признака нормальной ткани. В другом варианте осуществления модулятор вызывает раковый фенотип. Как правило, проводится исследование множества смесей параллельно с разными концентрациями средства для получения дифференцированного ответа на различные концентрации. Как правило, одна из этих концентраций служит негативным контролем, т.е. при нулевой концентрации или концентрации ниже уровня обнаружения.
Модуляторы, потенциальные лекарства или испытываемые соединения включают многочисленные химические классы, хотя обычно они представляют собой органические молекулы, предпочтительно небольшие органические соединения, имеющие молекулярную массу более 100 и менее чем около 2500 Да. Предпочтительными небольшими молекулы являются молекулы менее 2000, или менее 1500, или менее
- 15 027887
1000 или менее 500 Да. Потенциальные средства содержат функциональные группы, необходимые для структурного взаимодействия с белками, в частности, водородного связывания, и, как правило, включают, по меньшей мере, амино-, карбонильную, гидроксильную или карбоксильную группу, предпочтительно по меньшей мере две функциональные химические группы. Потенциальные средства часто содержат циклический углерод или гетероциклические структуры и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или более из вышеуказанных функциональных групп. Модуляторы также содержат биомолекулы, такие как пептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, производные, структурные аналоги или их комбинации. Особенно предпочтительными являются пептиды. Один класс модуляторов представляет собой пептиды, содержащие, например, приблизительно от 5 до 35 аминокислот, предпочтительно примерно от пяти до 20 аминокислот и особенно предпочтительно примерно от 7 до 15 аминокислот. Предпочтительно раковый модулирующий белок является растворимым, включает не-трансмембранный участок и/или имеет Ν-концевой Сук для улучшения растворимости. В одном варианте осуществления, С-конец фрагмента сохраняется как свободная кислота, и Ν-конец представляет собой свободный амин для улучшения соединения, т.е. к цистеину. В одном варианте осуществления раковый белок изобретения конъюгируют с иммуногенным средством, как уже обсуждалось. В одном варианте осуществления раковый белок конъюгируют с ΒδΆ. Пептиды изобретения, например, предпочтительных длин могут быть связаны между собой или с другими аминокислотами, для создания более длинного пептида/белка. Модулирующие пептиды могут быть гидролизатом природных белков, как описано выше, случайных пептидов или смещенных случайных пептидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения модуляторы на основе пептида /белка представляют собой антитела и их фрагменты, как указано в этом документе.
Термин моноклональное антитело в данном описании относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными на отдельный эпитоп антигена. Напротив, препараты обычных (поликлональных) антител, как правило, включают большое число антител, направленных против (или специфичных к) различных эпитопов. В одном варианте осуществления поликлональное антитело содержит множество моноклональных антител с различной специфичностью эпитопа, аффинностью или авидностью в пределах отдельного антигена, который содержит множественные антигенные эпитопы. Модификатор моноклональное указывает характер антитела, полученного в основном из гомогенной популяции антител, что следует рассматривать как обязательное получение антитела каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены методом гибридомы, впервые описанным КоЫег с1 а1., №11игс 256: 495 (1975), или могут быть созданы методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных в С1асккоп е1 а1., №11иге 352: 624-628 (1991) и Магкк е1 а1., 1. Мо1. Βίοί. 222: 581-597 (1991), Например, эти моноклональные антитела будут обычно связываться с Кд, равной по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, еще чаще по меньшей мере приблизительно 300 нМ, обычно по меньшей мере приблизительно 30 нМ, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 нМ, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3 нМ или лучше, что обычно определяется методом ЕЬ1§Л.
Фармацевтический эксципиент включает вещество, такое как адъювант, носитель, средство, регулирующее рН и буферное средство, средства, регулирующие тоничность, увлажняющие средства, консерванты и тому подобное.
Фармацевтически приемлемый относится к нетоксичной, инертной и/или композиции, которая физиологически совместима с человеком или другими млекопитающими.
Термин полинуклеотид подразумевает полимерную форму нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований или пар оснований, или рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов или модифицированной формы любого типа нуклеотида, и включает одно- и двухцепочечные формы ДНК и/или РНК. В данной области техники этот термин часто используется взаимозаменяемым образом с термином олигонуклеотид. Полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, раскрытую в этом описании, в которой тимидин (Т), как показано, например, на фиг. 1, также может быть урацилом (И); это определение имеет отношение к различиям между химическими структурами ДНК и РНК, в частности наблюдению, что одним из четырех основных оснований в РНК является урацил (И) вместо тимидина (Т).
Термин полипептид подразумевает полимер, состоящий по меньшей мере приблизительно из 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот. На всем протяжении подробного описания используются стандартные трехбуквенные или однобуквенные обозначения аминокислот. В данной области техники этот термин часто используется взаимозаменяемым образом с термином пептид или белок.
Рекомбинантная молекула ДНК или РНК представляет собой молекулу ДНК или РНК, которая подвергалась молекулярным манипуляциям ίη νίίτο.
В данном контексте термин одноцепочечный Ρν или ксРу или одноцепочечное антитело относится к фрагментам антитела, содержащим Ун и домены антитела, причем эти домены присутствуют в
- 16 027887 одной полипептидной цепи. Как правило, Εν полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между УН и Ун доменами, который дает возможность δΕν образовать желаемую структуру для связывания антигена; см. обзорные материалы по δΕ в Ρ^Μ^η, Тке ΡЬа^тасо1о§у О£ Мопос1опа1 АпйЬоЛее, νо1. 113, КоеепЬигд и Мооге ебе. 8ргшдег-Уег1ад, Νον Υо^к, р. 269-315 (1994).
В данном контексте термин специфический, специфически связывается и связывает специфично относится к селективному связыванию антитела с эпитопом антигена-мишени. Антитела могут быть проверены в отношении специфичности связывания путем сравнения связывания с соответствующим антигеном со связыванием с несоответствующим антигеном или антигенной смесью при заданном наборе условий. В том случае, если антитело связывается с соответствующим антигеном по меньшей мере в 2, 5, 7 и предпочтительно в 10 раз больше, чем с несоответствующим антигеном или смесью антигенов, оно считается специфичным. В одном варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает только 191Ρ4Ό12 антиген, но не связывается с несоответствующим антигеном. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий 191Ρ4Ό12 антиген, но не связывает нечеловеческий 191Ρ4Ό12 антиген с 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей гомологией аминокислотной последовательности с 191Ρ4Ό12 антигеном. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий 191Ρ4Ό12 антиген и связывает мышиный 191Ρ4Ό12 антиген, но с более высокой степенью связывания человеческого антигена. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывает человеческий 191Ρ4Ό12 антиген и связывает антиген 191Ρ4Ό12 приматов, но с более высокой степенью связывания человеческого антигена. В другом варианте осуществления специфическое антитело связывается с человеческим 191Ρ4Ό12 антигеном и любым нечеловеческим 191Ρ4Ό12 антигеном, но с более высокой степенью связывания человеческого антигена или любой их комбинации.
В данном контексте лечить или терапевтический или грамматически родственные термины относятся к любому улучшению любого следствия болезни, такому как увеличение выживаемости, меньшее количество смертельных случаев и/или уменьшение побочных эффектов, которые являются побочными продуктами альтернативного терапевтического воздействия; следует понимать, что полное устранение болезни является предпочтительным, но, тем не менее, не является требованием к акту лечения.
Термин вариант относится к молекуле, которая демонстрирует отличие от описанного типа или нормы, такой как белок, имеющий один или более различных аминокислотных остатков в соответствующей позиции(ях) специально описанного белка (например, 191Ρ4Ό12 белка, показанного на фиг. 1) Аналог представляет собой пример варианта белка. Сплайс-изоформы и одиночные нуклеотидные полиморфизмы (δΝΡβ) являются дополнительными примерами вариантов.
191Ρ4Ό12 белки и/или 191Р4О12-родственные белки изобретения включают белки, в частности, установленные в описании (см. фиг. 1), также как и аллельные варианты, варианты с консервативными заменами, аналоги и гомологи, которые могут быть выделены/созданы и охарактеризованы без излишнего экспериментирования, следуя описанным здесь или легко доступным в данной области техники методам. Кроме того, включаются гибридные белки, объединяющие части различных 191Ρ4Ό12 белков или их фрагментов, а также гибридные белки 191Ρ4Ό12 белка и гетерологичного полипептида. Такие 191Ρ4Ό12 белки в совокупности относятся к 191Ρ4^12-родственным белкам, белкам изобретения или 191Ρ4Ό12. Термин 191Ρ4^12-родственный белок относится к полипептидному фрагменту или последовательности белка 191Ρ4Ό12 из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более чем 25 аминокислот или по меньшей мере 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 335, 339 или более аминокислот.
II) 191Ρ4Ό12 Антитела.
Другой аспект изобретения предоставляет антитела, которые связываются с 191Ρ4Ό12родственными белками (см. фиг. 1). В одном варианте осуществления антитело, связывающееся с 191Ρ4^12-родственными белками, представляет собой антитело, которое специфически связывается с белком 191Ρ4Ό12, содержащим аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО ΝΟ: 2. Антитело, которое специфически связывается с белком 191Ρ4Ό12, содержащим аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО ΝΟ: 2, включает антитела, которые могут связываться с другими 191Ρ4^12-родственными белками. Например, антитела, связывающие белок 191Ρ4Ό12, содержащий аминокислотную последовательность δΕφ ГО ΝΟ:2, могут связывать 191Ρ4^12-родственные белки, такие как варианты 191Ρ4Ό12 и их гомологи и аналоги.
191Ρ4Ό12 антитела изобретения являются особенно удобными при прогностических исследованиях рака (см., например, табл. I), визуализации и в терапевтических методах. Подобным образом, такие антитела используются при лечении и/или прогнозировании рака толстой кишки и других видов рака, в тех случаях, когда 191Ρ4Ό12 также экспрессируется или сверхэкспрессируется при этих других видах рака. Кроме того, антитела, экспрессируемые внутри клетки (например, одноцепочечные антитела), находят терапевтическое применение при лечении видов рака, в которых наблюдается экспрессия 191Ρ4Ό12, таких как прогрессирующий или метастатический колоректальный рак или другие распространенные или
- 17 027887 метастатические виды рака.
Различные способы получения антител, в частности моноклональных антител, хорошо известны в данной области техники. Например, антитела можно получить путем иммунизации подходящего млекопитающего-хозяина с использованием 191Р4И12-родственного белка, пептида или фрагмента в изолированной форме или в форме иммуноконъюгата (АпйЬоФек: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, С8Н Рге55, Еб5., Наг1оте, апб Ьапе (1988); Наг1о\у, АпЕЬоЛек, Со1б 8рпп§ НагЬог Рге55, ΝΥ (1989)). Кроме того, также могут использоваться гибридные белки 191Ρ4Ό12, такие, как 191Ρ4Ό12 ΟδΤ-гибридный белок. В отдельном варианте осуществления получают ΟδΤ-гибридный белок, содержащий всю или большую часть аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, и затем используют в качестве иммуногена для создания соответствующих антител. В другом варианте осуществления 191Р4И12-родственный белок был синтезирован и использован в качестве иммуногена.
Кроме того, для вызова иммунного ответа к закодированному иммуногену используются известные в данной области методы иммунизации голой ДНК (с или без очищенного белка, родственного 191Ρ4Ό12, или 191Р4И12-экспрессирующими клетками) (см. для обозрения ИоппеПу е! а1., 1997, Апп. Кеу. 1ттипо1. 15: 617-648).
Аминокислотную последовательность белка 191Ρ4Ό12, как показано на фиг. 1, можно проанализировать, чтобы выбрать специфические участки белка 191Ρ4Ό12 для создания антител. Например, для определения гидрофильных участков в структуре 191Ρ4Ό12 используется анализ гидрофобности и гидрофильности аминокислотной последовательности 191Ρ4Ό12. Участки белка 191Ρ4Ό12, обнаруживающие иммуногенную структуру так же, как и другие участки и домены, могут быть без труда идентифицированы с использованием различных других методов, известных в данной области техники, таких как СЬои-Разтап, Оагтег-КоЬзоп, Ку!е-Ооо1й11е, Е15епЬегд, 1<агр1и5+с1ш11/ или анализ 1ате5оп-Ао1Г. Профили гидрофильности могут быть получены с использованием метода Норр, Т.Р. апб \Уооб5, К.К., 1981, Ргос. №й1. Асаб. δα. ИХ.А. 78:3824-3828. Профили гидрофобности могут быть получены с использованием метода Ку!е, ί. апб ИооШбе, КЕ., 1982, ί. Мо1. Бю1. 157:105-132. Профили содержания (%) доступных остатков могут быть получены с использованием метода 1атп ί., 1979, №-11иге 277:491-492. Профили средней подвижности могут быть получены с использованием метода ВЬа5кагап К., Роппи5№ату Р.К., 1988, 1п!. ί. Рер1. Рго!ет Ке5. 32:242-255. Профили бета-изгибов могут быть получены с использованием метода Эекаде, О., Коих В., 1987, Рго!еш Епдшеегшд 1:289-294. Таким образом, каждый участок, идентифицированный при помощи любой из этих программ или способов, входит в объем настоящего изобретения. Предпочтительные методы создания антител к 191Ρ4Ό12 далее проиллюстрированы посредством приведенных в этом описании примеров. Способы получения белка или полипептида для использования в качестве иммуногена хорошо известны в данной области техники. Также хорошо известны в данной области техники способы получения иммуногенных конъюгатов белка с носителем, таким как ВδА, КЬН или другой белок-носитель. При некоторых условиях используется прямая конъюгация, например используются карбодиимидные реагенты; в других случаях эффективны сшивающие реагенты такие, как поставляемые Р1егсе СЬет1са1 Со., КоскГогб, 1Ь. Введение иммуногена 191Ρ4Ό12 часто производится путем инъекции на протяжении подходящего периода времени и с использованием подходящего адъюванта, как известно в данной области техники. Во время проведения режима иммунизации для определения достаточности образования антител проводится титрование антител.
Моноклональные антитела к 191Ρ4Ό12 могут быть получены различными способами, хорошо известными в данной области техники. Например, иммортализованные клеточные линии, секретирующие целевое моноклональное антитело, получают с использованием стандартной гибридомной технологии по КоЫег и Мб5!еш или модификаций, иммортализующих антитело-продуцирующие В клетки, что хорошо известно. Иммортализованные клеточные линии, секретирующие целевые антитела, отбирают с помощью иммуноанализа, в котором антиген представляет собой 191Р4И12-родственный белок. Когда определена подходящая иммортализованная клеточная культура, клетки можно размножить и получить антитела или из культур ш убго или из асцитной жидкости.
Антитела или фрагменты изобретения также могут быть получены рекомбинантными способами. Участки, специфично связывающиеся с целевыми участками белка 191Ρ4Ό12, также могут быть получены в случае химерных антител или антител с привитым гипервариабельным участком (СЭР), происходящих от многих видов. Кроме того, могут быть получены гуманизированные или человеческие антитела к 191Ρ4Ό12, которые являются предпочтительными для использования в терапевтических целях. Способы гуманизации мышиных и других нечеловеческих антител путем замещения одного или более нечеловеческих СЭК5 на соответствующие последовательности человеческих антител, хорошо известны (см., например, 1опе5 е! а1., 1986, №-11иге 321: 522-525; ШесЬтапп е! а1., 1988, №-11иге 332: 323-327; УегЬоеуеп е! а1., 1988, 5с1епсе 239: 1534-1536); см. также Саг!ег е! а1., 1993, Ргос. №й1. Асаб. 8сЕ υδΛ 89: 4285 апб δίπΐ5 е! а1., 1993, ί. 1ттипо1. 151: 2296.
В предпочтительном варианте осуществления, антитела настоящего изобретения содержат полностью человеческие антитела к 191Ρ4Ό12 (191Ρ4Ό12 МАЬ5). Различные методы в данной области техники предоставляют способы получения полностью человеческих 191Ρ4Ό12 МАЬ5. Например, предпочтительный вариант осуществления предусматривает технологии с использованием трансгенных мышей,
- 18 027887 инактивированных в отношении выработки антител, созданных с человеческими локусами тяжелых и легких цепей, называемых ксеномыши (Хепотоике) (Атдеп Ргетоп!, 1пс.). Приводимое в качестве примера описание создания трансгенных мышей, продуцирующих человеческие антитела, можно найти в США 6657103; см. также патенты США №№ 5569825; 5625126; 5633425; 5,661016 и 5545806 и Мепбе/, е! а1. №-Циге Оепебск, 15: 146-156 (1998); Ке11егтап, §.А. & Огееп, Ь.Ь., Сигг. Орш. Вю!есЬпо1 13, 593-597 (2002).
Кроме того, человеческие антитела изобретения могут быть получены с использованием мышей НиМАЬ (Мебагех, 1пс.), которые содержат минилокусы генов иммуноглобулинов человека, кодирующие неперестроенные последовательности тяжелых цепей (мю и гамма) и каппа легкой цепи иммуноглобулинов человека, вместе с целевыми мутациями, инактивирующими эндогенные локусы мю и каппа цепей (см., например, ЬопЬегд, е! а1. (1994) №!ите 368(6474): 856-859).
В другом варианте осуществления полностью человеческие антитела изобретения могут быть получены с использованием мышей, несущих последовательности иммуноглобулинов человека в виде трансгенов и на трансхромосомах, таких как мыши, несущие трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такие мыши, упоминаемые в этом описании как КМ мыши, описаны в Топи/ика е! а1. (2000) Ριυα №И. Асаб. δα. И8А 97:722-727 и РСТ публикации \УО 02/43478 !о Топи/ика, е! а1.
Человеческие моноклональные антитела изобретения также могут быть приготовлены с использованием методов фагового дисплея в случае скрининга библиотек генов иммуноглобулинов человека. Такие методы фагового дисплея выделения человеческих антител разработаны в данной области техники; см., например, патенты США №№ 5223409; 5403484 и 5571698 Ьабпег е! а1.; патенты США №№ 5427908 и 5580717 Оо\\ег е! а1.; патенты США №№ 5969108 и 6172197 МсСайебу е! а1. и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 ОпН'пНк е! а1.
Человеческие моноклональные антитела изобретения также могут быть приготовлены с использованием мышей §СГО, у которых иммунные клетки человека преобразованы так, что иммунизация может вызвать образование человеческих антител. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5476996 и 5698767 №бкоп е! а1.
В предпочтительном варианте осуществления МАЬк 191Ρ4Ό12 изобретения содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела, обозначенного На22-2(2,4)6.1, полученного с помощью гибридомы, зарегистрированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под инвентарным № РТА-11267 (см. фиг. 3), или вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, гомологичные аминокислотным последовательностям вариабельных участков тяжелой и легкой цепи На22-2(2,4)6.1, при этом антитела сохраняют желаемые функциональные свойства МАЬк 191Ρ4Ό12 изобретения. Вариабельный участок тяжелой цепи На22-2(2,4)6.1 состоит из аминокислотной последовательности в пределах от 20-го Е остатка до 136-го δ остатка δΕφ ГО NО: 7, и вариабельный участок легкой цепи На22-2(2,4)6.1, состоящий из аминокислотной последовательности в пределах от 23-го Ό остатка до 130 К остатка δΕφ ГО NО: 8. В качестве константного участка антитела изобретения может быть выбран любой подкласс константного участка. В одном варианте осуществления могут быть использованы константный участок человеческого 1дО1 в качестве константного участка тяжелой цепи и константный участок человеческого 1д каппа в качестве константного участка легкой цепи.
Например, изобретение предоставляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащую вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, в котором:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, представленной на фиг. 3;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи, представленной на фиг. 3.
В других вариантах осуществления аминокислотные последовательности УН и/или могут быть на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичны последовательностям УН и Уь, представленным на фиг. 3.
В другом варианте осуществления изобретение предоставляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащую гуманизированный вариабельный участок тяжелой цепи и гуманизированный вариабельный участок легкой цепи, в котором:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает в себя гипервариабельные участки (СГОКк), имеющие аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой цепи СГОКк, представленных на фиг. 3;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи включает в себя СГОКк, имеющие аминокислотные последовательности вариабельных участков легкой цепи СГОКк, представленных на фиг. 3.
Разработанные антитела изобретения включают те, в которых были произведены изменения каркасных остатков внутри УН и/или (например, для улучшения свойств антитела). Обычно такие изме- 19 027887 нения каркаса делаются с целью снижения иммуногенности антитела. Например, один подход представляет собой мутацию к первоначальному виду одного или более каркасных остатков на соответствующую зародышевую последовательность. Конкретнее, антитело, подвергнувшееся соматической мутации, может содержать каркасные остатки, отличающиеся от зародышевой последовательности, на основе которой получено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, на основе которой получено антитело. Для возвращения последовательностей каркасных участков к их зародышевой конфигурации, соматические мутации могут быть мутированы к первоначальному виду последовательности зародышевой линии путем, например, сайт-специфического мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза (например, мутированы к первоначальному виду заменой лейцина на метионин). Такие мутированные к первоначальному виду антитела также рассматриваются изобретением.
Другой тип модификаций каркаса затрагивает мутирование одного или более остатков внутри каркасного участка, или даже внутри одного или более СОК участков, для удаления Т-клеточных эпитопов, чтобы посредством этого снизить возможную иммуногенность антитела. Этот подход также называется деиммунизация и более подробно описан в патентной публикации США № 2003/0153043 Сагг е! а1.
В дополнение или альтернативно модификациям внутри каркасных или СОК участков, антитела изобретения могут быть сконструированы так, чтобы включать модификации внутри Рс участка, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, связывание комплемента, связывание с Рс-рецептором и/или антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность. Кроме того, 191Ρ4Ό12 МАЪ изобретения может быть модифицировано химически (например, к антителу может быть присоединен один или более химических фрагментов) или быть модифицировано для изменения его гликозилирования, снова для изменения одного или более функциональных свойств МАЪ. Каждый из этих вариантов осуществления более подробно описан ниже.
В одном варианте осуществления шарнирный участок СН1 модифицирован таким образом, что число остатков цистеина в шарнирном участке изменено, например увеличено или уменьшено. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 5677425 Вобтег е! а1. Число остатков цистеина в шарнирном участке СН1 изменено, например, для облегчения объединения легкой и тяжелой цепей или увеличения или уменьшения стабильности 191Ρ4Ό12 МАЪ.
В другом варианте осуществления Рс шарнирный участок антитела мутирован для того, чтобы снизить биологическое время полужизни 191Ρ4Ό12 МАЪ. Конкретнее, одну или более аминокислотных мутаций вводят в участок зоны взаимодействия СН2-СН3 доменов Рс-шарнирного фрагмента так, что связывание антитела с белком З!арЬу1ососсу1 рто!еш А (ЗрА) ухудшено по сравнению со связыванием нативного Рс-шарнирного домена с ЗрА. Этот подход более подробно описан в патенте США № 6165745 \агб е! а1.
В другом варианте осуществления 191Ρ4Ό12 МАЪ модифицировано для увеличения его биологического времени полужизни. Возможны различные подходы. Например, мутации могут быть введены, как описано в патенте США № 6277375 \агб. Альтернативно, для увеличения биологического времени полужизни антитело может быть изменено внутри СН1 или СЬ участка так, чтобы содержать эпитоп, связывающий рецептор спасатель, взятый из двух петель -СН2 домена Рс участка 1дС, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022 ΡιόκΡι е! а1.
В следующих вариантах осуществления Рс участок изменен путем замещения по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной функции(й) 191Ρ4Ό12 МАЪ. Например, одна или более аминокислот, выбранных из специфических аминокислотных остатков, может быть замещена другим аминокислотным остатком, так что антитело будет иметь измененную аффинность к эффекторному лиганду, но сохранит антигенсвязывающую способность исходного антитела. Например, эффекторным лигандом, аффинность к которому изменяется, может быть Рс-рецептор или С1 компонент комплемента. Этот подход более подробно описан в патентах США № 5624821 и 5648260, \ш!ет е! а1.
Реактивность 191Ρ4Ό12 антител к 191Ρ4^12-родственному белку может быть установлена несколькими хорошо известными способами, включая Вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, ЕЫЗА и РАСЗанализ с использованием, при необходимости, 191Ρ4^12-родственных белков, 191Ρ4Ό12экспрессирующих клеток или их экстрактов. 191Ρ4Ό12 антитело или его фрагмент может быть помечено обнаружимым маркером или конъюгировано со второй молекулой. Подходящие обнаружимые маркеры включают, но не ограничиваются этим, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, металлохелат или фермент. Кроме того, биспецифические антитела, специфичные к двум или более 191Ρ4Ό12 эпитопам, создаются с использованием способов, общеизвестных в данной области техники. Гомодимерные антитела также могут быть созданы при помощи методов перекрестного сшивания, известных в данной области техники (например, \\о1ГГ е! а1., Сапсег Кек. 53: 2560-2565).
В следующем предпочтительном варианте осуществления 191Ρ4Ό12 МАЪ изобретения представляет собой антитело, содержащее тяжелую и легкую цепи антитела, обозначенного На22-2(2,4)6.1. Тяжелая цепь На22-2(2,4)6.1 состоит из аминокислотной последовательности в пределах от 20 Е остатка до 466 К
- 20 027887 остатка последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 7, и легкая цепь На22-2(2,4)6.1 состоит из аминокислотной последовательности в пределах от 23-го Ό остатка до 236-го С остатка последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 8, последовательность которых представлена на фиг. 2 и 3. В предпочтительном варианте осуществления На22-2(2,4)6.1 конъюгировано с цитотоксическим средством.
Гибридома, продуцирующая антитело, обозначенное На22-2(2,4)6.1, была направлена (через Федерал-экспресс) в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), Р.О. Вох 1549, Мапаккак, УА 20108 18 августа 2010, и получила инвентарный номер РТА-11267.
III) Конъюгаты антитело-лекарственное средство.
В другом аспекте изобретение предоставляет конъюгаты антитела с лекарственным средством (АЭСк), содержащие антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, ингибирующее рост средство, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). В другом аспекте изобретение дополнительно предоставляет способы использования ЛЭСк. В одном аспекте АЭС содержит какие-либо из указанных в описании 191Р4Э12 МАЬк, ковалентно присоединенные к цитотоксическому средству или поддающемуся обнаружению средству.
Использование конъюгатов антитела с лекарственным средством для локализованной доставки цитотоксических или цитостатических средств, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении рака (8ут1док апб ЕрепеЮк (1999) АпИсапсет КекеагсН 19:605-614; №си1ексиГОиуа/ апб 8ртшдет (1997) Абу. Ότ§ Ое1. Кеу. 26:151-172; патент США № 4975278), предоставляет возможность целенаправленной доставки молекул лекарственного средства в опухоли и внутриклеточного накопления в них, когда системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности по отношению к нормальным клеткам, таким же как и для опухолевых клеток, которые должны быть уничтожены (Ва1б\\п1 е( а1., (1986) Ьапсе1 р. 60305 (Маг. 15, 1986); ТНогре, (1985) Лпΐ^Ьобу Сатегк ОЕ СуЮЮ.хю Адейк 1п Сапсег ТНегару: А Ке\ае\у, ш Мопос1опа1 АпйЬоб1ек '84: Вю1одюа1 Апб СНйса1 АррНсайопк, А. РшсНета е( а1. (еб.к), р. 475-506). Таким образом, проводится поиск максимальной эффективности в сочетании с минимальной токсичностью. Как сообщалось, и поликлональные антитела и моноклональные антитела используются в этих стратегиях (КоМапб е( а1., (1986) Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1Нег., 21:183-87). Лекарственные средства, используемые в этих методах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (КоМапб е( а1., (1986) кирга). Токсины, используемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Мапб1ег е( а1. (2000) 1оит. оЕ (Не №Е. Сапсег 1пк1. 92(19):1573-1581; Мапб1ег е( а1. (2000) Вюотдашс & Меб. СНет. Ьейетк 10:1025-1028; Мапб1ег е( а1. (2002) ВюсопщдаЕе СНет. 13:786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Ьш е( а1., (1996) Ргос. №й1. Асаб. 8сЕ И8А 93:8618-8623) и калихимицин (Ьобе е( а1. (1998) Сапсег Кек. 58:2928; Нттап е( а1. (1993) Сапсег Кек. 53:3336-3342). Токсины могут оказывать свое цитотоксическое и цитостатическое действие с помощью некоторых механизмов, включая связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства обычно бывают неактивными или менее активными при конъюгировании с крупными антителами или белковыми лигандами рецепторов.
Примерами конъюгатов антитело-лекарственное средство являются ΖЕVЛ^IN® (ибритумомаб тиуксетан, ВюдепДбес), представляющий собой конъюгат антитела с радиоизотопом, состоящий из мышиного 1дО1 каппа моноклонального антитела к СГО20 антигену, обнаруженному на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов, и ш1п или 90Υ радиоизотопа, связанных при помощи линкерахелатора тиомочевины (\йетап е( а1. (2000) Еиг. 1оиг. №с1. Меб. 27(7):766-77; \1кетап е( а1. (2002) В1ооб 99(12):4336-42; \\'П/1д е1 а1. (2002) Е СНп. Опсо1. 20(10):2453-63; \\'П/1д е1 а1. (2002) Е СНп. Опсо1. 20(15):3262-69).
Дополнительно, МΥ^ΟТЛКО™ (гемтузумаб озогамицин, \уе(Н РНаттасеийса1к), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из человеческого 1шСГО33 антитела, связанного с калихимицином, был одобрено в 2000 г. для лечения острой миелоидной лейкемии с помощью инъекций (Эгидк оЕ (Не Рифте (2000) 25(7):686; патенты США № 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001).
Дополнительно кантузумаб мертанзин (1ттиподеп, 1пс.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из НиС242 антитела, связанного через дисульфидный линкер 8РР с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, ЭМ1, находится на II Стадии испытаний в отношении применения для лечения видов рака, экспрессирующих СапАд, таких как колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка и другие.
Дополнительно, МЬ^2704 (МШепишт РНагт., ΕΖΕ Вю1одюк, Нптиподеп Фс.), конъюгат антителолекарственное средство, состоящий из антипростат специфического мембранного антигена (Р8МА) моноклонального антитела, связанного с молекулой майтанзиноидного лекарственного средства, ЭМ1, находится в состоянии разработки для возможного лечения опухолей предстательной железы.
- 21 027887
Наконец, ауристатиновые пептиды, ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин (ММАЕ), синтетический аналог доластатина, были конъюгированы с химерными моноклональными антителами сВК96 (специфичными к Ье\1з Υ при карциномах) и сАС10 (специфичными к СЭ30 при гемобластозах) (Эогоп1па е1 а1. (2003) №Чиге В|о1есйпо1оду 21(7):778-784) и находятся в процессе терапевтической разработки.
