ES2290964T3

ES2290964T3 - Modelos animales de la evolucion del cancer de prostata humano.

Info

Publication number: ES2290964T3
Application number: ES97910929T
Authority: ES
Inventors: Charles L. Sawyer; Karen Klein; Owen Witte; Robert Reiter
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2017-10-15
Also published as: US6107540A; AU4818997A; DE69738077T2; WO1998016628A1; JP2001502537A; EP0953039A1; JP2009017879A; EP0953039A4; CA2271234C; ATE371721T1; DE69738077D1; CA2271234A1; EP0953039B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN RATON INMUNODEFICIENTE QUE TIENE UN HETEROINJERTO DE LA PROSTATA DEL SER HUMANO AFECTADO POR UN CANCER LOCALMENTE AVANZADO O METASTATICO DE PROSTATA, ASI COMO SUS USOS.

Description

Modelos animales de la evolución del cáncer de próstata humano.

A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a varias publicaciones entre paréntesis. Las citas completas de estas publicaciones pueden encontrarse al final de la memoria inmediatamente antes de las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es la causa más frecuente de cáncer en el hombre. En 1996, se diagnosticaron 317.000 nuevos casos de adenocarcinoma de próstata y más de 41.400 hombre murieron de la enfermedad (Karp et al., 1996). Únicamente el cáncer pulmonar presenta una mortalidad mayor. La probabilidad de un hombre de desarrollar el cáncer de próstata invasivo durante su vida es de 1 de cada 6 ó 15,4%. A la edad de 50 años, un hombre presenta una probabilidad del 42% de desarrollar el cáncer de próstata y del 2,9% de morir de la enfermedad. Aunque se han conseguido avances en el diagnóstico precoz y el tratamiento de tumores confinados localmente, el cáncer de próstata es incurable una vez que se ha metastasizado. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico en terapia hormonal desarrollarán eventualmente un estado resistente al andrógeno (independiente del andrógeno) que conducirá a la evolución de la enfermedad y a la muerte.

La causa principal de mortalidad y la mortalidad del cáncer de próstata es el resultado del crecimiento del tumor metastásico independiente del andrógeno. Como resultado, existe un gran interés en definir las bases moleculares para la enfermedad en etapa avanzada con la esperanza de que estas ideas puedan mejorar las opciones terapéuticas para estos pacientes. Sin embargo, la evolución en esta área ha sido difícil por numerosas razones. Por ejemplo, la disponibilidad del tejido de próstata para estudios moleculares está limitada porque la mayoría de los tumores de próstata son pequeños. Además, existe una heterogeneidad tremenda en las muestras de tumor de prostatectomía quirúrgica, es difícil cultivar de forma reducible los explantes de cáncer de próstata in vitro, y existen un número limitado de estirpes celulares de cáncer de próstata inmortalizadas.

Existe, por consiguiente, un interés en encontrar procedimientos alternativos que permitan el crecimiento estable del tejido de cáncer de próstata, lo que a su vez permitiría la investigación de la evolución del cáncer de próstata in vivo, proporcionaría un aporte estable de tejido de cáncer de próstata y proporcionaría un modelo de expansión metastásica del cáncer de próstata que simularía o imitaría exactamente la biología de la enfermedad.

Hay necesidad también de procedimientos más fiables y de estadificación informativa y de pronóstico en el tratamiento del cáncer de próstata avanzado. Los tumores de próstata de estadificación clínica se basan en el examen rectal para determinar si el tumor permanece dentro de los límites de la cápsula prostática (confinado localmente) o se extiende más allá (avanzado localmente) en combinación con las determinaciones de PSA en el suero y las biopsias transrectales guiadas por ultrasonidos. Sin embargo, ninguna de estas técnicas ha demostrado ser fiable para predecir la evolución de la enfermedad.

Los puntos principales de la metástasis del cáncer de próstata son los ganglios linfáticos regionales y los huesos. La metástasis ósea se produce en los puntos de médula ósea roja hematopoyéticamente activos, incluyendo la columna vertebral lumbar, costillas, pelvis, huesos largos proximales, esternón y el cráneo. La metástasis ósea del cáncer de próstata se diferencia de la de aquellos de los demás tumores que colonizan frecuentemente en el hueso y que se caracterizan por una ganancia neta en la formación de hueso (osteoblástica) más que en la reabsorción predominante en la metástasis ósea del cáncer de mama y melanoma.

Hasta recientemente, se creó que la metástasis ósea era una etapa tardía en la evolución de la enfermedad. Sin embargo, el desarrollo reciente de técnicas muy sensibles (tales como RT-PCR para los genes específicos de la próstata) para detectar las células de cáncer de próstata ha revisado esta idea. Las células de cáncer de próstata se han detectado en la sangre periférica y en la médula ósea de pacientes con la enfermedad en etapa avanzada utilizando análisis de RT-PCR para el ARNm de PSA (Ghossein et al., 1955; Seiden et al., 1994; Wood et al., 1994; Katz et al., 1994) o selección de perlas inmunomagnéticas para la proteína PSA (Brandt et al., 1996). Cuando son positivas, estas pruebas demuestran que las células del cáncer de próstata representan aproximadamente entre el 0,1 y 1,0% de las células sanguíneas en circulación. Además, es evidente actualmente que un pequeño número de células de cáncer de próstata circulan en la sangre periférica y se alojan en la médula ósea incluso en pacientes en etapa precoz, enfermedad con riesgo bajo (Olsson et al., 1997; Deguchi et al., 1997; Katz et al., 1996). Resulta interesante que estas células tiendan a desaparecer en la mayoría de los pacientes después de la prostatectomía radical (Melchior et al., 1997). Estos resultados sugieren que el punto tumoral principal es una fuente constante para sembrar la médula, y que solamente un pequeño subconjunto de estas células tiene capacidad para crecer en una lesión metastásica. Este concepto es coherente con las estimaciones en modelos animales para otros tipos de tumor que solo aproximadamente 1 en 10.000 células de cáncer circulantes son capaces de alojarse y colonizar de manera productiva otros órganos (Fidler et al., 1990).

Los factores involucrados en la evolución del cáncer de próstata avanzado hasta la metástasis ósea están poco definidos. Se cree que todos los factores anatómicos, de médula ósea local y de la célula tumoral desempeñan una función. Baston describió el sistema venoso vertebral general que consta de una red de venas longitudinales sin válvulas que corren paralelas a la columna vertebral y la forma extensa, anastomosis directa con las venas de las costillas, pelvis y cerebro (Baston, 1942). Las células de cáncer de próstata que se introducen en las venas prostáticas pueden ser transportadas mediante por este plexo directamente a estos órganos sin entrar en la vena cava inferior de paso hacia los pulmones. Este mecanismo supuesto de metástasis tanto por documentación clínica de modelos de metástasis de cáncer de próstata comparados con otros tumores y por modelos animales en los que la oclusión de la vena cava inferior durante la inyección en la vena de la cola de células de tumor aumentó la frecuencia de la metástasis vertebral (Nishijama et al., 1992; Coman y DeLong, 1951).

Aunque la anatomía vascular es un componente esencial de la extensión del cáncer de próstata al hueso, no se puede explicar completamente el modelo selectivo de toda la metástasis del esqueleto. El hueso, que representa entre el 5 y el 10% del gasto cardíaco, es un punto metastásico frecuente que sería de esperar a partir de los criterios de sangre-circulación (Berettoni y Carter, 1986). La médula ósea consta de dos componentes claramente identificables: las células hematopoyéticas que comprenden la mayoría de los elementos celulares y el componente del estroma que se forma de tejido conectivo muy vascular. Las células hematopoyéticas son transitorias en la médula ósea; durante la maduración se desplazan en el torrente circulatorio. El estroma, sin embargo, permanece y sirve como estructura sobre la que las células hematopoyéticas pueden diferenciarse y madurar. Uno de los factores importantes en las células de cáncer de próstata que se detienen en estos puntos es probablemente su adherencia al estroma de la médula ósea. Se ha demostrado tanto in vitro como in vivo que las células tumorales se adherirán preferentemente a las células del estroma de los órganos a los que provocan metástasis (Haq et al., 1992; Netland y Zetter, 1985; Zetter et al., 1992). Cuando las células de cáncer de próstata de rata (MatLyLu) se inyectan en el ventrículo izquierdo de ratas clónicas, se desarrolla metástasis en el cuerpo vertebral; estas metástasis se recogen a continuación, se disgregan y se reinyectan. Las estirpes celulares creadas después de 6 pases similares a través de animales se adhirieron fuertemente y preferentemente al estroma de la médula ósea y a las células endoteliales (Haq et al., 1992). Una estrategia similar ha aumentado la frecuencia de metástasis de la estirpe celular LNCaP del cáncer de próstata en ratones inmunodeficientes (Thalmann et al., 1994).

Resulta crítico que modelos apropiados in vivo para la metástasis ósea del cáncer de próstata se desarrollan para explorar más completamente los aspectos mecanísticos de este proceso. Hasta la fecha, la mayoría del trabajo en esta área se ha enfocado en tres estirpes celulares de cáncer de próstata humano, PC-3, DU-145 y LNCaP (Lee et al., 1993). Los tres desarrollan unos nódulos subcutáneos en ratones inmunodeficientes, y se han derivado sublíneas con propiedades metastásicas variables (Shervin et al., 1988, 1989; Wang y Sterarns, 1991; Kozlowski et al., 1988). Sin embargo, se ha demostrado que ninguna de estas sublíneas da lugar de forma reproducible a lesiones osteoblásticas típicas del cáncer de próstata. Una limitación principal de las líneas celulares DU-145 y PC-3 es la carencia del antígeno específico de la próstata (PSA) y la expresión del receptor del andrógeno (AR) (Kaighn et al., 1979; Gleave et al., 1992), que aumenta con respecto a la relevancia al cáncer de próstata clínico. La estirpe celular LNCaP es sensible al andró-
geno y expresa a PSA, pero contiene una mutación en el receptor del andrógeno que altera la especificidad del ligando.

La introducción de un xenotrasplante de cáncer de próstata humano en un ratón inmunodeficiente se describe en otra parte (Pretlow, et al., 1993; Van Weerden et al., 1996; Lubaroff et al., 1995). Sato et al. (1996) describe xenotrasplantes de cáncer de próstata humano subcutáneos en ratones SCID utilizando una estirpe celular de cáncer de próstata. Ellis et al. (1996) describe ratones (atímicos) BALB/c-nu/nu que tienen xenotrasplantes de cáncer de próstata humano de un paciente diagnosticado con una etapa de adenocarcinoma D1 de la próstata. Nagabhushan et al. (1996) describe el modelo de cáncer de próstata CWR22 en ratones lampiños. Hsieh et al. (1993) describe el desarrollo de un modelo de evolución del cáncer de próstata humano. Wu et al. (1994) demuestra que la inyección conjunta de células LNCaP con fibroblastos de hueso conduce a la evolución del cáncer de próstata in vivo. Kjonniksen et al. (1994) describe la validez y la utilidad de los modelos de tumor humano creados por inoculación intratibial de células en ratas lampiñas.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para simular la evolución del cáncer de próstata humano desde la formación de tumor primario hasta la micrometástasis en un modelo animal que comprende (a) generar un xenotrasplante de cáncer de próstata humano en un ratón SCID inmunodeficiente implantando localmente tejido de cáncer de próstata avanzado o metastásico, o una suspensión celular de éste procedente de un hombre en un ratón SCID inmunodeficiente; y (b) permitir que el xenotrasplante se desarrolle durante un tiempo suficiente que permita la detección de las células de cáncer de próstata dentro y externas al punto del implante en el ratón SCID inmunodeficiente simulando de este modo la evolución del cáncer de próstata humano desde la formación del tumor primario hasta la micrometástasis en el modelo animal.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento de simulación de la evolución de la metástasis ósea osteoblástica en el cáncer de próstata humano en un modelo de ratón que comprende (a) inyectar dentro de la cavidad de la médula ósea tibial de un ratón SCID inmunodeficiente célula de cáncer de próstata preparadas a partir de un xenotrasplante de cáncer de próstata generado implantando en un ratón SCID inmunodeficiente tejido de cáncer de próstata humano avanzado localmente o metastásico o una suspensión celular de éste; y (b) permitir a las células inyectadas desarrollarse y formar una lesión ósea osteoblástica que estimule la evolución de la metástasis ósea osteoblástica en el cáncer de próstata humano en el modelo de ratón.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un gen que minimiza la evolución del cáncer de próstata humano, que comprende las etapas de (a) introducir el gen en un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo en el presente ratón SCID inmunodeficiente, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde enfermedad sensible al andrógeno hasta independiente del andrógeno; (b) transducir las células del xenotrasplante con el gen in vivo; (c) evaluar la presencia de micrometástasis en el presente ratón SCID inmunodeficiente detectando las células de cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que se determina el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico se determina con relación a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva el xenotrasplante de próstata humano y en el que el gen no se ha introducido, por lo que el xenotrasplante del ratón de referencia no está transducido; y (d) seleccionar un gen que facilite la evolución del cáncer de próstata en el presente ratón en comparación con la evolución del cáncer en el ratón de referencia.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un gen que facilita la evolución del cáncer de próstata humano, que comprende las etapas de (a) introducir el gen a un presente ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado implantando el tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular de éste en un presente ratón SCID inmunodeficiente, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde la enfermedad sensible al andrógeno hasta independiente al andrógeno; (b) transducir las células del xenotrasplante con del gen in vivo; (c) evaluar la presencia de micrometástasis en el presente ratón SCID inmunodeficiente detectando las células del cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico se determina con relación a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva el xenotrasplante humano de próstata y en el que no se ha introducido el gen por lo que el xenotrasplante del ratón de referencia no está transducido; y d) seleccionar un gen que facilite la evolución del cáncer de próstata en el presente ratón con relación a la evolución del cáncer de próstata en el ratón de referencia.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un procedimiento para evaluar el efecto de una composición o tratamiento sobre el cáncer de próstata, que comprende (a) (a) proporcionar un ratón SCID inmunodeficiente que comprende un xenotrasplanfe de cáncer de próstata humano de tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo; (b) someter al ratón a la composición o tratamiento; y (c) determinar el efecto de la composición o tratamiento sobre el crecimiento del xenotrasplante en dicho ratón.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de un modelo de ratón híbrido de cáncer de próstata humano que comprende (a) implantar tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo de un ser humano en un primer ratón SCID inmunocomprometido en un punto que vasculariza el tejido de cáncer de próstata humano implantado; (b) determinar si el tejido de cáncer de próstata humano o la suspensión celular de éste da como resultado el modelo de ratón que simula la transición clínica desde la enfermedad dependiente del andrógeno hasta la independiente del andrógeno; y (c) seleccionar el modelo de ratón híbrido que simula la transición clínica desde la enfermedad dependiente del andrógeno hasta la independiente del andrógeno.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un ensayo para evaluar el efecto de un tratamiento de cáncer de próstata humano que comprende (a) aplicar el tratamiento a un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano subcutáneo generado implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular de éste procedente de un ser humano en el ratón SCID inmunodeficiente; (b) determinar el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del xenotrasplante en dicho ratón.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un ensayo para evaluar el efecto de un gen de interés para el cáncer de próstata humano que comprende (a) introducir el gen en un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado por el tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico implantando o una suspensión celular del mismo en el ratón SCID inmunodeficiente; (b) transducir las células del xenotrasplante con el gen in vivo; (c) evaluar la presencia de metástasis en el ratón SCID inmunodeficiente detectando las células del cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que se determina el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico con relación a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva un xenotrasplante de próstata humano generado con un subconjunto no transducido de las células del xenotrasplante.

Las formas de realización preferidas del primer al octavo aspectos están publicadas en las reivindicaciones 2 a 7, 9, 13 a 18, 20 a 23 y 26 a 29.

Los modelos procedimientos descritos en la presente memoria proporcionan un sistema para estudiar la biología molecular del cáncer de próstata, evaluando la influencia que varios genes y compuestos terapéuticos presentan en distintas etapas de la evolución de la enfermedad, evaluando el potencial metastásico de las células de cáncer de próstata, y diseñando regímenes terapéuticos específicos para el paciente.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Análisis molecular de xenotrasplantes de cáncer de próstata para contenido en ADN humano y expresión del antígeno específico de la próstata (PSA). Fig. 1A: Análisis por ADN-PCR de ADN genómico aislado de xenotrasplantes utilizando cebadores específicos para el gen de \beta-globina humana. Cada muestra presentada se obtuvo a partir de xenotrasplantes de pase tardío. La muestra LAPC-5 se obtuvo en el que 4 cuando el tumor humano se sobredesarrolló mediante un tumor de origen murino. Las dos muestras LAPC-4 se obtuvieron a partir de las sublíneas dependiente del andrógeno ("ad") e independiente del andrógeno ("ai"). Fig. 1B: análisis por RT-PCR de ARN completo utilizando cebadores específicos para PSA humano y \beta-actina humana o murina ("% de células humanas") se refiere al porcentaje de células LNCaP que se diluyen en 10^{5} células de ratón). En la parte izquierda de la figura se presenta una dilución en serie de células LNCaP de cáncer de próstata humano en células NIH 3T3 murinas, variando el porcentaje de células LNCaP desde el 100% hasta 0,0%. A la derecha se presentan los resultados de los tres xenotrasplantes de LAPC.

Fig. 2. Fotografías de análisis inmunohistoquímico del xenotrasplante de LAPC-4, que presentan la expresión de PSA. Secciones de parafina de tejido fijado con formalina procedente de la muestra de tumor original obtenida en el momento de la cirugía (fila superior) y el xenotrasplante de LAPC-4 (fila inferior) se tiñeron con hematoxilina y eosina (izquierda), un anticuerpo de referencia (en el medio) y un anticuerpo específico para PSA humano (derecha).

Fig. 3. Gráficos de barras que presentan la sensibilidad al andrógeno de los xenotrasplantes LAPC-3 y LAPC-4 in vivo. Los implantes de igual tamaño de los xenotrasplantes LAPC-3 y LAPC-4 fueron objeto de pases simultáneamente a ratones macho o hembra y se examinó semanalmente la formación de tumores.

Fig. 4. Regresión y recrecimiento de los tumores de LAPC-4 tras la castración. Fig. 4A: Línea gráfica que presenta resultados típicos de dos animales en la cohorte cuyos tamaños de tumor eran equivalentes a las 4 semanas. El transcurso del desarrollo del tumor en un ratón hembra se presenta para comparación. Fig. 4B: Gráfico de barras que presenta el tamaño medio del tumor (\pm error estándar) de la cohorte completa de ratones macho íntegros y castrados. Los datos de cada animal se expresan en tamaño del tumor en comparación con el punto de tiempo de la 4ª semana.

Fig. 5. Gráfico de líneas que presenta el análisis de dilución limitativa del injerto de LAPC-4 en ratones macho.

Fig. 6. Fotografías que presentan la detección de la enfermedad metastásica en ratones con xenotrasplantes LAPC-4. Se aisló ARN completo de los tejidos murinos indicados y analizados para la expresión de PSA (a) o \beta-actina (b) utilizando RT-PCR. Se presentan los resultados del tumor y de varios tejidos de los tres ratones representativos. Se analizaron tejidos de un cuarto ratón (SCID de referencia) como referencia negativa. La señal puede cuantificarse por comparación con LNCaP (banda 1). No se añadió ARN a la muestra de referencia negativa (banda 2).

Fig. 7. Fotografías que muestran la detección de células LAPC-4 en el hueso por inmunohistoquímica después de 2 semanas. Secciones congeladas de la tibia de ratones inyectados con células LAPC-4 se tiñeron con un anticuerpo contra citoqueratina-18 (panel inferior) o un anticuerpo de referencia del isótopo (panel superior). Las cuatro células que se tiñen de rojo son las células LAPC-4.

Fig. 8. Fotografías que demuestran que LAPC-4 produce lesiones óseas. Las secciones de hematoxilina y eosina de la tibia se presentan a las semanas 4, 6 y 8 después de la inyección intratibial de las células LAPC-4. El panel A presenta un pequeño foco de formación tumoral adyacente al hueso normal y hematopoyesis. Los paneles B y C presentan el aumento evolutivo en la formación de nuevo hueso en respuesta a las células tumorales circundantes.

Fig. 9. Pruebas radiográficas de las lesiones óseas osteoblásticas producidas por LAPC-4. Se realizaron rayos X de ratones a las 8 semanas después de la inyección de células LAPC-4 en la tibia (panel derecho). El hueso demuestra las pruebas de la erosión de la corteza cerebral con aumento de densidad ósea en la cavidad de la médula debido a la activación osteoblástica.

Fig. 10. Análisis por citometría de flujo de células LAPC-4 teñidas con anticuerpo anti-galectina-6, que presentan el nivel de expresión en comparación con un anticuerpo de referencia del isótopo.

Descripción detallada de la invención Hospedadores animales inmunodeficientes

Ratones inmunodeficientes graves combinados (SCID) son los hospedadores animales utilizados en la práctica de la invención. Pueden emplearse ratones hembra, macho, castrados o sin castrar, dependiendo de si se está interesado en estudiar el efecto de la disponibilidad de andrógenos sobre el curso del crecimiento tumoral. En las formas de realización específicas y preferidas descritas en la presente memoria, se utilizan ratones C.B. 17 scid/scid.

Modelos que simulan el cáncer de próstata avanzado

En un aspecto, los modelos de xenotrasplante murino descritos en la presente memoria simulan o parecen cáncer de próstata humano de formación tumoral primaria. Se describen también los procedimientos para preparar el tejido tumoral de próstata humana en etapa avanzada de propagación como xenotrasplantes subcutáneos en ratones SCID inmunodeficientes. En la práctica de la invención, pueden crearse xenotrasplantes de cáncer de próstata en ratones SCID inmunodeficientes mediante la implantación subcutánea de explantes de cáncer de próstata humano recientes eliminados quirúrgicamente de los pacientes con cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico. El punto de implantación puede ser en cualquier punto subcutáneo que permita que el aporte de sangre alcance el implante, tal como los costados del animal hospedador. El tejido de tumores de próstata primario así como de los puntos de ganglio linfático, pulmón, huesos y otras metástasis de órganos pueden utilizarse para crear los xenotrasplantes de cáncer de próstata utilizados en la invención. Pueden introducirse los explantes de tumor de próstata junto con una composición de membrana de base, tal como Matrigel (patente U.S. nº 5.508.188), una preparación de matriz extracelular que se ha demostrado que aumenta el crecimiento de tumores epiteliales in vivo (incluyendo las células de cáncer de próstata) (Lim et al., 1993; Noel et al., 1992; Pretlow et al., 1991), así como otros tipos similares de composiciones. Una vez creados, los tumores de xenotrasplante crecen hasta considerable tamaño, que proporcionan volúmenes de tejido sustanciales para su utilización adicional. Los xenotrasplantes utilizados en la invención conservan el fenotipo humano determinado por la expresión de \beta-globina humana, expresan el antígeno específico de la próstata humano (PSA) y conservan la sensibilidad al andrógeno y las características de crecimiento metastásico reflejo de la situación clínica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "cáncer de próstata localmente avanzado" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres de próstata que se han extendido por la cápsula prostática y significa que incluyen la enfermedad en la etapa C en el sistema de la American Urological Association (AUA), la enfermedad en la etapa C1-C2, en el sistema de Whitmore-Jewett y la enfermedad en la etapa T3-T4 y N+ en el sistema TNM (tumor, ganglio, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para los pacientes con enfermedad localmente avanzada, y estos pacientes presentan sustancialmente menos respuestas favorables en comparación con los pacientes que presentan cáncer de próstata clínicamente localizado (confinado en órganos). La enfermedad localmente avanzada está clínicamente identificada por el endurecimiento más allá del límite lateral de la próstata, o asimetría o endurecimiento por encima de la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica patológicamente después de la prostatectomía radical si el tumor invade o penetra la cápsula prostática, se extiende en el margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "cáncer de próstata metastásico" y "enfermedad metastásica" significa cánceres de próstata que se han extendido a los ganglios linfáticos de la zona o a puntos distantes, y significa que incluyen la enfermedad en la etapa D en un sistema AUA y en la etapa T\timesN\timesM+ en el sistema TNM. Como en el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía no está generalmente indicada para los pacientes con enfermedad metastásica, y la terapia hormonal (extirpación del andrógeno) es la modalidad de tratamiento preferida. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico desarrollan opcionalmente un estado resistente al andrógeno en 12 a 18 meses de iniciación del tratamiento y aproximadamente la mitad de estos pacientes muere a los 6 meses. El punto más frecuente para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis óseas del cáncer de próstata son, en equilibrio, característicamente osteoblásticas en lugar de osteolíticas (es decir, resultantes en la formación ósea pura). Las metástasis óseas se encuentran más frecuentemente en la columna vertebral, seguido por el fémur, pelvis, caja torácica, cráneo y húmero. Otros puntos frecuentes de metástasis incluyen los ganglios linfáticos, pulmones, hígado y cerebro. El cáncer de próstata metastásico es diagnosticado típicamente por linfadenectomía pélvica abierta o laparoscópica, exploraciones de radionucleicos en todo el cuerpo, radiografía del esqueleto y/o biopsia de la lesión ósea.

Éste y otros aspectos de la invención descritos en la presente memoria proporcionan herramientas para estudiar la patogénesis y el tratamiento del cáncer de próstata avanzado. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones SCID inmunodeficientes con xenotrasplantes subcutáneos (y otros) para evaluar el efecto de varios tratamientos de cáncer de próstata (p. ej., composiciones terapéuticas, terapias génicas, inmunoterapias, etc.) en el crecimiento de tumores y evolución de la enfermedad. Pueden utilizarse células de xenotrasplante para identificar nuevos genes y genes que se expresan de forma diferenciada en las células de cáncer de próstata, o para analizar el efecto que dichos genes tienen sobre la evolución del cáncer de próstata. Por ejemplo, las composiciones genéticas de las células de cáncer de próstata procedentes de xenotrasplantes con diferentes sensibilidades al andrógeno (p. ej. dependientes del andrógeno frente a independientes del andrógeno) pueden compararse entre sí así como a las composiciones genéticas de las células de próstata normales. Asimismo, las composiciones genéticas de las células de cáncer de próstata micrometastásicas pueden compararse con las células de cáncer de próstata metastásicas. Varias técnicas de sustracción de ácido nucleico y de muestreo pueden utilizarse con este objeto, incluyendo, por ejemplo, el análisis diferencial representativo (RDA). Además, las células del xenotrasplante de cáncer de próstata pueden utilizarse para la introducción de varias capacidades genéticas, incluyendo la introducción de varios genes, secuencias complementarias, ribozimas, secuencias reguladoras que aumentan o reprimen la expresión de genes endógenos y así sucesivamente.

Además, este aspecto proporciona procedimientos para purificar células de cáncer de próstata de la mezcla heterogénea de células típicas de material para biopsia de cáncer de próstata humano, proporcionando además procedimientos para generar cantidades mayores de células tumorales para la utilización y análisis ulteriores. En una forma de realización, el procedimiento de purificación de células de cáncer de próstata comprende la implantación del material para la biopsia del cáncer de próstata humano por vía subcutánea en un ratón SCID y permitir que el material implantado crezca como xenotrasplante en el ratón. Las células de cáncer de próstata humano purificadas se obtienen recogiendo el xenotrasplante. Los xenotrasplantes pueden expandirse y purificarse más por propagación en serie en ratones SCID inmunodeficientes adicionales o por propagación a corto plazo en el cultivo celular. Las suspensiones celulares individuales de tejido tumoral de xenotrasplante o las células cultivadas pueden utilizarse para sembrar ortotópicamente tumores intraprostáticos, tumores óseos u otros tumores orgánicos. El tejido tumoral del xenotrasplante y las preparaciones celulares pueden congelarse y recuperarse de manera viable para su utilización posterior.

La invención también utiliza xenotrasplantes de cáncer de próstata subcutáneo que conservan los fenotipos estables de la célula de cáncer de próstata mediante múltiples pases en ratones SCID. Se proporcionan varias formas de realización, incluyendo xenotrasplantes de pendientes del andrógeno e independientes del andrógeno, xenotrasplantes que expresan el antígeno específico de la próstata (PSA) a niveles clínicamente reflejos, xenotrasplantes que expresan el receptor del andrógeno (AR) natural y xenotrasplantes que presentan anomalías cromosómicas. Incluso otras formas de realización incluyen xenotrasplantes que conservan todas las características anteriores así como xenotrasplantes que modelan la evolución a la enfermedad independiente del andrógeno. Éstas y otras formas de realización de la invención se describen con mayor detalle mediante los ejemplos siguientes. Como se describe en el Ejemplo 1, se crearon con éxito numerosos xenotrasplantes subcutáneos a partir de explantes de tejido tumoral extraídos de la glándula prostática y la metástasis ósea, linfática y pulmonar de pacientes con cáncer de próstata en la etapa C o D. Estos xenotrasplantes crecen y son objeto de pases en ratones SCID con mucha frecuencia y conservan características definitivas del cáncer de próstata humano, incluso en pases tardíos. Se ha adaptado un xenotrasplante, denominado LAPC-4, al cultivo tisular como estirpe celular estable y ha sido en el cultivo continuo durante 18 meses.

Xenotrasplantes tales como el xenotrasplante LAPC-4 descrito en el Ejemplo 1 son de particular interés. Similar a los tumores de próstata aislados directamente de los pacientes, las células LAPC-4 conservan la expresión del antígeno específico de la próstata (PSA), receptor del andrógeno (AR) y fosfatasa ácida prostática mediante más de 20 pases. Además, el xenotrasplante LAPC-4 es exclusivo entre los sistemas de modelo de cáncer de próstata ya que su AR no contiene ninguna mutación en el ADN o en los dominios de unión al ligando y la expresión de AR se conserva en sublíneas LAPC-4 independientes del andrógeno. Además, el xenotrasplante LAPC-4 modela la transición desde la enfermedad dependiente del andrógeno hasta la independiente del andrógeno así como el desarrollo de la enfermedad micrometastásica. Por ejemplo, los tumores de LAPC-4 que han sido objeto de pases en ratones macho conservan las características de crecimiento dependientes del andrógeno, mientras que los tumores que han sido objeto de pases en ratones machos o hembras castrados adquieren un fenotipo estable independiente del andrógeno. Estas sublíneas pueden expandirse fácilmente utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria para proporcionar tejido amplio para el análisis molecular bioquímico de los casos asociados con el crecimiento independiente del andrógeno. Existen otros pocos modelos experimentales para el crecimiento del cáncer de próstata dependiente del andrógeno. Los artículos publicados incluyen la estirpe celular LNCaP ampliamente utilizada (Lim et al., 1993; Gleave et al., 1992) y dos xenotrasplantes recientemente descritos, CWR22 (Weinstein et al., 1994) y LuCaP23 (Lin et al., 1996). El xenotrasplante LAPC-4 es único porque los tumores colocados a la presión selectiva de la reproducibilidad con pérdida del andrógeno provocan un estado independiente del andrógeno, proporcionando una oportunidad para evaluar los cambios moleculares asociados a la independencia del andrógeno a lo largo del tiempo y directamente probar su importancia funcional.

Este aspecto también proporciona ensayos para determinar la función o el efecto de varios genes sobre las células de cáncer de próstata. En una forma de realización, el análisis comprende el aislamiento de células de cáncer de próstata de un xenotrasplante de cáncer de próstata (p. ej., subcutáneo, intraprostático), transduciendo las células con el gen de interés de modo que las células transducidas expresan o sobreexpresan el gen, creando un tumor de xenotrasplante subcutáneo o intraprostático en un ratón SCID con las células transducidas y evaluando el crecimiento del xenotrasplante resultante. El efecto de expresar el gen sobre el crecimiento del xenotrasplante puede determinarse por referencia a un xenotrasplante de referencia creado con células de cáncer de próstata sin traducir, preferentemente aisladas del mismo xenotrasplante paterno. En otra forma de realización, el análisis comprende generar un xenotrasplante de cáncer de próstata (p. ej., subcutáneo, intraprostático), transduciendo las células con el gen de interés in vivo, y evaluando el crecimiento del xenotrasplante, en el que el efecto del gen sobre el crecimiento del xenotrasplante puede determinarse por referencia a un xenotrasplante de referencia.

Asimismo, este aspecto proporciona análisis para determinar el efecto de las composiciones o tratamientos terapéuticos experimentales sobre el crecimiento de las células de cáncer de próstata. En una forma de realización, el análisis comprende aplicar la composición o tratamiento a un ratón SCID que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata subcutáneo humano y determinar el efecto de la composición o del tratamiento sobre el crecimiento del xenotrasplante. En otra forma de realización, se utiliza un ratón SCID que lleva un xenotrasplante intraprostático para determinar el efecto de la composición o tratamiento.

Este aspecto puede tener también varias aplicaciones clínicas, incluyendo la utilización del modelo en un procedimiento para evaluar el pronóstico de un paciente con cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico. Por ejemplo, en una forma de realización, el procedimiento comprende implantar una muestra de tumor de próstata procedente del paciente en un ratón SCID inmunocomprometido por vía subcutánea, y dejar que la muestra implantada se desarrolle en un xenotrasplante en el ratón. Las velocidades de crecimiento del xenotrasplante pueden utilizarse como indicador de pronóstico. Los resultados de dicho análisis pueden ayudar al oncólogo de tratamiento en determinar cómo tratar de forma intensiva a un paciente.

Modelos que simulan la micrometástasis del cáncer de próstata

En otro aspecto, la invención utiliza modelos y procedimientos para simular y estudiar el proceso de micrometástasis en el cáncer de próstata humano. Los ratones SCID con xenotrasplantes de cáncer de próstata subcutáneos presentan pruebas de células de cáncer de próstata en circulación. Por lo tanto, este modelo duplica el proceso de migración celular desde el tumor principal a la médula de hueso y a otros puntos distantes de micrometástasis. Como se detalla en el Ejemplo 3, el 100% de los ratones macho inoculados por vía subcutánea con células LAPC-4 de xenotrasplante desarrollaron tumores subcutáneos localizados a las 4 a 6 semanas sin pruebas de metástasis ósea. Sin embargo, cuando se examinó en estos animales la presencia de la enfermedad micrometastásica, hasta el 50% de los ratones tenía células de cáncer de próstata detectables en la médula ósea y en la sangre. Utilizando el mismo análisis RT-PCR semicuantitativo que se ha aplicado a grandes exploraciones de pacientes de cáncer de próstata, se observaron células de cáncer de próstata micrometastásicas a niveles comparables a aproximadamente 0,1 a 1,0% de la médula ósea total del ratón. Resultados similares se obtuvieron por análisis inmunohistoquímico para la expresión del PSA. Por lo tanto, el crecimiento subcutáneo de los xenotrasplantes de cáncer de próstata simula la observación clínica de que las células de cáncer de próstata circulan en la sangre y se alojan en la médula ósea, incluso en la enfermedad en etapa precoz.

En una forma de realización, que simula o imita la micrometástasis de cáncer de próstata comprende la creación de un xenotrasplante de cáncer de próstata subcutáneo en un ratón SCID y que deja que el tumor crezca durante un tiempo suficiente que permita la detección de células de cáncer de próstata en la sangre periférica del ratón. La presencia de micrometástasis se controla detectando células de tumor de próstata que han migrado al sistema linfático y/o vascular, hueso, pulmón, hígado y a otros puntos distantes del punto de xenotrasplante primario. La detección de dichas células puede realizarse, por ejemplo, analizando la presencia de ARNm del PSA humano en la sangre periférica utilizando un análisis RT-PCR para ARNm de PSA (tal como el análisis descrito en el Ejemplo 3).

En otra forma de realización, la simulación de la micrometástasis de cáncer de próstata comprende preparar una única suspensión celular de células de cáncer de próstata procedentes de un tumor de xenotrasplante subcutáneo desarrollado en un ratón SCID, seguido de inyección intraprostática (ortotópica) de la suspensión celular aislada en otro ratón SCID. Se deja desarrollar el tumor intraprostático durante un tiempo suficiente que permita la detección de las células de cáncer de próstata en la sangre periférica del ratón o en otros puntos distantes del tumor ortotópico. Las suspensiones celulares aisladas preparadas a partir de células de xenotrasplante cultivadas pueden también utilizarse para el implante intraprostático (ortotópico).

Este aspecto proporciona también un marco de trabajo para determinar el efecto de determinas variables sobre el desarrollo de la micrometástasis. Dichas variables pueden incluir la presencia o ausencia de hormonas o de otros factores moduladores del crecimiento en el medio del tumor, el estado de la expresión de varios genes en las células tumorales, etc. Por ejemplo, la velocidad de micrometástasis de las variantes de xenotrasplante dependientes del andrógeno e independientes del andrógeno pueden evaluarse. Dicha evaluación se describe en el Ejemplo 3, utilizando las sublíneas dependiente e independiente del andrógeno del xenotrasplante LAPC-4, que demuestra una velocidad significativamente mayor de micrometástasis en los ratones con xenotrasplantes LAPC-4 independientes del andrógeno.

Este aspecto proporciona análisis para determinar la función o efecto de varios genes sobre la evolución de la micrometástasis del cáncer de próstata. En una forma de realización, el análisis comprende aislar las células de cáncer de próstata de un xenotrasplante de cáncer de próstata (p. ej., subcutáneo, intraprostático), transducir las células con el gen de interés de modo que las células transducidas expresen o sobreexpresen el gen, utilizar las células transducidas para crear un tumor de xenotrasplante subcutáneo o intraprostático en un ratón SCID y evaluar la presencia y los niveles de la enfermedad micrometastásica detectando células de cáncer de próstata en la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos y otros puntos distantes del punto del tumor del xenotrasplante primario. El efecto de expresar el gen sobre la velocidad de la micrometástasis puede determinarse con relación a un xenotrasplante de referencia creado con células de cáncer de próstata no transducidas, preferentemente aisladas del mismo xenotrasplante precursor. En otra forma de realización, el análisis comprende generar un xenotrasplante de cáncer de próstata (p. ej., subcutáneo, intraprostático), transduciendo las células del xenotrasplante con el gen de interés in vivo, y evaluando la presencia de concentraciones de enfermedad micrometastásica, en la que el efecto de expresar el gen sobre la velocidad de micrometástasis puede determinarse con relación al xenotrasplante de referencia.

Asimismo, este aspecto proporciona análisis para determinar el efecto o las composiciones o tratamientos terapéuticos experimentales sobre la evolución de la enfermedad micrometastásica. En una forma de realización, el análisis comprende aplicar la composición o tratamiento a un ratón SCID que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano subcutáneo y determinar el efecto del tratamiento sobre la micrometástasis controlando la presencia y los niveles de las células de cáncer de próstata en la sangre periférica, ganglios linfáticos, médula ósea y/o otros puntos distantes del xenotrasplante. En otra forma de realización, un SCID que lleva un xenotrasplante intraprostático se utiliza para determinar el efecto del tratamiento sobre la micrometástasis.

Este aspecto puede tener también varias aplicaciones clínicas, incluyendo la utilización del modelo en un procedimiento para evaluar el pronóstico de un paciente con cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico. Por ejemplo, en una forma de realización, el procedimiento comprende implantar una muestra de tumor de próstata procedente del paciente en un ratón SCID inmunodeficiente por vía subcutánea y dejar la muestra implantada que se desarrolle como xenotrasplante en el ratón. Las velocidades de crecimiento del xenotrasplante y el desarrollo de la micrometástasis pueden utilizarse como indicadores de pronóstico. Los resultados de dicho análisis pueden ayudar al oncólogo del tratamiento al determinar cómo tratar de forma intensiva a un paciente.

Modelos que simulan el cáncer de próstata metastásico

En otro aspecto, la invención utiliza modelos y procedimientos para imitar y estudiar el desarrollo de las lesiones óseas osteoblásticas macrometastásicas (metástasis ósea) en cáncer de próstata. El crecimiento subcutáneo de tumores de xenotrasplante da como resultado micrometástasis detectable, lo que indica que las células de los tumores del xenotrasplante en ratones SCID tienen capacidad para salir del punto de crecimiento del tumor principal, circulan en la sangre y se alojan en la médula ósea, reflejando la situación clínica humana.

En una forma de realización, que simula el desarrollo de la metástasis ósea de cáncer de próstata comprende inyectar una única suspensión celular de células de cáncer de próstata preparada a partir de un xenotrasplante de cáncer de próstata subcutáneo que se desarrolla en ratones SCID en la próstata de otro ratón hospedador SCID, y dejar que el tumor ortotópico resultante crezca durante un tiempo suficiente que permita la detección de metástasis ósea en el ratón. Alternativamente, los xenotrasplantes de cáncer de próstata subcutáneos pueden crearse con dichas preparaciones celulares únicas y dejar que se desarrollen. La detección de la metástasis ósea puede llevarse a cabo por varios métodos, incluyendo por vía histológica, por vía inmunohistoquímica y por vía radiográfica.

Los tumores subcutáneos y ortotópicos se desarrollan típicamente de manera rápida, alcanzando un tamaño que exige que el animal hospedador se sacrifique a las 4 a 6 semanas aproximadamente. Por consiguiente, se proporcionan también los procedimientos alternativos que aumentan el número de células de cáncer de próstata en la médula ósea, obviando de este modo esta limitación. En una forma de realización, una suspensión celular aislada preparada a partir de células de tumor de xenotrasplante, o a partir de células de xenotrasplante en el cultivo tisular, se inyecta directamente en la cavidad de la médula ósea (p. ej., de la tibia) de un ratón SCID. El desarrollo de la micrometástasis, crecimiento tumoral del hueso y la actividad osteoblástica pueden controlarse de varias maneras, incluyendo por inmunohistoquímica e hibridación in situ de las secciones óseas o por diagnóstico por imagen radiográfica.

Como se describe en el Ejemplo 6, una suspensión celular aislada de 10.000 células de tumor de xenotrasplante preparadas a partir de un tumor subcutáneo se inyectó en la tibia de un ratón SCID. Un pequeño subconjunto de las células inyectadas fue detectable a las 2 semanas, seguido de pequeños focos de crecimiento del tumor óseo en unas pocas áreas aisladas a las 4 semanas, seguido de crecimiento del tumor óseo macroscópico extenso, destrucción de la corteza ósea y formación de hueso nuevo puro a las 6 a 8 semanas. Por consiguiente, las células aisladas de los xenotrasplantes de cáncer de próstata humano de la invención son capaces de proliferación en el microambiente de la cavidad de la médula ósea de ratón SCID.

El procedimiento anterior proporciona un modelo excelente para simular la formación de lesiones óseas osteoblásticas y la evolución hasta esta etapa de la enfermedad. El modelo puede utilizarse no solamente para estudiar los casos molecular y celular implicados en la evolución de esta etapa del cáncer de próstata, sino también probar el efecto de varios genes terapéuticos experimentales, proteínas y otros compuestos. Además, el modelo puede utilizarse como un análisis para evaluar el potencial metastásico y osteoblástico de las células de cáncer de próstata obtenidas de pacientes humanos.

Por consiguiente, este aspecto también proporciona análisis para determinar la función o efecto de varios genes en la evolución de la metástasis ósea del cáncer de próstata. En una forma de realización, el ensayo comprende aislar las células de cáncer de próstata de un xenotrasplante de cáncer de próstata (p. ej., subcutáneo, intraprostático, óseo), transduciendo las células con el gen de interés de modo que las células transducidas expresan o sobreexpresan el gen, introduciendo las células transducidas en la cavidad de la médula ósea de un ratón SCID y controlando en la médula ósea la presencia y niveles de las lesiones macrometastásicas osteoblásicas. El efecto de expresar el gen en el desarrollo y crecimiento de la metástasis ósea puede determinarse haciendo referencia a un animal de referencia que recibe células de cáncer de próstata no transducidas, preferentemente aisladas del mismo xenotrasplante precursor. En otra forma de realización, el ensayo comprende generar un xenotrasplante de médula ósea en un ratón SCID inyectando una única suspensión celular de células de cáncer de próstata preparada a partir de un xenotrasplante subcutáneo o intraprostático creado en otro ratón SCID, transduciendo las células de xenotrasplante de médula ósea con el gen de interés in vivo, y evaluando el efecto del gen en la presencia y niveles de lesiones macrometastásicas
osteoblásticas.

Además, este aspecto proporciona análisis para determinar el efecto de composiciones o tratamientos terapéuticos experimentales sobre la evolución de la metástasis ósea del cáncer de próstata. En una forma de realización, el análisis comprende aplicar la composición o tratamiento a un ratón SCID que recibe una inyección intratibial de células de xenotrasplante de cáncer de próstata y determinar el efecto de la composición o tratamiento sobre la evolución de la metástasis ósea controlando en la médula ósea de la tibia la presencia y niveles de las células de cáncer de próstata y/o lesiones macrometastásicas osteoblásticas. La presencia de células de cáncer de próstata en la médula ósea puede detectarse por varios medios, incluyendo por histología, inmunoquímica o analizando la presencia de ARNm o proteína de PSA. La presencia de lesiones macrometastásicas osteoblásticas puede detectarse utilizando técnicas histológicas, radiográficas u otras de diagnóstico por la imagen.

Este aspecto puede también tener varias aplicaciones clínicas, incluyendo utilizar el modelo en un procedimiento para evaluar el pronóstico de un paciente con cáncer de próstata localmente avanzado, y en particular, para predecir la probabilidad de que un paciente evolucione hasta la enfermedad metastásica. Por ejemplo, en una forma de realización, el procedimiento comprende inyectar una sola suspensión celular preparada a partir del material de la biopsia de próstata del paciente directamente en la médula ósea de un ratón inmunodeficiente y a continuación controlar en la médula ósea el desarrollo de las lesiones óseas. La velocidad de crecimiento de la lesión ósea y la actividad osteoblástica pueden utilizarse como indicadores de pronóstico. Los resultados de dicho análisis pueden ayudar al oncólogo del tratamiento a determinar cómo de manera intensiva tratar un paciente con enfermedad localmente avanzada.

Asimismo, puede predecirse el efecto de varias estrategias terapéuticas para tratar localmente la enfermedad avanzada o metastásica en un paciente determinado. Por ejemplo, puede predecirse el efecto de una estrategia de tratamiento aplicando el tratamiento a un ratón inmunodeficiente que recibe una inyección de médula ósea de las células de cáncer de próstata del paciente. El efecto del tratamiento puede controlarse comparando la velocidad y extensión del crecimiento de la lesión ósea y la actividad osteoblástica en el ratón de la prueba para las velocidades correspondientes en un ratón de referencia sin tratar que recibe una inyección de médula ósea correspondiente. Además, este procedimiento puede utilizarse para determinar la eficacia de una estrategia de tratamiento sobre las células de cáncer de próstata independientes del andrógeno utilizando un ratón inmunodeficiente hembra o macho castrado con objeto de seleccionar clones independientes del andrógeno en el material del tumor del paciente. Los resultados de dichas pruebas pueden ayudar a un oncólogo de tratamiento a determinar cuál de varias terapias alternativas debería utilizarse para tratar una determinada enfermedad del paciente.

Cultivo de corta duración de células tumorales de xenotrasplante

Las células tumorales de xenotrasplante pueden propagarse utilizando técnicas de corta duración in vitro de cultivo tisular bien conocidas en la materia. Además, pueden aislarse diferentes poblaciones clónicas de un tumor de xenotrasplante mediante técnicas de cultivo tisular. A este respecto, se describen los métodos para preparar suspensiones celulares aisladas de muestras de tejido de tumor de xenotrasplante. En una forma de realización, el tejido tumoral de xenotrasplante se extrae quirúrgicamente de un tumor de xenotrasplante subcutáneo, se separa y se digiere proteolíticamente, utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 o en procedimientos similares. Las células pueden ponerse en suspensión a continuación en una solución de Matrigel, otras composiciones de membrana de base, solución salina u otros tampones. Dichas preparaciones son útiles para crear nuevos tumores en ratón receptor SCID, por ejemplo, por inoculación subcutánea, inyección intraprostática o por inyección directamente en la metástasis de la médula ósea. Las suspensiones celulares pueden prepararse a partir de tumores subcutáneos, intraprostáticos, óseos u otros ortotópicos que se desarrollan en ratones SCID.

Procedimientos de expansión y purificación de las poblaciones de células de cáncer de próstata

Además se describen los procedimientos para expandir las células de cáncer de próstata en etapa avanzada, los procedimientos para preparar poblaciones relativamente puras de células de cáncer de próstata a partir de poblaciones heterogéneas de células, y los procedimientos para preparar células de cáncer de próstata específicas de la etapa in vivo o in vitro. Las muestras del tumor principal son heterogéneas en sus composiciones celulares, y se contaminan habitualmente con células normales y de estroma. Además, es difícil obtener poblaciones sustanciales de células de cáncer de próstata a partir del material de la biopsia de tejido humano. En cambio, las células recogidas de tumores de próstata subcutáneos que se desarrollan en ratones SCID comprenden predominantemente células de cáncer de próstata. De este modo, los modelos utilizados en la invención proporcionan un vehículo para purificar las células de cáncer de próstata humanas en etapa avanza a partir del material de biopsia heterogéneo.

El pase en serie de tumores de xenotrasplante en ratones adicionales puede utilizarse para aumentar más la especificidad del cáncer de próstata de la composición celular del xenotrasplante. Asimismo, la capacidad para propagar en serie, tal como mediante propagación en serie, células de cáncer de próstata humanas relativamente puras en ratones inmunodeficientes proporciona un método para obtener grandes cantidades de células de cáncer de próstata definidas.

En una forma de realización, el tejido recogido de tumores de xenotrasplante está enriquecido por células de cáncer de próstata mediante el pase ulterior en ratones SCID adicionales. En otra forma de realización, pueden cultivarse in vitro células de tumores de xenotrasplante. En otra forma de realización, las suspensiones celulares aisladas de las células de cáncer de próstata pueden prepararse a partir de dichas células cultivadas o directamente del tejido de tumor de xenotrasplante. Las suspensiones celulares aisladas preparadas a partir de tumores de xenotrasplante subcutáneo digeridas con proteasas conservan las propiedades biológicas de los tumores precursores. Pueden utilizarse suspensiones celulares aisladas para demostrar, por ejemplo, nuevos tumores subcutáneos, tumores intraprostáticos o tumores óseos. Como se muestra en los experimentos publicados en el Ejemplo 2, solamente 10 células de xenotrasplante pueden sembrarse en un nuevo tumor subcutáneo.

Pueden añadirse factores selectivos al medio en el que se está realizando el enriquecimiento de las células tumorales con objeto de expandir las células con un fenotipo específico. Por ejemplo, la presencia de andrógeno en el medio in vivo puede controlarse por procedimientos de castración química o quirúrgica bien conocidos en la materia con objeto de seleccionar las células de cáncer de próstata dependientes o independientes del andrógeno. Alternativamente, pueden utilizarse ratones hembra para expandir células independientes del andrógeno. Asimismo, en un medio in vitro, puede utilizarse la ausencia de andrógeno en el medio de crecimiento para seleccionar células de cáncer de próstata independientes del andrógeno.

Además, la presencia de proteínas de la superficie celular en las células tumorales de xenotrasplantes subcutáneos puede utilizarse para distinguir y aislar células de cáncer de próstata humano de otras células. En particular, los anticuerpos contra las proteínas de la superficie de la célula expresados de forma diferenciada en células de cáncer de próstata (en comparación con su expresión sobre células de médula murina), pueden utilizarse para aislar células de cáncer de próstata del tejido tumoral del xenotrasplante, a partir de células en el cultivo, etc., utilizando la clasificación de células basadas en anticuerpos o las técnicas de purificación por afinidad. La mayoría preferida para la clasificación celular basada en anticuerpo son anticuerpos contra proteínas de la superficie celular que son específicos del cáncer de próstata humano. Sin embargo, pueden emplearse anticuerpos contra otras proteínas humanas de manera eficaz con la condición de que no presenten reactividad cruzada significativa con el homólogo murino de la proteína. Un ejemplo de dicha proteína es la galectina-6 humana.

La capacidad para generar grandes cantidades de células de cáncer de próstata humana relativamente puras en etapa avanzada que pueden desarrollarse en cultivo celular o como tumores de xenotrasplante en ratones SCID proporciona muchas ventajas, incluyendo, por ejemplo, el permitir la evaluación de varios transgenes o compuestos terapéuticos experimentales en el crecimiento u otras características fenotípicas de una población relativamente homogénea de células de cáncer de próstata. Además, esto permite también el aislamiento de preparaciones muy enriquecidas de ácidos nucleicos específicos del cáncer de próstata humano en cantidades suficientes para varias manipulaciones moleculares. Por ejemplo, grandes cantidades de dichas preparaciones de ácido nucleico ayudarán a la identificación de genes raros con relevancia biológica para la evolución de la enfermedad del cáncer de próstata.

Otra aplicación valiosa de este aspecto de la invención es la capacidad para analizar y experimentar con las preparaciones relativamente puras de las células viables del tumor de próstata clonadas en pacientes individuales con enfermedad localmente avanzada o metastásica. De esta manera, por ejemplo, unas células de cáncer de próstata del paciente individual pueden expandirse en una muestra de biopsia limitada y a continuación determinar la presencia de los genes de diagnóstico y de pronóstico, proteínas, aberraciones cromosómicas, perfiles de expresión del gen u otras características relevantes genotípicas y fenotípicas, sin la variable que confunde potencialmente de las células contaminantes. Además, en dichas células puede evaluarse la agrevisidad neoplásica y el potencial metastásico en los modelos de tumor subcutáneos, ortotópicos y óseos de la invención. Este aspecto de la invención proporciona un método para las modalidades de tratamiento alternativas de experimentación con vista hacia regímenes de tratamiento específicamente para el paciente, óptimos habituales. Asimismo, las pueden crearse vacunas contra el cáncer de próstata específicas para el paciente e inmunoterapéuticos celulares a partir de dichas preparaciones celulares.

Los modelos de cáncer de próstata utilizados en la invención proporcionan además procedimientos para aislar las células de cáncer de próstata específicas para la etapa de aislamiento, incluyendo las células de cáncer de próstata micrometastásicas y osteoblásticas. En una forma de realización, se aíslan células macrometastásicas de tejidos hematopoyéticos tales como la médula ósea o la sangre utilizando técnicas de clasificación de células basadas en anticuerpo o de purificación por afinidad. En otra forma de realización, se aíslan células de cáncer de próstata osteoblásticas de la médula ósea de ratones SCID con lesiones óseas osteoblásticas. La presencia de dichas lesiones óseas puede detectarse por vía histológica, inmunohistoquímica o radiográfica. Las células de cáncer de próstata específicas para la etapa pueden expandirse más y purificarse por reimplantación ulterior en ratones SCID. Por ejemplo, las células de cáncer de próstata osteoblásticas pueden ser objeto de subpases in vivo por reinyección en la médula ósea o in vitro utilizando el estroma óseo definido como sustrato de crecimiento.

Como se muestra mediante el trabajo experimental presentado en el Ejemplo 3, un pequeño número de células de cáncer de próstata macrometastásicos puede detectarse y aislarse de la médula ósea de ratones SCID con xenotrasplantes de cáncer de próstata subcutáneos. Aunque estas células de cáncer de próstata representan menos de aproximadamente el 1% de las células en la médula ósea del ratón hospedador, pueden aislarse y expandirse utilizando procedimientos de purificación celular, tales como los expuestos anteriormente. En una forma de realización, la médula ósea recogida de ratones con xenotrasplantes subcutáneos se incuba con un anticuerpo monoclonal específico humano en galectina-6 y un anticuerpo secundario conjugado con lentejas magnéticas. Las células de cáncer de próstata se aíslan a continuación utilizando columnas Miltenyi Magnetic Minimacs (Sunnyvale, CA) para conservar magnéticamente las células positivas al anticuerpo en la columna mientras que se deja que las células negativas al anticuerpo pasen flujo a través. Un pequeño número de células de cáncer de próstata macrometastásico aisladas de esta manera pueden propagarse in vivo por inoculación subcutánea de las células en suspensión Matrigel en ratones SCID. Las células de cáncer de próstata osteoblástico pueden aislarse asimismo directamente de las lesiones de médula ósea.

La capacidad para purificar y expandir células de cáncer de próstata específicas para la etapa puede tener varias aplicaciones clínicas. Por ejemplo, pueden aislarse células de cáncer de próstata específicas para la etapa dentro del material clínico utilizando técnicas de clasificación o purificación celular y a continuación expandirse como tumores subcutáneos, intraprostáticos u óseos en ratones SCID, dependiendo del objetivo específico. En una forma de realización, las micrometástasis se aíslan del suero del paciente, se formulan en suspensiones celulares individuales y se inyectan por vía subcutánea con el objetivo de expandir estas células de forma general. En una forma de realización alternativa, las preparaciones celulares macrometastásicas se inyectan en la médula ósea de un ratón SCID con el objeto de expandir selectivamente estas células con características osteoblásticas. Las células de cáncer de próstata que han sido objeto de pases de esta manera pueden llegar a estar condicionadas por varios factores en el microambiente de la médula ósea y pueden formar lesiones osteoblásticas que pueden recogerse a continuación para su utilización o análisis posterior.

Estirpes celulares continuas

Las estirpes celulares continuas de cáncer de próstata humano pueden crearse cultivando preparaciones de células de xenotrasplante. En una forma de realización, la estirpe celular comprende células de cáncer prostático humano cultivadas en un xenotrasplante subcutáneo. En una forma de realización específica descrita a título del Ejemplo 9, la línea celular LAPC-4 fue creada cultivando una suspensión celular aislada preparada a partir del xenotrasplante LAPC-4. La estirpe celular LAPC-4 expresa a PSA, receptor del andrógeno (AR) y es dependiente del andrógeno. La estirpe celular LAPC-4 ha estado desarrollándose en cultivo continuo durante 1,5 años, y conserva las características fenotípicas que la correlacionan con la situación clínica humana más estrechamente que cualquier otra estirpe celular de cáncer de próstata humano disponible.

Pueden utilizarse estirpes celulares con numerosos objetivos. A título de ejemplo y no a título de limitación, las estirpes celulares pueden utilizarse como fuente de grandes cantidades de ácidos nucleicos y proteínas, como herramienta para identificar y evaluar transgenes terapéuticos experimentales, proteínas y otros compuestos, y como herramienta para identificar y aislar genes específicos de la próstata o expresados de manera diferenciada. Los genes que pueden regular el crecimiento del cáncer de próstata pueden evaluarse por sobreexpresión en el crecimiento de las células transducidas in vitro o in vivo. Los efectos de los genes sobre la micrometástasis y el desarrollo de las lesiones óseas osteoblásticas puede evaluarse in vivo mediante inoculación subcutánea, intraprostática o intratibial de las células transducidas.

Ejemplos

La invención se describe con mayor detalle y se ilustra mediante los siguientes ejemplos y los detalles experimentales en la misma. Este apartado se publica como ayuda para comprender la invención, pero no está destinado a limitar la invención reivindicada, ni debería considerarse que limita la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Generación de xenotrasplantes de cáncer de próstata humano subcutáneos que simulan la evolución del cáncer de próstata Materiales y procedimientos

Pacientes: Todo el material clínico se extrajo de pacientes con enfermedad localmente avanzada o metastásica (etapa C o D) después de obtener permiso por escrito según un protocolo aprobado por IRB. La mayoría de los pacientes han experimentado alguna forma de terapia de extirpación del andrógeno (médica o quirúrgica y presentan enfermedad progresiva en el momento en que se obtuvieron las muestras de tejido.

Animales: Se criaron ratones C.B.17 scid/scid (SCID) en UCLA en condiciones estériles como se describió anteriormente (Aldrovandi et al., Nature 363:732-736 (1993)). El material de biopsia obtenido en el momento de la cirugía se colocó en hielo e inmediatamente se transfirió a la instalación del ratón SCID para su implantación. Se utilizó un bisturí para picar el tejido en secciones de 2 a 3 mm^{3} que se implantaron a continuación subcutáneamente en los costados de ratones SCID. Se anestesiaron los ratones con metoxiflurano antes de la implantación, se realizaron implantes iniciales con 100 a 200 \mul de Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) inyectado alrededor del implante. Matrigel es una preparación de matriz extracelular útil para mejorar el crecimiento de tumores epiteliales in vivo (Pretlow (1993), supra; Noel et al., Biochemical Pharmacology 43:1263-1267 (1992) y Lim et al., Prostate 22:109-118 (1993)). Una vez se atenuó el xenotrasplante fue objeto de pases 2 a 3 veces, no se utilizó Matrigel ya más para la propagación en serie. La extirpación del andrógeno se realizó por castración quirúrgica bajo anestesia. Se determinaron los tamaños del tumor por mediciones de altura, anchura y espesor con calibre semanalmente. Se implantaron granulados de testosterona de liberación lenta (Innovative Research of America, Sarasota, FL) por vía subcutánea, tal como recomienda el fabricante, en algunos experimentos. Se almacenaron los xenotrasplantes de manera viable en nitrógeno líquido congelando secciones de tejido troceadas en 1 a 2 mm^{3} en medio que contiene DMSO.

Análisis por PCR, histología e inmunoquímica: Se preparó ADN procedente del tejido tumoral utilizando extracción con detergente SDS y digestión con proteinasa K según describe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,edición 2 (1989). Se preparó ARN utilizando un kit disponible en el mercado que contiene tiocianato de guanidina y \beta-mercaptoetanol (RNAgents Total RNA Isolation System, Promega). Para evitar la contaminación de las preparaciones de tejido en grueso, el homogeneizador de tejido y todos los instrumentos quirúrgicos utilizados en el momento de la necropsia se limpiaron mediante enjuagues repetidos en HCl, agua tratada con DEPC y etanol. Los análisis por PCR del ADN para la \beta-globina humana (Aldrovandi et al., supra y Saiki et al., Science 230:1350-1354 (1985)) y los análisis por RT-PCR para PSA (Pang et al., Hum. Gene Ther. 6:1417-1426 (1995)) se realizaron como se describió anteriormente. En resumen, el análisis por PCR que utiliza cebadores específicos para el gen de \beta-globina humana se realizó durante 30 ciclos con 100 ng de ADN genómico aislado de los xenotrasplantes de LAPC. Un décimo de cada mezcla de reacción se analizó por electroforesis mediante geles de agarosa y se observó tiñendo con bromuro de etidio. Se utilizaron células 3T3 murinas como referencia negativa. La calidad de todas las muestras de ARN se confirmó mediante tinción con bromuro de etidio para el ARN ribosómico y por RT-PCR utilizando cebadores para \beta-actina (Pang et al., supra) como referencia. Los detalles de las secuencias del cebador pueden encontrarse en las referencias originales. El análisis por RT-PCR para la expresión de PSA se realizó en 100 ng de ARN completo utilizando cebadores específicos para PSA humano. Se analizaron las mismas muestras de ARN utilizando cebadores que reconocen la \beta-actina humana o murina para confirmar cargas equivalentes en geles. La tinción inmunoquímica para PSA se realizó utilizando antisueros policlonales contra PSA (Dako) como se describe (Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75:734-738 (1981)).

Secuenciado del ADN receptor de andrógeno: Se secuenciaron los exones 2 a 8 del receptor de andrógeno de ADN genómico utilizando cebadores de PCR específicos para el intrón (Marcelli et al., Mol. Endocrinol. 90: 1105-1115 (1990)). Los productos por PCR se identificaron inicialmente por SSCP utilizando referencias positivas y negativas apropiadas como se describe (Sutherland et al., J. Urol. 156: 828-831 (1996)). Se ha demostrado que esta técnica detecta mutaciones en las muestras clínicas de cáncer de próstata aun cuando las células tumorales representen solamente el 20% de la población utilizada para construir el ADN genómico. Se analizaron todas las anomalías de SSCP mediante secuenciado. Se analizaron dos muestras de ADN independientes en dos laboratorios independientes para regular la presencia de cualquier mutación.

Citogenética: El tejido tumoral se transportó asépticamente en medio de cultivo DMEM enriquecido con suero bovino fetal al 10% mediante portador durante la noche en la Universidad de Utah para la preparación citogenética y el análisis. En resumen, se trituró y lavó el tejido en solución salina equilibrada de Hanks (exenta de Ca^{++} y Mg^{++}), se volvió a poner en suspensión en medio RPMI enriquecido con suero bovino fetal y las células se detuvieron en la metafase con 0,001 \mug/ml de colcemida durante 16 horas. Se efectuaron recogidas citogenéticas utilizando los procedimientos normalizados y, después del tratamiento con KC hipotónico (0,075 M) y fijación con metanol/ácido acético 3:1, se prepararon secciones y cromosomas con bandas G con tripsina/tinción de Wrights.

Resultados Los explantes de cáncer de próstata en etapa avanzada pueden propagarse en serie en ratones SCID

Se obtuvieron biopsias de tejido tumoral localmente avanzado o metastásico de un total de 15 pacientes con cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico (etapa C, D1 o D2) que experimentaron procedimientos quirúrgicos paliativos debido a complicaciones de la enfermedad. El material de la biopsia se transfirió inmediatamente desde la sala quirúrgica a la instalación del ratón SCID, se troceó en secciones de 2 a 3 mm^{3} y se implantó por vía subcutánea en ratones SCID en presencia de Matrigel. El crecimiento tumoral se puntuaba positivo solamente si el explante presentaba un aumento de tamaño mantenido de dos a tres veces. Además de los estudios histológicos, se realizaron dos ensayos moleculares en cada xenotrasplante para verificar el origen humano de los tumores. Éstos incluyen un análisis por PCR en ADN genómico utilizando cebadores específicos para el gen de \beta-globina humano y un análisis RT-PCR cuantitativo en ARN de tumores utilizando cebadores específicos para el gen PSA humano. El análisis de la expresión por PSA se utilizó también para comprobar el origen prostático de los xenotrasplantes.

Los resultados obtenidos de la implantación subcutánea de muestras de tejido tumoral de dos series independientes de estos 15 pacientes se describen individualmente a continuación (es decir, las series LAPC-1 a la LAPC-8 y la serie LAPC-9 a la LAPC-15).

Serie LAPC-1 a LAPC-8

Los explantes de seis a ocho pacientes (denominados LAPC 1-8 para el cáncer de próstata de Los Ángeles) formaron tumores después de un periodo latente que varió entre 2 y 10 meses (Tabla 1). Los seis explantes que crecieron fueron objeto de pases en receptores secundarios en un intento de crear xenotrasplantes permanentes. Dos de éstos (LAPC-1 y LAPC-5) se terminaron después de 3 a 4 pases porque no eran capaces de detectar el ADN humano o la expresión de PSA en los tumores. Estos explantes quizá fueron sobredesarrolados por células de origen murino debido a que contenían un contenido de ADN humano y expresaban PSA durante los pases iniciales de LAPC-5 (Tabla 1, columnas 6 y 7).

Los cuatro explantes restantes (LAPC-3, 4, 7 y 8) se propagaron con éxito como xenotrasplantes subcutáneos en receptores secundarios durante entre 4 y 20 (o más) pases. Se utilizó RT-PCR para medir los niveles de expresión de ARNm de PSA en comparación con LNCaP, estirpe celular de cáncer de próstata conocida por expresar ARNm de PSA y proteína. Este análisis es semicuantitativo y es capaz de detectar la expresión de ARNm de PSA de 100 células LNCaP diluidas en 10^{5} células de ratón (1 en 1.000 o 0,1%) (Fig. 1B, panel superior). Cuatro de los seis xenotrasplantes (LAPC-3, 4, 5 y 8) expresaron PSA humano a niveles comprendidos entre el 1% y 100% del nivel hallado en células LNCaP (Fig. 1B, panel superior). El análisis por RT-PCR simultáneo utilizando cebadores para \beta-actina confirmó que los niveles equivalentes de ARN estaban presentes en cada reacción (Fig. 1B, panel superior). Fig. 2 presenta una comparación histológica de la muestra de tumor LAPC-4 original obtenida en el momento de la cirugía para el mismo tumor después del pase como xenotrasplante en ratones macho. Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (Fig. 2, paneles de la izquierda) presentan una población monótona de células anaplásticas que tiñen positivo para PSA utilizando análisis inmunohistoquímico (Fig. 2, paneles de la derecha). Estos descubrimientos demuestran que los explantes de cáncer de próstata en etapa avanzada pueden propagarse en serie en ratones SCID y conservan la expresión génica específica del tejido definitivo.

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Dos de los xenotrasplantes en esta serie, LAPC-3 y LAPC-4, presentan características histológicas y moleculares constantes mantenidas de cáncer de próstata durante más de 6 y 8 pases, respectivamente. Ambos xenotrasplantes pueden congelarse viablemente como explantes tumorales y recuperarse de la congelación con casi el 100% de eficacia. Una estirpe celular de xenotrasplante LAPC-4 se creó por pase en serie de tejido de xenotrasplante triturado, tratado con tripsina en medio de cultivo Iscove enriquecido con suero de ternero fetal al 20%. La estirpe celular LAPC-4 se ha continuado confirmando durante más de 20 pases y ha estado en cultivo continuo durante más de 18 meses. Estas células continúan expresando PSA, forman tumores en ratones SCID, y conservan sensibilidad al andrógeno.

Series LAPC-9 a LAPC-15

Se realizó una segunda serie de experimentos de xenotrasplante implantando muestras de tejido de unos siete pacientes adicionales de cáncer de próstata con enfermedad en etapa avanzada (C o D) (Tabla 2). Cuatro de estos siete implantes han producido la generación de xenotrasplantes sensibles al andrógeno que expresan a PSA y que son capaces de propagarse en serie en más ratones (LAPC-9, 12, 14 y 15). El xenotrasplante LAPC-9, generado a partir de una biopsia de tumor óseo de un paciente con enfermedad metastásica resistente a hormonas, demuestra un fenotipo sumamente sensible al andrógeno (los niveles de PSA disminuyen hasta 0 después de la castración) y han sido objeto de pases y mantenido en forma viable durante aproximadamente 1 año. El xenotrasplante LAPC-14, generado a partir de una biopsia de un tumor de próstata de un paciente con enfermedad metastásica, demuestra características de crecimiento abrasivo y presenta un alto grado de sensibilidad al andrógeno (el crecimiento se mejoró sustancialmente mediante la adición de testosterona).

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Los xenotrasplantes LAPC-3 y LAPC-4 contienen anomalías cromosómicas

Los estudios histogenéticos extensos de cáncer de próstata humano han sido difíciles debido a la heterogeneidad del material clínico obtenido en cirugía y al crecimiento limitado de las células de tumor de próstata in vitro. Para determinar si el pase del tejido del tumor de próstata en ratones SCID debería facilitar el análisis cariotípico, se analizaron los tumores precoces con pase de los xenotrasplantes LAPC-3 y LAPC-4 utilizando técnicas citogenéticas normalizadas. Se obtuvo un alto rendimiento mitótico de las muestras de tumor de ambos xenotrasplantes y todas las células de la metafase contenían cromosomas humanos. Los cariotipos del compuesto detallado se indican en la Tabla 3. El número de cromosomas modal de LAPC-4 fue 89, lo que sugiere una línea hipotetraploide, ya que el número de cromosomas modal de LAPC-3 fue 69, lo que sugiere que esta línea es casi triploide, incluso la presencia de cuatro copias de muchos cromosomas aumenta la posibilidad de reducción del tetraploide. Ambos xenotrasplantes presentan anomalías cromosómicas numéricas y estructurales descritas tales como la pérdida de Y y 16. Además, ambos xenotrasplantes contienen una deleción en el cromosoma 12p12, anomalía cariotípica que no se ha descrito anteriormente en el cáncer de próstata.

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Evolución del xenotrasplante de LAPC-4 para independencia del andrógeno

Las células de cáncer de próstata son exquisitamente sensibles a los efectos estimulantes del crecimiento del andrógeno, pero la enfermedad independiente del andrógeno se desarrolla opcionalmente en pacientes bajo presión selectiva de privación del andrógeno. El mecanismo para esta transición al crecimiento independiente del andrógeno es desconocido. La cuestión de si esta fase de la enfermedad podría modelarse en ratones SCID se determinó utilizando el xenotrasplante LAPC-4, que forma de manera reproducible tumores en pases en serie en ratones macho con la frecuencia del 100%.

La dependencia del andrógeno del xenotrasplante se midió in vivo comparando las velocidades de crecimiento después de la implantación en ratones macho íntegros con los procedentes de ratones macho castrados o ratones hembra. Para LAPC-4, el tiempo medio para la formación del tumor en ratones macho castrados o ratones hembra (n=10) fue de 13,4 semanas frente a 4,3 semanas en machos íntegros (n=14) (Fig. 3). El crecimiento retardado en ratones hembra se invirtió mediante la implantación de un granulado de testosterona de liberación lenta a los 90 días (Fig. 3). La independencia del andrógeno de los tumores que crecen en ratones hembra o macho castrados se confirmó por experimentos de transferencia secundaria. Una vez creados, estos tumores se desarrollan en 4 a 5 semanas en ratones macho, hembra y macho castrados.

El xenotrasplante LAPC-3 presentó características de crecimiento similares a las sublíneas independientes del andrógeno de LAPC-4. Después de un periodo latente inicial para el pase 1, los tumores de LAPC-3 crecieron en 7 a 8 semanas independientemente del fondo hormonal del receptor (Fig. 3), creando claramente este xenotrasplante como independiente del andrógeno.

Clínicamente, la terapia con antiandrógeno produce la mejoría temporal de la enfermedad en la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata avanzado. Para determinar si un fenómeno similar se observa en el modelo de ratón, se examinó el efecto de la privación aguda del andrógeno sobre el crecimiento de los tumores creados en ratones macho. Los implantes de tamaño equivalente del xenotrasplante LAPC-4 fueron objeto de pases en una cohorte de 14 ratones macho, todos los cuales desarrollaron fácilmente tumores mensurables después de cuatro semanas. La mitad de estos ratones experimentaron castración, a continuación se determinaron semanalmente los tamaños de tumor en cada grupo por medición con calibre de los diámetros del tumor en tres dimensiones. Los tumores en los ratones no castrados se duplicaron de tamaño en un periodo de 2 a 3 semanas (Fig. 4). En cambio, los ratones castrados presentaron una disminución en el tamaño del tumor en una semana de aproximadamente 50 por ciento que persistió durante 2 a 3 semanas. Estos tumores reanudaron el crecimiento después de un periodo latente variable (3 a 8 semanas) y eventualmente desarrollaron el mismo tamaño observado en los ratones no castrados. Estos resultados demuestran que el xenotrasplante de LAPC-4 presenta crecimiento dependiente del andrógeno, que pueden desarrollarse sublíneas independientes del andrógeno, y que este xenotrasplante simula la transición clínica desde enfermedad sensible al andrógeno hasta independiente del andrógeno.

LAPC-3 y LAPC-4 expresan receptores de andrógenos naturales

Para determinar si están presentes mutaciones similares en LAPC-3 y LAPC-4, se secuenciaron los exones 2 a 8 del gen receptor del andrógeno, que abarcan los dominios de unión del ADN y de unión del ligando del receptor. Se realizó asimismo el análisis del poliformismo de la configuración de una sola cadena (SSCP). Cada exón fue ampliado por PCR a partir del ADN genómico de tumores con pase precoz y tardío y se analizó utilizando mutante previamente caracterizado y ADN del receptor del andrógeno natural como referencias positivas (Sutherland et al., 1996). Los resultados demuestran que tanto LAPC-3 como LAPC-4 contienen secuencias naturales en los exones 2 a 8. Además, estas secuencias permanecen de tipo natural en las sublíneas LAPC-4 independientes del andrógeno. El análisis por inmunotransferencia confirmó la expresión de una proteína receptora del andrógeno del tamaño apropiado. Estos resultados proporcionan pruebas definitivas de que la evolución del cáncer de próstata independiente del andrógeno puede suceder en ausencia de mutaciones de receptor del andrógeno en el ADN o en los dominios de unión al ligando.

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Las células LAPC-4 pueden ser transducidas de manera eficaz con retrovirus: Las células del xenotrasplante LAPC-4 pueden transducirse con éxito mediante retrovirus empaquetados temporalmente en células 293T con una proteína anfótropa con envoltura. Se infectaron células LAPC-4 con existencias de retrovirus que expresan la proteína Thy-1 de la superficie celular y la expresión detectada por citometría de flujo utilizando un anticuerpo contra Thy-1. Los resultados presentaron la expresión de Thy-1 en hasta 50% de las células 48 horas de la infección, lo que indica la transducción mediada retrovírica con éxito del gen Thy-1 en células LAPC-4.

Ejemplo 2 Preparación de las suspensiones celulares aisladas de células de xenotrasplante Materiales y procedimientos

Las suspensiones celulares aisladas de tumores LAPC-4 subcutáneos se prepararon de la manera siguiente. Después de eliminar el tejido del xenotrasplante de ratones SCID, el tejido se troceó en secciones de 1 a 2 mm^{3} aunque el tejido se bañó en medio 1\times Iscoves, se troceó el tejido a continuación se centrifugó a 1,3 K rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se volvió a poner en suspensión en 10 ml de medio 1\times Iscoves enfriado con hielo y se centrifugó a 1,3 K rpm durante 4 minutos. El sedimento se volvió a poner en suspensión a continuación en 1\times Iscoves con pronasa E al 0,1% y se incubó durante 18 minutos a temperatura ambiente con agitación suave seguido de incubación en hielo durante 2 a 4 minutos. La mezcla se filtró a continuación utilizando un filtro de malla de nilón de 200 \mum. Se centrifugó el filtrado a 1,3 K durante 4 minutos, y se eliminó la pronasa del sedimento aspirado volviendo a poner en suspensión en 10 ml de Iscoves y volviendo a centrifugar. Los sedimentos resultantes se volvieron a poner en suspensión en PrEGM preincubado a 37 grados C. Se determinaron los recuentos de células, y se formularon diluciones limitativas como se indica en la Fig. 5.

Resultados

Los resultados del análisis de dilución limitativo del injerto tumoral utilizando suspensión celular aislada de células de xenotrasplante LAPC-4 se presentan en la Fig. 5. Los resultados demuestran que las suspensiones celulares aisladas de células de xenotrasplante pueden formar tumores subcutáneos en ratones macho tras la inyección de solamente 10 células LAPC-4 y que estas células conservan la sensibilidad al andrógeno de los tumores precursores.

Ejemplo 3 Simulación de la evolución para la micrometástasis en ratones SCID con tumores subcutáneos Materiales y procedimientos

En este estudio se utilizó el xenotrasplante de LAPC-4. Este xenotrasplante procedía de un ganglio linfático que contenía células de cáncer de próstata metastásico, y el 100% de los ratones macho inoculados por vía subcutánea con células LAPC-4 desarrollaron tumores localizados después de 4 a 6 semanas sin pruebas de metástasis ósea. La presencia de micrometástasis en los ratones SCID implantados con tumores LAPC-4 se determinó analizando las células de cáncer de próstata en la sangre periférica utilizando análisis RT-PCR para ARNm del PSA. Estudios simultáneos por PCR del ARN utilizando cebadores de \beta-actina demostraron la carga equivalente de ARN. Para confirmar que las señales de ARNm del PSA positivo no eran debidas a la contaminación con células tumorales durante el procedimiento de necropsia o durante la preparación de ARN, las muestras se prepararon simultáneamente a partir de un ratón de referencia que no fue implantado con un xenotrasplante. No se detectó ninguna expresión del PSA en los ratones de referencia, aun después de tiempos de exposición a la autorradiografía prolongados (Fig. 6). En el tejido de médula ósea, de bazo, de hígado, de pulmón y de riñón de ratones implantados con tumores de LAPC-4 subcutáneos se analizó también la presencia de células de cáncer de próstata utilizando RT-PCR para detectar el ARNm del PSA.

Resultados

Los ejemplos de los análisis de dos ratones (Fig. 6A, ratones nº 213 y nº 241) demuestran la detección del ARNm del PSA en la sangre a un nivel entre 0,1 y 1,0%, que es comparable a los niveles descritos en los estudios clínicos. Otros órganos fueron positivos en varios ratones, incluyendo la médula ósea (ratones 213 y 241), pulmón (ratón 214) y bazo (datos no mostrados). Los resultados de 12 animales con xenotrasplantes de LAPC-4 (Tabla 4) demuestran que el 50 por ciento de los ratones tienen células positivas a ARNm de PSA (nivel de expresión del PSA por RT-PCR de 0,1 por ciento o mayor) detectado en la sangre periférica, médula ósea o bazo. El nivel de expresión se cuantificó aproximadamente por comparación con una serie de células LNCaP en fibroblastos murinos y oscilaba entre 0,1% y 1,0%. Resulta de interés que la frecuencia de detectar la enfermedad micrometastásica fue superior (80%) en ratones hembra o en ratones macho castrados antes de la implantación en comparación con los machos íntegros (27%). Estos resultados sugieren que la transición a la enfermedad independiente del andrógeno está asociada con una frecuencia metastásica superior, hipótesis que está también apoyada por la experiencia clínica.

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Ejemplo 4 Generación de tumores intraprostáticos con células de xenotrasplante Materiales y procedimientos

Se prepararon suspensiones celulares aisladas de xenotrasplantes subcutáneos como se describe en el Ejemplo 2. Se anestesiaron los ratones SCID con cetamina/xilazina antes de la implantación. Se practicaron incisiones transversales en el abdomen inferior de ratones, se practicaron incisiones en los músculos de la pared abdominal y la vejiga y se separaron las vesículas seminales por incisión para exponer la próstata dorsal. Se inyectaron aproximadamente 10.000 células LAPC-4 en suspensión en 10 \mul de PrEGM lentamente en la próstata dorsal bajo la cápsula mediante una aguja de calibre 30, y las incisiones se cerraron utilizando una sutura continua.

Resultados

La inyección intraprostática de las suspensiones celulares aisladas preparadas a partir de los xenotrasplantes de LAPC-4 y LAPC-9 y de la estirpe celular LAPC-4 dieron como resultado tumores ortotópicos en ratones SCID receptores con 100% de eficacia.

Ejemplo 5 Simulación de la evolución hasta la etapa metastásica del cáncer de próstata en ratones SCID con tumores intraprostáticos Materiales y procedimientos

Las suspensiones celulares aisladas de células de xenotrasplante de LAPC-4 se prepararon y se utilizaron para crear tumores ortotópicos en la próstata de ratones SCID según se describe en el ejemplo anterior. La presencia de metástasis se determinó por examen histológico y por RT-PCR para detectar ARNm de PSA entre 8 y 12 semanas después de la inyección.

Resultados

Los resultados, presentados en la Tabla 5 a continuación, indican frecuencias elevadas de metástasis de linfa y pulmonar así como una frecuencia significativa de formación de metástasis de médula ósea. Un aumento de frecuencia de la metástasis ósea se observó en un subconjunto de los ratones pretratados con una combinación de radiación y reducción de células NK. Similares resultados se obtuvieron utilizando el xenotrasplante de LAPC-9.

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Ejemplo 6 Simulación de la evolución a metástasis osteoblástica ósea en ratones SCID inoculados por vía intratibial con suspensiones celulares únicas de células de xenotrasplante Materiales y procedimientos

Ensayo de inyección en la tibia: Se aislaron células de cáncer de próstata de un tumor de LAPC-4 de xenotrasplante subcutáneo y se prepararon como suspensiones celulares aisladas tal como se describe en el Ejemplo 2. Se inyectaron quirúrgicamente diez mil células LAPC-4 en suspensión en 1 \mul de Matrigel en cada metástasis de tibia proximal de una cohorte de ratones SCID mediante una aguja del calibre 27. Se sacrificaron tres ratones en cada una de las semanas 2, 4, 6, 8 y 12 después de la inyección. Los niveles de PSA en el suero se analizaron periódicamente por ELISA. A las 2 semanas, se analizaron por un método inmunohistoquímico las secciones de hueso congelado para la tinción con citoqueratina-18 con un anticuerpo específico para citoqueratina-18 humana o un anticuerpo de referencia del isótopo. En las secciones longitudinales de las tibias de los ratones sacrificados en las semanas 4, 6 y 8 se analizó el crecimiento tumoral por tinción con hematoxilina y eosina (H+E) de las secciones descalcificadas en parafina. Las radiografías de los ratones fueron tomadas en necropsia para controlar las pruebas de las lesiones osteoblásticas óseas.

Resultados

A las 2 semanas, se observaron pequeñas cantidades de células de cáncer de próstata humana por tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-citoqueratina-18 (Fig. 7). Se observaron 18 células positivas a citoqueratina dispersas en toda la cavidad medular. Estos datos indican que la mayoría de las células LAPC-4 inyectadas en la tibia de ratón ya sean muertas o migradas a otras posiciones desde solamente un pequeño subconjunto de células inyectadas pueden detectarse en este punto de tiempo.

A las 4 semanas, se observaron pequeños focos de crecimiento tumoral en unas pocas áreas aisladas, normalmente adyacentes a las espículas óseas normales, mediante histología H+E (Fig. 8A) y el PSA no pudo detectarse en el suero. En los puntos de tiempo de las semanas 6 y 8, se observó crecimiento tumoral más extenso en toda la cavidad de la médula junto con un aumento progresivo en la formación de nuevo hueso indicativa de la actividad osteoblástica dentro de la cavidad de la médula en respuesta a las células tumorales circundantes (Fig. 8B y C). Las concentraciones de PSA en el suero se elevaron de manera acusada en este punto de tiempo.

Durante 8 semanas, las lesiones óseas fueron visibles por radiografía como mezcla de lesiones osteoblásticas y osteolíticas con formación de hueso dominante similar a la observación clínica en el cáncer de próstata humano. Con referencia a la Fig. 9, el panel izquierdo presenta una radiografía de una tibia de ratón normal con la corteza aguda, bien definida y la cavidad de la médula relativamente radioopaca. El panel derecho es una radiografía de la cavidad de la médula de la tibia inyectada con células de xenotrasplante de LAPC-4, que presentan un aumento heterogéneo en la densidad del hueso debido a la actividad osteoblástica y a la destrucción de un área de la corteza. Estos resultados indican que las células del xenotrasplante de LAPC-4 pueden proliferar en huesos murinos, lo que sugiere que el cruce entre el estroma óseo y las células de cáncer de próstata puede tener lugar a través de las especies.

Ejemplo 7 Aislamiento de las células de cáncer de próstata de la médula ósea de ratones SCID con xenotrasplantes subcutáneos

La presencia de la proteína galectina-6 de la superficie celular en células LAPC-4 se demostró incubando células LAPC-4 íntegras con un anticuerpo monoclonal específico humano contra galectina-6 o isótopo de referencia. El anticuerpo se observó por citometría de flujo después de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con FITC. Los resultados de la citometría de flujo presentan la expresión de galectina-6 a un nivel que es por lo menos un orden de magnitud superior al fondo (Fig. 10). Los experimentos similares realizados en médula ósea de ratón no mostraron ninguna tinción con galectina.

Como se describe en el Ejemplo 3, pequeñas cantidades de células de cáncer de próstata pueden detectarse en la médula ósea de ratones SCID con xenotrasplantes subcutáneos a las 4 a 6 semanas después de la incubación, lo que representa algo menos del 1% de las células en la médula. Esta población de células de cáncer de próstata puede aislarse de la médula ósea utilizando el sistema de purificación por afinidad basado en anticuerpo Miltenyi Magnetic Minimacs (Sunnyvale, CA) y anticuerpo anti-galectina-6 de la manera siguiente. Se practicó la eutanasia a veinte ratones con tumores de LAPC-4 subcutáneos tras la implantación de los xenotrasplantes. Se extrajo la médula ósea de las tibias y fémures por rociado de las cavidades de médula ósea con solución salina. La médula se mezcló e incubó con un anticuerpo monoclonal específico humano contra la galectina-6 y un anticuerpo secundario conjugado con lentejas magnéticas y se introdujo a través de la columna Minimacs según recomienda el fabricante. Las células LPAC-4 se mantendrán en la columna, mientras que las células de la médula ósea de ratón pasarán a través de ella. Las células LAPC-4 purificadas pueden extraerse a continuación de la columna y expandirse sembrando tumores subcutáneos en ratones SCID.

Ejemplo 8 Aislamiento de células de cáncer de próstata de la médula ósea de ratones SCID inyectados dentro de la tibia con células de xenotrasplante

Se crearon tumores intratibiales en ratones SCID utilizando células LAPC-4 como se describe en el Ejemplo 6. Las células LAPC-4 que crecen en la médula ósea se recuperan de los ratones tras la necropsia a las 12 semanas rociando la cavidad de la médula de la tibia con solución salina y recogiendo las células. A las 12 semanas tras la inyección, aproximadamente el 90% de las células recuperadas son células de tumor de próstata con algunas células de médula ósea murina residual. Esta población de células puede purificarse más para las células de cáncer de próstata utilizando el método de purificación por afinidad con anticuerpo galectina-6/magnético como se describe en el Ejemplo 7.

Ejemplo 9 La estirpe celular LAPC-4 conserva la expresión de PSA, receptor del andrógeno y fosfatasa ácida prostática mediante múltiples pases Materiales y procedimientos

Se creó una estirpe celular continua a partir del xenotrasplante de LAPC-4 por pase en serie de tejido de xenotrasplante troceado, tratado con tripsina en medio de cultivo Iscove enriquecido con suero de ternero fetal al 20%.

Resultados

Las células LAPC-4 que crecen en cultivo continuo in vitro han mantenido la expresión de PSA, receptor del andrógeno y de la fosfatasa ácida prostática durante más de 20 pases. Además, las células LAPC-4 no contienen mutaciones en el ADN o en los dominios de unión al ligando del receptor andrógeno, lo que es una nueva característica entre los modelos de cáncer de próstata conocidos. La otra única estirpe celular que expresa a PSA, LNCaP, expresa a un receptor del andrógeno con una mutación puntual en el dominio de unión al ligando. Además, las células LAPC-4 continúan para expresar el receptor del andrógeno en sublíneas independientes del andrógeno, análogas a los resultados obtenidos del análisis del material clínico. La estirpe celular LAPC-4 es dependiente del andrógeno ya que los tumores crecen rápidamente en ratones macho pero no en ratones hembra o macho castrados. La estirpe celular LAPC-4 ha permanecido creada durante más de 20 pases y ha estado en cultivo continuo durante más de 18 meses. Estas células continúan expresando PSA, forman tumores en ratones SCID y conservan sensibilidad al andrógeno.

Ejemplo 10 Experimentación de los efectos biológicos de genes experimentales en cultivo in vivo independiente del andrógeno

Algunos genes aumentados en el cáncer de próstata resistente a hormonas pueden contribuir a la patogénesis con independencia del andrógeno. BcI-2, por ejemplo que aumenta en muchos cánceres de próstata avanzados, se ha demostrado que proporciona independencia del andrógeno a la estirpe celular de cáncer de próstata LNCaP dependiente del andrógeno (Raffo et al., 1995). Según este ejemplo, se puede acceder in vivo a la contribución de genes experimentales para el fenotipo independiente del andrógeno.

Los explantes tumorales dependientes del andrógeno LAPC-4 se cultivan en cultivo tisular y forman tumores dependientes del andrógeno en reinyección en ratones SCID

Los bioanálisis actuales para crecimiento dependiente e independiente del andrógeno se basan casi exclusivamente en la estirpe celular de cáncer de próstata LNCaP, porque es la única estirpe celular disponible que presenta características de dependencia del andrógeno. Con objeto de solucionar el problema de la estirpe celular que han sido objeto de pases de larga duración con el potencial de múltiples mutaciones in vitro, se cultivó el xenotrasplante de LAPC-4 en cultivo de corta duración y a continuación se reinyectó en ratones para formar tumores. Los tumores explantados se manipularon genéticamente a continuación y se midieron in vivo los efectos de estas manipulaciones.

Los tumores de LAPC-4 se trocearon en pequeñas piezas y se cultivaron en medio con suero de ternero fetal al 15%. El crecimiento tanto de células epiteliales como de fibroblastos se notó después de 2 a 3 días. Las células se cultivaron a continuación hasta confluencia y pudieron ser objeto de pases con éxito para eliminar las piezas de tumor originales. La RT-PCR confirmó la expresión continua de PSA. Se reinyectaron a continuación 1 \times 10^{7} células en ratones macho íntegros o SCID castrados. De manera similar a los experimentos iniciales, las células inyectadas formaron tumores de modo dependiente del andrógeno, lo que requiere periodos prolongados para formar tumores en los ratones castrados.

Los cultivos de LAPC-4 pueden transducirse con retrovirus

Con objeto de probar la infectabilidad de las células LAPC-4 explantadas por retrovirus, estas células se transdujeron con un vector retrovírico que contiene un gen receptor del factor de crecimiento de nervios truncado (NGFR). Una estirpe celular con empaquetamiento PG13, que contiene la envoltura del virus de la leucemia del mono gibón (GALV), se utilizó para generar un virus con título elevado. Los viriones del retrovirus producidos de esta manera presentan la única propiedad de infectar al hombre, pero no las células murinas, impidiendo de este modo la introducción del transgén en células de estroma de ratón (Bauer et al., 1995). Tras la infección, las células se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra NGFR y se analizaron por análisis FACS. Cinco al 10% de las células se transdujeron. Las referencias negativas de fibroblastos murinos no presentaban infección, mientras que las células 293T humanas se transdujeron con eficacia.

Análisis biológico para ADNc regulado por aumento en el cáncer de próstata independiente del andrógeno

Los ADNc experimentales pueden clonarse en la posición 5' del vector retrovírico pSRalfa utilizado extensamente en el laboratorio de los inventores (Afar et al., 1994). Un gen indicador, ya sea NGFR, LacZ, o la proteína verde fluorescente (GFP) optimizada por el codón humano, se insertaría corriente abajo. El plásmido puede transfectarse en la estirpe celular con empaquetamiento PG13, recogerse el virus y medirse los títulos. Las células LAPC-4 pueden infectarse después del primer pase y a continuación propagarse sin selección hasta que estén disponibles en número suficiente para la inyección. La expresión del transgén puede confirmarse bien por análisis de FACS o por análisis de transferencia Northern utilizando el clon de ADNc de RDA como sonda.

Dos tipos diferentes de experimentos pueden realizarse. En el primero, las células infectadas se inyectan en los costados de ratones SCID macho íntegros. Una vez los tumores forman en ambos costados de un ratón individual, se extrae un tumor y el ratón se castra a continuación. El tumor explantado se analiza para cuantificar el porcentaje de células infectadas. Esto puede realizarse ya sea por tinción con LacZ o por análisis FACS para GFP o NGFR. Los autores prevén que del 5 al 10% de las células llevará el transgén. El tumor restante puede analizarse de manera similar una vez se retrograda y vuelve a crecer (es decir, aproximadamente de 4 a 8 semanas tras la castración). Si el transgén proporciona una ventaja de supervivencia o independencia del andrógeno para las células infectadas, sería de esperar el observar que el porcentaje de células con transgén aumenta después de la extirpación hormonal. Pueden inyectarse muchos ratones en cada montaje y confirmarse los resultados positivos por repetición.

En una segunda serie de experimentos, se pueden implantar células infectadas en ratones macho íntegros y castrados en paralelo después de cuantificar la frecuencia de la infección. Los tumores resultantes (a las 4 y 12 semanas, respectivamente) se analizan para la frecuencia de inserción como se describió anteriormente. De nuevo, los autores esperan que los genes "independientes del andrógeno" proporcionen una ventaja de crecimiento independiente del andrógeno y predominen en el tumor resultante. Además, es posible que un gen experimental dado se clasifique en el tiempo para la formación tumoral en machos castrados. Esto puede también medirse. Por último, es posible que un gen dado pueda producir crecimiento intensivo dependiente del andrógeno. Esto también puede cuantificarse en este análisis, comparando el tiempo para la formación del tumor y la frecuencia de inserción antes y después de la inyección en ratones macho íntegros.

Estos análisis pueden validarse con referencias positivas. En particular, se puede utilizar bci-2, c-myc y c-met, ya que éstas se han asociado de manera coherente a la independencia del andrógeno.

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Claims

1. Procedimiento para simular la evolución del cáncer de próstata humano desde la formación del tumor primario hasta la micrometástasis en un modelo animal que comprende:

a.: generar un xenotrasplante de cáncer de próstata humano en un ratón SCID inmunodeficiente implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico, o una suspensión celular del mismo procedente de un hombre en un ratón SCID inmunodeficiente; y

b.: permitir que el xenotrasplante crezca durante un tiempo suficiente que permita la detección de las células de cáncer de próstata en el interior y externas al punto del implante en el ratón SCID inmunodeficiente simulando así la evolución del cáncer de próstata humano desde la formación del tumor primario hasta la micrometástasis en el modelo animal.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el implante es subcutáneo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el implante es intraprostático.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa en la sangre periférica del ratón SCID inmunodeficiente.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa en la médula ósea del ratón SCID inmunodeficiente.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa en el tejido del ganglio linfático del ratón SCID inmunodeficiente.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección se efectúa en el tejido óseo del ratón SCID inmunodeficiente.

8. Procedimiento de simulación de la evolución de la metástasis ósea osteoblástica en el cáncer de próstata humano en un modelo de ratón que comprende:

a.: inyectar dentro de la cavidad de la médula ósea tibial de un ratón SCID inmunodeficiente, células de cáncer de próstata preparadas a partir de un xenotrasplante de cáncer de próstata generado implantando en un ratón SCID inmunodeficiente tejido de cáncer de próstata humano localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo; y

b.: permitir que las células inyectadas se desarrollen y formen una lesión ósea osteoblástica que estimule la evolución de la metástasis ósea osteoblástica en el cáncer de próstata humano en el modelo de ratón.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa de aporte proporciona células de cáncer de próstata humano procedentes de un xenotrasplante de cáncer de próstata, en el que el xenotrasplante procede de otro ratón SCID inmunodeficiente en el que se implantó tejido de cáncer de próstata humano localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo.

10. Procedimiento para identificar un gen que minimiza la evolución del cáncer de próstata humano, que comprende las etapas siguientes:

a.: introducir el gen en un ratón SCID inmunodeficiente sujeto que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo en el ratón SCID inmunodeficiente sujeto, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde enfermedad sensible al andrógeno hasta independiente del andrógeno;

b.: transducir las células del xenotrasplante con el gen in vivo;

c.: evaluar la presencia de micrometástasis en el ratón SCID inmunodeficiente sujeto detectando las células de cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que se determina el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico como referencia a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva el xenotrasplante de próstata humano y en el que el gen no se ha introducido, por lo que el xenotrasplante del ratón de referencia no está transducido; y

d.: seleccionar un gen que altere la evolución del cáncer de próstata en el ratón sujeto en comparación con la evolución del cáncer en el ratón de referencia.

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11. Procedimiento para identificar un gen que facilita la evolución del cáncer de próstata humano, que comprende las etapas siguientes:

a.: introducir el gen a un ratón SCID inmunodeficiente sujeto que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado implantando localmente el tejido de cáncer de próstata avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo en un ratón SCID inmunodeficiente sujeto, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde la enfermedad sensible al andrógeno hasta la independiente al andrógeno;

b.: transducir las células del xenotrasplante con del gen in vivo;

c.: evaluar la presencia de micrometástasis en el ratón SCID inmunodeficiente sujeto detectando las células del cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico se determina como referencia a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva el xenotrasplante humano de próstata y en el que no se ha introducido el gen, por lo que el xenotrasplante del ratón de referencia no está transducido; y

d.: seleccionar un gen que facilita la evolución del cáncer de próstata en el ratón sujeto con relación a la evolución del cáncer de próstata en el ratón de referencia.

12. Procedimiento para evaluar el efecto de una composición o tratamiento sobre el cáncer de próstata, que comprende:

a.: proporcionar un ratón SCID inmunodeficiente que comprende un xenotrasplante de cáncer de próstata humano de tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo;

b.: someter al ratón a la composición o tratamiento; y

c.: determinar el efecto de la composición o tratamiento sobre el crecimiento del xenotrasplante en dicho ratón.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de determinación comprende comparar el crecimiento del xenotrasplante en el ratón con el crecimiento del xenotrasplante en por lo menos otro ratón SCID inmunodeficiente que no recibió el tratamiento.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de aporte proporciona un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante subcutáneo.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de aporte proporciona un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante intraprostático.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de aporte proporciona un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante en el interior de la cavidad de la médula ósea del ratón.

17. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que:

a.: la etapa (b) somete al ratón con xenotrasplante a una composición o tratamiento cuya eficacia, respectivamente, no se conoce para el tratamiento del cáncer de próstata humano; y,

b.: la etapa (c) determina que el tratamiento o composición es eficaz para alterar el crecimiento del xenotrasplante del cáncer de próstata humano en el ratón.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 8 y 12, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde la enfermedad sensible al andrógeno hasta la independiente del andrógeno.

19. Procedimiento de producción de un modelo de ratón híbrido de cáncer de próstata humano que comprende:

a.: implantar tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo de un ser humano en un primer ratón SCID inmunocomprometido en un punto que vasculariza el tejido de cáncer de próstata humano implantado;

b.: determinar si el tejido de cáncer de próstata humano o la suspensión celular del mismo da como resultado el modelo de ratón que simula la transición clínica desde la enfermedad dependiente del andrógeno hasta la independiente del andrógeno; y

c.: seleccionar el modelo de ratón híbrido que simula la transición clínica desde la enfermedad dependiente del andrógeno hasta la independiente del andrógeno.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el tejido de cáncer de próstata humano o la suspensión celular del mismo está implantado en otro ratón SCID inmunocomprometido y el tejido de cáncer de próstata humano así implantado mantiene las características humanas.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, que comprende además las etapas siguientes:

a.: recoger tejido de cáncer de próstata humano de dicho modelo híbrido de ratón; y

b.: inyectar dicho tejido recogido en un segundo ratón SCID inmunocomprometido dando así como resultado un modelo híbrido de ratón con tejido de cáncer de próstata humano que ha sido objeto de pases.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el tejido de cáncer de próstata humano recogido se inyecta por vía subcutánea.

23. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el tejido de cáncer de próstata humano o la suspensión celular del mismo se pasa a por lo menos un ratón SCID inmunocomprometido adicional.

24. Ensayo para evaluar el efecto de un tratamiento de cáncer de próstata humano que comprende:

a.: aplicar el tratamiento a un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano subcutáneo generado implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular de éste procedente de un ser humano en el ratón SCID inmunodeficiente;

b.: determinar el efecto del tratamiento sobre el crecimiento del xenotrasplante en dicho ratón.

25. Ensayo para evaluar el efecto de un gen de interés para el cáncer de próstata humano que comprende:

a.: introducir el gen en un ratón SCID inmunodeficiente que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata humano generado implantando tejido de cáncer de próstata localmente avanzado o metastásico o una suspensión celular del mismo en el ratón SCID inmunodeficiente;

b.: transducir las células del xenotrasplante con el gen in vivo;

c.: evaluar la presencia de micrometástasis en el ratón SCID inmunodeficiente detectando las células del cáncer de próstata en la sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos u otros puntos distantes del punto del xenotrasplante; en el que se determina el efecto del gen sobre la evolución del cáncer de próstata micrometastásico como referencia a un ratón SCID inmunodeficiente de referencia que lleva un xenotrasplante de próstata humano generado con un subconjunto no transducido de las células del xenotrasplante.

26. Ensayo según la reivindicación 25, en el que la etapa de introducción introduce el gen al ratón SCID inmunodeficiente sujeto que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata subcutáneo humano.

27. Ensayo según la reivindicación 25, en el que la etapa de introducción introduce el gen al ratón SCID inmunodeficiente sujeto que lleva un xenotrasplante de próstata intraprostático humano.

28. Ensayo según la reivindicación 25, en el que la etapa de introducción introduce el gen al ratón SCID inmunodeficiente sujeto que lleva un xenotrasplante de cáncer de próstata intraóseo humano.

29. Ensayo según la reivindicación 24 ó 25, en el que el xenotrasplante simula la transición clínica desde enfermedad sensible al andrógeno hasta independiente del andrógeno.