ES2329635T3 - Secuencias de nucleotidos y proteinas de los genes nogo y metodos basados en estas. - Google Patents

Abstract

Una proteína purificada que consiste de una secuencia de aminoácido con más del 90% de identidad sobre la longitud total de la SEQ10 No: 29 y libre de todo el material de mielina del sistema nervioso central con el que se asocia naturalmente.

Description

Secuencias de nucleótidos y proteínas de los genes Nogo y métodos basados en estas.

1. Introducción

La presente invención se relaciona con el gen, Nogo, y en particular con Nogo, sus productos de proteína codificada, así como derivados y análogos de estos. La producción de las proteínas Nogo, derivados, y anticuerpos también se proporciona. La invención además se relaciona con composiciones terapéuticas y métodos de diagnóstico y terapia.

2. Antecedentes de la invención

En el sistema nervioso central (CNS) de los vertebrados superiores, la regeneración de los axones después de la lesión es, casi ausente y la plasticidad estructural se limita. Los inhibidores de crecimiento se asocian con la mielina del CNS son probables para jugar un papel importante. Esto se evidencia por un anticuerpo monoclonal (mAb), IN-1, que neutraliza una proteína de la mielina inhibitoria de crecimiento de neuritas potente, promoviendo por consiguiente la regeneración axonal a larga distancia y mejorando la plasticidad compensatoria después de las lesiones del cerebro o de la médula espinal en ratas adultas.

Un número de observaciones in vitro e in vivo han revelado un nuevo aspecto de regulación de crecimiento de neuritas, que es la presencia de señales repulsivas e inhibitorias y factores (Keynes and Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5:75-82). La mayoría de estas señales parecen ser proteínas o glicoproteínas. Un primer avance hacia la identificación de los factores fue la purificación y clonación del cADN de una molécula que induce el colapso del cono de crecimiento derivado del cerebro de pollo, Colapsina-1, que ahora se llama Semaforina 3A.

Un segundo grupo de indicadores guía repulsivos recientemente purificados y clonados, actualmente se designa como Efrinas. Son ligandos para la familia de la tirosina quinasa del tipo receptor Eph. Efrina-A5 y Efrina-A2 se expresan como gradientes en el techo óptico del embrión de pollo, y su expresión ectópica o deleción causa errores de orientación de los axones retinales en crecimiento. Como las Semaforinas, la familia Efrina tiene 15 a 20 miembros, cada una con un complejo y expresión dinámica dentro y fuera del sistema nervioso. Las funciones de la mayoría de estas moléculas permanecen para ser analizadas.

Un tercer grupo de señales de orientación que puede rechazar los axones de crecimiento y se expresa en el sistema nervioso en desarrollo son las Netrinas. La Netrina ha sido purificada como un quimiotáctico derivado de la placa de suelo para axones de la comisura en médulas espinales iniciales, como su ortólogo de C. elegans unc-6. La Netrina-1 resultó que tiene efectos repulsivos para ciertos tipos de neuronas que dependen del tipo de receptor presente en los conos de crecimiento neuronal dirigido (Tessier-Lavigne et al., 1996, Science 274:1123-33).

Previamente, una actividad inhibitoria de crecimiento de neuritas potente, se asocia con los oligodendrocitos y mielina del CNS adulto, se reportó por Canoni and Schwab (1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288). Un principal constituyente tiene una proteína de membrana de peso molecular alto (NI-250, con un componente más pequeño, NI-35, en rata) el cual recientemente se purificó, y que se relaciona con el sujeto de la presente invención, y se une por la neutralización mAb, IN-1 I (Canoni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106:1281-1288; U.S. Patent Nos. 5,684,133; 5,250,414; PCT Publication WO 93/00427).

Los inhibidores de crecimiento de neuritas asociados con la mielina juegan un papel crucial en la regeneración de la prevención de axones de CNS lesionados. Cuando el desarrollo de oligodendrocito y la formación de la mielina se bloquean en pollos o ratas, el periodo permisivo de regeneración después de las lesiones del CNS se prolonga. Efectivamente, la formación de la mielina coincide en el tiempo con el final del periodo para el desarrollo cuando el CNS muestra una alta plasticidad estructural y un alto potencial para la regeneración.

Es probable que NI-250 y NI-35 sean los componentes principales de la inhibición del crecimiento asociado con la mielina como se muestra por la aplicación in vivo de IN-1 a ratas adultas con la médula espinal lesionada que inducen la regeneración de axones corticoespinales sobre largas distancias y permite la recuperación funcional de comportamiento y motriz especialmente en relación con la locomoción. Experimentos similares sobre el nervio óptico y la senda del septo-hipocampo colinérgico también demostraron la relevancia in vivo del antígeno reconocido de IN-1, NI-35/250 (Schnell and Schwab, 1990, Nature 343:269-272; Bregman et al., 1995, Nature 378:498-501).

Los sistemas de fibra no-lesionada también responden a la neutralización de los inhibidores de crecimiento de la neurita por IN-1. Experimentos recientes han mostrado contundentemente que tras una lesión del tracto corticoespinal selectiva (piramidotomia), fibras intactas brotan a través de la línea media en la médula espinal y el tallo encefálico y establecen un patrón de inervación bilateral, acompañado por una recuperación del comportamiento casi completa de los movimientos de precisión en la presencia de IN-1 (Z'Graggen et al., 1998, J. Neuroscience 18(12):4744-4757).

El aislamiento del gen que codifica la proteína inhibitoria del crecimiento de neuritas proporciona oportunidades múltiples para productos de desarrollo, útiles en regeneración neuronal y en el tratamiento de varios desórdenes neurológicos, incluyendo tumor del CNS.

La citación de una referencia mencionada anteriormente no podrá ser interpretada como una adminisón de que tal referencia es disponible como oficio previo a la presente invención.

3. Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con las secuencias del nucleótido de genes Nogo (Nogo humano, rata y bovino y homólogos Nogo de otras especies), y secuencias de aminoácido de sus proteínas codificadas, así como derivados (por ejemplo, fragmentos) y análogos de estos. Los ácidos nucleicos hibridizan a un o complementarios a las secuencias del nucleótido mencionadas anteriormente también se proporcionan. En una modalidad específica, la proteína Nogo es una proteína de rata, de bovino o humana.

La invención también se relaciona con un método para identificar los genes que interactúan con Nogo.

Nogo es un gen proporcionado por la presente invención, identificado por el método de la invención, que tanto codifica como interactúa con las proteínas reguladoras de crecimiento neural.

La invención también se relaciona con derivados y análogos de Nogo de la invención que son funcionalmente activos, i.e., son capaces de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína Nogo que se produce naturalmente. Por ejemplo, una región inhibitoria principal entre los aminoácidos 542 a 722 ha sido identificada. Tales actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, inhibición de crecimiento de neuritas de células neurales, propagación y migración de fibroblastos, o cualquier célula que muestra crecimiento neoplástico, la capacidad de interactuar con o competir por la interacción con proteínas reguladoras del crecimiento neural, antigenicidad que es la capacidad de unir (o competir con Nogo por un enlace) con un anticuerpo anti-Nogo, la inmunogenicidad que es la capacidad de generar el anticuerpo que se une a Nogo. Estos anticuerpos que tienen el potencial de inducir la excrecencia de las neuritas o prevenir colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal, inhibiendo la función de Nogo, y fragmentos funcionales o derivados de Nogo, con la capacidad para inhibir la excrecencia de las neuritas.

La invención además se relaciona con fragmentos (y derivados y análogos de estos) de Nogo, que comprenden uno o más dominios de una proteína Nogo tal como el terminal amino, rico en prolina y ácido (por ejemplo, en los aminoácidos 31 a 58 de la SEQ ID NO:2), el terminal carboxi altamente conservado, y dos tramos hidrófobos de 35 y 36 aminoácidos de longitud en Nogo de rata, también en el terminal carboxi (por ejemplo, en los aminoácidos 988 a 1023, y en 1090 a 1125 de la SEQ ID NO:2).

Los anticuerpos en los diferentes Nogo, y derivados y análogos de Nogo, se proporcionan adicionalemente. En particular, a modo de ejemplo, dos anticuerpos han sido derivados, el primer anticuerpo, denominado AS 472, se derivó utilizando como inmunógeno un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 623 a 640 de la SEQ ID NO:2, y el segundo anticuerpo, denominado AS Bruna, se generó contra el terminal carboxi, los aminoácidos 762 a 1163 de la SEQ ID NO:2, de Nogo.

También se proporcionan, los métodos de producción de las proteínas Nogo, derivados y análogos, por ejemplo, por métodos recombinantes.

La presente invención también se relaciona con composiciones terapéuticas y de diagnóstico basadas en proteínas Nogo y ácidos nucleicos. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a proteínas Nogo y análogos y derivados (incluyendo fragmentos) de estas; anticuerpos de estas; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados; y ribozimas de Nogo o ácidos nucleicos antisentido de Nogo.

La presente invención también se relaciona con composiciones terapéuticas y de diagnóstico basadas en proteínas Nogo y ácidos nucleicos y anticuerpos anti-Nogo. La invención proporciona, el uso de la proteína Nogo según se define en las reivindicaciones 1-7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores derivados neurales y del CNS, mediante la administración de los compuestos que promueven la actividad de Nogo (por ejemplo, proteínas Nogo y análogos activos funcionalmente y derivados incluyendo fragmentos de estos; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados, agonistas.

La invención también proporciona, el uso de la ribozima o ácido nucleico antisentido según se define en las reivindicaciones 17 o 18, o el anticuerpo según se define en las reivindicaciones 23, 25-28, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o deterioro que finalmente dan lugar al deterioro del sistema nervioso; tales enfermedades, desórdenes o deterioro incluyen, pero no se limitan a, trauma del sistema nervioso central (CNS), (por ejemplo lesiones de la médula espinal o del cerebro), infarto, infección, malignidad, exposición a agentes tóxicos, deficiencia nutricional, síndromes paraneoplásicos, y enfermedades nerviosas degenerativas (incluyendo, pero no limitando a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y parálisis supra-nuclear progresiva); mediante la administración de compuestos que interfieren con la actividad de Nogo (por ejemplo, un derivado de Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos nucleicos anti-sentido de Nogo; ribozimas de Nogo o grupos químicos que unen un sitio activo de Nogo).

Los modelos de animales, métodos de diagnóstico y métodos de detección de la predisposición a desórdenes, y métodos para identificar y evaluar los agonistas y antagonistas de Nogo, también se revelan.

3.1 Definiciones

Como se utiliza aquí, subrayar o la letra cursiva del nombre de un gen deberán indicar el gen, en contraste con su producto de proteína codificada, la cual se indica por el nombre del gen en la ausencia de subrayado o letra cursiva. Por ejemplo, "Nogo" deberá entenderse el gen Nogo, mientras que "Nogo" deberá indicar el producto de la proteína del gen Nogo.

4. Descripción de las figuras

Figura 1a-1b: (a) clones de cADN de Nogo: CWP1-3 es un clon de cADN de bovino aislado a partir de la selección de una biblioteca de cADN de materia blanca de médula espinal de bovino con oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (combinados) y MSC9. El ARN complementario derivado de este clon se utilizó para la posterior selección de la biblioteca de cADN de rata. Oli3 y Oli18 se aislaron de una biblioteca de oligodendrocito de rata oligo d(T)-cebado. R1-3U21, RO18U1 y RO18U37-3 se aislaron de una biblioteca de médula espinal/tallo encefálico de rata hexanucleótido-cebado (Stratagene). Las posiciones de las secuencias del péptido 6 bovino NI220 (bNI220), se indican en CWP1-3 y R13U21. Las secuencias en las uniones de exones diferentes, se marcan en la parte superior de cada clon. Las marcas de interrogación indicadas en RO18U1 identifican la secuencia en este clon que no coincide con las secuencias de cualquiera de los otros clones Nogo. RO18U37-3 se secuenciaron-solo a partir del extremo5', y la porción sin secuenciar se representa por puntos. (b) Esquemáticos que demuestran el mecanismo hipotético para la generación de tres transcritos Nogo. P1 y P2 representan la ubicación putativa de los promotores alternativos. El número mínimo de tres exones se necesita para generar los tres transcritos como se muestra esquemáticamente, aunque cada exon potencialmente se podría cortar y empalmar en múltiples exones.

Figura 2a-2b: (a) Secuencias de nucleótido (SEQ ID NO:1) y aminoácido (SEQ ID NO:2) de transcrito Nogo A (secuencia generada conectando las secuencias de cADN de RO18U37-3, Oli18, y R1-3U21). Caja ovalada: codón de iniciación presunto; subrayado con puntos: tramo ácido; \Box: sitios de PKC potenciales; \Delta: sitios potenciales de caseina quina II; subrayado grueso: regiones hidrófobas del terminal carboxi y dominios transmembrana potenciales; subrayado delgado: sitios potenciales de N-glicosilación. (b) Comparación de la secuencia del péptido entre NI220 bovino purificado, secuenciado (bNI220; SEQ ID NOS:3-8), y las correspondientes secuencias de bovino (SEQ ID NOS:9-14) y de rata (SEQ ID NOS:15-20) traducidas a partir de cADNs de rata y bovino. Las secuencias de aminoácido de rata y bovino, que no corresponden a las secuencias del péptido bNI220, están en el caso inferior.

Figura 3a-3b: (a) Comparación de la secuencia de aminoácido de las regiones comunes del aminoácido 180 del terminal carboxi de NSP (humano; SEQ ID NO:21), S-REX (rata)(SEQ ID NO:22), CHS-REX (pollos; SEQ ID NO:23), NOGOBOV (bovino; SEQ ID NO:24), NOGORAT (rata; SEQ ID NO:25), un clon EST C. elegans (W06A7A; SEQ ID NO:26), y un clon EST D. melanogaster (US51048; SEQ ID NO:27). (b) Conservación evolutiva de las dos regiones hidrófobas. Similitudes porcentuales dentro de y a través de especies de las regiones comunes hidrófobas se muestran. Letras sombreadas: aminoácidos conservados.

Figura 4a-4c: (a) Hibridación Northern de varios tejidos con la sonda común de Nogo. La sonda común contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 2583-4678. ON, nervio óptico; SC, médula espinal; C, corteza cerebral; DRG, ganglio de raíz dorsal; SN, nervio ciático; PC 12, línea celular PC 12. (b) Hibridación Northern de la médula espinal y ARNs de las células PC 12 con una sonda específica para el exón 1 (panel izquierdo) y ARNs del cerebelo (HB) y del músculo esquelético (M) con una sonda específica para el exón 2 (panel derecho). (c) Hibridación Northern con la sonda común de Nogo. K, kidney; B, cartílago (del esternón); Sk, piel; M, músculo esquelético; Lu, pulmón; Li, hígado; Sp, bazo. Los tres principales transcritos se marcan (4.6 kilobases (kb), 2.6 kb, y 1.7 kb). \Delta: una banda difusa pero consistente de aproximadamente 1.3 kb en tamaño.

Figura 5a-5f: Hibridación in situ de secciones del cerebelo y de la médula espinal de rata adulta. (a, d) Filas de oligodendrocitos (OL) en materia blanca de la médula espinal y cerebelo, respectivamente, se puede presenciar marcado por la ribosonda "común" antisentido Nogo. Es muy similar a las señales detectadas cuando una sección de la médula espinal consecutiva se hibridizó con una ribosonda plop antisentido (b). (c) Las neuronas en materia gris (GM) también se marcaron por la ribosonda "común" antisentido Nogo. WM: materia blanca. Campo brillante y vista fluorescente, respectivamente, de una sección del cerebelo marcada doblemente con la ribosonda "común" antisentido Nogo (e) y de un anticuerpo anti-GFAP (f). Células de Purkinje (puntas de flecha doble) se marcan fuertemente con la sonda Nogo, mientras que los astrocitos (puntas de flecha, negra y blanca) son negativos. Unas pocas células en la capa granular de la célula (Gr) también se marcan con la sonda Nogo, m: capa molecular. Barra de escala: a, b, d-f: 50 p.m; c: 280 p.m.

Figura 6a-6i: Hibridación in situ de los nervios ópticos en días pos-natales diferentes (a,f: P0; b,g: P3; c,h: P7; d,e,i: P22) con ya sea sondas Nogo o plp (antisentido o sentido). (a-d) sonda antisentido Nogo; (e) sonda sentido Nogo; (g-i) sonda antisentido plp; (f) sonda sentido plp. La expresión Nogo en los precursores de oligodendrocito se pueden detectar tan pronto como P0, mientras que la expresión de plp solo estaba iniciando a ser detectable en los nervios ópticos P3 cerca al quiasma (g).

Figura 7: ambos AS Bruna y AS 472 reconocen una proteína mielina de aproximadamente 200 kD. Una mezcla-q de extracto de mielina de rata y bovino se preparó de acuerdo con Spillmann et al, 1998, J. Biol. Chem., 273(30):19283-19293. AS Bruna y AS 472 cada uno reconoció una banda de 200 kD así como varias bandas más pequeñas en mielina de bovino, que pueden ser productos de descomposición de bNI220. AS Bruna tiñe una banda de 200 kD en mielina de rata. I: AS Bruna; P: AS Bruna, suero preinmune; E: AS 472 purificado por afinidad.

Figura 8a-8i: Inmunohistoquímica en médula espinal y cerebelo de rata utilizando IN-1 (a-e), AS Bruna (d-f), y AS 472 (g-i), como se indica en la izquierda de cada panel. Se observó una tinción de la mielina fuerte en ambos tejidos con los tres anticuerpos cuando las secciones congeladas se fijaron con etanol/ácido acético (a, b, d, e, g, h). El tratamiento de las secciones con metanol suprimió la tinción de la mielina excepto para los cuerpos celulares del oligodendrocito (flechas; c, f, i). Puntas de flecha: Células de Purkinje, WM, materia blanca; GM, materia gris, DR: raíz dorsal; Gr, capa granular de la célula; m, capa molecular. Barra de escala: a, d, g: 415 \mum; b, c, e, f, h, i: 143 \mum.

Figura 9a-9d: Actividad de neutralización de AS 472 y AS Bruna en bioensayos diferentes. (a) los fibroblastos NIH 3T3 se colocaron en placas sobre platos de cultivo celular cubiertos con la mezcla-q y se pre-trataron con IN-1, AS Bruna, AS 472 o los sueros pre-inmunes correspondientes. Ambos sueros policlonales mostraron incluso una neutralización levemente mejor del sustrato inhibitorio que IN-1. Los sueros pre-inmunes no tienen efecto significante en la propagación de las células NIH 3T3. La adición de un exceso del péptido (P472) que se utilizó para levantar AS 472 compite con la neutralización de la actividad mientras que un péptido no-específico (Px) no tiene efecto. (b) Pre-tratamiento del sustrato inhibitorio con AS Bruna o AS 472 resulta en DRG excrecencia de las neuritas comparable a lo que se puede observar en un sustrato de laminina. Ejemplos de la excrecencia de las neuritas a partir de DRG en la mezcla-q se pre-trataron con PBS (c; puntuación = 0) y se pretrataron con AS Bruna (d; puntuación = 4).

Figura 10a-10d: Inyección de explantes del nervio óptico con AS 472 resulta en intracrecimiento de axones. (a) Pares de nervios ópticos de rata adulta se sometieron a disección, se inyectaron con AS 472 o suero preinmune y se colocaron en cultivos de cámara de tal manera que un terminal de los nervios estuvo en contacto con neuronas de DRG de rata P0 desintegradas. (b) Después de dos semanas in vitro, las secciones EM de los nervios se tomaron a 3.5 mm del sitio de corte (flechas en A) y sistemáticamente seleccionados por axones intactos (3 experimentos). (c) manojos de axones regenerados (flechas) crecen a través de la degeneración AS 472 del nervio óptico inyectado. (d) Regeneración de axones en contacto con mielina. Amplificación: c, 12,000x; d, 35,000x.

Figura 11a-11c: La expresión de Nogo A recombinante en células COS transfectadas. (a) Western blot que muestra inmunoreactividad de AS Bruna con Nogo A recombinante (senda 2) y Nogo A endógeno a partir de oligodendrocitos de rata de cultivos primarios (senda 3). Las movilidades de estas dos proteínas son virtualmente idénticas a aproximadamente 200 kD sobre un gel SDS desnaturalizado al 5%. Una muestra transfectada de la construcción LacZ control (senda 1) no mostró inmunoreactividad con AS Bruna. La misma transferencia también se probó con anticuerpo anti-myc, 9E10, como se indica. La banda que reacciona con AS Bruna también reaccionó con el anticuerpo tag anti-myc, 9E10 (senda 5), mientras que el endógeno Nogo A no (senda 6). La muestra de transfección control LacZ mostró la banda esperada a aproximadamente 118 kD (senda 4). Las células COS transfectadas temporalmente con una construcción Nogo A se tiñeron doblemente con AS Bruna (b) y IN-1 (c). Las células teñidas positivamente con AS Bruna también fueron positivas con IN-1.

Figura 12: La secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:28) del cADN de Nogo de bovino.

Figura 13: La secuencia de aminoácido de Nogo A de rata (SEQ ID NO:2) alineada con la secuencia de aminoácido teórica de Nogo humano (SEQ ID NO:29). La secuencia de aminoácido de Nogo humano se derivó a partir de la alineación de las etiquetas de la secuencia expresada (EST) con la secuencia de Nogo de rata y la traducción de ESTs humana alineada utilizando el Nogo de rata como una plantilla guía.

Figura 14: La secuencia de ácido nucleico de Nogo C de rata (SEQ ID NO:31) y su secuencia de aminoácido (SEQ ID NO:32) correspondiente.

Figura 15a-15e: Nogo A está presente en la membrana del plasma de oligodendrocito, como se demuestra por inmunocitoquímica y biotinilación de la superficie celular de los oligodendrocitos en cultivo.

Inmunocitoquímica (a-d): Los oligodendrocitos de los nervios ópticos de ratas P10 se desintegraron y cultivaron por 2 días. La tinción de células vivas con mAb IN-1 (a) o AS 472 (c) mostró inmunoreactividad en los cuerpos celulares del oligodendrocito y procesos. En la presencia del péptido que compite P472, AS 472 mostró solamente marcación de fondo (todos los tipos de células) (d). Similar tinción no-específica se observó cuando los anticuerpos primarios se omitieron (b). Evaluación: platos codificados con números se mezclaron aleatoriamente y se clasificaron por 3 observadores independientes. 8/10 platos se clasificaron correctamente AS 472-positivo, mAb IN-1-positivo o controles pos todos los observadores.

Biotinilación (e): Cultivos de cerebro total de P4 de rata enriquecido en oligodendrocitos fueron biotinilados en la superficie celular con un reactivo impermeable de membrana después de siete días en cultivo. Posteriormente, los homogeneizados celulares se trataron con Dynabeads-estreptavidina. El precipitado (Ppt) y el sobrenadante (sup) se transfirieron con AS472; mostraron un patrón de proteína distinto: La superficie celular de Nogo A encontrada en el precipitado mostró un peso Molecular aparente más alto que el intracelular de Nogo A. Este cambio se debe probablemente a la glicosilación. La proteína BiP de ER luminal y la gran mayoría de \beta-tubulina se podría encontrar solamente en la fracción intracelular.

Figura 16a-16j: Los ensayos funcionales muestran la presencia de Nogo A en la membrana celular de los oligodendrocitos. La preincubación de cultivos de nervio óptico con AS 472 (a, b) permitió a los fibroblastos NIH 3T3 extenderse sobre los oligodendrocitos ramificados, que se exponen por tinción inmunofluorescente para GalC (anticuerpo 01) (a). Las flechas en la imagen de contraste de la fase altamente correspondiente (b) indican la propagación de fibroblastos NIH 3T3 en la parte superior de los oligodendrocitos. (c, d): Cuando AS 472 se adicionó junto con P472, los fibroblastos NIH 3T3 estrictamente evitaron los territorios de los oligodendrocitos GalC-positivos (puntas de flecha) (Caroni and Schwab, 1988 Neuron 1:85-96). (e, f): En la presencia de AS 472, las neuronas de DRG desintegrado de rata P0 fueron capaces de extender la neuritas sobre el territorio de oligodendrocitos ramificados altamente (flechas en f). (g, h): El péptido P472 compite eficientemente la actividad neutralizante de AS 472: las neuritas evitan completamente los oligodendrocitos. AS 472 utilizada en estos experimentos se generó contra la secuencia del péptido 472 de rata. (i, j): La cuantificación de estos resultados (como se describe en métodos) demostró la fuerte actividad neutralizante de AS 472 en ambos tipos de ensayos. Barra de escala: 40 \mum.

Figura 17a-17e: Nogo A recombinante es un sustrato inhibitorio y su actividad inhibitoria se neutraliza por mAb IN-1. Extractos enriquecidos de RecNogo A a partir de una línea celular CHO-Nogo A estable, o \beta-galactosidasa, aislada en paralelo a partir de la línea celular CHO-LacZ estable, se cubrieron para los ensayos de propagación del fibroblasto NIH 3T3 y la excrecencia DRG de las neuritas. (a) Gel de plata de myc-his-tagged recLacZ (senda 1) y recNogo A (senda 2) muestra la banda Nogo A a 180 kD. La identidad de la banda Nogo A se confirmó por Western blot incubado con AS Bruna (senda 3) y un anticuerpo anti-myc 9E10 (senda 4). (b) platos recubiertos de RecNogo fueron claramente inhibitorios en la propagación de NIH 3T3. La pre-incubación con mAb IN-1 o AS Bruna da lugar a una neutralización de la actividad inhibitoria altamente significante (p<0.01). El control 1gM mAb O1 y suero pre-inmune fueron ineficaces. El extracto de CHO-LacZ tuvo un efecto parcial inhibitorio en las células NIH 3T3, probablemente debido a las proteínas CHO endógenas. Esta actividad inhibitoria no tuvo influencia por la pre-incubación con los anticuerpos.

(c) Para los ensayos de excrecencia de las neuritas de DRG, el mismo material proteínico como en (b) se mezcló con laminina y se recubrió. RecNogo A tuvo un efecto inhibitorio muy potente en la excrecencia de las neuritas de DRG desintegrado en una manera dosis-dependiente. La actividad se neutralizó por mAb IN-1 (p<0.001), pero no por el control mAb 01. El material proteínico aislado de las células CHOLacZ no fue inhibitorio en ninguna de las concentraciones utilizadas, ni la incubación con anticuerpos tiene ningún efecto en la excrecencia de las neuritas. Ejemplos para la puntuación se muestran en (d): 1 \mug recNogo A, no neuritas o pequeñas (flechas) puntuación: 2, y en (e): 1 \mug de CHO-LacZ, neuritas largas, bifurcadas (puntas de flecha) puntuación: 5-6. El análisis estadístico se realizó con test de Student de dos colas. Barra de escala: 280 \mum.

Figura 18: Análisis Funcional de Mutantes de Deleción de Nogo. Las siguientes construcciones de deleción que codifican las proteínas de fusión que contienen fragmentos de Nogo o porciones truncadas de Nogo (como se enumera abajo) se generaron según se describe en la Sección 6.2.7 mencionada abajo.

Nogo-A:

His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-1162

Nogo-B:

His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171 + 975-1162

Nogo-C:

His-tag/T7-tag/Nogo-C N-terminal (11 aa) + Nogo-A seq. aa 975-1162

NiAext:

His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aa1-974/T7-tag

NiR:

His-tag/T7-tag/vector/Nogo-A seq. aal-171/vector

NiG:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-974/His-tag

EST:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 760-1162

NiG-D1:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa172-908/vector

NiG-D2:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-866/His-tag

NiG-D3:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-723/His-tag

NiG-D4:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-646/vector

NiG-D5:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-646/His-tag

NiG-D7:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-234 + 292-974/His-tag

NiG-D8:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-628

NiG-D9:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259 + 646-974/His-tag

NiG-D10:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 291-974/His-tag

NiG-D14:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-259

NiG-D15:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 491-974/His-tag

NiG-D16:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 619-974/His-tag

NiG-D17:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 257-974/His-tag

NiG-D18:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 172-189 + 261-974/His-tag

NiG-D20:

His-tag/T7-tag/Nogo-A seq. aa 542-722/His-tag

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Los números de aminoácido (aa) se basan en la numeración de secuencia de aminoácido de Nogo A de rata (SEQ ID NO: 2) iniciando con la primera metionina. El His-tag y T7-tag consiste de 34 aminoácidos. Las secuencias vector del N- y C- terminal se derivan del vector de expresión pET28.

5. Descripción detalla de la invención

La presente invención se relaciona con secuencias del nucleótido de genes Nogo, y secuencias de aminoácido de sus proteínas codificadas. La invención además se relaciona con fragmentos y otros derivados, y análogos, de la proteínas Nogo. Los ácidos nucleicos que codifican tales fragmentos o derivados también están dentro del alcance de la invención. La invención proporciona genes Nogo y sus proteínas codificadas de muchas diferentes especies. Los genes Nogo de la invención incluyen Nogo humano, de rata y bovino y genes relacionados (homólogos) en otras especies. Las subsecuencias de bovino reveladas en Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-19293, no se revelan como parte de la presente invención. En modalidades específicas, los genes Nogo y proteínas son de vertebrados, o más particularmente, mamíferos. En una modalidad preferida de la invención, los genes Nogo y las proteínas son de origen humano. Se proporciona, la producción de las proteínas mencionadas anteriormente y sus derivados por ejemplo, por métodos recombinantes.

El gen Nogo como se revela aquí, abarca moléculas de ácido nucleico que codifican tres isoformas de Nogo; denominadas Nogo A, Nogo B y Nogo C. La referencia al gen "Nogo" debería incluir moléculas de ácido nucleico que codifican las tres isoformas a menos que se especifique de otra manera. Del mismo modo, la referencia a la proteína Nogo debería incluir las tres isoformas de Nogo a menos que se especifique de otra manera. Las proteínas Nogo de la invención pueden prevenir la regeneración de neuronas en la médula espinal o cerebro (i.e. propiedades del sustrato no-permisivas), inhiben el excrecencia de las neuritas del ganglio de raíz dorsal, inducen el colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal, bloquean la propagación celular de NIH 3T3, bloquean la excrecencia de las neuritas PC12, etc.

Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de estas son libres de todo el material de mielina del sistema nervioso central; en particular, son libres de todo el material de mielina del sistema nervioso central con el cual la proteína Nogo se asocia naturalmente. Tal material puede incluir otra mielina de las proteínas, lípidos, y carbohidratos de CNS. Las proteínas Nogo, fragmentos y derivados de estas, de la invención, también son preferiblemente libres de los reactivos utilizados en la purificación de especímenes biológicos, tales como detergentes.

En una modalidad específica, la invención proporciona proteínas recombinantes Nogo, fragmentos y derivados de estas, según se preparan por métodos conocidos en el oficio, tales como expresión del gen Nogo en una célula producida por ingeniería genética.

La invención también se relaciona con derivados y análogos de Nogo de la invención que son funcionalmente activos, i.e., son capaces de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína Nogo de longitud completa (tipo salvaje). Tales actividades funcionales incluyen pero no se limitan a la capacidad de interactuar (o competir por el enlace) con proteínas reguladoras de crecimiento neural, antigenicidad [capacidad de unir (o competir con Nogo por enlace) con un anticuerpo anti-Nogo], inmunogenicidad (capacidad de generar un anticuerpo que se une a Nogo), regeneración de la prevención de neuronas en la médula espinal o cerebro, confiriendo a un sustrato la propiedad de restringir el crecimiento, propagación, y migración de las células neurales, y células neoplásicas, inhibiendo la excrecencia de las neuritas del ganglio de raíz dorsal, induciendo el colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal, bloqueando la propagación celular de NIH 3T3 in vitro, bloqueando la excrecencia de las neuritas PC12, restringiendo la plasticidad neural, etc.

La invención además se relaciona con fragmentos (y derivados y análogos de estos) de Nogo que comprenden uno o más dominios de la proteína Nogo.

Los anticuerpos para Nogo, su derivados y análogos, se proporcionan adicionalemente.

La presente invención también se relaciona con métodos terapéuticos y de diagnóstico y composiciones basadas en proteínas y ácidos nucleicos Nogo y anticuerpos anti-Nogo. La invención proporciona el uso de proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos que promueven la actividad de Nogo, para el tratamiento de desórdenes de crecimiento de células u órganos regulados, mediante la administración de compuestos que promueve la actividad de Nogo (por ejemplo, proteínas Nogo y análogos activos funcionalmente y derivados (incluyendo fragmentos) de estos; ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados, agonistas de Nogo).

La invención también proporciona, el uso de antagonistas funcionales de Nogo o inhibidores para el tratamiento de deterioro o desorden del sistema nervioso (por ejemplo, anticuerpos, ácidos nucleicos antisentido Nogo, derivados de antagonistas Nogo).

También se revelan, los modelos de animales, métodos de diagnóstico y métodos de detección para la predisposición a desórdenes.

Para claridad de la divulgación, y no ha modo de la limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las subsecciones que siguen.

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5.1 Aislamiento de genes Nogo

La invención se relaciona con las secuencias del nucleótido de ácidos nucleicos o genes Nogo. En un aspecto, los ácidos nucleicos Nogo comprenden la secuencia de cADN de rata de la Figura 2a (SEQ ID NO:1) identificada como Nogo A según se describe en la Figura 1b, o las regiones codificantes de estos, o secuencias del nucleótido que codifican una proteína Nogo de 1163 aminoácidos de longitud o cualquier fragmento funcional o derivado de estos (por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de la SEQ ID NO:2, como se muestra en la Figura 2a).

En otro aspecto, los ácidos nucleicos Nogo comprenden la secuencia de nucleótido que codifica Nogo B, mientras que la proteína Nogo B es equivalente a los 172 aminoácidos de terminal amino fusionados a los 188 aminoácidos de terminal carboxi de Nogo A, resultando en una proteína de 360 aminoácidos truncada. Los transcritos para Nogo B surgen como un resultado de corte y empalme alternativo que elimina los nucleótidos que intervienen en la codificación de la secuencia.

En incluso otro aspecto, los ácidos nucleicos Nogo comprenden las secuencias del nucleótido que codifican Nogo C, mientras que la proteína Nogo C contiene 11 aminoácidos en su terminal amino, los cuales no están presentes en Nogo A, y los 188 aminoácidos terminal carboxi de Nogo A y B. La proteína Nogo C tiene 199 aminoácidos. El transcrito que codifica Nogo C es el resultado de la transcripción de un promotor alternativo Nogo.

En aún otra modalidad específica , la presente invención proporciona secuencias de ácido nucleico de Nogo de bovino (SEQID NO:28).

En aún otra modalidad específica , la presente invención proporciona las secuencias del nucleótido que codifican Nogo humano, y fragmentos de proteínas de Nogo humano, incluyendo los equivalentes humanos a Nogo de rata A, Nogo B y Nogo C. La secuencia de ácido nucleico de Nogo humano se ilustra utilizando el transcrito de Nogo A de rata como una plantilla y corte y empalme junto con etiquetas de la secuencia expresada (EST) humanas para revelar una secuencia de nucleótido continua. Las secuencias de aminoácido de Nogo de rata y bovino también proporcionaron información en el propio marco de lectura translacional, de tal manera que una secuencia de aminoácido de Nogo humano se deduce. La presente invención también proporciona las secuencias de aminoácido de fragmentos del gen Nogo humano.

La invención también proporciona ácidos nucleicos purificados que consisten de al menos 8 nucleótidos (i.e., una porción hibridizable) de una secuencia de Nogo; en otras modalidades, los ácidos nucleicos consisten de al menos 25 nucleótidos (continuos), 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 150 nucleótidos, 20 nucleótidos, 500 nucleótidos, 700 nucleótidos, o 800 nucleótidos de una secuencia de Nogo, o una secuencia codificante de Nogo de longitud completa. En otra modalidad, los ácidos nucleicos son más pequeños de 35, 200 o 500 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios. La invención también se relaciona con ácidos nucleicos hibridizables con o complementarios a las secuencias mencionadas anteriormente. En aspectos específicos, se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia complementaria a al menos 10, 25, 50, 100, o 200 nucleótidos o la región de codificación total de un gen Nogo.

En una modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que es hibridizable con un ácido nucleico de Nogo (por ejemplo, que tiene una secuencia SEQ ID NO:2; Figura 2a), o con un ácido nucleico que codifica un derivado de Nogo, bajo condiciones de severidad baja. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos utilizando tales condiciones de severidad baja son de la siguiente manera (ver también, Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): Filtros que contiene ADN se pretratan por 6 h a 40ºC en una solución que contiene formamida al 35%, 5X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA 5 mM, PVP al 0.1%, Ficoll al 0.1%, BSA al 1%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.2%, 100 ug/ml ADN de esperma de salmón, 10% (peso/vol) dextran sulfato, y se utiliza una sonda 5-20 X 10^{6} cpm ^{32}P-marcada. Los filtros se incuban en mezcla de hibridación por 18-20 h a 40ºC, y luego se lavan por 1.5 h a 55ºC en una solución que contiene 2X SSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM, y SDS al 0.1%. La solución de lavado se reemplaza con solución fresca y se incuba por 1.5 h más a 60ºC. Los filtros se transfieren secos y se exponen por autoradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan por una tercera vez a 65-68ºC y se exponen otra vez a la película. Otras condiciones de severidad baja que se pueden utilizar son bien conocidas en el oficio (por ejemplo, como se emplea para hibridaciones de especies-cruzadas según se demuestra en el ejemplo en la Sección 6.1.1).

En otra modalidad específica, se proporciona un ácido nucleico que es hibridizable con un ácido nucleico de Nogo bajo condiciones de severidad alta. A modo de ejemplo y no de limitación, los procedimientos utilizando tales condiciones de severidad alta son de la siguiente manera: Prehibridación de los filtros que contienen ADN se lleva a cabo por 8 h durante la noche a 65ºC en solución reguladora compuesta de 6X SSC, Tris-HCI 50 mM (pH 7.5), EDTA 1 mM, PVP al 0.02%, Ficoll al 0.02%, BSA al 0.02%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridizan por 48 h a 65ºC en mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonda 5-20 X 10^{6} cpm de ^{32}P-marcada. El lavado de los filtros se hace a 37ºC por 1h en una solución que contiene 2X SSC, PVP al 0.01%, Ficoll al 0.01%, y BSA al 0.01%. Esto se continúa por un lavado en 0.1X SSC a 50ºC por 45 min antes de la autoradiografía. Otras condiciones de severidad alta que se pueden utilizar son bien conocidas en el oficio.

En otra modalidad específica, un ácido nucleico, que es hibridizable con un ácido nucleico de Nogo bajo condiciones de severidad moderada se proporciona. Por ejemplo, pero no limitando a, procedimientos utilizando tales condiciones de severidad moderada son de la siguiente manera: Filtros que contienen ADN se pretratan por 6 h a 55ºC en una solución que contiene 6X SSC, 5X solución Denhart, SDS al 0.5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la misma solución y se utiliza una sonda 5-20 X 10^{6} cpm ^{32}P-marcada. Los filtros se incuban en la mezcla de hibridación por 18-20 h a 55ºC, y luego se lavan dos veces por 30 minutos a 60ºC en una solución que contiene 1X SSC y SDS al 0.1%. Los filtros se transfieren secos y se exponen por autoradiografía. Otras condiciones de severidad moderada que se pueden utilizar son bien conocidas en el oficio. El lavado de los filtros se hace a 37ºC por 1 h en una solución que contiene 2X SSC, SDS al 0.1%. Tales condiciones de severidad son apropiadas para aislar moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias del gen Nogo en otras especies, por ejemplo, utilizando los clones de cADN de Nogo de rata o bovino como sonda para aislar el cADN de Nogo humano.

Un número de etiquetas de secuencia expresada (ESTs) humanas, reportadas en bases de datos secuencia de ácido nucleico publicado, muestran un alto grado de identidad de secuencia cuando se compara con segmentos de las secuencias del gen Nogo de la invención. La siguiente lista preliminar de ESTs humanas se identificaron y se enumeran por sus números de acceso Genbank: AA158636 (SEQ ID NO:35), AA333267 (SEQ ID NO:36), AA081783 (SEQ ID NO:37), AA167765 (SEQ ID NO:38), AA322918 (SEQ ID NO:39), AA092565 (SEQ ID NO:40), AA081525 (SEQ ID NO:41), y AA081840 (SEQ ID NO:42) utilizando Consulta de nucleótido ENTREZ. Antes de la presente invención, ninguna de las ESTs identificadas anteriormente ha sido caracterizada, en relación con las secuencias de aminoácido estas ESTs se pueden codificar in vivo. Nada se conoce a cerca de la función de las proteínas que comprenden las secuencias de aminoácido pronosticadas de las ESTs humanas. Adicionalmente, una EST, tal como AA158636, alineada con el extremo 5' del cADN de Nogo de rata y otra EST, tal como AA081840, alineada con el extremo 3' de cADN de rata, no se superponen y no se debería percibir que son parte de la misma secuencia de cADN humana.

Basándose en las secuencias del gen Nogo de la presente invención, se cree que estas ESTs humanas representan porciones del gen Nogo humano que se expresan en el tejido del cual las ESTs se obtuvieron. Por consiguiente, la presente invención abarca moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las ESTs humanas identificadas anteriormente. Las ESTs se pueden expresar en el mismo tejido humano, o en tejidos humanos diferentes. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden las secuencias del nucleótido de al menos dos ESTs humanas que no se superponen en relación con las otras, o que no superponen una tercera o más EST humana.

Dado que las ESTs humanas identificadas anteriormente se identifican ahora como fragmentos del gen Nogo humano debido a la clonación de ácidos nucleicos de Nogo de bovino y rata, se contempla que las ESTs humanas tienen funciones similares relativas a las otras moléculas de ácido nucleico de Nogo en varios métodos de la invención, tales como, pero no limitando a, por ejemplo, Expresión de polipétidos de Nogo humano, ensayos de hibridación, e inhibición de la expresión de Nogo como moléculas de ácido nucleico antisentido, etc.

Por otra parte, la presente invención proporciona e incluye la secuencia de aminoácido pronosticada de la proteína Nogo humana, y fragmentos de esta. Como se muestra en la Figura 13, la secuencia de aminoácido de la proteína Nogo de rata (Figura 2a; SEQ ID NO:2) se alinea con la secuencia de aminoácido pronosticada de la proteína Nogo humana (Figura 13; SEQ ID NO:29). Por consiguiente, la presente invención abarca proteínas Nogo humanas, que comprenden la secuencia de aminoácido pronosticada de Nogo humano. Figura 13 y SEQ ID NO:29, o una subsecuencia de la secuencia de aminoácido pronosticada de Nogo humano, que consiste de al menos 6 residuos de aminoácido, o una o más de las siguientes secuencias de aminoácido pronosticadas de fragmentos de Nogo humano: MEDLDQSPLVSSS (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 1-13 con la SEQ ID NO:43), KIMDLKEQPGNTISAG (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 187-203 con la SEQ ID NO:44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 340-358 con la SEQ ID NO:45), QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEA
PLNSAVPSAGASVIQPSS (Nogo humano, correspondiente a los aminoácidos 570-619 con la SEQ ID NO:46). Nogo humano que ocurre naturalmente y Nogo humano recombinante, y fragmentos de estos que tienen una secuencia de aminoácido sustancialmente similar a las secuencias de aminoácido descritas anteriormente y capaces de ser unidas por un anticuerpo dirigido contra una proteína Nogo están dentro del alcance de la invención.

La presente invención además proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína Nogo humana que tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente similar a la secuencia de aminoácido como se muestra en la Figura 13 (Figura 13; (SEQ ID NO: 29). En modalidades específicas, las moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos de proteína Nogo humana que tienen una de aminoácido sustancialmente similar a la secuencia de aminoácido como se muestra en la Figura 13 (SEQ ID NO:29), también se contemplan con la condición que tales moléculas de ácido nucleico no comprendan la secuencia de nucleótido de las ESTs humanas identificadas anteriormente.

Una secuencia de aminoácido se estima que es sustancialmente similar a la secuencia de aminoácido pronosticada de la proteína Nogo humana cuando más del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% de los residuos de aminoácido en las dos moléculas son idénticas cuando se utiliza un algoritmo de ordenador, en el cual la alineación se hace por un programa de homología de ordenador conocido en el oficio, por ejemplo una búsqueda de ordenador BLAST (Altschul et al., 1994, Nature Genet. 6:119-129) se utiliza.

A modo de ejemplo y no de limitación, programas de homología de ordenador útiles incluyen los siguientes: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, ``The BLAST Algorithm; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) un algoritmo de búsqueda heurístico hecho a la medida para búsqueda de la similitud de la secuencia que atribuye significancia utilizando los métodos estadísticos de Karlin and Altschul 1990, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 90:5873-77. Cinco programas BLAST específicos desarrollan las siguientes tareas:

1) El programa BLASTP compara una secuencia de consulta de aminoácido contra una base de datos de secuencias de proteínas.

2) El programa BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleótido contra una base de datos de secuencia de nucleótido.

3) El programa BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótido (ambas cadenas) contra una base de datos de secuencias de proteínas.

4) El programa TBLASTN compara una secuencia de consulta de proteína contra una base de datos de la secuencia de nucleótidos traducidos en los seis marcos de lectura (ambas cadenas).

5) El programa TBLASTX compara las traducciones de los seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótido contra una base de datos de las traducciones de los seis marcos de una secuencia de nucleótido.

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Como se entenderá por aquellos de habilidad en el oficio, el programa TBLASTN es particularmente útil para identificar los ácidos nucleicos con un porcentaje de identidad deseado y el programa BLASTP es particularmente útil para identificar secuencias de aminoácido con un porcentaje de identidad deseado.

Smith-Waterman (base de datos: European Bioinformatics Institute wwwz.ebi.ac.uk/bicsw/) (Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197) es un algoritmo matemáticamente riguroso para alineaciones de secuencia.

FASTA (ver Pearson et al., 1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444-2448) es una aproximación heurística al algoritmo Smith-Waterman. Para una discusión general del procedimiento y los beneficios de los algoritmos de BLAST, Smith-Waterman y FASTA, ver Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods" (www.psc.edu) y las referencias citadas en este.

Los usos de las secuencias de aminoácido pronosticadas de Nogo humano, o las secuencias del nucleótido de las ESTs humanas, incluyendo secuencias degeneradas que codifican la secuencia de aminoácido pronosticada de Nogo humano, para aislar o identificar el gen Nogo humano, los fragmentos, mutantes que se producen naturalmente y variantes de estos, están dentro del alcance de la invención. Tales usos que serán bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio, incluyen pero no se limitan al uso de la información para preparar sondas de ácido nucleico para la selección de biblioteca de ADN, amplificación de ADN, selección genética de la población humana, y para preparar péptidos sintéticos para hacer anticuerpos. La descripción detallada de algunos de tales usos se proporciona aquí en las últimas secciones.

Los ácidos nucleicos que codifican derivados y análogos de proteínas Nogo, y ácidos nucleicos antisentido Nogo adicionalmente se revelan. Como es fácilmente aparente, según se utiliza aquí, un "ácido nucleico que codifica un fragmento o porción de una proteína Nogo" se deberá construir como refiriéndose a un ácido nucleico que codifica solamente el fragmento o porción enumerada de la proteína Nogo y no las otras porciones contiguas de la proteína Nogo como una secuencia contigua. En este contexto, una porción significa uno o más aminoácidos.

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Los fragmentos de ácidos nucleicos Nogo, que comprenden regiones conservadas entre (con homología a) otros ácidos nucleicos Nogo, de la misma o diferentes especies, también se revelan. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más dominios Nogo se proporcionan en la Figura 2a, por ejemplo, el dominio del terminal carboxi conservado de Nogo de rata, que tiene aproximadamente 180 aminoácidos, y se codifica por los últimos 540 nucleótidos de la secuencia codificada antes del codón de terminación. Las secuencias de aminoácido y de nucleótido de dos dominios hidrófobos dentro del dominio del terminal carboxi conservado, i.e., a partir de los aminoácidos 988 a 1023, y de los aminoácidos 1090 a 1125, en Nogo de rata A, también se proporcionan. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos del dominio ácido de terminal amino de Nogo de rata A, a partir de los residuos 31 a 58, también se proporcionan.

Para ejecutar el análisis funcional de varias regiones de Nogo, una serie de deleciones en el gen Nogo ha sido generada y se clona en un vector de expresión por técnicas de ADN recombinante y se expresa como una proteína de fusión. Los ácidos nucleicos que codifican un fragmento de una proteína Nogo se proporcionan, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácido 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974, o 975-1162 de la SEQ ID NO: 2, o combinaciones de estos; y ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácido 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, y 940-1127 de la SEQ ID NO: 29, o combinaciones de estos. Alguna de las construcciones de deleción comprende porciones truncadas de Nogo y secuencias adicionales del nucleótido que codifican una etiqueta de hexahistidina y/o una etiqueta-T7. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas truncadas Nogo que carecen de residuos de aminoácido 172-259, residuos de aminoácido 974-1162, o residuos de aminoácido 172-259 y 974-1162, de la SEQ ID NO:2 pero por otra parte, comprenden el remanente de la SEQ ID NO: 2; o los residuos de aminoácido 132-206, residuos de aminoácido 939-1127, o residuos de aminoácido 132-206 y 939-1127, de la SEQ ID NO:29 pero por otra parte comprenden el remanente de la SEQ ID NO:29, se proporcionan. La estructura de construcciones de deleción ejemplares se muestra en la Figura 18. Las construcciones de deleción producen fragmentos o porción(s) truncada(s) de Nogo cuando se introducen en una célula. Las actividades biológicas de estos mutantes se probaron en varios ensayos funcionales como se describe en la Tabla 2 en la Sección 6.2.7.

Los siguientes ejemplos específicos para la clonación de un gen Nogo, se presentan como un ejemplo particular pero no a modo de limitación:

Para la clonación de expresión (una técnica conocida normalmente en el oficio), una biblioteca de expresión se construye por métodos conocidos en el oficio. Por ejemplo, mARN (por ejemplo, humano) se aísla, el cADN se hace y liga en un vector de expresión (por ejemplo, un derivado bacteriofago) de tal manera que es capaz de ser expresado por la célula huésped en la cual este luego se introduce. Varios ensayos de selección luego se pueden utilizar para seleccionar el producto Nogo expresado. En una modalidad, los anticuerpos anti-Nogo se pueden utilizar para la selección.

En otra modalidad, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar la secuencia deseada en una biblioteca de cADN o genómica, antes de la selección. Los cebadores del oligonucleótido que representan conocidas secuencias de Nogo, se pueden utilizar como cebadores en PCR. En un aspecto preferido, los cebadores de oligonucleótido representan al menos parte de los segmentos conservados de Nogo de homología fuerte entre Nogo de especies diferentes. Los oligonucleótidos sintéticos se pueden utilizar como cebadores para amplificar por PCR las secuencias a partir de una fuente (ARN o ADN), preferiblemente una biblioteca de cADN, de interés potencial. La PCR se puede llevar a cabo, por ejemplo, por el uso de un Perkin-Elmer Cetus thermal cycler y Taq polimerasa (Gene Amp^{TM}). El ADN que se amplifica puede incluir mARN o cADN o ADN genómico de cualquier especie eucariótica. Alguien puede elegir sintetizar varios cebadores degenerados diferentes, para utilizar en las reacciones de PCR. También es posible variar la severidad de condiciones de hibridación utilizadas en el cebado de las reacciones de PCR, para permitir un mayor o menor grado de similitud de la secuencia de nucleótido entre la conocida secuencia de nucleótido de Nogo y el homólogo del ácido nucleico que se aísla. Para la hibridación de especies cruzadas, condiciones de severidad baja se prefieren. Para la hibridación de la misma especie, se prefieren las condiciones de severidad moderada.

Después de la amplificación exitosa de un segmento de un homólogo Nogo, este segmento se puede clonar y secuenciar molecularmente, y utilizar como una sonda para aislar un clon de cADN o genómico completo. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótido completa del gen, el análisis de su expresión, y la producción de su producto de la proteína para el análisis funcional, como se describe infra. De esta manera, los genes adicionales que codifican proteínas Nogo y análogos Nogo se pueden identificar.

Los métodos anteriores no están destinados para limitar la siguiente descripción general de los métodos por los cuales los clones de Nogo se pueden obtener.

Cualquier célula eucariótica, potencialmente puede servir como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen Nogo. Las secuencias de ácido nucleico que codifican Nogo se pueden aislar de vertebrados, mamífero, humano, porcinos, murina, bovino, felino, aviar, equino, canino, así como fuentes de primates adicionales, insectos, etc. El ADN se puede obtener por procedimientos estándar, conocidos en el oficio de ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), por síntesis química, por clonación de cADN, o mediante la clonación de ADN genómico, o fragmentos de estos, purificados a partir de la célula deseada. (Ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II.) Los clones derivados de ADN genómico pueden contener de regiones de ADN de intrón y reguladoras, en adición a las regiones codificantes; los clones derivados de cADN contendrán solamente secuencias del exón. Cualquiera que sea la fuente, el gen debería ser clonado molecularmente en un vector apropiado para la propagación del gen.

En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, los fragmentos de ADN se generan, alguno de los cuales codificaran el gen deseado. El ADN se puede dividir en sitios específicos utilizando varias enzimas de restricción. Alternativamente, alguien puede utilizar DNAsa en la presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cizallar físicamente, como por ejemplo, por sonicación. Los fragmentos lineales de ADN luego se pueden separar de acuerdo con el tamaño por técnicas estándar, incluyendo pero no limitando a, electroforesis de gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía de columna.

Una vez que los fragmentos de ADN se generan, la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el deseado gen se puede lograr de diferentes maneras. Por ejemplo, si una cantidad de una porción de un gen Nogo (de cualquier especie) o su ARN específico, o un fragmento de estos (ver Sección 6.1.1), está disponible y se puede purificar y marcar, los fragmentos de ADN generados se pueden seleccionar por hibridación del ácido nucleico con la sonda marcada (Benton, W. and Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. And Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Aquellos fragmentos de ADN con homología sustancial a la sonda serán hibridizados. También es posible identificar el fragmento apropiado por digestión(s) de la enzima de restricción y comparación de los tamaños del fragmento con aquellos esperados de acuerdo con un mapa de restricción conocido si tal está disponible. Otra selección se puede llevar a cabo sobre la base de las propiedades del gen.

Alternativamente, la presencia del gen se puede detectar por ensayos basados en las propiedades físicas, químicas, o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, clones de cADN, o clones de ADN que seleccionan el híbrido del propio mARNs, se pueden seleccionar para producir una proteína que tenga, por ejemplo, migración electroforética similar o idéntica, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteolítica, modificaciones pos-translacionales, propiedades ácidas o básicas o propiedades antigénicas como se conoce para Nogo. Los anticuerpos para Nogo son disponibles, tales como IN-1 y IN-2 (U.S. Patent 5,684,133), AS Bruna y AS 472. Preparación de AS Bruna y AS 472 se describen en la Sección 6.1.7. La proteína Nogo se pueden identificar por el enlace del anticuerpo marcado con los clones sintetizados de Nogo putativamente, en un procedimiento tipo ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enzima ligado) o por western blotting de extractos celulares purificados o completos.

El gen Nogo también puede ser identificado, mediante la selección de mARN por hibridación del ácido nucleico seguido por la traducción in vitro. En este procedimiento, los fragmentos se utilizan para aislar mARNs complementarios por hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar ADN de Nogo purificado, disponible de otras especies (por ejemplo, ratón, humano). Análisis de inmunoprecipitación o ensayos funcionales (por ejemplo, capacidad de agregación in vitro; enlace al receptor; ver infra) de los productos de traducción in vitro de los productos aislados de los mARNs aislados identifican el mARN y, por consiguiente, los fragmentos complementarios de ADN que contienen las secuencias deseadas. Además, mARNs específicos se pueden seleccionar por adsorción de polisomas aislados de células para anticuerpos inmovilizados, específicamente dirigidos contra la proteína Nogo. Un cADN de Nogo radiomarcado se puede sintetizar utilizando el mARN seleccionado (a partir de los polisomas adsorbidos) como una plantilla. El mARN o cADN radiomarcado luego se puede utilizar como una sonda para identificar los fragmentos de ADN de Nogo entre otros fragmentos de ADN genómico.

Alternativas para aislar el ADN genómico de Nogo incluyen, pero no se limitan a, sintetizar químicamente la secuencia del gen por si misma a partir de una secuencia conocida o haciendo el cADN con el mARN que codifica la proteína Nogo. Por ejemplo, ARN para la clonación de cADN del gen Nogo se pueden aislar a partir de las células que expresan Nogo. Otros métodos son posibles y en el alcance de la invención.

El gen identificado y aislado luego se puede insertar en un vector de clonación apropiado. Un gran número de sistemas vector-huésped conocidos en el oficio se pueden utilizar. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la célula huésped utilizada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados del plásmido pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene). En un ejemplo específico, Nogo se clona en pcDNA3 con etiquetas de epitope para el análisis de expresión de proteína simplificado (Sección 6.1.10).

La inserción en un vector de clonación, por ejemplo, se puede lograr por unión del fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene un terminal cohesivo complementario. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios utilizados con el fragmento del ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir por unión de las secuencias del nucleótido (ligadores) en el terminal de ADN; estos ligadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos, sintetizados químicamente que codifican las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector dividido y el gen Nogo se pueden modificar por prolongación homopolimérica. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células huésped vía transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de tal manera que muchas copias de la secuencia del gen se generan.

En un método alternativo, el deseado gen se puede identificar y aislar después de la inserción en un vector apropiado de clonación en un método "secuenciación aleatoria". El enriquecimiento para el deseado gen, por ejemplo, por fraccionización de tamaño, se puede hacer antes de la inserción en el vector de clonación.

En modalidades específicas, la transformación de las células huésped con moléculas de ADN recombinante que incorporan la secuencia del gen Nogo aislado, cADN, o ADN sintetizado permite la generación de múltiples copias del gen. De esta manera, el gen se puede obtener en grandes cantidades por el cultivo de transformantes, aislamiento de las moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperación del gen insertado a partir del ADN recombinante aislado.

Las secuencias de Nogo proporcionadas por la presente invención incluyen aquellas secuencias del nucleótido que codifican sustancialmente las mismas secuencias de aminoácido como se encuentra en las proteínas Nogo nativas, y aquellas secuencias de aminoácido codificadas con aminoácidos funcionalmente equivalentes, así como aquellas que codifican otros derivados de Nogo o análogos, como se describe en las Secciones 6.2.1 y 6.2.2 infra para derivados y análogos de Nogo.

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5.2 Expresión de los genes Nogo

La secuencia de nucleótido que codifica para una proteína Nogo o un análogo o fragmento funcionalmente activo u otro derivado de estos (ver Figuras 1b y 2a; Secciones 6.2.1 y 6.2.2), se puede insertar en un vector de expresión apropiado, i.e., un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Las necesarios señales transcripcionales y de traducción también se pueden suministrar por el gen Nogo nativo y/o sus regiones flanqueantes. La secuencia codificante también se puede marcar con una secuencia que codifica para un antígeno o molécula biológica descrita bien, que tiene conocidas propiedades de enlace para un patrón de enlace (por ejemplo etiqueta myc epitope, etiqueta histidina, etiqueta T7 epitope etc., ver Sección 6.2.6 y Figura 11a-11c). Esta secuencia adicional luego se puede explotar para purificar la proteína Nogo, fragmento de proteína, o su derivado utilizando la interacción del grupo de enlace con su patrón correspondiente, que se une a una matriz sólida.

Una variedad de vectores huésped-sistema se pueden utilizar para expresar la secuencia codificante de la proteína. Estos incluyen pero no se limitan a, sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo, virus de vacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura, o bacteria transformada con bacteriófago, ADN, ADN del plásmido, o ADN del cósmido. Los elementos de expresión de vectores varían en sus potencias y especificidades. Dependiendo del sistema vector-huésped utilizado, cualquiera de un número de transcripción apropiada y elementos de traducción se puede utilizar. En modalidades específicas, el gen Nogo humano se expresa, o una secuencia que codifica una porción funcionalmente activa de Nogo humano, como un ejemplo específico, ya sea Nogo A, Nogo B o Nogo C se expresa (Figura lb). En incluso otra modalidad, un fragmento de Nogo que comprende un dominio de la proteína Nogo se expresa.

Como se utiliza aquí, una célula se "transforma" con un ácido nucleico, cuando dicha célula contiene un ácido nucleico no presente nativamente en la célula, después de la introducción del ácido nucleico en la célula o su progenitor, por ejemplo, por transfección, electroporación, transducción, etc.

Las secuencias de nucleótido que codifican los fragmentos de Nogo humano A que comprenden una secuencia de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos de aminoácido 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, y 940-1127 de la SEQ ID NO:29 también se proporcionan. Las secuencias de nucleótido que codifican las porciones truncadas de Nogo A humano también se proporcionan: las proteínas truncadas carecen de residuos de aminoácido 132-206, residuos de aminoácido 939-1127, o residuos de aminoácido 132-206 y 939-1127, de la SEQ ID NO:29 pero por otra parte comprenden el remanente de la SEQ ID NO:29.

Cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste de apropiadas señales de control transcripcional/de traducción y la secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante y sintéticas in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína Nogo o fragmento de péptido, se puede regular por una segunda secuencia de ácido nucleico, de tal manera que la proteína Nogo o péptido se expresa en un huésped transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una proteína Nogo se puede controlar por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en el oficio. Una modalidad ejemplar es utilizar uno de los promotores naturales de Nogo, tanto P1 o P2, discutidos en la Sección 6.2.1. Un promotor no-nativo también se puede utilizar. Los promotores que se pueden utilizar para controlar la expresión Nogo incluyen, pero no se limitan a, la región promotor anticipada SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en el terminal alargado 3' repetido del virus Rous sarcoma (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor del herpes de la timidina quinasa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); ver también "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94; vectores de expresión de vegetales que comprenden la región promotor de la sintetasa nopalina (Nerreta-Estretla et al., Nature 303:209-213) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotor a partir de la levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol dehidrogenasa), promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones control transcripcional de animal, que muestran especificidad del tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos: región control del gen I elastasa, la cual es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región control del gen de la insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región control del gen de la inmunoglobulina que es activa en células linfoide (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región control del virus del tumor mamario del ratón, que es activa en células testiculares, de mama, linfoide y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), región control del gen albúmina, que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región control del gen alfafetoproteína, que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58; región control del alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), región control del gen beta-globina que es activa en la células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en células oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región control del gen de miosina de cadena liviana-2 que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286), y región control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

En un ejemplo específico, se utiliza un vector que comprende un promotor ligado operablemente a un ácido nucleico que codifica un Nogo, uno o más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores genéticos (por ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos).

En una modalidad específica, una construcción de la expresión se hace por subclonación de una secuencia codificante de Nogo en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (Glutathione S-Transferase expression vectors; Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Esto permite la expresión del producto de la proteína Nogo a partir del subclon en el correcto marco de lectura.

Los vectores de expresión que contienen insertos del gen Nogo se pueden identificar por tres enfoques generales: (a) hibridación del ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones del gen "marcador", y (c) expresión de las secuencias insertadas. En el primer método, la presencia de un gen Nogo insertado en un vector de expresión se puede detectar por hibridación del ácido nucleico utilizando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen Nogo insertado. En el segundo método, el sistema huésped/vector recombinante se pueden identificar y seleccionar basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad de la timidina quinasa, resistencia a los antibióticos, transformación fenotipo, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causado por la inserción de un gen Nogo en el vector. Por ejemplo, si el gen Nogo se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, recombinantes que contienen el inserto Nogo, se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer método, los vectores de expresión recombinante se pueden identificar, mediante el ensayo del producto Nogo expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína Nogo en sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, enlace con anticuerpo anti-Nogo.

Una vez que una molécula particular de ADN recombinante se identifica y aísla, varios métodos conocidos en el oficio se pueden utilizar para propagarla. Una vez que un sistema de huésped apropiado y las condiciones de crecimiento se establecen, los vectores de expresión recombinante se pueden propagar y preparar en cantidad. Como se explica previamente, los vectores de expresión que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores o sus derivados: virus de animales o humanos tales como virus de vacuna o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores bacteriófagos (por ejemplo, lambda), y vectores de plásmido y ADN del cósmido, para nombrar unos pocos.

Además, una cepa de célula huésped se puede escoger que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y los procesos del producto del gen de la manera específica deseada. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en la presencia de ciertos inductores; por lo tanto, la expresión de la proteína Nogo producida mediante ingeniería genética se puede controlar. Adicionalmente, diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procedimiento y modificación de traducción y post-translacional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas). Las líneas celulares o sistemas de huéspedes apropiados, pueden ser seleccionados para asegurar la deseada modificación y procedimiento de la proteína foránea expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un producto de la proteína del núcleo sin glicosilar. La expresión en la levadura producirá un producto glicosilado. La expresión en las células de mamíferos se puede utilizar para asegurar la glicosilación "nativa" de una proteína heteróloga. Adicionalmente, diferentes sistemas de expresión vector/huésped pueden afectar las reacciones del procedimiento en diferente medidas.

En otros ejemplos específicos, la proteína Nogo, fragmento; análogo, o derivado se pueden expresar como una fusión, o producto de proteína quimérica (que comprende la proteína, fragmento, análogo, o derivado unido vía un enlace peptídico a una secuencia de proteínas heteróloga (de una proteína diferente)): Tal producto quimérico se puede hacer por unión de las apropiadas secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias deseadas de aminoácido con cada otro por métodos conocidos en el oficio, en el marco de codificación propio, y la expresión del producto quimérico por métodos conocidos normalmente en el oficio. Alternativamente, dicho producto quimérico se puede hacer mediante técnicas sintéticas de proteína, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de péptido.

Ambas secuencias de cADN y genómicas pueden ser clonadas y expresadas.

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5.3 Identificación y purificación de los productos del gen Nogo

En aspectos particulares, la invención proporciona secuencias de aminoácido de Nogo, preferiblemente Nogo humano, y fragmentos y derivados de estos, que comprenden un determinante antigénico (i.e., se puede reconocer por un anticuerpo) o que son de otra manera funcionalmente activos, así como secuencias de ácido nucleico que codifican la precedente. El material Nogo "funcionalmente activo" según se utiliza aquí se refiere a este material que muestra una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína Nogo A de longitud completa (tipo salvaje), por ejemplo, propiedades del sustrato no-permisivas, colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal, inhibición de la propagación NIH 3T3, inhibición de la excrecencia de las neuritas, enlace a un sustrato Nogo o patrón de enlace Nogo, antigenicidad (enlace a un anticuerpo anti-Nogo), inmunogenicidad, etc.

A modo de ejemplo, los fragmentos de una proteína Nogo consisten de al menos 6 aminoácidos, 10 aminoácidos, 17 aminoácidos, 50 aminoácidos, 100 aminoácidos o de al menos 220 aminoácidos. En otros ejemplos las proteínas comprenden o consisten esencialmente del dominio Nogo altamente conservado del terminal carboxi (terminal carboxi 188 aminoácidos de Nogo A). También se revelan, los fragmentos, o proteínas que comprenden fragmentos, que carecen del dominio del terminal carboxi conservado, o los tramos del terminal carboxi hidrófobos, o el dominio ácido amino terminal, o la región terminal amino poli-prolina o cualquier combinación de estos, de una proteína Nogo. Los ácidos nucleicos que codifican las mencionadas anteriormente se revelan.

Una vez que un recombinante que expresa la secuencia del gen Nogo se identifica, el producto del gen se puede analizar. Esto se logra por ensayos basados en las propiedades físicas o funcionales del producto, incluyendo marcación radioactiva del producto seguido por el análisis por electroforesis en gel, inmunoensayo, etc.

Una vez que la proteína Nogo se identifica, se puede aislar y purificar por métodos estándar incluyendo cromatografía (por ejemplo, cromatografía de columna de intercambio iónico, afinidad, y exclusión), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las propiedades funcionales se pueden evaluar utilizando cualquier ensayo apropiado incluyendo colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal, inhibición de la propagación NIH 3T3, inhibición de regeneración de neuritas en nervios ópticos (ver Secciones 6.2.4-6.2.5).

Alternativamente, una vez que una proteína Nogo se produce por un recombinante se identifica, la secuencia de aminoácido de la proteína se puede deducir de la secuencia de nucleótido del contenido de gen quimérico en el recombinante. Como un resultado, la proteína se puede sintetizar por métodos químicos estándar conocidos en el oficio (por ejemplo, ver Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111).

En otro ejemplo alterno, el Nogo C nativo, se puede purificar a partir de fuentes naturales, por métodos estándar tales como aquellos descritos anteriormente (por ejemplo, purificación de inmunoafinidad).

En una modalidad específica de la presente invención, tales proteínas Nogo, tanto producidas por técnicas de ADN recombinante o por métodos de química sintética o por purificación de proteínas nativas, incluyen pero no se limitan a aquellas que contienen, como una secuencia de aminoácido primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácido sustancialmente como se describe en la Figura 13 (SEQ ID NO:29), así como fragmentos y otros derivados (tales como, pero no limitando a aquellos descritos en la Figura 18), y análogos de estos, incluyendo proteínas homólogas de estas. Preferiblemente, las proteínas Nogo de la invención son libres de toda la mielina del material de CNS con la que se asocia normalmente.

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5.4 Estructura de la proteína y del gen Nogo La estructura de la proteína y del gen Nogo se puede analizar por varios métodos conocidos en el oficio y varios de estos métodos se describen en las siguientes subsecciones.

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5.4.1 Análisis genético

El ADN clonado o cADN correspondiente al gen Nogo se puede analizar por métodos incluyendo pero no limitando a hibridación Southern (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), hibridación Northern (ver por ejemplo, Freeman et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4094-4098), cartografía de la endonucleasa de restricción (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), y análisis de secuencia de ADN. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR; U.S. Patent Nos. 4,683,202, 4,683,195 y 4,889,818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al., 1989, Science 243:217-220) seguido por la hibridación Southern con una sonda específica de Nogo, pueden permitir la detection del gen Nogo en ADN a partir de varios tipos de células. Métodos de amplificación, diferentes de PCR se conocen comúnmente y también se pueden emplear. En una modalidad, la hibridación Southern se puede utilizar para determinar el ligamiento genético de Nogo. El análisis de hibridación Northern se puede utilizar para determinar la expresión del gen Nogo. Varios tipos de células, en varios estados de desarrollo o actividad se pueden probar para la expresión de Nogo. La severidad de las condiciones de hibridación por ambas hibridación Southern y Northern se pueden manipular para asegurar la detection de ácidos nucleicos con el deseado grado de relevancia a la sonda específica de Nogo utilizada. Las modificaciones de estos métodos y otros métodos conocidos normalmente en el oficio, se pueden utilizar.

La cartografía de la endonucleasa de restricción, se puede utilizar en líneas generales, para determinar la estructura genética del gen Nogo. Los mapas de restricción derivados por la división de la endonucleasa de restricción se pueden confirmar por el análisis de secuencia de ADN.

El análisis de secuencia de ADN se puede realizar por cualquiera de las técnicas conocidas en el oficio, incluyendo pero no limitando al método de Maxam and Gilbert (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), el método dideoxi de Sanger (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463), el uso de la polimerasa de ADN T7 (Tabor and Richardson, U.S. Patent No. 4,795,699), o uso de un secuenciador de ADN automatizado (por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA).

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5.4.2 Análisis de proteínas

La secuencia de aminoácido de la proteína Nogo se puede derivar por deducción a partir de la secuencia de ADN, o alternativamente, por secuenciación directa de la proteína, por ejemplo, con un secuenciador de aminoácido automatizado.

La secuencia de proteínas de Nogo se puede además caracterizar por un análisis de hidrofilicidad (Hopp, T. and Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824). Un perfil de hidrofilicidad se puede utilizar para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas de la proteína Nogo y las correspondientes regiones de la secuencia del gen que codifica dichas regiones.

El análisis estructural, secundario (Chou, P. and Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) también se puede hacer, para identificar regiones de Nogo que asumen estructuras secundarias específicas.

La manipulación, traducción, y predicción de la estructura secundaria, predicción del marco de lectura abierto y marcado, así como la determinación de homologías de las secuencias, también se pueden lograr utilizando programas de software de ordenador disponibles en el oficio.

Otros métodos del análisis estructural también se pueden emplear. Estos incluyen pero no se limitan a cristalografía de rayos X (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) y moldeado por ordenador (Fletterick, R. and Zoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

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5.5 Generación de anticuerpos para proteínas Nogo y derivados de estas

De acuerdo con la invención, la proteína Nogo, su fragmentos u otros derivados, o análogos de estos, se pueden utilizar como un inmunógeno para generar anticuerpos que unen inmunoespecíficamente dicho inmunógeno. Tales anticuerpos incluyen pero no se limitan a policlonal, monoclonal, quimérico, cadena sencilla, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos dirigidos a un fragmento recombinante de Nogo de rata y bovino se producen (Sección 6.1.7), estos anticuerpos también reaccionan en cruz con otras especies epitopes. En otra modalidad, los fragmentos de una proteína Nogo identificado como hidrófilos se utilizan como inmunógenos para la producción de anticuerpos.

Varios procedimientos conocidos en el oficio se pueden utilizar para la producción de anticuerpos ploliclonales para una proteína Nogo o derivado o análogo. En una modalidad particular, anticuerpos ploliclonales de conejo para un epitope de una proteína Nogo codificada por una secuencia de la SEQ ID NO:2 en la Figura 2a, SEQ ID NO: 24 en la Figura 12, SEQ ID NO:32 en la Figura 14, o SEQ ID NO: 29 en la Figura 13, (Nogo A de rata, Nogo de bovino, Nogo C de rata, o Nogo humano respectivamente) o una subsecuencia de estos, se puede obtener. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped se pueden inmunizar por inyección con la proteína nativa Nogo, o una versión sintética, o derivado (por ejemplo, fragmento) de esta, incluyendo pero no limitando a conejos, ratones, ratas, etc. Varios adyuvantes se pueden utilizar para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, e incluyendo pero no limitando a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de la lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guérin) y corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una secuencia de proteínas de Nogo o análogo de esta, cualquier técnica que se proporcione para la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en cultivo se puede utilizar. Por ejemplo, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula-B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir en animales libres de gérmenes utilizando tecnología reciente (PCT/US90/02545). De acuerdo con la invención, los anticuerpos humanos se pueden utilizar y se pueden obtener mediante el uso de hibridomas humanos (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o por tansformación de células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96). De hecho, de acuerdo con la invención, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) por corte y empalme de los genes a partir de una molécula específica de anticuerpo de ratón para Nogo junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiado se pueden utilizar; tales anticuerpos están dentro del alcance de esta invención.

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (U.S. Patent 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de Nogo. Las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión Fab también se pueden utilizar (Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la deseada especificidad para las proteínas Nogo, derivados, o análogos.

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula, se pueden generar por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: el fragmento F(ab')_{2} que se pueden producir por la digestión de la pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos de Fab que se pueden generar por la reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2}, los fragmentos Fab que se puede generar por tratar la molécula de anticuerpo con papaina y un agente reductor, y los fragmentos Fv.

En la producción de anticuerpos, la selección para el deseado anticuerpo se puede lograr por técnicas conocidas en el oficio, por ejemplo ELISA (ensayo inmunoabsorbente de enzima ligado). Por ejemplo, para seleccionar los anticuerpos que reconocen un dominio específico de una proteína Nogo, se pueden ensayar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento Nogo que contiene dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo Nogo pero que no se une específicamente a diferentes homólogos Nogo, se puede seleccionar sobre la base de enlace positivo al primer homólogo Nogo y una carencia de enlace con el segundo homólogo Nogo.

También se proporcionan, los anticuerpos específicos con un dominio de una proteína Nogo.

Los anticuerpos mencionadas anteriormente se pueden utilizar en métodos conocidos en el oficio relacionados con la localización y actividad de la secuencias de proteínas de Nogo de la invención, por ejemplo, para imágenes de estas proteínas, la medición de los niveles de estos en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc.

Los anticuerpos anti-Nogo y fragmentos de estos que contienen el dominio de enlace son Terapéuticos.

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5.6 Proteínas Nogo, derivados y análogos

La invención además se relaciona con las proteínas Nogo y sus derivados (incluyendo pero no limitando a fragmentos) y análogos de las proteínas Nogo. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas derivadas de Nogo y proteínas análogas también se revelan. En un ejemplo, las proteínas Nogo se codifican por los ácidos nucleicos Nogo descritos en la Sección 5.1 supra. En aspectos particulares se revelan, las proteínas Nogo A, Nogo B, o Nogo C y derivados, o análogos son de animales, por ejemplo, ratón, rata, cerdo, vaca, perro, mono, humano, mosca, o ranas.

La producción y uso de derivados y análogos relacionados con Nogo también se revela en un ejemplo específico, el derivado o análogo es funcionalmente activo, i.e., capaz de mostrar una o más actividades funcionales asociadas con una proteína Nogo de tipo salvaje de longitud completa. Como un ejemplo, tales derivados o análogos que tienen la deseada inmunogenicidad o antigenicidad se pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos, para la inmunización, para la inhibición de la actividad de Nogo, etc. Los derivados o análogos que retienen, o alternativamente carecen o inhiben, una deseada propiedad Nogo de interés (por ejemplo, enlace a un patrón de enlace Nogo, se puede utilizar como inductores, o inhibidores, respectivamente, de tal propiedad y su correlación fisiológica. Un ejemplo específico se relaciona con un fragmento Nogo que se puede unir por un anticuerpo anti-Nogo. Los derivados o análogos de Nogo se pueden probar para la deseada actividad por procedimientos conocidos en el oficio, incluyendo pero no limitando a los ensayos descritos en las Secciones 6.1.10 a 6.1.12.

Con el fin de hacer el mapa de la(s) región(s) activa(s) de Nogo, una serie de mutantes de deleción de Nogo se han preparado por técnicas de ADN recombinante como se describe en la Sección 6.2.7. Las porciones de Nogo que están presentes en los mutantes de deleción se muestran en la Figura 18. En una modalidad específica, la invención proporciona los fragmentos de Nogo por ejemplo, fragmentos que comprenden (o alternativamente que consiste de) Nogo A (SEQ ID NO: 2) números de aminoácido 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, '722-974, 172-259, o 975-1162, o combinaciones de los mencionados anteriormente. Los mutantes truncados de Nogo que carecen de los números de aminoácidos 172-259 y/o 975-1162 de la SEQ ID NO:2 también se proporcionan, como estas regiones parecen ser no-esenciales y se pueden retirar de Nogo sin afectar la actividad biológica. Los fragmentos correspondientes de Nogo A humano que comprende (o alternativamente que consiste de) números de aminoácidos-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939, o 940-1127 de la SEQ ID NO:29 también se proporcionan. También se proporcionan los mutantes truncados de Nogo A humano que carecen de los números de aminoácido 132-206, residuos de aminoácido 939-1127, o residuos de aminoácido 132-206 y 939-1127, de la SEQ ID NO:29.

En un ejemplo específico, los fragmentos están libres de toda la mielina de material de CNS y/o muestran actividad inhibitoria de Nogo. Las proteínas de fusión que comprenden uno o más de los fragmentos fusionados anteriormente a una secuencia de no-Nogo también se proporcionan.

Los derivados del gen Nogo, se puede hacer por la alteración de las secuencias de Nogo por sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan las moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de secuencias codificantes del nucleótido, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácido como un gen Nogo se puede utilizar en la práctica de la presente invención. Estas incluyen pero no se limitan a secuencias del nucleótido que comprenden todos o porciones de genes Nogo que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, por lo tanto que produce un cambio silencioso. Del mismo modo, los derivados de Nogo de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácido primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácido de una proteína Nogo incluyendo secuencias alteradas en las cuales los residuos de aminoácido funcionalmente equivalentes se sustituyen por residuos dentro de la secuencia, resultando en un cambio silencioso. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia se pueden sustituir conservadoramente por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, resultando en una alteración silenciosa. Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos (hidrófobos) no-polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoáciods neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, aspargina, y glutamina. Los aminoácidos (básicos) cargados positivamente incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos (ácidos) cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

En un ejemplo específico, las proteínas que consisten de o que comprenden un fragmento de una proteína Nogo que consiste de al menos 10 aminoácidos (continuos) de la proteína Nogo se revelan. En otros ejemplos, el fragmento consiste de al menos 17 o 50 aminoácidos de la proteína Nogo. En ejemplos específicos, tales fragmentos no son más grandes de 35, 100 o 200 aminoácidos. Los derivados o análogos de Nogo incluyen pero no se limitan a aquellas moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogas a Nogo o fragmentos de estos (por ejemplo, en varias modalidades, al menos 60% o 70% o 80% o 90% o 95% de identidad sobre una secuencia de aminoácido de tamaño idéntico o cuando se compara con una secuencia alineada en la cual la alineación se hace por un programa de homología de ordenador conocidos en el oficio, por ejemplo búsqueda en ordenador BLAST (Altschul et al., 1994, Nature Genet. 6:119-129)) o cuyo ácido nucleico que codifican es capaz de hibridizar a una secuencia codificante de Nogo, bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosa, o no-rigurosas.

También se revelan, las moléculas que comprenden fragmentos Nogo por ejemplo, que contienen enlaces hidrocarburo con otras fracciones incluyendo fracciones marcadoras o bioactivas.

Los derivados y análogos de Nogo se pueden producir por varios métodos conocidos en el oficio. Las manipulaciones que dan lugar a su producción pueden ocurrir en el gen o nivel de proteína. Por ejemplo, la secuencia del gen de Nogo clonada se puede modificar por cualquiera de numerosas estrategias conocidas en el oficio (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). La secuencia se puede dividir en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido por otra modificación enzimática si se desea, aislar, y ligar in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de Nogo, se debe tener cuidado para asegurar que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura translacional como Nogo, sin interrupción por la señales de terminación de la traducción, en la región del gen donde la actividad deseada de Nogo se codifica.

Adicionalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica Nogo se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir las secuencias de traducción, iniciación, y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de endonucleasa de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar además la modificación in vitro. Cualquier técnica para la mutagénesis conocida en el oficio se pueden utilizar, incluyendo pero no limitando a, mutagénesis químicas, mutagénesis de sitio-dirigido in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), uso de ligadores TAB® (Pharmacia), etc.

Manipulaciones de la secuencia de Nogo también se pueden hacer en el nivel de la proteína.

Incluidos dentro del alcance de la invención están los fragmentos de la proteína Nogo u otros derivados o análogos que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de protección/bloqueado conocidos, división proteólica, ligamiento a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo por técnicas conocidas, incluyendo pero no limitando a división química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaina, proteasa V8, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en la presencia de tunicamicina; etc.

Además, los análogos y derivados de Nogo se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una proteína Nogo que comprenden el deseado dominio o que media la deseada actividad in vitro, se puede sintetizar por el uso de un sintetizador de péptido. Adicionalmente, si se desea, los aminoácidos no-clásicos o análogos de aminoácidos químicos, se pueden introducir como una sustitución o adición en la secuencia de Nogo. Los aminoácidos no-clásicos incluyen pero no se limitan a los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido \alpha-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, \gamma-Abu, \varepsilon-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, \beta-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñados tales como aminoácidos \beta-metil, aminoácidos C\alpha-metil, aminoácidos N\alpha-metil, y análogos de aminoácido en general. Adicionalmente, el aminoácido puede ser D (dextrorotatorio) o L (levoratorio).

En un ejemplo específico, el derivado de Nogo es una proteína quimérica, o de fusión, que comprende una proteína Nogo o fragmento de estas (preferiblemente que consiste de al menos un dominio o fracción de la proteína Nogo, o al menos 10 aminoácidos de la proteína Nogo) unida a su terminal amino- o - carboxi vía un enlace peptídico con una secuencia de aminoácido de una proteína diferente. En una modalidad, tal proteína quimérica se produce por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína (que comprende una secuencia codificante de Nogo unida en-marco a una secuencia codificante por una proteína diferente). Tal producto quimérico se puede hacer por unión de las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican la secuencia deseada de aminoácido a cada otro por métodos conocidos en el oficio, en el marco de codificación propio, y la expresión del producto quimérico por métodos conocidos normalmente en el oficio. Alternativamente, tal producto quimérico se puede hacer por técnicas sintéticas de proteína, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de péptido. Los genes quiméricos que comprenden porciones de Nogo fusionados a cualquier secuencia que codifica la proteína heteróloga se pueden construir. Tales secuencias que codifican la proteína hetertóloga incluyen, por ejemplo, la etiqueta de hexahistidina, y la etiqueta T7. Una modalidad específica se relaciona con una proteína quimérica que comprende un fragmento de Nogo de al menos seis aminoácidos.

En otro ejemplo específico, el derivado de Nogo puede ser una molécula que comprende una región de homología con una proteína Nogo.

En un ejemplo adicional, los derivados de Nogo (por ejemplo, fragmentos) son proteínas que no se producen naturalmente.

Otros ejemplos de derivados y análogos se describen en la subsección abajo y las secciones de ejemplos infra.

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5.6.1 Derivados de Nogo que contienen uno o más dominios de la proteína

En una modalidad específica, la invención se relaciona con derivados y análogos de Nogo, en particular fragmentos Nogo y derivados de tales fragmentos, que comprenden, o alternativamente consisten de, uno o más dominios de una proteína Nogo, incluyendo pero no limitando al terminal carboxi conservado y dominios hidrófobos o los dominios ácidos terminal amino o ricos en poli prolina, fragmentos funcionales (por ejemplo, enlace) de cualquiera de los mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mencionadas anteriormente.

Una modalidad específica se relaciona con moléculas que comprenden fragmentos específicos de Nogo que son aquellos fragmentos en la proteína Nogo respectiva más homólogas a los fragmentos específicos de una proteína Nogo de rata o bovino. Un fragmento que comprende un dominio de un Nogo. El homólogo se puede identificar por métodos de análisis de proteína como se describe en Secciones 6.1.2, 6.1.8, 6.1.9, 6.1.10, 6.1.11, o 6.1.12.

En otra modalidad específica, se revela una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo pero que también carecen de uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo. En otra modalidad, se revela una molécula que comprende uno o más dominios (o porción funcional de estos) de una proteína Nogo, y que tiene uno o más dominios de una proteína Nogo mutantes (por ejemplo, debido a la deleción o punto de mutación(s)) (por ejemplo, de tal manera que el dominio mutante ha disminuido la función).

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5.7 Ensayos de proteínas Nogo, derivados y análogos

La actividad funcional de proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden ensayar por varios métodos. La descripción de ensayos funcionales en las siguientes secciones no tiene la intención de ser limitante, y puede incluir otros ensayos conocidos por alguien de habilidad en el oficio.

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5.7.1 Ensayos de inhibición del crecimiento de la neurita in vitro de Nogo

En un ejemplo específico, las proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden ensayar para la inhibición de la propagación de NIH 3T3 o inhibición de la excrecencia de las neuritas de PC12 utilizando cultivo de tejido in vitro (Sección 6.1.10).

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En un ejemplo alternativo, las proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden utilizar para en ensayar de explantes del colapso del cono de crecimiento del ganglio de la raíz dorsal de pollo inducido por la presencia de Nogo. Del mismo modo, la función de Nogo se pueden ensayar por la inhibición de excrecencia de las neuritas de explantes de ganglio de raíz dorsal de pollo (Spillman et al., 1998 J. Biol. Chem. 273: 19283-19293).

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5.7.2 ensayos de propiedades funcionales in vivo de Nogo

En un ejemplo, los antagonistas de las proteínas Nogo, derivados y análogos se pueden utilizar para ensayos de función in vivo, utilizando un modelo de animal para regeneración del tracto corticoespinal (CST) sobre largas distancias y recuperación del comportamiento.

En un ejemplo preferido, un tracto corticoespinal de roedor se daña por resección quirúrgica o contusión de la médula espinal, y se administran los antagonistas de Nogo al animal. La plasticidad neural, regeneración y recuperación funcional, como se compara con animales control sin tratar o animales control tratados con anticuerpo, se monitorearon para la plasticidad estructural o regeneración por técnicas anatómicas, principalmente por marcación de tractos neurales definidos. La recuperación funcional se determina por locomoción y por pruebas de habilidad electrofisiológica ejecutado por el roedor (por ejemplo prueba de papel pegajoso, tarea para atrapar el alimento granulado, etc.) (Thallmair et al., 1998 Nat. Neuroscience 1(2):124-131).

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5.7.3 Inhibición del enlace ligando de Nogo y ensayos de este

En un ejemplo, donde se ensaya la capacidad de unir o competir con Nogo de tipo salvaje por el enlace con el anticuerpo anti-Nogo, varios inmunoensayos conocidos en el oficio se pueden utilizar, incluyendo pero no limitando a, sistemas de ensayo competitivos y no-competitivos utilizando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopo, por ejemplo), western blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación complementaria, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una modalidad, el enlace de anticuerpo se detecta por detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección del enlace de un anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo secundario se marca. Muchos medios se conocen en el oficio para detectar el enlace en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención.

En otro ejemplo, donde una proteína de enlace Nogo se identifica, el enlace se puede ensayar, por ejemplo, por medios bien conocidos en el oficio. En otra modalidad, la correlación fisiológica del enlace Nogo con sus sustratos se pueden ensayar.

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5.8 Usos terapéuticos

La invención proporciona el uso de compuestos terapéuticos en el tratamiento o prevención de varias enfermedades y desórdenes. El compuesto terapéutico se denomina aquí "Terapéutico". Tales "Terapéuticos" incluyen pero no se limitan a: proteínas Nogo (por ejemplo, como se describe anteriormente); anticuerpos de estas (como se describe anteriormente); los ácidos nucleicos que codifican las proteínas Nogo, análogos, o derivados (por ejemplo, como se describe anteriormente); los ácidos nucleicos antisentido Nogo. Los desórdenes que involucran el crecimiento celular desregulado, por ejemplo tumores del CNS, pueden ser tratados o prevenidos por la administración de un Terapéutico que promueve la función Nogo. Los desórdenes en los cuales el crecimiento de neurita, regeneración, o mantenimiento son deficientes o desean ser tratados por la administración de un Terapéutico que antagoniza (inhibe) la función Nogo. Lo anterior se describe con detalle en las subsecciones abajo.

Generalmente, se prefiere la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que es la misma especie como aquella del paciente. De esta manera, en una modalidad preferida, una proteína Nogo humana, derivado, o análogo, o ácido nucleico, o un anticuerpo para una proteína Nogo humana, se puede administrar terapéutica o profilácticamente a un paciente humano.

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5.8.1 Tratamiento y prevención de desórdenes que involucran el crecimiento celular desregulado

Las enfermedades y desórdenes que involucran el crecimiento celular desregulado se pueden tratar o prevenir, mediante la administración de un Terapéutico que promueva la función Nogo (i.e., incremento o suministro). Ejemplos de tal Terapéutico incluyen pero no se limitan a proteínas Nogo, que son funcionalmente activas, particularmente que son activas en la inhibición de extensión de neuritas o inhibición del crecimiento celular (por ejemplo, como se demuestra en ensayos in vitro o en modelos de animales), y ácidos nucleicos que codifican una proteína Nogo (por ejemplo, para utilizar en terapia génica). Preferiblemente, las proteínas Nogo, son libres de toda la mielina de material de CNS con el cual se asocia naturalmente. Otros Terapéuticos, por ejemplo, agonistas Nogo, se pueden identificar utilizando ensayos in vitro o modelos de animales, ejemplos de los cuales se describen infra.

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En modalidades específicas, los Terapéuticos que promueven la función Nogo se pueden administrar terapéuticamente (incluyendo profilacticamente): (1) en enfermedades o desórdenes que involucran un nivel de ausencia o disminución (relativo a normal o deseado) de la proteína o función Nogo, por ejemplo, en pacientes donde la proteína Nogo es carente, genéticamente defectuosa, biológicamente inactiva o de baja actividad, o sobre expresado; o (2) en enfermedades o desórdenes en donde ensayos in vitro (o in vivo) (ver infra) indican la utilidad de la administración de un agonista de Nogo. El nivel de ausencia o disminución en la proteína o función Nogo se puede detectar fácilmente, por ejemplo, obteniendo una muestra del tejido del paciente (por ejemplo, a partir de biopsia de tejido) y la prueba de esta in vitro para niveles de ARN o de proteínas, estructura y/o actividad de la ARN o proteína de Nogo expresada. Muchos métodos estándar en el oficio se pueden emplear por lo tanto, incluyendo pero no limitando a ensayos de quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, Western blot, inmunoprecipitación seguido por electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato poliacrilamida, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión Nogo por detección y/o visualización del mARN de Nogo (por ejemplo, ensayos Northern, transferencia puntual, hibridación in situ, etc.), etc.

Las enfermedades y desórdenes que involucran el crecimiento celular desregulado que se pueden tratar o prevenir, incluyen pero no se limitan a desórdenes proliferativos, tumores malignos, tumores del sistema nervioso, etc. Ejemplos de estos se detallan abajo.

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5.8.1.1 Crecimiento neoplástico

El crecimiento neoplástico y los desórdenes relacionados que se pueden tratar o prevenir por la administración de un Terapéutico que promueve la función Nogo incluyen pero no se limitan a aquellos enumerados en la Tabla 1 (para una revisión de tales desórdenes, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia):

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TABLA 1 Crecimiento neoplástico y desórdenes relacionados

1

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En modalidades específicas, malignidad o cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias), o desórdenes hiperproliferativos, se pueden tratar o prevenir en el sistema nervioso central, médula espinal o cualquier tejido neural.

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5.8.1.2 Condiciones premalignas

Los Terapéuticos de la invención que promueven la actividad de Nogo también se pueden administrar para tratar condiciones premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo pero no limitando a aquellos desórdenes enumerados en la Tabla 1. Tal uso profiláctico o terapéutico se indica en condiciones conocidas o supuestas de progresión precedente a neoplasia o cáncer, en particular, donde el crecimiento celular no-neoplásico que consiste de hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, displasia ha ocurrido (para revisión de tales condiciones de crecimiento anormales, ver Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79). La hiperplasia es una forma de controlar la proliferación celular que involucra un incremento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significante en estructura o función. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el cual un tipo de adulto o sustitutos de células diferenciados completamente por otro tipo de célula adulta. La metaplasia puede ocurrir en células de tejido epitelial o conectivo. La metaplasia atípica implica un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia es frecuentemente un precursor de cáncer, y se encuentra principalmente en el epitelio; es la forma más desordenada de crecimiento celular no-neoplásico, que involucra una pérdida en uniformidad de célula individual y en la orientación arquitectónica de células. Las células displásicas tienen a menudo núcleo manchado profundamente, anormalmente grande, y muestran pleomorfismo. La displasia característicamente ocurre cuando existe una irritación crónica o inflamación.

Alternativamente o en adición a la presencia de crecimiento celular anormal caracterizado como hiperplasia, metaplasia, o displasia, la presencia de una o más características de un fenotipo transformado, o de un fenotipo maligno, mostrada in vivo o mostrada in vitro por una muestra de célula de un paciente, puede indicar el atractivo de administración profiláctica/terapéutica de un Terapéutico que promueve la función Nogo. Como se menciona supra, tales características de un fenotipo transformado incluyen cambios morfológicos, adjunto del sustrato suelto, pérdida de inhibición del contacto, pérdida de dependencia de anclaje, liberación de la proteasa, aumento del transporte del azúcar, disminución de demanda de suero, expresión de antígenos fetales, desvanecimiento de la proteína de la superficie celular de 250,000 dalton, etc. (ver también id., at pp. 84-90 para características asociadas con un fenotipo transformada o maligno).

En otras modalidades, un paciente que muestra uno o más de los siguientes factores que predisponen la malignidad se puede tratar por la administración de una cantidad efectiva de un Terapéutico: neurofibromatosis de Von Recklingbausen o retinoblastoma; ver Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia pp. 112-113) etc.)

En otra modalidad específica, un Terapéutico de la invención se pueden administrar a un paciente humano para prevenir la progresión en el riñón, cartílago (del esternón), piel, músculo esquelético, pulmón, o bazo del cáncer, melanoma, o sarcoma.

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5.8.1.3 Desórdenes hiperproliferativos y disproliferativos

Como otro ejemplo de la invención, un Terapéutico que promueve la actividad de Nogo se puede utilizar para tratar o prevenir desórdenes hiperproliferativos o disproliferativos benignos. Ejemplos específicos se dirigen al tratamiento o prevención de cirrosis del hígado (una condición en la cual se ha superado la cicatrización normal de los procesos de regeneración del hígado), tratamiento de queloide (cicatriza hipertrófica) formación (desfiguración de la piel en la cual el proceso de cicatrización interfiere con la renovación normal), psoriasis (una condición de piel común caracterizada por proliferación excesiva de la piel y retraso en determinación destino de la célula propia), tumores benignos, condiciones fibrocisticas, e hipertrofia del tejido (por ejemplo, hiperplasia prostática).

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5.8.1.4 Terapia génica

En un ejemplo específico, los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una proteína Nogo o derivado funcional de estos, se pueden administrar para promover la función Nogo, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En este ejemplo, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico, promoviendo la función Nogo.

Cualquiera de los métodos para la terapia génica disponibles en el oficio se puede utilizar. Métodos ejemplares se describen abajo.

Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, ver Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215). Los métodos conocidos normalmente en el oficio de tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer an Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

En un aspecto preferido, el Terapéutico comprende un ácido nucleico de Nogo que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína Nogo en un huésped apropiado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor ligado operablemente a la región de codificación Nogo, dicho promotor que es inducible o constitutivo, y, opcionalmente, tejido-específico. En otra modalidad particular, una molécula de ácido nucleico se utiliza en la que las secuencias codificantes de Nogo y cualquier otra secuencia deseada se flanquean por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando de esta manera la expresión intracromosal del ácido nucleico de Nogo (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

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La entrega del ácido nucleico en un paciente puede ser tanto directa, caso en el cual el paciente se expone directamente al ácido nucleico o el vector que lleva el ácido nucleico, o indirecta, caso en el cual, las células primero se transforman con el ácido nucleico in vitro, luego se transplantan en el paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En un ejemplo específico, el ácido nucleico se puede administrar directamente in vivo, donde se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquiera de numerosos métodos conocidos en el oficio, por ejemplo, por construcción de este como parte de un apropiado vector de expresión de ácido nucleico y la administración de este de tal manera que llegue a ser intracelular, por ejemplo, por infección utilizando un retroviral defectuoso o atenuado u otro vector viral (ver U.S. Patent No. 4,980,286), o por inyección directa de ADN desnudo, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomes, micropartículas, o microcápsulas, o mediante la administración de este en el ligamiento con un péptido que se conoce para entrar el núcleo, mediante la administración de este en el ligamiento para un sujeto ligando con la endocitosis mediada del receptor (ver por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (que se puede utilizar para dirigir tipos de células que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, un complejo ácido nucleico-ligando se puede formar, en el cual el ligando comprende un péptido viral fusogénico para desestabilizar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En incluso otra modalidad, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para absorción y expresión específica de la célula, dirigiendo un receptor específico (ver, por ejemplo, PCT Publications WO 92/06180 dated April 16, 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992 (Wilson et al.); WO92/20316 dated November 26, 1992 (Findeis et al.); WO93/14188 dated July 22, 1993 (Clarke et al.), WO 93/20221 dated October 14, 1993 (Young)). Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro de la célula huésped de ADN para la expresión, por recombinación homóloga (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

En un ejemplo específico, un vector viral que contiene el ácido nucleico de Nogo se puede utilizar. Por ejemplo, un vector retroviral se puede utilizar (ver Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales han sido modificados para suprimir secuencias retrovirales que no sean necesarias para empaquetar el genoma viral y la integración en el ADN de célula huésped. El ácido nucleico de Nogo que se utiliza en terapia génica se clona en el vector, que facilita la entrega del gen en un paciente. Más detalle acerca de los vectores retrovirales se puede encontrar en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, que describe el uso de un vector retroviral para entregar el gen mdr1 para células madre hematopoyéticas con el fin de hacer las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83:1467-t473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden utilizar en terapia génica. Los adenovirus son vehículos atractivos especialmente para genes de entrega con el sistema nervioso central. Los adenovirus infectan naturalmente el epitelio respiratorio donde causan una enfermedad suave. Otro objetivo para los sistemas de entrega basados en adenovirus son el hígado, el epitelio respiratorio, células endoteliales, y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no-divididas. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presenta una revisión de terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demostró el uso de vectores de adenovirus para transferir los genes con el epitelio respiratorio de los monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica se puede encontrar en Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; and Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.

Además de los adenovirus, los virus Adeno-asociados (AAV) también han sido propuestos para utilizar en terapia génica (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300.

Otro método para terapia génica implica transferir un gen a las células en cultivo de tejido por tales métodos como electroporación, lipofección, transfección mediada con fosfato de calcio, o infección viral. Usualmente, el método para transferir incluye la transferencia de un marcador genético a las células. Las células luego se colocan bajo selección para aislar aquellas células que se han tomado y se expresan en el gen transferido. Aquellas células luego se entregan a un paciente.

En este ejemplo, el ácido nucleico se puede introducir en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en el oficio, incluyendo pero no limitando a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, célula fusión, transferencia de gen cromosoma-mediado, transferencia de gen microcélula-mediada, fusión esferoplasto, etc. Numerosas técnicas se conocen en el oficio para la introducción de genes foráneos en células (ver por ejemplo, Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, proporcionan que las necesarias funciones fisiológicas y de desarrollo de las células receptor no se desestabilizan. La técnica debería proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de tal manera que el ácido nucleico es expresable por la célula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie de la célula.

Las células recombinantes resultantes se pueden entregar a un paciente por varios métodos conocidos en el oficio. En una modalidad preferida, las células epiteliales se inyectaron, por ejemplo, vía subcutánea. En otra modalidad, células de piel recombinante se pueden aplicar como un injerto de piel sobre el paciente. Los glóbulos rojos recombinantes (por ejemplo, células madre o hematopoyéticas) preferiblemente se pueden administrar vía intravenosa. La cantidad de células visualizadas para utilizar, depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y se puede determinar por alguien de habilidad en el oficio.

Las células en las cuales un ácido nucleico se puede introducir para propósitos de terapia génica abarcan cualquier tipo de célula deseado, disponible, e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células del músculo, hepatocitos; glóbulos rojos tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinofilos, megacariocitos, granulocitos; varias células madre o troncales, en particular células troncales o madre hematopoyéticas, por ejemplo, según se obtienen de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.

En un ejemplo, la célula utilizada para la terapia génica es autóloga para el paciente.

En un ejemplo, en el cual, se utilizan las células recombinantes en terapia génica, un ácido nucleico de Nogo se pueden introducir en las células de tal manera que este es expresable por las células o su progenie, y las células recombinantes luego se pueden administrar in vivo para un efecto terapéutico. En una modalidad específica, se utilizan células madre o troncales. Cualquiera de las células madre y/o troncales que se pueden aislar y mantener in vitro se pueden utilizar potencialmente de acuerdo con esta modalidad de la presente invención. Tales células madre incluyen pero no se limitan a células madre neurales (Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

En un ejemplo adicional, el ácido nucleico que se introduce para propósitos de terapia génica comprende un promotor inducible ligado operablemente a la región de codificación, de tal manera que la expresión del ácido nucleico es controlable por el control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción.

Los métodos adicionales que se pueden adaptar para utilizar para entregar un ácido nucleico que codifica una proteína Nogo o derivado funcional.

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5.8.2 tratamiento y prevención de desórdenes en los cuales Nogo bloquea la regeneración

Las enfermedades y desórdenes en los cuales la extensión de neuritas, crecimiento o regeneración se desean, se pueden tratar mediante la administración de un Terapéutico que antagoniza (inhibe) la función Nogo. Las enfermedades, desórdenes o deterioro que finalmente dan lugar al deterioro del sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a, trauma del sistema nervioso central (CNS), (por ejemplo lesiones de la médula espinal o del cerebro), infarto, infección, malignidad, exposición a agentes tóxicos, deficiencia nutricional, síndromes paraneoplásicos, y enfermedades nerviosas degenerativas (incluyendo pero no limitando a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y parálisis supra-nuclear progresiva); mediante la administración de compuestos que interfieren con la actividad de Nogo (por ejemplo, un derivado de Nogo negativo dominante; anticuerpos para Nogo; ácidos nucleicos anti-sentido que codifican Nogo; ribozimas de Nogo o grupos químicos que unen un sitio activo de Nogo).

Los Terapéuticos que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a ácidos nucleicos antisentido Nogo, y ácidos nucleicos Nogo que son disfuncionales (por ejemplo, debido a una inserción heteróloga (secuencia no-Nogo) dentro de la secuencia codificante de Nogo) que se utilizan para "noquear" la función Nogo endógena por recombinación homóloga (ver, por ejemplo, Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Los anticuerpos anti-Nogo (y fragmentos y derivados de estos que contienen la región enlace de estos) se pueden utilizar como un antagonista de Nogo. En un ejemplo, un ácido nucleico que contiene una porción de un gen Nogo en el cual las secuencias de Nogo flanquean (son ambos 5' y 3' a) una secuencia diferente del gen, se pueden utilizar, como un antagonista Nogo, para promover la inactivación de Nogo por recombinación homóloga (ver también Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438). Otros Terapéuticos que inhiben la función Nogo se pueden identificar por el uso de ensayos conocidos convenientes in vitro, por ejemplo, basados en su capacidad para inhibir el enlace de Nogo con otra proteína, o inhibir cualquier función de Nogo conocida, como se prueba preferiblemente in vitro o en cultivo celular, aunque también se pueden emplear ensayos genéticos. Preferiblemente, se utilizan ensayos apropiados in vitro o in vivo, para determinar el efecto de un Terapéutico específico y si su administración se indica para el tratamiento del tejido afectado.

Como ejemplos, los Terapéuticos que inhiben la función Nogo se pueden administrar terapéuticamente (incluyendo profilácticamente):

(1) en enfermedades o desórdenes que involucran un nivel incrementado (relativo a normal o deseado) de proteína o función Nogo, por ejemplo, en pacientes donde la proteína Nogo es sobre activa o sobre expresada; o (2) en enfermedades o desórdenes en donde los ensayos in vitro (o in vivo) (ver infra) indican la utilidad de la administración del antagonista Nogo. Los niveles incrementados en proteína o función Nogo se pueden detectar fácilmente, por ejemplo, por cuantificación de la proteína y/o ARN, obteniendo una muestra del tejido del paciente (por ejemplo, a partir de biopsia de tejido) y prueba de esta in vitro para niveles de ARN o de la proteína, estructura y/o actividad del ARN o proteína de Nogo expresada. Muchos métodos estándar en el oficio se pueden emplear por lo tanto, incluyendo pero no limitando a ensayos quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar la proteína Nogo (por ejemplo, Western blot, inmunoprecipitación seguido por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida, inmunocitoquímica, etc.) y/o ensayos de hibridación para detectar la expresión Nogo por detección y/o visualización respectivamente de mARN de Nogo (por ejemplo, ensayos Northern, transferencia puntual, hibridación in situ, etc.), etc.

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5.8.2.1 Regulación antisentido de la expresión de Nogo

En una modalidad específica, la función de Nogo se inhibe por el uso de ácidos nucleicos antisentido Nogo. La presente invención proporciona el uso terapéutico o profiláctico de ácidos nucleicos de al menos seis nucleótidos que son antisentido a un gen o cADN que codifica Nogo o una porción de estos. Un ácido nucleico "antisentido" Nogo según se utiliza aquí se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridizar a una porción de un ARN de Nogo (preferiblemente mARN) en virtud de alguna secuencia complementaria. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una región codificante y/o no-codificante de un mARN de Nogo. Tales ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como Terapéuticos que inhiben la función Nogo, y se pueden utilizar en el tratamiento o prevención de desórdenes, como se describen supra.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser oligonucleótidos que son ARN o ADN bicatenario o monocatenario, o una modificación o derivado de estos, que se puede administrar directamente a una célula, o que se puede producir intracelularmente por transcripción de secuencias exógenas, introducidas.

En una modalidad específica, los ácidos nucleicos antisentido Nogo proporcionados por la presente invención se pueden utilizar para promover la regeneración de neuronas del sistema nervioso central en particular, incluyendo la regeneración del tracto corticoespinal, plasticidad durante la recuperación, recrecimiento de neuronas y cicatrización de deterioro asociado con lesiones traumáticas, accidentes cerebro vasculares, y enfermedades neurodegenerativas.

La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de los ácidos nucleicos antisentido Nogo de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable, como se describe infra.

En otra modalidad, la invención se dirige a métodos para inhibir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de Nogo en una célula procariota o eucariota que comprende el suministro de la célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido de Nogo de la invención.

Los ácidos nucleicos antisentido Nogo y sus usos se describen con detalle a continuación.

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5.8.2.1.1 Ácidos nucleicos antisentido Nogo

Los ácidos nucleicos antisentido Nogo tienen al menos seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos (que oscilan de 6 a aproximadamente 50 oligonucleótidos). En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de estos, monocatenario o bicatenario. El oligonucleótido se puede modificar en la fracción base, fracción azúcar, o esqueleto fosfato. El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos, o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. WO 88/09810, published December 15, 1988) o barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, PCT Publication No. WO 89/10134, published April 25, 1988), agentes de división desencadenantes de la hibridación (ver, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) o agentes intercalantes (ver, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).

En un aspecto preferido de la invención, un oligonucleótido antisentido Nogo se proporciona, preferiblemente de ADN monocatenario. En un aspecto más preferido, tal oligonucleótido comprende una secuencia antisentido a la secuencia cerca a una de las dos secuencias promotor del gen Nogo, o una secuencia que codifica porción terminal- carboxi del gen Nogo. Esto puede ser deseable para inhibir selectivamente la expresión de una de las isoformas Nogo. El oligonucleótido se puede modificar en cualquier posición en su estructura con sustituyentes generalmente conocidos en el oficio.

El oligonucleótido antisentido Nogo puede comprender al menos una fracción base modificada que se selecciona del grupo incluyendo pero no limitado a 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clrouracil, 5-iodouracil, hipoxantiina, xantina, 4-acetilcistoina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilami nometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, ácido uracil-5-oxiacético metilester, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3) w, y 2,6-diaminopurina.

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En otra modalidad, el oligonucleótido comprende al menos una fracción azúcar modificada seleccionada del grupo incluyendo pero no limitando a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.

En incluso otra modalidad, el oligonucleótido comprende al menos un esqueleto de fosfato modificado seleccionado del grupo que consiste de un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriester, y un formacetal o análogo de estos.

En incluso otra modalidad, el oligonucleótido es un \alpha-anomerico oligonucleótido. Un \alpha-anomerico oligonucleótido forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las unidades-\beta usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).

El oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de entrecruzamiento desencadenante de la hibridación, agente de transporte, agente de división desencadenante de la hibridación, etc.

Los oligonucleótidos de la invención, se pueden sintetizar por métodos estándar conocidos en el oficio, por ejemplo por el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tales son comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, fosforotioato oligonucleótidos se pueden sintetizar por el método de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), metilfosfonato oligonucleótidos se pueden preparar por el uso de soportes de polímero de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc.

En una modalidad específica, el oligonucleótido antisentido Nogo comprende ARN catalítico, o una ribozima (ver, por ejemplo, PCT International Publication WO 90/11364, published - October 4, 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225). En otra modalidad, el oligonucleótido es un 2'-0-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148), o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

En una modalidad alternativa, el ácido nucleico antisentido Nogo de la invención se produce intracelularmente por la transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector se puede introducir in vivo de tal manera que este se tome por una célula, dentro de la célula el vector o una porción de este se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de la invención. Tal vector debería contener una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido de Nogo. Tal vector puede seguir siendo episomal o llegar a ser integrado cromosomalmente, mientras que este se puede transcribir para producir el deseado ARN antisentido. Tales vectores se pueden construir por métodos estándar en el oficio de tecnología de ADN recombinante. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en el oficio, utilizados para la replicación y expresión en células de mamíferos.

La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido de Nogo, puede ser por cualquier promotor conocido en el oficio que actúa en células de mamífero, preferiblemente humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen pero no se limitan a: la región promotor anticipada SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición del terminal alargado 3' del virus Rous sarcoma (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor del herpes de la timidina quinasa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), etc.

Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de un ARN transcrito de un gen Nogo, preferiblemente un gen Nogo humano. Sin embargo, complementaria absoluta, aunque se prefiere, no se necesita. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN," como se refiere aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad que es capaz de hibridizar con el ARN, formando un bicatenario estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido Nogo bicatenarios, un monocatenario de ADN bicatenario por lo tanto se puede probar, o formación de triplex se puede probar. La capacidad para hibridizar dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, cuanto mayor sea el ácido nucleico hibridizado, este puede contener apareamientos erróneos más de base con un ARN de Nogo y a pesar de todo formar un bicatenario estable (o triplex, según sea el caso). Alguien de habilidad en el oficio puede determinar un grado tolerable de apareamientos erróneos, mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo de hibridación.

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5.8.2.1.2 Uso terapéutico de los ácidos nucleicos antisentido Nogo

Los ácidos nucleicos antisentido Nogo, se pueden utilizar para tratar (o prevenir) desórdenes de un tipo de célula que expresa, o preferiblemente sobreexpresa, Nogo. En una modalidad específica, tal desorden es un desorden de crecimiento proliferativo. En una modalidad preferida, se utiliza un oligonucleótido antisentido Nogo de ADN monocatenario.

Los tipos de células que expresan o sobreexpresan el ARN de Nogo, se pueden identificar por varios métodos conocidos en el oficio. Tales métodos incluyen pero no se limitan a, hibridación con un ácido nucleico Nogo-específico (por ejemplo, por hibridación Northern, hibridación de transferencia puntual, hibridación in situ), observando la capacidad de ARN a partir del tipo de célula que se traduce en Nogo in vitro, inmunoensayo, etc. En un aspecto preferido, tejido primario de un paciente se puede ensayar para la expresión Nogo antes del tratamiento, por ejemplo, por inmunocitoquímica o hibridación in situ.

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Composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un ácido nucleico antisentido de Nogo en un portador farmacéuticamente aceptable, se pueden administrar a un paciente que tiene una enfermedad o desorden el cual es de un tipo que expresa o sobreexpresa ARN o proteína Nogo.

La cantidad de ácido nucleico antisentido de Nogo, que será efectiva en el tratamiento de un desorden o condición particular, dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, es deseable determinar la citotoxicidad antisentido del tipo de tumor que se trata in vitro, y a continuación en sistemas útiles de modelo de animal antes de la prueba y su uso en humanos.

En un ejemplo específico, las composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos antisentido Nogo se administran vía liposomas, micropartículas, o microcápsulas. En varias modalidades de la invención, puede ser útil utilizar dichas composiciones para lograr la liberación controlada de los ácidos nucleicos antisentido Nogo. En una modalidad específica, se puede desear utilizar liposomas dirigidos vía los anticuerpos para antígenos de tumor identificable específico (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).

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5.9 Demonstración de la utilidad terapéutica o profiláctica

Los Terapéuticos como se revela aquí, se pueden probar in vitro, y luego in vivo para la deseada actividad terapéutica o profiláctica, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, ensayos in vitro que se pueden utilizar para determinar si la administración de un Terapéutico específico se indica, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro, en los cuales una muestra del tejido del paciente se siembra en el cultivo, y se expone a o de otro modo se puede administrar un Terapéutico, y se observa el efecto de tal Terapéutico sobre la muestra de tejido. Por ejemplo, un Terapéutico que es un inhibidor de la función Nogo se pueden ensayar midiendo el recrecimiento de la neurita o recuperación funcional del control motriz en el paciente.

En varios ejemplos específicos, ensayos in vitro se pueden llevar a cabo con células representativas de tipos de células involucradas en un desorden del paciente, para determinar si un Terapéutico tiene un efecto deseado sobre tales tipos de células.

Los compuestos para utilizar en terapia se pueden probar en apropiados sistemas de modelo de animal antes de la prueba en humanos, incluyendo pero no limitando a ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, etc. Para pruebas in vivo, antes de la administración a humanos, cualquier sistema de modelo de animal conocido en el oficio se pueden utilizar.

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5.10 Administración terapéutica/profiláctica y composiciones

La invención proporciona el uso de Terapéuticos de la invención para el tratamiento (y profilaxis) de un sujeto. En un aspecto preferido, el Terapéutico es sustancialmente purificado. El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero no limitando a animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano. En una modalidad específica, un mamífero no-humano es el sujeto.

Las formulaciones y métodos de administración que se pueden emplear cuando el Terapéutico comprende un ácido nucleico, se describen arriba; además apropiadas formulaciones y rutas de administración se pueden seleccionar dentro de aquellas descritas a continuación.

Varios sistemas de entrega se conocen y se pueden utilizar para administrar un Terapéutico de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el Terapéutico, endocitosis mediada del receptor (ver, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico Terapéutico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen pero no se limitan a rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos se pueden administrar por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de forros epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta apropiada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. La administración pulmonar, también se puede emplear, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosolización.

Como un ejemplo, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente a la zona que necesita el tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no ha modo de la limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en combinación con un vendaje para heridas después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no-poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o sitio formador) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.

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Como otro ejemplo, el Terapéutico se puede entregar en una vejiga, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver generalmente ibid.)

En un ejemplo adicional, el Terapéutico se puede entregar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); ver también Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En incluso otra modalidad, un sistema de liberación controlada se puede colocar cerca del objetivo terapéutico, i.e., el cerebro, necesitando de esta manera solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

En un ejemplo específico donde el Terapéutico es un ácido nucleico que codifica una proteína Terapéutico, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyendo esta como parte de un apropiado vector de expresión de ácido nucleico y la administración de esta de tal manera que se haga intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (ver U.S. Patent No. 4,980,286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, o mediante la administración de esta en ligamiento a un péptido como caja homeo, que se conoce para entrar el núcleo (ver por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico Terapéutico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro de ADN de célula huésped para la expresión, por recombinación
homóloga.

La presente invención también revela las composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de un Terapéutico, y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o un estado o enumerado en la Farmacopea U.S. u otra farmacopea reconocida mayoritariamente para su uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que el Terapéutico se puede administrar. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se puede administrar vía intravenosa. Las soluciones salinas y de dextrosa acuosa y soluciones de glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos apropiados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, silica gel, estearato de sodio, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, lecha descremada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes de humectación o emulsificación, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, tabletas, grageas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación controlada y similares. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio de calidad farmacéutica etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos apropiados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad efectiva terapéuticamente del Terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad apropiada del portador así como para proporcionar la forma para la administración propia con el paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

La composición se puede formular de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a los seres humanos. Usualmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en solución reguladora acuosa isotónica estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaina para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran ya sea por separado o mezclados juntos en una forma de dosificación por unidad, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor sellado herméticamente tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición es para ser administrada por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina estéril grado farmacéutico. Cuando la composición se puede administrar por inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina se puede proporcionar, de tal manera que los ingredientes pueden ser mezclados antes de la administración.

Los Terapéuticos de la invención se puede formular como formas de sal o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres, tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxil libre tales como aquellos derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.

La cantidad de Terapéutico que será efectiva en el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y se puede determinar por técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro opcionalmente se pueden emplear para ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se puede emplear en la formulación también dependerá de la ruta de administración, y la gravedad de la enfermedad o desorden, y se deberá decidir de acuerdo con el juicio del médico y cada una de las circunstancias del paciente. Sin embargo, rangos de dosificación apropiados para la administración intravenosa generalmente están aproximadamente entre 20-500 microgramos del compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los rangos de dosificación apropiados para administración intranasal son por lo general aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o modelo de animal.

La invención también revela un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más contenedores rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociados con tale(s) contenedor(s) puede estar una información en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, información que refleja la aprobación de la agencia para la fabricación, uso o venta para la administración a humanos.

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5.11 Diagnóstico y selección

Las proteínas Nogo, análogos, derivados, y subsecuencias de estas, ácidos nucleicos Nogo (y secuencias complementarias de estos), anticuerpos anti-Nogo, tienen usos en diagnóstico. Tales moléculas se pueden utilizar en ensayos, tales como inmunoensayos, para detectar, pronosticar, diagnosticar, o monitorear varias condiciones, enfermedades, y desórdenes que afectan la expresión de Nogo, o monitorear el tratamiento de estos. En particular, dicho inmunoensayo se lleva a cabo por un método que comprende en contacto de una muestra derivada de un paciente con un anticuerpo anti-Nogo bajo condiciones de tal manera que el enlace inmunoespecífico pueda ocurrir, y la detección o determinación de la cantidad de cualquier enlace inmunoespecífico por el anticuerpo. En un aspecto específico, tal enlace de anticuerpo, en secciones del tejido, se puede utilizar para detectar la localización de Nogo aberrante o niveles de Nogo aberrante (por ejemplo, bajo o ausente). En una modalidad específica, un anticuerpo para Nogo se puede utilizar para ensayar en una muestra de tejido o suero de un paciente para la presencia de Nogo donde un nivel de Nogo aberrante es un indicativo de una condición de enfermedad. Por "niveles aberrantes", se entiende el incremento o disminución de los niveles relativos a aquel presente, o un nivel estándar que representa aquel presente, en una muestra análoga a partir de una porción del cuerpo o a partir de un sujeto que no tiene el desorden.

Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo competitivos y no-competitivos utilizando técnicas tales como inmunohistoquímica, patología, transferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas), inmunoensayos "sandwich", ensayos inmunoprecipitación, reacciones precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoensayos de proteína A, para nombrar unos pocos.

Los genes Nogo y secuencias de ácido nucleico relacionadas y subsecuencias, incluyendo las secuencias complementarias, también se pueden utilizar en ensayos de hibridación. Las secuencias de Nogo de ácido nucleico, o subsecuencias de estos que comprenden aproximadamente al menos 8 nucleótidos, se pueden utilizar como sondas hibridación. Ensayos de hibridación se pueden utilizar para detectar, pronosticar, diagnosticar, o monitorear las condiciones, desórdenes, o estados de enfermedad asociados con cambios aberrantes en la expresión Nogo y/o actividad como se describen supra. En particular, tal ensayo de hibridación se lleva a cabo por un método que comprende el contacto de una muestra que contiene el ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar a ADN o ARN de Nogo, bajo condiciones de tal manera que la hibridación pueda ocurrir, y detectar o determinar cualquier hibridación resultante.

Por ejemplo, las enfermedades y desórdenes que involucran el crecimiento celular y desarrollo de desórdenes se pueden diagnosticar, o su supuesta presencia puede ser seleccionado por, o se puede detectar una predisposición para desarrollar tales desórdenes, por detección de la disminución de niveles de proteína Nogo, ARN Nogo, o actividad funcional Nogo como se demuestra la inhibición del crecimiento, o por detección de mutaciones en ARN, ADN o proteína Nogo (por ejemplo, desplazamientos en ácidos nucleicos Nogo, truncaciones en la proteína o gen Nogo, cambios en nucleótido o secuencia de aminoácido relativo a Nogo tipo salvaje) que causa la disminución de la expresión o actividad de Nogo. Tales enfermedades y desórdenes incluyen pero no se limitan a aquellas descritas en la Sección 3 y Sección 5.8.1.1. A modo de ejemplo, los niveles de proteína Nogo se pueden detectar por inmunoensayo, niveles de ARN de Nogo se pueden detectar por ensayos de hibridación (por ejemplo, transferencias Northern, transferencia puntual), el enlace Nogo con los receptores de la proteína inhibidora del crecimiento celular se puede hacer por ensayos de enlace conocidos normalmente en el oficio, desplazamientos y mutaciones puntuales en ácidos nucleicos Nogo se pueden detectar por Southern blotting, análisis RFLP, PCR utilizando cebadores que preferiblemente generan un fragmento que
abarca al menos más del gen Nogo, secuenciación del ADN genómico Nogo o cADN de obtenido del paciente, etc.

Los Kits para uso de diagnóstico también se revelan, los cuales comprenden en uno o más contenedores un anticuerpo anti-Nogo, y, opcionalmente, un patrón marcado de enlace con el anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo anti-Nogo se puede marcar (con un marcador detectable, por ejemplo, una fracción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, o radioactiva). También se proporciona un kit que comprende en uno o más contenedores una sonda de ácido nucleico capaz de hibridizar con ARN de Nogo. En una modalidad específica, un kit puede contener en uno o más contenedores un par de cebadores (por ejemplo, cada uno en el rango de tamaño de 6-30 nucleótidos) que son capaces de imprimir la amplificación [por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (ver por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reacción en cadena de la ligasa (ver EP 320,308) uso de Q\beta replicasa, reacción de sonda cíclica, u otros métodos conocidos en el oficio) bajo condiciones de reacción apropiadas de al menos una porción de un ácido nucleico de Nogo. Un kit opcionalmente además puede comprender en un contenedor una cantidad predeterminada de una proteína purificada o ácido nucleico Nogo, por ejemplo, para utilizar como un estándar o control.

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5.12 Selección para agonistas y antagonistas de Nogo

Los ácidos nucleicos, proteínas Nogo y sus derivados también tienen usos en ensayos de selección para detectar moléculas que específicamente se unen a los ácidos nucleicos, proteínas Nogo o sus derivados y por lo tanto tienen un potencial uso como agonistas o antagonistas de Nogo, en particular, las moléculas que afectan de tal modo la regulación del crecimiento celular. En una modalidad preferida, tales ensayos se realizan para seleccionar las moléculas con utilidad potencial como promotores de crecimiento neural para el desarrollo de fármacos. La invención por lo tanto revela ensayos para detectar moléculas que específicamente se unen a los ácidos nucleicos, proteínas Nogo, o sus derivados. Por ejemplo, la expresión de las células recombinantes de los ácidos nucleicos Nogo, se puede utilizar para producir recombinantemente proteínas Nogo en estos ensayos, para seleccionar las moléculas que se unen a una proteína Nogo. Las moléculas (por ejemplo, patrones putativos de enlace de Nogo) se ponen en contacto con la proteína Nogo (o fragmento de esta) bajo condiciones conductivas para el enlace, y luego las moléculas que se unen específicamente a la proteína Nogo se identifican. Métodos similares se pueden utilizar para seleccionar las moléculas que se unen a los derivados o ácidos nucleicos de Nogo. Los métodos que se pueden utilizar para llevar a cabo lo anterior se conocen normalmente en el oficio.

A modo de ejemplo, diversidad de bibliotecas, tales como bibliotecas de péptidos o no-péptidos aleatorios o combinatorios pueden ser seleccionados para moléculas que se unen específicamente a Nogo. Se conocen en el oficio muchas bibliotecas que se pueden utilizar, por ejemplo, bibliotecas sintetizadas químicamente, recombinantes (por ejemplo, bibliotecas que muestran fagos), y bibliotecas basadas en la traducción in vitro.

Ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente se describen en Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Houghten et al., 1991, Nature 354:84-86; Lam et al., 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412; Jayawickreme et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Publication No. WO 93/20242; y Brenner and Lerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.

Ejemplos de bibliotecas que muestran fagos se describen en Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406; Christian, R.B., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718); Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., 1993, Gene 128:59-65; y PCT Publication No. WO 94/18318 dated August 18, 1994.

Bibliotecas basadas en la traducción in vitro incluyen pero no se limitan a aquellas descritas en PCT Publication No. WO 91/05058 dated April 18, 1991; y Mattheakis et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.

A modo de ejemplos de bibliotecas no-péptidos, una biblioteca de benzodiazepina (ver por ejemplo, Bunin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712) se pueden adaptar para utilizar. Bibliotecas de péptidos (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371) también se pueden utilizar. Otro ejemplo de una biblioteca que se puede utilizar, en la cual las funcionalidades amida en los péptidos han sido permetiladas para generar una biblioteca combinatoria transformada químicamente, se describe por Ostresh et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-1142).

La selección de las bibliotecas se puede lograr por cualquiera de una variedad de métodos conocidos comúnmente. Ver, por ejemplo, las siguientes referencias, que revelan la selección de bibliotecas de péptidos: Parmley and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes et al., 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76:933-945; Staudt et al., 1988, Science 241:577-580; Bock et al., 1992, Nature 355:564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellingtonet al., 1992, Nature 355:850-852; U.S. Patent No. 5,096,815, U.S. Patent No. 5,223,409, y U.S. Patent No. 5,198,346, all to Ladner et al.; Rebar and Pabo, 1993, Science 263:671-673; y PCT Publication No. WO 94/18318.

A modo de ejemplo, la selección se puede llevar a cabo por el contacto de los miembros de la biblioteca con una proteína Nogo (o ácido nucleico o derivado) inmovilizada sobre una fase sólida y cultivando aquellos miembros de la biblioteca que se unen a la proteína (o ácido nucleico o derivado). Ejemplos de tales métodos de detección, denominados técnicas de "cribado" se describen a modo de ejemplo en Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT Publication No. WO 94/18318; y en las referencias citadas anteriormente.

Como otro ejemplo, el sistema de dos-híbridos para seleccionar proteínas que interactúan en levadura (Fields and Song, 1989, Nature 340:245-246; Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582) se puede utilizar para identificar moléculas que se unen específicamente a una proteína Nogo o derivado.

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5.13 Modelos de animales

La invención también revela modelos de animales, incluyendo pero no limitando a modelos en ratones, hámsters, ovejas, cerdos, ganado, y preferiblemente mamíferos no-humanos.

A modo de ejemplo, se proporcionan modelos de animales para enfermedades y desórdenes que involucran la extensión, crecimiento y regeneración de neuritas. Tal animal puede ser producido inicialmente promoviendo la recombinación homóloga entre un gen Nogo en su cromosoma y un gen Nogo exógeno ha sido suministrado inactivo biológicamente (preferiblemente por inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos). En un aspecto preferido, esta recombinación homóloga se lleva a cabo por tansformación células madre (ES) embrio-derivadas con un vector que contiene el gen Nogo inactivo intercionalmente, de tal manera que recombinación homóloga ocurra, seguido por la inyección de las células ES en un blastocisto, e implantación del blastocisto en una madre sustituta, seguido por el nacimiento del animal quimérico ("animal carente") en los cuales un gen Nogo ha sido inactivo (ver Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). El animal quimérico se puede reproducir para producir animales carentes adicionales. Tales animales pueden ser ratones, hámsters, ovejas, cerdos, ganado, etc., y son preferiblemente mamíferos no-humanos. En una modalidad específica, se produce un ratón carente.

Tales animales carentes se espera que desarrollen o sean predispuestos al desarrollo de enfermedades o desórdenes que involucran el sistema nervioso central y por lo tanto puedan tener uso como modelos de animales de tales enfermedades y desórdenes, por ejemplo, para seleccionar o probar las moléculas (por ejemplo, terapéuticos potenciales para desorden del sistema nervioso) con capacidad para inhibir tumores del tejido nervioso y por lo tanto para tratar o prevenir tales enfermedades o desórdenes.

Varias referencias se citan aquí, las revelaciones de las que se incorporan por referencia en su totalidad.

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6. Ejemplo Caracterización del producto de nucleótidos y proteínas del gen Nogo

Los ejemplos descritos aquí demuestran que el gen clonado, Nogo, codifica una proteína que es un potente inhibidor del crecimiento celular neural y también se reconoce por los anticuerpos monoclonales descritos en Schwab et al., U.S. Patent No. 5,684,133.

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6.1 Materiales y métodos

Las siguientes secciones describen los materiales y métodos utilizados en la presente invención. Alguien de habilidad en el oficio reconocerá que estos materiales y métodos son solamente ilustrativos de la invención reivindicada en el momento presente y las modificaciones se visualizan por los inventores presentes. Tales modificaciones tienen la intención de caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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6.1.1 Purificación del Nogo de bovino a partir de la mielina

Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4ºC y la actividad inhibitoria del sustrato de las fracciones obtenidas se determinó rutinariamente por los ensayos de propagación de NIH 3T3 y excrecencia de las neuritas de PC12 (Sección 6.1.10). El tejido de la médula espinal de bovino se limpió cuidadosamente despojando las meninges y cortando en piezas pequeñas. La mielina luego se extrajo en solución reguladora de extracción (CHAPS 60 mM, Tris-Cl 100 mM, pH 8.0, solución reguladora de EDTA 10 mM, pH 8.0, iodacetamida 2.5 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM, 0.1 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de peptstatina A).

Para obtener extracto de médula espinal, el tejido se homogenizó directamente en solución reguladora de extracción CHAPS en una relación de (1:1; peso:vol). El homogeneizado se centrifugó dos veces a 100,000 X g (tipo Kontron: K50.13, ángulo de fijación) por 1 hora a 4ºC. El sobrenadante claro (extracto) inmediatamente se aplicó a una columna Q-Sepharose (2.6 X 11.5 cm), se equilibró en solución reguladora A (Tris-Cl20 mM, pH 8.0, 0.5% (peso/vol) CHAPS). Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de volumen de cinco-lechos a partir de NaCl 0 a 1 M en solución reguladora A (100 ml gradiente en 50 minutos). Las fracciones activas que contienen bovino NI220 eluyeron alrededor de NaCl 0.4 M y se combinaron (mezcla-q 1) para las aplicaciones posteriores en la columna Superdex 200 (2.6 X 60 cm), equilibrada en solución reguladora B (NaCl150 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, 0.5% (peso/vol) de CHAPS).

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Las fracciones activas, después de la filtración en gel (mezcla-s 1), se separaron por 6% de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y potencia constante baja (2 watts/gel) por un total de 2500 Voltios-hora. Las bandas y regiones de gel se identificaron después de la tinción con Azul de Coomoassie (R250 al 0.1% peso/vol en 50% de metanol y 10% de ácido acético), se cortaron, y extrajeron en 800 \mul de solución reguladora de elución del gel (CHAPS al 0.5% (peso/vol), Tris-Cl 20 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM, pH 8.0, iodacetamida 2.5 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1 mM, 0.1 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de peptstatina A) por al menos 48 horas a 4ºC.

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6.1.2 Microsecuenciación de Nogo purificado

El material eluido del gel de IN-1 neutralizable activo de varios geles se volvió a correr sobre un gel de SDS al 10%-poliacrilamida bajo condiciones reductoras, y se tiñó con 0.1%(peso/vol) de Azul de Coomassie R250 en 50% de metanol y 10% de ácido acético. La banda de 220 KDa se cortó, y se realizó la digestión de endoproteinasa Lys-C (1:50 relación molar) directamente en el gel. La muestra se acidificó y aplicó a una columna de fase reversa de cromatografía líquida de alta eficiencia, los péptidos se separaron con un gradiente lineal (0-100%) de 0.04% de ácido trifluoroacético y 80% de acetonitrilo, y las fracciones que contienen especies de péptido sencillo se sometieron a degradación Edman automatizada.

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6.1.3 Electroforesis de Nogo purificado

SDS-PAGE de Alta resolución se llevó a cabo utilizando geles de SDS-poliacrilamida al 6%(peso/vol) (10 X 24 X 0.01 cm) bajo condiciones reductoras (ditiotreitol 100 mM). La transferencia sobre membranas Immobilon-P (Millipore) se realizó en base Tris 20 mM, glicina 192 mM, pH 8.3, 0.037%(peso/vol) SDS, 20% de metanol con un equipo de transferencia semi-seco (Bio-Rad, Trans Blot SD). El tiempo de transferencia fue 2 h a 0.8 mA/cm^{2}. Reactivo de bloqueo (1 hora a temperatura ambiente) fue gelatina al 3% en PBS (solución salina reguladora de fosfato, pH 7.2, 8 g de NaCl, 0.2 g de kH_{2}PO_{4}, 2.8 g de Na_{2}HPO_{4}*12H_{2}O, y 0.2 g de KCI, disueltos en 1 litro de agua) y la solución de lavado contenía Tris-Cl 20 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, y 0.4% de Tween (3 X 10 minutos a temperatura ambiente). El tiempo de incubación para el primer anticuerpo (para la dilución con 1% de gelatina en PBS) fue usualmente durante la noche a 4ºC. El anticuerpo secundario anti-ratón IgG peroxidasa de rábano picante-conjugado (1:2000) se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. El sistema de quimioluminiscencia ECL se utilizó para la detección (Amersham Pharmacia Biotech).

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6.1.4 Ensayo de biblioteca de cADN

La materia blanca reciente a partir de la médula espinal de bovino, y poli(A)+ ARN se extrajo utilizando el kit FastTrack (Invitrogen). La construcción de las bibliotecas de cADN se realizó utilizando el kit Uni-ZAP (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. La complejidad de las bibliotecas fue mayor de 4x10^{6} unidades formadoras de placa en total, y el tamaño promedio de los insertos fue aproximadamente 1.8 kilobases.

Oligonucleótidos degenerados MSC5-8 (MSC5: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID NO:47); MSC6: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO:48); MSC7: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:49); MSC8: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:50)) se diseñaron a partir de la secuencia del péptido 1 bNI220, y MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID NO:51)) se diseñó a partir de la secuencia del péptido 2 bNI220. Los oligonucleótidos se sintetizaron por MWG Biotech (Munchenstein, Switzerland) y se marcaron con el kit de marcación DIG ADN extremo 3'. Las ribosondas se sintetizaron utilizando el kit de marcación DIG ARN (Boehringer Mannheim).

Las condiciones de hibridación de sonda y lavado fueron como se describe por el fabricante (MSC5-8 y MSC9 se utilizaron en una temperatura de hibridación y de lavado de 57ºC). La detección de la sonda se realizó utilizando el sistema CDP-star (Boehringer Mannheim). La manipulación y selección de la biblioteca de CDNA se hizo de acuerdo con los protocolos para las bibliotecas lambda ZAP cADN (Stratagene). Las membranas de nylon Genescreen (DuPont) se utilizaron para levantamiento de placas.

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6.1.5 Secuenciación de ADN

Ambas hebras de CWP1-3, Oli18, Oli3, y R1-3U21 se secuenciaron con el sistema Perkin Elmer AB1377 por Microsynth (Balgach, Switzerland). Las secuencias de ADN se analizaron por el programa DNASIS (Hitachi). Las búsquedas de bases de datos se llevaron a cabo con el programa BLAST (NCBI).

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6.1.6 Análisis de ARN

El ARN total y poli(A)+ARN se extrajeron a partir de los tejidos utilizando el kit RNAgent (Promega) o FastTrack (Invitrogen), respectivamente. Los ARNs se separaron por electroforesis sobre geles de 1% de formaldehido y se transfirieron a las membranas Genescreen. Las transferencias se hibridizaron con ribosondas antisentido, que se generaron con el kit de marcación DIG ARN (Boehringer Mannheim), a partir de los plásmidos relevantes. Las condiciones de hibridación de la transferencia, lavado, y CDP star-detección fueron como se describe por el fabricante. La sonda "común", EST111410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD, USA) contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 2535-4678, la sonda del exón 1 específico contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 65-769, y la sonda del exón 2 específico contiene la secuencia del transcrito A entre los nucleótidos 815-3183.

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6.1.7 Producción del antisuero

El antisuero 472 (AS 472) se generó por Research Genetics, Inc. (Huntsville AL, USA) contra el péptido sintético P472, SYDSIKLEPENPPPYEEA (secuencia bovino; SEQ ID NO:33), que corresponde a una secuencia de Nogo de rata del aminoácido 623 a 640 de la SEQ ID NO:2, con tres apareamientos erróneos.

El antisuero Bruna (AS Bruna) se generó contra un fragmento de proteína recombinante Nogo, expresada en E. coli como una proteína de fusión. Específicamente, el terminal-carboxi de la secuencia de nucleótido Nogo de rata A que codifica los aminoácidos 762 a 1,163 de la SEQ ID NO:2 (expresada en E. coli utilizando el sistema Novagen pET) se utilizó para generar los antisueros anti-Nogo de AS Bruna.

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6.1.8 Electroforesis y western blotting

SDS-PAGE y Western blotting se realizó por métodos estándar bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio. Los anticuerpos se diluyeron como sigue: AS Bruna 1: 7,500; AS 472 1:2,000; anti-myc (9E10) 1:5,000 (Invitrogen); 2 \mug/ml de anti-BiP (Stressgen); sobrenadante de hibridoma mAb IN-1 se utilizó sin diluir. Los anticuerpos secundarios fueron: HRP conjugado anti-conejo (Pierce; 1:20,000); IgM anti-ratón (1:50,000); y fosfatasa alcalina conjugada anti-ratón (Milan Analytica AG, La Roche, Switzerland; 1:5,000).

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6.1.9 Inmunohistoquímica

La médula espinal o cerebelo de rata adulta se diseccionó rápidamente, se incrustó en el compuesto OTC y se congeló a -40ºC. Veinte secciones post mortem se cortaron y fijaron en etanol/ácido acético a 40ºC. La inmunotinción se realizó como se describe por Rubin et al., 1994, J. Neurocytol. 23:209-217, excepto que la etapa de apagado se omitió. Alternativamente, las secciones del tejido se fijaron por metanol (2 minutos a -20ºC), y la inmunotinción se llevó a cabo como per Rubin et al., supra. Los anticuerpos primarios utilizados fueron (Anticuerpo: (dilución)): sobrenadante de hibridoma de IN-1: (sin diluir); AS Bruna: (1:5000); o AS 472 purificado por afinidad: (1:50).

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6.1.10 Ensayo de esparcimiento del fibroblasto NIH 3T3

Los fibroblastos NIH 3T3 se colocaron en placas dentro de los platos de cultivo pre-cubiertos con 5 \mug/pozo (=1 cm^{2}) mezcla-q. La mezcla-q es las fracciones activas combinadas del extracto médula espinal de bovino, separadas en una columna Q sepharose. IN-1 se utilizó como sobrenadante de cultivo sin diluir (1-10 \mug/ml), AS Bruna y suero pre-inmune se diluyeron 1:1000 en PBS, y el AS 472 y suero preinmune se diluyeron 1:500 en PBS. Para compensar las variaciones de actividad en diferentes preparaciones de la mezcla-q el número de células redondas, inhibidas colocadas en placas en la mezcla-q se normalizó a 100% y a 0% se colocaron en placas sobre una solución reguladora control (Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-93).

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6.1.11 Ensayo de excrecencia de neuritas DRG

Ganglios de la raíz dorsal (DRG)s se sometieron a disección a partir de E16 pollos embrionarios en solución salina balanceada de Hank (HBSS), se dividieron en dos partes y se colocaron en placas en platos pre-cubiertos con mezcla-q en 100 \mul de medio F12 con 10% de (FCS) y 1% de methocel. La excrecencia de la neurita a partir de DRGs individuales se valoró después de 24 horas de incubación a 37ºC de una manera semi-cuantitativa utilizando una escala de 0 (no excrecencia) a 4 (máxima excrecencia).

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6.1.12 Ensayo de co-cultivo nervio óptico/DRG

Los nervios ópticos se sometieron a disección a partir de ratas adultas, irradiadas con 5500 Grays y se inyectaron tanto con AS 472 o el correspondiente suero pre-inmune (1:10 dilución). Los pares de nervios se cultivaron en 3-cultivos de cámara de tal manera que un terminal de cada nervio se alcanza a través de una barrera de anillo de teflón/grasa de silicio en la cámara media, donde las neuronas de DRGs primarias cultivadas desintegradas de las ratas P0 se colocaron. Después de dos semanas en cultivo, los nervios se fijaron por técnicas estándar conocidas en el oficio y se incrustaron por Microscopia electrónica (EM), y secciones ultrafinas se tomaron a una distancia de aproximadamente 3.5 mm a partir del muñón expuesto de DRG. Las secciones se analizaron sistemáticamente para la presencia de axones de recrecimiento utilizando un Zeiss EM 902.

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6.1.13 Expresión de Nogo A en células COS

El marco de lectura abierto de Nogo A se subclonó en el vector pcDNA3.1mychis (Invitrogen) utilizando técnicas de clonación estándar conocidas en el oficio. El plásmido resultante (Nogo-myc19) dio lugar a una proteína recombinante que contiene la secuencia de Nogo A fusionada a la etiqueta myc-his (21 aminoácidos). Nogo-myc19 (2 \mug de ADN por 35 mm de plato) o plásmido control (pcDNAmychisLacZ) se transfectaron en células COS utilizando superfect (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se cosecharon 36-48 horas después de la transfección. Basándose en la tinción inmunofluorescente con el anticuerpo anti-myc y reacción enzimática de color \beta-galactosidasa, la velocidad media de transfección se estimó que era aproximadamente 20%. Las células transfectadas COS se fijaron con 95% de etanol/5% de ácido acético (4ºC, 25 minutos), se bloquearon en PBS/10% de FCS, y se incubaron con AS Bruna (1:200) o IN-1 (1:2) por 2 horas en PBS/1% FCS a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS y reaccionaron con anticuerpos secundarios fluorescentes (cabra anti-conejo-FITC para AS Bruna y cabra anti-ratón-TRITC para detección IN-1, Jackson Immuno Research Lab. Inc.,
West Grove, PA).

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6.1.14 Cultivos de oligodendrocitos

Los oligodendrocitos aislados a partir de cerebro de rata recién nacida se colocaron en placas sobre matraces de 75 cm^{2} de poli-lisina (Sigma, St. Louis, MO) y se cultivaron por 10-12 días en DMEM suplementado con 5% de FCS. Enriquecidas, poblaciones mezcladas de oligodendrocitos y sus progenitores se liberaron a partir de la monocapa astrocito, con agitación durante la noche a 210 rpm en un mezclador orbital. Las células se colocaron en placas a una densidad de 1-2x10^{6} células sobre platos de 35 cm^{2} cubiertos de poli-lisina. Los progenitores se dejaron diferenciar en medio definido químicamente (CDM) por 3-4 días.

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6.1.15 Biotinilación de la superficie celular

Los cultivos de cerebro completo de rata P4 se prepararon como se describe en van der Haar, et al. (1998, J. Neurosci. Res. 51:371-81). En el día 7 in vitro se biotinilaron con la célula-impermeable EZ-LINK-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) como se describe, excepto que todas las etapas se llevaron a cabo a 15ºC y la células lisadas en 1 ml de solución reguladora de lisis (NaH_{2}PO_{4} 0.05M de pH8.0, NaCl 0.15M, 0.5% de CHAPS (Sigma), iodacetamida 2.5mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 1mM, 0.1 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina A). Las proteínas biotiniladas se inmuno-precipitaron con Dynabeads M-280 Streptavidina (Dynal), se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se probaron con AS472, \alpha-BiP y \alpha-\beta-tubulina. Las membranas que se despojaron con el Kit Re-Blot Western Blot Recycling (Chemicon).

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6.1.16 Inmunocitoquímica

Los oligodendrocitos del nervio óptico se prepararon como se describe en Schwab and Caroni (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393). Cultivos de dos días de viejos se incubaron con AS 472 (1:200) o mAb IN-1 (1:3) en medio por 25 minutos a temperatura ambiente (rt). Los cultivos se lavaron, fijaron con 4% de paraformaldehido/5% de sacarosa en PBS, y se bloquearon en ácido maleico 0.1M/2% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim) por 1 hora. Anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Milan Analytica) se utilizaron a 1:7,500 en ácido maleico 0.1M/1% de reactivo de bloqueo (1 hora, rt). Las células transfectadas COS se fijaron con 95% de etanol/5% de ácido acético (4ºC, 25 minutos), se bloquearon, y se incubaron con AS Bruna (1: 200) o mAb IN-1 por 2 horas a rt. Las células se hicieron reaccionar con anti-conejo-FITC de cabra, y anti-ratón TRITC de cabra (Jackson Immuno Research Lab).

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6.1.17. Cámara del nervio óptico

Los pares de nervios ópticos se cultivaron en un sistema de cultivo de 3-cámaras como se describe en Schwab et al. (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393), se inyectaron con y se exponen a su AS 472 o el suero pre-inmune correspondiente (1:10). Los nervios ópticos se incrustaron por Microscopia electrónica (EM), y se tomaron secciones ultra-finas a una distancia de aproximadamente 3.5 mm a partir del muñón expuesto de DRG. Las secciones se analizaron sistemáticamente para la presencia de axones de recrecimiento utilizando un microscopio Zeiss EM 902.

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6.2 Resultados experimentales

La siguiente sección revela los resultados experimentales obtenidos de las secciones de métodos establecidos en 6.1 y las subsecciones.

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6.2.1 Aislamiento de cADN de Nogo

El homólogo bovino de NI-250 de rata se purificó, bNI220, y los péptidos de la proteína purificada se generaron por digestión de proteasa. Los oligonucleótidos degenerados múltiples digoxigenina-marcada se diseñaron de acuerdo con seis diferentes secuencias del péptido bNI220. Varios clones de cADN se aislaron a partir de la selección de una biblioteca de materia blanca de bovino utilizando estos oligonucleótidos. El inserto del clon más largo (CWP1-3, Figura 1a) se utilizó para sintetizar sondas para la posterior selección de cADN de bibliotecas de rata. Los clones seleccionados a partir de tales selecciones se muestran en la Figura 1a. Los análisis de secuencia de ADN de estos clones de cADN sugirieron que tres diferentes transcritos originados de un gen, y este gen se designó Nogo. Los diferentes transcritos probablemente resultan de ambos uso del promotor alternativo y corte y empalme alternativo (Nogo A, Nogo B y Nogo C; Figura 1b). Las secuencias de ADN se recopilaron a partir de los clones mostrados en la Figura 1A para crear el transcrito A, la secuencia de ADN de la que se muestra en la Figura 2a.

La traducción conceptual de los tres transcritos da lugar al producto de las proteínas diseñadas Nogo A (1163 aminoácidos), Nogo B (360 aminoácidos) y Nogo C (199 aminoácidos). Dado que Nogo A contiene todas las seis secuencias del péptido obtenido a partir del bNI220 purificado (Figura 2b), es probablemente equivalente a la proteína purificada, NIH-250 de rata. Nogo A, B, y C tienen un terminal carboxi común de los 188 aminoácidos (el dominio común), y Nogo A y B comparten un terminal amino de 172 aminoácidos. Nogo A es más largo que Nogo B por 803 aminoácidos debido al corte y empalme alternativo.

Ninguna de las isoformas de Nogo posee un tramo hidrófobo de aminoácidos en el N-terminal, que podría ser utilizado como un péptido señal convencional. Sin embargo, ha sido descrito que las proteínas carecen de un péptido señal convencional pero aún son transferidas a través de las membranas, por ejemplo factor de crecimiento del fibroblasto (Florkiewicz et al., 1995, J. Cell. Physiology 162:388-399), factor neurotrófico ciliar (Sendtner et al., 1994, J. Neurobiology 25:1436-1353) e interleucina-1 (Rubartelli et al., 1990, EMBO J. 9:1503-1510). Las proteínas de la membrana tales como commissureless (Tear et al., 1996, Neuron 16:501-514) también carecen un péptido señal convencional, pero se insertan en la membrana.

Aunque no hay codón de terminación en-marco en la región putativa 5'-no-traducida que podría definir inequívocamente el codón de iniciación, la siguiente evidencia sugiere que la metionina indicada en la Figura 2a es el codón de iniciación para Nogo A y Nogo B: (1) La secuencia alrededor de este codón de iniciación supuesto conforma bien la secuencia consenso para traducir los sitios de iniciación (GCCGCC A/G CCATGG; SEQ ID NO: 34); (2) Esfuerzos extensos se hicieron para alcanzar las más secuencias en dirección 5' por cualquiera selección de biblioteca y
5'-RACE. Ninguna de estas investigaciones han resultado en la identificación de más secuencias en dirección 5', y (3) Nogo A recombinante eucariótico expresado a partir de la metionina mencionada anteriormente tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD, según se estima por SDS-PAGE, que es indistinguible del Nogo A endógeno de oligodendrocitos de rata (Figura 11a).

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6.2.2 Análisis de secuencia Nogo

Nogo A contiene siete sitios potenciales de N-glicosilación, sin embargo la evidencia bioquímica indica que Nogo A no tiene un componente polisacárido principal. Nogo A también tiene diecinueve sitios de reconocimiento para PKC, y siete sitios de reconocimiento para caseina quinasa II (Figura 2a). Todos los tres Nogos tienen dos dominios hidrófobos terminal carboxi comunes de 35 y 36 aminoácidos, respectivamente. Uno o ambos de ellos se pueden utilizar como dominios trans- o intra-membrana, lo que es consistente con la caracterización de bNI220 como una proteína de membrana integral. Nogo A (así como Nogo B y C) no contienen ninguna fracción de conocida de moléculas de adhesión celular, proteínas de matriz extracelular, u otras moléculas guía.

Las secuencias de Nogo se utilizaron para alcanzar diferentes bases de datos para genes homólogos, el dominio de terminales carboxi comunes de los tres productos Nogo es similar (62.5%) a un gen humano identificado, nsp (c113 y s-rex en rata, y chs-rex en pollos) (Figura 3). Una EST de C. elegans y una EST de Drosophila melanogaster también tienen significante similitud (16.6% y 13.6%, respectivamente) a ambos Nogo y nsp en esta misma región. Los dominios de 180 aminoácidos del terminal carboxi de ambos Nogos y Nsps se conservan altamente a través de especies de mamífero (98.3% y 97.3%, respectivamente), lo que sugiere que ellos pueden desarrollar funciones esenciales y similares. Fuera de esta región, la similitud para una proteína dada entre las especies también es alta (73% entre Nogo A de rata y bovino; 76.2% entre NSP-A y S-rexb; 50% entre Chs-rexb y NSP-A o S-rexb). La similitud entre NSPs y Nogos son, sin embargo, limitadas a su dominio común, terminal carboxi, hidrófobos, (Figura 3a), y a la naturaleza ácida de las proteínas fuera de esta región conservada. Los NSPs (NSP-A, -B y -C) han sido descritos previamente como productos espeíficos neuro-endocrinos con funciones desconocidas. La hibridación in situ y la inmunohistología mostraron una localización neuronal de NSPs en el sistema nervioso. Otro gen humano, nsp-similar-1, que también tiene una región hidrófoba con terminal carboxi con 50% de similitud a ambos Nsp y Nogo se identificó recientemente.

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6.2.3 Expresión del tejido Nogo

El patrón de expresión Nogo se examinó por Northern blotting e hibridación in situ. Cuando una sonda "común" (Sección 6.1.6) se utilizó, tres transcritos Nogos principales (Designados: A, 4.6 kb; B, 2.6 kb; y C, 1.7 kb) se detectaron en el nervio óptico, la médula espinal, y la corteza cerebral (Figura 4a). En el ganglio de raíz dorsal, solamente los dos transcritos más grandes se detectaron. A 2.6 kb, el transcrito principal se detectó en la célula PC12, mientras que una banda de 4.6 kb se puede detectar solamente después de largas exposiciones (Figura 4a). En el nervio ciático, niveles más pequeños de transcritos se detectaron con la banda 2.6 kb siendo el principal transcrito. Cuando la médula espinal y la célula PC12 poli (A)+ ARN se hibridizaron a una sonda específica del exón 1, solamente los transcritos de 4.6 kb y 2.6 kb se detectaron; cuando el cerebelo y músculo esquelético poli(A)+ ARNs se hibridizaron a una sonda específica del exón 2, solamente el transcrito de 4.6 kb en cerebelo se detectó (Figura 4b). Estos resultados verifican el mapa de transcritos mostrado en la Figura 1B. Los resultados de Northern blotting, sin embargo, también demostraron que la expresión Nogo no es restringida al sistema nervioso (Figura 4c); los transcritos de Nogo, también se detectaron en el músculo esquelético (1.7 kb), riñón (2.6 kb y 1.7 kb), cartílago (del esternón, 1.7 kb), piel (1.7 kb), pulmón (2.6 kb), y bazo (2.6 kb). Excepto para el músculo esquelético, que expresa transcritos de Nogo C en un nivel alto, el nivel de transcritos de Nogo fuera del sistema nervioso es más pequeño que aquel del sistema nervioso. Hasta el momento, los transcritos de 4.6 kb de Nogo A parce que son los únicos que se transcriben en el sistema nervioso.

Las hibridaciones in situ en secciones de tejido del CNS de rata adulta utilizando la sonda común mostraron moderada marcación de las filas de los cuerpos celulares en la materia blanca de varias partes del cerebro y la médula espinal. Esta distribución es típica de oligodendrocitos interfasciculares (Figura 5a, d). Además de los oligodendrocitos, varios tipos de neuronas también expresan los transcritos de Nogo en niveles altos (Figura 5c, e). En cerebelo, la doble tinción de las secciones con un anticuerpo anti-GFAP e hibridación in situ mostró claramente una fuerte marcación de las Células de Purkinje, mediante la sonda Nogo, mientras que los astrocitos no se marcaron (Figura 5e, f). En nervios ópticos desarrollos, los transcritos de Nogo se detectaron tan pronto como el día postnatal 0 (P0), i.e., varios días antes de que los mARNs de la proteína proteolipido (PLP) de las proteínas mielinas principales y proteína básica de la mielina (MBP) se puedan detectar (Figura 6). Esta sincronización es consistente con la apariencia de los primeros oligodendrocitos galactocerebrósido-positivos y la expresión de una actividad del inhibidor de crecimiento de la neurita, que puede ser neutralizado por IN-1.

Los antisueros se generaron contra un péptido sintético basado en un secuencia específica de Nogo A de bovino (AS 472), y contra un Nogo de rata A parcial, recombinante de 45 kD (AS Bruna) (Sección 6.1.7). AS 472 y AS Bruna cada uno, reconoció una proteína de aproximadamente 200 kD en mielina de bovino, y AS Bruna además reconoció una proteína mielina de rata de 200 kD en Western blots (Figura 7). Las secciones de médula espinal y cerebelo de rata adulta se tiñeron con AS 472, AS Bruna, e IN-1. Cuando las secciones se fijaron con etanol/ácido acético (un procedimiento mostró primero que se necesita para la preservación y accesibilidad de los antígenos IN-1), se observó una fuerte tinción de la materia blanca/mielina con los tres anticuerpos (Figura 8). La tinción de los cuerpos celulares del oligodendrocito fue particularmente distinta con AS Bruna. El tratamiento de las secciones congeladas recientemente con metanol en lugar de etanol/ácido acético suprimió la tinción de la mielina excepto para los cuerpos celulares del oligodendrocito.

AS Bruna y AS 472 también tiñen algunos tipos de neuronas incluyendo neuronas motoras en la médula espinal, y capas molecular y granular en el cerebelo. Las células de Purkinje tiñen fuertemente con AS 472 y AS Bruna, pero no hay una tinción detectable con IN-1.

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6.2.4 Anticuerpos de Nogo inhiben la inihibición del crecimiento inducido por Nogo in vitro

Las preparaciones de NI-220 semi-purificadas de la médula espinal de bovino (mezcla-q) pueden prevenir la propagación del fibroblasto NIH 3T3 y la excrecencia de las neuritas. En la presencia de antisueros de Nogo, tanto AS Bruna, AS 472, como IN-1, se redujo la actividad inhibitoria de la mezcla-q, i.e., los fibroblastos NIH 3T3 experimentaron propagación y neuritis extendida del ganglio de raíz dorsal (DRG) de pollos embrionarios en platos cubiertos con mezcla-q (Figura 9). La especificidad se demostró por adición del péptido P472, que fue el péptido utilizado para cultivar AS 472 (Sección 6.1.7). P472 bloqueó exitosamente el efecto inhibitorio de AS 472, mientras que, un péptido control no tuvo efecto en la inhibición.

Adicionalmente, la presencia de Nogo A en la superficie celular de los oligodendrocitos se demostró inmunocitoquímicamente, funcional y bioquímicamente utilizando AS 472. Cuando, oligodendrocitos primarios vivos cultivados, se tiñeron con cualquiera mAb IN-1 o AS 472 una relativamente débil (según se compara con inmunocitoquímica para galactocerebrósido) pero se observó una clara tinción superficial en los oligodendrocitos diferenciados (Figura 15a, c). La adición del péptido que compite (P472) por AS 472 o que omite el anticuerpo primario suprimió la tinción específica (Figura 15b, d). La biotinilación de la superficie celular y posterior precipitación con estreptavidina además de comprobar la presencia de Nogo A en la membrana del plasma de los oligodendrocitos. En el precipitado, AS 472 detectó una banda que corre aproximadamente 40 kD arriba del intracelular, probablemente una banda inmuno-positiva AS 472no-procesada y no-glicosilada. La proteína BiP de ER no podría ser detectada en la fracción biotinilada (Figura 15e).

Nogo A como una molécula de superficie celular de oligodendrocito también se analizó funcionalmente. El co-cultivo de los oligodendrocitos y fibroblastos o oligodendrocitos NIH 3T3 y neuronas de DRG mostró claramente las propiedades inhibitorias de los oligodendrocitos maduros. Estos ensayos demuestran que los fibroblastos NIH 3T3 y neuritas de DRG evitan fuertemente el territorio de los oligodendrocitos, un efecto que se neutralizó por mAb IN-1. En la presencia de AS 472, esta inhibición se redujo igualmente (Figura 16a, b y e, f), mientras que la preincubación de AS 472 con P472 restituye la inhibición mediada del oligodendrocito (Figura 16c, d y g, h). La cuantificación reveló la capacidad de neutralización altamente significante de mAb IN-1 y AS 472 en ambos tipos de ensayos
(Figura 16i y j).

RecNogo-A (Figura 17a) producido por un línea celular CHO transfectada estable se probó por su actividad en la propagación del fibroblasto NIH 3T3 y excrecencia de las neuritas de DRG. La \beta-galactosidasa producida recombinantemente, aislada de una línea celular CHO estable (CHO-LacZ) se enriqueció en paralelo con recNogo-A y se utilizó como un control para la actividad inhibitoria de las proteínas de CHO endógenas en ambos ensayos. En el ensayo de propagación del fibroblasto NIH 3T3, el extracto de CHO que contiene recNogo-A (Nogo-A: aproximadamente 1-5% de la proteína total; fig. 9a) mostró efectos inhibitorios claros en la propagación celular a 10 \mug/cm^{2} (Figura 17b). Este efecto fue dosis-dependiente: a 20 \mug/cm^{2} la actividad inhibitoria fue más alta, mientras que 5 \mug/cm^{2} no fueron inhibitorios (los datos no se muestran). La actividad inhibitoria se podría neutralizar a niveles de fondo por preincubación de la proteína recubierta con mAb IN-1 o AS Bruna, mientras que un anticuerpo control contra el suero preinmune de galactocerebrósido (mAb O1) o AS Bruna no tiene efecto (Figura 17b).

Además de su fuerte efecto en la propagación del fibroblasto NIH 3T3, el extracto de CHO que contiene recNogo-A, pero no el extracto CHO-LacZ tuvo un potente efecto inhibitorio en la excrecencia de las neuritas a partir de neuronas cultivadas primarias: Las neuronas de DRG disociadas se inhibieron por recNogo-A de una manera dosis-dependiente (Figura 17c). Esta actividad inhibitoria se podría neutralizar por mAb IN-1, pero no por el control mAb O1 (Figura 17c-e). La proteína recombinante aislada de CHO-LacZ no fue inhibitoria a 1 y 5 \mug, y la adición de mAbs O1 o IN-1 no tiene efecto en la excrecencia de las neuritas.

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6.2.5 Recrecimiento de neuritas in vitro

La capacidad de las neuritas de DRG de rata recién-nacida para regenerar y crecer a través de tejido de CNS adulto se investigó. Los pares de nervios ópticos se sometieron a disección a partir de ratas adultas y se cultivaron en un sistema de cultivo de cámara especial de tal manera que las neuritas de DRG tienen acceso a un terminal de cada nervio (Figura 10a). En cada cultivo, uno de los dos nervios se inyectó con y se expuso a suero de conejo pre-inmune, el segundo nervio se inyectó con AS 472, que también se presento en la cámara lateral alrededor del nervio. Después de dos semanas in vitro en la presencia de NGF, los cultivos se fijaron, se desmontaron, e incrustaron por Microscopia electrónica (EM). Las secciones de EM se tomaron aproximadamente 3.5 mm a partir del final del nervio en contacto con las neuronas de DRG. Los nervios inyectados con el suero pre-inmune no comprendieron axones o solamente unos pocos axones (Figura 10b). Estos últimos se encontraron exclusivamente asociados con membranas basales y astrocitos en la superficie de los nervios. En contraste, la mayoría de los nervios ópticos inyectados con AS 472 comprendieron considerables números de axones, a menudo hasta varios cientos. El contacto con la mielina con frecuencia se puede ver (Figura 10c, d).

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6.2.6 Nogo recombinante un reconocimiento por IN-1

Cuando Nogo A se expresó como un proteína recombinante myc-his-tagged terminal carboxi en células COS transfectadas, el western blotting que utiliza ambos anticuerpo anti-myc y AS Bruna demostró que el recombinante Nogo A tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD en geles de SDS desnaturalizados (Figura 11a). En la misma transferencia, una banda de similar movilidad se detectó por AS Bruna en oligodendrocitos cultivados de rata primaria, sugiriendo que Nogo A recombinante tiene un peso molecular casi idéntico como el endógeno Nogo A a partir de oligodendrocitos (Figura 1a). Cuando las células COS transfectadas se tiñeron por inmunofluorescencia con IN-1 y AS Bruna, IN-1 y AS Bruna reconoció las mismas, células transfectadas (Figura 11b, c). La mayoría de la inmunoreactividad se localizó intracelularmente y fue accesible solamente después de la permeabilización.

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6.2.7 Cartografía de la(s) región(s) activa(s) de Nogo

Una serie de mutantes de deleción de Nogo se generó con el fin de hacer el mapa del dominio(s) o región(s) inhibitoria(s) de Nogo. Las construcciones de deleción del gen Nogo se generaron utilizando sitios de restricción internos, digestiones con exonucleasa III de soja mung y reacciones en cadena de la polimerasa. Una descripción de los mutantes se proporciona en la Figura 18 y su Breve Descripción. La mayoría de las construcciones tienen una etiqueta-T7 N-terminal para la identificación con anticuerpos anti-T7 monoclonales; y una etiqueta de hexahistidina N- o C-terminal ("etiqueta-His") para la purificación utilizando cromatografía de afinidad Co(II)-inmovilizada. Los mutantes de la deleción de Nogo, denominados NiG-D1, NiG-D2, hasta NiG-D20, se probaron todos utilizando el ensayo de propagación de los fibroblastos NIH 3T3 para determinar la actividad inhibitoria. Algunos mutantes se probaron en ensayos de excrecencia de las neuritas PC12, excrecencia desintegrada de las neuritas DRG de rata o banda de ganglio retinal. Los resultados se muestran en la Tabla 2 abajo.

TABLA 2 Actividades Funcionales de Mutantes de Deleción de Nogo

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Un resultado positivo en el ensayo del fibroblasto NIH 3T3 (3T3) o ensayo PC12 se registra cuando los fibroblastos o células PC12 se inhiben a partir de la propagación en una placa cubierta con una preparación de Nogo obtenida de un mutante de deleción. Un resultado positivo en el ensayo de excrecencia de las neuritas del ganglio de raíz dorsal (DRG) de pollos embrionarios o ensayo de colapso de crecimiento de cono del ganglio (RGC) indica que la excrecencia de las neuritas se inhibe o que el crecimiento del cono se debe al colapso en la presencia de una preparación de Nogo obtenida de un mutante de deleción.

Los datos indican que un dominio inhibitorio principal se identificó en la región específica Nogo-A a partir de los números de aminoácido 172-974, particularmente los números de aminoácido 542-722. Además, la secuencia N-terminal de Nogo-A y Nogo-B (números de aminoácido 1-171) también fue inhibitoria para la propagación de 3T3. Basándose en los resultados, las regiones de Nogo a partir de los números de aminoácido 172-259, y de los números 975-1162 parece que son no-esenciales y se pueden retirar sin pérdida de la actividad inhibitoria.

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7. Ejemplo Ácidos nucleicos y proteínas de Nogo humano, derivados y fragmentos

La presente invención proporciona las secuencias del nucleótido que codifican la proteína Nogo humano, y fragmentos de proteínas de Nogo humano, incluyendo los equivalentes humanos a Nogo A de rata, Nogo B y parte de Nogo C. La secuencia de aminoácido de Nogo humano se describe en la Figura 13 y ha sido asignada SEQ ID NO: 29.

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La presente invención también proporciona secuencias del nucleótido de fragmentos del gen Nogo humano. La secuencia de nucleótido Nogo humano se puede determinar utilizando el transcrito de Nogo A de rata como una ayuda para alinear y para empalme y corte junto con etiquetas de secuencia expresada (EST) humanas que son homólogas a la secuencia de cADN rata o bovino.

Por ejemplo, las ESTs AA081783 y AA333267 (Sección 5.1) traslapan entre sí y corresponden a Nogo de rata A (Figura 2a; SEQ ID NO:1) posiciones del ácido nucleico 765 a 1272. Las ESTs AA322592, AA092565, y AA081525 (Sección 5.1) también traslapan entre sí y las secuencias superpuestas corresponden a ácidos nucleicos de Nogo de rata 1642 a 2131. Estos dos conjuntos independientes de ESTs superpuestas no se pueden alinear para dar la secuencia humana sin comparación directa por ordenador con la secuencia de nucleótido de Nogo de rata o bovino de la presente invención. Para la alineación por ordenador inicial, se prefiere ENTREZ Nucleotide QUERY. Otros programas de alineación por ordenador se enumeran en la Sección 5.1, como ejemplos alternativos y no tienen la intención de limitar el alcance de programas de ordenador que se pueden utilizar.

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8. Discusión 8.1 Clonación del Nogo inhibidor del crecimiento de la neurita

El Nogo A tiene muchas propiedades que soportan lo que se describe previamente para NI-250 de rata, una proteína inhibitoria principal de la excrecencia de las neuritas de mielina de CNS y el antígeno del IN-1. En el nivel molecular, Nogo A contiene los seis péptidos originalmente obtenidos por secuenciación de bNI-220, el componente más inhibitorio de la médula espinal de mielina de bovino. En el nivel de expresión, los oligodendrocitos son el principal tipo de célula en CNS adulto para la expresión de Nogo A, y el momento de la expresión de Nogo en el nervio óptico coincide con la descripción previa de una actividad inhibitoria de la mielina neutralizada de IN-1 para el crecimiento de neurita. Por otra parte, el Western blotting reveló la presencia de Nogo A en fracciones activas de la mezcla-q, y la materia blanca a partir de varias regiones del CNS se tiñó con AS Bruna así como AS 472 (específico para Nogo A) en un patrón idéntico a aquel de IN-1. Ambos de estos hechos coinciden con la interpretación de que Nogo A es NI-250.

Dos antisueros construidos contra las secuencias Nogo A, AS Bruna y AS 472, disminuyen en gran medida la actividad inhibitoria de una preparación (mezcla-q) de médula espinal de bovino parcialmente purificada. AS 472 también permite el intracrecimiento de números grandes de axones de ganglio de raíz dorsal sobre varios milímetros en explantes del nervio óptico adulto, muy similar a IN-1.

Aunque el peso molecular calculado de Nogo A es aproximadamente 140 kD, este tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 200 kD sobre geles de SDS desnaturalizados, el cual está en el rango de la estimación previa de aproximadamente 250 kD. La movilidad aberrante de Nogo A en geles SDS probablemente se causa por su naturaleza ácida en lugar de las modificaciones pos-translacionales. La movilidad aberrante de las proteínas en SDS-PAGE ha sido postulada por otras proteínas altamente ácidas tales como la Proteína Asociada con el Crecimiento GAP-43, así como NSP-A. Adicionalmente, Nogo A expresada recombinante de bacterias, tiene el mismo peso molecular aparente como aquel del endógeno de Nogo A expresado por oligodendrocitos de rata. Esto va en contra de las principales modificaciones de Nogo A por un mecanismo tal como la glicosilación.

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8.2 Nogo previene la regeneración y restringe la plasticidad del CNS adulto

La expresión de Nogo en oligodendrocitos de nervio óptico de rata a partir de P0 coincide bien con los primeros hallazgos de una actividad neutralizable del inhibidor de crecimiento de la neurita de IN-1. Interesantemente, esta expresión precede a aquel de las principales proteínas mielinas, y compacta la formación de la mielina por varios días. La apariencia de Nogo, posiblemente en respuesta a las señales axonales, podría prevenir además el crecimiento del axón en los correspondientes tractos de fibras (pico de números de axón en E20 en nervios ópticos de rata). Nogo también podría inhibir la formación colateral y por consiguiente estabilizar la estructura general del CNS diferenciado. En materia gris de diferentes regiones del CNS, el contenido de la mielina e inmunoreactividad de IN-1 se correlaciona inversamente con el nivel de GAP-43 y el potencial plástico de las regiones dadas. Efectivamente, los anticuerpos de IN-1 se aplicaron al CNS adulto permiten que la proliferación y plasticidad ocurran en el tallo encefálico y la médula espinal con un grado conocido previamente solo del CNS de recién-nacido. La gran recuperación funcional que paralela a la plasticidad indica que los axones que proliferan son capaces de formar conexiones funcionalmente apropiadas.

Se ha demostrado previamente que la respuesta de neuronas para Nogos inhibitorios difiere entre las neuronas de diferentes edades. Presumiblemente, esto se debe a una expresión diferencial de los receptores, que se espera que pronto se caracterice. Al igual que para las Netrinas y muchos factores de crecimiento, la existencia de diferentes receptores de Nogo, que provocan diferentes respuestas, sigue teniendo una posibilidad. El hecho que los Nogos también se expresen en algunos tipos de neuronas puntúa para posibles interacciones entre las mismas y/o diferentes isoformas de Nogo.

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8.3 Nogo pertenece a una nueva familia de moléculas reguladoras de neuritas

El análisis de secuencia de Nogo revela la fracción no conocida de superficie celular o proteínas matriz involucradas en la guía axonal (repulsiva o atractiva); i.e. no Inmunoglobulina, fibronectina tipo III, o dominios-EGF podrían ser identificados. Tampoco hubo homología con los inhibidores de crecimiento neurales descritos, las Semaforinas, las Netrinas, o las Efrinas.

Los Nogos forman una familia novedosa con un grupo de proteínas descritas recientemente, las proteínas de NSP/s-rex y las de NSP-como 1, basadas en la similitud de sus 180 aminoácidos de terminal carboxi. Al igual que en el caso de Nogo, tanto en uso de promotor alternativo (ambos genes Nsp y Nsp-como 1) y corte y empalme alternativo (Nsp solamente) son responsables de la producción del producto alternativo de las proteínas con terminal carboxi común que contienen dos tramos de aminoácidos hidrófobos. Como se indica por el nombre, las NSPs (proteínas específicas del neuroendocrino) predominantemente se expresan en neuronas y varios tipos de células del endocrino. Se localizan sobre todo intracelularmente en asociación con el retículo endoplasmático. El gen 1 como-NSP se expresa predominantemente en cerebro y músculo. Ni las funciones de la NSP ni las familias de 1 como-Nsp se conocen. El hecho de que ortólogos potenciales existan tanto en C. elegans y Drosophila melanogaster sugiere que Nogo, con su regeneración del nervio y proliferación de la actividad inhibitoria, puede ser un miembro recién evolucionado y hasta ahora sin describir de la familia de NSP.

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8.4 Nogo en tejidos no-neurales

El transcrito Nogo C se expresa en el músculo esquelético en un nivel comparable a aquel del sistema nervioso. Una función concebible del músculo Nogo C es repeler los axones motores y restringirlos a la región de la placa terminal motora. Niveles bajos de la expresión Nogo también se pueden detectar en otros tejidos no nerviosos. La inhibición observada de propagación del fibroblasto y astrocito por el extracto de mielina y NI-250 se refiere a la presencia de receptores y mecanismos de respuesta de las proteínas Nogo en estas células. Esto sugiere una posible función general de Nogos en la inhibición del contacto del movimiento celular.

La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas aquí. Efectivamente, varias modificaciones de la invención en adición a aquellas descritas aquí serán evidentes por aquellos de habilidad en el oficio a partir de la descripción y figuras anexas mencionadas anteriormente. Tales modificaciones tienen la intención de entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

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Claims (32)

1. Una proteína purificada que consiste de una secuencia de aminoácido con más del 90% de identidad sobre la longitud total de la SEQ10 No: 29 y libre de todo el material de mielina del sistema nervioso central con el que se asocia naturalmente.

2. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicha proteína tiene la secuencia SEQ ID NO:29.

3. La proteína de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha proteína es una proteína de mamífero.

4. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína es una proteína humana.

5. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, proteína que tiene la secuencia SEQ ID NO:29, en donde uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia se sustituyen conservadoramente por otro aminoácido de una polaridad similar, el cual actúa como un equivalente funcional, resultando en una alteración silenciosa.

6. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que se codifica por un primer ácido nucleico que se hibridiza a un segundo ácido nucleico, que consiste de la secuencia de nucleótido SEQ ID NO:1.

7. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha proteína es no glicosilada.

8. Una proteína de fusión, proteína quimérica que comprende la proteína de las reivindicaciones 1-7.

9. Un ácido nucleico aislado que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. El ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde dicho ácido nucleico (a) es capaz de hibridizar a un segundo ácido nucleico, dicho segundo ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótido complementaria a una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID NO:29; y (b) codifica una proteína que ocurre naturalmente la cual une un anticuerpo a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID NO:29.

11. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 10 que codifica una proteína humana que ocurre naturalmente.

12. Un vector de clonación que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 ligado operablemente a un promotor no-nativo.

13. El vector de la reivindicación 12, en donde el vector es un vector de expresión.

14. Una célula recombinante transformada con el ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13.

15. La célula recombinante de la reivindicación 14 que es una célula procariota o eucariota recombinante.

16. Un método para producir la proteína de las reivindicaciones 1-8 que comprende: (a) cultivo de la célula de la reivindicación 14 o 15; y (b) recuperación de dicha proteína.

17. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para utilizar como un medicamento.

18. Una ribozima o un ácido nucleico antisentido que inhibe específicamente la producción de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un sujeto.

19. Una ribozima o un ácido nucleico antisentido de acuerdo con la reivindicación 18 para utilizar como un medicamento.

20. Uso de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, siendo dicha proteína activa en la inhibición de la proliferación celular en un sujeto, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad neoplástica del sistema nervioso central.

21. El uso de la reivindicación 20, en donde la enfermedad neoplástica es glioma, glioblastoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependioma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústica, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, o retinoblastoma.

22. Uso de una ribozima o un ácido nucleico antisentido de acuerdo con la reivindicación 18, para la fabricación de un medicamento para tratar el deterioro en el sistema nervioso central, para inducir la regeneración o proliferación de neuronas, o para promover la plasticidad del sistema nervioso central.

23. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 20 y 22, en donde el sujeto es un humano.

24. Un anticuerpo monoclonal, en donde el anticuerpo monoclonal inmunoespecíficamente une a la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

25. Un método para obtener los anticuerpos ploliclonales con la proteína de la reivindicación 1-7, dicho método que comprende:

(a) la administración a un animal no-humano de una cantidad inmunogénica de una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(b) recuperación de dichos anticuerpos ploliclonales a partir de dicho animal no-humano.

26. Una muestra de antisuero aislado que comprende los anticuerpos ploliclonales producidos de acuerdo con el método de la reivindicación 25 que inmunoespecíficamente se une a la SEQ ID NO:29.

27. El anticuerpo de la reivindicación 24 o el antisuero de la reivindicación 26, en donde dicho anticuerpo o antisuero es un anticuerpo o antisuero terapéutico.

28. El anticuerpo de la reivindicación 24 o 27, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo de cadena sencilla.

29. El anticuerpo de la reivindicación 24, 27 o 28 o el antisuero de la reivindicación 26 para utilizar como un medicamento.

30. Uso del anticuerpo de la reivindicación 24, 27 o 28 o el antisuero de la reivindicación 26 para la fabricación de un medicamento para tratar el deterioro al sistema nervioso central, para inducir la regeneración o proliferación de neuronas, o para promover la plasticidad del sistema nervioso central en un sujeto.

31. Uso de la reivindicación 30, en donde el sujeto es un humano.

32. Un método para obtener anticuerpos monoclonales con la proteína de las reivindicaciones 1-7, dicho método que comprende:

(a) la administración a un animal no-humano de una cantidad inmunogénica de una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(b) producción de moléculas de anticuerpo monoclonal por líneas celulares continuas a partir de dicho animal no-humano en cultivo,

(b) recuperación de dichos anticuerpos monoclonales del cultivo.