KR20120093400A - 아밀로이드?베타 펩티드에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 β-아밀로이드 펩티드에 결합되는 항체, 상기 항체로 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병 또는 질환을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

아밀로이드?베타 펩티드에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST AMYLOID-BETA PEPTIDE}

본 발명은 β-아밀로이드 펩티드 및 특히 사람 β-아밀로이드 펩티드에 결합되는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체로 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 특히 알츠하이머병을 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 하기 설명으로부터 명백할 것이다.

알츠하이머병(AD)은 세계적으로 1200만 명을 초과하는 개인이 걸린 연령-관련 인식능 감소의 가장 일반적인 원인이다 (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057). 이 질병의 가장 초기 단계는 인식능 감소와 관련된 기억력의 점진적인 손실 및 언어와 거동 불편이다. 이 질병의 후기 단계에서, 환자는 총체적인 기억상실을 갖게 되고 매우 감소된 운동 기능을 지닌다. 사망은 통상적으로 진단 9년 후에 발생하며 종종 다른 질환, 통상적으로 폐렴과 연관된다 (Davis K. L. and Samules S.C. (1998) in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J. and Coyle J.T. (McGraw-Hill, New York pp267-316)). 현재의 치료법은 징후에 관한 접근법이며, 인식능 손상을 완화시키고 진행 중인 질병 병인학과 관련된 거동 징후를 개선하는데 초점을 맞추고 있다. 실제로, 이러한 치료는 짧게 지속되는 인식능 이익만을 제공하며 인식능 손상 수준은 2년까지만 지속되는 것으로 보고된다. 질병의 진행을 늦추거나 가능하게는 정지시키는 질병-개질 치료법에 대한 가능성은 무수히 많다. 이러한 접근법은 환자 및 중요하게는 이들을 돌보는 사람의 삶의 질에 대한 근본적이고 지속적인 개선을 제공할 뿐만 아니라 이 질병을 관리하기 위한 전체적인 막대한 비용을 감소시킬 것이다.

알츠하이머병의 임상적인 진단은 가능하거나 있음직한 알츠하이머병의 진단을 야기하는 물리적 및 정신적 시험의 조합에 기초한다. 이 질병은, 사후에, 뇌에서의 잘 특성화된 신경학적 검증에 의해 확인되며, 여기에는 실질 플라크 및 뇌혈관에서 Aβ의 침착, 신경섬유 매듭의 신경세포내 형성, 시냅스 손실 및 특정 뇌영역에서 신경세포 아집단(subpopulation)의 손실이 포함된다 (Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53: 141-145).

다수의 유전적, 조직학적 및 기능적 증거는, β-아밀로이드 펩티드(Aβ)가 알츠하이머병의 진행에서 중요함을 시사한다 (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766).

Aβ는 BACE1 (β-세크레타아제, Asp2 또는 메맙신-2로서도 공지됨)으로서 공지된 아스파르틸 프로테아제 효소에 의한 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP로서도 공지됨)의 절단을 통해 생성된다고 공지되어 있다 (De Strooper, B. and Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). 가용성 올리고머 형태의 Aβ는 실질(parenchymal) 및 혈관 침착에 추가하여 AD의 개시에 기여하는 것으로 가정되며 이들은 초기에 시냅스 기능을 손상시킴에 의해 신경세포 기능에 영향을 미칠 수 있다 (Lambert et. al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95 : 6448- 6453). 비록 불용성 아밀로이드 플라크가 AD 및 MCI 초기에 발견되나, 가용성 Aβ 응집물(올리고머 또는 Aβ-유래된 확산성 리간드(ADDL)로서 언급됨)의 수준도 이러한 개체에서 증가되며, 가용성 Aβ 수준은 아밀로이드 플라크 보다 신경섬유 퇴행, 및 시냅스 마커의 손실과 보다 큰 관련이 있다 (Naslund et.al. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001 ) Nat. Med. 1 : 8-19). 고도로 아밀로이드원성(amyloidogenic)인 Aβ42 및 아미노말단에서 트렁케이션된 형태인 Aβx-42가 확산 및 노화 플라크 둘 모두에서 발견되는 Aβ의 현저한 종들이다 (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016). Aβ42의 상대적인 수준은 아밀로이드 플라크로의 Aβ 응집의 중요한 조절인자인 것으로 보이며, 실제로 Aβ42는 시험관내에서 다른 Aβ 형태보다 더욱 용이하게 응집시키는 것으로 나타났고 (Jarrett, JT (1993) Biochemistry.32:4693-4697) Aβ42는 그 자체로 AD의 병인론에서 개시 분자로서 고려되어 왔다 (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). 비록 Aβ42가 APP 대사의 소량 생성물이나, 이의 생성에 있어서의 작은 변화가 Aβ 침착에 대한 큰 효과와 관련되므로, Aβ42만의 감소가 AD를 치료하는 효과적인 방법일 수 있다고 고려되었다 (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). 이를 입증하는 것으로서, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 및 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이가 Aβ42의 상대적인 수준을 우세하게 증가시키고 이에 따라 알츠하이머병(AD)의 개시 시점이 단축되었다고 보고되었다 (Selkoe D.J., Podlisny M. B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:67-99). 그러나, 침착 속도는 이화작용 및 Aβ 청소율에도 의존적임이 주목되어야 한다.

마우스에서 돌연변이 사람 이식유전자(transgene)를 과발현시킴에 의해 아밀로이드 침착의 동물 모델을 생성하였다. 단일 사람 APP 이식유전자를 과발현시키는 마우스는 통상적으로 12월령으로부터 대뇌 플라크-유사 β-아밀로이드 침착을 전개한 반면 (Games D. et al., (1995) Nature 373: 523-527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99-102)), 돌연변이 사람 APP 및 프레세닐린-1 (PS-1) 이식유전자 둘 모두를 지니는 마우스는 통상적으로 2개월 빠른 연령에서 대뇌 플라크-유사 β-아밀로이드 침착을 전개하였다 (Kurt M.A. et al., (2001) Exp. Neurol. 171: 59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6: 231-244).

중추신경계(CNS) 및 혈장간의 외인성 Aβ의 수송이 뇌 아밀로이드 수준을 조절하는 역할을 한다는 것이 더욱더 자명해지고 있으며 (Shibata, et al (2000) J Clin Invest 106 : 1489-1499), CSF Aβ가 신속하게 CSF로부터 혈장으로 운반된다. 따라서, Aβ 펩티드를 이용한 능동적인 백신화 또는 특정 Aβ 항체의 수동적 투여는 신속하게 말초 Aβ에 결합되어 혈장, CSF 및 궁극적으로 CNS간의 동적 평형을 변경시킨다. 실제로, 현재, 이러한 접근법이 Aβ 수준을 낮출 수 있고, Aβ 병리를 감소시키며 아밀로이드증의 다양한 유전자이식 모델에서 인식능 개선을 제공함을 입증하는 다수의 연구가 있다. 고등 종에서의 제한된 연구도 수행되었다. 캐리비안 버빗 원숭이 (16-10세)를 10개월에 걸쳐 Aβ 펩티드로 면역시켰다. Aβ40 수준이 251일에 최고점에 달하는 혈장에서 2-5배로 증가된 반면 Aβ40 및 Aβ42의 CSF 수준이 100일까지 현저하게 감소되고 그 이후 기준선 쪽으로 회복되었다. CSF에서의 이러한 감소는 플라크 버든(burden)의 현저한 감소를 동반한다(Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165: 283-297). 혈장 Aβ 수준에서의 유사한 증가가 늙은 (15-20세) 레수스 원숭이 (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18 : 44:46)를 면역화시킨 후에도 검출되었다.

뇌 아밀로이드를 표적화하는 첫 번째 면역 치료법은 능동 백신인 엘란/위스(Elan/Wyeth)의 AN-1792였다. 이 치료는 수막뇌염과 일치하는 임상적 징후의 발생 이후에 종료되었다. 하위그룹 분석들로부터 이 치료가 인식능 기능의 감소를 늦추었음이 제안되었다 (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1: 84-85). 환자의 사후분석도 플라크-청소의 증거를 나타내었다 (Gilman S. et al, (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562). 수동적 MAb 치료법인 바피뉴주맵 (AAB-001, Elan/Wyeth)은 소규모 I상 안전성 연구에서 인식능 점수를 현저하게 개선시키는 것으로 나타났다.

증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 하는 다른 질병 또는 질환으로는 가벼운 인식능 손상 (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine" in press, e-published 19 Oct 2006), 더치(Dutch)형 β-아밀로이드증을 지닌 유전성 뇌출혈, 대뇌 β-아밀로이드 혈관병증 및 다양한 유형의 퇴행성 치매, 예컨대 파킨슨병과 관련된 것들, 점진적인 핵상 마비, 겉질 기조 퇴행 및 확산성 루이스체 유형의 알츠하이머병(Mollenhauer B (2007) J Neural Transm e-published 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5:655-60) 및 다운증후군 (Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254:22-7)이 있다.

발명의 개요

본 발명의 일 구체예에서, 100pM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-12(서열번호 15)에 결합되나 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에는 결합되지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 100pM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-12(서열번호 15)에 결합되며, 펩티드 1-12(서열번호 15)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 1000배 초과하는 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 100pM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-12(서열번호 15)에 결합되며, 펩티드 1-12(서열번호 15)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 10,000배 초과하는 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

일 측면에서, 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정은 하기 실시예에 개시된 표면 플라스몬 공명 검정이다. 또 다른 측면에서, 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정은 하기 SPR Biacore™ 분석에 개시된 방법 A(i)이다.

본 발명의 대안적인 구체예에서, 10nM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-40에 결합되나 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에는 결합되지 않는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 하기 실시예의 방법 B에 개시된 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

본 발명의 또 다른 대안적인 구체예에서, 10nM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-40에 결합되며, 펩티드 1-12(서열번호 15)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 1000배 초과하는 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 하기 실시예의 방법 B에 개시된 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

본 발명의 대안적인 또 다른 구체예에서, 10nM 미만의 평형상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-40에 결합되며, 펩티드 1-12(서열번호 15)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 10,000배 초과하는 β-아밀로이드 펩티드 2-13(서열번호 44)에 대한 결합에 관한 평형상수 KD를 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공되며, 상기 두 측정 모두는 하기 실시예의 방법 B에 개시된 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행된다.

본 발명의 구체예에서, β-아밀로이드 펩티드에 결합되며 하기 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체가 제공된다:

VH3 유전자족(gene family)으로부터 유래된 사람 중쇄 가변 영역 내에서

CDRH1 : DNGMA (서열번호 1)

CDRH2 : FISNLAYSIDYADTVTG (서열번호 2)

CDRH3 : GTWFAY (서열번호 3) 및:

GenPept 엔트리 CAA51135 (서열번호 24)에 기재된 아미노산 서열로부터 유래된 사람 경쇄 가변 영역 내에서

CDRL1 : RVSQSLLHSNGYTYLH (서열번호 4)

CDRL2 : KVSNRFS (서열번호 5)

CDRL3 : SQTRHVPYT (서열번호 6).

본 명세서에서, "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3"라는 용어는 문헌[Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987]에 기재된 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따른다. 따라서, 하기는 본 발명에 따른 CDR을 정의한다:

CDR : 잔기

CDRH1 : 31-35B

CDRH2 : 50-65

CDRH3 : 95-102

CDRL1 : 24-34

CDRL2 : 50-56

CDRL3 : 89-97

VH3 유전자족 및 관련 면역글로불린 유전자 명명법이 문헌[Matsuda et al (Journal of Experimental Medicine, 188:2151-2162, 1998) and Lefranc & Lefranc (The Immunoglobulin Factsbook. 2001. Academic Press: London)]에 개시되어 있다.

특정 구체예에서, 사람 중쇄 가변 영역은 하기로부터 유래된다:

- 하기 서브세트의 VH3족 일원들 중에서 선택된 V 유전자: VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9 및 VH3-43.

- 하기 서브세트의 VH3족 일원들 중에서 선택된 V 유전자: VH3-48, VH3-21 및 VH3-11.

- VH3-48 유전자, 또는 이들의 대립유전자.

Genbank 엔트리 M99675의 서열은 VH3-48 유전자의 대립유전자이다. M99675는 사람 중쇄 유전자 VH3-48 (서열번호 22)을 구성하고 서열번호 21로 제시된 가변 영역 아미노산 서열을 엔코딩하는 2개 엑손을 포함하는 DNA의 게놈 조각의 Genbank 누클레오티드 서열이다. 특정 측면에서, 사람 수용체 중쇄 프레임워크는 M99675로부터 유도된다.

완전한 V-영역을 작제하기 위해 프레임워크 4를 생식세포(germline) 엔코딩된 V-유전자 M99675에 첨가하여야 한다. 적합한 프레임워크 4 서열 YFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 23)은 사람 JH4 미니유전자(minigene)(카바트(Kabat))에 의해 엔코딩된 것을 포함하며:

이의 처음 4개 잔기는 공여체 항체로부터의 도입 CDR에 의해 대체되는 CDR3 영역내에 있다.

당업자는 생식세포 V 유전자 및 J 유전자가 중쇄 CDR3 전체에 대한 코딩 서열을 포함하지 않음을 이해한다. 그러나, 본 발명의 항체에서, CDR3 항체는 공여체 면역글로부린에 의해 제공된다. 따라서, VH3-48과 같은 VH 유전자, JH4와 같은 JH 미니유전자, 및 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3과 같은 중쇄 CDR의 세트의 조합은 (성숙한 완전히 재배열된 중쇄 가변 영역을 모방하는 방식으로 어셈블링됨) 서열번호 26, 28, 30으로 대표되는 것과 같은 본 발명의 중쇄 가변 영역을 정의하기에 충분하다.

Genpept ID CAA51134에 의해 엔코딩된 가변 영역은 서열번호 24로 제공되는 아미노산 서열을 지닌다.

GenPept ID CAA51134로 공지된 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열은 완전히 재배열된 경쇄 가변 영역의 추론된 아미노산 서열이며 데이터베이스에서 동일한 프레임워크를 지니는 또 다른 아미노산 서열과 동일하고: Genpept 수탁번호 S40356, 문헌[Klein, R., et al., Eur. J. Immunol. 23 (12), 3248-3262 (1993)]에 개시되어 있다. Genbank 수탁번호 X72467로서 입수할 수 있는 CAA51134에 대한 DNA 코딩 서열이 서열번호 25로서 제공된다.

본 발명의 특정 측면에서, 사람 수용체 중쇄 프레임워크는 M99675 및 JH4 미니유전자로부터 유래되고 사람 수용체 경쇄 프레임워크는 하나 이상, 예컨대 1 내지 4개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 잔기의 치환을 함유하거나 함유하지 않는 CAA51135로부터 유래되는데, 이는 β-아밀로이드 펩티드에 대한 공여체 항체의 모든 결합 친화성 또는 실질적으로 모든 결합 친화성을 유지하는 서열번호 17의 서열을 지니는 공여체 V_H 도메인 및 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인에서 발견되는 상응하는 잔기에 기초한다.

"실질적으로 모든 결합 친화성"이란, 치료용 항체의 결합 친화성이 공여체 항체에 비해 많아야 10배 감소됨을 의미한다.

더욱 특수한 측면에서, M99675 및 JH4로부터 유래된 사람 수용체 중쇄 프레임워크는 위치 24, 48, 93 및/또는 94 (카바트 넘버링)로부터 선택된 1 내지 4개의 아미노산 잔기 치환을 지닌다.

본 발명의 더욱 특수한 측면에서, M99675 및 JH4로부터 유래된 사람 수용체 중쇄 프레임워크는 하기 잔기를 포함한다 (또는 이의 보존성 치환체).

(i)

위치 잔기

93 V

94 S

또는

(ii)

위치 잔기

24 V

93 V

94 S

또는

(iii)

위치 잔기

48 I

93 V

94 S

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 26, 28 또는 30에 기재된 서열을 지니는 V_H 사슬 및 서열번호 32에 기재된 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 항체인 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 34, 36 또는 38에 기재된 서열을 지니는 중쇄 및 서열번호 40에 기재된 서열을 지니는 경쇄를 포함하는 항체인 치료용 항체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 치료용 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 치료용 항체를 β-아밀로이드 펩티드-관련 질병에 걸린 사람 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법이 제공된다.

β-아밀로이드 펩티드-관련 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 치료용 항체의 용도도 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하여, 본 발명에 따른 치료용 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 26, 28 또는 30에 기재된 서열을 지니는 V_H 사슬을 포함하는 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 32로 기재된 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

*본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 34, 36 또는 38로 기재된 서열을 지니는 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 40으로 기재된 서열을 지니는 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 더욱 특수한 구체예에서, 서열번호 35, 37, 39 또는 42로 기재된 서열을 포함하는, 치료용 항체 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 더욱 특수한 구체예에서, 서열번호 41 또는 43으로 기재된 서열을 포함하는, 치료용 항체 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

특정 구체예에서, 항체 또는 이의 단편 및/또는 유도체인 치료용 항체에는 본질적으로 a) 표준 경로에 의해 보체를 활성화시키고 b) 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 기능이 결여되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 17의 서열을 지니는 V_H 도메인 및 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 17의 서열을 지니는 V_H 도메인을 포함하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 특히 서열번호 18의 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 특히 서열번호 20의 폴리누클레오티드가 제공된다.

발명의 상세한 설명

1. 항체 구조

1.1 완전한 항체

완전한 항체는 일반적으로 2개 이상의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이종다합체 당단백질이다. IgM을 제외하고, 완전한 항체는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 약 150KDa의 이종사합체 당단백질이다. 통상적으로, 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합되며, 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄간에 이황화 결합의 수는 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄도 사슬내 이황화 브릿지를 지닌다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_H)에 이어 다수의 불변 영역을 지닌다. 각 경쇄는 이의 다른 말단에 가변 도메인(V_L) 및 불변 영역을 지니며; 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 첫 번째 불변 영역과 정렬되고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 대부분의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다라 불리는 두 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 사람 항체는 5개의 상이한 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM에 할당될 수 있다. IgG 및 IgA는 하위부류인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 종 변이체는 적어도 IgG2a, IgG2b를 지니는 마우스 및 래트에 존재한다. 항체의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 특수한 가변성을 나타내는 특정 영역을 지니는 항체에 대해 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역의 더욱 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라 부른다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되며 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않으나 항체 의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), Fcγ 수용체와의 결합을 통한 포식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/청소율 및 보체 캐스캐이드의 C1q 성분을 통한 보체 의존적인 세포독성에 관여하는 것과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 사람 IgG2 불변 영역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 능력이 없다. IgG4 불변 영역은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 능력이 없으며 단지 약하게 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개한다. 이러한 효과기 기능이 본질적으로 결여되어 있는 항체를 "비-세포용해" 항체라고 부를 수 있다

1.1.1 사람 항체

사람 항체는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 사람 항체는 사람 골수종 또는 마우스-사람 헤테로골수종 세포주를 이용한 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다[참조, Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984) and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987]. 대안적인 방법으로는 사람 V 영역 레퍼토리를 이용하는 파지 라이브러리 또는 유전자이식 마우스의 이용이 있다[참조, Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J. Immunol. methods 231, 11-23].

여러 균주의 유전자이식 마우스가 현재 이용가능하며, 여기서 이들의 마우스 면역글로불린 유전자좌는 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트로 대체되었다[참조, Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156]. 항원 챌린지시에, 이러한 마우스는 관심있는 항체가 선택될 수 있는 사람 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있다.

특히 주목되는 것이 사람 림프구를 조사된 마우스에게 이식하는 트리메라(Trimera™) 시스템 (참조 Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161), 사람(또는 다른 종) 림프구를 대량 푸울링된 시험관내 항체 발생 절차로 처리하고 희석 및 선택 공정을 제한하면서 데컨불레이션(deconvulated)시키는 선택된 림프구 항체 시스템(SLAM, 참조 Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848) 및 제노마우스(Xenomouse) II™ (Abgenix Inc)가 있다. 대안적인 접근법이 모르포도마(Morphodoma™) 기술을 이용하여 모르포텍 인크(Morphotek Inc)로부터 이용될 수 있다.

파지 디스플레이 기술을 이용하여 사람 항체 (및 이의 단편)을 생성할 수 있다[참조, McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) and Griffiths AD et al. (1994) EMBO 13:3245-3260]. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자를 프레임에서 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 단백질 유전자의 주요 또는 부수 외피로 클로닝하고 파지 입자의 표면 상에서 기능적인 항체 단편으로서 디스플레이한다 (일반적으로 헬퍼 파지의 도움을 받음). 항체의 기능성에 기초한 선택으로 그러한 특성을 나타내는 항체를 엔코딩하는 유전자를 선택한다. 파지 디스플레이 기술은 상기 개시된 질병 또는 질환에 걸린 개체 또는 대안적으로 면역화되지 않은 사람 공여체로부터 수득된 사람 B 세포로 제조된 라이브러리로부터 항원 특이적 항체를 선택하는데 사용될 수 있다[참조, Marks; J. Mol. Bio. 222,581-597, 1991]. 완전한 사람 항체가 Fc 도메인을 포함할 것이 요망되는 경우, 파지 디스플레이된 유래된 단편을 요망되는 불변 영역을 포함하며 안정한 발현 세포주를 확립시키는 포유동물 발현 벡터로 재클로닝시키는 것이 필수적이다.

친화성 성숙화 기술(Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992))을 이용하여 결합 친화성을 개선시킬 수 있고, 여기서 일차 사람 항체의 친화성은 H 및 L 사슬 V 영역을 차례로 천연 발생 변이체로 대체하고 개선된 결합 친화성에 기초하여 선택함에 의해 개선된다. "에피토프 각인(imprinting)"과 같은 이 기술의 변이체는 현재 입수가능하다[참조, WO 93/06213]. 또한 문헌[Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)] 참조.

1.2 키메라 및 사람화된 항체

사람 질환 또는 질병의 치료에서 완전한 비-사람 항체의 이용은, 특히 항체의 반복된 투여시에 면역원성의 널리 확립된 문제점에 대한 가능성을 수반하며, 즉 환자의 면역계는 완전한 비-사람 항체를 비-자가(non-self) 항체로서 인식할 수 있고 중화 반응을 준비할 수 있다. 완전한 사람 항체를 개발하는 것 외에 (상기 참조) 다양한 기법이 이들 문제점을 극복하기 위해 수년에 걸쳐 개발되었으며, 일반적으로 완전한 치료용 항체에서 비-사람 아미노산 서열의 조성을 감소시키면서 면역화된 동물 예를 들어, 마우스, 래트 또는 토끼로부터 비-사람 항체를 수득하는데 있어서 상대적 용이성을 보유하는 것을 포함한다. 넓게는, 이를 달성하기 위해 두 접근법이 이용되었다. 첫 번째는 일반적으로 사람 불변 영역에 융합된 비-사람 (예를 들어, 설치류 예컨대, 마우스) 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체이다. 항체의 항원-결합 부위가 가변 영역내에 국소화되기 때문에, 키메라 항체는 항원에 대한 이의 결합 친화성을 보유하며, 사람 불변 영역의 효과기 작용을 획득하여 상기 기재된 바와 같은 효과기 작용을 수행할 수 있다. 키메라 항체는 전형적으로 재조합 DNA 방법을 이용하여 생성된다. 항체를 엔코딩하는 DNA(예를 들어, cDNA)가 통상적인 공정(예를 들어, 본 발명의 항체의 H 및 L 사슬 가변 영역을 엔코딩하는 유전자, 예를 들어, 상기 기재된 서열번호 18 및 20의 DNA에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고누클레오티드 프로브를 사용함으로써)으로 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 전형적인 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치하며, 이어서 항체의 합성을 달성하기 위한 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포 예컨대, 대장균(E. Coli), COS 세포, CHO 세포, PerC6 세포 또는 골수종 세포로 트랜스펙션된다. DNA는 사람 L 및 H 사슬에 대한 코딩 서열을 상응하는 비-사람(예를 들어, 뮤린) H 및 L 불변 영역으로 치환함으로써 개질될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Morrison; PNAS 81 , 6851 (1984)] 참조). 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예에서 사람 불변 영역(IgG1과 같은 IgG 이소형일 수 있음)에 융합된 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인 및 서열번호 17의 서열을 지니는 V_H 도메인을 포함하는 키메라 항체가 제공된다.

두 번째 접근법은 사람화된 항체의 생성을 포함하며, 여기서 항체의 비-사람 내용물은 가변 영역을 사람화함으로써 감소된다. 사람화를 위한 두 기법은 대중성을 갖는다. 첫 번째는 CDR 그래프팅에 의한 사람화이다. CDR은 항체의 N-말단에 밀접한 루프를 수립하며, 여기서 이들은 프레임워크 영역에 의해 제공된 골격에 끼워진 표면을 형성한다. 항체의 항원-결합 특이성은 이의 CDR 표면의 화학적 특성 및 토포그래피에 의해 주로 규정된다. 이어서, 이들 특징이 개별 CDR의 형태, CDR의 상대적 배치, 및 CDR을 포함하는 잔기의 측쇄의 특성 및 배치에 의해 결정된다. 면역원성의 큰 감소는, 단지 비-사람 (예를 들어, 뮤린) 항체 ("공여체" 항체)의 CDR을 적합한 사람 프레임워크 ("수용체 프레임워크") 및 불변 영역으로 그래프팅시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 and Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536] 참조). 그러나, CDR 그래프팅 자체는 항원-결합 특성을 완전하게 유지시키지 못할 수 있으며, 현저한 항원 결합 친화성이 회복되는 경우, 공여체 항체의 일부 프레임워크 잔기가 사람화된 분자중에 보존(때때로 "복귀돌연변이(backmutations)"로 불림)되어야 함이 종종 발견되었다 (문헌 [Queen C et al. (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al. (1991) Nature 351, 501-502] 참조). 이러한 경우, 비-사람 공여체 항체에 대한 가장 큰 서열 상동성(통상적으로 60% 이상)을 나타내는 사람 V 영역은 사람 프레임워크 (FR)를 제공하기 위해 데이타베이스로부터 선택될 수 있다. 사람 FR의 선택은 사람 컨센서스 또는 개별 사람 항체로부터 이루어질 수 있다. 필요에 따라, 공여체 항체로부터의 필요한 주요 잔기가 사람 수용체 프레임워크로 치환되어 CDR 형태가 보존된다. 항체의 컴퓨터 모델링을 사용하여 이러한 구조적으로 중요한 잔기를 확인하는 것을 도울 수 있다 (WO99/48523 참조).

대안적으로, 사람화는 "베니어링(veneering)" 공정에 의해 달성될 수 있다. 독특한 사람 및 뮤린 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 통계학적 분석에 의해, 노출된 잔기의 정확한 패턴이 사람 항체와 뮤린 항체에서 상이하며, 대부분의 개별적 표면 위치는 더 적은 수의 상이한 잔기에 대한 강한 선호도를 갖는 것이 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Padlan E.A. et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 and Pedersen J.T. et al. (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973] 참조). 따라서, 사람 항체에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 프레임워크 영역내의 노출된 잔기를 대체함으로써 비-사람 Fv의 면역원성을 저하시키는 것이 가능하다. 단백질 항원성이 표면 접근성과 관련있을 수 있기 때문에, 표면 잔기의 치환은 "내밀한 (invisible)" 마우스 가변 영역이 사람 면역 시스템을 띠게 하는데 충분할 수 있다(문헌 [Mark G. E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134] 참조). 사람화의 이러한 공정은 단지 항체의 표면만 변경되고, 지지 잔기는 교란되지 않고 유지되기 때문에 "베니어링"으로 불린다. 추가의 대안적인 접근법으로는 WO04/006955에 개시된 방법과, 세균 발현 시스템을 이용하여 서열에서 사람 생식세포와 밀접한 항체를 생성하는 휴머니어링(Humaneering™) 절차(Kalobios)가 있다(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California).

용어 "유래된"은 물질에 대한 물리적 기원의 견지에서의 공급원 뿐만 아니라, 상기 물질과 구조적으로 동일하나 기준 공급원으로부터 유래되지 않은 물질을 규정하는 것으로 의도됨이 당업자에게는 자명할 것이다. 따라서, "공여체 항체에서 발견된 잔기"가 반드시 공여체 항체로부터 정제될 필요는 없다.

특정 아미노산 치환은 "보존성"인 것으로 간주됨이 당업자에게 자명할 것이다. 아미노산은 공통된 측쇄 특성에 기초하여 군으로 나누어지며, 본 발명의 치료용 항체의 결합 친화성을 모두 또는 실질적으로 모두 유지하는 군내의 치환은 보존성 치환으로서 간주된다. 하기 표 1 참조:

표 1

1.3 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 유도체이고 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성법은 두개의 면역글로불린 H 사슬-L 사슬 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기서 두개의 H 사슬은 상이한 결합 특이성을 갖는다(문헌 [Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 and Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659] 참조). H 및 L 사슬의 무작위 분류로 인해, 10개의 상이한 항체 구조의 잠재적 혼합이 생성되며, 이 중 단지 하나만이 목적하는 결합 특이성을 갖는다. 대안적인 방법은 목적하는 결합 특이성을 갖는 가변 도메인을 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 융합물 중 하나 이상에 존재하는 경쇄 결합에 요구되는 부위를 함유하는 CH1 영역을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 융합물을 엔코딩하는 DNA, 및 필요에 따라, L 사슬이 별도의 발현 벡터로 삽입된 후, 적합한 숙주 유기체로 공동트랜스펙션된다. 2개 또는 모든 3개 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터로 삽입하는 것이 가능하다. 하나의 바람직한 접근법에서, 이중특이적 항체는 하나의 암(arm) 및 H-L 사슬 쌍에서 첫번째 결합 특이성을 갖는 H 사슬로 이루어지며, 두번째 결합 특이성은 다른 암에 존재한다. WO94/04690 참조. 또한, 문헌 [Suresh et al. Methods in Enzymology 121, 210, 1986] 참조.

*치료용 단백질을 뇌에 전달하는 것은 혈뇌 장벽(BBB)의 존재에 의해 방해되어 왔다. 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체 단편을 BBB를 가로질러 전달하는 것이 요망되는 경우, 필요하다면 이러한 전달을 향상시키는 다양한 방법들이 제안되어 있다.

혈액으로부터 요구되는 영양소 및 인자들을 수득하기 위해, BBB는 일부 특이적 수용체를 소유하며, 이들은 순환하는 혈액으로부터 뇌로 화합물을 운반한다. 연구들로부터 인슐린과 같은 일부 화합물[참조, Duffy KR et al. (1989) Brain Res. 420:32-38], 트랜스페린[참조, Fishman JB et al. (1987) J.Neurosci 18:299-304] 및 인슐린 유사 성장 인자 1 및 2[참조, Pardridge WM (1986) Endocrine Rev.7: 314-330 and Duffy KR et al. (1986) Metabolism 37:136-140]가 수용체-매개된 트랜스시토시스(transcytosis)를 통해 BBB를 횡단함이 지적되었다. 따라서, 이러한 분자들에 대한 수용체는, 본 발명의 치료용 항체가 소위 "벡터화된(vectored)" 항체를 이용하여 뇌에 접근하기 위한 잠재적인 수단을 제공한다[참조, Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321). 예를 들어, 트랜스페린 수용체에 대한 항체가 동적으로 뇌 실질에 운반되는 것으로 나타났다[참조, Friden PM et al (1991) PNAS 88:4771-4775 and Friden PM et al (1993) Science 259:373-377]. 따라서, 한 가지 잠재적인 접근법은 상술된 바와 같이 첫 번째 특이성이 운반 수용체에 대한 것이고 두 번째 특이성이 BBB에 위치한 운반 수용체에 대한 것인, 예컨대, 두 번째 특이성이 트랜스페린 운반 수용체에 대한 것인 이중특이적 항체 또는 이중특이적 단편을 제공하는 것이다.

1.4 항체 단편

본 발명의 특정 구체예에서, 항원 결합 단편인 치료용 항체가 제공된다. 이러한 단편은 완전한 및/또는 사람화된 및/또는 키메라 항체의 기능성 항원 결합 단편 예컨대, 상기 기재된 항체의 Fab, Fd, Fab', F(ab')₂, Fv, ScFv 단편일 수 있다. 불변 영역이 결여된 단편은 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키거나 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 능력이 없다. 전형적으로, 이러한 단편은 예를 들어, 파파인 분해 (참조, 예를 들어 WO94/29348)에 의한 완전한 항체의 단백질 분해에 의해 생성되며, 재조합에 의해 형질전환된 숙주 세포로부터 직접 생성될 수 있다. ScFv의 생성에 있어서는 문헌 [Bird et al;(1988) Science, 242, 423-426] 참조. 또한, 항체 단편은 하기 기재된 바와 같이 다양한 엔지니어링 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

Fv 단편은 Fab 단편 보다 이들의 두 사슬의 상호작용 에너지가 더 낮은 것으로 보여진다. V_H와 V_L 도메인의 결합을 안정화시키기 위해, 이들은 펩티드 (Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al., PNAS, 85, 5879-5883), 이황화 결합 (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) 및 "놉 인 홀 (knob in hole)" 돌연변이 (Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)로 연결되었다. ScFv 단편은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 and Huston et al (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217] 참조). ScFv는 세균 세포 예컨대, 대장균(E. Coli)에서 생성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 진핵세포에서 생성될 수 있다. ScFv의 한 불이익은 일가 생성물에 있으며, 이는 다가 결합으로 인한 증가된 항원항체결합력 및 이들의 짧은 반감기를 배제시킨다. 이들 문제점을 극복하기 위한 시도는 화학적 커플링 (Adams et al (1993) Can. Res 53, 4026-4034 and McCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314) 또는 쌍을 이루지 않은 C 말단 시스테인 잔기를 함유하는 ScFv의 자발적인 부위 특이적 이량체화에 의해 추가적인 C 말단 시스테인을 함유하는 ScFV로부터 생성된 이가 (ScFv')₂를 포함한다 (문헌 [Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204] 참조). 대안적으로, ScFv는 3 내지 12개 잔기 사이로 펩티드 링커를 짧게 함으로써 다량체를 형성하여 "디아바디 (diabodies)"를 형성하게 할 수 있다 (문헌 [Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448] 참조). 링커를 감소시키는 것은 추가로 ScFV 삼량체 ("트리아바디", 문헌 [Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433] 참조) 및 사량체 ("테트라바디", 문헌 [Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168] 참조)를 유도할 수 있다. 이가 ScFV 분자의 작제는 또한, 단백질 이량체화 모티프와의 유전적 융합에 의해 달성되어 "미니항체" (문헌 [Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584] 참조) 및 "미니바디" (문헌 [Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061] 참조)를 형성할 수 있다. ScFv-Sc-Fv 탠덤 ((ScFV)₂)은 또한, 제 3 펩티드 링커에 의해 두개의 ScFv 유닛을 연결함으로써 생성될 수 있다 (문헌 [Kurucz et al (1995) J.Immol.154, 4576-4582] 참조). 이중특이적 디아바디는 한 항체의 V_L 도메인에 짧은 링커에 의해 연결된 또 다른 항체로부터의 V_H 도메인으로 이루어진 두개의 단일 사슬 융합 생성물의 일가 결합을 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Kipriyanov et al (1998), Int. J. Can 77, 763-772] 참조). 이러한 이중특이적 디아바디의 안정성은 상기 기재된 바와 같은 이황화 브릿지 또는 "놉 인 홀" 돌연변이의 유입에 의해 또는 두 개의 하이브리드 ScFv 단편이 펩티드 링커를 통해 연결된 단일 사슬 디아바디 (ScDb)의 형성에 의해 향상될 수 있다 (문헌 [Kontermann et al (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188] 참조). 삼가 이중특이적 분자는 예를 들어, ScFv 단편을 IgG 분자의 CH3 도메인 또는 Fab 단편에 힌지 영역을 통해 융합시킴으로써 이용가능하다 (문헌 [Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163] 참조). 대안적으로, 사가 이중특이적 분자는 이중특이적 단일 사슬 디아바디의 융합에 의해 생성되었다 (문헌 [Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94] 참조). 더 작은 사가 이중특이적 분자는 또한, 헬릭스-루프-헬릭스 모티프를 함유하는 링커와의 ScFv-ScFv 탠덤 (DiBi 미니항체, 문헌 [Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49] 참조) 또는 분자내 페어링을 방지하는 배향으로 4개의 항체 가변 도메인 (V_H 및 V_L)을 포함하는 단일 사슬 분자 (탠덤 디아바디, 문헌 [Kipriyanov et al, (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56] 참조)의 이량체화에 의해 형성될 수 있다. 이중특이적 F(ab')₂ 단편은 Fab' 단편의 화학 커플링 또는 류신 지퍼를 통한 헤테로이량체화를 통해 생성될 수 있다 (문헌 [Shalaby et al, (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 and Kostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553] 참조). 또한, 분리된 V_H 및 V_L 도메인이 이용가능하다 (US 6,248,516; US 6,291,158; US 6,172,197 참조).

1.5 헤테로컨주게이트 항체

헤테로컨주게이트 항체는 또한, 본 발명의 구체예를 형성하는 유도체이다. 헤테로컨주게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 형성된 두개의 공유적으로 결합된 항체로 이루어진다. 예를 들어, US 4,676,980 참조.

1.6 기타 개질

항체의 Fc 영역과 다양한 Fc 수용체 (FcγR)간의 상호작용은 항체-의존적인 세포의 세포독성(ADCC), 보체의 고정, 포식작용 및 항체의 반감기/청소율을 포함하는 항체의 효과기 기능을 매개하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 항체의 Fc 영역에 대한 다양한 개질이 요망되는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. 구체적으로, a) 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키고 b) 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 기능이 본질적으로 결여된 사람 불변 영역은 IgG4 불변 영역, IgG2 불변 영역 및 IgG1 불변 영역을 포함하며, 이들은 EP0307434 (WO8807089), EP 0629 240 (WO9317105) 및 WO 2004/014953에 기재된, 예를 들어 위치 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및/또는 322에서의 돌연변이로서 특이적인 돌연변이를 함유한다. 중쇄 불변 영역의 CH2 도메인내 잔기 235 또는 237에서의 돌연변이들은 (카바트 넘버링; EU Index system) 각기 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII에 대한 결합을 감소시켜 항체-의존적인 세포의 세포독성(ADCC)을 감소시킴이 기술되었다 (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75(24); 12161-12168). 추가로, 보체 의존적인 세포독성(CDC)를 동원하거나 매개하는데 있어서 이러한 잔기 중 일부가 관여됨이 몇몇 보고에서 기술되었다 (Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). 이에 따라, 잔기 235 및 237 둘 모두를 알라닌 잔기로 돌연변이시켜 (Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48; and WO9958679) 보체 매개된 효과와 FcγR-매개된 효과 둘 모두를 감소시켰다. 이러한 불변 영역을 포함하는 항체를 "비-세포용해" 항체라고 부를 수 있다.

당업자는 혈청 반감기를 증가시키기 위해 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체로 혼입시킬 수 있다 (US 5,739,277 참조).

5개의 현재 인정된 사람 Fcγ 수용체, FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및 신생아 FcRn가 있다. 문헌[Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604]은 IgG1 잔기의 공통된 세트가 모든 FcγR들의 결합에 관련되나, FcγRII 및 FcγRIII는 이러한 공통된 세트 이외의 별개의 부위를 이용함을 입증하였다. IgG1 잔기 중 한 기가 알라닌으로 변경되는 경우 모든 FcγR들에 대한 결합을 저하시킨다: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 및 Pro-239. 모두 IgG CH2 도메인에 위치하며, CH1 및 CH2를 결합시키는 힌지 근처에서 덩어리를 이룬다. FcγRI만이 결합을 위해 IgG1 잔기의 공통된 세트를 이용하는 반면, FcγRII 및 FcγRIII는 공통된 세트 이외의 별개의 잔기와 상호작용한다. 일부 잔기의 변경은 단지 FcγRII (예를 들어, Arg-292) 또는 FcγRIII (예를 들어, Glu-293)으로의 결합을 저하시켰다. 일부 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII에 대한 증가된 결합을 나타내지만, 다른 수용체로의 결합에는 영향을 미치지 못하였다 (예를 들어, Ser-267Ala는 FcγRII로의 결합은 향상시키지만, FcγRIII로의 결합에는 영향을 미치지 못하였다). 기타 변이체는 FcγRII 또는 FcγRIII으로의 향상된 결합을 나타내며, 다른 수용체로의 결합은 저하된다 (예를 들어, Ser-298Ala는 FcγRIII로의 결합을 향상시키지만, FcγRII로의 결합은 저하시켰다). FcγRIIIa에 있어서, 가장 우수한 결합 IgG1 변이체는 Ser-298, Glu-333 및 Lys-334에서 알라닌 치환기와 조합되었다. 신생아 FcRn 수용체는 IgG 분자를 분해로부터 보호하는 것에 관여하여 혈청 반감기 및 조직을 가로지르는 트랜스시토시스를 증진시키는 것으로 여겨진다 (문헌 [Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766] 참조). 사람 FcRn과 직접 상호작용하는 것으로 결정된 사람 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다.

본 발명의 치료용 항체는 상기 임의의 불변 영역 개질을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 치료용 항체에는 a) 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키고 b) 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 기능이 본질적으로 결여되어 있다. 더욱 특수한 구체예에서, 본 발명은 상술된 잔기 변화 중 임의의 하나(이상)를 지니는 본 발명의 치료용 항체를 제공하여 반감기/청소율 및/또는 ADCC와 같은 효과기 기능 및/또는 보체 의존적인 세포독성 및/또는 보체 용해를 개질시킨다.

본 발명의 추가의 측면에서, 치료용 항체는 위치 235 (예컨대, L235A) 및 237 (예컨대, G237A)(카바트에 개요된 EU 도식에 따른 넘버링)에 알라닌(또는 다른 붕괴) 치환기를 지니는 이소형 사람 IgG1의 불변 영역을 지닌다.

본 발명의 다른 유도체는 본 발명의 항체의 당화 변이체를 포함한다. 이들의 불변 영역에서 보존된 위치에서의 항체의 당화는 항체 작용 특히, 상기 기재된 바와 같은 효과기 작용에 현저하게 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318] 참조). 하나 이상의 탄수화물 부분이 부가되거나, 치환되거나, 결실되거나, 개질된 본 발명의 치료용 항체의 당화 변이체가 고려된다. 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 모티프의 유입은 탄수화물 부분의 효소 부착을 위한 잠재적인 부위를 생성시키며, 따라서, 항체의 당화를 조작하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876]에서, TNFR-IgG 면역부착소의 말단 시알릴화는 베타-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제 및/또는 알파, 2,3 시알릴트랜스퍼라아제를 사용하여 재갈락토실화 및/또는 재시알릴화의 공정을 통해 증가되었다. 말단 시알릴화의 증가는 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 것으로 여겨진다. 대부분의 당단백질과 함께 항체는 전형적으로, 자연에서 당형(glycoform)의 혼합물로서 생성된다. 이러한 혼합물은 특히, 항체가 진핵생물 특히, 포유동물 세포에서 생성되는 경우 명백해진다. 규정된 당형을 제조하기 위한 다양한 방법이 개발되었다 (문헌 [Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727] 참조). 이와 같이, 본 발명은 규정된 수 (예를 들어, 7개 이하, 예를 들어, 5개 이하, 예컨대, 2개 또는 1개)의 상기 항체의 당형(들)을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 (아마도, IgG 이소형 예를 들어, IgG1의) 다수의 치료용 항체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유도체는 또한 비단백질성 중합체 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 커플링된 본 발명의 치료용 항체를 포함한다. PEG로의 단백질 컨주게이션은 단백질의 반감기를 증가시키고, 단백질의 항원성 및 면역원성을 감소시키는 확립된 기법이다. 상이한 분자량 및 스타일 (선형 또는 분지형)을 지니는 페길화의 이용이 완전한 항체 및 Fab' 단편으로 조사되었다 (문헌 [Koumenis I. L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95] 참조). 특정 구체예는 a) 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키고 b) 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 효과기 기능이 없는 PEG에 커플링된 본 발명의 항원-결합 단편 (예컨대, Fab 단편 또는 scFv)을 포함한다.

2. 생성 방법

본 발명의 항체는 유전자이식 유기체 예컨대, 염소 (문헌 [Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157] 참조), 닭 (문헌 [Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55] 참조), 마우스 (문헌 [Pollock et al] 참조) 또는 식물 (문헌 [Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590] 참조)에서 생성될 수 있다. 항체는 또한, 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 전형적으로, 당업자에게 공지된 재조합 세포 배양 기술을 이용하여 생성된다. 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 분리되고 복제가능한 벡터 예컨대, 숙주 세포 내에서의 증식 또는 발현을 위한 플라스미드로 삽입된다. 하나의 유용한 발현 시스템은 글루타메이트 합성효소 시스템 (예컨대, 론자 바이올로지스 (Lonza Biologies)에 의해 판매되는 것과 같은)이며, 특히 여기서 숙주 세포는 CHO 또는 NS0이다 (하기 참조). 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 통상적인 공정 (예를 들어, 올리고누클레오티드 프로브)을 사용하여 용이하게 분리되고 서열화된다. 사용될 수 있는 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 파지, 트랜스포존, 미니염색체가 있으며, 이 중 플라스미드가 전형적인 구체예이다. 일반적으로, 이러한 벡터는 추가로, 발현을 조장하기 위해 경쇄 및/또는 중쇄 폴리누클레오티드에 작동가능하게 연결된 전사 종결 서열, 프로모터, 인핸서 엘리먼트, 하나 이상의 마커 유전자, 복제 오리진, 및 시그널 서열을 포함한다. 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 별도의 벡터로 삽입되고 동일한 숙주 세포로 동시에 또는 순차적으로 도입(예컨대, 형질전환, 트랜스펙션, 일렉트로포레이션 또는 형질도입)될 수 있거나, 필요에 따라, 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 이러한 도입에 앞서 동일한 벡터내로 삽입될 수 있다.

유전자 코드의 중복으로 인해, 본원에 기재된 폴리누클레오티드에 대해 대안적인, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩할 폴리누클레오티드가 또한 이용가능함이 곧 자명해질 것이다.

2.1 시그널 서열

본 발명의 항체는 성숙 단백질의 N 말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 이종성 시그널 서열을 갖는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 시그널 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱될 수 있어야 한다. 원핵 숙주 세포에 있어서, 시그널 서열은 알칼리성 포스파타아제, 페니실리나아제, 또는 열 안정성 엔테로톡신 II 리더일 수 있다. 효모 분비에 있어서, 시그널 서열은 효모 전환효소 리더, α 인자 리더 또는 산 포스파타아제 리더일 수 있다 (예를 들어, WO90/13646 참조). 포유동물 세포 시스템에서, 바이러스 분비 리더 예컨대, 헤르페스 단순 gD 시그널 및 원시 면역글로불린 시그널 서열(예컨대, 사람 Ig 중쇄)이 이용가능하다. 전형적으로, 시그널 서열은 본 발명의 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 리딩 프레임에서 라이게이션된다.

2.2 복제 오리진

복제 오리진은 대부분의 그람-네거티브 세균에 적합한 pBR322, 대부분의 효모에 대한 2μ 플라스미드, 및 대부분의 포유동물 세포에 대한 다양한 바이러스 오리진 예컨대, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV로 당해분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 복제 성분의 SV40 오리진은 포유동물 발현 벡터에 필수적이진 않으나, SV40 오리진은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 포함될 수 있다.

2.3 선택 마커

전형적 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나 (b) 영양요구 결핍을 보완하거나 복합물 배지에서 이용불가능한 영양분을 제공하거나 (c) 이 둘의 조합을 제공하는 단백질을 엔코딩한다. 선택 계획은 벡터 또는 벡터들을 함유하지 않는 숙주 세포의 성장을 저지하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 항체를 엔코딩하는 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포는 예를 들어, 함께-전달된 선택 마커에 의해 부여받은 약물 내성으로 인해 생존한다. 일 실시예는 DHFR 선택 시스템이며, 여기서 형질전환체는 DHFR 네거티브 숙주 균주에서 생성된다 (예컨대, 참조 Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). 이 시스템에서, DHFR 유전자는 본 발명의 항체 폴리누클레오티드 서열과 함께-전달되며 이후 누클레오시드 회수(withdrawal)에 의해 DHFR 포지티브 세포가 선택된다. 필요하다면, DHFR 억제제 메토트렉세이트도 적용시켜 DHFR 유전자 증폭된 형질전환체를 선택한다. 본 발명의 항체 코딩 서열 또는 이의 기능성 유도체에 DHFR 유전자를 작동가능하게 결합시킴에 의해 DHFR 유전자 증폭이 관심있는 요망되는 항체 서열의 부수적인 증폭을 초래한다. CHO 세포는 이러한 DHFR/메토트렉세이트 선택에 특히 유용한 세포주이며 DHFR 시스템을 이용하여 숙주 세포를 증폭시키고 선택하는 방법이 당 분야에 널리 확립되어 있다[참조, Kaufman R.J. et al J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, 검토를 위해서는, Werner RG, Noe W, Kopp K.Schluter M," Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8): 870-80, 1998 Aug 참조]. 추가의 실시예는 글루타메이트 합성효소 발현 시스템이다 (Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p169). 효모에 사용하기에 적합한 선택 유전자는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979] 참조).

2.4 프로모터

본 발명의 항체를 발현하기에 적합한 프로모터는 항체를 엔코딩하는 DNA/폴리누클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주용 프로모터는 phoA 프로모터, Beta-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타아제, 트립토판 및 하이브리드 프로모터 예컨대, Tac를 포함한다. 효모 세포에서 발현에 적합한 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 기타 글리콜 효소 예를 들어, 에놀라아제, 글리세르알데히드 3 포스페이트 데히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스 6 포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제 및 글루코키나아제를 포함한다. 유도가능한 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나아제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타아제, 메탈로티오네인 및 질소 대사 또는 말토오스/갈락토오스 이용에 기여하는 효소를 포함한다. 포유동물 세포계에서 발현을 위한 프로모터는 바이러스 프로모터 예컨대, 폴리오마, 포울폭스 및 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소태 파필로마 바이러스, 아비안 사르코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (특히, 즉각적 초기 유전자 프로모터), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 액틴, 라우스 사르코마 바이러스 (RSV) 프로모터 및 초기 또는 후기 시미안 바이러스 40 및 비-바이러스 프로모터, 예컨대 EF-1알파 (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17): 5322)를 포함하는 RNA 중합효소 II 프로모터를 포함한다. 프로모터의 선택은 발현에 사용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다.

2.5 인핸서 엘리먼트

적합하게는, 예를 들어, 고등 진핵생물에서의 발현을 위해, 상기 기재된 프로모터에 위치하는 것으로 발견된 것들 뿐만 아니라 그 대신에 추가의 인핸서 엘리먼트가 포함될 수 있다. 적합한 포유동물 인핸서 서열은 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, 태아단백, 메탈로티오닌 및 인슐린으로부터의 인핸서 엘리먼트를 포함한다. 대안적으로, 원핵세포 바이러스로부터의 인핸서 엘리먼트, 예컨대 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 바쿨로바이러스 인핸서 또는 뮤린 IgG2a 유전자좌를 사용할 수 있다 (WO04/009823 참조). 이러한 인핸서는 통상적으로 프로모터에 대해 업스트림 부위에 있는 벡터 상에 위치하나, 이들은 예컨대 비번역된 영역 또는 폴리아데닐화 시그널의 다운스트림내에서 다른 곳에 위치할 수도 있다. 인핸서의 선택 및 정위는 발현에 이용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다.

2.6 폴리아데닐화 /종결

진핵계에서, 폴리아데닐화 시그널은 본 발명의 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 이러한 시그널은 전형적으로, 오픈 리딩 프레임의 3'에 위치한다. 포유동물 시스템에서, 비제한적 예로는 성장 호르몬, 신장 인자-1 알파 및 바이러스 (예를 들어, SV40) 유전자 또는 레트로바이러스 장말단 반복부로부터 유래된 시그널을 포함한다. 효모 시스템에서, 폴리아데닐화/종결 시그널의 비제한적 예로는 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK) 및 알코올 데히드로게나아제 1 (ADH) 유전자로부터 유래된 것을 포함한다. 원핵 시스템에서, 전형적으로 폴리아데닐화 시그널이 요구되지 않으며, 대신 더 짧고 더욱 규정된 터미네이터 서열을 적용하는 것이 일반적이다. 폴리아데닐화/종결 서열의 선택은 발현을 위해 사용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다.

2.7 수율을 향상시키는 기타 방법/ 엘리먼트

상기에 추가하여, 수율을 향상시키기 위해 적용될 수 있는 기타 특징들로는 크로마틴 리모델링 엘리먼트, 인트론 및 숙주-세포 특이적인 코돈 개질이 있다. 본 발명의 항체의 코돈 사용은 전사 및/또는 생성 수율을 증가시키도록 숙주 세포의 코돈 바이어스를 조정하기 위해 개질될 수 있다 (예컨대, Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24). 코돈의 선택은 발현을 위해 사용된 숙주 세포와의 적합한 양립성에 기초한다.

2.8 숙주 세포

본 발명의 항체를 엔코딩하는 벡터를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포로는 원핵, 효모 또는 고등 진핵 세포가 있다. 적합한 원핵 세포는 진정세균(eubacteria) 예를 들어, 장내세균(enterobacteriaceae) 예컨대, 에스케리키아 (Escherichia) 예를 들어, 대장균(E. Coli)(예를 들어, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라 프로테우스(Klebsiella Proteus), 살모넬라(Salmonella) 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia) 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 및 바실리(Bacilli) 예컨대, B. 서브틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (DD 266 710 참조), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대, P. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 효모 숙주 세포중에서, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces)(예를 들어, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), 야로이와(yarrowia) (EP 402,226), 피키아 파스토리스 (Pichia Pastoris)(EP 183,070, 문헌 [Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192] 참조), 캔디다 (Candida), 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia) (EP244, 234), 페니실린(Penicillin), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주 예컨대, A.니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)가 고려된다.

원핵세포 및 효모 숙주 세포가 본 발명에 의해 특정하게 고려된다 하더라도, 통상적으로, 본 발명의 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 적합한 척추동물 숙주 세포로는 포유동물 세포 예컨대, COS-1 (ATCC No.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), 사람 배아 신장주 293, PerC6 (Crucell), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC NO: CRL 10314), 293 (ATCC NO.CRL 1573), 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO (예를 들어, CHO-K1 , ATCC NO: CCL 61 , DHFR-CHO 세포주 예컨대, DG44 (문헌 [Urlaub et al, Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12, pp555-566] 참조)), 특히 부유 배양에 적합한 CHO 세포주, 마우스 세르톨리 세포, 원숭이 신장 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (ATCC CRL-1587), HELA 세포, 개 신장 세포 (ATCC CCL 34), 사람 폐 세포 (ATCC CCL 75), Hep G2 및 골수종 또는 림프종 세포 예를 들어, NSO (US 5,807,715 참조), Sp2/0, YO가 있다.

이와 같이, 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료용 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 벡터를 포함하는 안정하게 형질전환된 숙주 세포가 제공된다. 통상적으로 이러한 숙주 세포는 상기 경쇄를 엔코딩하는 제 1 벡터 및 상기 중쇄를 엔코딩하는 제 2 벡터를 포함한다.

이러한 숙주 세포는 본 발명의 항체의 품질, 기능 및/또는 수율을 개질시키기 위해 추가로 공학처리되거나 조정될 수도 있다. 비제한적인 예로는 특이적 개질(예컨대 당화) 효소 및 단백질 폴딩 샤페론(chaperone)의 발현이 있다.

2.9 세포 배양법

본 발명의 치료용 항체를 엔코딩하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 당업자에게 공지된 방법에 의해 배양될 수 있다. 숙주 세포는 스피너 플라스크 (spinner flask), 진탕 플라스크, 롤러 보틀 (roller bottle), 웨이브 반응기 (예컨대, 웨이브바이오텍 닷 컴으로부터의 시스템 1000) 또는 할로우 섬유 시스템 (hollow fibre system)에서 배양될 수 있으며, 대규모 생성이 바람직하고, 교반된 탱크 반응기 또는 백 반응기(예컨대, 웨이브 바이오텍, Somerset, New Jersey USA)가 특히 부유 배양에 사용된다. 통상적으로, 교반된 탱커는 예를 들어, 살포기, 배플 (baffle) 또는 저전단 임펠러를 사용하여 공기를 공급하기에 적합하다. 버블 컬럼 및 에어리프트 반응기에 있어서, 공기 또는 산소 버블의 직접 공기 주입이 이용될 수 있다. 숙주 세포가 혈청 비함유 배양 배지중에서 배양되는 경우, 배지에는 세포 보호성 제제 예컨대, 플루로닉 F-68이 추가되어 공기 공급 과정으로 인한 세포 손상을 방지하는 것을 돕는다. 숙주 세포 특징에 따라, 마이크로담체가 부착 의존성 세포주에 대한 성장 기질로서 사용될 수 있거나, 세포는 부유 배양 (부유 배양이 전형적임)에 적합할 수 있다. 숙주 세포 특히, 척추동물 숙주 세포의 배양은 다양한 작동 모드 예컨대, 회분, 유가식-회분, 반복된 회분식 공정 (문헌 [Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109] 참조), 연장된 회분식 공정 또는 관류 배양을 이용할 수 있다. 재조합에 의해 형질전환된 포유동물 숙주 세포가 혈청 함유 배지 예컨대, 소태 혈청 (FCS)을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있지만, 이러한 숙주 세포는, 필요에 따라 에너지 공급원 예컨대, 글루코오스 및 합성 성장 인자 예컨대, 재조합 인슐린이 보충된, 예컨대, 문헌 [Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163]에 기재된 바와 같은 혈청-비함유 배지 또는 시중에서 입수가능한 배지 예컨대, ProCHO-CDM 또는 UltraCHO^TM (Cambrex NJ, USA)에서 배양되는 것이 바람직하다. 숙주 세포의 혈청 비함유 배양은 이러한 세포들이 혈청 비함유 조건에서 성장하기에 적합하게 되어야 한다. 한 적합화 방법은 이러한 숙주 세포를 혈청 함유 배지중에서 혈청 비함유 배지용 배양 배지중 80%를 반복적으로 대체하면서 배양시켜, 숙주 세포를 혈청 비함유 조건에 적응시키는 것이다 (문헌 [Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology : Developments towards the 21 st century (Beuvery E. C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers] 참조).

배지로 분비된 본 발명의 항체는 다양한 기법을 이용하여 배지로부터 회수되고 정제되어 의도된 용도에 적합한 정제 정도를 제공한다. 예를 들어, 사람 환자의 치료를 위한 본 발명의 치료용 항체의 사용은, 치료용 항체를 포함하는 배양 배지와 비교하여, SDS-PAGE를 감소시킴에 의해 측정되는 대로 전형적으로 95% 이상의 순도, 더욱 전형적으로는 98% 또는 99%의 순도이어야 한다. 제 1 예에서, 배양 배지로부터의 세포 부스러기는 전형적으로 원심분리에 이어서, 예를 들어, 미세여과, 초여과 및/또는 심층 여과를 사용하여 상층액 정화 단계에 의해 제거된다. 대안적으로, 항체는 사전의 원심분리 없이 미세여과, 초여과 또는 심층 여과에 의해 회수될 수 있다. 다양한 기타 기법 예컨대, 투석 및 겔 전기영동 및 크로마토그래피 기법 예컨대, 히드록시아파타이트 (HA), 친화성 크로마토그래피 (선택적으로, 폴리히스티딘과 같은 친화성 태깅 시스템을 포함) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC, US 5,429,746 참조)가 이용가능하다. 일 구체예에서, 다양한 정화 단계 후, 본 발명의 항체는 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 후, 추가의 크로마토그래피 단계 예컨대, 이온 교환 및/또는 HA 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환, 크기 배제 크로마토그래피 및 암모늄 설페이트 침전을 이용하여 포획된다. 전형적으로, 다양한 바이러스 제거 단계가 또한 사용된다 (예를 들어, DV-20 필터를 사용한 나노여과). 이러한 다양한 단계 후, 적어도 10mg/ml 또는 이를 초과하는, 예를 들어 100mg/ml 또는 이를 초과하는 본 발명의 항체를 포함하는 정제된 (바람직하게는, 모노클로날) 제조물이 제공되며, 따라서, 이는 본 발명의 구체예를 형성한다. 초원심분리에 의해 100mg/ml 또는 이를 초과하는 농도가 생성될 수 있다. 적합하게는 이러한 제조물은 본 발명의 응집된 형태의 항체를 사실상 함유하지 않는다.

세균 시스템은 항체 단편을 발현시키기에 특히 적합하다. 이러한 단편은 세포내 또는 주변혈장(periplasma) 내에 국소화된다. 당업자에게 공지된 방법에 따라 가용성 주변세포질 단백질을 추출하고 재폴딩시켜 활성 단백질을 형성할 수 있다[참조, Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 and Cupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277].

3. 약제학적 조성물

상기 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 정제된 제조물 (특히, 모노클로날 제조물)은 상기 나열된 것들과 같은 사람 질병 및 질환의 치료에 사용되기 위한 약제학적 조성물로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 공지되어 있고 허용될 수 있는 약제학적 실무에 요구되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는(즉, 비활성) 담체를 추가로 포함한다(예를 들어, 문헌 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition, (1980), Mack Publishing Co] 참조). 이러한 담체의 예로는 적합한 완충제, 예컨대 나트륨 아세테이트 삼수화물에 의해 pH 5 내지 8과 같이 약제학적으로 허용되는 pH로 완충된, 멸균된 담체 예컨대, 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액이 있다. 주입용 (예를 들어, 정맥내, 복막내, 진피내, 피하내, 근내 또는 문맥내) 또는 연속 주입용 약제학적 조성물에는 적합하게는 육안으로 확인되는 입자 물질이 없으며, 1mg 내지 10g의 치료용 항체, 통상적으로 5mg 내지 1g, 더욱 특히 5mg 내지 25mg 또는 50mg의 항체를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물의 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일 구체예에서, 약제학적 조성물은 1mg 내지 10g의 본 발명의 치료용 항체를 선택적으로, 사용 설명서와 함께 단위 용량 형태로 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 동결 건조 (냉동 건조)되어 당업자에게 널리 공지되거나 자명한 방법에 따라 투여 전에 재구성될 수 있다. 본 발명의 구체예가 IgG1 이소형을 갖는 본 발명의 항체를 포함하는 경우, 구리를 포함하는 금속 이온의 킬레이터, 예컨대 시트레이트 (예를 들어, 나트륨 시트레이트) 또는 EDTA 또는 히스티딘이 약제학적 조성물에 첨가되어 이러한 이소형의 항체의 금속-매개된 분해 수준을 저하시킬 수 있다 (EP 0612251 참조). 약제학적 조성물은 아르기닌 염기와 같은 용해제, 세제/항-응집제, 예컨대 폴리소르베이트 80, 및 바이알의 공간부분 산소를 대신하는 비활성 기체, 예컨대 질소도 포함할 수 있다.

본 발명의 항체를 투여하기에 유효한 용량 및 처리 요법은 일반적으로 실험에 의해 결정되며, 환자의 연령, 체중 및 건강 상태, 및 치료하려는 질환 또는 질병과 같은 인자에 의존적이다. 이러한 인자는 담당 주치의의 권한내에 있다. 적합한 투여량 선택에 대한 기준은 예를 들어, 문헌 [Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York]에서 발견되며, 일반적으로 1mg 내지 10g일 것이다. 일 구체예에서, 사람 환자를 치료하기 위한 용량 섭생은 1주에 1회 또는 2주에 1회 피하 투여되거나, 1개월 또는 2개월마다 정맥내 주입되는 1mg 내지 1g의 본 발명의 치료용 항체이다. 이러한 투여량은 0.014-140mg/kg, 예컨대 0.014-14mg/kg에 상응한다. 본 발명의 조성물은 예방을 위해 이용될 수도 있다.

4. 임상 용도

증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 질병으로는 알츠하이머병, 가벼운 인식능 손상, 다운증후군, 더치형 β-아밀로이드증을 지닌 유전성 뇌출혈, 대뇌 β-아밀로이드 혈관병증 및 다양한 유형의 퇴행성 치매, 예컨대 파킨슨병과 관련된 것들, 점진적인 핵상 마비, 겉질 기조 퇴행 및 확산성 루이스체 유형의 알츠하이머병이 있다.

가장 바람직하게는, 증가된 β-아밀로이드 수준 또는 β-아밀로이드 침착을 특징으로 질병이 알츠하이머병이다.

본 발명이 주로 사람 질환 또는 질병의 치료에 관해 기술되었으나, 본 발명은 또한 사람 이외의 포유동물의 유사한 질환 또는 질병의 치료에 적용될 수 있다.

실시예

방법

Biacore™/Biacore 3000 SPR을 이용하여 분자 상호작용의 실시간 동력학을 측정할 수 있는 장치

SPR (표면 플라스몬 공명) - 센서 칩 상에서 질량 변화를 측정하기 위해 Biacore™ 기계에 의해 적용되는 물리적 현상

CM5 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 코팅된 일반적 용도의 표면을 지니는 Biacore™ 센서 칩

ELISA 효소면역측정법

SRU 무-표지 생화학적 상호작용을 모니터링할 수 있는 SRU BIND™ 바이오센서 기술

Integra CL 1000 IBS Integra Biosciences에 의해 판매되는 미니-바이오반응기

FMAT 형광측정 미세부피 검정 기술 (Applied Biosystems)

ABi8200 FMAT용 Applied Biosystems 8200 형광 매크로 공초점 세포 검출 시스템

FPLC 고속 단백질 액체 크로마토그래피

ProSepA HiTrap GE Healthcare에서 판매되는 FPLC용 단백질 A 컬럼

재료

DMSO 디메틸설폭사이드

HEPES N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

Tris HCl - 트리스-(히드록시메틸)아미노메탄 히드로클로라이드

NaCl - 염화나트륨

Tween-20 - 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트

BSA - 소혈청 알부민

PBS - 포스페이트 완충된 염수

PFA - 파라포름알데히드

IMS - 산업용 메틸화 스피릿

DAB - 3,3'디아미노벤지딘

DMEM 둘베코의 개질된 이글 배지

FCS 우태아 혈청

Opti-MEM Invitrogen/Gibco에 의한 개질된 이글 배지를 기재로 하는 배지

리포펙타민 Invitrogen/Gibco에 의해 판매되는 양이온 지질 기재 세포 트랜스펙션제

트랜스패스트(Transfast) Promega에 의해 판매되는 리포솜 트랜스펙션제

베르센(Versene) 금속 이온 킬레이팅제 (에틸렌디아민테트라아세트산)

글루타맥스 배양 배지에 첨가되는 안정한 형태의 글루타민 (디펩티드 L-알라닐-L-글루타민 보충물)

히스토클리어(Histoclear) 조직 청소제

HBS-EP 완충액 0.01 M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20을 함유하는 일반적인 용도의 Biacore™ 완충액.

마우스 모노클로날 항체 2 E7 의 생성

마우스의 통상적인 면역화로부터 마우스 모노클로날 항체 2E7을 생성하였다. 마우스를 프로인트 애주번트에 제형화된 가용성 또는 응집된 β-아밀로이드 1-40 및 1-42로 면역시켰다. 애주번트 없이 최종 부스트(boost) 이후에, 비장세포를 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 96-웰 플레이트에서 성장시켰고, 이로부터 잠재적인 리드(leads)용의 하이브리도마 상층액을 스크리닝하였다. 가용성 β-아밀로이드 1-40으로 면역시켜 수득된 선택된 항체 2E7은 뮤린 lgG2a 이소형이었고 하기 개시된 유출 검정에서 베타-아밀로이드 결합 활성을 지녔으며 친화성은 Biacore™, 방법 A(i)에 의해 측정시 베타-아밀로이드 1-40에 대해 36.1 pM이었다 (표 10A).

2 E7 의 에피토프 맵핑

β-아밀로이드 펩티드에 대한 항체 2E7의 결합을 정교하게 맵핑하기 위해, 펩티드 세트(A)를 이용하였다. 펩티드 세트(A)는 β-아밀로이드 1-42 펩티드의 완전 서열을 커버하는 31개 12량체 중복 펩티드의 세트로 구성된다. 각 연속되는 펩티드는 β-아밀로이드 펩티드 내에서 연속되는 아미노산에서 개시되므로, 단일 아미노산에 의해 연속되는 펩티드 사이에 커버된 서열을 변화시킨다. 세트(A)의 모든 펩티드는 3개의 아미노산 C-말단 링커(글리신-세린-글리신) 및 말단 비오티닐화된 리신 잔기를 함유하였다. 추가로, 펩티드 Aβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-비오틴 (서열번호 15)를 제외한 모든 펩티드가 N-말단에서 아세틸화되었다. 두 번째 세트의 펩티드(세트(B))는 β-아밀로이드 서열의 아미노산 1-10를 함유하는 펩티드로부터의 연속되는 하나의 아미노산 C-말단 결실체로 구성된다. 세트(B)의 모든 펩티드는 3개의 아미노산 C-말단 링커(글리신-세린-글리신) 및 말단 비오티닐화된 리신 잔기를 함유하였으나, 결실된 β-아밀로이드 아미노산을 대신하는 추가의 글리신 및 세린 잔기를 지닌다 (표 2). 따라서, 세트(B)의 모든 펩티드는 동일한 길이를 지닌다.

표 2

광학 바이오센서를 이용한 2 E7 의 β-아밀로이드 유래 펩티드에 대한 결합 모니터링

96-웰 SRU Bind™ 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 (SRU Biosystems)를 1% DMSO를 함유하는 PBS로 세척하여 글리세롤 및 보존제를 제거하였다. 50㎕/웰의 부피를 남겨 실온에서 평형을 이루게 함으로써 일정한 베이스 라인을 제공하였다. 비오티닐화된 펩티드를 1% DMSO를 함유하는 PBS에서 대략 0.3㎍/ml로 희석시키고 각 50㎕를 웰에 첨가하고 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트의 상이한 섹터를 이용하여 복제 웰을 제조하고 적어도 하나의 비-펩티드 대조군 웰을 각 섹터에서 데이터를 감하는 기준으로 이용하였다. 펩티드 포획 후에, 플레이트를 1% DMSO를 함유하는 PBS로 세척하고, 웰 당 50㎕의 새로운 완충액을 남겨서 판독기 상에서 새로운 베이스 라인을 제공하였다. 표면으로부터 펩티드의 붕괴가 관찰되지 않았다. 이후 완충액을 20-64 nM의 시험 항체를 함유하는 40㎕/웰 완충액으로 2시간 동안 대체하였다. 항체 2E7이 펩티드 세트(A)에서 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-12를 포함하는 펩티드(펩티드 Aβ1, 서열번호 15)에만 결합된 것이 발견되었다. 이 결과는 잔기 1의 아스파르트산이 이 펩티드로의 결합에 필요함을 암시한다.

항체 2E7의 결합 부위를 추가로 특성화하기 위해, 펩티드 세트(B)를 이용하였다. SRU BIND™ 바이오센서 방법을 이용하여, 항체 2E7은 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-3 및 1-4를 포함하는 펩티드 (서열번호 14 및 13)에 대해 무시할 수 있을 정도의 결합을 나타내었다. β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-7을 포함하는 펩티드 (서열번호 10)에 대한 결합은 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-12를 포함하는 펩티드 (펩티드 세트(A)로부터)에 필적하였다. β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-5 또는 1-6을 포함하는 펩티드(서열번호 12 또는 11)에 대한 결합이 관찰되었으나, β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-7을 포함하는 펩티드(서열번호 10)에 대한 결합 보다 약했다 (추가의 세척 단계 후 안정성에 의해 측정됨).

따라서, β-아밀로이드 펩티드의 잔기 1-7만이 이 방법을 이용하여 측정시 충분한 결합에 필요한 것으로 나타났다.

표면 플라스몬 공명 검정

상기 기재된 실험에 추가하여, Biacore™ 3000 광학 바이오센서를 이용하여 선택된 β-아밀로이드 서열 유래 펩티드에 대한 2E7 항체의 결합을 모니터링하였다. 결합은, 시험 항체를 64nM 이하로 5분 동안 분리된 스트렙타비딘 칩 표면(130-230 RU(공명 유닛)) 상에 포획된 펩티드 위에 주입하여 측정되었다. 0.01 M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20™를 함유하는 진행 (running) 완충액(HBS-EP)을 25℃에서 20㎕/분의 유속으로 이용하였다. 모든 진행은 블랭크 스트렙타비딘 표면 및 블랭크 주입에 대하여 이중으로 평가되었다. Biacore™ 분석 소프트웨어 BIAevaluation™ 버젼 4.1을 이용하여 분석을 수행하였다. 세트(A)의 선택된 펩티드로부터의 결과는, 2E7이 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-12를 포함하는 펩티드 (서열번호 15)에만 약 5OpM의 겉보기 평형상수 KD로 결합됨을 나타내는 SRU BIND™ 유래 데이터를 추가로 확증한다. 동일한 조건하에, 2E7은 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 2-13을 포함하는 펩티드에 결합되지 않았다.

펩티드 Aβ2-13 AEFRHDSGYEVHGSGK-비오틴 (서열번호 44)

사용된 실험 방법 및 조건은 고 친화성 분자 뿐만 아니라 저 친화성 분자의 검출도 가능하게 한다 - 동일한 실험 설비에서, 2E7에 대조적으로, β-아밀로이드 펩티드의 N-말단 에피토프를 인식하는 또 다른 항체는 7nM의 겉보기 KD로 2-13 펩티드 (서열번호 44)에 결합되는 것으로 나타났다. 2E7는 β-아밀로이드 펩티드의 중간 영역으로부터의 세트(A)의 선택 펩티드에 결합되지 않았다. 별개의 실험에서, β-아밀로이드 1-40 펩티드는 비오티닐화된 이의 N-말단 아스파르트산 잔기를 통해 포획되었다. 이 펩티드는 앞서 기재된 Biacore™ 스트렙타비딘 코팅된 칩 상에 포획되었다. 66nM으로 1분 동안 주사된 항체 2E7는 이 펩티드에 결합될 수 없었다. 따라서, 앞서 기재된 N-말단 결합 부위가 링커 및 포획 방법에 의해 차폐된다는 결론을 내렸고, 이에 따라 맨끝의 N-말단이 코어 결합 부위를 함유하는 것으로 확인된다.

세포 발현된 아밀로이드 전구체 단백질( APP )에 대한 결합

β-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라 불리는 타입 I 막횡단 전구체 단백질의 단백질분해 절단에 의해 형성된 펩티드로 구성된다. APP가 큰 세포외 도메인이기 때문에, 이 단백질에 대한 결합은 항체-의존적인 세포의 세포독성 반응(ADCC)을 잠재적으로 개시할 수 있었다.

세포-표면 전장 APP에 대한 항체의 결합을 특성화하기 위해 FMAT™ ABI8200 기재 검정을 이용하였다.

야생형 APP DNA 를 이용한 HEK293T 세포의 트랜스펙션

HEK293T 세포를 10 % (v/v) FCS 및 1x 글루타맥스를 함유하는 DMEM F12 배지에 유지한다. 세포를 75cm² 조직 배양 플라스크에 시딩하고 트랜스펙션 전에 60-80%의 컨플루언시 (18-24 h)로 성장시켰다. 트랜스펙션을 위해, 9 ㎍의 DNA (야생형 APP DNA (PCDNA3.1 (Invitrogen) 벡터에서), 또는 벡터 단독의 대조군)을 0.3 ml의 Opti-MEM™ 배지와 혼합시켰다. 3O㎕의 리포펙타민™ 트랜스펙션제를 0.3ml의 Opti-MEM™ 배지와 혼합시키고 두 혼합물을 푸울링하였다. 푸울링된 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후 추가로 4.8 ml의 Opti-MEM™ 배지를 첨가하였다. 최종 혼합물을 세포에 (Opti-MEM™ 배지를 이용한 세척 후) 5시간 동안 첨가한 다음 DMEM 중 6 ml의 10 % (v/v) 신생 송아지 혈청을 첨가하였다. 트랜스펙션 48시간 후에, 상층액을 제거하고 단층을 베르센으로 세척한 다음, 3ml의 베르센™ 킬레이팅제를 각 플라스크에 첨가하고, 5분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 분리된 세포를 200g으로 5분 동안 펠릿화하였다. 생성된 세포 펠릿을 1ml의 검정 완충액 (PBS 중 2% 열처리된 혈청, 0.5% BSA, 0.1 % NaN₃ pH7.4, 0.2㎛ 필터를 통해 여과됨)에 서서히 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 생성하였다.

FMAT ™ ABI8200 기재 검정

시험 항체 (2E7, 포지티브 대조군으로서 APP의 세포외 도메인에 대한 LN27 (Zymed) 마우스 IgG, 및 네거티브 대조군으로서 β-아밀로이드의 x-40 형태를 인식하는 항체 G210)를 폴리프로필렌 플레이트에서 멸균 여과된 검정 완충액(PBS 중 2% 열처리된 혈청, 0.5% BSA, 0.1% NaN₃ pH7.2)에서 10㎍/ml로 희석시킨 다음, 플레이트를 따라 추가로 6회 연속하는 1:1 희석을 수행하였다. 블랭크로서 검정 완충액만을 이용하였다. 야생형 APP DNA로 트랜스펙션된 HEK293T 세포의 50㎕의 현탁액 (실험 1: 10,000개 세포; 실험 2: 20,000개 세포)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 여기에 5㎕의 각 항체 용액을 첨가시켜 웰을 이중으로 하였다. 검정 완충액에서 1:500(실험 1) 및 1:1000(실험 2)로 희석된, 5O㎕/웰의 F-MAT™ 블루 항-마우스 IgG 스톡 (항체는 ABI로부터의 F-MAT™ 블루 일작용성 반응 염료 키트를 이용하여 표지됨, 4328408)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 잠시 진탕시키고, 1시간 동안 가라앉게 두었다. 이후 플레이트를 ABI 8200 형광 매크로 공초점 세포 검출 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 판독하였다.

획득한 집계 데이터를 Excel™ 스프레드시트 소프트웨어를 이용하여 해석하였다. 간단히 말해, 모의 트랜스펙션된 집계를 전장 APP 트랜스펙션된 세포 집계로부터 빼서 각 항체에 대한 특정 시그널을 수득하였다. 곡선의 직선 부분에 있는 두 항체 농도를 선택하여 (1.25 및 0.63㎍/ml) 이러한 농도에서 배경 교정된 획득된 집계를 LN27 항체 결합의 백분율로서 표시하고, 두 항체 농도에 대해 평균을 내었다. 수득된 데이터를 표 3에 기술한다 (LN27 결합의 %±SE). 따라서, 이 검정 시스템내에서, 세포 표면 APP에 대한 2E7의 결합이 네거티브 대조군 항체 G210의 것과 구별될 수 없다.

표 3

아밀로이드 전구체 단백질 유래된 펩티드에 대한 결합

앞서 개시된 에피토프 맵핑 연구는, 항체 2E7이 β-아밀로이드 펩티드의 맨끝의 N-말단에 결합되며, 위치 1의 아스파르트산 잔기가 결합에 필수적임을 나타내었다. 이것은, 항체가 β-세크레타아제 부위에서 APP의 절단에 의해 형성된 '네오(neo)' 에피토프를 인식함을 시사한다. 이러한 관찰은, 항체 2E7이 인접한 APP 펩티드 서열을 인식하지 않아야 함을 암시할 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해, β-아밀로이드 펩티드의 잔기 1-7 및 5개의 인접한 APP 유래 아미노산을 포함하는 APP 펩티드 (펩티드 APP1, 서열번호 16)를 합성하였다. 따라서, 펩티드 APP1은 BACE-1 절단 부위에 대한 위치 5N-말단으로부터 BACE-1 절단 부위에 대한 위치 7 C-말단까지의 연속하는 아미노산을 함유하였고 N-말단 아세틸화되었다. APP 유래 펩티드 APP1 및 β-아밀로이드 1-12 펩티드 (펩티드 Aβ1)에 결합되는 항체 2E7의 능력을 Biacore™ 방법 (에피토프 맵핑에 대해 앞서 기술됨)을 이용하여 비교하였다. 항체 2E7은 기본적인 에피토프 1-7을 함유하는 β-아밀로이드 펩티드 Aβ-1에 대해 높은 친화성 결합을 나타내었다. 그러나, 기본적인 β-아밀로이드 유래 서열 1-7도 함유하는 APP1 펩티드에 대해서는 아무런 결합도 관찰되지 않았다.

펩티드 Aβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-비오틴 서열번호 15

APP1 AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK-비오틴 서열번호 16

FMAT™ 기재 세포 결합 및 Biacore™ 기재 펩티드 맵핑을 조합하여 이용해 보면, 이러한 포맷에서, 2E7은 전장 APP 단백질에 대해 어떠한 결합 친화성도 지니지 않았다. β-아밀로이드 펩티드의 위치 1에 있는 아스파르트산 잔기가 결합에 필요하다고 가정하면, 2E7만이 β-아밀로이드의 '네오' N-말단을 인식하므로 세포 표면 발현된 APP에 결합되지 않아야 한다는 결론이 내려진다.

생체내 생물학적 활성

I ¹²⁵ β-아밀로이드 유출 모델

다수의 공개된 연구는, β-아밀로이드 항체가 혈류에서 β-아밀로이드 펩티드와 복합체를 형성할 수 있다고 보았다. 말초 β-아밀로이드의 이러한 격리가 CNS 아밀로이드가 혈류로 추가 유출되는 것을 가능하게 한다고 주장된다 (DeMattos RB, PNAS (2001), 98(15); 8850-8855). 혈류에서 뇌 유래된 β-아밀로이드 펩티드와 복합체화되는 항체의 능력에 대해 항체를 스크리닝하기 위해 급성 약역학 모델이 개발되었다.

수컷 C57/BL6J 마우스의 마취(4% 이소플루란)를 유도하고 100% 산소 중에 유지하였다(1.5% 이소플루란). 이후 동물을 정위 프레임에 놓았다. 시상 봉합에 따른 중간선 절개 이후에, 보어 홀(bore hole)을 두개골을 통해 꿰뚫고 가이드 캐뉼러를 측면 뇌실로 삽입하였다 (공동-세로좌표 전후방(AP) -0.5mm, 측면 (L) +0.7mm, 배쪽 (V) -2.5mm). 추가로 2개의 보어 홀을 두개골을 통해 꿰뚫고 여기에 겉질 스크류를 정위시켰다. 캐뉼러를 시아노아크릴레이트 겔에 의해 적소에 앵커링하고 시아노아크릴레이트 겔 헤드캡 주위에서 절개를 봉합하였다. 수술 후 마우스에게 0.3ml 염수를 피하 제공하고 마취로부터 회복되도록 따뜻한 환경에 두었다. 바로잡기 반사의 회복시에, 마우스를 홀로 수용하고 표준 수술후 처치를 5일간 받게 하였다. 추가 5일 동안 또는 수술 전 체중이 회복될 때까지 어떠한 조처도 취하지 않았다. 회복 후, 캐뉼러 위치를 안지오텐신 II 음용 반응에 의해 확인하였다. 각 마우스에게 100ng의 안지오텐신 II(AII)(0.9% 염수에서 제조됨)를 뇌실내(ICV) 투여하였다. AII를 투여한 후, 15분 동안 물 섭취를 관찰하였다. AII에 포지티브 구갈성 반응을 지니는 마우스(지속된 음용)를 연구에 포함시켰고, 이 연구는 AII 주입 후 5일째에 개시되었다.

연구 당일에, 마우스를 따뜻한 환경에 5-10분 동안 두어 혈관확장을 유도하였고, 이것은 꼬리 정맥으로의 주사를 용이하게 하는데 필요하다. 시험 항체(600㎍) 또는 PBS 비히클(체중 1kg에 대하여 10ml 이하의 용량 부피)을 꼬리 정맥을 통해 주사하고 주사 후 이들의 개별 우리로 돌려 보냈다. 꼬리 정맥에 주사한 지 정확히 1시간 후에, 마우스에게 2ng(1μCi)의 I¹²⁵ 베타-아밀로이드 1-40(Amersham Biosciences, UK)을 5㎕의 용량 부피로 천천히 ICV 주사하였다 (분당 2㎕). ICV 투여한지 정확히 4시간 후에, 50㎕의 동맥혈을 수집하였고 섬광 계수기 상에서 방사능 활성을 측정하였다.

꼬리-정맥에 2E7 (처리 그룹 당 n=6)이 주사된 마우스는 비히클이 주사된 마우스에서 검출된 CPM 시그널과 비교하여 50㎕의 동맥혈 중의 방사능 시그널(분당 계수-CPM)에서 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다 - (CPM - 비히클: 1339.7 ± 496.2 vs. 2E7 4387.9 ± 980.3; ANOVA:F(2,13) = 4.97, p<0.05. Post-hoc LSD: p=0.01 2E7 vs. 비히클 [post-hoc Duncans: p=0.02 2E7 vs, 비히클]).

동일한 프로토콜을 이용하여 수행된 2E7을 이용한 2회의 추가 연구에서, 비히클 주사된 대조군에 비해 혈액으로의 아밀로이드 유출에 있어서 유사한 증가가 관찰되었다 (CPM 혈액: 비히클 352 ± 113 versus 2E7 2397 ± 353, 및 비히클 1281 ± 312 versus 2E7 5291 ± 885; ANOVA post-hoc LSD 시험 이용 p<0.001 vs. 비히클).

유전자이식 CNS β-아밀로이드 저하 모델

1. 2월령 TASTPM 마우스의 4주 투여 후 β-아밀로이드 로드

연구 시작시에 수컷 및 암컷 TASTPM 유전자이식 마우스 (이중-돌연변이 APPswe x PS1.M146V, Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136)는 61 내지 65일령이었고 단독으로 수용되었다. 동일한 수의 마우스를 각 처리 그룹으로 할당하였는데 (그룹당 n=12) 성별 및 연령에 따라 무작위로 하였다. 처리 그룹은 하기를 포함하였다: A: MOPC21 (공지되지 않은 특이성의 항체, Holton et al (1987) J.Immunol 139(9) 3041-3049, 네거티브 대조군), B: 2E7 (시험 항체). 모든 항체를 PBS에 용해시키고 복막내 경로에 의해 투여하였다. 동물의 체중과 무관하게, 300㎍의 항체를 투여하였다. 동물에게 매주 2회씩 4주 동안 투여하였다. 최종 투여한 지 1일 후에, 동물을 과량의 나트륨 펜토바르비탈로 안락사시켰다. 뇌를 해부하고 반절단하였다. 반절단된 뇌 샘플을 미리-칭량된 2ml의 에펜도르프™ 튜브에 수집하고 스냅 동결시켰다. 후속하여 샘플을 해동시키고, 재칭량하고, 완전 프로테아제 억제제™ 정제(Boefringer Mannheim)를 함유하는 1ml의 5M 구아니딘 HCl을 첨가한 후, 샘플을 균질화하고 일정한 교반과 함께 4℃에서 >90분 동안 인큐베이션하였다.

이후 샘플을 검정 완충액에 10 중의 1로 희석하고 (5OmM Tris HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20+ 1% BSA), 볼텍싱시키고, 20,00OG에서 20분 동안 4℃에서 회전시켰다. 상층액을 제거하고 검정 플레이트에 삼중 샘플로서 첨가하였다.

비오티닐화된 N-말단 특이적인 Aβ 항체와 함께, Aβ40 또는 Aβ42를 포획하는데 사용되는 검출 (BioVeris™)을 촉진하기 위한 오리태그(Oritag™) 특이적인 표지로 표지된 C-말단 특이적인 β-아밀로이드 항체 (Aβ40 또는 Aβ42에 대해)를 적용하는 민감성 플레이트 기재 전기화학발광 면역검정 (BioVeris™)을 이용하여 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정하였다. 항체-Aβ 복합체를 강렬한 혼합과 함께 실온에서 밤새 인큐베이션된 비오티닐화된 항체(Dynabeads™, Dynal)에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 비즈로 포획하고 BioVeris™ M8 광검출기에서 검정하였다. 요구되는 농도의 구아니딘 HCl을 함유하는 검정 완충액에서 사람 Aβ40 및 Aβ42 펩티드를 이용하여 표준 곡선을 그렸다. 데이터를 엑셀 로보세이지(Excel Robosage™) 통계 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하고 Aβ 수준을 pmole/조직g으로서 표시하였다.

이러한 범례에서, 2E7 항체를 이용한 치료는 CNS Aβ42 로드를 37% (p<0.001)까지 감소시켰고 CNS Aβ40 로드를 23% (p<0.001)까지 감소시켰다.

유사한 실험 조건하에서의 후속적인 연구에서, 2E7 항체는 PBS 처리된 동물에 비해, CNS Aβ42 로드를 38% (연구 1, 수컷만), 22% (연구 2, 비유의적임) 및 39% (연구 3, 수컷, p=0.001) 및 13% (연구 3, 암컷, 비유의적임)까지 감소시켰다. 이러한 연구에서, 2E7은 PBS 처리된 동물에 비해, CNS Aβ40도 18% (연구 3, 수컷, p=0.017)까지 감소시켰고 CNS Aβ40에서 25% (연구 1, 수컷만), <1% (연구 2)의 비유의적인 감소와 3% (연구 3, 암컷)의 비유의적인 증가를 제공하였다.

2. 4월령 TASTPM 마우스의 4개월 투여 후 β-아밀로이드 로드

간단히 말해, 4월령 TASTPM 유전자이식 마우스에게 매주 1회 또는 2회씩 300㎍의 항체를 복막내(i.p.) 경로를 통해 투여하였다. 4개월 투여 후 CNS β-아밀로이드 수준을 ELISA에 의해 측정하고 면역조직화학에 의해 플라크 로드를 측정하였다. 4월령 내지 8월령 사이에, CNS β-아밀로이드 로드가 급격하게 증가하였고, 결과적으로 플라크 병리학이 신속하게 전개되었다 (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136).

연구 시작시에 마우스는 120 내지 128일령이었고 단독으로 수용되었다. 유사한 수의 마우스를 각 처리 그룹으로 할당하였는데 (그룹당 n=20 또는 21) 성별 및 연령에 따라 무작위로 하였다. 처리 그룹은 하기를 포함하였다: A: 매주 2회 투여되는 PBS (비히클), B: 매주 1회 투여되는 2E7, C: 매주 2회 투여되는 2E7, D: 매주 1회 투여되는 PBS. 300㎍ 용량 (79㎕ 부피)의 2E7을 복막내 경로를 통해 투여하였다. 비히클 처리된 동물은 동일한 부피의 PBS를 수용하였다. 동물에게 18주 동안 투여하였다. TASTPM 마우스는 자발적인 발작을 겪기 쉬우며 그 결과 연구를 진행하는 동안 다수의 동물이 죽었다. 최종 수는 다음과 같았다: A: 4마리 암컷, 9마리 수컷; B: 5마리 암컷, 8마리 수컷; C: 4마리 암컷, 9마리 수컷; D: 2마리 암컷, 9마리 수컷. 최종 투여한 지 2일 또는 4일 후 (그룹당 동일한 수) 동물을 과량의 나트륨 펜토바르비탈로 안락사시켰다. 유전자형을 확인하기 위해 각 마우스로부터 꼬리 끝 샘플을 취하였다. 뇌를 해부하고 반절단하였다. 오른쪽 반구체를 4% 파라포름알데히드에 담금에 의해 고정시키고 조직학을 위해 프로세싱하였다. 왼쪽 반구체를 미리-칭량된 2ml의 에펜도르프™ 튜브에 수집하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고 아밀로이드 함량의 후속 분석을 위해 -80℃에 저장하였다. 분석 전에, 샘플을 해동시키고, 재칭량하고, 완전 프로테아제 억제제™ 정제(Boefringer Mannheim)를 함유하는 1ml의 5M 구아니딘 HCl을 첨가한 후, 샘플을 균질화하고 일정한 교반과 함께 4℃에서 >90분 동안 인큐베이션하였다.

이후 샘플을 검정 완충액에 10 중의 1로 희석하고 (50mM Tris HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20+ 1% BSA), 볼텍싱시키고, 20,00OG에서 20분 동안 4℃에서 회전시켰다. 상층액을 추가로 1:1000으로 희석하고 검정 플레이트에 삼중 샘플로서 첨가하였다. Aβ40 및 Aβ42의 수준을 4주 동안의 투여 연구로서 측정하였다.