Далее, в настоящем документе описаны химиотерапевтические средства, пригодные для получения АЭСз. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Рзеиботопаз аетидшоза), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки А1еигПез £отби, белки диантина, белки Рйу1о1аса атепсапа (РАР1, РАР11 и РАР-8), ингибитор МотогФса сйагапба. курцин, кротин, ингибитор 8араопапа о£ПстаНз. гелонин, митогелин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены; см., например, \УО 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г. Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радионуклидов. Примеры включают 212Βί, 1311, 1311п, 90Υ и 186Ке. Конъюгаты антитела с цитотоксическим средством получают с использованием различных бифункциональных связывающих белки средств, таких как Шсукцинимидил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (8ΡΌΡ), иминотиолан (1Т), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат ΗϋΒ), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис-(пазидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(пдиазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и биоактивные фтористые соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получать, как описано в УйеНа е1 а1., (1987) 8аепсе, 238:1098. Типичным примером хелатирующего средства для конъюгации радионуклида с антителом является меченная по углероду-14 1изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-ЭТРА) (\УО 94/11026).
Также в настоящем документе рассматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихимицин, майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и СС1065 и производные этих токсинов, которые обладают токсической активностью.
111(А) Майтанзиноиды.
Майтанзиноидные соединения, пригодные для использования в качестве молекул майтанзиноидных лекарственных средств, хорошо известны в данной области техники, и их можно выделить из природных источников известными способами, получить с помощью методов генетической инженерии (смотри Υυ е1 а1. (2002) РNА8 99:7968-7973), или майтанзинол и аналоги майтанзинола можно получить синтетическим путем, используя известные методы.
Типичные молекулы майтанзиноидных лекарственных средств включают молекулы с модифицированным ароматическим кольцом, такие как С-19-дехлоро (патент США 4256746) (полученным посредством восстановления ансамитоцина Р2 гидридом алюминия лития); С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/С-19-дехлоро (патенты США № 4361650 и 4307016) (полученным деметилированием с использованием 81герЮтусез или Асйпотусез или дехлорированием с применением ΕΛΗ); и С-20-деметокси, С-20ацилокси (-ОСОК), +/-дехлоро (патент США № 4294757) (полученного посредством ацилирования с применением ацилхлоридов) и молекулы с модификациями в других положениях.
Типичные молекулы майтанзиноидных лекарственных средств также включают молекулы с такими модификациями, как Ε'-9-8Η (патент США 4424219) (полученная посредством реакции майтанзинола с Η28 или Р285); С-М-алкоксиметилЩеметокси/СЩ ОК) (патент США 4331598); С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (ΘΗ^Η или СЩОАс) (патент США 4450254) (полученные из ШсагФа); С-15гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (полученная посредством конверсии майтанзинола 81гер1отусез); С-15-метокси (патенты США № 4313 946 и 4315 929) (выделенная из Тге\\аа пиб1£1ога); С-18-Νдеметил (патенты США № 4362663 и 4322348) (полученная деметилированием майтанзинола 81герЮтусез); и 4,5-дезокси (патент США 4371533) (полученная посредством восстановления майтанзинола трихлоридом титана/^АΗ).
АЭСз, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в патентах США №№ 5208020; 5416064; 6441163 и Европейском патенте ЕР 0425235 В1, описания которых в полном объеме включены в настоящий документ путем отсылки. Ьш е1 а1., Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И8А 93:8618-8623 (1996) описывает АЭСз, содержащие майтанзиноид, обозначенный ΌΜ1, связанный с моноклональным антителом С242, направленным против колоректального рака человека. Обнаружено, что конъюгат был высокотоксичен для культивируемых клеток рака толстого кишечника, и показана противоопухолевая активность при анализе роста опухоли ίπ νί\Ό. Сйап е1 а1., Сапсег Кезеагсй 52:127-131 (1992) описывает АОСз, в которых майтанзиноид через дисульфидный линкер конъюгирован с мышиным антителом А7, связывающиеся с антигеном клеточных линий рака толстого кишечника человека, или с другим моноклональным антителом мыши ТА.1, которое связывается с онкогеном ΗΕΚ-2/пеи. Цитотоксичность конъюгата ТАД-майтанзиноид тестировали ш уйго на клеточной линии рака молочной железы человека 8К-ВК-3, экспрессирующей 3х105 поверхностных антигенов ΗΕΚ-2 на клетку. Лекарственный конъюгат достигал степени цитотоксичности, сходной со степенью цитотоксичности свободного майтанзиноидного лекарственного средства, которую можно увеличить,
- 22 027887 увеличивая количество майтанзиноидных молекул на молекулу антитела. Конъюгат А7-майтанзиноид продемонстрировал низкую системную цитотоксичность у мышей.
Ш(В) Ауристатины и долостатины.
В некоторых вариантах осуществления АЭС содержит антитело изобретения, конъюгированное с долостатинами или пептидными аналогами и производными долостатинов, ауристатинами (патенты США № 5635483; 5780588). Показано, что долостатины и ауристатины препятствуют активности микротрубочек, гидролизу ГТФ и делению ядра и клетки (Шоуке е! а1. (2001) АпбтюгоЬ. АдепТз и СЬетоТЬег. 45(12):3580-3584) и обладают противоопухолевой (патент США 5663149) и противогрибковой активностью (Ре!!й е! а1. (1998) АпИтюгоЬ. АдепТз СЬетоТЬег. 42:2961-2965). Молекулу лекарственного средства доластатина или ауристатина можно связывать с антителом через Ν-конец (амино) или С-конец (карбоксильный) пептидной группы лекарственного средства (ШО 02/088172).
Типичные примеры ауристатина включают присоединенные по Ν-концу группы лекарственного средства монометилауристатина ΌΕ и ΌΡ, описанные в 8еп!ег е! а1., Ргосееб1п§з оЛ ТЬе Атепсап АззоааТюп Лог Сапсег КезеагсЬ, Vο1ите 45, АЬзТгас! ШтЬег 623, представленной 28 марта 2004 года и описанной в патентной публикации США № 2005/0238649, раскрытие которой полностью включается в описание путем отсылки.
Типичный пример ауристатина представляет собой ММАЕ (где волнистая линия показывает ковалентную связь с линкером (Ь) конъюгата антитело-лекарственное средство)
Другой типичный пример ауристатина представляет собой ММАР, где волнистая линия указывает ковалентную связь с линкером (Ь) конъюгата антитело-лекарственное средство (патент США 2005/0238649)
Дополнительные типичные примеры, содержащие ММАЕ или ММАР, и различные линкерные компоненты (описанные далее в настоящем документе) имеют следующие структуры и сокращения (где АЬ означает антитело, 8 означает серу антитела, а р представляет собой число от 1 приблизительно до 8)
Как правило, основанные на пептиднах лекарственные средства можно получить посредством формирования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи можно получить, например, методом синтеза в жидкой фазе (см. Е. 8сЬгобег апб К. ЬиЬке, ТЬе Рерббез, уо1ите 1, р. 76-136, 1965, Асабетю Ргезз), который хорошо известен в области пептидной химии. Ауристатиновые/доластатиновые группы лекарственных средств можно получить способами согласно патенту США 5635483; патенту сШа 5780588; РеТТй е! а1. (1989) I. Ат. СЬет. 8ос. 111:5463-5465; Ре!б! е! а1. (1998) Апб-Сапсег Бга§ Безхдп 13:243-277; РеТТб, О.К., е! а1. 8уп!Ьез1з, 1996, 719-725; Ре!!й е! а1. (1996) I. СЬет. 8ос. Регкт Тгапз. 1 5:859-863 и Богопта (2003) Ка! Вю!есЬпо1 21(7):778-784.
Ш(С) Калихимицин.
В других вариантах осуществления иммуноконъюгат содержит антитело изобретения, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихимицина. Калихимициновое семейство антибиотиков способно к образованию двухцепочечных разрывов в ДНК в субпикомолярных концентрациях. Для получения конъюгатов калихимицинового семейства см. патенты США № 5712374, 5714586, 5739116,
- 23 027887
5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все выданы Атепсап Суапаш1б Сотрапу). Структурные аналоги калихимицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются этим, γ1 Ι, α2\ α3’. Ν-ацетил- γ1Ι Ρ8ΆΟ и θ1Ι (Нттап е! а1., Сапсег Кезеагсй 53:3336-3342 (1993), Ьобе е! а1., Сапсег Кезеагсй 58:2925-2928 (1998) и указанные выше патенты США, выданные Атепсап Суапат1б). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым можно конъюгировать антитело, является РРА, представляющее собой антифолат. И калихимицин, и ЦРА содержат внутриклеточные участки действия и с трудом проходят через плазматическую мембрану. Таким образом, поглощение клетками этих средств вследствие опосредованной антителом интернализации значительно усиливает их цитотоксические эффекты. 1П(Э).
Другие цитотоксические средства.
Другие противоопухолевые средства, которые можно конъюгировать с антителами изобретения, включают ВСТО, стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство средств, в совокупности известных как комплекс ЬЬ-Е33288, описанный в патентах США 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США 5877296).
Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Ρзеиботоηаз аегидтоза), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки А1еип!ез Гогбй, диантиновые белки, белки Ρйу!о1аса атепсапа (ΡАΡI, ΡАΡII и ΡАΡ-8), ингибитор Мотогбюа сйагапйа, курцин, кротин, ингибитор 8араопапа оГПстаПз, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены; см., например, АО 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г.
Настоящее изобретение дополнительно относится к АЭС', образованному антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).
Для селективного разрушения опухоли антитело может содержать высокорадиоактивный атом. Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радиоактивных изотопов. Примеры Л ,211 т131 т125 -ν-90 г, 186 п 188 с 153 η-212 г>32 ηΐ212 τ π включают А! , I , I , Υ , Ке , Ке , 8т , Βι , Ρ , ΡЬ и радиоактивные изотопы Ьи. При использовании конъюгата для детекции он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например !с99т или I123, или спиновую метку для получения изображения ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как снова йод123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Радиоактивные или другие метки можно вводить в конъюгат известными способами. Например, пептид можно биосинтезировать или синтезировать посредством химического синтеза аминокислот с применением подходящих предшественников аминокислот, содержащих, например, фтор-19 вместо водорода. Метки, такие как !с99т или I123, Ке186, Ке188 и 1п111, можно присоединить через цистеиновый остаток в пептиде. Иттрий-90 можно присоединять посредством лизинового остатка. Для введения йода-123 можно использовать способ !ΟΩΟΟΕΝ (Ргакег е! а1. (1978) Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип. 80:49-57). В Мопос1опа1 АпйЬоб1ез т 1ттипозс1пИугарНу (СЬа!а1, СКС 1’гезз 1989) подробно описаны другие способы.
IV) Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающие 191Ρ4Ω12.
Настоящее изобретение предоставляет, в числе прочего, конъюгаты антитело-лекарственное средство, предназначенные для направленной доставки лекарственных средств. Изобретатели обнаружили, что конъюгаты антитело-лекарственное средство обладают сильной цитотоксической и/или цитостатической активностью в отношении клеток, экспрессирующих 191Ρ4Ώ12. Конъюгат антитело-лекарственное средство содержит антитело, ковалентно связанное по меньшей мере с одной молекулой лекарственного средства. Молекулы лекарственного средства могут быть ковалентно связаны непосредственно или через линкерный фрагмент (ЬИ).
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу:
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где Ь представляет собой молекулу антитела, например 191Ρ4Ω12 МАЬ настоящего изобретения;
(Ьи-О) является блоком линкерный фрагмент-молекула лекарственного средства, где ЬИ - представляет собой линкерный фрагмент и
-О представляет собой молекулу лекарственного средства, обладающего цитостатической или цитотоксической активностью против клетки-мишени; и р является целым числом от 1 до 20.
В некоторых вариантах осуществления р находится в пределах от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления р находится в пределах от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления р является 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления р представляет собой 2 или 4.
- 24 027887
В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу:
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, где Ь представляет собой молекулу антитела, например 191Ρ4Ό12 МАЬ;
-Аа-№те-Уу- представляет собой линкерный фрагмент (ЬИ), в котором -А- представляет собой фрагмент для расширения (расширитель); а является 0 или 1;
каждый -№- независимо является аминокислотным фрагментом; ш является целым числом в пределах от 0 до 12;
-Υ- представляет собой самоуничтожающийся спейсерный фрагмент; у является 0, 1 или 2;
-О представляет собой молекулу лекарственного средства, обладающего цитостатической или цитотоксической активностью против клетки-мишени;
р является целым числом от 1 до 20.
В некоторых вариантах осуществления а является 0 или 1, ш является 0 или 1 и у является 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления а является 0 или 1, ш является 0 или 1 и у является 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления р находится в пределах от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления р находится в пределах от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления р представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления р является 2 или 4. В некоторых вариантах осуществления, когда ш не является нулем, у является 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления, когда ш является 1-12, у является 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления ш является 2-12 и у является 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления а является 1, а ш и у являются 0.
Для композиций, содержащих множество антител, нагрузка лекарственного средства представлена в виде р, среднего числа молекул лекарственного средства на антитело. Нагрузка лекарственного средства может находиться в пределах от 1 до 20 молекул лекарственного средства (Ό) на антитело. Среднее число молекул лекарственного средства на антитело в препарате после реакции конъюгации может быть охарактеризовано с помощью обычных методов, таких как масс-спектроскопия, анализ ЕЫ8А и ВЭЖХ. Также можно определить количественное распределение конъюгатов антитело-лекарственное средство в виде р. В некоторых случаях разделение, очистку и характеристику гомогенных конъюгатов антителолекарственное средство, где р представляет собой определенное значение конъюгатов антителолекарственное средство с другими нагрузками лекарственным средством, можно оценить такими способами, как ВЭЖХ с обратной фазой или электрофорез. В иллюстративных вариантах осуществления р находится в пределах от 2 до 8.
Получение конъюгированных соединений антитело-лекарственное средство может осуществляться с помощью любого метода, известного специалисту в данной области. Коротко, конъюгированные соединения антитело-лекарственное средство содержат 191Ρ4Ό12 МАЬ в качестве молекулы антитела, лекарственное средство и необязательно линкер, соединяющий лекарственное средство и связующий агент. В предпочтительных вариантах осуществления антитело представляет собой 191Ρ4Ό12 МАЬ, содержащее вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, обозначенного №22-2(2,4)6.1 и описанного выше. В более предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой 191Ρ4Ό12 МАЬ, содержащее тяжелую и легкую цепь антитела, обозначенного №22-2(2,4)6.1 и описанного выше. Для ковалентного связывания лекарственных средств и/или линкеров со связующими агентами имеется в распоряжении целый ряд различных реакций. Это часто достигается посредством реагирования остатков аминокислот связующего агента, например молекулы антитела, включая аминогруппы лизина, свободные карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильные группы цистеина и различные фрагменты ароматических аминокислот. Одним из обычно используемых неспецифических методов ковалентного связывания является карбодиимидная реакция для связи карбокси (или амино) групп соединения с амино (или карбокси) группами антитела. Кроме того, бифункциональные агенты, такие как диальдегиды или имидоэфиры, используются для того, чтобы связать аминогруппу соединения с аминогруппами молекулы антитела. Кроме того, для прикрепления лекарственных средств к связующим агентам доступной является реакция с шиффовыми основаниями. Этот метод затрагивает окисление периодатом лекарственного средства, содержащего гликоль- или гидроксигруппы, таким образом, образуя альдегид, который затем вступает в реакцию со связующим агентом. Присоединение происходит через образование шиффового основания с аминогруппами связующего агента. Изотиоцианаты также могут использоваться в качестве сопрягающих агентов для ковалентного связывания лекарственных средств со связующими агентами. Специалистам в данной области известны другие методы, входящие в объем настоящего изобретения.
- 25 027887
В некоторых вариантах осуществления при подходящих условиях в реакцию с лекарственным средством вступает промежуточный продукт, являющийся предшественником линкера. В некоторых вариантах осуществления используются реакционно-способные группы на лекарственном средстве и/или промежуточном продукте. Продукт реакции между лекарственным средством и промежуточным продуктом, или полученное лекарственное средство, потом вступает в реакцию с 191Ρ4Ό12 МЛЬ при соответствующих условиях.
Каждое из конъюгированных соединений антитело-лекарственное средство описано в этом документе более подробно. Кроме того, синтез и структура типичных линкерных фрагментов, расширителей, аминокислотных фрагментов, самоуничтожающихся линкерных фрагментов и молекулы лекарственных средств описаны в опубликованных патентных заявках США № 2003-0083263, 2005-0238649 и 2005-0009751, каждая из которых полностью и во всех смыслах включена в описание путем отсылки.
V) Линкерные фрагменты.
Как правило, конъюгированные соединения антитело-лекарственное средство содержат линкерный фрагмент между молекулой лекарственного средства и антителом. В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется при внутриклеточных условиях, так что расщепление линкера освобождает молекулу лекарственного средства от антитела во внутриклеточную окружающую среду. В других вариантах осуществления линкер не расщепляется, а лекарственное средство освобождается, например, при разрушении антитела.
В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется с помощью расщепляющего агента, присутствующего во внутриклеточной окружающей среде (например, в лизосоме или эндосоме или ямке). Линкер может быть, например, пептидильным линкером, который расщепляется внутриклеточной пептидазой или протеазой, включая, но не ограничиваясь этим, лизосомальную или эндосомальную протеазу. В некоторых вариантах осуществления пептидильный линкер имеет длину по меньшей мере две аминокислоты или по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и Ό и плазмин, которые, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней (см., например, ИиЬоусЫк и \Уа1кег. 1999, РЬагт. ТЬегареийск 83:67-123). Самыми типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, присутствующими в 191Ρ4Ό12экспрессирующих клетках. Например, можно использовать пептидильный линкер, расщепляемый тиолзависимой протеазой катепсином-В, который высоко экспрессируется в злокачественной ткани (например, линкер РЬе-Ьеи или О1у-РЬе-Ьеи-О1у (§ЕЦ ГО N0:9)). Другие примеры таких линкеров описаны, например, в патенте США № 6214345, полностью и во всех отношениях включенном в описание путем отсылки. В специальном варианте осуществления пептидильным линкером, расщепляемым внутриклеточной протеазой, является линкер νη1-ΟΙ или линкер РЬе-Ьук (см., например, патент США № 6214345, который описывает синтез доксорубицина с использованием линкера νη1-ΟΙ). Одно преимущество использования внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического средства заключается в том, что средство, как правило, в конъюгированном состоянии является ослабленным, а устойчивость конъюгатов в сыворотке в основном высокая.
В других вариантах осуществления расщепляемый линкер является чувствительным к рН, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. В большинстве случаев рН-чувствительный линкер гидролизуется при кислых условиях. Например, можно использовать кислото-лабильный линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цисаконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь или тому подобное) (см., например, патент США № 5122368; 5824805; 5622929; ИиЬоусЫк и \Уа1кег. 1999, РЬагт. ТЬегареиЬск 83:67-123; №\а11е е1 а1., 1989, Вю1. СЬет. 264:14653-14661) Подобные линкеры являются относительно устойчивыми при нейтральных значениях рН, например значениях в крови, но являются нестабильными при более низких значениях рН 5,5 или 5,0, приблизительное значение рН в лизосомах. В определенных вариантах осуществления линкер, подвергающийся гидролизу, является тиоэфирным линкером (таким как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому агенту через ацилгидразоновую связь (см., например, патент США № 5622929).
В других вариантах осуществления линкер расщепляется при восстановительных условиях (например, дисульфидный линкер). В этой области техники известен целый ряд дисульфидных линкеров, включая, например, такие, которые могут образовываться при использовании 8ЛТЛ Щ-сукцинимидил-3ацетилтиоацетат), §РИР (№сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), §РИВ (№сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)бутират) и 8МРТ (№сукцинимидил-оксакарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол), §РИВ и 8МРТ (см., например, ТЬогре е1 а1., 1987, Сапсег Кек. 47:5924-5931; \Уа\\т/упс/ак е1 а1., 1п 1ттипосои)ида1ек: ЛпйЬойу Соп)ида1ек ίη КайМтадегу и ТЬегару оГ Сапсег (С.\У. №де1 ей., ОхГогй и. Ргекк, 1987. §ее а1ко И.8. Ра1еп1 №. 4880935).
В других определенных вариантах осуществления линкер является малонатным линкером ЦоЬпкоп е1 а1., 1995, Лпйсапсег Кек. 15:1387-93), малеимидобензоиловым линкером (Ьаи е1 а1., 1995, Вюогд-МейСЬет. 3(10):1299-1304) или 3'-№амидным аналогом (Ьаи е1 а1., 1995, Вюогд-Мей-СЬет. 3(10):1305-12).
В следующих вариантах осуществления линкерный фрагмент является нерасщепляемым, а лекарст- 26 027887 венное средство освобождается при разрушении антитела (см. публикацию США № 2005/0238649, полностью и во всех отношениях включенную в описание путем отсылки).
Как правило, линкер является практически нечувствительным к внеклеточной окружающей среде. При использовании в описании практически нечувствительный к внеклеточной окружающей среде в контексте, связанном с линкером, означает, что не более около 20%, как правило, не более чем около 15%, более типично не более чем около 10% и даже еще более типично не более чем около 5%, не более чем около 3% или не более чем около 1% линкеров в образце конъюгированного соединения антителолекарственное средство расщепляется, когда конъюгированное соединение антитело-лекарственное средство находится во внеклеточной окружающей среде (например, в плазме). Чувствительность линкера к внеклеточной окружающей среде можно определить, например, путем инкубирования с плазмой конъюгированного соединения антитело-лекарственное средство в течение предопределенного периода времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 ч), а затем определения количества свободного лекарственного средства, присутствующего в плазме.
В других, невзаимоисключающих вариантах осуществления линкер оказывает содействие клеточной интернализации. В определенных вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации, когда он конъюгирован с терапевтическим агентом (т.е. в микросреде молекулы линкертерапевтический агент конъюгированного соединения антитело-лекарственное средство, как описано в этом документе). В других вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации, когда он конъюгирован и с ауристатином соединением и 191Р4Э12 МАЪ.
Целый ряд типичных линкеров, которые могут использоваться с настоящими композициями и способами, описан в \УО 2004-010957, публикации США № 2006/0074008, публикации США № 20050238649 и публикации США № 2006/0024317 (каждая из которых полностью и во всех отношениях включена в описание путем отсылки).
Линкерный фрагмент (ЬИ) является бифункциональным соединением, которое можно использовать для того, чтобы соединить молекулу лекарственного средства и молекулу антитела и получить конъюгированное соединение антитело-лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления линкерный фрагмент имеет формулу
где -А- представляет собой расширитель; а является 0 или 1;
каждый -Ψ- независимо является молекулой аминокислоты;
№ является целым числом в пределах от 0 до 12;
-Υ- представляет собой самоуничтожающийся спейсерный фрагмент; у является 0, 1 или 2.
В некоторых вариантах осуществления а является 0 или 1, № является 0 или 1 и у является 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления а является 0 или 1, № является 0 или 1, а у является 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления, когда № составляет от 1 до 12, у является 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления № составляет от 2 до 12, а у является 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления а является 1, а № и у являются 0.
VI) Фрагмент для расширения (расширитель).
Расширитель (А), когда имеется, способен соединить молекулу антитела с аминокислотным фрагментом (-Ψ-), если он имеется, со спейсерным фрагментом (-Υ-), если он имеется; или с молекулой лекарственного средства (-Ό). Подходящие функциональные группы, которые могут присутствовать на 191Р4Э12 МАЪ (например, На22-2(2,4)6.1), или по своей природе или в результате химической манипуляции, включают, но не ограничиваются этим, сульфгидрильную группу, аминогруппу, гидроксильную группу, аномерную гидроксильную группу углевода и карбоксил. Подходящими функциональными группами являются сульфгидрильные группы или аминогруппы. В одном примере сульфгидрильные группы могут быть получены путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей антитела 191Р4Э12 МАЪ. В другом варианте осуществления сульфгидрильные группы могут быть получены при взаимодействии аминогруппы лизина антитела 191Р4Э12 МАЪ с 2-иминотиоланом (реагент Трота) или другими реагентами, порождающими сульфгидрильные группы. В определенных вариантах осуществления 191Р4Э12 МАЪ является рекомбинантным антителом и конструируется так, чтобы нести один или более лизинов. В других вариантах осуществления рекомбинантное 191Р4Э12 МАЪ конструируется так, чтобы нести дополнительные сульфгидрильные группы, например дополнительные цистеины.
В одном варианте осуществления расширитель образует связь с атомом серы молекулы антитела. Атом серы может происходить из сульфгидрильной группы антитела. Типичные расширители этого варианта осуществления изображены в квадратных скобках формул Ша и ШЪ, где Ь-, -Ψ-, -Υ-, -Ό, № и у являются, как определено выше, а К17 выбирают из Ю-Сюалкилен-, Ю-Сюалкенилен-, -С1Сюалкинилен-, карбоцикло-, -О-(С1-С8алкилен)-, О-(С1-С8алкенилен)-, -О-(С1-С8алкинилен)-, -арилен-, -С1-С10алкилен-арилен-, -С2-С10алкенилен-арилен, -С2-С10алкинилен-арилен, -арилен-С1-С10алкилен-, арилен-С2-С10алкенилен-, -арилен-С2-С10алкинилен-, -С1-С10алкилен-(карбоцикло)-, -С2-С10алкенилен(карбоцикло)-, -С2-С10алкинилен-(карбоцикло)-, -(карбоцикло)-С1-С10алкилен-, -(карбоцикло)-С2- 27 027887
С10алкенилен-, -(карбоцикло)-С2-С10алкинилен, -гетероцикло-, -С1-С10алкилен-(гетероцикло)-, -С2С10алкенилен-(гетероцикло)-, -С2-С10алкинилен-(гетероцикло)-, -(гетероцикло)-С1-С10алкилен-,
-(гетероцикло)-С2-С10алкенилен-, -(гетероцикло)-С1-С10алкинилен-, -(СН2СН2О)Г- или -(СН2СН2О)Г-СН2-, а г является целым числом в пределах от 1 до 10, где указанный алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоцикл, карбоцикло, гетероцикло и арилен радикалы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно являются замещенными. В некоторых вариантах осуществления указанный алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоцикл, карбоцикло, гетероцикло и арилен радикалы, или отдельно, или как часть другой группы, являются незамещенными. В некоторых вариантах осуществления К17 выбирают из -С1-С10алкилен-, -карбоцикло-, -О-(С1-С8алкилен)-, -арилен-, -С1-С10алкилен-арилен-, -арилен-С1-С10алкилен-, -С1-С10алкилен-(карбоцикло)-, -(карбоцикло)С1-С10алкилен-, -С3-С8гетероцикло-, -С1-С10алкилен-(гетероцикло)-, -(гетероцикло)-С1-С10 алкилен-, -(СН2СН2О)Г- и -(СН2СН2О)ГСН2-; и г является целым числом в пределах от 1 до 10, где указанные алкиленовые группы являются незамещенными, а оставшиеся группы необязательно являются замещенными.
Из всех иллюстративных вариантов осуществления понятно, что даже в том случае, когда не указано точно, с антителом может быть связано от 1 до 20 молекул лекарственного средства (р = 1-20).
Один типичный :н2-соын—к17-С(О)' ШЬ расширитель соответствует формуле 111а, в которой К17 представляет собой
-(СН2)5-.
Другой типичный расширитель -(СН2СН2О)ГСН2-; а г является 2.
соответствует формуле 111а, в которой К17 представляет собой
Некоторый типичный расширитель соответствует формуле 111а, в которой К17 представляет собой арилен- или арилен-С1-С10алкилен-. В некоторых вариантах осуществления арильная группа представляет собой незамещенную фенильную группу.
Еще один типичный расширитель соответствует формуле 111Ь, в которой К17 представляет собой -(СН2)5-.
В некоторых вариантах осуществления расширитель связывается с молекулой антитела через дисульфидную связь между атомом серы молекулы антитела и атомом серы расширителя. Типичный расширитель этого варианта осуществления показан в квадратных скобках формулы IV, в которой К17, Ь-, -^-, -Υ-, -Ώ, и у являются, как определено выше.
Следует отметить, что на всем протяжении данной заявки, компонент 8 в формуле ниже относится к атому серы молекулы антитела, если контекст не указывает иначе.
В других вариантах осуществления расширитель содержит реакционноспособный центр, который может образовывать связь с первичной или вторичной аминогруппой антитела. Примеры этих реакционноспособных центров включают, но не ограничиваются этим, активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры сукцинимида, 4 нитрофениловые сложные эфиры, пентафторфениловые сложные эфи- 28 027887 ры, тетрафторфениловые сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Типичные расширители этого варианта осуществления показаны в квадратных скобках формул Уа и УЬ, где -К17-, Ь-, -№-, -Υ-, -Ό, \ν и у являются, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления расширитель содержит реакционноспособный центр, который является реакционноспособным по отношению к модифицированной группе углевода (-СНО), которая может присутствовать на антителе. Например, углевод может быть слабо окислен при помощи реактива, такого как йоднокислый натрий, а полученный (-СНО) фрагмент окисленного углевода может быть соединен с расширителем, который содержит функциональность, такую как гидразид, оксим, первичный или вторичный амин, гидразин, тиосемикарбазон, гидразин карбоксилат и арилгидразид, такие как описанные Капеко е1 а1., 1991, Вюсощида!е СЬет. 2:133-41. Типичные расширители этого варианта осуществления показаны в квадратных скобках формул У1а-У1с, где -К17-, Ь-, -№-, -Υ-, -Ό, \ν и у являются, как описано выше.
VII) Аминокислотный фрагмент.
Аминокислотный фрагмент (-№-), если присутствует, связывает расширитель со спейсерным фрагментом, если спейсерный фрагмент присутствует, связывает расширитель с молекулой лекарственного средства, если спейсерный фрагмент отсутствует, и связывает антитело с лекарственным средством, если расширитель и спейсерный фрагмент отсутствуют.
^,- может быть, например, монопептидом, дипептидом, трипептидом, тетрапептидом, пентапептидом, гексапептидом, гептапептидом, октапептидом, нонапептидом, декапептидом, ундекапептидом или додекапептидом. Каждый -^-компонент независимо имеет формулу, указанную ниже в квадратных скобках, а \ν является целым числом от 0 до 12
где К19 представляет собой водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, ргидроксибензил, -СН2ОН, -СН(ОН)СН3, -СН2СН28СН3, -СΗ2СΘNΗ2, -СН2СООН, -СΗ2СΗ2СΘNΗ2, -СН2СН2СООН, -(^)^6(-^^¾ -(0¾)^¾ -(СН2)3КНСОСН3, -(СН2)3ЯНСНО,
-(СН2)4КНС(=КН)КН2, -(СН2)4КН2, -(СН2)4ЯНСОСН3, -(СНД^НСНО, -(СΗ2)3NΗСΘNΗ2, -(СΗ2)4NΗСΘNΗ2, -СΗ2СΗ2СΗ(ΘΗ)СΗ2NΗ2, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, фенил, циклогексил,
- 29 027887
В некоторых вариантах осуществления аминокислотный фрагмент может отщепляться под воздействием одного или более ферментов, включая протеазы, ассоциированные с раком или опухолью, чтобы освободить молекулу лекарственного средства (-Ό), которая в одном варианте осуществления протонируется ΐη νί\Ό после высвобождения с получением лекарственного средства (Ό).
В некоторых вариантах осуществления аминокислотный фрагмент может содержать природные аминокислоты. В других вариантах осуществления аминокислотный фрагмент может содержать искусственные аминокислоты. Типичные фрагменты представлены формулами (УИНГС)
О Р21
21 где К и К представляют собой, как указано ниже:
Бензил (<3Η2)4ΝΗ2;
Метил (ΟΗ2)4ΝΗ2;
изопропил (СЩчЯНз;
изопропил (ΌΗ2)3ΝΗΟΟΝΗ2;
Бензил <ΌΗ2)3ΝΗΟΟΝΗ2;
Изобутил (ΟΗ2)3ΝΗΟΟΝΗ2;
ещод-бутил (ΟΗ2)3ΝΗΟΟΝΗ2;
>_сн^О N Н (<3Η2)3ΝΗΟΟΝΗ2;
Бензил метил;
Бензил (ΟΗ2)3ΝΗΰ(=ΝΗ)ΝΗ2;
- 30 027887 где Κ20, Κ21 и Κ22 представляют собой, как указано ниже:
Типичные аминокислотные фрагменты включают, но не ограничиваются этим, фрагменты формулы УН, где: Κ20 представляет собой бензил, а Κ21 представляет собой (СН2)4МН2; Κ20 является изопропилом, а Κ21 представляет собой -(СН2)4МН2; или Κ20 является изопропилом, и Κ21 представляет собой -(ΟΗ2)3Ν^ΟΝΗ2. Другим примером аминокислотного компонента является фрагмент формулы УШ, где Κ20 представляет собой бензил, Κ21 представляет собой бензил, и Κ22 представляет собой -(СН2)4МН2.
Можно создать подходящие фрагменты -ν№- и оптимизировать их по селективности в отношении ферментативного расщепления определенным ферментом, например опухоль-ассоциированной протеазой. В одном варианте осуществления фрагмент -V»- является частью, расщепление которой катализируется катепсином В, С и Ό, или протеолитическим ферментом плазмином.
В одном варианте осуществления -V»- представляет собой дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Когда Κ19, Κ20, Κ21, Κ22 или Κ23 является иным, чем водород, атом углерода, к которому присоединяется Κ , Κ , Κ , Κ или Κ , является хиральным.
Каждый атом углерода, к которому присоединяется Κ19, Κ20, Κ21, Κ22 или Κ23, независимо находится в (δ)- или (^-конфигурации.
В одном аспекте аминокислотный фрагмент представляет собой валин-цитруллин (Ас или Уа1-Сй). В другом аспекте аминокислотный фрагмент представляет собой фенилаланин-лизин (т.е. 1к). В следующем аспекте аминокислотный фрагмент представляет собой Ν-метилвалин-цитруллин. В еще одном аспекте аминокислотный фрагмент представляет собой 5-аминовалериановую кислоту, гомофенилаланин лизин, тетраизохинолинкарбоксилат лизин, циклогексилаланин лизин, изонипекатиновая кислота лизин, бета-аланин лизин, глицин серин валин глутамин и изонипекатиновая кислота.
УШ) Спейсерный фрагмент.
Спейсерный фрагмент (-Υ-), если присутствует, связывает аминокислотный фрагмент с молекулой лекарственного средства, когда аминокислотный фрагмент присутствует. Альтернативно, спейсерный фрагмент связывает расширитель с молекулой лекарственного средства, когда аминокислотный фрагмент отсутствует. Спейсерный фрагмент также связывает молекулу лекарственного средства с молекулой антитела, когда отсутствуют и аминокислотный фрагмент и расширитель.
Спейсерные фрагменты бывают двух основных типов: несамоуничтожающиеся или самоуничтожающиеся. Несамоуничтожающийся спейсер - это спейсер, в котором часть или весь спейсерный фрагмент остается связанным с молекулой лекарственного средства после отщепления, в частности, ферментативного, аминокислотного фрагмента от конъюгата антитело-лекарственное средство. Примеры несамоуничтожающегося спейсерного фрагмента включают, но не ограничиваются этим, (глицин-глицин) спейсерный фрагмент и глициновый спейсерный фрагмент (оба показаны на схеме 1) (ниже). Когда конъюгат, содержащий спейсерный фрагмент глицин-глицин или глициновый спейсерный фрагмент, претерпевает ферментативное расщепление при посредстве фермента (например, протеазы, ассоциированной с опухолевой клеткой, протеазы, ассоциированной со злокачественной опухолевой клеткой, или протеазы, ассоциированной с лимфоцитом), фрагмент глицин-глицин-лекарственное средство или фрагмент глицин-лекарственное средство отщепляется от Ь-Ла-ν»-. В одном варианте осуществления в клетке-мишени протекает независимая реакция гидролиза, при этом расщепляется связь глицинмолекула лекарственного средства и освобождается лекарственное средство.
- 31 027887
Схема 1
Да»-^— О1у—о] ь|-А,-^-01у-01у]-0
Ферментативное I Ферментативное расщепление 1 расщепление
СНу-ϋ 01у-01у-0 гидролиз лекарство лекарство
В некоторых вариантах осуществления несамоуничтожающийся спейсер (-Υ-) представляет собой -О1у-. В некоторых вариантах осуществления несамоуничтожающийся спейсер (-Υ-) представляет собой -С1у-С1у-.
В одном варианте осуществления предоставляется конъюгат лекарственное средство-линкер, в котором спейсерный фрагмент отсутствует (-Υ^, где у=0), или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
Альтернативно, конъюгат, содержащий самоуничтожающийся спейсерный фрагмент, может высвобождать -Ό. При использовании в описании термин самоуничтожающийся спейсер относится к бифункциональному химическому фрагменту, который способен ковалентно связывать вместе две расположенные на расстоянии химические молекулы в стабильную трехсоставную молекулу. Он будет спонтанно отделяться от второго химического фрагмента, если его связь с первой молекулой расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления -Υ^ представляет собой молекулу р-аминобензилового спирта (РАВ) (смотри схемы 2 и 3), фениленовая часть которого замещается О,,,- где О представляет собой -С1-С8алкил, -С1-С8алкенил, -С1-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О-(С1-С8алкенил), -О-(С1-С8алкинил), -галоген, -нитро или -циано; а т является целым числом в пределах от 0 до 4. Алкил, алкенил и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут быть замещенными.
В некоторых вариантах осуществления -Υ- представляет собой группу РАВ, которая связывается с - через аминоатом азота группы РАВ, и соединяется непосредственно с -Ό через карбонатную, карбаматную или простую эфирную группу. Не будучи связанной с какой-либо отдельной теорией или механизмом, схема 2 показывает возможный механизм высвобождения лекарственного средства из группы РАВ, которая присоединяется непосредственно к -Ό через карбаматную или карбонатную группу, как описано Ток1 е! а1., 2002, I. Огд. СЬет. 67:1866-1872.
На схеме 2 О представляет собой -С1-С8алкил, -С1-С8алкенил, -С1-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О(С1-С8алкенил), -О-(С1-С8алкинил), -галоген, -нитро или -циано; т является целым числом в пределах 0-4 и р находится в пределах примерно от 1 до 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут быть замещенными.
Не будучи связанной с какой-либо отдельной теорией или механизмом, схема 3 показывает возможный механизм высвобождения лекарства из РАВ группы, которая присоединяется непосредственно к -Ό через простую эфирную или аминную связь, в которой Ό включает группу кислорода или азота, которая является частью молекулы лекарственного средства.
- 32 027887
На схеме 3 О представляет собой -С1-С8алкил, -С1-С8алкенил, -С1-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О(С1-С8алкенил), -О-(С1-С8алкинил), -галоген, -нитро или -циано; т является целым числом в пределах 04; и р находится в пределах примерно от 1 до 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут быть замещенными.
Другие примеры самоуничтожающихся спейсерных фрагментов включают, но не ограничиваются этим, ароматические соединения, являющиеся электронно-сходными с РАВ группой, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Нау е! а1., 1999, Вюогд. Меб. СЬет. ГеИ. 9:2237) и орто- или парааминобензилацетали. Могут использоваться спейсеры, подвергающиеся циклизации после гидролиза амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Кобпдиез е! а1., 1995, СИепшПу Вю1оду 2:223), соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] системы колец (81огт е! а1., 1972, I. Атег. СЬет. 8ос. 94:5815) и амиды 2аминофенилпропионовой кислоты (АтзЬеггу е! а1., 1990, I. Огд. СЬет. 55:5867). Удаление аминсодержащих лекарственных средств, которые являются замещенными в α-положении глицина (КтдзЬигу е! а1., 1984, I. Меб. СЬет. 27:1447), - это также примеры самоуничтожающихся спейсеров.
В одном варианте осуществления спейсерный фрагмент представляет собой разветвленный бис(гидроксиметил)-стирольный (ВНМ8) фрагмент, как показано на схеме 4, который может использоваться для включения и высвобождения лекарственных средств.
Схема 4 / От СН2(0(С(0)))л-0 \
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ I РАСЩЕПЛЕНИЕ }
ЛЕКАРСТВА
На схеме 4 О представляет собой -С1-С8алкил, -С1-С8алкенил, -С1-С8алкинил, -О-(С1-С8алкил), -О(С1-С8алкенил), -О-(С1-С8алкинил), -галоген, -нитро или -циано; т является целым числом в пределах 04; η представляет собой 0 или 1; и р находится в пределах примерно от 1 до 20. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут быть замещенными.
В некоторых вариантах осуществления -Ό фрагменты являются одинаковыми. В другом варианте осуществления -Ό фрагменты являются разными.
В одном аспекте спейсерные фрагменты (-Уу-) представлены формулами (Χ)-(ΧΙΙ)
- 33 027887 где С) представляет собой -С]-С8алкил, -С]-С8алкенил, -С]-С8алкинил, -О-(С]-С8алкил), -О-(С1С8алкенил), -О-(С]-С8алкинил), -галоген, -нитро или -циано и т является целым числом в пределах 0-4. Алкильные, алкенильные и алкинильные группы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно могут быть замещенными.
^-Н1Ч-СН2-СО-4 χί
-ΝΗΟΗ2Ο(Ο)-ΝΗΟΗ2Ο(Ο)-|
Варианты осуществлений формул I и II, содержащие конъюгированные соединения антителолекарственное средство, могут включать
XII.
где \ν и у, каждый, представляют собой 0, 1 или 2 и
где \ν и у, каждый, представляют собой 0,
IX) Молекула лекарственного средства.
Молекулой лекарственного средства (Ό) может быть любое цитотоксическое, цитостатическое или иммуномодулирующее (например, иммуносупрессорное) лекарственное средство. Ό представляет собой молекулу (фрагмент) лекарственного средства, имеющую атом, который может образовывать связь со спейсерным фрагментом, с аминокислотным фрагментом, с расширителем или с молекулой антитела. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства Ό содержит атом азота, который может образовывать связь со спейсерным фрагментом. При использовании в описании термины молекула лекарственного средства и фрагмент лекарственного средства являются синонимами и используются взаимозаменяемо.
Подходящие классы цитотоксических, цитостатических или иммуномодулирующих средств включают, например, антитубулиновые вещества, вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК, ингибиторы репликации ДНК и алкилирующие агенты.
- 34 027887
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство является ауристатином, таким как ауристатин Е (также известный в данной области как производное доластатина-10) или его производным. Ауристатин может быть, например, сложным эфиром, образованным ауристатином Е и кетокислотой. Например, ауристатин Е может реагировать с параацетил бензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с получением АЕВ и АΕVВ соответственно. Другие типичные ауристатины включают АРР, ММАР и ММАЕ. Синтез и структура характерных ауристатинов описаны в опубликованной патентной заявке США № 2003-0083263; международной патентной публикации № ШО 04/010957, международной патентной публикации № ШО 02/088172 и патентах США №№ 7498298, 6884869, 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; и 4486414, каждый из которых полностью и во всех отношениях включен в описание путем отсылки.
Показано, что ауристатины вмешиваются в динамику микротрубочек и деление ядра и клетки и обладают противоопухолевой активностью. Ауристатины связывают тубулин и могут оказывать цитотоксическое или цитостатическое действие на 191Р4П12-экспрессирующие клетки. Существует множество различных методов анализа, известных в данной области техники, которые можно использовать для определения, проявляет ли ауристатин или полученный конъюгат антитело-лекарственное средство цитотоксическое или цитостатическое действие на нужную линию клеток.
В данной области техники известны способы определения, связывает ли соединение тубулин; см., например, Ми11ег е! а1., Апа1. СЬет 2006, 78, 4390-4397; Нате1 е! а1., Мо1еси1аг РЬагтасо1о§у, 1995 47: 965-976 и Нате1 е! а1., ТЬе Зонта! оЛ Вю1о§юа1 СЬет1з!гу, 1990 265:28, 17141-17149. В целях настоящего изобретения можно определить относительную аффинность соединения к тубулину. Некоторые предпочтительные ауристатины настоящего изобретения связывают тубулин с аффинностью в пределах от 10-кратно более низкой (низкая аффинность), чем аффинность связывания ММАЕ с тубулином, до аффинности в 10 раз, 20 раз или даже 100 раз более высокой (высокая аффинность), чем аффинность связывания ММАЕ с тубулином.
В некоторых вариантах осуществления -О представляет собой ауристатин формулы 1)Е или 1)Р
или его фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму; где независимо в каждом положении волнистая линия показывает связь;
К2 представляет собой -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил;
К3 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, -карбоцикл, -С1-С20алкилен (карбоцикл), -С2-С20алкенилен(карбоцикл), -С2-С20алкинилен(карбоцикл), -арил, -С1-С20алкилен(арил), -С2-С20алкенилен(арил), -С2-С20алкинилен(арил), гетероцикл, -С1-С20алкилен(гетероцикл), -С2С20алкенилен(гетероцикл) или -С2-С20 алкинилен(гетероцикл);
К4 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, карбоцикл, -С1-С20алкилен (карбоцикл), -С2-С20алкенилен(карбоцикл), -С2-С20алкинилен(карбоцикл), -арил, -С1-С20 алкилен(арил), -С2-С20 алкенилен(арил), -С2-С20 алкинилен(арил), -гетероцикл, -С1-С20 алкилен(гетероцикл), -С2С20алкенилен(гетероцикл) или -С2-С20 алкинилен(гетероцикл);
К5 представляет собой -Н или -С1-С8алкил;
или К4 и К5 вместе образуют карбоциклическое кольцо и имеют формулу -(СКаКЬ)з-, где Ка и КЬ независимо представляют собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20 алкинил или карбоцикл, а з представляет собой 2, 3, 4, 5 или 6,
К6 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил;
К7 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, карбоцикл, -С1-С20алкилен (карбоцикл), -С2-С20алкенилен(карбоцикл), -С2-С20алкинилен(карбоцикл), -арил, -С1-С20алкилен(арил), -С2-С20алкенилен(арил), -С2-С20алкинилен(арил), гетероцикл, -С1-С20алкилен(гетероцикл), -С2С20алкенилен(гетероцикл) или -С2-С20алкинилен(гетероцикл);
каждый К8 представляет собой независимо -Н, -ОН, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20 алкинил, -О-(С1-С20алкил), -О-(С2-С20алкенил), -О-(С1-С20алкинил) или -карбоцикл;
К9 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил;
К24 представляет собой -арил, -гетероцикл или -карбоцикл;
- 35 027887
К25 представляет собой -Н, С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, -карбоцикл, -О-(С1С20алкил), -О-(С2-С20алкенил), -О-(С2-С20алкинил) или ОК18, где К18 представляет собой -Н, гидроксильную защитную группу или прямую связь, где ОК18 представляет =О;
К26 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил, -арил, -гетероцикл или -карбоцикл;
К10 представляет собой -арил или -гетероцикл;
Ζ представляет собой -О, -δ, -ΝΗ или -ЫК12, где К12 представляет собой -С1-С20алкил, -С2С20алкенил или -С2-С20алкинил;
К11 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, -арил, -гетероцикл, -(К13О)т-К14 или -(К13О)т-СН(К15)2;
т является целым числом в пределах от 1-1000 или т=0-1000;
К13 представляет собой -С2-С20алкилен, -С2-С20алкенилен или -С2-С20алкинилен;
К14 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил;
в каждом случае К15 независимо представляет собой -Н, -СООН, -(СН2)п-Ы(К16)2, -(СН2)п-ЗО3Н, -(СН2)п-ЗО3-С1-С20 алкил, -(СН2)п-ЗО3-С2-С20алкенил или -(СН2)п-ЗО3-С2-С20алкинил;
в каждом случае К16 независимо представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, С2С20алкинил или -(СН2)п-СООН;
п является целым числом в пределах от 0 до 6;
где указанные алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоциклические и гетероциклические радикалы, отдельно или как часть другой группы, необязательно являются замещенными.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, в которых указанные алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоциклические и гетероциклические радикалы являются незамещенными.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, в которых группы К2, К3, К4, К5, К6, К7, К8 и К9 являют19 20 21 ся незамещенными, а группы К19, К20 и К21 необязательно являются замещенными, как описано в этом документе.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, в которых
К2 представляет собой С1-С8алкил;
К3, К4 и К7 независимо выбирают из -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, моноциклический С3-С6карбоцикл, -С1-С20алкилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), С2-С20алкенилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), -С2-С20алкинилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), С6Сюарил, -С1-С20алкилен(С6-С10арил), -С2-С20алкенилен(С6-С10арил), -С2-С20алкинилен(С6-С10арил), гетероцикл, -С1-С20алкилен(гетероцикл), -С2-С20алкенилен(гетероцикл) или -С2-С20алкинилен(гетероцикл); где указанный алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, карбоцикл, арильный и гетероциклический радикалы необязательно являются замещенными;
К5 представляет собой -Н;
К6 представляет собой -С1-С8алкил;
каждый К8 независимо выбирают из -ОН, -О-(С1-С20алкил), -О-(С2-С20алкенил) или -О-(С2С20алкинил), где указанный алкил, алкенил и алкинил радикалы необязательно являются замещенными;
К9 представляет собой -Н или -С1-С8алкил;
К24 необязательно замещается -фенилом;
К25 представляет собой -ОК18; где К18 представляет собой Н, гидроксильную защитную группу или прямую связь, где ОК18 представляет =О;
К26 выбирают из -Н, -С1-С20алкила, -С2-С20алкенила, -С2-С20алкинила или -карбоцикла; где указанныеалкил, алкенил, алкинил и карбоциклический радикалы необязательно являются замещенными; или фармацевтически приемлемой соли или сольватной формы.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, где
К2 представляет собой метил;
К3 представляет собой -Н, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил или С2-С8алкинил, где указанные алкил, алкенил и алкинил радикалы необязательно являются замещенными;
К4 представляет собой -Н, -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил, -С2-С8алкинил, моноциклический С3С6карбоцикл, -С6-С10арил, -С1-С8алкилен(С6-С10арил), -С2-С8алкенилен(С6-С10арил), -С2-С8алкинилен(С6С10арил), -С1-С8алкилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), -С2-С8алкенилен(моноциклический С3С6карбоцикл), -С2-С8алкинилен(моноциклический С3-С6карбоцикл); где указанные алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил и карбоциклический радикалы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно являются замещенными;
К5 представляет собой -Н;
К6 представляет собой метил;
К7 представляет собой -С1-С8алкил, -С2-С8алкенил или -С2-С8алкинил; каждый К8 является метоксигруппой;
К9 представляет собой -Н или -С1-С8алкил;
- 36 027887
К24 представляет собой -фенил;
К25 представляет собой -ОК18; где К18 является Н, гидроксильной защитной группой или прямой связь, где ОК18 представляет =О;
К26 является метилом;
или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, в которых К2 представляет собой метил; К3 представляет собой -Н или -С1-С3алкил; К4 представляет собой -С1-С5алкил; К5 является -Н; К6 является метилом; К7 представляет собой изопропил или втор-бутил; К8 является метоксигруппой; К9 является -Н или -С124 25 18 18
С8алкилом; К24 является фенилом; К25 представляет собой -ОК18; где К18 является -Н, гидроксильной защитной группой или прямой связью, где ОК18 представляет =О; и К26 является метилом; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ΌΕ включают такие, в которых К2 является метилом или С1-С3алкилом, К3 является -Н или -С1-С3алкилом; К4 представляет собой -С1-С5алкил; К5 является Н; К6 является С1С3алкилом; К7 является -С1-С5алкилом; К8 является -С1-С3алкоксигруппой; К9 является -Н или -С124 25 18 18
С8алкилом; К24 является фенилом; К25 является -ОК18; где К18 является -Н, гидроксильной защитной группой или прямой связью, где ОК18 представляет =О; и К26 является -С1-С3алкилом; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ΌΡ включают такие, в которых К2 является метилом;
К3, К4 и К7 независимо выбирают из -Н, -С1-С20алкила, -С2-С20алкенила, -С2-С20алкинила, моноциклического С3-С6карбоцикла, -С1-С20алкилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), -С2С20алкенилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), -С2-С20алкинилен(моноциклический С3-С6карбоцикл), -С6-С10арил, -С1-С20алкилен(С6-С10арил), -С2-С20алкенилен(С6-С10арил), -С2-С20алкинилен(С6-С10арил), гетероцикла, -С1-С20алкилен(гетероцикл), -С2-С20алкенилен(гетероцикл) или -С2С20алкинилен(гетероцикл); где указанные алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, карбоцикл, арильный и гетероциклический радикалы, или отдельно, или как часть другой группы, необязательно являются замещенными;
К5 является -Н;
К6 является метилом;
каждый К8 является метоксигруппой;
К9 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил; где указанный алкил, алкенил и алкинильный радикалы необязательно являются замещенными;
К10 необязательно замещается арил ом или необязательно замещается гетероциклом;
Ζ представляет собой -О-, -8-, -ЫН- или -ЫК12, где К12 представляет собой -С1-С20алкил, -С2С20алкенил или -С2-С20 алкинил, каждый из которых необязательно является замещенным;
К11 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил, -арил, -гетероцикл, -(К13О)т-К14 или -(К13О)т-СН(К15)2, где указанный алкил, алкенил, алкинил, арильный и гетероциклический радикалы необязательно являются замещенными;
т является целым числом в пределах от 1-1000 или т = 0;
К13 представляет собой -С2-С20алкилен, -С2-С20алкенилен или -С2-С20алкинилен, каждый из которых необязательно замещается;
К14 представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил или -С2-С20алкинил, где указанный алкил, алкенильный и алкинильный радикалы необязательно являются замещенными;
в каждом случае появления К15 независимо представляет собой -Н, -СООН, -(-СН2)и-Ы(К16)2, -(СН2)и-8О3Н, -(СН2)и-8О3-С1-С20алкил, -(СН2)и-8О3-С2-С20алкенил или -(СН2)и-8О3-С2-С20алкинил, где указанныйалкил, алкенильный и алкинильный радикалы необязательно являются замещенными;
в каждом случае появления К16 независимо представляет собой -Н, -С1-С20алкил, -С2-С20алкенил, -С2-С20алкинил или -(СН2)и-СООН, где указанный алкил, алкенил и алкинильный радикалы необязательно являются замещенными;
η является целым числом в пределах от 0 до 6;
или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
В некоторых из этих вариантов осуществления К10 необязательно замещается фенилом. Ауристатины формулы ΌΡ включают такие, в которых группы К2, К3, К4, К5, К6, К7, К8 и К9 являются незамещенными, а группы К10 и К11 представляют собой, как описано в этом документе.
Ауристатины формулы включают такие, в которых указанный алкил, алкенил, алкинил, алкилен, алкенилен, алкинилен, арил, карбоциклический и гетероциклический радикалы являются незамещенными.
Ауристатины формулы включают такие, в которых К2 представляет собой -С1-С3алкил; К3 является -Н или -С1-С3алкилом; К4 является -С1-С5алкилом; К5 является -Н; К6 является -С1-С3алкилом; К7 является -С1-С5алкилом; К8 является -С1-С3алкоксигруппой; К9 является -Н или -С1-С8алкилом; К10 необязательно замещается фенилом; Ζ представляет собой -О-, -8- или -ΝΉ-; К11 является, как определено в этом документе; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
- 37 027887
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых К2 является метилом; К3 является -Н или -С1 С3алкилом; К4 является -С+Сбалкилом; К5 является -Н; К6 является метилом; К7 является изопропилом или втор-бутилом; К8 является метоксигруппой; К9 является -Н или -С1-С8алкилом; К10 необязательно замещается фенилом; Ζ представляет собой -О-, -δ- или -ΝΉ-; и К11 является, как определено в этом документе; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых К2 является метилом; К3 является -Н или -С1 С3алкилом; К4 является -С1-С5алкилом; К5 является -Н; К6 является метилом; К7 является изопропилом или втор-бутилом; К8 является метоксигруппой; К9 является -Н или С1-С8алкилом; К10 является фенилом; и Ζ является -О- или -N4-, и К11 является, как определено в этом документе, предпочтительно водородом; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых К2 является -С1-С3алкилом; К3 является -Н или -С1-С3алкилом; К4 является -С+Сбалкилом; К5 является -Н; К6 является -С1-С3алкилом; К7 является -С+Сбалкилом; К8 является -С1-С3алкоксигруппой; К9 является -Н или -С1-С8алкилом; К10 является фенилом; и Ζ является -О- или -ΝΉ- и К11 является, как определено в этом документе, предпочтительно водородом; или их фармацевтически приемлемую соль или сольватную форму.
Ауристатины формулы ΌΕ или ЭЕ включают такие, в которых К3, К4 и К7 независимо являются изопропилом или вторбутилом, а К5 является -Н. В характерных вариантах осуществления К3 и К4 каждый являются изопропилом, К5 является Н, и К7 является вторбутилом. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ΌΕ или ЭЕ включают такие, в которых К2 и К6 каждый являются метилом, и К9 является Н. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ΌΕ или ЭЕ включают такие, в которых в каждом случае К8 представляет собой -ОСН3. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ΌΕ или ЭЕ включают такие, в которых К3 и К4 каждый являются изопропилом, К2 и К6 каждый являются метилом, К5 является Н, К7 является вторбутилом, в каждом случае К8 является -ОСН3, и К9 является Н. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых Ζ представляет собой -О-или -ΝΉ-. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых К10 является арилом. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых К10 является -фенилом. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых Ζ является -О-, а К11 является Н, метилом или трет-бутилом. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых, когда Ζ является -ΝΉ-, К11 представляет собой -(К13О)т-СН(К15)2, где К15 представляет собой -(СН2)п-^К16)2, и К16 представляет собой -С1-С8алкил или -(СН2)п-СООН. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
Ауристатины формулы ЭЕ включают такие, в которых, когда Ζ является -ΝΉ-, К11 представляет собой -(К13О)т-СН(К15)2, где К15 представляет собой -(СН2)п^О3Н. Остальные заместители являются, как определено в этом документе.
В предпочтительных вариантах осуществления, когда Ό является ауристатином формулы ΌΕ, \ν является целым числом в пределах от 1 до 12, предпочтительно от 2 до 12, у является 1 или 2 и а предпочтительно является 1.
В некоторых вариантах осуществления, где Ό является ауристатином формулы ЭЕ, а является 1, а ν и у являются 0.
- 38 027887
Типичные молекулы лекарственных средств (-Ώ) включают молекулы лекарственных средств, имеющие следующие структуры:
- 39 027887
или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты.
В одном аспекте гидрофильные группы, такие как, но не ограничиваясь этим, сложные эфиры триэтиленгликоля (ТЕО) могут присоединяться к молекуле лекарственного средства на К11. Без связи с теорией, гидрофильные группы способствуют интернализации и отсутствию агломерации молекул лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства не является Т/Т-1027. В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства не является ауристатином Е, доластатином 10 или ауристатином РЕ.
- 40 027887
Типичные конъюгированные соединения антитело-лекарственное средство имеют следующие структуры, где Ь или тАЬ-δ- представляет 191Ρ4Ώ12 МАЬ, обозначенные №22-2(2,4)6.1 в данном документе:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В некоторых вариантах осуществления молекула лекарственного средства представляет собой калихимицин, камптотецин, майтанзиноид или антрациклин. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой таксан, ингибитор топоизомеразы, винкаалкалоид или тому подобное.
В некоторых типичных вариантах осуществления подходящие цитотоксические средства включают, например, вещества, связывающиеся с малой бороздкой (например, энедиины и лекситропсины, СВ1соединение; смотри также патент США № 6130237), дуокармицины, таксаны (например, паклитаксель и доцетаксель), пуромицины и винкаалкалоиды. Другие цитотоксические средства включают, например, СС-1065, δΝ-38, топотекан, морфолино-доксорубицин, ризоксин, цианоморфолино-доксорубицин, эхиномицин, комбретастатин, нетропсин, эпотилон А и В, эстрамустин, криптофизины, цемадотин, майтанзиноиды, дискодермолид, элеутеробин и митоксантрон.
В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство является антитубулиновым средством. Примеры антитубулиновых средств включают ауристатины, таксаны (например, таксол® (паклитаксель), таксотер® (доцетаксель)), Т67 (Ти1апк) и винкаалкалоиды (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорельбин). Другие антитубулиновые средства включают, например, производные баккатина, аналоги таксана (например, эпотилон А и В), нокодазол, колхицин и колцимид, эстрамустин, криптофицины, цемадотин, майтанзиноиды, комбретастатины, дискодермолид и элеутеробин.
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство является майтанзиноидом, представителем другой группы антитубулиновых средств. Например, в отдельных вариантах осуществления майтанзиноид является майтансином или ЭМ-1 ^тти^Ое^ 1пс.; δее ако СНап еΐ а1., 1992, Сацсег №δ. 52:127-131).
В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство является доластатином. В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство является средством из класса ауристатинов. Соответственно в отдельном варианте осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство является ММАЕ (формула XI). В другом определенном варианте осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство является ΛΡΡ (формула Χνΐ).
- 41 027887
В определенных вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство является соединением формул XII-XXI или его фармацевтически приемлемой солью
- 42 027887
(XXI)
X) Нагрузка лекарственным средством.
Нагрузка лекарственным средством обозначается р и представляет собой среднее число молекул лекарственного средства на антитело. Нагрузка лекарственным средством может находиться в диапазоне от 1 до 20 молекул лекарственного средства (Ώ) на антитело. АЭС§ изобретения включают наборы антител, конъюгированных с молекулами лекарственного средства, в пределах от 1 до 20 молекул. Среднее число молекул лекарственных средств на антитело в препаратах АЭС после реакций конъюгации можно охарактеризовать обычными способами, такими как масс-спектрометрия, анализ ЕЫ8А. Также можно определить количественное распределение АЭС в единицах р. В тех случаях, когда р составляет определенное значение, разделение, очистка и получение характеристик гомогенных АЭС от АЭС с нагрузкой другими лекарственными средствами может осуществляться с помощью таких методов, как электрофорез.
Для некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство р может быть ограничено количеством участков присоединения на антителе. Например, когда участок присоединения представляет собой тиол цистеина, как в иллюстративных вариантах осуществления выше, на антителе могут присутствовать только одна или несколько тиольных групп цистеина или могут присутствовать только одна или несколько достаточно реакционноспособных тиольных групп, посредством которых может быть присоединен линкер. В некоторых вариантах осуществления большая нагрузка лекарственным средством, например р > 5, может вызвать агрегацию, нерастворимость, токсичность или потерю проницаемости в клетки определенных конъюгатов антитело-лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством для АЭС изобретения находится в пределах примерно от 1 до 8; примерно от 2 до 6; примерно от 3 до 5; примерно от 3 до 4; примерно от 3,1 до 3,9; примерно от 3,2 до 3,8; примерно от 3,2 до 3,7; примерно от 3,2 до 3,6; примерно от 3,3 до 3,8; или примерно от 3,3 до 3,7. Действительно, было показано, что для определенных АЭС§ оптимальное отношение молекул лекарственного средства на антитело может не превышать 8, и может составлять примерно от 2 до 5; смотри США патент № 7498298 (полностью включенный в описание путем отсылки).
В некоторых вариантах осуществления в течение реакции конъюгации с антителом конъюгирует
- 43 027887 меньше молекул лекарственного средства, чем теоретический максимум. Антитело может содержать, например, остатки лизина, которые не реагируют с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, как обсуждается ниже. Как правило, антитела не содержат много свободных и реакционноспособных тиольных групп цистеинов, которые могут связываться с молекулой лекарственного средства; в самом деле, большинство тиольных остатков цистеинов в антителах существуют в виде дисульфидных мостиков. В определенных вариантах осуществления антитело может быть восстановлено в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол (ΌΤΤ) или трикарбонилэтилфосфин (ТСЕР), в частично или полностью восстанавливающих условиях, чтобы получить реакционноспособные тиольные группы цистеинов. В определенных вариантах осуществления антитело помещают в денатурирующие условия для открытия реакционноспособных нуклеофильных групп, таких как лизин или цистеин.
Нагрузку (отношение лекарственное средство/антитело) Л^С можно контролировать различными способами, например (ί) ограничением молярного избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер или линкерного реагента относительно антитела, (ίί) ограничением времени или температуры реакции конъюгации и (ίίί) частичными или ограниченными восстанавливающими условиями для модификации тиолов цистеинов, (ίν) инженерией аминокислотной последовательности антитела с помощью рекомбинантных технологий для того, чтобы модифицировать количество и положение остатков цистеина с целью контролировать количество и/или положение мест связывания линкера и лекарственного средства (например, тио-ΜаЬ или тио-РаЬ получают, как раскрывается в описании и в νΟ2006/034488 (полностью включенном в описание путем отсылки)).
Следует понимать, что когда более чем одна нуклеофильная группа реагирует с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, а затем с молекулой лекарственного вещества, тогда полученный продукт является смесью Л^С соединений с распределением присоединенных к антителу молекул лекарственного средства от одной или более. Среднее число молекул лекарственного средства на антитело можно вычислить исходя из смеси методом ΕΕΙ8Α с использованием двойной системы антител, которые являются специфическими к антителу и специфическими к лекарственному средству. Отдельные молекулы Л^С можно распознать в смеси с помощью массспектроскопии и отделить с помощью ВЭЖХ, например хроматографии с гидрофобным взаимодействием (см., например, НатЫеИ, К.Е, е( а1. 'БНес! οί бгад кабтд οη 1Не рНа^тасο1οду, рНа^тасοктеί^С8, и ίοχ1С11у οί аи πηΐί-ί'.Ό30 аиί^Ьοбу-б^ад ^πρ^-ι^. Νο. 624, ΑιικτΕπη Л88οс^аί^οη ίοτ Саисег ИехеагсН,
2004 Απι-ιππΐ Μееί^ид, Μа^сН 27-31, 2004, Ρ^οсееб^и§8 οί (Не ΑΑ№, Уο1ите 45, Μа^сН 2004; Α1^, 8.С., е! а1. 0?οηΐΓο11ί пц (Не ^са!^ οί бгад аНасНтеШ ίη аиί^Ьοбу-б^ад Νο. 627, Лте^^саη Αδδο^ίΐίίοη ίοτ Сансег ИехеагсН, 2004 Απη^ΐ Μееί^ид, Μа^сН 27-31, 2004, Ρ^οсееб^и§8 οί (Не ΑΑ№, Уο1ите 45, Μа^сН 2004). В определенных вариантах осуществления гомогенные ΑΟΕ' с одним значением нагрузки можно выделить из смеси конъюгатов с помощью электрофореза или хроматографии.
ΧΙ) Способы определения цитотоксического эффекта ΑΟΕΑ.
Способы определения, оказывает ли лекарственное средство или конъюгат антитело-лекарственное средство цитостатическое и/или цитотоксическое действие на клетку, известны. Как правило, цитотоксическая или цитостатическая активность конъюгата антитело-лекарственное средство может быть определена с помощью: обработки клеток млекопитающего, экспрессирующих белок-мишень, конъюгатом антитело-лекарственное средство в среде для культуры клеток; культивирования клеток в течение периода времени примерно от 6 ч до 5 дней; и измерения жизнеспособности клеток. Методы анализа ш νίίτο на основе клеток могут использоваться для измерения жизнеспособности (пролиферации), цитотоксичности и индукции апоптоза (активации каспаз) конъюгата антитело-лекарственное средство.
Для определения того, оказывает ли конъюгат антитело-лекарственное средство цитостатическое действие, можно использовать метод включения тимидина. Например, раковые клетки, экспрессирующие антиген-мишень, при плотности 5000 клеток/лунку 96-луночного планшета можно культивировать в течение 72-часового периода и подвергать воздействию 0,5 мк С1 3Н-тимидина в течение заключительных 8 ч 72-часового периода времени. При этом измеряют включение 3Н-тимидина в культуральные клетки в присутствии и при отсутствии конъюгата антитело-лекарственное средство.
Для определения цитотоксичности можно измерить некроз или апоптоз (программируемую смерть клетки). Некроз, как правило, сопровождается повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны; разбуханием клетки и разрывом цитоплазматической мембраны. Апоптоз в большинстве случаев отличается пузырением мембраны, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз. Обнаружение любого из этих эффектов на раковых клетках указывает на то, что конъюгат антителолекарственное средство пригоден для лечения злокачественных заболеваний.
Жизнеспособность клеток можно измерить, определив поглощение клетками красителя, такого как нейтральный красный, трипановый синий или ΑΣΑΜΑ^™ синий (см., например, Гаде е! а1., 1993, Ιηίΐ. ί. Οисο1ο§у 3:473-476). В таком методе анализа клетки инкубируют в среде, содержащей краситель, затем клетки промывают, а оставшийся краситель, отражающий поглощение клетками красителя, измеряют спектрофотометрическим методом. Для измерения цитотоксичности также можно использовать белоксвязывающий краситель сульфородамин-В (δΚΒ) (δкеНаи е! а1., 1990, ί. №ч1. Саасег НъГ 82:1107-12).
- 44 027887
Альтернативно, для оценки выживаемости и пролиферации живых (не мертвых) клеток млекопитающих с помощью количественного колориметрического анализа используется соль тетразолия, такая как МТТ (см., например, Моктапп, 1983, 1. Iттипо1. Мейобк 65:55-63).
Количественный анализ апоптоза можно осуществить, определив, например, фрагментацию ДНК. Доступны коммерческие фотометрические методы количественного определения фрагментации ДНК ш уйго. Примеры таких методов анализа, включая Ти№Е (с помощью которого определяют включение меченых нуклеотидов во фрагментированную ДНК) и методы анализа на основе ЕЫ8А, описаны в Вюсйетюа, 1999, по. 2, р. 34-37 (Косйе Мо1еси1аг ВюсЬеткак).
Кроме того, апоптоз можно определить посредством оценки морфологических изменений в клетке. Например, как и в случае некроза, потеря целостности цитоплазматической мембраны может быть установлена посредством измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентного красителя, такого как акридиновый оранжевый или бромистый этидий). Способ определения количества апоптотических клеток описан Энке и Сойеп, Ситтеп! Ρ^о!осо1к ш Iттипо1о§у (Сойдап е! а1. ебк., 1992, р. 3.17.1-3.17.16). Кроме того, клетки можно пометить ДНК-красителем (например, акридиновым оранжевым, бромистым этидием или пропидий иодидом) и обнаружить клетки с конденсацией и скоплением хроматина вдоль внутренней ядерной мембраны. Для установления апоптоза можно оценить другие морфологические признаки, включая, например, конденсацию цитоплазмы, повышенную пузырчатость мембраны и сжатие клетки.
Наличие апоптотических клеток можно определить и в прикрепленных и плавающих компартментах культур. Например, оба компартмента могут быть собраны посредством удаления супернатанта (культуральной среды), трипсинизации прикрепленных клеток, объединения препаратов, а затем центрифугирования после стадии промывки (например, 10 мин при 2000 об/мин) и установления апоптоза (например, измерением фрагментации ДНК) (см., например, Ρί;·ιζζ;·ι е! а1., 1995, Сапсег Кекеатсй 55:311016).
Действие 191Ρ4Ό12 терапевтической композиции ш У1уо может быть оценено на подходящей животной модели. Например, могут использоваться ксеногенные модели рака, когда раковые эксплантаты или перевиваемые ксенотрансплантаты тканей вводятся животным с ослабленной иммунной системой, таким как бестимусные мыши или мыши линии 5СГО (К1еш е! а1., 1997, №!ите Мебюше 3: 402-408). Например, патентная заявка РСТ \УО98/16628 и патент США № 6107540 описывают различные модели ксенотрансплантатов рака предстательной железы человека, способные повторять развитие первичных опухолей, микрометастазов и образование остеобластных метастазов, характерных для поздней стадии болезни. Эффективность может быть предсказана с помощью методов анализа, определяющих ингибирование образования опухоли, регрессию опухоли или метастазов, и т.п.
При оценке терапевтических композиций используются методы анализа ш У1уо, которые оценивают содействие развитию апоптоза. В одном варианте осуществления мышей с ксенотрансплантатами опухоли, которых лечили терапевтической композицией, можно исследовать на наличие апоптотических очагов и сравнить с нелечеными контрольными мышами с ксенотрансплантатами. Величина (степень) образования апоптотических очагов в опухолях леченых мышей дает представление о терапевтической эффективности композиции.
Терапевтические композиции, используемые при применении на практике вышеупомянутых способов, могут включаться в состав фармацевтических композиций, содержащих носитель, подходящий для желательного способа доставки. Подходящие носители включают любой материал, который при объединении с фармацевтической композицией сохраняет противоопухолевое действие терапевтической композиции и в большинстве случаев не вызывает реакции со стороны иммунной системы пациента. Примеры включают, но не ограничиваются этим, любой из целого ряда стандартных фармацевтических носителей, таких как стерильные фосфатно-солевые буферные растворы, бактериостатическая вода и т.п. (см., в целом, Кетйд1оп'к ΡЬа^тасеи!^са1 Заепсек 16й Ебйоп, А. Ока1., Еб., 1980).
Терапевтические композиции можно солюбилизировать и ввести с помощью любого способа доставки терапевтической композиции в местонахождение опухоли. Потенциально эффективные способы введения включают, но не ограничиваются этим, внутривенный, парентеральный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутриопухолевый, внутриорганный, ортотопический и т.п. Предпочтительная композиция для внутривенной инъекции содержит терапевтическую композицию в растворе консервированной бактериостатической воды, стерильной неконсервированной воды и/или в разведенном виде в мешочках из поливинилхлорида или полиэтилена, содержащих 0,9% стерильный хлорид натрия для инъекций, υδΡ. Терапевтические белковые препараты можно лиофилизировать и хранить в виде стерильных порошков, предпочтительно в вакууме, а затем восстанавливать в бактериостатической воде (содержащей, например, консервант бензиловый спирт) или в стерильной воде перед инъекцией.
Дозировки и протоколы введения для лечения злокачественных опухолей при использовании вышеупомянутых способов будут изменяться в зависимости от метода и конкретного злокачественного заболевания, и будут зависеть от целого ряда других факторов, принимаемых во внимание в данной области техники.
- 45 027887
XII) Лечение злокачественной опухоли(ей), экспрессирующей 191Ρ4Ό12.
Идентификация белка 191Ρ4Ό12, который в норме экспрессируется в ограниченном наборе тканей, но который также экспрессируется при раковых заболеваниях, например, таких как перечисленные в табл. I, открывает целый ряд терапевтических подходов для лечения таких видов рака.
Следует отметить, что таргентная противоопухолевая терапия используется даже когда белокмишень экспрессируется в нормальных тканях, даже в тканях жизненно важных органов. Жизненно важный орган - это орган, необходимый для поддержания жизни, такой как сердце или толстая кишка. Нежизненно важный орган - это орган, который можно удалить, после чего индивидуум все еще способен выжить. Примерами нежизненно важных органов являются яичник, молочная железа и предстательная железа.
Экспрессия белка-мишени в нормальной ткани, даже жизненно важной нормальной ткани, не отменяет пользу нацеливающегося на белок средства, как терапевтического средства для определенных видов опухолей, в которых белок также сверхэкспрессируется. Например, экспрессия в жизненно важных органах и сама по себе не является вредной. В дополнение к этому органы, рассматриваемые как несущественные, такие как предстательная железа и яичник, могут быть удалены, что не приводит к смерти. Наконец, в некоторых жизненно важных органах не происходит нормальной экспрессия вследствие иммунной привилегии. Иммунопривилегированные органы - это органы, защищенные от крови гистогематическими барьерами, и поэтому не доступные для иммунотерапии. Примерами иммунопривилегированных органов являются мозг и яичко.
Соответственно терапевтические подходы, ингибирующие активность белка 191Ρ4Ό12, пригодны для пациентов, страдающих от рака, экспрессирующего 191Ρ4Ό12. Эти терапевтические подходы обычно разделяются на три класса. Первый класс модулирует функцию 191Ρ4Ό12, так как он имеет отношение к росту опухолевой клетки, приводя к ингибированию или задержке роста опухолевых клеток или вызывая их уничтожение. Второй класс включает различные методы ингибирования связывания или ассоциации белка 191Ρ4Ό12 с его партнером по связыванию или с другими белками. Третий класс включает целый ряд способов ингибирования транскрипции гена 191Ρ4Ό12 или трансляции 191Ρ4Ό12 мРНК.
Соответственно раковых пациентов можно оценить по наличию и уровню экспрессии 191Ρ4Ό12, предпочтительно с помощью иммуногистохимических анализов опухолевой ткани, количественной визуализации 191Ρ4Ό12 или других методов, надежно показывающих наличие и степень экспрессии 191Ρ4Ό12. Для этой цели предпочтительным является иммуногистохимический анализ опухолевой биопсии или операционных препаратов. Способы иммуногистохимического анализа опухолевых тканей хорошо известны в данной области техники.
XIII) 191Ρ4Ό12 как мишень для терапии на основе антител.
191Ρ4Ό12 является перспективной целью для терапевтической стратегии, основанной на антителах. В данной области техники известен ряд стратегий нацеливания и на внеклеточные и на внутриклеточные молекулы (см., например, уничтожение, опосредованное комплементом, и АЭСС, а также использование интраантител). Так как 191Ρ4Ό12 экспрессируется раковыми клетками различных линий дифференцировки по сравнению с соответствующими нормальными клетками, разрабатывается системное введение 191Ρ4^12-иммунореактивных композиций, при котором наблюдается отличная чувствительность без токсических, неспецифических и/или нецелевых эффектов, вызванных связыванием иммунореактивной композиции с органами и тканями, не являющимися мишенями. Антитела, специфически реагирующие с доменами 191Ρ4Ό12, являются пригодными для системного лечения видов рака, экспрессирующих 191Ρ4Ό12, предпочтительно в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство (т.е. АЭСк), в которых конъюгат создается с токсическим веществом или терапевтическим средством.
Специалистам в данной области техники понятно, что антитела могут использоваться для специфического нацеливания и связывания с иммуногенными молекулами, такими как иммуногенная область последовательности 191Ρ4Ό12, показанная на фиг. 1. Кроме того, специалистам понятно, что конъюгирование антител с цитотоксическими средствами является общепринятой практикой (см., например, З1еуегк е! а1. В1ооб 93:11 3678-3684 (.Типе 1, 1999)). В том случае, когда цитотоксические и/или терапевтические средства доставляются непосредственно в клетки, например, при конъюгировании их с антителами, специфическими к молекуле, экспрессируемой этими клетками (например, 191Ρ4Ό12), цитотоксическое средство будет оказывать свое известное биологическое действие (т.е. цитотоксичность) на такие клетки.
В данной области техники известно большое число композиций и способов использования конъюгатов антитело-цитотоксическое средство для уничтожения клеток. В случае злокачественных опухолей типичные способы включают введение млекопитающему с опухолью биологически эффективного количества конъюгата, содержащего выбранное цитотоксическое и/или терапевтическое средство, связанное с нацеливающим агентом (например, 191Ρ4Ό12 МАЪ, предпочтительно На22-2(2,4)6.1) которое связывается с экспрессированным антигеном (например, 191Ρ4Ό12), доступным для связывания или локализованным на поверхности клетки. Типичным вариантом осуществления является способ доставки цитотоксического и/или терапевтического средства в клетку, экспрессирующую 191Ρ4Ό12, содержащего конъюгированное с антителом цитотоксическое средство, которое иммуноспецифически связывается с эпито- 46 027887 пом 191Ρ4Ό12, при этом клетка подвергается действию конъюгата антитело-лекарственное средство (АЭС). Другим иллюстративным вариантом осуществления является способ лечения индивидуума, предположительно с метастазирующим раком, включающий стадию введения указанному индивидууму парентеральным способом фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела, конъюгированного с цитотоксическим и/или терапевтическим средством.
Иммунотерапия рака с использованием антител 191Ρ4Ό12 может быть проведена в соответствии с различными подходами, которые успешно применяются при лечении других типов рака, включая, но не ограничиваясь этим, рак толстой кишки (Аг1еп е! а1., 1998, Сгй. Кем. Iттиηо1. 18:133-138), множественную миелому (О/а1Е е! а1., 1997, В1ооб 90:3179-3186, ТеипепаЕ е! а1., 1997, В1ооб 90:2437-2444), рак желудка (Каерг/ук е! а1., 1992, Сапсег Кее. 52:2771-2776), В-клеточную лимфому (ЕипакоеЫ е! а1., 1996, I. Нпишпобюг. ЕтрЕае1е Титог Iттиηо1. 19:93-101), лейкоз (2Еоп§ е! а1., 1996, Ьеик. Кее. 20:581-589), колоректальный рак (Моип е! а1., 1994, Сапсег Кее. 54:6160-6166; Уе1беге е! а1., 1995, Сапсег Кее. 55:43984403) и рак молочной железы (§Еерагб е! а1., 1991, I. С1ш. Iттиηо1. 11:117-127). Некоторые терапевтические подходы касаются конъюгирования оголенного антитела с токсином или радиоизотопом, такого как конъюгация Υ91 или I131 с анти-СЭ20 антителами (например, 2еуаПп Т.М., ГОЕС ΡЬа^тасеи!^са1е Согр. или Веххаг™, Сои1!ег ΡЬа^тасеиί^са1е) соответственно, в то время как другие касаются совместного введения антител и других терапевтических средств, например Г ерцептина™ (трастузумаб) с паклитакселем (Оепеп!есЕ, Ею.). В предпочтительном варианте осуществления антитела будут конъюгированы с цитотоксическим средством, см. выше, предпочтительно производным ауристатина, обозначенным ММАЕ (8еай1е ОепеЕсе, Ею).
Хотя лечение 191Ρ4Ό12 антителом применяется на всех стадиях рака, терапия антителами может предназначаться, в частности, для лечения распространенной злокачественной опухоли или метастатических видов рака. Лечение с помощью антител изобретения показано пациентам, получившим один или более курсов химиотерапии. Альтернативно, терапия антителами изобретения комбинируется с химиотерапевтическим режимом лечения или курсом облучения при лечении пациентов, не получавших химиотерапии. Кроме того, терапия антителами может предоставить возможность использования уменьшенных дозировок сопутствующей химиотерапии, в частности, для пациентов, которые плохо переносят токсичность химиотерапевтического средства. Еап е! а1. (Сапсег Кее. 53:4637-4642, 1993), Ριό\\όΙΙ е! а1. (Iη!етаΕоηа1 I. оГ Опсо. 9:217-224, 1996) и Напсоск е! а1. (Сапсег Кее. 51:4575-4580, 1991) описывают применение различных антител в сочетании с химиотерапевтическими средствами.
Моноклональные антитела 191Ρ4Ό12, с помощью которых можно лечить виды рака, представленные в табл. I, включают антитела, вызывающие сильный иммунный ответ против опухоли, или антитела, являющиеся непосредственно цитотоксичными. В этом отношении 191Ρ4Ό12 моноклональные антитела (МАЬе) могут вызывать лизис опухолевых клеток с помощью механизмов или комплементопосредованной или антитело-зависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС), оба из которых нуждаются в интактном Ес-фрагменте молекулы иммуноглобулина для взаимодействия эффекторной молекулы с Ес рецепторными участками на белках комплемента. В дополнение к этому, 191Ρ4Ό12 МАЬе, которые оказывают прямое биологическое действие на рост опухоли, являются пригодными для лечения видов рака, экспрессирующих 191Ρ4Ό12. Механизмы, с помощью которых оказывают действие цитотоксические МАЬе, включают: ингибирование клеточного роста, модулирование дифференцировки клеток, модулирование профиля факторов ангиогенеза опухоли и индукцию апоптоза. Механизм(ы), за счет которых отдельное 191Ρ4Ό12 МАЬ оказывает противоопухолевое действие, оцениваются с помощью использования любого количества методов анализа ш νίΙΐΌ, которые устанавливают клеточную смерть, таких как АЭСС, комплемент-опосредованный лизис клетки и так далее, как общеизвестно в данной области техники.
Таким образом, предпочтительными моноклональными антителами, использованными в терапевтических способах изобретения, являются или полностью человеческие антитела или антитела, специфически связывающиеся с целевым антигеном 191Ρ4Ό12 с высокой аффинностью.
XIV) Смесь 191Ρ4Ό12 АЭС.
Терапевтические способы изобретения рассматривают введение отдельных 191Ρ4Ό12 АЭСе, а также комбинаций, или смесей, различных МАЬе (т.е. 191Ρ4Ό12 МАЬе или МаЬе, которые связывают другой белок). Такая смесь МАЬ может иметь определенные преимущества в виду того, что она содержит МАЬе, нацеленные на разные эпитопы и эксплуатирующие разные эффекторные механизмы, или смешивает непосредственно цитотоксичные МАЬе с МАЬе, которые основываются на функциональности иммунного эффектора. Такие МАЬе в комбинации могут демонстрировать синергические терапевтические эффекты. Кроме того, 191Ρ4Ό12 МАЬе могут вводиться параллельно с другими терапевтическими воздействиями, включая, но не ограничиваясь этим, разнообразные химиотерапевтические и биологические средства, блокаторы андрогенов, иммуномодуляторы (например, ГО-2, ОМ-С8Е), хирургическую операцию или облучение. В предпочтительном варианте осуществления 191Ρ4Ό12 МАЬе вводятся в конъюгированной форме.
- 47 027887
Композиции 191Р4Э12 АЭС вводятся любым путем, способным доставить антитела в опухолевую клетку. Способы введения включают, но не ограничиваются этим, внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутриопухолевый, внутрикожный и тому подобные. В большинстве случаев лечение включает повторное введение 191Р4Э12 АЭС препарата через приемлемый путь введения, такой как внутривенная инъекция (IV), как правило, в дозе, включая, но не ограничиваясь этим, 0.1,.2,.3,.4,.5,.6,.7,.8,.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг веса тела. В общем, дозы в пределах 10-1000 мг МАЬ в неделю являются эффективными и хорошо переносятся.
Исходя из клинического опыта применения Герцептина® (трастузумаба) при лечении метастатического рака молочной железы первоначальная нагрузочная доза приблизительно 4 мг/кг веса тела пациента IV, с последующими еженедельными дозами около 2 мг/кг IV препарата МАЬ представляет подходящий режим дозирования. Предпочтительно первоначальная нагрузочная доза вводится с помощью 90минутной или более продолжительной инфузии. Периодическая поддерживающая доза вводится в виде 30-минутной или более продолжительной инфузии, при условии, что первоначальная доза была хорошо перенесена пациентом. Специалистам ясно, что на идеальный режим дозирования в отдельном случае могут оказывать влияние различные факторы. Такие факторы включают, например, аффинность связывания и время полужизни использованных МАЬк, степень экспрессии 191Р4Э12 у пациента, величину циркулирующего слущивающегося (кНеб) 191Р4Э12 антигена, уровень желательной равновесной концентрации антител, повторение лечения и действие химиотерапевтических или других средств, использованных в комбинации с методом лечения изобретения, а также состояние здоровья конкретного пациента.
Необязательно, пациентов следует оценивать по уровням 191Р4Э12 в определенном образце (например, уровням циркулирующего 191Р4Э12 антигена и/или 191Р4Э12 экспрессирующих клеток) для того, чтобы лучше установить наиболее эффективный режим дозирования и т.д. Такие оценки используются для мониторинга результатов на всем протяжении терапии, а также для того, чтобы оценить терапевтический успех в комбинации с оценкой других параметров (например, цитологии мочи и/или уровней ^типоСу! при лечении рака мочевого пузыря, или по аналогии, уровней Р8А в сыворотке при лечении рака предстательной железы).
Цель настоящего изобретения - предоставить 191Р4Э12 АЭСк, которые ингибируют или задерживают рост опухолевых клеток, экспрессирующих 191Р4Э12. Дополнительная цель этого изобретения предоставить способы ингибирования ангиогенеза и других биологических функций и, таким образом, уменьшить рост опухоли у млекопитающих, предпочтительно людей, используя 191Р4Э12 АЭСк, и, в частности, используя такие 191Р4Э12 АЭСк в комбинации с другими лекарственными средствами или иммунологически активными методами лечения.
XV) Комбинированная терапия.
В одном варианте осуществления наблюдается синергизм в тех случаях, когда опухоли, включая опухоли человека, лечат 191Р4Э12 АЭСк в сочетании с химиотерапевтическими средствами или облучением или их комбинацией. Другими словами, ингибирование роста опухоли с помощью 191Р4Э12 АЭС увеличивается больше, чем ожидалось, при использовании комбинации с химиотерапевтическими средствами или облучением или их комбинации. Синергизм может проявляться, например, более значительным ингибированием роста опухоли при комбинированном лечении, чем можно было бы ожидать от лечения только 191Р4Э12 АЭС, или аддитивным эффектом лечения 191Р4Э12 АЭС и химиотерапевтическим средством или облучением. Предпочтительно синергизм проявляется ремиссией рака там, где ремиссия не предполагалась при лечении или 191Р4Э12 АЭС или аддитивной комбинацией 191Р4Э12 АЭС и химиотерапевтического средства или облучения.
Способ ингибирования роста опухолевых клеток при использовании 191Р4Э12 АЭС и комбинации химиотерапии или облучения или и того и другого включает введение 191Р4Э12 АЭС до, во время или после начала химиотерапии или радиационной терапии, а также любой их комбинации (т.е. до и во время, до и после, во время и после или до, во время и после начала химиотерапии и/или радиотерапии). Например, 191Р4Э12 АЭС, как правило, вводится между 1 и 60 днями, предпочтительно между 3 и 40 дням, более предпочтительно между 5 и 12 днями до начала радиационной терапии и/или химиотерапии. Тем не менее, в зависимости от протокола лечения и конкретных потребностей пациента способ осуществляется таким образом, чтобы обеспечить самое эффективное лечение и, в конечном счете, продлить жизнь пациента.
Введение химиотерапевтических средств может осуществляться множеством способов, включая системное введение парентеральным и энтеральным путем. В одном варианте осуществления 191Р4Э12 АЭСк и химиотерапевтическое средство вводятся как отдельные молекулы. Конкретные примеры химиотерапевтических средств или химиотерапии включают цисплатин, дакарбазин (ΌΤΚ.'), дактиномицин, мехлоретамин (мустарген), стрептозоцин, циклофосфамид, кармустин (ВСИи), ломустин (ССИи), доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид, метотрексат, 5-фторурацил, винбластин, винкристин, блеомицин, паклитаксель (таксол), доцетаксель (таксотер), алдеслейкин, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, кладрибин, дакарбазин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевину, ифосфамид, интерферон альфа, леупролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин,
- 48 027887 пликамицин, митотан, пегаспаргазу, пентостатин, пипоброман, пликамицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепу, урамустин, винорельбин, гемцитабин, хлорамбуцил, таксол и их комбинации.
Источник излучения, используемый в комбинации с 191Ρ4Ό12 АЭС, может быть или внешним или внутренним по отношению к пациенту, которого следует лечить. В том случае, когда источник является внешним по отношению к пациенту, терапия называется наружная дистанционная лучевая терапия (ЕВКТ). Когда источник является внутренним по отношению к пациенту, терапия называется брахитерапия (ВТ).
Описанные выше терапевтические режимы могут сочетаться с дополнительными средствами лечения рака и/или режимами, например дополнительной химиотерапией, противоопухолевыми вакцинами, ингибиторами сигнальной трансдукции, средствами, используемыми при лечении аномального роста клеток или рака, антителами (например, анти-СТЬА-4 антителами, как описано в АО/2005/092380 (ΡΠ/ег)) или другими лигандами, ингибирующими опухолевый рост путем связывания с ЮР-1К, и цитокинами.
Когда млекопитающее подвергается дополнительной химиотерапии, могут использоваться химиотерапевтические препараты, описанные выше. В дополнение к этому могут использоваться ингибиторы факторов роста, модификаторы биологического ответа, противогормональная терапия, селективные модуляторы рецепторов эстрогена (8ЕКМ8), ингибиторы ангиогенеза и антиандрогены. Например, могут использоваться антигормоны, такие как антиэстрогены, например нолвадекс (тамоксифен), или антиандрогены, такие как касодекс (4'-циано-3-(4-фторфенилсульфонил)-2-гидрокси-2-метил-3-4'(трифторметил)пропионанилид).
Вышеупомянутые терапевтические подходы можно комбинировать с любым из большого разнообразия режимов хирургического, терапевтического или радиационного лечения. Терапевтические подходы изобретения могут дать возможность применения уменьшенных дозировок химиотерапии (или других видов терапии) и/или менее частого введения, что является преимуществом для всех пациентов и, в частности, для тех, которые плохо переносят токсичность химиотерапевтических средств.
XVI) Наборы/готовые изделия.
Для практического применения в лабораторных, прогностических, профилактических, диагностических и терапевтических целях, описанных в данном документе, в объем изобретения включаются наборы. Такие наборы могут включать носитель, упаковку или контейнер, который может подразделяться на один или более контейнеров, таких как пузырьки, пробирки и тому подобное, каждый контейнер(ы) содержит один из определенных элементов, предназначенных для использования в способе, вместе с этикеткой или вкладышем, содержащим инструкции по применению, такому как применение, описанное в этом документе. Например, контейнер(ы) может содержать антитело, которое является меченым или может быть помечено обнаружимым образом. Наборы могут включать контейнер, содержащий молекулу лекарственного средства. Набор может включать все или часть аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 2 или 3, или их аналоги или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей такие аминокислотные последовательности.
Как правило, набор изобретения содержит контейнер, описанный выше, и один или более других контейнеров, связанных с этим контейнером, которые содержат материалы, желательные с коммерческой и потребительской точек зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы; носитель, упаковка, контейнер, пузырек и/или пробирка имеет маркировку с перечнем содержимого и/или инструкциями по применению, и листок-вкладыш с инструкциями по применению.
Этикетка может находиться на контейнере или вместе с контейнером, чтобы указать, что композиция используется для специфического лечения или нетерапевтического применения, такого как прогностическое, профилактическое, диагностическое или лабораторное применение, а также может содержать указания относительно применения ίη У1уо или ίη У11го, как описано в данном документе. Указания и/или другая информация также может содержаться на вкладыше(ах) или этикетке(ах), которые включаются в набор. Этикетка может находиться на контейнере или быть соединена с контейнером. Этикетка может находиться на контейнере, когда буквы, числа или другие символы, образующие этикетку, выдавлены или вытравлены на самом контейнере; этикетка может быть соединена с контейнером, когда он находится внутри коробки (тары) или носителя, который также имеет контейнер, например, как листок-вкладыш. Этикетка может указывать, что композиция используется для диагностики, лечения, профилактики или предсказания состояния, такого как злокачественная опухоль ткани, представленного в табл. I.
Термины набор и готовое изделие могут использоваться как синонимы.
В другом варианте осуществления изобретения предоставляется готовое изделие(я), содержащее композиции, такие как антитело(а) или конъюгаты антитело-лекарственное средство (ЛЭСХ). например материалы, пригодные для диагностики, прогнозирования, профилактики и/или лечения злокачественных опухолей тканей, таких как представленные в табл. I. Как правило, готовое изделие содержит по меньшей мере один контейнер и по меньшей мере одну этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, пузырьки, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер может содержать аминокислотную после- 49 027887 довательность(и), небольшую молекулу(ы), нуклеиновокислотную последовательнсоть(и), клеточную популяцию(и) и/или антитело(а). В другом варианте осуществления контейнер содержит антитело, его связывающий фрагмент или специфический связывающий белок для использования при оценке экспрессии белка 191Ρ4Ό12 в клетках и тканях или для соответствующих лабораторных, прогностических, диагностических, профилактических и терапевтических целей; показания и указания для такого применения могут включаться или входить в комплект такого контейнера, как и реагенты и другие композиции или приспособления, служащие для этих целей.
Альтернативно, контейнер может содержать композицию, эффективную при лечении, диагностировании, прогнозировании или профилактике состояния, и может иметь стерильный входной порт (например, контейнер может представлять собой мешочек с внутривенным раствором или флакон, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции). Активным веществом в композиции может являться антитело, способное специфически связываться с 191Ρ4Ό12 или конъюгат антителолекарственное средство, специфически связывающийся с 191Ρ4Ό12.
Готовое изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-буферный раствор, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, мешалки, иглы, шприцы и/или листки-вкладыши с указаниями и/или инструкциями по применению.
Примеры
Далее различные аспекты изобретения дополнительно описываются с помощью нескольких примеров, ни один из которых не имеет целью ограничить объем изобретения.
Пример 1. 191Ρ4Ό12 антиген.
Экспрессия гена 191Ρ4Ό12 была обнаружена с помощью методов супрессионной вычитающей гибридизации (88Н), известных в данной области техники. Последовательность 191Ρ4Ό12 88Н из 223 п.о. была установлена из опухоли мочевого пузыря за вычетом кДНК, выделенной из пула из девяти (9) нормальных тканей с помощью стандартных методов. Клон полноразмерной кДНК для 191Ρ4Ό12 был выделен из библиотеки кДНК рака мочевого пузыря. кДНК имеет 3464 п.о. в длину и кодирует 510 аминокислот ОКР (см. фиг. 1). Ген 191Ρ4Ό12 демонстрирует гомологию с геном №с!ш-4. Дополнительно смотри США 2004/0083497 (Адепзуз, Шс., 8ап!а Мотса, СА) и ΡΟΓ публикацию АО2004/016799 (Адепзуз, Шс., 8ап!а Мотса, СА). Иллюстративные воплощения антигена 191Ρ4Ό12 смотри на фиг. 1.
Пример 2. Получение 191Ρ4Ό12 моноклональных антител (МАЬз).
В одном варианте осуществления терапевтические моноклональные антитела (МАЬз) к вариантам 191Ρ4Ό12 и 191Ρ4Ό12 включают такие, которые реагируют с эпитопами, специфическими для каждого белка или специфическими к общим между вариантами последовательностям, которые могут связываться, интернализировать, нарушать или модулировать биологическую функцию 191Ρ4Ό12 или 191Ρ4Ό12 вариантов, например, тех, которые могут нарушать взаимодействие с лигандами, субстратами и партнерами по связыванию. Иммуногены для получения таких МАЬз включают предназначенные для того, чтобы кодировать или содержать внеклеточные домены или всю последовательность белка 191Ρ4Ό12, участки, предположительно содержащие функциональные мотивы, и участки вариантов белка 191Ρ4Ό12 предположительно являющиеся антигенными, если исходить из компьютерного анализа аминокислотной последовательности. Иммуногены включают пептиды и рекомбинантные белки, такие как !ад5191Ρ4Ό12, полученный очищенный белок клеток млекопитающих, содержащий аффинную метку Шз. В дополнение к этому для иммунизации мышей используются клетки, созданные для того, чтобы экспрессировать высокие уровни 191Ρ4Ό12, таких как КАТ1-191Ρ4^12 или 300.19-191Ρ4Ό12.
МАЬз к 191Ρ4Ό12 были получены с помощью технологии ксеномыши ХепоМоизе® (Атдет Ргетоп!), когда локусы мышиной тяжелой и каппа легкой цепи были инактивированы и была вставлена большая часть локусов тяжелой и каппа легкой цепи иммуноглобулина человека. МАЬ, обозначенные На22-2(2,4)6.1, были получены в результате иммунизации продуцирующих человеческий γ1 ксеномышей (ХепоМюе) с помощью рТад5/тусЬ^з-191Ρ4^12 (аминокислоты 23-351).
191Ρ4Ό12 МАЬ На22-2(2,4)6.1 специфически связывается с белком рТад5/тусЬ^з-191Ρ4^12 с помощью ЕЫ8А, а также рекомбинантными клетками, экспрессирующими 191Ρ4Ό12, и несколькими линиями раковых клеток, экспрессирующими 191Ρ4Ό12.
Гибридома, продуцирующая антитело, обозначенное На22-2(2,4)6.1, была послана (через службу Федерал-Экспресс) в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), ΡΌ. Вох 1549, Мапаззаз, VА 20108 18 августа 2010 г. и получила инвентарный номер РТА-11267.
Кодирующие последовательности ДНК для 191Ρ4Ό12 МАЬ На22-2(2,4)6.1 были определены после выделения мРНК из соответствующих клеток гибридомы с помощью реагента Тризол (ЬГе ТесЬпо1од1ез, ОЛсо ВКЬ).
Нуклеиновокислотные вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей :-1^11-19104012 На22-2(2,4)6.1 были секвенированы из клеток гибридомы с помощью следующего протокола. Клетки гибридомы, секретирующие На22-2(2,4)6.1, лизировали с помощью реагента Тризол (Ь-Ге ТесЬпо1од1ез,
- 50 027887
СнЬсо ВКЕ). Выделяли и количественно оценили общую РНК. Первую цепь кДНК получали из тотальной РНК с использованием олиго (йТ)12-18 праймирования с помощью системы ОЛсо-ВКЕ 8ирегксг1р1 РгеатрЕйсаИоп. Первую цепь кДНК амплифицировали с использованием праймеров вариабельной тяжелой цепи иммуноглобулина человека и праймеров вариабельной легкой цепи иммуноглобулина человека. ПЦР-продукты были секвенированы и определены вариабельные участки тяжелой и легкой цепи.
Нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи перечислены на фиг. 2 и 3. Выравнивание На22-2(2,4)6.1 МАЬ и зародышевой линии 1д человека представлено на фиг. 4А, 4В.
Пример 3. Экспрессия На22-2(2,4)6.1 с использованием методов рекомбинантной ДНК.
Для рекомбинантной экспрессии На22-2(2,4)6.1 МАЬ в трансфицированных клетках последовательности вариабельной тяжелой и легкой цепи На22-2(2,4)6.1 МАЬ были клонированы выше последовательностей тяжелой цепи 1дО1 человека и константных областей легкой цепи 1дк человека соответственно. Полные кассеты На22-2(2,4)6.1 МАЬ тяжелой цепи и легкой цепи человека были клонированы ниже СМV промотор/энхансера в клонирующий вектор. Сайт полиаденилирования был включен ниже последовательности, кодирущей МАЬ. Конструкты, экспрессирующие рекомбинантное На22-2(2,4)6.1 МаЬ, были трансфицированы в клетки СНО. На22-2(2,4)6.1 МаЬ, секретируемое рекомбинантными клетками, оценивали в отношении связывания с 191Р4Э12, расположенным на клеточной поверхности, с помощью проточной цитометрии (фиг. 5А). КАТ-контроль и клетки КАТ-191Р4Э12 окрашивали На22-2(2,4)6.1 МаЬ, полученными или из гибридомы или из клеток СНО, трансфицированных векторными конструктами тяжелой и легкой цепи На22-2(2,4)6.1.
Связывание детектировали с помощью проточной цитометрии.
Результаты показывают, что рекомбинантно экспрессированные на клетках СНО На22-2(2,4)6.1 связывают 191Р4Э12 подобно На22-2(2,4)6.1, выделенным из гибридомы. На22-2(2,4)6.1 МаЬ, секретированное рекомбинантными клетками, также было оценено в отношении связывания с рекомбинантным белком 191Р4Э12 с помощью ЕЬ18А. Как видно на фиг. 5В, связывание На22-2(2,4)6.1 с белком 191Р4Э12 было одинаковым между МаЬ, полученными из клеток СНО и из клеток гибридомы.
Пример 4. Конъюгирование антитела На22-2(2,4)6.1 МАЬ с лекарственным препаратом.
На22-2(2,4)6.1 МаЬ (фиг. 2) было конъюгировано с производным ауристатина, обозначенным ММАЕ (формула XI) с использованием линкера νс ^а1-Сй), описанного в этом документе, для создания конъюгата антитело-лекарственное средство (АЭС) изобретения, обозначенного На22-2(2,4)6.ксММАЕ, с помощью следующих протоколов. Конъюгирование νс ^а1-Сй) линкера с ММАЕ (8еа1±1е Оепейск, 1пс., Сиэтл, Вашингтон) осуществляли с помощью общего способа, представленного в табл. IV, чтобы получить цитотоксический νсММАЕ (смотри патент США № 7659241).
Затем был получен конъюгат антитело-лекарственное средство (АЭС) изобретения, обозначенный 11а22-2(2.4)6.1усММАЕ. с использованием следующих протоколов.
Коротко, к раствору На22-2(2,4)6.1МАЬ 15 мг/мл в 10 мМ ацетате при значении рН 5,0 прибавили 1% сорбит, 3% Ь-аргинин в 20% объема 0,1 М Трис-С1 при рН 8,4, 25 мМ ЕЭТА и 750 мМ №С1, чтобы отрегулировать рН раствора до значения 7,5, 5 мМ ЕЭТА и 150 мМ хлорид натрия. Затем МАЬ частично восстанавливали добавлением 2,3 мол.экв. ТСЕР (относительно молей МАЬ) и затем перемешивали при 37°С в течение 2 ч. Затем частично восстановленный раствор МАЬ охлаждали до 5°С и добавляли 4,4 мол.экв. νсММАЕ (относительно молей антитела) в виде 6% (об./об.) раствора ЭМ8О. Смесь перемешивали в течение 60 мин при 5°С, затем в течение 15 дополнительных минут после добавления 1 мол.экв. Ν-ацетилцистеина относительно νсММАЕ. Избыток гашеного νсММАЕ и другие компоненты реакции удаляли ультрафильтрованием/диафильтрованием конъюгата антитело-лекарственное средство (АЭС) с 10 объемами 20 мМ гистидина, рН 6,0.
Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (АЭС) обозначается На22-2(2,4)6.1 νсММАЕ и имеет следующую формулу:
где МАЬ представляет собой На22-2(2,4)6.1 (фиг. 2 и 3) и р является числом от 1 до 8. Значение р конъюгата антитело-лекарствнное средство, установленное в этом примере, составляло примерно 3,8.
Пример 5. Характеристика На22-2(2,4)6.1 νсММАЕ.
Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающие 191Р4Э12, были получены с помощью методов, представленных в примере, озаглавленном Конъюгирование антитела На22-2(2,4)6.1 МАЬ с лекарственным препаратом, и были отобраны, идентифицированы и охарактеризованы с помощью комбинации методов, известных в данной области техники.
- 51 027887
A. Определение аффинности с помощью РАС8.
Была исследована аффинность связывания На22-2(2,4)6.1усММАЕ с 191Ρ4Ό12, экспрессированным на поверхности клеток РС3-человек-191Р4Э12, РС3-циномолгус-191Р4Э12 и РС3-крыса-191Р4Э12 соответственно. Коротко, одиннадцать (11) разведений На22-2(2,4)6.1усММАЕ инкубировали с каждым из типов клеток (50000 клеток на лунку) в течение ночи при 4°С при окончательной концентрации от 160 до 0,011 нМ. В конце инкубации клетки промывали и инкубировали с антителами обнаружения анти-ЫдСРЕ в течение 45 мин при 4°С. После отмывания несвязанных антител обнаружения клетки анализировали с помощью РАС8. Были получены средние значения интенсивности флуоресценции (МИ), перечисленные на фиг. 6-8. Значения МИ вводили в программу ОтарЬрай Ргыт и анализировали с использованием уравнения одного участка связывания (опе 8Йе Ьшйшд) (гипербола) Υ=Втаx*Х/(Кд+Х), чтобы получить На22-2(2,4)6.1усММАЕ кривые насыщения, представленные также на фиг. 6-8 соответственно. Втах представляет собой значение МИ при максимальном связывании На22-2(2,4)6.1усММАЕ с 191Р4Э12; Кд - аффинность связывания На22-2(2,4)6.1усММАЕ, которая представляет собой концентрацию На222(2,4)6.1усММАЕ, необходимую для достижения полумаксимального связывания.
Вычисленная аффинность (Кд) На22-2(2,4)6.1усММАЕ к 191Р4Э12, экспрессированному на поверхности клеток РС3-человек-191Р4Э12, РС3-циномолгус-191Р4Э12 и РС3-крыса-191Р4Э12, соответственно составляет 0,69 нМ (фиг. 6); 0,34 нМ (фиг. 7) и 1,6 нМ (фиг. 8).
B. Определение аффинности с помощью 8РК.
Аффинность На22-2(2,4)6.1 МАЬ и На22-2(2,4)6.1усММАЕ к очищенному рекомбинантному 191Р4Э12 (ЕСЭ аминокислоты 1-348) была исследована с помощью поверхностного плазмонного резонанса (8РК) (В1Асоге). Коротко, козел-античеловек Рсу поликлональные АЬ§ (1аск§оп 1ттипо КекеагсЬ ЬаЬк, 1пс.) были ковалентно иммобилизованы на поверхности СМ5 сенсорного чипа (В1асоге). Затем очищенные На22-2(2,4)6.1 МАЬ или На22-2(2,4)6.1усММАЕ были захвачены на поверхности указанного чипа. В среднем, приблизительно 300 КИ8 тестируемых На22-2(2,4)6.1 МАЬ или На22-2(2,4)6.1усММАЕ было захвачено в каждом цикле. После этого, серия из пяти (5) - шести (6) разведений рекомбинантного 191Р4Э12 (ЕСЭ аминокислоты 1-348) в пределах от 1 до 100 нМ было впрыснуто на такую поверхность, чтобы получить кривые связывания (сенсограммы), которые затем были обработаны и в целом соответствуют 1:1 модели взаимодействия с использованием программы В1Аеуа1иайоп 3.2 и программного обеспечения СЬАМР (Му5/ка и Мойоп, 1998) (фиг. 22). Табл. У суммирует константы скорости ассоциации и диссоциации, а также аффинность На22-2(2,4)6.1 МАЬ и На22-2(2,4)6.1усММАЕ к рекомбинантному 191Р4Э12 (ЕСЭ аминокислоты 1-348).
C. Картирование домена На22-2(2,4)6.1 МАЬ.
Чтобы картировать сайт связывания На22-2(2,4)6.1 МАЬ со специфическим доменом белка 191Р4Э12, было получено несколько Ка!1(Е) рекомбинантных клеточных линий, экспрессирующих такие домены (или их комбинацию) (табл. VI). Связывание На22-2(2,4)6.1 с клеточной поверхностью оценивали с помощью РАС8, используя стандартные протоколы. Как показано на фиг. 10, На22-2(2,4)6.1 МАЬ связывается с клетками, экспрессирующими УС1 домен, а также диким типом 191Р4Э12, но не с клетками, экспрессирующими С1С2 домен. В дополнение к этому, другое 191Р4Э12 МАЬ, названное На22-8е6.1, узнает С1С2 домен 191Р4Э12 на клеточной поверхности, но не домен УС1. Из этого можно сделать вывод, что сайт связывания На22-2(2,4)6.1 МАЬ располагается в 1-147 аа домене 191Р4Э12, но не каждое МАЬ, связывающееся с 191Р4Э12, узнает этот домен.
Чтобы дополнительно подтвердить результаты, представленные на фиг. 10, проводили вестернблоттинг. Коротко, весь внеклеточный участок 191Р4Э12 (полной длины), а также специфические домены, представленные в табл. VI, были экспрессированы в клетках 293Т как мышиные Рс-гибридные белки и очищены. Козлиные антимышь-НКР использовали в качестве контроля. Как показано на фиг. 11, при анализе с помощью δΌδ-РАСЕ (в невосстанавливающих условиях) и мечении На22-2(2,4)6.1-биотином, а затем стрептавидином-НКР, обнаруживаются дорожки, соответствующие полноразмерному 191Р4Э12 (дорожка 1), V (дорожка 2) и УС1 (дорожка 3) гибридным конструктам, но не С1С2 гибридному конструкту (дорожка 4). Эти результаты дополнительно подтверждают, что эпитоп связывания для На222(2,4)6.1 МАЬ располагается в пределах 1-147 аа домена 191Р4Э12.
Пример 6. Клеточная цитотоксичность, опосредованная На22-2(2,4)6.1усММАЕ.
Способность На22-2(2,4)6.1усММАЕ опосредовать 191Р4Э12-зависимую цитотоксичность оценивали на клетках РС3, созданных для экспрессии 191Р4Э12 человека, 191Р4Э12 циномолгуса и 191Р4Э12 крысы. Коротко, клетки РС3-№о, РС3-человек-191Р4Э12, РС3-циномолгус-191Р4Э12 или РС3-крыса191Р4Э12 клетки (1500 клеток/лунку) высевали в 96-луночные планшеты в 1 день. На следующий день к каждой лунке добавили равный объем среды, содержащей указанную концентрацию На222(2,4)6.1усММАЕ или контрольного МаЬ, конъюгированного с усММАЕ (т.е. контроль-усММАЕ). Затем клетки инкубировали в течение 4 дней при 37°С. В конце периода инкубации к каждой лунке добавили аламар синий и продолжали инкубирование в течение дополнительных 4 ч. Получаемую флуоресценцию обнаруживали с помощью ридера Вю1ек р1а1е при длине волны возбуждения 620 нм и длине волны излучения 540 нм.
- 52 027887
Результаты, представленные на фиг. 9Λ-9Ό, показывают, что На22-2(2,4)6.1усММАЕ оказывал цитотоксическое действие на клетки РС3-человек-191Р4Э12 (фиг. 9А), РС3-циномолгус-191Р4Э12 (фиг. 9В) и РС3-крыса-191Р4О12 (фиг. 9С), в то время как контрольный 1§О человека, конъюгированный с усММАЕ не оказывал действия. Специфичность На22-2(2,4)6.1усММАЕ была дополнительно продемонстрирована отсутствием токсичности в отношении клеток РС3-№о, которые не экспрессируют 191Р4Э12 (фиг. 9Ό). Таким образом, эти результаты показывают, что На22-2(2,4)6.1усММАЕ может селективно доставлять цитотоксическое лекарственное средство в клетки, экспрессирующие 191Р4Э12, что приводит к их уничтожению.
Пример 7. На22-2(2,4)6.1усММАЕ ингибирует рост опухолей ш У1уо.
Значительная экспрессия 191Р4Э12 на поверхности клеток опухолевых тканей, наряду с ограниченной экспрессией в нормальных тканях, делает 191Р4Э12 хорошей мишенью для терапии с использованием антител и также терапии с помощью АЭС. Соответственно была оценена терапевтическая эффективность На22-2(2,4)6.1усММАЕ на мышиных моделях ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря, легкого, молочной железы и поджелудочной железы.
Действие конъюгата антитело-лекарственное средство на рост опухоли и образование метастазов исследовали на мышиных моделях ксенотрансплантатов рака (например, подкожной и ортотопической).
Подкожные (з.с.) опухоли получали инъекцией 5х104-106 раковых клеток смешанных при разведении 1:1 с МаЬтде1 (СоЬаЬотаИуе КезеагсЬ) в правый бок самцов мышей 8СЮ. Чтобы проверить действие АЭС на образование опухоли, инъекции АЭС начинали в тот же самый день, когда проводилась инъекция опухолевых клеток. В качестве контроля мышам вводили или очищенный человеческий 1§О или РВ8; или очищенные МаЬ, которые узнавали несоответствующий антиген, не экспрессирующийся на клетках человека. В предварительных исследованиях не обнаружено различий между действием контрольного 1дО или РВ8 на рост опухоли. Размеры опухолей определяли с помощью штангенциркуля, при этом объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером. Мышей с подкожными опухолями больше чем 1,5 см в диаметре забивали.
Опухоль яичника часто метастазирует и растет внутри брюшной полости. Соответственно для внутрибрюшинного роста рака яичника у мышей делается инъекция 2 миллионов клеток прямо в брюшную полость самок мышей. Общее состояние здоровья, физическую активность и внешний вид мышей контролировали до момента умирания. После умерщвления исследовали брюшную полость с целью определения опухолевой массы и брали на анализ легкие, чтобы оценить метастазирование в удаленные области. Альтернативно, смерть могла использоваться в качестве конечной точки. Мышей делили на группы в соответствии с видом лечения - или 191Р4Э12 или контрольными МаЬз, которые вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции (ί.ρ).
Преимуществом моделей ксенотрансплантатов опухолей является возможность исследовать неоваскуляризацию и ангиогенез. Рост опухоли отчасти зависит от развития новых кровеносных сосудов. Хотя источником происхождения капиллярной системы и развития кровеносной сети является хозяин, инициация и структура новообразованных сосудов регулируется ксенотрансплантатом опухоли Оа\абоГГ е! а1., СЬп Сапсег Кез. (2001) 7:2870; 8о1езу1к е! а1., Еиг 1. Сапсег СЬп Опсо1. (1984) 20:1295). Действие антитела и небольшой молекулы на неоваскуляризацию исследуется в соответствии с методами, известными в данной области техники, такими как 1НС-анализ опухолевых тканей и окружающей их микросреды.
^122-2(2,4)6.^001 ингибирует формирование ксенотрансплантатов рака легкого, мочевого пузыря, молочной железы и поджелудочной железы. Эти результаты показывают полезность На22-2(2,4)6.1АОС при лечении местной и распространенной стадий рака и предпочтительно видов рака, представленных в табл. I.
191Р4Э12 АОСз.
Моноклональные антитела были получены к 191Р4Э12, как описано в примере, озаглавленном Получение 191Р4Э12 моноклональных антител (МАЬз). Затем МАЬз конъюгируют с токсином, как описано в примере, озаглавленном Конъюгирование антитела На22-2(2,4)6.1 МАЬ с лекарственным препаратом с получением На22-2(2,4)6.1усММАЕ. На22-2(2,4)6.1усММАЕ охарактеризовали с помощью РАС8 и других методов, известных в данной области техники, чтобы определить их способность связываться с 191Р4Э12.
Линии клеток и ксенотрансплантаты.
Клетки ВТ-483 и НРАС поддерживали в среде ЭМЕМ, с добавлением Ь-глутамина и 10% РВ8, как известно в данной области техники. Ксенотрансплантаты АО-В8, АО-Рапс4, АО-Рапс2, АО-В1, АО-Ь4 и АО-Рапс3 поддерживали с помощью последовательного культивирования на мышах линии 8СГО.
Оценка На22-2(2,4)6.1усММАЕ МАЬ на подкожной модели ксенотрансплантата рака легкого человека АО-Ь4 на мышах 8СГО.
В этом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака легкого АО-Ь4 поддерживали серийными пассажами на мышах 8СГО. Исходные опухоли стерильно извлекали и подвергали ферментативному расщеплению на одноклеточные суспензии. Два (2) миллиона клеток прививали в бок ка- 53 027887 ждой мыши линии §СГО. Затем животных случайным образом делили на семь групп: шесть (6) групп 191Ρ4Ό12 для лечения антителами и группу с контрольным антителом Н3-1.10.1.2 (η=10). Все антитела вводили внутрибрюшинно в дозе 750 мкг/животное два раза в неделю до конца исследования. Рост опухоли контролировали, проводя измерение опухолей с помощью штангенциркуля каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что 191Ρ4Ό12 МАЬ незначительно ингибировало рост опухоли на модели ксенотрансплантатов рака легкого человека АО-Ь4 на мышах 8СГО. В дополнение к этому другие 191Ρ4Ό12 МАЩ были использованы в этом исследовании. Результаты не представлены (фиг. 12).
Оценка Ηа22-2(2,4)6.1 МАЬ на подкожной модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека ОТАС на мышах δί'.ΊΌ.
В другом эксперименте клетки рака поджелудочной железы человека ОТАС (2,0 млн/мышь) вводили в бок отдельной мыши линии δί',ΊΌ. Затем животных случайным образом отнесли к восьми группам: семь (7) групп, обработанных антителом 191Ρ4Ό12, и группа, обработанная контрольным антителом Н31.4.1.2 (η=10). Все антитела вводили внутрибрюшинно в дозе 500 мкг/животное два раза в неделю до конца исследования. Рост опухоли контролировали, проводя измерение опухолей с помощью штангенциркуля каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что 191Ρ4Ό12 МАЬ не ингибировало рост опухоли на модели ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы человека на мышах δί',ΊΌ по сравнению с контрольным антителом. В дополнение к этому другие 191Ρ4Ό12 МАЩ были использованы в этом исследовании. Результаты не представлены (фиг. 13).
Оценка Ηа22-2(2,4)6.1 МАЬ на подкожной модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы АΟ-Ρаηс3 на мышах δί'.ΊΌ.
В другом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы АΟ-Ρаηс3 поддерживались серийными пассажами на мышах линии δί',ΊΌ. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии δί',ΊΌ. Затем животных случайным образом делили на следующие группы (η=10): две (2) группы, леченые 191Ρ4Ό12 МаЬ, и группа, леченая контрольным антителом Н3-1.4.1.2. Все антитела вводили внутрибрюшинно 500 мкг/животное два раза в неделю до конца исследования. Рост опухоли контролировали, проводя измерение опухолей с помощью штангенциркуля каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что 191Ρ4Ό12 МАЬ не ингибировало рост ксенотрансплантата поджелудочной железы у мышей δί',ΊΌ по сравнению с контрольным антителом. Кроме того, в этом исследовании использовались другие 191Ρ4Ό12 МАЩ. Результаты не показаны (фиг. 14).
Эффективность Ηа22-2(2,4)6.1-νсΜΜΛЕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака легкого человека АО-Ь4 на мышах δί',ΊΌ.
В другом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака легкого АО-Ь13 поддерживались серийными пассажами на мышах линии δί',ΊΌ. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии δί',ΊΌ. Опухоли росли, не подвергаясь воздействию, до того, как они достигали приблизительного объема 200 мм3. На22-2(2,4)6.КсММАЕ и контрольные АЭС вводили в дозе 10 мг/кг каждые семь (7) дней в виде двух доз с помощью внутривенных болюсных инъекций. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, полученному непосредственно перед введением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1-νсΜΜΛЕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов АО-Ь4 рака легкого, подкожно привитых бестимусным мышам по сравнению с контрольным АЭС. Кроме того, в этом исследовании использовались другие 191Ρ4Ό12 МАЩ. Результаты не показаны (фиг. 15).
Эффективность Ηа22-2(2,4)6.1-νсΜΜΛЕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака молочной железы ВТ-483 человека АО-Ь4 на мышах δί'.ΊΌ.
В этом эксперименте клетки рака молочной железы человека ВТ-483 использовали для получения исходных ксенотрансплантатов, которые поддерживались серийными пассажами на мышах линии δί',ΊΌ. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии δί',ΊΌ. Опухоли росли, не подвергаясь воздействию, до того, как они достигали приблизительного объема 100 мм3. Ηа22-2(2,4)6.1νсΜΜΛЕ и контрольный АЭС вводили в дозе 5 мг/кг каждые четыре (4) дня в виде четырех (4) доз с помощью внутривенных болюсных инъекций. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, по- 54 027887 лученному непосредственно перед введением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1-νсММАΕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов ВТ-483 рака молочной железы, подкожно привитых мышам линии 8СГО, по сравнению с контрольным АЭС. Кроме того, в этом исследовании использовались друге 191Р4Э12 МАЬз. Результаты не показаны (фиг. 16).
Эффективность Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака мочевого пузыря человека АО-В1 на мышах 8СГО.
В другом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря АО-В1 поддерживались серийными пассажами на мышах линии 8СГО. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии 8СГО. Опухоли росли, не подвергаясь воздействию, до того, как они достигали приблизительного объема 230 мм3. Ηа22-2(2,4)6.1νсММАΕ и контрольный АЭС вводили в дозе 4 мг/кг однократно с помощью внутривенной болюсной инъекции. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, полученному непосредственно перед введением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов АО-В 1 рака мочевого пузыря по сравнению с контрольным АЭС. Кроме того, другие 191Р4Э12 МАЬз были использованы в этом исследовании. Результаты не показаны (фиг. 17).
Эффективность Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека АО-Рапс2 на мышах 8СГО.
В другом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы АО-Рапс2 поддерживались серийными пассажами на мышах линии 8СГО. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Пять (5) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии 8СГО. Опухоли росли, не подвергаясь воздействию, до того, как они достигали приблизительного объема 100 мм3. Ηа22-2(2,4)6.1νсММΛΕ и контрольный АЭС вводили в дозе 5 мг/кг каждые четыре (4) дня в виде четырех (4) доз с помощью внутривенной болюсной инъекции. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, полученному непосредственно перед введением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов АО-Рапс2 рака поджелудочной железы по сравнению с контрольным АЭС. Кроме того, в этом исследовании использовались другие 191Р4Э12 МАЬз. Результаты не показаны (фиг. 18).
Эффективность Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека АО-Рапс4 на мышах 8СГО.
В другом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы АО-Рапс4 поддерживались серийными пассажами на мышах линии 8СГО. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии 8СГО. Ηа22-2(2,4)6.1νсММΛΕ и контрольный АЭС вводили в дозе 5 мг/кг каждые семь (7) дней в виде трех доз с помощью внутривенной болюсной инъекции. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, полученному непосредственно перед введением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ значительно ингибировало рост ксенотрансплантатов АО-Рапс4 рака поджелудочной железы по сравнению с контрольным АЭС. Кроме того, в этом исследовании использовались другие 191Р4Э12 МАЬз. Результаты не показаны (фиг. 19).
Сравнение эффективности дозировок Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ на подкожной модели ксенотрансплантата рака мочевого пузыря человека АО-В8 на мышах 8СГО.
В этом эксперименте полученные от пациента ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря АО-В8 поддерживались серийными пассажами на мышах линии 8СГО. Исходные опухоли стерильно извлекали и резали на кусочки 1 мм3. Шесть (6) кусочков были имплантированы в бок отдельной мыши линии 8СГО. Опухоли росли, не подвергаясь воздействию, до того, как они достигали приблизительного объема 200 мм3. Затем животных случайным образом делили на три следующие когорты (п=6): две (2) группы, леченые Ηа22-2(2,4)6.1-νсММΛΕ, и контрольную группу АЭС VС^37-5се5р-νсММΛΕ. Ηа22-2(2,4)6.1усММАЕ вводили в дозе 5 мг/кг или 10 мг/кг, а контрольный АЭС вводили в дозе 5 мг/кг. Все АЭСз вводили однократно с помощью внутривенной болюсной инъекции. Количество введенного АЭС соответствовало индивидуальному весу тела каждого животного, полученному непосредственно перед вве- 55 027887 дением. Рост опухоли контролировали, проводя измерения штангенциркулем каждые 3-4 дня. Объем опухоли вычисляли как ширина2 х длина/2, где ширина является самым маленьким размером, а длина является самым большим размером.
Результаты показывают, что лечение Ηа22-2(2,4)6.1νсММАΕ в дозе 10мг/кг нгибировало рост ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря хАО-В8 по сравнению с Ηа22-2(2,4)6.1νсММАΕ в дозе 5 мг/кг (фиг. 20).
Заключение.
В заключение, фиг. 12-20 показывают, что 191Р4Э12 АЭС, названный На22-2(2,4)6.1νсММАΕ, значительно ингибировал рост опухолевых клеток, экспрессирующих 191Р4Э12, по сравнению с контрольными ЛЭСХ. Таким образом, Ηа22-2(2,4)6.1νсММАΕ может использоваться для лечения и сдерживания развития злокачественных опухолей, представленных в табл. I.
Пример 8. Клинические испытания на людях лечения и диагностирования карцином человека с использованием 191Р4О12 АЭСк.
В соответствии с настоящим изобретением используются 191Р4Э12 АЭСк, которые специфически связываются с 191Р4Э12 и находят применение при лечении определенных опухолей, предпочтительно перечисленных в табл. I. Применительно к каждому из этих указаний успешно рассматриваются два клинических подхода.
I) Дополнительная терапия: при дополнительном лечении пациентов лечат 191Р4Э12 АЭСк в комбинации с химиотерапевтическим или антинеопластическим средством и/или радиационной терапией или их комбинацией. Первичные злокачественные опухоли-мишени, такие как перечисленные в табл. I, лечат в соответствии со стандартными протоколами, добавляя 191Р4Э12 АЭСк к стандартному лечению первой или второй линии. Протокол предполагает адресную эффективность, которая оценивается, например, включая, но не ограничиваясь этим, по уменьшению опухолевой массы первичных или метастатических очагов поражения, увеличению выживаемости без прогрессирования, увеличению общей выживаемости, улучшению здоровья пациентов, стабилизации болезни, а также возможности уменьшать обычные дозы стандартной химиотерапии и других биологических средств. Такое уменьшение дозировки дает возможность проведения дополнительного и/или продолжительного лечения, уменьшив связанную с дозировкой токсичность химиотерапевтического или биологического средства. 191Р4Э12 АЭСк используются в некоторых дополнительных клинических испытаниях в комбинации с химиотерапевтическими или антинеопластическими средствами.
II) Монотерапия: при использовании в монотерапии опухолей 191Р4Э12 АЭСк вводятся пациентам без химиотерапевтического или антинеопластического средства. В одном варианте осуществления монотерапия проводится пациентам со злокачественным новообразованием в конечной стадии заболевания с распространенной метастатической болезнью. Протокол предполагает адресную эффективность, которая оценивается, например, включая, но не ограничиваясь этим, по уменьшению опухолевой массы первичного или метастатического поражений, увеличению выживаемости без прогрессирования, увеличению общей выживаемости, улучшению здоровья пациентов, стабилизации болезни, а также возможности уменьшать обычные дозы стандартной химиотерапии и других биологических средств.
Дозировка.
Чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ, можно регулировать режимы дозирования. Например, можно вводить отдельную болюсную инъекцию, можно вводить несколько дробных доз в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально уменьшить или увеличить, на что указывает необходимость терапевтической ситуации. Особенно удобно заключать парентеральные композиции в стандартную лекарственную форму для удобства введения и однородности дозировки. Стандартная лекарственная форма при использовании в описании относится к физически отдельным единицам, пригодным в качестве единичных дозировок для субъектов-млекопитающих, которых необходимо лечить; каждый единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных лекарственных форм изобретения обусловливаются и прямо зависят от (а) уникальных характеристик антитела и/или АЭС и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который нужно получить, и (Ъ) ограничений, характерных в данной области техники для приготовления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Иллюстративный неограничивающий предел терапевтически эффективного количества 191Р4Э12 АЭС, введенного в комбинации согласно изобретению, составляет примерно от 0,5 до 10 мг/кг, примерно от 1 до 5 мг/кг, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 мг/кг. Другие иллюстративные неограничивающие пределы составляют, например, примерно от 0,5 до 5 мг/кг, или, например, примерно от 0,8 до 5 мг/кг, или, например, примерно от 1 до 7,5 мг/кг. Вариант осуществления высокой дозы изобретения имеет отношение к дозировке более чем 10 мг/кг. Следует отметить, что величина дозировки может меняться в зависимости от типа и тяжести состояния, которое нужно улучшить, и может включать одну или множество доз. Кроме того, следует понимать, что для любого отдельного субъекта конкретные режимы дозирования в течение времени следует корректировать в
- 56 027887 соответствии с индивидуальной необходимостью и профессиональным суждением лица, осуществляющего лечение или контролирующего введение композиций, и что диапазон доз, излагаемый в этом документе, является только иллюстративным и не предназначается для ограничения рамок или осуществления на практике заявленной композиции.
План клинических исследований (СИР).
СИР контролирует и совершенствует методы лечения 191Ρ4Ό12 АЭС5 применительно к дополнительной терапии или монотерапии. Испытания сначала продемонстрировали безопасность, а после этого подтвердили эффективность повторных доз. Испытания представляют собой открытые клинические исследования (без контроля плацебо), сравнивающие стандартную химиотерапию со стандартной химиотерапией в сочетании с 191Ρ4Ό12 АЭС5. Следует понимать, что одним неограниченным критерием, который может использоваться в связи с зачислением пациентов, является уровень экспрессии 191Ρ4Ό12 в опухолях, определенный с помощью биопсии.
Как и в случае с любым белком или лечением с использованием вливания антител, проблемы безопасности связаны в первую очередь с (ί) синдромом высвобождения цитокинов, т.е. гипотонией, жаром, лихорадкой, ознобом; (ίί) развитием иммунного ответа на материал (т.е. выработкой человеческих антител у пациента на терапевтические антитела, или НАМА ответ) и (ίίί) токсичностью по отношению к нормальным клеткам, экспрессирующим 191Ρ4Ό12. Для контролирования каждой из этих угроз безопасности используются стандартные тесты и наблюдение. Обнаружено, что 191Ρ4Ό12 АЭС5 являются безопасными при введении человеку.
Пример 9. Обнаружение белка 191Ρ4Ό12 в образцах пациентов со злокачественным новообразованием с помощью 1НС.
Экспрессию белка 191Ρ4Ό12 исследовали иммуногистохимическим методом анализа в образцах пациентов с раком (ί) мочевого пузыря, (ίί) молочной железы, (ίίί) поджелудочной железы, (ίν) легкого, (ν) яичника, (νί) пищевода и (νίί) головы и шеи. Коротко, из зафиксированных в формалине, залитых парафином тканей готовили срезы толщиной четыре (4) микрона и помещали на предметные стекла. Удаляли воск со срезов, регидратировали и обрабатывали раствором ΕΩ^ для демаскирования антигена (Вюдепех, §ап Катоп, СА) в микроволновом ΕΖ-Ке!^^еνе^ (Вюдепех, §ап Катоп, СА) в течение 30 мин при 95°С. Затем срезы обрабатывали раствором 3% перекиси водорода, чтобы инактивировать активность эндогенной пероксидазы. Бессывороточный блокирующий агент Рго!еш В1оск (Эако, Сагреп!епа, СА) использовали, чтобы ингибировать неспецифическое связывание до инкубации с моноклональными мышиными анти-191Р4Э12 антителами или изотипическим контролем. Затем срезы обрабатывали с использованием системы §ирег Зешйгуе™ Ро1утег-Ьог5егаб15Ь регох1ба5е (НКР) Ое1ес1юп §у5!ет, которая включает инкубацию в реагенте §ирег ΕπΙκηκχγ™ с последующей инкубацией с конъюгатом полимерной НКР с вторичным антителом (ВюОепех, §ап Катоп, СА). Затем срезы обработали с использованием набора ЭАВ (ВюОепех, §ап Катоп, СА). Ядра окрашивали гематоксилином и анализировали с помощью светлопольной микроскопии. Специфическое окрашивание было обнаружено в образцах пациентов с помощью 191Ρ4Ω12 иммунореактивного антитела, на что указывает бурое окрашивание (см. фиг. 21А, 21С, 21Е, 21О, 211-21(М)). В противоположность этому, контрольное антитело не окрашивало какиелибо образцы, полученные от пациента (см. фиг. 21В, 21Ω, 21Е, 21Н, 21ί, 21Ь и 21Ν).
Результаты указывают на экспрессию 191Ρ4Ω12 в опухолевых клетках из злокачественных тканей мочевого пузыря, поджелудочной железы, яичника, легкого, пищевода, головы и шеи пациента. Эти результаты показывают, что 191Ρ4Ω12 экспрессируется в злокачественных опухолях человека, и что антитела к этому антигену и конъюгат антитело-лекарственное средство, обозначенный На222(2,4)6.1νсΜΜΛΕ), являются пригодными для применения в диагностических и терапевтических целях (фиг. 21).
Пример 10. Определение эпитопа связывания На22-2(2,4)6.1 МАЬ.
Белок 191Ρ4Ω12 человеческого, обезьян циномолгус, крысиного и мышиного происхождения был рекомбинантно экспрессирован в линии клеток РС3, чтобы определить перекрестную реактивность На22-2(2,4)6.1 к этим ортологам. Было показано, что На22-2(2,4)6.1 обладает значительной перекрестной реактивностью с ортологами циномолгус и крыс 191Ρ4Ω12 (фиг. 23). Значения связывания ЕС50 показаны в табл. VII. Связывание На22-2(2,4)6.1 с мышиным ортологом показывает значительное уменьшение величины связывания ЕС50, что показывает важные аминокислотные замены в V домене (по сравнению с последовательностями человека и крысы), затрагивающие аффинность На22-2(2,4)6.1 к 191Ρ4Ω12.
Табл. VIII показывает выравнивание аа 1-180 белковой последовательности 191Ρ4Ω12 ортологов, содержащих ν-домен. Только две аминокислоты в последовательности ортолога крысы, ТЬг-75 и §ег-90, замещаются в последовательности ортолога мыши на Не и А5п соответственно (выделенные жирным шрифтом). Следует отметить, что соответствующими аминокислотами в человеческой последовательности являются А1а-76 и §ег-91. Чтобы определить, содержат ли эти аминокислоты эпитоп связывания На22-2(2,4)6.1, были созданы несколько мутантных конструктов 191Ρ4Ω12 и его мышиный ортолог и экспрессированы в клетках РС3 (табл. IX). Мышиные аминокислоты были введены вместо стандартного мутагенеза в виде замены аланина в человеческую последовательность и, наоборот, в мышиную по- 57 027887 следовательность.
Было показано, что мутация 8ег-91 на Аки в 191Ρ4Ό12 сильно ухудшает связывание На22-2(2,4)6.1, подтверждая, что эта аминокислота, 8ег-91, является существенной для связывания и должна содержать эпитоп, узнаваемый На22-2(2,4)6.1 МАЬ. Дополнительная мутация А1а в положении 76 (А761, 891Ν двойной мутант) также была введена в 191Ρ4Ό12. Было показано, что связывание На22-2(2,4)6.1 с двойным мутантом А761, 891Ν является похожим на связывание с ортологом мыши (фиг. 24). С другой стороны, мутация Аки-90 в мышиной последовательности на 8ег сильно улучшает связывание На222(2,4)6.1 с мутантным ортологом мыши, дополнительно подтверждая важность аминокислоты в этом положении для связывания На22-2(2,4)6.1. Связывание На22-2(2,4)6.1 с двойным мутантом ортолога мыши А908, 175А, по-видимому, очень сходно с человеческим ортологом 191Ρ4Ό12.
Взятые в совокупности, эти данные подтверждают, что 8ег-91 и А1а-76 играют решающую роль в связывании На22-2(2,4)6.1 с белком 191Ρ4Ό12 на поверхности клетки и составляют часть эпитопа, распознаваемого На22-2(2,4)6.1, на поверхности 191Ρ4Ό12.
Чтобы визуализировать эту идею, мы создали компьютерную модель ν-домена 191Ρ4Ό12 исходя из опубликованных данных о кристаллической структуре членов семейства 191Ρ4Ό12 и белков, содержащих 1д-домен, с помощью ГуМОЕ (фиг. 25). Показаны положения А1а-76 (испещренный точками) и 8ег91 (заштрихованный).
В дополнение к этому, чтобы дополнительно усовершенствовать сайт связывания На22-2(2,4)6.1 на молекуле 191Ρ4Ό12, мы создали и получили экспрессию фрагмента 191Ρ4Ό12, соответствующего Vдомену на поверхности клеток Каф1)Е. Следующий конструкт был получен в ретровирусном векторе: 191Ρ4Ό12 (аа1-150,347-510).
Связывание На22-2(2,4)6.1 МАЬ оценивали с помощью РАС8. Как показано на фиг. 26, На222(2,4)6.1 связывается с клетками, экспрессирующими ν-домен (А), а также диким типом 191Ρ4Ό12 (В), но не с клетками, экспрессирующими С1С2 домен, полученными ранее (С). Это свидетельствует о том, что сайт связывания этого антитела располагается в ν-домене 191Ρ4Ό12 в пределах первых 150 аминокислот.
Результаты показывают, что На22-2(2,4)6.1 МАЬ связывается с ν-доменом белка 191Ρ4Ό12 по положению аа 1-150, и дополнительно показывают, что специфический эпитоп, содержащий аа 8ег-91 и аа А1а-76, является решающим для связывания На22-2(2,4)6.1 МАЬ.
На всем протяжении этой заявки приводятся ссылки на содержание данных различных веб-сайтов, публикации, патентные заявки и патенты (ссылки на веб-сайты приводятся с помощью унифицированного указателя ресурсов, или ИКЬ, адреса во всемирной компьютерной сети). Раскрытие каждой из этих ссылок полностью включается в описание путем отсылки.
Настоящее изобретение не ограничивается в объеме раскрытыми в описании вариантами осуществления, которые предназначаются только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения, и любые аспекты, являющиеся функционально эквивалентными, находятся в объеме изобретения. Различные модификации моделей и способов изобретения, в дополнение к раскрытым в описании, станут понятны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания и идей, и аналогичным образом подпадают под действие изобретения. Такие модификации или другие варианты осуществления могут применяться без отклонения от истинного объема и сущности изобретения.
Таблицы.
Таблица I
Ткани, экспрессирующие 191Ρ4Ό12 при озлокачествлении Поджелудочная железа Яичник
Молочная железа Легкие
Мочевой пузырь
- 58 027887
Таблица II
Сокращенные названия аминокислот
Однобуквенное Трехбуквенное Полное название
Р РЬе фенилаланин
Ь Ьей лейцин
8 Зег серин
Υ Туг тирозин
С Суз цистеин
Ψ Тгр триптофан
Р Рго пролин
Н ΗΪ8 гистидин
Ω О1п глутамин
К Аг§ аргинин
I Не изолейцин
м Ме1 метионин
т ТЬг треонин
N Азп аспарагин
К Ьуз лизин
V Уа1 валин
А А1а аланин
ϋ Азр аспарагиновая кислота
Е О1и глутаминовая кислота
О О1у глицин
Таблица III
Матрица аминокислотных замен
А С Ό Е Р С Н I К ь М N Р <2 К 3 т V N Υ .
4 0 -2 -1 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 А
9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 С
6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 0
5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 Е
6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 Р
6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 0
8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 Н
4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I
5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 К
2-3-3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 Ь
5-2-2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 М
6-2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N
-1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 Р
1 0-1-2-2-10
-1 -1 -3 -3 -2 К
1-2-3-23
0 -2 -2 Т
-3 -1 V
2 И
Υ
Основанная на ОСО программном обеспечении 9.0 ВЬОЗиМ62 матрица аминокислотных замен (подстановочная матрица). Чем выше значение, тем более вероятная замена обнаруживается в родственных природных белках.
Таблица IV Общий метод синтеза усММАЕ
Где: АА1 = Аминокислота 1
АА2 = Аминокислота 2 АА5 = Аминокислота 5 О1Ь - Долаизолейцин ΏΑΡ = Долапролин Линкер = Уа1-Сй (ус)
- 59 027887
АА^ААг-ОН-йар-ΑΑδ
Линкер— ΑΑή—ААг—ϋϋ —ϋβρ —ΑΑβ
Таблица V
Вычисление скорости ассоциации и диассоциации и полученная аффинность с использованием В1асоге
коп, М-15-1 коЯ, 5-1 Κϋ, М
На22-2(2,4)6.1 3.8Е+05 5.8Е-03 1.6Е-08
На222(2,4)6.1усММАЕ 4.5Е+05 5.2Е-03 1.1Е-08
Таблица VI
191Ρ4Ό12 конструкты, использованные в картировании домена. Название конструктов 191Р4Э12 (аа 1-242, 347-510) УС1, КаН(Е) экспрессирующая линия
191Ρ4Ώ12 (аа 1-31, 147-510) С1С2, Ка11(Е) экспрессирующая линия
191Ρ4Ό12 (аа 1-242) шРс-УС1, гибридный белок 191Ρ4Ώ12 (аа 1-31, 147-346) тРс-С1С2, гибридный белок 191Ρ4Ώ12 (аа 1-141) тРс-У, гибридный белок
Таблица VII
РСЗ-191Р4О12 Ортолог циномолгус Ортолог крысы Ортолог мыши
Вшах (ΜΡΊ) 816 1146 679 325
ЕС50 (нМ) 0.28 0.30 0.44 70.3
Таблица VIII (8Ер ГО ^8:11-13, по порядку)
Таблица IX
Конструкты дикого типа Мутантные конструкты Двойные мутантные конструкты
191Р4Э12, дикий тип 891Ν 89 ΙΝ, Α76Ϊ
Ортолог мыши 191Ρ4Ό12, дикий тип N908 N908,175Α
- 60 027887
Перечень последовательностей <110> АСЕИБУБ, ΙΝΟ.
БЕАТТЬЕ СЕИЕТЮБ, ΙΝΟ.
БАТРАУЕУ, ϋβΐΐΐθΐ ΜΟΚΚΙ5ΟΝ, коЬеге кепс!аП Μ0ΚΚΙ5ΟΝ, кагеп лапе меугтск сиодз, зеап ЭАКОВОУ1Т5, Ауа τοκοον, мтспае1 ΑΝ, Ζτϋ <120> КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО,
СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С БЕЛКАМИ 191Р4О12 <130> 511582008250 <140> Пока не назначена <141> Текущая <150> из 61/387,933 <151> 2010-09-29 <160> 13 <170> РазеБЕЦ для Мтпбомз Уегзтоп 4.0 <210> 1 <211> 3464 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<221> СЭБ <222> (264)...(1796) <220>
<221> новая или редкая характеристика <223> 191Р4О12 <400> 1 ддссдесдее дееддссаса дсдедддаад садсеседдд ддадсесдда дсесссдаес 60 асддсеесее дддддеадсе асддседдде дедеадаасд дддссддддс еддддседдд 120 ессссеадед дадасссаад едсдададдс аадаасесед садсеессед ссееседдде 180 садеессееа еесаадесед садссддсес ссадддадае сесддеддаа сеесадааас 240 дседддсаде седссеееса асс агд ссс сед есс сед дда дсс дад аед едд 293
Мее Рго ьеи Бег ьеи С1у А1а с1и Мее тгр 1 5 10 ддд
С1у ддс
С1у дед
Уа1 ддс
С1у ддс
С1у
ссе дад дсс едд Тгр 15 сед сед сед сед сеа сед сед дса еса еее рКе 25 аса тНг 341
Рго С1и А1а ьеи ьеи ьеи ьеи ьеи 20 Ьеи Ьеи А1а Бег
едд еде ссс дед ддс С1у дад сед дад асс еса дас дед Уа1 деа асе дед Уа1 389
Агд Суз Рго А1а с1и ьеи с1и тНг Бег Азр Уа1 тКг
30 35 40
сед ддс С1у сад дас дса ааа сед ссс еде еес еас еда ддд дас есс 437
Ьеи с!п Азр А1а ьуз Ьеи Рго Су5 РКе Туг Агд С1у А5Р Бег
45 50 55
дад с1и саа с1п дед Уа1 ддд С1у саа с1п дед Уа1 дса А1а едд тгр дсе А1а едд Агд дед Уа1 дас Азр дед а1 а ддс С1у даа с1и 485
60 65 70
дсс сад даа сеа дед сеа сед сас есс ааа еас ддд С1у сее сае дед уа! 533
А1а с!п С1и ьеи А1а ьеи ьеи НТ 5 Бег ьуз туг ьеи нт 5
- 61 027887
75 80 85 90
аде сед дег гас дад ддс еде дгд дад сад сед сед ссс сса еде аас 581
5ег РГО А1а туг б1и С1у Агд УаТ б!и 61 η Рго РГО Рго рго Агд АЗП
95 100 105
ссс егд дас ддс гса дгд сгс егд еде аас дса дгд сад дед даг дад 629
РГО ьеи Азр бТу Зег УаТ ьеи ьеи Агд АЗП А1а УаТ б1п А1а Азр б1и
110 115 120
ддс дад гас дад где едд дгс аде асе ггс ссс дсс ддс аде ГГС сад 677
бТу б!и туг с1и Су 5 Агд Уа1 зег ТНг РНе Рго А1а бТу Зег рНе б1п
125 130 135
дед едд егд едд сгс еда дгд егд дгд ССГ ссс егд ссс Гса егд ааг 725
А1а Агд Ьеи Агд ьеи Агд УаТ ьеи УаТ РГО Рго ьеи Рго Зег ьеи АЗП
140 145 150
ссг ддг сса дса сга даа дад ддс сад ддс егд асе егд дса дсс гее 773
РГО 61 у РГО А1а Ьеи б!и б1и С1у с!п бТу Ьеи тНг ьеи А1а А1а зег
155 160 165 170
Где аса дег дад ддс аде сса дсс ссс аде дгд асе гдд дас асд дад 821
Суз ТНг А1а б!и бТу зег РГО А1а рго зег УаТ тНг тгр Азр ТНг 61 и
175 180 185
дгс ааа ддс аса асд гее аде едг ГСС ггс аад сас ГСС еде ГСГ дег 869
Уа1 ьуз бТу ТНг ТНг Зег зег Агд зег РНе ьуз нтз зег Агд зег А1а
190 195 200
дсс дгс асе теа дад ггс сас ггд дгд ССГ аде еде аде агд ааг ддд 917
А1а Уа1 ТНг Зег б!и РНе НТ 5 ьеи УаТ РГО зег Агд Зег мег Азп бТу
205 210 215
сад сса егд асг гдг дгд дгд ГСС саг ССГ ддс егд СГС сад дас саа 965
6ΐη РГО Ьеи ТНг Суз УаТ УаТ зег нтз рго бТу ьеи Ьеи б!п Азр б!п
220 225 230
адд асе асе сас агс сгс сас дгд гее ггс егг дег дад дсс ГСГ дгд 1013
Агд 11 е ТНг нтз Не ьеи Нт 5 уаТ зег РНе ьеи А1а 61 и А1а зег УаТ
235 240 245 250
адд ддс егг даа дас саа ааг егд гдд сас агг ддс ада даа дда дег 1061
Агд С1у ьеи с!и Азр 61 η АЗП ьеи тгр НТ 5 11е бТу Агд б1и бТу А1а
255 260 265
агд сгс аад где егд адг даа ддд сад ссс ССГ ссс гса гас аас гдд 1109
Μβΐ ьеи ьуз Суз ьеи Зег бТи бТу С1п РГО рго РГО Зег туг АЗП тгр
270 275 280
аса едд егд даг ддд ссГ егд ссс адг ддд дга еда дгд даг ддд дас 1157
тНг Агд ьеи Азр С1у Рго ьеи рго зег бТу Уа1 Агд УаТ Азр бТу Азр
285 290 295
асг ггд ддс ΐΐΐ ссс сса егд асе асг дад сас аде ддс агс гас дгс 1205
тНг ьеи бТу РНе РГО РГО Ьеи ТНг ТНг с!и нтз зег бТу 11е туг Уа1
300 305 310
где саг дсс аде ааг дад ГГс Гее гса адд даг ГСГ сад дгс асг дгд 1253
суз НТЗ Уа1 Зег АЗП б1и РНе Зег 5ег Агд Азр 5ег б1п Уа1 тНг уаТ
315 320 325 330
да! д« егг дас ссс сад даа дас гсг ддд аад сад дгд дас ста дгд 1301
Азр Уа1 ьеи Азр РГО 335 6ΐη б1и Азр Зег сТу 340 ьуз б1п уаТ Азр ьеи 345 уаТ
Гса зег дсс А1а гсд Зег дгд УаТ дгд УаТ дгд УаТ дгд УаТ ддг бТу дгд УаТ агс 11 е дсс А1а дса А1а СГС ьеи ггд ьеи ггс РНе где суз 1349
- 62 027887
1397
350 355 360
схх Хеи ехд Хеи дхд Уа1 дед Уа1 дгд УаТ дхд Уа1 дхд УаТ схс хеи ахд Мех ХСС Зег еда Агд хас туг сах нт 5 едд Агд сдс Агд аад хуз
365 370 375
дсс сад сад ахд асе сад ааа хах дад дад дад ехд асе ехд асе адд
А1а 6ΐη 6ΐη мех ТЬг 6ΐη Хуз туг б!и б!и б1и хеи ТЬг хеи ТЬг Агд
380 385 390
дад аас ХСС ах с едд адд ехд сах ХСС сах сас асд дас ссс адд аде
б!и АЗП Зег Пе Агд Агд Хеи нтз Зег НТ 5 нт 5 тНг Азр РГО Агд Зег
395 400 405 410
сад ссд дад дад адх дха ддд ехд ада дсс дад ддс сас ссх дах адх
б!п РГО б!и б1и Зег Уа1 бТу хеи Агд А1а б1и бТу Нтз РГО Азр 5ег
415 420 425
схс аад дас аас адх аде хде хсх д*д ахд адх даа дад ссс дад ддс
хеи ьуз А5р Азп Зег зег Суз Зег УаТ мех зег б1и б1и РГО 61 и бТу
430 435 440
сдс адх хас ХСС асд ехд асе асд дха адд дад аха даа аса сад асх
Агд зег туг Зег тНг хеи ТНг ТКг УаТ Агд б!и Пе б1и тНг б!п ТКг
445 450 455
даа ехд ехд хсх сса ддс ХСХ ддд едд дсс дад дад дад даа дах сад
б!и Хеи хеи зег РГО сТу Зег бТу Агд А1а б1и б!и б1и б1и Азр б1п
460 465 470
дах даа ддс ах с ааа сад дсс ахд аас сах XXX дхх сад дад аах ддд
Азр б!и 61 у Пе Хуз б1п А1а мех АЗП нт 5 рКе Уа1 6ΐη 61 и Азп б!у
475 480 485 490
асе сха едд дсс аад ссс асд ддс аах ддс ахс Хас ахс аах ддд едд
тНг хеи Агд А1а хуз Рго тКг бТу АЗП бТу ΐΐ е Туг Пе Азп бТу Агд
495 500 505
1445
1493
1541
1589
1637
1685
1733
1781 дда сас ехд дхс Хда сссаддссхд ссхсссххсс схаддссхдд схссххсхдх б1у Нт 5 Хеи \/а1 *
510 хдасахддда даххххадсх сахсххдддд дссхссххаа асасссссах ххсххдсдда адахдсхссс сахсссасхд асхдсххдас схххассхсс аасссххсхд ХХсаХсддда дддсхссасс ааххдадхсх схсссассах дсахдсаддх сасхдхдхдх дхдсахдхдх дссхдхдхда дхдххдасхд асхдхдхдхд хдхддадддд хдасхдхссд хддаддддхд асхдхдхссд хддхдхдхах хахдсхдхса хахсададхс аадхдаасхд хддхдхахдх дссасдддах ххдадхддхх дсдхдддсаа сасХдХсадд дхххддсдхд хдхдхсахдх ддсхдхдхдх дассхсхдсс хдааааадса ддхаххххсх садассссад адсадхахха ахдахдсада ддххддадда дададдхдда дасхдхддсх садасссадд хдхдсдддса хадсхддадс хддаахсхдс схссддхдхд адддаассхд хсхссхасса сххсддадсс ахдддддсаа дхдхдаадса дссадхсссх дддхсадсса даддсххдаа схдххасада адсссхсхдс ссхсхддхдд ссхсхдддсс хдсхдсахдх асахаххххс хдхааахаха сахдсдссдд дадсххсххд саддаахасх дсхссдаахс асххххаахх хххххсхххх ххххххсххд сссхххссах хадххдхахх ххххахххах ххххаххххх аххххххххх ададахддад хсхсасхахд ххдсхсаддс хддссххдаа схссхдддсх саадсаахсс хссхдссхса дссхсссхад хадсхдддас хххаадхдха сассасхдхд ссхдсхххда ахссхххасд аададааааа аааааххааа дааадссххх адахххахсс аахдхххасх асхдддаххд сххааадхда ддссссхсса асассадддд дххааххссх дхдаххдхда ааддддсхас ххссааддса хсххсахдса ддсадссссх хдддадддса ссхдададсх ддхададхсх даааххаддд ахдхдадссх сдхддххасх дадхааддха аааххдсахс сассаххдхх хдхдахассх хадддааххд сххддассхд дхдасааддд схссхдххса ахадхддхдх Хддддадада дададсадхд аххахадасс дадададхад дадххдаддх даддхдаадд аддхдсхддд ддХдадааХд хсдссхххсс сссхдддххх хддахсасха аххсааддсх сххсхддахд хххсхсхддд ххддддсхдд адххсаахда ддхххахххх хадсхддссс асссадахас асхсадссад аахассхада хххадхассс ааасхсххсх хадхсхдааа хсхдсхддах ххсхддссха адддададдс хсссахссхх сдххссссад ссадссхадд асххсдаахд хддадссхда адахсхаада хссхаасахд хасаххххах
1836
1896
1956
2016
2076
2136
2196
2256
2316
2376
2436
2496
2556
2616
2676
2736
2796
2856
2916
2976
3036
3096
3156
3216
3276
3336
3396
- 63 027887 дтааататдт дсататттдт асатаааатд ататтстдтт тттааатааа садасаааас 3456 ттдааааа 3464 <210> 2 <211> 510 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(510) <223> 191Р4Р12 <400> 2
мет РГО Ьеи Зег ьеи с! у А! а с! и мет тгр С1у РГО с! и а! а тгр ьеи
1 5 10 15
Ьеи ьеи Ьеи ьеи ьеи ьеи А! а зег рКе ТКг С1у Агд Суз РГО А! а с! у
20 25 30
С1и ьеи с!и тКг Зег Азр Уа1 уа! тКг Уа! Уа! ьеи С1у С1п Азр а! а
35 40 45
ьуз Ьеи РГО Суз РКе туг Агд с!у Азр зег с!у С1и С!п Уа1 С1у с!п
50 55 60
Уа! А1а тгр А1а Агд Уа1 Азр А1а б!у с! и с!у А1а С1п С1и ьеи А1а
65 70 75 80
ьеи ьеи Нт 5 Зег ьуз туг С!у ьеи Нт 5 Уа1 зег РГО А! а туг с!и С1у
85 90 95
Агд Уа! с!и С1п РГО РГО Рго рго Агд АЗП РГО ьеи Азр с!у Зег Уа!
100 105 110
ьеи ьеи Агд АЗП а! а Уа! С1п а! а АЗр с!и с! у с1и Туг с!и Суз Агд
115 120 125
Уа! Зег ТКг РКе РГО А! а С!у зег РКе с!п а! а Агд ьеи Агд ьеи Агд
130 135 140
Уа! Ьеи Уа! РГО РГО ьеи Рго зег ьеи АЗП РГО с!у РГО А! а ьеи с!и
145 150 155 160
С1и С1у С1п С1у Ьеи тКг ьеи А1а А1а 5ег Суз тКг д1а С1и С1у Зег 165 170 175
рго А1а Рго Зег Уа! тКг тгр Азр тКг с!и 185 Уа1 ьуз С1у тКг 190 тКг Зег
180
зег Агд зег РКе Ьуз Нт 5 Зег Агд Зег А1а А1а Уа1 ТКг зег С1и РКе
195 200 205
НТ 5 ьеи Уа1 Рго Зег Агд Зег МеТ Азп С1у С1п РГО ьеи ТКг Суз уа!
210 215 220
Уа! зег Нт 5 РГО с!у ьеи Ьеи С1п Азр с!п Агд 11е тКг Нт 5 11е Ьеи
225 230 235 240
НТ 5 Уа1 Зег РКе ьеи А! а е!и а! а Зег Уа! Агд с!у ьеи с! и Азр с!п
245 250 255
Азп ьеи тгр Нт 5 11е С1у Агд С1и С1у д1а МеТ ьеи ьуз Суз ьеи 5ег 260 265 270
С1и <Лу С1п Рго Рго Рго Зег туг Азп Тгр ТКг Агд ьеи Азр с!у Рго 275 280 285 ьеи Рго 5ег с1у Уа1 Агд Уа1 Азр С1у Азр тКг ьеи С1у РКе Рго Рго 290 295 300
Ьеи тКг тКг С1и нтз зег С1у IIе Туг \/а1 Суз нтз Уа1 5ег Азп С1и
305 310 315 320 рКе зег Зег Агд Азр 5ег С1п Уа! тКг Уа1 Азр Уа! ьеи Азр Рго С1п
325 330 335 с1и Азр зег с1у ьуз е!п Уа! Азр ьеи Уа! Зег А1а зег Уа1 Уа1 Уа!
340 345 350
Уа1 с! у Уа! 1!е А1а а! а Ьеи ьеи РКе Суз Ьеи ьеи Уа! Уа1 Уа! Уа1 355 360 365
Уа! ьеи мет зег Агд туг Нтз Агд Агд ьуз А1а с1п с!п мет ТКг с!п 370 375 380 ьуз Туг С1и С1и С1и ьеи тКг Ьеи ТКг Агд с!и Азп 5ег 11е Агд Агд
385 390 395 400
Ьеи Нтз Зег нтз Нтз тКг Азр Рго Агд Зег с!п Рго с!и С1и Зег Уа!
405 410 415
С1у ьеи Агд А1а С1и с1у нтз Рго Азр 5ег ьеи ьуз Азр Азп зег Зег 420 425 430
- 64 027887
Суз Зег Уа1 435 ме! 5ег б!и б1и РГО 440 С1и б1у Агд зег Туг 445 Зег тНг ьеи
ТНг тНг Уа1 Агд б!и 11е б!и ТНг С1п тНг б!и ьеи Ьеи 5ег Рго б!у
450 455 460
5ег б!у Агд А1а б1и с!и С1и б1и АЗр б1п Азр б1и б1у 11е ьуз 61 п
465 470 475 480
А1а ме! Азп НТ 5 РНе Уа1 С1п С1и АЗП С1у ТНг ьеи Агд А1а ьуз Рго
485 490 495
ТНг б!у АЗП б!у 11 е туг 11 е Азп С1у Агд б!у Нт 5 Ьеи Уа1
500 505 510
<210> 3 <211> 1432 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <220>
<221> СРЗ <222> (32)...(1432) <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(1432) <223> На22-2(2,4)6.1 тяжелая цепь <400> 3 ддтда!садс ас!даасаса даддас!сас с агд дад !!д ддд с!д где !дд 52
Ме! б!и ьеи 61 у ьеи Суз тгр
д!! !!С С!! д!! Уа1 дс! А1а а!! !!а 11е ьеи 1 даа дд! д!с б1и б1у Уа1 15 сад 61 п 5 !д! дад д!д сад с!д 100
Уа1 РНе ьеи 10 суз б1и 20 Уа1 61 п ьеи
д!д Уа1 дад !с! ддд дда ддс !!д д!а сад СС! ддд б1у ддд 61у тсс с!д ада с!с 148
б1и Зег 61 у 61у б1у ьеи Уа1 б1п РГО 5ег ьеи Агд ьеи
25 30 35
ТСС !д! дса дсс !С! дда !!С асе !!С ад! аде та! аас а!д аас !дд 196
Зег суз А1а А1а 5ег б!у РНе ТНг РНе зег Зег туг Азп ме! АЗП тгр
40 45 50 55
д!с еде сад дс! сса ддд аад ддд 61 у с!д дад !дд д!! !са тас а!! ад! 244
Уа1 Агд С1п А1а РГО б!у ьуз ьеи 61 и Тгр Уа1 зег туг Не Зег
60 65 70
ад! ад! ад! ад! асе а!а тас !ас дса дас !С! д!д Уа1 аад ддс б1у еда !!с 292
Зег Зег зег зег ТНг 11 е туг туг А1а Азр зег ьуз Агд РНе
75 80 85
асе а!с !СС ада дас аа! дсс аад аас !са с!д !с! с!д саа асд аас 340
ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а ЬУ5 Азп зег ьеи зег ьеи 61 п ме! АЗП
90 95 100
аде с!д ада дас дад дас асд дс! д*д Уа1 !а! !ас !д! дед ада дса !ас 388
Зег ьеи Агд Азр б1и Азр ТНг А1а туг Туг Суз А1а Агд А1а туг
105 110 115
!ас !ас дд* б1у а!д дас д*с *дд ддс 61 у саа ддд 61 у асе асд д*с асе дтс !СС 436
туг туг Ме! Азр Уа1 тгр б1п ТНг тНг Уа1 тНг Уа1 зег
120 125 130 135
!са дсс !СС асе аад ддс 61 у сса !сд д*с !!С ссс с!д дса ссс !СС !СС 484
Зег А1а Зег тНг ьуз РГО зег Уа1 РНе РГО Ьеи А1а РГО Зег Зег
140 145 150
аад аде асе !с! ддд ддс аса дед дсс С!д ддс !дс стд д*с аад дас 532
- 65 027887
ЬУЗ 5ег ТЬг зег сТу с1у тЬг 155 А1а А1а геи С1у суз 160 геи УаТ 165 ьуз АЗР
гас ггс ссс даа сед дгд УаТ асд дгд УаТ гсд гдд аас гса ддс сТу дсс егд асе 580
туг рЬе РГО С1и РГО тЬг зег тгр АЗП зег А1а геи тЬг
170 175 180
аде ддс сТу дгд УаТ сас асе ггс сед дег дгс сга сад гее гса дда сТу сгс гас 628
зег Нт 5 ТЬг рЬе РГО А1а Уа1 геи С1п зег Зег геи туг
185 190 195
гее сгс аде аде дгд УаТ дед УаТ асе дгд уаТ ссс гее аде аде ггд ддс сТу асе сад 676
Зег геи зег Зег тЬг рго зег зег зег геи тЬг с!п
200 205 210 215
асе гас агс где аас дгд УаТ ааг сас аад ссс аде аас асе аад дгд УаТ дас 724
тЬг ту Г 11 е Суз Азп Азп НТ 5 ьуз РГО Зег АЗП тЬг ьуз Азр
220 225 230
аад ада дгг дад ссс ааа гсг гдг дас ааа асг сас аса где сса сед 772
ЬУЗ Агд уа! с1и Рго ьуз Зег суз Азр гуз ТКг нт 5 тЬг Суз РГО РГО
235 240 245
где сса дса ссг даа сгс егд ддд сТу дда сед гса дгс ггс сгс ггс ссс 820
Суз РГО А1а РГО С1и геи геи сТу рго Зег Уа1 РЬе геи РЬе РГО
250 255 260
сса ааа ссс аад дас асе сгс агд агс гее едд асе ссг дад дгс аса 868
Рго ьуз РГО ьуз Азр ТЬГ геи мег Пе зег Агд тЬг рго с1и Уа1 тЬг
265 270 275
где Суз дгд дгд УаТ УаТ дгд УаТ дас Азр дгд УаТ аде Зег сас НТЗ даа с!и дас Азр ссг рго дад С1и дгс Уа1 аад ьуз ггс рпе аас Азп 916
280 285 290 295
гдд гас дгд УаТ дас ддс сТу дед УаТ дад дгд УаТ саг ааг дсс аад аса аад сед едд 964
тгр ту Г Азр с1и нт 5 АЗП А1а ьуз тЬг ьуз Рго Агд
300 305 310
дад дад сад гас аас аде асд гас едг дгд УаТ дгс аде дгс сгс асе дгс 1012
с!и с1и с1п ту Г АЗП зег тЬг ту г Агд Уа1 зег Уа1 геи тЬг Уа1
315 320 325
егд сас сад дас гдд егд ааг ддс аад дад гас аад где аад дгс гее 1060
геи НТ 5 с!п Азр тгр геи Азп сТу ьуз с!и туг ьуз суз ьуз уа! 5ег
330 335 340
аас ааа дсс сгс сса дсс ссс агс дад ааа асе агс гее ааа дсс ааа 1108
А5П ьуз А1а геи РГО А1а Рго Пе с!и ьуз тЬг Пе Зег ЬУЗ А1а ьуз
345 350 355
ддд сад ссс еда даа сса сад дгд УаТ гас асе егд ссс сса гее едд дад 1156
сТу С1п рго Агд С1и рго С1п ту Г тЬг геи Рго рго Зег Агд С1и
360 365 370 375
дад агд асе аад аас сад дгс аде егд асе где егд дгс ааа ддс ггс 1204
с!и Мег ТЬг ьуз АЗП С1п Уа1 Зег геи тЬг суз геи Уа1 ьуз сТу рЬе
380 385 390
гаг ссс аде дас агс дсс дгд уаТ дад гдд дад аде ааг ддд сТу сад сед дад 1252
ту Г РГО Зег Азр Пе А1а С1и тгр С1и Зег А5П С1п РГО с!и
395 400 405
аас аас гас аад асе асд ссг ссс дгд УаТ егд дас гее дас ддс гее ггс 1300
АЗП АЗП Туг ьуз тЬг тЬг РГО рго геи Азр зег АЗр сТу зег рЬе
410 415 420
ггс сгс гаг аде аад сгс асе дгд дас аад аде адд гдд сад сад ддд 1348
РЬе теи 425 туг Зег ьуз ьеи тЬг 430 УаТ Азр ьуз Зег Агд 435 тгр СТп СТп СТу
аас дтс «с тса *дс ГСС дьд агд саг дад дег егд сас аас сас гас
АЗП УаТ РЬе Зег Су5 зег УаТ мег НТ 5 сТи АТа ьеи НТ 5 АЗП НТ 5 Туг
440 445 450 455
асд сад аад аде сгс ГСС егд ГСС ссд ддг ааа гда
ТЬг СТп ьуз зег Теи зег Теи Зег РГО СТу Ьуз *
460 465
<210> 4 <211> 466 <212> РКТ <213> Ното зартепз <22О>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(466) <223> На22-2(2,4)6.1 тяжелая цепь <400> 4
мег СТи теи сТу теи суз тгр УаТ РЬе теи УаТ АТа 1Те теи сТи СТу
1 5 10 15
уа! СТп Суз сТи УаТ СТп теи УаТ СТ и зег СТу СТу СТу теи УаТ СТп
20 25 30
РГО СТу СТ у зс зег Теи Агд теи Зег да Суз АТа АТа Зег СТу РЬе ТЬг РЬе
зег 5ег 0 э туг АЗП мет АЗП Тгр УаТ Агд СТп АТа РГО сТу ьуз СТу теи
50 55 60
СТи Тгр УаТ зег туг 1Те Зег Зег зег зег 5ег тЬг Пе туг Туг АТа
65 70 75 80
Азр зег УаТ туз сТу Агд РЬе ТЬг Пе зег Агд Азр АЗП АТа ьуз Азп
85 90 95
Зег теи Зег теи бТп мет Азп зег Теи Агд Азр сТи Азр тЬг АТа УаТ
100 105 110
Туг туг Суз АТа Агд АТа Туг Туг туг СТу мег Азр УаТ тгр СТу СТп
115 120 125
СТу тЬг ТЬг УаТ ТЬг УаТ Зег Зег АТа зег тЬг ьуз СТу Рго Зег УаТ
130 135 140
РЬе РГО Теи АТа РГО зег зег ЬУЗ зег тЬг Зег СТу СТу тЬг АТа АТа
145 150 155 160
ьеи с1у Суз Теи УаТ 1 ьуз Азр Туг РЬе РГО 1 7П сТи РГО УаТ тЬг УаТ 17<; Зег
тгр АЗП Зег СТу 1 ЯП хоэ АТа теи ТЬг 5ег СТу ιος х/ и УаТ Нтз ТЬг РЬе Рго 1 ОП X * о АТа УаТ
теи с) η Зег Д-Ον Зег СТу теи Туг зег Хо Э теи зег зег УаТ УаТ ТЬг УаТ РГО
195 200 205
Зег зег Зег Теи СТу ТЬг СТп ТЬг туг 1Те Суз АЗП УаТ АЗП НТ 5 ьуз
210 215 220
РГО зег Азп ТЬг ьуз УаТ Азр ЬУЗ Агд УаТ СТи РГО Ьуз Зег Суз Азр
225 230 235 240
ьуз тЬг Нт 5 ТЬг Суз Рго РГО Суз РГО АТа Рго сТи Теи теи СТу СТу
245 250 255
РГО зег УаТ РЬе теи РЬе РГО РГО ьуз РГО ьуз Азр ТЬг Теи Мет Пе
260 265 270
Зег Агд ТЬг РГО сТи УаТ ТЬг Суз УаТ УаТ УаТ Азр УаТ 5ег нтз сТи
275 280 285
А5р Рго 9ОП сТи УаТ ьуз РЬе АЗП Тгр Туг УаТ А5р СТу 300 УаТ СТ и УаТ Нт 5
А5П АТа ьуз тЬг ьуз РГО СзЗ Агд сТи СТ и СТп Туг АЗП Зег ТЬг Туг Агд
305 310 315 сТу 320
УаТ УаТ 5ег УаТ теи ТЬг УаТ Теи НТ 5 СТп Азр тгр теи Азп ьуз
325 330 335
СТи туг ьуз суз туз УаТ зег Азп туз АТа теи РГО АТа Рго Пе СТ и
340 345 350
ьуз ТЬг 1Те зег туз АТа ьуз СТу СТп РГО Агд сТи Рго СТп УаТ Туг
- 67 027887
355 360 365
ТЬг ьеи РГО Рго Бег Агд б!и б!и мес ТЬг ьуз АЗП б!п Уа1 Бег ьеи
370 375 380
тЬг Суз ьеи Уа! Ьуз б1у РЬе Туг РГО Бег АЗр Пе А1а Уа! С1и тгр
385 390 395 400
б1и зег АЗП б!у 6ΐη РГО б1и АЗП АЗП туг ьуз ТЬг ТЬг РГО Рго Уа1
405 410 415
ьеи АЗр Бег Азр б1у Бег РЬе РЬе ьеи туг Бег ьуз ьеи ТЬг Уа1 Азр
420 425 430
1_У5 Бег Агд тгр 6ΐη с1п б1у АЗП Уа1 РЬе Бег Суз Бег Уа! мес НТ 5
435 440 445
б!и А1а ьеи НТ 5 АЗП нтз Туг ТЬг б!п ьуз Бег ьеи Бег ьеи Бег РГО
450 455 460
С1у 1_у5 465 <210> 5 <211> 735 <212> ΡΝΑ <213> ното зартепз <220>
<221> СРБ <222> (25)...(735) <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(735) <223> На22-2(2,4)6.1 легка цепь <400> 5 адСсадассс адссаддаса саде асд дас асд адд дсс ссс дсс сад ссс 51 мес Азр мес Агд Уа1 рго А1а б!п ьеи .
сед ьеи 10 ддд ссс сед сед 1 ссс едд ссс сса 5 ддс ссс ада сдс дас Азр асе Пе сад 61 п 25
С1у ьеи ьеи ьеи Ьеи Тгр 15 РЬе РГО СТу Бег 20 Агд Суз
асд асе сад ссс сса ссс Ссс дед Уа! ссс дса Ссс дсс дда б1у дас ада дсс
Мес ТЬг б!п Бег Рго Бег Бег Бег А1а Бег Уа! Азр Агд Уа1
30 35 40
асе асе асе сдс едд дед аде сад дд* 61у асе аде ддс едд сса дсс *дд
ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Бег б1п Пе Бег 61у тгр ьеи а! а тгр
45 50 55
сас сад сад ааа сса ддд с ι у ааа дсс ссс аад ссс сед асе сас дсс дса
Туг С1п 61 п ьуз РГО ьуз А1а РГО ьуз РЬе ьеи Пе туг А1а А1а
60 65 70
ссс асе «д саа аде ддд 61 у д*с сса сса адд ссс аде ддс б1у аде дда С1у ссс
Бег тЬг Ьеи б1п Бег Уа! Рго Бег Агд РЬе Бег Бег Бег
75 80 85
ддд аса дас ССс асе ссс асе асе аде аде с*д сад ссс даа дас ССС
б1у ТЬг Азр РЬе тЬг ьеи ТЬг Не Бег Бег ьеи с!п РГО б!и Азр рЬе
90 95 100 105
дса асе сас сас сдс саа сад дсс аас аде ссс ссс ссс асе ссс ддс 61 у
А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п б1п а! а АЗП Бег РЬе РГО РГО ТЬг РЬе
110 115 120
дда сТу ддд асе аад дед Уа! дад асе ааа еда асе дед Уа! дсс дса сса ссс дсс
С1у ТЬг ьуз б!и 11 е ьуз Агд тЬг А1а А1а РГО Бег уа!
125 130 135
ттс
РЬе д«
Уа1 гдд тгр
170 аса тЬг асд
ТЬг дтс уа!
атс ТТс ссд сса тст дат дад сад ттд ааа тст дда аст тЬг дсс А1а тст Зег 483
Не РЬе Рго 140 Рго Зег Азр 61 и 145 61η Теи ьуз Зег С1у 150
дтд Уа1 где стд стд аат аас ттс тат ссс ада дад дсс ааа дта сад 531
Суз ьеи ьеи АЗП АЗП РЬе туг Рго Агд б!и А1а ьуз Уа1 б!п
155 160 165
аад д*д Уа1 дат аас дсс СТС саа тсд ддт аас ТСС сад дад адт дтс 579
ьуз Азр АЗП А1а теи с1п зег б!у АЗП зег С1п б1и зег Уа1
175 180 185
дад сад дас аде аад дас аде асе тас аде СТС аде аде асе стд 627
б1и 6ΐη Азр Зег ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег теи Зег Зег тЬг Теи
190 195 200
сгд аде ааа дса дас тас дад ааа сас ааа дтс тас дсс где даа 675
ьеи зег ьуз А1а Азр Туг б!и туз нтз ьуз Уа1 туг А1а суз б!и
205 210 215
асе саг сад ддс с Ту стд аде тсд ссс дтс аса аад аде ттс аас адд 723
тЬг НТ 5 С1п ьеи зег зег РГО Уа1 тЬг ьуз зег РЬе АЗП Агд
220 225 230
дда дад тдт тад 735 б!у б1и суз *
235 <210> 6 <211> 236 <212> РКТ <213> Ното Бартелз <22О>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(236) <223> На22-2(2,4)б.1 легкая цепь <400> 6
Мет Азр мет Агд Уа1 РГО А1а 6ΐη Теи теи б!у теи Теи теи Теи тгр
1 5 10 15
Р1те Рго С1у Зег Агд суз Азр 11е 61 η мет ТЬг 6ΐη Зег Рго Зег зег
20 25 30
Уа1 зег А1а Зег Уа1 б!у Азр Агд Уа1 тЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег
35 40 45
6ΐη С1у Не Зег б!у тгр теи А1а тгр туг 61 η 61 η Туз Рго б1у ьуз
50 55 60
А1а РГО Ьуз РЬе Теи Не Туг А1а А1а Зег ТЬг теи 6ΐη Зег б1у Уа1
65 70 75 80
РГО Зег Агд РЬе Зег с!у Зег б1у Зег б1у ТЬг Азр РЬе ТЬг теи ТЬг
85 90 95
11 е Зег Зег Теи С1п РГО б1и Азр РЬе А1а ТЬг туг туг Суз б1п б1п
100 105 110
А1а Азп Зег РЬе РГО РГО ТЬг РЬе С1у б!у б!у ТЬг ьуз Уа1 б!и 11е
115 120 125
ьуз Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго 5ег Уа1 РЬе 11е РЬе рго рго Зег Азр
130 135 140
б1и б1п Теи ЬУЗ 5ег с1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз теи теи АЗП АЗП
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд б1и А1а ЬУЗ Уа1 С1п Тгр ТУЗ Уа1 Азр АЗП А1а теи
165 170 175
б1п Зег б!у АЗП зег б!п б1и Зег Уа1 тЬг б1и б1п Азр Зег ЬУЗ А5р
180 185 190
Зег ТЬг Туг 5ег теи зег Зег ТЬг теи тЬг теи зег ьуз А1а А5р Туг
195 200 205
б!и ьуз НТ 5 ьуз Уа1 туг А1а Суз б!и уа! ТЬг Нт 5 61 η б!у теи Зег
210 215 220
5ег Рго Уа! тКг ьуз Зег РКе Азп Агд б!у б1и Суз 225 230 235 <210> 7 <211> 466 <212> РРТ <213> Ното зартепз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(466) <223> На22-2(2,4)6.1 тяжелая цепь <400> 7
Мег 61 и ьеи б!у ьеи Суз Тгр Уа1 РКе ьеи Уа1 А1а Пе ьеи б!и 61 у
1 5 10 15
Уа1 б!п Суз б!и Уа1 б!п Ьеи Уа1 б!и зег б1у б!у б!у ьеи Уа! б1п
20 25 30
Рго б1у б1у зег ьеи Агд Ьеи зег суз А1а А1а зег б1у РКе тКг РКе
35 40 45
Зег Зег Туг АЗП мес Азп Тгр Уа1 Агд 61 п А1а РГО б1у ьуз б1у ьеи
50 55 60
б1и тгр Уа1 5ег туг Пе 5ег Зег зег зег Зег ТКг Пе туг Туг А1а
65 70 75 80
Азр зег Уа1 ьуз 61 у Агд рКе тКг Пе Зег Агд Азр АЗП А1а Ьуз А5П
85 90 95
Зег ьеи зег ьеи 61 η Мес АЗП зег ьеи Агд Азр б1и Азр тКг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг суз А1а Агд А1а туг туг Туг 61 у Мес Азр Уа1 Тгр 61 у 61 п
115 120 125
б!у тКг тКг Уа! ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТКг ьуз б1у Рго Зег Уа1
130 135 140
РКе РГО ьеи А1а Рго зег 5ег ьуз Зег ТНг 5ег б1у б!у тКг А1а А1а
145 150 155 160
ьеи б!у суз ьеи Уа! ьуз Азр туг РКе РГО б1и Рго Уа1 тКг Уа1 5ег
165 170 175
тгр АЗП Зег 61 у А1а ьеи тКг зег б!у Уа! Нтз ТКг РКе Рго А1а Уа1
180 185 190
|_еи б1п зег Зег б!у ьеи туг Зег Ьеи зег зег Уа1 Уа1 ТКг Уа! РГО
195 200 205
зег Зег Зег ьеи б!у тНг б1п ТКг туг Пе Суз Азп Уа1 АЗП нт 5 ьуз
210 215 220
рго зег Азп ТЬг ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 б1и Рго ьуз зег суз Азр
225 230 235 240
1-У5 тКг Нтз ТЬг суз РГО РГО Суз РГО А1а Рго 61 и Ьеи ьеи б!у б1у
245 250 255
Рго зег Уа1 РКе ьеи рКе РГО Рго ьуз РГО ьуз Азр тКг ьеи мес 11 е
260 265 270
Зег Агд ТНг Рго б!и Уа1 ТКг суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 зег нт 5 б!и
275 280 285
Азр РГО 61 и Уа! ьуз РКе Азп тгр туг Уа1 Азр 61 у Уа1 б1и уа! Нт 5
290 295 300
А5П А1а 1-У5 ТНг ьуз РГО Агд б1и б1и б1п Туг АЗП Зег тКг туг Агд
305 310 315 320
Уа1 Уа1 Зег Уа1 ьеи тКг Уа! Ьеи НТ 5 б1п Азр тгр Ьеи Азп б!у ьуз
325 330 335
61 и туг Ьуз суз ьуз Уа! Зег Азп ьуз А1а Ьеи РГО А1а Рго 11 е 61 и
340 345 350
цуз ТКг 11 е зег ьуз А1а Ьуз б!у б!п РГО Агд б!и Рго б!п Уа1 Туг
355 360 365
ТНг Ьеи РГО РГО Зег Агд б!и б!и мес ТКг ьуз АЗП б1п Уа1 Зег Ьеи
370 375 380
ТНг суз ьеи Уа1 ьуз б!у РКе туг РГО Зег Азр Пе А1а уа! 61 и Тгр
385 390 395 400
61 и Зег АЗП 61 у 61 п Рго б1и АЗП Азп Туг Ьуз ТКг тКг РГО РГО Уа!
405 410 415
ьеи Азр зег Азр 61 у Зег РКе РКе ьеи туг Зег ьуз ьеи ТКг Уа! Азр
- 70 027887
465
420 425 430
5ег Агд Тгр с1п С1п С1у АЗП Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 мет ΗΪ 5
435 440 445
А1а ьеи Н15 АЗП Н15 туг ТНг С1п ьуз Зег теи Зег ьеи Зег РГО
450 455 460
1-У5
<210> 8 <211> 236 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(236) <223> На22-2(2,4)6.1 легкая цепь <400> 8
мет Азр мет Агд Уа1 Рго А1а С1п теи теи С1у теи теи теи Теи тгр
1 5 10 15
РНе РГО С1у Зег Агд Суз Азр Пе с!п мет тНг С1п зег Рго зег Зег
20 25 30
Уа) Зег А1а Зег Уа1 с!у Азр Агд Уа1 тНг Пе тНг суз Агд А1а зег
35 40 45
б1п С1у Не Зег С1у тгр Теи А1а тгр туг с1п с!п туз РГО с1у туз
50 55 60
А1а РГО туз РНе теи Пе Туг А1а А1а 5ег ТНг теи с1п Зег с!у Уа1
65 70 75 80
РГО зег Агд РНе зег яс с1у Зег С1у Зег с1у ОП ТНг Азр РНе тНг теи тНг
11 е Зег Зег Ьеи С1п РГО С1и Азр РНе А1а ТНг туг туг Суз с!п С1п
100 105 110
А1а АЗП Зег РНе РГО рго ТНг РНе С1у С1у С1у тНг туз Уа1 С1и Пе
115 120 125
Ту5 Агд ТНг Уа1 А1а А1а РГО зег Уа1 РНе Пе РНе РГО Рго Зег Азр
130 135 140
с1и С1п Ьеи ьуз зег С1у тНг А1а зег Уа1 Уа1 Суз теи теи АЗП АЗП
145 150 155 160
РНе туг РГО Агд С1и ΐ βς А1а цуз уа! с!п тгр 1 7Ω Туз Уа1 Азр Азп А1а 1 73 Теи
С1п зег С1у А5П Зег С1п С1и 5ег Уа1 X/ V тНг С1и с!п Азр Зег х/ и туз Азр
180 185 190
5ег ТНг Туг зег ьеи зег Зег тНг теи тНг теи Зег туз А1а Азр туг
195 200 205
С1и туз ΗΪ 5 ьуз Уа1 туг А1а Суз С1и Уа1 ТНг НТ 5 С1п С1у теи зег
210 215 220
зег РГО Уа1 тНг ЬУ5 Зег РНе Азп Агд С1у С1и Суз
225 230 235
<210> 9 <211> 98 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(98) <223> Человеческий 1д зародышевой линии УНЗ-48 <400> 9
б1и Уа1 с1п теи Уа1 С1и Зег С1у С1у с1у Теи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
зег теи Агд теи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе тНг РНе 5ег зег туг
20 25 30
Зег мет Азп тгр Уа1 Агд С1п А1а РГО С1у Туз с!у теи С1и тгр уа!
35 40 45
Зег туг Пе зег 5ег 5ег 5ег Зег ТНг Пе Туг Туг АТа Азр зег УаТ
50 55 60
ьуз СТу Агд РНе тНг 11е Зег Агд А5р АЗП А1а ьуз АЗП 5ег ьей туг
65 70 75 80
ьей СТп мет АЗП 5ег ьеч Агд Азр СТч Азр ТНг АТа УаТ туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд
<210> 10 <211> 96 <212> РИТ <213> Ното зартепз
<22О> <221> дегтТтпе
<222> (1)...(96)
<223> человеческий 1д зародышевой линии Ь5
<400> 10 Азр 1Те СТ η мет тНг СТп зег Рго Зег Зег УаТ зег АТа Зег УаТ СТу
1 5 10 15
Азр Агд УаТ тНг 1Те ТНг СУ5 Агд АТа Зег СТп СТу Пе Зег Зег тгр
20 25 30
|_еи АТа тгр туг сТп СТп ьуз РГО СТу ьуз АТа РГО ьуз ьей ьей Пе
35 40 45
Туг АТа АТа Зег зег ьей СТп Зег СТу УаТ Рго зег Агд РНе Зег СТу
50 55 60
зег СТу Зег СТу ТНг Азр РНе ТНг Ьей ТНг 1Те зег Зег Ьей СТп РГО
65 70 75 80
сТч Азр РНе АТа ТНг туг Туг Суз СТп СТп АТа АЗП Зег РНе Рго рго
90 95 <210> 11 <211> 179 <212> РИТ <213> Миз тизсиТчз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(179)
<223> ортолог 191Р4О12, содержащий область V
<400> 11
Мет Рго ьей зег ьей СТу АТа СТи Мет Тгр СТу Рго сТи АТа Тгр ьей
1 5 10 15
Агд Ьей Ьей РНе ьей АТа Зег РНе ТНг СТу СТп Туг Зег АТа СТу сТи
20 25 30
Ьей СТи ТНг зег Азр УаТ УаТ ТНг УаТ УаТ Ьей СТу СТп Азр АТа ьуз
35 40 45
Ьей Рго Су5 РНе Туг Агд СТу Азр Рго Азр сТи СТп УаТ СТу СТп УаТ
50 55 60
АТа тгр АТа Агд УаТ Азр Рго Азп сТи СТу Пе Агд сТи ьей АТа Ьей
65 70 75 80
ьей Нтз Зег ьуз туг СТу ьей нтз УаТ азп рго АТа туг сТи Азр Агд
85 90 95
УаТ СТи сТп Рго Рго Рго Рго Агд Азр Рго Ьей Азр СТу Зег УаТ Ьей
100 105 110
Ьей Агд Азп АТа УаТ СТп АТа Азр СТи СТу сТи Туг сТи Суз Агд УаТ
115 120 125
Зег ТНг РНе Рго АТа СТу зег РНе СТп АТа Агд мет Агд ьей Агд УаТ
130 135 140
Ьей УаТ Рго Рго ьей Рго Зег ьей Азп Рго СТу Рго Рго ьей СТи сТи
145 150 155 160
СТу СТп СТу ьей ТНг Ьей АТа АТа Зег Суз ТНг АТа сТи СТу зег Рго
165 170 175
А1а Рго Зег <210> 12 <211> 179 <212> РКТ <213> КаТТиз погуедтсиз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> ¢1)...(179) <223> ортолог 191Р4Р12, содержащий область V <400> 12
мет Рго геи зег Геи б1у А1а 61 и МеТ тгр б1у Рго б!и А1а тгр Геи
1 5 10 15
1_еи Геи Геи РЬе геи А1а Зег РЬе ТЬг б!у Агд Туг Зег А1а б!у б1и
20 25 30
геи б1и тЬг зег Азр геи Уа1 тЬг Уа1 Уа1 геи 61 у б!п Азр А1а гуз
35 40 45
ьеи РГО Суз РЬе Туг Агд 61 у Азр РГО Азр б!и б1п Уа1 61 у 6ΐη Уа1
50 55 60
А1а тгр А1а Агд Уа1 Азр РГО АЗП 61 и б1у ТЬг Агд б!и Геи А1а геи
65 70 75 80
геи нтз Зег гуз туг 61 у Геи НТЗ Уа1 Зег Рго А1а туг б!и АЗр Агд
85 90 95
Уа1 б!и 6ΐη Рго РГО РГО Рго Агд Азр рго геи АЗр б!у Зег 11е геи
100 105 110
ьеи Агд А5П А1а Уа1 61 η А1а Азр б!и б!у б!и туг 61 и суз Агд Уа1
115 120 125
зег ТЬг РЬе Рго А1а б!у зег РЬе б!п А1а Агд мет Агд Геи Агд Уа1
130 135 140
геи Уа1 РГО Рго геи РГО Зег геи АЗП Рго б!у Рго РГО геи б1и б1и
145 150 155 160
61 у 6ΐη 61 у Геи ТЬг геи А1а А1а Зег Суз ТЬг А1а 61 и б!у зег рго
165 170 175
А1а Рго Зег <210> 13 <211> 180 <212> РКТ <213> Ното зартепз <220>
<221> новая или редкая характеристика <222> (1)...(180) <223> ортолог 191Р4Р12, содержащий область V <400> 13
мет Рго Геи зег Геи б1у А1а б1и мет Тгр б!у РГО б!и А1а Тгр Геи
1 5 10 15
геи геи геи геи Геи геи А1а Зег РЬе ТЬг б!у Агд суз Рго А1а б1у
20 25 30
б!и Геи б1и тЬг Зег Азр Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Уа1 геи б!у 61 п АЗр А1а
35 40 45
гуз Геи сл РГО суз РЬе туг Агд сс б!у Азр Зег б!у б!и АП 6ΐη Уа1 б1у 61 п
Уа1 □и А1а тгр А1а Агд Уа1 ЭЭ Азр А1а 61 у б!и б!у А1а б1п б1и геи А1а
65 70 75 б!и 80
Геи геи нтз Зег гуз туг б1у геи Нт 5 Уа1 Зег РГО А1а Туг б!у
85 90 б1у 95 Уа1
Агд Уа1 б1и б1п РГО РГО РГО Рго Агд АЗП РГО геи Азр зег
100 105 110
геи геи Агд АЗП А1а Уа1 б1п А1а АЗр б1и б!у б!и Туг б!и суз Агд
115 120 125
Уа1 Зег тЬг РЬе Рго А1а б!у зег РЬе 6ΐη А1а Агд Геи Агд геи Агд
130 135 140 А1а б1и
Уа1 Геи Уа1 Рго РГО геи Рго зег геи Азп РГО б!у Рго геи
145 150 155 б!у 160
б1и б1у б!п б1у геи тЬг геи А1а А1а зег суз тЬг А1а б!и Зег
165 170 175
РГО А1а РГО Зег
180

Claims (28)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Анти-191Р4О12 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком 191Р4О12, содержащим аминокислотную последовательность 8Е^ ГО NΘ: 2, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков 20-136 последовательности 8Е^ ГО NΘ: 7, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков 23-130 последовательности 8Е^ ГО NΘ: 8.
  2. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, которые содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотных остатков 20-466 последовательности 8Е^ ГО NΘ: 7, и легкую цепь, состоящую из аминокислотных остатков 23-236 последовательности 8Е^ ГО NΘ: 8.
  3. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν или §сРу фрагмент.
  4. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент являются полностью человеческим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
  5. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, полученные рекомбинантным способом.
  6. 6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело производится гибридомой АТСС № РТА-11267.
  7. 7. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, связанные с монометилауристатином Е (ММАЕ) через линкер для доставки цитотоксических средств.
  8. 8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, где линкер содержит валин-цитруллин.
  9. 9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.8, где указанный конъюгат антителолекарственное средство имеет следующую структуру:
    в которой Ь-представляет собой анти-191Р4В12 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и р составляет от 1 до 8.
  10. 10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.9, в котором р равняется от 2 до 5.
  11. 11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, в котором указанный линкер является ферментативно расщепляемым линкером и указанный линкер образует связь с атомом серы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
  12. 12. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, в котором линкер имеет формулу -Ά3-№,-Υ^, где -А- представляет собой расширитель, а является 0 или 1, -№- является молекулой аминокислоты, \ν является целым числом в пределах от 0 до 12 и -Υ- представляет собой спейсерный фрагмент, у является 0, 1 или 2; где расширитель имеет структуру формулы (1), представленной ниже; молекула аминокислоты представляет собой валин-цитруллин и спейсерный фрагмент представляет собой группу РАВ, имеющую структуру формулы (2), представленной ниже:
    где расширитель образует связь с атомом серы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и спейсерный фрагмент связывают с ММАЕ посредством карбаматной группы.
  13. 13. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, содержащий от около 1 до около 10 единиц ММАЕ на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
  14. 14. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, содержащий от около 2 до около 5 единиц ММАЕ на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
    - 74 027887
  15. 15. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-14 при лечении рака, экспрессирующего белок 191Ρ4Ό12.
  16. 16. Применение по п.15, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак легкого, рак мочевого пузыря и рак молочной железы.
  17. 17. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по п.7 при лечении рака, экспрессирующего белок 191Ρ4Ό12, в комбинации с облучением или химиотерапевтическим средством.
  18. 18. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата антителолекарственное средство по любому из пп.7-14 в стандартной лекарственной форме, предназначенной для человека, для лечения рака, экспрессирующего белок 191Ρ4Ό12.
  19. 19. Применение фармацевтической композиции по п.18 при лечении рака, экспрессирующего белок 191Ρ4Ό12.
  20. 20. Применение по п.19, отличающееся тем, что рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак легкого, рак мочевого пузыря и рак молочной железы.
  21. 21. Способ лечения рака, экспрессирующего белок 191Ρ4Ό12, у субъекта, включающий введение указанному субъекту конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-14.
  22. 22. Способ по п.21, в котором субъект является человеческим субъектом.
  23. 23. Способ по п.22, где рак представляет собой рак поджелудочной железы, рак легкого, рак мочевого пузыря или рак молочной железы.
  24. 24. Способ по п.23, где рак представляет собой рак поджелудочной железы.
  25. 25. Способ по п.23, где рак представляет собой рак легких.
  26. 26. Способ по п.23, где рак представляет собой рак мочевого пузыря.
  27. 27. Способ по п.23, где рак представляет собой рак молочной железы.
  28. 28. Способ по п.22, включающий введение от около 0,5 до около 10 мг/кг конъюгата антителолекарственное средство человеческому субъекту.
EA201300411A 2010-09-29 2011-09-29 Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающиеся с белками 191p4d12 EA027887B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38793310P 2010-09-29 2010-09-29
PCT/US2011/054054 WO2012047724A1 (en) 2010-09-29 2011-09-29 Antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300411A1 EA201300411A1 (ru) 2013-11-29
EA027887B1 true EA027887B1 (ru) 2017-09-29

Family

ID=45871300

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300411A EA027887B1 (ru) 2010-09-29 2011-09-29 Конъюгаты антитело-лекарственное средство, связывающиеся с белками 191p4d12
EA201790850A EA201790850A1 (ru) 2010-09-29 2011-09-29 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc), связывающиеся с белками 191p4d12

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201790850A EA201790850A1 (ru) 2010-09-29 2011-09-29 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc), связывающиеся с белками 191p4d12

Country Status (29)

Country Link
US (8) US8637642B2 (ru)
EP (3) EP3409287B9 (ru)
JP (8) JP6083871B2 (ru)
KR (9) KR102166408B1 (ru)
CN (2) CN103402538B (ru)
AU (1) AU2011312417B2 (ru)
BR (1) BR112013007309B1 (ru)
CA (1) CA2811644C (ru)
CY (3) CY1121023T1 (ru)
DK (2) DK2621526T3 (ru)
EA (2) EA027887B1 (ru)
ES (2) ES2680624T3 (ru)
FR (1) FR22C1050I2 (ru)
HK (1) HK1256964A1 (ru)
HR (1) HRP20181154T8 (ru)
HU (3) HUE038908T2 (ru)
IL (5) IL290591B2 (ru)
LT (2) LT2621526T (ru)
MX (4) MX347954B (ru)
NL (1) NL301198I2 (ru)
NO (1) NO2022039I1 (ru)
PH (1) PH12017501461A1 (ru)
PL (2) PL2621526T3 (ru)
PT (2) PT2621526T (ru)
RS (1) RS57483B1 (ru)
SI (2) SI2621526T1 (ru)
TW (7) TWI814373B (ru)
UA (1) UA110495C2 (ru)
WO (1) WO2012047724A1 (ru)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL290591B2 (en) * 2010-09-29 2024-08-01 Seagen Inc Antibody drug preparations (ADC) that bind to 191P4D12 proteins
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
US20130116404A1 (en) 2011-11-08 2013-05-09 Case Western Reserve University Targeted non-invasive imaging probes of egfr expressing cells
CN104334580B (zh) 2012-02-24 2018-03-30 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 抗sez6抗体及使用方法
PE20150090A1 (es) 2012-02-24 2015-02-16 Stem Centrx Inc Moduladores y metodos de empleo novedosos referencia cruzada a solicitudes
US8968742B2 (en) * 2012-08-23 2015-03-03 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to 158P1D7 proteins
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
CA2900764A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Stemcentrx, Inc. Novel multispecific constructs
DK2958944T3 (da) 2013-02-22 2019-06-24 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-dll3-antistof-pbd-konjugater og anvendelser deraf
PE20160209A1 (es) * 2013-08-28 2016-05-09 Stemcentrx Inc Conjugados anti-dll3 (ligando3 tipo delta) manipulados y metodos de uso
AU2014312310A1 (en) 2013-08-28 2016-04-07 Abbvie Stemcentrx Llc Novel SEZ6 modulators and methods of use
AU2014312215B2 (en) 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
AU2015218633A1 (en) 2014-02-21 2016-09-01 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
AU2015231001A1 (en) * 2014-03-21 2016-09-29 Abbvie Inc. Anti-EGFR antibodies and antibody drug conjugates
CN104212698A (zh) * 2014-10-01 2014-12-17 南京飞马食品有限公司 一种发芽糙米醋的制作方法
BR112017019062A2 (pt) 2015-03-09 2018-04-17 Agensys Inc conjugados de anticorpo-fármaco (adc) que se ligam a proteínas flt3
BR112017027690A2 (pt) * 2015-06-29 2018-10-09 Daiichi Sankyo Co Ltd “método para produção de uma composição de conjugado anticorpo-fármaco, e, composição de conjugado anticorpo-fármaco
US10675357B2 (en) 2015-09-09 2020-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to nectin-4 and uses thereof
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
EP3510047A1 (en) 2016-09-07 2019-07-17 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Anti-nkp46 antibodies and therapeutic use of same
CN110392697A (zh) * 2017-03-02 2019-10-29 国家医疗保健研究所 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
EP3635013A4 (en) * 2017-06-05 2021-02-24 Agensys, Inc. NECTIN-4 BINDING PROTEINS AND PROCESSES FOR USE
MX2020002626A (es) * 2017-09-07 2020-10-07 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas de union a nkg2d, cd16 y un antigeno asociado a tumores.
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2019183633A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Case Western Reserve Univeristy Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
WO2019183438A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Seattle Genetics, Inc. Use of antibody drug conjugates comprising tubulin disrupting agents to treat solid tumor
US11180531B2 (en) * 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
MX2021006430A (es) * 2018-12-03 2021-09-14 Agensys Inc Composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de fármaco-anticuerpo anti-191p4d12 y métodos de uso de las mismas.
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
JP2022544227A (ja) * 2019-08-13 2022-10-17 アジェンシス，インコーポレイテッド １９１ｐ４ｄ１２タンパク質に結合する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）による癌の治療方法
IL293209A (en) * 2019-11-25 2022-07-01 Agensys Inc Cancer treatment with antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins
US20230099149A1 (en) 2020-01-31 2023-03-30 Innate Pharma Treatment of cancer
JP2023514727A (ja) 2020-02-21 2023-04-07 シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用
EP4129345A4 (en) * 2020-03-25 2023-11-29 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND USE THEREOF
CN115955980A (zh) 2020-04-10 2023-04-11 思进公司 电荷可变接头
JP2023540526A (ja) 2020-09-04 2023-09-25 ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド ネクチン－４抗体およびそれの使用
CN116234564A (zh) 2020-09-16 2023-06-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗Nectin-4抗体、包含所述抗体的缀合物及其应用
AU2021344976A1 (en) * 2020-09-17 2023-04-27 Agensys, Inc. Methods for treating cancers with antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins
PE20231512A1 (es) 2020-10-25 2023-09-26 Araris Biotech Ag Medios y metodos para producir conjugados de ligador-anticuerpo
TW202233248A (zh) 2020-11-08 2022-09-01 美商西健公司 組合療法
KR102408221B1 (ko) * 2020-11-10 2022-06-13 삼성메카닉스 (주) 그리드 커플링 성형장치
AU2021387795A1 (en) 2020-11-25 2023-06-01 Innate Pharma Treatment of cancer
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
KR20230158005A (ko) 2021-03-18 2023-11-17 씨젠 인크. 생물학적 활성 화합물의 내재화된 접합체로부터의 선택적 약물 방출
EP4086284A1 (en) 2021-05-07 2022-11-09 Emergence Therapeutics AG Anti-nectin-4 antibody exatecan conjugates
EP4314057A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Emergence Therapeutics AG Anti-nectin-4 antibody exatecan conjugates
TW202304524A (zh) 2021-04-10 2023-02-01 美商普方生物製藥美國公司 Folr1結合劑、其結合物及使用方法
TW202308699A (zh) 2021-04-23 2023-03-01 美商普方生物製藥美國公司 Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
BR112023022098A2 (pt) 2021-04-26 2023-12-19 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-nectina-4 e conjugado anticorpo-fármaco anti-nectina-4 e uso medicinal dos mesmos
AU2022283467A1 (en) 2021-05-28 2023-12-07 Seagen Inc. Anthracycline antibody conjugates
CA3223690A1 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Christopher CAROSINO Methods for treating non-muscle invasive bladder cancer (nmibc) with antibody drug conjugates (adc) that bind to 191p4d12 proteins
EP4429654A1 (en) 2021-11-09 2024-09-18 Case Western Reserve University Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
EP4433096A1 (en) 2021-11-19 2024-09-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
US20230381321A1 (en) 2022-03-17 2023-11-30 Seagan Inc., Camptothecin conjugates
WO2023180490A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing nectin-4
WO2023227660A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Innate Pharma Nectin-4 binding agents
WO2023235754A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating urothelial carcinoma
EP4285935A1 (en) 2022-06-03 2023-12-06 Emergence Therapeutics AG Novel anti-nectin-4 antibody camptothecin derivative conjugates
EP4309676A1 (en) 2022-07-22 2024-01-24 Emergence Therapeutics AG Novel anti-nectin-4 antibody camptothecin derivative conjugates
EP4324849A1 (en) 2022-08-18 2024-02-21 Emergence Therapeutics AG Humanized anti-nectin-4 antibodies
WO2024052503A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof
EP4344707A1 (en) 2022-09-29 2024-04-03 Emergence Therapeutics AG New anti-nectin-4 antibody drug conjugates
WO2024129756A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Seagen Inc. Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060275211A1 (en) * 2001-11-07 2006-12-07 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
US20090203538A1 (en) * 2006-07-10 2009-08-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Method of classifying antibody, method of identifying antigen, method of obtaining antibody or antibody set, method of constructing antibody panel and antibody or antibody set and use of the same

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
FI102355B (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Squibb Bristol Myers Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjug aattien valmistamiseksi
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP1136556B1 (en) 1991-11-25 2005-06-08 Enzon, Inc. Method of producing multivalent antigen-binding proteins
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US7625697B2 (en) 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
ATE234635T1 (de) 1995-12-22 2003-04-15 Bristol Myers Squibb Co Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
ES2290964T3 (es) 1996-10-15 2008-02-16 The Regents Of The University Of California Modelos animales de la evolucion del cancer de prostata humano.
EP0972022A2 (en) 1997-01-21 2000-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides and polypeptides encoding receptors
CA2282504A1 (en) 1997-02-25 1998-08-27 Jun-Ping Xu Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
US20030065156A1 (en) 1997-12-23 2003-04-03 Williams Lewis T. Novel human genes and gene expression products I
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP4472173B2 (ja) 1998-04-15 2010-06-02 セローノ ジェネティクス インスティテュート ソシエテ アノニム ５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク（ｆｌａｐ）のゲノム配列、その多型マーカーおよび喘息の検出方法
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6264949B1 (en) 1998-09-29 2001-07-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Noninvasive agents for diagnosis and prognosis of the progression of fibrosis
US20020137160A1 (en) 1998-12-17 2002-09-26 Byatt John C Nucleic acid and other molecules associated with lactation and muscle and fat deposition
US7160694B2 (en) 1999-06-14 2007-01-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding TANGO405 and functional fragments and uses thereof
EP1194549A2 (en) 1999-07-02 2002-04-10 Chiron Corporation Human genes and gene expression products
EP1074617A3 (en) 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
AU7084500A (en) 1999-09-03 2001-04-10 Human Genome Sciences, Inc. Immunoglobulin superfamily polynucleotides, polypeptides, and antibodies
WO2001018016A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
WO2001022920A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
WO2001051628A2 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20020042096A1 (en) 2000-01-31 2002-04-11 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20030013649A1 (en) 2000-01-31 2003-01-16 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055320A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001243142A1 (en) 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001060860A2 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
CN1169954C (zh) 2000-03-09 2004-10-06 上海市肿瘤研究所 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸
AU4592601A (en) 2000-03-21 2001-10-03 Millennium Predictive Medicine Novel genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001264559A1 (en) 2000-06-05 2001-12-17 Avalon Pharmaceuticals Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
IL154129A0 (en) 2000-07-28 2003-07-31 Compugen Inc Oligonucleotide library for detecting rna transcripts and splice variants that populate a transcriptome
US7175849B2 (en) 2000-10-05 2007-02-13 Immunex Corporation Nectin polypeptides
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
DE60121628T2 (de) * 2000-12-20 2007-06-21 Teijin Ltd. Verfahren zur herstellung von garn aus gemischten polyesterfasern
WO2002059377A2 (en) 2001-01-24 2002-08-01 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
US20040029114A1 (en) 2001-01-24 2004-02-12 Eos Technology, Inc. Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
US20030073144A1 (en) 2001-01-30 2003-04-17 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US7271240B2 (en) 2001-03-14 2007-09-18 Agensys, Inc. 125P5C8: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
AU2002338431A1 (en) 2001-04-04 2002-11-05 Quark Biotech, Inc. Sequence characteristics of bladder cancer
CA2444691A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6794501B2 (en) 2001-05-04 2004-09-21 Ludwig Institute For Cancer Research Colon cancer antigen panel
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
AU2002310256A1 (en) 2001-06-05 2002-12-16 Exelixis Inc. Ppp2cs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2002102235A2 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7171311B2 (en) 2001-06-18 2007-01-30 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of assigning treatment to breast cancer patients
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
US20030099974A1 (en) 2001-07-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2003008443A2 (en) 2001-07-19 2003-01-30 Nymox Corporation Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
ATE516042T1 (de) 2001-09-18 2011-07-15 Genentech Inc Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung und diagnose von tumoren
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
WO2003106635A2 (en) 2002-06-13 2003-12-24 Regulome Corp Functional sites
HUE027549T2 (hu) 2002-07-31 2016-10-28 Seattle Genetics Inc Hatóanyagot tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk rák, autoimmun betegség vagy fertõzéses betegség kezelésére
AU2008202217B2 (en) * 2002-08-16 2012-07-26 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 191PAD12(b) useful in treatment and detection of cancer
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
JP2006514541A (ja) 2002-08-29 2006-05-11 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 酸化的に安定な脂質供給システムを形成するためのエマルジョン界面エンジニアリングの利用
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
DK2489364T3 (en) 2003-11-06 2015-03-02 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds conjugated to antibodies
CA2560919A1 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Pfizer Products Inc. Uses of anti-ctla-4 antibodies
US20080268476A1 (en) 2004-05-12 2008-10-30 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Nectin 4 (N4) as a Marker for Cancer Prognosis
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN101500590A (zh) * 2005-03-31 2009-08-05 阿根西斯公司 与161p2f10b蛋白结合的抗体和相关分子
EP1863848A4 (en) 2005-03-31 2009-09-23 Agensys Inc CORRESPONDING ANTIBODIES AND MOLECULES THAT ATTACH PROTEINS 161P2F10B
PT2061814E (pt) 2006-10-27 2012-09-10 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados e suas utilizações
JP5394246B2 (ja) 2007-03-30 2014-01-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートとこれらの使用方法
KR101641345B1 (ko) * 2007-10-12 2016-07-20 시애틀 지네틱스, 인크. 항체-약물 접합체를 이용한 병용 요법
IL290591B2 (en) 2010-09-29 2024-08-01 Seagen Inc Antibody drug preparations (ADC) that bind to 191P4D12 proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060275211A1 (en) * 2001-11-07 2006-12-07 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
US20090203538A1 (en) * 2006-07-10 2009-08-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Method of classifying antibody, method of identifying antigen, method of obtaining antibody or antibody set, method of constructing antibody panel and antibody or antibody set and use of the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR102504750B1 (ko) 2023-03-02
JP2017110002A (ja) 2017-06-22
MX2019013655A (es) 2020-01-21
HRP20181154T8 (hr) 2018-12-14
ES2680624T3 (es) 2018-09-10
CY1124166T1 (el) 2022-05-27
EP2621526B1 (en) 2018-06-06
TWI674112B (zh) 2019-10-11
MX347954B (es) 2017-05-19
TWI720377B (zh) 2021-03-01
NO2022039I1 (no) 2022-09-29
US20150306245A1 (en) 2015-10-29
PL3409287T3 (pl) 2021-09-27
CY2022029I1 (el) 2023-01-05
US20180296693A1 (en) 2018-10-18
EA201300411A1 (ru) 2013-11-29
EP3903812A1 (en) 2021-11-03
HUE038908T2 (hu) 2018-12-28
EP3409287A1 (en) 2018-12-05
KR102595129B1 (ko) 2023-10-31
USRE48389E1 (en) 2021-01-12
SI3409287T1 (sl) 2021-08-31
TW202106337A (zh) 2021-02-16
SI2621526T1 (sl) 2018-11-30
DK3409287T3 (da) 2021-07-05
FR22C1050I2 (fr) 2024-04-05
AU2011312417B2 (en) 2015-08-20
IL311145A (en) 2024-04-01
NL301198I1 (ru) 2022-10-05
PT3409287T (pt) 2021-05-27
KR20210109656A (ko) 2021-09-06
EP2621526A1 (en) 2013-08-07
US20230346968A1 (en) 2023-11-02
MX369679B (es) 2019-11-15
ES2874306T3 (es) 2021-11-04
KR20190019211A (ko) 2019-02-26
EP3409287B1 (en) 2021-04-07
BR112013007309B1 (pt) 2021-07-06
IL225460B (en) 2018-10-31
US20120078028A1 (en) 2012-03-29
US11559582B2 (en) 2023-01-24
US9962454B2 (en) 2018-05-08
CN105567717B (zh) 2019-10-29
PH12017501461A1 (en) 2019-10-28
UA110495C2 (ru) 2016-01-12
FR22C1050I1 (fr) 2022-12-09
US20160263243A1 (en) 2016-09-15
TWI764324B (zh) 2022-05-11
IL290591B2 (en) 2024-08-01
TW201642908A (zh) 2016-12-16
KR20240013851A (ko) 2024-01-30
TW201934144A (zh) 2019-09-01
KR101851746B1 (ko) 2018-04-24
US9078931B2 (en) 2015-07-14
KR20200119895A (ko) 2020-10-20
IL290591B1 (en) 2024-04-01
LTPA2022012I1 (ru) 2022-10-25
WO2012047724A4 (en) 2012-07-05
WO2012047724A1 (en) 2012-04-12
TW201818968A (zh) 2018-06-01
KR20220012413A (ko) 2022-02-03
PT2621526T (pt) 2018-08-02
KR102295534B1 (ko) 2021-08-30
MX2013003419A (es) 2014-04-14
CA2811644C (en) 2022-07-12
EP2621526A4 (en) 2014-06-04
HUS2200043I1 (hu) 2022-10-28
DK3409287T5 (da) 2021-08-23
CN105567717A (zh) 2016-05-11
HUE054855T2 (hu) 2021-10-28
KR20230128131A (ko) 2023-09-01
DK2621526T3 (en) 2018-08-06
JP6726258B2 (ja) 2020-07-22
US20210283268A1 (en) 2021-09-16
IL262073A (en) 2019-02-28
JP7042872B2 (ja) 2022-03-28
TW201216987A (en) 2012-05-01
TW202300174A (zh) 2023-01-01
HK1256964A1 (zh) 2019-10-04
JP7370405B2 (ja) 2023-10-27
CA2811644A1 (en) 2012-04-12
CN103402538A (zh) 2013-11-20
TWI651096B (zh) 2019-02-21
KR20130130709A (ko) 2013-12-02
JP2019055958A (ja) 2019-04-11
KR20170124617A (ko) 2017-11-10
KR20230031999A (ko) 2023-03-07
US8637642B2 (en) 2014-01-28
TWI814373B (zh) 2023-09-01
IL278696B (en) 2022-03-01
IL290591A (ru) 2024-04-01
JP2013543498A (ja) 2013-12-05
MX337873B (es) 2016-03-23
BR112013007309A2 (pt) 2016-07-05
JP2019031563A (ja) 2019-02-28
JP2022075818A (ja) 2022-05-18
AU2011312417A1 (en) 2013-05-02
CN103402538B (zh) 2015-10-07
RS57483B1 (sr) 2018-10-31
JP6083871B2 (ja) 2017-02-22
JP2019031565A (ja) 2019-02-28
KR102353283B1 (ko) 2022-01-19
US9314538B2 (en) 2016-04-19
IL262073B (en) 2020-11-30
PL2621526T3 (pl) 2018-11-30
TWI524901B (zh) 2016-03-11
JP2020152735A (ja) 2020-09-24
HRP20181154T1 (hr) 2018-11-02
IL225460A0 (en) 2013-06-27
US10894090B2 (en) 2021-01-19
LT2621526T (lt) 2018-09-25
CY2022029I2 (el) 2023-01-27
JP2023179713A (ja) 2023-12-19
TW202344270A (zh) 2023-11-16
US20130189286A1 (en) 2013-07-25
EA201790850A1 (ru) 2017-11-30
CY1121023T1 (el) 2019-12-11
EP3409287B9 (en) 2021-07-21
NL301198I2 (nl) 2022-11-17
KR102166408B1 (ko) 2020-10-16
KR102627947B1 (ko) 2024-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7370405B2 (ja) １９１ｐ４ｄ１２タンパク質に結合する抗体薬物結合体（ａｄｃ）
TWI606063B (zh) 結合至１５８ｐ１ｄ７蛋白之抗體藥物結合物（ａｄｃ）
JP2013507968A (ja) 抗ｇｃｃ分子と関連組成物および方法
EA040277B1 (ru) Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc), связывающиеся с белками 191p4d12
EA040898B1 (ru) Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc), которые связываются с белками 158p1d7

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent