CN103917871A - 增加从流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于增加从含有细胞的流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法及材料。本方法包括分离在过滤器上的靶细胞，并且然后在具有免疫缺陷的非人类动物中植入含有靶细胞的过滤器，其中至少一些靶细胞可以增殖。

Description

增加从流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月7日提交的美国申请序列第61/531848号的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于增加从含有细胞的流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法及材料，更具体地，涉及通过分离在过滤器上的靶细胞并且然后在具有免疫缺陷的非人类动物中植入含有靶细胞的过滤器来增加从含有细胞的流体样品中所回收的靶细胞的数量，其中至少一些靶细胞可以增殖。
背景技术
尽管在诊断和治疗实体瘤方面已经取得了长足的进步，但转移性疾病仍然是癌症相关死亡的首要原因。虽然转移发展的机理尚未被完全阐明，但是衍生于患者血流中原发肿瘤的肿瘤细胞的循环是转移级联中的基本中间事件。检测循环肿瘤细胞(CTC)对于患者护理很重要，这是因为许多原因，包括早期检测继发性肿瘤、监测对治疗的反应、以及监测疾病的进展。然而，由于血液中具有这种小数量的CTC(例如，在转移性癌症患者的外周血中的每109个细胞中具有约1个CTC)，但仍然需要用于捕获、检测以及生长CTC的方法及材料。
发明内容
此文件基于用于增加从含有细胞的流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法的发现。如本文所述，靶细胞基于尺寸可以保留在过滤器上或中，并且然后可以将含有靶细胞的过滤器植入到非人类动物中，优选的是具有免疫缺陷的非人类动物，其中所述细胞可以增殖。这样的方法可以用来增加稀少循环细胞比如从外周血样品中所回收的CTC的数量，并且创建患者肿瘤的个性化动物模型，其例如可用于评价患者的肿瘤，评估细胞的转移潜能，以及确定细胞对不同化疗药物的响应。
在一方面，本文件的特征在于一种增加来自含有细胞的流体样品中的靶细胞的数量的方法。所述方法包括：提供包括一个或多个靶细胞的过滤器，所述一个或多个靶细胞通过样品穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体含有靶细胞和非靶细胞的样品中获得，其中，过滤器中的孔的尺寸导致靶细胞保留在所述过滤器上或中；以及在非人类动物例如具有免疫缺陷的非人类动物比如具有免疫缺陷的鼠中植入所述过滤器和在所述过滤器上的所述一个或多个靶细胞，其中，在所植入的过滤器上或中的一个或多个细胞中的一些或全部在所述动物中增殖。在样品通过所述过滤装置的过程中，基本上所有的非靶细胞可以穿过所述过滤器。所述具有免疫缺陷的鼠可以对于严重联合免疫缺陷(SCID)自发突变(Prkdcscid)是纯合的；对于裸自发突变(Foxn1nu/nu)是纯合的；对于Rag1突变是纯合的；对于Rag2突变是纯合的；或者对于Rag1及Rag2突变是纯合的。
所述方法还可以包括提供一至四个附加的过滤器(例如，一个、两个、三个或四个附加的过滤器)，每个附加的过滤器包括一个或多个靶细胞，并且在所述具有免疫缺陷的非人类动物中植入所述第一和附加的过滤器。所述第一和附加的过滤器可以从单一的过滤装置中或者从单独的过滤装置中获得。所述方法还可以包括在植入所述过滤器和在所述过滤器上的所述一个或多个靶细胞之前将所述过滤器基本上堆叠在彼此的顶部上以产生多层的培养装置。
本文所述的任何方法还可以包括在植入所述过滤器和在所述过滤器上的所述一个或多个靶细胞之前接触所述过滤器及包含所述靶细胞的任何附加的过滤器的表面，其具有可以从液体转变成凝胶相的组合物，而对靶细胞没有致死或毒性作用。所述组合物可以包括一个或多个细胞外基质(ECM)成分(例如，重组的基底膜)。
在本文所述的任何方法中，所述过滤器可以包括固定于其的一个或多个化合物。在本文所述的任何方法中，一个或多个化合物可以被施用至具有免疫缺陷的动物。例如，所述一个或多个化合物可以选自由生长因子、细胞外基质蛋白、酶、报道分子、脂质体以及核酸构成的组。所述生长因子可以是表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或转化生长因子(TGF)。所述细胞外基质蛋白可以是胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、或硫酸乙酰肝素。所述报道分子可以包括荧光团-淬灭剂双重标记探针，其是用于金属蛋白酶的基片。
在本文所述的任何方法中，所述方法还可以包括监测在所述具有免疫缺陷的动物中的所述细胞的生长。
在本文所述的任何方法中，所述流体含有细胞的样品可以包括外周血细胞，或者可以包括来自尿、骨髓、淋巴、淋巴结、脾、脑脊髓液、导管流体、活检标本或针活检抽吸物的细胞。
在本文所述的任何方法中，所述方法还可以包括在所述植入步骤之前培养所述一个或多个靶细胞。
在本文所述的任何方法中，所述靶细胞可以是癌细胞、循环癌细胞、胎儿细胞、或干细胞(例如，内皮干细胞或间充质干细胞)。
在另一方面，本文件的特征在于一种包括至少一个植入的过滤器的非人类的具有免疫缺陷的动物，所述过滤器包括通过穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体含有靶细胞和非靶细胞的样品中获得的多个靶细胞，其中，过滤器中的孔的尺寸导致靶细胞保留在所述过滤器上或中。所述动物还可以包括一至四个附加的植入的过滤器(例如，一个、两个、三个或四个)，每个所述附加的过滤器包括一个或多个靶细胞。所述第一和附加的过滤器可以从单一的过滤装置中或者从单独的过滤装置中获得。所述第一和附加的过滤器可以基本上堆叠在彼此的顶部上，以产生多层的三维培养装置。所述过滤器和包括所述靶细胞的任何附加的过滤器的表面可包括可以从液体转变成凝胶相的组合物，而对靶细胞(例如，人靶细胞)没有致死或毒性作用。
本文件的特征还在于一种测试在包括测试细胞的流体样品中的肿瘤细胞的存在的方法。所述方法包括：提供包括通过穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体测试含有细胞的样品中所获得的多个测试细胞的过滤器，其中，过滤器中的孔的尺寸导致一个或多个测试细胞保留在所述过滤器上或中；在所述具有免疫缺陷的非人类动物中植入所述过滤器和在所述过滤器上或中的所述一个或多个测试细胞；以及对于肿瘤的存在或不存在，监测所述具有免疫缺陷的非人类动物，其中，肿瘤的存在表明测试细胞包括肿瘤细胞。所述测试细胞可以是人细胞。所述流体含有细胞的样品可以包括外周血细胞，或者包括来自尿、骨髓、淋巴、淋巴结、脾、脑脊髓液、导管流体、活检标本或针活检抽吸物的细胞。所述方法还可以包括：如果所述肿瘤存在的话，将化学治疗剂施用至所述非人类动物；以及为响应于所述化学治疗剂，监测所述肿瘤。
在另一方面，本文件的特征在于一种增加来自含有细胞的流体样品中的靶细胞的数量的方法。所述方法包括：提供流体含有靶细胞和非靶细胞的样品；使所述样品穿过过滤装置，所述装置包括紧固至过滤器的过滤器支撑、具有上部开口和下部开口的隔室、以及相对于所述隔室可移动的构件，用于将力施加至支撑并释放所述支撑；从所述装置中去除含有一个或多个靶细胞的所述过滤器；以及将所述过滤器和在所述过滤器上或中的所述靶细胞植入到所述具有免疫缺陷的非人类动物中，其中，在所植入的过滤器上或中的一个或多个细胞中的一些或全部在所述具有免疫缺陷的动物中增殖。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些相类似或等同的方法及材料可以用于实施本发明，但下面将对合适的方法及材料进行说明。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用的方式将其全部内容并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法以及示例仅是说明性的，并非旨在进行限制。
根据下面的详细说明书以及权利要求书，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1是根据本文所述的实施例的用于从流体样品中回收靶细胞的过滤装置的透视图。
图2A和2C是图1的实施例的垂直轴向截面图，图1中所示的部件组装在一起。图2A和2C中圈定的部分分别以图2B和2D中的放大示图示出。
图3A-3O是图1的过滤装置的正视图或剖视图，从存储配置(3A)通过使用该装置(3B-3O)用于从流体样品中分离和回收靶细胞的每个步骤。
图4是在使用之前的过滤装置的一实施例的透视图。
图5示意性地示出了在去除保护膜之后并在插入真空管之前的图4中所示的装置的实施例。
图6示意性地示出了在插入真空管之后的图4和5中所示的装置的实施例。
图7示意性地示出了在去除真空管和保护筒的过程中的图4-6中所示的装置的实施例。
图8A是通过Cyto装置过滤后的活H2030细胞的显微照片。图8B是来自图8A中的细胞在培养基中培养过滤器达4天之后的显微照片。图8A和8B中的细胞代表8个独立的实验；在显微镜(x40)下观察细胞。
各个附图中相同的参考标记表示相同的元件。
具体实施方式
一般而言，本文件基于用于增加从包含靶细胞和非靶细胞的流体样品中所回收的靶细胞的数量的方法及材料。术语“含有细胞的流体样品”是指含有细胞悬浮液的液体。非限制性示例包括生物流体，比如血液(例如，外周血或脐带血)、尿液、淋巴液、脑脊髓液、或导管流体、或稀释于生理溶液(例如盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)或组织培养基)中的这样的流体、或者从生物流体(例如，通过离心)中所获得的并悬浮于生理溶液中的细胞。“含有细胞的流体样品”的其它示例包括从骨髓抽吸物、针活检抽吸物或活检标本(例如，来自淋巴结或脾)中所获得的细胞悬浮液(在生理溶液中)。这样的流体样品可以从任何哺乳动物受试者中获得，包括人类、猴子、鼠、兔、豚鼠、狗或猫。来自人类受试者的流体样品是特别有用的。在其中流体样品含有红血细胞的实施例中，红血细胞可以选择性地例如通过使用含有氯化铵或皂角苷的缓冲液而被裂解，或者例如通过密度梯度沉降或羟乙基淀粉聚集而被除去。
如本文所述，活靶细胞可以从在过滤器上或中的流体样品中回收，然后可以将过滤器植入具有免疫缺陷的非人类动物中，其中所述靶细胞可以增殖。靶细胞可以包括胎儿血细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、播散性肿瘤细胞(DTC)(即骨髓中的肿瘤细胞)、或干细胞(例如，癌症干细胞、间充质干细胞、或内皮干细胞)。例如，胎儿血细胞可以从母体血液(任选地稀释于生理溶液中)的样品中回收，并且用于非侵入性产前诊断。可以将含有从具有或怀疑具有癌症(例如，乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、甲状腺癌或淋巴瘤)的患者中所回收的靶细胞的一个或多个过滤器植入具有免疫缺陷的非人类哺乳动物中来增加靶细胞(包括俘获在过滤器中或上的靶细胞的后代)的数量用于进一步表征，包括基因组学、蛋白质组学、免疫细胞化学或荧光原位杂交(FISH)化验中的一个或多个，例如以便有助于预后判断。植入到具有免疫缺陷的动物中还允许判定靶细胞启动肿瘤与转移的能力，和/或判定细胞对一种或多种化学治疗剂的响应性。
非靶细胞是含有除靶细胞以外的流体样品中的所有细胞。因此，例如在其中靶细胞是CTC的血液中，非靶细胞会包括红血细胞、淋巴细胞(T和B)、单核细胞以及粒细胞，它们比大多数癌细胞更小。例如，其中含有细胞的流体样品是从淋巴结组织制备的细胞悬浮液且靶细胞是癌细胞，非靶细胞将包括淋巴细胞(T和B)、单核细胞、巨噬细胞以及粒细胞，它们比大多数癌细胞更小。
过滤装置
含有靶细胞和非靶细胞的流体样品可以穿过包括过滤器的过滤装置，其中，过滤器中的孔的尺寸导致靶细胞保留在过滤器上或中。为了制备样品用于通过过滤器装置，通常采用含有培养基的缓冲液(例如，RPMI比如RPMI1640、DMEM或MEM)来稀释样品，缓冲液补充有牛血清白蛋白、红血细胞裂解剂(比如氯化铵、皂角苷或碳酸氢钾)、杀生物剂比如叠氮化钠或次氯酸盐溶液(0.1至2mM)、以及任选的钙通道阻滞剂比如氨氯地平、贝尼地平或巴尼地平，并且样品被培育达一至五分钟(例如，一分钟、两分钟、三分钟、四分钟或五分钟)。例如，缓冲液可以补充有0.2至2g(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0g)的BSA、0.01至0.1g(例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或1.0g)的红血细胞裂解剂、0.1至2mM(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0mM)的杀生物剂、以及5至30nM(例如，5、10、15、20、25或30nM)的钙通道阻滞剂。培育之后，细胞培养基(例如RPMI)被加入到稀释的样品，然后其透过该装置过滤。在样品通过过滤装置的过程中，基本上所有即大于99％的非靶细胞穿过该过滤器。通过向过滤器的下侧施加真空，流体样品的非靶细胞可以穿过过滤器。在一些实施例中，通过将管引入到装置的保持器内来促使样品的非靶细胞穿过过滤器，一旦装置的橡胶帽被刺穿，其就在管中的血液体积与真空之间建立压力差，从而迫使血液通过滤器并进入管中。
含有过滤器的过滤装置并不限于特定的结构，并且可以是任何的形状、尺寸或材料，前提是只要其a)能够接收含有细胞的流体样品，并且支撑过滤器，其中孔的尺寸将靶细胞保留在过滤器上或中，以及b)配置成用于在样品通过过滤器之后除去流体。例如，过滤装置可以包括以下中的一个或多个：由一种或多种聚合物比如聚碳酸酯、聚酰胺、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、或聚醚醚酮(比如PEEKTM)制成的塑料；金属合金，比如不锈钢(例如，手术钢)；陶瓷、玻璃；或复合材料。(巴黎，法国)的过滤装置是特别有用的，并且已用于本文所述的方法。还参见在美国专利公开号20110070642、美国专利公开号20110104670、美国专利公开号20090081772、美国临时申请号61/417526、WO2011055091、WO2009106760以及WO2009047436中所述的过滤装置，这些专利中的每个的全部内容通过引用并入本文。
在一实施例中，所述过滤装置包括隔室，用于接收流体样品和安装(至少暂时地)到隔室开口上的过滤器。该过滤装置还可以包括安装(至少暂时地)到隔室开口上的针。在这样的实施例中，过滤器位于针与隔室的内部容积之间。所安装的针设计成刺穿真空管(例如，血液真空管)的插塞，创建相对于环境压力的负压，以便抽吸通过过滤器的液体。这样的过滤装置允许活细胞在与进一步培养和/或植入到具有免疫缺陷的非人类动物中相容的条件下被分离并收集在过滤器上。
图1示出了过滤装置(巴黎-法国)的一实施例，其包括储藏室或隔室102、端部件104、密封件106、带有支撑件108的过滤器、可动构件110、密封件112以及插塞114。隔室102大致为圆筒形。其上端可通过插塞114以这样不可渗透的方式密封。隔室102的下端在其外表面上具有带有间隙的不连续环，其引导腿在可动构件110上，所述环引导可动构件110的主体。
此可动构件110的形状通常是圆筒形并且具有两个腿，它们朝向端部件104延伸并且在该方向上一起缩小，从而在它们之间存在间隔，测量小于过滤器支撑件108的直径。如随后将要说明，这种特殊的形状，特别是朝向彼此弯曲的腿116的形状，允许可动构件110在其从端部件104取下之后将压力施加至过滤器支撑件108，以便使过滤器支撑件与过滤器一起从隔室102释放，同时可动构件移向过滤器支撑件108。
可动构件110的腿116的端部和隔室102的下端被设计成插入到细胞培养盒或孔中。隔室102端部的不连续环的直径被设计成使得隔室可以被支撑在细胞培养盒或孔的边缘上。
端部件或适配器104位于隔室102的下部开口。端部件或适配器104夹住隔室102的外壁，并且具有直径比隔室102的直径更小的下部窄开口。端部件或适配器104是可拆卸的、不可渗透的、以及无菌的。端部件或适配器104中的下部窄开口足够长，以使得能够无泄漏地机械配合针的孔(参见图3B至3D)。
以与隔室102的下端(其具有横向凸耳118)的形状相配合的方式，端部件104具有旋转锁定构件，用于以公知方式夹持凸耳。这样，端部件104允许过滤器架在过滤期间保持在适当位置。另外，端部件104保护过滤器免遭喷溅及任何潜在的污染。
连接时，隔室102的下端具有排出到由过滤器支撑件108保持的过滤器上的开口，该支撑件自身一方面通过隔室102的下端且另一方面通过端部件104而保持在适当位置。
在一实施例中，过滤器支撑件108的形状为环状的圆盘。该过滤器是微穿孔的，并且融合到过滤器支撑件108的下侧，然后与其一起插入到隔室102的下端中。
过滤器支撑件108可以是环形的，并且例如由塑料比如聚氯乙烯(PVC)或金属合金比如手术钢制成。由手术钢制成的过滤器支撑件在过滤装置中是特别有用的。环的厚度被设计成允许其被扫描。过滤器支撑件可以包括标识符，从而使所收集的细胞可以与患者相关联。在一实施例中，过滤器支撑件的外径可以是例如12至13毫米，比如12.6毫米，过滤器支撑件108所连接的过滤器的直径可以是5.5至6.5毫米，比如5.9毫米。
在一实施例中，隔室102、端部件104及可动构件110例如由聚丙烯构成。密封件106和112例如由硅树脂制成。
图2A和2C是图1所示的实施例的垂直轴向截面的视图。图2B和2D分别是图2A和2C的圈定部分的放大视图。
图3A表示过滤装置的正视图，处于其存储配置。图3B表示端部件104插入到针180的孔181中，该针具有另一非常精细的斜削端182，以便更容易地刺穿真空管插塞。针180的孔181优先地由塑料制成。针180的端部182优先的是金属。在液体(未示出)例如血液通过上部开口而被引入到隔室102中之前或者之后，针180可定位在端部件104上。
图3C示出了一旦针180不可透过地接合至端部件104就开始被刺穿的真空管185插塞186。
图3D示出了完全由针180刺穿的插塞186，通过过滤器108，将负压真空管185的内部连接至保持含有所关注细胞的液体的隔室102的体积。真空管185的内部容积大于待过滤的液体的体积。
在过滤过程中，存在于隔室102中的流体样品中的某些靶细胞(直径较大)由过滤器108保留，而基本上所有的液体内容物和尺寸比靶细胞更小的细胞通过过滤器108被抽吸到真空管185中。
接下来，如图3E和3F所示，端部件104在旋转至将其从凸耳118释放之后被去除。然后，如图3G和3H所示，隔室102的端部插入到细胞培养盒或孔130中。
如上所述以及如图3I所示，靠近可动构件110的腿116的端部和隔室102的下端设计成插入到细胞培养盒或孔中。与此相反，在隔室102的端部的不连续环的直径允许其被支撑在培养盒或孔130的边缘上。
更准确地说，如图3J和3K所示，可动构件110可以在该位置仍平行于隔室102的轴线移动。
如图3L、3M和3N所示，在此运动过程中，移动构件的腿116在通过操作者的手指移动时施加垂直向下的压力于过滤器支撑件108上，并且将其从隔室102的下端释放。然后，过滤器及其支撑件108下落到细胞培养盒或孔130中。
最后，如图3O所示，将隔室102和移动构件110从细胞培养盒或孔130中移除。
图4-7涉及使用保护引导圆筒用于真空管的过滤装置的特定实施例。图4至7示出了隔室102、可动构件110以及通过两部分的连接构件504和520而连接至隔室102的保护筒502。
该保护筒包括连接构件部分504、磨砂部分506、透明部分508以及在隔室102对面的开口上的保护膜510。
部分520形成在隔室102的端部内。图7示出了包括相对于室102共轴地横向定位在圆筒形部分上的4个爪齿522的部分520的特定实施例。在本实施例中，部分504包括四个槽，轮廓对应于爪齿的外形。这些槽524以椭圆形的方式从设计成容纳爪齿522的开口朝向保护筒502的内部延伸，以便通过旋转保护筒502(如由图7中的箭头所指示)促使每个爪齿522移入相应的槽524中且促使保护筒502被紧固到隔室102上。
保护筒502连接至承载针180的端部件，如下所述。针180嵌入在部分504(其是对着隔室502的部分)的下部中。部分504通过4根辐条被强制安装到部分506上。辐条位于部分504上，并插入到位于部分506上的四个槽中。
部分506用于隔离和保护针180。透明部分508使用户能够验证过滤的状态及完成。
保护膜510(其覆盖并密封圆筒502的整个下部开口)配备有从(图4中所示的)圆筒502延伸短距离的横向部分。此横向部分允许膜510可被很容易地除去。
保护膜510保护用户免于接近针180。膜510还保护针180免遭堵塞和/或污染的风险。
圆筒502可以被小心地着色，例如蓝色、绿色或黄色，这取决于过滤装置所使用的目的(分别是细胞学、分子生物学及培养研究)。
注意，在图5中，在待过滤的液体被引入到隔室102中且膜510被移除之后，装配有插塞186的真空管185被插入到保护引导圆筒502中。然后，将力施加至真空管185，以使得针180刺穿插塞186，如上所述。
在由此产生的装配中，如图6所示，最初存在于真空管185中的负压导致存在于隔室102中的液体的过滤。
当过滤完成后，如图7所示，保护筒502及其所容纳的针180被共同去除。
用于保留靶细胞的过滤器
用于本文所述的方法中的过滤器包含孔，其导致靶细胞被保留在过滤器上或中。合适的过滤器可以包括50,000与200,000个孔/cm2之间(例如，75,000至150,000个孔/cm2、90,000至115,000个孔/cm2、或95,000至110,000个孔/cm2)，平均直径为5.5微米至约7.5微米。在一实施例中，过滤器具有约100,000个孔/cm2，平均直径约为6.5微米。用于任何特定应用中的孔径大小将取决于靶细胞和非靶细胞的相对大小。保留在过滤器上的靶细胞通常具有的直径(或最长尺寸)>20微米且<50微米。自然地，含有细胞的流体样品中的至少大多数的非靶细胞将具有的直径(或最大尺寸)显著小于流体样品中的靶细胞，并且小于所关注的过滤器中的孔的直径(或最大尺寸)。
过滤器可以由任何生物相容的材料构成，例如包括可生物降解的或不可生物降解的生物相容的聚合物。代表性的生物相容的聚合物包括但不限于聚(酯酰胺)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚(3-羟基烷酸酯)比如聚(3-羟基丙酸酯)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(3-羟基戊酸酯)、聚(3-羟基己酸酯)、聚(3-羟基庚酸酯)以及聚(3-羟基辛酸酯)、聚(4-羟基烷酸酯)比如聚(4-羟基丁酸酯)、聚(4-羟基戊酸酯)、聚(4-羟基己酸酯)、聚(4-羟基庚酸酯)、聚(4-羟基辛酸酯)以及共聚物，其包括本文所述的任何3-羟基烷酸酯或4-羟基烷酸酯的单体或它们的共混物、聚(D、L-丙交酯)、聚(L-丙交酯)、聚乙交酯、聚(D、L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)、聚己内酯、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(乙交酯-共-己内酯)、聚(二氧杂环己酮)、聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(酪氨酸碳酸酯)及其衍生物、聚(酪氨酸酯)及其衍生物、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯)、聚磷酸酯、聚磷酸酯氨基甲酸乙酯、聚(氨基酸)、聚氰基丙烯酸酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚氨酯类、聚磷腈、聚硅氧烷、聚酯、聚烯烃、聚异丁烯和乙烯-α-烯烃共聚物、丙烯酸聚合物和共聚物、乙烯基卤化物聚合物和共聚物比如聚氯乙烯、聚乙烯醚比如聚乙烯基甲基醚、聚偏二卤化物比聚偏二氯乙烯、聚丙烯腈、聚乙烯酮、聚乙烯基芳族化合物比如聚苯乙烯、聚乙烯酯比如聚乙酸乙烯酯、乙烯基单体相互之间及烯烃的共聚物比如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂、以及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酰胺比如尼龙66和聚己内酰胺、醇酸树脂、聚碳酸酯、聚甲醛、聚酰亚胺、聚醚、聚(癸二酸甘油酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(甲基丙烯酸正丁酯)、聚(仲-丁基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(甲基丙烯酸正丙酯)、聚(甲基丙烯酸异丙酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环氧树脂、聚氨酯、人造丝、人造丝-三乙酸酯、纤维素乙酸酯、纤维素丁酸酯、纤维素乙酸丁酸酯、玻璃纸、硝酸纤维素、丙酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、共聚(醚-酯)(例如，聚(环氧乙烷/聚(乳酸)(PEO/PLA))、聚亚烷基氧化物比如聚(环氧乙烷)、聚(氧化丙烯)、聚(醚酯)、聚亚烷基草酸酯、聚磷腈、磷酰胆碱、胆碱、聚(阿司匹林)、聚合物和含单体羟基的共聚物比如2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、或羟丙基甲基、含单体羧酸比如甲基丙烯酸(MA)、丙烯酸(AA)、烷氧基甲基丙烯酸甲酯、烷氧基丙烯酸酯、或3-三甲基甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯(TMSPMA)。例如，参见美国专利号7887572。由一种或多种这样的聚合物构成的轨道蚀刻过滤器是特别有用的，因为轨道蚀刻制造过程产生具有窄的孔径分布的更精确的孔径。在一实施例中，过滤器是聚碳酸酯过滤器。在一实施例中，过滤器是来自Whatman(Kent,UK)、EMD Millipore(Billerica,Massachusetts)、Membrane solutions(Plano，Texas)、或it4ip(Seneffe,Belgium)的聚碳酸酯轨道边过滤器。聚碳酸酯轨道边过滤器可以植入具有免疫抑制的鼠中，而没有不良影响。
在一些实施例中，过滤器(例如，聚碳酸酯过滤器)的表面可以例如通过一种或多种化合物的固定或通过处理而被修改，以使该表面更亲水。例如，一种或多种生长因子、细胞外基质蛋白、酶、报道分子、脂质体或核酸可以固定在过滤器上。生长因子的非限制性示例包括表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子(TGF)。胞外基质蛋白的非限制性示例包括胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和硫酸类肝素。
在一实施例中，一个或多个报道分子可被固定在过滤器上，从而可以在细胞培养的过程中或者在植入具有免疫缺陷的非人类动物后检测细胞生长。例如，当靶细胞是肿瘤细胞时，报道分子可以包括荧光团-淬灭剂双重标记探针，其是用于金属蛋白酶(MMP)的基片。例如，可以使用基片，比如MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH，其中MCA是指甲氧基香豆素，DPA是指二硝基苯基。与肿瘤生长相关的大多数蛋白酶可以裂解，比如基片。荧光MCA由DPA淬火，直到肽由Gly与Leu残基之间的MMP裂解。荧光MCA的检测反映的是细胞的生长。本领域技术人员要理解的是，可以使用荧光团和淬灭剂分子的其它组合。
在一实施例中，固定在过滤器上的报道分子是基于结合至靶向配体的荧光团-淬灭剂对的体内有针对性的活化光学成像探针。参见Ogawa等人的Mol.Pharm.6(2):386–395(2009)。由于具有该系统，荧光由靶细胞以外的荧光团-淬灭剂的相互作用被淬火，而且通过溶酶体/核内体的荧光团-淬灭剂对的解离而在靶细胞内被激活。对于体内成像来说，若丹明荧光团TAMRA和QSY7淬灭剂对特别有用。例如，合适的靶配体包括受体配体比如抗生物素蛋白，其是结合至D-半乳糖受体的非共价结合的同源四聚体糖蛋白。D-半乳糖受体表现在许多癌细胞上，包括卵巢癌、结肠癌、胃癌及胰腺癌细胞。靶向配体还可以是抗体或其抗原结合片段，其具有结合亲和力用于肿瘤特异性抗原，比如表现在某些肿瘤的细胞表面上的人表皮生长因子受体2型(HER2)。参见Ogawa等人的2009，同上。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以固定在过滤器上。这样的抗体或其抗原结合片段可以在过滤样品之前或之后固定在过滤器上。要理解的是，然而，抗体或其片段固定在过滤器上不会在过滤过程中大致有助于靶细胞的选择。但是，对于用作在细胞的培养过程中或者在植入具有免疫缺陷的非人类动物之后的生长促进配体，这样的抗体或其片段可能是有用的。
如在本文中使用的术语“抗体”是指一种蛋白质，其通常包括重链多肽和轻链多肽。抗原识别和结合发生在重链和轻链的可变区之内。还已知的是单域抗体，其具有一条重链和一条轻链以及缺少轻链的重链抗体。给定的抗体包括五种类型的重链(称为α、δ、ε、γ和μ)中的一种，其分类基于重链恒定区的氨基酸序列。这些不同类型的重链分别引起五类抗体，IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。给定的抗体还包括两种类型的轻链(称为κ或λ)中的一种，其分类基于轻链恒定域的氨基酸序列。IgG、IgD和IgE抗体通常含有两条相同的重链和两条相同的轻链以及两个抗原结合域，每个包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通常，IgA抗体包括两种单体，每个单体包括两条重链和两条轻链(就IgG、IgD和IgE抗体来说)；这样，IgA分子具有四个抗原结合域，每个再由VH和VL构成。某些IgA抗体是单体的，因为它们由两条重链和两条轻链构成。分泌的IgM抗体通常由五个单体构成，每个单体包括两条重链和两条轻链(就IgG和IgE抗体来说)；这样，IgM分子具有十个抗原结合域，每个再由VH和VL构成。IgM的细胞表面形式也存在，并且这具有两条重链/两条轻链结构，类似于IgG、IgD和IgE抗体。
如在本文中使用的术语抗体的“抗原结合片段”是指抗原结合分子，其不是如上所定义的完整抗体，而是仍保留至少一个抗原结合位点。抗体片段通常包括完整抗体的裂解部分，尽管该术语并不限于这样的裂解片段。例如，抗原结合片段可以包括Fab、F(ab')2、Fv以及单链Fv(scFv)片段。scFv片段是单多肽链，其包括scFv从其中衍生的抗体的重链及轻链可变区。其它合适的抗体或抗原结合片段包括线性抗体、多特异性抗体片段比如双特异性、三特异性以及多特异性抗体(例如双抗体(Poljak Structure2(12):1121-1123(1994)；Hudson et al.,J.Immunol.Methods23(1-2):177-189(1994))、三抗体、四抗体)、小分子抗体、螯合重组抗体、胞内抗体(Hustonet al.,Hum.Antibodies10(3-4):127-142(2001)；Wheeler et al.,Mol.Ther.8(3):355-366(2003)；Stocks Drug Discov.Today9(22):960-966(2004))、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼抗体、骆驼源化抗体、以及含有抗体的VHH。
抗体或用作生长促进配体的其抗原结合片段的非限制性示例包括用于T细胞肿瘤的抗CD3抗体；用于B细胞肿瘤的抗Ig抗体；或者可诱导1类生长因子受体的二聚化的抗体。例如，参见Fuh,et al.(1992)Science256:1677–1680；Rui,et al.(1994)Endocrinology135:1299–1306；Schneider,et al.(1997)Blood89:473–482；Mahanta,et al.(2008)PLoS One.3(4):e2054；andSpaargaren,et al.(1991)J Biol Chem.266(3):1733-9。
将过滤器植入具有免疫缺陷的非人类动物中
在回收过滤器上的一个或多个靶细胞之后，过滤器可以被植入非人类动物中，最常用的是具有免疫缺陷的非人类动物(例如，具有免疫缺陷的啮齿动物，比如具有免疫缺陷的鼠)。具有免疫缺陷的非人类动物可以对于严重联合免疫缺陷(SCID)自发突变(Prkdcscid)是纯合的；对于裸自发突变(Foxn1nu/nu)是纯合的；对于Rag1突变是纯合的；对于Rag2突变是纯合的；或者对于Rag1及Rag2突变是纯合的。这样的具有免疫缺陷的非人类动物(例如，具有免疫缺陷的鼠)可以商购，例如从The Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)获得。通常，过滤器通过外科手术被植入到具有免疫缺陷的动物皮下。例如，过滤器可以被植入在神经嵴之下、肾上腺囊之下、腹腔内、或动物的侧面中。在一些实施例中，可以在植入过滤器之前、期间或之后，将化合物比如生长因子或重组基底膜基质施用至动物。
在一些实施例中，一至四个附加的过滤器被植入非人类动物，其中每个过滤器包含一个或多个靶细胞。例如，一个、两个、三个或四个过滤器可以被植入非人类动物。每个过滤器可以从单一的过滤装置中获得，或者可以从单独的过滤装置中获得。通常，当多个过滤器被植入到一个动物中时，所有的过滤器包含从同一患者中所回收的细胞。这些过滤器可以被植入动物的不同区域中，例如在动物的每个侧面或侧面与腹部中。
在一些实施例中，在植入之前，过滤器的表面可以与可从液体转变成凝胶相而对靶细胞没有致死或毒性作用的组合物接触，例如无需使用将会损害活细胞例如杀死或抑制细胞增殖能力的化学物质或温度。另外，该组合物的成分不应对细胞是毒性或致死的或抗增殖的。例如，该组合物可以是水凝胶，其包括交联的聚合物链、天然或合成的来源比如来自3DM,Inc(Cambridge,MA)的PuramatrixTM(合成肽基质)、或来自Glycosan BioSystems(Salt LakeCity,UT)的聚乙烯(乙二醇)二丙烯酸酯基础的、透明质酸基础的或胶原蛋白基础的水凝胶。这样的水凝胶可以以液体的形式被施加至过滤器，然后通过添加培养基而转变成凝胶相。过滤器还可以与MatrigelTM(BD Biosciences)重组基底膜基质或含由MatrigelTM和培养基的组合物接触。该组合物还可以含有一种或多种细胞外基质成分，例如蛋白聚糖(比如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素以及硫酸角质素)、透明质酸、胶原IV型、弹性蛋白、纤连蛋白以及层粘连蛋白。根据培养靶细胞的需要，可以将生长因子或其它分子加入到该组合物中。
在其中植入两个或更多过滤器的实施例中，过滤器可以基本上堆叠在彼此的顶部上以产生多层的三维培养装置。在堆叠过滤器之前，过滤器的表面可以与可从液体转变成凝胶相而对靶细胞没有致死或毒性作用的上述组合物接触。例如，过滤器的表面可以与重组基底膜基质接触。
在一些实施例中，在植入之前，所述一个或多个过滤器可以被放置在细胞培养装置中，并且培养在培养基的存在中，例如来评估活力或增加细胞数量。在一些实施例中，一旦靶细胞的数量已经增加，则靶细胞就可从过滤器中被除去(例如，通过洗涤)并且被植入具有免疫缺陷的动物中。
在将一个或多个过滤器植入具有免疫缺陷的非人类动物中之后，动物可被监测用于细胞的生长或肿瘤的发展。例如，为了监测细胞的生长，所植入的过滤器可以包括用于MMP的基片或如上所讨论的体内活化的光学成像探针。肿瘤在动物中的发展证实了流体样品中肿瘤细胞的存在，并且指示细胞的转移潜力。肿瘤可以从动物中取出，并且经受进一步的体外或体内表征。例如，从肿瘤中分离出的肿瘤或细胞可以经受基因组学、蛋白质组学、免疫细胞化学、或其它分子测定来进一步表征肿瘤和/或细胞。在一些实施例中，组织特异性和/或肿瘤特异性试剂比如抗体、探针或PCR引物可以用于检查从肿瘤中分离出的肿瘤或细胞。
在其中肿瘤细胞的生长已在动物模型中被确认的实施例中，细胞对一种或多种化学治疗剂的响应性可以通过将所关注的化学治疗施用至该动物及监测响应性(例如，通过监测细胞生长或细胞死亡)而得到评估。
本发明被进一步描述在下列示例中，这些示例并不限制在权利要求中所描述的本发明的范围。
示例
示例1—— 过滤装置的使用
该非限制性示例提供了使用来自(细胞培养(CC))的过滤装置的一般方法。该装置长19厘米，并且包括圆形轨道蚀刻聚碳酸酯过滤器(例如，来自Whatman,EMD Millipore,Membrane Solution,或it4ip)，具有光滑、平坦且亲水的表面。
该过滤器包含具有直径为6.5微米的圆形孔，它们随机地分布在整个过滤器上(1×105个孔/cm2)。根据该装置的制造商，在过滤之前并且以便裂解红血细胞(RBC)，3至6毫升血液样品分别稀释在3至1毫升的LC缓冲液中。即，3毫升血液样品采用3毫升缓冲液稀释，而6毫升血液样品采用1毫升缓冲液稀释。在混合样品和稀释缓冲液并且在室温下培养达2分钟之后，对于8.6毫升的总体积来说，分别加入2.6或1.6毫升的培养基，然后将样品穿过真空管所连接的过滤装置。过滤通常在约2分钟内完成。在过滤结束时，装置的喷嘴/保持器是截短的并且从过滤罐中取出，以及通过均匀按下位于过滤装置底部的杆，过滤器被释放到24孔组织培养板的孔中。适当的组织培养基和生长因子可以被添加到孔中。CC装置过滤器的过滤面积通过由具有数字代码的手术inox制成的O型圈限定，以确保所过滤的样品的可追溯性。
为了增加从样品中所获得的稀有细胞的数量，可以从相同的稀释血液样品的多个部分中回收细胞。可以通过不同的过滤装置过滤每个部分。当获得多个过滤器时，这些过滤器可以连续地堆放在彼此之上，如上所述。例如，过滤器可以从过滤装置中释放，并且被放置在1:1的Matrigel/Medium(M/M)的100微升层上。在放下下一个过滤器之前，每个连续的过滤器覆盖有70微升的M/M。在该过程结束时，最后的过滤器覆盖有70微升的M/M，加入足够量的培养基(例如，含有胎儿牛血清(FCS)的培养基)来覆盖堆叠的过滤器，以提供三维的培养装置。该三维装置可用于输送和/或培养细胞，并且还可以被植入具有免疫缺陷的动物中。
示例2——用于检测CTC的 装置的灵敏度
用于分离CTC的装置(示例1中所述)的灵敏度如下评估。采用固定的H2030细胞(来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的腺癌非小细胞肺癌细胞系；目录号CRL-5914TM)进行二十五个独立的试验。H2030细胞在包含补充有10％FCS的RPMI1640的瓶中培养，并且通过胰蛋白酶消化收获。细胞活力通过台盼蓝排除被评估。如果活力估计超过90％，则将细胞用于如下所述的试验中。
在用甲醛进行固定之后，将H2030细胞掺入到从健康供体所抽吸的整个外周血液中，以得到每1毫升血液中2个或5个固定的H2030细胞的最终浓度，并且通过装置过滤，如在示例1中所述。平均过滤时间为50秒。采用苏木精和曙红对过滤器上的细胞进行染色并计数。表1和表2中示出了相比在样品中所回收的H2030细胞的实际数量的掺入到血液样品中的H2030细胞的数量。对于掺有5个细胞的样品来说，所回收的H2030细胞的平均百分比为91.2％，平均4.56±0.71个细胞被回收。参见表1。在掺有5个细胞的样品中，不下3个细胞在所有的25个样品中被检测出。对于掺有2个细胞的样品来说，所回收的H2030细胞的平均百分比为74％，平均1.480±0.71个细胞被回收。参见表2。
表1
表2
为了验证细胞损失的百分比是否与过滤装置有关，H2030细胞被收获(如上面所指出)、固定以及被直接移入到含有过滤缓冲液的Eppendorf管中。通过使用Cytospin离心来回收细胞，并且采用苏木精和曙红对其进行染色。在这些条件下，回收的平均百分比对于掺有2个细胞的样品来说为82％，对于掺有5个细胞的样品来说为88％。对于掺有2个细胞的样品来说，平均1.64±0.57个细胞被回收。对于掺有5个细胞的样品来说，平均4.40±0.71个细胞被回收。装置相比直接细胞收集的相对灵敏度通过为未配对单边学生检验(分别对于2个和5个掺入细胞为0.19和0.20)、未配对双边学生检验(分别对于2个和5个细胞为0.39和0.41)以及Fisher检验(分别对于2个和5个细胞为0.14和0.34)所计算的P值而得以评估。这些检验表明通过装置的2个或5个掺入的肿瘤细胞的收集或者通过直接进入Eppendorf管中的微移入的细胞的直接收集导致类似的灵敏度。通过使用装置和直接收集的不同系列的检验，在2个或5个掺入的肿瘤细胞的25个独立的收集之后损失类似数量的细胞。事实上，通过装置所损失的细胞的百分比对于2个和5个掺入的H2030细胞来说分别为26％(标准偏差(SD)为0.71，细胞损失的平均数量为0.52)和9％(SD为0.65，细胞损失的平均数量为0.44)，而通过直接收集，其为18％(SD为0.57，细胞损失的平均数量为0.36)和12％(SD为0.71，细胞损失的平均数量为0.60)。通过使用Cyto装置或通过直接收集，采用2个或5个肿瘤细胞，对于未配对单边学生检验的P值表示类似数量的损失细胞。
当使用对于未配对单边学生检验的P值来比较通过装置或通过直接收集(分别对于2个和5个掺入的肿瘤细胞为0.19与0.20)采用2个与5个掺入的肿瘤细胞所获得的结果时，没有发现显著的差异。此外，当使用对于未配对单边学生检验的P值来比较通过装置(0.34)或通过直接收集(0.10)采用2个与5个掺入的肿瘤细胞所获得的结果时，没有发现显著的差异。总之，这些结果表明细胞基本上是通过微移入而损失的，并且装置的回收率接近100％。
示例3——细胞在通过 装置过滤之后的活力和培养。
在通过示例1的CC装置过滤之后，进行了五个独立的试验来评估肿瘤细胞的活力。H2030细胞在包含补充有10％FCS的RPMI1640的瓶中培养，并且通过胰蛋白酶消化收获。五十(50)个活H2030细胞通过过滤装置进行过滤，如示例1所述。在通过使用台盼蓝排除检验进行过滤之后，立即对活细胞计数。图8A是活H2030细胞在通过装置过滤后的显微照片。平均回收率为85％±9％。所分离的H2030细胞在组织培养中生长的能力进一步在八个独立的试验中得到评价。在每个试验中，所分离的H2030细胞能够在适当的组织培养条件下生长并且在过滤器上扩大。图8B是来自图8A中的细胞在培养基中培养过滤器达4天之后的显微照片。
示例4——过滤器上靶细胞的回收以及将过滤器转移至具有免疫缺陷的 动物
为了证明CTC可以从人类患者转移至鼠，人HT29结直肠癌细胞生长至50％汇合，并且用胰蛋白酶消化以将细胞从培养皿的表面释放。细胞在PBS中洗涤并被稀释，以得到每微升10,000个细胞的终浓度。正常的人体血液收集在无菌的EDTA真空采血管中并且在收集的60分钟内使用。将1000或10,000个HT29细胞加入至6毫升的正常的人体血液，且血液被轻轻混合。然后，采用1毫升的LC稀释缓冲液来稀释含有HT29细胞的六毫升血液，并且将其在室温下培养达2分钟。2分钟的培养之后，加入1.6毫升的培养基，然后整个8.6毫升的稀释血液穿过在示例1中描述的CC装置。在过滤完成时，过滤器被喷射到一块无菌纱布上。无菌镊子用来将过滤器放置在含有100μl的比例为1:1的Matrigel/Medium的固化垫上。此固化的M/M垫用于在外科手术过程中保持细胞的水分。
过滤器被植入Rag2-/-具有免疫缺陷的鼠的皮肤之下，并且通过触诊来监测细胞生长。肿瘤于3周内在过滤器的两侧上发展。将鼠处死，并且除去附带有肿瘤的过滤器并将其置于Petri培养皿中。培养来自肿瘤的细胞，并采用抗体对其进行染色，证实肿瘤从HT29细胞中衍生。Herrmann等人(PLoS ONE,2010,5:1-10)表明在体内所选的CD44high/CD24high/EpCAMhighHT29细胞具有癌症干细胞表型。
其它实施例
虽然结合前面的详细描述以及示例已对本发明进行了说明，但是上述说明及示例旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他的方面、优点以及修改在权利要求的范围之内。

Claims (44)

1.一种增加来自含有细胞的流体样品中的靶细胞的数量的方法，所述方法包括：
a)提供包括一个或多个靶细胞的过滤器，所述一个或多个靶细胞通过样品穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体含有靶细胞和非靶细胞的样品中获得，其中，过滤器中的孔的尺寸导致靶细胞保留在所述过滤器上或中；以及
b)在具有免疫缺陷的非人类动物中植入所述过滤器和在所述过滤器上的所述一个或多个靶细胞，其中，在所植入的过滤器上或中的一个或多个细胞中的一些或全部在所述具有免疫缺陷的动物中增殖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在样品通过所述过滤装置的过程中，基本上所有的非靶细胞穿过所述过滤器。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述具有免疫缺陷的非人类动物是鼠。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述鼠对于严重联合免疫缺陷(SCID)自发突变(Prkdcscid)是纯合的；对于裸自发突变(Foxn1nu/nu)是纯合的；对于Rag1突变是纯合的；对于Rag2突变是纯合的；或者对于Rag1及Rag2突变是纯合的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包括提供一至四个附加的过滤器，每个所述附加的过滤器包括一个或多个靶细胞，并且在所述具有免疫缺陷的非人类动物中植入所述第一和附加的过滤器。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述一至四个附加的过滤器是一个附加的过滤器。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述一至四个附加的过滤器是两个附加的过滤器。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述第一和附加的过滤器是从单一的过滤装置中获得的。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述第一和附加的过滤器每个都是从单独的过滤装置中获得的。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，所述方法还包括在植入所述过滤器和在所述过滤器上的所述一个或多个靶细胞之前将所述过滤器基本上堆叠在彼此的顶部上以产生多层的培养装置。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法还包括在植入所述过滤器和在所述过滤器上植入所述一个或多个靶细胞之前接触所述过滤器及包含所述靶细胞的任何附加的过滤器的表面，其具有能够从液体转变成凝胶相的组合物，而对靶细胞没有致死或毒性作用。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述组合物包括一个或多个细胞外基质(ECM)成分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述组合物包括重组的基底膜。
14.根据权利要求1-4或11-13中任一项所述的方法，其中，所述过滤器包括固定于其的一个或多个化合物。
15.根据权利要求5-10中任一项所述的方法，其中，附加的过滤器包括固定于其的一个或多个化合物。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，一个或多个化合物被施用至具有免疫缺陷的动物。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个化合物选自由生长因子、细胞外基质蛋白、酶、报道分子、脂质体以及核酸构成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述生长因子是表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或转化生长因子(TGF)。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞外基质蛋白是胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、或硫酸乙酰肝素。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述报道分子包括荧光团-淬灭剂双重标记探针，其是用于金属蛋白酶的基片。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括监测在所述具有免疫缺陷的动物中的所述细胞的生长。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述流体含有细胞的样品包括外周血细胞。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述流体含有细胞的样品包括来自尿、骨髓、淋巴、淋巴结、脾、脑脊髓液、导管流体、活检标本或针活检抽吸物的细胞。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述植入步骤之前培养所述一个或多个靶细胞。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是癌细胞。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是循环癌细胞。
27.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是胎儿细胞。
28.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是干细胞。
29.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞是内皮干细胞或间充质干细胞。
30.一种包括至少一个植入的过滤器的非人类的具有免疫缺陷的动物，所述过滤器包括通过穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体含有靶细胞和非靶细胞的样品中获得的多个靶细胞，其中，过滤器中的孔的尺寸导致靶细胞保留在所述过滤器上或中。
31.根据权利要求30所述的动物，所述动物还包括一至四个附加的植入的过滤器，每个所述附加的过滤器包括一个或多个靶细胞。
32.根据权利要求31所述的动物，其中，所述一至四个附加的过滤器是一个附加的过滤器。
33.根据权利要求31所述的动物，其中，所述一至四个附加的过滤器是两个附加的过滤器。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的动物，其中，所述第一和附加的过滤器是从单一的过滤装置中获得的。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的动物，其中，所述第一和附加的过滤器每个都是从单独的过滤装置中获得的。
36.根据权利要求30-35中任一项所述的动物，其中，所述第一和附加的过滤器基本上堆叠在彼此的顶部上，以产生多层的三维培养装置。
37.根据权利要求30或权利要求35所述的动物，其中，所述过滤器和包括所述靶细胞的任何附加的过滤器的表面包含能够从液体转变成凝胶相的组合物，而对靶细胞没有致死或毒性作用。
38.根据权利要求30-37中任一项所述的动物，其中，所述靶细胞是人靶细胞。
39.一种测试在包括测试细胞的流体样品中的肿瘤细胞的存在的方法，所述方法包括：
a)提供包括通过穿过包括所述过滤器的过滤装置而从流体测试含有细胞的样品中所获得的多个测试细胞的过滤器，其中，过滤器中的孔的尺寸导致一个或多个测试细胞保留在所述过滤器上或中；
b)在所述具有免疫缺陷的非人类动物中植入所述过滤器和在所述过滤器上或中的所述一个或多个测试细胞；以及
c)对于肿瘤的存在或不存在，监测所述具有免疫缺陷的非人类动物，其中，肿瘤的存在表明测试细胞包括肿瘤细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述测试细胞是人细胞。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中，所述流体含有细胞的样品包括外周血细胞。
42.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中，所述流体含有细胞的样品包括来自尿、骨髓、淋巴、淋巴结、脾、脑脊髓液、导管流体、活检标本或针活检抽吸物的细胞。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，所述方法还包括：d)如果所述肿瘤存在的话，将化学治疗剂施用至所述非人类动物；以及e)为响应于所述化学治疗剂，监测所述肿瘤。
44.一种增加来自含有细胞的流体样品中的靶细胞的数量的方法，所述方法包括：
a)提供流体含有靶细胞和非靶细胞的样品；
b)使所述样品穿过过滤装置，所述装置包括紧固至过滤器的过滤器支撑、具有上部开口和下部开口的隔室、以及相对于所述隔室可移动的构件，用于将力施加至支撑并释放所述支撑；
c)从所述装置中去除含有一个或多个靶细胞的所述过滤器；以及
d)将所述过滤器和在所述过滤器上或中的所述靶细胞植入到所述具有免疫缺陷的非人类动物中，其中，在所植入的过滤器上或中的一个或多个细胞中的一些或全部在所述具有免疫缺陷的动物中增殖。
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