CN114591918B - 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途 - Google Patents

产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114591918B
CN114591918B CN202210490830.1A CN202210490830A CN114591918B CN 114591918 B CN114591918 B CN 114591918B CN 202210490830 A CN202210490830 A CN 202210490830A CN 114591918 B CN114591918 B CN 114591918B
Authority
CN
China
Prior art keywords
beta
amyloid
monoclonal antibody
hybridoma cell
subtype
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210490830.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114591918A (zh
Inventor
张博文
康志云
王怡
郑新越
杨志云
李晓英
王月丹
王铁山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd filed Critical Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202210490830.1A priority Critical patent/CN114591918B/zh
Publication of CN114591918A publication Critical patent/CN114591918A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114591918B publication Critical patent/CN114591918B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Abstract

本申请提供了产生抗β‑淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途。由本申请的杂交瘤细胞产生的抗β‑淀粉样蛋白单克隆抗体能够与灵长类动物β‑淀粉样蛋白特异性结合，优选地具有对人β‑淀粉样蛋白的高亲和性效果。本申请的产生特异性结合β‑淀粉样蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体可用于检测β‑淀粉样蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症。

Description

产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途
技术领域
本申请涉及细胞及抗体领域，更具体地，本申请涉及产生抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其用途。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是一种渐进性神经系统疾病，会损害思维、记忆和独立性。临床前阶段包括大脑中所有看不见的变化(如斑块的积聚)在症状出现前数年发生，随着疾病的发展，患者日常活动的护理需求越来越高，轻度AD患者虽然开始忘记熟悉的单词或物体的位置，但生活仍然可以自理；发展到中度，患者变得更健忘，更难以完成日常任务，并经历性格和行为的变化；重度AD患者则不能再对他们的环境做出反应，不能进行交谈，也不能控制运动或控制大便。
AD的病因仍不明确，β淀粉样蛋白(Amyloid beta peptide，Aβ)级联假说认为Aβ蛋白代谢失衡、聚集和形成的低聚物和纤维体会沉积于脑中，沉积物形成老年斑，引起神经炎症增加，以及神经元凋亡等脑部病变，是诱发阿尔兹海默症的重要因素。Aβ分子量约为4kDa，是由跨膜淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)经过β和γ分泌酶两次裂解后产生的神经毒性蛋白，是蛋白质错误折叠形成的，其能够以单体、寡聚体、原纤维和不溶性纤维的形式存在，在脑内沉积并伴随突触的损伤和神经元的死亡。
尽管没有治愈AD的方法，但一些FDA批准的药物可以延缓疾病进展，如胆碱酯酶抑制剂(增加脑内神经递质乙酰胆碱的量，促进细胞间信号传导)、NMDA受体拮抗剂(改变脑细胞信号传导)，但是这些药物的疗效依然不够好，特别对中重度AD患者，依然未能满足患者的临床需求。此外，一些药物尽管有时能延缓一些患者的智力衰退，但可引起严重副作用。因此，病人需要更有效的药物。
近年来以Aβ为药物靶点治疗AD的研究取得了较大进展，2021年6月7日，美国食品药品监督管理局(FDA)宣布批准渤健(Biogen)公司研发的阿尔茨海默症新药阿杜那单抗(Aducanumab，商品名Aduhelm)上市。阿杜那单抗代表了首个被批准用于阿尔茨海默病的治疗方法，其最常见的不良反应(至少比安慰剂发生率高10%)：ARIA水肿、头痛、ARIA-H微出血、ARIA-H表面铁沉积症和跌倒。
有研究表明，从脑中除去Aβ而设计的免疫治疗已在AD的动物模型中产生了阳性结果，因此针对Aβ蛋白的检测对于AD的诊断、干预及治疗有重要意义。
因此，开发Aβ(特别是Aβ1~42肽和/或Aβ1~40肽)靶向抗体对于AD的实验室研究和临床诊断都具有一定的意义。
发明内容
第一方面，本申请提供了产生特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其以保藏号CGMCC No. 45043保藏。
在第一方面的一些实施方案中，所述杂交瘤细胞株被命名为7D10-1E6。
在第一方面的一些实施方案中，所述杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株，例如Balb/c小鼠杂交瘤细胞株。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合于灵长类动物β-淀粉样蛋白。在第一方面的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合于人β-淀粉样蛋白。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合于人β-淀粉样蛋白的Aβ1~40亚型或Aβ1~42亚型。在第一方面的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合于人β-淀粉样蛋白的Aβ1~42亚型。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在第一方面的一些实施方案中，其中所述单克隆抗体的EC50值不超过100 pM。
第二方面，本申请提供了特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体，其由第一方面所述的杂交瘤细胞株产生。
第三方面，本申请提供了产生第二方面所述的单克隆抗体的方法，其包括培养第一方面所述的杂交瘤细胞株。
在第三方面的一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述单克隆抗体的步骤。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的杂交瘤细胞株或第二方面所述的单克隆抗体在制备用于检测β-淀粉样蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
附图说明
图1显示了由杂交瘤细胞株7D10-1E6产生的单克隆抗体的EC50值测定曲线。
图2显示了由杂交瘤细胞株7D10-1E6产生的单克隆抗体的亚型检测结果。
具体实施方式
人体内Aβ最常见的亚型是Aβ1~40和Aβ1~42，在人脑脊液和血中，Aβ1~40分别比Aβ1~42的含量水平高10倍和1.5倍，Aβ1~42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成Aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用。在病理条件下，AD患者脑内Aβ的产生是正常情况下的4~10倍，大量的Aβ聚集形成的神经炎性斑(老年斑)，老年斑的形成导致海马内大量细胞的死亡，这说明延长的两个氨基酸不仅增加了Aβ的疏水性，使其更容易聚集，而且提高了聚集物的稳定性，早期即可选择性地在淀粉样斑块中沉积。
在AD患者中，在脑脊液(CSF)中会出现Aβ浓度的变化，其病理变化依次是脑Aβ积聚、CSF增加、海马和灰质体积减少、葡萄糖代谢减少、记忆障碍和痴呆。Aβ可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。Aβ不仅在脑细胞中表达，也能够在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中表达，还会在外周器官和组织如肝、肾、胰腺、脾等脏器及各种血液和内皮细胞中表达。
Aβ抗体可使体外聚集状的Aβ解聚，从而降低其毒性作用，用Aβ抗体治疗转基因AD小鼠，不但能减少模型鼠脑内的老年斑的数量，也可以改善其学习记忆能力，因此制备和应用针对Aβ及其不同片段的抗体将会对于相关疾病的诊断、治疗以及研究都会有积极的影响。
本申请提供了产生特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述杂交瘤细胞株能够产生特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体。在优选实施方案中，本申请的杂交瘤细胞株产生的特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体具有pM级别的EC50值。本申请还提供了产生特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体方法，以及所述杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体的医学和生物学应用，例如用于检测β-淀粉样蛋白水平和/或用于诊断阿尔兹海默症。
为容易地理解本申请，首先定义本文中使用的某些术语。
如本文所用的，术语“杂交瘤细胞”是指一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备，它可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。
如本文所用的，术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多种与其序列相关的抗原。例如，本发明的单克隆抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的β-淀粉样蛋白。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。
如本文所用的，术语“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80%同源性”是指同源性为80%至100%任一值，例如85%、90%、95%、99%等。
如本文所用的，术语“EC50值”是指半数最大效应浓度(concentration for 50% ofmaximal effect, EC50)，指能引起50%最大效应的浓度。
第一方面，本申请提供了产生特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45043，保藏日期为2022年2月17日。
在第一方面的一些实施方案中，所述杂交瘤细胞株被命名为7D10-1E6。
在第一方面的一些实施方案中，所述杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株，例如Balb/c小鼠杂交瘤细胞株。
在第一方面的一些实施方案中，向动物接种β-淀粉样蛋白(例如Aβ1~42亚型)抗原后，可自动物体内得到抗体和/或产生抗体的细胞。产生抗体的永生化细胞系可由经免疫的动物体中分离出的细胞制备。免疫接种后，杀死动物，取淋巴结和/或脾脏B细胞进行永生化处理，经过致癌性化合物及诱变化合物处理，与永生化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合，去除肿瘤抑制基因的活性。若使用骨髓瘤细胞进行融合时，该骨髓瘤细胞最好不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性细胞系)。使用β-淀粉样蛋白、其部分或表达β-淀粉样蛋白的细胞筛选永生化细胞。在优选的实施方案中，初次筛选是利用酶联免疫分析法(ELISA)进行。选取产生抗β-淀粉样蛋白抗体的细胞例如杂交瘤进行克隆，再进一步筛选所需的特性，包括生长良好、抗体产量高以及具有所需抗体特性等。杂交瘤的筛选、克隆及扩增方法是本领域普通技术人员熟知的。在第一方面的一些实施方案中，经免疫接种的动物为非人类动物，其中脾脏B细胞与来自与该非人类动物相同物种的骨髓瘤细胞系融合。在第一方面的一些实施方案中，该经免疫接种的动物为Balb/c小鼠。
本文公开的由第一方面所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体能够特异性结合β-淀粉样蛋白。在第一方面的一些实施方案中，所述抗单克隆抗体特异性结合灵长类动物β-淀粉样蛋白，或者与灵长类动物β-淀粉样蛋白具有高度同源性的物种的β-淀粉样蛋白。在第一方面的一些具体的实施方案中，所述单克隆抗体特异性结合人β-淀粉样蛋白，例如人β-淀粉样蛋白的Aβ1~40亚型或Aβ1~42亚型，优选为Aβ1~42亚型。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为IgG1亚型。
在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在第一方面的一些具体实施方案中，所述轻链恒定区为κ亚型。
在第一方面的一些实施方案中，本申请的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的EC50值不超过100 pM。在第一方面的一些实施方案中，所述单克隆抗体的EC50值为15 pM-50 pM。在第一方面的一些实施方案中，单克隆抗体的EC50值为15 pM-40 pM。在第一方面的一些实施方案中，单克隆抗体的EC50值为34.78 pM。
在一些更具体的实施方案中，本文公开的抗体为抗人β-淀粉样蛋白单克隆抗体。β-淀粉样蛋白抗体类型与亚型可由本领域已知的任何方式确定。通常，抗体类型与亚型可使用特异于特定抗体类型与亚型的抗体确定。
第二方面，本申请提供了特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体，其由第一方面所述的杂交瘤细胞株产生。
第三方面，本申请提供了产生第二方面所述的单克隆抗体的方法，其包括培养第一方面所述的杂交瘤细胞株。
在第三方面的一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述单克隆抗体的步骤。
在第三方面的一些实施方案中，可以利用亲和层析的方法对本文公开的抗β-淀粉样蛋白抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗β-淀粉样蛋白抗体。
在第三方面的一些具体实施方案中，可以采用Protein G亲和层析柱进行所述单克隆抗体的纯化。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的杂交瘤细胞株或其抗原结合部分或第二方面所述的单克隆抗体在制备用于检测β-淀粉样蛋白和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
在第四方面的一些实施方案中，所述产品可以为试剂盒、试纸条(例如胶体金免疫层析试纸条)、检测卡、微流控检测装置等。
在第四方面的一些实施方案中，所述产品还可以包含检测标记，如胶体金、化学发光标记、荧光标记、纳米颗粒标记等。
在第四方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括用于检测的其它试剂，例如酶或胶体金标记抗原或抗体、底物、参考标准品、稀释液、洗涤液等。
在第四方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括用于处理生物样品以进行检测的试剂，所述生物样品可以为脑脊液、脑间质液、组织液、尿液、血液或血清。
在第四方面的一些实施方案中，所述产品还可以包括产品使用说明书。
本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
上述公开内容从总体上描述了本申请，以下实施例是对本申请作进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。本发明公开了能够产生特异性结合灵长类动物(人类等) β-淀粉样蛋白(Aβ1~42亚型)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，和由所述杂交瘤细胞株产生的特异性结合β-淀粉样蛋白的单克隆抗体，以及它们被用于检测和诊断等方面的应用，如在阿尔兹海默症诊断中的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本领域技术人员能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例
实施例1. 材料与方法
1.1试剂和仪器
1.1.1细胞培养
名称 货号 厂家
DMEM基础培养基(1X) C11995500BT GIBCO
青霉素-链霉素 15140122 GIBCO
HAT补充剂(50X) 21060017 GIBCO
HT补充剂(100X) 11067030 Fluka
FBS RY-F11-05 Royacel
DMSO A3672,0250 APPLICHEM
96孔细胞培养板 TCP011096 广州洁特生物过滤股份有限公司
24孔细胞培养板 TCP011024 广州洁特生物过滤股份有限公司
6孔细胞培养板 TCP011006 广州洁特生物过滤股份有限公司
T75细胞培养瓶 TCF012250 广州洁特生物过滤股份有限公司
二氧化碳培养箱 2406-2 SHELLAB
离心机 TG16MW 湘仪
1.1.2 ELISA检测
名称 厂家
山羊抗鼠IgG(H+L)/HRP 北京博奥森生物技术有限公司
ELISA酶联板 北京中生奥邦生物科技有限公司
TMB显色液 北京博奥森生物技术有限公司
酶标仪 MD
1.2 动物
BalB/C 雌性
周龄 6W-8W
厂家 中国食品药品检定研究院
实施例2. 单克隆抗体的制备
2.1 动物免疫
将β-淀粉样蛋白(Aβ1~42亚型)免疫原与佐剂按1:1的体积比乳化后，在Balb/c小鼠(10只)皮下进行多点免疫注射，其中免疫方案如表1所示：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2.2 效价测定
取10只免疫小鼠的腹水分别用生理盐水稀释成不同浓度，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其效价，具体步骤如下：
1. 包被：用包被缓冲液PBS将β-淀粉样蛋白(Aβ1~42亚型)免疫原进行稀释并加入ELISA酶联板中，0.1 μg/孔，4 ℃过夜；
2. 封闭：生理盐水洗3遍，加入封闭液，200 μl/孔，37 ℃下孵育1.5 h；
3. 向微孔板中加入100 μl待测样本，37 ℃下孵育45 min，洗板3次，扣干；
4. 加入100 μl酶标抗体，用PBS稀释5000倍，37 ℃下孵育45 min，洗板3次，扣干；
5. 加入TMB显色液100 μl，室温反应5min，加入终止液，在酶标仪上进行读数；
阴性对照为生理盐水。ELISA效价检测结果如表2所示：
表2
稀释比例 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10
1:1000 2.509 2.216 1.984 2.226 2.26 2.51 1.543 1.332 1.607 1.843
1:2000 2.242 1.649 1.618 1.971 2.019 2.136 1.118 0.889 1.453 1.388
1:4000 1.908 1.237 1.077 1.593 1.507 1.457 0.88 0.722 1.054 1.076
1:8000 1.375 0.97 0.682 1.24 1.25 1.275 0.553 0.419 0.7 0.793
1:16000 0.91 0.606 0.469 0.873 0.759 0.885 0.348 0.256 0.47 0.523
1:32000 0.589 0.373 0.302 0.526 0.543 0.498 0.205 0.168 0.279 0.32
1:64000 0.387 0.247 0.211 0.385 0.368 0.363 0.146 0.13 0.227 0.222
阴性对照 0.072 0.068 0.063 0.069 0.077 0.072 0.068 0.062 0.069 0.077
2.3 细胞融合和筛选
选出最佳免疫应答的#1 Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，以β-淀粉样蛋白(Aβ1~42亚型)作为检测抗原包板，经过多次筛选以及多次稳定性试验得到稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株7D10-1E6。细胞株7D10-1E6由北京第一生物化学药业有限公司于2022年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 45043，分类命名为Balb/c小鼠杂交瘤细胞。
2.4 放大培养
将阳性细胞株7D10-1E6采用T75培养瓶培养，冻存保种以及腹水制备；
腹水制备流程如下所述：将小鼠用液体石蜡致敏，同时培养杂交瘤细胞，将培养好的杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射，观察小鼠腹水生长状态，及时收取腹水；
代次标记-有限稀释6孔培养默认为第一代，每传代一次增加一代将筛选的细胞扩入T75培养瓶中培养，冻存，在80%进行冻存，冻存代次3；
冻存液：90% FBS+10% DMSO。
2.5 细胞冻存以及复苏
2.5.1 细胞复苏
培养基：10% FBS+1% PS+DMEM(高糖型)；
1. 于安全柜中准备15 ml无菌离心管，加入9 ml基础培养基，备用；
2. 于37 ℃水浴中将冻存细胞快速化冻；
3. 于生物安全柜中，将解冻细胞用1 ml枪转移至15 ml离心管中，1000 r/min离心5 min；
4. 弃上清，沉淀用完全培养基重悬，采用T75培养瓶进行培养。
2.5.2 细胞冻存
冻存液：6:3:1(60%FBS+30%基础培养基+10%DMSO)或者90% FBS+10% DMSO；
1. 将T75培养瓶培养的细胞(状态圆润，透亮，细胞汇合度80%-90%)置于50 ml无菌离心管800 r/min-1000 r/min离心5 min；
2. 弃上清，取3 ml冻存液快速悬浮，分装到2支冻存管中，放置梯度冻存盒中，在-80 ℃冰箱中进行保存；
3. 第二天从-80 ℃冰箱转移至液氮中。
2.6 抗体纯化
将选定的免疫腹水经Protein G亲和层析纯化得到单克隆抗体。纯化前，利用腹水稀释进行初步试验，阴性对照为生理盐水。ELISA检测结果显示腹水具有pM级别的EC50值。
2.7 纯化后抗体ELISA检测
1．用抗原(bs-0107P)包被酶联反应板，2 μg/ml，0.2 μg/孔；
2．将纯化抗体按以下比例稀释：1:500、1:2000、1:8000、1:32000、1:128000、1:512000和1:2048000；
3．二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，1:5000稀释；
4．显色剂用四甲基联苯胺；
5．检测波长为：450nm，测得OD值；
阴性对照为生理盐水。ELISA检测结果如图1和表3所示：由杂交瘤细胞株7D10-1E6产生的单克隆抗体的EC50值为34.78 pM。
表3
Figure 523861DEST_PATH_IMAGE002
实施例3. 小鼠单克隆抗体亚型检测实验
3.1 实验材料
小鼠抗体亚型快速检测卡：CAT#THJ-ISO-M8a-10/20，北京泰和健生物医药研发有限公司；
7D10-1E6杂交瘤细胞纯化抗体：2 mg/mL，北京博奥森生物技术有限公司。
3.2 实验原理
采用胶体金免疫层析技术快速检测小鼠抗体亚型，5分钟快速显色，可检测小鼠抗体的重链恒定区和轻链恒定区的亚型。
3.3 实验过程
1) 开启检测卡包装，平放在实验台上；
2) 将待检测抗体使用纯化水稀释至所需浓度(0.0625 μg/ml)；
3) 用微量移液器吸取80-100 μl样本，滴加至加样孔中；
4) 静置5-10 min读取结果；
结果显示由7D10-1E6杂交瘤细胞产生的单克隆抗体重链恒定区为IgG1亚型，轻链恒定区为κ亚型(图2)。
可以理解，尽管本申请以上述具体形式描述了所涉及的发明，但这些发明并不局限于这些具体形式描述的特定内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请所描述的发明精神的前提下，还可对其中所涉及的发明包含的技术特征进行各种等同变化，这些变化都应该属于所述发明的范围之内。

Claims (5)

1.产生特异性结合人β-淀粉样蛋白Aβ1~42亚型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其以保藏编号CGMCC No. 45043保藏。
2.特异性结合人β-淀粉样蛋白Aβ1~42亚型的单克隆抗体，其由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。
3.产生权利要求2所述的单克隆抗体的方法，其包括培养权利要求1所述的杂交瘤细胞株。
4.如权利要求3所述的方法，其还包括纯化所述单克隆抗体的步骤。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测人β-淀粉样蛋白Aβ1~42亚型和/或用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
CN202210490830.1A 2022-05-07 2022-05-07 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途 Active CN114591918B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210490830.1A CN114591918B (zh) 2022-05-07 2022-05-07 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210490830.1A CN114591918B (zh) 2022-05-07 2022-05-07 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114591918A CN114591918A (zh) 2022-06-07
CN114591918B true CN114591918B (zh) 2022-07-26

Family

ID=81811402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210490830.1A Active CN114591918B (zh) 2022-05-07 2022-05-07 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114591918B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113508133A (zh) * 2019-02-01 2021-10-15 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN114578066A (zh) * 2022-05-07 2022-06-03 北京第一生物化学药业有限公司 检测β-淀粉样蛋白的产品和方法
CN114591917A (zh) * 2022-05-07 2022-06-07 北京第一生物化学药业有限公司 产生结合β-淀粉样蛋白的抗体的杂交瘤细胞及其用途
CN114605532A (zh) * 2022-05-07 2022-06-10 北京第一生物化学药业有限公司 抗β-淀粉样蛋白抗体及其用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA015654B9 (ru) * 2006-03-30 2012-01-30 Глаксо Груп Лимитед Антитела против бета-амилоидного пептида
PT2237803E (pt) * 2007-12-28 2015-10-16 Prothena Biosciences Ltd Tratamento e profilaxia da amiloidose
CA2796339C (en) * 2010-04-15 2020-03-31 Abbott Laboratories Amyloid-beta binding proteins
US9320793B2 (en) * 2010-07-14 2016-04-26 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Method for treating a disease associated with soluble, oligomeric species of amyloid beta 1-42

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113508133A (zh) * 2019-02-01 2021-10-15 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN114578066A (zh) * 2022-05-07 2022-06-03 北京第一生物化学药业有限公司 检测β-淀粉样蛋白的产品和方法
CN114591917A (zh) * 2022-05-07 2022-06-07 北京第一生物化学药业有限公司 产生结合β-淀粉样蛋白的抗体的杂交瘤细胞及其用途
CN114605532A (zh) * 2022-05-07 2022-06-10 北京第一生物化学药业有限公司 抗β-淀粉样蛋白抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN114591918A (zh) 2022-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3431140B2 (ja) 抗体およびその使用方法
CN108473566A (zh) 抗N3pGlu淀粉样蛋白β肽抗体及其用途
US11155638B2 (en) Anti-CHI3L1 antibodies for the detection and/or treatment of nonalcoholic fattly liver disease/nonalcoholic steatonhepatitis and subsequent complications
JPS62187417A (ja) 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体
CN114578066B (zh) 检测β-淀粉样蛋白的产品和方法
CN114594272B (zh) 用于检测β-淀粉样蛋白的产品和方法
CN114591917B (zh) 产生结合β-淀粉样蛋白的抗体的杂交瘤细胞及其用途
JPH10130167A (ja) 補体成分Ｃ５ａに対するモノクローナル抗体
Toyoshima et al. Kinesin and cytoplasmic dynein in spinal spheroids with motor neuron disease
CN114591918B (zh) 产生抗β-淀粉样蛋白抗体的杂交瘤细胞及其用途
CN114605532A (zh) 抗β-淀粉样蛋白抗体及其用途
JPS60155134A (ja) 体液中のだ液α―アミラーゼの存在下にすいぞうα―アミラーゼを特異的に測定するための試薬
CN114591429B (zh) 结合β-淀粉样蛋白的抗体及其用途
JP3345507B2 (ja) アシアログリコプロテインレセプターの測定法及びこれに用いる測定試薬
CN106771216B (zh) 提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用
RU2768838C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus 365e11, продуцирующий моноклональные антитела к шигаподобному токсину ii типа
RU2535982C1 (ru) Штамм культивируемых гибридных клеток животного mus musculus l. cchfv vd-1-продуцент моноклонального антитела 4g4/b6 к вирусу крым-конго геморрагической лихорадки
CN112813035B (zh) 一株分泌硝呋烯腙单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
US8530172B2 (en) Methods and materials for assessing enzyme-nucleic acid complexes
JP4422291B2 (ja) ヒトメダラシンの免疫学的測定方法
JPS62500587A (ja) モノクロ−ナル抗体およびその用途
JPS63258493A (ja) 抗ガングリオシドｇｍ↓１単クロ−ン性抗体、これを産生する細胞及びこれから成る試薬
JP3036545B2 (ja) モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法
CA1294905C (en) Anti-lafora body monoclonal antibody
JPS62500585A (ja) モノクロ−ナル抗体およびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant