ES2600915T3 - Anticuerpos fosfoespecíficos que reconocen Tau - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en la proteína Tau de mamífero o a un fosfoepítopo en un fragmento de la proteína Tau de mamífero, en donde dicho fosfoepítopo tiene o está comprendida en la secuencia de aminoácidos VYKSPVVSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) 5 (Tau aa 393-408 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404), en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble con una constante de disociación en un intervalo de entre 2 nM y 80 nM, y una constante de velocidad de asociación en un intervalo de entre 1,6 x 102 y x 105 y puede detectar y/o modular los niveles de Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 108, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una 15 CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91.

Description

Anticuerpos fosfoespecíficos que reconocen Tau
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso terapéutico y diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con ovillos neurofibrilares. En particular, la invención se refiere a anticuerpos que reconocen y se unen específicamente a confórmeros de la proteína Tau patológica fosforilada y a métodos y composiciones que involucran dichos anticuerpos para el uso terapéutico y diagnóstico en el tratamiento de Tauopatías que incluyen la enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés).
Los ovillos neurofibrilares y los hilos del neurópilo (NT, por sus siglas en inglés) son las características distintivas neuropatológicas principales de la enfermedad de Alzheimer (AD). Están compuestos por la proteína Tau asociada a microtúbulos que ha experimentado modificaciones postraduccionales, incluida la fosforilación, desamidación e isomerización de residuos de asparaginilo o aspartilo. Estos se originan mediante la agregación de proteína Tau hiperfosforilada y sus confórmeros. La AD comparte esta patología con muchas Tauopatías neurodegenerativas, en particular, con tipos determinados de demencia frontotemporal (FTD, por sus siglas en inglés).
La proteína Tau es una proteína "naturalmente no plegada" libremente soluble que se une con avidez a los microtúbulos (MT, por sus siglas en inglés) para fomentar su montaje y estabilidad. Los MT tienen una gran importancia para la integridad citoesqueletal de las neuronas y, por lo tanto, para la formación y el funcionamiento adecuados de los circuitos neuronales, y, por lo tanto, para el aprendizaje y la memoria. La unión de Tau a MT es controlada por la fosforilación y desfosforilación dinámica, como se demuestra principalmente in vitro y en células no neuronales. Debido a la gran cantidad de sitios de fosforilación posibles (>80), la contribución exacta de cada uno y la identidad de las cinasas responsables permanece en gran medida no definida in vivo.
En el cerebro con AD, la patología de Tau se desarrolla luego de, y, por lo tanto, probablemente en respuesta a la patología amiloide, que constituye la esencia de la hipótesis de la cascada amiloide. Esto se basa en e indica mediante los estudios en pacientes con AD y síndrome de Down, y es corroborado por estudios en ratones transgénicos con patología amiloide y Tau combinadas (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006; 2008; Terwel et al, 2008).
El momento exacto de ambas patologías en pacientes con AD humanos, así como mecanismos que relacionan la patología amiloide con Tau permanecen en gran medida desconocidos, pero se propone que estos implican la activación de vías de señalización neuronal que actúan en o mediante GSK3 y cdk5 como las "Tau-cinasas" principales (analizado por Muyllaert et al, 2006, 2008).
La hipótesis de que la Tauopatía no es un efecto secundario inocente sino un ejecutor patológico principal en AD se basa en observaciones genéticas, patológicas y experimentales razonables que se corroboran entre sí en su totalidad:
 En casos de AD familiar de inicio temprano debido a mutaciones en la proteína precursora amiloide (APP, por sus siglas en inglés) o presenilina, la causa patogénica obligada es la acumulación amiloide, pero invariablemente, la patología comprende Tauopatía colateral, idéntica a la de los casos de AD esporádica de inicio tardío;
 la gravedad de la disfunción cognitiva y la demencia se correlaciona con la Tauopatía, no con la patología amiloide, lo que se ejemplificó más recientemente mediante varios estudios de fase clínica 1 y 2 que incluyen imagenología de PIB-PET para amiloide e identifican muchos "falsos positivos".
 individuos cognitivamente normales con carga amiloide cerebral alta;
 en FTD familiar, la Tauopatía es provocada por Tau mutante y provoca la neurodegeneración directamente, sin patología amiloide;
 en modelos de ratón experimentales, los defectos cognitivos provocados por la patología amiloide se alivian casi por completo con la ausencia de la proteína Tau (Roberson et al, 2007).
Los argumentos combinados sostienen la hipótesis de que la proteína Tau es un elemento principal en la muerte cognitiva en AD y las Tauopatías neurodegenerativas relacionadas.
Un tratamiento emergente prominente de la AD es mediante inmunoterapia pasiva con mAb específicos, para eliminar los péptidos amiloides y sus agregados que se supone que son neurotóxicos o sinaptotóxicos.
Se prevé que la inmunoterapia dirigida a la patología de Tau, como se propone en la presente, contrarresta los confórmeros de la proteína Tau patológica que se sabe o se propone que provocan disfunción sináptica y neurodegeneración.
Otros enfoques terapéuticos que se dirigen a la proteína Tau son escasos y comprenden principalmente:
 inhibidores de las cinasas que se cree que aumentan la fosforilación de Tau hasta niveles patológicos
 compuestos que bloquean la agregación citoplásmica de proteína Tau hiperfosforilada.
Estos enfoques presentan varios obstáculos de especificidad y eficacia, un problema que comparten con los intentos de modificar el metabolismo de APP y amiloide, los cuales enfatizan la importancia de una búsqueda continua de opciones de tratamiento adicionales, incluida la inmunoterapia contra Tau. De hecho, la inmunoterapia dirigida a amiloide en un modelo de ratón preclínico con patología tipo AD combinada demostró también un efecto en la patología Tau, si bien persistieron los agregados de Tau (Oddo et al., 2004)
Se han sembrado algunas dudas con respecto a la viabilidad de alcanzar la proteína Tau intracelular mediante inmunoterapia. Estas se han contrarrestado con el estudio experimental más reciente en un modelo de ratón de Tauopatía (Asuni et al., 2007). Mostraron una reducción en la patología de los ovillos y mejoras funcionales mediante vacunación con un fosfopéptido derivado de proteína Tau.
US2008050383 describe anticuerpos monoclonales que reconocen el péptido Tau fosforilado 379-409 [P-Ser 396,404]. US2008050383 propone además el uso de los anticuerpos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Estos datos corroboran los informes anteriores de inmunoterapia dirigida a α-sinucleína en modelos de enfermedad de Parkinson (PD, por sus siglas en inglés) y enfermedad de cuerpos de Lewy (Masliah et al., 2005, 2011) y superóxido dismutasa en modelo de esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) (Urushitiani et al., 2007). Estas enfermedades son ejemplos en los que las proteínas intracelulares producen defectos sinápticos y neurodegeneración mediante mecanismos que aún no se comprenden en su totalidad.
Existe la necesidad aún no satisfecha de inmunoterapias pasivas y/o activas que funcionen para contrarrestar los confórmeros de proteína patológica que se sabe, o supone, que provocan trastornos neurodegenerativos, como patología amiloide en AD provocada, por ejemplo, por agregados intraneuronales de proteína Tau hiperfosforilada que sean tan comunes para AD como para amiloide.
Esta necesidad no satisfecha es resuelta por la presente invención que proporciona proteínas de unión que reconocen y se unen a los principales fosfoepítopos patológicos de la proteína Tau. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos específicos contra fosfoepítopos lineales y conformacionales, simples y complejos, en la proteína Tau, particularmente en la proteína Tau agregada que se cree que son responsables de la sinapto y neurotoxicidad en Tauopatías, incluida la AD.
La presente invención se define mediante las reivindicaciones representadas por las siguientes realizaciones. En particular, la invención se refiere en una primera realización a un anticuerpo, particularmente a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en la proteína Tau de mamífero o a un fosfoepítopo en un fragmento de la proteína Tau de mamífero, donde dicho fosfoepítopo tiene o está comprendida en la secuencia de aminoácidos VYKSPVVSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau aa 393-408 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404), donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble con una constante de disociación en un intervalo de entre 2 nM y 80 nM, y una constante de velocidad de asociación en un intervalo de entre 1,6 x 102 y 5 x 105 y puede detectar y/o modular los niveles de Tau fosforilada oligomérica soluble e insoluble in vivo y donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 108, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91.
