CN101500590A - 与161p2f10b蛋白结合的抗体和相关分子 - Google Patents
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Abstract
本文描述了能与161P2F10B蛋白及其变体结合的抗体以及由其衍生的分子，其中161P2F10B在正常成年组织中表现出组织特异性表达，并且在表I所列的癌症中异常表达。因此，161P2F10B提供了癌症的诊断、预测、预防和/或治疗靶。可以使用161P2F10B基因或其片段或其编码的蛋白质或其变体或其片段来引发体液或细胞免疫应答；与161P2F10B反应的抗体或T细胞可用于主动或被动免疫。
Description
技术领域
本文所述的发明涉及能结合被称作161P2F10B的蛋白质的抗体及其结合片段以及由它们改造的分子。本发明还涉及可用于治疗表达161P2F10B的癌症的诊断、预测、预防和治疗方法以及组合物。
背景技术
癌症是仅次于冠状疾病的导致人类死亡的第二大病因。世界上每年有数百万人死于癌症。据美国癌症学会报道，仅在美国，癌症每年导致50万以上的健康人死亡，每年诊断出的新病例超过120万。尽管由心脏病所致的死亡已显著减少，但由癌症导致的死亡却普遍呈上升趋势。预测在下个世纪早期，癌症将成为导致死亡的首要原因。
在世界范围内，有几种癌症突显为主要杀手。具体地说，肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌成为癌症死亡主要原因的代表。这些癌症和事实上所有其它癌症都具有共同的致死特征。除了极少数的例外，癌症的转移疾病也是致死性的。另外，即便有些癌症患者起初从原发性癌症中生还，但它们共同的体验表明它们的生活已发生明显变化。很多患者担心癌症很可能会复发或治疗会失败，因而感到非常焦虑。很多癌症患者在治疗后感到身体虚弱。另外，很多癌症患者还会遭遇癌症复发。
在世界范围内，前列腺癌在男性最易发癌症中列第四位。在北美和北欧，前列腺癌是男性中最常见的癌症，是导致男性死于癌症的第二大病因。仅在美国，每年死于此病的男人远远超过30,000人-仅次于肺癌。尽管这些数字的数量级很大，但针对转移的前列腺癌仍无有效的治疗方法。外科前列腺切除术、放疗、激素脱离疗法、外科阉割和化疗仍是主要的治疗形式。不幸的是这些疗法对很多人都不起效果，并且经常与不良的后果有关。
在诊断方面，缺乏可准确检测早期、定位前列腺肿瘤的肿瘤标记显著限制了前列腺癌的诊断和治疗。尽管血清前列腺特异性抗原(PSA)测定法已成为很有用的工具，但人们普遍认为该方法在几个重要的方面缺乏特异性和普遍实用性。
能在小鼠体内重演疾病的不同阶段的前列腺癌异种移植物的产生推进了鉴定前列腺癌其它特异性标记的进程。LAPC(Los Angeles Prostate Cancer)异种移植物是前列腺癌异种移植物，它能在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中幸免于死，并能表现出模拟从雄激素依赖型转变为雄激素非依赖型的能力(Klein et al.，1997，Nat.Med.3：402)。最新鉴定的前列腺癌标记包括PCTA-1(Su et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7252)、前列腺-特异性膜(PSM)抗原(Pinto et al.，Clin Cancer Res 1996 Sep 2(9)：1445-51)、STEAP(Hubert，et al，Proc Natl Acad Sci USA.1999 Dec 7；96(25)：14523-8)和前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：1735)。
尽管以前鉴定的标记，如PSA，PSM，PCTA和161P2F10B对诊断和治疗前列腺癌起到一定作用，但是，为了进一步完善诊断和治疗，仍需要鉴定前列腺和相关癌症的其它标记和治疗靶标。
肾细胞癌(RCC)造成了约3％的成年人恶性肿瘤。一旦腺瘤的直径达到2至3cm，就存在恶变的可能。在成年人中，两种主要的恶性肾肿瘤是肾细胞腺癌以及肾盂或输尿管的移行细胞癌。据估计，美国的肾细胞腺癌的发病率超过29,000例，1998年，有11,600多位患者死于该病。移行细胞癌较少发生，美国每年的发病率约为500例。
几十年来，外科手术是肾细胞腺癌的主要疗法。直至最近，任何全身性疗法都对付不了转移疾病。借助于全身性疗法，特别是免疫疗法的最新进展，可以进攻性地接近适当患者体内的转移肾细胞癌，并且有可能伴有持久的反应。然而，这些患者仍需要有效的疗法。
在美国的所有癌症新病例中，膀胱癌约占男性肿瘤的5％(在常见肿瘤中名列第五)和女性肿瘤的3％(在常见肿瘤中名列第八)。发病率随着老年人群的逐渐增加而缓慢增加。据估计，1998年有54,500个病例，包括39,500位男性和15,000位女性。在美国，受年龄调节的发病率为：每100,000位男性有32位患者，每100,000位女性有8位患者。与女性的吸烟模式相关联，历史性的男性/女性患病比例3：1可能会降低。据估计，1998年有11,000位患者死于膀胱癌(7,800位男性和3,900位女性)。膀胱癌的发病率和死亡率随着年龄的增加而急剧增加，随着种群老龄化的出现，这将成为日益严重的问题。
大多数膀胱癌在膀胱中复发。膀胱癌的治疗方法为联合使用膀胱经尿道切除术(TUR)以及膀胱内化学疗法或免疫疗法。膀胱癌的多病灶和复发特征显出TUR的局限性。仅通过TUR不能治愈大多数的肌肉-受侵癌症。膀胱根治切除术和尿流改道术是消除癌症的最有效方法，但不可否认的是，它们对泌尿和性功能有影响。因此，十分需要有利于膀胱癌患者的治疗形式。
据估计，2000年美国有130,200例结肠直肠癌发生，包括93,800例结肠癌和36,400例直肠癌。结肠直肠癌是男性和女性第三多发的癌症。1992-1996年，发病率显著降低(每年下降2.1％)。研究表明发病率的下降可能应归功于筛查和切除息肉，防止息肉发展成为侵害性癌症。据估计，2000年有56,300位患者死亡(47,700位死于结肠癌，8,600位死于直肠癌)，约占所有美国癌症死亡人数的11％。
目前，最普遍的结肠直肠癌疗法是外科手术，对于尚未扩散的癌症而言，经常是可治愈的。对于癌症已深度穿入肠壁或已扩散至淋巴结的大多数患者而言，在手术前或手术后应给予化学疗法或化学疗法加放疗。结肠癌患者有时需要永久性结肠造口术(在腹部开一个小口以排出体内废物)，而直肠癌患者较少需要该手术。结肠直肠癌患者仍需要有效的诊断和治疗形式。
据估计，2000年新出现164,100个肺和支气管癌病例，占所有美国癌症诊断病例的14％。男性肺和支气管癌的发病率显著降低，从1984年每100,000人中高达86.5人患病至1996年的70.0人患病。在上个世纪九十年代，女性发病率的增加速度开始减缓。1996年，女性的发病率为每100,000人中42.3人患病。
据估计，2000年肺和支气管癌导致156,900人死亡，占所有癌症死亡人数的28％。1992-1996年，男性中的肺癌死亡率显著下降(每年下降1.7％)，而女性中的死亡率仍然逐渐增加(每年增加0.9％)。自1987年以来，与乳腺癌相比，每年死于肺癌的妇女更多，对于40岁以上的妇女来说，肺癌是女性癌症死亡的主要病因。前30年降低吸烟人数的比例最有可能导致肺癌发病率和死亡率的降低；然而，相对于男性而言，减少女性吸烟模式的工作有些滞后。值得关注的是，尽管成人烟草使用率的下降速度趋于缓慢，但年轻人中的烟草使用率再次呈逐渐增加的趋势。
可根据癌症的类型和阶段，确定肺和支气管癌的治疗选择，其包括外科手术、放疗和化疗。对于多种固定于局部的癌症来说，通常选择的疗法是外科手术。由于在发现癌症之前，癌症通常已扩散，经常需要在外科手术的同时联合使用放疗和化疗。对于小细胞肺癌而言，可以选择的疗法是仅用化疗或将化疗与放疗联合；通过使用此方案，高百分比患者的病情减轻，在有些情况下，这种好的疗效会长时间保持。然而，肺和支气管癌不断需要有效的治疗和诊断方法。
预计2000年美国妇女中会出现约182,800例新的乳腺癌侵害病例。另外，预计2000年会诊断出约1,400例新的男性乳腺癌病例。自上个世纪八十年代每年约增加4％之后，妇女乳腺癌的发病率在九十年代已停止增长，维持在每100,000人中约110.6个病例。
仅在美国，据估计2000年有41,200人(40,800名女性，400名男性)死于乳腺癌。乳腺癌在女性癌症死亡中名列第二。根据最新的数据，在1992-1996年，死亡率显著降低，在年轻白人和黑人妇女中死亡率的降低最为显著。死亡率的降低可能是早期检测和改进疗法的结果。
考虑到就医环境和患者的选择，乳腺癌疗法包括肿块切除术(局部切除肿瘤)和摘除胳膊下方的淋巴结；乳房切除术(手术切除乳房)和摘除胳膊下方的淋巴结；放疗；化疗；或激素疗法。经常联合使用两种或多种疗法。多项研究表明对于早期乳腺癌而言，肿块切除术加放疗之后的长期存活率类似于改良根治性乳房切除术之后的存活率。重建术的显著进步给乳房切除术后的乳房重建提供了几种选择。最近，已在乳房切除术的同时进行乳房重建。
针对周围有足够量的正常乳腺组织的原位导管癌(DCIS)的局部切除术可防止DCIS的局部复发。对乳房进行放疗和/或他莫昔芬可减少其余乳腺组织发生DCIS的机会。这一点至关重要，因为如果对DCIS不加治疗，即可发展为侵害性乳腺癌。然而，这些疗法有严重的副作用或后遗症。因此，需要有效的乳腺癌疗法。
据估计，2000年美国有23,100例新的卵巢癌病例。占妇女所有癌症的4％，并在妇产科癌症中名列第二。在1992-1996年，卵巢癌发病率显著降低。据估计，2000年有14,000人死于卵巢癌。与任何其它女性生殖系统癌症相比，卵巢癌导致更多患者死亡。
外科手术、放疗和化疗是可选择的卵巢癌疗法。外科手术通常包括摘除一个或两个卵巢，输卵管(输卵管卵巢切除术)和子宫(子宫切除术)。对一些很早期的肿瘤，特别是对那些希望生孩子的年轻妇女而言，仅需要摘除染病的卵巢。对晚期卵巢癌而言，应尝试摘除所有腹内病灶以增强化疗的效果。卵巢癌仍需要有效的治疗方法。
据估计，2000年美国有28,300例新的胰腺癌病例。在过去的20年内，男性胰腺癌的发病率下降。女性胰腺癌的发病率基本保持不变，但人数已开始下降。2000年美国约有28,200人死于胰腺癌。在过去的20年内，男性死亡率有微弱但显著的下降趋势(每年约下降0.9％)，而女性死亡率略有增加。
外科手术、放疗和化疗是可选择的胰腺癌疗法。这些疗法可以延长很多患者的存活期和/或减轻它们的症状，但不可能治愈大多数患者。显然，还需要其它针对癌症的治疗和诊断方法。包括将抗体、疫苗和小分子用作治疗方式。另外，还需要将这些治疗方式用作研究工具以诊断、检测、监测和促进所有癌症治疗和研究领域的技术状态。
单克隆抗体(MAb)的治疗用途正在被实现(G.Kohler and C.Milstein，Nature 256：495-497(1975))。目前，单克隆抗体已被批准用于治疗移植、癌症、传染病、心血管病和炎症。不同的同种型具有不同的效应子功能。对于多种免疫球蛋白同种型而言，这种功能的差异表现在不同的三维结构中(P.M.Alzari et al.，Annual Rev.Immunol.，6：555-580(1988))。
由于小鼠便于免疫接种，并能将大多数人抗原识别为外来物，因此，针对具有潜在治疗功能的人靶标的MAb一般都来源于鼠。然而，用作人治疗剂时，鼠MAb具有固有的缺点。它们需要更经常地定量给药，因为与人抗体相比，鼠MAb在人体内的循环半寿期较短。更不好的是：给人免疫系统重复施用鼠抗体会导致人免疫系统作出反应，将小鼠蛋白质识别为外来物，并产生人抗小鼠抗体(HAMA)反应。这种HAMA反应可导致变态反应，鼠抗体从系统中被快速清除，从而使鼠抗体疗法失效。为了避免这种影响，人们已尝试在小鼠体内建立人免疫系统。
最初的尝试希望建立能以具有人序列的抗体与抗原反应的转基因小鼠(参见Bruggemann et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713(1989))，但可用的克隆载体能稳定维持的DNA量有限，因此，此尝试受到限制。使用酵母人工染色体(YAC)克隆载体能够将人Ig基因座的大种系片段导入转基因哺乳动物。实质上，使用YAC能将在人基因组中发现的、以相同间距排列的人V，D和J区基因的大部分以及人恒定区导入小鼠。已知一个此类转基因小鼠品系为XenoMouse小鼠，其可购自Abgenix，Inc.(Fremont CA)。
发明简述
本发明提供了能与161P2F10B蛋白及其多肽片段结合的抗体及其结合片段和由它们改造的分子。本发明包括多克隆和单克隆抗体、鼠和其它哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化和全人抗体以及用可测标记或治疗剂标记的抗体。在一些实施方案中，需满足的前提条件是：不编码图3的完整核酸序列和/或不制备图2的完整氨基酸序列。在一些实施方案中，编码了图3的完整核酸序列和/或制备了图2的完整氨基酸序列，它们中的任一种皆为其各自的人单位剂量形式。
本发明还提供了检测多种生物样品中161P2F10B多核苷酸和蛋白质的存在和状况的方法，以及鉴定表达161P2F10B的细胞的方法。本发明的实施方案提供了监测具有或怀疑具有一些形式的生长调节异常，如癌症的组织或血液样品中是否具有161P2F10B基因产物的方法。
本发明还提供了多种用于治疗表达161P2F10B的癌症，如表I所列组织的癌症的免疫原性或治疗性的组合物和策略，包括目的在于抑制161P2F10B转录、翻译、加工或功能的疗法以及癌症疫苗。一方面，本发明提供了用于治疗人受试者中表达161P2F10B的癌症的组合物和包括使用该组合物的方法，其中组合物含有适用于人的载体，以及人单位剂量的一种或多种可抑制161P2F10B产生或功能的药剂。优选载体是独特的人载体。在本发明的另一方面，药剂是能与161P2F10B蛋白发生免疫反应的组成成分。所述组成成分的非限制性例子包括但不限于抗体(如单链、单克隆、多克隆、人源化、嵌合或人抗体)，其功能等同物(可以是天然的，也可以是合成的)及其组合。抗体可以与诊断或治疗组成成分偶联。另一方面，药剂是本文定义的小分子。
附图说明
图1.图1A.161P2F10B变体1(也称为“161P2F10B v.1”或“161P2F10B变体1”)的cDNA(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)序列示于图1A。图中显示了161P2F10B变体1的3858个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸。开放阅读框从核酸44延伸至2671，其中包括终止密码子。
图1B.161P2F10B变体2(也称为“161P2F10B v.2”)的cDNA(SEQ ID NO：3)和氨基酸(SEQ ID NO：4)序列示于图1B。图中显示了161P2F10B变体2的3858个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸44延伸至2671，其中包括终止密码子。
图1C.161P2F10B变体3(也称为“161P2F10B v.3”)的cDNA(SEQ ID NO：5)和氨基酸(SEQ ID NO：6)序列示于图1C。图中显示了161P2F10B变体3的3858个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸44延伸至2671，其中包括终止密码子。
图1D.161P2F10B变体4(也称为“161P2F10B v.4”)的cDNA(SEQ ID NO：7)和氨基酸(SEQ ID NO：8)序列示于图1D。图中显示了161P2F10B变体4的3858个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸44延伸至2671，其中包括终止密码子。
图1E.161P2F10B变体5(也称为“161P2F10B v.5”)的cDNA(SEQ ID NO：9)和氨基酸(SEQ ID NO：10)序列示于图1E。图中显示了161P2F10B变体5的3858个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸44延伸至2671，其中包括终止密码子。
图1F.161P2F10B变体6(也称为“161P2F10B v.6”)的cDNA(SEQ IDNO：11)和氨基酸(SEQ ID NO：12)序列示于图1F。图中显示了161P2F10B变体6的3165个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸84延伸至2711，其中包括终止密码子。
图1G.161P2F10B变体7(也称为“161P2F10B v.7”)的cDNA(SEQ IDNO：13)和氨基酸(SEQ ID NO：14)序列示于图1G。图中显示了161P2F10B变体7的3988个核苷酸长的序列。下划线的是起始甲硫氨酸密码子。开放阅读框从核酸276延伸至2801，其中包括终止密码子。
图2.161P2F10b抗体的核酸和氨基酸序列。图2A.H16-7.213 VH的cDNA(SEQ ID NO：15)和氨基酸(SEQ ID NO：16)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2B.H16-7.213 VL的cDNA(SEQ ID NO：17)和氨基酸(SEQ ID NO：18)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2C.H16-9.69 VH的cDNA(SEQ ID NO：19)和氨基酸(SEQ ID NO：20)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2D.H16-9.69 VL的cDNA(SEQ ID NO：21)和氨基酸(SEQ ID NO：22)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2E.H16-1.52 VH的cDNA(SEQ ID NO：23)和氨基酸(SEQ ID NO：24)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2F.H16-1.52 VL的cDNA(SEQ ID NO：25)和氨基酸(SEQ ID NO：26)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2G.Ha16-1(1)23 VH的cDNA(SEQ ID NO：27)和氨基酸(SEQ ID NO：28)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2H.Ha16-1(1)23 VL的cDNA(SEQ ID NO：29)和氨基酸(SEQ ID NO：30)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2I.Ha16-9.44 VH的cDNA(SEQ ID NO：31)和氨基酸(SEQ ID NO：32)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2J.H16-9.44 VL的cDNA(SEQ ID NO：33)和氨基酸(SEQ ID NO：34)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2K.H16-1.67 VH的cDNA(SEQ ID NO：35)和氨基酸(SEQ ID NO：36)序列。
图2L.H16-1.67 VL的cDNA(SEQ ID NO：37)和氨基酸(SEQ ID NO：38)序列。下划线的是轻链恒定区。
图2M.Ha16-1(3，5)36VH的cDNA(SEQ ID NO：39)和氨基酸(SEQ IDNO：40)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2N.Ha16-1(3，5)36 VL的cDNA(SEQ ID NO：41)和氨基酸(SEQ IDNO：42)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2O.H16-1.86 VH的cDNA(SEQ ID NO：43)和氨基酸(SEQ ID NO：44)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2P.H16-1.86 VL的cDNA(SEQ ID NO：45)和氨基酸(SEQ ID NO：46)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2Q.Ha16-9.10 VH的cDNA(SEQ ID NO：47)和氨基酸(SEQ ID NO：48)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2R.H16-9.10 VL的cDNA(SEQ ID NO：49)和氨基酸(SEQ ID NO：50)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2S.H16-9.33 VH的cDNA(SEQ ID NO：51)和氨基酸(SEQ ID NO：52)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2T.H16-9.33 VL的cDNA(SEQ ID NO：53)和氨基酸(SEQ ID NO：54)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2U.H16-1.68 VH的cDNA(SEQ ID NO：55)和氨基酸(SEQ ID NO：56)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2V.H16-1.68 VL的cDNA(SEQ ID NO：57)和氨基酸(SEQ ID NO：58)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2W.Ha16-1(1)11 VH的cDNA(SEQ ID NO：59)和氨基酸(SEQ IDNO：60)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2X.Ha16-1(1)11 VL的cDNA(SEQ ID NO：61)和氨基酸(SEQ ID NO：62)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2Y.Ha16-1(3，5)18 VH的cDNA(SEQ ID NO：63)和氨基酸(SEQ IDNO：64)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2Z.Ha16-1(3，5)18 VL的cDNA(SEQ ID NO：65)和氨基酸(SEQ IDNO：66)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2AA.Ha16-1(2，4)4 VH的cDNA(SEQ ID NO：67)和氨基酸(SEQ IDNO：68)序列。
图2AB.Ha16-1(2，4)4 VL的cDNA(SEQ ID NO：69)和氨基酸(SEQ IDNO：70)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2AC.Ha16-1(3，5)56 VH的cDNA(SEQ ID NO：71)和氨基酸(SEQ IDNO：72)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AD.Ha16-1(3，5)56 VL的cDNA(SEQ ID NO：73)和氨基酸(SEQ IDNO：74)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2AE.H16-1.93 VH的cDNA(SEQ ID NO：75)和氨基酸(SEQ ID NO：76)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AF.H16-1.93 VL的cDNA(SEQ ID NO：77)和氨基酸(SEQ ID NO：78)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AG.H16-7.8 VH的cDNA(SEQ ID NO：79)和氨基酸(SEQ ID NO：80)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AH.H16-7.8 VL的cDNA(SEQ ID NO：81)和氨基酸(SEQ ID NO：82)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AI.Ha16-1(3，5)27.1 VH的cDNA(SEQ ID NO：83)和氨基酸(SEQ IDNO：84)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AJ.Ha16-1(3，5)27 VL的cDNA(SEQ ID NO：85)和氨基酸(SEQ IDNO：86)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2AK.H16-1.61 VH的cDNA(SEQ ID NO：87)和氨基酸(SEQ ID NO：88)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AL.H16-1.61 VL的cDNA(SEQ ID NO：89)和氨基酸(SEQ ID NO：90)序列。下划线的是轻链恒定区部分。
图2AM.H16-1(3，5)5 VH的cDNA(SEQ ID NO：91)和氨基酸(SEQ IDNO：92)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AN.H16-1(3，5)5 VL的cDNA(SEQ ID NO：93)和氨基酸(SEQ IDNO：94)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AO.H16-7.200 VH的cDNA(SEQ ID NO：95)和氨基酸(SEQ ID NO：96)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AP.H16-7.200 VL的cDNA(SEQ ID NO：97)和氨基酸(SEQ ID NO：98)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AQ.Ha16-1(3，5)42 VH的cDNA(SEQ ID NO：99)和氨基酸(SEQ IDNO：100)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AR.Ha16-1(3，5)42 VL的cDNA(SEQ ID NO：101)和氨基酸(SEQ IDNO：102)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AS.H16-9.65 VH的cDNA(SEQ ID NO：103)和氨基酸(SEQ IDNO：104)序列。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图2AT.H16-9.65 VL的cDNA(SEQ ID NO：105)和氨基酸(SEQ ID NO：106)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AU.H16-1.29 VH的cDNA(SEQ ID NO：107)和氨基酸(SEQ IDNO：108)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AV.H16-3.4 VH的cDNA(SEQ ID NO：109)和氨基酸(SEQ ID NO：110)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AW.H16-1.92 VH的cDNA(SEQ ID NO：111)和氨基酸(SEQ IDNO：112)序列。下划线的是重链恒定区部分。
图2AX.Ha16-1(3，5)19 VL的cDNA(SEQ ID NO：113)和氨基酸(SEQ IDNO：114)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AY.Ha16-1(3，5)19 VH的cDNA(SEQ ID NO：169)和氨基酸(SEQ IDNO：170)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AZ.Ha16-1.80 VH的cDNA(SEQ ID NO：171)和氨基酸(SEQ IDNO：172)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图2AAA.Ha16-1.80 VL的cDNA(SEQ ID NO：173)和氨基酸(SEQ IDNO：174)序列。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3.161P2F10B抗体的氨基酸序列。图3A.H16-7.213 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：115)。下划线的是重链恒定区部分。
图3B.H16-7.213 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：116)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3C.H16-9.69 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：117)。下划线的是重链恒定区部分。
图3D.H16-9.69 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：118)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3E.H16-1.52 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：119)。下划线的是重链恒定区部分。
图3F.H16-1.52 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：120)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3G.Ha16-1(1)23 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：121)。下划线的是重链恒定区部分。
图3H.Ha16-1(1)23 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：122)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3I.H16-9.44 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：123)。下划线的是重链恒定区部分。
图3J.H16-9.44 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：124)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3K.H16-1.67 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：125)。下划线的是重链恒定区部分。
图3L.H16-1.67 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：126)。下划线的是轻链恒定区。
图3M.Ha16-1(3，5)36 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：127)。下划线的是重链恒定区部分。
图3N.Ha16-1(3，5)36 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：128)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3O.H16-1.86 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：129)。下划线的是重链恒定区部分。
图3P.H16-1.86 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：130)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3Q.H16-9.10 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：131)。下划线的是重链恒定区部分。
图3R.H16-9.10 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：132)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3S.H16-9.33 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：133)。下划线的是重链恒定区部分。
图3T.H16-9.33 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：134)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3U.H16-1.68 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：135)。下划线的是重链恒定区部分。
图3V.H16-1.68 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：136)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3W.Ha16-1(1)11 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：137)。下划线的是重链恒定区部分。
图3X.Ha16-1(1)11 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：138)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3Y.Ha16-1(3，5)18 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：139)。下划线的是重链恒定区部分。
图3Z.Ha16-1(3，5)18 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：140)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3AA.Ha16-1(2，4)4 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：141)。
图3AB.Ha16-1(2，4)4 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：142)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3AC.Ha16-1(3，5)56 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：143)。
图3AD.Ha16-1(3，5)56 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：144)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3AE.H16-7.8 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：145)。下划双线的是前导序列，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AF.H16-7.8 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：146)。下划双线的是前导序列，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AG.H16-1.93 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：147)。下划双线的是前导序列，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AH.H16-1.93 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：148)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AI.Ha16-1(3，5)27.1 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：149)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是重链恒定区部分。
图3AJ.Ha16-1(3，5)27 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：150)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3AK.H16-1.61 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：151)。下划线的是重链恒定区部分。
图3AL.H16-1.61 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)。下划线的是轻链恒定区部分。
图3AM.H16-1(3，5)5 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：153)。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图3AN.H16-1(3，5)5 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：154)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AO.H16-7.200 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：155)。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图3AP.H16-7.200 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：156)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AQ.Ha16-1(3，5)42 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：157)。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图3AR.Ha16-1(3，5)42 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：158)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AS.H16-9.65 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：159)。下划双线的是前导序列，下划线的是重链恒定区部分。
图3AT.H16-9.65 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：160)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AU.H16-1.29 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：161)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是重链恒定区部分。
图3AV.H16-3.4 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：162)。下划线的是重链恒定区部分。
图3AW.H16-1.92 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：163)。下划线的是重链恒定区部分。
图3AX.Ha16-1(3，5)19 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：164)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AY.Ha16-1(3，5)19 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：175)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AZ.Ha16-1.80 VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：176)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图3AAA.Ha16-1.80 VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：177)。下划双线的是前导序列部分，下划线的是轻链恒定区部分。
图4.161P2F10B抗体重链可变区与种系V-D-J序列的序列比对。图4A.H16-7.213重链可变区与人种系VH1-2/D3-9/JH4的序列比对。
图4B.H16-9.69重链可变区与人种系VH1-8/D3-10/JH4的序列比对。
图4C.H16-1.52重链可变区与人种系VH3-23/6-19/JH4的序列比对。
图4D.Ha16-1(1)23重链可变区与人种系VH3-33/D3-10/JH6的序列比对。
图4E.H16-9.44重链可变区与人种系VH4-4/D3-22/JH4的序列比对。
图4F.H16-1.67重链可变区与人种系VH4-31/D3-10/JH6的序列比对。
图4G.Ha16-1(3，5)36重链可变区与人种系VH4-39/D6-19/JH4的序列比对。
图4H.H16-1.86重链可变区与人种系VH4-59/D1-26/JH6的序列比对。
图4I.H16-9.10重链可变区与人种系VH6-1/D6-19/JH5的序列比对。
图4J.H16-9.33重链可变区与人种系VH6-1/D6-19/JH5的序列比对。
图4K.Ha16-1(1)11重链可变区与人种系VH4-59/D4-23/JH6的序列比对。
图4L.Ha16-1(3，5)18重链可变区与人种系VH4-4/D4-17/JH6的序列比对。
图4M.Ha16-1(2，4)4重链可变区与人种系VH3-33/D1-26/JH6的序列比对。
图4N.Ha16-1(3，5)56重链可变区与人种系VH5-51/D1-26/JH6的序列比对。
图4O.H16-7.8重链可变区与人种系VH4-31/D5-12/JH6的序列比对。
图4P.H16-1.68重链可变区与人种系VH3-33/D3-3/JH6的序列比对。
图4Q.H16-1.93重链可变区与人种系VH1-18/D6-13/JH6的序列比对。
图4R.Ha16-1(3，5)27重链可变区与人种系VH5-51/D4-4/JH6的序列比对。
图4S.Ha16-1.61重链可变区与人种系VH3-33/D3-3/JH6的序列比对。
图4T.Ha16-1(3，5)5重链可变区与人种系VH5-51/D3-10/JH6的序列比对。
图4U.H16-7.200重链可变区与人种系VH4-31/D4-23/JH4的序列比对。
图4V.Ha16-1(3，5)42重链可变区与人种系VH5-51/D4-11/JH6的序列比对。
图4W.H16-9.65重链可变区与人种系VH3-33/D1-26/JH4的序列比对。
图4X.H16-1.29重链可变区与人种系VH1-2/D5-12/JH6的序列比对。
图4Y.H16-3.4重链可变区与人种系VH4-31/D5-12/JH4的序列比对。
图4Z.H16-1.92重链可变区与人种系VH4-39/D4-11/JH3的序列比对。
图5.161P2F10B抗体轻链可变区与种系V-D-J序列的序列比对。图5A.H16-7.213轻链可变区与人种系VK-O2/JK4的序列比对。
图5B.H16-9.69轻链可变区与人种系VK-B3/JK1的序列比对。
图5C.H16-1.52轻链可变区与人种系B3/JK2的序列比对。
图5D.Ha16-1(1)23轻链可变区与人种系V1-20/JL2的序列比对。
图5E.H16-9.44轻链可变区与人种系L1/JK3的序列比对。
图5F.H16-1.67轻链可变区与人种系O2/JK1的序列比对。
图5G.Ha16-1(3，5)36轻链可变区与人种系V1-16/JL2的序列比对。
图5H.H16-1.86轻链可变区与人种系O2/JK1的序列比对。
图5I.H16-9.10轻链可变区与人种系L5/JK4的序列比对。
图5J.H16-9.33轻链可变区与人种系L5/JK4的序列比对。
图5K.Ha16-1(1)11轻链可变区与人种系O2/JK3的序列比对。
图5L.Ha16-1(3，5)18轻链可变区与人种系V1-19/JL2的序列比对。
图5M.Ha16-1(2，4)4轻链可变区与人种系V2-1/JL2的序列比对。
图5N.Ha16-1(3，5)56轻链可变区与人种系V1-4/JL2的序列比对。
图5O.H16-7.8轻链可变区与人种系A26/JK1的序列比对。
图5P.H16-1.68轻链可变区与人种系O2/JK4的序列比对。
图5Q.H16-1.93轻链可变区与人种系A20/JK3的序列比对。
图5R.Ha16-1(3，5)27轻链可变区与人种系V1-4/JL2的序列比对。
图5S.H16-1.61轻链可变区与人种系O12/JK3的序列比对。
图5T.Ha16-1(3，5)5轻链可变区与人种系V1-4/JL2的序列比对。
图5U.H16-7.200轻链可变区与人种系A19/JK5的序列比对。
图5V.Ha16-1(3，5)42轻链可变区与人种系V1-4/JL2的序列比对。
图5W.H16-9.65轻链可变区与人种系A19/JK5的序列比对。
图5X.Ha16-1(3，5)19轻链可变区与人种系V1-4/JL2的序列比对。
图6.通过FACS分析161P2F10B MAb与CAKI-161P2F10B细胞的结合。使用CAKI-neo作为阴性对照进行FACS分析。结果表明161P2F10B MAb特异性结合CAKI-161P2F10B细胞上的人161P2F10B。
图7.通过FACS分析161P2F10B MAb与UG-K3细胞的结合。使用CAKI-neo作为阴性对照进行FACS分析。结果表明161P2F10B MAb特异性结合UG-K3细胞上的人161P2F10B。
图8.使用UG-K3细胞进行161P2F10B MAb表位定组。各种生物素化161P2F10B MAb用过量的每种抗体竞争UG-K3细胞上的结合，通过链霉亲和素-PE检测生物素化的抗体。使用FACScan分析细胞。将得自FACS的MFI值用于数据分析。如表中所示，细胞明显表现出自我竞争(100％竞争)，这些细胞的MFI值是各种生物素化抗体的背景对照。另外，没有颜色的细胞表示两种抗体互相竞争(低MFI值)，突显为灰色的细胞(高MFI值)表示两种抗体与两种不同的表位结合。结果表明具有相同结合模式的抗体与抗体中的相同表位结合，在受试抗体中有16个表位组。
图9.通过免疫沉淀进行161P2F10B MAb的结构域作图。将编码161P2F10B的完整胞外结构域(ECD)(氨基酸46-875)、生长调节素(somatomedin)-b-样结构域(氨基酸46-157)、催化结构域(氨基酸158-558)、或催化和核酶结构域(氨基酸158-875)的Tag5表达构建体转染至293T细胞，制备细胞裂解物。然后，用所示的161P2F10B MAb或H3-1.5对照MAb对这些裂解物进行免疫沉淀(10μg MAb和100-200μg细胞裂解物)。然后，使用能识别每种重组蛋白质上呈递的His表位标记的抗-His多克隆Ab对免疫沉淀物进行Western印迹。通过裂解物整齐的Western印迹(右上方的印迹)鉴定出每种重组蛋白质的特异性分子量带，以箭头表示所述的带。将与全长ECD和生长调节素-b-样结构域结合的MAb作图于生长调节素-b-样结构域。将与全长ECD和催化结构域结合，但不与催化+核酶结构域结合的MAb作图于催化结构域。将与全长ECD和催化+核酶结构域结合，但不与催化结构域结合的MAb作图于核酶结构域。图中所示的泳道表示为：泳道1.载体，泳道2.pTag5161P2F10b WT全长ECD，泳道3.pTag5 161P2F10b(46-157)生长调节素-b-样结构域，泳道4.pTtag5 161P2F10b(158-558)催化结构域，和泳道5.pTag5161P2F10b(158-875)催化+核酶结构域。结果表明该项技术能于胞外结构域的不同区域作出抗161P2F10B的MAb的图谱。
图10.161P2F10B MAb结构域作图。右图为汇总表，其中显示了选定161P2F10B MAb，通过BiaCore分析测定的这些MAb对全长ECD(氨基酸46-875)的相对亲和力，通过基于FACS的MAb竞争试验测定的这些MAb的表位组，以及通过使用含有全长ECD、生长调节素-b-样结构域(氨基酸46-157)、催化结构域(氨基酸158-558)、或催化和核酶结构域(氨基酸158-875)的细胞裂解物进行的免疫沉淀试验测定的这些MAb的表位结构域。左图显示了161P2F10B蛋白和MAb组的分配。通过BiaCore竞争试验断定组内MAb的存在，在所述试验中，分析了MAb同时结合161P2F10B蛋白的能力。不能同时结合表示MAb共有相同或重叠的表位。能同时结合表示所用的MAb属于不同的表位组，并识别不同的或非-重叠的区域。图中每个结构域内MAb组的位置是任意的；然而，由得自较大实验组的BiaCore竞争数据已断定出核酶c，d，e组和催化组被置于彼此靠近和重叠的位置，在所述数据中，存在于不同组中的MAb与所分析的MAb竞争。这些结果表明161P2F10B MAb作图于胞外结构域的不同区域。
图11.人MAb与小鼠161P2F10B的交叉反应性。通过FACS，使用293T-小鼠161P2F10B和293T-neo细胞检测人MAb与小鼠161P2F10B的交叉反应性。将50μl2μg/ml的MAb与293T-小鼠161P2F10B或293T-neo细胞(50,000个细胞/100μl)一起保温。使用抗-hIgG-PE检测与细胞结合的抗体，并在FACS上进行分析。用Cell Quest Pro软件分析数据。实心紫色线是阴性对照细胞的数据，绿色线是161P2F10B-阳性细胞的数据。这些结果表明人161P2F10BMAb能与细胞表面的小鼠161P2F10B蛋白结合。
图12.抗161P2F10B的MAb在KU-812细胞中介导皂草毒蛋白(saporin)依赖型杀伤。KU-812细胞是表达高水平的内源性161P2F10B的CML细胞系。在第1天，将KU-812细胞(3000个细胞/孔)接种于96孔培养板。第2天，在每孔中加入等体积的培养基，其中含有2倍浓度的所示第一抗体以及2倍过量的与皂草毒蛋白毒素(AdvancedTargeting Systems，San Diego，CA)偶联的抗人(Hum-Zap)多克隆抗体。将细胞置于37℃保温5天。在保温期结束时，在每孔中加入MTS(Promega)，再继续保温4小时。然后测定450nM的光密度。结果表明161P2F10B MAb HA16-9.69，HA16-1.18和HA16-1.93在KU-812细胞中介导依赖于皂草毒蛋白的细胞毒性，而对照，即非特异性人IgG1(H3-1.4)和另一种161P2F10B MAb(HA16-7.200)却没有此效果。
图13.161P2F10B MAb抑制肾细胞癌的生长。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为750μg，到第27个研究日为止，总共给药8个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb H16-1.29.1.1，Ha16-1(3，5)27.1，H16-9.69和Ha16-1(1)11在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(p<0.05)。
图14.161P2F10B MAb抑制SCID小鼠中UG-K3细胞的生长。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，到第20个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb Ha16-11(3，5)27和Ha16-1(3，5)18在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(p<0.05)。
图15.161P2F10B MAb抑制人肾癌异种移植物。将人肾癌RXF-393肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为400μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb Ha16-1(3，5)18(P<0.01)，H16-1.68(P<0.05)和H16-9.44(P<0.05)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物RXF-393的生长。
图16.161P2F10B MAb抑制SCID小鼠中人肾癌SKRC-01的生长。将人肾癌SKRC-01肿瘤细胞(2.5×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为250μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb H16-1.68(P<0.05)，H16-7.8(P<0.05)，H16-9.44(P<0.05)和H16-3.4(P<0.01)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物SKRC-01的生长。
图17.161P2F10B MAb抑制SCID小鼠中人肾癌UG-K3的生长。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为750μg，到第19个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb H16-1.29.1.1(P<0.05)，Ha16-1(3，5)56(P<0.01)和Ha16-1(2，4)4(P<0.05)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长。
图18.161P2F10B MAb抑制SCID小鼠中人肾癌UG-K3的生长。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为500μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb H16-1.93和Ha16-1(3，5)18在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.05)。
图19.混合型161P2F10B MAb抑制SCID小鼠中人肾癌UG-K3的生长。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示进行腹膜内(i.p.)治疗。为了用161P2F10B MAb进行治疗，在每个给药剂量中将各为200μg的三种MAb混合在一起。每周给予动物两次治疗，到第27个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明使用161P2F10B MAb混合物的组合疗法在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.05)。
图20.161P2F10B MAb与Avastin
(贝伐珠单抗(bevacizumab))的组合。将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb、Avastin(贝伐珠单抗)或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，到第18个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明：当161P2F10B MAb H16-1.93和Ha16-1(3，5)18.1与Avastin组合时，在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.01)。
图21.在HepG2细胞中证实161P2F10B Qa siRNA双链体。将2×105个细胞铺于6孔培养板，每孔中含有DMEM+10％ FBS O.N.，随后，于37℃，使用20nM与1μg/ml Lipofectamine 2000(Invitrogen)复合的各种所示siRNA双链体(CT1或161P2F10B Qa)处理72小时。然后，用10mM EDTA收集细胞，用最终稀释度为1/100的与PE偶联的抗-161P2F10B、97A6 MAb(得自Immunotech Cat#PNIM3575)(空心灰色图和空心黑色图)或对照IgG(实心灰色图)染色细胞表面，通过FACS进行分析(21A)。另外，裂解复制细胞，通过SDS-PAGE分析等量的各种细胞裂解物，将所述裂解物转移至PVDF膜，用各为1μg/ml的特异性161P2F10B MAb(H16-1.52，H16-1.68和H16-1.92)混合物(上图)或抗-肌动蛋白MAb(Sigma Cat#A5060)(下图)进行Western印迹。数据表明：细胞表面作为总蛋白质的161P2F10B抗原水平被HepG2细胞中的161P2F10B Qa siRNA双链体特异性地下调。
图22.161P2F10B的RNAi沉默抑制细胞生长。用所示浓度的siRNA双链体处理内源性表达161P2F10B抗原(HepG2)或不表达161P2F10B(UMUC3)的细胞。按图22中所述制备细胞，重新铺板以进行标准的3H-胸苷掺入试验(22A)或集落生长试验(22B)。简单地说，为了进行3H-胸苷掺入试验，将2000个细胞一式三份重新铺板，培养板的每个孔中含有DMEM+10％ FBS，加入3H-胸苷放置6小时，然后收集样品，计数放射性的掺入。针对在每个寡核苷酸(oligo)浓度下经对照CT1siRNA处理的细胞将数据归一化。为了进行集落生长试验，将400个细胞重新铺于12孔培养板中，使其生长14天后，用甲醇固定集落，用龙胆紫染色，然后照相。相邻的FACS图中显示了161P2F10B的表达，图中显示出161P2F10B在HepG2细胞(粗黑线)而不是UMUC3细胞(粗黑线)中表达。这些数据表明：沉默HepG2细胞表面的161P2F10B，而不是161P2F10B缺损的UMUC3细胞表面的161P2F10B能抑制细胞生长和增殖。
图23.用RNAi沉默161P2F10B能抑制细胞迁移和Rho信号转导途径。将2×105个细胞一式两份铺于6孔培养板，每孔中含有DMEM+10％ FBS O.N.，随后，于37℃，使用10nM与1μg/ml Lipofectamine 2000复合的各种所示siRNA双链体处理72小时。用10mM EDTA收集细胞，重新铺于用胶原I预包被的Boyden迁移室(孔径为8μm)的上室中，所述上室中含有DMEM+0.1％ FBS。下室中的DMEM培养基+10％ FBS被用作化学吸引剂。使细胞迁移18小时，然后用Calcein AM染色，以4倍的放大倍数照相(23A)。平行地对复制细胞的细胞表面进行染色以测定161P2F10B沉默水平(23B，左边的实验组)。另外，在DMEM+0.1％ FBS O.N.中分开对复制细胞进行饥饿处理，随后用20ng/mlHGF刺激(或不刺激)15分钟，再制备全细胞裂解物。根据厂商(UpstateBiotechnology)提供的说明书，将等量的各种细胞裂解物与Rhotekin-琼脂糖珠一起保温以获取与GTP结合的Rho蛋白(具有活性构象的Rho)。通过SDS-PAGE分析获取的活性Rho或总的全细胞裂解物(相对于对照蛋白质上样)，转移至PVDF膜，用特异性RhoB抗体进行Western印迹。总体数据表明：161P2F10B细胞表面沉默能降低细胞的迁移能力，这与Rho B激活的显著下调有关。
图24.161P2F10b突变体在重组Caki肾癌细胞中的相对表达和酶活性。用逆转录病毒感染Caki肾癌细胞，所述逆转录病毒含有野生型161P2F10BcDNA或编码第205位氨基酸的苏氨酸至丝氨酸突变(T/S)，第205位氨基酸的苏氨酸至丙氨酸突变(T/A)或第80位氨基酸的天冬氨酸至谷氨酸突变(D/E)的点突变cDNA。通过流式细胞计量术，用97A6(CD203c)MAb分析稳定表达细胞系的161P2F10B表达(25A)，以p-nTMP为底物分析稳定表达细胞系的酶活性(25B)。结果表明：第205位的苏氨酸突变为天冬氨酸或丙氨酸会使161P2F10B裂解底物的能力丧失，这表明第205位的苏氨酸对于161P2F10B的酶活性而言是至关重要的。
图25.161P2F10B的过表达能抑制Caki-1细胞中由ATP-诱导的细胞内Ca2+振动。使用单细胞荧光显微成像术检测荷载有Fura-2的Caki-1细胞对嘌呤配体ATP(25A)，ATPγ-S(不可水解的ATP类似物)(25B)，AMP(25C)和腺苷(25D)随时间变化的细胞内Ca2+移动反应，所述Caki-1细胞过表达野生型(wt)161P2F10B，催化失活的突变体(T205A)或仅过表达对照新霉素抗性基因(neo)。将每个细胞系的各5000个细胞铺于包被有胶原的多室载玻片上，使细胞粘附过夜。将载玻片封固于显微成像系统并开始获得图像(轮流用340nm和38nM激发)，然后通过加入所示化合物(箭头)至终浓度为100μM来起始反应。每个实验组中显示的是约15-30340/380nm荧光比例痕迹，代表着显微镜视野中的各个细胞。组与组之间通过加入配体起始Ca2+反应的差异应归因于配体扩散至视野内细胞所在位置所需时间的差异。ATP能诱导Cakl-neo和Caki-1-161P2F10B催化失活突变细胞中的Ca2+振动波。然而，Caki-1-161P2F10B wt细胞中的反应为最初的Ca2+通量的反应，所述Ca2+通量以较低频率和较长持续时间的最小振动波随时间逐渐衰变。不可水解的ATP类似物ATPγ-S在所有细胞系中诱导振动的Ca2+波。腺苷和AMP在任何细胞系中都不会诱导Ca2+反应，这表明ATP-介导的反应应归因于经P2Y嘌呤能ATP受体的信号传导，而不是经腺苷或AMP这两种ATP的潜在代谢物的受体的信号传导。所有这些数据表明：通过161P2F10B介导的酶裂解除去细胞外培养基中的ATP会导致抑制作用。该试验可筛选出能够破坏161P2F10B的焦磷酸酶/磷酸二酯酶活性，并改变表达161P2F10B的细胞和组织中的ATP和其它嘌呤核苷酸-介导的Ca2+反应的化合物、药物、抗体和蛋白质。
图26.161P2F10B ECD诱导HUVEC管形成。将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于内皮细胞生长培养基(EGM)中，所述培养基的下方为200μl半固体Matrigel
，其中仅含0.1％ FBS，仅含10％ FBS，含有0.1％ FBS+161P2F10B ECD(1μg/ml)或含有0.1％ FBS+对照ECD(1μg/ml)。使细胞形成管网络(tube network)7小时，然后照相。测定每个孔中闭合管网络的数量。结果表明：当铺于Matrigel上时，161P2F10B的细胞外结构域(ECD)诱导原代内皮细胞中管网络的形成。
图27.HUVEC管形成需要161P2F 10B磷酸二酯酶活性。将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于内皮细胞生长培养基(EGM)中，所述培养基的下方为200μl半固体Matrigel，其中仅含0.1％ FBS，仅含10％ FBS，含有0.1％FBS+VEGF(50ng/ml)，0.1％ FBS+野生型161P2F10B WT ECD(0.1，1或5μg/ml)，0.1％ FBS+非催化型突变体161P2F10B D80E ECD(DE)(0.1，1或5μg/ml)，或0.1％ FBS+催化型突变体161P2F10B T205A ECD(TA)(0.1，1或5μg/ml)。使细胞形成管网络7小时，然后照相。测定每个孔中闭合管网络的数量。结果表明：当铺于Matrigel上时，161P2F10B的磷酸二酯酶活性对于ECD诱导原代内皮细胞中管网络形成的活性而言是至关重要的。另外，当铺于Matrigel上时，161P2F10B ECD的RGD结构域对于原代内皮细胞中管网络的形成也起到部分作用。
图28.161P2F10B MAb抑制HUVEC管形成。将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于内皮细胞生长培养基(EGM)中，所述培养基的下方为200μl半固体Matrigel，其中仅含0.1％FBS，仅含5％ FBS，或含有0.1％ FBS+161P2F10B ECD(1μg/ml)，其中含或不含抗161P2F10B的MAb(20μg/ml)。使细胞形成管网络18小时，然后照相。测定每个孔中闭合管网络的数量。对照孔表示100％管形成，以此为基础计算抑制百分比。结果表明：当铺于Matrigel上时，抗161P2F10B的MAb抑制原代内皮细胞中管网络的形成。
图29.161P2F10B ECD诱导HUVEC的迁移。在内皮细胞生长培养基(EGM)中培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并用荧光染料Calcien AM进行标记。使细胞与0.1％ BSA，10％ FBS，0.1％ BSA+VEGF(20ng/ml)，0.1％BSA+161P2F10B ECD(1，5或10μg/ml)或0.1％ BSA+对照ECD(1，5或10μg/ml)一起保温，然后接种于Boyden室的上方插入物上。使细胞穿过室进行迁移达20小时，然后使用显微镜和MetaMorph软件进行定量。结果表明：161P2F10B的ECD以依赖于剂量的形式诱导内皮细胞的迁移。
图30.161P2F10B MAb抑制SK-RC-01(肾明细胞(kidney clear cell))癌细胞的增殖。将SK-RC-01细胞与20μg/ml MAb一起保温，然后在含有10％FBS的培养基中生长3-5天。在培养物中加入6小时的3H-胸苷脉冲，然后处理细胞以掺入3H-胸苷。使用对照MAb作为掺入的最大总数计算所示抑制作用的水平。结果表明：相对于对照MAb而言，抗161P2F10B的MAb能抑制SK-RC-01肾明细胞癌细胞的增殖(45-76％)。
图31.161P2F10B MAb对肾癌细胞增殖、存活和细胞凋亡的作用。将RFX-393肾癌细胞与20μg/ml所示MAb(或5μg/ml EGFR MAb M225)一起保温，然后在含有10％FBS的培养基中生长6天。在培养物中加入6小时的3H-胸苷脉冲，然后处理细胞以掺入3H-胸苷。使用对照MAb作为掺入的最大总数计算所示抑制作用的水平。为了进行存活试验(MTS)，在细胞培养孔中直接加入得自试剂盒的少量溶液试剂(Solution Reagent)，接着保温1-4小时，然后用96孔培养板读数器纪录490nm下的光吸收值。通过490nm下的光吸收值测定的生色formazan产物的量与培养物中活细胞的线粒体活性和/或数目直接成比例。计算相对于对照MAb的％抑制作用。为了进行细胞凋亡试验，将与MTS试验中制备的细胞裂解物相同的细胞裂解物用于核小体释放试验(细胞死亡ELISA)。将细胞凋亡水平记录为相对于对照MAb的％抑制作用。较强的MAb以最高水平影响所有三个试验。结果表明：抗161P2F10B的MAb能抑制RFX-393肾癌明细胞的增殖，降低其细胞存活能力并诱导细胞凋亡程序。
图32.161P2F10B MAb以依赖于剂量的形式抑制HUVEC管形成。将原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于内皮细胞生长培养基(EGM)中，所述培养基的下方为200μl半固体
其中仅含0.1％ FBS，仅含5％ FBS，或含有0.1％ FBS+161P2F10B ECD(1μg/ml)，其中含或不含抗161P2F10B的MAb(所示浓度)。使细胞形成管网络18小时，然后照相。测定每个孔中闭合管网络的数量。对照孔表示100％管形成，以此为基础计算抑制百分比。结果表明：当铺于
上时，抗161P2F10B的MAb以依赖于剂量的形式抑制原代内皮细胞中管网络的形成。
图33.161P2F10B MAb抑制HepG2肝癌细胞的迁移(图33A)。在10％FBS中培养HepG2肝癌细胞，并用Calcien AM荧光染料进行标记。使2×104个细胞与对照MAb或161P2F10B MAb的混合物(各为25μg/ml)一起保温，然后在缺乏或存在8ng/ml肝细胞生长因子(HGF)的情况下，将细胞接种于Boyden室的上方插入物上。使细胞穿过室进行迁移达24小时，然后照相，并使用MetaMorph软件进行定量。结果表明：161P2F10B MAb能抑制HepG2细胞的迁移，用肝细胞生长因子处理细胞能加强对161P2F10B MAb的抑制作用敏感的细胞迁移。结果图示于图33B。
图34.161P2F10B MAb抑制A-704肾明细胞的迁移(图34A)。在10％ FBS中培养A-704(肾明细胞)癌细胞，并用Calcien AM荧光染料进行标记。使2×104个细胞与对照MAb或161P2F10B MAb的混合物(各为25μg/ml)一起保温，然后在缺乏或存在8ng/ml肝细胞生长因子(HGF)的情况下，将细胞接种于Boyden室的上方插入物上。使细胞穿过室进行迁移达24小时，然后照相，并使用MetaMorph软件进行定量。结果表明：161P2F10B MAb能抑制A-704细胞的迁移，用肝细胞生长因子处理细胞能加强对161P2F10B MAb的抑制作用敏感的细胞迁移。结果图示于图34B。
图35.161P2F10B MAb抑制A-704肾明细胞的侵入(图35A)。在10％ FBS中培养A-704(肾明细胞)癌细胞，并用Calcien AM荧光染料进行标记。使2×104个细胞与对照MAb或161P2F10B MAb的混合物(各为25μg/ml)一起保温，然后在缺乏或存在8ng/ml肝细胞生长因子(HGF)的情况下，将细胞接种于包被有Matrigel的Boyden室的上方插入物上。使细胞穿过室进行侵入达44小时，然后照相，并使用MetaMorph软件进行定量。结果表明：HGF能刺激A-704细胞的侵入，161P2F10B MAb(H16-1.93)能在经HGF处理的细胞和未经处理的细胞中抑制细胞侵入。结果表明：161P2F10B MAb能通过Matrigel抑制A-704细胞的侵入，用肝细胞生长因子处理细胞能加强对161P2F10B MAb的抑制作用敏感的细胞侵入。结果图示于图35B。
图36.161P2F10B在KU-812细胞上的二聚体化。室温下将KU-812细胞(2×105个细胞)与含有如图所示渐增浓度的乙二醇双[琥珀酰亚胺琥珀酸酯](EGS)的PBS保温30分钟。在RIPA缓冲液(1％ NP-40)中裂解细胞，进行4-12％梯度的非-还原性SDS-PAGE，然后使用1μg/ml MAb混合物(H16-1.52，H16-1.68和H16-1.92)对161P2F10B进行Western印迹。结果表明：161P2F10B在细胞表面是二聚体化的，当在肿瘤细胞表面表达时，该特性可能是161P2F10B完整的酶活性和其它功能活性所必需的。
图37.通过IHC检测癌症患者样本中的161P2F10B蛋白。简单地说，将冷冻组织切成6微米的切片，封固于载玻片上。室温下使切片干燥2小时，在丙酮中固定8分钟，然后风干。室温下将切片放置在161P2F10B抗体M16-41(3)50中保温3小时。用缓冲液将载玻片洗涤3次，再与和DAKOEnVision+TM过氧化物酶-偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白第二抗体(DAKOCorporation，Carpenteria，CA)保温1小时。然后用缓冲液洗涤切片，使用DAB试剂盒(SIGMA Chemicals)显色，用苏木精复染，并通过亮视野显微镜进行分析。细胞显示出棕色表明161P2F10B在肝细胞癌肿瘤细胞中表达(37A和37B)。没有在M16-41(3)50中保温的一系列切片没有被染色(37C和37D)。结果表明：161P2F10B在人肝癌中表达，针对此抗原的抗体可用作诊断试剂。
发明详述
章节概述
I.)定义
II.)161P2F10B多核苷酸
II.A.)161P2F10B多核苷酸的用途
II.A.1)监测基因异常
II.A.2)反义实施方案
II.A.3.)引物和引物对
II.A.4.)分离编码161P2F10B的核酸分子
II.A.5.)重组核酸分子和宿主-载体系统
III.)161P2F10B-相关蛋白质
III.A.)携有基元的蛋白质的实施方案
III.B.)161P2F10B-相关蛋白质的表达
III.C.)161P2F10B-相关蛋白质的修饰
III.D.)161P2F10B-相关蛋白质的用途
IV.)161P2F10B抗体
V.)161P2F10B细胞免疫反应
VI.)161P2F10B转基因动物
VII.)检测161P2F10B的方法
VIII.)监测161P2F10B-相关基因及其产物之状态的方法
IX.)鉴定与161P2F10B相互作用的分子
X.)治疗方法和组合物
X.A.)抗癌疫苗
X.B.)161P2F10B用作基于抗体之疗法的靶标
X.C.)161P2F10B用作细胞免疫反应的靶标
X.C.1.小基因疫苗
X.C.2.CTL肽与辅助肽的组合
X.C.3.CTL肽与T细胞引发剂的组合
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
X.D.)过继免疫疗法
X.E.)为了治疗或预防的目的施用疫苗
X.I.)161P2F10B的诊断和预测实施方案
XII.)抑制161P2F10B蛋白质的功能
XII.A.)用胞内抗体抑制161P2F10B
XII.B.)用重组蛋白质抑制161P2F10B
XII.C.)抑制161P2F10B转录或翻译
XII.D.)有关治疗策略的一般性考虑
XIII.)161P2F10B调制剂的鉴定、表征和应用
XIV.)试剂盒/制品
I.)定义
除非另有说明，本文所用的所有技术术语、注释和其它科学术语或专用名词与本发明所属技术领域的技术人员所一般理解的意思相同。在有些情况下，为了清楚说明和/或易于引用，本文定义了具有公知含义的术语，本文所述定义的内容与本领域一般理解的意思没有什么本质的不同。本文所描述或引用的很多技术和方法是易于理解的，本领域技术人员使用常规的方法学，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.中所述的被广泛使用的分子克隆方法学，可以一般性地使用这些技术和方法。除非另有说明，适当时可根据厂商定义的方法和/或参数，一般性地进行包括使用商购试剂盒和试剂的方法。
术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”指的是已经由相关组织囊扩散的癌症，包括美国泌尿协会(AUA)系统下的C期疾病、Whitmore-Jewett系统下的C1-C2期疾病和TNM(肿瘤、淋巴结、转移)系统下的T3-T4和N+期疾病。一般说来，不推荐给局部晚期疾病患者进行外科手术，与患有临床上定位(局限于器官)的癌症的患者相比，这些患者的结果要差很多。
本文中的“改变天然糖基化模式”指的是(通过除去构成糖基化之基础的糖基化位点或经化学和/或酶学方法消除糖基化)缺失天然161P2F10B序列中存在的一个或多个糖组成成分，和/或添加一个或多个天然161P2F10B序列中原本不存在的糖基化位点。另外，该术语包括天然蛋白质糖基化性质上的变化，包括所存在的不同糖组成成分性质和比例的变化。
术语“类似物”指的是与另一种分子结构类似或具有类似或相应特征的分子(如161P2F10B-相关蛋白质)。例如，161P2F10B蛋白的类似物可以被特异性结合161P2F10B的抗体或T细胞特异性结合。
除非另有清楚说明，术语“抗体”的含义是最宽泛的。因此，“抗体”可以是天然的或人工制备的，例如通过常规杂交瘤技术产生的单克隆抗体。抗-161P2F10B抗体包括单克隆和多克隆抗体以及含有这些抗体的抗原-结合结构域和/或一个或多个互补决定区的片段。本文所用术语“抗体”指的是能特异性结合161P2F10B和/或表现出所需生物活性的任何形式的抗体或其片段，它特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能特异性结合161P2F10B和/或表现出所需生物活性即可。任何特异性抗体都可用于本文提供的方法和组合物。因此，在一个实施方案中，术语“抗体”包括一种分子，其含有至少一个得自轻链免疫球蛋白分子的可变区和至少一个得自重链分子的可变区，它们合起来形成靶抗原的特异性结合位点。在一个实施方案中，抗体是IgG抗体。例如，抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4抗体。可在细胞培养物、噬菌体或包括但不限于奶牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿的多种动物中产生可用于本发明方法和组合物中的抗体。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是哺乳动物抗体。可使用噬菌体技术分离最初的抗体或产生具有经改变的特异性或亲合力特征的变体。此技术是本领域中常规的和众所周知的技术。在一个实施方案中，通过本领域已知的重组技术生产抗体。例如，通过用含有编码抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来生产重组抗体。可使用一个或多个载体将表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列转染至宿主细胞。有关重组产生和生产抗体的技术可参见例如：Delves，ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，et al.，MONOCLONALANTIBODIES(Oxford University Press，2000)；Goding，MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)；CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons，最新版)。可通过重组技术修饰本发明的抗体以使抗体介导所需功能的效力变得更强。因此，使用重组技术通过取代来修饰的抗体也落入本发明的范围之内。取代通常是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可被不同的残基所替代。参见例如美国专利5,624,821、美国专利6,194,551、WO 9958572；和Angal，et al.，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。氨基酸中的修饰包括氨基酸的缺失、添加、取代。在有些情况下，进行这种改变是为了降低不必要的活性，例如补体-依赖型的细胞毒性。经常通过共价或非共价地连接能提供可测信号的物质来标记抗体。多种标记和偶联技术是已知的，科技和专利文献中已有广泛报道。可筛选这些抗体以结合正常或有缺陷的161P2F10B。参见例如ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(OxfordUniversity Press，1996)。下述体外和体内试验可鉴定出具有所需生物活性的适当抗体，所述体外试验包括但不限于：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管发生、细胞间通讯、细胞凋亡、转运、信号转导，体内试验如抑制肿瘤生长。本文提供的抗体也可用于诊断用途。作为捕获或非-中和抗体，可筛选它们与特异性抗原结合但不会抑制抗原的受体-结合或生物活性的能力。作为中和抗体，抗体可用于竞争性结合试验。它们也可用于定量161P2F10B或其受体。
“抗体片段”被定义为能与其靶标结合的至少部分免疫球蛋白分子可变区，即抗原-结合区。在一个实施方案中，它特别地覆盖单个抗-161P2F10B抗体及其克隆(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)和具有多表位特异性的抗-161P2F10B抗体组合物。本发明方法和组合物中的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体可以是与抗原结合的抗体片段形式，包括Fab片段、F(ab’)2片段、单链可变区等。可使用本领域众所周知的方法产生完整分子的片段，包括酶促消化和重组技术。
本文所用的任何形式的“抗原”都可用于产生特异于161P2F10B的抗体。因此，引发抗原可以是单个表位、多个表位或仅为完整的蛋白质或完整蛋白质与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂的组合。引发抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白质(如用被至少一部分抗原转染的细胞进行免疫)或可溶性蛋白质(如仅用蛋白质的胞外结构域部分进行免疫)。可在经基因修饰的细胞中生产抗原。编码抗原的DNA可以是基因组或非-基因组的(如cDNA)，并编码至少一部分胞外结构域。本文所用术语“部分”指的是恰好构成所需抗原的免疫原性表位的最少数目的氨基酸或核酸。可以使用任何适于转化所需细胞的基因载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非-病毒载体，如阳离子脂质。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的抗体特异性结合所需161P2F10B的胞外结构域的至少一部分。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可以与“生物活性剂”偶联。本文所用术语“生物活性剂”指的是任何能结合抗原和/或增强或介导合乎需要的增强细胞杀伤毒素的生物学作用的合成或天然化合物。
在一个实施方案中，可用于本发明的结合片段是有生物活性的片段。本文所用术语“有生物活性”指的是抗体或抗体片段能结合所需的抗原表位并能直接或间接发挥生物学作用。直接作用包括但不限于调制、刺激和/或抑制生长信号，调制、刺激和/或抑制抗-细胞凋亡信号，调制、刺激和/或抑制细胞凋亡或坏死信号，调制、刺激和/或抑制ADCC级联和调制、刺激和/或抑制CDC级联。
“双特异性”抗体也可用于本发明的方法和组合物。本文所用术语“双特异性抗体”指的是对至少两个不同的抗原表位具有结合特异性的抗体，一般是单克隆抗体。在一个实施方案中，表位得自相同的抗原。在另一个实施方案中，表位得自两个不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，例如，通过共-表达两个免疫球蛋白重链/轻链对可以重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein et al.，Nature 305：537-39(1983)。或者，使用化学键制备双特异性抗体。参见例如Brennan，et al.，Science 229：81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Hollinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)，Gruber，et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。
本文的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与得自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而其余链与得自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，还包括所述抗体的片段，只要它们能特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物活性即可(美国专利4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
术语“化疗剂”指的是所有能有效抑制肿瘤生长的化合物。化疗剂的非限制性例子包括烷化剂，例如氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺化合物和烷基磺酸酯；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如长春花生物碱(vinca alkaloids)和鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物、细胞毒抗生素、破坏或干扰DNA表达的化合物、和生长因子受体拮抗剂。另外，化疗剂包括细胞毒性剂(如本文所定义)、抗体、生物分子和小分子。
术语“密码子最优化的序列”指的是通过替换任何使用频率低于约20％的密码子，针对特定宿主物种而最优化的核苷酸序列。本文将除了密码子最优化以外，通过消除错误的聚腺苷酸化序列，消除外显子/内含子剪接信号，消除转座子-样重复序列和/或最优化GC含量而被最优化以在给定宿主物种中表达的核苷酸序列称为“表达增强的序列”。
“组合文库”是通过混合多种化合物“构件”(如试剂)进行化学合成或生物合成而产生的多种化合物的集合。例如，线性组合化合物文库，如多肽(如突变蛋白)文库是通过以每一种可能的方式混合一套被称为化合物构件的具有给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)的氨基酸而形成的。通过组合混合化合物构件即可合成多种化合物(Gallop et al.，J.Med.Chem.37(9)：1233-1251(1994))。
组合文库的制备和筛选是本领域技术人员众所周知的技术。所述组合化合物文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175，Furka，Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)，Houghton et al.，Nature，354：84-88(1991))，peptoid(PCT公开号WO91/19735)，编码肽(PCT公开号WO 93/20242)，随机生物-寡聚体(PCT公开号WO92/00091)，苯并二氮杂卓(benzodiazepine)(美国专利5,288,514)，diversomer，如乙内酰脲、苯并二氮杂卓和二肽(Hobbs et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))，插烯多肽(vinylogous peptides)(Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有β-D-葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡氨基甲酸酯(Cho，et al.，Science 261：1303(1993))，和/或肽基膦酸酯(Campbell et al.，J.Org.Chem.59：658(1994))。一般可参见Gordonet al.，J.Med.Chem.37：1385(1994)，核酸文库(参见例如Stratagene，Corp.)，肽核酸文库(参见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(参见例如Vaughn et al.，Nature Biotechnology 14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖类文库(参见例如Liang et al.，Science 274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，以及有机小分子文库(参见例如苯并二氮杂卓，Baum，C & EN，Jan 18，page 33(1993)；类异戊二烯(isoprenoid)，美国专利5,569,588；噻唑烷二酮(thiazolidinone)和间噻唑烷酮(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷(pyrrolidine)，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物(morpholinocompound)，美国专利5,506,337；苯并二氮杂卓，美国专利5,288,514等)。
制备组合文库的仪器可以商购(参见例如357 NIPS，390 NIPS，AdvancedChem Tech，Louisville KY；Symphony，Rainin，Woburn，MA；433A，AppliedBiosystems，Foster City，CA；9050，Plus，Millipore，Bedford，NIA)。已开发出多种众所周知的机器人系统用于溶液相化学。这些系统包括自动化工作站，如由Takeda Chemical Industries，LTD.(Osaka，Japan)开发的自动化合成仪，以及多种利用机器手的机器人系统(Zymate H，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，Palo Alto，Calif.)，所述机器人系统能模拟化学家进行的人工合成操作。上述任一种仪器都适用于本发明。(必要时)对这些仪器进行改装以使它们能按本文所述的方式操作，这一点对相关领域的熟练技术人员而言是显而易见的。另外，多种组合文库本身也是可以商购的(参见例如ComGenex，Princeton，NJ；Asinex，Moscow，RU；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；ChemStar，Ltd，Moscow，RU；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；MartekBiosciences，Columbia，MD等)。
本文所用术语“保守取代”指氨基酸取代是本领域技术人员已知的，一般不会改变所得分子的生物活性。本领域技术人员一般认为在多肽的非-必需区进行单个氨基酸取代不会显著改变生物活性(参见例如Watson，et al.，MOLECULAR BIOLOGY OFTHE GENE，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，p.224(第4版1987))。优选根据表III(a-b)所列的那些进行例举的取代。例如，所述改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任何一种取代任何其它的疏水氨基酸；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)和反之；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)和反之；以及用丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)和反之。其它取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境以及它在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可以互换使用，丙氨酸(A)和缬氨酸(V)也是如此。相对疏水的甲硫氨酸(M)经常可与亮氨酸和异亮氨酸互换使用，有时可与缬氨酸互换使用。在氨基酸残基的显著特征为其电荷的位置处，赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常可以互换使用，这两个氨基酸残基pK的差异不显著。在特殊的环境中，其它改变也可被认为是“保守的”(参见例如本文的表III(a)；page 13-15“Biochemistry”2nd ED.Lubert Stryer ed(Stanford University)；Henikoff et al.，PNAS 1992 Vol 89 10915-10919；Lei etal.，J Biol Chem 1995 May 19；270(20)：11882-6)。其它取代也是允许的，可以凭经验或根据已知的保守取代确定这些取代。
术语“细胞毒性剂”指的是能抑制或防止细胞表达活性、细胞功能和/或导致细胞被破坏的物质。该术语欲包括放射性同位素、化疗剂和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的有酶促活性的毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒性剂的例子包括但不限于奥瑞斯他丁(auristatin)、奥瑞斯他丁E、金霉素(auromycin)、美登木素生物碱(maytansinoids)、钇(yttrium)、铋(bismuth)、蓖麻毒蛋白(ricin)、蓖麻毒蛋白A-链、康伯来斯他丁(combrestatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、多罗斯他丁(dolostatin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺红菌素(daunorubicin)、紫杉醇(taxol)、顺铂(cisplatin)、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙素(colchicine)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、放线菌素(actionmycin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白(abrin)、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、白树毒蛋白(gelonin)、丝裂吉霉素(mitogellin)、局限曲霉素(retstrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素(crotin)、加利车霉素(calicheamicin)、Sapaonaria offcinalis抑制剂、糖皮质激素、其它化疗剂以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和放射性同位素Lu，包括Lu177。抗体也可与抗-癌前药激活酶偶联，所述酶能将前药转变为其活性形式。
本文所用术语“二价抗体(diabody)”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在相同多肽链(VH-VL)中含有与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用长度很短以至于相同链上的两个结构域之间不能配对的接头，所述结构域只能与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。二价抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)。
“基因产物”在本文中用于表示肽/蛋白质或mRNA。例如，“本发明的基因产物”在本文中有时被称为“癌症氨基酸序列”、“癌症蛋白质”、“表I所列癌症的蛋白质”、“癌症mRNA”、“表I所列癌症的mRNA”等。在一个实施方案中，癌症蛋白质由图1的核酸编码。癌症蛋白质可以是片段，或者是图1的核酸所编码的全长蛋白质。在一个实施方案中，使用癌症氨基酸序列测定序列同一性或相似性。在另一个实施方案中，序列是图1的核酸所编码蛋白质的天然等位基因变体。在另一个实施方案中，序列是本文详细描述的序列变体。
“异偶联物”抗体可用于本发明的方法和组合物。本文所用术语“异偶联物抗体”指的是两个共价连接的抗体。可使用合成蛋白质化学领域的已知方法制备这种抗体，包括使用交联剂。参见例如美国专利4,676,980。
测定特定核酸或蛋白质产物的存在、缺乏、含量或其它特性的“高通量筛选”试验是本领域技术人员众所周知的。类似地，结合试验和报道基因测定法也是众所周知的。因此，例如，美国专利5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选法；美国专利5,585,639公开了核酸结合的高通量筛选法(即阵列)；而美国专利5,576,220和5,541,061公开了高通量筛选配体/抗体结合的方法。
另外，高通量筛选系统可以商购(参见例如Amersham Biosciences，Piscataway，NJ；Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等)。这些系统的整个操作流程一般是自动进行的，包括所有样品和试剂的移取、分液、定时保温和最终对适用于测定法的检测仪中的微量培养板进行读数。这些成型的系统提供了高流通量和快速起动以及高水平的灵活性和可定制性。这些系统的制造商提供了针对多种高通量系统的详细操作方法。因此，例如，Zymark公司提供了技术公报，其中描述了用于检测基因转录调制、配体结合等的筛选系统。
术语“同系物”指的是与另一种分子有同源性的分子，例如，在相应位置具有相同或相似化合物残基序列的分子。
在一个实施方案中，本文提供的抗体是“人抗体”。本文所用术语“人抗体”指的是这样一种抗体，其中实质上整个轻链和重链序列，包括互补决定区(CDR)都得自人基因。在一个实施方案中，通过三源杂交瘤技术、人B-细胞技术(参见例如Kozbor，et al.，Immunol.Today 4：72(1983))、EBV转化技术(参见例如Cole et al.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY 77-96(1985))或使用噬菌体展示(参见例如Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))制备人单克隆抗体。在具体实施方案中，在转基因小鼠中产生人抗体。制备部分至完整人抗体的技术是本领域已知的，可使用任何此类技术。根据一个特别优选的实施方案，在经改造可表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中制备完整的人抗体序列。有关制备能生产人抗体的转基因小鼠的描述可参见例如WO 02/43478和美国专利6,657,103(Abgenix)及其同族专利。然后使得自能产生所需抗体的转基因小鼠的B细胞融合以制备能连续产生抗体的杂交瘤细胞系。参见例如美国专利5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；和5,545,806；以及Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.31：33-42(1998)；Green，et al.，J.Exp.Med.188：483-95(1998)。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见例如Stites，et al.，IMMUNOLOGY，8TH ED.，Lange Publishing，LosAltos，CA(1994))。
本文所用术语“人源化抗体”指的是含有非-人(如鼠)抗体序列以及人抗体序列的抗体形式。所述抗体是嵌合抗体，其含有得自非-人免疫球蛋白的最少序列。一般说来，人源化抗体基本上含有至少一个，一般为两个可变结构域中的全部结构域，其中全部或基本上全部的高变环与非-人免疫球蛋白的相对应，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体也任选含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般含有至少一部分人免疫球蛋白恒定区。参见例如Cabilly，美国专利号4,816,567；Queen et al.(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；和ANIIBODYENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996)。
有关多核苷酸的上下文中使用的术语“杂交”指的是常规的杂交条件，优选例如在50％甲酰胺/6×SSC/0.1％ SDS/100μg/ml ssDNA中的杂交，其中杂交温度高于37℃，在0.1×SSC/0.1％ SDS中的洗涤温度高于55℃。
术语“分离的”或“生物纯的”指的是基本上或实质上不含通常与天然状态的物质相伴存在的组分的物质。因此，本发明的分离的肽优选不含通常与处于原位环境中的肽相关的物质。例如，当一种多核苷酸基本上与污染的多核苷酸分离开时，即可将其称为“分离的”，所述污染的多核苷酸对应于除161P2F10B基因以外的基因或与之互补，或者编码除161P2F10B基因产物或其片段以外的多肽。本领域技术人员能容易地使用核酸分离方法来获得分离的161P2F10B多核苷酸。当利用物理、机械或化学方法，从通常与161P2F10B蛋白相关的细胞组分中提取出161P2F10B蛋白时，即可认为该蛋白质是“分离的”。本领域技术人员能容易地利用标准的纯化方法来获得分离的161P2F10B蛋白。或者，可通过化学方法制备分离的蛋白质。
适当的“标记”包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光组成成分、化学发光组成成分、磁性颗粒等。教导所述标记的使用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，本文提供的抗体可用作荧光体的抗原结合成分。参见例如Zeytun et al.，Nat.Biotechnol.21：1473-79(2003)。
术语“哺乳动物”指的是被归为哺乳动物的任何生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、奶牛、马和人。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物是小鼠。在本发明的另一个实施方案中，哺乳动物是人。
术语“转移性癌症”和“转移疾病”指的是已扩散至局部淋巴结或远端位点的癌症，欲包括AUA系统下的D期疾病和TNM系统下的TxNxM+期疾病。
本文所用术语“调制剂(modulator)”或“受试化合物”或“候选药物”或语义等同的术语描述的是任何欲测定其直接或间接改变癌症表型或癌症序列(如核酸或蛋白质序列)的表达，或癌症序列的作用(如信号转导、基因表达、蛋白质相互作用等)的能力的分子，例如蛋白质、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。一方面，调制剂可中和本发明癌症蛋白质的作用。“中和”指的是蛋白质活性受到抑制或阻断，以及随后对细胞的作用。另一方面，调制剂通过中和所述蛋白质的水平可中和本发明的基因及其相应蛋白质的作用。在优选实施方案中，调制剂改变本文所提供核酸或蛋白质的表达分布图或下游的效应物途径。在一个实施方案中，调制剂抑制癌症表型，例如使之成为正常组织指纹。在另一个实施方案中，调制剂诱导癌症表型。一般说来，平行电泳多种具有不同试剂浓度的受试混合物，从而获得针对不同浓度的差异反应。一般将其中一个浓度用作阴性对照，即作为零浓度或低于检测水平。
调制剂、候选药物或受试化合物包含多个化合物类别，但一般为有机分子，优选为分子量大于100至小于约2,500道尔顿的小的有机化合物。优选的小分子小于2000，或小于1500或小于1000或小于500道尔顿。候选药物含有与蛋白质进行结构上的相互作用，特别是氢键所必需的官能团，一般至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选含有至少两个化学官能团。候选药物经常含有被一个或多个上述官能团取代的碳环或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。调制剂还含有生物分子，例如肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物及其组合。特别优选的是肽。一类调制剂是肽，例如约5至约35个氨基酸的肽，优选约5至约20个氨基酸的肽，特别优选约7至约15个氨基酸的肽。优选癌症调制蛋白是可溶性的，包括非-跨膜区，和/或具有N-末端Cys以有助于溶解性。在一个实施方案中，片段的C-末端保持为游离的酸，而N-末端是游离的胺以有助于与半胱氨酸偶联。在一个实施方案中，本发明的癌症蛋白质与本文所述的免疫原性的药物偶联。在一个实施方案中，癌症蛋白质与BSA偶联。本发明的肽，例如具有优选长度的肽可以互相连接或与其它氨基酸连接以产生较长的肽/蛋白质。调制肽可以是上文所述天然蛋白质的消化物、随机肽或“偏性”随机肽。在优选实施方案中，基于肽/蛋白质的调制剂是本文所定义的抗体或其片段。
癌症调制剂也可以是核酸。核酸调制剂可以是天然核酸、随机核酸、或“偏性”随机核酸。例如，可以在与上文所述针对蛋白质的方法相类似的方法中使用原核或真核基因组的消化物。
本文所用术语“单克隆抗体”指的是由一群基本上均一的抗体获得的抗体，即除了可能存在极少量的天然突变外，抗体群中的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的抗单个抗原表位的抗体。相反，常规的(多克隆)抗体制品一般包括抗(或特异于)不同表位的多种抗体。在一个实施方案中，在含有多个抗原表位的单个抗原中，多克隆抗体含有多个具有不同的表位特异性、亲和性或亲合力的单克隆抗体。修饰词“单克隆”表示得自基本上均一的抗体群的抗体的特征，不应解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。例如，可通过Kohler et al.，Nature 256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA法(参见例如美国专利4,816,567)制备用于本发明的单克隆抗体。也可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)所述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。经ELISA测定，这些单克隆抗体的结合Kd通常约为1M，更通常至少约为300nM，一般至少约为30nM，优选至少约为10nM，更优选至少约为3nM或更高。
在161P2F10B-相关蛋白质的生物基元中提及的“基元”指的是形成蛋白质部分一级序列的任何氨基酸模式，它与特定的功能(例如蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用等)或修饰(例如磷酸化、糖基化或酰胺化)，或定位(例如分泌序列，核定位序列等)相关，或者是与体液或细胞免疫原性相关联的序列。基元可以是邻接的或能排列至一般与一些功能或特性相关的一些位置处。在HLA基元的上下文中，“基元”指的是能被特定HLA分子识别的限定长度的肽中的残基模式，通常对I类HLA基元而言，所述肽的长度为约8至约13个氨基酸，对II类HLA基元而言，所述肽的长度为约6至约25个氨基酸。对于由每个人HLA等位基因编码的每个蛋白质而言，与HLA结合的肽基元一般是不同的，不同之处在于一级和二级锚残基的模式。常见的基元列于表V中。
“药物赋形剂”包括如下所述的物质：佐剂、载体、pH-调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂、防腐剂等。
“药物可接受”指的是无毒、惰性和/或与人或其它哺乳动物生理上相容的组合物。
术语“多核苷酸”指的是长度至少为10个碱基或碱基对的核苷酸聚合物形式，它可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一种核苷酸的修饰形式，它包括单链和双链形式的DNA和/或RNA。在本领域中，该术语经常与“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可含有本文所述的核苷酸序列，其中图1所示的胸苷(T)也可以是尿嘧啶(U)；该定义与DNA和RNA化学结构之间的差异相关，与RNA中4个主要碱基之一是尿嘧啶(U)而不是胸苷(T)这一观察结果特别相关。
术语“多肽”指的是至少约为4，5，6，7或8个氨基酸的聚合物。在整个说明书中，使用了标准的三字母或单字母氨基酸名称。在本领域中，该术语经常与“肽”或“蛋白质”互换使用。
HLA“一级锚残基”是肽序列特定位置处的氨基酸，它可提供免疫原性肽与HLA分子之间的接触点。一般将限定长度的肽内部的1至3个，通常为2个一级锚残基定义为免疫原性肽的“基元”。据认为这些残基适合与HLA分子的肽结合沟密切接触，其侧链掩埋于结合沟的特殊袋中。例如，在一个实施方案中，针对I类HLA分子的一级锚残基位于本发明的8，9，10，11或12残基肽表位的第2位(自氨基末端位置起)和羧基末端的位置。或者，在另一个实施方案中，与II类HLA分子结合的肽一级锚残基彼此间隔，而不是位于肽的末端，其中肽的长度一般至少为9个氨基酸。表IV(a)中列出了每个基元和超基元的一级锚位置。例如，通过改变表IV所示一级和/或二级锚位置中的特定残基的存在或缺乏，即可产生类似肽。可以使用所述类似肽来调制含有特定HLA基元或超基元的肽的结合亲和性和/或群体覆盖范围。
“放射性同位素”包括但不限于下述例子(表IV(I)同时列出了非限制性用途的例子)。
本文提及核酸和蛋白质时所用的“随机化”或语义等同的词指的是：每种核酸和蛋白质分别由实质上随机的核苷酸和氨基酸组成。这些随机的肽(或本文所述的核酸)可在任何位置掺入任何核苷酸或氨基酸。可以设计合成方法以产生随机化的蛋白质或核酸，从而在序列长度上形成所有或大多数可能的组合，进而形成随机化的候选生物活性蛋白质剂文库。
在一个实施方案中，文库是“完全随机化的”，在任何位置处都没有序列偏好或不变的序列。在另一个实施方案中，文库是“偏性随机”文库。即，序列内的一些位置保持不变，或只有有限数目的可能性。例如，核苷酸或氨基酸残基只在有限的类别，例如疏水氨基酸、亲水残基、有空间偏性(小或大)的残基中随机化，用于产生核酸结合结构域，产生交联用的半胱氨酸，SH-3结构域所用的脯氨酸，磷酸化位点所用的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或组氨酸等，或者对嘌呤有偏好等。
“重组”DNA或RNA分子是已经在体外进行过分子操作的DNA或RNA分子。
本文所用术语“单链Fv”或“scFv”或“单链”抗体指的是含有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链上。Fv多肽一般在VH和VL结构域之间还含有多肽接头，从而使sFv形成所需的能与抗原结合的结构。有关sFv的综述，参见Pluckthun，THE PHARMACOLOGY OFMONOCLONAL ANTIBODIES，vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
“小分子”的非限制性例子包括与161P2F10B结合或相互作用的化合物，配体包括激素，神经肽，趋化因子，添味剂(odorant)，磷脂，及它们的能结合、且优选能抑制161P2F10B蛋白质功能的功能等同物。所述非限制性小分子的分子量优选小于约10kDa，更优选小于约9，约8，约7，约6，约5或约4kDa。在一些实施方案中，小分子与161P2F10B蛋白在生理上相关或与之结合；天然代谢途径中不存在所述小分子；和/或相对于非水溶液而言，所述小分子更容易溶于水溶液。
本文所用术语“特异性的”指的是抗体选择性地与靶抗原表位结合。在给定的一套条件下，通过比较与适当抗原的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合来测定抗体的结合特异性。如果与不相关抗原或抗原混合物相比，抗体结合的适当抗原至少多2，5，7倍，优选为10倍，那么可认为抗体是特异性的。在一个实施方案中，特异性抗体是仅与161P2F10B抗原结合而不与不相关抗原结合的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人161P2F10B抗原，而不结合与161P2F10B抗原具有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高氨基酸同源性的非-人161P2F10B抗原的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人161P2F10B抗原，结合鼠161P2F10B抗原，但结合人抗原的程度更高的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人161P2F10B抗原，结合灵长类动物161P2F10B抗原，但结合人抗原的程度更高的抗体。在另一个实施方案中，特异性抗体是结合人161P2F10B抗原和任何非-人161P2F10B抗原，但结合人抗原或其任何组合的程度更高的抗体。
本领域技术人员易于测定杂交条件的“严紧度”，一般根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算严紧度。一般说来，较长的探针需要较高的温度维持适当退火，而较短的探针需要较低的温度。当低于其解链温度的环境中存在互补链时，杂交一般取决于变性核酸序列重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源性越高，可使用的相对温度越高。结果，较高的相对温度倾向于使反应条件更加严紧，而较低的温度会使反应条件较不严紧。有关杂交反应严紧度的其它细节和解释，可参见Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文所定义的“严紧条件”或“高严紧条件”的特征如下，但并不局限于此：(1)利用低离子强度和高温洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，42℃；或(3)利用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、经超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％ SDS和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，洗涤时用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)，42℃和50％甲酰胺，55℃，接着于55℃在含有EDTA的0.1×SSC中进行高-严紧度的洗涤。“中度严紧条件”描述于，但不限于Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989，包括使用严紧度比上述条件低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中度严紧条件的例子是：于65℃在含有1％牛血清白蛋白、0.5M磷酸钠(pH7.5)、1.25mM EDTA和7％ SDS 5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)的溶液中保温过夜，接着于50℃，用2×SSC/1％ SDS和0.2×SSC/0.1％SDS洗涤滤膜。必要时本领域技术人员懂得如何调整温度、离子强度等以顺应诸如探针长度等的因素。
HLA“超基元”是由两个或多个HLA等位基因所编码的HLA分子共有的肽结合特异性。表IV(f)列出了不同人群中HLA-超级类型的整体表型频率。多个超级类型的非限制性组分如下：
A2：A*0201，A*0202，A*0203，A*0204，A*0205，A*0206，A*6802，A*6901，A*0207
A3：A3，A11，A31，A*3301，A*6801，A*0301，A*1101，A*3101
B7：B7，B*3501-03，B*51，B*5301，B*5401，B*5501，B*5502，B*5601，B*6701，B*7801，B*0702，B*5101，B*5602
B44：B*3701，B*4402，B*4403，B*60(B*4001)，B61(B*4006)
A1：A*0102，A*2604，A*3601，A*4301，A*8001
A24：A*24，A*30，A*2403，A*2404，A*3002，A*3003
B27：B*1401-02，B*1503，B*1509，B*1510，B*1518，B*3801-02，B*3901，B*3902，B*3903-04，B*4801-02，B*7301，B*2701-08
B58：B*1516，B*1517，B*5701，B*5702，B58
B62：B*4601，B52，B*1501(B62)，B*1502(B75)，B*1513(B77)
表IV(g)列出了不同HLA-超级类型组合提供的经计算的群体覆盖范围。
本文所用的“治疗”一词和语义相关的术语指的是对任何疾病后果的任何改善，例如存活期延长、发病率降低，和/或减轻与所选择的治疗形式相伴随的副作用；本领域易于理解的是：虽然完全根除疾病不是治疗行为所必需的，但仍是优选的。
“转基因动物”(例如小鼠或大鼠)是细胞中含有转基因的动物，所述转基因被导入动物或出生前(例如胚胎阶段)动物的祖先。“转基因”是整合至细胞基因组中的DNA，由所述细胞发育成转基因动物。
本文所用的HLA或细胞免疫反应“疫苗”是含有或编码本发明的一种或多种肽的组合物。所述疫苗有多个实施方案，例如一种或多种单个肽的混合物；由多表位肽所包含的一种或多种肽；或编码所述单个肽或多肽的核酸，例如编码多表位肽的小基因。“一种或多种肽”包括从1至150种或更多种的任何整数种肽，例如至少为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145或150种或更多种本发明的肽。任选通过脂化、添加靶向或其它序列来修饰肽或多肽。本发明的I类HLA肽可与II类HLA肽混合或连接，以便于活化细胞毒T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞。HLA疫苗也可含有肽-脉冲的抗原呈递细胞，例如树状细胞。
术语“变体”指的是与所述类型或规范有差异的分子，例如在具体描述的蛋白质(如图1所示的161P2F10B蛋白)的相应位置有一个或多个不同氨基酸残基的蛋白质。类似物是一例变体蛋白质。剪接同种型和单核苷酸多态性(SNP)是另一例变体。
本发明的“161P2F10B-相关蛋白质”包括本文具体鉴定的那些蛋白质以及等位基因变体、保守取代变体、类似物和同系物，根据本文概述的方法或本领域中易于获得的方法，无需进行过度的实验即可分离/产生和鉴定出它们。还包括不同161P2F10B蛋白的部分或其片段组合而成的融合蛋白，以及161P2F10B蛋白和异源多肽的融合蛋白。将所述161P2F10B蛋白通称为161P2F10B-相关蛋白质，本发明的蛋白质或161P2F10B。术语“161P2F10B-相关蛋白质”指的是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25或25个氨基酸以上；或至少为30，35，40，45，50，55，60，65，70，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，225，250，275，300，325，330，335，339或更多个氨基酸的多肽片段或161P2F10B蛋白质序列。
II.)161P2F10B多核苷酸
一方面，本发明提供了与全部或部分161P2F10B基因、mRNA和/或编码序列(优选它们为分离形式)相对应或互补的多核苷酸，包括编码161P2F10B-相关蛋白质及其片段的多核苷酸，DNA，RNA，DNA/RNA杂合体和相关分子，与161P2F10B基因或mRNA序列或其部分互补的多核苷酸或寡核苷酸，以及能与161P2F10B基因，mRNA或编码161P2F10B的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸(通称为“161P2F10B多核苷酸”)。在本节中提到的所有情况下，图1中的T也可以是U。
161P2F10B多核苷酸的实施方案包括：具有图1所示序列的161P2F10B多核苷酸，具有图1所示的161P2F10B核苷酸序列，其中T是U的161P2F10B多核苷酸；具有图1所示多核苷酸序列的至少10个邻接核苷酸的161P2F10B多核苷酸；或具有图1所示多核苷酸序列的至少10个邻接核苷酸，其中T是U的161P2F10B多核苷酸。
编码相对较长的161P2F10B蛋白部分的多核苷酸也落入本发明的范围。例如，通过本领域众所周知的多种技术可以产生编码图1或图3所示161P2F10B蛋白或“变体”的约氨基酸1(或20或30或40等)至约氨基酸20(或30，或40或50等)的多核苷酸。这些多核苷酸片段可包括图1所示161P2F10B序列的任何部分。
II.A.)161P2F10B多核苷酸的用途
II.A.1.监测基因异常
上文所述的多核苷酸具有多种不同的具体用途。将人161P2F10B基因作图于题为“161P2F10B的染色体作图”的实施例中所示的染色体位置。例如，由于161P2F10B基因作图于该染色体，可以使用编码161P2F10B蛋白不同区域的多核苷酸来鉴定该染色体位点的细胞遗传异常，例如被鉴定为与多种癌症相关的异常。在一些基因中，包括重排的多种染色体异常被鉴定为多种不同癌症中的常见细胞遗传异常(参见例如Krajinovic et al.，Mutat.Res.382(3-4)：81-83(1998)；Johansson et al.，Blood 86(10)：3905-3914(1995)和Finger et al.，P.N.A.S.85(23)：9158-9162(1988))。因此，编码161P2F10B蛋白特定区域的多核苷酸提供了新的工具，它可用于以优于从前的准确度来描述编码161P2F10B的染色体区域中可能会导致恶性表型的细胞遗传异常。在本上下文中，这些多核苷酸能满足本领域扩展染色体筛选的敏感性，从而鉴定出更细微和较罕见的染色体异常的需求(参见例如Evans et al，Am.J.Obstet.Gynecol 171(4)：1055-1057(1994))。
另外，由于已证实161P2F10B在前列腺癌和其它癌症中高表达，可以在评价161P2F10B基因产物在正常对癌症组织中的状况的方法中使用161P2F10B多核苷酸。一般使用编码161P2F10B蛋白特定区域的多核苷酸来评价161P2F10B基因特定区域，如含有一个或多个基元的区域中微扰(如导致抗原等的丧失的缺失、插入、点突变或改变)的存在。例举的试验包括RT-PCR试验以及单链构象多态性(SSCP)分析(参见例如Marrogiet al.，J.Cutan.Pathol.26(8)：369-378(1999))，它们都利用编码蛋白质特定区域的多核苷酸来检测蛋白质内的这些区域。
II.A.2.反义实施方案
本文公开的本发明欲包括的其它具体核酸-相关实施方案是基因组DNA、cDNA、核酶和反义分子以及基于可选择主链或包括可选择碱基的核酸分子，它们可以是天然来源的或合成的，并包括能抑制161P2F10B的RNA或蛋白质表达的分子。例如，反义分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非-核酸分子，例如以依赖于碱基对的方式与DNA或RNA特异性结合的硫代磷酸酯衍生物。本领域技术人员使用本文公开的161P2F10B多核苷酸和多核苷酸序列可以容易地获得这些类别的核酸分子。
反义技术必需施用能与位于细胞内的靶多核苷酸结合的外源性寡核苷酸。术语“反义”指的是寡核苷酸与其细胞内的靶，如161P2F10B互补这一事实。参见例如Jack Cohen，Oligodeoxynucleotides，Antisense Inhibitors ofGene Expression，CRC Press，1989；and Synthesis 1：1-5(1988)。本发明的161P2F10B反义寡核苷酸包括表现出增强的癌症细胞生长抑制作用的衍生物，如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-oligo，参见Jack Cohen，文献同上)。S-oligo(核苷硫代磷酸酯)是寡核苷酸(O-oligo)的等电类似物，其中磷酸基团的非桥连氧原子被硫原子取代。通过用硫转运试剂3H-1，2-苯并二硫代-3-酮-1，1-二氧化物处理相应的O-oligo，即可制备本发明的S-oligo。参见例如Iyer，R.P.et al.，J.Org.Chem.55：4693-4698(1990)；and Iyer，R.P.et al.，J.Am.Chem.Soc.112：1253-1254(1990)。本发明的其它161P2F10B反义寡核苷酸包括本领域已知的吗啉代反义寡核苷酸(参见例如Partridge et al.，1996，Anbsense &Nucleic Acid Drug Development 6：169-175)。
本发明的161P2F10B反义寡核苷酸一般可以是与161P2F10B基因组序列的前100个5，密码子或后100个3’密码子或相应的mRNA互补和稳定杂交的RNA或DNA。不需要绝对互补，但优选高水平的互补。使用与该区域互补的寡核苷酸能选择性地与161P2F10B mRNA杂交，而不与蛋白质激酶的其它调节亚单位所特有的mRNA杂交。在一个实施方案中，本发明的161P2F10B反义寡核苷酸是具有与161P2F10B mRNA杂交之序列的反义DNA分子的15至30-聚体片段。任选161P2F10B反义寡核苷酸是与161P2F10B的前10个5’密码子或后10个3’密码子中的区域互补的30-聚体寡核苷酸。或者，对反义分子进行修饰以利用核酶来抑制161P2F10B的表达，参见例如L.A.Couture & D.T.Stinchcomb；Trends Genet 12：510-515(1996)。
II.A.3.引物和引物对
本发明的这些核苷酸的其它具体实施方案包括引物和引物对，它们可以特异性地扩增本发明的多核苷酸或其任何特定部分，还包括探针，它们可以与本发明的核酸分子或其任何部分选择性地或特异性地杂交。可以用可测标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶标记探针。所述探针和引物可用于检测样品中161P2F10B多核苷酸的存在，并可用作检测表达161P2F10B蛋白之细胞的工具。
所述探针的例子包括含有图1所示的全部或部分人161P2F10B cDNA序列的多核苷酸。实施例中还描述了能特异性扩增161P2F10B mRNA的引物对的例子。本领域技术人员懂得基于本文提供的序列可以制备很多种不同的引物和探针，并将它们有效地用于扩增和/或检测161P2F10B mRNA。
本发明的161P2F10B多核苷酸可用于多种目的，包括但不限于用作探针和引物以扩增和/或检测161P2F10B基因、mRNA或其片段；用作试剂以诊断和/或预测前列腺癌和其它癌症；用作能介导161P2F10B多肽表达的编码序列；用作调制或抑制161P2F10B基因表达和/或161P2F10B转录物翻译的工具；和用作治疗剂。
本发明包括使用本文所述的任何探针从天然来源，如人或其它哺乳动物中鉴定和分离出161P2F10B或161P2F10B相关核酸序列，本发明还包括分离的核酸序列本身，所述序列可含有所用探针的全部或大多数序列。
II.A.4.分离编码161P2F10B的核酸分子
本文所述的161P2F10B cDNA能分离其它编码161P2F10B基因产物的多核苷酸，以及分离编码161P2F10B基因产物同系物，或者161P2F10B基因产物的剪接同种型、等位基因变体和突变体形式的多核苷酸，以及分离编码161P2F10B-相关蛋白质的类似物的多核苷酸。用于分离编码161P2F10B基因的全长cDNA的多种分子克隆方法是众所周知的(参见例如Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor Press，New York，1989；Current Protocols in Molecular Biology.Ausubel et al.，Eds.，Wiley and Sons，1995)。例如，可以方便地使用可使用商购克隆系统(如Lambda ZAP Express，Stratagene)的λ噬菌体克隆方法学。通过用经标记的161P2F10B cDNA或其片段进行探测，即可鉴定出含有161P2F10B基因cDNA的噬菌体克隆。例如，在一个实施方案中，可以合成161P2F10B cDNA(如图1)或其部分，并将它们用作探针以获取对应于161P2F10B基因的重叠和全长cDNA。通过用161P2F10B DNA探针或引物筛选基因组DNA文库，细菌人工染色体文库(BAC)，酵母人工染色体文库(YAC)等，即可分离出161P2F10B基因本身。
II.A.5.重组核酸分子和宿主-载体系统
本发明还提供了含有161P2F10B多核苷酸，其片段、类似物或同系物的重组DNA或RNA分子，包括但不限于噬菌体、质粒、噬粒、粘粒、YAC、BAC以及多种本领域众所周知的病毒和非-病毒载体，本发明还提供了被所述重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。产生所述分子的方法是众所周知的(参见例如Sambrook et al，1989，文献同上)。
本发明还提供了在适当的原核或真核宿主细胞内含有重组DNA分子的宿主-载体系统，所述重组DNA分子含有161P2F10B多核苷酸、其片段、类似物或同系物。适当真核宿主细胞的例子包括酵母细胞、植物细胞、或动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞(如可被杆状病毒感染的细胞，如Sf9或HighFive细胞)。适当哺乳动物细胞的例子包括多种前列腺癌细胞系，如DU145和TsuPrl，其它可转染或转导的前列腺癌细胞系，原代细胞(PrEC)，以及多种常规用于表达重组蛋白质的哺乳动物细胞(如COS、CHO、293、293T细胞)。更具体地，可以使用本领域常规使用和公知的任何一种宿主-载体系统，使用含有161P2F10B编码序列或其片段、类似物或同系物的多核苷酸产生161P2F10B蛋白或其片段。
适于表达161P2F10B蛋白或其片段的多种宿主-载体系统是可以获得的(参见例如Sambrook et al，1989，文献同上；Current Protocols in MolecularBiology，1995，文献同上)。用于哺乳动物表达的优选载体包括但不限于pcDNA 3.1 myc-His-tag(Invitrogen)和逆转录病毒载体pSRαtkneo(Muller etal.，1991，MCB 11：1785)。使用这些表达载体，可以在包括例如293，293T，rat-1，NIH 3T3和TsuPrl的几种前列腺癌和非-前列腺细胞系中表达161P2F10B。本发明的宿主-载体系统可用于产生161P2F10B蛋白或其片段。可以使用所述宿主-载体系统研究161P2F10B和161P2F10B突变或类似物的功能特性。
通过被编码161P2F10B-相关核苷酸的构建体转染的哺乳动物细胞，可以产生重组人161P2F10B蛋白或其类似物或同系物或片段。例如，用编码161P2F10B或其片段、类似物或同系物的表达质粒转染293T细胞，在293T细胞中表达161P2F10B-相关蛋白质，使用标准的纯化方法(例如使用抗-161P2F10B抗体进行亲和纯化)分离重组161P2F10B蛋白。在另一个实施方案中，将161P2F10B编码序列亚克隆至逆转录病毒载体pSRαMSVtkneo，并用于感染多种哺乳动物细胞系，如NIH3T3，TsuPrl，293和rat-1，从而建立表达161P2F10B的细胞系。也可以使用本领域众所周知的多种其它表达系统。编码与161P2F10B编码序列框内连接的前导肽的表达构建体可用于产生分泌形式的重组161P2F10B蛋白。
如本文所讨论的，遗传密码的丰余性允许161P2F10B基因序列中出现变异。特别地，本领域已知特定的宿主种类经常具有特殊的密码子偏好，因此可以将公开的序列修改为所需宿主偏好的序列。例如，优选的类似物密码子序列一般以使用频率较高的密码子替代罕见密码子(即在所需宿主的已知序列中使用频率低于约20％的密码子)。例如，利用可得自互联网，如URLdna.affrc.go.jp/-nakamura/codon.html上的密码子使用表，计算出特定物种的密码子偏好。
已知其它序列修饰可增强细胞宿主中的蛋白质表达。所述修饰包括除去编码错误聚腺苷酸化信号、外显子/内含子剪接位点信号、转座子-样重复的序列和/或其它为人们所熟知的对基因表达有害的序列。参照宿主细胞中表达的已知基因进行计算，将序列的GC含量调整为给定细胞宿主的平均水平。可能的话，对序列进行修饰以避免推测的发夹二级mRNA结构。其它有用的修饰包括如Kozak，Mol.Cell Biol.，9：5073-5080(1989)所述，在开放阅读框的起点处添加翻译起始共有序列。本领域技术人员懂得真核生物核糖体仅在邻近5’的AUG密码子处起始翻译这一一般性原则仅在罕见的条件下被废除(参见例如Kozak PNAS 92(7)：2662-2666，(1995)and Kozak NAR 15(20)：8125-8148(1987))。
III.)161P2F10B-相关蛋白质
本发明的另一方面提供了161P2F10B-相关蛋白质。161P2F10B蛋白的具体实施方案包括具有图1，优选图1A所示人161P2F10B的全部或部分氨基酸序列的多肽。或者，161P2F10B蛋白的实施方案包括在图1所示161P2F10B氨基酸序列中具有改变的变体、同系物或类似物多肽。
161P2F10B多肽的实施方案包括：具有图1所示序列的161P2F10B多肽；由图1所示，其中T是U的161P2F10B多核苷酸序列编码的肽；编码具有图1所示序列的多肽的至少10个邻接核苷酸；或由图1所示，其中T是U的多核苷酸序列编码的至少10个邻接肽。
表II中提供了氨基酸缩写。可以在蛋白质中进行频繁的保守氨基酸取代而不会改变蛋白质的构象或功能。本发明的蛋白质可含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15个保守的取代。
本文公开的本发明的实施方案包括多种为本领域所接受的161P2F10B蛋白变体或类似物，例如具有氨基酸插入、缺失和取代的多肽。使用本领域已知的方法，如定点诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变即可制备161P2F10B变体。可以对克隆的DNA进行定点诱变(Carter et al.，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987))、盒诱变(Wells et al.，Gene，34：315(1985))、限制性选择诱变(Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))或其它已知的技术以产生161P2F10B变体DNA。
也可使用扫描氨基酸分析来鉴定沿着与特定生物活性，如蛋白质-蛋白质相互作用有关的邻接序列的一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的、中性的氨基酸。所述氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。其中优选丙氨酸作为扫描氨基酸，因为它消除了β碳上的侧链，不太可能改变变体的主链构象。优选丙氨酸的另一个原因是它是最常见的氨基酸。另外，经常在被掩盖和暴露的位置发现丙氨酸(Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976))。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用同配氨基酸。
本文所定义的161P2F10B变体、类似物或同系物具有区别性特征，它们具有至少一个能与161P2F10B蛋白“交叉反应”的表位，所述161P2F10B蛋白具有图1的氨基酸序列。所述“交叉反应”指的是与161P2F10B变体特异性结合的抗体或T细胞也能与具有图1所示氨基酸序列的161P2F10B蛋白特异性结合。当多肽不再含有任何能被与原始161P2F10B蛋白特异性结合的抗体或T细胞所识别的表位时，该多肽不再是图1所示蛋白质的变体。本领域技术人员懂得识别蛋白质的抗体与不同大小的表位结合，级别约为4或5个氨基酸的一组邻接或不邻接氨基酸被认为是最小表位的典型氨基酸数目。参见例如Nair et al.，J.Immunol.2000，165(12)：6949-6955；Hebbes et al.，MolImmunol(1989)26(9)：865-73；Schwartz et al.，J Immunol(1985)135(4)：2598-608。
其它类161P2F10B-相关蛋白质变体与图1的氨基酸序列或其片段共享70％，75％，80％，85％或90％，95％或更高的相似性。另一特殊类别的161P2F10B蛋白变体或类似物含有一种或多种本文所述或本领域已知的161P2F10B生物基元。因此，本发明包括相对于原始片段而言具有经改变的功能(如免疫原性)特性的161P2F10B片段类似物(核酸或氨基酸)。应懂得本文所述或本领域已知的基元适用于图1的核酸或氨基酸序列。
如本文所讨论的，本发明的实施方案包括多肽，其含有图1所示161P2F10B蛋白全长氨基酸序列的部分序列。例如，本发明的代表性实施方案包括具有图1所示161P2F10B蛋白的任意4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多个邻接氨基酸的肽/蛋白质。
使用标准的肽合成技术或使用本领域众所周知的化学裂解法可以产生161P2F10B-相关蛋白质。或者，可以使用重组法产生编码161P2F10B-相关蛋白质的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子提供了产生161P2F10B蛋白(或其变体、同系物或类似物)的限定片段的工具。
III.A.)携有基元的蛋白质的实施方案
本文公开的本发明的其它说明性实施方案包括161P2F10B多肽，其含有图1所示161P2F10B多肽序列内所含一种或多种生物基元的氨基酸残基。多种基元是本领域已知的，通过多个公知的互联网站点，如BIMAS可以评价蛋白质中是否存在所述基元。
所有161P2F10B变体蛋白质的携有基元的亚序列都已被公开。
表IV(h)列出了几种基于pfam检索(参见URL网址pfam.wustl.edu/)的常见基元。表IV(h)中的各栏列出了(1)基元名称的缩写，(2)在基元家族不同成员中发现的同一性百分比，(3)基元名称或描述和(4)最常见的功能；如果基元与位置相关，还包括位置信息。
上文所讨论的161P2F10B基元与生长异常调节有关，而且161P2F10B在一些癌症中过表达(参见例如表I)，鉴于此观察结果，可以使用含有上文所讨论的一种或多种161P2F10B基元的多肽来阐明恶性表型的特殊特征。例如，已知酪蛋白激酶II，cAMP和camp依赖型蛋白质激酶以及蛋白质激酶C是与恶性表型发展有关的酶(参见例如Chen et al.，Lab Invest.，78(2)：165-174(1998)；Gaiddon et al.，Endocrinology 136(10)：4331-4338(1995)；Hall et al.，Nucleic Acids Research 24(6)：1119-1126(1996)；Peterziel et al.，Oncogene18(46)：6322-6329(1999)and O′Brian，Oncol.Rep.5(2)：305-309(1998))。另外，糖基化和十四酰化也是与癌症和癌症进展有关的蛋白质修饰(参见例如Dennis et al.，Biochem.Biophys.Acta 1473(1)：21-34(1999)；Raju et al.，Exp.Cell Res.235(1)：145-154(1997))。酰胺化是另一种与癌症和癌症进展有关的蛋白质修饰(参见例如Treston et al.，J.Nab.CancerInst.Monogr.(13)：169-175(1992))。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白质含有一种或多种根据为本领域所接受的方法鉴定的免疫活性表位，如以前所公开的肽。使用特殊的算法可确定CTL表位，从而鉴定出161P2F10B蛋白内能最佳地与特定HLA等位基因结合的肽(例如表IV；EpimatrixTM and EpimerTM，Brown University，andBIMAS)。另外，鉴定与HLA分子有足够结合亲和性并且与成为免疫原性表位有关的肽的方法是本领域众所周知的，无需经过过度的实验即可实施。另外，鉴定可用作免疫原性表位的肽的方法是本领域众所周知的，无需经过过度的实验即可在体外或体内实施该方法。
另外，本领域已知为了调制免疫原性而产生所述表位的类似物的原理。例如，可以以携有CTL或HTL基元(参见例如表IV的HLA I类和HLA II类基元/超基元)的表位开始。通过换下一个特定位置处的氨基酸，用该位置特有的另一个氨基酸取代之，即可制备类似表位。例如，以表IV定义的残基为基础，用任何其它残基，如优选的残基取代有害的残基；用优选的残基取代较不优选的残基；或用另一个优选的残基取代原来出现的优选残基。取代可发生在肽中的一级锚位置或其它位置；参见例如表IV。
多篇参考文献反映了有关鉴定和产生所需蛋白质及其类似物中的表位的技术。参见例如Chesnut et al.的WO97/33602；Sette，Immunogenetics 199950(3-4)：201-212；Sette et al.，J.Immunol.2001 166(2)：1389-1397；Sidney et al.，Hum.Immunol.1997 58(1)：12-20；Kondo et al，Immunogenetics 1997 45(4)：249-258；Sidney et al.，J.Immunol.1996 157(8)：3480-90；and Falk et al.，Nature351：290-6(1991)；Hunt et al，Science 255：1261-3(1992)；Parker et al.，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker et al.，J.Immunol.152：163-75(1994)；Kastet al，1994 152(8)：3904-12；Borras-Cuesta et al.，Hum.Immunol.200061(3)：266-278；Alexander et al.，J.Immunol.2000 164(3)：1625-1633；Alexanderet al.，PMID：7895164，UI：95202582；O′Sullivan et al.，J.Immunol.1991147(8)：2663-2669；Alexander et al.，Immunity 1994 1(9)：751-761 and Alexanderet al.，Immunol.Res.1998 18(2)：79-92。
本发明的相关实施方案包括含有表IV(a)，IV(b)，IV(c)，IV(d)和IV(h)所示的不同基元，和/或以前公开的一种或多种推测CTL表位，和/或本领域已知的一种或多种T细胞结合基元的组合的多肽。优选实施方案在基元内或多肽的间插序列内都不含插入、缺失或取代。另外，在这些基元的任一侧包括多个N-末端和/或C-末端氨基酸残基的实施方案是合乎需要的(例如，包括多肽结构的较大部分，其中包含有基元)。通常，位于基元任一侧的N-末端和/或C-末端氨基酸残基的数目约为1至100个氨基酸残基，优选为5至约50个氨基酸残基。
本发明包括多种形式(优选为分离形式)的161P2F10B-相关蛋白质。纯化的161P2F10B蛋白分子基本上不含其它有损于161P2F10B与抗体、T细胞或其它配体的结合的蛋白质或分子。分离和纯化的性质和水平取决于欲实现的用途。161P2F10B-相关蛋白质的实施方案包括纯化的161P2F10B-相关蛋白质和功能性的、可溶的161P2F10B-相关蛋白质。在一个实施方案中，功能性的、可溶的161P2F10B蛋白或其片段保留了与抗体、T细胞或其它配体结合的能力。
本发明还提供了含有图1所示161P2F10B氨基酸序列的生物活性片段的161P2F10B蛋白。所述蛋白质表现出原始161P2F10B蛋白的特性，例如引发产生能特异性结合原始161P2F10B蛋白相关表位的能力；能被抗体结合；能导致HTL或CTL激活；和/或被也能与原始蛋白质特异性结合的HTL或CTL识别。
使用多种本领域众所周知的分析技术，包括例如Chou-Fasman，Gamier-Robson，Kyte-Doolittle，Eisenberg，Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析法，或基于免疫原性，即可推测和/或鉴定出含有特别令人感兴趣之结构的161P2F10B-相关多肽。含有所述结构的片段可特别地用于产生亚单位-特异性抗-161P2F10B抗体或T细胞，或用于鉴定与161P2F10B结合的细胞因子。例如，使用Hopp，T.P.and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法，可以产生亲水性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Kyte，J.and Doolittle，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132的方法，可以产生亲/疏水性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Janin J.，1979，Nature 277：491-492的方法，可以产生可及残基百分比(％)分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.，1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法，可以产生平均柔性分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。使用Deleage，G.，Roux B.，1987，Protein Engineering 1：289-294的方法，可以产生β-转角分布图并鉴定出免疫原性的肽片段。
使用特殊的算法可确定CTL表位，从而鉴定出161P2F10B蛋白内能最佳地与特定HLA等位基因结合的肽(例如通过使用SYFPEITHI和BIMAS)。阐明了这些表位，即可推测出人MHC I类分子，如HLA-A1，A2，A3，A11，A24，B7和B35环境中呈递的161P2F10B肽表位。具体地说，将161P2F10B蛋白的完整氨基酸序列和其它变体的相关部分(即对HLA I类分子而言，推测在点突变的任一侧或在外显子的连接处有9个侧翼残基，对HLA II类分子而言，推测在点突变的任一侧或在对应于该变体的外显子连接处有14个侧翼残基)输入Bioinformatics and Molecular Analysis Section站点中的HLA肽基元检索算法中。
Ken Parker博士根据HLA I类分子，特别是HLA-A2的沟中特定肽序列的结合研究出HLA肽基元检索算法(参见例如Falk et al.，Nature351：290-6(1991)；Hunt et al.，Science 255：1261-3(1992)；Parker et al，J.Immunol.149：3580-7(1992)；Parker et al.，J.Immunol.152：163-75(1994))。该算法能够定位得自完整蛋白质序列的8-聚体、9-聚体和10-聚体肽，并将它们与HLA-A2以及多种其它HLA I类分子推测的结合按级别排列。很多种HLA I类结合肽是8-、9-、10或11-聚体。例如，对I类HLA-A2而言，表位优选在第2位含有亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)，并在C-末端含有缬氨酸(V)或亮氨酸(L)(参见例如Parker et al.，J.Immunol.149：3580-7(1992))。161P2F10B推测结合肽的选定结果已被显示。结合评分相当于37℃，pH6.5时所估计的含肽复合物解离所需时间的一半。推测具有最高结合评分的肽与细胞表面HLA I类分子的结合最紧密，结合的时间也最长，因此是T-细胞识别的最佳免疫原性靶。
通过使抗原-加工有缺陷的细胞系T2上的HLA表达稳定化，即可评价肽与HLA等位基因的实际结合情况(参见例如Xue et al.，Prostate 30：73-8(1997)and Peshwa et al.，Prostate 36：129-38(1998))。通过在抗原呈递细胞，如树状细胞的存在下刺激CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)，可以在体外评价特定肽的免疫原性。
应懂得通过BIMAS位点、EimerTM和EpimatrixTM位点推测，或通过本领域已知或已成为本领域的一部分的HLAI类或II类基元，如表IV中所示的基元特化的每一种表位都“适用于”本发明的161P2F10B蛋白。本文所用的“适用于”指的是凭视觉或通过基于计算机的模式发现法来评价161P2F10B蛋白，这些技术是本领域技术人员可以掌握的。每一种携有HLA I类基元、长度为8，9，10或11个氨基酸残基的161P2F10B蛋白亚序列，或携有HLA II类基元、长度为9或更多个氨基酸残基的亚序列也落入本发明的范围。
III.B.)表达161P2F10B-相关蛋白质
在下文实施例描述的实施方案中，可以方便地在被可商购的表达载体转染的细胞(如293T细胞)中表达161P2F10B，所述表达载体如编码161P2F10B、具有C-末端6×His和MYC标记的CMV-驱动表达载体(pcDNA3.1/mycHIS，Invitrogen或Tag5，GenHunter Corporation，NashvilleTN)。Tag5载体提供了IgGκ分泌信号，该信号有利于在转染细胞中产生分泌的161P2F10B蛋白。例如，按照标准技术使用镍柱，可以从培养基中纯化出分泌的HIS-标记的161P2F10B。
III.C.)修饰161P2F10B-相关蛋白质
161P2F10B-相关蛋白质的修饰，如共价修饰包括在本发明的范围之内。一种类型的共价修饰包括使161P2F10B多肽的目的氨基酸残基与有机衍生试剂反应，所述试剂能与161P2F10B蛋白的选定侧链或N-或C-末端残基反应。本发明范围所包含的另一种161P2F10B多肽共价修饰包括改变本发明蛋白质的天然糖基化模式。另一种161P2F10B共价修饰包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式，将161P2F10B多肽与多种非蛋白质类聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种连接。
也可以修饰本发明的161P2F10B-相关蛋白质以形成含有与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的161P2F10B的嵌合分子。可以通过化学或重组的方法合成所述嵌合分子。嵌合分子可具有与另一种肿瘤-相关抗原或其片段融合的本发明的蛋白质。或者，本发明的蛋白质可含有161P2F10B序列(氨基酸或核酸)片段的融合物，以产生在其整个长度上不与图1所示氨基酸或核酸序列直接同源的分子。所述嵌合分子可含有多个相同的161P2F10B亚序列。嵌合分子可含有161P2F10B-相关蛋白质与多聚组氨酸表位标记的融合物，所述融合物可提供表位与固定化的镍选择性结合，嵌合分子还可含有161P2F10B-相关蛋白质与细胞因子或生长因子的融合物。表位标记一般位于161P2F10B蛋白的氨基或羧基末端。在另一个实施方案中，嵌合分子可含有161P2F10B-相关蛋白质与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)而言，所述融合物可以是与IgG分子Fc区域的融合物。Ig融合物优选包括用可溶(跨膜结构域缺失或失活)形式的161P2F10B多肽取代Ig分子内的至少一个可变区。在优选实施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的绞链区，CH2和CH3，或绞链区，CH1、CH2和CH3区。关于产生免疫球蛋白融合物，可参见例如1995年6月27日颁布的美国专利5,428,130。
III.D.)161P2F10B-相关蛋白质的用途
本发明的蛋白质具有多种不同的具体用途。由于161P2F10B在前列腺癌和其它癌症中高表达，可以在评价正常对癌症组织中161P2F10B基因产物状况的方法中使用161P2F10B-相关蛋白质，从而阐明恶性表型。一般使用得自161P2F10B蛋白特定区域的多肽评价区域(如含有一种或多种基元的区域)中微扰(如缺失、插入、点突变等)的存在。例举的试验利用靶向161P2F10B-相关蛋白质的抗体或T细胞，以评价正常对癌症组织中该区域的特征或引发针对表位的免疫应答，所述蛋白质含有161P2F10B多肽序列所含一种或多种生物基元的氨基酸残基。或者，使用161P2F10B-相关蛋白质来筛选与161P2F10B的该区域相互作用的因子，所述蛋白质含有161P2F10B蛋白的一种或多种生物基元的氨基酸残基。
161P2F10B蛋白的片段/亚序列可特别地用于产生和鉴定结构域-特异性抗体(例如识别161P2F10B蛋白的胞外或胞内表位的抗体)，用于鉴定与161P2F10B或其特殊结构域结合的试剂或细胞因子，和用于多种治疗和诊断目的，包括但不限于诊断试验、癌症疫苗和制备所述疫苗的方法。
由161P2F10B基因或其类似物、同系物或片段编码的蛋白质具有多种用途，包括但不限于产生抗体和用于鉴定与161P2F10B基因产物结合的配体和其它试剂和细胞组分的方法中。针对161P2F10B蛋白或其片段产生的抗体可用于诊断和预测试验，以及用于处理特征在于表达161P2F10B蛋白的人类癌症(如表I所列的癌症)的显象方法学。所述抗体可在细胞内表达并用于治疗所述癌症之患者的方法中。也可使用161P2F10B-相关核酸或蛋白质来产生HTL或CTL反应。
可以使用多种可用于检测161P2F10B蛋白的免疫学试验，包括但不限于多种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫荧光试验(ELIFA)、免疫细胞化学方法等。可以标记抗体，并将其用作能检测表达161P2F10B之细胞的免疫显象试剂(例如用于放射闪烁照相显象法)。如本文进一步地描述，161P2F10B蛋白也可特别地用于产生癌症疫苗。
IV.)161P2F10B抗体
另一方面，本发明提供了与161P2F10B-相关蛋白质结合的抗体。在生理条件下，优选的抗体特异性结合161P2F10B-相关蛋白质，但并不结合(或微弱地结合)不是161P2F10B-相关蛋白质的肽或蛋白质。在本文中，生理条件的例子包括：1)磷酸缓冲盐水；2)含有25mM Tris和150mM NaCl的Tris-缓冲盐水；或3)普通盐水(0.9％ NaCl)；4)动物血清，如人血清；或5)1)至4)的任意组合；优选这些反应在pH7.5时发生，或者在pH7.0至8.0的范围内发生，或者在pH6.5至8.5的范围内发生；这些反应在4℃至37℃的温度下发生。例如，与161P2F10B结合的抗体可以结合161P2F10B-相关蛋白质，例如其同系物或类似物。
本发明的161P2F10B抗体可特别地用于癌症(参见例如表I)诊断和预测试验和显象方法学。类似地，所述抗体可用于治疗、诊断和/或预测前列腺癌和其它也能表达或过表达161P2F10B的癌症。另外，细胞内表达的抗体(如单链抗体)能用于治疗与161P2F10B表达有关的癌症，如晚期或转移前列腺癌或其它晚期或转移癌症。
本发明还提供了多种可用于检测和定量161P2F10B和突变的161P2F10B-相关蛋白质的免疫学试验。适当时，所述试验包括一种或多种能识别和结合161P2F10B-相关蛋白质的161P2F10B抗体。这些试验在本领域众所周知的多种免疫学试验，包括但不限于多种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫荧光试验(ELIFA)等中进行。
本发明的免疫学非-抗体试验还包括T细胞免疫原性试验(抑制或刺激)以及主要组织相容性复合物(MHC)结合试验。
另外，本发明还提供了能检测肾癌和其它能表达161P2F10B的癌症的免疫显象方法，包括但不限于使用经标记161P2F10B抗体的放射闪烁照相显象法。所述试验在临床上可用于检测、监测和预测表达161P2F10B的癌症，如肾癌。
161P2F10B抗体也可用于纯化161P2F10B-相关蛋白质和分离161P2F10B同系物和相关分子的方法中。例如，纯化161P2F10B-相关蛋白质的方法包括：在允许161P2F10B抗体与161P2F10B-相关蛋白质结合的条件下，将已与固体基质偶联的161P2F10B抗体与含有161P2F10B-相关蛋白质的裂解液或其它溶液一起保温；洗涤固体基质以清除杂质；从偶联的抗体上洗脱161P2F10B-相关蛋白质。本发明的161P2F10B抗体的其它用途包括产生模拟161P2F10B蛋白的抗-独特型抗体。
多种制备抗体的方法是本领域众所周知的。例如，通过用分离或免疫偶联形式的161P2F10B-相关蛋白质、肽或片段免疫适当的哺乳动物宿主，即可制备抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press，Eds.，Harlow，andLane(1988)；Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))。另外，也可使用161P2F10B的融合蛋白，如161P2F10B GST-融合蛋白。在具体的实施方案中，先产生含有图1的全部或大部分氨基酸序列的GST融合蛋白，再将其用作免疫原以产生适当的抗体。在另一个实施方案中，合成161P2F10B-相关蛋白质并将其用作免疫原。
另外，使用本领域已知的裸DNA免疫技术(含或不含纯化的161P2F10B-相关蛋白质或表达161P2F10B的细胞)以产生针对编码的免疫原的免疫应答(有关评述可参见Donnelly et al.，1997，Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可以分析图1所示的161P2F10B蛋白氨基酸序列，以选择出161P2F10B蛋白的特定区域用于产生抗体。例如，使用161P2F10B氨基酸序列的疏水性和亲水性分析，以鉴定出161P2F10B结构中的亲水性区域。使用本领域已知的多种其它方法，可以容易地鉴定出显示出免疫原结构的161P2F10B蛋白区域以及其它区域和结构域，所述方法如Chou-Fasman，Gamier-Robson，Kyte-Doolittle，Eisenberg，Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析。使用Hopp，T.P.and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法，可以产生亲水性分布图。使用Kyte，J.and Doolittle，R.F.，1982，J.Mol.Biol.157：105-132的方法，可以产生亲/疏水性分布图。使用Janin J.，1979，Nature277：491-492的方法，可以产生可及残基百分比(％)分布图。使用Bhaskaran R.，Ponnuswamy P.K.，1988，Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法，可以产生平均柔性分布图。使用Deleage，G.，Roux B.，1987，Protein Engineering1：289-294的方法，可以产生β-转角分布图。因此，由这些程序或方法中的任一种鉴定出的每个区域都落入本发明的范围内。本文提供的实施例将进一步阐明产生161P2F10B抗体的优选方法。制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域众所周知的。制备蛋白质与载体，如BSA、KLH或其它载体蛋白质的免疫原性偶联物的方法也是本领域众所周知的。在一些情况下，使用例如碳二亚胺试剂进行直接偶联；在其它情况下，诸如Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL提供的连接试剂是有效的。经常通过在适当长的时间内注射并使用适当的佐剂来施用161P2F10B免疫原，这一点是本领域技术人员可以理解的。在免疫程序中，可以检测抗体滴度以测定是否形成了足够量的抗体。
通过多种本领域众所周知的方法可以产生161P2F10B单克隆抗体。例如，使用Kohler和Milstein的标准杂交瘤技术或公知的无限增殖化产生抗体的B细胞的修饰技术，制备能分泌所需单克隆抗体的无限增殖细胞系。通过抗原为161P2F10B-相关蛋白质的免疫测定筛选出能分泌所需抗体的无限增殖细胞系。当鉴定出适当的无限增殖细胞培养物时，可以扩充细胞，并从体外培养物或腹水中产生抗体。
也可以通过重组方法产生本发明的抗体或片段。也可以在多种来源的嵌合或互补决定区(CDR)移植抗体中产生与161P2F10B蛋白的所需区域特异性结合的区域。也可以产生人源化或人161P2F10B抗体，并优选将它们用于治疗目的。通过用一个或多个非人抗体CDR取代相应的人抗体序列，从而使鼠和其它非人抗体人源化的方法是众所周知的(参见例如Jones et al，1986，Nature 321：522-525；Riechmann et al.，1988，Nature 332：323-327；Verhoeyen et al.，1988，Science 239：1534-1536)。也参见Carter et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285和Sims et al.，1993，J.Immunol.151：2296。
产生完整人单克隆抗体的方法包括噬菌体展示和转基因法(有关评述可参见Vaughan et al.，1998，Nature Biotechnology 16：535-539)。使用利用了大型人Ig基因组合文库(即噬菌体展示)的克隆技术，可以产生完整的人161P2F10B单克隆抗体(Griffiths and Hoogenboom，Building an in vitroimmune system：human antibodies from phage display libraries.In：ProteinEngineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man，Clark，M.(Ed.)，Nottingham Academic，pp 45-64(1993)；Burton and Barbas，Human Antibodies from combinatorial libraries.Id.，pp65-82)。按照1997年12月3日公开的Kucherlapati和Jakobovits等的PCT专利申请WO98/24893所述，使用经基因工程改造后含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠也可以制备完整的人161P2F10B单克隆抗体(也可参见Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4)：607-614；2000年12月19日颁布的美国专利6,162,963；2000年11月12日颁布的6,150,584；和2000年9月5日颁布的6,114,598)。该方法避免了噬菌体展示技术所需的体外操作，并能有效产生高亲和性的真正的人抗体。
适当时，使用161P2F10B-相关蛋白质、表达161P2F10B的细胞或其提取物，通过多种众所周知的方法，包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析确定161P2F10B抗体与161P2F10B-相关蛋白质的反应性。161P2F10B抗体或其片段可被可测标记标记或与第二种分子偶联。适当的可测标记包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。另外，使用本领域公知的方法产生特异于两个或多个161P2F10B表位的双-特异性抗体。通过本领域已知的交联技术也可以产生同二聚体抗体(例如Wolff et al.，Cancer Res.53：2560-2565)。
在一个实施方案中，本发明提供了被鉴定为Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(1)11，H16-1.93，H16-9.69的单克隆抗体，这些单克隆抗体已于2006年3月28日(经由联邦快递)被送到美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，指定的保藏号分别为PTA-7452和PTA-7450和PTA-7449和PTA-7451。
V.)161P2F10B细胞免疫反应
T细胞识别抗原的机理已被描述。本发明的有效肽表位疫苗组合物能在世界种群范围内的很多种族中诱导治疗或预防性的免疫反应。为了理解本发明的组合物诱导细胞免疫反应的数值和效力，本文提供了与免疫学相关的技术的简单评述。
将HLA分子和肽抗原的复合物用作被HLA-受限的T细胞识别的配体(Buus，S.et al.，Cell 47：1071，1986；Babbitt，B.P.et al，Nature 317：359，1985；Townsend，A.and Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7：601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11：403，1993)。通过研究单个氨基酸被取代的抗原类似物并测序内源性结合、天然加工的肽，鉴定出对应于特异性结合HLA抗原分子所需基元的关键残基，并示于表IV(参见例如Southwood，et al，J.Immunol.160：3363，1998；Rammensee，et al，Immunogenetics 41：178，1995；Rammensee et al，SYFPEITHI，access via World Wide Web at URL(134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)；Sette，A.and Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10：478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.6：13，1994；Sette，A.and Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.4：79，1992；Sinigaglia，F.andHammer，J.Curr.Biol.6：52，1994；Ruppert et al.，Cell 74：929-937，1993；Kondoet al.，J.Immunol.155：4307-4312，1995；Sidney et al.，J.Immunol.157：3480-3490，1996；Sidney et al.，Human Immunol 45：79-93，1996；Sette，A.and Sidney，J.Immunogenetics 1999 Nov，50(3-4)：201-12，Review)。
另外，对HLA-肽复合物的X-射线晶体学分析揭示出HLA分子的肽结合裂缝/沟内的袋，它以等位基因-特异性的方式容纳肽配体携有的残基，这些残基反过来决定了含有这些残基的肽的HLA结合能力(参见例如Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13：587，1995；Smith，et al.，Immunity 4：203，1996；Fremont et al，Immunity 8：305，1998；Stern et al，Structure 2：245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol 9：75，1997；Brown，J.H.et al.，Nature 364：33，1993；Guo，H.C.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8053，1993；Guo，H.C.et al，Nature360：364，1992；Silver，M.L.et al.，Nature 360：367，1992；Matsumura，M.et al，Science 257：927，1992；Madden et al，Cell 70：1035，1992；Fremont，D.H.et al，Science 257：919，1992；Saper，M.A.，Bjorkman，P.J.and Wiley，D.C.，J.Mol.Biol.219：277，1991.)。
因此，I类和II类等位基因-特异性HLA结合基元或I类或II类超基元的定义能够鉴定出蛋白质内与结合特定HLA抗原有关的区域。
因此，通过鉴定HLA基元的过程，已鉴定出基于表位的候选疫苗；通过HLA-肽结合试验可进一步评价候选疫苗，以测定表位及其相应HLA分子的结合亲和性和/或结合时间。可进行其它的确证工作，从而在这些候选疫苗中选择出在种群覆盖和/或免疫原性方面具有优选特性的表位。
可利用多种策略评价细胞免疫原性，包括：
1)评价得自正常个体的原代T细胞培养物(参见例如Wentworth，P.A.et al，Mol Immunol 32：603，1995；Celis，E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2105，1994；Tsai，V.et al.，J.Immunol.158：1796，1997；Kawashima，I.et al.，HumanImmunol 59：1，1998)。该方法包括在体外，在存在抗原呈递细胞时，用受试肽刺激得自正常受试者的外周血淋巴细胞达几周时间。特异于所述肽的T细胞在此时间内被激活，使用例如涉及到肽致敏靶细胞的淋巴因子-或51Cr-释放试验可以检测所述T细胞。
2)免疫HLA转基因小鼠(参见例如Wentworth，P.A.et al.，J.Immunol.26：97，1996；Wentworth，P.A.et al，Int.Immunol 8：651，1996；Alexander，J.et al，J.Immunol.159：4753，1997)。例如，在所述方法中，将处于不完全弗氏佐剂中的肽皮下施用于HLA转基因小鼠。免疫几周后，取出脾细胞，在受试肽的存在下体外培养脾细胞约1周。使用例如涉及到肽致敏靶细胞和表达内源产生之抗原的靶细胞的51Cr-释放试验检测肽-特异性T细胞。
3)阐明经有效免疫接种的免疫个体和/或慢性病患者的回忆T细胞反应(参见例如Rehermann，B.et al.，J.Exp.Med.181：1047，1995；Doolan，D.L.et al，Immunity 7：97，1997；Bertoni，R.et al.，J.Clin.Invest.100：503，1997；Threlkeld，S.C.et al.，J.Immunol.159：1648，1997；Diepolder，H.M.et al.，J.Virol.71：6011，1997)。因此，通过培养PBL检测回忆反应，所述PBL得自因疾病而暴露于抗原，因而产生了“自然”免疫应答的受试者，或得自已进行过针对该抗原的免疫接种的患者。在受试肽与抗原呈递细胞(APC)的存在下，在体外将受试者的PBL培养1-2周以激活“记忆”T细胞(与“原初”T细胞相比)。在培养结束时，使用例如涉及到肽致敏靶、T细胞增殖或淋巴因子释放的51Cr-释放试验检测T细胞活性。
VI.)161P2F10B转基因动物
也可以使用编码161P2F10B-相关蛋白质的核酸产生转基因动物或“敲除”动物，所述动物反过来可用于开发和筛选在治疗上有用的试剂。根据已建立的技术，可以使用编码161P2F10B的cDNA克隆编码161P2F10B的基因组DNA。然后将克隆的基因组序列用于产生转基因动物，所述动物含有表达编码161P2F10B之DNA的细胞。产生转基因动物，特别是诸如小鼠或大鼠之类的动物的方法是本领域的常规技术，其描述于例如1988年4月12日颁布的美国专利4,736,866和1989年9月26日颁布的美国专利4,870,009。通常，特定的细胞成为掺入组织-特异性增强子的161P2F10B转基因的目标。
可以使用包括一拷贝编码161P2F10B的转基因的转基因动物来检查编码161P2F10B的DNA表达增加所起的作用。所述动物可用作测试动物，用于检测据认为可防止动物遭受与所述DNA过表达有关的病理学疾病的试剂。根据本发明的此方面，用试剂治疗动物，与携有转基因的未治疗动物相比，病理学疾病发病率的降低可表示对病理学疾病的潜在治疗性干预。
或者，可以使用161P2F10B的非-人同系物来构建161P2F10B“敲除”动物，作为编码161P2F10B的内源性基因和导入动物胚胎细胞中的、编码161P2F10B的经改变基因组DNA之间同源重组的结果，所述动物具有缺损的或经改变的编码161P2F10B的基因。例如，可以根据已建立的技术，使用编码161P2F10B的cDNA来克隆编码161P2F10B的基因组DNA。编码161P2F10B的基因组DNA的一部分可以被缺失或被另一种基因，如编码可用于监测整合的选择标记的基因所取代。通常，载体(的5’和3’末端)包括几千个碱基的未改变侧翼DNA(有关同源重组载体的描述，可参见例如Thomasand Capecchi，Cell，51：503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，选择其中的导入DNA已与内源性DNA发生同源重组的细胞(Li et al.，Cell，69：915(1992))。然后将选定的细胞注射至动物(如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，in Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152)。然后将嵌合胚胎植入适当的假孕雌性养育动物体内，胚胎最终只能长成“敲除”动物。通过标准技术可鉴定出生殖细胞中携有同源重组DNA的子代，将其用于繁殖动物，其中动物的所有细胞都含有经同源重组的DNA。例如，敲除动物的特征在于能够防御一些病理学疾病，或因缺乏161P2F10B多肽而产生病理学疾病。
VII.)检测161P2F10B的方法
本发明的另一方面涉及检测161P2F10B多核苷酸和161P2F10B-相关蛋白质的方法，以及鉴定表达161P2F10B之细胞的方法。161P2F10B的表达分布图使其成为转移疾病的诊断标记。因此，161P2F10B基因产物的状况所提供的信息可用于预测多种因素，包括对晚期疾病的易感性、发展速率和/或肿瘤攻击力。如本文所详细讨论的，可通过本领域众所周知的多种方法分析患者样品中的161P2F10B基因产物状况，所述方法包括免疫组化分析、包括原位杂交的多种Northern印迹技术、(例如在激光-捕获微-解剖样品上进行的)RT-PCR分析、Western印迹分析和组织阵列分析。
更特别地，本发明提供了检测生物样品，如血清、骨、前列腺和其它组织、尿、精液、细胞制品等中的161P2F10B多核苷酸的试验。可测的161P2F10B多核苷酸包括例如161P2F10B基因或其片段、161P2F10B mRNA、可选择的剪接变体161P2F10B mRNA、和含有161P2F10B多核苷酸的重组DNA或RNA分子。多种扩增161P2F10B多核苷酸和/或检测其存在的方法是本领域众所周知的，可用于本发明此方面的实践中。
在一个实施方案中，检测生物样品中的161P2F10B mRNA的方法包括：使用至少一个引物通过逆转录产生所述样品的cDNA；使用161P2F10B多核苷酸作为有义和反义引物扩增所产生的cDNA，以扩增出161P2F10B cDNA；检测所扩增的161P2F10B cDNA的存在。任选测定扩增的161P2F10B cDNA的序列。
在另一个实施方案中，检测生物样品中161P2F10B基因的方法包括：首先分离样品的基因组DNA；使用161P2F10B多核苷酸作为有义和反义引物扩增分离的基因组DNA；并检测扩增的161P2F10B基因的存在。可由161P2F10B核苷酸序列(参见例如图1)设计出任何数目的适当有义和反义探针组合，并将它们用于此目的。
本发明还提供了检测组织或其它生物样品，如血清、精液、骨、前列腺、尿、细胞制品等中是否存在161P2F10B蛋白的试验。检测161P2F10B-相关蛋白质的方法也是众所周知的，包括例如免疫沉淀、免疫组化分析、Western印迹分析、分子结合试验、ELISA、ELIFA等。例如，检测生物样品中161P2F10B-相关蛋白质的存在的方法包括：首先使样品与161P2F10B抗体、其161P2F10B-反应片段、或含有161P2F10B抗体的抗原-结合区域的重组蛋白质接触；然后检测样品中161P2F10B-相关蛋白质的结合。
鉴定表达161P2F10B的细胞的方法也落入本发明的范围。在一个实施方案中，鉴定表达161P2F10B基因之细胞的试验包括检测细胞中161P2F10BmRNA的存在。检测细胞中的特定mRNA的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交试验(如使用经标记161P2F10B核糖探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)，以及多种核酸扩增试验(如使用161P2F10B特异性互补引物的RT-PCR和其它扩增型检测法，如分支DNA、SISBA、TMA等)。或者，鉴定表达161P2F10B基因之细胞的试验包括检测细胞中或由细胞分泌的161P2F10B-相关蛋白质的存在。多种检测蛋白质的方法是本领域众所周知的，可用于检测161P2F10B-相关蛋白质和表达161P2F10B-相关蛋白质的细胞。
161P2F10B表达分析也可用作鉴定和评价调制161P2F10B基因表达之药剂的工具。例如，161P2F10B表达在肾癌中显著上调，161P2F10B在表I所列组织的癌症中表达。鉴定能抑制癌症细胞中的161P2F10B表达或过表达的分子或生物试剂具有治疗价值。例如，通过使用经RT-PCR、核酸杂交或抗体结合定量161P2F10B表达的筛选，即可鉴定出所述药剂。
VIII.)监测161P2F10B-相关基因及其产物之状态的方法
已知癌症发生是一个多步骤的过程，其中细胞生长逐渐被异常调节，细胞由正常的生理状态发展成为前癌状态，然后发展成为癌症状态(参见例如Alers et al.，Lab Invest.77(5)：437-438(1997)and Isaacset al.，Cancer Surv.23：19-32(1995))。在此上下文中，在生物样品中查找被异常调节的细胞生长的证据(如癌症中的异常161P2F10B表达)能够在诸如癌症的病理学状态发展成为治疗选择更加局限和或预测较差的阶段之前早期检测出所述异常生理状态。在所述查找过程中，可将例如感兴趣生物样品中的161P2F10B状态与相应正常样品(例如得自该个体或另一个未受病理学影响的个体的样品)中的161P2F10B状态相比较。生物样品中161P2F10B状态的改变(与正常样品相比)提供了细胞生长被异常调节的证据。除了使用未受病理学影响的生物样品作为正常样品外，也可以使用预定的标准值，如预定的正常mRNA表达水平(参见例如Grever et al.，J.Comp.Neurol.1996 Dec 9；376(2)：306-14和美国专利5,837,501)来比较样品中的161P2F10B状态。
根据为其领域所接受的含义使用此上下文中的术语“状态”，该术语指的是基因及其产物的情况或状态。通常，本领域技术人员使用多个参数评价基因及其产物的情况或状态。所述参数包括但不限于基因产物表达的位置(包括表达161P2F10B的细胞的位置)和水平，以及表达的基因产物(如161P2F10B mRNA、多核苷酸和多肽)的生物活性。一般说来，161P2F10B状态的改变包括161P2F10B和/或表达161P2F10B之细胞的位置的改变，和/或161P2F10B mRNA和/或蛋白质表达的增加。
通过多种本领域众所周知的方法，包括但不限于免疫组化分析、原位杂交、在激光捕获微-解剖样品上进行的RT-PCR分析、Western印迹分析和组织阵列分析可以分析样品中的161P2F10B状态。评价161P2F10B基因和基因产物之状态的一般方法可参见例如Ausubel et al于1995年编辑的CurrentProtocols In Molecular Biology第2(Northern印迹)、4(Southern印迹)、15(免疫印迹)和18(PCR分析)单元。因此，通过本领域技术人员可利用的多种方法来评价生物样品中的161P2F10B状态，所述方法包括但不限于基因组Southern分析(用于检查例如161P2F10B基因中的微扰)、161P2F10B mRNA的Northern分析和/或PCR分析(用于检查例如161P2F10B mRNA多核苷酸序列或表达水平的变化)，以及Western和/或免疫组化分析(用于检查例如多肽序列的变化、样品中多肽定位的变化、161P2F10B蛋白表达水平的变化和/或161P2F10B蛋白与多肽结合配对物的结合的变化)。可测161P2F10B多核苷酸包括例如161P2F10B基因或其片段、161P2F10B mRNA、可选择的剪接变体161P2F10BmRNA、和含有161P2F10B多核苷酸的重组DNA或RNA分子。
161P2F10B的表达分布图使其成为局部和/或转移疾病的诊断标记，并提供了有关生物样品生长或致癌潜能的信息。特别是，161P2F10B的状态提供的信息可用于预测对特殊疾病时期、发展和/或肿瘤攻击性的易感性。本发明提供了测定161P2F10B状态和诊断表达161P2F10B之癌症，如表I所列组织的癌症的方法和试验。例如，由于相对于正常肾组织而言，肾癌和其它癌症中的161P2F10B mRNA表达水平非常高，可以使用评价生物样品中161P2F10B mRNA转录物或蛋白质水平的试验来诊断与161P2F10B异常调节有关的疾病，所述试验可提供用于确定适当治疗选择的预测信息。
161P2F10B表达状态提供的信息包括发育异常细胞、前癌和癌症细胞的存在、时期和位置，能预测对各个疾病时期的易感性和/或评价肿瘤的攻击性。另外，161P2F10B表达分布图使其可用作转移疾病的显象试剂。因此，本发明一方面涉及多种分子预测和诊断方法，所述方法可用于检查生物样品中的161P2F10B状态，所述样品例如得自患有或怀疑患有特征在于异常调节的细胞生长的病理学，如癌症的个体。
如上所述，通过本领域众所周知的多种方法可检查生物样品中的161P2F10B状态。例如，通过评价样品中是否存在表达161P2F10B的细胞(例如表达161P2F10B mRNA或蛋白质的细胞)，即可检查取自身体特定位置的生物样品中的161P2F10B状态。例如，由于生物样品中161P2F10B状态的改变经常与异常调节的细胞生长有关，因此，当在通常不含有表达161P2F10B的细胞的生物样品(如淋巴结)中发现所述细胞时，该检查即可提供细胞生长受异常调节的证据。具体地说，异常调节的细胞生长的一个标志是癌症细胞从最初的器官(如前列腺)转移至身体的不同区域(如淋巴结)。在此上下文中，受异常调节的细胞生长的证据是重要的，因为在大多数前列腺癌患者中可以检测到隐藏的淋巴结转移，所述转移与已知的疾病进展预测因子有关(参见例如Murphy et al.，Prostate 42(4)：315-317(2000)；Su et al.，Semin.Surg.Oncol.18(1)：17-28(2000)，Freeman et al.，J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1)：474-8)。
一方面，本发明提供了通过测定得自怀疑患有与异常调节细胞生长有关之疾病(如增生或癌症)的个体的细胞所表达161P2F10B基因产物的状态，然后将所测定的状态与相应的正常样品中的161P2F10B基因产物状态比较，从而监测161P2F10B基因产物的方法。相对于正常样品而言，受试样品中存在异常161P2F10B基因产物提供了个体细胞内存在受异常调节的细胞生长的指示。
另一方面，本发明提供了可用于测定个体中是否存在癌症的试验，其包括检测受试细胞或组织样品中161P2F10B mRNA或蛋白质表达相对于相应正常细胞或组织表达水平而言的显著增加。例如，可评价包括但不限于表I所列组织中是否存在161P2F10B mRNA。任何这些组织中显著161P2F10B表达的存在可用于表示癌症的出现、存在和/或严重性，因为相应的正常组织不表达或仅表达较低水平的161P2F10B mRNA。
在相关实施方案中，在蛋白质水平而不是核酸水平上测定161P2F10B状态。例如，所述方法包括测定受试组织样品中由细胞表达的161P2F10B蛋白水平，将所测定的水平与相应正常样品中表达的161P2F10B水平相比较。在一个实施方案中，使用例如免疫组化法评价161P2F10B蛋白的存在。可以在针对此目的的本领域众所周知的多种试验形式中使用能检测161P2F10B蛋白表达的161P2F10B抗体或结合配对物。
在另一个实施方案中，可评价生物样品中161P2F10B核苷酸和氨基酸序列的状态以鉴定出这些分子结构中的微扰。所述微扰包括插入、缺失、取代等。所述评价是有用的，因为能在大量与生长被异常调节的表型有关的蛋白质中观察到核苷酸和氨基酸序列中的微扰(参见例如Marrogi et al.，1999，J.Cutan.Pathoi.26(8)：369-378)。例如，161P2F10B序列中的突变可以表示肿瘤的存在或加强。因此，所述试验具有诊断和预测的价值，其中161P2F10B的突变表示功能的潜在损失或肿瘤生长的增加。
多种可用于观察核苷酸和氨基酸序列中的微扰(perturbation)的试验是本领域众所周知的。例如，通过本文所讨论的Northern、Southern、Western、PCR和DNA测序法可观察到161P2F10B基因产物的核酸或氨基酸序列的大小和结构。另外，其它可用于观察核苷酸和氨基酸序列中的微扰的方法，如单链构象多态性分析也是本领域众所周知的(参见例如1999年9月7日颁布的美国专利5,382,510和1995年1月17日颁布的5,952,170)。
另外，可以检查生物样品中161P2F10B基因的甲基化状态。基因5’调节区中CpG岛的异常脱甲基化和/或过度甲基化经常发生于无限增殖化和转化细胞中，并可改变多种基因的表达。例如，pi-类谷胱甘肽S-转移酶(在正常前列腺中表达但在>90％的前列腺癌中不表达的蛋白质)的启动子过度甲基化似乎能永久地沉默该基因的转录，并且是前列腺癌中最经常被检测到的基因组改变(De Marzo et al.，Am.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999))。另外，该改变存在于至少70％高级别的前列腺上皮内肿瘤(PIN)中(Brooks et al，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7：531-536)。在另一个例子中，通过脱氧-氮胞苷诱导类淋巴母细胞中的LAGE-1肿瘤特异性基因(在正常前列腺中不表达，但在25-50％的前列腺癌中表达)的表达，暗示肿瘤表达是脱甲基化引起的(Lethe et al.，Int.J.Cancer 76(6)：903-908(1998))。多种检查基因甲基化状态的试验是本领域众所周知的。例如，可以在Southern杂交法中使用对甲基化敏感的限制性酶来评价CpG岛的甲基化状态，所述酶不能裂解含有甲基化CpG位点的序列。另外，MSP(甲基化特异性PCR)可快速描绘给定基因的CpG岛中存在的所有CpG位点的甲基化状态。该方法包括起初用亚硫酸氢钠(可将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶)修饰DNA，接着使用特异于甲基化对非甲基化DNA的引物进行扩增。涉及甲基化干预的方法也可参见例如Current Protocols In Molecular Biology，Unit 12，Frederick M.Ausubel etal.eds.，1995。
基因扩增是另一种可用于评价161P2F10B状态的方法。可基于本文提供的序列，使用适当的经标记探针，直接通过例如常规的Southern印迹或定量mRNA转录的Northern印迹(Thomas，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205)、点印迹(DNA分析)或原位杂交来测定样品中的基因扩增。或者，使用能识别特异性双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。反过来标记抗体，进行双链体与表面结合的试验，使得通过表面双链体的形成，可以检测与双链体结合的抗体的存在。
使用例如Northern、点印迹或RT-PCR分析检测161P2F10B表达，可以方便地分析出活检组织或外周血中是否存在癌细胞。RT-PCR可扩增的161P2F10B mRNA的存在提供了存在癌症的指示。RT-PCR试验是本领域众所周知的。最近，外周血中肿瘤细胞的RT-PCR检测试验被评价，以用于多种人实体肿瘤的诊断和处理。在前列腺癌领域，所述试验包括用于检测表达PSA和PSM之细胞的RT-PCR试验(Verkaik et al.，1997，Urol.Res.25：373-384；Ghossein et al.，1995，J.Clin.Oncol.13：1195-2000；Heston et al，1995，Clin.Chem.41：1687-1688)。
本发明的另一方面是评价个体对处于发展中的癌症的易感性。在一个实施方案中，预测对癌症的易感性的方法包括检测组织样品中的161P2F10BmRNA或161P2F10B蛋白，其存在表示对癌症易感，其中161P2F10B mRNA表达的水平与易感性的程度相关。在具体实施方案中，检查前列腺或其它组织中是否存在161P2F10B，样品中存在161P2F10B表示对前列腺癌易感(或出现或存在前列腺肿瘤)。类似地，可以评价生物样品中161P2F10B核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等。样品中161P2F10B基因产物内一种或多种微扰的存在表示对癌症的易感性(或肿瘤的出现或存在)。
本发明还包括评价肿瘤攻击性的方法。在一个实施方案中，评价肿瘤攻击性的方法包括：测定肿瘤细胞所表达的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白的水平，将所测定的水平与取自相同个体的相应正常组织或正常组织参照样品中表达的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白的水平相比较，其中相对于正常样品而言，肿瘤样品的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白表达水平显示出攻击性水平。在具体实施方案中，通过测定肿瘤细胞表达161P2F10B的水平来评价肿瘤的攻击性，较高的表达水平表示肿瘤更具攻击性。另一个实施方案是评价生物样品中161P2F10B核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等。一种或多种微扰的存在表示肿瘤更具攻击性。
本发明的另一个实施方案涉及观察个体的恶性肿瘤在整个时间内的发展的方法。在一个实施方案中，观察个体的恶性肿瘤在整个时间内的发展的方法包括：测定肿瘤样品中的细胞所表达的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白的水平，将所测定的水平与在不同时间取自相同个体的等同组织样品中表达的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白的水平相比较，其中在整个时间内肿瘤样品中的161P2F10B mRNA或161P2F10B蛋白表达水平提供了有关癌症发展的信息。在具体实施方案中，通过测定肿瘤细胞中在整个时间内的161P2F10B表达来评价癌症的发展进程，其中在整个时间内表达的增加表示癌症的发展。也可以评价生物样品中161P2F10B核苷酸和氨基酸序列的完整性以鉴定出这些分子结构中的微扰，如插入、缺失、取代等，其中一种或多种微扰的存在表示癌症的发展。
上述诊断方法可以与本领域已知的多种预测和诊断方法中的任何一种联合使用。例如，本发明的另一个实施方案涉及观察161P2F10B基因和161P2F10B基因产物的表达(或161P2F10B基因和161P2F10B基因产物中的微扰)与恶性肿瘤相关因子之间的一致性的方法，所述方法可用于诊断和预测组织样品状态。可以利用多种与恶性肿瘤相关的因子，例如恶性肿瘤相关基因的表达以及总体细胞学观察(参见例如Bocking et al.，1984，Anal.Quant.Cytol.6(2)：74-88；Epstein，1995，Hum.Pathol.26(2)：223-9；Thorson etal.，1998，Mod.Pathol.11(6)：543-51；Baisden et al，1999，Am.J.Surg.Pathol.23(8)：918-24)。例如，由于一套与疾病相符的特定因子的存在可提供对于诊断和预测组织样品状态而言至关重要的信息，因此，观察161P2F10B基因和161P2F10B基因产物的表达(或161P2F10B基因和161P2F10B基因产物中的微扰)与另一个恶性肿瘤相关因子之间的一致性的方法是有用的。
本文描述了检测和定量161P2F10B mRNA或蛋白质表达的方法，标准的核酸和蛋白质检测和定量技术是本领域众所周知的。检测和定量161P2F10BmRNA的标准方法包括：使用经标记161P2F10B核糖探针的原位杂交，使用161P2F10B多核苷酸探针的Northern印迹和相关技术，使用161P2F10B特异性引物的RT-PCR分析，和其它扩增型检测法，如分支DNA、SISBA、TMA等。在具体实施方案中，使用半-定量的RT-PCR检测和定量161P2F10BmRNA表达。能扩增161P2F10B的任何数目的引物都可用于此目的，包括但不限于本文具体描述的多种引物套。在具体实施方案中，可以在活检组织的免疫组化试验中使用与野生型161P2F10B蛋白特异性反应的多克隆或单克隆抗体。
IX.)鉴定与161P2F10B相互作用的分子
本文公开的161P2F10B蛋白和核酸序列使本领域技术人员可以鉴定出与161P2F10B相互作用的蛋白质、小分子和其它试剂，以及经由多种为本领域所接受的方法中的任一种被161P2F10B激活的途径。例如，可以利用一种所谓的相互作用陷阱系统(也称为“双-杂合试验”)。在所述系统中，分子与介导报道基因表达的转录因子相互作用，并重建所述转录因子，由此测定报道基因的表达。其它系统通过重建真核转录激活物来鉴定体内蛋白质-蛋白质相互作用。参见例如1999年9月21日颁布的美国专利5,955,280；1999年7月20日颁布的5,925,523；1998年12月8日颁布的5,846,722和1999年12月21日颁布的6,004,746。有关基于基因组预测蛋白质功能的算法也是本领域已知的(参见例如Marcotte，et al.，Nature 402：4 November 1999，83-86)。
或者可以筛选肽文库以鉴定与161P2F10B蛋白序列相互作用的分子。在所述方法中，通过筛选编码随机或受控氨基酸集合的文库，鉴定出与161P2F10B结合的肽。将文库编码的肽表达成噬菌体包被蛋白的融合蛋白，然后筛选与161P2F10B蛋白结合的噬菌体颗粒。
因此，无需先知道任何有关预期配体或受体分子结构的信息，也可鉴定出具有多种用途的肽，如治疗、预测或诊断试剂。可用于鉴定与161P2F10B蛋白序列相互作用的分子的典型肽文库和筛选方法公开于例如1998年3月3日颁布的5,723,286和1998年3月31日颁布的5,733,731。
或者，表达161P2F10B的细胞系可用于鉴定由161P2F10B介导的蛋白质-蛋白质相互作用。可使用免疫沉淀技术检测所述相互作用(参见例如Hamilton B.J.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1999，261：646-51)。使用抗-161P2F10B抗体可从表达161P2F10B的细胞系中免疫沉淀161P2F10B蛋白。或者，可在经改造后可表达161P2F10B与His-tag的融合物(上述载体)的细胞系中使用抗His-tag抗体。通过诸如Western印迹、蛋白质的35S-甲硫氨酸标记、蛋白质微量测序、银染和二维凝胶电泳的方法，可以检测免疫沉淀复合物的蛋白质结合情况。
通过所述筛选试验的相关实施方案即可鉴定出与161P2F10B相互作用的小分子和配体。例如，可以鉴定出能妨碍蛋白质功能的小分子，包括能妨碍161P2F10B介导磷酸化和去磷酸化、与DNA或RNA分子的相互作用(作为细胞周期调节、第二信使信号传导或肿瘤发生的指示)之能力的分子。类似地，鉴定出能调制161P2F10B-相关离子通道、蛋白质泵或细胞通讯功能的小分子，并将它们用于治疗患有表达161P2F10B之癌症的患者(参见例如Hille，B.，ionic Channels of Excitable Membranes 2nd Ed.，SinauerAssoc.，Sunderland，MA，1992)。另外，基于其结合161P2F10B和激活报道构建体的能力鉴定出调节161P2F10B功能的配体。典型的方法讨论于例如1999年7月27日颁布的美国专利5,928,868，其包括形成杂合配体的方法，其中至少一个配体是小分子。在说明性的实施方案中，使用经改造可表达161P2F10B与DNA-结合蛋白的融合蛋白的细胞共表达杂合配体/小分子和cDNA文库转录激活物蛋白质的融合蛋白。细胞还含有报道基因，在第一和第二融合蛋白彼此的近侧调节报道基因的表达，该事件仅当杂合配体结合两种杂合蛋白质上的靶位点时才会发生。选择表达报道基因的细胞，并鉴定未知的小分子或未知的配体。该方法提供了鉴定能激活或抑制161P2F10B的调制剂的方法。
本发明的实施方案包括筛选能与图1所示161P2F10B氨基酸序列相互作用的分子的方法，所述方法包括下述步骤：使分子群体与161P2F10B氨基酸序列接触，在有利于相互作用的条件下使分子群体与161P2F10B氨基酸序列相互作用，测定与161P2F10B氨基酸序列相互作用的分子的存在，然后将不与161P2F10B氨基酸序列相互作用的分子同与161P2F10B氨基酸序列相互作用的分子分开。在具体实施方案中，该方法进一步包括纯化、表征和鉴定与161P2F10B氨基酸序列相互作用的分子。使用鉴定的分子调制161P2F10B行使的功能。在优选实施方案中，161P2F10B氨基酸序列与肽文库接触。
X.)治疗方法和组合物
将161P2F10B鉴定为一般在有限的一套组织中表达，但也在如表I所列的癌症中表达的蛋白质开发了多种治疗所述癌症的治疗方法。
值得注意的是，靶向抗肿瘤疗法是有用的，即便当正常组织，甚至是重要的正常器官组织表达靶向的蛋白质时，该疗法也是有用的。重要器官是维持生命所必需的，如心脏或结肠。不重要的器官是摘除后个体仍可存活的器官。不重要器官的例子是卵巢、乳腺和前列腺。
例如，Herceptin是经FDA批准的由抗体组成的药物，所述抗体能与被不同地称作HER2，HER2/neu和erb-b-2的蛋白质进行免疫反应。该药物被Genentech推向市场，是一种在商业上很成功的抗肿瘤剂。2002年Herceptin的销售额达到近4亿美元。Herceptin可治疗HER2阳性转移乳腺癌。然而，HER2的表达并不局限于该肿瘤。多种正常组织也表达该蛋白质。特别是已知正常肾脏和心脏中存在HER2/neu，因此这些组织存在于Herceptin的所有人受体中。Latif，Z.，et al.，B.J.U.International(2002)89：5-9也证实了正常肾脏中HER2/neu的存在。如该篇文献(该文评价了抗-HER2抗体如Herceptin是否优选指示肾细胞癌)中所示，良性肾组织既产生蛋白质也产生mRNA。HER2/neu蛋白在良性肾组织中显著地强烈地超表达。
尽管HER2/neu在诸如心脏和肾脏的重要组织中表达，Herceptin仍是非常有用的、经FDA批准的、在商业上获得成功的药物。Herceptin对心脏组织的作用，即“心脏毒性”仅仅是治疗的副作用。当仅用Herceptin治疗患者时，只有很低百分比的患者会出现显著的心脏毒性。为了使心脏毒性最小化，对于用HER2/neu治疗有更严格的准入要求。在进行治疗之前，要评价对心脏病的易感性等因素。
特别值得注意的是，尽管肾组织表现出正常的表达，甚至可能比心脏组织的表达更高，肾脏却没有可察觉的Herceptin副作用。另外，在表达HER2的正常组织的多种阵列中，很少会出现任何副作用。只有心脏组织会出现一些可察觉的副作用。HER2/neu表达特别显著的组织，如肾脏不是任何副作用的基础。
另外，已发现靶向表皮生长因子受体(EGFR)；Erbitux(ImClone)的抗肿瘤疗法有有利的治疗效果。EGFR也在多种正常组织中表达。使用抗-EGFR治疗剂之后，正常组织中仅有很有限的副作用。与EGFR治疗相伴的副作用一般是在接受治疗的100％患者中观察到严重的皮疹。
因此，正常组织，甚至是重要的正常组织中靶蛋白质的表达不会妨碍该蛋白质的靶向药剂用作一些超表达该蛋白质的肿瘤的治疗剂。例如，在重要器官中的表达本身不是有害的。另外，被认为是非必需的器官，如前列腺和卵巢可以被摘除而不会影响死亡率。最终，由于免疫优待，正常器官中的表达不会影响一些重要器官。受到免疫优待的器官通过血液-器官屏障而得到保护，免受血液的影响，从而使免疫疗法无法到达该器官。受到免疫优待的器官的例子是脑和睾丸。
因此，抑制161P2F10B蛋白活性的治疗方法对患有表达161P2F10B的癌症患者是有用的。这些治疗方法一般分为三类。第一类调制161P2F10B的功能，因为它涉及肿瘤细胞生长，导致肿瘤细胞生长的抑制或延迟或诱导其杀伤。第二类包括多种抑制161P2F10B蛋白与其结合配对物或其它蛋白质结合或缔合的方法。第三类包括多种抑制161P2F10B基因转录或161P2F10BmRNA翻译的方法。
X.A.)抗-癌疫苗
本发明提供了含有161P2F10B-相关蛋白质或161P2F10B-相关核酸的癌症疫苗。由于161P2F10B的表达，癌症疫苗能防止和/或治疗表达161P2F10B的癌症，而对非-靶组织的影响很小或无影响。在疫苗中使用能产生细胞-介导的体液免疫应答的肿瘤抗原作为抗-癌疗法是本领域众所周知的，并且已用于使用人PSMA和啮齿动物PAP免疫原的前列腺癌疫苗中(Hodge et al.，1995，Int.J.Cancer 63：231-237；Fong et al，1997，J.Immunol.159：3113-3117)。
通过利用161P2F10B-相关蛋白质，或编码161P2F10B的核酸分子和能表达和呈递161P2F10B免疫原(一般含有多种T细胞表位或抗体)的重组载体，可以容易地实施该方法。本领域技术人员懂得多种传递免疫反应表位的疫苗系统是本领域已知的(参见例如Heryin et al.，Ann Med 1999 Feb31(1)：66-78；Maruyama et al.，Cancer Immunol Immunother 2000 Jun49(3)：123-32)。简单地说，所述的在哺乳动物中产生(例如细胞-介导的和/或体液的)免疫应答的方法包括下述步骤：将哺乳动物免疫系统暴露于免疫反应表位(如图1所示161P2F10B蛋白或其类似物或同系物中存在的表位)，以使哺乳动物产生特异于该表位的免疫应答(例如产生特异性识别该表位的抗体)。
可通过多种方法组合和传递完整的161P2F10B蛋白，其免疫原性区域或其表位。所述疫苗组合物可包括例如脂肽(例如Vitiello，A.et al.，J.Clin.Invest.95：341，1995)，包裹于聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球体中的肽组合物(参见例如Eldridge，et al.，Molec.Immunol.28：287-294，1991；Alonso et al.，Vaccine 12：299-306，1994；Jones et al.，Vaccine 13：675-681，1995)，包含于免疫刺激复合物(ISCOMS)中的肽组合物(参见例如Takahashi et al，Nature344：873-875，1990；Hu et al.，Clin Exp Immunol.113：235-243，1998)，多抗原肽系统(MAP)(参见例如Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5409-5413，1988；Tam，J.P.，J.Immunol.Methods 196：17-32，1996)，配制成多价肽的肽；用于弹道传递系统的肽，典型晶体化的肽，病毒传递载体(Perkus，M.E.et al.，In：Concepts in vaccine development，Kaufmann，S.H.E.，ed.，p.379，1996；Chakrabarti，S.et al.，Nature 320：535，1986；Hu，S.L.et al.，Nature320：537，1986；Kieny，M-P.et al.，AIDS Biol Technology 4：790，1986；Top，F.H.et al.，J.Infect Dis.124：148，1971；Chanda，P.K.et al.，Virology 175：535，1990)，病毒或合成来源的颗粒(例如Kofier，N.et al.，J.Immunol.Methods.192：25，1996；Eldridge，J.H.et al.，Sem.Hematol.30：16，1993；Falo，L.D.，Jr.etal.，Nature Med.7：649，1995)，佐剂(Warren，H.S.，Vogel，F.R.，and Chedid，L.A.Annu.Rev.Immunol.4：369，1986；Gupta，R.K.et al.，Vaccine 11：293，1993)，脂质体(Reddy，R.et al.，J.Immunol.148：1585，1992；Rock，K.L.，Immunol.Today 17：131，1996)，或裸露的或吸附于颗粒的cDNA(Ulmer，J.B.et al.，Science 259：1745，1993；Robinson，H.L.，Hunt，L.A.，and Webster，R.G.，Vaccine 11：957，1993；Shiver，J.W.et al.，In：Concepts in vaccine development，Kaufmann，S.H.E.，ed.，p.423，1996；Cease，K.B.，and Berzofsky，J.A.，Annu.Rev.Immunol.12：923，1994 and Eldridge，J.H.et al.，Sem.Hemato.30：16，1993)。也可以使用毒素-靶向传递技术，也已知为受体介导的靶向，如AvantImmunotherapeutics，Inc.(Needham，Massachusetts)的技术。
对161P2F10B-相关癌症的患者而言，本发明的疫苗和抗体组合物也可以与其它用于癌症的疗法，如外科手术、化疗、药物疗法、放疗等联合使用，包括与免疫佐剂，如IL-2、IL-12、GM-CSF等联合使用。
细胞疫苗：
使用特殊算法即可测定CTL表位，以鉴定出161P2F10B蛋白中与相应HLA等位基因结合的肽(参见例如Brown University，BIMAS和SYFPEITHI)。在优选实施方案中，161P2F10B免疫原含有一种或多种使用本领域众所周知的技术鉴定的氨基酸序列，如以前公开的表中所示的序列或被HLAI类基元/超基元特化的8，9，10或11个氨基酸的肽(如表IV(A)，表IV(D)或表IV(E))和/或含有HLA II类基元/超基元的至少9个氨基酸的肽(如表IV(B)或表IV(C))。本领域技术人员应懂得HLA I类结合沟必需封闭末端，使得只有特定大小范围的肽适合进入沟内并且被结合，通常，I类HLA表位的长度为8，9，10或11个氨基酸。相反，HLA II类结合沟必需开放末端，因此，约9个或更多个氨基酸的肽可以被HLA II类分子结合。由于HLA I类和II类之间结合沟的差异，HLA I类基元是长度特异性的，即I类基元的第2位是肽的氨基至羧基方向的第二个氨基酸。II类基元的氨基酸位置仅是相对于彼此而言的，而不是相对于整个肽而言的，即可以在携有基元之序列的氨基和/或羧基末端结合其它的氨基酸。HLA II类表位的长度经常为9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个氨基酸，或长于25个氨基酸。
多种在哺乳动物中产生免疫应答的方法是本领域已知的(例如作为产生杂交瘤的第一步)。在哺乳动物中产生免疫应答的方法包括将哺乳动物的免疫系统暴露于蛋白质(如161P2F10B蛋白)上的免疫原性表位以产生免疫应答。典型的实施方案由在宿主中产生抗161P2F10B免疫应答的方法组成，通过使宿主与足够量的至少一种161P2F10B B细胞或细胞毒T-细胞表位或其类似物接触；至少间隔一段时间之后，使宿主与161P2F10B B细胞或细胞毒T-细胞表位或其类似物再次-接触即可实施此方法。具体实施方案由产生抗161P2F10B-相关蛋白质或人造多表位肽的免疫应答的方法组成，所述方法包括：给人或另一种哺乳动物施用疫苗制品中包含的161P2F10B免疫原(如161P2F10B蛋白或其肽片段，161P2F10B融合蛋白或类似物等)。通常，所述疫苗制品还含有适当的佐剂(参见例如美国专利6,146,635)或通用的辅助表位，如PADRETM肽(EpimmuneInc.，San Diego，CA；参见例如Alexander et al.，J.Immunol.2000 164(3)；164(3)：1625-1633；Alexander et al.，Immunity 19941(9)：751-761 and Alexander et al.，Immunol.Res.1998 18(2)：79-92)。另一种可选择的方法包括通过给个体的肌肉或皮肤体内施用DNA分子，在个体中产生抗161P2F10B免疫原的免疫应答，所述DNA分子含有编码161P2F10B免疫原的DNA序列，所述DNA序列与控制DNA序列表达的调节序列可操作相连；其中DNA分子被细胞摄取，DNA序列在细胞中表达，从而产生抗免疫原的免疫应答(参见例如美国专利5,962,428)。任选也施用基因疫苗促进剂，如阴离子脂质；皂苷；凝集素；雌激素化合物；羟化低级烷基；二甲基亚砜；和尿素。另外，为了产生针对靶抗原的应答，可以施用模拟161P2F10B的抗独特型抗体。
核酸疫苗：
本发明的疫苗组合物包括核酸-介导的疫苗。可以给患者施用编码本发明蛋白质的DNA或RNA。可使用基因免疫法产生针对表达161P2F10B之癌症细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫应答。可以将含有编码161P2F10B-相关蛋白质/免疫原的DNA和适当调节序列的构建体直接注射至个体的肌肉或皮肤，使肌肉或皮肤细胞摄取构建体，并表达编码的161P2F10B蛋白/免疫原。或者，疫苗含有161P2F10B-相关蛋白质。161P2F10B-相关蛋白质免疫原的表达导致产生针对携有161P2F10B蛋白之细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫力。可以使用多种本领域已知的预防和治疗性基因免疫技术(有关评述可参见国际互联网地址genweb.com公开的信息和参考文献)。基于核酸的传递描述于例如Wolff et.al.，Science247：1465(1990)以及美国专利5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647和WO98/04720。基于DNA的传递技术的例子包括“裸露的DNA”、促进(bupivicaine、聚合物、肽-介导的)传递、阳离子脂质复合物和颗粒-介导(“基因枪”)或压力-介导的传递(参见例如美国专利5,922,687)。
为了进行治疗或预防性免疫，可经由病毒或细菌载体表达本发明的蛋白质。可用于本发明实践的多种病毒基因传递系统包括但不限于痘苗病毒、禽痘病毒(fowlpox)、金丝雀痘病毒(canarypox)、腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、腺-伴随病毒、慢病毒和新培斯病毒(sindbis virus)(参见例如Restifo，1996，Curr.Opin.Immunol.8：658-663；Tsang et al J.Nat.Cancer Inst.87：982-990(1995))。也可通过将编码161P2F10B-相关蛋白质的裸露DNA导入患者(例如肌内或皮内)来利用非-病毒传递系统诱导抗-肿瘤应答。
将痘苗病毒用作例如表达编码本发明肽的核苷酸序列的载体。通过导入宿主，重组痘苗病毒表达蛋白质免疫原性肽，籍此引发宿主免疫应答。用于免疫接种方案的痘苗病毒载体和方法描述于例如美国专利4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover et al.，Nature 351：456-460(1991)。根据本文的描述，多种可用于治疗性施用或免疫接种本发明肽的其它载体，例如腺和腺-伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、脱毒的炭疽毒素载体等对于本领域技术人员而言是显而易见的。
因此，可使用基因传递系统传递161P2F10B-相关核酸分子。在一个实施方案中，利用了全长人161P2F10B cDNA。在另一个实施方案中，利用了编码特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)和/或抗体表位的161P2F10B核酸分子。
来自体内的(Ex vivo)疫苗：
可以利用多种来自体内的策略产生免疫应答。一种方法包括使用抗原呈递细胞(APC)，如树状细胞(DC)为患者的免疫系统呈递161P2F10B抗原。树状细胞表达MHC I类和II类分子、B7共刺激物和IL-12，因此是高度特化的抗原呈递细胞。在前列腺癌中，用前列腺-特异性膜抗原(PSMA)肽脉冲的自身树状细胞被用于I期临床试验以刺激前列腺癌患者的免疫系统(Tjoa et al.，1996，Prostate 28：65-69；Murphy et al.，1996，Prostate 29：371-380)。因此，在MHC I类或MHC II类分子环境中，可使用树状细胞将161P2F10B肽呈递给T细胞。在一个实施方案中，用能与MHC I类和/或II类分子结合的161P2F10B肽脉冲自身树状细胞。在另一个实施方案中，用完整的161P2F10B蛋白脉冲树状细胞。另一个实施方案包括使用多种本领域已知的工具载体，如腺病毒(Arthur et al.，1997，Cancer Gene Ther.4：17-25)、逆转录病毒(Henderson etal.，1996，Cancer Res.56：3763-3770)、慢病毒、腺-伴随病毒、DNA转染(Ribaset al.，1997，Cancer Res.57：2865-2869)或得自肿瘤的RNA转染(Ashley et al.，1997，J.Exp.Med.186：1177-1182)对树状细胞中的161P2F10B基因过表达进行改造。也可改造表达161P2F10B的细胞以使其表达免疫调制剂，如GM-CSF并用作免疫剂。
X.B.)161P2F10B用作基于抗体之疗法的靶
161P2F10B是有吸引力的基于抗体之治疗策略的靶。本领域已知多种靶向细胞外和细胞内分子的抗体策略(参见例如补体和ADCC介导的杀伤以及内体的使用)。由于相对于相应的正常细胞而言，多种谱系的癌症细胞表达161P2F10B，准备全身性施用161P2F10B-免疫反应组合物，该组合物表现出极好的敏感性，未表现出由免疫反应组合物与非-靶器官和组织的结合导致的毒性、非-特异性和/或非-靶作用。与161P2F10B结构域特异性反应的抗体作为与毒素或治疗剂的偶联物，或作为能抑制细胞增殖或功能的裸露抗体，可用于全身性治疗表达161P2F10B的癌症。
可将161P2F10B抗体导入患者以使抗体与161P2F10B结合并调制功能，如与结合配对物的相互作用，随后介导肿瘤细胞的破坏和/或抑制肿瘤细胞的生长。所述抗体发挥治疗作用的机理包括补体-介导的细胞裂解、依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性、调制161P2F10B的生理功能、抑制配体结合或信号转导途径、调制肿瘤细胞分化、改变肿瘤血管生成因子分布和/或细胞凋亡。
本领域技术人员懂得可以使用抗体特异性靶向和结合免疫原性分子，例如图1所示161P2F10B序列的免疫原性区域。另外，本领域技术人员懂得抗体与细胞毒性剂的偶联是常规技术(参见例如Slevers et al.Blood 93：113678-3684(June 1，1999))。例如，当通过使细胞毒性和/或治疗剂与特异于细胞所表达分子(如161P2F10B)的抗体偶联而将它们直接传递至细胞时，细胞毒性剂将对所述细胞发挥其已知的生物学作用(即细胞毒性)。
使用抗体-细胞毒性剂偶联物以杀死细胞的多种组合物和方法是本领域已知的。在癌症的上下文中，典型的方法必需给患有肿瘤的动物施用生物有效量的偶联物，所述偶联物含有与靶向剂(如抗-161P2F10B抗体)连接的选定细胞毒性剂和/或治疗剂，所述靶向剂与表达的标记(如161P2F10B)结合，易于结合或定位于细胞表面。典型的实施方案是将细胞毒性剂和/或治疗剂传递至表达161P2F10B的细胞的方法，所述方法包括使细胞毒性剂与免疫特异性结合161P2F10B表位的抗体偶联，并将细胞暴露于抗体-细胞毒性剂偶联物。另一个说明性的实施方案是治疗怀疑患有转移癌症的个体的方法，所述方法包括给所述个体非肠道施用药物组合物的步骤，所述组合物含有治疗有效量的与细胞毒性剂和/或治疗剂偶联的抗体。
可根据多种已成功用于治疗其它类型的癌症的方法来进行使用抗-161P2F10B抗体的癌症免疫疗法，所述癌症包括但不限于：结肠癌(Arlen etal.，1998，Crit.Rev.Immunol.18：133-138)，多发性骨髓瘤(Ozaki et al.，1997，Blood 90：3179-3186，Tsunenari et al.，1997，Blood 90：2437-2444)，胃癌(Kasprzyk et al.，1992，Cancer Res.52：2771-2776)，B-细胞淋巴瘤(Funakoshi etal.，1996，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19：93-101)，白血病(Zhonget al.，1996，Leuk.Res.20：581-589)，结肠直肠癌(Moun et al.，1994，Cancer Res.54：6160-6166；Velders et al.，1995，Cancer Res.55：4398-4403)和乳腺癌(Shepard et al.，1991，J.Clin.Immunol.11：117-127)。一些治疗方法包括使裸露的抗体与毒素或放射性同位素偶联，如Y91或I131分别与抗-CD20抗体偶联(例如ZevalinTM，IDEC Pharmaceuficals Corp.or BexxarTM，CoulterPharmaceuficals)，而其它治疗方法包括共同施用抗体和其它治疗剂，如同时施用HerceptinTM(trastuzuMAb)与paclitaxel(Genentech，Inc.)。抗体可与治疗剂偶联。例如，为了治疗肾癌，可以在施用161P2F10B抗体的同时使用放疗、化疗或激素脱离疗法。另外，抗体可与毒素偶联，所述毒素如刺孢霉素(如MylotargTM，Wyeth-Ayerst，Madison，NJ，一种与抗-肿瘤抗生素刺孢霉素偶联的重组人源化IgG4κ抗体)或美登木素生物碱(如基于taxane的肿瘤-激活前体药物，TAP，platform，ImmunoGen，Cambridge，MA，也可参见例如美国专利5,416,064)或奥瑞斯他丁E(Nat Biotechnol.2003 Jul；21(7)：778-84.(SeattleGenetics))。
尽管161P2F10B抗体疗法可用于所有阶段的癌症，但抗体疗法特别适于晚期或转移癌症。对已接受一轮或多轮化疗的患者进行本发明的抗体疗法。或者，对未接受过化疗的患者进行本发明的抗体疗法与化疗或放疗方案。另外，抗体疗法能使相伴随的化疗剂量降低，对于不能很好耐受化疗药剂之毒性的患者更是如此。Fan等(Cancer Res.53：4637-4642，1993)，Prewett等(International J.of Onco.9：217-224，1996)和Hancock等(Cancer Res.51：4575-4580，1991)描述了多种抗体与化疗剂的联合使用。
尽管161P2F10B抗体疗法可用于所有阶段的癌症，但抗体疗法特别适于晚期或转移癌症。对已接受一轮或多轮化疗的患者进行本发明的抗体疗法。或者，对未接受过化疗的患者进行本发明的抗体疗法与化疗或放疗方案。另外，抗体疗法能使相伴随的化疗剂量降低，对于不能很好耐受化疗药剂之毒性的患者更是如此。
优选使用肿瘤组织的免疫组化评价、定量161P2F10B显象或其它能可靠表示161P2F10B表达的存在和水平的技术来评价癌症患者中161P2F10B表达的存在和水平。为此优选对肿瘤活检或手术样品进行免疫组化分析。对肿瘤组织进行免疫组化分析的方法是本领域众所周知的。
治疗前列腺癌和其它癌症的抗-161P2F10B单克隆抗体包括能引发强有力的抗肿瘤免疫应答或直接具有细胞毒性的单克隆抗体。在这一点上，抗-161P2F10B单克隆抗体(MAb)能通过补体-介导的或依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)机理引起肿瘤细胞裂解，这两种机理都需要免疫球蛋白分子的完整Fc部分，以与补体蛋白质上的效应细胞Fc受体位点相互作用。另外，对肿瘤生长直接发挥生物学作用的抗-161P2F10B MAb可用于治疗表达161P2F10B的癌症。直接细胞毒MAb的作用机理包括：抑制细胞生长、调制细胞分化、调制肿瘤血管生成因子分布和诱导细胞凋亡。使用任何一种评价细胞死亡的体外试验，如ADCC、ADMMC、补体-介导的细胞裂解等来评价特定抗-161P2F10B MAb发挥抗-肿瘤作用的机理，所述试验一般是本领域已知的。
在一些患者中，使用鼠或其它非-人单克隆抗体，或人/小鼠嵌合MAb可诱导抗-非人抗体的中度至强烈的免疫应答。这会导致抗体从循环中被清除且效力降低。在大多数严重病例中，所述免疫应答可导致免疫复合物的广泛形成，所述复合物可潜在导致肾衰竭。因此，用于本发明的治疗方法的优选单克隆抗体是那些全人或人源化，并以高亲和性与靶161P2F10B抗原特异性结合，但在患者中表现出低抗原性或无抗原性的单克隆抗体。
本发明的治疗方法期望单独施用抗-161P2F10B MAb以及联合或混合使用不同的MAb(即161P2F10B MAb或与另一种蛋白质结合的MAb)。所述MAb混合物由于含有靶向不同表位的MAb、利用不同效应物机理或直接联合细胞毒MAb与依赖免疫效应物功能性的MAb而具有一些优点。所述MAb组合可表现出协同治疗作用。另外，161P2F10B MAb可以与包括但不限于多种化疗剂和生物制剂、雄激素-阻断剂、免疫调制剂(如IL-2，GM-CSF)、外科手术或放疗的其它治疗形式相伴使用。可以施用“裸露”或未偶联形式的161P2F10B MAb，或者使治疗剂与所述MAb偶联。
可经由任何能将抗体传递至肿瘤细胞的途径施用161P2F10B MAb制剂。给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内等。治疗一般包括经由可接受的给药途径，如静脉内注射(IV)重复施用161P2F10BMAb制品，剂量范围一般包括但不限于0.1，.2，.3，.4，.5，.6，.7，.8，.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20或25mg/kg体重。一般说来，每周10-1000mg MAb是有效的并且能被较好地耐受。
基于用Herceptin(曲司珠单抗(Trastuzumab))治疗转移的乳腺癌的临床经验，可接受的剂量方案是原始静脉内负荷剂量约为4mg/kg患者体重，接着，每周的静脉内剂量约为2mg/kg MAb制品。优选以90分钟或更长时间的输注施用原始负荷剂量。如果原始剂量能被较好地耐受，以30分钟或更长时间的输注施用周期维持剂量。本领域技术人员懂得多种因素可影响具体病例的理想剂量方案。所述因素包括例如所用Ab或MAb的结合亲和性和半寿期、患者中的161P2F10B表达水平、循环流出161P2F10B抗原的程度、所需的稳态抗体浓度水平、治疗频率和与本发明的治疗方法联合使用的化疗剂或其它药剂的影响、以及特定患者的健康状况。
任选评价患者的给定样品中161P2F10B的水平(例如循环161P2F10B抗原和/或表达161P2F10B的细胞的水平)，以辅助确定最有效的剂量方案等。所述评价也可用于治疗过程中的监测，并可用于与其它参数(如膀胱癌疗法中的尿细胞学和/或ImmunoCyt水平，或类似地，前列腺癌疗法中的血清PSA水平)的评价相结合来评价治疗是否成功。
在抗-癌疗法中，抗-独特型抗-161P2F10B抗体也可用作疫苗以引发针对表达161P2F10B-相关蛋白质的细胞的免疫应答。特别是，产生抗-独特型抗体的方法是本领域众所周知的；可以容易地改动此方法以产生模拟161P2F10B-相关蛋白质上的表位的抗-独特型抗-161P2F10B抗体(参见例如Wagner et al.，1997，Hybridoma 16：33-40；Foon et al.，1995，J.Clin.Invest.96：334-342；Herlyn et al.，1996，Cancer Immunol.Immunother.43：65-76)。所述抗-独特型抗体可用于癌症疫苗策略。
本发明的目的是提供161P2F10B MAb，它能抑制或延缓表达161P2F10B的肿瘤细胞的生长。本发明的另一个目的是提供抑制血管生成和其它生物学功能从而减少哺乳动物，优选人体内肿瘤生长的方法，所述方法使用了161P2F10B MAb，特别是在使用161P2F10B MAb的同时，还联合使用了其它药物或免疫活性疗法，包括但不限于：
(贝伐珠单抗)、
(sunitinib malate)、(Sorafinib tosylate)、
(紫杉萜(docetaxel))、白细胞介素-2(a.k.a.
IL-2或阿地白介素(Aldesleukin))或干扰素α(干扰素-α-2a或干扰素-α-2b)和其它本领域已知可用于治疗肾和其它癌症的药物。
在一个实施方案中，当联合使用161P2F10B抗体以及化疗剂或放疗或其组合治疗肿瘤，包括人肿瘤时，会产生协同作用。换句话说，当与化疗剂或放疗或其组合联合使用时，161P2F10B抗体对肿瘤生长的抑制作用会比预期的有所增强。例如，联合治疗对肿瘤生长的抑制作用比仅用161P2F10B抗体治疗的预期效果，或使用161P2F10B抗体和化疗剂或放疗的叠加效果更强，这一点即可显示出协同作用。优选通过癌症的缓解阐明协同作用，其中用裸露的161P2F10B抗体治疗或使用161P2F10B抗体和化疗剂或放疗的组合治疗预期都不能导致癌症的缓解。
使用161P2F10B抗体和化疗剂或放疗或两者的组合抑制肿瘤细胞生长的方法包括：在开始化疗或放疗之前、期间或之后及其任意组合(即在开始化疗和/或放疗之前和期间，之前和之后，期间和之后，或之前，期间和之后)施用161P2F10B抗体。例如，一般在开始放疗和/或化疗之前的1至60天，优选3至40天，更优选5至12天施用161P2F10B抗体。然而，根据治疗方案和患者特殊需求的不同，应以能提供最有效的治疗并最终延长患者生命为宗旨来实施所述方法。
可以多种方式施用化疗剂，包括通过非肠道和肠道途径全身给药。在一个实施方案中，161P2F10B抗体和化疗剂被当成独立的分子给药。在另一个实施方案中，161P2F10B抗体通过例如偶联与化疗剂结合(参见题为“通过使用161P2F10B MAb治疗和诊断人癌症的人临床试验”)。化疗剂或化疗的特别例子包括：顺铂、达卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、更生霉素(dactinomycin)、mechlorethamine(氮芥)、链脲菌素(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、亚德利亚霉素(adriamycin)、道诺红菌素、丙卡巴腈(procarbazine)、丝裂霉素、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷、氨甲蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、长春花碱、长春花新碱、博来霉素(bleomycin)、紫杉醇(paclitaxel)、紫杉萜(taxotere)、阿地白介素(aldesleukin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、克拉立滨(cladribine)、达卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、羟脲(hydroxyurea)、宜佛斯酰胺(ifosfamide)、干扰素α、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、戊制菌素(pentostatin)、pipobroman、他莫昔芬(tamoxifen)、表鬼臼毒噻吩糖苷(teniposide)、testolactone、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、脱水长春花碱(vinorelbine)、氯氨布西(chlorambucil)、紫杉醇及其组合。
与161P2F10B MAb联合使用的放射源可以置于待治疗患者的体外或体内。当放射源位于患者体外时，疗法为外部射线放疗(EBRT)。当放射源位于患者体内时，治疗被称为短疗法(brachytherapy)(BT)。
上述治疗方案可进一步与其它癌症治疗剂和/或治疗方案联合使用，例如其它化疗、癌症疫苗、信号转导抑制剂、用于治疗异常细胞生长或癌症的药剂、能通过与IGF-1R结合抑制肿瘤生长的抗体(如WO/2005/092380中所述的抗-CTLA-4抗体(Pfizer))或其它配体、以及细胞因子。
当给予哺乳动物其它化疗时，可使用上述化疗剂。另外，也可使用生长因子抑制剂、生物反应修饰剂、抗-激素疗法、选择性雌激素受体调制剂(SERM)、血管生成抑制剂和抗-雄激素。例如，可使用抗-激素，如抗-雌激素，如Nolvadex(他莫昔芬)或抗-雄激素，如Casodex(4′-氰-3-(4-氟苯磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3-′-(三氟甲基)丙酰苯胺)。
在本发明的一些实施方案中，上述方法与癌症疫苗联合使用。有用的疫苗可以是，但不限于含有癌症-相关抗原(如BAGE，癌胚抗原(CEA)，EBV，GAGE，gp100(包括gp100：209-217和gp100：280-288等)，HBV，HER-2/neu，HPV，HCV，MAGE，乳珠蛋白，MART-1/Melan-A，黏蛋白-1，NY-ESO-1，蛋白酶-3，PSA，RAGE，TRP-1，TRP-2，酪氨酸酶(如酪氨酸酶：368-376)，WT-1)的疫苗，GM-CSF DNA和基于细胞的疫苗，树状细胞疫苗，重组病毒(如痘苗病毒)疫苗和热休克蛋白(HSP)疫苗。有用的疫苗还包括肿瘤疫苗，如由黑素瘤细胞形成的疫苗，这些疫苗可以是自体的或是同种异体的。疫苗可以是例如肽、DNA或基于细胞的。这些不同的药剂可以联合使用，以使特别包括gp100肽、酪氨酸酶和MART-1的组合能与抗体一起施用。
可以在干细胞移植之前或之后施用疫苗，当化疗是治疗方案的一部分时，可在化疗前施用疫苗。在一些实施方案中，也可在化疗之前施用本发明的抗体。也可在干细胞移植之后施用疫苗，在一些实施方案中，在施用抗体的同时施用疫苗。
上述疗法也可与信号转导抑制剂一起使用，如能抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的药剂，如EGFR抗体、EGF抗体和能用作EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体和能抑制VEGF的分子；以及erbB2受体抑制剂，如能与erbB2受体结合的有机分子或抗体。
EGFR抑制剂描述于例如WO 95/19970(公开于1995年7月27日)，WO98/14451(公开于1998年4月9日)，WO 98/02434(公开于1998年1月22日)和美国专利5,747,498(1998年5月5日公布)，如本文所述，这些物质能用于本发明。EGFR-抑制剂包括但不限于单克隆抗体ERBITUX(ImClone SystemsIncorporated，New York，N.Y.)和ABX-EGF(Abgenix Inc.，Fremont，Calif.)，化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.，Annandale，New.Jersey)和OLX-103(Merck & Co.，Whitehouse Station，N.J.)，VRCTC-310(Ventech Research)和EGF融合毒素(Seragen Inc.，Hopkinton，Mass.)。这些和其它EGFR-抑制剂可用于本发明。
VEGF抑制剂，例如SU-5416和SU-6668(Sugen Inc.，South San Francisco，Calif.)也可与抗体联合使用。VEGF抑制剂描述于例如WO 99/24440(公开于1999年5月20日)，PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年5月3日提交)，WO95/21613(公开于1995年8月17日)，WO 99/61422(公开于1999年12月2日)，美国专利5,834,504(1998年11月10日公布)，WO 98/50356(公开于1998年11月12日)，美国专利5,883,113(1999年3月16日公布)，美国专利5,886,020(1999年3月23日公布)，美国专利5,792,783(1998年8月11日公布)，WO99/10349(公开于1999年3月4日)，WO 97/32856(公开于1997年9月12日)，WO97/22596(公开于1997年6月26日)，WO 98/54093(公开于1998年12月3日)，WO 98/02438(公开于1998年1月22日)，WO 99/16755(公开于1999年4月8日)和WO 98/02437(公开于1998年1月22日)。可用于本发明的其它一些具体VEGF抑制剂的例子为：IM862(Cytran Inc.，Kirkland，Wash.)；IMC-1C11Imclone抗体和angiozyme，一种得自Ribozyme(Boulder，Colo.)和Chiron(Emeryville，Calif.)的合成核酶。
另外，erbB2受体抑制剂，如GW-282974(Glaxo Wellcome)以及单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.，TheWoodlands，Tex.)和2B-1(Chiron)可与抗体联合使用，所述抗体公开于例如WO 98/02434(公开于1998年1月22日)，WO 99/35146(公开于1999年7月15日)，WO 99/35132(公开于1999年7月15日)，WO 98/02437(公开于1998年1月22日)，WO 97/13760(公开于1997年4月17日)，WO 95/19970(公开于1995年7月27日)，美国专利5,587,458(公布于1996年12月24日)和美国专利5,877,305(公布于1999年3月2日)。可用于本发明的erbB2受体抑制剂也描述于EP1029853(公开于2000年8月23日)和WO 00/44728(公开于2000年8月3日)。上述PCT申请、美国专利和美国临时申请中描述的erbB2受体抑制剂化合物和物质，以及能抑制erbB2受体的其它化合物和物质可与本发明的抗体一起使用。
本发明的治疗方案也可与通过结合IGF-1R(胰岛素-样生长因子1受体)而抑制肿瘤生长的抗体或其它配体联合使用。可用于本发明的具体抗-IGF-1R抗体包括2001年12月20日提交的PCT申请PCT/US01/51113(公开号为WO02/053596)中描述的那些。
本文所述的治疗方案可与抗-血管生成药剂联合使用，例如，MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂可与本发明方法中的抗体联合使用。有用COX-II抑制剂的例子包括CELEBREX(celecoxib)、valdecoxib和rofecoxib。
X.C.)161P2F10B用作细胞免疫应答的靶
本发明的其它实施方案是疫苗和制备疫苗的方法，所述疫苗含有免疫原性有效量的一种或多种本文所述的HLA-结合肽。另外，本发明的疫苗包含一种或多种所要求肽的组合物。肽可以单独存在于疫苗中。或者，肽可以作为含有多拷贝相同肽的同聚物存在，或作为与多种肽的异聚物存在。聚合物的优点是能增强免疫反应，当使用不同的肽表位组成聚合物时，还能诱导产生与病原体生物的不同抗原决定簇或免疫应答所靶向的肿瘤-相关肽反应的抗体和/或CTL。组合物可以是抗原的天然区域，通过例如重组或化学合成即可制备所述组合物。
可与本发明疫苗一起使用的载体是本领域众所周知的，包括例如甲状腺球蛋白、如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、如聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸的聚氨基酸、流感病毒、乙肝病毒核心蛋白质等。疫苗可含有生理可耐受的(即可接受的)稀释剂，如水、或盐水，优选为磷酸缓冲盐水。疫苗一般还包括佐剂。如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾的佐剂是本领域众所周知的佐剂材料的例子。另外，如本文所公开的，通过使本发明的肽与脂质，如三棕榈酰基(tripalmitoyl)-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)偶联，可以引发CTL反应。另外，已发现诸如含有合成的胞嘧啶-硫代磷酸化-鸟嘌呤(CpG)的寡核苷酸的佐剂可将CTL反应增强10至100倍(参见例如Davila and Celis，J.Immunol.165：539-547(2000))。
通过经由注射、气溶胶、口服、经皮、经粘膜、胸膜内、鞘内或其它适当途径用本发明的肽组合物进行免疫接种，宿主的免疫系统通过产生大量特异于所需抗原的CTL和/或HTL对疫苗作出反应。结果，宿主至少对后来产生的表达或过表达161P2F10B抗原的细胞产生了部分免疫力，或当抗原是肿瘤-相关抗原时，至少能获得一些治疗上的益处。
在一些实施方案中，需要组合使用I类肽组分与能诱导或促进针对靶抗原的中和抗体和或辅助T细胞反应的组分。所述组合物的优选实施方案含有本发明的I类和II类表位。所述组合物的另一个可选择的实施方案含有本发明的I类和/或II类表位以及交叉反应的HTL表位，如PADRETM(Epimmune，San Diego，CA)分子(描述于例如美国专利5,736,142)。
本发明的疫苗也可包括抗原-呈递细胞(APC)，如树状细胞(DC)作为呈递本发明肽的载体。在活动化和收集树状细胞之后，可以在体外产生疫苗组合物，从而在体外进行树状细胞的荷载。例如，用例如根据本发明的小基因转染树状细胞，或用肽脉冲树状细胞。接着可以将树状细胞施用于患者以在体内引发免疫反应。无论是基于DNA或肽的疫苗组合物也可以与树状细胞活动化联合体内给药，从而在体内进行树状细胞的荷载。
优选地，当选择包括在用于疫苗的多表位合成物中的表位阵列时，或选择包括在疫苗中和/或由核酸如小基因编码的离散表位时，采用下述原则。优选平衡下列原则的每一种以进行选择。包括在给定疫苗组合物的多个表位可以是，但不一定是获得表位的天然抗原中的邻近序列。
1.)选择表位，所述表位经给药后可模拟经观察与肿瘤清除相关的免疫应答。对HLA I类而言，这包括来自至少一个肿瘤相关抗原(TAA)的3-4个表位。对HLA II类而言，采用类似的原理；由至少一个TAA再选择3-4个表位(参见例如Rosenberg et al.，Science 278：1447-1450)。来自一个TAA的表位可以与来自一个或多个其它TAA的表位联合使用，以生产靶向肿瘤的疫苗，所述肿瘤具有频繁表达的TAA的不同表达模式。
2.)选择表位，所述表位具有已确定与免疫原性相关的必须的结合亲和性：对HLA I类而言，IC50为500nM或更低，通常为200nM或更低；对II类而言，IC50为1000nM或更低。
3.)选择足够的携有超基元的肽或足够的携有等位基因特异性基元的肽阵列来给予广泛的种群覆盖面。例如，优选具有至少80％的种群覆盖面。MonteCarlo分析，一种本领域已知的统计评估，可以被用于评估种群覆盖的范围或冗余。
4.)当从癌症相关抗原中选择表位时，由于患者可以已产生对天然表位的耐受性，选择类似物通常是有益的。
5.)特别相关的表位指的是“嵌套表位”。在给定肽序列至少两个表位的重叠处出现嵌套表位。嵌套肽序列可以包括B细胞、HLA I类和/或HLA II类表位。当提供嵌套表位时，一个通常的目的是每个序列提供最大数目的表位。因此，一方面是为了避免提供比肽序列中氨基端表位的氨基端和羧基端表位的羧基端长的肽。当提供一个多表位序列，例如含有嵌套表位的序列时，筛选序列以确定其不具有病理的或其它有害的生物特性通常是很重要的。
6.)如果制备多表位蛋白质或制备小基因时，目的是产生最小的包含感兴趣表位的肽。这一原则与选择具有嵌套表位的肽时采用的原则如果不相同也是类似的。然而，对于人工的多表位肽，最小化的目的与在多表位蛋白质的表位间整合任意间隔序列的需要相平衡。例如，可以引入间隔氨基酸残基以避免连接表位(被免疫系统识别的表位，不存在于靶抗原中，且只由人工并列表位产生)，或辅助表位间的裂解，从而增强表位呈递。通常应当避免连接表位，因为接受者可能对非天然表位产生免疫应答。特别关注的是身为“决定簇表位”的连接表位。决定簇表位可能导致强烈的应答，从而使对其它表位的免疫应答减低或抑制。
7.)当同一靶蛋白的多个变体的序列存在时，也可以基于它们的保守性选择潜在的肽表位。例如，保守性的原则可定义为，HLA I类结合肽的全序列或II类结合肽的整个9-聚体核心，在被评价特异性蛋白质抗原的指定比例的序列中保守。
X.C.1.小基因疫苗(minigene vaccine)
可以使用多种不同的允许同时传递多个表位的方法。编码本发明的肽的核酸是本发明的特别有用的实施方案。根据前一部分列出的指南，优选在包含在小基因中的表位。优选的施用编码本发明肽的核酸的方式使用了编码含有一个或多个本发明表位的肽的小基因构建体。
多表位小基因的应用如下文和Ishioka et al，J.Immunol.162：3915-3925，1999；An，L.and Whitton，J.L.，J.Virol.71：2292，1997；Thomson，S.A.et al，J.Immunol.157：822，1996；Whitton，J.L.et al.，J.Virol.67：348，1993；Hanke，R.et al，Vaccine 16：426，1998所述。例如，可对多表位DNA质粒进行改造，所述质粒编码得自161P2F10B的携有超基元和/或基元的表位，PADRETM通用辅助T细胞表位或得自161P2F10B的多个HTL表位，以及内质网转运信号序列。疫苗也可以包括得自其它TAA的表位。
多表位小基因的免疫原性可以在转基因小鼠中确定，以评估CTL诱导的针对受试表位的反应。另外，体内DNA编码的表位的免疫原性可以与特定CTL系针对用DNA质粒转染的靶细胞的体外反应相关联。因此，这些实验可以表明小基因用于：1.)产生CTL应答以及2.)诱导的CTL识别表达编码表位的细胞。
例如，为产生编码选择表位的DNA序列(小基因)以在人细胞中表达，表位的氨基酸序列可以被反向翻译。人密码子使用表可以用来指导每个氨基酸的密码子选择。这些编码表位的DNA序列可以直接连接，使得当被翻译时可产生连续的多肽序列。为了最优化表达和/或免疫原性，可以向小基因设计中加入附加的元件。可以反向翻译并包含在小基因序列中的氨基酸序列实例包括：HLA I类表位，HLA II类表位，抗体表位，遍在蛋白化信号序列和/或内质网靶向信号。另外，CTL和HTL表位的HLA呈递可以通过包括合成的(例如多聚丙氨酸)或天然的与CTL或HTL表位相邻的侧翼序列来改善，这些含有表位的较大的肽也在本发明的范围内。
可以通过装配编码小基因正链和负链的寡核苷酸将小基因序列转化为DNA。可以在适宜的条件下用众所周知的技术合成、磷酸化、纯化和退火重叠寡核苷酸(长30-100个碱基)。寡核苷酸的末端可以用例如T4DNA连接酶连接，这一合成的编码表位多肽的小基因可以克隆入一个所需的表达载体。
优选将本领域技术人员已知的标准调节序列包括在载体中以确保靶细胞中的表达。需要一些载体元件：具有下游克隆位点共小基因插入的启动子；有效终止转录的聚腺苷酸信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择标记(如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。为此可采用多种启动子，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子，其它合适的启动子序列可参见例如美国专利5,580,859和5,589,466。
可能需要其它的载体修饰来优化小基因的表达和免疫原性。在一些情况下，有效的基因表达需要内含子，一个或多个合成或天然的内含子可以掺入小基因的转录区域。为增加小基因的表达，也可以考虑包括mRNA稳定序列和在哺乳动物细胞中复制所需的序列。
一旦选择了表达载体，将小基因克隆入启动子下游的多接头区域。将该质粒转化至适宜的大肠杆菌菌株，用标准技术制备DNA。用限制性图谱和DNA序列分析确定小基因的方向和DNA序列以及载体中包括的其它所有元件。含有正确质粒的细菌细胞可以保存为主细胞库和工作细胞库。
另外，免疫刺激序列(ISS或CpG)似乎在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果需要提高免疫原性，这些序列可以包括在载体中，位于小基因编码序列的外部。
在一些实施方案中，可以采用允许同时产生小基因编码表位和第二种蛋白质(包括在内以提高或降低免疫原性)的双顺反子表达载体。共表达可以有益地提高免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括：细胞因子(如IL-2，IL-12，GM-CSF)、细胞因子诱导分子(如LeIF)、共刺激分子，或对于HTL应答而言的pan-DR结合蛋白(PADRETM，Epimmune，San Diego，CA)。辅助(HTL)表位可以与细胞内靶向信号相结合，并与表达的CTL表位分开表达；这允许指引HTL表位进入与CTL表位不同的细胞区室。必要时，这有助于HTL表位更有效地进入HLA II类途径，因此改善HTL诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过共表达免疫抑制分子(例如TGF-β)特异性降低免疫应答在一些疾病中是有益的。
可以通过例如在大肠杆菌中发酵然后纯化来制备治疗量的质粒。根据众所周知的技术，将工作细胞库的等分试样用于接种生长培养基，生长至在摇瓶或生物反应器中饱和。质粒DNA可以用标准的生物分离技术纯化，例如QIAGEN Inc.(Valencia，California)提供的固相阴离子交换树脂。如果需要，可以用凝胶电泳或其它方法从开环和线性形式中分离出超螺旋DNA。
可以用多种制剂制备纯化的质粒DNA用于注射。最简单是将冷冻的DNA在无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中重建。已知为“裸DNA”的该方法目前在临床试验中被用于肌内(IM)注射。为使小基因DNA疫苗的免疫治疗效果最大化，需要一个可选择的配制纯化质粒DNA的方法，已经描述了多种方法，也可以使用新技术。阳离子脂质、糖脂和融合脂质体也可以用在配方中(参见例如WO93/24640；Mannino & Gould-Fogerite，BioTechniques6(7)：682(1988)；美国专利5,279,833；WO91/06309；和Felgner，et al，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 84：7413(1987))。另外，总称为保护性、有活性的、非凝聚化合物(PINC)的肽和化合物可以与纯化的质粒DNA复合以影响例如稳定性、肌内分散或到达特定器官或细胞类型的变量。
靶细胞致敏可以用作小基因编码的CTL表位的表达和HLA I类呈递的功能性分析。例如，将质粒DNA引入适宜用作标准CTL铬释放试验的靶的哺乳动物细胞系。所用转染方法将依赖于最终的配方。电穿孔可以用于“裸”DNA，而阳离子脂质允许介导体外转染。表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒可以被共转染以用荧光激活的细胞分选(FACS)富集转染的细胞。接着将这些细胞用硌-51(51Cr)标记，并用作表位特异性CTL系的靶细胞；通过51Cr释放检测到的细胞裂解暗示小基因编码的CTL表位的产生和HLA呈递。可以用与评估HTL活性类似的方式评估HTL表位的表达。
体内免疫原性是功能性测定小基因DNA配方的第二种方法。用DNA产物免疫表达合适的人HLA蛋白的转基因小鼠。给药剂量和途径依赖于配方(例如，PBS中的DNA用IM，与脂质复合的DNA用腹膜内(i.p.)注射)。免疫后21天，收集脾细胞并在编码每个被测定表位的肽的存在下重新刺激一周。然后，对于CTL效应细胞，用标准技术对荷载有肽的经51Cr标记的靶细胞的细胞裂解进行分析。用带有与小基因编码的表位相对应的肽表位的HLA致敏的靶细胞的裂解显示了DNA疫苗用于体内诱导CTL的功能。用类似方式在转基因小鼠内确定HLT表位的免疫原性。
可选地，核酸可以用所述的弹道传递方式给药，例如美国专利5,204,253。采用这一技术，施用仅含有DNA的颗粒。在进一步可选的实施方案中，DNA可以被粘附在颗粒上，例如金粒。
小基因也可以用现有技术中已知的其它细菌或病毒传递系统传递，例如，编码本发明表位的表达构建体可以掺入病毒载体，例如痘苗病毒。
X.C.2.CTL肽与辅助肽的组合
含有本发明CTL肽的疫苗组合物可以被修饰，例如类推以提供需要的属性，例如提高的血清半寿期、扩大的种群覆盖率或提高的免疫原性。
例如，肽诱导CTL活性的能力可以通过将肽与含有至少一个可以诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接而提高。尽管CTL肽可以直接与T辅助肽相连，通常是CTL表位/HTL表位偶联物通过间隔分子相互连接。间隔分子通常由相对较小的中性分子，如在生理条件下基本上不带电的氨基酸或氨基酸类似物组成。间隔分子通常选自例如Ala，Gly或其它非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔分子。可以理解：任选的间隔分子不必由相同的残基组成，因此可以是异源或同源的寡聚体。当出现时，间隔分子通常至少有1或2个残基，更常见的是3到6个残基，有时为10个或更多的残基。CTL肽表位可以与T辅助肽表位直接连接或通过间隔分子在CTL肽的氨基端或羧基端连接。免疫原性肽或T辅助肽的氨基端均可被酰化。
HTL肽表位也可以被修饰来改变其生物特性。例如，它们可以被修饰为包含D-氨基酸来提高它们对蛋白酶的抗性，因此延长了它们的血清半寿期。或它们可以与其它分子，例如脂质、蛋白质、糖类等偶联以提高它们的生物活性。例如，T辅助肽可以与一个或更多棕榈酸链的氨基或羧基端连接。
X.C.3.CTL肽与T细胞引发剂的组合
在一些实施方案中，也许需要将至少一种能引发B淋巴细胞或T淋巴细胞的成分包括在本发明的药物组合物中。已经确定脂质是一种可以在体内引发CTL的试剂。例如，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的ε-和α-氨基基团，然后经由例如一个或更多个连接残基例如Gly，Gly-Gly-，Ser，Ser-Ser等连接到免疫原性肽上。脂化肽可以直接在微胶粒或颗粒中，掺入脂质体，或在如不完全弗氏佐剂的佐剂中乳化以进行给药。在优选的实施方案中，一种显著有效的免疫原性组合物含有与Lys的ε-和α-氨基基团结合的棕榈酸，其通过接头，例如Ser-Ser，与免疫原性肽的氨基端结合。
作为另一个脂质引发CTL应答的例子，大肠杆菌脂蛋白，例如与适合的肽共价连接的三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)可以用来引发病毒特异性的CTL(参见例如Dereset al，Nature 342：561，1989)。本发明的肽可以与P3CSS偶联，例如，给予个体脂肽以特异性引发针对靶抗原的免疫应答。另外，由于中和抗体的诱导也可以用与P3CSS偶联的表位引发，两个这样的组合物可以联合使用从而更有效地引发体液和细胞介导的应答。
X.C.4.含有用CTL和/或HTL肽脉冲的DC的疫苗组合物
本发明的疫苗组合物实施方案包括给患者血液中的PBMC或从中分离的DC来自体外地施用携有表位的肽的混合物。可以使用有助于收集DC的药物，例如，ProgenipoietinTM(Pharmacia-Monsanto，St.Louis，MO)或GM-CSF/IL-4。在用肽脉冲DC后，以及再输注于患者之前，冲洗DC以去除未结合的肽。在该实施方案中，疫苗包含肽脉冲的DC，在其表面存在与HLA分子复合的脉冲肽表位。
DC可以用肽混合物来自体外地脉冲，其中一些刺激针对161P2F10B的CTL应答。任选地，辅助T细胞(HTL)肽，例如天然或人工松弛限制的HLA II类肽，可以包括在内以便于CTL应答。因此本发明的疫苗可用来治疗表达或过表达161P2F10B的癌症。
X.D.)过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)
抗原性161P2F10B相关肽也可用于来自体外地引发CTL和/或HTL应答，得到的CTL或HTL细胞可以用来治疗那些对其它常规形式的治疗没有反应，或对治疗性疫苗肽或本发明的核酸没有反应的肿瘤患者。通过在组织培养物中将患者的或遗传相容的CTL或HTL前体细胞与抗原呈递细胞(APC)来源，如树状细胞，和适宜的免疫原性肽共同保温，诱导对特定抗原的来自体外的CTL或HTL应答。在合适的保温时间后(通常大约7-28天)，其中前体细胞被活化并扩展为效应细胞，将细胞回输至患者体内，在那里它们将破坏(CTL)或促进破坏(HTL)它们特异性的靶细胞(例如，肿瘤细胞)。转染的树状细胞也可以用作抗原呈递细胞。
X.E.)为了治疗或预防的目的施用疫苗
本发明的药物和疫苗组合物通常用于治疗和/或预防表达或过表达161P2F10B的癌症。在治疗性应用中，以足够引发针对抗原的有效B细胞、CTL和/或HTL应答，和治愈或至少部分遏制或减缓症状和/或并发症的量，给患者施用肽和/或核酸组合物。足够完成这些目的的量被定义为“治疗有效剂量”。这种应用的有效量取决于例如，施用的特定组合物、给药的方式，被治疗疾病的阶段和严重程度、患者的体重和一般健康状况以及开药医师的判断。
对于药物组合物，本发明的免疫原性肽或编码它们的DNA，通常被给与已经患有表达161P2F10B的肿瘤的个体。肽或编码它们的DNA可以单独或作为一个或多个肽序列的融合物给药。可以单独用免疫原性肽或适当时与其它疗法，如外科手术联合治疗患者。
对于治疗性应用，给药通常应该从161P2F10B相关癌的首次诊断开始。然后加强剂量直到至少症状实质上减轻以及一段时间以后。给与患者的疫苗组合物的实施方案(即包括但不限于如肽混合物，多表位多肽，小基因或TAA-特异性CTL或脉冲树状细胞的实施方案)可依照疾病的阶段或患者的健康状态调整。例如，在表达161P2F10B的肿瘤患者中，含有161P2F10B-特异性CTL的疫苗可以在患有更高阶段疾病的患者体内，比可选择的实施方案更有效地杀灭肿瘤细胞。
提供一定量的通过足以有效刺激细胞毒T细胞应答的给药模式传递的肽表位一般是重要的；根据本发明的此实施方案，也可提供刺激辅助T细胞应答的组合物。
起始治疗性的免疫剂量通常在单位剂量的范围内，较低值大约为1，5，50,500或1,000μg，较高的值约为10,000；20,000；30,000；或50,000μg。人的剂量值范围典型地为大约500μg到大约50,000μg每70公斤患者体重。遵照数周至数月的加强方案，大约1.0μg到50,000μg的加强剂量的肽，依照通过测量从患者血液中获得的CTL和HTL比活性确定的患者应答和情况而给药。给药应该持续直到至少临床症状或实验检测表明肿瘤已经被除去或缩小并达一段时间之后。根据本领域已知的方法学调整剂量、给药途径和剂量时间表。
在一些实施方案中，本发明的肽和组合物在严重的疾病状态中使用，即威胁生命的或可能威胁生命的情形。在这种情形下，本发明的优选组合物中存在最小量的外来物质和肽的相对无毒的性质的结果，治疗医师可能和觉得需要相对于规定的剂量给予实质上超量的肽组合物。
本发明的疫苗组合物也能被单纯用作预防剂。通常起始预防免疫的剂量为单位剂量，较低值约为1，5，50，500或1000μg，较高值约为10,000；20,000；30,000或50,000μg。通常的人用剂量值为大约500μg到大约50,000μg每70公斤患者体重。在首次施用疫苗后，以确定的大约4周至6个月的间隔，给予约1.0μg到50,000μg的加强剂量的肽。可以通过测量从患者的血样获得的CTL和HTL比活来评估疫苗的免疫原性。
治疗性处理的药物组合物可以非肠道、表面局部(topical)、口服、鼻饲、鞘内或局部(local)(如作为乳膏或表面局部软膏)给药。优选地，药物组合物被非肠道给药，例如，静脉内、皮下、皮内或肌内给药。因此，本发明提供了含有溶解或悬浮在可接受载体，优选为含水载体中的免疫原性肽溶液的非肠道给药组合物。
可以采用多种含水载体，例如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些成分可用传统又众所周知的灭菌技术消毒，或经过滤变得无菌。产生的水溶液可被包装以备使用或冻干，在给药之前将冻干的制剂与无菌溶液混合。
组合物可包含药物可接受的接近生理条件所需的辅助物质，如pH-调节和缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂、防腐剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单十二酸酯、三乙醇胺油酸盐等。
本发明的肽在药物制剂中的浓度可以有很大的不同，即从占重量小于约0.1％，通常为或至少为大约2％到多达20％至50％或更多，而且将根据选择的特定给药模式，主要通过液体体积，粘度等进行选择。
组合物的人用单位剂量形式通常包括在含有人单位剂量可接受载体的药物组合物中，在一个实施方案中，所述载体是含水载体，以本领域技术人员已知的用于将这种组合物施用于人类的体积/用量进行给药(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，17 Edition，A.Gennaro，Editor，MackPublishing Co.，Easton，Pennsylvania，1985)。例如，对于一个70公斤的患者，起始免疫的肽剂量可为大约1到大约50,000μg，通常为100-5,000μg。例如，对于核酸来说，可以使用在多个位点以0.5-5毫克的量IM(或SC或ID)给药的裸核酸形式的表达载体进行初次免疫。核酸(0.1到1000μg)也能用基因枪给药。在3-4周的保温期后，施用加强剂量的药物。加强剂量可以是以5×107到5×109pfu剂量给药的重组禽痘病毒。
对于抗体，治疗通常包括抗161P2F10B抗体制剂经由多种可接受的给药途径，例如静脉内注射(IV)的重复给药，剂量范围通常约为0.1到约10mg/kg体重。大体上，每周剂量为10-500mg MAb是有效的并能被较好耐受。而且，约为4毫克/公斤患者体重的起始IV荷载剂量，接着每周大约2毫克/公斤IV剂量的抗161P2F10B MAb制剂代表了可接受的剂量方案。如本领域熟练技术人员所知，各种因素能影响特定病例的理想剂量。这些因素包括例如组合物的半寿期、Ab的结合亲和力、物质的免疫原性、患者中161P2F10B的表达程度、161P2F10B抗原循环流出的程度、所需的稳态浓度水平、治疗的频率和与本发明治疗方法联合使用的化疗或其它试剂的影响、以及特定患者的健康状态。非限制的优选人单位剂量为例如：500μg-1mg，1mg-50mg，50mg-100mg，100mg-200mg，200mg-300mg，400mg-500mg，500mg-600mg，600mg-700mg，700mg-800mg，800mg-900mg，900mg-1g或1mg-700mg。在一些实施方案中，剂量范围为2-5mg/kg体重，例如接着施用1-3mg/kg的每周剂量；0.5mg，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mg/kg体重，接着例如在2，3或4个星期中施用每周剂量；0.5-10mg/kg体重，例如在2，3或4个星期中施用每周剂量；每周225，250，275，300，325，350，375，400mg/m2身体表面积；每周1-600mg/m2身体表面积；每周225-400mg/m2身体表面积；然后可以实行2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多周的每周剂量。
在一个实施方案中，多核苷酸的人单位剂量形式包含能提供任何治疗效果适当剂量范围或有效量。如本领域技术人员所知，治疗效果取决于多个因素，包括多核苷酸序列，多核苷酸的分子量和给药途径。通常由医师或其它的保健专业人士根据本领域已知的多种参数，如症状严重程度、患者病史等来选择剂量。通常，对大约20个碱基的多核苷酸而言，剂量值范围可选自例如独立挑选的下限，如大约0.1，0.25，0.5，1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400或500mg/kg直到独立挑选的比下限大的上限，如大约60，80，100，200，300，400，500，750，1000，1500，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000或10,000mg/kg。例如，剂量可能为大约下列任何一项：0.1到100mg/kg，0.1到50mg/kg，0.1到25mg/kg，0.1到10mg/kg，1到500mg/kg，100到400mg/kg，200到300mg/kg，1到100mg/kg，100到200mg/kg，300到400mg/kg，400到500mg/kg，500到1000mg/kg，500到5000mg/kg或500到10,000mg/kg。通常，与更直接地将核酸应用于生病组织相比，非肠道途径给药需要较高剂量的多核苷酸，增加长度的多核苷酸也是如此。
在一个实施方案中，人单位剂量形式的T细胞含有能提供任意治疗效果的适当剂量范围或有效量。如本领域普通技术人员所知，治疗效果依赖于多个因素。通常由医师或其它的保健专业人士根据已知的多种参数，如症状严重程度，患者病史等来选择剂量。剂量可以为大约104个个细胞至大约106个细胞，大约106个细胞至大约108个细胞，大约108个到大约1011个细胞，或大约108个到大约5×1010个细胞，也可以为大约106个细胞/m2到大约1010个细胞/m2，或大约106细胞/m2到大约108细胞/m2。
本发明的蛋白质和/或编码蛋白质的核酸也可以通过脂质体给药，所述脂质体可用于：1)使蛋白质靶向特定的组织，如淋巴组织；2)选择性靶向疾病细胞；或3)增加肽组合物的半寿期。脂质体包括乳剂、泡沫、微胶粒、不溶解的单层、液晶、磷脂分散剂、薄片层等。在这些制剂中，被传递的肽可作为脂质体的一部分单独地、或与能和淋巴细胞中普遍存在的受体结合的分子(例如结合CD45抗原的单克隆抗体)，或与其它治疗性的或免疫原性组合物联合被掺入。因此，用本发明所需的肽填充或修饰的脂质体可被递送到淋巴细胞的位点，在那儿脂质体输送肽组合物。本发明所用的脂质体由标准的小泡形成脂质形成，通常包括中性和带负电的磷脂和固醇，例如胆固醇。脂质的选择通常考虑例如，脂质体大小、血流中脂质体的酸易变性和稳定性。多种方法可用来制备脂质体，如Szoka et al，Ann Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369所描述的。
为靶向免疫系统的细胞，掺入脂质体的配体包括例如特异性针对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇的抗体或其片段。含肽脂质体悬浮液可以静脉内、局部、外用等方式，以根据给药方式、传递的肽和治疗疾病的阶段调整的剂量给药。
对于固体组合物，可采用传统的无毒固体载体，包括例如药学等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过组合任意通常采用的赋形剂，例如前面所列的载体，和通常为10-95％的活性成分，即一种或多种本发明的肽，更优选其浓度为25％-75％，来制备药物可接受的无毒组合物。
对于气溶胶给药，免疫原性肽优选以精细分开的形式与表面活性剂和推进剂一起应用。肽通常的重量百分比为大约0.01％-20％，优选大约1％-10％。表面活性剂当然必须是无毒的，并优选可溶解在推进剂中。这类试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸，例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric acid和油酸与多羟基脂肪醇或其环酐形成的酯或部分酯。可以采用混合酯，如混合或天然的甘油脂。表面活性剂可构成组合物重量的大约0.1％-20％，优选大约0.25-5％。组合物的平衡通常使用推进剂。必要时，载体也可包括在内，如用于鼻内传递的卵磷脂。
XI.)161P2F10B诊断和预测的实施方案
如本文公开的，161P2F10B多核苷酸、多肽、反应性细胞毒T细胞(CTL)、反应性辅助T细胞(HTL)和抗多肽抗体被用于广为人知的诊断、预测和治疗性的分析，该分析用于确定与异常细胞生长有关的疾病，如癌症，特别是表I中所列的癌症(参见例如题为“正常组织和患者样品中161P2F10B的表达分析”的实施例中所述的组织表达特异性模式和在一些癌症中的过表达)。
161P2F10B可以类推至前列腺相关抗原PSA，PSA是医疗实践者多年采用的识别和监测前列腺癌存在的原型标记(参见例如Merrill et al，J.Urol.163(2)：503-5120(2000)；Polascik et al.，J.Urol.Aug；162(2)：293-306(1999)and Fortier et al.，J.Nat.CancerInst.91(19)：1635-1640(1999))。在类似的上下文中也可以使用多种其它诊断标记，包括p53和K-ras(参见例如Tulchinsky etal.，Int J Mol Med 1999 Jul 4(1)：99-102 and Minimoto et al.，Cancer Detect Prev2000；24(1)：1-12)。因此，161P2F10B多核苷酸和多肽(以及用来识别这些分子存在的161P2F10B多核苷酸探针和抗161P2F10B抗体)和它们的特性的公开使本领域技术人员在与这些应用类似的方法，例如在多种用于确定癌症相关疾病的诊断试验中利用这些分子。
利用161P2F10B多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断方法的典型实施方案与那些已经确立的利用例如PSA多核苷酸、多肽、反应性T细胞和抗体的诊断试验类似。例如，正如PSA多核苷酸被用作探针(例如在Northern分析中，参见例如Sharief et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.33(3)：567-74(1994))和引物(例如在PCR分析中，参见例如Okegawa et al，J.Urol.163(4)：1189-1190(2000))，以在监测PSA过表达或前列腺癌转移的方法中观察PSA mRNA的存在和/或水平。本文所述的161P2F10B多核苷酸可以用同样的方式检测161P2F10B的过表达或肾和其它表达该基因的癌症的转移。可选地，正如在监测PSA蛋白过表达的方法中，PSA多肽可用来生产针对PSA的特异性抗体，从而用来观察PSA蛋白的存在或水平(参见例如Stephanet al，Urology 55(4)：560-3(2000))或前列腺细胞的转移(参见例如Alanen et al.，Pathol.Res.Pract.192(3)：233-7(1996))，本文所述的161P2F10B可以用来生产抗体，用来检测161P2F10B过表达或肾细胞和其它表达该基因的癌细胞的转移。
具体地，因为转移涉及到癌细胞从原始器官(例如肺或前列腺等)向身体不同区域(例如淋巴结)移动，确定生物样品中表达161P2F10B多核苷酸和/或多肽的细胞的存在的分析可以用来提供转移的证据。例如，当来自异常含有161P2F10B表达细胞的组织的生物样品被发现包含161P2F10B表达细胞时，这一发现预示了转移。
可选地，例如，当异常表达161P2F10B或以不同水平表达161P2F10B的生物样品中的细胞被发现表达161P2F10B或161P2F10B表达增强时(参见例如表I中所列癌症和患者样品中的161P2F10B表达等，如附图中所示)，161P2F10B多核苷酸和/或多肽可以用来提供癌症的证据。在这样的分析中，技术人员可以进一步希望通过检测生物样品中第二组织限制性标记(除161P2F10B之外)的存在来产生辅助的转移证据。
使用免疫组化鉴定组织切片中161P2F10B多肽的存在，结果表明该组织中一些细胞的状态有所改变。本领域技术人员清楚地知道抗体探测癌细胞所表达多肽的能力可用于诊断疾病的存在、病程、进展和/或肿瘤的侵占性。所述抗体还可检测与相应非-恶性组织相比，癌细胞中的多肽的有所改变的分布。
鉴于疾病状态下亚细胞蛋白质定位有所改变的现象，161P2F10B多肽和免疫原性组合物也是有用的。细胞由正常改变为疾病状态导致细胞形态学的变化，并且常常与亚细胞蛋白质定位/分布的变化有关。例如，在正常细胞中以极性方式表达的细胞膜蛋白质在患病时有所改变，导致蛋白质以非-极性的方式分布于整个细胞表面。
通过使用免疫组化方法，以MUC1和Her2蛋白的表达阐明了在疾病状态下亚细胞蛋白质定位有所改变的现象。正常上皮细胞除了一些糖蛋白的核上定位外，还具有典型的MUC1顶端分布，而恶性损害经常表现出无极性的染色模式(Diaz et al.，The Breast Journal，7；40-45(2001)；Zhang et al.，ClinicalCancer Research，4；2669-2676(1998)：Cao，et al.，The Journal ofHistochemistry and Cytochemistry，45：1547-1557(1997))。此外，正常乳腺上皮细胞为Her2蛋白阴性，或者仅表现出基底外侧分布，而恶性细胞可在整个细胞表面表达蛋白质(De Potter，et al.，International Journal of Cancer，44；969-974(1989)：McCormick，et al.，117；935-943(2002))。或者，蛋白质分布可由仅定位于表面变为包括疾病状态下的弥散的胞质表达。用MUC1可观察到这样的例子(Diaz，et al.，The Breast Journal，7：40-45(2001))。
通过免疫组化方法检测到的细胞中蛋白质定位/分布的改变也能提供与一些治疗方式的有利性相关的有价值的信息。最后一点可由下述情况阐明：在正常组织中蛋白质可以是细胞内的，但在恶性细胞中却位于细胞表面；细胞表面定位使得细胞能顺利地接受基于抗体的诊断和治疗方案。当161P2F10B发生这种蛋白质定位改变时，161P2F10B蛋白和与其相关的免疫应答非常有用。使用161P2F10B组合物能使本领域技术人员作出重要的诊断和治疗决定。
当正常情况下不会产生161P2F10B的组织中出现了该多肽时，特异于161P2F10B的免疫组化试剂也可用于检测表达161P2F10B的肿瘤的转移。
因此，161P2F10B多肽和由对其的免疫应答而产生的抗体可用于本领域技术人员已知的多种重要目的，如诊断、预测、预防和/或治疗目的。
另外，本发明的161P2F10B相关蛋白质或多核苷酸可用于治疗以过表达161P2F10B为特征的病理疾病。例如，图1中的氨基酸或核酸序列，或它们的片段可用来产生对161P2F10B抗原的免疫应答。可采用与161P2F10B反应的抗体或其它分子来调制该分子的功能，因此提供治疗性的效益。
XI.A.)抑制161P2F10B蛋白的功能
本发明包括多种抑制161P2F10B与其结合配对物结合或与其它蛋白质结合的方法和组合物以及抑制161P2F10B功能的方法。
XI.B.)用细胞内抗体抑制161P2F10B
在一个方法中，通过基因转移技术将编码与161P2F10B特异性结合的单链抗体的重组载体引入表达161P2F10B的细胞。相应的，编码的单链抗161P2F10B抗体在细胞内表达，与161P2F10B蛋白结合并因此抑制其功能。生产这种细胞内单链抗体的方法是广为人知的。这种细胞内抗体，也被称为“内体(intrabodies)”，是特异性靶向细胞内的特定区室的，在治疗的抑制活性集中的地方提供控制。这一技术已经成功地应用于现有技术中(综述见Richardson and Marasco，1995，TIBTECH vol.13)。内体已经表现出实质上减弱了其它冗余的细胞表面受体的表达(参见例如Richardsonet al，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3137-3141；Beerli et al，1994，J.Biol.Chem.289：23931-23936；Deshane et al，1994，Gene Ther.1：332-337).
单链抗体包括通过柔性接头多肽连接的重链和轻链可变区，并作为单个多肽被表达。任选地，单链抗体作为与轻链恒定区连接的轻链可变区片段被表达。通过生物工程技术将熟知的细胞内运输信号引入编码这种单链抗体的重组多肽载体，以使内体精确靶向所需的胞内区室。例如通过生物工程技术在靶向内质网的内体中掺入前导肽，和任选的如KDEL氨基酸基元的C端ER保留信号。在欲在细胞核内发挥活性的内体中通过生物工程技术加入核定位信号。为了将内体限制在质膜的胞质溶胶面，脂质组成成分被加入内体。内体也可以用于在胞质溶胶中发挥功能，例如胞质溶胶内体被用于隔离胞质溶胶内的因子，从而抑制它们向它们天然的细胞位置转运。
在一个实施方案中，内体被用于捕获细胞核内的161P2F10B，从而抑制其在细胞核内的活性。为了到达所需的靶，核靶向信号被引入这种161P2F10B内体。设计这种161P2F10B内体来与特定的161P2F10B结构域结合。在另一实施方案中，与161P2F10B蛋白特异性结合的胞质溶胶内体被用于抑制161P2F10B进入细胞核，从而抑制其在细胞核内发挥生物活性(例如防止161P2F10B与其它因子形成转录复合物)。
XI.C.)用重组蛋白质抑制161P2F10B
在另一方法中，重组分子与161P2F10B结合并因此抑制161P2F10B的功能。例如，这些重组分子防止或抑制161P2F10B与其结合配对物靠近/结合或与其它蛋白质结合。例如，这种重组分子可以包括例如161P2F10B特异性抗体分子的活性部分。在一个特定的实施方案中，161P2F10B结合配对物的161P2F10B结合结构域被改造成二聚体融合蛋白，因此该融合蛋白包含2个与人IgG，如人IgG1的Fc部分连接的161P2F10B配体结合结构域。这种IgG部分可以包含例如CH2和CH3结构域以及铰链区，但是没有CH1结构域。这种二聚体融合蛋白以可溶解的形式给予患有与161P2F10B表达相关的癌症患者，籍此，该二聚体融合蛋白与161P2F10B特异性结合，并阻断161P2F10B与其结合配对物的相互作用。用已知的抗体连接技术将这种二聚体融合蛋白进一步与多聚体蛋白质组合。
XI.D.)抑制161P2F10B的转录和翻译
本发明也包含抑制161P2F10B基因转录的多种方法和组合物。类似地，本发明也提供了抑制161P2F10B mRNA翻译成蛋白质的方法和组合物。
在一个方法中，抑制161P2F10B基因转录的方法包括使161P2F10B基因与161P2F10B反义多核苷酸接触。在另一方法中，抑制161P2F10B mRNA翻译的方法包括使161P2F10B mRNA与反义多核苷酸接触。在另一方法中，161P2F10B特异性核酶被用来裂解161P2F10B mRNA，从而抑制翻译。这种基于反义和核酶的方法也可以被导入161P2F10B基因的调节区，如161P2F10B启动子和/或增强子元件。类似地，能够抑制161P2F10B基因转录因子的蛋白质被用来抑制161P2F10B mRNA转录。多种用于前述方法中的多核苷酸和组合物已经在上面描述。反义和核酶分子在抑制转录和翻译中的应用在现有技术中已经广为人知。
其它干扰161P2F10B转录活性的抑制161P2F10B转录的因子也可以用来治疗表达161P2F10B的癌症。类似地，干扰161P2F10B加工的因子也可用于治疗表达161P2F10B的癌症。利用这种因子的癌症治疗方法也在本发明的范围内。
XI.E.)治疗策略的一般性考虑
基因转移和基因治疗技术可以用来将治疗性多核苷酸分子转移到合成161P2F10B的肿瘤细胞中(即反义，核酶，编码内体的多核苷酸和其它的161P2F10B抑制分子)。现有技术中已知有多种基因治疗方法。可以用这些基因治疗方法将编码161P2F10B反义多核苷酸、核酶、能够干扰161P2F10B转录的因子等的重组载体传递到靶肿瘤细胞中。
上述的治疗方法可以与其它多种外科手术、化疗或放疗方案结合。使用本发明的治疗方法可以使化疗(或其它治疗)降低使用剂量以及/或降低治疗频率，这对所有患者特别是那些对化疗剂毒性无法较好耐受的患者有利。
可以用多种体外和体内分析系统评估特定组合物(例如，反义，核酸酶，内体)或这些组合物的组合的抗肿瘤活性。评估治疗活性的体外试验包括细胞生长试验，软琼脂试验和其它可以指示肿瘤增殖活动的试验，能够确定治疗性组合物抑制161P2F10B与其结合配对物结合程度的结合试验等等。
在体内，161P2F10B治疗性组合物的效果可以在合适的动物模型中评估。例如，可以采用异种的肾癌模型，其中人前列腺癌外植体或者继代移种的异种移植组织被引入无免疫应答的动物，例如裸鼠或SCID小鼠(Klein etal，1997，Nature Mediane 3：402-408)。例如，PCT专利申请W098/16628和美国专利6,107,540中描述了多种人前列腺癌的异种移植物模型，所述模型能够重演原始肿瘤的发育，微转移，和疾病晚期阶段的骨转移特征的形成。用测量肿瘤形成抑制、肿瘤衰退或转移的试验可以预测功效。
评价细胞凋亡促进的体内试验有助于评估治疗性组合物。在一个实施方案中，可以检测用治疗性组合物治疗的含有肿瘤异种移植物的小鼠中是否存在细胞凋亡病灶，并与未治疗的携有异种移植物的对照小鼠相比较。被治疗小鼠的肿瘤中发现细胞凋亡病灶的程度提供了组合物治疗效果的指示。
在前述方法的实践中用到的治疗性组合物可以被配制成含有适于所需传递方法的载体的药物组合物。适合的载体包括当与治疗性组合物混合时，可保留治疗性组合物的抗肿瘤活性，且通常不与患者的免疫系统反应的任意物质。例子包括但不限于多种标准药物载体的任意一种，例如无菌磷酸缓冲盐水溶液，抑菌水等(一般参见Remington′s Pharmaceutical Sciences 16tEdition，A.Osal.，Ed.，1980)。
治疗制剂可以被溶解和通过任意能够将治疗组合物传递到肿瘤位点的途径给药。潜在有效的给药途径包括但并不限于：静脉内、非肠道、腹膜内、肌内、肿瘤内、皮内、器官内、常位(orthotopic)等。优选的静脉内注射的制剂包含保存在防腐抑菌水、无菌未防腐水中的治疗性组合物，和/或包含稀释于含有0.9％无菌氯化钠的聚氯乙烯或聚乙烯袋中供注射，USP的治疗性组合物。治疗性的蛋白质制品可以冻干，作为无菌粉末保存，优选在真空中保存，然后在注射前重新用抑菌水(含有防腐剂，例如苯甲醇)或无菌水重建。
用前述方法治疗癌症的剂量和给药方案将随着方法和靶癌症的改变而变化，且通常依赖于现有技术中所知的多种其它因素。
XII.)161P2F10B调制剂的鉴定、表征和应用
鉴定和利用调制剂的方法
在一个实施方案中，进行筛选以鉴定能诱导或抑制特定表达分布图、抑制或诱导特定途径的调制剂，优选由此产生相关表型的调制剂。在另一个实施方案中，已经鉴定了在特定状态下重要的差异表达基因，进行筛选以鉴定改变单独的基因表达(无论是增加还是降低)的调制剂。在另一个实施方案中，进行筛选以鉴定改变差异表达基因所表达产物的生物功能的调制剂。另外，已经鉴定了特定状态下基因的重要性，进行筛查以鉴定结合和/或调制基因产物的试剂。
此外，筛选对候选试剂反应的基因。鉴定出调制剂(那些抑制癌症表达模式从而导致正常表达模式，或导致如正常组织中的基因表达的癌症基因的调制剂)之后，进行筛选来鉴定那些对试剂反应而被特异性调制的基因。比较正常的组织和用药剂治疗过的癌症的表达分布图，揭示了那些不能在正常组织或癌组织中表达，但可以在经药剂治疗过的组织表达的基因，反之亦然。用本文描述的方法鉴定这些药剂-特异性序列并将其用于癌症基因或蛋白质。特别地，这些序列和它们编码的蛋白质被用于标记或鉴别用药剂治疗过的细胞。除此之外，生产针对药剂诱导的蛋白的抗体，并用于将新疗法靶向经治疗的癌症组织样品。
调制剂相关的鉴定和筛选试验：
基因表达相关试验
本发明的蛋白质、核酸和抗体可用于筛选试验。癌症-相关蛋白质、抗体、核酸、修饰的蛋白质和含有这些序列的细胞可用于筛选试验，例如评价候选药物对“基因表达分布图”、多肽表达分布图或生物功能的改变的影响。在一个实施方案中，表达分布图优选与高通量的筛选技术联合应用，以便用候选药剂治疗后追踪监测基因表达的状况(如，Davis，GF，et al.J BiolScreen 7：69(2002)；Zlokarnik，et al，Science 279：84-8(1998)；Heid，GenomeRes 6：986-94，1996)。
癌症蛋白质、抗体、核酸、修饰蛋白质和包含天然的或修饰的癌症蛋白质或基因的细胞被用于筛选试验。即，本发明包括筛选组合物的方法，该组合物调制癌症的表型或本发明的癌症蛋白质生理学功能。对基因本身进行或通过评估候选药物对“基因表达分布图”或生物功能的影响。在一个实施方案中，表达分布图优选与高通量的筛选技术联合应用，以便用候选药剂治疗后追踪监测基因表达的状况，见前文Zlokamik。
针对本发明的基因和蛋白质实行了多种试验。试验在各个核酸或蛋白质水平上进行。也就是说，鉴定出在癌症中上调的特定基因，筛选受试化合物调制基因表达或者结合本发明中的癌症蛋白质的能力。这种情况下的“调制”包括基因表达的提高或降低。优选的调制量依赖于癌症中正常组织对癌组织的基因表达的初始变化，变化至少是10％，优选50％，更优选为100-300％，在一些实施方案中达300-1000％或更高。因此，与正常组织相比，如果一个基因在癌组织中显示出4倍的增加，经常需要4倍的减少；同样地，与正常组织相比，在癌组织中10倍的减少经常需要被测试化合物表达的10倍目标值的增加。增加癌症中可见的基因表达类型的调制剂也是有用的，例如，在进一步分析中用作上调的靶标。
通过使用核酸探针和基因表达水平的量化来监测基因表达的量，或者，可选地，例如通过使用癌症蛋白质的抗体和标准的免疫测定监测基因产物本身。蛋白质组学和分离技术也可进行表达的量化。
监测表达以鉴定修饰基因表达的化合物
在一个实施方案中，同时监测多个个体的基因表达，即表达分布图。这些分布图典型地包括图1中的一个或多个基因。在该实施方案中，例如，在生物芯片上固定癌的核酸探针来检测并量化特定细胞中的癌序列。可选择地，可以用PCR。因此，可以使用微滴板上的一系列孔，其中所需的孔中分散有引物。然后进行PCR反应并对每个孔进行分析。
进行表达监测来鉴定能调制一个或多个癌相关序列表达的化合物，如图1中显示的多核苷酸序列。通常，在分析之前往细胞中加入受试调制剂。而且，也提供筛选来鉴定药剂，所述药剂能调制癌症、调制本发明的癌症蛋白质、与本发明的癌症蛋白质结合或者干扰本发明的癌症蛋白与抗体或其它结合配对物的结合。
在一个实施方案中，高通量的筛选方法包括提供含大量潜在治疗化合物(候选化合物)的文库。这种“组合化学文库”随后用一种或多种试验来筛选以鉴定显示出所需特征性活性的文库成员(特殊化合物种类或亚类)。如此鉴定的化合物可用作常规的“主导化合物”作为筛选用化合物或治疗剂。
在一些实施方案中，筛选组合文库中潜在的能与癌症多肽结合或能调制活性的调制剂。按照惯例，通过鉴定具有一些所需性质或活性，例如抑制活性的化合物(被称为“主导化合物”)，制备主导化合物的变体，以及评估这些变体化合物的特性和活性，可产生新的有可利用性质的化学个体。通常，采用高通量筛查(HTS)方法来进行这种分析。
如上所述，基因表达监测可便利地用于检验候选调制剂(例如蛋白质、核酸或小分子)。加入候选药剂后，使细胞保温一段时间，要分析的含有靶序列的样品被加入生物芯片。
如果需要，用已知的技术制备靶序列。例如，用已知的裂解缓冲液等处理样品以裂解细胞，电穿孔，适当时进行纯化和/或扩增如PCR。例如，进行标记物与核酸共价连接的体外转录。通常，核酸用生物素-FITC或PE，或用cy3或cy5标记。
靶序列可以用例如荧光，化学发光物质，化学药品，或放射性信号标记，从而提供检测靶序列与探针的特异性结合的方式。标记也可以是酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，当提供合适的底物时，会产生可检测的产物。可选地，该标记是被标记的化合物或小分子，例如酶抑制剂，该抑制剂与酶结合但并不被其催化或改变。该标记也可以是组成成分或化合物，例如与链霉亲和素特异性结合的表位标记或生物素，至于生物素的例子，如上所述标记链霉亲和素，从而提供针对结合的靶序列的可测信号。未结合的经标记链霉亲和素通常在分析之前除去。
如本领域技术人员所知，这些试验可以是直接的杂交试验或可以包括“夹心试验”，包括使用多种探针，如美国专利5,681,702；5,597,909；5,545,730；5,594,117；5,591,584；5,571,670；5,580,731；5,571,670；5,591,584；5,624,802；5,635,352；5,594,118；5,359,100；5,124,246；和5,681,697中所略述的。在这一实施方案中，通常如前略述制备靶核酸，然后在使杂交复合物形成的条件下，加入含有大量核酸探针的生物芯片中。
本发明中运用了多种杂交条件，包括如上指出的高度、中度和低度严紧性条件。试验通常在严紧性条件下进行，使只有当靶存在时才能形成标记探针杂交复合物。可以通过调整热力学可变的步骤参数来控制严紧度，包括但不限于温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液序列高的盐浓度pH、有机溶剂浓度等。这些参数也可以用来控制非特异性结合，如美国专利5,681,697中大体指出的。因此，在较高严紧度条件下进行一些步骤来降低非特异性结合是令人满意的。
本文简述的反应可以经多种途径完成。反应成分可以以不同的顺序同时或相继加入，下面有略述的优选的实施方案。另外，反应可以包括多种其它试剂。包括盐、缓冲液、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等，可以用来促进最佳的杂交和检测，和/或降低非特异性或背景相互作用。也可以合适地应用其它提高试验效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂，核酶抑制剂，抗微生物试剂等，这取决于样品的制备方法和靶的纯度。分析试验数据来确定不同基因的表达水平，以及不同状态间的表达水平改变，形成基因表达分布图。
生物活性相关试验
本发明提供了鉴定或筛选调制本发明中癌症相关基因或蛋白质活性的方法。这些方法包括在含有本发明癌症蛋白质的细胞中加入如前文详细说明的受试化合物，细胞含有编码本发明癌症蛋白质的重组核酸。在另一实施方案中，在大量细胞中检测候选制剂库。
一方面，试验在生理学信号存在或不存在或之前或之后暴露的情况下评估，上述信号包括例如激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、作用潜力、包括化疗、放疗、致癌物质或其它细胞(即细胞-细胞接触)的药剂。在另一例子中，鉴定在细胞周期的不同阶段进行。调制本发明基因或蛋白质的化合物被以这种方式鉴别出来。具有药学活性的化合物能够增强或干扰本发明癌症蛋白质的活性。一旦被鉴定，评估类似的结构来识别化合物的关键结构特征。
在一个实施方案中，提供了调制(如抑制)癌细胞分裂的方法；该方法包括给与癌症调制剂。在进一步的实施方案中，提供了治疗癌症细胞或患癌症个体的方法；该方法包括给与癌调制剂。
在一个实施方案中，提供了调制表达本发明基因的细胞状态的方法。本文使用的状态包括为本领域所接受的参数，例如细胞的生长，增殖，存活，器官功能，细胞凋亡，衰老，定位，酶活性，信号传导等。在一个实施方案中，癌症抑制剂是前文讨论的抗体。在另一实施方案中，癌症抑制剂是反义分子。如本文所述，细胞生长、增殖和转移的试验是本领域熟练技术人员已知的。
鉴定调制剂的高通量筛查
鉴定合适调制剂的试验应当是高通量筛选。因此，优选的试验检测癌症基因转录的增强或抑制，多肽表达的抑制或增强，和多肽活性的抑制和增强。
在一个实施方案中，高通量筛查方法中评估的调制剂是蛋白质，通常为天然蛋白质或天然蛋白质的片段。因此，利用例如含有蛋白质的细胞提取物，或随机的或直接消化的蛋白质细胞提取物。通过这种方式，制备蛋白质文库供本发明的方法筛选。在该实施方案中特别优选的是细菌，真菌，病毒，以及哺乳动物蛋白质文库，优选后者，特别优选人蛋白质。特别有价值的检测化合物靶向靶所属的蛋白质种类，例如酶的底物，或配体和受体。
用软琼脂生长和集落形成来鉴定和表征调制剂
正常细胞需要粘附于固体基质上生长。当细胞被转化，它们失去这一表型，并脱离基质生长。例如，转化的细胞可以在搅动的悬浮培养物或悬浮的半固态培养基，如半固态琼脂或软琼脂上生长。当用肿瘤抑制基因转染转化的细胞时，可以重新建立正常的表型并再次需要吸附于固体基质生长。试验中软琼脂生长或集落形成用来鉴定癌症序列的调制剂，当在宿主细胞中表达时，所述调制剂抑制异常细胞的增殖和分化。调制剂降低或消除宿主细胞在固态或半固态培养基例如琼脂中悬浮生长的能力。
悬浮试验中的软琼脂生长或集落形成技术描述于Freshney，Culture ofAnimal Cells a Manual of Basic Technique(3rd ed.，1994)。也可参见Garkavtsevet al.(1996)，文献同上的方法部分。
评估接触抑制和生长密度限制来鉴定和表征调制剂
正常细胞通常以平铺和有组织的方式在细胞培养物中生长直至它们接触到其它的细胞。当细胞相互接触时，它们被接触抑制并停止生长。然而转化的细胞并不受接触抑制，且继续生长至高密度无规则的病灶。因此，与相应的正常细胞相比，转化的细胞可生长至一个更高饱和度的密度。这可以通过无规单层细胞或细胞集落的形成在形态学上检测出来。可选地，在饱和密度下，(3H)-胸苷的标记指数被用来检测生长的密度限制。类似地，MTT或Alamar蓝实验可以揭示细胞的增殖能力和调制剂对其影响的能力，参见Freshney(1994)，文献同上。当用肿瘤抑制基因转染转化的细胞后，可以产生正常的表型，变为受接触抑制并生长为较低的密度。
在这一实验中，饱和密度下的3H-胸苷标记指数是检测生长密度限制的优选方法。用癌症相关序列转染转化的宿主细胞，并在非限制培养基的条件下以饱和密度生长24小时。通过掺入cpm确定用3H-胸苷标记的细胞的百分比。
将不依赖于接触的生长用来鉴定癌症序列，所述序列导致异常的细胞增殖和转化。调制剂可以降低或消除不依赖于接触的生长，使细胞恢复正常表型。
评估生长因子或血清依赖性以鉴定和表征调制剂
与其正常配对物相比，转化细胞具有较低的血清依赖性(参见例如Temin，J.Natl.Cancer Inst.37：167-175(1966)；Eagle et al，J.Exp.Med 131：836-879(1970))；Freshney，文献同上。这部分是由于转化细胞释放的多种生长因子。可以比较转化宿主细胞与对照细胞的生长因子和血清依赖性水平。例如，在鉴定和表征调制本发明的癌症相关序列的化合物的方法中监测细胞的生长因子和血清依赖性水平。
用肿瘤特异性的标记水平来鉴定和表征调制剂
与其正常配对物相比，肿瘤细胞释放一些因子(下文称为“肿瘤特异性标记”)的量增加。例如，人神经胶质瘤释放了比正常脑细胞增高的纤溶酶原激活物(PA)(参见例如Gullino，Angiogenesis，Tumor Vascularization，andPotential Interference with Tumor Growth，in Biological Responses in Cancer，pp.178-184(Mihich(ed.)1985))。类似地，肿瘤细胞释放的肿瘤血管生成因子(TAF)比其正常配对物增高。(参见例如Folkman，Angiogenesis and Cancer，Sem Cancer Biol.(1992))，而内皮细胞瘤释放bFGF(Ensoli，B et al.)。
多种检测这些因子释放的技术由Freshney(1994)，文献同上描述。也可参见Unkless et al，J.Biol.Chem.249：4295-4305(1974)；Strickland & Beers，J.Biol.Chem.251：5694-5702(1976)；Whur et al.，Br.J.Cancer 42：305312(1980)；Gullino，Angiogenesis，TumorVascularization，and Potential interferencewith Tumor Growth，in Biological Responses in Cancer，pp.178-184(Mihich(ed.)1985)；Freshney，Anticancer Res.5：111-130(1985)。例如，在鉴定和表征调制本发明癌症相关序列的化合物的方法中监测肿瘤特异性标记水平。
利用侵入Matrigel来鉴定和表征调制剂
侵入Matrigel或细胞外基质组分的程度可以用作鉴定和表征调制癌症相关序列的化合物的试验。肿瘤细胞表现出恶性度与细胞侵入Matrigel或一些其它细胞外基质组分之间的正相关性。在这一试验中，肿瘤发生细胞通常用作宿主细胞。这些宿主细胞中肿瘤抑制基因的表达将降低宿主细胞的进攻性。可以采用前述的Cancer Res.1999；59：6010；Freshney(1994)中的技术。简要地说，通过采用被Matrigel或其它细胞外基质组分包被的过滤器来检测宿主细胞的进攻水平。渗透入凝胶，或穿透至过滤器的末端被认为具有进攻性，并通过移动的细胞数和距离，或通过预先用125I标记细胞并在过滤器远端或盘的底部计数放射性来进行组织学分级，参见例如前述的Freshney(1984)，文献同上。
评估体内肿瘤的生长来鉴定和表征调制剂
在转基因或免疫抑制生物体中检测癌症相关序列对细胞生长的影响。通过多种为本领域所接受的方法制备转基因生物体。例如，制备如小鼠的哺乳动物的敲除转基因生物体，其中癌症基因被破坏或插入了癌症基因。经由同源重组，在小鼠基因组的内源性癌基因位点插入标记基因或其它异源性基因，以制备敲除转基因小鼠。这种小鼠也可通过用突变型癌症基因取代内源性癌基因而制备，或者通过使内源性癌症基因突变而制备，如通过暴露于致癌物质。
为制备转基因的嵌合动物，如小鼠，往胚胎干细胞的核中导入DNA构建体。含有新改造的遗传损伤的细胞被注射入宿主小鼠的胚胎中，将胚胎重新植入雌性受体。这些胚胎中的一部分发育成为具有生殖细胞的嵌合小鼠，这些细胞中的一些来源于突变的细胞系。因此，通过饲养该嵌合鼠，可能获得包含引入的遗传损伤的小鼠新品系(参见例如Capecchi et al.，Science 244：1288(1989))。嵌合小鼠可依照以下文献获得：2002年4月2日出版的美国专利6,365,797；出版于2000年8月22日的美国专利6,107,540；Hoganet al，Manipulating the Mouse Embryo：A laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)and Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：APractical Approach，Robertson，ed.，IRL Press，Washington，D.C.，(1987)。
可选地，可以采用多种免疫抑制或免疫缺陷宿主动物。例如，遗传性无胸腺的“裸”鼠(参见例如Giovanella et al，J.Natl.CancerInst.52：921(1974))、SCID鼠、切除胸腺的小鼠或经照射的小鼠(参见例如Bradley et al，Br.J.Cancer 38：263(1978)；Selby et al，Br.J.Cancer 41：52(1980))均可以用作宿主。注射入同基因宿主的可移植肿瘤细胞(通常大约106个细胞)在高比例的病例中产生进攻性肿瘤，而类似起源的正常细胞则不会。在长出进攻性肿瘤的宿主中，表达癌症相关序列的细胞被皮下或常位注射。然后小鼠被分成组，包括对照组和治疗试验组(例如，用调制剂治疗)。在适宜长度的时间后，优选4-8周，检测肿瘤的生长(例如，通过体积或它的两个最大的尺寸，或重量)并与对照相比较。具有统计学显著性的缩小的肿瘤(采用例如Student′s T检验)被称为有生长抑制。
鉴定和表征调制剂的体外试验
鉴定具有调制活性的化合物的试验可在体外进行。例如，首先使癌症多肽与潜在的调制剂接触并保温一段合适的时间，例如，从0.5到48小时。在一个实施方案中，通过测量蛋白质或mRNA的水平在体外确定癌症多肽水平。使用与癌症多肽或其片段选择性结合的抗体，采用例如Western印迹，ELISA等的免疫分析来检测蛋白质水平。采用例如PCR、LCR的扩增方法或例如优选为Northern杂交、RNAse保护、点印迹的杂交分析来检测mRNA。如本文所述，用直接或间接标记的检测试剂，例如经荧光或放射性标记的核酸、放射性或酶标记的抗体等来检测蛋白质或mRNA水平。
可选地，可以采用癌症蛋白质启动子设计报告基因系统，该癌症蛋白质启动子与诸如萤光素酶、绿色荧光蛋白、CAT或P-gal的报道基因可操作相连。通常将报道基因构建体转染至细胞。用潜在的调制剂处理后，根据本领域技术人员已知的标准技术检测报道基因的转录、翻译或活性的量(Davis GF，见前文；Gonzalez，J.& Negulescu，P Curr.Opin.Biotechnol.1998：9：624)。
如上所述，可以对各个基因和基因产物进行体外筛选。也就是说，先鉴定出对特定状态至关重要的特殊差异表达的基因，再筛选基因或基因产物本身的表达调制剂。
在一个实施方案中，筛选特定基因的表达调制剂。通常，仅评价一个或几个基因的表达。在另一个实施方案中，设计筛选以首先发现能结合差异表达蛋白质的化合物。然后评价这些化合物调制差异表达活性的能力。另外，一旦鉴定出原始的候选化合物，可进一步筛选变体以更好地评价结构活性关系。
鉴定和表征调制剂的结合试验
在本发明的结合试验中，一般使用本发明的纯化或分离的基因产物。例如，产生针对本发明蛋白质的抗体，进行免疫测定以确定蛋白质的量和/或位置。或者，在试验中使用含有癌症蛋白质的细胞。
因此，方法包括混合本发明的癌症蛋白质和候选化合物，如配体，并测定化合物与本发明的癌症蛋白质的结合。优选实施方案利用了人癌症蛋白质；也可以开发和使用人类疾病的动物模型。另外，本领域技术人员懂得也可以使用其它类似的哺乳动物蛋白质。另外，在一些实施方案中，使用了变异或衍生的癌症蛋白质。
一般说来，本发明的癌症蛋白质或配体非-弥散性地与不溶性支持物结合。支持物可以是例如具有接受分离样品之区域的支持物(微滴板、阵列等)。不溶性支持物可由任何能结合合成物的成分制成，所述支持物能容易地与可溶性材料分开，要不然就是可以与整个筛选方法相容。所述支持物的表面可以是固体或孔状，并且可以是任何方便的形状。
适当不溶性支持物的例子包括微滴板、阵列、膜和珠。它们一般由玻璃、塑料(如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝酸纤维素或TeflonTM等制成。微滴板和阵列特别方便，因为可以使用少量试剂和样品同时进行大量试验。对于合成物与支持物结合的特定方式没有特别限制，只要它能与试剂和本发明的整个方法相容、能保持合成物的活性并且是非弥散的即可。优选的结合方法包括使用抗体，所述抗体当使蛋白质与支持物结合、直接结合于“粘性”或离子支持物、化学交联表面蛋白质合成或试剂等时，不会在空间上封闭配体结合位点或激活序列。使蛋白质或配体/结合剂与支持物结合之后，通过洗涤除去过量的未结合材料。然后通过与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它无毒蛋白质或其它组成成分保温来封闭样品接受区域。
一旦本发明的癌症蛋白质与支持物结合，在试验中添加受试化合物。或者，使候选结合剂与支持物结合，然后添加本发明的癌症蛋白质。结合剂包括特异性抗体、筛选化学文库鉴定出的非-天然结合剂、肽类似物等。
特别令人感兴趣的是鉴定对人细胞低毒的药剂的试验。为此可以使用多种试验，包括增殖试验、cAMP试验、体外标记的蛋白质-蛋白质结合试验、电泳迁移率转变试验、蛋白质结合的免疫测定、功能试验(磷酸化试验等)等。
可以用多种方法测定受试化合物(配体、结合剂、调制剂等)与本发明的癌症蛋白质的结合。可以标记受试化合物，通过例如使本发明的全部或部分癌症蛋白质与固体支持物结合，添加经标记的候选化合物(如荧光标记)，洗下过量试剂并测定固体支持物上是否存在标记来直接测定结合。适当时可以利用多种封闭和洗涤步骤。
在一些实施方案中，仅标记一种组分，例如仅标记本发明的蛋白质或配体。或者，用不同的标记物标记一种以上的组分，如用I125标记蛋白质，用氟标记化合物。邻近试剂，如淬灭或能量转移试剂也是有用的。
竞争性结合以鉴定和表征调制剂
在一个实施方案中，通过与“竞争剂”的竞争结合试验来测定“受试化合物”的结合。竞争剂是与靶分子(如本发明的癌症蛋白质)结合的结合组成成分。竞争剂包括如抗体、肽、结合配对物、配体等的化合物。在一些情况下，受试化合物与竞争剂之间的竞争结合置换了受试化合物。在一个实施方案中，受试化合物被标记。在蛋白质中加入受试化合物，竞争剂，或这两者，维持足够长的时间以使它们结合。在有利于最佳活性的温度下，一般为4至40℃进行保温。通常最优化保温时间以有利于快速高通量筛选；一般0至1小时就足够了。通常需除去或洗去过量的试剂。然后加入第二种组分，测定是否存在经标记组分以显示结合。
在一个实施方案中，首先加入竞争剂再加入受试化合物。置换竞争剂表示受试化合物与癌症蛋白质结合，因此能结合并潜在调制癌症蛋白质的活性。在此实施方案中，可以标记任一种组分。因此，例如，如果标记竞争剂，后-测试化合物洗涤溶液中存在标记表示被受试化合物置换。或者，如果标记受试化合物，支持物上存在标记表示置换。
在可选择的实施方案中，首先加入受试化合物，保温并洗涤，接着加入竞争剂。缺乏竞争剂结合表示：与竞争剂相比，受试化合物以更高的亲和性与癌症蛋白质结合。因此，如果标记受试化合物，支持物上标记的存在合并竞争剂结合的缺乏表示受试化合物结合因此潜在调制本发明的癌症蛋白质。
因此，竞争结合方法包括差异筛选以鉴定出能调制本发明癌症蛋白质活性的药剂。在此实施方案中，该方法包括在第一个样品中混合癌症蛋白质和竞争剂。第二个样品含有受试化合物、癌症蛋白质和竞争剂。测定两个样品中的竞争剂结合，两个样品之间结合的改变或差异表示存在能与癌症蛋白质结合并潜在调制其活性的药剂。即，如果相对于第一个样品而言，第二个样品中的竞争剂结合是不同的，该药剂即能与癌症蛋白质结合。
或者，使用差异筛选鉴定出能与天然癌症蛋白质结合，但不能与经修饰的癌症蛋白质结合的候选药物。例如，制作癌症蛋白质的结构模型，并将其用于理性药物设计以合成能与该位点相互作用的药剂，一般不与位点经修饰的蛋白质结合的药剂。另外，通过筛选药物增强或降低所述蛋白质活性的能力也可鉴定出能影响天然癌症蛋白质活性的候选药物。
在此试验中使用了阳性对照和阴性对照。优选在至少三份试验中进行对照和受试样品试验以获得统计学显著的结果。所有样品的保温时间足以使药剂与蛋白质结合。保温之后，从样品中洗去非-特异性结合的物质，测定结合的，通常是经标记的药剂的量。例如，当利用放射性标记时，可在闪烁计数器中计数样品以测定结合化合物的量。
筛选试验中可包括多种其它试剂。其包括如盐、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等的试剂，所述试剂有利于最佳蛋白质-蛋白质结合和/或降低非-特异性或背景相互作用。也可以使用能改善试验效率的试剂，如蛋白酶抑制剂、核酶抑制剂、抗-微生物药剂等。以能提供所需结合的次序添加组分的混合物。
使用多核苷酸下调或抑制本发明的蛋白质
如WO91/04753所述，通过与配体-结合分子形成偶联物，将癌症的多核苷酸调制剂导入含有靶核苷酸序列的细胞中。适当的配体-结合分子包括但不限于细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或其它与细胞表面受体结合的配体。优选配体结合分子的偶联实质上不会干扰配体结合分子结合其相应分子或受体的能力，或妨碍有义或反义寡核苷酸或其偶联形式进入细胞。或者，可如WO90/10448所述，通过例如形成多核苷酸-脂质复合物将癌症的多核苷酸调制剂导入含有靶核酸序列的细胞中。应懂得除了治疗方法外，还可以在上文所述的筛选试验中使用反义分子或敲除和嵌入(knock in)模型。
抑制性核苷酸和反义核苷酸
在一些实施方案中，通过使用反义多核苷酸或抑制性的小核RNA(snRNA)，即互补于并优选能特异性杂交编码mRNA核酸序列，如本发明的癌症蛋白质，mRNA或其亚序列的核酸可下调或完全抑制癌症-相关蛋白质的活性。反义多核苷酸与mRNA的结合降低了mRNA的翻译和/或稳定性。
在本发明的上下文中，反义多核苷酸可含有天然核苷酸，或由天然亚单位或其密切同系物形成的合成核苷酸。反义多核苷酸也可具有经改变的糖组成成分或糖内连键。例如硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫组分。本发明还包括类似物，只要它们能有效地与本发明的核苷酸杂交即可。参见例如Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA；Sequitor，Inc.，Natick，MA。
使用重组方法可容易地合成所述反义多核苷酸，或者也可以在体外合成所述多核苷酸。所述合成的仪器可购自几个厂商，包括AppliedBiosystems。其它寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物的制备也是本领域技术人员众所周知的。
本文使用的反义分子包括反义或有义寡核苷酸。例如，可使用有义寡核苷酸通过与反义链结合来阻断转录。反义和有义寡核苷酸含有能结合癌症分子的靶mRNA(有义)或DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或DNA)。本发明的反义或有义寡核苷酸含有一般至少约为12个核苷酸，优选约为12至30个核苷酸的片段。基于编码给定蛋白质的cDNA序列获得反义或有义寡核苷酸的能力描述于例如Stein & Cohen(Cancer Res.48：2659，(1988))和vander Krol et al.(BioTechniques 6：958(1988))。
核酶
除了反义多核苷酸以外，也可使用核酶靶向和抑制癌症-相关核苷酸序列的转录。核酶是能催化裂解其它RNA分子的RNA分子。已描述了不同类型的核酶，包括I组核酶、锤头核酶、发夹核酶、RNase P和斧头核酶(有关不同核酶之特性的评述参见例如Castanotto et al.，Adv.in Pharmacology 25：289-317(1994))。
发夹核酶的一般性特征描述于例如Hampel et al.，Nucl.Acids Res.18：299-304(1990)；欧洲专利公开号0360257；美国专利5,254,678。制备方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如WO94/26877；Ojwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6340-6344(1993)；Yamada et al.，Human Gene Therapy1：39-45(1994)；Leavitt et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 92：699-703(1995)；Leavitt et al.，Human Gene Therapy 5：1151-120(1994)和Yamada et al.，Virology205：121-126(1994))。
在表型筛选中使用调制剂
在一个实施方案中，给一群具有相关癌症表达分布图的癌症细胞施用受试化合物。本文的“施用”或“接触”指的是以特定的方式在细胞中加入调制剂，使调制剂通过摄取和细胞内作用或通过细胞表面的作用对细胞发挥作用。在一些实施方案中，将编码蛋白质试剂(即肽)的核酸导入病毒构建体，如腺病毒或逆转录病毒构建体，并加入至细胞中，从而完成肽剂的表达，参见例如PCT US97/01019。也可使用可调节的基因治疗系统。一旦给细胞施用了调制剂，必要时洗涤细胞，优选使细胞在生理条件下保温一段时间。然后收集细胞，产生新的基因表达分布图。因此，例如，针对癌症组织筛选调制，如诱导或抑制癌症表型的药剂。至少一个基因，优选多个基因表达分布图的改变表示该药剂对癌症活性起作用。类似地，改变生物功能或信号传导途径是调制剂活性的显示。通过限定癌症表型的特征，设计能改变表型的新药的筛选。使用此方法，不必知道药物靶，也不必将药物靶呈现在原始基因/蛋白质表达筛选平台上，也不必改变靶蛋白质转录物的水平。调制剂抑制功能可用作替代标记。
如上所述，需进行筛选以评价基因或基因产物，也就是说，先鉴定出对特定状态至关重要的特殊差异表达的基因，再筛选基因或基因产物本身的表达调制剂。
使用调制剂影响本发明的肽
使用多种试验测定癌症多肽活性或癌症表型。例如，通过检测上述参数测定调制剂对癌症多肽功能的影响。使用影响活性的生理学改变评估受试化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物测定功能结果时可评价多种作用，例如对与实体肿瘤相关的癌症而言，可评价肿瘤生长、肿瘤转移、新血管生成、激素释放、已知和未鉴定的基因标记的转录改变(如通过Northern印迹)、细胞代谢的改变(如细胞生长或pH改变)和细胞内第二信使(如cGNIP)的改变。
鉴别特征性癌症相关序列的方法
多种基因序列的表达与癌症相关，相应地，鉴定了基于突变或变异癌症基因的疾病。在一个具体实施方案中，本发明提供了鉴定含有变异癌症基因的细胞的方法，例如，确定细胞中至少一个内源性癌症基因全部或部分序列的存在。这可通过运用任意数目的测序技术来完成。本发明包括鉴定个体癌症基因型的方法，例如，确定个体中至少一种本发明的基因的全部或部分序列的存在。这通常在个体的至少一种组织，例如表1所列组织中进行，还可以包括对多种组织或同一组织不同样品的评估。该方法可以包括将已测序基因的序列与已知癌症基因，即野生型基因进行比较，来确定家族成员、同源性、突变或变异的存在，然后可将该基因的全部或部分序列与已知癌症基因的序列进行比较来确定是否有差异存在。这可以通过任何数目的已知同源性程序进行，如BLAST，Bestfit等。如本文所述，患者癌症基因和已知癌症基因序列之间差异的存在与疾病状态或疾病状态倾向相关。
在一个优选实施方案中，用癌症基因作为探针来确定基因组中癌症基因拷贝的数目。用癌症基因作探针来确定其在染色体上的位置。特别是，当在癌症基因的基因座中鉴定出如易位等的染色体异常时，如染色体定位的信息可以应用于提供诊断或预测。
XIII.)RNAi和小的干扰RNA(siRNA)的治疗用途
本发明还涉及至少包括161P2F10B编码区或5’UTR区的片段的siRNA寡核苷酸，特别是双链RNA，或其互补物，或任何特异于161P2F10B序列的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，使用所述寡核苷酸阐明161P2F10B的功能，或使用所述寡核苷酸筛选或评价161P2F10B功能或表达的调制剂。在另一个实施方案中，使用siRNA转染降低161P2F10B的基因表达，进而使内源性表达抗原的经转化癌细胞的增殖能力显著降低；通过使用例如与降低的增殖能力有关的细胞生存能力代谢读出值测定，用特异性161P2F10B siRNA处理的细胞显示出降低的存活率。因此，161P2F10B siRNA组合物含有对应于161P2F10B蛋白的核酸ORF序列或其亚序列的siRNA(双链RNA)；这些亚序列的长度一般为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35或多于35个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。在优选实施方案中，亚序列的长度为19-25个核苷酸，最优选长度为21-23个核苷酸。
RNA干扰是体外和体内沉默基因的新方法，因此，小的双链RNA(siRNA)是有价值的治疗剂。目前，siRNA沉默特异性基因活性的能力已在疾病的动物模型中得以体现，并且也可用于人。例如，已证实将针对特定靶标的siRNA的溶液流体灌注至小鼠体内具有疗效。
Song等的在先工作表明：一种纯天然的核酸，即小的干扰RNA(siRNA)甚至无需经过进一步的化学修饰即可用作治疗剂(Song，E.，et al.，“RNAinterference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis”Nat.Med.9(3)：347-51(2003))。此项工作首次提供了给动物灌注siRNA可缓解疾病的体内证据。在该项工作中，作者给小鼠注射了经设计可沉默FAS蛋白(一种细胞死亡受体，当其在炎性反应中被过度活化时，可诱导肝细胞和其它细胞死亡)的siRNA。第二天，给动物施用特异于Fas的抗体。在随后的几天内，对照小鼠死于急性肝衰竭，而80％以上经siRNA处理的小鼠未患严重疾病，并且得以存活。这些小鼠的约80％至90％肝细胞掺入了裸露的siRNA寡核苷酸。另外，RNA分子可发挥作用达10天，3周后才失去作用。
当用于治疗人时，通过能诱导长期RNAi活性的有效系统传递siRNA。对临床应用的主要告诫是应将siRNA传递给适当的细胞。肝细胞似乎特别能接受外源性RNA。目前，由于肝脏是核酸分子和病毒载体容易靶向的器官，因此，位于肝脏的靶标格外引人注目。然而，其它组织和器官的靶标也是优选的。
用能够促进跨细胞膜转运的化合物配制siRNA，以此改善治疗过程中siRNA的施用。本发明的另一个实施方案是经化学修饰的合成siRNA，所述siRNA能抵抗核酶的作用，具有血清稳定性，与之相伴地，RNAi作用的持续时间延长。
因此，siRNA技术是通过将针对161P2F10B的siRNA分子传递给患有如表I所列癌症的个体来治疗人类恶性肿瘤的方法。施用siRNA可导致表达161P2F10B的癌细胞的生长减弱，并且提供了抗-肿瘤疗法，降低了与恶性肿瘤相关的发病率和/或死亡率。
当在体外或体内测定时，这种基因产物击倒(knockdown)形式的效力是显著的。通过(如上所述)给培养物中的细胞使用siRNA，或者当使用体外方法检测降低的161P2F10B蛋白表达时，给癌症患者活检样品的等分试样使用siRNA，即可容易地阐明体外效力。
XIV.)试剂盒/制品
为了用于本文描述的实验室、预测、预防、诊断和治疗应用，试剂盒也在本发明的范围之内。所述试剂盒可以包括载体、包装或容器，容器可以被分隔为小室以盛放一个或多个容器如小瓶、试管等，每个容器分别含有本方法所用到的一种独立成分，以及写有使用(如本文所述的应用)说明的标签或插页。例如，容器可以含有经可测标记或能被可测标记的探针。这种探针可以是分别特异于本发明的蛋白质或基因或信息的抗体或多核苷酸。当该方法利用核酸杂交来检测目标核酸时，试剂盒也可以包括含有扩增目标核酸序列的核苷酸的容器。试剂盒可包括含有报道分子的容器，如与报道分子如酶、荧光或放射性同位素标记结合的生物素结合蛋白，例如亲和素或链霉亲和素；所述报道分子可与例如核酸或抗体一起使用。该试剂盒可以包括图1、图2或图3所示的全部或部分氨基酸序列或其类似物，或者编码所述氨基酸序列的核酸分子。
本发明的试剂盒通常包括上述的容器及一个或多个与之相关的其它容器，其中含有符合商业和用户需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；载体、包装、容器、小瓶、和/或试管标签，其上列有供使用的内容物和/或说明，以及写有使用说明的包装插页。
容器可以贴有或附有标签来说明组合物用于特定的治疗或非治疗的应用，如预测、预防、诊断或实验室应用，也可以说明如本文所述的体内或体外应用的指示。指示和/或其它信息也可以包括在试剂盒所附或所贴的插页或标签上。标签可以贴于容器上或与之相关联。当字母、数字或其它组成标签的文字铸模或蚀刻在容器上时，标签置于容器上；当标签存在于盛放容器的贮器或载体中时，标签与所述的容器相关联，例如作为包装的插页。标签可以说明组合物用于诊断、治疗、预防或预测疾病，如表I所示组织的肿瘤。
术语“试剂盒”与“制品”可以被用作同义词。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种包含如氨基酸序列、小分子、核酸序列和/或抗体的组合物的制品，例如，用于诊断、预测、预防和/或治疗如表I中所列举组织的肿瘤的材料。制品通常包括至少一个容器及至少一个标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器以及试管。容器可以由多种材料制成，如玻璃、金属或塑料。该容器可以包含氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群体和/或抗体。在一个实施方案中，容器包含用于检测细胞中mRNA表达分布图的多核苷酸，同时含有用于此目的的试剂。在另一个实施方案中，容器包含用于评价161P2F10B在细胞和组织中的蛋白质表达，或用于相关的实验室、预测、诊断、预防和治疗目的的抗体、其结合片段或特异性结合蛋白；所述容器可贴有或附有所述应用的说明和/或指示，也可包括用于这些目的的试剂和其它组合物或工具。在另一个实施方案中，容器中含有用于引发细胞或体液免疫应答的物质以及相关的说明和/或指示。在另一个实施方案中，容器中含有用于过继免疫疗法的物质，如细胞毒T细胞(CTL)或辅助T细胞(HTL)，以及相关的说明和/或指示；容器中也可包括用于此目的的试剂和其它组合物或工具。
容器也可以选择性地包含用于有效地治疗、诊断、预测或预防某种疾病的组合物，同时可以含有无菌接口(如容器可以是一个静脉内溶液袋或一个具有用皮下注射针穿孔的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可以是能够特异性结合161P2F10B和调制其功能的抗体。
制品可以进一步包括第二容器，其含有药学上可接受的缓冲液，例如磷酸缓冲盐水，林格氏溶液和/或葡萄糖溶液。它可以进一步包括其它符合商业和用户需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和/或附有使用指示和/或说明的包装插页。
实施例：
通过以下的一些实施例对本发明的不同方面进行进一步描述和举例说明，所有实施例不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例1：正常组织和患者样品中161P2F10B变体的表达分析
为了比较161P2F10B和161P2F10B变体在正常组织与患者癌症组织中的表达，使用正常组织和患者癌症组织进行RT-PCR实验。由正常胃、正常脑、正常心脏、正常肝脏、正常骨骼肌、正常睾丸、正常前列腺、正常膀胱、正常肾、正常结肠、正常肺、正常胰腺以及来自前列腺癌患者，膀胱癌患者，肾癌患者，结肠癌患者，肺癌患者，胰腺癌患者的癌症样品库，前列腺癌异种移植物(LAPC-4AD，LAPC-4AI，LAPC-9AD和LAPC-9AI)样品库，和2个前列腺癌淋巴结转移患者的样品库产生第一链cDNA。使用肌动蛋白引物进行PCR反应来使其标准化。使用针对161P2F10B的引物进行26和30轮扩增循环以进行半-定量PCR。样品在琼脂糖凝胶中电泳，使用Alphalmager软件定量PCR产物。
以前已证实161P2F10B在一系列肾癌明细胞癌、肾癌乳头状癌和子宫癌患者样品中表达。由患者样品制备第一链cDNA。使用肌动蛋白引物进行PCR反应来使其标准化。使用针对161P2F10B的引物进行26和30轮扩增循环以进行半-定量PCR。样品在琼脂糖凝胶中电泳，使用Alphalmager软件定量PCR产物。将表达记录为无、低度、中度或强。结果表明：94.7％的明细胞肾癌表达161P2F10B，62.5％的乳头状肾细胞癌表达161P2F10B，61.5％的子宫癌表达161P2F10B。
161P2F10B在正常组织中的表达受限，在肾癌，肾癌转移以及前列腺、膀胱、结肠、肺、胰腺、骨、淋巴、子宫、乳腺和卵巢癌中的表达被上调表明161P2F10B是人类癌症的治疗靶标和诊断标记。
实施例2：161P2F10B的剪接变体
转录变体是来自通过可变转录或可变剪接产生的来自同一基因的成熟mRNA的变体。可变转录物是来自相同的基因但是在不同点开始转录的转录物。剪接变体是得自相同转录物但剪接不同的mRNA变体。在真核生物中，当多-外显子基因由基因组DNA转录时，原始RNA经过剪接产生功能性的mRNA，它只有外显子，用来翻译成氨基酸序列。相应地，一个给定的基因可以有零个或多个可变转录物，每个转录物有零个或多个剪接变体。每个转录变体都有独特的外显子组成，而且与原始转录物相比，可有不同的编码和/或非编码(5′或3′末端)部分。转录变体可以编码具有相同或相似功能的相似或不同的蛋白质，或能编码具有不同功能的蛋白质，而且可以同时在相同的组织中、或同时在不同的组织中、或在不同时间在相同的组织中、或不同时间在不同的组织中表达。转录变体编码的蛋白质可有相似或不同的细胞或细胞外定位，例如，分泌的相对于细胞内的。
可以通过多种为本领域所接受的方法来鉴定转录变体。例如，可变转录物和剪接变体可以通过全长克隆实验，或采用全长转录物和EST序列来鉴定。首先，所有人类的EST聚集成簇，相互之间表现出直接或间接的同一性。其次，相同聚簇中的EST被进一步分组为亚簇，并且装配为共有序列。将原始基因序列与共有序列或其它的全长序列相比较。每个共有序列都是该基因的潜在剪接变体。即使变体被鉴定为不是全长克隆，通过采用本领域已知的技术，变体的该部分对产生抗原和进一步克隆全长剪接变体是很有用的。
另外，本领域已知基于基因组序列鉴定转录变体的计算机程序。基于基因组的转录变体鉴定程序包括FgenesH(A.Salamov and V.Solovyev，“Abinitio gene finding in Drosophila genomic DNA，”Genome Research.2000 April；10(4)：516-22)；Grail和GenScan。有关剪接变体鉴定方案的一般性讨论可以参见例如：Southan，C.，A genomic perspective on human proteases，FEBS Lett.2001 Jun 8；498(2-3)：214-8；de Souza，S.J.，et al.，Identification of humanchromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags，Proc.Natl Acad Sci U S A.2000 Nov 7；97(23)：12690-3。
为进一步确认转录变体的参数，可使用本领域已知的多种技术，例如全长克隆、蛋白质组学确认、基于PCR的确认以及5′RACE确认等(参见例如：蛋白质组学确认：Brennan，S.O.，et al.，Albumin banks peninsula：a newtermination variant characterized by electrospray mass spectrometry，BiochemBiophys Acta.1999 Aug 17；1433(1-2)：321-6；Ferranti P，et al.，Differentialsplicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of maturecaprine alpha(s1)-casein，Eur J Biochem.1997 Oct 1；249(1)：1-7；基于PCR的确认：WellmannS，et al.，Specific reverse transcription-PCR quantification of vascularendothelial growth factor(VEGF)splice variants by LightCycler technology，Clin Chem.2001 Apr；47(4)：654-60；Jia，H.P.，et al，Discovery of new humanbeta-defensins using a genomics-based approach，Gene.2001 Jan 24；263(1-2)：211-8；基于PCR和5′RACE的确认：B rigle，K.E.，et al.，Organization of themurine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms，Biochem Biophys Acta.1997 Aug 7；1353(2)：191-8)。
本领域已知癌症中的基因组区域被调制了。当基因所作图的基因组区域在特定癌症中被调制时，可变的转录物或基因剪接变体也被调制。本文揭示的是161P2F10B具有与癌症相关的特定表达分布图。在相同或其它组织中，161P2F10B的可变转录物和剪接变体也与癌症相关，因此可以用作肿瘤相关标记/抗原。
通过图1中的变体基础给出了161P2F10B变体的氨基酸和核酸序列。
实施例3：161P2F10B的单核苷酸多态性
单核苷酸多态性(SNP)是核苷酸序列特定位置的单个碱基对改变。在基因组中任何给定的点，均有四种可能的核苷酸碱基对：A/T、C/G、G/C和T/A。基因型指的是个体基因组中一个或多个位置的特定碱基对序列。单元型指同一DNA分子上(或高等生物的同一染色体上)多个位置的碱基对序列，通常在提及一个基因或几个紧密连锁基因时使用。在cDNA上发生的SNP称为cSNP。这种cSNP可以改变基因所编码蛋白质的氨基酸，因此改变蛋白质的功能。一些SNP可导致遗传病；其它的可造成表型的数量变化和影响个体对包括饮食和药物的环境因素的反应。因此，SNP和/或等位基因组合(被称为单元型)有许多应用，包括诊断遗传病、确定药物反应和剂量、鉴定造成疾病的基因、以及分析个体间遗传关系(P.Nowotny，J.M.Kwon and A.M.Goate，“SNP analysis to dissect human traits，”Curr.Opin.Neurobiol.2001 Oct；11(5)：637-641；M.Pirmohamed and B.K.Park，“Genetic susceptibility toadverse drug reactions，”Trends Pharmacol.Sci.2001 Jun；22(6)：298-305；J.H.Riley，C.J.Allan，E.Lai and A.Roses，“The use of single nucleotidepolymorphisms in the isolation of common disease genes，”Pharmacogenomics.2000 Feb；1(1)：39-47；R.Judson，J.C.Stephens and A.Windemuth，“Thepredictive power of haplotypes in clinicalresponse，”Pharmacogenomics.2000feb；1(1)：15-26)。
SNP可以通过多种为本领域所接受的方法来鉴定(P.Bean，“Thepromising voyage of SNP target discovery，”Am.Clin.Lab.2001 Oct-Nov；20(9)：18-20；K.M.Weiss，“In search of human variation，”Genome Res.1998 Jul；8(7)：691-697；M.M.She，“Enabling large-scale pharmacogenefic studies byhigh-throughput mutation detection and genotyping technologies，”Clin.Chem.2001 Feb；47(2)：164-172)。例如，可以通过以凝胶为基础的方法对显示多态性的DNA片段进行测序，如限制性片段长度多态性(RFLP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)来鉴定SNP。也可以通过对收集自不同个体的DNA样品直接测序或通过比较来自不同DNA样品的序列来发现SNP。随着公共和私人数据库的序列数据的迅速累积，可以运用计算机程序比较序列来发现SNP(Z.Gu，L.Hillier and P.Y.Kwok，“Single nucleotide polymorphism hunting incyberspace，”Hum.Mutat.1998；12(4)：221-225)。SNP可以被确定，且个体的基因型或单元型可以通过一系列方法确定，包括直接测序和高通量微阵列(P.Y.Kwok，“Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms，”Annu.Rev.Genomics Hum.Genet 2001；2：235-258；M.Kokoris，K.Dix，K.Moynihan，J.Mathis，B.Erwin，P.Grass，B.Hines and A.Duesterhoeft，“High-throughputSNP genotyping with the Masscode system，”Mol.Diagn.2000 Dec；5(4)：329-340)。
运用上述方法，鉴定出原始转录物161P2F10Bv.1的4个SNP，分别位于408(A/G)，2502(A/G)，2663(A/C)和3233(A/C)。具有可选择等位基因的转录物或蛋白质分别被命名为变体161P2F10B v.2，v.3，v.4和v.5。尽管在这里分开表示这些SNP的等位基因，但它们可以以不同的组合(单元型)出现并可在任一含有该SNP序列上下文的转录变体(如161P2F10B v.7)中出现。
通过图1中的变体基础给出了161P2F10B变体的氨基酸和核酸序列。
实施例4：在原核系统中生产重组161P2F10B
为了在原核细胞中表达重组161P2F10B和161P2F10B变体，将全长或部分161P2F10B和161P2F10B变体cDNA序列克隆入多种本领域已知的表达载体的任何一种，161P2F10B的一个或多个下列区域被表达：图1中所示的全长序列，或161P2F10B、其变体或其类似物的任意8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多个邻接的氨基酸。
体外转录和翻译构建体：
pCRII：为了生产原位检测RNA的161P2F10B有义和反义RNA探针，制备编码161P2F10B cDNA全长或片段的pCRII构建体(Invitrogen，CarlsbadCA)。pCRII载体在插入序列的侧翼具有Sp6和T7启动子，可启动161P2F10BRNA的转录，用作RNA原位杂交实验的探针。这些探针可用于分析细胞和组织中161P2F10B在RNA水平的表达。表示161P2F10B基因的cDNA氨基酸编码区域的经转录161P2F10B RNA用于体外翻译系统，如TnTTM CoupledReticulolysate System(Promega，Corp.，Madison，WI)来合成161P2F10B蛋白。
细菌构建体：
pGEX构建体：为了在细菌中生产与谷胱甘肽S-转移酶(GST)蛋白融合的重组161P2F10B蛋白，将全部或部分161P2F10B cDNA蛋白编码序列克隆入GST融合载体的pGEX家族(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。这些构建体允许氨基末端融合了GST和羧基末端融合了6个组氨酸表位(6×His)的重组161P2F10B蛋白序列可控制的表达。GST和6×His标记允许通过适宜的亲和基质纯化来自诱导细菌的重组融合蛋白，并允许运用抗GST和抗His抗体来识别融合蛋白。6×His标记通过例如，给开放阅读框(ORF)3′末端的克隆引物添加6个组氨酸密码子来产生。可以使用蛋白酶裂解位点，例如pGEX-6P-1内的PreScissionTM识别位点，这样可以允许GST标记从161P2F10B相关蛋白上裂解下来。氨苄青霉素抗性基因和pBR322来源允许在大肠杆菌中选择和维持pGEX质粒。
pMAL构建体：为了在细菌中生产融合了麦芽糖-结合蛋白(MBP)的重组161P2F10B蛋白，通过克隆到pMAL-c2X和pMAL-p2X载体(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)上，将全部或部分的161P2F10B cDNA蛋白编码序列与MBP基因融合。这些构建体允许氨基端融合了MBP和羧基端融合了6个组氨酸表位标记的重组161P2F10B蛋白序列可控制地表达。MBP和6×His标记允许通过适宜的亲和基质纯化来自诱导细菌的重组蛋白质，并允许运用抗MBP和抗His抗体来识别融合蛋白。6×His表位标签通过给3′克隆引物添加6个组氨酸密码子来产生。Xa因子识别位点允许将pMAL标记从161P2F10B中裂解下来。pMAL-c2X和pMAL-p2X载体被最优化从而分别在细胞质或细胞周质内表达重组蛋白。细胞周质表达增强了蛋白质通过二硫键的折叠。
pET构建体：为了在细菌细胞中表达161P2F10B，将全部或部分的161P2F10B cDNA蛋白编码序列克隆到pET家族的载体中(Novagen，Madison，WI)。这些载体允许在细菌中严密控制地表达重组161P2F10B蛋白，所述蛋白质可以与提高溶解性的蛋白质，例如NusA和硫氧还蛋白(Trx)以及有助于纯化和检测重组蛋白质的表位标记例如6×His和S-TagTM融合，也可以不与它们融合。例如，采用pET NusA融合系统43.1来生产构建体，使得161P2F10B蛋白的区域被表达成与NusA氨基末端的融合蛋白。
酵母构建体：
pESC构建体：为了在酵母种酿酒酵母中表达161P2F10B以生产重组蛋白质和进行功能研究，将全部或部分161P2F10B cDNA蛋白编码序列克隆到pESC家族的载体中，每个载体包含4个选择标记HIS3，TRP1，LEU2，和URA3的一个(Stratagene，La Jolla，CA)。这些载体允许在同一酵母细胞内由同一质粒可控制地表达直至2个包含FlagTM或Myc表位标记的不同基因或克隆序列。这个系统可用于确定161P2F10B的蛋白质-蛋白质相互作用。另外，酵母中的表达产生类似的翻译后修饰，例如糖基化和磷酸化，当在真核细胞中表达时可发现这些修饰。
pESP构建体：为了在粟酒糖酵母(Saccharomyces pombe)中表达161P2F10B，将全部或部分的161P2F10B cDNA蛋白编码序列克隆到pESP家族的载体中。这些载体允许氨基端或羧基端融合了有助于纯化重组蛋白质的GST的161P2F10B蛋白序列可控制地高表达。FlagTM表位标记允许运用抗FlagTM抗体来检测重组蛋白质。
实施例5：在高等真核系统中生产重组161P2F10B
A.哺乳动物构建体：
为了在真核细胞中表达重组161P2F10B，将全部或部分的161P2F10BcDNA序列或其变体克隆到本领域已知的多种表达载体的任何一种。这些构建体中表达了一个或多个下列161P2F10B区域：161P2F10B v.1，161P2F10B变体或其类似物的氨基酸1到875，或8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多个邻接氨基酸。
该构建体可以被转染至多种哺乳动物细胞的任意一种，如293T细胞中。可以用本文描述的抗161P2F10B多克隆血清来检测被转染的293T细胞裂解产物。
pcDNA4/HisMax构建体：为了在哺乳动物细胞中表达161P2F10B，将161P2F10B的ORF，或其一部分克隆入pcDNA4/HisMax Version A(Invitrogen，Carlsbad，CA)。采用巨细胞病毒(CMV)启动子和SP16翻译增强子来驱动蛋白质的表达。重组蛋白质的氨基末端融合有XpressTM和6个组氨酸(6×His)表位。pcDNA4/HisMax载体也含有牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。Zeocin抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。
pcDNA3.1/MycHis构建体：为了在哺乳动物细胞中表达161P2F10B，将161P2F10B ORF，或其多个部分，与共有Kozak翻译起始位点一起，克隆入pcDNA3.1/MycHis Version A(Invitrogen，Carlsbad，CA)。蛋白质的表达通过巨细胞病毒(CMV)启动子来驱动。重组蛋白质的羧基末端融合有myc表位和6×His表位。pcDNA3.1/Myc His载体也包含牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。可应用新霉素抗性基因，因为可它允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。
pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建体：为了在哺乳动物细胞中表达161P2F10B，并允许采用荧光检测重组蛋白质，将161P2F10B ORF，或其多个部分，与共有Kozak翻译起始位点一起，克隆入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO(Invitrogen，CA)。蛋白质的表达通过巨细胞病毒(CMV)启动子来驱动。重组蛋白质的羧基末端融合有绿色荧光蛋白(GFP)，有助于非侵入性的体内检测和细胞生物学研究。pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体也包含牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号和转录终止序列来提高mRNA的稳定性，同时含有在表达大T抗原的细胞系中用于附加型复制和简单载体拯救的SV40起点。新霉素抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。氨基末端融合有GFP的其它构建体在pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO中制成，其跨越了全长的161P2F10B蛋白。
PAPtag：将161P2F10B的ORF，或其一部分克隆入pAPtag-5(GenHunterCorp.Nashville，TN)。该构建体产生了羧基末端融合了碱性磷酸酶而氨基末端融合了IgGκ信号序列的161P2F10B蛋白。同时还制备了具有氨基末端IgGκ信号序列的碱性磷酸酶与161P2F10B蛋白氨基末端融合的构建体。使得到的重组161P2F10B蛋白最优化，以分泌至被转染哺乳动物细胞的培养基中，并可用于鉴定与161P2F10B蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，重组蛋白质也含有在羧基末端融合的有助于纯化和检测的myc和6×His表位。载体上的Zeocin抗性基因允许对表达重组蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
pTag5：将161P2F10B ORF或其一部分克隆入pTag-5。该载体与pAPtag类似但没有融合碱性磷酸酶。该构建体产生的161P2F10B蛋白在氨基末端具有IgGκ信号序列，同时羧基末端具有有助于检测和亲和纯化的myc和6×His表位标记。将得到的重组161P2F10B蛋白最优化，以分泌入被转染哺乳动物细胞的培养基，并可作为免疫原或配体用于鉴定与161P2F10B蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，载体上的Zeocin抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
PsecFc：将161P2F10B ORF或其一部分也克隆入psecFc。通过将人免疫球蛋白G1(IgG)Fc(铰链区，CH2，CH3区)克隆至pSecTag2(Invitrogen，California)来装配psecFc载体。该构建体在161P2F10B蛋白的羧基末端产生IgG1Fc融合蛋白，而在N末端融合了IgGκ信号序列。也使用了利用鼠IgG1Fc区域的161P2F10B融合蛋白。将得到的重组161P2F10B蛋白最优化以分泌入被转染哺乳动物细胞的培养基，并可作为免疫原或配体用于鉴定与161P2F10B蛋白相互作用的蛋白质，如配体或受体。蛋白质的表达通过CMV启动子来驱动，载体上的潮霉素抗性基因允许对表达重组蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因允许在大肠杆菌中选择质粒。
pSRα构建体：为了产生组成型表达161P2F10B的哺乳动物细胞系，将161P2F10B ORF或其一部分克隆入pSRα构建体。通过分别将pSRα构建体转染至293T-10A1包装系，或将pSRα和辅助质粒(包含缺失的包装序列)共转染至293细胞，来产生双嗜性和亲嗜性逆转录病毒。使用所述逆转录病毒感染多种哺乳动物细胞系，导致克隆基因161P2F10B整合至宿主细胞系。蛋白质的表达通过长末端重复序列(LTR)驱动，载体上存在的新霉素抗性基因允许对表达蛋白质的哺乳动物细胞进行选择，同时氨苄青霉素抗性基因和ColE1起点允许在大肠杆菌中选择和维持质粒。因此逆转录病毒载体可以用于感染和生产多种使用如PC3，NIH3T3，TsuPrl，293或rat-1细胞的细胞系。
另外制备了使161P2F10B序列的羧基端融合如FLAGTM标记的表位标记的pSRα构建体，从而允许使用抗Flag抗体来检测。例如，将FLAGTM序列5′gattac aag gat gac gac gat aag3′(SEQ ID NO：165)加入ORF3′末端的克隆引物。另外制备了pSRα构建体，来生产全长161P2F10B蛋白的氨基端和羧基端GFP和myc/6×His融合蛋白。
其它的病毒载体：另外制备了用于病毒介导的161P2F10B传递和表达的构建体。在病毒传递系统如腺病毒载体和疱疹病毒扩增子载体中获得了导致161P2F10B高水平表达的高病毒滴度。通过PCR扩增161P2F10B编码序列或其片段，并亚克隆至AdEasy穿梭载体(Stratagene)。根据厂家说明进行重组和病毒包装来生产腺病毒载体。可选地，将161P2F10B编码序列或其片段克隆至HSV-1载体(Imgenex)来生产疱疹病毒载体。然后将这些病毒载体用于感染多种细胞系如PC3，NIH 3T3，293或rat-1细胞。
受调节的表达系统：为了调控哺乳动物细胞中161P2F10B的表达，将161P2F10B的编码序列或其部分克隆入受调节的哺乳动物表达系统如T-Rex系统(Invitrogen)、GeneSwitch系统(Invitrogen)和紧密调节的Ecdysone系统(Sratagene)。这些系统允许对重组161P2F10B依赖于时间和浓度的效应进行研究。然后可将这些载体用于控制多种细胞系，如PC3，NIH 3T3，293或rat-1细胞中的161P2F10B表达。
B.杆状病毒表达系统
为了在杆状病毒表达系统中产生重组161P2F10B蛋白，将161P2F10BORF或其部分克隆入杆状病毒转移载体pBlueBac 4.5(Invitrogen)中，所述载体的N末端提供了His-标记。具体地说，将pBlueBac-161P2F10B与辅助质粒pBac-N-Blue(Invitrogen)共转染入SF9(草地夜蛾)昆虫细胞来生产重组杆状病毒(详见Invitrogen操作手册)。然后从细胞上清液中收集杆状病毒并用空斑试验进行纯化。
然后通过用纯化的杆状病毒感染HighFive昆虫细胞(Invitrogen)来生产重组161P2F10B蛋白。可以用抗161P2F10B或抗-His标记抗体检测重组161P2F10B蛋白。可以纯化161P2F10B蛋白，将其用于多种基于细胞的分析或作为免疫原来生产161P2F10B特异性的多克隆和单克隆抗体。
161P2F10B直向同源物表达载体
将161P2F10B的小鼠和猴直向同源物克隆至pcDNA3.1/MycHisVersion A(Invitrogen，Carlsbad，CA)。蛋白质表达由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。重组蛋白质具有与羧基末端融合的myc表位和6×His表位。这些载体可表达161P2F10B直向同源物以检测单克隆抗-人161P2F10B抗体的交叉反应性。
另外，将161P2F10B的小鼠和猴直向同源物克隆至pSRα构建体。pSRα构建体可以产生能组成型表达161P2F10B直向同源物的哺乳动物细胞系。蛋白质表达由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。重组蛋白质具有与羧基末端融合的myc表位和6×His表位。这些载体可表达161P2F10B直向同源物以检测单克隆抗-人161P2F10B抗体的交叉反应性，并研究161P2F10B直向同源物的功能活性。通过分别将pSRα构建体转染至293T-10A1包装系，或将pSRα和辅助质粒(含有缺失的包装序列)共转染至293细胞以产生双嗜性和亲嗜性逆转录病毒。使用逆转录病毒感染多种哺乳动物细胞系，导致克隆的基因161P2F10B直向同源物整合至宿主细胞系。
实施例6：抗原性分布图和二级结构
161P2F10B和161P2F10B变体的氨基酸分布图可以通过访问位于万维网ProtScale网站的ExPasy分子生物学服务器获得。
这些分布图：亲水性(Hopp T.P.，Woods K.R.，1981.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828)；亲/疏水性(Kyte J.，Doolittle R.F.，1982.J.Mol.Biol.157：105-132)；可及残基百分比(Janin J.，1979 Nature 277：491-492)；平均柔性(Bhaskaran R.，and Ponnuswamy P.K.，1988.Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255)；β-转角(Deleage，G.，Roux B.1987 Protein Engineering 1：289-294)以及任何其它可在本领域，如在ProtScale站点获得的分布图可用来鉴定每种161P2F10B变体蛋白质的抗原性区域。应用下述ProtScale参数来生成161P2F10B变体的上述每一个氨基酸分布图以供分析：1)窗口大小为9；2)与窗口中心相比窗口边缘占100％的权重；以及3)氨基酸分布图的数值标准化至介于0和1之间。
使用亲水性，亲/疏水性和可及残基百分比分布图来确定亲水性(即亲水性和可及残基百分比值大于0.5，亲/疏水性分布图上的值小于0.5)氨基酸片段。这些区域很可能暴露于水环境，出现在蛋白质的表面，因此可以用于免疫识别，如被抗体识别。
平均柔性和β转角分布图可确定不受二级结构如β折叠和α折叠约束的氨基酸片段(即，β-转角分布图和平均柔性分布图的数值大于0.5)。这些区域也很可能暴露于蛋白质的表面，因此可以用于免疫识别，如被抗体识别。
通过例如上述分布图显示出来的161P2F10B变体蛋白质的抗原性序列可用于制备或者是肽或是编码肽的核酸的免疫原，用以产生治疗和诊断用的抗161P2F10B抗体。该免疫原可以是图1中所列161P2F10B蛋白变体的任意5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50或50个以上邻接的氨基酸，或相应的编码它们的核酸，可推断出所述变体的氨基酸分布图，因为该变体含有与所示变体相同的序列。特别地，本发明的肽免疫原可含有图1中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在亲水性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；图1中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在亲/疏水性分布图中数值小于0.5的氨基酸位置；图1中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在可及残基百分比分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；图1中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在平均柔性分布图中数值大于0.5的氨基酸位置；以及图1中的以任何整数增加但至少为5个氨基酸的肽区域，其中包括在β-转角分布图中数值大于0.5的氨基酸位置。本发明的肽免疫原也可以包括编码前述任一个的核酸。
本发明所有的免疫原、肽或核酸均可以包含在人的单位剂量形式中，或包含在包括与人体生理学相容的药物赋形剂的组合物中。
可运用通过万维网ExPasy分子生物学服务器访问的HNN-等级神经网络法(NPS@：Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March Vol.25，No 3[291]：147-150 Combet C.，Blanchet C.，Geourjon C.and Deléage G.)，由一级氨基酸序列来预测161P2F10B和161P2F10B变体的二级结构，即α螺旋、延伸链和无规卷曲的出现和位置。分析显示161P2F10B变体1由31.31％的α螺旋，11.31％的延伸链和57.37％无规卷曲组成。
对161P2F10B变体蛋白可能存在跨膜结构域的分析采用通过万维网ExPasy分子生物学服务器访问的多种跨膜预测算法进行。
实施例7：生产161P2F10B多克隆抗体
多克隆抗体可以在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂，以及需要时注射佐剂。典型地，免疫剂和/或佐剂通过多重皮下或腹膜内注射给哺乳动物注射。另外，为用全长161P2F10B蛋白变体免疫，采用计算机算法来设计免疫原，根据氨基酸序列分析，所述免疫原包括抗原性特征和被免疫宿主的免疫系统识别的特征(参见标题为“抗原性分布图和二级结构”的实施例)。这样的区域被预测为有亲水性、柔性、有β-转角构象并暴露在蛋白质表面。
例如，包含161P2F10B蛋白变体的亲水性、柔性、β-转角区域的重组细菌融合蛋白或肽被用作抗原，在新西兰白兔(New Zealand White rabbits)中生产多克隆抗体或如标题为“生产161P2F10B单克隆抗体(MAb)”的实施例所述产生单克隆抗体。例如，在161P2F10B变体1中，这种区域包括但并不限于氨基酸43-93，100-134，211-246，567-492，500-517和氨基酸810-870。
其它可以利用的重组细菌融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白、LacZ、硫氧还蛋白、NusA或免疫球蛋白的恒定区(参见题为“在原核系统中生产161P2F10B”的部分，以及Current Protocols In Molecular Biology，Volume 2，Unit 16，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995；Linsley，P.S.，Brady，W.，Urnes，M.，Grosmaire，L.，Damle，N.，and Ledbetter，L.(1991)J.Exp.Med.174，561-566)。
除了细菌来源的融合蛋白，也采用了哺乳动物表达的蛋白质抗原。这些抗原由哺乳动物表达载体如Tag5和Fc-融合载体表达(参见题为“在真核生物系统中生产重组161P2F10B”的部分)，并保留翻译后修饰，如在天然蛋白质中发现的糖基化等。在一个实施方案中，将氨基酸45-875克隆入Tag5哺乳动物分泌载体。通过金属螯合层析由稳定表达重组载体的293T细胞的组织培养物上清中纯化重组蛋白质。然后将纯化的Tag5 161P2F10B蛋白用作免疫原。
在免疫操作期间，在佐剂中混匀或乳化抗原对提高宿主动物的免疫应答是有益的。免疫佐剂的实例包括但并不限于完全弗氏佐剂(CFA)和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质体A，合成的海藻糖二棒杆菌酸酯(trehalosedicorynomycolate)。
在典型的操作中，起先用至多200μg，典型地为100-200μg与完全弗氏佐剂(CFA)混合的与KLH偶联的融合蛋白或肽对兔进行皮下免疫。接着用至多200μg，典型地为100-200μg处于不完全弗氏佐剂(IFA)中的免疫原给兔每2周皮下注射一次。每次免疫后大约7-10天取血检验，用ELISA监测抗血清滴度。
为了检验免疫血清(如用Tag5 161P2F10B编码氨基酸58-538免疫获得的兔血清)的反应性和特异性，将各个全长161P2F10B变体cDNA克隆入pCDNA3.1myc-his表达载体(Invitrogen，参见题为“在真核系统中生产重组161P2F10B”的实施例)。将构建体转染至293T细胞后，用抗-变体血清和抗-His抗体(Santa Cruz Biotechnologies)检测细胞裂解物，用Western印迹技术确定对变性变体蛋白的特异反应性。另外，通过对293T和其它重组表达161P2F10B变体的细胞的荧光显微术、流式细胞术和免疫沉淀反应检测免疫血清，确定对天然蛋白质的特异性识别。也可进行应用内源性表达161P2F10B的细胞的Western印迹、免疫沉淀、荧光显微术和流式细胞仪技术以检测反应性和特异性。
通过流经与GST蛋白共价结合的AffiGel基质(BioRad)柱亲和纯化由经Tag5 161P2F10B免疫的兔获得的抗血清。然后通过流经由与MBP-161P2F10B融合蛋白共价结合的AffiGel基质组成的柱子亲和纯化抗血清。接着，进一步通过G蛋白亲和层析来纯化血清以分离IgG组分。通过流经由原始蛋白质免疫原或游离肽组成的柱基质来亲和纯化得自其它被His标记的抗原和肽免疫的兔的血清和耗尽融合配对物的血清。
实施例8：生产161P2F10B单克隆抗体(MAb)
在一个实施方案中，161P2F10B和161P2F10B变体的治疗性单克隆抗体(“MAb”)包含与特异性针对每个蛋白质或特异性针对变体间共同序列的表位反应的MAb，所述MAb会结合、内化、破坏或调制161P2F10B或161P2F10B变体的生物学功能，例如，那些会破坏与配体、底物和结合配对物的相互作用的MAb。用于生产这种MAb的免疫原包括那些经设计编码或包含胞外结构域或全部161P2F10B蛋白序列的区域，经推测含有功能性基元的区域，以及由氨基酸序列的计算机分析推测具有抗原性的161P2F10B蛋白变体的区域。免疫原包括肽和重组蛋白质，如tag5-161P2F10B，一种由哺乳动物表达的纯化的经His标记的蛋白质。另外，使用经逆转录病毒转导而改造的可高水平表达161P2F10B变体1的细胞，例如RAT1-161P2F10B来免疫小鼠。
为了生产161P2F10B的MAb，首先用与适当佐剂混合的5-50μg蛋白质免疫原或106-107个表达161P2F10B的细胞足垫内(FP)免疫小鼠。用于FP免疫的适当佐剂的例子是最初FP注射所用的Titermax(Sigma)和随后免疫所用的明矾凝胶。最初注射之后，每周两次免疫小鼠直至它们被处死。处死小鼠后，摘除淋巴结，收集它们的B-细胞以进行电-细胞融合。
在免疫操作的过程中，取血检验以监测免疫反应的滴度和特异性。在大多数情况下，一旦通过ELISA、Western印迹、免疫沉淀、荧光显微术或流式细胞术分析确定已获得适宜的反应性和特异性，便采用电细胞融合(BTX，ECM2000)进行融合与杂交瘤的产生。
在一个实施方案中，本发明提供了名称如下的单克隆抗体：Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(2，4)4，Ha16-1(3，5)56，Ha16-1(1)11，H16-1.68，H16-1.93，H16-7.8，H16-9.10，H16-9.44，H16-9.69，Ha16-1(1)23，Ha16-1(3，5)36，H16-1.52，H16-1.67，H16-1.86，H16-7.213，H16-9.33，Ha16-1(3，5)27.1，H16-1.61.1，H16-1(3，5)5，H16-7.200，Ha16-1(3，5)42，H16-9.65，H16-1.29.1.1，H16-3.4，H16-1.92.1.1，Ha16-1(3，5)19和H16-1.80。
通过流式细胞术证实上述抗体能与细胞表面161P2F10B反应和结合，通过ELISA证实上述抗体能与固定化的161P2F10B反应和结合。
使用
产生针对161P2F10B的抗体，其中鼠重链和κ轻链基因座已失活，大部分人重链和κ轻链免疫球蛋白基因座被插入。通过用RAT1-161P2F10B细胞免疫能产生人γ1的XenoMice，产生了名称如下的MAb：Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(2，4)4，Ha16-1(3，5)56，Ha16-1(1)11，Ha16-1(1)23，Ha16-1(3，5)36，Ha16-1(3，5)27.1，Ha16-1(3，5)42和Ha16-1(3，5)19。通过用纯化的tag5-161P2F10B免疫能产生人γ1的XenoMice，产生了名称如下的MAb：H16-1.68，H16-1.93，H16-1.52，H16-1.67，H16-1.86，H16-1.61.1，H16-1(3，5)5，H16-1.29.1.1，H16-1.80和H16-1.92.1.1。通过用tag5-161P2F10B免疫能产生人γ2的XenoMice，产生了名称如下的MAb：H16-7.8，H16-9.10，H16-9.44，H16-9.69，H16-7.213，H16-9.33和H16-7.200。
161P2F10B MAb Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(2，4)4，Ha16-1(3，5)56，Ha16-1(1)11，H16-1.68，H16-1.93，H16-7.8，H16-9.10，H16-9.44，H16-9.69，Ha16-1(1)23，Ha16-1(3，5)36，H16-1.52，H16-1.67，H16-1.86，H16-7.213，H16-9.33，Ha16-1(3，5)27.1，H16-1.61.1，H16-1(3，5)5，H16-7.200，Ha16-1(3，5)42，H16-9.65，H16-1.29.1.1，H16-3.4，H16-1.92.1.1和Ha16-1(3，5)19特异性结合重组表达161P2F10B的细胞和癌症异种移植物细胞中表达的内源性细胞表面161P2F10B(图6和图7)。
被称为Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(1)11，H16-1.93，H16-9.69的抗体已于2006年3月28日(经由联邦快递)被送到美国典型培养物保藏中心(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，VA 20108，指定的保藏号分别为PTA-7452和PTA-7450和PTA-7449和PTA-7451。
用Trizol试剂(Life Technologies，Gibco BRL)从各个杂交瘤细胞中分离出mRNA之后，测定编码161P2F10B MAb Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(2，4)4，Ha16-1(3，5)56，Ha16-1(1)11，H16-1.68，H16-1.93，H16-7.8，H16-9.10，H16-9.44，H16-9.69，Ha16-1(1)23，Ha16-1(3，5)36，H16-1.52，H16-1.67，H16-1.86，H16-7.213，H16-9.33，Ha16-1(3，5)27.1，H16-1.61.1，H16-1(3，5)5，H16-7.200，Ha16-1(3，5)42，H16-9.65，H16-1.29.1.1，H16-3.4，H16-1.92.1.1，Ha16-1(3，5)19和H16-1.80的DNA序列。
纯化和定量总RNA。使用Gibco BRL Superscript Preamplification系统，用寡(dT)12-18引发，由总RNA产生第一链cDNA。使用人免疫球蛋白可变重链引物和人免疫球蛋白可变轻链引物来扩增第一链cDNA。将PCR产物克隆至pCRScript载体(Stratagene)。测定几个克隆的序列，确定可变重链和轻链区。
图2和图3列出了可变重链和轻链区的核酸和氨基酸序列。图4A-图4Z和图5A-图5X列出了161P2F10B抗体与种系V-D-J序列的序列比对。
实施例9：筛选、鉴定和表征161P2F10B MAb
使用包括ELISA、FACS、通过表面等离子体共振(BIAcore)(“SPR”)的亲和分级、表位定组、与重组161P2F10B和细胞表面表达的161P2F10B的亲和性的试验组合筛选、鉴定和表征使用题为“生产161P2F10B单克隆抗体(MAb)”的实施例中所述方法产生的抗体。
A.通过FACS筛选161P2F10B人MAb
通过FACS分析进行161P2F10B MAb原代杂交瘤的筛选。方法如下：将50μl/孔杂交瘤上清液(纯净的)或纯化的抗体(经连续稀释)加入96-孔FACS培养板并与表达161P2F10B的细胞(内源性的或重组的，50,000个细胞/孔)混合。将混合物置于4℃保温2小时。保温结束时，用FACS缓冲液洗涤细胞，于4℃，与100μl检测抗体(抗-hIgG-PE)保温45分钟。保温结束时，用FACS缓冲液洗涤细胞，用甲醛固定细胞，并使用FACScan进行分析。使用CellQuestPro软件分析数据。
将由原代筛选物中鉴定出的阳性杂交瘤转移至24-孔培养板，收集上清液以进行确证性筛选。确证性筛选包括对Caki-161P2F10B/Caki-neo，HepG2(人肝癌细胞系)，KU812(人前髓细胞的细胞系)，SKRC-01(人肾肿瘤细胞系)进行的FACS分析和使用Tag5-161P2F10B进行的ELISA。
B.通过ELISA筛选161P2F10B人MAb
通过ELISA筛选161P2F10B MAb以测定抗体同种型。所用方法如下：用Tag5-161P2F10B-ECD或抗-hIgG抗体包被ELISA培养板。在培养板中加入几套检测抗体并保温1小时。洗涤培养板以洗去未结合的抗体，然后，通过与HRP偶联的检测抗体抗-hIgG1，抗-hIgG2，抗-hIgK和抗-hIgL来检测结合的抗体。
C.通过SPR筛选161P2F10B人MAb
SPR可以鉴定和实时表征蛋白质-蛋白质相互作用的动力学和亲和性，因此，是一项能用于选择和鉴定针对感兴趣靶抗原之MAb的技术。使用SPR分析筛选和鉴定针对161P2F10B的杂交瘤上清液和纯化的MAb。通过SPR生物传感器(BIAcore 3000)筛选能产生161P2F10B MAb的杂交瘤的方法如下：将50μl/孔用运行缓冲液(HBS-P，10μg/ml BSA)稀释至1.5-2μg/ml的杂交瘤上清液(纯净的)加入96-孔培养板(BIAcore)，由CM5传感器芯片表面共价固定的山羊-抗-人Fcγ pAb捕获MAb(20μl)。每次运行(循环)在流动室(flow cell)的通道2，3和4上检测三种含MAb的杂交瘤上清液，其中通道1被留作非特异性结合的参照。在测定每个单独的通道中抗原与被捕获的MAb的结合之前，以20μl/分钟的流速将60μl运行缓冲液注射至芯片表面以用作被捕获MAb基线偏移的参照。然后以相同的20μl/分钟的流速将60μl 150nM的纯化重组161P2F10B注射至芯片表面以测定抗原结合。在每轮抗原与MAb的结合之后，通过注射100mM磷酸(1分钟)来剥离任何被捕获MAb的表面，从而进行表面再生。
使用BiaEvaluation 4.1和CLAMP软件(Myszka and Morton，1998)进行数据分析。减去参照并将反应归一化至被捕获MAb的水平之后，使用1:1结合模型使数据完全符合。
由缔合和解离速率常数计算出亲和性。缓慢的解离速率一般表示较高的对MAb的整体亲和性，这一点对于本领域技术人员而言是显而易见的。初步的亲和性数据和解离速率被用作治疗性161P2F10B MAb选择标准的基础。
D.通过FACS进行表位分组
通过评价其对UG-K3(人肾癌细胞系)或KU812细胞的结合模式，根据表位对161P2F10B抗体进行分组。简单地说，使少量的各种抗体生物素化；然后于4℃，在过量(100×)非-生物素化抗体的存在下，使每种生物素化的抗体与KU812一起保温1小时。本领域技术人员应理解：在保温过程中，如果与相同表位结合的话，过量抗体会与生物素化的抗体竞争。在保温结束时，洗涤细胞，于4℃与链霉亲和素-PE保温45分钟。洗下未结合的链霉亲和素-PE之后，使用FACS分析细胞。使用CellQuest Pro软件获得MFI值以用于数据分析。如图8所示，使用UG-K3细胞对25种161P2F10B MAb进行表位分组。细胞被高亮显示以表示自我竞争(100％竞争)，这些细胞中的MFI值是每种生物素化抗体的背景对照。另外，没有颜色的细胞表示两种抗体互相竞争(低MFI)，以灰色高亮显示的细胞(高MFI)表示两种抗体与两种不同的表位结合。结果表明：抗体群体中，具有相同结合模式的抗体会结合相同表位，被检测的抗体中有16个表位组。
E.161P2F10B MAb的结构域作图
为了鉴定含有MAb结合表位的161P2F10B蛋白区域，制备几种编码161P2F10B胞外结构域部分的构建体并用于免疫沉淀实验。将编码161P2F10B的完整胞外结构域(ECD)(氨基酸46-875)、生长调节素-b-样结构域(氨基酸46-157)、催化结构域(氨基酸158-558)、或催化和核酶结构域(氨基酸158-875)的Tag5表达构建体转染至293T细胞，制备细胞裂解物。然后，用所示的161P2F10B MAb或对照MAb对这些裂解物进行免疫沉淀。然后，使用能识别每种重组蛋白质上呈递的His表位标记的抗-His多克隆Ab对免疫沉淀物进行Western印迹。通过裂解物整齐的Western印迹鉴定出每种重组蛋白质的特异性分子量带。通过鉴定出被每种MAb免疫沉淀的重组蛋白质的模式，测定含有每种MAb的结合表位的结构域。将与全长ECD和生长调节素-b-样结构域结合的MAb作图于生长调节素-b-样结构域。将与全长ECD和催化结构域结合，但不与催化+核酶结构域结合的MAb作图于催化结构域。将与全长ECD和催化+核酶结构域结合，但不与催化结构域结合的MAb作图于核酶结构域。所述分析示于图9。如图10所示，所述数据与SPR竞争数据联合可用于同时对与类似或重叠表位结合的MAb进行分组。
F.通过FACS测定亲和性
检测一组共33种人161P2F10B MAb对几种表达161P2F10B的细胞系(HepG2，KU812，SKRC-01和RXF393)上的161P2F10B的结合亲和性。简单地说，于4℃，将23种经1:2连续稀释的纯化抗体与表达161P2F10B的细胞(50,000个细胞/孔)保温过夜，终浓度为167nM至0.01pM。保温结束时，洗涤细胞，于4℃，与抗-hIgG-PE检测抗体保温45分钟。洗涤未结合的检测抗体之后，通过FACS分析细胞。使用CellQuest Pro软件获得每个点的MFI值，并用于使用Graphpad Prism软件和单个位点结合(hyperbola)方程式计算亲和性。表VI简要列出了13种抗体的亲和性数值。
G.通过SPR测定亲和性
通过SPR检测多组纯化的抗-人161P2F10B MAb对纯化的重组161P2F10B的结合亲和性。简单地说，将每种纯化的人MAb捕获于CM5传感器芯片表面。每轮循环每种MAb平均捕获约150RU。将经5-6次连续稀释、浓度为1nM至100nM的重组161P2F10B注射至芯片表面，以产生结合曲线(传感图)，使用CLAMP软件(Myszka and Morton，1998)使结合曲线与1∶1相互作用模型全面符合。表VII显示了几种161P2F10B MAb的亲和性，所述亲和性被表示为使用方程式KD＝kdiss/kassoc通过解离速率常数和缔合速率常数限定的KD。亲和性数据和解离速率以及通过FACS的亲和性分析(参见上文的F部分)是161P2F10B MAb的部分选择标准。
H.与小鼠161P2F10B的交叉反应性
筛选和鉴定MAb与小鼠161P2F10B直向同源物反应的能力。当使用小鼠动物模型时，该特性可用于理解MAb与细胞和组织上的161P2F10B相互作用的结果。克隆小鼠161P2F10B基因，然后将其瞬时转染至293T细胞。为了检测161P2F10B MAb与小鼠161P2F10B的交叉反应性，将抗体与表达鼠161P2F10B的293-T细胞或仅表达neo基因的293T细胞(用作阴性对照)一起保温，将Ku812细胞用作MAb与人16lP2F10B结合的阳性对照。使用抗-hIgG-PE第二检测抗体测定特异性识别。图11图示了显示种间交叉反应性和与人161P2F10B的结合的代表性直方图。结果表明8种抗体与小鼠161P2F10B交叉反应。
I.与猴161P2F10B的交叉反应性
筛选和鉴定161P2F10B MAb与猴源161P2F10B反应的能力。为了毒理学的目的，该特性可用于理解得自不同种的猴的组织上161P2F10B的表达。克隆并测序食蟹猴(cynomolgous mokey)161P2F10B基因。该基因与人161P2F10B的同源性为100％。所有161P2F10B MAb与表达161P2F10B的猴组织的交叉反应性等于与表达161P2F10B的人源细胞和组织的交叉反应性。
实施例10：抗体免疫介导的细胞毒性
ADCC(依赖于抗体的细胞的细胞毒性)是结合有抗体的细胞上由免疫介导的溶胞进攻，所述抗体靶向特异性的细胞表面抗原。免疫细胞通过与
受体结合以识别抗体的Fc部分，所述受体位于能引起导致细胞死亡的溶胞进攻的白细胞、单核细胞和NK细胞的表面。简单地说，在体外使Caki细胞与51Cr保温1小时，所述细胞经改造可表达靶抗原161P2F10B。用新鲜培养基洗涤之后，以不同的效应细胞对靶细胞的比例(E：T比例)，将经标记的细胞与2.5mg/ml抗161P2F10B的人MAb和新鲜分离的外周血单核细胞一起保温。37℃保温4小时之后，缓慢离心细胞，在β计数器中计数含有由死细胞释放的51Cr的上清液。
结果表明：当效应细胞与靶(E:T)细胞比例增加时，依赖于抗体的细胞杀伤有所增加。当E:T比例为50:1或更高时，HA16-1.80和HA16-1.93显示出对Caki-AGS-16细胞的特异性杀伤，而具有g-2同种型的Ha16-9.69在此试验中未显示出活性。通过证实不相关的IgG1对照MAb(H3-1.4)和在缺乏抗体的情况下保温靶细胞和效应细胞(细胞+PBMC)不会导致细胞杀伤，可以确定试验的特异性(参见表VIII)。
实施例11：抗体介导的二次杀伤
抗161P2F10B的MAb在KU-812细胞中介导依赖于皂草毒蛋白的杀伤。KU-812细胞是表达高水平内源性161P2F10B的CML细胞系。在第一天，将KU-812细胞(3000个细胞/孔)接种于96孔培养板。第2天，在每孔中加入等体积的培养基，其中含有2倍浓度的所示第一抗体以及2倍过量的与皂草毒蛋白毒素(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA)偶联的抗人(Hum-Zap)多克隆抗体。将细胞置于37℃保温5天。在保温期结束时，在每孔中加入MTS(Promega)，再继续保温4小时。然后测定450nM下的光密度。
图12中的结果表明161P2F10B MAb HA16-9.69，HA16-1.18和HA16-1.93在KU-812细胞中介导依赖于皂草毒蛋白的细胞毒性，而对照，即非特异性人IgG1(H3-1.4)和另一种161P2F10B MAb(HA16-7.200)却没有此效果。这些结果表明：使用适当的161P2F10B MAb，可将药物或细胞毒性蛋白质选择性地传递至KU-812和其它表达161P2F10B的细胞。
实施例12：产生F(Ab’)2片段
产生MAb的F(Ab’)2片段可用于在体外和体内治疗性模型中研究MAb分子的作用，所述MAb分子保留了其二价抗原结合位点，但缺乏免疫效应物Fc结构域。一般说来，方法如下：将20mg溶于20mM醋酸钠缓冲液pH4.5的MAb与和不与固定化的胃蛋白酶(Pierce.Rockford IL)保温所示的一段时间。通过A蛋白层析除去完整的MAb和经消化的Fc片段。试剂可用于治疗携有表达161P2F10B之肿瘤的动物。用此抗体片段观察到的抗-肿瘤活性可将内在的生物活性与由依赖于免疫的机制介导的活性区分开来的。
实施例13：使用重组DNA法表达人MAb
为了在经转染的细胞中重组表达161P2F10B MAb，分别将161P2F10BMAb可变重链和轻链序列克隆至人重链IgG1和轻链Igκ恒定区的上游。将完整的161P2F10B MAb人重链和轻链盒克隆至克隆载体中CMV启动子/增强子的下游。聚腺苷酸化位点位于MAb编码序列的下游。将表达重组161P2F10B MAb的构建体转染至293T，Cos和CHO细胞。评价由重组细胞分泌的161P2F10B MAb与细胞表面161P2F10B的结合。
实施例14：161P2F10B肿瘤生长促进的体内分析
通过评价表达或缺乏161P2F10B的细胞的肿瘤发育和生长，体内评价161P2F10B蛋白对肿瘤细胞生长的影响。例如，在SCID小鼠的两肋皮下注射1×106个包含tkNeo空载体或161P2F10B的肾癌细胞系(如UG-K3)。至少可以使用两种策略：(1)在启动子的调节下组成型表达161P2F10B，所述启动子如得自病毒基因组或异源哺乳动物启动子的组成型启动子，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒(UK 2,211,504，公开于1989年7月5日)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)，异源哺乳动物启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，条件是所述启动子与宿主细胞系统相容，和(2)在可诱导的载体系统，例如蜕皮素、四环素等控制下可调节地表达，条件是所述启动子与宿主细胞系统相容。然后通过测径器测量监测可触及的肿瘤表现出的肿瘤体积，接着随着时间推移测定是否表达161P2F10B的细胞以更快的速率生长以及是否由表达161P2F10B的细胞生成的肿瘤显示了变化了的攻击特征(例如增强的转移、血管化，对化疗药物的反应性降低)。
此外，可向小鼠常位移植1×105个同样的细胞从而测定是否161P2F10B对肾的局部生长有影响，以及161P2F10B是否会影响细胞的转移能力(Miki Tet al，Oncol Res.2001；12：209；Fu X et al，Int J Cancer.1991，49：938)。通过胫骨内注射肾或肝肿瘤细胞可评估161P2F10B对肿瘤形成和生长的影响。
该分析还有助于测定候选治疗组合物的161P2F10B抑制作用，所述合成物如161P2F10B内体、161P2F10B反义分子以及核酶。
实施例15：161P2F10B单克隆抗体介导的体内肿瘤抑制
161P2F10B在肿瘤组织细胞表面的显著表达，以及其在正常组织内的限制性表达使得161P2F10B成为抗体治疗的出色靶点。相似地，161P2F10B是基于T细胞免疫治疗的靶点。因此，通过使用如RXF-393和HepG2的细胞系以及人肾明细胞异种移植模型，如UG-K3评价161P2F10B MAb在人肾癌异种移植小鼠模型和人肝癌异种移植小鼠模型中的疗效。
在例如小鼠常位肾或肝癌异种移植模型中研究抗体对肿瘤生长和转移形成的效能。如本实施例中所讨论的，抗体可以是未偶联的，或可以与其它药物相偶联，这一点是本领域技术人员能理解的。161P2F10B MAb抑制肾和肝癌异种移植物的形成。161P2F10B MAb还阻碍了已建立的常位肿瘤的生长并延长了荷瘤小鼠的存活时间。这些结果表明161P2F10B MAb可用于治疗局部和晚期肾和肝癌以及表I中所列癌症。
给予161P2F10B MAb可以导致阻碍已建立的常位肿瘤的生长并抑制向远处位点的转移，从而显著延长荷瘤小鼠的存活时间。这些研究显示161P2F10B是免疫治疗的有吸引力的靶点，并表明了161P2F10B MAb治疗局部和转移肾和肝癌的治疗潜力。该实施例表明未偶联的161P2F10B MAb能有效抑制生长于SCID小鼠体内的人肾肿瘤异体移植物的生长；相应地，所述有效的MAb的联合也是有效的。
使用多个161P2F10B MAb抑制肿瘤
材料和方法
161P2F10B单克隆抗体：
如题为“生产161P2F10B单克隆抗体(MAb)”的实施例中的描述，产生针对161P2F10B的单克隆抗体。用ELISA、Western印迹、FACS以及免疫沉淀法表征此MAb结合161P2F10B的能力。由ELISA和Western分析测定的161P2F10B MAb表位作图数据识别161P2F10B蛋白上的表位。用这些抗体进行正常和癌症组织和细胞的免疫组化分析。
通过G蛋白或A蛋白Sepharose层析从腹水或杂交瘤组织培养物上清液中纯化MAb，对着PBS进行透析，过滤消毒，并于-20℃贮存。通过Bradford试验(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白质的量。制备治疗用MAb或包含各个MAb的混合物的混合物，并用于治疗接受皮下或常位注射UG-K3和RXF-393肿瘤异体移植物的小鼠。
细胞系和异种移植物
肾癌细胞系RXF-393和SKRC01以及肝癌细胞系HepG2(美国典型培养物保藏中心)分别维持于添加有L-谷氨酰胺和10％ FBS的RPMI和DMEM中。
通过皮下(s.c.)套针(trocar)植入物(Craft，N.et al.，Nat Med.1999，5：280)将UG-K3异种移植物传入6至8周龄雄性ICR-重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Taconic Farms)体内。按Craft等人所述制备UG-K3肿瘤细胞的单细胞悬浮液。还使用了其它细胞系。
异种移植小鼠模型
在雄性SCID小鼠右肋注射与Matrigel(Collaborative Research)以1:1的稀释度混合的1×106个癌细胞，从而生成皮下(s.c.)肿瘤。为了测试抗体对肿瘤形成的效能，在注射肿瘤细胞的同一天开始注射抗体。作为对照，给小鼠注射纯化的小鼠IgG(ICN)或PBS；或识别人细胞不表达的无关抗原的纯化MAb。在前期研究中，没有发现小鼠IgG或PBS之间对肿瘤生长的差异。肿瘤大小通过测径器测定，肿瘤体积由长度×宽度×厚度计算。皮下肿瘤直径大于1.5cm的小鼠被处死。
使用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后进行常位注射。为了进行肾常位研究，切开一穿过腹肌的切口暴露出肾，UG-K3或RXF-393肿瘤细胞(2×106)与Matrigel的混合物以10μl的体积被注射入肾囊。为了监测肿瘤生长，小鼠被触诊。为了合适的治疗将小鼠分组，腹膜内注射抗161P2F10B或对照MAb。
161P2F10B MAb抑制表达161P2F10B的异种移植肿瘤的生长
使用UG-K3和RXF-393常位模型测试161P2F10B MAb对肿瘤形成的影响。与s.c.肿瘤模型相比，需要将肿瘤细胞直接注射入小鼠肾的常位模型导致局部肿瘤生长，远处位点转移的发展，小鼠健康的恶化，以及随后的死亡。这些特征使得常位模型更能代表人类疾病的进程并使我们能跟踪MAb对临床上相关终点的疗效。
相应地，将肿瘤细胞注射入小鼠肾中，2天后，将小鼠分成两组，使用a)250-1000μg的161P2F10B MAb或b)对照抗体治疗，每周三次，持续二至五周。
常位癌症模型的主要优势在于能研究转移的发展。通过用IHC分析组织切片来研究荷有已建立的常位肿瘤的小鼠中转移的形成。
异种移植癌症模型的另一个优点是能研究新血管形成和血管发生。肿瘤生长部分取决于新血管的生成。尽管毛细血管系统和正在生成的血液网络源自宿主，但新血管结构的起始和构造由异种移植肿瘤调节(Davidoffet al.，Clin Cancer Res.(2001)7：2870；Solesvik et al.，Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20：1295)。根据本领域已知的方法，如通过IHC分析肿瘤组织及其周围的微环境来研究抗体和小分子对新血管形成的影响。
在4周时间内，注射161P2F10B MAb或对照抗体以对荷有已建立的常位肿瘤的小鼠进行给药。两组小鼠均允许建立高肿瘤负荷，从而确保小鼠肺转移形成的高频率。然后处死小鼠，通过IHC分析它们的膀胱、肝脏、骨和肺中是否存在肿瘤细胞。这些研究在异种移植小鼠模型中证明了抗-161P2F10B抗体对肾癌的起始和发展具有广泛的抗肿瘤效能。抗-161P2F10B抗体抑制肿瘤的形成，并阻碍已建立的肿瘤的生长，从而延长所治疗小鼠的存活时间。此外，161P2F10B MAb显示了对局部肾肿瘤扩散至远处位点的引人注目的抑制作用，甚至在大肿瘤负荷存在时同样起效。因此，161P2F10B MAb对多数临床上相关终点(肿瘤生长)、存活期的延长以及健康有效。
161P2F10B MAb对小鼠体内人肾细胞癌生长的作用
使用了下述方法。将得自患者的明细胞肾癌UG-K3细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为750μg，到第27个研究日为止，总共给药8个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb H16-1.29.1.1，Ha16-1(3，5)27.1，H16-9.69和Ha16-1(1)11在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(p<0.05)(图13)。
在另一个实验中，将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只小鼠)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，到第20个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAb Ha16-11(3，5)27和Ha16-1(3，5)18在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(p<0.05)(图14)。
在另一个实验中，将人肾癌RXF-393肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为400μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAbHa16-1(3，5)18(P<0.01)，H16-1.68(P<0.05)和H16-9.44(P<0.05)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物RXF-393的生长(图15)。
在另一个实验中，将人肾癌SKRC-01肿瘤细胞(2.5×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为250μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAbH16-1.68(P<0.05)，H16-7.8(P<0.05)，H16-9.44(P<0.05)和H16-3.4(P<0.01)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物SKRC-01的生长(图16)。
在另一个实验中，将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为750μg，到第19个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAbH16-1.29.1.1(P<0.05)，Ha16-1(3，5)56(P<0.01)和Ha16-1(2，4)4(P<0.05)在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(图17)。
在另一个实验中，将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，每次剂量为500μg，到第22个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明161P2F10B MAbH16-1.93和Ha16-1(3，5)18在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.05)(图18)。
混合型161P2F10B MAb对小鼠体内人肾癌生长的作用
在此实验中，将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只)，在第0天，如图所示进行腹膜内(i.p.)治疗。为了用161P2F10B MAb进行治疗，在每个给药剂量中将各为200μg的三种MAb混合在一起。每周给予动物两次治疗，到第27个研究日为止，总共给药7个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。结果表明使用161P2F10B MAb混合物的组合疗法在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.05)(图19)。
161P2F10B MAb与
(bevacizuMAb)的组合治疗对小鼠体内人肾
癌异种移植物生长的作用
在此实验中，将人肾癌UG-K3肿瘤细胞(2.0×106个细胞)皮下注射至雄性SCID小鼠。将小鼠随机分组(每组10只小鼠)，在第0天，如图所示，腹膜内(i.p.)用治疗性MAb、Avastin或同种型MAb对照开始治疗。每周给予动物两次治疗，到第18个研究日为止，总共给药6个剂量。如图所示，每隔3至4天，使用测径器测量以监测肿瘤的生长。
结果表明：当161P2F10B MAb H16-1.93和Ha16-1(3，5)18.1与
(bevacizumab)组合时，在统计学意义上能显著抑制移植到SCID小鼠皮下的人肾癌异种移植物UG-K3的生长(P<0.01)(图20)。
这些实验结果表明：161P2F10B MAb可用于治疗和诊断目的以治疗和处理表I所示的癌症。
实施例16：抗-161P2F10B抗体对人类的治疗和诊断应用
抗-161P2F10B单克隆抗体可安全有效地用于人类的诊断、预防、预测和/或治疗目的。使用抗-161P2F10B MAb对癌症组织和癌症异种移植物进行的Western印迹和免疫组化分析显示肿瘤中有大面积强染色，而正常组织中显著减低或检测不到。在癌中和转移性疾病中检测到161P2F10B证明MAb可用作诊断和/或预测指示剂。因此抗-161P2F10B抗体可用于诊断应用，例如肾活检样品的免疫组化分析以检测可疑患者是否患有癌症。
如流式细胞术所测定的，抗-161P2F10B MAb特异性地结合癌细胞。因此，抗-161P2F10B抗体被用于诊断性的全身显象，例如放免液闪法和放射免疫疗法(参见例如Potamianos S.et al.，Anticancer Res 20(2A)：925-948(2000))以检测显示有161P2F10B表达的局部和转移的癌。161P2F10B细胞外结构域脱落或释放于细胞外环境，如用碱性磷酸二酯酶B10所观察到的那样(Meerson，N.R.，Hepatology 27：563-568(1998))，允许通过抗-161P2F10B抗体在可疑患者的血清和/或尿样中诊断性检测161P2F10B。
特异性结合161P2F10B的抗-161P2F10B抗体被用于治疗表达161P2F10B的癌症。抗-161P2F10B抗体以非偶联模式应用或以偶联模式应用，其中在偶联模式中，抗体与本领域所熟知的多种治疗或显像模式中的一种，例如前药、酶或放射性同位素结合。在临床前研究中，在SCID小鼠癌异体移植模型，例如肾癌模型中测试了未偶联的和偶联的抗-161P2F10B抗体对肿瘤预防和生长抑制的效能(参见例如题为“161P2F10B单克隆抗体介导的体内肿瘤抑制”的实施例)。偶联的和未偶联的抗-161P2F10B抗体被用作人类临床试验的治疗形式，可单独使用或与其它的治疗方法联合应用，在如下实施例中进行了描述。
实施例17：通过使用161P2F10B MAb治疗和诊断人癌症的人类临床试
验
本发明所使用的抗体会识别161P2F10B上的表位，被用于治疗一些肿瘤，优选表I中所列出的肿瘤。与各适应症相结合，成功地推行了三种临床方法。
I.)辅助治疗：在辅助治疗中，使用161P2F10B MAb(裸露或与药剂偶联)联合化疗或抗肿瘤药物和/或放疗或其组合治疗患者。通过在标准一线和二线治疗中加入161P2F10B MAb，根据标准方案治疗原发癌靶，例如表I所列出的癌症。方案设计的有效性通过下述例子进行评价，所述例子包括但不限于：原发或转移损害的肿瘤体积缩小、无进展存活的增加、全面存活、患者健康状况的改善、疾病稳定化以及降低标准化疗剂和其它生物药剂的常规剂量的能力。这些剂量的降低通过降低化疗或生物药物的剂量-相关毒性而允许额外的和/或延长的治疗。在几种辅助临床试验中，161P2F10B MAb与化疗或抗肿瘤药物联合使用。
II.)单一疗法：关于161P2F10B MAb(裸露的或偶联的)在肿瘤单一疗法中的应用，给予患者抗体而不给予化疗或抗肿瘤药物。在一个实施方案中，单一疗法在临床上用于有广泛转移性疾病的末期癌症患者。方案设计的有效性通过下述例子进行评价，所述例子包括但不限于：原发或转移损害的肿瘤体积缩小、无进展存活的增加、全面存活、患者健康状况的改善、疾病稳定化以及降低标准化疗剂和其它生物药剂的常规剂量的能力。
III.)显像剂：通过将放射性核素(例如碘或钇(I131，Y90))与161P2F10BMAb相连，经放射性标记的抗体可用作诊断和/或显像剂。在这一作用中，经标记的抗体定位于实体瘤以及表达161P2F10B的细胞的转移病灶。关于161P2F10B MAb作为显像剂的应用，该抗体被用作外科治疗实体瘤的辅剂，包括手术前筛选以及手术后随访测定肿瘤残留和/或复发。在一个实施方案中，(111In)-161P2F10B抗体被用作I期人临床试验的显像剂，其中患者的肿瘤表达161P2F10B(类比参见例如Divgi et al J.Natl.Cancer Inst 83：97-104(1991))。接着对患者进行标准的前部和后部γ照相。结果表明：鉴定出原发的损害和转移的损害。
剂量
可调节剂量方案以提供最佳的合乎需要的反应。例如，可以进行单次推注(single bolus)，可在一定的时间内施用几个分开的剂量，或在治疗过程中出现紧急状况时，成比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位的形式配制非肠道组合物，这样可以易于给药并使剂量均一。本文所用的剂量单位形式指的是作为单一剂量适用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上分离的单元；每个单元含有预定量的活性化合物和所需的药物载体，经计算该化合物可产生所需的治疗效果。本发明剂量单位形式的说明书受制于和直接依赖于(a)抗体的独特性质和欲取得的特殊治疗或预防效果，和(b)化合所述活性化合物以治疗个体敏感性的技术中内在的局限性。
例如，根据本发明联合使用的治疗有效量抗体的非限制性范围是：至少1mg/kg，至少5mg/kg，至少10mg/kg，大于10mg/kg，或至少15mg/kg，例如1-21mg/kg，或例如5-21mg/kg，或例如5-18mg/kg，或例如10-18mg/kg，或例如15mg/kg。本发明的高剂量实施方案与大于10mg/kg的剂量相关。应注意剂量值可根据欲缓解的疾病类型和严重性进行改变，可包括单个或多个剂量。还应进一步理解对于任何特定的受试者而言，应根据个体需要和施用或负责施用组合物的人士的职业判断，随时间调整特定的剂量方案，本文给出的剂量范围仅是举例，不应将其理解为对所要求保护的组合物的范围或实践的限制。
临床开发计划(CDP)
CDP追随并发展了161P2F10B MAb连同辅助治疗、单一治疗以及作为显像剂的治疗方法。在重复剂量中，试验最初证明了安全性随后证实了有效性。试验为公开标记，比较了标准化疗与标准治疗加161P2F10B MAb。如所理解的，可用于选择患者的一个非限制性标准是通过活检测定的其肿瘤中161P2F10B的表达水平。
对于任何基于蛋白质或抗体输注的治疗，安全性考虑主要涉及(i)细胞因子释放综合征，即，低血压、发热、振颤、寒战；(ii)对材料的免疫原性反应的发生(即，接受抗体治疗的患者产生人抗体，或HAHA反应)；以及，(iii)对于表达161P2F10B的正常细胞的毒性。标准测试和随访被用于监测上述各种安全性考虑。发现161P2F10B MAb用于人类是安全的。
实施例18：161P2F10B功能研究
A.RNA干扰(RNAi)
RNAi是由双链RNA(dsRNA)激活的转录后基因沉默机制，RNAi诱导特异性mRNA降解，导致蛋白质表达发生改变，随后会改变基因的功能。RNAi技术在哺乳动物细胞中已被成功用于沉默靶向的基因。在哺乳动物细胞中，这些dsRNA(也被称为短的干扰RNA或siRNA)激活RNAi途径，导致靶序列特异性mRNA的降解。参见Elbashir S.M.，et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAsMediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells，Nature411(6836)：494-8(2001)。
相应地，使用RNAi研究161P2F10B抗原的功能。为了产生161P2F10B特异性的siRNA，使用能预测寡核苷酸的算法，所述寡核苷酸表现出至关重要的分子参数(G:C含量，解链温度等)，当被导入细胞时，能显著降低161P2F10B蛋白的表达水平。根据此实施例，所使用的161P2F10B siRNA组合物对应于161P2F10B蛋白或其亚序列的核酸ORF，5’或3’非翻译序列。因此，按此方式使用的siRNA亚序列一般长度为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35或35个以上邻接的RNA核苷酸。这些siRNA序列与mRNA编码或非编码序列的至少一部分互补和非-互补。在优选实施方案中，亚序列的长度为19-25个核苷酸，最优选长度为21-23个核苷酸。在优选实施方案中，这些siRNA在表达161P2F10B抗原的细胞中能实质性地击倒该蛋白质，还具有通过模拟对161P2F10B靶的抑制作用逆转在特定疾病中发现的表型的潜能。因此，将基因击倒与功能性细胞表型相联系对于得出有效结论和排除毒性或其它非特异性效果是至关重要的。
为了证实我们的方法，通过使用荧光激活的细胞分选(FACS)进行细胞表面染色并通过Western印迹(WB)，评价在HepG2肝癌细胞中经RNAi转染后161P2F10B的沉默水平。制备了下述样品：LF2k(仅用转染试剂LF2k处理的细胞)，对照siRNA双链体CT1和161P2F10B特异性双链体Qa(序列公布于下文)。哺乳动物siRNA转染：在siRNA转染前一天，以2×103个细胞/孔(96孔培养板的形式)的密度，将细胞系铺于80μl培养基(RPMI 1640+10％ FBS w/o抗生素)。与161P2F10B特异性siRNA oligo相平行，在每一个实验中包括下述序列作为对照：a)Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)和退火缓冲液(LF2k)的模拟转染细胞；b)CT1非特异性siRNA(靶向序列：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)(SEQ ID NO：166)；c)Eg5特异性siRNA(靶向序列：5′-AACTGAAGACCTGAAGACAA TAA-3′)(SEQ ID NO：167)和161P2F10B特异性siRNA Qa(靶向序列5’-AACCTCATGGCTGGAAGAAAA-3’)(SEQ ID NO：168)。以所示浓度和1μg/mlLipofectamine 2000终浓度使用siRNA。
方法如下：首先用OPTIMEM(无血清转染培养基，Invitrogen)稀释siRNA至0.1μM(10倍浓缩)并于室温保温5-10分钟。针对转染总数，将Lipofectamine2000稀释至10μg/ml(10倍浓缩)并于室温(RT)保温5-10分钟。使适量的经稀释的10倍浓缩的Lipofectamine 2000以1:1的比例与经稀释的10倍浓缩的siRNA混合，并于室温(RT)保温20-30”(5倍浓缩的转染溶液)。将20μl 5倍浓缩的转染溶液加至各个样品中，37℃保温96小时再作分析。在每种情况下，在用161P2F10B特异性PE-标记的MAb 97A6(Beckman-Coulter)进行FACS分析或进行WB分析之前，将细胞保温72小时。通过FACS和WB检测发现：161P2F10B siRNA双链体Qa能有效下调靶基因(图21)。
本发明的另一个实施方案是分析161P2F10B在细胞增殖中的作用的方法。细胞增殖控制的丧失是癌细胞的标志，因此，我们致力于在细胞增殖试验中研究特异性161P2F10B蛋白沉默的作用。经标记前体(即3H-胸苷)在DNA中的掺入与培养物中出现的细胞分裂的量直接成比例。用不同浓度(200nM至20pM)的对照siRNA双链体(阴性对照CT1和阳性对照Eg5)以及161P2F10B siRNA双链体Qa处理HepG2细胞，通过3H-胸苷掺入试验评价它们对细胞增殖的影响。图22A所示的数据表明：161P2F10B的细胞表面水平(图21)与细胞增殖相关，因为在这些条件下，161P2F10B蛋白水平的降低对应于对细胞合成DNA能力的影响。
另一种用于测定细胞增殖的方法是进行克隆发生/集落形成试验。在这些试验中，将限定数目的细胞铺于适当的基质上，对经siRNA处理后生长一段时间后所形成的集落数目和大小进行评价。用下述siRNA双链体的LF2k处理161P2F10B阳性HepG2细胞或161P2F10B阴性UMUC3细胞：CT1，Eg5和161P2F10B Qa。如图22B所示，161P2F10B Qa双链体仅能降低内源性表达161P2F10B的细胞所形成集落的数目和大小，在UMUC3阴性细胞中不起作用，这与先前观察到的对细胞增殖的作用有关。总体上看，数据表明癌症表型的主要标志，即细胞增殖和生长受癌细胞中161P2F10B表达的调节。
细胞迁移在多种生物现象中起着关键性的作用。在成年生物体中，细胞迁移在正常生理和病理状态下都表现突出。在转移中，肿瘤细胞由最初的肿瘤块迁移至身体的其它部位定居。通过几种不同的方法评价细胞迁移，其中被最广泛接受的是Boyden室试验。该试验使用了中空的塑料穿孔(transwell)室，室中具有带孔的膜(必要时膜可被胞外基质包被)。该室悬挂在较大的孔上，孔中可含有培养基加上化学引诱剂。将细胞放置于室中，使其穿过孔迁移至膜的另一边；然后染色并计数迁移的细胞。着手研究161P2F10B在调节细胞迁移中的潜在作用。在Boyden室迁移试验中，在两个内源性表达161P2F10B的细胞系(HepG2和A-704)中检测选定161P2F10B Qa双链体。如图23所示，在A-704(肾明细胞癌)和HepG2(肝癌)系统中，相对于对照oligo CT1而言，用oligo Qa沉默161P2F10B能显著降低被胶原I包被的插入物上细胞迁移的水平。
为了进一步支持161P2F10B在细胞迁移中的作用，我们研究了支撑该表型的分子机制。驱动细胞游动性的主要信号传导网络之一是Rho/Rac/Cdc42途径。Rho是小GTP酶家族的成员，它对胞外信号作出反应后进行肌动蛋白细胞骨架重构，籍此调节细胞形态学和游动性。有活性的Rho能增加基于肌动蛋白的结构，如应力纤维和黏着斑的稳定性。Rho活性的失调通过重构肌动蛋白细胞骨架和基因表达控制与细胞增殖和细胞游动性的改变相关。我们使用Rhotekin下拉(pull down)试验来评价161P2F10B表达是否能调节Rho活性，所述试验使用了Rhotekin蛋白，该蛋白质能特异性结合并沉淀细胞裂解物中有活性的GTP-Rho，而不是无活性的GDP-Rho。图23B表明：161P2F10B沉默能显著降低HepG2细胞表面的161P2F10B表达，同时可降低肝细胞生长因子(HGF)-诱导的Rho B激活(Rho B-GTP)。图23的结果合起来表明：161P2F10B通过激活Rho-家族的GTP酶(Rho B)在癌细胞迁移中发挥作用，161P2F10B对于肿瘤发生过程中表达161P2F10B的癌细胞的迁移至关重要。
对于161P2F10B基因而言，RNAi研究有利于理解基因产物在癌症途径中的贡献。所述有活性的RNAi分子可用于鉴定试验，以筛选出可用作活性抗肿瘤治疗剂的MAb。另外，可将siRNA作为治疗剂给癌症患者施用，从而降低几种癌症类型，包括表I所列癌症的恶性生长。当161P2F10B在细胞存活、细胞增殖、肿瘤发生或细胞凋亡中起作用时，可将其用作诊断、预测、预防和/或治疗目的的靶标。
B.表达161P2F10B的细胞中161P2F10B-调制的ATP-诱导的Ca2+移动 试验
161P2F10B是能水解嘌呤核苷酸ATP的细胞表面焦磷酸酶/磷酸二酯酶(PDE)。PDE催化结构域第205位氨基酸的苏氨酸至丙氨酸突变(T205A)消除了161P2F10B的PDE活性(图24)。除了ATP外，已知其它基于嘌呤的类似物可以是161P2F10B酶活性的底物。存在于细胞外环境的ATP能调制多种生物反应，其中的一些通过结合和激活与P2Y G-蛋白偶联的受体(GPCR)来介导，所述受体通过细胞内储藏室的Ca2+移动，和通过P2X配体门控Ca2+通道来诱导信号传导，所述通道可调制细胞外来源的Ca2+流量(参见McLarnon，J.G.(2005)J.NeuroSci.Res.81：349-356)。因此，我们研究了ATP对表达161P2F10B的细胞中钙移动的作用。161P2F10B在Caki细胞系中的过表达导致胞质钙移动对嘌呤核苷酸和嘌呤核苷酸类似物处理作出反应，出现明显的差异。我们利用单细胞显像记录表达野生型161P2F10B(wt)，不具有PDE活性的161P2F10B T205A突变体的Caki-1细胞或仅表达新霉素抗性基因(neo)的对照Caki-1细胞对嘌呤配体ATP，ATPγ-S(不能被水解的ATP类似物)，AMP和腺苷作出反应而导致的细胞内Ca2+移动。结果示于图25。
按下述进行实验：将Caki-1-neo，或Caki-1-161P2F10B，或Caki-1-161P2F10B T205A突变体细胞铺于用胶原预包被的分室盖玻片上过夜；用无血清培养基洗涤细胞，37℃用fura---2染料(3μM，溶于无血清培养基中)覆盖30分钟，接着洗涤细胞，于37℃再与无血清培养基保温30分钟。然后用Ringers’溶液(20mM HEPES，pH7.4，130mM NaCl，5mM KCl，3mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM葡萄糖)取代培养基，通过在倒置显微镜(Nikon 2000TS)下对细胞内Ca2+[Ca2+]I进行比值测量(ratiometric)显像以分析细胞，测定FURA-2，所述显微镜配备有20×物镜，与LAMBDA-10B滤光轮(Sutter)匹配的340/380nm激发滤光片，二色(电子束分裂器)滤光器和与滤光器立方体匹配的发射光滤光器(CHROMA)。在MetaFluor 6.2显像软件(Molecular DevicesCorp.)的控制下，使用ORCA-ER Hamamatsu CCD照相机，在互换的波长(340/380nm)下获得成对的图像，从而得到成比例的图像。
在Ringers’溶液中将所有研究的化合物制备成400uM的储液，以100μM的终浓度添加至含有细胞的室中。尽管ATP在所有三个细胞系中都引发了强有力的Ca2+移动反应，但它们之间的反应动力学和反应模式有着显著差异：Neo和161P2F10B酶活性已“死亡”的突变体显示出高振幅和频率的钙振动，而表达野生型161P2F10B(wt)的细胞表现出起初的Ca2+流量，所述Ca2+通量以较低频率和较长持续时间的最小振动波随时间逐渐衰变。不可水解的ATP类似物ATPγS在所有三个细胞系中诱导类似的“波-样”振动反应。总之，这些数据表明：161P2F10B的焦磷酸酶/磷酸二酯酶活性在表达161P2F10B的Caki-1细胞中通过将ATP裂解成AMP和焦磷酸，耗尽细胞外介质中的ATP，从而介导对Ca2+振动的抑制作用。另外，腺苷和腺苷单磷酸(AMP)这两种ATP的潜在代谢物不会在任何细胞系中引发钙反应，这表明反应是由ATP激活的GPCR P2Y家族介导的，而不是由腺苷或AMP激活的受体介导的。
Ca2+移动试验和监测由P2Y受体激活的细胞内信号传导途径能够筛选出化合物、药物、抗体和蛋白质，这些物质能调制161P2F10B的PDE活性，导致表达161P2F10B的细胞和组织中ATP和其它嘌呤核苷酸反应的抑制或改变。与在野生型161P2F10B中的平稳不变的反应相对比，161P2F10B突变体或Neo细胞中钙振动的意义在于：正常消退的钙反应与细胞增加的增殖能力相关(参见Schreiber，R.，2005，J.Membrane Biol.205：129-137)。钙移动导致钙调蛋白和CamKII细胞增殖组分的激活，从而诱导对细胞生长途径Ras-Raf轴的刺激(参见Agell，N.，Bachs，O.，Rocamora，N.，and Villalonga，P，2002，Cellular Signaling 14：649-654)。因此，钙是刺激细胞生长程序的重要元素。由ATP介导的P2Y受体的激活导致磷脂酶C激活和下游信号转导事件(参见Communi，D.，et.al.，2000，Cellular Signaling 12：351-360)。细胞外ATP在为依赖于ATP的胞外酶和转运蛋白提供能量时起作用，它是DNA的组建模块，也能刺激细胞增殖。另外，161P2F10B的PDE活性可为肿瘤细胞提供来自ATP(ADP，AMP，腺苷，无机磷酸)和其它嘌呤核苷酸的代谢物，这些代谢物是肿瘤细胞生长的重要营养物。这些结果合起来表明：161P2F10B为影响肿瘤细胞生长和存活的细胞外ATP提供调节功能。
C.通过重组161P2F10B胞外结构域(ECD)和MAb的调制作用使人脐静 脉内皮细胞的血管生成(管形成)增强
血管生成是维持肿瘤生长、营养和氧合的重要事件。内皮细胞生长和迁移是血管生成的标志，对所述细胞的刺激需要多种血清生长因子，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)。为了研究161P2F10B是否有利于原代内皮细胞的血管生成，我们建立了试验以检测161P2F10B胞外结构域(ECD)(氨基酸46-875)对铺于Matrigel上的内皮细胞网络(管)形成的作用。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人肺微血管内皮细胞(HMVEC)接种于含10％FBS的培养基中，培养至70％铺满(2代至6代)。在1:1胰蛋白酶：PBS或10mM EDTA中分离细胞，洗涤并重新悬浮于EBM-0.1％ FBS。在细胞中加入重组161P2F10B ECD(描述于题为“在真核系统中生产重组161P2F10B”的实施例)，然后于37℃，在200μl Matrigel层中保温8-16小时。通过显微镜和照相术捕获的数据定量管形成。图26显示了161P2F10B ECD诱导内皮细胞管的形成，用10％ FBS处理能产生类似的管，然而，使用161P2F10B ECD观察到较少的闭合网络，而对照ECD不会产生超出0.1％ FBS对照的管。图27表明：161P2F10B的PDE酶活性失活的161P2F10B催化结构域(T205A)的突变或推定的整联蛋白结合RGD序列(D80E)的突变导致降低的管形成，这些数据表明161P2F10B的PDE活性是所观察到的HUVEC管形成所必需的。这些结果合起来表明：161P2F10B蛋白通过其PDE活性参与促进血管生成，所述PDE活性有利于肿瘤生长、肿瘤细胞侵入和/或肿瘤血管生成所需的内皮细胞激活。
D.通过重组161P2F10B胞外结构域(ECD)使内皮细胞的迁移增强
迁移的增强是血管生成和癌细胞表型的标志。为了研究161P2F10B蛋白对正常内皮细胞迁移的影响，用161P2F10B ECD处理HUVEC，并在无血清的条件下(0.1％ BSA)进行检测。将细胞在0.5％ FBS中培养过夜，洗涤，然后与用VEGF，10％ FBS或161P2F10B ECD处理的细胞进行比较。通过Boyden室试验评价细胞在transwell中的迁移。图29的结果表明：内皮细胞生长因子VEGF或10％ FBS(阳性对照)以及浓度渐增的重组161P2F10B ECD可增加HUVEC细胞的迁移。这些结果表明：被161P2F10B蛋白处理的HUVEC细胞在低血清条件下具有增强的迁移能力。因此，表达161P2F10B的细胞能在体内诱导增加的内皮细胞迁移潜能。
E.161P2F10B在KU-812细胞上的二聚体化
161P2F10B蛋白含有不同的胞外结构域(例如生长调节素B-样结构域)，它们可参与蛋白质的同二聚体化。为了研究细胞表面161P2F10B的潜在二聚体状态，用不同浓度的化学交联剂乙二醇双[琥珀酰亚胺琥珀酸酯](EGS)处理内源性表达161P2F10B的KU-812细胞达30分钟。然后裂解细胞，对细胞蛋白质进行SDS-PAGE，然后对161P2F10B进行Western印迹。图36的结果表明：用渐增浓度的EGS处理，161P2F10B的单聚体形式(约100kDa)消失，同时观察到约200kDa的新带。200kDa的条带与161P2F10B蛋白的二聚体形式相关。EGS试剂会交联彼此相距16.1埃以内的分子以形成稳定的二聚体或多聚体。数据表明：KU-812细胞上的161P2F10B分子靠得很近，使得它们在化学交联之前就已经成为细胞表面的二聚体。在特定的Western印迹中仅观察到二聚体分子量带，而没有其它的分子量带，这一观察结果消除了161P2F10B能与其它蛋白质随机形成二聚体的假说。总体上说，这些结果表明：当在肿瘤细胞表面表达时，细胞表面的161P2F10B是二聚体，该特性是161P2F10B完整酶活性和其它功能活性所必需的。
实施例19：161P2F10B MAb抑制作用研究
A.MAb在表达161P2F10B的细胞中抑制细胞增殖、存活和细胞凋亡
相对于正常细胞而言增强的增殖和进入肿瘤细胞S-期是癌细胞表型的标志。为了研究161P2F10B对细胞增殖速率的调制作用，在缺乏或存在抗161P2F10B蛋白MAb的3H-胸苷掺入试验(细胞增殖试验)中评价内源性表达161P2F10B基因的癌症细胞系(肾明细胞癌症细胞系SK-RC-01和RXF-393；肝癌细胞系HepG2；前髓细胞系KU-812)。在10％FBS中培养细胞，与MAb一起保温，处理18-96小时后，经3H-胸苷掺入试验评价增殖。图30的结果表明：MAb能抑制表达161P2F10B抗原之细胞的增殖；而与同种型匹配的对照MAb不会影响细胞生长。表达161P2F10B的RXF-393、HepG2和KU-812癌细胞获得了类似的结果。另外，在MTS存活试验中评价肾明细胞系RXF-393细胞(图31)。MTS试验是在基于四氮唑化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑，内盐；MTS(b)]和电子偶联试剂(吩嗪硫酸甲酯(ethosulfate)；PES)的增殖、细胞毒性或化学敏感性试验中测定活细胞数目的比色法。通过在培养物孔中直接加入少量Solution Reagent，保温1-4小时，然后用96-孔培养板读数器记录490nm的光吸收值以进行试验。通过490nm的光吸收值测定的有色甲
(formazan)产物的量与线粒体活性和/或培养物中活细胞的数目成正比例。如图31所示，161P2F10B MAb抑制RXF-393细胞的存活，这与对细胞增殖的抑制作用相关。为了进一步检测MAb对细胞存活的调制作用，裂解MTS存活试验中所检测的细胞，在测定细胞凋亡的细胞死亡ELISA中进行检测。观察细胞中片段化DNA的方法是通过免疫测定法对与组蛋白-复合的DNA片段进行的免疫学检测(即细胞死亡检测ELISA)，所述检测可测定凋亡细胞的胞质中与组蛋白-复合的DNA片段(单-和寡-核小体)的富集。在图31中，能抑制增殖和存活的相同MAb也能诱导增加的细胞凋亡。这些结果证实：抗161P2F10B蛋白的MAb可调制表达161P2F10B抗原的细胞，在高血清条件下导致增殖和存活能力降低，细胞凋亡程序增加。因此，161P2F10B MAb能调制表达161P2F10B且具有在体内长成肿瘤细胞之潜能的癌细胞的生长。
B.MAb抑制由重组161P2F10B胞外结构域(ECD)刺激的人脐静脉内皮 细胞增强的血管生成(管形成)
图28显示了在体外血管生成(管形成)试验中，将HUVEC细胞和ECD与20μg/ml 161P2F10B MAb一起保温，会导致网络形成33-78％受抑制，根据试验中所用MAb的不同，抑制作用有所不同。相同浓度的同种型对照MAb不会抑制管形成。另外，如图32所示，161P2F10B MAb对血管生成的抑制作用依赖于剂量。这些结果合起来表明：161P2F10B蛋白通过其PDE活性参与促进血管生成，所述PDE活性有利于肿瘤生长、肿瘤细胞侵入和/或肿瘤血管生成所需的内皮细胞激活，161P2F10B MAb能抑制此活性。
C.通过161P2F10B MAb抑制细胞迁移和侵入
增强的迁移和侵入是癌细胞表型的标志。为了研究161P2F10B MAb对迁移的作用，在transwell迁移试验中评价内源性表达161P2F10B蛋白的HepG2细胞(肝癌)和A-704细胞(肾明细胞癌)。将细胞与对照MAb或三种(各为25μg/ml)的161P2F10B MAb混合物一起保温，穿过transwell室迁移24小时。图33的结果表明：161P2F10B MAb混合物能抑制HepG2细胞迁移，而对照MAb不能抑制迁移。如图34所示，也可观察到对A-704肾明细胞迁移的抑制作用。通过用8ng/ml肝细胞生长因子(HGF)处理细胞，在两个细胞系中都发现了迁移的增强。对于这两个细胞系而言，增强的由HGF诱导的迁移受161P2F10B MAb抑制(图33和34)。为了研究细胞侵入细胞外基质的能力，将A-704细胞接种于被Matrigel包被的transwell室。该试验基本类似于迁移试验，不同之处仅在于为了在此试验中被评价为已移动，细胞需要穿过Matrigel迁移。这是肿瘤细胞的特性，因为它们表达酶(即基质金属蛋白酶，如MMP，ADAM等)，所述酶可降解Matrigel中的细胞外基质蛋白，并且有利于细胞迁移。图35的结果表明：A-704细胞具有侵入的能力，MAb H16-1.93对该细胞表型表现出抑制活性。另外，对细胞的HGF处理增强了其受MAbH16-1.93抑制的侵入
的能力。
总体上说，体外功能结果和MAb抑制作用研究表明：161P2F10B蛋白具有生长促进、存活力加强、迁移和侵入增强和血管生成活性。当在体外检测时，这些活性受161P2F10B MAb抑制。通过刺激内皮细胞毛细血管床的形成，所述细胞和生化功能对于肿瘤的建立和维持是必不可少的(参见Ferrara，N.and Kerbel，R.S.，2005 Nature 438：967-974)。增加的血管生成为生长中的肿瘤提供了增加的营养和氧合作用，并且提供了靶向恶性肿瘤中的161P2F10B的治疗干预策略。161P2F10B蛋白也在细胞迁移和侵入中起作用，对表达该蛋白质的细胞而言更是如此，161P2F10B蛋白也可用作内皮细胞和其它表达该配体的细胞的引诱剂。161P2F10B蛋白的磷酸二酯酶/焦磷酸酶(PDE)活性对于改变肿瘤微环境中的ATP浓度以有利于血管生成和提供营养便利而言是至关重要的。细胞迁移和侵入对于肿瘤细胞的转移能力而言是重要的，有利于它们归巢和补充至远离的组织。转移病灶中161P2F10B蛋白的表达说明：表达161P2F10B的细胞的迁移表型赋予所述细胞以较强的转移能力。在体外检测的161P2F10B的所有功能都受MAb抑制。
实施例20：通过IHC检测癌症患者样品中的161P2F10B蛋白
使用抗体M16-41(3)50检测得自肝癌患者的肿瘤样品中161P2F10B蛋白的表达。简单地说，将冷冻组织切成6微米的切片，封固于载玻片上。室温使切片干燥2小时，在丙酮中固定8分钟，然后进行干燥。室温将切片放置在161P2F10B抗体M16-41(3)50中保温3小时。用缓冲液将载玻片洗涤3次，再与和DAKO EnVision+TM过氧化物酶-偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白第二抗体(DAKO Corporation，Carpenteria，CA)保温1小时。然后用缓冲液洗涤切片，使用DAB试剂盒(SIGMA Chemicals)显色，用苏木精复染，并通过亮视野显微镜进行分析。细胞显示出棕色表明161P2F10B在肝细胞癌肿瘤细胞中表达(37A和37B)。没有在M16-41(3)50中保温的一系列切片没有被染色(37C和37D)。结果表明：161P2F10B在人肝癌中表达，针对此抗原的抗体可用作诊断试剂(图37)。
结果表明161P2F10B是癌症诊断、预测和治疗应用的靶标。
在本申请各处引用了多个网站的数据内容，出版物，专利申请和专利。(引用了网站的Uniform Resource Locator，或ULR，在万维网上的地址)。各参考文献中公开的内容皆全文列入本文作为参考。
本发明不限于本文公开的实施方案的范围，这些实施方案仅为单独阐明本发明的各个方面，任何功能等同的实施方案均在本发明的范围内。除本文描述的，本发明的模式和方法的各种变化，对于参照前文描述和教导的熟练技术人员而言都是显而易见的，同样欲落入本发明的范围内，这样的变化或其它实施方案可在不偏离本发明的实际范围和精神的情况下实施。
表
表1：表达161P2F10B的恶性组织
前列腺
肾脏
结肠
肺
卵巢
乳腺
淋巴
骨
子宫
胰腺
肝脏
表II：氨基酸缩写
| 单字母 | 三字母 | 全称 |
| F | Phe | 苯丙氨酸 |
| L | Leu | 亮氨酸 |
| S | Ser | 丝氨酸 |
| Y | Tyr | 酪氨酸 |
| C | Cys | 半胱氨酸 |
| W | Trp | 色氨酸 |
| P | Pro | 脯氨酸 |
| H | His | 组氨酸 |
| Q | Gln | 谷氨酰胺 |
| R | Arg | 精氨酸 |
| I | Ile | 异亮氨酸 |
| M | Met | 甲硫氨酸 |
| T | Thr | 苏氨酸 |
| N | Asn | 天冬酰胺 |
| K | Lys | 赖氨酸 |
| V | Val | 缬氨酸 |
| A | Ala | 丙氨酸 |
| D | Asp | 天冬氨酸 |
| E | Glu | 谷氨酸 |
| G | Gly | 甘氨酸 |
表III：氨基酸取代矩阵
根据GCG软件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩阵(块取代矩阵(block substitution matrix))修改。值越高，越有可能在相关的天然蛋白质中发现取代。
A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y .
4 0 -2 -1 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 A
9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 C
6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 D
5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E
6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 F
6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G
8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H
4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I
5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K
4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L
5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M
6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N
7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P
5 1 0 -1 -2 -2 -1 Q
5 -1 1 -3 -3 -2 R
4 1 -2 -3 -2 S
5 0 -2 -2 T
4 -3 -1 V
1 1 2 W
7 Y
表IV：
HLA III类基元/超基元
表1V(A)：HLAI类超基元/基元
| 超基元 | 位置 | 位置 | 位置 |
| 2(一级锚) | 3(一级锚) | C末端(一级锚) | |
| A1 | TILVMS | FWY | |
| A2 | LIVMATQ | IVMATL | |
| A3 | VSMATLI | RK | |
| A24 | YFWIVLMT | FIYWLM | |
| B7 | P | VILFMWYA | |
| B27 | RHK | FYLWMIVA | |
| B44 | ED | FWYLIMVA | |
| B58 | ATS | FWYLIWMA | |
| B62 | QLVMP | FWYMIVLA | |
| 基元 | |||
| A1 | TSM | Y | |
| A1 | DEAS | Y | |
| A21 | LMVQIAT | VLIMAT | |
| A3 | LMVISATFCGD | KYRHFA | |
| A11 | VTMLISAGNCDF | KRYH | |
| A24 | YFWM | FLIW | |
| A＊3101 | MVTALIS | RK | |
| A＊3301 | MVALFIST | RK | |
| A＊6801 | AVTMSLI | RK | |
| B＊0702 | P | LMFWYAIV | |
| B＊3501 | P | LMFWYIVA | |
| B51 | P | LIVFWYAM | |
| B＊5301 | P | IMFWYALV | |
| B＊5401 | P | ATIVLMFWY |
粗体的残基为优选的残基，斜体的残基次之：当一种肽在每一个一级(primary)锚位置具有上表所指明的基元或超基元的一级锚时，可以认为这种肽携有基元。
表1V(B)：HLAII类超基元
| 1 | 6 | 9 |
| W，F，Y，V，.I，L | A，V，I，L，P，C，S，T | A，V，I，L，C，S，T，M，Y |
表1V(C)：HLAII类基元
斜体的残基表示较不优选(less preferred)的残基或“耐受”的残基。
表1V(D)：HLAI类超基元
斜体的残基表示较不优选(less preferred)的残基或“耐受”的残基。
表IV(E)：HLA I类基元
表IV(G)：
基元表示限定超型特异性的残基。这些基元插入基于公共数据所确定的残基，以便被所述超型内部的多重等位基因识别。括号内的残基是另外的残基，预测它们也能被所述超型内部的多重等位基因所耐受。
表VI：使用Ku812细胞通过FACS测定的161P2F10B MAb亲和性
表VII：通过SPR测定的161P2F10B MAb亲和性
| 161P2F10B MAb | kon(M-1s-1) | koff(s-1) | 亲和性-KD(nM) |
| Ha16-1(1)23 | 3.60E+04 | 8.80E-04 | 24 |
| Ha16-1(3，5)36 | 5.29E+04 | 4.60E-04 | 8.7 |
| H16-1.52 | 9.00E+05 | 1.20E-05 | 0.133 |
| H16-1.67 | 1.60E+04 | 7.00E-04 | 43 |
| H16-1.86 | 4.30E+04 | 6.40E-04 | 14.9 |
| H16-7.213 | 1.29E+05 | 5.09E-04 | 3.9 |
| H16-9.10 | 5.95E+04 | 4.42E-04 | 7.4 |
| H16-9.33 | 6.63E+04 | 2.57E-04 | 3.9 |
| H16-944 | 1.74E+05 | 1.32E-04 | 0.76 |
| H16-9.69 | 4.24E+04 | 1.86E-04 | 4 |
| Ha16-1(1)11 | 6.58E+04 | 1.43E-03 | 21.7 |
| Ha16-1(3，5)18 | 2.20E+04 | 6.20E-04 | 28 |
| Ha16-1(2，4)4 | 7.70E+04 | 1.75E-03 | 22.6 |
| Ha16-1(3，5)56 | 4.08E+04 | 5.93E-04 | 14.5 |
| H16-7.8 | 3.50E+04 | 6.30E-04 | 18 |
| H16-1.68 | 1.06E+05 | 2.44E-04 | 2.3 |
| Ha16-1(3，5)27.1 | 3.69E+04 | 1.77E-04 | 4.8 |
| H16-1(3，5)5 | 6.60E+03 | 4.76E-05 | 7.2 |
| H16-7.200 | 6.50E+04 | 5.90E-04 | 9 |
| Ha16-1(3，5)42 | 4.76E+04 | 2.05E-04 | 4.3 |
| H16-9.65 | 9.37E+04 | 4.64E-04 | 5 |
| H16-1.29.1.1 | 3.20E+04 | 8.30E-04 | 26 |
| H16-34 | 9.62E+04 | 9.01E-03 | 94 |
| H16-1.92.1.1 | 3.70E+04 | 3.60E-04 | 9.8 |
| Ha16-1(3，5)19 | 5.00E+04 | 8.40E-05 | 1.68 |
表VIII：161P2F10B MAb证实当效应细胞与靶细胞的比例增加时，依赖于抗体的细胞杀伤也有所增加
序列表
<110>阿根西斯公司(AGENSYS，INC.)
<120>与161P2F10B蛋白结合的抗体和相关分子
<130>511582006246
<140>待定
<141>同此
<150>10/291.241
<151>2002-11-07
<150>10/005,480
<151>2001-11-07
<150>60/667,588
<151>2005-03-31
<150>60/700,975
<151>2005-07-20
<160>177
<170>FastSEQ适用Windows 4.0
<210>1
<211>3858
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>875
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
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<212>DNA
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>1351
<223>n＝a，t，c，或g.
<400>19
<210>20
<211>450
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变体
<222>433
<223>Xaa＝任何氨基酸。
<400>20
<210>21
<211>685
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Claims (27)
1.含有能特异性结合161P2F10B蛋白(SEQ ID NO：4)的抗原结合位点的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体是图2和图3所示的H16-7.213，H16-9.69，H16-1.52，Ha16-1(1)23，Ha16-9.44，H16-1.67，Ha16-1(3，5)36，H16-1.86，Ha16-9.10，H16-9.33，H16-1.68，Ha16-1(1)11，Ha16-1(3，5)18，Ha16-1(2，4)4，Ha16-1(3，5)56，H16-1.93，H16-7.8，Ha16-1(3，5)27.1，H16-1.61，H16-1(3，5)5，H16-7.200，Ha16-1(3，5)42，H16-9.65，H16-1.29，H16-3.4，H16-1.92，Ha16-1(3，5)19或Ha16-1.80。
2.权利要求1的抗体或片段，其中抗体是完整的人抗体。
3.权利要求1或2的抗体或片段，其中片段是Fab，F(ab′)2，Fv或Sfv片段。
4.权利要求1，2或3中任一项的抗体或片段，其与可测标记、毒素、治疗剂或化疗剂偶联。
5.权利要求4的抗体或片段，其中可测标记是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
6.权利要求5的抗体或片段，其中放射性同位素包括212Bi，131I，131In，90Y，186Re，211At，125I，188Re，153Sm，213Bi，32P或Lu。
7.权利要求4的抗体或片段，其中毒素包括蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、道诺红菌素、美登木素生物碱、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、白树毒蛋白、丝裂吉霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、加利车霉素、Sapaonaria offcinalis抑制剂、糖皮质激素、奥瑞斯他丁、金霉素、钇、铋、康伯来斯他丁、倍癌霉素、多罗斯他丁、cc1065或顺铂。
8.产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤。
9.含有编码权利要求1，2或3中任一项的抗体的多核苷酸的载体。
10.权利要求9的载体，其为含有重链和轻链可变区的单链。
11.含有人单位剂量形式的权利要求1的抗体或片段的药物组合物。
12.检测生物样品中161P2F10B蛋白的存在的测定法，所述方法包括使样品与权利要求1，2或3中任一项的抗体接触，并检测样品中161P2F10B蛋白(SEQ ID NO：4)的结合。
13.抑制受试者体内表达161P2F10B(SEQ ID NO：4)的细胞的生长的方法，所述方法包括给所述受试者施用编码单链单克隆抗体的载体，以使载体将单链单克隆抗体编码序列传递给癌症细胞，并使编码的单链抗体在细胞内表达，其中所述抗体含有与161P2F10B蛋白(SEQ ID NO：4)特异性结合的权利要求1，2或3中任一项的抗体。
14.将细胞毒性剂或诊断剂传递给表达161P2F10B蛋白(SEQ ID NO：4)的细胞的方法，所述方法包括：
提供与权利要求1，2或3中任一项的抗体或抗体片段偶联的细胞毒性剂或诊断剂以形成抗体-药剂或片段-药剂偶联物；和
使细胞暴露于抗体-药剂或片段-药剂偶联物。
15.权利要求14的方法，其中细胞毒性剂或诊断剂选自可测标记、毒素和治疗剂。
16.权利要求15的方法，其中可测标记是放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
17.权利要求16的方法，其中放射性同位素包括212Bi，131I，131In，90Y，186Re，211At，125I，188Re，153Sm，213Bi，32P或Lu。
18.权利要求15的方法，其中毒素包括蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、道诺红菌素、美登木素生物碱、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春花新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、白树毒蛋白、丝裂吉霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、加利车霉素、Sapaonaria offcinalis抑制剂、糖皮质激素、奥瑞斯他丁、金霉素、钇、铋、康伯来斯他丁、倍癌霉素、多罗斯他丁、cc1065或顺铂。
19.检测生物样品中161P2F10B蛋白(SEQ ID NO：4)的方法，所述方法包括下述步骤：
提供生物样品和对照样品；
使生物样品和对照样品与特异性结合161P2F10B蛋白的权利要求1，2或3中任一项的抗体接触；和
测定生物样品和对照样品中存在的161P2F10B蛋白与抗体的复合物的量。
20.权利要求19的方法，进一步包括从患有或怀疑患有前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌的患者中取生物样品和对照样品。
21.含有161P2F10B siRNA(双链RNA)的组合物，所述siRNA对应于编码图2所示蛋白质(SEQ ID NO：4)的核酸或其亚序列，其中亚序列的长度为19，20，21，22，23，24或25个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列。
22.鉴定能调制细胞增殖的分子的方法，所述方法包括：
(a)将分子导入系统，其中分子是含有161P2F10B siRNA(双链RNA)的组合物，所述siRNA对应于编码图2所示蛋白质的核酸或其亚序列，其中亚序列的长度为19，20，21，22，23，24或25个邻接的RNA核苷酸，并且含有与mRNA编码序列的至少一部分互补和不互补的序列；和
(b)测定分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用存在与否，分子和核苷酸序列或蛋白质之间的相互作用的存在可将分子鉴定为能调制细胞增殖的分子。
23.权利要求22的方法，其中系统是体内的。
24.权利要求22的方法，其中系统是体外的。
25.降低哺乳动物中前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌肿瘤生长的方法，所述方法包括用有效量的特异性结合161P2F10B(SEQ ID NO：4)的权利要求1，2或3中任一项的单克隆抗体或其片段与放疗的组合治疗哺乳动物。
26.降低哺乳动物中前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌肿瘤生长的方法，所述方法包括用有效量的特异性结合161P2F10B(SEQ ID NO：4)的权利要求1，2或3中任一项的单克隆抗体或其片段与化疗剂的组合治疗哺乳动物。
27.权利要求1，2或3中任一项的单克隆抗体或其片段用于制备药物的用途，所述药物用于治疗前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或乳腺癌，其中单克隆抗体或其片段与放疗或化疗剂联合使用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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