ES2484967T3 - Anticuerpos contra el péptido beta-amiloide - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo terapéutico que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y/o derivado del mismo que se une al péptido β-amiloide y que comprende las siguientes CDR: CDRH1: DNGMA (SEC ID N.º: 1) CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG (SEC ID N.º: 2) CDRH3: GTWFAY (SEC ID N.º: 3) dentro de un armazón de una región variable de cadena pesada humana que se origina a partir de la familia de genes VH3 y: CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH (SEC ID N.º: 4) CDRL2: KVSNRFS (SEC ID N.º: 5) CDRL3: SQTRHVPYT (SEC ID N.º: 6) dentro de un armazón de una región variable de cadena ligera humana que se origina a partir de la secuencia de aminoácidos desvelada en la SEC ID N.º: 24.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra el péptido β-amiloide

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen al péptido β-amiloide y en particular, al péptido β

5 amiloide humano. La presente invención también se refiere a procedimientos para el tratamiento de enfermedades o trastornos caracterizados por niveles elevados de β-amiloide o de los depósitos de β-amiloide, particularmente la enfermedad de Alzheimer, con dichos anticuerpos, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y a procedimientos para su fabricación. Otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la descripción que se presenta más adelante.

10 Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común del deterioro cognitivo relacionado con la edad, que afecta a más de 12 millones de individuos en todo el mundo (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Supl. 1055-1057). Las primeras fases de la enfermedad se caracterizan por una pérdida progresiva de memoria con un deterioro cognitivo asociado y déficits del lenguaje y del comportamiento. En las últimas fases de la enfermedad, los pacientes 15 desarrollan amnesia global y tienen la función motora muy reducida. La muerte se produce típicamente 9 años después del diagnóstico y a menudo está asociada con otras afecciones, típicamente neumonía (Davis K.L. y Samules S.C. (1998) en Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S. J. y Coyle J. T. (McGraw-Hill, Nueva York, páginas 267-316)). Las terapias actuales representan estrategias sintomáticas, que se centran en el alivio del deterioro cognitivo y en la mejora de los síntomas conductuales 20 asociados con la etiología de la enfermedad en progreso. En la práctica estos tratamientos solo proporcionan un efecto beneficioso sobre la cognición de corta duración, notificándose una duración del nivel de deterioro cognitivo conseguido de tan solo hasta 2 años. El potencial de una terapia para modificar la enfermedad que ralentice y posiblemente detenga la progresión de la enfermedad es enorme. Tales estrategias proporcionarían mejoras radicales y sostenidas en la calidad de vida de los pacientes y de forma importante en sus cuidadores igual que

25 reducen los enormes costes sanitarios globales de esta enfermedad.

El diagnóstico clínico de la enfermedad de Alzheimer se basa en una combinación de ensayos físicos y mentales que conducen al diagnóstico de una enfermedad de Alzheimer posible o probable. Después de la muerte la enfermedad se confirma por signos neurológicos bien caracterizados en el cerebro, que incluyen la deposición de Aβ en placas parenquimatosas y vasos cerebrales, la formación intraneuronal de ovillos neurofibrilares, pérdida

30 sináptica y pérdida de subpoblaciones neuronales en regiones específicas del cerebro (Terry, RD (1991) J Neural Trans Supl. 53: 141-145).

Una gran cantidad de evidencias genéticas, histológicas y funcionales sugieren que el péptido β-amiloide (Aβ) es clave en la progresión de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe, D. J. (2001) Physiological Reviews 81: 741-766).

Se sabe que Aβ se produce por medio de la escisión de la proteína precursora de beta amiloide (también conocida

35 como APP) por una enzima aspartil proteasa conocida como BACE1 (también conocida como β-secretasa, Asp2 o Memapsina-2) (De Strooper, B. y Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). Se ha postulado que además de la deposición parenquimática y vascular, ciertas formas oligoméricas solubles de Aβ contribuyen a la aparición de EA y pueden afectar a la función neuronal inicialmente perjudicando a la función sináptica (Lambert y col. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, EE.UU. 95: 6448-6453). Aunque se encuentran placas amiloides

40 insolubles en las primeras fases de EA y de MCI, en estos individuos también están aumentados los niveles de agregados de Aβ soluble (que reciben el nombre de oligómeros o ligandos difundibles derivados de Aβ (ADDL) y los niveles de Aβ soluble se correlacionan mejor con la degeneración neurofibrilar y la pérdida de marcadores sinápticos que las placas de amiloide (Naslund y col. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001) Nat. Med. 1: 8-19). El Aβ42 altamente amiloidogénico y las formas truncadas en el extremo amino Aβx-42 son las especies

45 predominantes de Aβ encontradas tanto en placas difusas como en placas seniles (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45–53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270: 7013–7016). Los niveles relativos de Aβ42 parecen ser el regulador clave de la agregación de Aβ en placas amiloides, de hecho se ha demostrado que Aβ42 forma agregados más rápidamente que otras formas de Aβ in vitro (Jarrett, JT (1993) Biochemistry. 32: 4693–4697) y Aβ42 como tal se ha implicado como molécula iniciadora en la patogénesis de la EA (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:

50 289–292). Aunque Aβ42 es un producto minoritario del metabolismo de APP, los pequeños cambios en su producción están asociados con grandes efectos sobre la deposición de Aβ por lo tanto se ha postulado que la reducción de Aβ42 sola puede ser una forma eficaz de tratar la EA (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92: 289– 292). Respaldando esto, se ha informado que mutaciones en los genes de la proteína precursora de amiloide (APP) y de la presenilina aumentan predominantemente los niveles relativos de Aβ42 y por lo tanto acortan el tiempo hasta

55 la aparición de la enfermedad de Alzheimer (EA) (Selkoe D.J., Podlisny M.B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3: 67-99). Debe tenerse en cuenta sin embargo, que la velocidad de deposición también depende del catabolismo y eliminación de Aβ.

Se han generado modelos animales de la deposición de amiloides por sobreexpresión de transgenes humanos

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Tabla 10A

Anticuerpo

ka kd KD (pm)

2E7

Proceso 1 Proceso 2 Media (SD) 1,61e6 1,69e6 1,65e6 6,17e-5 5,72e-5 5,97e-5 38,3 33,8 36,1 (3,2)

c2E7

Proceso 1 Proceso 2 Media (SD) 1,34e6 1,3e6 1,32e6 6,44e-5 5,65e-5 6,10e-5 48,1 43,5 45,8 (3,3)

H1L1

Proceso 1 Proceso 2 Media (SD) 5,60e5 6,37e5 5,99e5 5,32e-5 5,87e-5 5,60e-5 95,0 92,2 93,6 (2,0)

H2L1

Proceso 1 Proceso 2 Media (SD) 9,91e5 1,1e6 1,05e6 5,76e-5 5,49e-5 5,63e-5 58,1 49,8 54,0 (5,9)

H3L1

Proceso 1 Proceso 2 Media (SD) 8,24e5 8,3e5 8,27e5 6,26e-5 4,75e-5 5,47e-5 76,0 57,2 66,6 (13,3)

El procedimiento A(ii) se usó para confirmar que los dos residuos aminoacídicos adicionales en el extremo Cterminal del beta-amiloide (1-42) en comparación con el beta-amiloide (1-40) no alteraban significativamente las propiedades de unión de 2E7 y H2L1. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 10B y confirmaron esto.

Tabla 10B

Anticuerpo

Betaamiloide ka (Ms-1) kd ( s-1) KD (pM)

2E7

1-40 1-42 4,05e5 3,82e5 1,28e-4 1,51e-4 317 394

H2L1

1-40 1-42 3,33e5 3,40e5 1,22e-4 1,55e-4 366 456

El procedimiento B se usó para invalidar los efectos de avidez que podían verse en el primer formato de ensayo. Los efectos de avidez, producidos por los dos dominios Fab de una sola molécula de anticuerpo que se une al mismo

10 tiempo a dos moléculas de beta-amiloide adyacentes en la superficie del biosensor (o en formas multiméricas de beta-amiloide) aumentarían la afinidad aparente de la unión. Las mediciones de afinidad obtenidas usando el procedimiento B se muestran en la Tabla 10C.

Tabla 10C

Anticuerpo

ka (Ms-1) kd KD (nM)

( s-1)

Con Desviación Típica n = 3

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(continuación)

# mediana e intervalo

Cmáx Concentración máxima en plasma observada.

Tmáx Tiempo transcurrido hasta la concentración máxima en plasma observada

CLp Eliminación total en plasma; Dosis/AUC(0-inf).

t½ La semivida de fase terminal se determinó como la relación de ln2/z donde z es la constante de la velocidad en fase terminal; calculada usando un análisis de regresión lineal no ponderado (después de la transformación logarítmica) en los pares de concentración-tiempo que se produjeron después del inicio evaluado visualmente de la fase terminal de log-lineal.

Vss Volumen de distribución en estado estacionario; CLp x MRT0-inf.

Efecto de H2L1 sobre la carga de amiloide periférica en primates no humanos de edad avanzada

Se realizó un estudio en monos del género Cynomolgus de edad avanzada (de aproximadamente 15 años) para investigar la relación de respuesta a exposición con respecto a la formación de complejos de amiloide/H2L1 y la eliminación y los efectos posteriores sobre los niveles de amiloide del CSF y el SNC. Se recogieron muestras de sangre y de CSF lumbar (tomadas con sedación con ketamina) semanalmente 3 semanas antes de administrar la 1ª dosis de H2L1. Inmediatamente después del muestreo en la semana 3, los animales recibieron placebo (n = 10), 0,1 mg/kg (n = 5), 1 mg/kg (n = 5) o 10 mg/kg (n = 10) de H2L1 y después cada 2 semanas durante un periodo de 12 semanas. Se tomaron semanalmente muestras de sangre para realizar el análisis en plasma de H2L1 y Aβ42 total. Se recogieron muestras de CSF para la cuantificación de Aβ40/42 cada 2 semanas. Después de terminar el periodo de dosificación, los animales se sacrificaron para cuantificar en el cerebro el beta-amiloide por análisis bioquímico como se ha descrito anteriormente y para investigar las microhemorragias. En el grupo de menor dosificación (0,1 mg/kg), los animales se sacrificaron de forma escalonada para evaluar el posible efecto del transcurso del tiempo en los niveles cerebrales como consecuencia de la terminación de la dosificación y por lo tanto la saturación de las reservas plasmáticas de amiloide.

Este estudio se aprobó por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de MACCINE Pte Ltd, o “Maccine” antes de iniciar la fase experimental. El número de protocolo de IACUC fue n.º: 08-2006. GSK ha realizado una visita al centro de Maccine y ha revisado su procedimiento de revisión ética y lo ha encontrado aceptable.

Las muestras de plasma se diluyeron en serie 1:10 a 1:50000 y se añadieron a Aβ40 aplicadas como un recubrimiento en placas ELISA. Se crearon curvas patrón que variaban de 0–10 μg/ml de H2L1 en diluyente. Después de una incubación de una noche a 4ºC H2L1 se visualizó usando IgG anti-humana-peroxidasa de rábano picante (Amersham – diluido 1:2000 en diluyente) y un sistema de detección de tetrametilbencideno. Después de una administración iv en bolo individual y repetida, los niveles plasmáticos de H2L1 parecían aumentar de una manera dependiente de la dosis. No hubo indicios de ausencias de linealidad grave en la farmacocinética, lo que indica que para la mayor parte del intervalo de dosificación, se consiguieron concentraciones molares en exceso de H2L1 en el plasma en comparación con los niveles de amiloide libres.

La Aβ42 total se midió en plasma puro usando un kit ELISA Aβ 1-42 comercialmente disponible (Innogenetics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, variando las curvas patrón de 500-7 pg/ml creados en el diluyente del kit. Las muestras y los patrones se incuban durante una noche a 4ºC antes del ensayo por duplicado de acuerdo con las instrucciones del kit. Debe indicarse que debido a la interferencia del anticuerpo de detección suministrado con el ensayo de Aβ42, este kit no puede usarse para medir los niveles de Aβ42 libre, sino que mide el Aβ42 ‘total’ aparente. Hubo un aumento dependiente de la dosis y concentración en Aβ42 (niveles mantenidos de aproximadamente 300, 125 y 25 pg/ml detectados después de 10, 1 o 0,1 mg/kg de H2L1 respectivamente).

Por los datos del análisis, es probable que el aumento en el "Aβ42 total" se deba al resultado de un flujo de salida significativo de amiloide del exterior de las reservas plasmáticas, que parecía dependiente de las concentraciones de H2L1 > 1 ug/ml y no parecía ser el resultado de la ausencia de aclaramiento del complejo. Esto fue evidente por la velocidad de eliminación del Aβ42 total así como por la fluctuación en los niveles totales en un intervalo de dosificación.

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