BR112012021926A2 - proteína de ligação de antígeno, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para a produção de uma proteína de ligação de antígeno e para tratar um indivíduo afligido e prevenir uma doença, composição farmacêutica, composto de esgotamento de sap - Google Patents

proteína de ligação de antígeno, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para a produção de uma proteína de ligação de antígeno e para tratar um indivíduo afligido e prevenir uma doença, composição farmacêutica, composto de esgotamento de sap Download PDF

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Abstract

PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO E PARA TRATAR UM INDIVÍDUO AFLIGIDO E PREVENIR UMA DOENÇA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSTO DE ESGOTAMENTO DE SAP. A presente invenção diz respeito a proteínas de ligação de antígeno, tais como anticorpos, que se ligam ao componente de amiloide P sérico (SAP), polinucleotídeos que codificam tais proteínas de ligação de antígeno, composições farmacêuticas que compreendem as ditas proteínas de ligação de antígeno e métodos de fabricação. A presente invenção também diz respeito ao uso de tais proteínas de ligação de antígeno no tratamento ou profilaxia de doenças associados com a deposição de amiloide que inclui amiloidose sistêmica, amiloidose local, doença de Alzheimer, e diabete tipo 2.

Description

“PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO, MOLÉCULA DE ÁCIDO " NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA . RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO E PARA TRATAR UM S INDIVÍDUO AFLIGIDO E PREVENIR UMA DOENÇA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSTO DE ESGOTAMENTO DE SAP”
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere às proteínas de ligação de antígeno, tais como anticorpos, que se ligam ao componente de amiloide P —sérico (SAP), polimucleotídeos que codificam tais proteínas de ligação de antígeno, composições farmacêuticas que compreendem as ditas proteinas de ligação de antígeno e métodos de fabricação. A presente invenção também diz respeito ao uso de tais proteínas de ligação de antígeno no tratamento ou profilaxia de doenças associadas com a deposição de amiloide que inclui amiloidose sistêmica, amiloidose local, doença de Alzheimer, e diabete tipo 2.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A amiloidose é uma doença séria e usualmente fatal causada pelo acúmulo extracelular nos tecidos de fibras de proteína insolúvel anormal conhecida como fibrilas de amiloide. Estas são derivadas de mais do que 20 proteínas diferentes em formas diferentes da doença, mas todas as fibrilas de amiloide compartilham uma estrutura de núcleo fº cruzado comum e todas são derivadas pelo enovelamento de proteinas precursoras normalmente solúveis (Pepys, M. B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Uma proteína plasmática não fibrilar normal, o componente de amiloide P sérico (SAP), também está sempre presente em depósitos de amiloide em virtude da sua ligação dependente de cálcio específica ávida a todos os tipos de fibrilas de amiloide (Pepys ef al. (1979) Clin. Exp. Immunol., 38: 284-293; Pepys et al. (1997) Amyloid: Int. 1. Exp. Clin. Invest., 4: 274-295). SAP humana é uma proteina constitutiva no plasma, em uma concentração em tomo de 20 a 40 mg/l (Nelson er al. (1991) Clin, Chim. 7 Acta, 200: 191-200) e com um total de cerca de 50 a 100 mg de SAP nos - compartimentos plasmáticos e extravasculares combinados tanto de indivíduos normais quanto de pacientes com doenças outras que não —amiloidose (Hawkins ef al. (1990) J.
Clin.
Invest, 86: 1862-1869). Em pacientes com amiloidose, SAP também é especificamente concentrada nos depósitos de amiloide e em um indivíduo com amiloidose sistêmica extensiva pode haver tanto quanto 20.000 mg de SAP no amiloide (Pepys et al. (1994) PNAS, 91: 5602-5606), reversivelmente ligado às fibrilas e em equilíbrio com a reunião de SAP na fase fluídica.
A função fisiológica normal da SAP circulante é insuficientemente entendida, mas experimentos de animal e estudos in vitro sugerem um papel na defesa do hospedeiro (Noursadeghi ef al. (2000) PNAS, 97: 14584-14589). SAP também é um constituinte da estrutura de tecido normal associado com fibras elásticas e a membrana de base glomerular embora a sua função não seja conhecida.
Na amiloidose, os depósitos de amiloide extracelulares causam doença pelo acúmulo progressivo até que eles danificam a estrutura e assim a função de qualquer tecido que eles ocupem (Pepys, M.
B. (2006) Annu.
Rev.
Med,., 57: 223-241). Muito raramente existe qualquer resposta inflamatória ou “de corpo estranho' à deposição de amiloide, localmente observado nos tecidos ou sugerido pelos marcadores sistêmicos de inflamação.
A amiloidose sistêmica pode envolver qualquer órgão, é usualmente fatal e causa —1 por mil mortes nos países desenvolvidos.
O amiloide localizado, confinado a um único local anatômico ou tipo de tecido, também pode ser muito sério, por exemplo, angiopatia amiloide cerebral é uma causa importante de acidente vascular hemorrágico.
As apresentações clínicas da amiloidose são extremamente diversas e o diagnóstico é raramente feito antes que dano a órgão significante esteja presente, Mais de 20 proteínas de fibrila de amiloide diferentes são responsáveis por formas diferentes de amiloidose, mas os tratamentos que substancialmente reduzem a abundância da respectiva " proteina precursora de fibrila de amiloide fazem parar o acúmulo de amiloide s e os depósitos podem regredir. Infelizmente medidas eficazes nem sempre estão disponíveis e, quando elas existem, são tóxicas ou nocivas e lentas para agir (Pepys, M. B (2006) Anmu. Rev. Med, 57: 223-241). Existe, portanto uma necessidade médica principal não atingida quanto à terapia que promove com segurança a depuração de depósitos de amiloide estabelecidos. Além disso, existem outras condições em que os depósitos de amiloide estão sempre presentes, o mais importante na doença de Alzheimer (AD) e diabete melito tipo2,em que a contribuição da deposição de amíloide para a patogênese da doença, especificamente a perda da função cognitiva e da ilhota pancreática, respectivamente, não é conhecida (Pepys, M. B. (2006) Annu. Rev. Med., 57: 223-241). Entretanto, depósitos de amiloide em qualquer outro lugar no corpo são demonstravelmente patogênicos e é provável que os depósitos cerebrais de ADe os depósitos de amiloide da ilhota da diabete tipo 2 também são nocivos. Visto que o tratamento que depura depósitos de amiloide na amiloidose sistêmica certamente será terapêutico (Pepys, M. B. (2006) Annu. Rev. Med,, 57: 223-241), a remoção dos depósitos de amiloide na AD e diabete tipo 2 também deve ser clinicamente benéfica.
A ligação de SAP estabelece fibrilas de amiloíde, protege-as da proteólise im vitro (Tennent et al., (1995) PNAS, 92: 4299-4303), pode realçar a fibrilogênese de amiloide invitro (Myers et al, (2006), Biochemistry, 45: 2311-2321) e contribui para a patogênese da amiloidose sistêmica in vivo (Botto er al., (1997) Nature Med., 3: 855-859). Ligada com a — sua presença universal em todos os depósitos de amiloide, estas propriedades de SAP a tornam um alvo terapêutico atrativo.
O pedido de patente europeu EP 0915088 divulga compostos derivados de D-prolina que são inibidores competitivos da ligação de SAP às fibrilas de amiloide, assim como métodos para a sua fabricação. Um composto preferido divulgado na EP 0915088 é o ácido (R)-1-[6-[(R)-2- 7 Carbóxi-pirrolidin-1-11]-6-0x0 oxoexanoil] pirrolidino-2-carboxílico cs (CPHPC). O pedido de patente internacional WO 03/051836 divulga pró- —medicamentosparaoscompostos derivados de D-prolina.
O pedido de patente internacional WO 2004/099173 divulga derivados de piruvato cíclico de glicerol que são inibidores competitivos da ligação de SAP às fibrilas de amiloide.
O pedido de patente internacional WO 04/059318 descreve métodos que são declarados realçar a formação de fibrócitos que compreendem o fornecimento de composições que ligam SAP. Tais composições incluem anticorpos anti SAP e CPHPC. A WO 04/059318 não divulga o tratamento de doenças associadas com a deposição de amiloide. Além disso, existe evidência clínica e instigação in vivo de que nem a SAP nema sua depleção têm qualquer efeito sobre a fibrose nos seres humanos (Tennent et al., (2007) Arthritis Rheum., 56: 2013-2017; Pepys, M. B,, Tennent, G. A. e Denton, C, P. (2007) Reply to Letter from Pilling, D., Buckley, C. D., Salmon, M. e Gomer, R. G., Serum amyloid P and fibrosis in systemic sclerosis: comment on the article by Tennent er a/. Arthritis Rheum., 56:4229-4230).
O composto de bis-D-prolina, CPHPC, divulgado nas patentes listadas acima, está ligado com alta afinidade pela SAP humana e foi intencionado como um medicamento para remover SAP dos depósitos de amiloide in vivo e facilitar deste modo a sua depuração. A ligação de CPHPC —pelaSAP deflagra depuração rápida do complexo pelo fígado, esgota quase todas as SAP circulantes contanto que o medicamento seja administrado, e remove muito mas não todo o SAP ligado a amiloide (Pepys ef al., (2002) Nature, 417: 254-259). Em estudos clínicos iniciais (Gillmore et al., (2010) Brit. J. Haematol., doi: 10.1111/i, 1365-2141, 2009, 08036x), a e) administração de CPHPC parece parar o acúmulo de amiloide mas ela não É produz a regressão de amiloide e visto que CPHPC não remove - completamente todo o SAP dos depósitos de amiloide, um outro método é necessário.
O pedido de patente internacional WO 2009/000926 divulga o uso de compostos que esgotam SAP da circulação, tais como derivados de D- prolina, em particular CPHPC, em combinação com um anticorpo específico para SAP para o tratamento ou profilaxia de amiloidose.
O pedido de patente internacional PCT/EP2008/011135 diz respeito a vários anticorpos monoclonais de camundongo que podem ser usados em combinação com compostos que esgotam SAP da circulação, tais como derivados de D-prolina, em particular CPHPC, para o tratamento ou profilaxia de amiloidose.
Consequentemente, existe uma necessidade na técnica quanto à anticorpos, particularmente anticorpos humanizados ou humanos, que especificamente alvejam SAP e fornecem eficácia terapêutica melhorada em pacientes, particularmente pacientes humanos, com doenças associadas com a deposição de amiloide de modo a preservar a função de órgão e prolongar a vida.
—SUMÁRIODAINVENÇÃO A presente invenção fornece, em um primeiro aspecto, uma proteina de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compete quanto à ligação ao SAP com um anticorpo de referência que compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 7, e uma —sequênciada região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9.
Em um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que se liga ao SAP e compreende CDRH3 apresentada na SEQ ID NO: 3 ou uma variante funcional de CDRH3.
Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP, em que a proteína 7 de ligação de antígeno é um anticorpo quimérico ou humanizado que - compreende a CDRH3 correspondente da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 7, ou uma variante funcional de CDRH3.
Em um quarto aspecto da invenção, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP, e compreende uma unidade de ligação H3 que compreende os resíduos de Kabat de 95 a 101 da SEQ ID NO: 7, ou uma variante funcional da unidade de ligação H3. Em um quinto aspecto da invenção, é fomecida uma proteína deligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada da SEQ ID NO: 27-31; e/ou uma região variável de cadeia leve selecionada da SEQ ID NO: 34-36; ou um região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve variantes com identidade de sequência de 75 % ou maior.
Em um sexto aspecto da invenção, é fornecida uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 62; e/ou uma cadeia leve da SEQ ID NO: 64; ou uma cadeia pesada ou cadeia leve variantes com identidade de sequência de 75 % ou maior.
A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação de antígeno da invenção, vetores de expressão que compreendem a mesma, e células hospedeiras capazes de produzir as proteínas de ligação de antígeno da invenção.
Em um outro aspecto da invenção uma composição — farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de antígeno como aqui definida é fornecida. A presente invenção também fornece métodos de prevenir e/ou tratar um indivíduo suscetível a ou afligido com uma doença associada com a deposição de amiloide, método este que compreende à etapa de administrar uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação de antígeno ao dito indivíduo. O uso de uma proteina de 7 ligação de antígeno como aqui definida para prevenir e/ou tratar um indivíduo -s suscetível a ou afligido com uma doença associada com a deposição de amiloide é fornecida. O uso de uma proteína de ligação de antígeno como —aquidefinidaparaa fabricação de um medicamento para prevenir e/ou tratar * um indivíduo suscetível a ou afligido com uma doença associada com a deposição de amiloide também é fornecida.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A Figura 1 mostra as curvas de ligação para anticorpos de —murino SAP-E e SAP-K em uma concentração de revestimento de 1 ug/ml de SAP humano.
A Figura 2 mostra as curvas de ligação para os anticorpos de murino SAP-E e SAP-K. em uma concentração de revestimento de 5 ug/ml de SAP humano.
A Figura 3 mostra as curvas de ligação para os anticorpos quiméricos cSAP-E e cSAP-K. O perfil das curvas para os anticorpos quiméricos é o mesmo como aquele dos hibridomas equivalentes.
À Figura 4 mostra as curvas de ligação para SAP-K HOLO, SAP-K. H1ILO0, SAP-K H2L0 e SAP-K. H3LO comparados com a quimera SAP-KeSAP-E HILI comparado com a quimera SAP-E, Um anticorpo de IgGl capa humano irrelevante também foi testado como um controle negativo.
A Figura 5 mostra anticorpos monoclonais de murino SAP-K e SAP-E purificados em um ELISA de competição com a quimera SAP-E.
À Figura 6 mostra anticorpos monoclonais de murino SAP-K e SAP-E purificados em um ELISA de competição com a quimera SAP-K.
A Figura 7 mostra um ensaio imunorradiométrico para ligação de anticorpos monoclonaís de camundongo SAP-E e SAP-K ao SAP humano capturado pelo anticorpo SAP anti-ser humano policlonal de ovelha imobilizado. 7 A Figura 8 mostra o mapeamento de epítopo para anticorpo - SAP anti-ser humano monoclonal SAP-E. A Figura 9 mostra a localização dos epitopos no SAP humano — reconhecido por SAP-K (A, salientado em preto) e SAP-E (B, mostrado em branco).
A Figura 10 mostra a ativação de C3 pelos anticorpos SAP anti-ser humano monoclonais humanizados em soro humano integral.
A Figura 11 mostra a ativação de C3 pela dose baixa de anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais humanizados em soro humano integral.
A Figura 12 mostra a ativação de C3 pelos anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais humanizados em soro de camundongo integral suplementado com o SAP humano puro.
15º DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece uma proteína de ligação de antígeno que se liga ao componente de amíiloide P sérico (SAP), por exemplo SAP humano, como seu antígeno específico (isto é, uma proteína de ligação de SAP). Em aplicações terapêuticas da invenção, a proteína de ligação de antígeno ativa os mecanismos potentes do corpo para a depuração de fragmentos anormais de tecidos. A proteína de ligação de antígeno pode ser um anticorpo, por exemplo um anticorpo monoclonal. Uma proteína de ligação de antígeno da invenção não é um anticorpo de murino, Em uma forma de realização, uma proteína de ligação de antígeno da invenção não é uma proteína de ligação de antígeno de murino. Em particular, uma proteína de ligação de antígeno da invenção é uma proteína de ligação de antígeno quimérica, humanizada ou humana.
“Componente de amiloide P sérico” ou “SAP” refere-se a uma glicoproteína plasmática homopentamérica da família pentraxina. Cada molécula é composta de 5 promotores idênticos, cada um com uma dobra em - rocambole (| achatado e hélice alfa única, não covalentemente associadas em s um anel semelhante a disco com simetria pentamérica cíclica (Hutchinson er al., (2000) Mol. Med,., 6: 482-493); Pepys et al., (2002) Nature, 417: 254- 259) O temo “SAP” como aqui usado também inclui a subunidade individual codificada pelo gene humano APCS (cromossoma: 1; Localização: 1921-923) ou genes homólogos em outros organismos, por exemplo a subunidade de polipeptíideo SAP humano tendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 43 assim como a forma pentamérica nativa de SAP, e — quaisquer fragmentos e variantes de SAP que retém a atividade biológica de ligação às fibrilas de amiloide in vivo.
A proteína de ligação de SAP da invenção pode ligar-se a qualquer uma ou qualquer combinação das formas diferentes descritas acima de SAP. Em uma forma de realização particular, a proteína de ligação de antígeno da invenção liga SAP humano. A proteína de ligação de SAP da invenção pode ligar-se a SAP quando o SAP é ligado a fibrilas de amiloide de qualquer tipo e em qualquer localização extracelular dentro do corpo. A proteína de ligação de antígeno da invenção também pode ligar-se ao SAP não ligado nativo, Um aspecto essencial de utilização das proteínas de ligação de SAP da invenção em métodos terapêuticos é que a concentração de SAP na circulação deve ser reduzida em pelo menos 90 % abaixo do seu valor normal antes da administração da proteína de ligação de SAP. Especificamente, isto pode ser obtido pelos compostos que diminuem a quantidade de SAP circulante e, em particular, compostos que resultam na depleção de SAP circulante, aqui definidos como “compostos que esgotam SAP”. Tais compostos são ligandos ligados por SAP e são inibidores competitivos da ligação de SAP às fibrilas de amiloide, tais como os derivados de D-prolina e derivados de piruvato cíclico de glicerol. Os derivados de D-prolina são divulgados na EP 0915088, que é aqui incorporada por referência em sua 7 totalidade, e o termo “derivados de D-prolina” inclui pró-medicamentos, tais - como aqueles divulgados na WO 03/05 1836, que também é aqui incorporada por referência em sua totalidade. As D-prolinas das seguintes fórmulas são consideradas: OH FO,
ATA SS Pr. VA A A HA ss em que
R Y e o grupo Ré hidrogênio ou halógeno; e X é (CH); -CH(RYCH),-; -CHO(CH3),; -CHANH-; -C(RI=CH-; -CH.CH(OH)-; ou thiazol-2,5-diil; -O-; Y é-S-S; (CHo)I-; -O-; -NH; -N(RÔ); -CH=CH-; “NHC(OJNH-;-N(R)C(O)N(R)-; NJ [CH;CH;(OCH),]-; N(CELCOH;)-; -N(CHCHs)C(ON(CHACHs); -N(alcoxialquila)-; Ní(cicloalquil-metila)-; 2,6-piridila; 2,5-furanila; 2,5-tienila; 1,2-cicloexila; 1,3-cicloexila; 1,4-cicloexila; 1,2-naftila; 1,4-naftila; 1,5-nafiila; 1,6-naftila; ou 1,2-fenileno, 1,3-fenileno e 1,4-fenileno, em que os grupos fenileno são opcionalmente substituídos por 1 a 4 substituíntes, selecionados de halógeno, alquila inferior, alcóxi inferior, hidroxila, carbóxi, -COO-alquila inferior, nitrilo, S-tetrazol, (ácido 2-carboxílico pirrolidin-1-
u1 i1)-2-0x0-etóxi, N-hidroxicarbamimidoíla, 5-oxo[1,2,4]- 7 oxadiazolila, 2-oxo [1,2,3,5] oxatiadiazolila, S-tioxo[1,2,4] - oxadiazolila e 5-terc-butilsulfanil-[1,2,4]oxadiazolila; X* é (CH); -(CH2),CH(R2)-; -(CH;).OCH7-; -NHCHy-; s -CH=C(R)-; CH(OH)CH; ou tiazol-2,5-diila; -O-; R? é alquila inferior, alcóxi inferior ou benzila, né0a3eemque alquila ou alquila inferior é alquila Cie; alcóxi ou alcóxi inferior é alcóxi Cs; cicloalquila é cicloalquila C3.6; halógeno é F, Cl ou Br; e alocalização onde a linha pontilhada aparece na fórmula é uma ligação única ou dupla; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou mono- ou diéster deste.
As D-prolinas da fórmula I-A acima pode ser escrita como —Ligando-ligador- Ligando, em que a porção X-Y-X' da fórmula I-A forma o ligador. O ligador (X-Y-X") pode ter de 4 a 20 átomos de carbono lineares no comprimento, que incluí de 4 a 15 átomos de carbono lineares, de 5 a 10 átomos de carbono lineares, e de 6 a 8 átomos de carbono lineares no comprimento. O ligador pode ser uma cadeia reta ou ramificada, ou pode opcionalmente formar uma ou mais estruturas de anel, com a condição de que pelo menos 4 átomos de carbono de cadeia linear ou reta estejam presentes no ligador, Pelo menos um dos átomos C de cadeia linear ou reta pode ser opcionalmente substituído em pelo menos um heteroátomo selecionado de N, O, ou S, vantajosamente O ou S, vantajosamente O.
Assim, um “ligador opcionalmente substituído” pode ter uma ou mais substituições que levam à ramificação e/ou uma ou mais substituições de átomo(s) de carbono dos átomos de carbono da cadeia linear ou reta do ligador, por exemplo o ligador pode ser um éter ou um éter substituído, O ácido — (R)1-[6-[(R)-2-carbóxi-pirrolidin-1-11]-6-0x0-
hexanoil]pirrolidino-2-carboxílico (CPHPC) é uma D-prolina específica : considerada pela invenção. Em uma forma de realização particular, CPHPC . deve ser administrado a um paciente humano. Os derivados de piruvato de glicerol cíclico são divulgados na WO2004/099173,que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
O termo “proteína de ligação de antígeno” como aqui usado refere-se a anticorpos, fragmentos de anticorpo e outras construções de proteína, tais como domínios, que são capazes de ligar ao SAP.
O termo “anticorpo” é aqui usado no sentido mais amplo para sereferir às moléculas com um domínio como o de imunoglobulina e inclui anticorpos — monoclonais, — recombinantes, — policlonais, — quiméricos, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados; um domínio variável único, um anticorpo de domínio, fragmentos de ligação de antígeno, fragmentos imunologicamente eficazes, Fv de cadeia única, diacorpos, Tandabsº, etc.
(para um resumo de formatos de “anticorpo” alternativos ver Holliger e Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136).
A frase “domínio variável único” refere-se a um domínio variável de proteína de ligação de antígeno (por exemplo, VH, VHH, VL) que especificamente liga um antígeno ou epítopo independentemente de uma regiãooudomínio variáveis diferentes.
Um “anticorpo de domínio” ou “dAb” pode ser considerado o mesmo como um “domínio variável único” que é capaz de ligação a um antígeno. Um domínio variável único pode ser um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui domínios variáveis de anticorpo único de outras espécies tais como dAbs VHH de roedor (por exemplo, como divulgado na WO 00/29004), tubarão lixa e Cameliídeo. VHH de camelídeo são polipeptídeos de domínio variável único de imunoglobulina que são derivadas de espécies que inclui camelo, lhama, alpaca, dromedário, e guanaco, que produz anticorpos de cadeia pesada naturalmente destituídos de cadeias leve. Tais domínios VHH podem ser humanizados de acordo com 7 técnicas padrão disponíveis na técnica, e tais domínios são considerados ser “ “anticorpos de domínio”. Como aqui usado VH inclui domínios VHH de camelídeos.
Como aqui usado o termo “domínio” refere-se a uma estrutura de proteina dobrada que tem estrutura terciária independente do resto da proteína. No geral, os domínios são responsáveis pelas propriedades funcionais distintas das proteínas, e em muitos casos podem ser adicionados, removidos ou transferidos para outras proteínas sem a perda de função do resto da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável único” é um domínio de polipeptídeo dobrado que compreende características de sequências de domínios variáveis de anticorpo, O mesmo portanto inclui domínios variáveis de anticorpo completos e domínios variáveis modificados, por exemplo, em que uma ou mais alças foram substituídas pelas sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo, ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões de terminal N ou C, assim como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade e especificidade de ligação do domínio de tamanho natural. Um domínio pode ligar um antígeno ou epítopo — independentemente de uma região ou domínio variáveis diferentes.
Um fragmento de ligação de antígeno pode ser forecido por meio dos arranjo de uma ou mais CDRs nos esqueletos de proteína que não anticorpo tais como um domínio. O domínio pode ser um anticorpo de domínio ou pode ser um domínio que é um derivado de um esqueleto — selecionado do grupo que consiste de CTLAH, lipocalina, SpA, um Affibody, um avímero, GroEl, transferrina, GroES e fibronectina/adnectina, que foram individualizadas para o engenheiramento de proteína de modo a obter a ligação a um antígeno, tal como SAP, outros que não o ligando natural.
Um fragmento de ligação de antígeno ou um fragmento imunologicamente eficaz pode compreende parcialmente sequências variáveis 7 de cadeia pesada ou leve. Os fragmentos têm pelo menos 5, 6, 7, 8, 92 0u 10 . aminoácidos no comprimento. Alternativamente os fragmentos têm pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 75, ou pelo menos 100 —aminoácidosno comprimento.
O termo “especificamente liga” como usado por todo o presente relatório descritivo em relação às proteínas de ligação de antígeno significa que a proteína de ligação de antígeno se liga ao SAP sem nenhuma ou ligação insignificante a qualquer outra proteína, que incluí moléculas intimamente relacionadas tais como proteína reativa C (CRP) que, em seres humanos, compartilha 55 % do resíduo estrito para a homologia de sequência de aminoácido do resíduo e tem essencialmente a mesma dobra de proteína.
A constante de dissociação (KD) no equilíbrio da interação da proteína de ligação de antígeno SAP pode ser de 1 MM ou menos, de 100 nM oumenos, de 10 nM ou menos, de 2 nM ou menos ou de | 6M ou menos. Alternativamente a KD pode estar entre 5 e 10 nM; ou entre 1e 2nM. A KD pode estar entre 1 pM e 500 pM; ou entre 500 pM e 1 nM, A afinidade de ligação pode ser medida pela BIAcore”, por exemplo pela captura de antígeno com o SAP ligado a uma lasca de —carboximetildextrano pela ligação de amina primária e captura de anticorpo nesta superfície. Alternativamente, a afinidade de ligação pode ser medida pelo BIAcore” pela ligação de anticorpos anti SAP ao SAP humano capturado pela O-fosfoetanolamina imobilizada em uma lasca de CMS. Os métodos BIAcore” descritos no Exemplo 8 podem ser usados para medir a afinidade de ligação A constante da taxa de dissociação (kd) pode ser de 1 x 10? sº ou menos, 1 x 10º s ou menos, ou | x 10º s* ou menos. À kd pode estar entre 1 x 10º sº e 1 x 10º s; ou entre L x 10º s' elx 10º sº. Uma kd pequena pode resultar em uma dissociação lenta do complexo de proteína de ligação de antígeno-ligando e depuração melhorada de complexos de SAP " ligados ao amiloide.
* Estará evidente a aqueles habilitados na técnica que o termo “derivado” é intencionado a definir não apenas a fonte no sentido do mesmo sera origem física do material mas também para definir o material que é estruturalmente idêntico ao material mas que não se origina da fonte de referência. Assim “resíduos encontrados no anticorpo doador” não precisam necessariamente ter sido purificado a partir do anticorpo doador. Por “isolado” é intencionado que a molécula, tal como uma proteína de ligação de antígeno, é removida do ambiente no qual o mesmo pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, a molécula pode ser purificada de substâncias com as quais a mesma normalmente existiria na natureza. Por exemplo, a massa da molécula em uma amostra pode ser de 95 % da massa total.
Um “anticorpo quimérico” refere-se a um tipo de anticorpo engendrado que contém uma região variável que ocorre naturalmente (cadeia leve e cadeias pesadas) derivada de um anticorpo doador em associação com regiões constantes de cadeia leve e pesada derivadas de um anticorpo aceitador.
Um “anticorpo humanizado” refere-se a um tipo de anticorpo engendrado tendo as suas CDRs derivadas de uma imunoglobulina doadora não humana, as partes derivadas da imunoglobulina remanescentes da molécula sendo derivadas de uma ou mais imunoglobulina(s) humanas. Além disso, os resíduos de suporte da estrutura podem ser alterados para preservar a afinidade de ligação (ver, por exemplo, Queen et al, Proc. Natl Acad Sci EUA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson er al. Bio/Technology, 9: 421 (1991)). Um anticorpo aceitador humano adequado pode ser um selecionado de uma base de dados convencional, por exemplo, à base de dados de KABAT?, base de dados da Los Alamos, e base de dados Swiss Protein, pela homologia às sequências de nmucleotideo e aminoácido do anticorpo doador. , Um anticorpo humano caracterizado por uma homologia com as regiões de ” estrutura do anticorpo doador (em uma base de aminoácido) pode ser adequada para fornecer uma região constante de cadeia pesada e/ou uma rTegião de estrutura variável de cadeia pesada para a inserção das CDRs do doador. Um anticorpo aceitador adequado capaz de doar regiões de estrutura constante ou variável de cadeia leve pode ser selecionado em uma maneira similar. Deve ser mencionado que as cadeias pesada e leve do anticorpo aceitador não são requeridas originar-se do mesmo anticorpo aceitador. À técnica anterior descreve vários modos de produzir tais anticorpos humanizados — ver por exemplo EP-A-0239400 e EP-A-054951.
O termo “anticorpo doador” refere-se a um anticorpo que contribui com as sequências de aminoácido das suas regiões variáveis, CDRs, ou outros fragmentos funcionais ou seus análogos para um primeiro parceiro de imunoglobulina, O doador portanto formece a região codificadora de imunoglobulina alterada e o anticorpo alterado expressado resultante com a especificidade antigênica e atividade neutralizantes características do anticorpo doador.
O termo “anticorpo aceitador” refere-se a um anticorpo que é —heterólogo para o anticorpo doador, que contribuí com todas (ou qualquer porção) das sequências de aminoácido que codificam as suas regiões de estrutura de cadeia pesada e/ou leve e/ou as suas regiões constantes de cadeia pesada e/ou leve para o primeiro parceiro de imunoglobulina. Um anticorpo humano pode ser o anticorpo aceitador.
O termo “anticorpo humano” refere-se a um anticorpo derivado de sequências de gene imunoglobulina humana. Estes anticorpos humanos completamente fornece uma alternativa para os anticorpos monoclonais reengenheirados, ou desimunizados, de roedor (por exemplo anticorpos humanizados) como uma fonte de anticorpos terapêuticos de imunogenicidade baixa e eles são normalmente gerados usando plataformas " de demonstração de fago ou de camundongo transgênico. Em uma forma de - realização, um anticorpo da invenção é um anticorpo humano. Os termos “VH” e “VL” são aqui usados para se referir à região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve respectivamente de uma proteína de ligação de antígeno, As “CDRs” são definidas como as sequências de aminoácido da região determinadora de complementaridade de uma proteína de ligação de antígeno. Estas são as regiões hipervariáveis de cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Existem três CDRs (ou regiões de CDR) de cadeia pesada e três de cadeia leve na porção variável de uma imunoglobulina, Assim, as “CDRs” como aqui usadas referem-se a todas as três CDRs de cadeia pesada, todas as três CDRs de cadeia leve, todas as CDRs de cadeia pesada e leve, ou pelo menos duas CDRs.
Por todo este relatório descritivo, os resíduos de aminoácido nas sequências de domínio variável e sequências de anticorpo de tamanho natural são numeradas de acordo com a convenção de numeração de Kabat. Similarmente, os termos “CDR”, “CDRLI”, “CDRL2”, “CDRL3”, “CDRH1”, “CDRH2”, “CDRH3” usados nos Exemplos seguem a convenção —denumeração de Kabat. Para mais informação, ver Kabat er al., Sequences of Proteins of Immunologíical Interest, 4º Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987).
Entretanto, embora usemos a convenção de numeração de Kabat para os resíduos de aminoácido nas sequências de domínio variável e — sequências de anticorpo de tamanho natural por todo este relatório descritivo, estará evidente a aqueles habilitados na técnica que existem convenções de numeração alternativas para os resíduos de aminoácido nas sequências de domínio variável e sequências de anticorpo de tamanho natural, Existem também convenções de numeração alternativas para as sequências de CDR,
por exemplo aquelas apresentadas em Chothia et al. (1989) Nature 342: 877- 7 883. A estrutura e dobra de proteína do anticorpo pode significar que outros - resíduos são considerados parte da sequência de CDR e é entendido ser assim por uma pessoa habilitada.
Outras convenções de numeração para as sequências de CDR disponíveis a uma pessoa habilitada incluem os métodos “APM” (University of Bath) e “contact” (University College London). A região de sobreposição mínima usando pelo menos dois dos métodos de Kabat, Chothia, ADM e contact pode ser determinada fornecer a “unidade de ligação mínima”. A unidade de ligaçãomínima pode ser uma snbporção de uma CDR.
A Tabela | abaixo representa uma definição usando cada convenção de numeração para cada CDR ou unidade de ligação. O esquema de numeração de Kabat é usado na Tabela 1 para numerar a sequência de aminoácido de domínio variável. Deve ser mencionado que algumas das definições de CDR podem variar dependendo da publicação individual usado. Tabela 1 [27 EFE Tee TEIMA Tea Term Como aqui usado, 6 termo “sítio de ligação de antígeno” refere-se a um sítio em uma proteína de ligação de antígeno que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. Este pode ser um domínio único (por exemplo, um epíitopo-domínio de ligação), ou domínios de Fv de cadeia única (ScFv) ou pode ser domínios VH/VL emparelhados como pode ser encontrado em um anticorpo padrão.
O termo “epítopo” como aqui usado refere-se àquela porção do antígeno que faz contato com um domínio de ligação particular da proteína de ligação de antígeno. Um epítopo pode ser linear, que compreende uma sequência “de aminoácido essencialmente linear do antígeno.
Alternativamente, um epítopo pode ser conformacional ou descontínuo.
Por ' exemplo, um epítopo conformacional compreende resíduos de aminoácido > que requerem um elemento de restrição estrutural.
No caso de um epítopo conformacional, embora os resíduos possam ser de regiões diferentes da cadeia peptídica, eles podem estar em proximidade imediata na estrutura tridimensional do antígeno.
No caso de antígenos multiméricos, tais como SAP, um epítopo conformacional pode incluir resíduos de cadeias peptídicas diferentes que podem estar em proximidade imediata na estrutura tridimensional do antígeno.
Tais resíduos estruturalmente vizinhos podem ser determinados através de programas de modelagem computacional ou por intermédio de estruturas tridimensionais obtidas através de métodos conhecidos na técnica, tais como a cristalografia de raio X.
Um epítopo descontínuo compreende resíduos de aminoácido que são separados por outras sequências, isto é, não em uma sequência — contínua na sequência primária do antígeno.
No contexto da estrutura terciária e quaternária do antígeno, os resíduos de um epítopo descontínuo estão próximos o bastante para cada um estar ligado por uma proteína de ligação de antígeno, Em uma forma de realização, uma proteína de ligação de antígeno da invenção se liga a um epítopo dentro dos resíduos de 140 a 158 do SAP humano, Para as sequências de nucleotídeo e aminoácido, os termos “idêntico” ou “identidade de sequência” indicam o grau de identidade entre duas sequências de ácido nucleico ou duas de aminoácido quando otimamente — alinhadas e comparadas com inserções ou deleções apropriadas.
A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade % = número de posições idênticas/número total de posições multiplicadas por 100), levando-se em conta o número de intervalos, € o comprimento de cada intervalo, que necessita ser introduzido para o 7 alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação das sequências e a * determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, como descrito abaixo.
A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG, usando uma estrutura NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A identidade percentual entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido também podem ser determinadas usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que foram incorporados no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, usando uma estrutura Blossum 62 ou uma estrutura PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1,2,3,4,5, ou 6.
Por via de exemplo, uma sequência de polinucleotídeo pode ser idêntica a uma sequência de polinucleotídeo de referência como aqui descrita (ver por exemplo a SEQ ID NO: 8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65- 73), que deve ser 100 % idêntica, ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de nucleotíideo quando comparado com a sequência de referência, tal como pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99 % idêntica. Tais alterações são selecionadas de pelo menos uma deleção, substituição de nucleotídeo, que inclui transição e transversão, ou inserção, e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições de terminal 5º ou 3º da sequência de nucleotídeo de referência ou em qualquer lugar entre estas posições de terminal, intercaladas individualmente entre os nucleotídeos na 7 sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da - sequência de referência O número de alterações de nucleotídeo é determinado multiplicando-se o número total de nucleotídeos na sequência de —polinucleotídeo de referência como aqui descrita (ver por exemplo SEQ ID NO: 8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65-73), pelo percentual numérico da respectiva identidade percentual (dividido por 100) e subtraindo este produto do dito número total de nucleotídeos na sequência de polinucleotídeo de referência como aqui descrito (ver por exemplo a SEQ ID NO: 8, 10, 18, 20, 45-48,51-61,63,65-73), ou: Mn <Xo- (En º 7), em que n, é o número de alterações de nucleotídeo, x, é o número total de nucleotídeos na sequência de polinucleotídeo de referência como aqui descrito (ver por exemplo a SEQ ID NO: 8, 10, 18, 20, 45-48, 51-61, 63, 65- 73) ey éde 0,50 para 50 %, 0,60 para 60 %, 0,70 para 70 %, 0,75 para 75 %, 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 %, 0,98 para 98 %, 0,99 para 99 % ou 1,00 para 100 %, « é o símbolo para o operador de multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de x, e y é arredondado para baixo até o número inteiro mais próximo antes de subtraí-lo de x,.
Similarmente, uma sequência de polipeptídeo pode ser idêntica a uma sequência de referência de polipeptideo como aqui descrita (ver por exemplo SEQ TD NO: 1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), que deve ser 100 % idêntica, ou pode incluir até um certo número inteiro de alterações de aminoácido quando comparada com a sequência de referência talquea identidade % seja menor do que 100 %, tal como pelo menos 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99 % idêntica. Tais alterações são selecionadas do grupo que consiste de pelo menos uma deleção, substituição de aminoácido, que inclui substituições, ou inserções conservativas e não conservativas, e em que as ditas alterações podem ocorrer nas posições do terminal amina ou carbóxi da sequência de polipeptídeo de referência ou em : qualquer lugar entre estas posições de terminal, intercaladas individualmente * entre os aminoácidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
O número de alterações de —amincácido para uma dada identidade % é determinado multiplicando-se o número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo codificada pela sequência de polipeptídeo de referência como aqui descrita (ver por exemplo SEQ 1D NO: 1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74) pelo percentual numérico da respectiva identidade percentual (dividido por 100) e depois subtraindo-se este produto do dito número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência como aqui descrita (ver por exemplo SEQ ID NO: 1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), ou: MÉX- Cx), em que n, é a número de alterações de aminoácido, x, é o número total de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência como aqui descrita (ver por exemplo SEQ ID NO: 1-7, 9, 11-17, 19, 21-24, 27-31, 34-42, 62, 64, 74), e y é, 0,50 para 50 %, 0,60 para 60 %, 0,70 para 70 %, 0,75 para 75 %, 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 %, 0,98 para 98 %, 0,99 para 99 %, ou 1,00 para 100 %, * é o símbolo para o operador da multiplicação, eem que qualquer produto não inteiro de x, e y é arredondado para o número inteiro mais próximo antes de subtraí-lo de x,. A identidade % pode ser determinada através do comprimento da sequência.
Os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” cada um se —refereauma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido.
Um peptídeo pode ser monomérico ou polimérico, É bem reconhecido na técnica que certas substituições de aminoácido são consideradas como sendo “conservativas”. Os aminoácidos são divididos em grupos com base nas propriedades é as substituições de cadeia lateral comuns dentro de grupos que mantém toda ou substancialmente 7 toda da afinidade de ligação da proteína de ligação de antígeno são - consideradas como substituições conservativas, ver a Tabela 2 abaixo: Tabela 2 Ce Hidrofilica neutra À proteína de ligação de antígeno pode competir quanto à ligação ao SAP com um anticorpo de referência que compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 7, e uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9. Alternativamente, a proteína de ligação de antígeno pode competir quanto à ligação ao SAP com um anticorpo de referência que comipreende uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17, e uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ TD NO: 19, A competição entre a proteína de ligação de antígeno € o anticorpo de referência pode ser determinada pelo ELISA de competição, FMAT ou BIlAcore.
Uma proteína de ligação de antígeno competidora pode ligar-se ao mesmo epítopo, um epítopo de sobreposição, ou um epítopo em proximidade imediata do epítopo ao qual o anticorpo de referência se liga.
A presente invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende a CDRH3 da SEQIDNO:3ouumaCDR variante desta.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender ainda uma ou mais CDRs, ou todas as CDRs, em qualquer combinação, selecionadas da: CDRHI1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), e CDRL3 (SEQ ID NO: 6); ou uma variante destas.
Por exemplo, a proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 (SEQ ID NO: 3) e CDRHI (SEQ ID NO: 1), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a 7 CDRH3 (SEQ ID NO: 3) e CDRH2 (SEQ ID NO: 2), ou variantes destas.
À - proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH1 (SEQ ID NO: 1) e CDRH2 (SEQ ID NO: 2), e CDRH3 (SEQ ID NO: 3), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL] (SEQ ID NO: 4) e CDRL2 (SEQ ID NO: 5), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL2 (SEQ ID NO: 5) e CDRL3 (SEQ ID NO: 6), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO:5)eCDRL3 (SEQID NO: 6), ou variantes destas.
A proteina de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 (SEQ ID NO: 3) e CDRL3 (SEQ ID NO: 6), ou variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRH2 (SEQ ID NO: 2) e CDRL3 (SEQ ID NO: 6), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRL2 (SEQ ID NO: 5) e CDRL3 (SEQ ID NO: 6), ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH! (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL! (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5) e CDRL3 (SEQ ID NO: 6), ou variantes destas.
A presente invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende CDRH3 da SEQ ID NO: 13 ou uma CDR variante desta.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender ainda uma ou mais CDRs, ou todas as CDRs, em qualquer combinação, selecionada da: CDRHI (SEQ ID NO: 11), CDRH2 (SEQ ID NO: 12), CDRL1 (SEQ ID NO: 14), CDRL2 (SEQ ID NO: 15), e CDRL3 (SEQ ID NO; 16); ou uma variante desta, À presente invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP, em que a proteína de ligação 7 de antígeno é um anticorpo quimérico ou humanizado que compreende a - CDRH3 correspondente da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 7, ou uma CDRH3 variante.
A proteína de ligação de antígeno quimérica ou humanizada pode compreender ainda uma ou mais, ou todas das CDRs correspondentes selecionadas da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9, ou uma CDR variante desta.
Por exemplo, a proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 correspondente e CDRHI correspondente, ou variantes destas, A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 correspondente e CDRH2 correspondente, ou variantes destas. A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRHI1 correspondente, CDRH2 correspondente, e CDRH3 correspondente; ou variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL1 correspondente e CDRL2 correspondente, ou variantes destas. A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL2 correspondente é CDRL3 correspondente, ou variantes destas. A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRL] correspondente, CDRL2. correspondente e CDRL3 correspondente, ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 correspondente e CDRL3 correspondente, ou variantes destas. À proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 correspondente, CDRH2 correspondente e CDRL3 correspondente, ou variantes destas, À —proteínade ligação de antígeno pode compreender a CDRH3 correspondente, CDRH?2 correspondente, CDRL2 correspondente e CDRL3 correspondente, ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender a CDRHI correspondente, CDRH2 correspondente, CDRH3 correspondente,
CDRL1 correspondente, CDRL2 correspondente e CDRL3 correspondente, : Ou variantes destas, - As CDRs correspondentes podem ser definidas por referência aos métodos de Kabat (1987), Chothia (1989), ABM ou contact, ou uma combinação destes métodos.
Uma definição de cada um dos métodos pode ser encontrada na Tabela ] e pode ser aplicada ao domínio variável de cadeia pesada de referência da SEQ TD NO: 7 e ao domínio variável de cadeia leve de referência da SEQ ID NO: 9 para determinar a CDR correspondente.
A presente invenção também fomece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP, em que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo quimérico ou humanizado que compreende a CDRHS3 correspondente da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 17, ou uma CDRH3 variante, A proteina de ligação de antígeno quimérica ou humanizada — pode compreender ainda uma ou mais, ou todas das CDRs correspondentes selecionadas da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 17 ou SEQID NO: 19, ou uma CDR variante desta.
A presente invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP, e compreende uma unidade deligação H3 que compreende os resíduos de Kabat de 95-101 da SEQ 1D NO: 7, ou uma H3 variante.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender ainda uma ou mais ou todas as unidades de ligação selecionadas de: H1 que compreende os resíduos de Kabat de 31 a 32 da SEQ ID NO: 7, H2 que compreende os resíduos de Kabat de 52 a 56 da SEQ ID NO: 7, LI — que compreende os resíduos de Kabat de 30 a 34 da SEQ ID NO: 9, L2 que compreende os resíduos de Kabat de 50 a 55 da SEQ ID NO: 9 e L3 que compreende os resíduos de Kabat de 89 a 96 da SEQ ID NO: 9; ou uma unidade de ligação variante.
Por exemplo, a proteina de ligação de antígeno pode compreender um unidade de ligação H3 e uma unidade de ligação HI, ou 7 variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender uma - unidade de ligação H3 e uma unidade de ligação H2, ou variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação —Hl,uma unidade de ligação H2,e uma unidade de ligação H3; ou variantes destas.
A proteina de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação L1 e uma unidade de ligação L2, ou variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação L2 euma unidade de ligação L3, on variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação LI, uma unidade de ligação L2, e uma unidade de ligação L3; ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação H3 e uma unidade de ligação L3, ou variantes destas.
À proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação H3, uma unidade de ligação H2, e uma unidade de ligação L3; ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação H3, uma unidade de ligação H2, uma unidade de ligação L2, e uma unidade de ligação L3; ou variantes destas.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma unidade de ligação H1, uma unidade de ligação H2, uma unidade de ligação H3, uma unidade de ligação L1, uma unidade de ligação L2, e uma unidade de ligação L3; ou variantes destas.
A presente invenção também fornece uma proteína de ligação — de antígeno que especificamente se liga ao SAP, e compreende uma unidade de ligação H3 que compreende os resíduos de Kabat de 95 a 101 da SEQ ID NO: 17, ou um H3 variante.
A proteina de ligação de antígeno pode compreender ainda uma ou mais ou todas as unidades de ligação selecionadas de: H1 que compreende os resíduos de Kabat de 31 a 32 da SEQ ID NO: 17,
H2 que compreende os resíduos de Kabat de 52 a 56 da SEQ ID NO: 17, LI 7 que compreende os resíduos de Kabat de 30 a 34 da SEQ ID NO: 19, L2 que - compreende os resíduos de Kabat de 50 a 55 da SEQ ID NO: 19 e L3 que compreende os resíduos de Kabat de 89 a 96 da SEQ ID NO: 19; ou uma —unidadede ligação variante.
Uma variante de CDR ou unidade de ligação variante inclui uma sequência de aminoácido modificada em pelo menos um aminoácido, em que a dita modificação pode ser química ou uma alteração parcial da sequência de aminoácido (por exemplo em não mais do que 10 aminoácidos), modificação esta que permite que a variante retenha as características biológicas da sequência não modificada. Por exemplo, a variante é uma variante funcional que especificamente se liga ao SAP e ativa a depuração de complexos de SAP ligados ao amiloide de tecidos. Uma alteração parcial da sequência de aminoácido da CDR pode ser pela deleção ou substituição de um avários aminoácidos, ou pela adição ou inserção de um a vários aminoácidos, ou por uma combinação destes (por exemplo em não mais do que 10 aminoácidos). A variante de CDR ou variante da unidade de ligação podem conter 1, 2,3, 4,5 ou 6 substituições, adições ou deleções de aminoácido, em qualquer combinação, na sequência de aminoácido. A variante de CDR ou variantede unidade de ligação podem conter 1, 2 ou 3 substituições, inserções ou deleções de aminoácido, em qualquer combinação, na sequência de aminoácido. As substituições nos resíduos de aminoácido podem ser substituições conservativas, por exemplo, substituindo um aminoácido hidrofóbico por um aminoácido hidrofóbico alternativo, Por exemplo leucina — podeser substituído com valina, ou isoleucina.
Uma ou mais das CDRs, CDRs correspondentes, CDRs variantes ou unidades de ligação aqui descritas podem estar presentes no contexto de uma estrutura humana, por exemplo como um domínio variável humanizado ou quimérico. Os anticorpo completamente humanos que compreendem uma ou mais das CDRs, CDRs correspondentes, CDRs 7 variantes ou unidades de ligação aqui descritas também são considerados e + estão dentro do escopo da invenção. As CDRs L1, L2, L3, H1 e H2 tendem a exibir estruturalmente um de um número finito de conformações de cadeia principal, A classe de estrutura canônica particular de uma CDR é definida tanto pelo comprimento da CDR quanto pelo empacotamento da alça, determinada pelos resíduos localizados nas posições chave tanto nas CDRs quanto nas regiões de estrutura (determinando estruturalmente resíduos ou SDRs). Martin e Thornton (1996; J Mol Biol 263: 800-815) geraram um método automático para definir os padrões canônicos do “resíduo chave”. A análise de grupos é usada para definir as classes canônicas para conjuntos de CDRs, e os padrões canônicos são depois identificados pela análise de resíduos hidrofóbicos, que ligam hidrogênio encobertos, e glicinas e prolinas conservadas. As CDRs de sequências de anticorpo podem ser designadas às classes canônicas pela comparação das sequências com os padrões de resíduo chave e contando cada padrão usando estruturas de identidade ou similaridade, Os exemplos de CDRs canônicas dentro do escopo da invenção são dados abaixo. A numeração de aminoácido usada é Kabat, Os exemplos de canônicas para CDRHI1 como apresentádos na SEQ ID NO: 1, uma variante desta, a CDRH1 da SEQ ID NO: 7 ou uma CDR correspondente são: Tyr 32 é substituído por Tle, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu ou Asp; Asn 33 é substituído por Tyr, Ala, Trp, Gly, Thr, Leu ou Val; Met 34 é substituído por Ile, Val ou Trp; e/ou His 35 é substituído por Glu, Asn, Gln, Ser, TyrouThr.
Os exemplos de canônicas para CDRH2 como apresentadas na SEQ ID NO: 2, uma variante desta, a CDRH2 da SEQ ID NO: 7 ou uma CDR correspondente são: Tyr 50 é substituído por Arg, Glu, Trp, Gly, Gln, Val, Leu, Asn, Lys ou Ala; Ile51 é substituído por Leu, Val, Thr, Ser ou Asn; Tyr
52 é substituído por Asp, Leu, Asn ou Ser; Gly 53 é substituído por Ala, Tyr, 7 Ser, Lys, Thr ou Asn; Asp 54 é substituído por Asn, Ser, Thr, Lys ou Gly; - Asn 56 é substituído por Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Val, Ser ou Ala; e/ou Asn 58 é substituído por Lys, Thr, Ser, Asp, Arg, Gly, Phe ou Tyr.
Os exemplos de canônicas para CDRH3 como apresentadas na SEQ ID NO; 3, uma variante desta, a CDRH3 da SEQ ID NO: 7 ou uma CDR correspondente são: Ser 102 é substituído por Tyr, His, Val, Ile, Asp ou Gly, Os exemplos de canônicas para CDRL1 como apresentadas na SEQ ID NO: 4, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ ID NO; 9 ou uma CDR correspondente são: Asn 28 é substituído por Ser, Asp, Thr ou Glu; Ile 29 é substituído por Val; Tyr 30 é substituído por Asp, Leu, Val, Te, Ser, Asn, Phe, His, Gly ou Thr; Ser 31 é substituído por Asn, Thr, Lys ou Gly; Tyr 32 é substituído por Phe, Asn, Ala, His, Ser ou Arg; Leu 33 é substituído por Met, Val, Ile ou Phe; e/ou Ala 34 é substituído por Gly, Asn, Ser, His, Val ou Phe. Os exemplos de canônicas para CDRL2 como apresentadas na SEQ ID NO: 5, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ ID NO: 9 ou uma CDR correspondente são: Ala 51 é substituído por Thr, Gly ou Val. Os exemplos de canônicas para CDRL3 como apresentadas na SEQ ID NO: 6, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ ID NO: 9 ou uma CDR correspondente são: Gln 89 é substituído por Ser, Gly, Phe ou Leu; His 90 é substituído por Gln ou Asn; His 91 é substituído por Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, Thr, Tyr ou Val; Tyr 92 é substituído por Asn, Trp, Thr, Ser, Arg, Gln, His, Ala ou Asp; Gly 93 é substituído por Glu, Asn, His, Thr, Ser, Arg ou Ala; Ala 94 é substituído por Asp, Tyr, Thr, Val, Leu, His, Asn, Ile, Trp, Pro —ouSer,e/ouLeu 596 é substituído por Pro, Tyr, Arg, Ile, Trp ou Phe. Os exemplos de canônicas para CDRH1 como apresentadas na SEQ ID NO: 11, uma variante desta, a CDRH1 da SEQ ID NO: 17 ou uma CDR correspondente são: Tyr 32 é substituído por Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu ou Asp; Trp 33 é substituído por Tyr, Ala, Gly, Thr, Leu ou Val;
Met 34 é substituído por Ile, Val ou Trp; e/ou His 35 é substituído por Glu, 7 Asn, Gln, Ser, Tyr ou Thr. - Os exemplos de canônicas para CDRH2 como apresentadas na SEQ ID NO: 12, uma variante desta, a CDRH1 da SEQ ID NO: 17 ou uma —CDR correspondente são: Met 50 é substituído por Arg, Glu, Trp, Tyr, Gly, Gln, Val, Leu, Asn, Lys ou Ala; NleS1 é substituído por Leu, Val, Thr, Ser ou Asn; His 52 é substituído por Asp, Leu, Asn, Ser ou Tyr; Asn 53 é substituído por Ala, Gly, Tyr, Ser, Lys ou Thr; Ser 54 é substituído por Asn, Thr, Lys, Asp ou Gly; Asn 56 é substituído por Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Val, Ser ou —Ala;e/ouAsn58 é substituído por Lys, Thr, Ser, Asp, Arg, Gly, Phe ou Tyr.
Os exemplos de canônicas para CDRH3 como apresentadas na SEQ ID NO: 13, uma variante desta, a CDRHI da SEQ ID NO: 17 ou uma CDR correspondente são: Val 102 é substituído por Tyr, His, Ile, Ser, Asp ou Gly.
Os exemplos de canônicas para CDRL1 como apresentadas na SEQ ID NO: 14, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ ID NO: 19 ou uma CDR correspondente são: Asn 28 é substituído por Ser, Asp, Thr ou Glu; Val 29 é substituído por Ile; Asn 30 é substituído por Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Ser, Phe, His, Gly ou Thr; Ser 31 é substituído por Asn, Thr, Lys ou Gly; Asn 32 é substituído por Phe, Tyr, Ala, His, Ser ou Arg; Val 33 é substituído por Met, Leu, Ile ou Phe; Ala 34 é substituído por Gly, Asn, Ser, His, Val ou Phe.
Os exemplos de canônicas para CDRL2 como apresentadas na SEQ ID NO: 15, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ ID NO; 19 ou uma CDR correspondente são: Ala 51 é substituído por Thr, Gly ou Val, Os exemplos de canônicas para CDRL3 como apresentadas na SEQ ID NO: 16, uma variante desta, a CDRL1 da SEQ 1D NO: 19 ou uma CDR correspondente são: Gln 89 é substituído por Ser, Gly, Phe ou Leu; Gln 90 é substituído por Asn ou His; Cys 91 é substituído por Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, His, Thr, Tyr ou Val; Asn 92 é substituído por Tyr, Trp, Thr, Ser,
Arg, Gln, His, Ala ou Asp; Asn 93 é substituído por Glu, Gly, His, Thr, Ser, 7 Arg ou Ala; Tyr 94 é substituído por Asp, Thr, Val, Leu, His, Asn, Ile, Trp, . Pro ou Ser; e/ou Phe 96 é substituído por Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile ou Trip. Podem haver posições canônicas de CDR variante múltiplas porCDR, por CDR correspondente, por unidade de ligação, por região variável de cadeia pesada ou leve, por cadeia pesada ou leve, e por proteína de ligação de antígeno, e portanto qualquer combinação de substituição pode ser apresentada na proteína de ligação de antígeno da invenção, contanto que a estrutura canônica da CDR seja mantida tal que a proteína de ligação de antígeno seja capaz de ligar especificamente SAP.
Como debatido acima, a classe de estrutura canônica particular de uma CDR é definida tanto pelo comprimento da CDR quanto pelo empacotamento da alça, determinada pelos resíduos localizados nas posições chave em ambas as CDRs e nas regiões de estrutura.
Assim além das CDRs listadas na SEQ ID NO: 1-6 ou 11-16, CDRs da SEQ ID NO; 7, 9, 17 ou 19, CDRs correspondentes, unidades de ligação, ou variantes destas, os resíduos da estrutura canônica de uma proteína de ligação de antígeno da invenção podem incluir (usando a numeração de Kabat): Cadeia pesada: Val, Ile ou Gly na posição 2; Leu ou Val na posição 4; Leu, Ile, Met ou Val na posição 20; Cys na posição 22; Thr, Ala, Val, Gly ou Ser na posição 24; Gly na posição 26; Ile, Phe, Leu ou Ser na posição 29; Trp na posição 36; Trp ou Tyr na posição 47; Ile, Met, Val ou Leu na posição 48; Tle, Leu, Phe, Met ou Val na posição 69; Val, Ala ou Leu na —posição7l; Ala, Leu, Val, Tyr ou Phe na posição 78; Leu ou Met na posição 80; Tyr ou Phe na posição 90; Cys na posição 92; e/ou Arg, Lys, Gly, Ser, His ou Asn na posição 94, Cadeia leve: Ile, Leu ou Val na posição 2; Val, Gln, Leu ou Glu na posição 3; Met ou Leu na posição 4; Cys na posição 23; Trp na posição 35; Tyr, Leu ou Phe na posição 36; Leu, Arg ou Val na posição 46; 7 Tyr, His, Phe ou Lys na posição 49; Tyr ou Phe na posição 71; Cys na posição - 88; e/ou Phe na posição 98, Em uma forma de realização particular, a estrutura de cadeia —pesadacompreende os seguintes resíduos: Val na posição 2, Leu na posição 4, Val na posição 20, Cys na posição 22, Ala na posição 24, Gly na posição 26, Phe na posição 29, Trp na posição 36, Trp na posição 47, Met na posição 48, Tle na posição 69, Ala na posição 71, Ala na posição 78, Met na posição 80, Tyr na posição 90, Cys na posição 92, e Arg na posição 94; e a estrutura da cadeia leve compreende os seguintes resíduos: Ile na posição 2, Gn na posição 3, Mei na posição 4, Cys na posição 23, Trp na posição 35, Tyr na posição 36, Leu na posição 46, His na posição 49, Phe na posição 71, Cys na posição 88, e Phe na posição 98.
Qualquer uma, qualquer combinação, ou todas das posições de estrutura descritas acima podem estar presentes na proteína de ligação de antígeno da invenção. Pode haver posições canônicas de estrutura variante múltipla por região variável de cadeia pesada ou leve, por cadeia pesada ou leve, e por proteína de ligação de antígeno, e portanto qualquer combinação pode estar presente na proteína de ligação de antígeno da invenção, contanto —queaestruturacanônica da estrutura seja mantida.
O domínio variável de cadeia pesada humanizado pode compreender as CDRs listadas na SEQ ID NO: 1-3; CDRs variantes; CDRs correspondentes na SEQ ID NO: 7; unidades de ligação; ou variantes destas, dentro de uma estrutura de anticorpo aceitador tendo 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85% ou maior, 90% ou maior, 95 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade nas regiões de estrutura com a sequência de domínio variável aceitadora humana na SEQ ID NO: 25, O domínio variável de cadeia leve humanizado pode compreender as CDRs listadas na SEQ ID NO: 4-6; CDRs variantes; CDRs correspondentes na SEQ ID NO: 9; unidades de ligação; ou variantes destas, dentro de uma estrutura de anticorpo aceitador 7 tendo 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % - ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade nas regiões de estrutura com a sequência de domínio variável aceitadora humana na SEQ IDNO:32, O domínio variável de cadeia pesada humanizado pode compreender as CDRs listadas na SEQ ID NO: 11-13; as CDRs variantes; CDRs correspondentes na SEQ ID NO: 17; unidades de ligação; ou variantes destas, dentro de uma estrutura de anticorpo aceitador tendo 75 % ou maior, 80% ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade nas regiões de estrutura com a sequência de domínio variável aceitadora humana na SEQ 1D NO: 25. O domínio variável de cadeia leve humanizado pode compreender as CDRs listadas na SEQ ID NO: 14-16; CDRs variantes; CDRs correspondentes na 15º SEQID NO: 19; unidades de ligação; ou variantes destas, dentro de uma estrutura de anticorpo aceitador tendo 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade nas regiões de estrutura com a sequência de domínio variável aceitadora humana na SEQ ID NO: 32.
A invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada da qualquer uma da SEQ ID NO: 27-
31. A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma região variável de cadeia leve selecionada da qualquer uma da SEQ ID NO: 34-36. Qualquer —umadasregiões variáveis de cadeia pesada pode ser combinada com qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve.
A proteina de ligação de antígeno pode compreender qualquer uma das seguintes combinações da região variável de cadeia pesada e cadeia leve: HOLO (SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 34), HOL1 (SEQ ID NO: 27 é
SEQ ID NO: 35), HOL2 (SEQ ID NO: 27 e SEQ TD NO: 36), H1LO0 (SEQ ID 7 NO: 28 e SEQ ID NO: 34), HIL1 (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 35), HIL2 - (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 36), H2L0 (SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 34), H2L1 (SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO; 35), H2L2 (SEQ ID NO: 29 e SEQIDNO:36), HE3LO0(SEQ ID NO: 30 e SEQID NO: 34), HBLI (SEQID NO: 30 e SEQ ID NO: 35), H3L2 (SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 36), HALO (SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 34), H4L1 (SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 35), ou H4L2 (SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 36).
A invenção também fornece uma proteína de ligação de antígeno que especificamente se liga ao SAP e compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada da qualquer uma da SEQ ID NO: 37- 40, A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 ou SEQ ID NO: 74. Qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada pode ser combinada —comqualquer um das regiões variáveis de cadeia leve.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender qualquer uma das seguintes combinações de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve: HOLO (SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 41), HOL1 (SEQ ID NO; 37 e SEQ ID NO: 42), HILO0 (SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 41), HILI (SEQIDNO:38eSEQID NO: 42), F2LO (SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 41), H2L1 (SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO; 42), HE3LO (SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41), ou H3L1 (SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 42).
LO (SEQ ID NO: 41) pode ser substituído com LO 91 A (SEQ ID NO: 74). A região variável de cadeia pesada de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade com à SEQ ID NO: 28. A região variável de cadeia leve de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % 7 ou maior, ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 35.
- A região variável de cadeia pesada de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 %ou maior, 97% ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 40. A região variável de cadeia leve de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior, ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 41. A região variável de cadeia leve de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior, ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 74.
A região variável de cadeia pesada de anticorpo pode ser uma variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 27-31 que contém 30, 25, 20, 15, 10,9,8,7,6,5,4,3,2 ou 1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido, A região variável de cadeia leve de anticorpo pode ser uma variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 34 a 36 que contém 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido.
A região variável de cadeia pesada de anticorpo pode ser uma variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 37 a 40 que contém 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido, A região variável de cadeia leve de anticorpo pode ser uma variante da SEQ ID NO: 41, 42 ou 74 que contém 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6,5,4,3,20u1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido.
Por exemplo, as substituições de CDRs canônicas e resíduo de estrutura canônica descritas acima também podem estar presentes nas regiões variáveis de cadeia pesada ou leve variantes como sequências variantes que são pelo menos 75 % idênticas ou que contém até 30 substituições de aminoácido. 7 Qualquer uma das regiões variáveis de cadeia pesada podem - ser combinadas com uma região constante humana adequada.
Qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve podem ser combinadas com uma região constanteadequada.
A proteína de ligação de antígeno da invenção pode compreender uma cadeia pesada da SEQ ID NO: 62 e/ou uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 64. A cadeia pesada de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85% ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior ou 100 % de identidade com a SEQ ID NO: 62. A cadeia leve de anticorpo pode ter 75 % ou maior, 80 % ou maior, 85 % ou maior, 90 % ou maior, 95 % ou maior, 96 % ou maior, 97 % ou maior, 98 % ou maior, 99 % ou maior, ou 100 % de identidade com a SEQ IDNO:64. A cadeia pesada de anticorpo pode ser uma variante de qualquer uma da SEQ 1D NO: 62 que contém 30, 25, 20, 15, 10,9, 8,7,6,5, 4,3, 2 ou 1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido.
À cadeia leve de anticorpo pode ser uma variante de qualquer uma da SEQ ID NO: 64 — que contém 30, 25,20, 15, 10,9, 8,7,6,5,4,3,2 ou 1 das substituições, inserções ou deleções de aminoácido.
A molécula SAP como disco tem duas faces.
À hélice alfa única presente em cada um dos 5 protômeros está localizada na face A.
A bolsa de ligação de ligando dependente de cálcio de cada protômero está localizada na face B e esta face é portanto ocluída quando SAP é ligado às fibrilas de amiloide.
Para as proteínas de ligação de antígeno da presente invenção terem utilidade terapêutico, o epítopo reconhecido pela proteina de ligação de antígeno aqui descrita é desejavelmente acessível em SAP quando SAP é ligado aos depósitos de amiloide e está portanto localizado na face À ou as bordas da molécula de SAP. A proteína de ligação de antígeno pode 7 depois reconhecer e ligar-se ao SAP ligado ao amiloide, levando à ativação de . complemento que deflagra o mecanismo de depuração dependente de macrófago eficiente do corpo. Consequentemente, em uma forma de S rtealizaçãoda invenção a proteína de ligação de antígeno liga SAP humano que é ligado às fibrilas de amiloide in vivo, Em uma outra forma de realização da invenção, a proteína de ligação de antígeno se liga à face A de SAP humano.
A proteína de ligação de antígeno pode ser derivada de rato, camundongo, coelho, camelo (ou espécie de camelídeo relacionada), ou primata (por exemplo cinomolgo, macaco do velho mundo, Grandes símios ou ser humano). Em uma forma de realização particular a proteína de ligação de antígeno é derivada de camundongo. Em uma outra forma de realização a proteína de ligação de antígeno é derivada de ser humano, À proteína de ligação de antígeno pode ser um anticorpo humanizado ou quimérico. À proteína de ligação de antígeno pode ser um anticorpo humano. A proteina de ligação de antígeno não é um anticorpo de murino.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma região constante, que pode ser de qualquer isótipo ou subclasse. A região constante pode ser do isótipo IgG, por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou variantes destas. À região constante da proteina de ligação de antígeno pode ser IgG].
Em uma forma de realização particular da invenção, a proteína de ligação de antígeno compreende uma região constante que é funcional na —ativaçãode complemento por exemplo IgG1, IgG2 ou IgG3 humanos.
Em uma outra forma de realização da invenção, a proteína de ligação de antígeno compreende uma região constante que é funcional em macrófagos de ligação por exemplo IZgG1 ou IgG3 humanos, Em uma outra forma de realização da invenção, a proteina de ligação de antígeno compreende uma região constante que é funcional tanto ' : no complemento de ativação quanto nos macrófagos de ligação por exemplo - IgG1 ou IgG3 humanos. A proteína de ligação de antígeno pode compreender uma ou mais modificações selecionadas de um domínio constante mutado tal que o anticorpo tenha funções efetoras/ADCC e/ou de ativação de complemento alteradas, Os exemplos de modificações adequadas são descritas em Shields et al. J. Biol. Chem (2001) 276: 6591-6604, Lazar et al. PNAS (2006) 103: 4005-4010 e US6737056, WO2004063351 e WO2004029207.
A proteína de ligação de antígeno pode compreender um domínio constante com um perfil de glicosilação alterado tal que a proteína de ligação de antígeno tenha funções efetoras/ADCC e/ou ativação de complemento alteradas. Os exemplos de metodologias adequadas para produzir uma proteína de ligação de antígeno com um perfil de glicosilação alterado são descritos na WO2003/011878, WO2006/014679 e EP1229125.
Em uma forma de realização da invenção, as proteínas de ligação de antígeno são selecionadas de modo que não tenham resíduos dentro das regiões que são responsáveis pela ligação de antígeno, por exemplo as CDRs, que são suscetíveis à desamidação. Em uma outra forma de realização da invenção, as proteínas de ligação de antígeno são selecionadas de modo que não tenham resíduos dentro das regiões responsáveis pela ativação de complemento que são suscetíveis à desamidação.
A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação de antígeno como aqui descrita.
A molécula de ácido nucleico pode compreender sequências que codificam tanto a variável de cadeia pesada ou sequência de tamanho natural; quanto a variável de cadeia leve ou sequência de tamanho natural, Alternativamente, a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação de antígeno aqui descrita pode compreender sequências que codificam a variável de cadeia pesada ou sequência de tamanho natural; ou variável de cadeia leve ou Í sequência de tamanho natural. - A molécula de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada pode compreender qualgner uma das SEQ ID NOs: 51 ou 53-
57.A molécula de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve pode compreender qualquer uma das SEQ ID NOs: 52 ou 58-60, A molécula de ácido mucleico que codifica a cadeia pesada pode compreender a SEQ ID NO: 61. A molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve pode compreender a SEQ ID NO; 63.
A molécula de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada pode compreender qualquer uma das SEQ ID NOs: 65 ou 67- 70, A molécula de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve pode compreender qualquer uma das SEQ ID NOs: 66 ou 71-73. A molécula de ácido nucleico também pode conter uma ou mais substituições de nucleotídeo que não alteram a sequência de aminoácido da cadeia pesada e/ou leve codificada.
A presente invenção também fornece um vetor de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico como aqui descrita. Também é fornecida uma célula hospedeira recombinante, que compreende um vetorde expressão como aqui descrito.
A proteína de ligação de antígeno aqui descrita pode ser produzida em uma célula hospedeira adequada. Um método para a produção da proteína de ligação de antígeno como aqui descrita pode compreender a etapa de cultivar uma célula hospedeira como aqui descrita e recuperar a proteína de ligação de antígeno. Uma célula hospedeira recombinante transformada, transfectada, ou transduzida pode compreender pelo menos um cassete de expressão, por meio da qual o dito cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada da proteína de ligação de antígeno aqui descrita e compreende ainda um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve da proteína de ligação de antígeno aqui descrita. 7 Altemativamente, uma célula hospedeira recombinante transformada, - transfectada ou transduzida pode compreender pelo menos um cassete de expressão, por meio do qual um primeiro cassete de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada da proteína de ligação de antígeno aqui descrita e compreendem ainda um segundo cassete que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve da proteina de ligação de antígeno aqui descrita.
Uma célula hospedeira estavelmente transformada pode compreender um vetor que compreende um ou mais — cassetes de expressão que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve da proteína de ligação de antígeno aqui descrita.
Por exemplo tais células hospedeiras podem compreender um primeiro vetor que codifica a cadeia leve e um segundo vetor que codifica a cadeia pesada.
A célula hospedeira pode ser eucariótica, por exemplo de mamífero.
Os exemplos de tais linhagens de célula incluem CHO ou NS0. À célula hospedeira pode ser cultivada em um meio de cultura, por exemplo meio de cultura isento de soro.
À proteína de ligação de antígeno pode ser secretada pela célula hospedeira no meio de cultura.
À proteína de ligação de antígeno pode ser purificada até pelo menos 95 % ou maior (por exemplo 98 %ou maior) com respeito ao dito meio de cultura que contém a proteína de ligação de antígeno,
Uma composição farmacêutica que compreende a proteína de ligação de antígeno e um carreador farmaceuticamente aceitável podem ser fornecidos.
Um kit de partes que compreende a composição farmacêutica
—juntocom instruções para o uso pode ser fornecido, Por conveniência, o kit pode compreender os reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para o uso,
Estruturas de Anticorpo Anticorpos Intactos
As cadeias leves de anticorpos da maioria das espécies de 7 vertebrado podem ser designados a um de dois tipos chamados de Capa e - Lambda com base na sequência de aminoácido da região constante. Dependendo da sequência de aminoácido da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos humanos podem ser designados a cinco classes diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgG e IBA pode ser subdividida ainda em subclasses, IzG1, IgG2, IgG3 e IgG4; e IgAl e IgA2. As variantes de espécie existem com camundongo e rato tendo pelo menos IgG2a, IgG2b.
As porções mais conservadas da região variável são chamadas Regiões de Estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve intactas cada uma compreende quatro FRs conectadas por três CDRs. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade imediata pelas regiões de FR e com as CDRs da outra cadeia contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno dos anticorpos, Às regiões constantes não são diretamente envolvidas na ligação do anticorpo ao antígeno mas exibem várias funções efetoras tais como a participação na citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose por intermédio da ligação ao receptor de Fey, meia-vida/taxa de depuração por intermédio do receptor de Fc neonatal (FeRm) e ativação de complemento por intermédio do componente Cla, levando às ações quimiotáticas, opsônicas e, potencialmente no caso de um alvo de antígeno celular viável, citolíticas de complemento. Os anticorpos humanos da classe de IgG1 são os mais potentes na ativação do sistema de complemento e são portanto o isótipo desejável para a aplicação terapêutica —dosanticorpos da presente invenção.
A região constante de 18G2 humana foi relatada essencialmente carecer da capacidade para ativar complemento pelo caminho clássico ou para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A região constante IgG4 foi relatada carecer da capacidade para ativar complemento pelo caminho clássico e medeia a citotoxicidade celular 7 dependente de anticorpo apenas fracamente. Os anticorpos que - essencialmente carecem destas funções efetoras podem ser chamados de anticorpos “não líticos”. — Anticorpos humanos Os anticorpos humanos podem ser produzidos por vários métodos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, Os anticorpos humanos podem ser fabricados pelo método do hibridoma usando mieloma humano ou linhagens de célula de heteromieloma de camundongo-ser humano, ver Kozbor (1984) J. Immunol 133, 3001, e Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker Tnc, 1987). Os métodos alternativos incluem o uso de bibliotecas de fago ou camundongos transgênicos ambos dos quais utilizam repertórios da região variável humana (ver Winter (1994) Annu. Rev. Immunol 12: 433-455; Green (1999), Immunol. Methods 231: 11-23).
Várias cepas de camundongos transgênicos são agora disponíveis em que seus locais de imunoglobulina de camundongo foram substituídos com segmentos do gene da imunoglobulina humana (ver Tomizuka (2000) PNAS 97: 722-727; Fishwild (1996) Nature Biotechnol. 14: 845-851; Mendez (1997) Nature Genetics, 15: 146-156). Na inoculação de antígeno tais camundongos são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos a partir dos quais os anticorpos de interesse podem ser selecionados.
A tecnologia de demonstração de fago pode ser usada para —produzirproteínas de ligação de antígeno humanas (e fragmentos destas), ver McCafferty (1990) Nature 348: 552-553 e Griffiths er al. (1994) EMBO 13: 3245-3260.
À técnica de maturação por afinidade (Marks Bio/technol (1992) 10: 779-783) pode ser usada para melhorar a afinidade de ligação em que a afinidade do anticorpo humano primário é melhorado pela substituição 7 sequencial das regiões variáveis de cadeia pesada (H) e leve (L) com variantes - que ocorrem naturalmente e selecionando na base de afinidades de ligação melhoradas. Variantes desta técnica tais como “impressão de epítopo” são agora também disponíveis, ver por exemplo WO 93/06213; Waterhouse (1993) Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266, Anticorpos Quiméricos e Humanizados Os anticorpos quiméricos são tipicamente produzidos usando métodos de DNA recombinantes. O DNA que codifica os anticorpos (por exemplo cDNA) é isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo usando-se sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação especificamente aos genes que codificam as cadeias He L do anticorpo. As células de hibridoma servem como uma fonte típica de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA é colocado em vetores de expressão que são depois transfectados em células hospedeiras tais como E. coli, células COS, células CHO ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina para obter a síntese do anticorpo. O DNA pode ser modificado pela substituição da sequência codificadora para cadeias L e H humanas para as regiões constantes não humanas (por exemplo de murino) H eL correspondentes, ver por exemplo Morrison (1984) PNAS 81: 6851.
Uma diminuição grande na imunogenicidade pode ser obtida apenas pelo enxerto das CDRs de anticorpos não humanos (por exemplo de murino) (anticorpos “doadores”) na estrutura humana (“estrutura aceitadora”) e regiões constantes para gerar anticorpos humanizados (ver Jones ef al.
(1986) Nature 321: 522-525; e Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534- 1536). Entretanto, o enxerto de CDR por si pode não resultar na retenção completa de propriedades de ligação de antígeno e é frequentemente encontrado que alguns resíduos de estrutura (algumas vezes aludidas como “retro mutações”) do anticorpo doador necessitam ser preservadas na molécula humanizada se afinidade de ligação de antígeno significante deva 7 ser recuperada (ver Queen et a/. (1989) PNAS 86: 10.029-10.033: Co et al, - (1991) Nature 351: 501-502). Neste caso, as regiões variáveis humanas que mostram a maior homologia de sequência para o anticorpo humano não — doador são escolhidas à partir de uma base de dados de modo a fornecer a estrutura humana (FR). À seleção de FRs humanos podem ser fabricados de anticorpos de consenso humano ou anticorpos individuais humanos.
Onde necessário, os resíduos chave do anticorpo doador podem ser substituídos na estrutura aceitadora humana para preservar conformações de CDR.
A modelagem de computador do anticorpo podem ser usados para ajudar a identificar tais resíduos estruturalmente importantes, ver a WO 99/48523. Alternativamente, a humanização pode ser obtida por um processo de “embutimento”. Uma análise estatística de regiões de cadeia pesada e leve variáveis únicas de imunoglobulina humana e de murino revelaram que os padrões precisos de resíduos expostos são diferentes em anticorpos de ser humano e de murino, e a maioria das posições de superfície de indivíduo têm uma preferência forte para um número pequeno de resíduos diferentes (ver Padlan et al. (1991) Mol.
Immunol. 28: 489-498; e Pedersen er al. (1994) TJ.
Mol.
Biol. 235: 959-973). Portanto é possível para reduzir a —imunogenicidade de um Fv não humanos pela substituição de resíduos expostos nas suas regiões de estrutura que diferem daqueles usualmente encontrados em anticorpos humanos.
Porque a antigenicidade da proteína pode ser correlacionada com a acessabilidade da superfície, a substituição dos resíduos de superfície podem ser suficientes para tornar a região variável de — camundongo “invisível” para o sistema imune humano (ver também Mark ef al. (1994) em Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113: The pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, 105-134), Este procedimento de humanização é aludido como “embutimento” porque apenas a superfície do anticorpo é alterada, os resíduos de sustentação permanecem não perturbados. Outros métodos alternativos incluem aqueles apresentados : na WO04/006955 e o procedimento de Humaneering” (Kalobios) que faz uso - de sistemas de expressão bacteriana e produzem anticorpos que estão próximos da linha germinativa humana na sequência (Alfenito-M Advancing — Protein Therapeutics Janeiro de 2007, San Diego, Califórnia). Proteínas de ligação de antígeno biespecíficas .
Uma proteína de ligação de antígeno biespecífica é uma proteína de ligação de antígeno tendo especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes. Métodos de fabricar tais proteínas de ligação de antígeno são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de proteínas de ligação de antígeno biespecíficas é : fundamentada na coexpressão de dois pares de cadeia H-cadeia L da imunoglobulina, onde as duas cadeias H têm especificidades de ligação diferentes, ver Millstein ef al. (1983) Nature 305: 537-539; WO 93/08829; e —Trauneoker er al. (1991) EMBO 10: 3655-3659. Por causa da escolha aleatória de cadeias H e L, uma mistura potencial de dez estruturas de anticorpo diferentes são produzidas das quais apenas uma tem a especificidade de ligação desejada. Um método alternativo envolve fundir os domínios variáveis com as especificidades de ligação desejadas à região constante da cadeia pesada que compreende pelo menos parte da região de dobradiça, regiões CH2 e CH3. A região CH1 que contém o sítio necessário para a ligação de cadeia leve pode estar presente em pelo menos uma das fusões. O DNA que codifica estas fusões, é se desejado a cadeia L são inseridos em vetores de expressão separados e são depois cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. É possível entretanto inserir as sequências codificadoras em duas ou todas as três cadeias em um vetor de expressão. Em um método, o anticorpo biespecífico é composto de uma cadeia H com uma primeira especificidade de ligação em um ramo e um par de cadeia H-L, fornecendo uma segunda especificidade de ligação no outro ramo, ver a WO 94/04690, Também ver Suresh er al. (1986) Methods in 7 Enzymology 121: 210.
- Fragmentos de Ligação de Antígeno Fragmentos que carecem da região constante carecem da — capacidade para ativar complemento pelo caminho clássico ou para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Tradicionalmente tais fragmentos são produzidos pela digestão proteolítica de anticorpos intactos por exemplo pela digestão com papaína (ver por exemplo, a WO 94/29348) mas pode ser produzida diretay a partir das células hospedeiras —recombinantemente transformadas. Para a produção de ScFv, ver Bird et al. (1988) Science 242: 423-426. Além disso, fragmentos de ligação de antígeno podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas de engenheiramento como descritas abaixo, Os fragmentos de Fv parecem ter energia de interação mais baixa de suas duas cadeias do que os fragmentos de Fab. Para estabilizar a associação dos domínios VH e VL, eles foram ligados com peptídeos (Bird er al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) PNAS 85(16): 5879- 5883), pontes de dissulfeto (Glockshuber er al, (1990) Biochemistry 29: 1362- 1367) e mutações de “knob in hole” (Zhu er al. (1997) Protein Sci., 6: 781- 788) Os fragmentos de ScFv podem ser produzidos pelos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, ver Whitlow ef al. (1991) Methods Companion Methods Enzymol, 2: 97-105 e Huston er al. (1993) Int. Rev. Immunol 10: 195-217. ScFv pode ser produzido em células bacterianas tais como E. coli ou em células eucarióticas. Uma desvantagem de ScFv é a —monovalência do produto, que impede uma avidez aumentada devido à ligação polivalente, e a sua meia-vida curta. Tentativas para superar estes problemas incluem (ScFv*)2 bivalente produzido a partir de ScFy que contém uma cisteína de terminal C adicional pela ligação química (Adams ef al. (1993) Can. Res 53: 4026-4034; e McCartney et al. (1995) Protein Eng. 8:
301-314) ou pela dimerização específica de sítio espontânea de ScFv que ' contém um resíduo de cisteína de terminal C não emparelhado (ver - Kipriyanov ef al. (1995) Cell. Biophys 26: 187-204). Alternativamente, ScFv pode ser forçado a formar multímeros pelo encurtamento do ligador de —peptídeo para3 a 12 resíduos para formar “diacorpos”, ver Holliger er al. (1993) PNAS 90: 6444-6448. Reduzindo o ligador pode resultar além disso em trímeros de ScFv (“triacorpos”, ver Kortt er al. (1997) Protein Eng 10: 423-433) e tetrâmeros (“tetracorpos”, ver Le Gall et al. (1999) FEBS Lett, 453: 164-168). A construção de moléculas de ScFv bivalentes também pode ser obtida pela fusão genética com motivos que dimerizam proteína para formar “minianticorpos” (ver Pack et al. (1992) Biochemistry 31: 1579-1584) e “minicorpos” (ver Hu er al. (1996) Cancer Res. 56: 3055-3061). Tandens de ScFv-Se-Fv ((ScFV)2) também podem ser produzidos pela ligação de duas unidades de ScFv por um terceiro peptídeo ligador, ver Kurucz et al. (1995) IJ.
Immol., 154: 4576-4582. Os diacorpos biespecíficos podem ser produzidos através da associação não covalente de produtos de fusão de duas cadeias simples que consiste do domínio VH de um anticorpo conectado por um ligador curto ao domínio VL de um outro anticorpo, ver Kipriyanov et al. (1998) Int. J. Can 77: 763-772. A estabilidade de tais diacorpos biespecíficos — pode ser realçada pela introdução de pontes de dissulfeto ou mutações “knob in hole” como descrito acima ou pela formação de diacorpos de cadeia simples (ScDb) em que dois fragmentos de ScFv híbridos são conectados através de um ligador peptídico ver Kontermann et al. (1999) J. Immunol. Methods 226: 179-188. Moléculas biespecíficas tetravalentes são disponíveis por exemplo pela fusão de um fragmento ScFv ao domínio CH3 de uma molécula de IgG ou a um fragmento de Fab através da região de dobradiça, ver Coloma et al. (1997) Nature Biotechnol. 15: 159-163. Altenativamente, moléculas biespecíficas tetravalentes foram criadas pela fusão de diaçorpos de cadeia simples biespecíficos (ver Alt et al. (1999) FEBS Lett 454: 90-94, As moléculas biespecíficas tetravalentes menores também podem ser formadas 7 pela dimerização de tandens de ScFv-ScFv com um ligador que contém um - motivo de hélice-alça-hélice (minianticorpos DIBi, ver Muller er al. (1998) FEBS Lett 432: 45-49) ou uma molécula de cadeia simples que compreende — quatro domínios variáveis de anticorpo (VH e VL) em uma orientação que previne o emparelhamento intramolecular (diacorpo em tandem, ver Kipriyanov et al. (1999) J.
Mol.
Biol. 293: 41-56). Fragmentos de F(ab”)2 biespecíficos podem ser criados pela ligação quimica de fragmentos Fab' ou pela heterodimerização através de zípers de leucina (ver Shalaby et al, (1992) SJ Exp.
Med, 175: 217-225; e Kostelny et al. (1992), ]. Immunol. 148: 1547- 1553). Também são disponíveis domínios VH e VL isolados (Domantis plc), ver a US 6.248.516, US 6.291.158, e US 6.172.197. Anticorpos Heteroconjugados Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos covalentemente unidos formados usando qualquer um dos métodos de reticulação convenientes.
Ver, por exemplo, a US 4.676.980. Outras Modificações As proteínas de ligação de antígeno da presente invenção pode compreender outras modificações para realçar ou mudar as suas funções efetoras.
Acredita-se que a interação entre a região Fc de um anticorpo e vários receptores de Fc (FeyR) medeiem as funções efetoras do anticorpo que incluem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), a fixação de complemento, a fagocitose e a meia-vida/depuração do anticorpo.
Várias modificações para a região Fc de anticorpos pode ser realizada dependendo da — propriedade desejada.
Por exemplo, mutações específicas na região Fc para tornar um anticorpo de outro modo lítico, não lítico são detalhadas na EP 0629240 e EP 0307434 ou pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo para aumentar a meia vida sérica ver a US 5.739.277. os receptores Fey humanos incluem FeyR (D, FeyRIla,
FceyRIIb, FeyRIMa e FcRn neonatal.
Shields et al. (2001) J, Biol.
Chem 276: Í 6591-6604 demonstraram que um conjunto comum de resíduos de IZgG1 está - envolvido na ligação de todos FoyRs, enquanto que FeyRI e FeyRII utilizam sítios distintos fora deste conjunto comum.
Um grupo de resíduos de IgG1 reduziram a ligação a todos FoyRs quando alterados para alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 e Pro-239. Todos estão no domínio CH2 da IgG e agrupados próximos da junção de dobradiça CH1 e CH2. Enquanto FeyRI utiliza apenas o conjunto comum de resíduos de I2G1 para a ligação, FoeyRI e FoyRIMI interagem com resíduos distintos além do conjunto comum.
À alteração de alguns residuos reduziu a ligação apenas para FeyRII (por exemplo Arg-292) ou FceyRIII (por exemplo Glu-293). Algumas variantes apresentaram ligação melhorada ao FeyRII ou FeyRIII mas não afetaram a ligação ao outro receptor (por exemplo Ser-267Ala melhorou a ligação ao FeyRII mas a ligação ao FeyRIII não foi afetada). Outras variantes exibiram ligação melhorada ao FeyRII ou FeyRIM com redução na ligação ao outro receptor (por exemplo Ser-298Ala melhorou a ligação ao FeyRII e reduziu a ligação ao FeyRIL). Para FceyRIMa, a melhor ligação de variantes de IgG1 teve substituições de alanina combinadas em Ser-298, Glu-333 e Lys-334. A credita-se que o receptor de FcRn neonatal esteja envolvido tanto na depuração de anticorpo quanto na transcitose através dos tecidos (ver Junghans (1997) Immunol.
Res 16: 29-57; e Ghetie et al. (2000) Annu.
Rev.
Immunol. 18: 739-766). Os resíduos de IgG] humana determinados interagir diretamente com FcRn humano incluem Tle253, Ser254, Lys288, Thr307, Gin311, Asn434 e His435, As substituições em qualquer uma das posições descritas nesta seção podem permitir meia-vida sérica aumentada e/ou propriedades efetoras alteradas dos anticorpos, Outras modificações incluem variantes de glicosilação dos anticorpos.
A glicosilação de anticorpos em posições conservadas nas suas regiões constantes é conhecida ter um efeito profundo sobre a função de anticorpo, particularmente sobre o funcionamento efetor tal como aqueles í descritos acima, ver por exemplo, Boyd et al. (1996) Mol.
Immunol., 32: - 1311-1318. As variantes de glicosilação dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno em que uma ou mais das porções de carboidrato são adicionadas, substituídas, apagadas ou modificadas são consideradas.
À introdução de um motivo de asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina cria um sítio potencial para a ligação enzimática de porções de carboidrato e pode portanto ser usada para manipular a glicosilação de um anticorpo.
Em Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876 a sialilação de terminal de uma imunoadesina TNFR-IgG foi aumentada através de um processo de regalactosilação e/ou resialilação usando beta-l1, 4-galactosiltransferase e/ou alfa, 2,3 sialiltransferase.
Acredita-se que aumentar a sialilação de terminal aumente a meia-vida da imunoglobulina.
Anticorpos, em comum com a maioria das glicoproteínas, são tipicamente produzidos como uma mistura de glicoformas.
Esta mistura é particularmente evidente quando anticorpos são produzidos em células eucarióticas, particularmente de mamífero.
Uma variedade de métodos foram desenvolvidos para a fabricação de glicoformas definidas, ver Zhang ef al. (2004) Science 303: 371: Sears ef al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem.
Rev. 102: 579; Hang er al, (2001) Aco.
Chem.
Res 34: 727. Os anticorpos (por exemplo do siotipo IgG, por exemplo IgG1l) como aqui descrito pode compreender um número definido (por exemplo 7 ou menos,
por exemplo 5 ou menos, tal como duas ou uma única) de glicoformas.
Os anticorpos podem ser ligados a um polímero não —proteináceo tal como polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquileno.
A conjugação de proteínas ao PEG é uma técnica estabelecida para aumentar a meia-vida de proteínas, assim como reduzir a antigenicidade e imunogenicidade de proteínas, O uso da PEGuilação com pesos moleculares e estilos (linear ou ramificado) diferentes foi investigado
' com anticorpos intactos assim como fragmentos de Fab”, ver Koumenis et al.
7 (2000) Int. J. Pharmaceut. 198: 83-95.
- Métodos de Produção As proteínas de ligação de antígeno podem ser produzidas em organismos transgênicos tais como cabras (ver Pollock er al. (1999) 1. Immunol. Methods 231: 147-157), galinhas (ver Morrow (2000) Genet.) Eng. News 20: 1-55, camundongos (ver Pollock er al.) ou plantas (ver Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601- 606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol 42: 583-590).
As proteínas de ligação de antígeno também podem ser produzidas pela síntese química. Entretanto, as proteínas de ligação de antígeno são tipicamente produzidas usando tecnologia de cultivar de célula recombinante bem conhecida por aqueles habilitados na técnica. Um —polinucleotídeo que codifica a proteína de ligação de antígeno é isolado e inserido em um vetor replicável tal como um plasmídeo para clonagem (amplificação) ou expressão adicionais. Um sistema de expressão é um sistema da glutamato sintetase (tal como vendido pela Lonza Biologics), particularmente quando a célula hospedeira é CHO ou NS0. O i 20 —polinucleotídeo que codifica a proteina de ligação de antígeno é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo sondas de oligonucleotídeo). Os vetores que podem ser usados incluem plasmídeo, vírus, fago, transposons, minicromossomas dos quais os plasmídeos são tipicamente usados. No geral tais vetores incluem ainda uma sequência de sinal, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento realçador, um promotor e sequências de terminação de transcrição operavelmente ligadas ao polinucleotídeo da proteína de ligação de antígeno de modo a facilitar a expressão. O polinucleotídeo que codifica as cadeias leve e pesada pode ser inserido em vetores separados e introduzidos (por
" exemplo pela transformação, transfecção, eletroporação ou transdução) dentro Í da mesma célula hospedeira concorrente ou sequencialmente ou, se desejado, = tanto a cadeia pesada quanto a cadeia leve podem ser inseridas dentro do mesmo vetor antes da dita introdução.
A otimização de códon pode ser usada com a intenção de que o nível total de proteína produzida pela célula hospedeira seja maior quando transfectada com o gene otimizado no códon em comparação com o nível quando transfectada com a sequência.
Vários métodos foram publicados (Nakamura er al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 214-215; WO 98/34640; WO 97/11086). Devido à redundância do código genético, polinucleotídeos alternativos a aqueles aqui divulgados (particularmente aqueles otimizados no códon para a expressão em uma dada célula hospedeira) também pode codificar as proteínas de ligação de antígeno aqui descritas.
O uso de códon da proteína de ligação de antígeno desta invenção portanto pode ser modificado para acomodar tendências de códon da célula hospedeira tal como para aumentar o transcrito e/ou rendimento de produto (por exemplo Hoekema ef al Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24). A escolha de códons pode ser fundamentada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para a expressão, —Sequênciasde Sinal As proteínas de ligação de antígeno podem ser produzidas como uma proteína de fusão com uma sequência de sinal heteróloga tendo um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína madura.
A sequência de sinal deve ser reconhecida e processada pela célula hospedeira, Para as — células hospedeiras procariótica, a sequência de sinal pode ser por exemplo uma fosfatase alcalina, penicilinase, ou líderes da enterotoxina II estável ao calor.
Para a secreção de levedura as sequências de sinal podem ser por exemplo um líder da invertase de levedura, líder do fator a ou líderes da fosfatase ácida ver por exemplo a WO 90/13646. Em sistemas de célula de
' mamífero, os líderes secretores virais tais como o sinal gD do herpes simples Í e uma sequência de inal da imunoglobulina nativa podem ser adequados. - Tipicamente a sequência de sinal é ligada na estrutura de leitura ao DNA que codifica a proteína de ligação de antígeno.
Uma sequência de sinal de murino —talcomoaquelamostradana SEQ ID NO: 79 pode ser usada.
Origem de replicação A origem de replicações é bem conhecida na técnica com PBR322 adequado para a maioria das bactérias gram-negativas, o plasmídeo 24 para a maioria das leveduras e várias origens virais tais como SV40, —polioma, adenovirus, VSV ou BPV para a maioria das células de mamífero.
No geral o. componente de origem de replicação não é necessário para os vetores de expressão de mamífero mas o SV40 pode ser usado vosto que o mesmo contém o promotor inicial.
Marcador de seleção Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência aos antibióticos ou outros toxinas por exemplo ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina ou (b) deficiências auxiotróficas de complemento ou nutrientes de abastecimento não disponíveis no meio complexo ou (c) combinações de ambos.
O esquema de seleção pode envolver parar o crescimento da célula hospedeira.
As células, que foram transformadas com êxito com os genes que codificam a proteína de ligação de antígeno, sobrevivem devido por exemplo à resistência a medicamento conferida pelo marcador de seleção coliberado.
Um exemplo é o marcador de seleção DHFR em que os transformantes são cultivados na presença de —metotrexato.
As células podem ser cultivadas na presença de quantidades crescentes de metotrexato para amplificar o número de cópia do gene exógeno de interesse.
As células CHO são uma linhagem de célula particularmente útil para a seleção de DHFR, Um outro exemplo é o sistema de expressão da glutamato sintetase (Lonza Biologics). Um exemplo de um gene de seleção
7 para o uso em levedura é o gene trp1, ver Stinchoomb et al, (1979) Nature ' 282:38. ” Promotores Os promotores adequados para expressar proteínas de ligação de antígeno são operavelmente ligados ao DNA/polinucleotideo que codificam a proteína de ligação de antígeno. Os promotores para os hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas de promotor de beta-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, triptofano e promotores híbridos tais como Tac. Os promotores adequados para a expressão em células de levedura incluem a 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas por exemplo enolase, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose 6 fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase e glicocinase. Os promotores de levedura indutíveis incluem a álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, metalotioneína e enzimas responsáveis pelo metabolismo de nitrogênio ou utilização de maltose/galactose.
Os promotores para a expressão em sistemas de célula de mamífero incluem promotores virais tais como polioma, epitelioma contagioso dos galináceos e adenovírus (por exemplo adenovirus 2), vírus do.
—papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus (em particular o promotor do gene inicial imediato), retrovírus, vírus da hepatite B, actina, promotor do vírus do sarcoma de rous (RSV) e o vírus Símio 40 inicial ou tardio, Naturalmente a escolha do promotor está fundamentada na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para a expressão.
—Umprimeiroplasmídeo pode compreender um promotor RSV e/ou SV40 e/ou CMV, o DNA que codifica a região variável de cadeia leve (VL), à região xC junto com marcadores de seleção de resistência à neomicina e ampíicilina e um segundo plasmídeo que compreende um promotor de RSV ou SV40, o DNA que codifica à região variável de cadeia pesada (VM), o DNA que
' codifica a região constante y1, DHFR e marcadores de resistência à ' ampicilina. . Elemento Realçador
Onde apropriado, por exemplo para a expressão em eucariotas superiores, um elemento realçador operavelmente ligado ao elemento promotor em um vetor pode ser usado.
As sequências realçadoras de mamífero incluem elementos realçadores de globina, elastase, albumina, fetoproteína e insulina.
Alternativamente, pode-se usar um elemento realçador de um vírus de célula eucariótica tal como o realçador de SV40 (em 100 a 270 pares de base), realçador do promotor inicial de citomegalovirus, realçador de polioma, realçador baculoviral ou local IgG2a de murino (ver a WO 04/009823). O realçador pode estar localizado no vetor em um sítio a montante do promotor, Alternativamente, o realçador pode estar localizado em qualquer lugar, por exemplo dentro da região não traduzida ou a montante do sinal de poliadenilação.
A escolha e posicionamento do realçador podem estar fundamentados na compatibilidade e adequada com a célula hospedeira usada forpara a expressão,
Poliadenilação/terminação Em sistemas eucarióticos, os sinais de poliadenilação são —operavelmente ligados ao DNA/polinucleotídeo que codifica à proteína de ligação de antígeno.
Tais sinais são tipicamente colocados a 3º da estrutura de leitura aberta.
Em sistemas de mamífero, os exemplos não limíitantes incluem sinais derivados de hormônios do crescimento, fator-1 alfa de alongamento e genes virais (por exemplo SV40) ou repetições de terminal longo retrovirais.
Em sistéemas de levedura não limitantes os exemplos de sinais de polidenilação/terminação incluem aqueles derivados da fosfoglicerato cinase (PGK) e os genes da álcool desidrogenase 1 (ADH). Em sistemas procarióticos, os sinais de poliadenilação tipicamente não são requeridos e ao invés é usual utilizar sequências terminadoras mais curtas e mais definidas, À
S7 ' escolha de sequências de poliadenilação/terminação pode estar fundamentada ' na compatibilidade adequada com a célula hospedeira usada para a expressão. . Outro métodos/elementos para rendimentos realçados Além do acima, outras características que podem ser utilizadas S — pararealçar rendimentos incluem os elementos de remodelagem da cromatina, introns e modificação de códon específico da célula hospedeira. Células hospedeiras As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou vetores de expressão que codificam proteínas de ligação de antígeno são células —procariótica, levedura ou eucariótica superior. As células procarióticas adequadas incluem eubactérias por exemplo enterobacteriaceae tais como Escherichia por exemplo E. coli (por exemplo ATCC 31,446; 31.537;
27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella por exemplo Salmonella typhimurium, Serratia por exemplo Serratia marcescans € Shigella assim como Bacilli tal como B. subtilis e B. licheniformis (ver DD 266 710), Pseudomonas tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Das células hospedeiras de levedura, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaceharomyces pombe, Kluyveromyces (por exemplo ATCC 16.045; 12.424; 24178; 56.500), Yarrowia (EP402.226), Pichia pastoris (EP 183 070, ver também Peng et al. (2004), Biotechnol. 108: 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Penicillin, Tolypocladium e hospedeiros de Aspergillus tais como À. nidulans e A. niger também são considerados. As células hospedeiras eucarióticas superiores incluem células de mamífero tais como COS-1 (ATCC No. CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), linhagem 293 renal embrionária humana, células renais do hamster bebê (BHK) (ATCC CRL,1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), células do ovário do hamster chinês CHO (por exemplo CHO-K1, ATCC NO: CCL 61, linhagem de célula DHFR-CHO tal como DG44 (ver Urlaub et al. (1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12: 555-556),
' particularmente aquelas linhagens de célula CHO adaptadas para a cultura em " suspensão, células de sertoli de camundongo, células renais de macaco, . células renais de macaco verde africano (ATCC CRL-1587), células HELA, células ranais caninas (ATCC CCL 34), células pulmonares caninas (ATCC CCL75), Hep G2 e células de mieloma ou linfoma por exemplo NSO0 (ver a US 5.807.715), Sp2/0, YO. : Tais células hospedeiras também podem ser engendradas ou adaptadas ainda para modificar a qualidade, função e/ou rendimento da proteína de ligação de antígeno.
Os exemplos não limitantes incluem a expressão de enzimas modificadoras específicas (por exemplo glicosilação) e chaperones de dobra de proteína.
Métodos de Cultivar Célula As células hospedeiras transformadas com vetores que codificam proteínas de ligação de antígeno podem ser cultivadas por qualquer método conhecido por aqueles habilitados na técnica.
As células hospedeiras podem ser cultivadas em frascos giratórios, garrafas rolantes ou sistemas de fibra oca mas para a produção em larga escala reatores de tanque agitado são usados particularmente para as culturas em suspensão, Os tanques agitados podem ser adaptados para a aeração usando por exemplo pulverizadores, —defletores ou pás de baixo cisalhamento, Para as colunas de bolha e reatores de elevação de ar a aeração direta com bolhas de ar ou oxigênio pode ser usada.
Onde as células hospedeiras são cultivadas em um meio de cultura isento de soro, os meios são suplementados com um agente de proteção de célula tal como pluronic F-68 para ajudar a prevenir o dano à célula como um — resultado do processo de aeração.
Dependendo das características da célula hospedeira, microcarreadores podem ser usados como substratos de cultura para as linhagens de célula dependentes de ancoragem ou as células podem ser adaptadas para a cultura em suspensão (que é típica). O cultivar de células hospedeiras, particularmente células hospedeiras de invertebrado pode utilizar
7 uma variedade de modos operacionais tais como lote alimentado, ” processamento de lote repetido (ver Drapeau et al. (1994) Citotechnology 15: . 103-109), processo de lote ampliado ou cultura de perfusão.
Embora as células hospedeiras de mamífero recombinantemente transformadas possam ser cultivadas em meio que contênha soro tal como soro de bezerro fetal (FCS), tais células hospedeiras podem ser cultivadas em meios isentos de soro sintéticos tal como divulgado em Keen et al. (1995) Citotechnology 17: 153- 163, ou meios comercialmente disponíveis tais como ProCHO-CDM ou UltraCHO* (Cambrex NJ, USA), suplementado quando necessário com uma . 10 —fontede energia tal como glicose e fatores de crescimento sintéticos tais como insulina recombinante, O cultivar isento de soro das células hospedeiras pode requerer que estas células são adaptadas para crescer em condições isentas de soro.
Um método de adaptação é cultivar tais células hospedeiras em meio que contém soro e repetidamente trocar 80 % do meio de cultura para os meios isentos de soro de mopo que as células hospedeiras aprendam a se adaptar em condições isentas de soro (ver por exemplo Scharfenberg er al. (1995) em Animal Cell Tecnology: Developments towards the 21st century
(Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers). As proteínas de ligação de antígeno secretadas nos meios — podem ser recuperadas e purificadas usando uma variedade de técnicas para fornecer um grau de purificação adequado para o uso pretendido.
Por exemplo o uso de proteínas de ligação de antígeno para o tratamento de pacientes humanos tipicamente exige pelo menos 95 % de pureza, mais tipicamente 98 % ou 99 % ou pureza maior (comparado com o meio de cultura bruto). Os — fragmentos de célula do meio de cultura é tipicamente removido usando centrifugação seguida por uma etapa de clarificação do sobrenadante usando por exemplo microfiltração, ultrafiltração e/on filtração profunda.
Uma variedade de outras técnicas tais como diálise e eletroforese em gel e técnicas cromatográficas tais como hidroxiapatita (HA), cromatografia de afinidade
' (opcionalmente envolvendo um sistema de alvejamento de afinidade tal como " poliistidina) e/ou cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, ver US . 5.429.746) são disponíveis.
Os anticorpos, a seguir de várias etapas de clarificação, podem ser capturados usando Proteína A ou cromatografia de afinidade G.
Outras etapas de cromatografia podem seguir tais como cromatografia de troca iônica e/ou HA, de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de exclusão de tamanho e precipitação com sulfato de amônio.
Várias etapas de remoção de vírus também podem ser utilizadas (por exemplo nanofiltração usando por exemplo um filtro DV-20). A seguir destas várias etapas, uma preparação purificada (por exemplo uma monoclonal) que compreende pelo menos 75 mg/ml ou mais, ou 100 mg/ml ou mais, da proteina de ligação de antígeno é fornecida.
Tais preparações são substancialmente livres de formas agregadas de proteínas de ligação de antígeno,
Os sistemas bacterianos podem ser usados para a expressão de fragmentos de ligação de antígeno.
Tais fragmentos podem estar localizados intracelularmente, dentro do periplasma ou extracelularmente secretados.
As proteínas insolúveis podem ser extraídas e redobradas para formar proteinas ativas de acordo com métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica,
ver Sanchez et al. (1999) T.
Biotechnol. 72: 13-20; e Cupit et a/. (1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277,
A desamidação é uma reação química em que um grupo funcional de amida é removido.
Em bioquímica, a reação é importante na degradação de proteínas porque a mesma danífica as cadeias laterais que contém amida dos aminoácidos asparagina e glutamina.
A asparagina é convertida a uma mistura de isoaspartato e aspartato.
A desamidação de resíduos de glutamina ocorre em uma taxa muito mais baixa.
Acredita-se que as reações de desamidação sejam um dos fatores que pode limitar o tempo de vida útil de uma proteína, elas são também uma das modificações pós-
' translacionaís mais comuns que ocorrem durante a fabricação de proteínas o terapêuticas. Por exemplo, uma redução ou perda de atividade biológica in * vitro ou in vivo foram relatadas para a DNAse humana recombinante e CD4 solúvel recombinante, ao passo que outras proteínas recombinantes parecem —nãoserafetadas. Composições farmacêuticas As preparações purificadas de uma. proteína de ligação de antígeno como aqui descrita podem ser incorporadas em composições farmacêuticas para o uso no tratamento das doenças, distúrbios e condições . 10 — humanos aqui descritos. Os termos doenças, distúrbios e condições são usados intercambiavelmente. A composição farmacêutica pode ser usada no tratamento de qualquer uma das doenças onde depósitos de amiloide estão presentes nos tecidos e contribuem para o dano estrutural e funcional que leva à enfermidade clínica. SAP está sempre presente em todos os depósitos de
15. amiloide im vivo e a composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno aqui descrita pode ser usada no tratamento de doenças responsivas à depuração de depósitos de amiloide dos tecidos. A preparação farmacêutica pode compreender uma proteína de ligação de antígeno em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável. A proteína de ligação de antígeno pode ser administrada sozinha, ou como parte de uma composição farmacêutica. Tipicamente tais composições compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável como conhecido e exigido pela prática farmacêutica aceitável, ver por exemplo Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16º edição (1980) Mack Publishing Co. Os exemplos de tais carreadores incluem carreadores esterilizados tais como solução salina, solução de Ringers ou solução de dextrose, opcionalmente tamponada com tampões adequados a um pH dentro de uma faixa de 5 a 8.
' As composições farmacêuticas podem ser administradas pela " injeção ou infusão contínua (por exemplo intravenosa, intraperitoneal, . intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraportal). Tais composições são adequadamente isentas de matéria particulada visível. As composições — farmacêuticas também podem ser administradas oralmente, especificamente aquelas que contém CPHPC.
Ás composições farmacêuticas podem compreender entre 1 mg a 10 g de proteína de ligação de antígeno, por exemplo entre 5 mg e 1 g de proteina de ligação de antígeno. Alternativamente, a composição pode . 10 compreender entre 5 mg e 500 mg, por exemplo entre 5 mg e 50 mg.
Os métodos para a preparação de tais composições farmacênticas são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. As composições farmacêuticas podem compreender entre 1 mg a 10 g de proteína de ligação de antígeno na forma de dosagem unitária, opcionalmente junto com instruções para O uso. As composições farmacêuticas podem ser liofilizadas (secadas por congelamento) para reconstituição antes da administração de acordo com métodos bem conhecidos ou evidentes para aqueles habilitados na. técnica, Onde anticorpos têm um isótopo I&G1, um quelador de cobre, tal como citrato (por exemplo citrato de sódio) ou EDTA ou histidina, pode ser adicionado à composição farmacêutica para reduzir o grau de degradação mediado pelo cobre de anticorpos deste isótipo, ver a EPO0612251. As composições farmacêuticas também podem compreender um solubilizante tal como base de arginina, um detergente/agente antiagregação tal como polissorbato 80, e um gás inerte tal como nitrogênio para substituir o —oxigênionotopo livre do frasco.
As doses eficazes e regimes de tratamento para administrar a proteína de ligação de antígeno são no geral determinadas empiricamente e podem ser dependentes de fatores tais como a idade, peso e situação de saúde do paciente e doença ou distúrbio a serem tratados, Tais fatores estão dentro
' da competência do médico atendente.
Orientação na seleção de doses ” apropriadas pode ser encontrada por exemplo em Smith et al (1977) * Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, Nova Iorque.
A dosagem de proteína de ligação de antígeno administrada a um indivíduo estáno geral entre 1 ue/kg a 150 mg/kg, entre 0,1 mg/kg e 100 mg/kg, entre 0,5 mg/kg e 50 mg/kg, entre 1 e 25 mg/kg ou entre 1 e 10 mg/kg do peso corporal do indivíduo.
Por exemplo, a dose pode ser de 10 mg/kg, 30 mg/kg, ou 60 mg/kg.
A proteína de ligação de antígeno pode ser administrada parenteralmente, por exemplo subcutânea, intravenosa ou : 10 —intramuscularmente.
O composto de esgotamento de SAP pode ser administrado em uma dose entre 0,1 mg/kg e 2 mg/kg, dependendo da sua atividade.
O composto de esgotamento de SAP pode ser administrado como uma dose fixa, independente de uma razão de dose para peso do indivíduo.
O composto de esgotamento de SAP pode ser administrado em uma ou mais doses parenterais separada, simultânea ou sequencial de 100 mg ou menos, de 50 mg ou menos, 25 mg ou menos, ou 10 mg ou menos.
Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais —subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados por todo o dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária.
A proteína de ligação de antígeno pode ser administrada em uma dose grande única ou em doses repetidas menores.
À administração de uma dose pode ser pela infusão contínua lenta em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas, ou de 2a 6 horas.
Isto pode resultar em efeitos colaterais tóxicos reduzidos.
A administração de uma dose pode ser repetida uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, três vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada 2 dias, uma vez por semana, uma vez por quinzena, uma vez por
7 mês, uma vez a cada 3 meses, uma vez a cada 6 meses, ou uma vez a cada 12 " meses. As proteínas de ligação de antígeno podem ser administradas pela : terapia de manutenção, por exemplo uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais. As proteínas de ligação de antígeno podem ser administradas — pelaterapia intermitente, por exemplo por um período de 3 a 6 meses e depois nenhuma dose por 3 a 6 meses, seguido pela administração de proteinas de ligação de antígeno mais uma vez por 3 a 6 meses, e assim por diante em um ciclo.
Por exemplo, a dose pode ser administrada subcutaneamente, . 10 uma veza cada 14 ou 28 dias na forma de subdoses múltiplas em cada dia de administração, A proteína de ligação de antígeno pode ser administrada ao indivíduo em um tal modo como para alvejar a terapia à um sítio particular. Por exemplo, a proteína de ligação de antígeno pode ser injetada localmente em uma massa de amiloide local circunscrita nos tecidos, ou infundida na circulação sanguínea para um órgão amiloidótico.
À proteína de ligação de antígeno deve ser usada em combinação com um ou mais outros agentes terapeuticamente ativos, especificamente compostos que esgotam SAP, para o tratamento das doenças aqui descritas. O esgotamento eficaz de SAP da circulação deve ser obtido antes da administração da proteína de ligação de SAP de modo a mais tarde ser dada tanto segura quanto eficazmente.
O composto de esgotamento de SAP é administrado primeiro de modo que quase todo do SAP circulante seja depurado. Visto que isto deixa quantidades substanciais de SAP associadas com os depósitos de amiloide nos tecidos a administração sequencial de uma proteína de ligação de antígeno anti SAP permite a localização e ligação específica aos depósitos de amiloide para promover a sua regressão rápida e extensiva. Adequadamente, a proteina de ligação de antígeno anti SAP pode ser
1 administrado 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 12, 15, 20 ou 25 ou mais dias depois " de começar o(s) tratamento(s) com o composto de esgotamento de SAP. . A administração sequencial pode envolver dois ou mais tratamentos sequenciais com o composto de esgotamento de SAP seguido por —doisou mais tratamentos sequenciais com a proteína de ligação de antígeno anti SAP, A administração sequencial pode envolver um tratamento com composto de esgotamento de SAP seguido por um tratamento sequencial com a proteína de ligação de antígeno anti SAP, que é depois repetido uma ou - 10 mais vezes. A dose sequencial/subsequente pode ser uma quantidade que é maior do que a dose inicial/prévia ou menos do que a dose inicial/prévia. A administração de uma dose inicial de composto que esgota a proteína de SAP pode ser seguida pela administração de uma ou mais doses sequenciais (por exemplo subsequentes) de composto de esgotamento de SAP e/ou a proteína de ligação de antígeno anti SAP, e em que as ditas uma ou mais doses sequenciais pode estar em um quantidade que é aproximadamente a mesma ou menor do que a dose inicial.
Depois da depleção inicial de SAP circulante, a administração de mais doses de composto de esgotamento de SAP e a primeira dose de proteína de ligação de antígeno anti SAP pode ser seguida pela administração de uma ou mais doses sequenciais (por exemplo subsequentes), e em que pelo menos uma das doses subsequentes está em uma quantidade que é maior do que a dose inicial, Consequentemente, a administração pode usar um programa pré-determinado ou de rotina para a administração, resultando deste modo em um período predeterminado designado de tempo entre as administrações de dose, O programa pode abranger períodos de tempo que são idênticos ou que diferem no comprimento, contanto que o programa seja predeterminado.
Y' Qualquer combinação particular seria abrangida pelo programa,a contanto que "” o mesmo seja determinado antecipadamente que o programa apropriado . envolve a administração em um certo dia.
A composição farmacêutica pode compreender um kit de —partesda proteina de ligação de antígeno junto com outros medicamentos, opcionalmente com instruções para o uso. Por conveniência, o kit pode compreender os reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para o uso. Os termos “indivíduo”, “sujeito” e “paciente” são aqui usados . 10 intercambiavelmente. O indivíduo pode ser um primata (por exemplo um sagui ou macaco). O indivíduo é tipicamente um ser humano, ' O tratamento pode ser terapêutico, profilático ou preventivo. O indivíduo será um que está em necessidade deste. Aqueles em necessidade de tratamento pode incluir indivíduos que já sofrem de uma doença médica particular além daqueles que podem desenvolver a doença no futuro. Assim, o composto de esgotamento de SAP seguido pela proteína de ligação de antígeno de SAP aqui descrita podem ser usados para o tratamento profilático ou preventivo. Neste caso, os tratamentos sequenciais aqui descritos são administrados à um indivíduo de modo a prevenir ou — retardar o início de um ou mais aspectos ou sintomas da doença, O indivíduo pode ser assintomático ou pode ter uma predisposição genética para a doença, visto que os depósitos de amiloide são conhecidos estar presentes nos tecidos e acumular por períodos de tempo antes que eles causem dano suficiente para produzir sintomas clínicos, Tal deposição de amiloide subclínica pode ser detectada pela examinação histológica de biópsias de tecido ou pelos procedimentos de formação de imagem não invasiva, que inclui cintigrafia radiorrotulada, ecocardiografia e formação de imagem de ressonância magnética cardíaca de SAP. Depois de primeiro esgotar o SAP circulante, uma quantidade profilaticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno é
' administrada a um tal indivíduo. Uma quantidade profilaticamente eficaz é " uma quantidade que impede ou retarda o início de um ou mais aspectos ou . sintomas de uma doença aqui descrita, A proteína de ligação de antígeno aqui descrita também pode —serusadaem métodos de terapia. O termo “terapia” abrange alívio, redução, ou prevenção de pelo menos um aspecto ou sintoma de uma doença. Por exemplo, a proteina de ligação de antígeno aqui descrita pode ser usada para melhorar ou reduzir um ou mais aspectos ou sintomas de uma doença aqui descrita. . 10 À proteína de ligação de antígeno aqui descrita é usada em uma quantidade eficaz para tratamento terapêutico, profilático ou preventivo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação de antígeno aqui descrita é uma quantidade eficaz para melhorar ou reduzir um ou mais aspectos ou sintomas da doença. A proteína de ligação de antígeno aqui descrita também pode ser usada para tratar, prevenir, ou curar a doença aqui descrita.
A proteína de ligação de antígeno aqui descrita pode ter um eféito no geral benéfico sobre a saúde do indivíduo, por exemplo a mesma pode aumentar a longevidade esperada do indivíduo.
A proteína de ligação de antígeno aqui descrita não precisa aparentar uma cura completa, ou erradicar todos os sintomas ou manifestações da doença para constituir um tratamento terapêutico viável. Como é reconhecido no campo pertinente, os medicamentos utilizados como agentes terapêuticos podem reduzir a severidade de um dado estado de — doença, mas não necessita abolir todas as manifestações da doença para serem considerados como agentes terapêuticos úteis. Similarmente, um tratamento profilaticamente administrado não precisa ser completamente eficaz na prevenção do início de uma doença de modo a constituir um agente profilático viável. Simplesmente é suficiente reduzir o impacto de uma doença (por
' exemplo, pela redução do número ou severidade de seus sintomas, ou pelo " aumento da eficácia de um outro tratamento, ou pela produção de um outro * efeito benéfico), ou reduzir à probabilidade de que a doença ocorrerá (por exemplo pelo retardo do início da doença) ou piora em um indivíduo.
As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser * —“usadas no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a deposição de amiloide isto é, amiloidose.
A “amiloidose” é qualquer doença caracterizada pelo acúmulo extracelular de amiloide em vários órgãos e tecidos do corpo. . 10 O termo “amiloide” refere-se a depósitos extracelulares nos tecidos de fibras de proteína insolúvel composta de fibrilas com morfologia ultraestrutural característica, uma estrutura de núcleo de folha À cruzada e a propriedade tintorial histoquímica patognomônica da ligação de corante de vermelho do Congo a partir de solução alcoólica alcalina e depois dando —dicroísmo vermelho-verde quando visualizado microscopicamente em luz polarizada cruzada forte.
Cerca de 25 proteínas não relacionadas diferentes são conhecidas formar fibrilas de amiloide que depositam em tecidos humanos e compartilham todas estas propriedades típicas.
Os depósitos de amiloide na substância cerebral, amiloide cerebral, diferem um pouco dos depósitos de amiloide em outro lugar no corpo em que eles são sempre focais e microscópicos no tamanho, e são habitualmente aludidos como placas de amiloide.
A amiloidose, que é doença diretamente causada pela deposição de amiloide nos tecidos, compreende tanto a amiloidose local, em que os depósitos são confinados a uma região anatômica e/ou um tecido ou sistema de órgão, e a amiloidose sistêmica em que os depósitos podem ocorrer em qualquer órgão ou tecido no corpo, que inclui vasos sanguíneos e tecidos conectivos.
A causa da amiloidose pode ser adquirida ou hereditária.
A amiloidose adquirida surge como uma complicação de uma condição
' médica precedente, que por si só pode ser adquirida ou hereditária.
Assim, a " amiloidose sistêmica reativa, conhecida como tipo proteína de amiloide À - (AA) é uma complicação de doenças inflamatórias ativas crônicas tais como artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, doença de Crohn, infecções —crônicase septicemia crônica, e de síndromes de febre periódica hereditária tais como febre do mediterrâneo familiar, síndrome de Muckle-Wells e síndrome de CINCA.
A amíiloidose relacionada com a diálise é causada pelo acúmulo de B2-microglobulina como um resultado da insuficiência renal de estágio final.
À amiloidose de cadeia leve (AL) da imunoglobulina . 10 —monoclonal é uma complicação de mieloma múltiplo ou de outro modo gamopatia monoclonal benigna (gamopatia monoclonal de significância incerta, MGUS). A amiloidose adquirida do tipo transtiretina pode ocorrer sem qualquer enfermidade precedente e é meramente uma complicação da idade senil.
A amiloidose hereditária é causada pelas mutações nos genes para várias proteinas que codificam a expressão de proteinas variantes tendo uma propensão aumentada para formar fibrilas de amiloide, e inclui doença causada pela transtiretina, apolipoproteína AI, gelsolina, lisozima, cistatina C e proteína amiloide RB.
Descrições abrangentes de todas as formas diferentes de amiloídose e das proteínas envolvidas estão disponíveis em livros texto e na literatura científica (Pepys, M.
B. (2006) Annu.
Rev.
Med., 57: 223-241; Pepys e Hawkins (2003) Amyloidosis.
Oxford Textbook of Medicine, 4º Ed., Vol. 2, Oxford University Press, Oxford, pp. 162-173; Pepys e Hawkins (2001) Amyloidosis.
Samter's Immunologic Diseases, Sexta Ed., Vol. 1, Lippincott Williams & Williams, Filadélfia, pp. 401412),
A deposição de amiloide local, confinada a um órgão ou tecido, pode ser clinicamente silenciosa ou pode causar dano ao tecido e doença sérios.
Por exemplo, a angiopatia amiloide cerebral em que os depósitos de amiloide vasculares são compostos de proteína AB, é usualmente uma condição adquirida esporádica que surge por razões que não são
' entendidas na ausência de qualquer outra patologia, é é uma causa maior de "” hemorragia cerebral e acidente vascular cerebral.
Existem diversas doenças - muito importantes e comuns, particularmente a doença de Alzheimer (AD) e diabete tipo 2, em que os depósitos de amiloide estão sempre presentes mas em que os mecanismos exatos que causam estas respectivas doenças não são ainda conhecidos.
Não obstante a deposição local de amiloide no cérebro e os vasos sanguíneos cerebrais na doença de Alzheimer, e nas ilhotas pancreáticas na diabete é muito provável de exacerbar a patologia e a doença.
Consequentemente, a presente invenção inclui tratamento tanto da doença de . 10 Alzheimer quanto da diabete tipo 2, na verdade de qualquer condição associada com a presença de depósitos de amiloide nos tecidos, com proteínas de ligação de antígeno como aqui divulgado.
Muitas formas de encefalopatia espongiforme transmissível (doenças priônicas) são associadas com depósitos de amiloide no cérebro, e a — presente invenção portanto diz respeito a todas estas condições, que incluem a doença de Creutzfeldt-Jakob variante em seres humanos, a própria doença de Creutzfeldt-Jakob, kuru e as várias outras formas de doença priônica humana, e também a encefalopatia espongiforme bovina, doença debilitante crônica de mula-cervídeos e alce, e encefalopatia transmissível de marta.
Métodos de diagnóstico de uso As proteínas de ligação de antígeno aqui descritas podem ser usadas para detectar SAP em uma amostra biológica in vitro ou in vivo para propósitos de diagnóstico.
Por exemplo, as proteínas de ligação de antígeno anti SAP podem ser usadas para detectar SAP em soro ou em associadas com —amiloide por exemplo placas amiloides.
O amiloide pode ter sido primeiro removido (por exemplo uma biópsia) de um corpo humano ou animal, Os imunoensaios convencionais podem ser utilizados, que inclui ELISA, Western blot, imunoistoquímica, ou imunoprecipitação.
As proteínas de ligação de antígeno podem ser fornecidas em
' um kit de diagnóstico que compreende uma ou mais proteínas de ligação de ” antígeno, um rótulo detectável, e instruções para o uso do kit. Por - conveniência, o kit pode compreender os reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para o uso.
"EXEMPLOS Exemplo 1 - Sequenciamento de Domínios Variáveis de Hibridoma: SAP-E e SAP-K SAP-E e SAP-K são de dois grupos de anti SAP monoclonais, cada grupo tendo sido testado separadamente quanto a sua ligação ao SAP . 10 humano in vitro. SAP-E e SAP-K mostrou a ligação mais forte ao SAP, dentro dos seus grupos, e foram comparados entre si em ensaios diferentes.
O primeiro grupo de anticorpos compreendeu dos anticorpos de 7 hibridomas gerados em uma imunização convencional único com o SAP humano purificado (SEQ ID NO: 43 mostrado abaixo) (os detalhes do método —paraa purificação do SAP humano são dados em Hawkins ef al. (1991) Clin. Exp. Immunol. 84, 308-316) e protocolo de fusão e são designados SAP-A a SAP-G. Dois destes anticorpos, SAP-E e SAP-B, são isótipos IgG2a enquanto que os outros são todos isótipos de IZG1 (ver o Exemplo 13, Tabela 11).
O segundo grupo de anticorpos compreendeu 6 IgG2a —monoclonais diferentes (SAP-H a SAP-M) derivadas pelas técnicas padrão de imunização com o SAP humana purificada (SEQ ID NO: 43 mostrada abaixo) (Hawkins et al. (1991) Clin. Exp. Immunol. 84, 308-316) e uma fusão convencional para produzir hibridomas que foram clonados pelos métodos de rotina.
—Sequênciade aminoácido madura de SAP do hiomo sapiens (SEQ ID NO: 43)
HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLONFTLCFRAYSDLSRAYSL FSYNTQGRDNELL VYKERVGEYSLYIGRHK VTSK VIEKFPAPVHICVS WESSSGIAEF WINGTPLVKKGLROGYFVEAQPKIVLGQEQDSYGGKF DRSQSFVGEIGDL YMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEI
' RGYVIKPLVWV " Para propósitos de comparação, a sequência de SAP de - camundongo, que tem uma identidade de 69,4 % com o SAP humano, é dado abaixo.
—Proteínamadurade SAP de mus musculus (SEQID NO: 44)
QTDLKRKVFVFPRESETDHVKLIPHLEKPLQNFTLCFRTYSDLSRSOSL FSYSVKGRDNELLIYKEKVGEYSLYIGOSKVTVRGMEEYLSPVHLCTT WESSSGIVEF WVNGKPWVKKSLQREYTVKAPPSIVLGQEQDNYGGGF
QRSQSFVGEFSDLYMWDY VLTPQDILFVYRDSPVYNPNILNWOALNYE 2 10 MINGYVVIRPRVW O RNA total foi extraído de pelotas de célula de hibridoma de ] aproximadamente 10º células usando o kit RNeasy da Qiagen (474106). Sistema de RT-PCR AccessQuick (A1702) foi usado para produzir cDNA das regiões variáveis pesadas e leves usando iniciadores degenerados específicos para as sequências líder do gene da imunoglobulina de murine e regiões constantes IgG2a/x de murino. Os fragmentos de RT-PCR purificados foram clonados usando o kit de clonagem TA da Invitrogen (K2000-01). Uma sequência de consenso foi obtida para cada hibridoma pelo alinhamento de sequência, e alinhamento com sequências variáveis de imunoglobulina conhecidas listadas em KABAT (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4º Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Tnstítutes of Health (1987)). As sequências de consenso para SAP-E e SAP-K são mostrados abaixo. Sequências SAP-E —CDRH!I de SAP-E(SEQIDNO:1)
TYNMH CDRHD de SAP-E (SEQ ID NO: 2)
YIYPGDGNANYNQQOFKG CDRH3 de SAP-E (SEQ ID NO: 3
TB ' GDFDYDGGYYFDS Lo CDRL1 de SAP-E (SEQ ID NO: 4) " RASENIYSYLA CDRL?2 de SAP-E (SEQ ID NO: 5)
NAKTLAE CDRL3 de SAP-E (SEQ ID NO: 6 .
QHHYGAPLT Sequência de aminoácido V, de SAP-E (SEQ ID NO: 7) com CDRs sublinhadas BR 10 QASLOQSGTELVRSGASVKMSCKASGFTFATYNMHWIKQOTPGQGLE
WIGYIYPGDGNANYNQOQFKGKATLTADTSSNTAYMQISSLTSEDSAV ' YECARGDFDYDGGYYFDSWGQGTTLTVSS Sequência de DNA Vg de SAP-E (SEQ ID NO: 8)
CAGGCTTCTCTACAGCAGTCTGGGACTGAGCTGGTGAGGTCTGGG GCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCACATTTGCCA CTTACAATATGCACTGGATTAAGCAGACACCCGGACAGGGCCTGG AATGGATTGGGTATATTTATCCTGGAGATGGTAATGCTAACTACAA TCAGCAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACACATCCTC CAACACAGCCTACATGCAGATCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTC TGCGGTCTATTTCTGTIGCAAGAGGGGACTTTGATTACGACGGAGG GTACTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTCTCC
TCA Sequência de aminoácido V, de SAP-E (SEQ ID NO: 9) com CDRs sublinhadas
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGRSPOLLV HNAKTLAEGVPSRVSGSGSGTHFSLKINGLQPEDFGNYYCOHHYGAP
LTFGAGTKLELK Sequência de DNA V, de SAP-E (SEQ ID NO: 10
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGG ' GAGAAACTGTICACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACA SÍ GTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAGATCCCCTCAGC . TCCTGGTCCATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAA GGGTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACACTTTTCTCTGAAGATCA — ACGGCCTIGCAGCCTGAAGATTTTGGGAATTATTACTGTCAACATCA TTATGGTGCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTG
AAA Sequências SAP-K CDRHI1 de SAP-K (SEQ ID NO: 11)
SYWMH CDRH2 de SAP-K (SEQ ID NO: 12 i MIHPNSVNTNYNEKFKS CDRH3 de SAP-K (SEQ ID NO: 13
RNDYYWYFDV CDRLI de SAP-K (SEQ1ID NO: 14)
KASQNVNSNVA CDRL2 de SAP-K (SEQ ID NO: 15)
SASYRYS CDRL3 de SAP-K (SEQ ID NO: 16)
QQCNNYPET Sequência de aminoácido Vy de SAP-K (SEQ ID NO: 17) com CDRs sublinhadas
QVQLQQOPGAELIKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQORPGOGLE WIGMIHPNSVNTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAV
YYCARRNDYYWYFDVWGTGTTVTVSS Sequência de DNA Vy de SAP-K (SEQ ID NO: 18)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGATAAAGCCTGGG GCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACCA GCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTG ] AGTGGATTGGAATGATTCATCCTAATAGTGTTAATACTAACTACAA " TGAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTC . CAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTC TGCGGTCTATTACTGTGCAAGACGGAATGATTACTACTGGTACTTC
GATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA Sequência de aminoácido V, de SAP-K (SEQ ID NO: 19) com CDRs sublinhadas
DIVMTOSQKFMSTSVGDRVSVTCKASONVNSNVAWYQQKPGOSPKA
LIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVOSEDLAEYFCOQCNNY . 10 PETFGSGTKLEIK Sequência de DNA V, de SAP-K (SEQ ID NO: 20) ' GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAG
GAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGAATT CTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAG
15. CACTGATTTACTCGGCTTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCG
CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACC AATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATGTA ACAACTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAA
AA —Exemplo2: Construção de anticorpos quiméricos Os anticorpos quiméricos, que compreendem domínios variáveis de murino precursores enxertados em regiões constantes do tipo selvagem de IgG1/x humana foram construídos pela clonagem em PCR para SAP-E e SAP-K. Com base na sequência de consenso, os iniciadores para amplificar os domínios variáveis de murino foram planejados, incorporando sítios de restrição requeridos para facilitar a clonagem em vetores de expressão de mamífero. Através da introdução do sítio de restrição em FR4 (Região de Estrutura 4 (sequência da região V a seguir de CDR3 e precedendo o primeiro domínio constante)) a sequência de aminoácido VH
' em SAP-E foi mudada de TTLTVSS como mostrado na SEQ ID NO: 7 para " TLVTVSS e a sequência de aminoácido VH em SAP-K foi mudada de * TTVTVSS como mostrado na SEQ ID NO: 17 para TLVTVSS. Na cadeia. leve variável de SAP-K um sítio EcoRI interno foi presente em CDRLI1 e os iniciadores de mutagênese foram designados para remover este sítio EcoRI interno indesejado pela mudança de um par de base — isto não muda a sequência de aminoácido. As sequências de proteína de cadeia pesada e leve de tamanho natural do anticorpo quimérico de SAP-E (cSAP-E) são dadas nás SEQ ID . 10 NO: 21 e SEQ ID NO: 22 respectivamente. As sequências de proteína de cadeia pesada e leve de tamanho natural do anticorpo quimérico de SAP-K ' (cSAP-K) são dadas nas SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 respectivamente, Sequência de nucleotídeo quimérica VH de SAP-E (SEQ ID NO: 45)
CAGGCTTCTCTACAGCAGTCTGGGACTGAGCTGGTGAGGTCTGGG 15º GCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTCACATTTGCCA
CTTACAATATGCACTGGATTAAGCAGACACCCGGACAGGGCCTGG AATGGATTGGGTATATTTATCCTGGAGATGGTAATGCTAACTACAA TCAGCAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACACATCCTC CAACACAGCCTACATGCAGATCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTC TGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGACTTTGATTACGACGGAGG GTACTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCC AGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGEGTGTTCCCCCTGGECCOCCCAGE AGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGETGCCTGGTGE AAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGA — GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCEGTGCTGCAGAGE AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGC AGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCAÇAAGCOCC
AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGA CAAGACCCACACCTGCCCCCCoTGOCCTGCCECOGAGCTGCTGGGA
T7 ' GGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCOTGA " TGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGA . GCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG
TGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTAC — AACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCEGTGCTGCACCAG GATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAG GCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGC CAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGC . 10 TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAG
CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGAT GGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCC CTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGC
AAG sequência de aminoácido quimérica VH de SAP-E (SEQ ID NO: 21)
QASLQQSGTELVRSGASVKMSCKASGFTFATYNMHWIKQTPGQGLE WIGYIYPGDGNANYNQQFKGKATLTADTSSNTA YMOQISSLTSEDSAYV YFCARGDFDYDGGYYFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST —SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTK VDKK VEPKSCDK THTCPPCP APELLGGPSVFLEPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHY TOKSLSLSPGK Sequência de nucleotídeo quimérica VL de SAP-E (SEQ ID NO: 46)
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCOTATCTGCATCTGTGG GAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACA ' GTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAGATCCCCTCAGC SÍ TCCTGGTCCATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAA * GGGTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACACTTTTCTCTGAAGATCA
ACGGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAATTATTACTGTCAACATCA — TrATGGTGCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTG
AAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCEGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTIGCTGA ACAACTTCTACCCCOGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACA
ATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAG . 10. GACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTG ' ACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGG
GGCGAGTGC Sequência de aminoácido quimérica VL de SAP-E (SEQ ID NO: 22) 15º DIQMTQOSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQOGRSPOLLV
HNAKTLAEGVPSRVSGSGSGTHFSLKINGLQPEDFGNYYCOHHYGAP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVYDNALQOSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequência demnucleotideo quimérica VH de SAP-K (SEQ ID NO: 47)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGATAAAGCCTGGG GCTICAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACCA GCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTG AGTGGATTGGAATGATTCATCCTAATAGTGTTAATACTAACTACAA TGAGAAGITCAAGAGTAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTC CAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTC TGCGGTCTATTACTGTGCAAGACGGAATGATTACTACTGGTACTTC GATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGC ACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGC ' ACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTAC " TTCCCCGAACOGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCOCCTGACCE - AGCOGGCGTGCACACCTTCCCCGCEGTGCTGÇCAGAGCAGCGGCOCTG TACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGAC — ACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC
AAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCA CACCTGCCCCCCeTGECEeTGCoccCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGE
GTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCOTGATGATCAGCA
GAACCCCCOGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGG ' 10 ACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
ACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACC TACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGA ACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTG CCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAG
15. AGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCOTGACCOA
AGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAAC AACTACAAGACCACCOOCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTC TTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAT
CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG Sequência de aminoácido quimérica VH de SAP-K (SEQ ID NO: 23)
QVQLQQPGAELIKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLE WIGMIHPNSVNTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAV YYCARRNDYYWYFDVYWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSN
' KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP " SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQOQGN " VFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK. Sequência de nucleotídeo quimérica VL de SAP-K (SEQ TD NO: 48)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAG GAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGAACT CTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAG CACTGATTTACTCGGCTTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCG
CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACC . 10 AATGIGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATGTA
ACAACTATCCATTICACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAA AACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCEGTGTTCATCTTCCCCCCcAGCOGA
TGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA
CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAA 15º TGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGG
ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGA GCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCEGTGACCAAGAGCTTCAACCGGG
GCGAGTGC —Sequênciade aminoácido quimérica VL de SAP-K (SEQTD NO: 24
DIVMTQOSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNSNVA WYQQOKPGOSPKA LIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVOSEDLAE YFCOQCNNY PFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQOWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Exemplo 3: Estratégia de Humanização Os anticorpos humanizados foram gerados por um processo de enxertar CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 do anticorpo de murino em uma sequência de estrutura humana adequada.
ES " Estratégia de Humanização de SAP-E SJ Humanização da Cadeia Pesada de SAP-E . Para a sequência de cadeia pesada variável de camundongo de SAP-E uma estrutura aceitadora da linha germinativa humana foi selecionada — (IGHVI-69,SEQID NO: 25) que teve 60 % de identidade (que inclui CDRs) com a sequência de cadeia pesada variável de SAP-E de camundongo (SEQ ID NO: 7) junto com o minigene JH1 (Kabat: AEYFOHWGQOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26)), Os primeiros seis resíduos dos resíduos do minigene JH] caem dentro da região de CDR3 e foram substituídos pela CDR que entra do - 10 anticorpo doador. Cinco variantes humanizadas foram geradas com base na comparação de sequência e impacto possível sobre a função do anticorpo. À construção HO foi um enxerto direto de CDRs de murino (usando a definição de Kabat) na estrutura aceitadora humana selecionada acima. A construção HI tem retromutações adicionais nos resíduos 27 e 30. As construções H2 e H3 foram fundamentadas em H1 com retromutações adicionais nos resíduos 2 (H2), e 48 e 67 (H3). A construção H4 foi fundamentada em H3 com retromutações adicionais nos resíduos 69, 73 e 91. Ver a Tabela 3. As sequências dos domínios de cadeia pesada variável —humanizados de HO, HI, H2, H3 e H4 são dadas abaixo (SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO; 31 respectivamente). Tabela 3: Sumário de Variantes VH humanizadas de SAP-E geradas Construção — | Estrutura — | Retromutações | Número total de | Estrutura | Sequência de 2 (SEQ ID NO 25) gas PE 0:28) 30 Ss FE
TT NO: 29 Ha (SEO Esp A EM HH o 7 T L E A é A o o Y F
' Humanização da Cadeia Leve de SAP-E "” Para a sequência de cadeia leve variável de camundongo SAP- . E uma estrutura aceitadora da linha germinativa humana foi selecionada (IGKV1-39, SEQ ID NO: 32) que teve 68 % de identidade (que inclá CDRs) coma sequência de cadeia leve variável de SAP-E de camundongo (SEQ ID No: 9) junto com o minigene capa 2 da região J (Kabat: YTFGQGTKLEIK, SEQ ID NO: 33)) com base na similaridade de sequência. Os primeiros dois resíduos dos resíduos de minigene JK-2 caem dentro da região de CDR3 e foram substituídos pelas CDR que entram do anticorpo doador. . 10 Três variantes humanizadas foram geradas com base na comparação de sequência e possível impactar na função de anticorpo. A construção LO foi um enxerto direto de CDRs de murino (usando a definição de Kabat) na estrutura aceitadora humana selecionada acima. a construção L 1 tem uma retronutação no resíduo 49 e a construção L2 tem retro mutações mnasposições 48 e 49. Ver a Tabela 4. As sequências dos domínios leves variáveis humanizados de LO, L1 e L2 são dadas abaixo (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 respectivamente). Tabela 4: Sumário de variantes VL humanizadas de SAP-E geradas padrão humana
E Estratégia de Humanização de SAP-K Humanização da cadeia pesada de SAP-K Para a sequência de cadeia pesada variável SAP-K de
' camundongo uma estrutura aceitadora da linha germinativa humana foi " selecionada (IGHV1-69, SEQ ID NO: 25) que teve 65 % de identidade (que . inclui CDRs) com a sequência de cadeia pesada variável SAP-K de camundongo (SEQ ID NO: 17) junto com o minigene JHI (Kabat: — AEYFQHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26)). Os primeiros seis resíduos dos resíduos de minigene JHl caem dentro da região CDR3 e foram substituídos pela CDR que entra a partir do anticorpo doador. Quatro variantes humanizadas foram geradas com base na comparação de sequência e possível impactar na função de anticorpo. À , 10 construção HO foi um enxerto direto de CDRs de murino (usando a definição de Kabat) dentro da estrutura aceitadora humana selecionada acima, A construção Hl tem retromutações adicionais nos resíduos 27 e 30. A construção H2 foi fundamentada em Hl com retromutações adicionais nos resíduos 48 e 67. A construção H3 foi fundamentada em H2 com —retromutações adicionais nos resíduos 69 e 71, Ver a Tabela 5, Às sequências dos domínios pesados variáveis humanizados de HO, H1, H2 e H3 são dadas abaixo (SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ TD NO: 39 e SEQ ID NO: 40 respectivamente). Tabela 5: Sumário de variantes VH humanizadas de SAP-K geradas a ge o ee 25 CS s— 5
EEEF AA Humanização de Cadeia Levede SAP-K Para a sequência de cadeia leve variável de SAP-K de camundongo uma estrutura aceitadora da linha germinativa humana foi selecionada (IGKV1-39, SEQ ID NO: 32) que teve 63 % de identidade (que inclui CDRs) com a sequência de cadeia leve variável de SAP-K de
- camundongo (SEQ ID NO: 19) junto com o minigene capa 2 da região ] " (Kabat: YTFGQGTKLEIK, SEQ ID NO: 33) com base na similaridade de - sequência. Os primeiros dois resíduos dos resíduos de minigene JK-2 caem dentro da região de CDR3 e foram substituídos pela CDR que entra à partir do anticorpodoador. Duas variantes humanizadas foram geradas com base na comparação de sequência e possível impactar na função de anticorpo. À construção LO foi um enxerto direto de CDRs de murino (usando a definição de Kabat) dentro da estrutura aceitadora humana selecionada acima. À ' 10 construção L1 tem uma retromutação no resíduo 46. As sequências dos domínios leves variáveis humanizados de ' LO e L] são dadas abaixo (SEQ ID NO; 41 e SEQ ID NO: 42 respectivamente). Tabela 6: Sumário de variantes VL humanizadas de SAP-K geradas Construção Estrutura Retromutas | Número total de | Estrurura | Sequência de
EE A fee o o o rmepRa o R L Construção de vetores de anticorpo humanizados As sequências de DNA da região variável humanizadas foram otimizadas em sequência. Os fragmentos de DNA que codificam as regiões pesada variável e leve variável humanizadas foram construídas de novo usando uma estratégia com base na PCR e oligonucleotídeos de sobreposição. O produto de PCR foi clonado em vetores de expressão de mamífero que contém a região constante gama 1 humana e à região constante capa humana respectivamente. Esta é a região Fc do tipo selvagem. Sequência de nucleotídeo aceitadora da linha germinativa da cadeia pesada variável humana IGHV1-69 (SEQ TD NO: 49
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCA GCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG SJ AGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACG . CACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCA CGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACA
CGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA Sequência de aminoácido aceitadora da linha germinativa da cadeia pesada variável humana IGHV1-69 (SEQ ID NO: 25)
QVQOLVQOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGOGLE
WMGGIIPIFGOTANY AQKFQOGRVTITADKSTSTA YMELSSLRSEDTAVY . 10 YCAR Sequência de nucleotídeo aceitadora da linha germinativa da cadeia pesada ' variável humana IGKV1-39 (SEQ ID NO: 50)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCA GCTATITAAATTIGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC TCCTGATCTATGCTGCATCCAGTITIGCAAAGTGGGGTCCCATCAAG GTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGTCTGCAACCTGAAGATTTTIGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTT
ACAGTACCCCT Sequência de aminoácido aceitadora da linha germinativa da cadeia pesada variável humana IGK V 1-39 (SEQ ID NO: 32)
DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCRASQOSISSYLNWYQQOKPGKAPKLLIY
AASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCQQSYSTP minigene JH1 (SEQ ID NO: 26) —AEYFQHWGQGTLVTVSS minigene Jk2 (SEQ1ID NO: 33)
YTFGQGTKLEIK Sequência de nucleotídeo HO variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E não otimizada no códon (SEQ ID NO: 51)
' CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG O TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCA - CTTACAATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG AGTGGATGGGATATATTTATCCTGGAGATGGTAATGCTAACTACAA TCAGCAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCAC GAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACAC GGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGACTTTGATTACGACGGAGG GTACTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCOGTCTCC
TCA . 10 Sequência de nucleotídeo LO variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E não otimizada no códon (SEQ ID NO: 52)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGAGCAAGTGAGAATATTTACA
GTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC 15º TCCTGATCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGGGTCCCATCAA
GGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAG CAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATCAT TATGGTGCTCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATC
AAA Sequência de nucleotideo HO variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 53)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCGG CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGGGCACCTTCTC CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCTATATCTACCCCGGCGACGGCAACGCCAACTA CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAG CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA TACCGCEGTGTACTACTGCGCECAGGGGCGACTTCGACTACGACGG CGGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGT
' GTCCAGC JJ Sequência de aminoácido HO variante da região V de cadeia pesada . humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 27
QVQOLVQOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYNMHWVRQAPGQOGLE — WMGYIYPGDGNANYNQQFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA
VYYCARGDFDYDGGY YFDS WGQGTLVTVSS Sequência de nucleotideo H1l variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO; 54)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCEGAGGTGAAGAAACCCGG . 10 CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGTTCACCTTCGE
CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCTATATCTACCCCGGCGACGGCAACGCCAACTA CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAG
CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA 15º TACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCOGACTTCGACTACGACGG
CGGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGT
GTCCAGC Sequência de aminoácido H1l variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 28)
QVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFATYNMHWVRQAPGQOGLE WMGYTYPGDGNANYNQQFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA
VYYCARGDFDYDGGYYFDSWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotideo H2 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 55)
CAGGCGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCEGAGGTGAAGAAACCOCGG CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGTTCACCTTCGC CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCTATATCTACCCCGGCGACGGCAACGCCAACTA CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAG ' CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA " TACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCGACTTCGACTACGACGG CGGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGT
GTCCAGC Sequência de aminoácido H2 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E SEQ TD NO: 29
QAQLVQOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFATYNMHWVYRQAPGQGLE WMGYIYPGDGNANYNQQFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA
VYYCARGDFDYDGGYYFDSWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotideo H3 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 56)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCOCGG CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGTTCACCTTCGC
CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT 15º GGAGTGGATCGGCTATATCTACECCGGCGACGGEAACGEOCAACTA
CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGCCACCATCACCGCEGACAAGAG CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA TACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCGACTTCGACTACGACGG CGGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCOGT
GTCCAGC Sequência de aminoácido H3 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 30)
QVQLVQOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFATYNMHWVRQAPGQOGLE WIGYIYPGDGNANYNQQFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV
YYCARGDFDYDGGYYFDSWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeo H4 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 57
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCOGG CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGTTCACCTTCGC ' CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT " GGAGTGGATCGGCTATATCTACCCCGGCGACGGCAACGCCAACTA . CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGCCACCCTGACCGCCEGACACCAG CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA — TACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGGGGCGACTTCGACTACGACGGC GGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGTG
TCCAGC Sequência de aminoácido H4 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 31) ' 10 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFATYNMHWVRQAPGOGLE
WIGYTIYPGDGNANYNQQFKGRATLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAV
YFCARGDFDYDGGY YFDSWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeo LO variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 58) 15º GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCACTGAGCGCCAGCGTG
GGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCTCCGAGAACATCTAC AGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCECCOCAAG CTGCTGATCTACAACGCCAAGACCCTCGCCGAGGGCGTCCCTAGEC AGGTTCTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATC —AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCAC CACTACGGCGCCCCCCTGACCTTTGGOCAGGGCACCAAACTGGAG
ATCAAG Sequência de aminoácido LO variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E SEQ ID NO: 34 — DIOQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLI
YNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOHHYGAPL
TFGQGTKLEIK Sequência de nucleotídeo L] variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 59)
' GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCACTGAGCGCCAGEGTG . GGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCTCCGAGAACATCTAC . AGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCOCCOCAAG CTGCTGATCCACAACGCCAAGACCCTCGCCGAGGGCEGTCCETAGCO — AGGTTCICTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATC AGCAGCCTGCAGCCOGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCAC CACTACGGCGCCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAG
ATCAAG Sequência de aminoácido L1 variante da região V de cadeia leve humanizada . 10 deSAP-E(SEQID NO: 35)
DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLI
Ú HNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCQHHYGAPL TEGQGTKLEIK. Sequência de nucleotídeo L2 variante da região V de cadeia leve humanizada deSAP-E (otimizadano códon) (SEQ ID NO: 60)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCACTGAGCGCCAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCTCCGAGAACATCTAC AGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAG CTGCTGGTGCACAACGCCAAGACCCTCGCCGAGGGCGTCCCTAGC — AGGTTICTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATC AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCOAC CACTACGGCGCCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAG
ATCAAG Sequência de aminoácido L2 variante da região V de cadeia leve humanizada —deSAP-E(SEQID NO: 36)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLV HNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQHHYGAPL
TEGQGTKLEIK Sequência de nucleotídeo madura completa H1 de cadeia pesada humanizada
Y de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 61) . CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAACCCGG » CAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTAGCGGGTTCACCTTCGC
CACCTACAACATGCACTGGGTCAGGCAGGCACCCGGCCAGGGOCT GGAGTGGATGGGCTATATCTACCCCGGCGACGGCAACGCCAACTA CAACCAGCAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAG CACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGA TACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCGACTTCGACTACGACGG
CGGCTACTACTTCGACAGCTGGGGACAGGGCACACTAGTGACCGT - 10 GTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCOCCAGCGTEGTTCCCECTGGCEEE
CAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTECCT GGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAG CGGAGCCCTGACCAGCGGCEGTGCACACCTTCECCCGCCGTGCTGÇA
GAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAG 15º CAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAA
GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCT GTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCeTGcceTGECCOCGAGCTGEOT
GGGAGGCCOCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGUCTAAGGACAC CCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGA TGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGC AGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGC ACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCA ACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCA AGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCOA GAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGA AGGGCTTCTACCCCAGCOGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACG GCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCECETGTGETGGACA GCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGA
7 GCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACG : AGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCOCTGTCCC . CTGGCAAG Sequência de aminoácido madura completa H1 de cadeia pesada humanizada —deSAP-E(SEQIDNO:462)
QVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFATYNMHWVRQAPGOGLE WMGYTYPGDGNANYNQQFKGRVTITADKSTSTAY MELSSLRSEDTA VYYCARGDFDYDGGYYFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYS . 10 LSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK.
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W 15º QQGNVFSCSVYMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de nucleotídeo madura completa L1 de cadeia leve humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 63)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCTCACTGAGCGCOCAGOGTG GGCGACAGGGTGACCATTACCTGCAGGGCCTCCGAGAACATCTAC —AGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAG CTGCTGATCCACAACGCCAAGACCCTCGCCGAGGGOGTCCCTAGE AGGTTCTCTGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATC
AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCAC CACTACGGCGCCCECCCeTrACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAG
ATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCOGTGTTCATCTTCCCCCCCA GCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGC TGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGG ACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAG CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACC
] CTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAG . GTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAAC . CGGGGCGAGTGC Sequência de aminoácido madura completa L1 de cadeia leve humanizada de —SAP-E(SEQIDNO: 64
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLI HNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOHHYGAPL TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV - 10 YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequência de nucleotídeo HO variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E não otimizada no códon (SEQ ID NO: 65)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGG
TCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCA 15º GCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTG
AGTGGATGGGAATGATTCATCCTAATAGTGTTAATACTAACTACAA TGAGAAGTTCAAGAGTAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCAC GAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACAC
GGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGAATGATTACTACTGGTACTTC — GATGTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCOTCCTCA Sequência de nucleotideo LO variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E não otimizada no códon (SEQ ID NO: 66)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGAACT CIAATGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGC TCCTGATCTATTCGGCTTCCTACCGGTACAGTGGGGTCCCATCAAG GTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC AGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAATGTA ACAACTATCCATTCACGTITGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCA
+ AA . Sequência de nucleotídeo HO variante da região V de cadeia pesada 7 humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 67)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGG —CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCEGGAACCTTCAG CAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCACCCGGECAGGGCCT GGAGTGGATGGGCATGATCCACCCCAACAGCGTGAACACCAACTA CAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGA GCACCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCTCTGAGGAGCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGAACGACTACTACTGGT
ACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC ! Sequência de aminoácido de HO variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 37
QVQLVQOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSY WMHWVRQAPGQOGL EWMGMIHPNSVYNTNYNEKFKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA
VYYCARRNDYYWYFDVWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeo Hl variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 68)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCEGAAGTGAAGAAGCCCGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCOTICAC CAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATGGGCATGATCCACCCCAACAGCGTGAACACCAACTA CAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTGACCATCACCGCCGACAAGA GCACCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCTCTGAGGAGCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGAACGACTACTACTGGT
ACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC Sequência de aminoácido Hlvariante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 38)
QVQOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQOGL
' EWMGMIHPNSVNTNYNEKFKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA . VYYCARRNDYYWYFDVWGQGTLVTVSS s Sequência de nucleotídeo H2 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 69) — CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCOGG
CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC CAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATCGGCATGATCCACCCCAACAGCGTGAACACCAACTA
CAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATCACCGCCGACAAGA . 10 GCACCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCTCTGAGGAGCGAGG
ATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGAACGACTACTACTGGT
ACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC Sequência de aminoácido H2 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 39) 15º QVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGL
EWIGMIHPNSVNTNYNEKFKSRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV
YYCARRNDYY WYFDVWGQGTLVTVSS Sequência de nucleotídeo H3 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 70)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC CAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCACCCGGCCAGGGCCT GGAGTGGATCGGCATGATCCACCCCAACAGCGTGAACACCAACTA CAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACAAGA GCACCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCTCTGAGGAGCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGAACGACTACTACTGGT
ACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC Sequência de aminoácido H3 variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (SEQ ID NO: 40)
9% ' QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSY WMHWVRQAPGQGL . EWIGMIHPNSVNTNYNEKFKSRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTA . VYYCARRNDYY WYFDVWGQOGTLVTVSS Sequência de nucleotídeo LO variante da região V de cadeia leve humanizada —deSAP-E(otimizadano códon) SEQID NO: 71)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTTCACTGAGCGCTAGOGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGAAC AGCAACGTGGCCTGGTACCAGCÇCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAG
CTCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATATAGCGGCGTGCCTAGE . 10 AGGTTTAGCGGCAGCOGGAAGCGGGACCGATTICACCCTGACCATC
AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAG TGCAACAACTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG
ATCAAG Sequência de aminoácido LO variante da região V de cadeia leve humanizada —deSAP-E(SEQIDNO: 41)
DIQMTQSPSSLSAS VGDRVTITCKASQNVNSNVA WYQQKPGKAPKLL
IYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQCNNYPF TEGQGTKLEIK. Sequência de nucleotídeo L 1 variante da região V de cadeia leve humanizada —deSAP-E(otimizadano códon) (SEQTID NO: 72)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTTCACTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGAAC AGCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAG GCCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATATAGCGGCGTGCCTAGC — AGGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGGACCGATTTCACCCTGACCATC AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAG TGCAACAACTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG
ATCAAG Sequência de aminoácido L] variante da região V de cadeia leve humanizada
' de SAP-E (SEQ ID NO: 42) . DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVYNSNVAWYQQKPGKAPKAL - IYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQCNNYPF
TFGQGTKLEIK S Sequência de nucleotideo H3 da cadeia pesada humanizada de SAP-K (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 75)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGG CAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCAC
CAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCACCCEGGCCAGGGCCT . 10 GGAGTGGATCGGCATGATCCACCCCAACAGCGTGAACACCAACTA
CAACGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACAAGA GCACCAGCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCTCTGAGGAGCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGAACGACTACTACTGGT ACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCG CCAGCACCAAGGGCCCCAGCOGTGTTCCCCOTGGCCCCCAGCAGCA AGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCOTGGTGAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCOGCCGTGCTGCAGAGCAGEOG GCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCE — TGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCA
ACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAG ACCCACACCTGCCCCCCoTGCECTGCCCcoGAGCOTGCTGGGAGGCOC
CCAGCGTGTTCCTGTTCCOCCCCCAAGCCOTAAGGACACCCTGATGAT CAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCA CGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACA GCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCEGTGCTGCACCAGGATTG GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCT GCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCOC ' CAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCT . GACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTA - CCCCAGCGACATCGCEGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCOGA GAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAG CTTCTTCCIGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCA GCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCA
CAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG Sequência de aminoácido H3 de cadeia pesada humanizada de SAP-K (SEQ ID NO: 76) . 10 QVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTEFTSY WMHWVRQAPGQGL
EWIGMIHPNSVNTNYNEKFKSRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTA ' VYYCARRNDYYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGK Sequência de nucleotídeo LO de cadeia leve humanizada de SAP-K (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 77)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTTCACTGAGCGCTAGCGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGAAC AGCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCOCOCAAG CTOCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATATAGCGGCGTGCOCTAGC AGGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGGACCGATTTCACCCTGACCATC AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAG TGCAAÇAACTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCOTGGAG ATCAAGCGTACGGTGGCCEGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCA , GCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGC . TGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGG ACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCOGAG CAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACC — CTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAG GTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCOEGTGACCAAGAGCTTCAAC
CGGGGCGAGTGC Sequência de aminoácido LO de cadeia leve humanizada de SAP-K (SEQ ID NO: 78) - 10 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVNSNVAWYQQOKPGKAPKLL
IYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATY YCOQCNNYPF i TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV
YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequência líder para cadeias de imunoglobulina (SEQ ID: 79)
MGWSCIILFLVATATGVHS Exemplo 4: - Expressão de Anticorpo Expressão de anticorpo recombinante Plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesada e leve respectivamente de anticorpos quiméricos ou humanizados foram transitoriamente cotransfectados em células HEK2936E pela transfecção de lipídeo usando Fectina 293. As células foram cultivadas em meio de expressão Freestyle 293 com 10 % de pluronic F68 e 50 mg/ml de geneticina, 37 graus C, 5 % de CO, por 72 a 120 horas, o sobrenadante foi colhido pela centrifugação. Em alguns casos o material sobrenadante foi usado como o artigo de teste em ensaios de ligação. Em outros casos, o material sobrenadante foi esterilizado em filtro e o anticorpo recuperado pela cromatografia de afinidade usando a coluna de proteína A MAbSelect SuRE seguido pela diálise em PBS.
" Expressão de anticorpo em hibridoma . As células de hibridoma foram cultivadas em frascos agitados em meio Ex620 suplementado com 4 mM de glutamax e 10 % de FCS com IgG baixo.
As células foram passadas e desabituadas de soro até crescerem bem em meio isento de soro.
As células foram depois usadas como uma semente para um saco de ondas de 10 L.
As células foram cultivadas no saco de ondas a 22 oscilações/min, 37 graus C, 5 % de CO2 (2 0,1 L/min até a que viabilidade caiu para 30 %. O meio condicionado foi coletado pela filtração estéril.
O anticorpo foi recuperado pela cromatografia de afinidade usando . 10 — proteina A recombinante seguido pela diálise em PBS.
Exemplos 5 a 7: Os dados comparativos entre hibridomas e/ou mAbs quiméricos e/ou Mabs humanizados Exemplo 5: Comparação de bibridomas SAP-K e SAP-E em ELISA de ligação de SAP humano 1 ugml ou 5 pg/ml de SAP humano foram diretamente imobilizados em uma placa de ELISA e bloqueados com 1 % de BSA/TBS mais 0,05 % de TWEEN20. Os anticorpos anti SAP de material purificado foram titulados através da placa.
O anticorpo ligado foi detectado pelo tratamento com um anticorpo de IgG de coelho anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (Dako, P0260). O ELISA foi desenvolvido usando o substrato de peroxidase de dicloridreto de O-fenilenodiamina (OPD) (Sigma, P9187). A Figura 1 mostra as curvas de ligação para os anticorpos de murino SAP-E e SAP-K a uma concentração de revestimento de 1 ug/ml de — SAP humano, A Figura 2 mostra as curvas de ligação para os anticorpos de murino SAP-E e SAP-K em uma concentração de revestimento de 5 ng/ml de SAP humano, Na concentração de revestimento de 5 ng/ml, SAP-K e SAP-E
7 mostraram ligação similar ao SAP humano imobilizado, ao passo que na . densidade mais baixa de 1 ug/ml revestindo SAP-K mostrou maior ligação do que no SAP-E. Todos os ELISAs de ligação de SAP humano subsequentes usando este formato usaram a densidade mais baixa de 1 pg/ml de concentração de revestimento para distinguir entre as propriedades de ligação dos dois anticorpos. Exemplo 6: Comparação de mAbs quiméricos/humanizados de SAP-K e SAP-E em ELISA de ligação de SAP humano 1 ug/ml de SAP humano foi diretamente imobilizado em uma .: 10 placa de ELISA e bloqueado com 1 % de BSA/TBS mais 0,05 % de TWEEN?20. Os anticorpos anti SAP dos sobrenadantes de teste ou material ] purificado foram titulados através da placa. O anticorpo ligado foi detectado pelo tratamento com conjugado de peroxidase de cadeias leves Capa de cabra anti-ser humano (Sigma, A7164). O ELISA foi desenvolvido usando o substrato de peroxidase dicloridreto de O-fenilenodiamina (OPD) (Sigma, P9187).
A Figura 3 mostra as curvas de ligação para os anticorpos quiméricos cSAP-E e cSAP-K., O perfil das curvas para os anticorpos quiméricos é o mesmo como aquele dos hibridomas equivalentes.
A Figura 4 mostra as curvas de ligação para SAP-K HOLO, SAP-K HILO, SAP-K H2L0 e SAP-K H3LO0 comparados com a quimera SAP-K e o SAP-E HIL1 comparado com a quimera SAP-E, Um anticorpo de IgGl capa humano irrelevante também foi testado como um rcontrole negativo. Os dados mostram que a humanização do anticorpo SAP-K resultou emuma perda de atividade de ligação do SAP humano de aproximadamente 2 vezes comparado com à quimera SAP-K precursora, enquanto o anticorpo SAP-E humanizado reteve a atividade de ligação comparada com a quimera SAP-E precursora.
Exemplo 7 - ELISA de Competição
“ As placas de ELISA foram revestidas com o SAP humano a 1 . pg/ml (para à competição com a quimera SAP-K) ou 5 pg/ml (para a competição com a quimera SAP-E) e bloqueadas com 1% de BSA/PBS. Uma concentração constante de mAb anti SAP quimérico foi misturada com — quantidades diluídas em série (1:1) de mAbs anti SAP de camundongo. As placas foram lavadas e a quantidade de anticorpo quimérico ligado ao SAP humano imobilizado foi detectada usando conjugado de peroxidase de cadeia leve capa de cabra anti-ser humano (Sigma, A7164), O ELISA foi desenvolvido usando o substrato de peroxidase dicloridreto de O- . 10 —fenilenodiamina(OPD) (Sigma, P9187). A Figura 5 mostra anticorpos monoclonais de murino SAP-K e : SAP-E purificados no ELISA de competição com a quimera SAP-E.
A Figura 6 mostra anticorpos monoclonais de murino SAP-K e SAP-E purificados no ELISA de competição com a quimera SAP-K.
Tanto na figura 5 quanto na 6 nenhuma competição é observada entre os anticorpos SAP-E e SAP-K. mostrando que os dois anticorpos ligam-se a epítopos distintos na molécula de SAP humano. Exemplo 8: Determinação das cinéticas de ligação Análise Biacore da ligação de variantes de anticorpo anti SAP humanizado ao —SAPdeser humano purificado e de macaco cinomolgo purificado, SAP de ser humano e de macaco cinomolgo foram imobilizados em um chip Biacore C1 pela ligação de amina primária de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo anti SAP humanizado contido em sobrenadantes de cultura e os anticorpos quiméricos purificados a 512nM foram passados nas superfícies de SAP tanto de ser humano quanto de macaco cinomolgo e sensogramas de ligação obtidos. Todas as rodadas foram de referência dupla com uma injeção de tampão para amostra ou meio purificados para as amostras de sobrenadante sobre as superfícies de SAP de ser humano e cino. A análise foi realizada a 25º C usando tampão HBS-EP. À
: regeneração de superfície foi feita na presença de MgCl, 3 M e não afetou a . capacidade dos anticorpos para religar-se ao SAP humano em um ciclo subsequente. Os dados foram analisados usando o modelo de dissociação de 1 para 1 dentro do software de avaliação Biacore T100.
Os dados gerados nas Tabelas 6a e 6b mostra as taxas de dissociação (kd) dos sobrenadantes dos anticorpos SAP-E e SAP-K humanizados respectivamente. Os valores foram com base em uma única curva e usados para propósitos de classificação entre as construções diferentes para a ligação ao SAP humano. Os anticorpos SAP-E humanizados - 10 mostraram taxas de dissociação melhores do que os anticorpos SAP-K humanizados para a ligação de SAP humano. Diversas das variantes de ' anticorpo SAP-K humanizado mostraram a ligação ao SAP de macaco cinomolgo (N.B. a quimera SAP-K ligou SAP de macaco cinomolgo) enquanto nenhuma das variantes do anticorpo SAP-E humanizado ligou SAP de macaco cinomolgo (N.B. a quimera SAP-E do mesmo modo não ligou SAP de macaco cinomolgo). As variantes de SAP-E humanizado que conteve a cadeia pesada humanizada de enxerto direto (HO) ou a cadeia leve humanizada de enxerto direto (LO) ou uma combinação de ambos mostraram as taxas de dissociação mais pobres. À cadeia leve L1 de SAP-E humanizado foiamelhor variante de cadeia leve e a combinação do L] com a variante de cadeia pesada H 1 deu um anticorpo humanizado com uma taxa de dissociação aceitável enquanto manteve o número de retro mutações em um mínimo. À classificação da taxa de dissociação das variantes de SAP-K humanizado mostraram que o LO de enxerto direto é a melhor variante de cadeia leve humanizada e o HO de enxerto direto é a variante de cadeia pesada humanizada mais pobre. Tabela 6a
: ; : Tabela 6b N.B. Kd é para SAP humano
IS TE SAP de cino sm ne ss e e EE ee | e Análise de Biacore da ligação de anticorpos anti SAP ao SAP humano purificado diretamente imobilizado em um suporte de fase sólida SAP humano foi imobilizado em um chip Biacore CM3 pela ligação de amina primária de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos anti SAP foram passados sobre esta superfície a 512, 128, 32, 8,2,
. 0,5 nM e os sensogramas de ligação obtidos.
Todas as rodadas foram de . referência dupla com uma injeção de tampão sobre a superfície de SAP humano.
A análise foi realizada a 25º C usando tampão de HBS-EP.
À regeneração da superfície foi feita permitindo-se que o tampão fluísse sobre a superfíciepor vários minutos e não afetou a capacidade de SAP humano para religar anticorpos em um ciclo subsequente, Os dados foram analisados a partir de rodadas de 128 a 0,5 nM usando o modelo do análito bivalente inerente ao software de avaliação Biacore T100. Os dados gerados e compilados na tabela 7 foram ' 10 intencionados para a comparação entre as construções e mostraram que os anticorpos SAP-K. têm uma taxa de associação melhor neste ensaio enquanto ' que os anticorpos SAP-E mostraram taxas de dissociação melhores.
Além disso, a humanização não alterou as cinéticas de ligação do anticorpo SAP-E enquanto que para SAP-K uma perda nas taxas de associação e dissociação foiobservada a seguir da humanização.
Tabela 7 Fr se ae Análise Biacore da ligação de anticorpos anti SAP ao SAP humano purificado capturado sobre O-fosfoetanolamina imobilizada A O-fosfoetanolamina foi imobilizada em um chip Biacore CMS pela ligação de amina primária de acordo com as instruções do fabricante.
SAP humano foi depois capturado sobre a superfície na presença de cloreto de cálcio, de modo a replicar no sistema Biacore in vitro, a orientação precisa de moléculas SAP ligadas às fibrilas de amiloide in vivo.
Anticorpos anti SAP foram depois passadas sobre esta superfície a 256, 64, 16,4,1nMeum sensorgrama de ligação obtido.
A análise foi realizada a 25º
] C usando 4 % de BSA, 10 mM de Tris, 140 mM de NaCl, 2 mM de CaCl,, . 0,05 % de tensoativo P20, 0,02 % de NaN;, pH 8,0 como tampão de condução, A regeneração foi obtida usando dois pulsos de Tris-EDTA (10 mM de Tris, 140 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, pH 8,0) que removeu o —SAP humano ligado mas não afetou significantemente a ligação subsequente de SAP à fosfoetanolamina imobilizada.
Os dados gerados foram de referência dupla com uma injeção de tampão sobre a superfície de SAP humano e analisados usando o modelo do análito bivalente no software de avaliação Biacore T100. - 10 Os dados gerados, como mostrado na Tabela 8, são intencionados apenas com propósitos de comparação entre as construções. ' Eles não constituem valores cinéticos precisos, devido à modificação possível de ligação pelo efeito de avidez inerente no formato de ensaio.
À avidez é mais provável ter afetado as taxas de dissociação do anticorpo, levando a —valoresdeKD calculado mais baixos.
Além disso, para todos os anticorpos de SAP-E, a taxa de dissociação (kd) obtida está fora do limite da faixa de medição do Biacore.
Não obstante, os resultados indicam ligação firme dos anticorpos anti SAP ao SAP humano imobilizado pela interação do SAP com um ligando de fase sólida, exatamente como é nos depósitos de amiloide in vivo,queéo alvo terapêutico da presente invenção.
Tabela 8 pro pes pe fe FT Ee) Exemplo 9: Varredura de aminoácido na posição 91 da cadeia leve de SAP-K LO humanizado À mutagênese de saturação direcionada ao sítio foi usada para
7 gerar um painel de variantes onde o resíduo de cisteina na posição 91 . (numeração. de Kabat) foi potencialmente substituído com todos os outros 19 aminoácidos em uma única reação usando-se um iniciador de mutagênese que codifica NNK nesta posição (onde N codifica adenosina ou cistidina ou — guanosinaoutimídinae K codifica guanosina ou timidina). Das classificações da taxa de dissociação pelo Biacore realizadas no sobrenadante de anticorpo para as variantes geradas, quatro foram selecionadas para aprimoramento nas células HEK2936E e purificação. A análise cinética pelo Biacore usando o método da O-fosfoetanolamina como detalhado no Exemplo 7 mostrou que a - 10 variante com alanina na posição 91 (SEQ ID NO: 43) teve uma afinidade melhorada comparada com o tipo selvagem; os valores KD de 0,436 nM e i 36,8 nM foram medidos respectivamente. N.B. todas as variantes foram testadas no mesmo experimento usado para produzir os resultados mostrados na tabela 7, Outras variantes, por exemplo, glicina, serina e valina melhoraram a ligação com respeito ao H3LO, mas a um grau menor do que a alanina. Além disso, o fato de que estas quatro variantes tiveram melhor propriedades de ligação do que LO também foi observado em um ELISA de ligação e um experimento de classificação da taxa de dissociação pela Biacore —quandoas cadeiasleves foram emparelhadas com HI.
Sequência de nucleotídeo da variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E LO 91A (otimizada no códon) (SEQ ID NO: 73)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTTCACTGAGCOGCTAGOGTG GGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGTGAAC — AGCAACGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAG CTCCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATATAGCGGOGTGCCTAGCE AGGTTTAGCGGCAGCGGAAGCGGGACCGATTTCACCCTGACCATC AGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACTTACTACTGCCAGCAG GCGAACAACTACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAG
7 ATCAAG . Sequência de aminoácido variante da região V de cadeia leve humanizada de SAP-E LO 91A (SEQT1ID NO: 74
DIQMTQSPSSLSAS VGDR VTITCKASQNVNSNVA WYQQKPGKAPKLL IYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCQQANNYPF
TFGQGTKLEIK Exemplo 10: Dependência de complemento da depuração de amiloide pelo anticorpo anti SAP. O papel de complemento na depuração de amiloide pelo - 10 anticorpo anti SAP foi investigado pela comparação da eficiência do tratamento entre camundongos com animais com deficiência de complemento e normais, suficientes em complemento. A deleção alvejada do gene para Cl1q bloqueia a ativação do caminho de complemento clássico, que é iniciado pela ligação de Clq aos complexos de anticorpo-antígeno, mas a ativação de C3, a etapa funcional fundamental responsável pela quimiotaxia e opsonização, as funções biológicas principais de complemento, podem ter seguimento ainda por intermédio dos caminhos alternativo e lectina assim como pela clivagem de C3 direcionado pelas proteinases de serina que não de complemento. A deleção alvejada do gene para C3 completamente amulou estas funções. Induçãodeamiloidose AA A amiloidose AA foi induzida e confirmada em dois grupos de camundongos deficientes em complemento: silenciados C3 (n = 14) e silenciados Clq (n = 12), e em 15 camundongos do tipo selvagem. Todos os camundongos foram da linhagem pura. Cada camundongo recebeu uma dose única de fator realçador de amiloide, um extrato de tecido amiloidótico que contém fibrilas de amiloide (Baltz et al, (1986) Plenum Press, Nova lorque, pp. 115-121), pela injeção intravenosa seguida 4 dias mais tarde por 10 injeções subcutânea diária de 10 % p/v de caseina em solução em NaHCO; 0,1 M administrado em um período de 12 dias (Botto er al, (1997) Nature
' Med., 3: 855-859), A caseína evoca a inflamação aguda persistente e um . aumento prolongado na produção da proteína de amiloide A sérica (SAA) levando à deposição de amiloide AA em todos os animais.
Sete dias depois da última injeção de caseina, KI foi introduzido na água de beber de todos os camundongos e 3 dias mais tarde cada camundongo recebeu uma injeção intravenosa de uma dose padrão de SAP humano rotulado com “*I (Hawkins er al, (1990) 1. Clin, Invest., 86: 1862-1 869 e Hawkins er al, (1988) J]. Exp.
Med., 167: 903-913). Todos os camundongos passaram pela contagem de corpo inteiro 24 h e 48 h depois da injeção de traçador para determinar a : 10 retenção da radioatividade, um índice preciso de carga de amiloide de corpo inteiro.
Dez dias depois da injeção de traçador MSESAP, todos os : camundongos foram “carregados' com o SAP humano por uma injeção intraperitoneal única de 10 mg por camundongo de SAP humano puro isolado.
O SAP humano injetado em camundongos amiloidóticos localiza-se nos depósitos de amiloíde e persiste aí com uma meia vida de cerca de 3 a 4 dias enquanto que qualquer SAP humano não ligado a amiloide é depurado da circulação com uma meia vida de cerca de 3 a 4 horas (Hawkins ef al, (1988) J.
Exp.
Med, 167: 903-913 e Pepys et al, (2002) Nature, 41 7: 254-259). O tingimento imunoistoquímico com anticorpo SAP anti-ser — humano no baço de um camundongo amiloidótico depois da injeção de SAP humano puro isolado mostra que existe tingimento positivo forte de todos os depósitos de amiloide em sua distribuição de zona marginal típico, Este SAP humano ligado é o alvo do anticorpo anti SAP terapêutico de acordo com a presente invenção.
Tratamento Anti SAP Três dias depois da injeção de SAP humano, quando SAP humano não foi mais detectável na circulação, todos os camundongos exceto dois em cada um dos grupos silenciados no complemento uma injeção intraperitoneal única de 1 ml da fração de IgG integral (lote no. 2866) de SAP
. anti-ser humano de ovelha monoespecífico antissoro em 50 mg/ml em solução ' em solução salina tamponada por fosfato (PBS), que contém 7 mg/ml de anticorpo anti SAP real.s O antissoro foi produzida pela The Binding Site Ltd, Birmingham, UK, usando SAP humano (rigorosamente purificada a 100 % na S University College London Centre for Amyloidosis and Acute Phase Protein) e procedimentos de imunização patenteados.
Todos os animais foram depois mortos 15 dias depois da administração anti SAP para estimativa histológica da carga de amiloide pelo tingimento de vermelho do Congo alcoólico alcalino (Puchiler, H., Sweat, EF. e Levine, M. (1962) On the binding of Congo - 10 red by amyloid.
J.
Histochem.
Cytochem., 10: 355-364). As seções de vermelho do Congo de baço e fígado de todos os animais foram independentemente = examinados por um ou mais observadores experimentados, cegos ao tratamento que cada camundongo recebeu, e marcados quanto à quantidade de amiloide presente como anteriormente relatado (Botto et al, (1997) Nature Med., 3: 855-859). As contagens de | a 5 representam um log base 10 aproximadamente variando a escala de 1, correspondente a uma ou duas manchas muito pequenas de amiloide entre várias seções de um órgão particular, a 5, correspondente aos depósitos amplamente abundantes que compreendem cerca de 10.000 vezes mais —amiloide do que o grau 1 (Botto ef al, (1997) Nature Med., 3: 8555-859). As contagens dos observadores diferentes foram sempre altamente concordantes embora alguns observadores também usaram contagens de número inteiro.5 intermediário.
A média aritmética das contagens de todos os observadores para cada órgão em cada animal foram usados para a análise estatística,
— Resultados
Em constraste acentuado com a depuração eficaz de depósitos de amiloide nos camundongos do tipo selvagem suficientes em complemento, houve ainda amiloide abundante presente em ambos os grupos de animais deficientes em complemento embora tendam a ter uma aparência mais
“ fragmentada do que nos dois camundongos deficientes em complemento de . controle de cada tipo.
As contagens medianas, de faixa, de amiloide do baço foram: tipo selvagem, 1,17, 0,0 a 1,5, n= 15; silenciado em C3, 1,92, 1,17 a 4,33, n = 12; silenciado em Clq, 1,25, 1,17 a 3,5, n = 10 (ANOVA não —paramétricode Kruskal-Wallis, P < 0,001). As diferenças entre os controles do tipo selvagem e ambos os grupos deficientes em complemento foram significantes, P < 0,001 para os silenciados em C3 e P = 0,036 (com correção de Bonferroni para comparações múltiplas) para os silenciados em Clg, mas a diferença entre os silenciados em C3 e Clq não foi significante, P = 0,314 - 10 (testes UdeMann-Whitney). Debate ] Em camundongos que carecem de Clq ou C3, o tratamento anti SAP não depurou depósitos de amiloide tão eficazmente quanto nos camundongos do tipo selvagem suficientes em complemento.
A eficácia terapêutica de anti SAP é assim muito substancialmente dependente do complemento é não é mediada apenas pela ligação do anticorpo de IgG que, em teoria, alistaria células fagocíticas por intermédio de seus receptores Fe(y). Não obstante, a aparência mais fragmentada dos depósitos de amiloide persistentes nos camundongos deficientes em complemento sugeriu pelo menos algum efeito de anticorpo sozinho.
Também a tendência para mais depuração em animais deficientes em Cl1q comparados com os deficientes em C3 sugeriu que a ativação de C3 é crítica e que alguma ativação de complemento pode ocorrer na ausência de Cla.
Exemplo 11: Requisito para anticorpo de IzG anti SAP intacto A ativação de complemento pelo anticorpo de IgG requer a molécula inteira intacta, que inclui a região Fc, e prossegue por intermédio do caminho clássico iniciado pela ligação de Clq.
Entretanto, em alguns sistemas de anticorpo-antígeno, a ativação de complemento por intermédio do caminho alternativo pode ser mediado pelo fragmento F(ab);. De modo a confirmar a
' dependência de complemento da depuração de amíiloide pelo anticorpo anti . SAP e para investigar o requisito potencial para a região Fc do anticorpo, o efeito foi testado de anticorpo F(ab); anti SAP que foi produzido pela clivagem com pepsina no pH 4,0 da fração IBG do antissoro de SAP — policlonal de ovelha anti-ser humano (lote 2866) e purificado pelos métodos padrão.
Indução e tratamento de amiloidose AA A amiloidose AA foi induzida e confirmada em camundongos CSTBL/6 do tipo selvagem como detalhado no Exemplo 10 acima.
Depois de - 10 carregar os depósitos de amiloide com o SAP humano também como detalhado no Exemplo 10, grupos de camundongos foram tratados com a ' fração de IgG inteira do antíissoro de SAP policlonal de ovelha anti-ser humano, com apenas veículo de tampão ou com o fragmento F(ab), da fração de IgG.
A dose de atividade de anticorpo anti SAP injetada foi de 7,28 mg por camundongo que recebe F(ab); e 7 mg (50 mg de 1gG total como usual) por camundongo que recebe IgG inteiro.
Todos os camundongos foram mortos 14 dias mais tarde para a estimativa da carga de amiloide pelo tingimento com vermelho do Congo, Resultados A depuração de depósitos de amiloide foi quase completa em camundongos que recebem anticorpo de IgG anti SAP comparado com depósitos maciços de amiloide nos camundongos de controle que recebem apenas veículo.
Os camundongos que recebem F(ab); tiveram menos amiloide do que os controles não tratados, mas ainda substancialmente mais do que os — camundongos tratados com anticorpo de IgG anti SAP inteiro (Tabela 9). Tabela 9. Eficácia reduzida de F(ab); anti SAP comparada ao intacto IeG anticorpo na depuração de depósitos de amiloide.
Pnet Ea tratamento, tamanho do grupo) média, faixa
: Teste de Kruskal-Wallis: baço, P <.0,001; fígado P < 0,001 ' Testes de Mann-Whitney**: 1 vs 2, baço & figado ambos, P < 0,001; 1 vs 3, baço & fígado ambos, P = 0,001; 2 vs 3, baço, P = 0,284; fígado, P = 0,019 E *Caso atípico único no grupo 2 com amiloide do baço pesado a despeito do tratamento com IgG anti SAP.
Excluindo este animal dá uma diferença altamente significante entre a eficácia dos tratamentos com anticorpo anti SAP IgG e F(ab),. **Devido às comparações múltiplas, um valor P de 0,01 ou menos é requerido para significância Debate - A dose molar de anticorpo anti SAP F(ab), usado neste estudo foi de cerca de um terço maior do que aquele de anticorpo IgG, devido ao peso molecular menor do fragmento F(ab), comparado a IgG integral.
Para o efeito ótimo na depuração de amiloide do Fc é requerido.
Isto não é por causa do envolvimento direto de reconhecimento celular pelos receptores de Fe(y) visto que a lgG inteira foi ainda menos eficaz em camundongos deficientes em complemento do que foi F(ab); em camundongos suficientes em complemento.
É provável que a alta dose de F(ab); que foi administrada foi capaz de ativar algum complemento por intermédio do caminho alternativo.
Exemplo12: Requisito para macrófagos Os estudos histológicos e histoquímicos descritos na US 2009/0191 196 mostraram que as células que infiltram, circundam e fagocitam os depósitos de amiloide em camundongos tratados com anticorpo anti SAP são macrófagos.
De modo a confirmar que os macrófagos são de fato responsáveis pela depuração do amiloide, o efeito do tratamento com a fração de IgG inteira do antissoro de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano (lote 2866) foi testado em camundongos em que toda a atividade de macrófago foi inibida pela administração de clodronato lipossômico.
Os reagentes, protocolo experimental e efeitos sobre a função de macrófago de clodronato
. lipossômico são bem estabelecidos e extensivamente documentados (Van ' Rooijen er al, (2002) 1. Liposome Research.
Vol. 12. Pp, 81-94). Indução e tratamento de amiloidose AA Depois da indução e confirmação de amiloidose AA em S — camundongos do tipo selvagem, usando o protocolo detalhado no Exemplo 10 acima, todos os animais receberam uma única dose intraperitoneal de 10 mg de SAP humano puro isolado para carregar seus depósitos com o SAP humano.
O grupo de teste depois recebeu 0,3 ml de clodronato lipossômico pelo modo intraperitoneal imediatamente e nos dias 2, 7 e 14 depois disso. - 10 Um grupo de controle e o grupo de teste receberam uma única dose intraperitoneal de 50 mg da fração de IgG de antissoro de SAP de ovelha anti- ' ser humano no dia 3 depois da injeção de SAP humano.
Um segundo grupo de controle não recebeu nenhum anti SAP e nenhum outro tratamento adicional.
Todos os camundongos foram mortos para a estimativa da carga amiloide pelo tingimento de vermelho do Congo 14 dias depois da administração do anti SAP aos grupos de teste e controle de anticorpo, Resultados O tratamento com anti SAP produziu depuração quase completa de depósitos de amiloide comparado com o grupo que não recebeu nenhum anticorpo.
Ao contrário, em camundongos que receberam o clodronato lipossômico em um regime conhecido por anular completamente a função de macrófago, não houve nenhuma depuração de depósitos de amiíiloide (Tabela 10). Tabela 10. A depleção de macrófago inibe a depuração de depósitos de —amiloide pelo anticorpo anti SAP. 4,0,3,54,5 Teste de Kruskal-Wallis: baço, P < 0,001; fígado P < 0,001 Testes de Mann- Whitney com correção de Bonferroni: 1 vs 2:
- baço & fígado ambos, P < 0,003; 1 vs 3: baço, P = 0,078; fígado, P =0,411;2 . vs 3, baço & fígado ambos, P < 0,003. Debate O resultado neste experimento particular confirmou que a —funçãode macrófago é requerida para a depuração de depósitos de amíloide pelo anticorpo de SAP anti-ser humano, Exemplo 13: Eficácia do anticorpo de SAP de camundongo monoclonal anti- ser humano, SAP-E, na depuração de depósitos de amiloide AA sistêmicos de camundongo. . 10 A capacidade de vários anticorpos monoclonais para mediar a depuração de depósitos de amiloide AA de murino que contém SAP humano ' foi procurada em comparação com o anticorpo de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano padrão como um controle positivo.
Indução e tratamento de amiloidose AA Camundongos transgênicos C57BL/6 silenciados em SAP para SAP humano foram criados pelo cruzamento de animais CS7BL/6 de linhagem pura em que o gene SAP de camundongo foi deletado (Botto er al, (1997) Nature Med,, 3: 855-859) com camundongos CS57BL/6 que carregam um transgene de SAP humano (Yamamura et al, (1993) Mol.
Reprod.
Dev., 36: 248-250 e Gillmore et al, (2004) Immunology, 112; 255-264), Estes camundongos carecem assim de SAP de camundongo mas expressam SAP humano em concentrações significantemente maiores do que aqueles observados no ser humano, A amiloidose AA sistêmica foi induzida. nos camundongos silenciados no SAP de camundongo transgênicos em SAP — humano como descrito no Exemplo 10, e 9 dias depois da injeção final de caseína nos camundongos, a presença é grau de deposição de amiloide foram confirmados como usual pela contagem de corpo inteiro de amiloide depois da injeção de uma dose de traçador de SAP humano rotulado com *L.
Todos os camundongos tiveram quantidades substanciais e comparáveis de amiloide,
s e foram distribuídos em grupos intimamente igualados para receber os . tratamentos diferentes. Uma semana depois da injeção de traçador, cada camundongo recebeu uma dose única de 5 mg de CPHPC pela injeção intraperitoneal, para esgotar o seu SAP humano circulante, seguido 5 h mais tarde por intermédio da mesma via pela fração de IEG de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano padrão (lote 2866, 1 ml a 50 mg/ml de proteína total que contém 7 mg/ml de anticorpo de SAP anti-ser humano) ou 5 mg de um a nove anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais puros isolados diferentes (Tabela 11), Todos os camundongos foram mortos 21 dias depois BR 10 da injeção do anticorpo € a carga de amiloide foi determinada pela histologia em vermelho do Congo de seus baços.
' Tabela 11. A presença de amiloide no baço de camundongos com amiloidose AA sistêmica depois do tratamento com CPHPC e vários anticorpos SAP anti-ser humano.
média, faixa Parent ag [SAP-G monoelonal O gra | Entre os anticorpos monoclonais testados, apenas SAP-E produziu a depuração dos depósitos de amiloide mas o seu efeito foi o mesma como a ação altamente reprodutível e dramática do anticorpo de ovelha policlonal. De maneira importante SAP-E é do isótipo IgG2a de camundongo que é conhecido ativar o complemento de camundongo enquanto que todos os outros monoclonais exceto SAP-B foram isótipo IgG1 de camundongo que não é ativador de complemento. Embora SAP-B seja um isótipo IgG2a de
7 camundongo, à sua ligação ao SAP in vitro foi notavelmente menor do que . aquele de SAP-E e evidentemente não foi suficiente in vivo para ser eficaz.
Debate Estes resultados demonstram que um anticorpo de IgG2a de —SAPde camundongo monoclonal anti-ser humano suficientemente ávido, que ativa complemento, medeia a depuração de amiloide in vivo tão eficazmente quanto o anticorpo de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano.
Exemplo 14: Caracterização comparativa de anticorpos de SAP monoclonal de camundongo anti-ser humano, SAP-K e SAP-E, in vitro, - 10 SAP-K foi selecionado dentre os 6 monoclonais de IgG2a de camundongo diferentes, que se ligam mais avidamente, derivados pelas i técnicas padrão de imunização com SAP humano purificado e uma fusão convencional para produzir hibridomas que foram clonados pelos métodos de rotina.
Entre estes anticorpos de IgG2a, SAP-K mostrou a maior ligação ao SAP humano imobilizado.
Este foi o caso independente de se o SAP humano foi diretamente imobilizado em superfícies. plásticas pela aderência não específica ou pela ligação covalente, ou pela ligação específica dependente de cálcio de SAP aos ligandos imobilizados, sejam fibrilas de amiloide ou o ligando de molécula pequena, fosfoetanolamina.
SAP-K também ligou bem ao SAP diretamente imobilizado na presença ou ausência de cálcio, e se o SAP foi anteriormente complexado com CPHPC e depois covalentemente “fixado? no complexo SAP-CPHPC decamérico (Pepys, M.
B. er al (2002) Targeted pharmacological depletion of serum amyloid P component for treatment of human amyloidosis.
Nature, 417: 254-259; Kolstoe, S.
E. et al (2009) Molecular dissection of Alzheimer's disease neuropathology by depletion of serum amyloid P component, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 106: 7619-7623). SAP-E também ligou-se bem ao SAP humano em todas estas configurações —“diferentes.
Entretanto os dois anticorpos diferem significantemente em que muito mais SAP-K do que SAP-E tornou-se ligado
- quando SAP humano foi apenas escassamente disponível, por exemplo . quando as placas foram expostas a exatamente 1 ug/ml de SAP humano para revestimento, ão passo que quando houve SAP imobilizado mais abundante, por exemplo quando a solução de revestimento conteve 100 ug/ml de SAP, entãohouvemaisligaçãode SAP-E do que SAP-K.
Esta diferença sugere que SAP-E liga otimamente quando mais do que uma molécula SAP situa-se intimamente associada uma com as outras enquanto SAP-K liga avidamente a moléculas de SAP isolada única.
Este mecanismo é sustentado pela descoberta de que quando SAP humano foi imobilizado pela captura nas - 10 placas revestidas com SAP policlonal de ovelha anti-ser humano (lote 2866), que fornecê pares de moléculas SAP mantidas intimamente juntas nos dois ' ramos de cada molécula de anticorpo de IgG de ovelha, SAP-E ligou melhor do que SAP-K em todos os níveis de entrada de SAP humano (Figura 7), À Figura 7 mostra ensaio imunorradiométrico para a ligação —deanticorpos de camundongo monoclonais para SAP humano capturado pelo anticorpo de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano imobilizado.
Substancialmente mais SAP-E do que SAP-K ligado a todas as concentrações de SAP humano oferecidas.
Cada ponto é a média de 3 réplicas.
De maneira muito importante, tanto SAP-E quanto SAP-K —ligaram-se de modo aparente igualmente bem em relação ao SAP humano nativo, mostrado pela imunoprecipitação similar ambos os anticorpos em imunodifusão dupla em gel de agarose tanto contra SAP humano isolado puro quanto soro humano integral.
A ligação similar destes dois anticorpos monoclonais de camundongo foi refletida nos parâmetros similares medidos no instrumento Biacore (BIAcoreX, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia) usando SAP humano covalentemente imobilizado no chip (Tabela 12). Tabela 12. Afinidade de anticorpos monoclonais para SAP humano determinada pelo Biacore
1EL7X10 . Os valores mostrados são média e Desvio Padrão de 3 medições em réplicas Ao contrário, embora ambos os anticorpos ligassem ao SAP humano nativo no western blotting depois da eletroforese em gel de agarose S emtampões fisiológicos, apenas SAP-E ligou-se ao SAP humano no western blotting de SDS-PAGE reduzido, SAP-E assim reconhece SAP humano desnaturado enquanto SAP-K. apenas reconhece SAP humano nativo e deve ser ligado a um epítopo conformacional. - A digestão com CNBr de SAP humano resulta na clivagem entre159M e 160W resultando em um novo peptídeo onde a posição 159 foi convertida de metionina para homosserina lactona (denominada 150-158- homosserina lactona). No western blotting de SDS-PAGE, SAP-E ligou-se ao polipeptídeo de lactona de 1-158-homosserina de terminal N liberado pela clivagem, com CNBr de SAP no resíduo Met159, mas raramente reagiu com o fragmento 1-140 liberado pela digestão com quimiotripsina na ausência de cálcio (Figura 8), O epítopo reconhecido pelo SAP-E portanto deve estar na região 140-158 que evidentemente compreende alguma estrutura secundária resistente à desnaturação visto que a ligação de SAP-E não é potentemente inibida pelos peptídeos 136-147, 138-149, 140-151 e 112-119 em solução.
Isto está compatível com a estabilidade cinética e resistência à desnaturação de SAP (Manning, M. e Colón, W. (2004) Biochemistry, 43: 11248-11254). A Figura 8 mostra mapeamento de epítopo para anticorpo de SAP monoclonal anti-ser humano, SAP-E.
A, sequência de aminoácido completa de SAP humano que mostra os pontos nos quais o mesmo é clivado pelo CNBr em TFA a 70 % (resíduo 159M) e pela quimiotripsina, sem redução/carbamidometilação, em bicarbonato de amônio na ausência de cálcio, (resíduos 140Y e 144F). B, a análise de SDS-PAGE de SAP clivou com CNBr, Painel esquerdo: mancha de azul de Coomassie; linha 1, SAP de
7 controle não tratado; linha 2, SAP depois da clivagem com CNBr, mostrando . traço do protômero residual não clivado intacto e os fragmentos esperados em aproximadamente 20 kD (resíduos 1-158-homosserina-lactona) e SKD (160- 204) respectivamente.
Estes foram precisamente confirmados pela espectrometria de massa.
Painel direito: Western blot com o SAP-S mostrando tingimento intenso de SAP não tratado intacto nas linhas 1 (100 ng carregado) e 2 (10 ng), e também SAP intacto residual e o resíduo maior do fragmento de 1-158-homosserina-lactona em CNBr clivou SAP nas linhas 3 (600 ng), 4 (130 ng) e 5 (64 ng). A linha 6 conteve CRP isolado puro humano . 10 com queoSAP-S não reagiu de modo algum.
C, SDS-PAGE a análise de SAP digerido com quimiotripsina.
Painel esquerdo: mancha de azul de ' Coomassie; linha 1, SAP de controle não tratado; linha 2, SAP depois da digestão com quimiotripsina, mostrando os fragmentos maiores esperados correspondentes aos resíduos 1-140 e 145-204. Estes foram precisamente confirmados pela espectrometria de massa.
Painel direito: Western blot com o SAP-E mostrando tingimento intenso de SAP não tratado intacto nas linhas 1 (500 ng carregados) e 2 (100 ng), e também SAP residual intacto nas linhas 3 e 4 que contiveram o SAP digerido com quimiotripsina em cargas diferentes.
Ligação muito fraca de SAP-E ao fragmento de resíduo 1-140 é observado —apenasnalinha3 que foi mais pesadamente carregada.
As linhas 5 (500 ng) e 6 (100 ng) contiveram CRP humano puro isolado com que o SAP-E não reagiu de modo algum.
D, Comparação de sequência entre SAP humano (h) e SAP de camundongo (m) para os resíduos 136-147, Painel de topo, as diferenças indicadas acima pelos resíduos mostrados em preto na sequência —demurino.
Painel de fundo, posição desta alça prolongada com 140Y no seu ápice mostrado em branco na estrutura da subunidade 3D de SAP humano, Os resíduos diferentes na sequência de murino são mostrados em preto.
As esferas cinzas representam os átomos de cálcio ligados na bolsa de ligação de ligando,
. O epítopo conformacional reconhecido por SAP-K foi . identificado pela tecnologia de mapeamento de epítopo CLIPS& (Pepscan Presto BV) como a alça periférica exposta, resíduos 121-131, na circunferência do disco como molécula de SAP nativa pentamérica.
A Figura 9 mostra a localização dos epítopos no SAP humano reconhecido por SAP-K (A, salientado em preto, como determinada pela tecnologia CLIPS&) e SAP-E (B, mostrado em branco, 140-158 como determinada pelos resultados de ligação com o produto de clivagem CNBr de SAP e o fragmento liberado pela digestão com quimiotripsina na ausência de - 10 cálcio). Exemplo 15: Eficácia de anticorpo SAP-K de SAP de camundongo monoclonal anti-ser humano na depuração de depósitos de amiloide in vivo no modelo de amiloidose AA de camundongo. A potência de SAP-K foi comparada com a ação do anticorpo de ovelha policlonal padrão na depuração de depósitos de amiloide AA sistêmico estabelecidos em camundongos. Indução de amiloidose AA e tratamento A amiloidose AA foi induzida e confirmada nos camundongos C57BL/6 do tipo selvagem como detalhado no Exemplo 10 acima. Depois de carregar os depósitos de amiloide com o SAP humano também detalhado no Exemplo 10, os grupos de camundongos foram tratados com 50 mg por camundongo de IgG total como a fração de IgG inteira (lote 2866) do anti- soro de SAP de ovelha policlonal anti-ser humano que fornece uma dose de 7 mg de anticorpo anti SAP real, SAP-K purificado isolado em uma dose de 5 mg por camundongo, SAP-K purificado isolado em uma dose de 1 mg por camundongo, €, como um controle negativo, anticorpo de IgG2a de camundongo monoclonal purificado isolado específico para um antígeno humano não relacionado e não reativo com SAP humano ou qualquer antígeno de murino. Todos os camundongos foram mortos 17 dias mais tarde
* para a estimativa da carga de amiloide pelo tingimento com vermelho do . Congo. Resultados Os camundongos tratados com 5 mg de SAP-K mostrou a mesma depuração notável de depósitos de amiloide esplênicos e hepáticos como observado com a dose de 7 mg de anticorpo policlonal de ovelha. Apenas pequenas manchas traço de amiloide permaneceram nos baços dos camundongos tratados e nenhuma sob qualquer condição foi detectada em muitos dos fígados, contrastando acentuadamente com os depósitos de . 10 amiloide esplênicos e hepáticos extensivos em todos os animais que receberam o anticorpo de IgG2a de camundongo de controle irrelevante : (Tabela 13). Nas doses mais baixas de | mg, 0,5 mg e 0,1 mg (dados não mostrados para 0,5 mg e 0,1 mg) de SAP-K por camundongo, não houve nenhum efeito significante, Tabela 13. Efeito de anticorpo de SAP de I8G2a monoclonal de camundongo anti-ser humano SAP-K sobre os depósitos de amiloide viscerais em camundongos com amiloidose AA sistêmica.
Contagem de Amiloide: média, faixa Grupo (tratamento, tamanho do grupo) Baço Figado 1 (camundongo de controle negativo IgG2a, n =8) 4,08, 1,54,50 — 2,42,2,02,67 27 mg de anticorpo SAP de ovelha policional IeG 117, LO-L5 1,0, 0,67-1,17 anti-ser humano, n=5)
3.(1 mg de anticorpo SAP monocional de camundongo 3,5,2,83-4,5 1,83, 1,0-2,83 TgG2a anti-ser humano, SAP-K, n=10) 415 mg de anticorpo SAP monoclonal de camundongo 1,25, 102,0 1,0, 1,0-1,33 1gG2a anti-ser humano, SAP-K, n=10).
Teste de Kruskal-Wallis: baço, P < 0,001; fígado P. 0,001 Testes de Mann-Whitney *: 1 vs 2, baço, P = 0,002; fígado, P =0,002;1vs3, baço, P=0,173; fígado, P = 0,083; 1 vs 4, baço, P < 0,001; fígado, P < 0,001; 2 vs 3, baço, P = 0,0,001; fígado, P =.0,019; 2 vs 4, baço, P = 0,513; fígado, P = 0,768; 3 vs 4, baço, P < 0,001; fígado, P = 0,004. *Devido às comparações múltiplas, um valor P de 0,01 ou menos é requerido para significância.
Debate : Estes resultados demonstram a eficácia na depuração de depósitos de amiloide in vivo de um anticorpo de SAP monoclonal anti-ser humano, do isótipo IgG2a de camundongo quê ativa complemento, que especificamente reconhece um epítopo conformacional.
Assim anticorpos de SAP monoclonal anti-ser humano para o uso de acordo com a presente invenção pode ser direcionado a epítopos predominantemente de sequência, tal como anticorpo SAP-E, ou a epítopos totalmente conformacionais, tais como SAP-K. : 10 Exemplo 16: Comparação da eficácia de SAP-E e SAP-K. na depuração de depósitos de amiloide AA sistêmicos em camundongos, e estimativa das Í concentrações plasmáticas de anticorpo anti SAP.
Tndução de amiloidose AA e tratamento A amiloidose AA foi induzida e confirmada em camundongos 15º CSTBL/6 do tipo selvagem como detalhado no Exemplo 10 acima.
Depois de carregar os depósitos de amiloide com o SAP humano também detalhado no Exemplo 10, grupos de camundongos foram tratados com 3 mg e | mg por camundongo dos dois anticorpos diferentes.
Um grupo de controle, em que o amiloide também foi induzido, recebeu apenas PBS ao invés de anticorpo e dois outros grupos foram administrados com a dose eficaz conhecida de 5 mg/camundongo de cada anticorpo.
Todos os camundongos foram sangrados para o ensaio de anticorpo anti SAP circulante nos dias 1, 5 e 15 depois da dosagem com anticorpo, e todos foram mortos no dia 21 para a estimativa da carga de amiloide pelo tingimento com vermelho do Congo.
Todos os soros foram ensaiados quanto à atividade anti SAP usando um ensaio imunorradiométrico robusto padronizado com SAP-E e SAP-K purificados respectivamente, reforçados nas concentrações conhecidas em soro de camundongo normal.
Resultados
. A carga de amiloíde foi contada por quatro observadores experimentados independentes todos cegos para a identidade de cada tecido examinado, As contagens de todos os observadores foram, como usual altamente concordantes e para a análise estatística, as contagens totais de todos os observadores tanto para o baço quanto para o fígado para cada camundongo foram somadas.
Ambos os anticorpos foram eficazes, como anteriormente demonstrado, e houve um efeito dependente da dose evidente mas SAP-E foi aparentemente mais potente do que SAP-K nas doses mais baixas, ' 10 Tabela 4, Comparação de potência entre SAP-E e SAP-K na depuração de depósitos de amiloide AA viscerais (tratamento, nº de camundongos) média, faixa Teste de Kruskal-Wailis: P < 0,001 Testes de Mann-Whitney*: K5 vs ES, P = 0,095; K3 vs E3, P = 0,684; K1 vs El, P = 0,001; K5 vs K3, P = 0,594; K5 vs K1, P = 0,001; K3 vsKl,P<0,001;E5 vs E3, P = 0,008; E5 vs EI, P = 0,001; E3 vs EL, P= 0,004; K5 vs C, P = 0,001; ES vs C, P = 0,001; K3 vs C, P<0,001; E3 vs C, P <0,001; K1 vs C, P = 0,043; El vs C, P < 0,001. *Devido às comparações múltiplas, um valor P de 0,01 ou menos é requerido para significância.
As concentrações da atividade de anticorpo anti SAP circulante foram forte e compativelmente dependentes da dose depois da dose única administrada a todos os animais, separado de um único indivíduo afastado em cada um dos grupos de dose mais baixa.
Depois da dose de 1 mg por camundongo, nada retrogradadas acima foi no geral detectável mesmo no dia | na maioria dos camundongos.
Ao contrário, depois da dose de 5 mg — anticorpo abundante ainda foi presente no dia 15, e depois de 3 mg a maioria
. dos camundongos tiveram anticorpo circulante no dia $ mas pouco depois de . 15 dias (Tabela 15). Não houve nenhuma diferença significante entre os padrões para SAP-E e SAP-K.
Tabela 15. Concentração sérica de anticorpo anti SAP depois das doses intraperitoneais únicas.
Concentração anti SAP depois da dosagem média, faixa (ug/ml)* (dose de anticorpo anti SAP) K5 950, 840-1200 — | 400,300-480 (SAP-K 5 mg SAP-E 5 mg . Ki 240, 50-600 40, 8-280 (SAP-K 3 mg - (SAP-E 3 mg SAP-K. | mg El 7,6-280 7,6-120 5,3-12 (SAP-E | mg apenas PBS) *Concentrações de anticorpo anti SAP aparentes abaixo de 17 pg/ml são retrogradadas para o ensaio e não representam nenhuma atividade genuína.
Debate Na comparação direta de ponta a ponta houve evidência compatível de que SAP-E foi leve mas significantemente mais potente do que SAP-K.
Depois da administração de 1 mg por camundongo nenhuma atividade de anticorpo anti SAP circulante foi detectável um dia mais tarde, tendo evidentemente todos localizados para o SAP humano dentro dos depósitos de amiloide.
Depois da dose de 3 mg anti SAP abundante foi presente na circulação no dia | e foi ainda presente no dia 5. Depois de 5 mg por camundongo houve ainda uma concentração significante de anti SAP no sangue depois de 15 dias.
Estas observações sugerem que doses pequenas repetidas de anticorpo anti SAP podem ser suficientes para deflagra a depuração de amiloide, Exemplo 17: Comparação da eficácia da dose baixa de SAP-E e SAP-K na s depuração de depósitos de amiloide AA sistêmicos em camundongos. : Indução de amiloidose AA e tratamento A amiloidose AA foi induzida e confirmada em camundongos C5TBL/6 do tipo selvagem como detalhado no Exemplo 10 acima.
Depois de carregar os depósitos de amiloide com o SAP humano como também detalhado no Exemplo 10, grupos de camundongos (n = 10 cada) foram tratados com doses únicas de 0,5 mg e | mg por camundongo dos dois anticorpos diferentes, ou 6 doses repetidas de 0,15 mg, dadas em intervalos de 3 ou 4 dias.
Um grupo de controle (n = 9), em que o âmiloide também foi . 10 induzido, recebeu apenas PBS ao invés de anticorpo e dois outros grupos (n = 3 cada) foram administrados com a dose eficaz conhecida de 5 mg/camundongo de cada anticorpo.
Todos foram mortos no dia 29 para a estimativa da carga de amiloide pelo tingimento com vermelho do Congo, Resultados As doses baixas, que incluem a dose muito baixa repetida, mostrou eficácia significante na redução da carga de amiloide, especialmente no fígado.
SAP-E foi mais uma vez evidentemente mais potente do que SAP-K.
Tabela 16. Comparação da potência entre doses baixas de SAP-E e SAP-K na depuração de depósitos de amiloide AÁ viscerais Contagem de Amiloide, (média, faixa) Grupo Baço Fígado C, controle negativo apenas PBS 4,5, 4,0-4,75 3,25, 2,0-4,0 EI, SAPE | mg 1,25, 1,0-4,25 1,0, 0,5-1,25 EO0,5, SAP-E 0,5 mg 4,75, 1,0-5,0 1,0, 0,5-3,5 Erep, SAP-E 6x 0,15 mg 3,5, 2,0-4,5 0,5,0,0-3,25 K1, SAP-K | mg 4,13, 1,0-5,0 1,0, 0,0-4,0 KO0,5, SAP-K 0,5 mg, 4,25, 1,75-4,5 1,13, 0,0-2,75 Krep, SAP-K 6x 0,15 mg 4,38, 1,5-4,75 1,0, 0,0-2,25 Teste de Kruskal- Wallis: baço, P < 0,001; fígado, P = 0,001 Testes de Mann-Whitney*: El vs C: baço, P < 0,001; fígado P < 0,001; E0,5 vs C: baço, P = 0,604; fígado P = 0,004; Erep vs C: baço, P0,002; fígado, P < 0,001; K1 vs C: baço, P = 0,065; fígado, P = 0,001; K0,5 —wvsC: baço, P=0,022; fígado, P =0,001; Krep vs C: baço, P =0,079; fígado,
. P <0,001; EI vs E0,5: baço, P = 0,005; fígado P = 0,143; El vs Erep: baço, P . = 0,043; figado, P = 0,280; E0,5 vs Erep: baço, P = 0,019; fígado, P = 0,043; K1 vs K0,5: nenhuma diferença significante; K1 vs Krep: nenhuma diferença significante; K0,5 vs Krep: nenhuma diferença significante; El vs K1: baço, P =0,015; fígado, P=0,353; EO0,5 vs K0,5: nenhuma diferença significante; Erep vs Krep: nenhuma diferença significante. *Devido às comparações múltiplas, um valor P de 0,01 ou menos é requerido para significância. Debate A potência significantemente maior de SAP-E do que SAP-K. parece ser reprodutível. A eficácia de doses ainda mais baixas quando administradas repetidamente e a sugestão de efeitos maiores sobre os depósitos de amiloide do fígado do que baço são de interesse e significância clínica potencial. Exemplo 18: Ativação de complemento pelos anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais humanizados in vitro.
A ativação de complemento é essencial para a eficácia da depuração de amiloide pelos anticorpos de SAP anti-ser humano de acordo com a presente invenção. A capacidade dos anticorpos monoclonais humanizados, SAP-E HIL1 e SAP-K H3LO, para ativar C3 em soro de ser humano e camundongo foi comparada in vitro pela adição de quantidades diferentes dos anticorpos puros isolados ao soro humano integral que contém uma concentração de SAP de 30 mg/l, ou ao soro de camundongo integral que foi reforçado com SAP humano puro isolado para esta mesma concentração. Em ambos os casos o soro foi fresco e condições de complemento suficientes e experimentais foram ideais para a ativação de complemento com o tampão de teste de fixação de complemento (CFT) como o diluente.
As seguintes misturas foram feitas (Tabela 17): Tubo Soro Anticorpo Concentrações Finais (ug/ml) nm anti SAP monoclonal Anti SAP SAP humano MI —Camundongo+ SAP humano SAP-E HIL1 15 30
M2 —Camundongo+SAPhumano SAP-EHILI 30 30 Í M3 —Camundongo+tSAPhumano SAP-EHILI 60 30 M4 —Camundongo+SAPhumano SAPEHILI 120 30 . MS —Camundongo+SAPhumano SAP-KH3LO 15 30 M6 —Camundongo+SAPhumano SAP-KH3LO 30 30 M7 Camundongo+SAPhumano SAP-KH3LO 60 30 M8 Camundongo+SAPhumano —SAP-KH3LO 120 30 M9 —Camundongo+SÁPhumano — Nenhuma o 30 HI Ser Humano SAP-E HIL1 15 30 H2 — SerHumano SAP-E HIL] 30 30 Hs Ser Humano SAP-E HIL] 60 30 H4 Ser Humano SAP-E HIL] 120 30 Hs Ser Humano SAP-K H3LO 15 30 HnH6 Ser Humano SAP-K H3LO0 30 30 HT Ser Humano SAP-K H3LO0 so 30 H8 — SerHumano SAPKH3LO — 120 30 Ho Ser Humano Nenhuma 0 30 : Todos os tubos foram incubados a 37º C por 2 horas para à permitir que a ativação de complemento se processasse.
Visto que a ativação espontânea lenta sempre ocorre no soro, dois controles adicionais foram fomecidos, réplicas de M9 e H9, designadas M10 e HI1O0, que não foram S —incubadas mas foram congeladas a -80º C imediatamente depois da mistura e depois descongeladas exatamente antes de ensaiar quanto à clivagem de C3. A comparação entre M/H9 e M/HIO0 permite a distinção entre a clivagem espontânea de C3 e qualquer ativação adicional produzida pelo anticorpo anti SAP, assim como qualquer efeito da adição de SAP humano sozinho rf soro de camundongo.
A clivagem de C3 no soro humano foi ensaiada por duas eletroimunoforeses dimensionais usando anticorpo monoespecífico contra C3o.
Este método é de baixa sensibilidade para a clivagem de C3 de camundongo porque as mobilidades eletroforéticas diferentes de camundongo C3 são mais difíceis de distinguir com segurança do que é o caso com C3 humano.
À clivagem de C3 de camundongo foi portanto ensaiada pela eletroforese em gel de agarose seguido pelo imunomanchamento com anticorpo C3 anticamundongo monoespecífico.
Resultados Ambos os anticorpos humaníizados eficientemente ativaram
- complemento humano, evidenciado pela clivagem dependente da dose maior de C3, produzir redução no tamanho do pico de imunoprecipitação de C3 nativo de mobilidade mais baixa e aumento no tamanho do pico C3c clivado mais rápido (Figura 10). A Figura 10 mostra a ativação C3 pelos anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais humanizados em soro humano integral.
Em nm ensaio que inclui o comrole para a clivagem de C3 na linha de base na amostra H10, está claro que mesmo a dose mais baixa de ambos os anticorpos anti SAP produz mais clivagem de C3 do que observado - 10 —nocontrole de clivagem espontânea sem anticorpo (Figura 11). A Figura 11 mostra a ativação de C3 pela dose baixa de ' anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonaíis humanizados em soro humano integral.
Resultados muito similares foram obtidos para a clivagem de camundongo C3 no soro de camundongo integral suplementado com o SAP humano. Ambos os anticorpos mostraram a clivagem dependente da dose de C3 de camundongo nativo que leva à intensidade diminuída da faixa de C3 nativo de mobilidade lenta e intensidade aumentada da forma ativada de mobilidade mais rápida. Também mesmo a dose mais baixa de cada anticorpo produzia mais clivagem de C3 do que foi observado no controle sem anticorpo, de ativação espontânea (Figura 12).
A Figura 12 mostra a ativação de C3 pelos anticorpos de SAP anti-ser humano monoclonais humanizados em soro de camundongo integral suplementado com o SAP humano puro.
— Debate Ambos os anticorpos de SAP antí-ser humano monoclonais humanizados eficientemente ativam complemento na presença de SAP humano e são assim candidatos adequados para o uso no tratamento de amiloidose sistêmica, e qualquer outra doença causada pelos depósitos de
: amiloide extracelulares nos tecidos, de acordo com a presente invenção.
SEQUÊNCIA CONCORDANCE ' SEQ ID NO
L 2 sequência de aminoácido de CDRH3 de SAP-E equência de aminoácido de CDRL1 de SAP-E Sequência de aminoácido de CDRL2 de SAP-E Ee | Seguência de aminoácido de CDRL3 de SABE | BE Sequência de DNA de Vide SAP a sequência de aminoácido de V de SAP-E o Sequência de DNA de VIIude SAPE--- un . sequência de aminoácido de CDRL3 de SAP-K [8 Sequência de DNA de Vg de SAP 9 pesada variável humana de IGHV 1-69 Sequência de aminoácido H1 da variante Vr humanizada de SAP-E 29 31 equência de aminoácido HA da variante Vy humanizada de SAP-E sequência de aminoácido aceitadora da linha germinativa da cadeia leve variável humana de IGKV1-39 Sequência de amincácido L] variante V, humanizada de SAP-E sequência de aminoácido de SAP de Homo sapiens
[48 | sequência de nucleotídeo quimérica VL de SAPK sada variável humana IGHV 1-69 pesada variável humana IGHV 1-39 humanizada de SAP-E não otimizada no códon humanizada de SAP-E não otimizada no códon humanizada de SAP-E (otimizada no códon Sequência de nucleotídeo H] variante da região V de cadeia pesada humanizada de SAP-E (otimizada no códon humanizada de SAP-E (otimizada no códon) humanizada de SAP-E (otimizada no códon) " humanizada de SAP-E (otimizada no códon - humanizada de SAP-E (otimizada no códon) º humanizada de SAP-E (otimizada no códon' 7 humanizada de SAP-E (otimizada no códon humanizada de SAP-E (otimizada no códon) humanizada de SAP-E humanizada de SAP-E (otimizada no códon) [| fumeaaesare o mo mms E E e e humanizada de SAP-E humanizada de SAP-E não otimizada no códon E atada caga tras humanizada de SAP-E não otimizada no códon trumanizada de SAP-E (otimizada no códon ESSE ES Ss TEA humanizada de SAP-E (otimizada no códon E 0 A antdalndaaal humanizada de SAP-E (otimizada no códon humanizada de SAP-K (otimizada no códon 7 humanizada de SAP-E (otimizada no códon) 7 humanizada de SAP-E (otimizada no códon humanizada de SAP-E (otimizada no códon: humanizada de SAP-E (otimizada no códon)
(otimizada no códon) ' Sequência de sinal para cadeias de imunoglobulina

Claims (37)

. REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação de antígeno não murino, caracterizada ' pelo fato de que se liga especificamente ao SAP e compete quanto à ligação ao SAP com um anticorpo de referência que compreende uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 7, e uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 9.
2. Proteína de ligação de antígeno não murino, caracterizada pelo fato de que se liga ao SAP e compreende CDRH3 apresentada na SEQ ID NO: 3 ou uma variante funcional de CDRH3. - 10
3. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente Ú uma ou mais ou todas CDRs selecionadas de: CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 12, CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), e CDRL3 (SEQ ID NO: 6); ou uma variante funcional de CDRHI, 15º CDRH2, CDRLI, CDRL2 ou CDRL3.
4, Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a variante funcional em CDRH3 é uma variante da SEQ TD NO: 3 em que Ser 102 é substituído por Tyr, His, Val, Tle, Asp ou Gly.
5. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que: (a) a variante funcional em CDRHI1 é uma variante da SEQ ID NO: 1 em que Tyr 32 é substituído por Tle, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu ou Asp; Asn 33 é substituído por Tyr, Ala, Trp, Gly, Thr, Leu ou Val; Met 34 é — substituído por Tle, Val ou Trp; e/ou His 35 é substituído por Glu, Asn, Gln, Ser, Tyr ou Thr; (b) a variante funcional em CDRH2 é uma variante da SEQ ID NO: 2 em que Tyr 50 é substituído por Arg, Glu, Trp, Gly, Gin, Val, Leu, Asn, Lys ou Ala; IleS1 é substituído por Leu, Val, Thr, Ser ou Asn; Tyr 52 é
. substituído por Asp, Leu, Asn ou Ser, Gly 53 é substituído por Ala, Tyr, Ser, . Lys, Thr ou Asn, Asp 54 é substituído por Asn, Ser, Thr, Lys ou Gly; Asn 56 é substituído por Tyr, Arg, Glu, Asp, Gly, Val, Ser ou Ala; e/ou Asn 58 é substituído por Lys, Thr, Ser, Asp, Arg, Gly, Phe ou. Tyr; (c) a variante funcional em CDRL 1 é uma variante da SEQ ID NO: 4 em que Asn 28 é substituído por Ser, Asp, Thr ou Glu; He 29 é substituído por Val; Tyr 30 é substituído por Asp, Leu, Val, Ile, Ser, Asn, Phe, His, Gly ou Thr; Ser 31 é substituído por Asn, Thr, Lys ou Gly; Tyr 32 é substituído por Phe, Asn, Ala, His, Ser ou Arg; Leu 33 é substituído por Met, : 10 Val, IleouPhe; e/ou Ala 34 é substituída por Gly, Asn, Ser, His, Val ou Phe; (d) a variante funcional de CDRL2 é uma variante da SEQ ID i NO: 5 em que Ala 51 é substituído por Thr, Gly ou Val; e/ou (e) a variante funcional em CDRL3 é uma variante da SEQ ID NO: 6 em que Gln 89 é substituído por Ser, Gly, Phe ou Leu; His 90 é substituído por Gln ou Asn; His 91 é substituído por Asn, Phe, Gly, Ser, Arg, Asp, Thr, Tyr ou Val; Tyr 92 é substitaído por Asn, Trp, Thr, Ser, Arg, Gln, His, Ala ou Asp; Gly 93 é substituído por Glu, Asn, His, Thr, Ser, Arg ou Ala; Ala 94 é substituído por Asp, Tyr, Thr, Val, Leu, His, Asn, He, Trp, Pro ou Ser; e/ou Leu 96 é substituído por Pro, Tyr, Arg, Ile, Trp ou Phe.
6. Proteína de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de que se liga especificamente ao SAP, em que a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo quimérico ou humanizado que compreende a CDRH3 correspondente da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 7, ou uma variante funcional de CDRH3.
7. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais ou todas das CDRs correspondentes selecionadas da CDRHI ou CDRH2 da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 7; ou CDRLI, CDRL2, CDRL3 da sequência de domínio variável da SEQ ID NO: 9; ou uma
- variante funcional de CDRH1, CDRH2, CDRL1, CDRL2 ou CDRL3.
8. Proteína de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de ] que se liga especificamente ao SAP, e compreende uma unidade de ligação H3 que compreende os resíduos de Kabat de 95-101 da SEQ ID NO: 7, ou uma variantefuncionalda unidade de ligação H3, ' 9. Proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais ou todas as unidades de ligação selecionadas de: H1 que compreende os resíduos de Kabat de 31-32 da SEQ ID NO: 7, H2 que compreende os - 10 resíduos de Kabat de 52-56 da SEQ ID NO: 7, L1 que compreende os resíduos de Kabat de 30-34 da SEQ ID NO:
9, L2 que compreende os i resíduos de Kabat de 50-55 da SEQ ID NO: 9; e L3 que compreende os resíduos de Kabat de 89-96 da SEQ ID NO: 9; ou uma variante funcional de unidade de ligação H1, H2, LI, L2 ou L3,
10. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de | a 9, caracterizada pelo fato de que a proteina de ligação de antígeno compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve em que; (a) a estrutura de cadeia pesada compreende os seguintes resíduos: Val, Ile ou Gly na posição 2; Leu ou Val na posição 4; Leu, Ile, Met ou Val na posição 20; Cys na posição 22; Thr, Ala, Val, Gly ou Ser na posição 24; Gly na posição 26; Ile, Phe, Leu ou Ser na posição 29; Trp na posição 36; Trp ou Tyr na posição 47; Ile, Met, Val ou Leu na posição 48; Ile, Leu, Phe, Met ou Val na posição 69; Val, Ala ou Leu na posição 71; Ala, Leu, Val, Tyrou Phe na posição 78; Leu ou Met na posição 80; Tyr ou Phe na posição 90; Cys na posição 92; e/ou Arg, Lys, Gly, Ser, His ou Asn na posição 94; e/ou (b) a estrutura de cadeia leve compreende os seguintes resíduos: Ile, Leu ou Val na posição 2; Val, Gln, Leu ou Glu na posição 3;
. Met ou Leu na posição 4; Cys na posição 23; Trp na posição 35; Tyr, Leu ou Phe na posição 36; Leu, Arg ou Val na posição 46; Tyr, His, Phe ou Lys na Ú posição 49; Tyr ou Phe na posição 71; Cys na posição 88; e/ou Phe na posição
98.
11. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que: a estrutura de cadeia pesada compreende os seguintes resíduos: Val na posição 2, Leu na posição 4, Val na posição 20, Cys na posição 22, Ala na posição 24, Gly na posição 26, Phe na posição 29, Trp na posição 36, Trp na posição 47, Met na —posição48,Tlena posição 69, Ala na posição 71, Ala na posição 78, Met na posição 80, Tyr na posição 90, Cys na posição 92, e Arg na posição 94, e/ou a ] estrutura de cadeia leve compreende os seguintes resíduos: Ile na posição 2, Gln na posição 3, Met na posição 4, Cys na posição 23, Trp na posição 35, Tyr na posição 36, Leu na posição 46, His na posição 49, Phe na posição 71, Cysnaposição 88, e Phe na posição 98.
12. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma estrutura de anticorpo de domínio variável de cadeia pesada tendo identidade de sequência de 75 % ou maior com as regiões de — estrutura como mostradas na SEQ ID NO: 25; e/ou uma estrutura de anticorpo de domínio variável de cadeia leve tendo identidade de sequência de 75 % ou maior com as regiões de estrutura como mostradas na SEQ ID NO: 32, 13, Proteína de ligação de antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao SAP e compreende uma região variável de — cadeia pesada selecionada das SEQ ID NOs: 27-31; e/ou uma região variável de cadeia leve selecionada das SEQ ID NOs: 34 a 36; ou uma região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve variantes com identidade de sequência de 75 % ou maior.
14, Proteína de ligação de antígeno, caracterizada pelo fato de
. que se liga especificamente ao SAP e compreende uma cadeia pesada da SEQ : 1D NO: 62; e/ou uma cadeia leve da SEQ ID NO: 64; ou uma cadeia pesada ou leve variantes com identidade de sequência de 75 % ou maior.
15. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer 5 umadasreivindicações del a l4, caracterizada pelo fato de que o SAP é SAP humano que é ligado às fibrilas de amiloide in vivo.
16. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno se liga à face A de SAP humano.
- 10 17. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a proteína de : ligação de antígeno ativa o sistema de complemento humano.
18. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, 8, 9 ou de 15 a 17, caracterizada pelo fato de queé quimérica, humanizada ou humana.
19, Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno compreende um humano de TgG1 ou I2G3 domínio constante humano.
20. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
21. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico compreende —aSEQIDNO:54 e/ou SEQ ID NO: 59,
22, Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 61 e/ou SEQ ID NO: 63.
23. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que
“ compreende uma molécula de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações de 20 a 22. 24, Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão como definido na reivindicação 23.
25. Método para a produção de uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira como definido na reivindicação 24 e recuperar a proteína de ligação de antígeno.
: 10 26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer Ú uma das reivindicações de 1 a 19 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
27. Método para tratar um indivíduo afligido com uma doença associada com a deposição de amiloide, caracterizado pelo fato de que o método compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 ou da composição como definido na reivindicação 26.
28, Método para prevenir uma doença associada com a deposição de amiloide em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz de uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 ou a composição como definido na reivindicação 26.
29, Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno deve ser administrada com um composto de esgotamento de SAP.
30. Proteína de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que é para o uso
- no tratamento ou prevenção de uma doença associada com a deposição de amiloide, em que a dita protema de ligação de antígeno deve ser administrada Í com um composto de esgotamento de SAP.
31. Composto de esgotamento de SAP, caracterizado pelo fato —dequeéparaousono tratamento ou prevenção de uma doença associada com a deposição de amiloide, em que o dito composto de esgotamento de SAP deve ser administrado com uma proteína de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
32. Método de acordo com as reivindicações 27, 28 ou 29, : 10 uma proteína de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 29, ou um composto de esgotamento de SAP de acordo com a reivindicação 31, caracterizados pelo fato de que a administração da proteína de ligação de antígeno e do composto de esgotamento de SAP é sequencial,
33. Método, uma proteína de ligação de antígeno, ou um composto de esgotamento de SAP de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o composto de esgotamento de SAP deve ser administrado primeiro.
34, Método, uma proteina de ligação de antígeno, ou um composto de esgotamento de SAP de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação de antígeno deve ser administrada quando substancialmente todo do SAP circulante no indivíduo foi depurado.
35. Método de acordo com as reivindicações 27, 28, 29, 31, 33, ou 34, uma proteina de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 30,32, 33, ou 34, ou um composto antagonista de SAP de acordo com as reivindicações 31, 32, 33, ou 34, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste de: amiloidose sistêmica, amiloidose local, doença de Alzheimer, diabete tipo 2, amiloidose relacionada com a diálise, amiloidose de cadeia de imunoglobulina monoclonal (AL) e
: angiopatia amiloide cerebral.
36. Método de acordo com as reivindicações 27, 28, 29, 32, Í 33, 34, ou 35, uma proteína de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 30, 32, 33, 34, ou 35, ou um composto de esgotamento de SAP de acordo com as reivindicações 31, 32,33, 34, ou 35, caracterizado pelo fato de que o composto de esgotamento de SAP é um derivado de D-prolina ou um derivado de piruvato cíclico de glicerol.
37. Método, proteína de ligação de antígeno ou composto de esgotamento de SAP de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo - 10 —fatode que o derivado de D-prolina é CPHPC.
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