불변 효과(fixed effect)로서 모델에 포함된 처리, 성별 및 투약 스케쥴에 대해 분산 분석을 이용하였다. 3개의 인자간의 상호작용 모두가 포함되었다. 두 투약 스케쥴(매주 1회 또는 2회)간에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 이 실험 설계에서, 먼저 투약 스케쥴간에 임의의 유의한 차이가 있는지가 평가될 수 있었고, 둘째로, 두 투약 스케쥴간에 이러한 유의성이 존재하지 않았기 때문에, 이들로부터의 데이터가 조합될 수 있었으므로, 분석에서 마우스의 수를 두 배로 늘림에 의해 실험의 일률을 증가시킬 수 있었다.

이러한 범례에서, 2E7 항체를 이용한 치료는 CNS Aβ42 로드를 22.5% (p=0.0152)까지 감소시켰다. CNS Aβ40의 수준도 12.1%까지 저하되었으나, 이러한 수치는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(p=0.118).

*이러한 샘플들의 복잡한 면역조직화학적 분석을 수행하여 플라크 병리학을 나타내는 뇌 조직 면적을 정의하였다. 꼬리 수준의 겉질 및 해마 수준의 겉질로부터 섹션을 취하였다. 인접한 섹션을 Aβ40 또는 Aβ42 특이적인 항체 또는 대안적으로 아밀로이드 염색 콩고 레드(Congo Red)로 염색하였다. 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여, 플라크에 대해 염색된 섹션의 면적을 총 섹션 면적의 백분율로서 표시하였다.

고정 후, PFA-담금된 반(half) 뇌를 뇌 매트릭스에서 6 x 2mm 두께의 섹션으로 두정에 의해(coronally) 절단하였다. 이러한 2mm 섹션을 섹션 A 내지 F라고 언급하며, A는 가장 입쪽이고 F는 가장 꼬리쪽이다. 섹션 A, B & C 및 D, E & F를 각 동물에 대해 넘버링된 별개의 엠베딩(embedding) 카세트에 정위시켰다. 프로세싱 및 엠베딩 준비시까지 카세트를 PFA에서 유지하였다.

Citadel™ 1000 (Shandon) 조직 프로세서 상에서 엠베딩을 수행하였다. 모든 조직은 하기 프로세싱 요법에 따랐다:-

70% IMS - 1 hr

100% IMS - 3 x 1 hr

100% 에탄올 - 2hr

100% 이소부틸 알코올; 1 x 2hr; 1 x 1.5hr

히스토클리어(Histoclear)™ - 2 x 1.5hr

파라핀 왁스 - 2 x 2hr

프로세싱 사이클을 완료한 후, 왁스 포화된 조직 섹션을 용융된-파라핀 왁스 충전된 베이스 몰드로 옮기고 히스토센터(Histocentre)™ (Shandon) 파라핀 엠베딩 시스템을 이용하여 엠베딩시켰다. 섹션 A, B & C가 하나의 몰드로 가고; D, E & F가 두 번째 몰드로 가도록 조직을 엠베딩시켰다. 이것은 모든 세트의 섹션들, 즉 각 반절단된 뇌에 대해 수행되어 각 3개 섹션의 2개의 왁스 불록을 야기하였다. 각 조각의 꼬리 표면이 향후 절단 표면이 되도록 섹션을 몰드에 놓았다. 각 섹션이 몰드에서 밑으로 잘 밀어넣어져서 각각의 마이크로토밍(microtoming)이 동시에 확실히 발생하도록 주의하였다. 천공된 프로세싱 카세트를 신중하게 각 몰드위에 두고, 그 위를 용융된 왁스로 씌웠다. 엠베딩된 블록을, 이들이 몰드로부터 제거될 수 있을 때까지 냉각된 플레이트 상에서 냉각시켰다. 블록을 마이크로토밍에 필요할 때까지 실온에서 저장하였다. 블록을 임의로 절단하고 5 미크론 섹션을 미리 표지된 젤라틴 코팅된 슬라이드에 부유시켰다 (Superfrost™, Erie Scientific Company). 두 섹션을 각 슬라이드 상에 부유시켰다. 가능한 어디든지, 연속적인 섹션을 탑재하고 슬라이드를 1에서 25까지 연속하여 넘버링하였다. 50개 섹션(25개 슬라이드)을 각 블록으로부터 취하였다. 슬라이드를 고온 플레이트 상에서 건조시킨 다음 필요시까지 실온에서 저장하였다.

면역조직화학법을 30개 슬라이드 세트에 대해 수행하였다. 각 슬라이드에 대해, 상부 섹션을 Aβ40 항체 (G30, x-40 β-아밀로이드를 인식하는 토끼 폴리클로날)로 표지하고, 하부 섹션을 Aβ42 항체, 20G10, x-42 β-아밀로이드를 인식하는 모노클로날 항체로 표지하였다. 블록에 대해 항체 당 최소 5개의 색션을 표지하였다.

다음과 같이 표지화를 수행하였다. 섹션을 히스토클리어와 다단계(graded) 알코올로 탈왁스화시킨 후, 85% 포름산에 8분 동안 담그고 0.3% 과산화수소로 30분 동안 차단시켜 내인성 퍼옥시다아제를 차단시켰다. 항체 G30 및 20G10 둘 모두를 1:1000 희석액으로 밤새 적용시켰고, 섹션은 4℃로 유지된다. 섹션의 현상을 각각의 비오티닐화된 항-토끼 및 항-마우스 종속물(secondary)로 하였다. 디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 염색 키트(DAB™, Vector Labs)를 이용하여 색 현상을 달성하였다. 섹션을 메이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 간단하게 상대염색한 후 탈수시키고, 깨끗이 하고, 유리 덮개를 씌웠다.

섹션을 방치시켜 현미경 검사 전에 적어도 48시간 동안 건조시켰다. 이미지를 디지탈 카메라가 구비된 레이카(Leica) DMRB™ 현미경 상에 잡았다. 이미지를 Qwin™ 소프트웨어 (Leica)를 이용하여 분석하고 결과를 Aβ 항체로 표지된 단면적의 %로서 표시하였다.

불변 효과로서 모델에 포함된 처리, 성별 및 투약 스케쥴에 대해 분산 분석을 이용하였다. 3개의 인자간의 상호작용 모두가 포함되었다. 두 투약 스케쥴(매주 1회 또는 2회)간에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 이 실험 설계에서, 먼저 투약 스케쥴간에 임의의 유의한 차이가 있는지가 평가될 수 있었고, 둘째로, 두 투약 스케쥴간에 이러한 유의성이 존재하지 않았기 때문에, 이들로부터의 데이터가 조합될 수 있었으므로, 분석에서 마우스의 수를 두 배로 늘림에 의해 실험의 일률을 증가시킬 수 있었다.

이러한 범례에서, 2E7 항체를 이용한 치료는 Aβ42를 인식하는 항체로 측정되는 플라크 병리를 감소시켰다. 플라크 병리는 해마 수준에서 겉질에서 27.1% (p=0.0026)까지 감소되었고 꼬리 수준에서 겉질에서 43% (p<0.0001)까지 감소되었다. 플라크 병리학도 Aβ40을 인식하는 항체로 측정시 감소되었다. 플라크 병리학은 해마 수준에서 겉질에서 16.6% (p=0.0421)까지 감소되었고 꼬리 수준에서 겉질에서 17.3% (p=0.0342)까지 감소되었다.

미세출혈의 어떠한 증거도 비히클 또는 2E7로 처리된 본 연구로부터의 임의의 마우스에서 관찰되지 않았다 (펄의 감청(Perls' Prussian Blue)에 의해 측정됨). 이 방법은 가용성 블루 화합물을 생성함에 의해 제2 철 (철은 적혈구에서 발견되는 산소-운반 헤모글로빈의 필수 구성성분이다)을 가시화한다. 모든 동물들로부터의 모든 뇌 수준이 깨끗하였다.

인식능 모델

상기 개시된 대로 4월령 TASTPM 마우스에게 4개월 투여한 후, 이들 마우스를 두 인식능 모델로 시험하였다: 물체 인식 검정 및 공포 조절 검정.

물체 인식 검정

물체 인식 검정은 새로운 물체를 탐구하는 동물의 타고난 경향을 이용하며 이전에 탐험된 물체(익숙한 물체)를 상기하는 동물의 능력에 의존한다. 8월령 TASTPM 마우스는 새로운 물체와 익숙한 물체를 구별하는 능력이 부족한 것으로 입증되었고 (Howlett et al., 2004) 이것은 이들 동물에서의 손상된 인식 성능을 나타낸다. 그러나, 본 연구에서, 비히클로 처리된 8월령 TASTPM 마우스가 인식능 손상을 증명하지 못했으며, 즉 이들은 새로운 물체와 익숙한 물체를 구별할 수 있었다. 따라서, 2E7을 이용한 치료로부터 임의의 잠재적인 치료 효과를 조사할 수단이 없었다.

공포 조절 검정

이전의 아픈 자극을 상황 또는 신호된 시그널과 관련시켜 Xh 지연 이후에 동일한 상황 또는 톤이 제공될 때 이것을 상기하는 동물의 능력을 시험하기 위해 공포 조절 모델을 설계하였다. 본 연구에서, 비히클로 처리된 (매주 1회 또는 2회) 8월령 TASTPM 마우스는 이들 동물에서의 인식능 손상의 상황 구분 표시에서의 결손을 나타내었다. 이러한 결손은 매주 1회 또는 2회로 2E7을 투여하여 치료해도 아무런 영향을 받지 않았다.

6월령 TASTPM 마우스의 4개월 투여

본 연구는 3월령부터 시작하여, TASTPM 마우스에서 4개월 동안 2E7 (300㎍ i.p. 매주 2회)을 투여하는 것을 포함한다. 대조군 동물은 PBS 중의 IgG2A를 수용하였다. 상기 기재된 대로, 뇌를 해부하고 반절단하였다. 오른쪽 반구체를 4% 파라포름알데히드에 담금에 의해 고정하고 조직학을 위해 프로세싱하였다. 왼쪽 반구체를 미리-칭량된 2ml 에펜도르프™ 튜브에 수집하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 아밀로이드 함량의 후속 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.

임의 선택된 각 뇌 샘플 (n=6 비히클, n=7 2E7 처리 그룹)로부터의 IHC에 의한 단일 섹션의 예비 분석을 상기와 동일한 일반적인 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 통계적 분석(스튜던트 t-테스트)은, 2E7을 투약한 마우스의 시상 (71.9%, p=0.007) 및 시상 + 겉질 + 해마 (54.1%, p=0.022)에서 Aβ42 플라크 로드의 현저한 감소가 있었고 Aβ40에서는 유의한 변화가 없었음을 나타내었다.

뇌 Aβ40 및 Aβ42의 생화학적 측정을 위해, 샘플을 프로세싱하고 상기대로 측정하였다 (희석 인자 1:10,000). Aβ42는 2E7이 투약된 마우스에서 29.9%까지 현저하게 감소되었다 (p=0.01)(n=12 대조군, n=16 치료됨). Aβ40 농도도 감소되었으나 (22.6%) 이러한 감소는 통계적 유의성에 도달하지 못했다 (p=0.052).

하이브리도마 가변 영역의 클로닝

가변 영역 서열

총 RNA를 2E7 하이브리도마 세포로부터 추출한 후 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 역전사 및 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 생성하였다. RT-PCR에 대한 전향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 리더-서열에 특이적인 퇴화 프라이머의 혼합물이었고 역 프라이머는 항체 불변 영역에 특이적이었으며, 이 경우 중쇄에 대해 뮤린 이소형 IgG2a 및 경쇄에 대해 뮤린 카파였다. 존 앤 벤딕(Jones and Bendig, Bio/Technology 9:88, 1991)에 기재된 방법에 따라 프라이머를 설계하였다. RT-PCR을 정확한 V-영역 서열의 후속적인 입증을 가능하게 하는 V-영역 서열 둘 모두에 대해 이중으로 수행하였다. RT-PCR에 의해 생성된 V-영역 생성물을 클로닝하고(Invitrogen TA Cloning Kit) 서열 데이터를 수득하였다.

2E7 V_H 아미노산 서열 (서열번호 17)

2E7 V_H DNA 서열 (서열번호 18)

2E7 V_L 아미노산 서열 (서열번호 19)

2E7 V_L DNA 서열 (서열번호 20)

상보성 결정 영역(CDR)을 아미노산 서열에서 밑줄로 표시한다.

2 E7 키메라의 클로닝 및 발현

중쇄에 대해 사람 IgG1 (Fc 돌연변이됨(L235A, G237A)) 상에 이식된 부모 뮤린 V 영역 또는 경쇄에 대한 사람 C 카파 영역으로 구성된 키메라 2E7 항체(2E7c)를 생성하여 기능성 뮤린 V 영역의 정확한 클로닝을 확인하는데 이용될 수 있는 재조합 항체 물질을 발현시켰다. 2E7 뮤린 중쇄 및 경쇄 V 영역을 엔코딩하는 DNA 및 내인성 뮤린 시그널 서열을 이미 사람 불변 영역 (각각 IgG1 Fc 돌연변이됨(L235A, G237A) 또는 사람 C 카파)을 함유하는 포유동물 발현 벡터 RLD-bshe (중쇄에 대해) 및 RLN-bshe (경쇄에 대해)로 프레임에서 클로닝시켰다.

중쇄 발현을 위한 RLD-bshe 발현 벡터의 엘리먼트:

염기 쌍 DNA 세그먼트의 설명

0-1014 프로모터(SV40/RSV)

1015-2442 항체 중쇄

2443-2765 폴리 A

2766-3142 BG 프로모터

3239-3802 DHFR

3803-4162 폴리 A

4163-6322 총 백본

5077-5937 (상보성 가닥) 베타 락타마아제

(상기 제공된 엘리먼트의 위치 및 벡터의 전체 크기는 단지 설명을 목적으로 한 것이며 항체 사슬 삽입물의 크기에 의존적일 것이다)

경쇄 발현을 위한 RLN-bshe 발현 벡터의 엘리먼트:

염기 쌍 DNA 세그먼트의 설명

0-1014 프로모터(SV40/RSV)

1015-1731 항체 경쇄

1732-2051 폴리 A

2388-2764 BG 프로모터

2774-3568 네오마이신

3569-3876 폴리 A

3877-6063 총 백본

5077-5937 (상보성 가닥) 베타 락타마아제

(상기 제공된 엘리먼트의 위치 및 벡터의 전체 크기는 단지 설명을 목적으로 한 것이며 항체 사슬 삽입물의 크기에 의존적일 것이다)

정확하게 클로닝된 V_H 및 V_L 서열을 갖는 클론을 동정하고 현탁 배양 CHO 세포에서의 발현을 위해 플라스미드를 제조하였다. 발현된 2E7c 항체를 FPLC 시스템 상에서 단백질 A 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제한 다음 ELISA 및 SPR에 의해 Biacore™ 기술을 이용하여 Aβ에 대한 결합을 시험하였다. 이 결과는, 정확한 2E7 마우스 V 영역이 클로닝 및 발현되었고, 그 결과 부모 뮤린 항체 2E7과 유사한 특성을 지니는 기능성 항체가 생성되었음을 나타내었다.

경쇄 사람화

아미노산 수준(CDR 포함)에서 77%의 동일성을 지니는, Genpept ID CAA51135 (서열번호 24) 및 Genbank Accesion No X72467을 갖는 사람 수용체 서열을 수용체 프레임워크로서 선택하였다. 작제물 L1은 2E7 VL 도메인으로부터 이 수용체 프레임워크로의 뮤린 CDR의 이식편이다.

중쇄 사람화

아미노산 수준(CDR 1 및 2 포함)에서 2E7 마우스 가변 중쇄 영역에 대해 74% 동일성을 갖는 VH3-48 유전자의 대립유전자인 사람 서열 Genbank accession No M99675 (서열번호 21)을 사람 JH4 미니유전자와 함께 사람 중쇄 수용체 프레임워크로서 선택하였다. 3개의 사람화된 가변 중쇄 변이체를 M99675 서열 및 JH4에 기초하여 설계하였다. H1은 위치 93 및 94에 두 추가의 프레임워크 복귀 돌연변이를 지니는 카바트 정의를 이용한 뮤린 CDR의 이식편이다. H2 및 H3 둘 모두는 H1으로부터 유래되었으나 각 작제물에서 상이한 하나의 추가 프레임워크 돌연변이를 포함한다 (각각 위치 24 및 48; 표 4 참조).

표 4

사람화된 중쇄 및 경쇄 DNA 의 작제

사람화된 V 영역을 중복 올리고의 구축 및 PCR 중폭에 의해 다시 합성하였다. 선택된 사람 수용체 프레임워크로부터 유래된 사람 면역글로불린 시그널 서열 및 포유동물 발현 벡터 RLD-bshe 및 RLN-bshe로 클로닝하기 위한 제한 부위를 포함시켰다. 시그널 서열 및 제한 부위와 함께 사람화된 V 영역 (H1 (서열번호 27), H2 (서열번호 29), H3 (서열번호 31), L1 (서열번호 33))을 엔코딩하는 DNA를 포유동물 발현 벡터로 프레임에서 클로닝하였다: H1, H2 및 H3를 RLD-bshe로 넣어 돌연변이 L235A 및 G237A를 각각 함유하는 3개의 전장 사람 IgG1 Fc 돌연변이된 중쇄를 엔코딩하는 DNA, 전장 H1 (서열번호 35), 전장 H2 (서열번호 37) 및 전장 H3 (서열번호 39)를 생성하였고; L1을 사람 카파 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 RLN-bshe로 프레임에서 클로닝시켜 전장 사람 카파 경쇄를 엔코딩하는 DNA를 생성하였다 (서열번호 41).

사람화된 중쇄 및 경쇄 항체 조합물 발현의 대표적인 실시예

CHOK1 세포를 사람화된 경쇄 및 중쇄 DNA 작제물의 모든 조합물로 6-웰 플레이트에서 소규모로 일시적으로 트랜스펙션시켰다: L1+H1, L1+H2, L1+H3 (서열번호 35+41, 37+41, 39+41). 5% 초저 IgG 우태아 혈청 및 2mM 글루타민을 지니는 DMEM F12에서 계대된 CHOK1 세포를 6-웰 플레이트에서 컨플루언시로 성장시켰다. 컨플루언트 세포를 옵티멤 글루타맥스 배지(Invitrogen)에서 총 7.5㎍의 DNA : 30㎍의 트랜스패스트 지질(Promega)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 5% CO₂와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 72시간에, 상층액을 회수하고 항체 농도에 대해 검정한 다음 ELISA에 의해 사람 Aβ에 대한 결합에 대해 시험하였다. 3개의 사람화된 중쇄와 조합된 사람화된 L1은 모두 사람 Aβ에 결합된 완전한 항체를 발현시켰다.

사람화된 항체를 DNA의 리포솜 전달 (예컨대, 트랜스패스트 (Promega)) 및 배양 보틀에서의 발현을 이용하여 일시적인 CHOK1 세포 트랜스펙션으로 대규모 발현시켰다. 일시적인 트랜스펙션에서의 발현 수준을 최적화하기 위해, 중쇄 대 경쇄 발현 벡터 DNA 비를 1:6으로 이용하였다. 일시적인 트랜스펙션으로부터의 물질을 ProSepA 컬럼 또는 ProSepA HiTrap 컬럼을 지니는 FPLC를 이용하여 정제하였다.

β-아밀로이드 결합 ELISA 에서 2 E7 사람화된 가변 H1L1 , H2L1 및 H3L1 의 평 가

2E7 H1L1, H2L1 및 H3L1 사람화된 변이체를 C 말단에서 비오티닐화된 사람 Aβ 펩티드 (1-40)에 대한 결합에 대해 평가하였다. 참조로서 키메라 2E7을 이용하였다. 표 5-7은 대규모 일시적인 트랜스펙션으로부터의 다양한 회분의 정제된 물질에 대한 결과를 보여준다.

표 5

표 6

표 7

상기 결과는 각 2E7-유래된 사람화된 변이체에 대하여 매우 유사한 Aβ 결합 프로필을 나타내었다. 2E7c에 대한 EC50 값의 비교는, Aβ 결합 활성의 손실이 사람화 공정을 통해 거의 일어나지 않았음을 나타내었다.

경쟁 ELISA 에 의한 2 E7 사람화된 변이체의 비교

2E7c 키메라 및 사람화된 항체 H1L1, H2L1 및 H3L1을, 경쟁 ELISA에서 사람 Aβ 펩티드와 부모 마우스 2E7 MAb 사이의 결합을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가하였다.

사람화된 3개의 변이체의 Aβ 결합 활성을 2E7 키메라 항체와 비교하기 위해 두 유형의 경쟁 ELISA를 수립하였다. 1) 고정된 β-아밀로이드; 비오티닐화된 사람 Aβ 펩티드(1-40)를 스트렙타비딘을 통해 ELISA 플레이트 상에 고정한다. 마우스 2E7 항체를 2E7-유래된 사람화된 변이체 항체의 연속 희석에 따라 일정한 농도로 첨가한다. 결합된 마우스 2E7 MAb를 항-마우스 IgG 컨주게이트로 검출한다. 표 8은 두 검정 결과를 나타낸다.

표 8

2) 용액 중의 β-아밀로이드; 일정한 농도의 β-아밀로이드를 연속 희석된 사람화된 2E7 항체 변이체와 함께 미리 인큐베이션하였다 - 복합체화된 아밀로이드 및 유리 아밀로이드를 포함하는 혼합물을 단시간 동안 고정된 마우스 2E7 MAb를 함유하는 웰에 첨가하였다. 고정된 부모 2E7 MAb와의 결합에 여전히 이용될 수 있는 유리 β-아밀로이드의 양을 검출하였다. 표 9는 두 검정 결과를 나타낸다.

표 9

모든 사람화된 항체 변이체가 매우 유사한 프로필로 β-아밀로이드에 대한 마우스 2E7 MAb의 결합을 억제하였다. H2L1 및 H3L1 변이체에 대해 생성된 IC₅₀ 값은 일관되게 2E7c 키메라 (사용되는 경우)의 값에 가까웠고, 이것은 두 검정 모두에서 가장 높은 억제 활성을 지녔다. 그러나, 변이체 H1L1은 두 검정 모두에서 다소 감소된 억제 활성을 나타내었고, 이것은 β-아밀로이드에 대해 있음직한 약간 저하된 친화성을 나타낸다.

2 E7 , 2 E7c , H1L1 , H2L1 , H3L1 의 SPR Biacore ™ 분석

사람 베타-아밀로이드 펩티드 (1-40) 및 (1-42)에 결합되는 재조합 마우스 2E7 MAb, 키메라 2E7c 및 사람화된 변이체 H1L1, H2L1 및 H3L1의 동력학 파라미터를 Biacore™ 3000 상에서 Biacore™ 분석을 이용하여 평가하였다. 2회의 상이한 검정 포맷을 이용하였다.

방법 A

(i) 간단히 말해, 베타-아밀로이드 1-40 펩티드 (C-말단에서 비오티닐화됨)의 <20 공명 유닛을 스트렙타비딘 바이오센서 칩 상에 포획하였다 (표 10A의 경우에 이용된 대로). 항체를 HBS-EP 완충액에서 아래로(down) 희석하고 0.001nM-8nM (표 10A의 경우) 범위의 농도로 스트렙타비딘/베타-아밀로이드 표면 위로 통과시켰다. 두 별도의 진행을 수행하였고; 각 진행은 새로운 스트렙타비딘/베타-아밀로이드 표면 상에서 수행되었다. 진행 1 및 2는, 비록 사용된 파라미터에서 약간의 차이는 있었지만 본질적으로 동일하였다; 진행 1을 16 RU의 베타-아밀로이드가 포획되어 있는 칩 표면을 이용하여 수행하였고, 0.001nM-8nM의 항체 농도를 이용하였고, 4분의 회합 시간 및 20분의 분리 시간을 분당 50㎕의 유속으로 이용하였다. 진행 2에 대하여, 10 RU 미만의 베타-아밀로이드가 포획되었고 0.003125nM-8nM의 항체 농도를 이용하였다. 유속 및 회합 시간은 진행 1과 동일하였으나, 분리 시간은 15분까지 감소되었다.

(ii) 베타 아밀로이드 (1-40) 및 (1-42)를 CM5 바이오센서 칩의 상이한 표면에서 <20 공명 유닛 수준까지 아민 커플링시켰다 (표 10B에 대해 이용된 대로). 항체를 HBS-EP 완충액에서 아래로 희석시키고 1nM-64nM (표 10B에 대해 이용된 대로) 범위의 농도로 바이오센서/베타-아밀로이드 표면 위로 통과시켰다.

방법 B

두 번째 예에서, 항체를 먼저 1000-2500 공명 유닛의 수준으로 CM5 바이오센서 칩의 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체 표면(재조합 마우스 2E7 MAb의 경우) 또는 단백질 A 표면(사람화된 H2L1의 경우) 상에서 포획한다는 점에서, 검정을 거꾸로 하였다. 새롭게 제조된 베타-아밀로이드 (1-40) 또는 (1-42)를 HBS-EP 완충액에서 아래로 희석시키고 4-500nM (표 10C 및 10D) 범위의 농도로 포획된-항체 표면 위로 통과시켰다.

두 방법 모두에서, 100mM H₃PO₄의 펄스를 통해 재생하였고, 표 10A 데이터의 경우 5OmM NaOH의 펄스를 계속하였다. 표면은 안정하며 재생에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 모든 진행은 완충액 블랭크 주사에 대해 이중으로 인용되었다. Biacore™ 분석 소프트웨어 BIAevaluation 버젼 4.1을 이용하여 분석을 수행하였다.

결과

방법 A(i)을 이용하여 베타-아밀로이드 결합 동력학 데이터에 의해 항체의 순위를 매겼다. 수득된 데이터를 표 10A에 도시한다. 이것은, 부모 2E7 Mab가 스트렙타비딘-포획된 베타-아밀로이드에 대해 36.1pM의 KD를 지님을 나타낸다. 키메라 마우스-사람 항체는 약간 감소된 45.8pM의 KD를 나타내었고 사람화된 작제물은 54 (H2L1) 내지 93.6pM (H1L1)의 범위를 나타내었다. 결론적으로, 이것은, 사람화 절차가 매우 성공적이었고 친화성이 거의 손실되지 않았음을 입증한다. H2 및 H3에 대해 도입된 추가의 복귀돌연변이는 소형이었으나, H2 및 H3 작제물간의 차이가 이들 실험에 대한 표준 오차내에 있었음에도 불구하고 유리한 효과를 지녔다.

표 10A

방법 A(ii)를 이용하여 베타-아밀로이드(1-42)의 C-말단 상에 있는 추가의 두 아미노산 잔기가 베타-아밀로이드 (1-40)와 비교하여 2E7 및 H2L1의 결합 특성을 현저하지 변경시키지 않았음을 확인하였다. 수득된 데이터를 표 10B에 도시하며 이를 확증한다.

표 10B

방법 B를 이용하여 첫 번째 검정 포맷에서 잠재적으로 보여진 항원항체결합력 효과를 부정하였다. 바이오센서 표면 상에서 (또는 다량체 형태의 베타-아밀로이드) 두 인접한 베타-아밀로이드 분자에 동시에 결합되는 단일 항체 분자의 Fab 도메인 둘 모두에 의해 야기된 항원항체결합력 효과는 결합의 겉보기 친화성을 증가시킬 것이다. 방법 B를 이용하여 수득된 친화성 측정치를 표 10C에 도시한다.

표 10C

상기 검정이 진정한 1:1 결합 친화성을 제공하였다는 증거가, 파파인 소화에 의해 수득된 H2L1의 Fab 단편이 방법 A(i)와 유사한 방법에 의해 스트렙타비딘-포획된 베타-아밀로이드(1-40)에 2.4nM의 산정된 KD로 결합될 때 수득되었다.

방법 B를 이용하여 베타-아밀로이드(1-42)의 C-말단 상에 있는 추가의 두 아미노산 잔기가 베타-아밀로이드 (1-40)와 비교하여 2F11이라 불리는, 마우스 2E7 MAb에 대한 동일한 서열 클론의 결합 특성을 현저하지 변경시키지 않았음을 확인하였다. 수득된 데이터를 표 10D에 도시한다.

표 10D

상기 개시된 표면 플라스몬 공명 검정을 이용한 2E7 상에서의 에피토프 맵핑 연구와 유사한 연구에서, H2L1은, β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-12를 포함하는 펩티드(Aβ1, 서열번호 15)에는 결합되나 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 2-13을 포함하는 펩티드(Aβ2-13, 서열번호 44)에는 결합되지 않음에 있어서, 2E7과 유사하게 거동하였다.

I ¹²⁵ β-아밀로이드 유출 모델에서 H2L1 의 활성

사람화된 H2L1를 부모 마우스 모노클로날 2E7과 기능적으로 비교하기 위해, 둘 모두를 동일한 날에 상기 기재된 I¹²⁵ β-아밀로이드 유출 모델로 시험하였다.

H2L1 및 2E7 둘 모두는 비히클 대조군과 비교하여 혈액에서 분당 계수(CPM)를 현저하게 증가시켰다. 혈중 방사능의 CPM은 다음과 같았다 (비히클: 1940 ± 166; 2E7: 10065 ± 1386; H2L1: 10913 ± 1535). 사용된 통계치는 post-hoc LSD 테스트를 이용한 ANOVA 였다. n=7 비히클, n=6 2E7, n=6 H2L1, (각 시험 화합물 vs. 비히클에 대하여 p<0.001).

이 데이터는, 사람화된 H2L1 항체가 마우스 2E7 분자에서 나타난 기능적 특성을 보유하였다는 추가의 증거를 제공한다.

H2L1 및 2 E7 의 약물 동력학의 조사

마우스에서 시험 항체의 최종 반감기를 조사하였다. 시험 항체를 4마리의 마우스에게 1시간 정맥내 주입에 의해 투여하여 마우스 당 400㎍의 표적 용량을 달성하였다. 연속적인 혈액 샘플을 투여 후 5일까지 각 마우스로부터 취하였다 (2E7 그룹으로부터의 한 마리 마우스가 연구를 완료하지 못했고 H2L1 그룹으로부터의 한 마리가 용량이 i.v. 투여될 수 없다는 것이 명백하였으므로 후속 분석으로부터 제외되었다). β-아밀로이드 포획 ELISA를 이용하여 항체 수준을 측정하였다.

데이터 분석은, 사람화된 항체 H2L1이 마우스에서 대략 82시간의 최종 반감기를 지님을 나타내었고(표 11), 이것은 부모 마우스 모노클로날 항체 2E7 (대략 75시간)에 필적한다.

표 11

#중간 값 및 범위

Cmax 관찰된 최대 혈장 농도

Tmax 관찰된 최대 혈장 농도의 시간

CLp 총 혈장 청소율; 용량/AUC_{(0- inf )}

t½ 최종기 반감기가 In2/Z의 비율로서 결정되었다 (여기서 z는 최종기 속도 상수이고; 최종 로그-선형기의 가시적으로 평가된 개시 이후에 발생하는 농도-시간 쌍에 대하여 (로그 형질전환 이후) 무게를 뺀(unweighted) 선형 회귀 분석을 이용하여 계산됨)

Vss 정지-상태에서 분포 부피; CLp x MRT_{0 - inf}

노화된 비-사람 영장류에서 말초 아밀로이드 로드에 대한 H2L1 의 효과

노화된 시노몰거스 원숭이(약 15세)에서 연구를 수행하여 아밀로이드/H2L1 복합체 형성 및 청소율 및 후속하는 CSF 및 CNS 아밀로이드 수준에 대한 효과에 대해 노출 반응 상관관계를 조사하였다. 매주 허리 CSF(케타민 진정하에 취해짐) 및 혈액 샘플을 H2L1를 첫 번째 투약하기 3주 전에 수집하였다. 3주에서의 샘플링 직후에, 동물은 플라세보 (n=10), 0.1 mg/kg (n=5), 1 mg/kg (n=5) 또는 10mg/kg (n=10)의 H2L1을 매 2주마다 12주 동안 수용하였다. H2L1 및 총 Aβ₄₂의 혈장 분석을 위한 혈액 샘플을 매주 수득하였다. Aβ_40/42를 정량하기 위한 CSF 샘플을 2주마다 수집하였다. 투약 기간의 완료 후에, 상기 기재된 생화학적 분석에 의한 베타-아밀로이드의 뇌 정량 및 미세출혈 조사를 목적으로 동물을 안락사시켰다. 가장 낮은 용량 그룹(0.1 mg/kg)에서, 동물을 시차적인 양상으로 안락사시켜 투약 종료의 영향력 및 이에 따른 혈장 아밀로이드 푸울의 포화로서 뇌 수준의 잠재적인 시간 경과 효과를 평가하였다.

상기 연구는 실험 단계를 시작하기 전에 인스티튜셔널 애니멀 케어 앤 유스 커미티 (IACUC) 오브 맥신 피티이 엘티디, 또는 "맥신(Maccine)"에 의해 허가되었다. IACUC 프로토콜 번호는 #08-2006이었다. GSK는 맥신의 현장 방문을 받았고 윤리적인 재고 과정을 거쳐 이것이 허용될 수 있는 것으로 판단되었다.

*혈장 샘플을 1:10 내지 1:50000으로 연속하여 희석하고 Aβ₄₀ 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 희석액 중 0-10㎍/ml H2L1의 범위로 표준 곡선을 그렸다. 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, H2L1을 항-사람 IgG 홀스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제 (Amersham - 희석액 중 1:2000 희석된) 및 테트라메틸벤지덴 검출 시스템을 이용하여 가시화하였다. 단일 및 반복 iv 볼루스(bolus) 투여 후에, H2L1의 혈장 수준이 용량 의존적인 양상으로 증가되는 것으로 나타났다. 약물 동력학에서 심한 비-선형성은 나타나지 않았는데, 이는 대부분의 투약 간격에 대해 혈장 중 H2L1의 과량 몰 농도가 유리 아밀로이드 수준에 비해 달성되었음을 나타낸다.

총 Aβ₄₂를 시판되는 Aβ 1-42 ELISA 키트 (Innogenetics)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 순수한(neat) 혈장에서 측정하였으며, 표준 곡선은 키트 희석액에서 500-7pg/ml 범위로 생성되었다. 샘플 및 기준물을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 키트 지시에 따라 이중으로 검정하였다. Aβ₄₂ 검정에 공급된 검출 항체의 간섭으로 인해, 키트가 유리 Aβ₄₂ 수준을 측정하는데 이용될 수 없으나 겉보기 '총' Aβ₄₂를 측정함을 주목해야 한다. Aβ₄₂에서 용량 및 농도 의존적인 증가가 있었다 (각각 10, 1 또는 0.1 mg/kg H2L1 이후에 검출된 대략 300, 125 및 25 pg/ml의 안정 수준을 지님). 분석으로부터, "총 Aβ₄₂"의 증가는, >1㎍/mL의 H2L1 농도에 의존적인 것으로 보이는, 혈장 푸울 외부로부터 아밀로이드의 현저한 유출의 결과인 것 같고, 복합체의 부족한 청소 때문인 것으로 여겨지지 않았다. 이것은 총 Aβ₄₂의 제거율 뿐만 아니라 투약 간격 동안 총 수준에서의 변동에 의해 명백하였다.

지금까지 혈장 분석을 달성하고 완전히 분석하였다. 그러나, 예비 분석은, 10mg/kg의 H2L1으로 치료한 이후 (상기 일반적으로 개시된 대로 측정된) '총' Aβ42의 CSF에서의 감소 추세 및 해마에서의 증가를 나타낸다.

일부 뇌 섹션에서, 미세출혈의 소면적이 펄의 감청 염색 방법에 의해 도시된 대로 검출되었다. 이 방법은 가용성 블루 화합물을 생성함에 의해 제2 철을 가시화한다 (철은 적혈구에서 발견되는 산소-운반 헤모글로빈의 필수 구성성분이다). 그러나, 비히클 및 약물 치료된 동물 간에 발병률에 있어서 차이가 없었다.

뇌의 베타 아밀로이드 플라크 및 혈장의 총 베타 아밀로이드에 대하여 노화 된 시노몰거스 마카퀴 원숭이에 대한 분석

사람 AD의 뇌척수액 (CSF) 및 조직 파라미터를 시노몰거스 원숭이에서 디스플레이하였다. 노화된 시노몰거스 원숭이는 아밀로이드 침착의 증거를 지니는 것으로 나타났다 (Covance, The cynomolgus monkey as a model for Alzheimer's disease. In: Buse E, Habermann G, Friderichs-Gromoll S, Kaspereit J, Nowak P and Niggemann K, editors. Poster Presentation at the 44th Annual Meeting of the Society of Toxicology, New Orleans, Louisiana, 6 to 10 March 2005). 노화된 뇌에서 부적합한 반응(예컨대 뇌수막염)을 유도하는 H2L1의 가능성을 대략 20세의 늙은 번식력이 없는(ex-breeding) 암컷 원숭이에서 조사하였다. 추가로, 시험 물질의 안전성, 치료-관련 미세출혈, 중화/청소율, 과민성, 및 면역 복합 질병도 2주 간격으로 8주 동안 정맥내 투여한 후 조사하였다. 또한, CNS 및 혈액 샘플을 Aβ_40/42의 수준에 대해 분석하였다.

연구 설계

5마리 (그룹 1), 9마리 (그룹 2) 또는 10마리 (그룹 3)의 노인병 암컷 시노몰거스 원숭이의 그룹에게 매 2주마다 8주 동안 0(비히클), 비히클(4 ml/kg) 중 50 또는 100 mg/kg/투약일로 H2L1을 느린 볼루스 투여에 의해 정맥내 제공하였다. 비히클은 나트륨 아세테이트 삼수화물 6.81 mg/mL, 이나트륨 에데테이트 탈수화물 0.0186 mg/mL, 폴리소르베이트 80 0.2 mg/mL, 및 L-아르기닌 염기 10 mg/mL로 구성되었고, pH는 5.5였다. 용량 수준을 선택하여 5배 및 10배로 의도된 임상적 용량 수준인 용량 수준을 조사하였다.

하기 평가를 투약-전, 매일(임상적 징후, 체중, 식품 소비), 4주 및 부검 전주에 수행하였다: 살아 있는 동물 관찰, 체중, 체온, 혈액학, 임상적 화학(뇌척수액[CSF] 분석 포함), 소변 검사, 및 CSF에서의 시토킨 측정. 부검 이후, 기관 중량, 육안 관찰, 및 뇌, 경부 척수 및 총체적인 병변의 현미경 관찰을 모든 동물에 대해 수행하였다. 각 투약 이후 독성 동력학 평가를 수행하였다.

결과

예정에 없는 사망은 없었고, 투여된 용량에서 동물의 일반적인 상태에 대한 시험 항목의 영향을 나타내는 징후도 없었다. 임상적 병리학(혈액학 및 혈청 화학)에서의 현저한 관찰만이 연령-관련되고 시험 물질과 비관련되는 것으로 추정되었다.

H2L1에 대한 전신적인 노출은 (AUC_{0 -τ} 및 C_max에 의해 측정됨) 대체로 용량에 비례하여 증가되었다. 두 용량 그룹 모두에 대하여, 첫 번째 투약과 네 번째 투약 샘플링 기간 사이에 전신적인 노출에서의 현저한 변화는 없었다 (≥2배).

CSF-분석에 의해 검출된 뇌에서 염증 반응의 징후는 없었고 부검에서 시험 항목 영향력을 제안하는 육안 또는 현미경 소견, 특히 미세출혈 또는 뇌수막염도 없었다.

본 연구는 굿 레버러토리 프랙티스 레귤레이션스[German Chemical Law, annex 1 and 2 to §19a Chemikalien Gesetz, June 2002, the OECD Principles of Good Laboratory Practice (revised 1997, issued January 1998) ENV/MC/CHEM (98) 17에 개요됨, the Consensus Document "The Application of the OECD Principles of GLP to the Organisation and Management of Multi-Site Studies" ENV/JM/MONO(2002)9]를 준수하여 수행되었다. 상기 레귤레이션스 및 기준을 준수하여 수행된 연구들은 US FDA 관리청에 허용될 것으로 고려된다.

CNS 에서 플라크 로드의 분석

상기 연구로부터의 비히클 처리된 시노몰거스 마카퀴 원숭이의 좌뇌 반구체를 면역조직화학에 의해 분석하였다. 치아이랑(dentate gyrus)의 부분 및 해마를 함유하는 중간 관자 고랑의 수준에서, 두정 섹션을 상기 기재된 왁스로 프로세싱하였다. 면역조직화학을 위해, 섹션을 판(pan)-Aβ 항체 (1E8, Aβ 13-27로 올린 모노클로날 항체), 또는 AB42 항체 (20G10, Aβ x-42를 인식하는 모노클로날 항체)로 표지하였고, 표지화는 상기에서 전개된 바와 같았다. 플라크 수의 가시적인 계수를 각 섹션에 대해 수행하였다. 5개의 모든 비히클-처리된 시노몰거스 원숭이로부터의 조직은 실질 Aβ 플라크의 증거를 나타내었다. 뇌혈관 표지된 Aβ 및 신경세포내 Aβ의 증거는 없었다.

혈장에서 베타 아밀로이드/항체 복합체의 분석

50mg/kg (n=9) 또는 100mg/kg (n=10)의 H2L1를 투여한 동물, 또는 비히클 투여된 대조군(n=5)으로부터의 혈장 샘플에 대해 두 시점에 (투여 개시 후 4주 및 8주의 끝에) 생화학적 분석을 수행하였다. 100㎕의 이중 샘플을, 4℃에서 밤새 인큐베이션된, 시판되는 이노게네틱스(lnnogenetics) Aβ 1-42 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. 대조군 샘플을 순수한 채로 및 1:10 희석액(공급된 희석제 이용) 둘 모두로서 분석한 반면, 투여된 동물로부터의 샘플은 순수한 채로 및 1:25로서 시험하였다. 후속하는 흡광도 값을 분석하였고, 공지되지 않은 흡광도 값은 표준 곡선을 이용하여 pg/ml 값으로 역산출한 다음 임의의 검정 희석액에 대해 교정하였다. 이들 샘플로부터 유래된 Aβ42의 총 혈장 수준을 하기 표 12에 도시한다 (pg/ml±SE의 값); H2L1로 처리된 동물로부터의 모든 샘플은 대조군에 비해 현저하게 높은 수준의 Aβ42를 함유하였다 (스튜던트 t-테스트에 의해 p<0.001).

표 12

보고된 데이터를 희석된 샘플로부터 수득하였다. 순수한 샘플로부터의 많은 데이터 점수가 최고 기준을 초과하기 때문에, 또는 단일 시점에만 검정된 샘플 부피 제한으로 인해 이의 결과를 이용하지 않았다.

생성 방법

H2L1을 엔코딩하고 증폭가능한 선택 마커, 예컨대 DHFR 또는 글루타민 합성효소에 작동가능하게 결합된 발현 벡터를 이용하여 적합한 부모 CHO 세포주(예컨대, CHODG44 또는 CHOK 1)를 트랜스펙션하거나 형질도입시켜 대규모로 모로클로날 항체를 생성하기에 적합한 공학처리된 세포주를 생성하였다 (검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel DNA Cloning Volume III; A practical approach (edited by Glover DM)(Oxford IRL press, 1987)] 참조). 발현 수준을 증가시키기 위해, 코딩 서열은 시스-작용 서열 모티프 및 극도의 GC 함량(높거나 낮은)을 회피하도록 코돈 최적화될 수 있다. 서열번호 42 및 43은 H2 중쇄 및 L1 경쇄에 대해 이러한 코딩 서열을 증폭시킨다. 대규모 생성은 동물-유래된-구성성분이 없는 배지를 이용하여 교반되는 탱크 바이오반응기에서 수행되고 정제될 수 있다. 이것은 회수물의 정화에 이어 단백질-A 친화성 크로마토그래피, 및 이온(예컨대, 양이온) 교환 및 혼합된 방식(예컨대, 세라믹 히드록시아파타이트) 크로마토그래피 유닛 작업을 이용한 추가의 정제를 포함할 수 있다. 바이러스 제거 나노여과 이후에 최종 초여과/정용여과 단계를 수행하여 제형이 의도된 투여 경로에 적합하게 되도록 할 수 있다.

약제학적 제형의 실시예

성분 양 ( mL 당)

H2L1 50mg

나트륨 아세테이트 삼수화물 6.81mg

폴리소르베이트 80 0.20mg

아르기닌 염기 10.00mg

염화나트륨 3.00mg

이나트륨 에데테이트 이수화물 0.0186mg

염산 pH 5.5가 되게 하는 양

주사용 물 1.0mL를 만든다

질소 공간 부분을 채운다

수용체 프레임워크의 V-영역 및 사람화된 변이체의 아미노산 서열

M99675 중쇄 수용체 프레임워크 V 영역 아미노산 서열 (서열번호 21)

M99675 중쇄 수용체 프레임워크 V 영역 DNA (서열번호 22)

CAA51135 경쇄 수용체 프레임워크 V 영역 아미노산 서열 (서열번호 24)

CAA51135 경쇄 수용체 프레임워크 V 영역 DNA (서열번호 25)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H1 아미노산 서열 (서열번호 26)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H1 DNA 코딩 서열 (서열번호 27)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H2 아미노산 서열 (서열번호 28)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H2 DNA (서열번호 29)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H3 아미노산 서열 (서열번호 30)

사람화된 중쇄 V 영역 변이체 H3 DNA (서열번호 31)

사람화된 경쇄 V 영역 변이체 L1 아미노산 서열 (서열번호 32)

사람화된 경쇄 V 영역 변이체 L1 DNA (서열번호 33)

성숙한 H1 중쇄 아미노산 서열 ( Fc 돌연변이된 이중 돌연변이 굵게 표시)(서열번호 34)

H1 전장 DNA (서열번호 35)

성숙한 H2 중쇄 아미노산 서열 ( Fc 돌연변이된 이중 돌연변이 굵게 표시)(서열번호 36)

H2 전장 DNA (서열번호 37)

성숙한 H3 중쇄 아미노산 서열 ( Fc 돌연변이된 이중 돌연변이 굵게 표시)(서열번호 38)

H3 전장 DNA (서열번호 39)

성숙한 경쇄 아미노산 서열 (서열번호 40)

L1 전장 DNA (서열번호 41)

최적화된 H2 중쇄 DNA (서열번호 42)

*

최적화된 L1 경쇄 DNA (서열번호 43)

SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited <120> Antibodies <130> PB61927 <160> 44 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mouse <400> 1 Asp Asn Gly Met Ala 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val Thr 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Mouse <400> 3 Gly Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mouse <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mouse <400> 6 Ser Gln Thr Arg His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 7 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 8 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 9 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 10 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 11 Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 12 Asp Ala Glu Phe Arg Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 13 Asp Ala Glu Phe Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 14 Asp Ala Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 15 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> ACETYLATION <222> (1)...(0) <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 16 Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Mouse <400> 17 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 18 <211> 345 <212> DNA <213> Mouse <400> 18 gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cactttcagt gacaacggaa tggcgtgggt tcgacaggct 120 ccaaggaagg ggcctgagtg gatagcgttc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tctagagata atgccaagaa taccctgtac 240 ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt actattgtgt aagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Mouse <400> 19 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Mouse <400> 20 gatgttgtgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactag acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 21 <211> 98 <212> PRT <213> Human <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 22 <211> 296 <212> DNA <213> Human <400> 22 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 23 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Human <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 336 <212> DNA <213> Human <400> 25 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 26 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 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<213> Human <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 345 <212> DNA <213> Human <400> 31 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gacaacggaa tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gatctcattc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca gggcacacta gtcacagtct cctca 345 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Human <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 336 <212> DNA <213> Human <400> 33 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaactag acatgttccg 300 tacacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 34 <211> 445 <212> PRT <213> Human <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 35 <211> 1335 <212> DNA <213> Human <400> 35 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gacaacggaa tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcattc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca gggcacacta gtcacagtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcgcgg gggcaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 36 <211> 445 <212> PRT <213> Human <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 37 <211> 1335 <212> DNA <213> Human <400> 37 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt caccttcagt gacaacggaa tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcattc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca gggcacacta gtcacagtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcgcgg gggcaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 38 <211> 445 <212> PRT <213> Human <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 39 <211> 1335 <212> DNA <213> Human <400> 39 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gacaacggaa tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gatctcattc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca gggcacacta gtcacagtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcgcgg gggcaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 40 <211> 219 <212> PRT <213> Human <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 657 <212> DNA <213> Human <400> 41 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaactag acatgttccg 300 tacacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657 <210> 42 <211> 1335 <212> DNA <213> Human <400> 42 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgtgccg tgtccggctt caccttcagc gacaacggca tggcctgggt gaggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggagtg ggtgtccttc atcagcaacc tggcctacag catcgactac 180 gccgacaccg tgaccggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgt gagcggcacc 300 tggttcgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt ccagcgccag caccaagggc 360 cccagcgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac agccgccctg 420 ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgaa ccggtgaccg tgtcctggaa cagcggagcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc cagcagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgtaacgtg 600 aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgtgacaag 660 acccacacct gccccccctg ccctgccccc gagctggccg gagcccccag cgtgttcctg 720 ttccccccca agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg 780 gtggtggatg tgagccacga ggaccctgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcaca atgccaagac caagcccagg gaggagcagt acaacagcac ctaccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 960 gtgtccaaca aggccctgcc tgcccctatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag 1020 cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cctagcagag atgagctgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgatggc 1200 agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acacccagaa gagcctgagc 1320 ctgtcccctg gcaag 1335 <210> 43 <211> 657 <212> DNA <213> Human <400> 43 gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 60 atcagctgta gagtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 120 tatctgcaga agcctggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ctgatagatt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct cccagaccag acacgtgcct 300 tacacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgta cggtggccgc ccccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga tgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgc 657 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <221> MOD_RES <222> (16)...(0) <223> Biotinylated <400> 44 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His Gly Ser Gly Lys 1 5 10 15

Claims (20)

1. VH3 유전자 패밀리로부터 유래된 사람 중쇄 가변 영역 내에서 하기 CDR을 포함하고:
   CDRH1 : DNGMA (서열번호 1)
   CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG (서열번호 2)
   CDRH3: GTWFAY (서열번호 3),
   GenPept 엔트리 CAA51135 (서열번호 24)에 기술된 아미노산 서열로부터 유래된 사람 경쇄 가변 영역 내에서 하기 CDR을 포함하며:
   CDRL1 : RVSQSLLHSNGYTYLH (서열번호 4)
   CDRL2: KVSNRFS (서열번호 5)
   CDRL3: SQTRHVPYT (서열번호 6),
   β-아밀로이드 펩티드에 결합되는 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 이들의 유도체인 치료용 항체.
2. 제 1항에 있어서, 사람 중쇄 가변 영역이
   하기 서브세트의 VH3 패밀리 멤버로부터 선택된 A V 유전자: VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH3-7, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH3-53, VH3-66, VH3-20, VH3-9 및 VH3-43;
   하기 서브세트의 VH3 패밀리 멤버로부터 선택된 A V 유전자: VH3-48, VH3-21 및 VH3-11;
   VH3-48 유전자 또는 이들의 대립유전자로부터 유래되는 치료용 항체.
3. 제 2항에 있어서, 사람 억셉터 중쇄 프레임워크가 프레임워크 4와 함께 M99675 (서열번호 21)로부터 유래되는 치료용 항체.
4. 제 3항에 있어서, 프레임워크 4 서열이 사람 JH4 미니겐(카바트):
   YFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 23)에 의해 엔코딩된 것이고, 이의 처음 4개 잔기는 공여체 항체로부터의 도입 CDR에 의해 교체되는 CDR3 영역내에 있는 치료용 항체.
5. 제 4항에 있어서, β-아밀로이드 펩티드에 대한 공여체 항체의 모든 결합 친화력 또는 실질적으로 모든 결합 친화력을 유지하는 서열번호 17의 서열을 지니는 공여체 V_H 도메인 및 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인에서 발견되는 상응하는 잔기에 기초하여 아미노산 잔기의 하나 이상의 치환부를 함유하는 치료용 항체.
6. 제 5항에 있어서, M99675 및 JH4로부터 유래된 사람 억셉터 중쇄 프레임워크가 위치 24, 48, 93 및/또는 94(카바트 넘버링)로부터 선택된 하나 내지 4개의 아미노산 잔기 치환부를 함유하는 치료용 항체.
7. 제 6항에 있어서, 사람 억셉터 중쇄 프레임워크가 하기 잔기(또는 이의 보존적 치환기)를 포함하는 치료용 항체:
   (i)
   위치 잔기
   93 V
   94 S
   또는
   (ii)
   위치 잔기
   24 V
   93 V
   94 S
   또는
   (iii)
   위치 잔기
   48 I
   93 V
   94 S
8. 서열번호 26에 기술된 서열을 지니는 V_H 사슬 및 서열번호 32에 기술된 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체.
9. 서열번호 28에 기술된 서열을 지니는 V_H 사슬 및 서열번호 32에 기술된 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체.
10. 서열번호 30에 기술된 서열을 지니는 V_H 사슬 및 서열번호 32에 기술된 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 치료용 항체.
11. 100pM 미만의 평형 상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-12 (서열번호 15)에 결합되며 β-아밀로이드 펩티드 2-13 (서열번호 44)에 결합되기 위해 펩티드 1-12 (서열번호 15)에 대한 것의 1000배를 초과하는 평형 상수 KD를 지니는 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 이들의 유도체인 치료용 항체로서, 상기 두 측정 모두는 스트렙타비딘 칩 상에 포획된 펩티드를 이용한 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행되는 치료용 항체.
12. 10nM 미만의 평형 상수 KD로 β-아밀로이드 펩티드 1-40에 결합되며 β-아밀로이드 펩티드 2-13 (서열번호 44)에 결합되기 위해 펩티드 1-12 (서열번호 15)에 대한 것의 1000배를 초과하는 평형 상수 KD를 지니는 항체 또는 항원 결합 단편 및/또는 이들의 유도체인 치료용 항체로서, 상기 두 측정 모두는 실시예의 방법 B에 기술된 표면 플라스몬 공명 검정으로 수행되는 치료용 항체.
13. 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, IgG1 이소형인 치료용 항체.
14. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, a) 전통적인 경로에 의해 보체를 활성화시키는 기능 및 b) 항체-의존적인 세포의 세포독성을 매개하는 기능이 본질적으로 결여되어 있는 치료용 항체.
15. 제 13항에 있어서, 잔기 235 및 237이 알라닌으로 돌연변이되어 있는 치료용 항체.
16. 제 1항에 있어서, 항체가 서열번호 34, 36 또는 38에 기술된 서열을 지니는 중쇄 및 서열번호 40에 기술된 서열을 지니는 경쇄를 포함하는 치료용 항체.
17. 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 치료용 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
18. 치료적 유효량의 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 치료용 항체를 β-아밀로이드 펩티드-관련 질병에 걸린 사람 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법.
19. β-아밀로이드 펩티드-관련 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 따른 치료용 항체의 용도.
20. 서열번호 17의 서열을 지니는 V_H 도메인 및 서열번호 19의 서열을 지니는 V_L 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편.