En una realización específica, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención y que se describió anteriormente tiene una constante de disociación inferior a 10 nM.
En varias realizaciones, la invención se refiere al anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en la presente en cualquiera de las realizaciones precedentes, que es del isotipo IgG2b, IgG2a o IgG3.
En una realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en la presente en cualquiera de las realizaciones precedentes.
En varias realizaciones alternativas, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en la
presente en cualquiera de las realizaciones precedentes o una combinación de las mismas, en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere además al anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, el polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención como se define en la presente en cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, para su uso en terapia, particularmente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo como una Tauopatía en un mamífero, particularmente un humano que necesita dicho tratamiento.
En particular, la presente invención se refiere al anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, el polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención como se define en la presente en cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, para su uso de acuerdo con la realización precedente para el tratamiento o alivio de déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano que padece dicho déficit, y opcionalmente: (i) en donde el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano, conlleva la interrupción del avance de los déficits cognitivos, o (ii) en donde el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano, conlleva un aumento de la retención, particularmente una restitución completa de la capacidad de memoria cognitiva en el sujeto tratado.
En varias realizaciones, la presente invención se refiere al anticuerpo o fragmento funcional del mismo, el polinucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención como se define en la presente en cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, para su uso de acuerdo con la realización precedente para el tratamiento de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la Tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran la presencia tanto de patologías Tau como amiloide que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de GerstmannSträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral de proteínas priónicas, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide característica que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuronal motora no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia argirofílica granulosa, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, demencia frontotemporal, enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de ovillos neurofibrilares predominantes, parkinsonismo posencefálico y distrofia miotónica.
La invención se refiere además a un método in vitro para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau o una predisposición a enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína Tau en una muestra, particularmente una muestra de fluido cerebroespinal o una muestra de cerebro, que comprende las etapas de:
a.
hacer que la muestra que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con el anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención como se define en la presente memoria en cualquiera de las realizaciones precedentes, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que el anticuerpo se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la muestra,
donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
En una realización específica, el método de la invención como se define en la presente memoria en la realización precedente permite la detección de multímeros fosfoTau (pTau) en una muestra post mortem de un sujeto que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno asociado con Tau.
En varias realizaciones alternativas, la invención se refiere al anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, para su uso en un método in vivo para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau o una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína Tau en una parte o área corporal específica que comprende las etapas de:
a. hacer que la parte o área corporal que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con el
anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención como se define en la presente memoria en cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que el anticuerpo se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la parte o área corporal específica,
donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
En una realización, la invención se refiere a un kit de prueba para la detección y el diagnóstico de las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en cualquiera de las realizaciones precedentes.
En una realización, la invención se refiere a una línea celular que produce el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la invención como se define en cualquiera de las realizaciones precedentes, particularmente en donde dicha célula es la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137; la línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
La presente invención se define mediante las realizaciones precedentes y mediante las reivindicaciones. Cualquier materia identificada en la solicitud como "invención", "realización", "aspecto", etc., que supere el alcance de la invención según se representa en las reivindicaciones, no forma parte de la invención reivindicada sino que solamente sirve como información antecedente para comprender mejor la invención.
Lo mismo se aplica a la materia identificada como la invención pero que está comprendida en los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y métodos de diagnóstico que se ponen en práctica en el cuerpo humano o animal.
Por consiguiente, la presente invención se refiere en una realización a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un fosfoepítopo en la proteína Tau agregada, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a los epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tienen una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo, particularmente en el cerebro, particularmente con una constante de disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM, particularmente de al menos 5 nM, particularmente de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM, particularmente de al menos 400 pM, particularmente de al menos 300 pM, particularmente de al menos 200 pM, particularmente de al menos 100 pM, particularmente de al menos 50 pM.
En particular, la constante de disociación se encuentra en un intervalo de entre 2 nM y 80 nM, particularmente entre 2 nM y 40 nM, particularmente entre 2 nM y 10 nM.
En un aspecto determinado, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un fosfoepítopo que tiene, o está dentro de, la secuencia de aminoácidos VYKSPWSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau aa 393-408 de la SEQ ID NO: 67, por ejemplo, según se establece en la Tabla 1) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404).
En una segunda realización, la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica patológica pero, en una realización, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y tiene una constante de velocidad de asociación de 104 M-1s-1 o más, particularmente de entre 3 -5 x 104 M-1s-1 o más, particularmente de 105 M-1s-1 o más; particularmente de 2 -9 x 105 M-1s-1 o más; particularmente de 106 M-1s-1
o más, particularmente de 1 -4 x 106 M-1s-1 o más, particularmente de 107 M-1s-1 o más.
En particular, la constante de velocidad de asociación se encuentra en un intervalo de entre 1,6 x 103 y 5 x 105,
particularmente entre 2,4 x 104 y 5 x 105, entre 3 x 103 y 5 x 105.
En una tercera realización, la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y tiene una afinidad de unión alta con una constante de disociación de al menos 4 nM y una constante de velocidad de asociación de 105 M-1s-1 o más, particularmente una constante de disociación de al menos 3 nM y una constante de velocidad de asociación de 106M-1s-1 o más, particularmente una constante de disociación de al menos 2 nM y una constante de velocidad de asociación de 104 M-1s-1 o más, particularmente una constante de disociación de al menos 1 nM y una constante de velocidad de asociación de 105 M-1s-1 o más, particularmente una constante de disociación de al menos 200 pM y una constante de velocidad de asociación de 105 M-1s-1 o más, particularmente una constante de disociación de al menos 100 pM y una constante de velocidad de asociación de 106 M-1s-1 o más.
En particular, la constante de disociación se encuentra en el intervalo de entre 2 nM y 80 nM y la constante de velocidad de asociación se encuentra en el intervalo de entre 1,6 x 103 y 5 x 105, particularmente la constante de disociación se encuentra en el intervalo de entre 2 nM y 40 nM y la constante de velocidad de asociación se encuentra en el intervalo de entre 2,4 x 104 y 5 x 105, particularmente la constante de disociación se encuentra en el intervalo de entre 2 nM y 10 nM y la constante de velocidad de asociación se encuentra en el intervalo de entre 3 x 103 y 5 x 105.
Una realización (4) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que se selecciona del grupo que consiste en Tau aa 393-401, que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 402406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
Una realización (5) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
Una realización (6) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
Una realización (7) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
Una realización (8) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404).
Una realización (9) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, pero especialmente la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
Una realización (10) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del
mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 73, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 75, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a esta y/o un segundo dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácidos al menos 95 %, particularmente 98 %, particularmente 99 % idéntica a esta, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 71, o una secuencia de aminoácidos al menos 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a esta, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 72, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a esta.
En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
(a)
un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 73, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 75; y/o
(b)
un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 70, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 71, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 72.
Una realización (11) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 81, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 83, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a esta y/o un segundo dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 78, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 80, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a esta.
En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
(a)
un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 81, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 83; y/o
(b)
un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 78, una CDR2 que comprende la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 80.
Una realización (12) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 93, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 95, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden y/o un segundo dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden.
En un aspecto determinado, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o una parte funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
(a)
un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 93, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 95; y/o
(b)
un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91.
Una realización (13) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 101, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 103, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden y/o un segundo dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 98, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 100, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden.
En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
(a)
un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEQ ID NO: 101, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 103; y/o
(b)
un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 98, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 100.
Una realización (14) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 108, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden y/o un segundo dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91, o una secuencia de aminoácidos al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de las CDR que anteceden.
En un aspecto particular, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
(a)
un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 108; y/o
(b)
un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91.
En una realización determinada, el primer dominio de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en la presente memoria es una región variable de cadena ligera, y el segundo dominio de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en la presente memoria es una región variable de cadena pesada.
En otra realización (15), la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 118, 97, 105, o una secuencia de aminoácidos particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al menos 99 % o 100 % idéntica a esta y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, particularmente al menos 85 %, particularmente al menos 86 %, particularmente al menos 87%, particularmente al menos 88%, particularmente al menos 89%, particularmente al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96 %, particularmente al menos 97 %, particularmente al menos 98 %, particularmente al
menos 99 % o 100 % idéntica a esta.
Una realización (16) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos al menos 98 % o 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 68, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 % o 93 % idéntica a esta.
Una realización (17) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 %, 94 % o 95 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácidos al menos 88 %, 89 % o 90 % idéntica a esta.
Una realización (18) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 116, 92 o 118, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 %, 94 % o 95 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácidos al menos 90 %, 91 %, 92 % o 93 % idéntica a esta.
Una realización (19) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácidos al menos 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácidos al menos 86%, 87%, 88% o 90% idéntica a esta.
Una realización (20) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 98 % o 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 88 %, 89 % o 90 % idéntica a esta.
Una realización (21) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos al menos 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 68, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 % idéntica a esta.
Una realización (22) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a esta y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a esta.
Una realización (23) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 116, 92 o 118, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 %, 95 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 % idéntica a esta.
Una realización (24) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácidos al menos 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a esta.
Una realización (25) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 98 % o 99 % idéntica a esta; y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a esta.
Una realización (26) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la realización (16), en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 73-75, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 70-72.
Una realización (27) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la realización (17), en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 81-83, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 78-80.
Una realización (28) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la realización (18), en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 93-95, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 89-91.
Una realización (29) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la realización (19), en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 101-103, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 98-100.
Una realización (30) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la realización (18), en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDR que se
muestran en las SEQ ID NO: 89, 115 y 91, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDR que se muestran en las SEQ ID NO: 106-108.
En aun otra realización (31), la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana
o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una afinidad de unión alta a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y puede detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un
a.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 69, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 68; o un
b.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 77, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 76; o un
c.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 116, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 88; o un
d.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 92, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 88; o un
e.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 97, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 96; o un
f.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 105, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 104.
g.
primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 118, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 88.
En una realización (32) de la invención, el péptido de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes es un anticuerpo, particularmente un anticuerpo del isotipo IgG2a, IgG2b o IgG3, particularmente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
Una realización (33) de la invención se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes.
En una realización (34), dicho polinucleótido comprende una molécula de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste en
a.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se ilustra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
b.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
c.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
d.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
e.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 98 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
f.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 84-87; SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119;
g.
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, cuya cadena complementaria se
hibrida con la molécula de ácido nucleico de cualquiera de a) -f);
h. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se desvía de la secuencia de nucleótidos definida en cualquiera de a) -g) mediante la degeneración del código genético,
en donde dicha molécula de ácido nucleico según se define en cualquiera de a) -h) reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente en la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que se selecciona del grupo que consiste en Tau aa 393-401, que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), en donde, en una realización, dicho péptido de unión tiene una afinidad de unión alta con una constante de disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM, particularmente de al menos 5 nM, particularmente de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM, particularmente de al menos 400 pM, particularmente de al menos 300 pM, particularmente de al menos 200 pM, particularmente de al menos 100 pM,
M-1-1
particularmente de al menos 50 pM y/o tiene una constante de velocidad de asociación de 104 so más, particularmente de entre 3 -5 x 104 M-1s-1 o más, particularmente de 105 M-1s-1 o más, particularmente de 6 -9 x 105
M-1
s-1 o más, particularmente de 106 M-1s-1 o más, particularmente de 1 -4 x 106 M-1s-1 o más, particularmente de 107 M-1s-1 o más, pero, en una realización, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados.
En varias realizaciones (35) de la invención, se proporciona un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, que puede reconocer y unirse específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana, particularmente una proteína Tau asociada con microtúbulos, particularmente una proteína Tau hiperfosforilada y asociada con microtúbulos agregada como la que se encuentra presente en filamentos helicoidales emparejados (PHF, por sus siglas en inglés), que son las estructuras predominantes en ovillos neurofibrilares, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o epítopos no relacionados.
En una realización específica (36) de la invención, la proteína Tau humana es la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67.
Los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes, por lo tanto, se pueden usar
(37) para reducir los niveles de proteína Tau soluble total, particularmente de proteína Tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un mamífero o un humano que contiene mayores niveles de proteína Tau soluble y/o proteína Tau fosforilada soluble.
Los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes también se pueden usar (38) para reducir los niveles de filamentos helicoidales emparejados que contienen proteína Tau hiperfosforilada (PHF pTau) en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un mamífero o un humano que contiene mayores niveles de dichos filamentos helicoidales emparejados de pTau.
La reducción del nivel de proteína Tau soluble total y/o proteína Tau fosforilada soluble y/o filamentos helicoidales emparejados de pTau en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un mamífero o un humano que contiene mayores niveles de dichas variantes de proteína Tau, que contribuyen a las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau en dicho mamífero o humano, puede conllevar una mejora y/o un alivio de los síntomas asociados con dichas enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau (39).
Los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes, por lo tanto, se pueden usar
(40) en terapia, particularmente en terapia en humanos, para enlentecer o detener el avance de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau.
Los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes se pueden usar además (41) en terapia, particularmente en terapia en humanos, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau como, por ejemplo, deterioro o pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, criterio situacional, capacidad de memoria, aprendizaje, navegación especial, etc.
En una realización (42), la invención se refiere a los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes para su uso en terapia, particularmente para su uso en el tratamiento de Tauopatías, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la proteína Tau, o para el alivio de los síntomas asociados con Tauopatías.
En una realización (43), la invención se refiere a los péptidos y anticuerpos de unión según cualquiera de las realizaciones precedentes para conservar o aumentar la capacidad de memoria cognitiva en un mamífero que
padece una Tauopatía.
En otra realización específica (44) de la invención, los péptidos y anticuerpos de unión que comprenden al menos una o todas las CDR de cadena ligera de los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; según se establece en las SEQ ID NO: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108 y/o al menos una o todas las CDR de cadena pesada de los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2; ACI-35-4A6-Ab1; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-1D2-Ab1; ACI-35-2G5-Ab1; ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; según se establece en las SEQ ID NO: 70-72, 78-80, 89-91, 98-100, (89, 115, 91) se usan en terapia, particularmente en terapia en humanos, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau como, por ejemplo, deterioro o pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, criterio situacional, memoria, aprendizaje, navegación especial, etc.
En otra realización específica (45) de la invención, los péptidos y anticuerpos de unión que comprenden al menos una o todas las CDR de cadena ligera de los anticuerpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3 según se establece en las SEQ ID NO: 106-108 y/o al menos una o todas las CDR de cadena pesada de los anticuerpos ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3; según se establece en las SEQ ID NO: 89, 115 y 91 se usan en terapia, particularmente en terapia en humanos, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau como, por ejemplo, deterioro o pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, criterio situacional, memoria, aprendizaje, navegación especial, etc.
La unión de los péptidos o anticuerpos según cualquiera de las realizaciones precedentes a ovillos Tau y pTau en cerebros se puede determinar mediante la aplicación de prueba de inmunorreactividad de proteína de secciones de cerebro y mediante tinción Western de homogenados de cerebro, respectivamente, como se describe en los Ejemplos.
En otra realización (46), la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal
o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización (47), el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, se usa en terapia, particularmente en terapia en humanos para el tratamiento o el alivio de los síntomas de enfermedades o trastornos asociados con la proteína Tau que incluyen trastornos neurodegenerativos como Tauopatías.
Los péptidos, anticuerpos de unión y/o composiciones farmacéuticas según cualquiera de las realizaciones precedentes, por lo tanto, se pueden usar (48) para enlentecer o detener el avance de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau, luego de la administración de dichos péptidos, anticuerpos de unión y/o composiciones farmacéuticas a un animal, particularmente un mamífero, particularmente un humano, que padece dicha enfermedad o afección.
Los péptidos, anticuerpos de unión y/o composiciones farmacéuticas según cualquiera de las realizaciones precedentes se pueden usar (49) para mejorar o aliviar los síntomas asociados con las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau como, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, criterio situacional, capacidad de memoria, aprendizaje, navegación especial, etc. luego de la administración de dichos péptidos, anticuerpos de unión y/o composiciones farmacéuticas a un animal, particularmente un mamífero, particularmente un humano, que padece dicha enfermedad o afección.
En una realización (50), el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, se usa en el tratamiento de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la Tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran la presencia tanto de patologías Tau como amiloide que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral de proteínas priónicas, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide característica que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuronal motora no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia argirofílica granulosa, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva. Panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de ovillos neurofibrilares predominantes, parkinsonismo
posencefálico y distrofia miotónica.
En una realización (51), el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas, se usa en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En una realización (52) de la invención, se proporciona un método para detectar y/o modular los niveles de proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica y/o insoluble, particularmente in vivo, particularmente en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que comprende administrarle a dicho animal, particularmente a dicho mamífero o humano, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En un aspecto, la modulación se refiere a la reducción de los niveles de proteína Tau soluble, particularmente de proteína Tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano que contiene mayores niveles de proteína Tau soluble y/o proteína Tau fosforilada soluble.
En una realización (53) de la invención, se proporciona un método para reducir los niveles de proteína Tau insoluble, particularmente de filamentos helicoidales emparejados que contienen proteína Tau hiperfosforilada (PHF pTau) en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que contiene mayores niveles de proteína Tau insoluble, particularmente de filamentos helicoidales emparejados de pTau (PHF de pTau) que comprenden administrarle a dicho animal, particularmente a dicho mamífero o humano, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En una realización (54), la presente invención se refiere a un método para enlentecer o detener el avance de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un animal, particularmente un mamífero o humano, que comprende la administración a dicho animal, particularmente dicho mamífero o humano, que padece dicha enfermedad o afección, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En una realización (55), la presente invención se refiere a un método para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau como, por ejemplo, el deterioro o la pérdida de las funciones cognitivas que incluyen el razonamiento, criterio situacional, capacidad de memoria, aprendizaje, navegación especial, etc. en un animal, particularmente un mamífero o un humano, que comprende la administración a dicho animal, particularmente a dicho mamífero o humano, que padece dicha enfermedad o afección, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En una realización (56), la presente invención se refiere a un método para conservar o aumentar la capacidad de memoria cognitiva en un mamífero que padece una Tauopatía.
En aun otra realización (57) de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociados con la proteína Tau que incluye una enfermedad o trastorno neurodegenerativo como una Tauopatía que comprende la administración a un animal, particularmente a un mamífero, pero especialmente a un humano, que padece dicha enfermedad o trastorno, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En una realización (58) de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la Tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran tanto patologías Tau como amiloide que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral de proteínas priónicas, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide característica que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuronal motora no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia argirofílica granulosa, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical
progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de ovillos neurofibrilares predominantes, parkinsonismo posencefálico, distrofia miotónica, dicho método comprende la administración a un animal, particularmente a un mamífero, pero especialmente a un humano, que padece dicha enfermedad o trastorno, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En otra realización (59) de la invención, se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria pasiva en un animal, particularmente un mamífero o un humano, que padece un trastorno neurodegenerativo, como una Tauopatía, mediante la administración a dicho animal o humano el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
En aun otra realización (60) de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad, trastorno
o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes, a un epítopo de la proteína Tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de
a.
hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene la proteína Tau entre en contacto con un péptido de unión o un fragmento del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido o anticuerpo de unión o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que dicho péptido de unión, particularmente dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína Tau en la muestra o parte o área corporal específica.
En aun otra realización (61) de la invención, se proporciona un método para el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes, a un epítopo de la proteína Tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de
a.
hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que dicho péptido de unión, particularmente dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la muestra o parte o área corporal específica;
e.
comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor de control normal;
en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
En una realización (62) de la invención, se proporciona un método para controlar la enfermedad residual mínima en un paciente luego del tratamiento con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho método comprende:
a.
hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que dicho péptido de unión, particularmente dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la muestra o parte o área corporal específica;
e.
comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor de control normal;
en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece una enfermedad residual mínima.
En una realización (63), se proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un paciente que se trata con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, según cualquiera de las realizaciones precedentes, que comprende
a.
hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes, el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
b.
permitir que dicho péptido de unión, particularmente dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico; y
d.
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la muestra o una parte o área corporal específica;
e.
comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento;
en donde una disminución de la cantidad de dicho agregado indica que dicho paciente tiene un potencial alto de poder responder al tratamiento.
Los anticuerpos anti-Tau y fragmentos de los mismos se pueden usar en los métodos precedentes de la invención. En los métodos precedentes, la muestra que contiene el anticuerpo o un fragmento del mismo pueden ser inmunoenriquecida para aumentar la concentración de la proteína Tau en la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Tau o un fragmento del mismo unido a un soporte sólido.
Antes de la etapa (a), la muestra es inmunoenriquecida para aumentar la concentración de proteína Tau en la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Tau o un fragmento del mismo unido a un soporte sólido.
En otra realización (64), la invención se refiere a un kit de prueba para la detección y el diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau, que comprende un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes.
En una realización (65), dicho kit de prueba comprende un recipiente que contiene uno o más péptidos de unión o fragmentos activos de los mismos, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes e instrucciones para usar los péptidos
o anticuerpos de unión con el fin de unirse al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de manera que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o ausencia del antígeno Tau.
En aun otra realización (66), la presente invención se refiere a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que se selecciona del grupo que consiste en Tau aa 393-401, que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396), Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
En una realización (67), dicho epítopo consiste en Tau aa 393-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
En una realización (68), dicho epítopo consiste en Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
En una realización (69), dicho epítopo consiste en Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
En una realización (70), dicho epítopo consiste en Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404).
En una realización (71), dicho epítopo consiste en Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396).
En otra realización (72), la invención se refiere a una línea celular que produce un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes.
En una realización (73), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136.
En una realización (74), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137.
En una realización (75), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
En una realización (76), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139.
En una realización (77), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140.
En una realización (78), la invención se refiere a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A6-1 D2-12 depositada el 6 de setiembre de 2011 como DSM ACC3141.
En una realización (79), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3139 usando
a.
un par de cebadores que comprende un cebador 5' de la SEQ ID NO: 149 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139 y 140; y un cebador 3' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 131, 134 y 141-148, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (80), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137 usando
a.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 y 169-174 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 124, 127 y 150-158; y un cebador 3' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 130 y 159168, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (81), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3140 usando
a.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 178, 179 y 180 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 121, 127, 139, 154, 155 y 175; y un cebador 3' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128, 129, 147, 176 y 177, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (82), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138 usando
a.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 51 y 188-192 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 120, 124, 126, 181, 182 y 183; y un cebador 3' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 144, 145 y 184-187, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (83), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3136 usando
a.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 50 y 201-204 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 121, 137, 151 y 193-197; y un cebador 3' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 131, 141, 144, 166, 198, 199 y 200, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (84), la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende un dominio de cadena ligera (VL) y/o cadena pesada (VH), que se codifica mediante un polinucleótido ubicado en un fragmento de nucleótido que se puede obtener mediante amplificación de PCR de ADN de línea celular de hibridomaA6-1D2-12 depositada el 6 de setiembre de 2011 como DSM ACC3141 usando
a.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 209-214 y 219-221 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 215, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o
b.
una mezcla de cebadores que comprende un cebador 5' que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 216, 217 y 218 y un cebador 3' de la SEQ ID NO: 208, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una realización (85), el anticuerpo según cualquiera de las realizaciones precedentes puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo de camélido, un diacuerpo, o un anticuerpo manipulado o modificado genéticamente.
En una realización (86), la invención proporciona un método para la producción de los péptidos o anticuerpos de unión de cualquiera de las realizaciones precedentes, que comprende la etapa de cultivar la línea celular de cualquiera de las realizaciones precedentes en un medio de cultivo adecuado y, opcionalmente, purificar los péptidos o anticuerpos de unión a partir de la línea celular o medio de cultivo.
En otra realización (87), la presente invención proporciona un método para detectar multímeros de fosfoTau (pTau) en una muestra de cerebro que comprende
a.
hacer que la muestra entre en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína fosfoTau;
b.
permitir que el anticuerpo se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico, particularmente mediante la aplicación de un ensayo ELISA.
En particular, la invención se refiere, en una realización específica (88), a un método de detección post mortem de multímeros de fosfoTau (pTau) en homogenados de cerebro de un sujeto que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno asociado con Tau y de un sujeto de control sano, que comprende
a.
hacer que una muestra de homogenados de cerebro de ambos sujetos entre en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína fosfoTau;
b.
permitir que el anticuerpo se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico;
c.
detectar la formación del complejo inmunológico, particularmente mediante la aplicación de un ensayo ELISA y
d.
comparar la cantidad o intensidad del complejo inmunológico en la muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que padece una enfermedad asociada con Tau o de la muestra de control,
en donde un aumento en la cantidad o intensidad de dicho complejo inmunológico en comparación con el valor de control indica que dicho paciente padecía una enfermedad residual mínima.
En una realización (89), el aumento observado en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control
es de entre 30 % y 50 %, particularmente entre 35 % y 45 %.
En una realización (90), la invención proporciona un péptido o proteína de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, según cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde dicho anticuerpo o fragmento muestra un perfil PK favorable. En particular, dicho anticuerpo o fragmento tiene una concentración en suero elevada hasta 10 días luego de la administración, lo que indica un perfil farmacocinético (PK) que avala favorablemente el uso de dichos anticuerpos como un anticuerpo terapéutico. (Deng et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2012, 8(2) 141-60; Putman et al., Trends Biotech, 2010 (28) 509-516 ; Bai, S. Clin Pharmacokinet 2012; 51 (2): 119-135.
Breve descripción de las figuras y secuencias
Figuras
La Figura 1 muestra resultados de detección de multímeros de Tau fosforilada mediante ACI-35-2A1-Ab1 (panel izquierdo), ACI-35-2G5-Ab3 (panel medio) y un anticuerpo de control (HT7; panel derecho) en homogenados de cerebro humano de sujeto de control y con AD.
La Figura 2 (2A y 2B) muestra resultados de detección de total y p-Tau mediante anticuerpos comerciales en homogenados de cerebro humano.
La Figura 3 (3A, 3B, 3C) muestra la detección de fosfo-Tau mediante ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B) y ACI-35-2G5-Ab3 (C) en homogenados de cerebro humano.
La Figura 4 (4A, 4B, 4C) muestra resultados de detección de Tau-pS396 en cerebro humano con AD y de control (Ctrl) mediante anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1 (A), ACI-35-1D2-Ab1 (B) y ACI-35-2G5-Ab3 (C) usando AlphaLISA. ****p<0,0001, **p<0,01 mediante prueba de Mann-Whitney.
La Figura 5 (5A y 5B) muestra resultados de tinción con IHC de Tau-pT231 (AT180) en la amígdala (A) y el hipocampo (B), luego del tratamiento de ratones transgénicos Tau con ACI-35-2G5-Ab3.
La Figura 6 (6A y 6B) muestra resultados de tinción con IHC de Tau total (HT7) en la amígdala (A) y el hipocampo (B), luego del tratamiento de ratones transgénicos Tau con ACI-35-2G5-Ab3.
La Figura 7 muestra un SDS-PAGE para Tau-pS396 generado usando distintas condiciones de GSK3β, y se transfirió la membrana usando el anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3.
La Figura 8 muestra una configuración de ensayo AlphaLISA específico usando anticuerpos ACI-35-2G5-Ab3-BT y Tau-13.
La Figura 9 muestra la detección de Tau-pS396 en una fracción de cerebro S1 humano de un donante con AD; comparación de señal obtenida de muestras enriquecidas mediante muestras IP y no IP.
La Figura 10 muestra los resultados de detección de Tau-pS396 en CSF humano con AD y de control (Ctrl) mediante anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 usando IP seguido de AlphaLISA. *** p=0,0003 mediante prueba de Mann-Whitney.
Secuencias
SEQ ID NO: 46 -57 representa las secuencias de nucleótidos de cebadores directos e inversos VH/VK.
SEQ ID NO: 62 representa la secuencia de aminoácidos del antígeno Tau, péptido T3 (ver la Tabla 1).
SEQ ID NO: 67 representa la secuencia de aminoácidos de la isoforma más larga de Tau humana (441 aa), también denominada Tau40.
SEQ ID NO: 68 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 69 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 70 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 71 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 72 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 73 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 74 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 75 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1.
SEQ ID NO: 76 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
SEQ ID NO: 77 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 78 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 79 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 80 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 81 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 82 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 83 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1.
SEQ ID NO: 84 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 85 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
SEQ ID NO: 86 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
SEQ ID NO: 87 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-1D2-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-1 D2-12.
SEQ ID NO: 88 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 y A4-4A6-48, respectivamente.
SEQ ID NO: 89 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 90 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente.
SEQ ID NO: 91 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 92 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 producido mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-40.
SEQ ID NO: 93 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2.
SEQ ID NO: 94 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2.
SEQ ID NO: 95 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VK) de
anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2.
SEQ ID NO: 96 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 97 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 98 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 99 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 100 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 101 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 102 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 103 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Ab1.
SEQ ID NO: 104 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
SEQ ID NO: 105 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
SEQ ID NO: 106 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 107 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente. SEQ ID NO: 108 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente.
SEQ ID NO: 109 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2 y ACI-35-4A6-Ab2, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 y A4-4A6-48, respectivamente.
SEQ ID NO: 110 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab2 producido mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-40.
SEQ ID NO: 111 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 112 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB1 producido mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
SEQ ID NO: 113 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
SEQ ID NO: 114 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3, respectivamente, producidos mediante línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
SEQ ID NO: 115 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3.
SEQ ID NO: 116 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-18.
SEQ ID NO: 117 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo
monoclonal ACI-35-2A1-Ab1 producido mediante línea celular de hibridoma A4-2A1-18.
SEQ ID NO: 118 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-48.
SEQ ID NO: 119 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (VK) de anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Ab2 producido mediante línea celular de hibridoma A4-4A6-48.
SEQ ID NO: 120 -221 representa las secuencias de nucleótidos de cebadores directos e inversos VH/VK.
Definición de términos
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", como se usan en la presente, son indistintos y se definen con el sentido de biomolécula compuesta por aminoácidos unidos por un enlace peptídico.
Los términos "péptidos" o "péptido de unión" se usan en la presente memoria de manera indistinta y se refieren a cadenas de aminoácidos (comúnmente, L-aminoácidos) cuyos carbonos alfa se unen mediante enlaces peptídicos formados mediante una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alfa de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. El aminoácido terminal en un extremo de la cadena (es decir, el amino terminal) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (es decir, el carboxi terminal) tiene un grupo carboxilo libre. De este modo, el término "extremo amino" (abreviado extremo N) se refiere al grupo alfa-amino libre en el aminoácido en el extremo amino del péptido, o al grupo alfaamino (grupo imino cuando participa en un enlace peptídico) de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro del péptido. De manera similar, el término "extremo carboxi" (abreviado extremo C) se refiere al grupo carboxilo libre en el aminoácido en el extremo carboxi de un péptido, o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro del péptido. Un péptido de unión puede constituir anticuerpos como anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, diacuerpos, anticuerpos de camélidos, etc., o partes funcionales de los mismos, como se definen en la presente memoria.
Los términos "fragmento del mismo" o "fragmento", como se usan en la presente memoria en el contexto de un péptido, se refieren a un fragmento funcional del péptido que presenta básicamente la misma actividad (biológica) que un péptido intacto definido en la presente memoria. Los términos, cuando se usan en la presente memoria en el contexto de un anticuerpo, se refieren a un fragmento de anticuerpo que comprende una parte de un anticuerpo intacto que contiene una unión al antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diacuerpos; moléculas de anticuerpo de cadena simple, que incluyen, moléculas Fv de cadena simple (scFv); y anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos.
Comúnmente, los aminoácidos que conforman un péptido están numerados en orden, comenzando en el extremo amino y aumentando en el sentido hacia el extremo carboxi del péptido. Por lo tanto, cuando se dice que un aminoácido "sigue" a otro, dicho aminoácido está ubicado más cerca del extremo carboxi del péptido que el aminoácido precedente.
El término "residuo" se usa en la presente memoria para referirse a un aminoácido que se incorpora a un péptido mediante un enlace amida. De este modo, el aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural o, a menos que se limite de otro modo, puede comprender análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural (es decir, miméticos de aminoácidos). Además, un mimético de enlace amida incluye modificaciones en la estructura principal del péptido conocidas por los expertos en la técnica.
La frase "que consiste básicamente en" se usa en la presente memoria para excluir cualquiera de los elementos que básicamente modificarían las propiedades esenciales de los péptidos a los que se refiere la frase. Por lo tanto, la descripción de un péptido "que consiste básicamente en" excluye cualquiera de las sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos que básicamente modificarían la actividad biológica de dicho péptido.
Además, un experto reconocerá que, como se mencionó anteriormente, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que modifican, agregan o eliminan un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácidos (comúnmente menor al 5 %, más comúnmente menor al 1 %) en una secuencia codificada son variaciones modificadas conservativamente donde las modificaciones generan la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la técnica se conocen las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
Las frases “aislado” o “biológicamente puro” se refieren a un material que carece sustancial o esencialmente de los componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado natural. Por lo tanto, los péptidos descritos en la presente memoria no contienen materiales normalmente asociados con su entorno in situ. Comúnmente, los péptidos inmunogénicos aislados descritos en la presente memoria son al menos alrededor de 80 % puros, generalmente al menos alrededor de 90 %, y preferiblemente al menos alrededor de 95 %, según se mide mediante intensidad de banda en un gel teñido con plata.
La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, como electroforesis con gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización luego de la tinción. Con determinados fines, será necesaria la resolución alta y HPLC o un medio similar para la purificación utilizada.
Cuando los péptidos inmunogénicos tienen una longitud relativamente corta (es decir, inferior a alrededor de 50 aminoácidos), a menudo se sintetizan usando técnicas de síntesis de péptidos químicas estándar.
La síntesis en fase sólida, en la cual el aminoácido de extremo C de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es un método preferido para la síntesis química de los péptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria. Las técnicas para la síntesis en fase sólida son conocidas por los expertos en la técnica.
De manera alternativa, los péptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria se sintetizan usando metodología de ácido nucleico recombinante. En general, esto implica crear una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, colocar el ácido nucleico en un casete de expresión controlado por un promotor particular, expresar el péptido en un hospedador, aislar el péptido o polipéptido expresado y, si fuera necesario, renaturalizar el péptido. Las técnicas suficientes para guiar a un experto en la técnica a través de dichos procedimientos pueden encontrarse en la bibliografía.
Una vez que se expresan, los péptidos recombinantes se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar, incluida la precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Se prefieren las composiciones básicamente puras de alrededor de 50 % a 95 % de homogeneidad, y se prefiere más la homogeneidad del 80 % al 95 % o más, para su uso como agentes terapéuticos.
Un experto en la técnica reconocerá que luego de la síntesis química, la purificación o la expresión biológica, los péptidos inmunogénicos pueden poseer una conformación básicamente distinta a las conformaciones naturales de los péptidos constitutivos. En este caso, a menudo es necesario desnaturalizar y reducir el péptido antiproliferativo y luego hacer que el péptido vuelva a plegarse en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar las proteínas e inducir el replegamiento son conocidos por los expertos en la técnica.
La antigenicidad de la proteína purificada se puede confirmar, por ejemplo, mediante la demostración de la reacción con suero inmune, o con antisuero producido contra la propia proteína.
Los términos «un», «una» y «el/la», tal como se utilizan en la presente memoria, se definen en el sentido de «uno/a
o más» e incluyen el plural, salvo que el contexto no lo permita.
Los términos "detectar" o "detectado", como se usan en la presente memoria, se refieren a usar técnicas conocidas para la detección de moléculas biológicas como métodos inmunoquímicos o histológicos y se refieren a determinar cualitativa o cuantitativamente la presencia o concentración de la biomolécula investigada.
"Aislado" se refiere a una molécula biológica libre de al menos algunos de los componentes con los cuales se origina naturalmente.
Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" o "partes funcionales del mismo", como se usan en la presente memoria, son términos reconocidos en la técnica y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, particularmente a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. La inmunoglobulina de acuerdo con la invención puede ser de cualquier tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o clase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclases de molécula de inmunoglobulina.
"Anticuerpos", en el alcance de la presente invención, pretenden incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, quiméricos, de cadena simple, biespecíficos, simianizados, humanos y humanizados, anticuerpos de camélido, diacuerpos, así como partes funcionales o fragmentos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen fragmentos Fab y F(ab')2, que incluyen los productos de una genoteca de expresión de inmunoglobulina Fab y fragmentos de unión al epítopo de
cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente.
Estos fragmentos activos se pueden obtener de un anticuerpo de la presente invención mediante diversas técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales purificados se pueden escindir con una enzima, como pepsina, y se pueden someter a filtración en gel de HPLC. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab luego se puede recoger y concentrar mediante filtración de membrana y similares. Para obtener una descripción adicional de las técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, véase, por ejemplo, Khaw, B. A. et al.
J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, (1986).
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado genéticamente que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina de donante no humano, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula derivan de una (o más) inmunoglobulina(s) humana(s).
Un anticuerpo humanizado se puede referir además a un anticuerpo que tiene una región variable en la que una o más de sus regiones marco tienen aminoácidos humanos o de primate. Además, los residuos de soporte marco pueden modificarse para conservar la afinidad de unión. Los métodos para obtener "anticuerpos humanizados" son conocidos por los expertos en la técnica. (véase, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:1002910032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloy, 9:421 (1991)).
Un "anticuerpo humanizado" también se puede obtener mediante un enfoque de ingeniería genética novedoso que permite la producción de anticuerpos policlonales similares a humanos madurados por afinidad en animales grandes como, por ejemplo, conejos (http://www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php).
El término "anticuerpo completamente humano" o anticuerpo "humano" pretende referirse a un anticuerpo derivado de ratones transgénicos que contienen genes de anticuerpo humano o de células humanas. Sin embargo, para el sistema inmunológico humano, la diferencia entre los anticuerpos "completamente humanos", "humanos" y "humanizados" puede ser insignificante o inexistente y, de ese modo, los tres pueden presentar la misma eficacia y seguridad.
El término "anticuerpo monoclonal" también es reconocido en la técnica y se refiere a un anticuerpo que se produce en masa en el laboratorio a partir de un único clon y que reconoce solamente un antígeno. Los anticuerpos monoclonales comúnmente se producen fusionando una célula B que produce anticuerpos, normalmente de corta duración, con una célula de crecimiento rápido, como una célula cancerosa (denominada a veces célula "inmortal"). La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rápidamente, creando un clon que produce grandes cantidades del anticuerpo.
El término "antígeno" se refiere a una entidad o fragmento de la misma que puede inducir una respuesta inmunitaria en un organismo, particularmente un animal, más particularmente un mamífero que incluye un humano. El término incluye inmunógenos y regiones responsables de la antigenicidad o determinantes antigénicos.
Como se usa en la presente memoria, el término "soluble" se refiere a parcialmente o completamente disuelto en una solución acuosa.
Además, como se usa en la presente memoria, el término "inmunogénico" se refiere a sustancias que provocan o potencian la producción de anticuerpos, linfocitos T y otras células inmunitarias reactivas dirigidas contra un agente inmunogénico y que contribuyen a una respuesta inmunitaria en humanos o animales.
Una respuesta inmunitaria tiene lugar cuando un individuo produce suficientes anticuerpos, linfocitos T y otras células inmunitarias reactivas contra las composiciones inmunogénicas administradas de la presente invención para moderar o aliviar el trastorno que deba tratarse.
El término "hibridoma" es reconocido en la técnica y los expertos en la técnica entienden que se refiere a una célula producida mediante la fusión de una célula que produce anticuerpos y una célula inmortal, por ejemplo, una célula de mieloma múltiple. Esta célula híbrida puede producir un suministro continuo de anticuerpo. Véase la definición de "anticuerpo monoclonal" que antecede y los Ejemplos que figuran más adelante para una descripción más detallada de los métodos de fusión.
El término "portador", como se usa en la presente memoria, se refiere a una estructura en la que el péptido antigénico o una construcción supramolecular se pueden incorporar o con la que se pueden asociar, presentando o exponiendo así péptidos antigénicos o parte del péptido al sistema inmunitario de un humano o animal. Cualquier partícula que se pueda usar de manera adecuada en terapia en animales o humanos como, por ejemplo, una vesícula, una partícula o un cuerpo particulado, se puede usar como portador dentro del contexto de la presente invención.
El término "portador" comprende además métodos de suministro en donde las composiciones de construcciones antigénicas supramolecular que comprenden el péptido antigénico se pueden transportar a sitios deseados mediante mecanismos de suministro. Un ejemplo de dicho sistema de suministro utiliza metales coloidales como oro coloidal.
Las proteínas portadoras que se pueden usar en las composiciones de construcciones antigénicas supramoleculares de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, péptido de unión a maltosa "MBP"; albúmina de suero bovino "BSA"; hemocianina de lapa californiana "KLH"; ovalbúmina; flagelina; tiroglobulina; albúmina de suero de cualquier especie; gamma globulina de cualquier especie; células singénicas; células singénicas que tienen antígenos la; y polímeros de D-y/o L-aminoácidos.
Además, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de péptido de unión que, cuando se administra a un humano o animal, es suficiente para generar un efecto terapéutico en dicho humano o animal. La cantidad eficaz la determina fácilmente un experto en la técnica siguiendo los procedimientos de rutina.
"pTau PHF", "PHF" y "filamentos helicoidales emparejados" se usan en la presente memoria como sinónimos y se refieren a pares de filamentos de aproximadamente 10 nm enrollados formando hélices con una periodicidad de 160 nm visibles en microscopio electrónico. El ancho varía entre 10 y 22 nm. PHF son las estructuras predominantes en los ovillos neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer (AD) e hilos del neurópilo. PHF se puede observar en algunos pero no en todas las neuritas distróficas asociadas con las placas neuríticas. El componente principal de PHF es una forma hiperfosforilada de la proteína Tau asociada a microtúbulos. PHF están compuestos por proteínas Tau hiperfosforiladas antiparalelas unidas a disulfuro. PHF Tau puede estar truncada de sus 20 residuos de aminoácidos de extremo C. Los mecanismos subyacentes a la formación de PHF son inciertos, pero la hiperfosforilación de Tau puede separarla de los microtúbulos, aumentando el conjunto soluble de Tau.
Dentro del alcance de la presente invención, se demostró que la respuesta inducida por anticuerpo a la composición antigénica de acuerdo con la invención, en gran medida, es independiente de linfocitos T. Se usó un modelo de ratón lampiño en este sentido y se vacunaron ratones lampiños y se midieron las respuestas del anticuerpo para evaluar la respuesta de anticuerpo específico de Aβ inducida por la composición antigénica de acuerdo con la invención en los ratones lampiños inmunizados. Los ratones lampiños contienen la mutación Foxn1nu y, como consecuencia, presentan una menor función de linfocitos T debido a la ausencia de un timo adecuado.
Una "cantidad farmacéuticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a una dosis del ingrediente activo en una composición farmacéutica adecuada para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección que deba tratarse o cualquier complicación asociada con estos.
La presente invención proporciona péptidos de unión que reconocen y se unen a los fosfoepítopos patológicos principales de la proteína Tau. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos específicos contra fosfoepítopos lineales y conformacionales, simples y complejos, en la proteína Tau, que se cree que son responsables de la sinapto y neurotoxicidad en Tauopatías, incluida la AD.
Por consiguiente, la presente invención se refiere en una realización a un péptido de unión o una parte funcional de los mismos, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, los cuales reconocen y se unen específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína Tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una realización, no se unen al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a los epítopos no relacionados, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tienen una afinidad de unión alta con una constante de disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM, particularmente de al menos 5 nM, particularmente de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM, particularmente de al menos 400 pM, particularmente de al menos 300 pM, particularmente de al menos 200 pM, particularmente de al menos 100 pM, particularmente de al menos 50 pM.
Proteína "Tau soluble", como se usa en la presente memoria, se refiere a proteínas que consisten en monómeros de péptido/proteína Tau completamente solubilizados o de péptidos/proteínas similares a Tau, o de péptidos/proteínas Tau modificados o truncados o de otros derivados de monómeros de péptidos/proteínas Tau y de oligómeros de proteína Tau. "Tau soluble" excluye particularmente los ovillos neurofibrilares (NFT).
"Tau insoluble", como se usa en la presente memoria, se refiere a múltiples monómeros agregados de péptidos o proteínas Tau, o de péptidos/proteínas similares a Tau, o de péptidos/proteínas Tau modificados o truncados o de otros derivados de péptidos/proteínas Tau que forman estructuras oligoméricas o poliméricas que son insolubles in vitro en un medio acuoso e in vivo en el cuerpo de mamífero o humano, más particularmente, en el cerebro, pero particularmente a múltiples monómeros agregados de Tau o de péptidos/proteínas Tau modificados o truncados o de derivados de los mismos, que son insolubles en el cuerpo de mamífero o humano más particularmente en el cerebro, respectivamente. "Tau insoluble" incluye particularmente los ovillos neurofibrilares (NFT).
"Tau monomérico" o "monómero de Tau", como se usan en la presente memoria, se refieren a proteínas Tau completamente solubilizadas sin complejos agregados en un medio acuoso.
"Tau agregado", "Tau oligomérico" y "oligómero de Tau" se refieren a múltiples monómeros agregados de péptidos o proteínas Tau, o de péptidos/proteínas similares a Tau, o de péptidos/proteínas Tau modificados o truncados o de otros derivados de péptidos/proteínas Tau que forman estructuras oligoméricas o poliméricas que son insolubles o solubles in vitro en un medio acuoso e in vivo en el cuerpo de mamífero o humano, más particularmente, en el
cerebro, pero particularmente a múltiples monómeros agregados de Tau o de péptidos/proteínas Tau modificados o truncados o de derivados de los mismos, que son insolubles o solubles en el cuerpo de mamífero o humano más particularmente en el cerebro, respectivamente.
Un "anticuerpo de modulación" se refiere a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo como se describe en la presente memoria en las diversas realizaciones, que pueden regular por aumento (por ejemplo, activar o estimular), regular por disminución (por ejemplo, inhibir o suprimir) o cambiar de otro modo una propiedad funcional, actividad biológica o nivel de proteína Tau soluble, insoluble y/u oligomérica, particularmente de proteína Tau fosforilada soluble, in vivo, particularmente en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano que contiene niveles superiores de proteína Tau soluble y/o proteína Tau fosforilada soluble. Un anticuerpo de modulación o fragmento funcional del mismo puede actuar para modular una proteína Tau o un polipéptido que codifica dicha proteína Tau directa o indirectamente. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de modulación o fragmento funcional del mismo reduce los niveles de proteína Tau soluble, insoluble y/u oligomérica, particularmente proteína Tau soluble e insoluble, particularmente proteína Tau soluble, insoluble y oligomérica. En un aspecto, la proteína Tau soluble, insoluble y/u oligomérica es proteína Tau fosforilada, particularmente proteína Tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano que contiene mayores niveles de proteína Tau y/o proteína Tau fosforilada, particularmente de proteína Tau soluble y/o proteína Tau fosforilada soluble.
En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho péptido o anticuerpo de unión, según cualquiera de las realizaciones descritas y reivindicadas en la presente memoria, o una combinación de las mismas, en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Los portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones como emulsiones de agua/aceite, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
Los péptidos de unión de acuerdo con la invención que incluyen anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se pueden preparar en una formulación fisiológicamente aceptable y pueden comprender un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable usando las técnicas conocidas. Por ejemplo, los péptidos de unión de acuerdo con la invención y que se describen en la presente memoria que incluyen cualquier péptido de unión funcionalmente equivalente o parte funcional del mismo, en particular, los anticuerpos monoclonales de la invención que incluyen cualquier anticuerpo funcionalmente equivalente o parte funcional del mismo, se combinan con un portador, diliyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición terapéutica. Los portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones como emulsiones de agua/aceite, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
La formulación de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede lograr de acuerdo con la metodología estándar conocida por los expertos en la técnica.
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar a un sujeto en forma de un sólido, líquido o aerosol en una dosis farmacéuticamente eficaz adecuada. Los ejemplos de composiciones sólidas incluyen píldoras, cremas y unidades de dosificación implantables. Las píldoras pueden administrarse por vía oral. Las cremas terapéuticas pueden administrarse por vía tópica. Las unidades de dosificación implantables pueden administrarse por vía local, por ejemplo, en un sitio de tumor, o pueden implantarse para la liberación sistemática de la composición terapéutica, por ejemplo, por vía subcutánea. Los ejemplos de composiciones líquidas incluyen formulaciones adaptadas para inyección por vía intramuscular, subcutánea, intravenosa, intraarterial y formulaciones para administración tópica e intraocular. Los ejemplos de formulaciones de aerosol incluyen formulaciones de inhalación para la administración a los pulmones.
Las composiciones pueden administrarse mediante vías de administración estándar. En general, la composición puede administrarse por vía tópica, oral, rectal, nasal, intradérmica, intraperitoneal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular).
Además, la composición se puede incorporar en matrices de liberación sostenida como polímeros biodegradables, donde los polímeros se implantan en la cercanía del lugar donde se desee el suministro, por ejemplo, en el sitio de un tumor. El método incluye la administración de una única dosis, la administración de dosis repetidas en intervalos de tiempo predeterminados, y la administración sostenida durante un período de tiempo predeterminado.
Una matriz de liberación sostenida, como se usa en la presente memoria, es una matriz compuesta por materiales, normalmente polímeros degradables mediante hidrólisis enzimática o con ácido/base o mediante disolución. Una vez insertada en el cuerpo, la matriz actúa mediante enzimas y fluidos corporales. La matriz de liberación sostenida
se selecciona de forma deseable mediante materiales biocompatibles como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctido), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), poliláctido co-glicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), polianhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, ácidos de poliamino, aminoácidos como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de un poliláctido, poliglicólido o poliláctido co-glicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).
Los expertos en la técnica saben que la dosificación de la composición dependerá de varios factores como, por ejemplo, la afección que se esté tratando, la composición particular utilizada y otros factores clínicos como peso, tamaño, sexo y condición de salud general del paciente, área de superficie corporal, el compuesto o la composición particular que se administre, otros fármacos que se administren simultáneamente, y la vía de administración.
La composición de acuerdo con la invención se puede administrar junto con otras composiciones que comprenden una sustancia o compuesto biológicamente activo como, por ejemplo, un compuesto conocido utilizado en la medicación de Tauopatías y/o amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con la proteína amilode o tipo amiloide como la proteína β amiloide implicada en la enfermedad de Alzheimer.
La otra sustancia o compuesto biológicamente activo puede producir su efecto biológico mediante el mismo mecanismo o un mecanismo similar al de la vacuna terapéutica de acuerdo con la invención o mediante un mecanismo de acción no relacionado o mediante una multiplicidad de mecanismos de acción relacionados y/o no relacionados.
En general, el otro compuesto biológicamente activo puede incluir potenciadores de transmisión de neutrones, fármacos psicoterapéuticos, inhibidores de acetilcolinesterasa, bloqueadores del canal de calcio, aminas biogénicas, tranquilizadores de benzodiazepina, síntesis de acetilcolina, potenciadores de almacenamiento o liberación, agonistas del receptor postsináptico de acetilcolina, inhibidores de monoamina oxidasa A o B, antagonistas del receptor de glutamato de N-metil-D-aspartato, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antioxidantes y antagonistas del receptor serotonérgico.
En particular, el agente o compuesto biológicamente activo puede comprender al menos un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en compuestos contra tensión oxidativa, compuestos anti-apoptóticos, quelantes metálicos, inhibidores de reparación de ADN como pirenzepina y metabolitos, ácido 3-amino-1-propanosulfónico (3APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), activadores de secretasa, ihibidores de [beta]-y 7-secretasa, proteínas Tau, neurotransmisor, agentes de ruptura lámina β, moléculas antiinflamatorias, "antipsicóticos atípicos" como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina o inhibidores de colinesterasa (ChEl) como tacrina, rivastigmina, donepezil y/o galantamina y otros fármacos y complementos nutritivos como, por ejemplo, vitamina B 12, cisteína, un precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acetil-L-carnitina, idebenona, propentofilina, o un derivado de xantina, junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente, un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable e instrucciones para el tratamiento de enfermedades.
En una realización adicional, la composición de acuerdo con la invención puede comprender niacina o memantina junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente, un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En aun otra realización de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden "antipsicóticos atípicos" como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina para el tratamiento de síntomas psicóticos positivos y negativos que incluyen alucinaciones, delirios, trastornos del pensamiento (manifestados por incoherencia notoria, descarrilamiento, tangencialidad) y comportamiento raro o desorganizado, así como anhedonia, afecto aplanado, apatía y aislamiento social, junto con el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente, un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otros compuestos que se pueden usar de manera adecuada en las composiciones además del péptido de unión de acuerdo con la invención son los que se describen, por ejemplo, en WO 2004/058258 (ver especialmente las páginas 16 y 17) incluidas las dianas de fármacos terapéuticos (página 36-39), ácidos alcanosulfónicos y ácido alcanolsulfúrico (páginas 39-51), inhibidores de colinesterasa (páginas 51-56), antagonistas del receptor de NMDA (páginas 56-58), estrógenos (páginas 58-59), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas de los receptores activados por proliferadores de peroxisoma (PPAR) (páginas 63-67), agentes que disminuyen el colesterol (páginas 68-75); inhibidores amiloides (páginas 75-77), inhibidores de la formación amiloide (páginas 77-78), quelantes metálicos (páginas 78-79), anti-psicóticos y antidepresivos (páginas 80-82), complementos nutricionales (páginas 83-89) y compuestos que aumentan la disponibilidad de sustancias biológicamente activas en el cerebro (ver páginas 89-93) y profármacos (páginas 93 y 94).
Puede haber materia farmacéuticamente activa proteinácea en cantidades de entre 1 ng y 10 mg por dosis. En general, el régimen de administración debería encontrarse en el intervalo de entre 0,1 µg y 10 mg del anticuerpo de acuerdo con la invención, particularmente en un intervalo de 1,0 µg y 1,0 mg, y más particularmente en un intervalo de entre 1,0 µg y 100 µg, en el que todas las cifras individuales que se encuentran dentro de estos intervalos forman parte de la invención si la administración tiene lugar mediante infusión continua, una dosificación más apropiada puede encontrarse en el intervalo de entre 0,01 µg y 10 mg de unidades por kilogramo de peso corporal por hora en donde todas las cifras individuales que se encuentran dentro de estos intervalos también forman parte de la invención.
La administración, en general, será por vía parenteral, por ejemplo, intravenosa o subcutánea. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los solventes no acuosos incluyen, pero no se limitan a, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los solventes acuosos se pueden seleccionar del grupo que consiste en agua, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas/alcohol que incluyen solución salina y medio amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluido y nutrientes, regeneradores de electrolitos (como los que se basan en la dextrosa de Ringer) y otros. También puede haber conservantes presentes, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc.
La composición farmacéutica puede comprender además portadores proteináceos como, por ejemplo, albúmina de suero o inmunoglobulina, particularmente de origen humano. Puede haber otros agentes biológicamente activos presentes en la composición farmacéutica de la invención según su uso pretendido.
Cuando la diana de unión se encuentra ubicada en el cerebro, determinadas realizaciones de la invención proporcionan el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, para atravesar la barrera hematoencefálica. Determinadas enfermedades neurodegenerativas se asocian con un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, de modo que el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales o fragmento activo de los mismos se pueda introducir fácilmente en el cerebro. Cuando la barrera hematoencefálica permanece intacta, existen varios enfoques conocidos en la técnica para transportar moléculas a través de esta, que incluyen, pero no se limitan a, métodos físicos, métodos basados en lípidos y métodos basados en receptores y canales.
Los métodos físicos para transportar el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales o fragmento activo de los mismos a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, evadir la barrera hematoencefálica completamente o mediante la creación de aberturas en la barrera hematoencefálica. Los métodos de evasión incluyen, pero no se limitan a, inyección directa en el cerebro (véase, por ejemplo, Papanastassiou et ál., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantar un dispositivo de administración en el cerebro (véase, por ejemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); y Gliadel Wafers(TM), Guildford Pharmaceutical). Los métodos para crear aberturas en la barrera incluyen, pero no se limitan a, ultrasonido (véase, por ejemplo, publicación de patente de EE.UU. N.° 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, mediante administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)), permeabilización mediante, por ejemplo, bradiquinina o permeabilizador A-7 (véase, por ejemplo, patentes de EE.UU. N.° 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206 y 5,686,416), y transfección de neuronas que se extienden a través de la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican el péptido de unión o fragmento de unión al antígeno (véase, por ejemplo, publicación de patente de EE.UU. N.° 2003/0083299).
Los métodos basados en lípidos para transportar el péptido de unión de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento activo de los mismos a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, encapsular el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmento activo de los mismos en liposomas que se acoplan a fragmentos activos de los mismos que se unen a receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20020025313), y recubrir el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmento activo de los mismos en partículas de lipoproteína de baja densidad (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20040204354) o apolipoproteína E (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 20040131692).
Los métodos basados en receptores y canales para transportar el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmento activo de los mismos, a través de la barrera hematoencefálica incluyen, pero no se limitan a, el uso de bloqueadores glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.º 2002/0065259, 2003/0162695 y 2005/0124533); la activación de canales de potasio (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.º 2005/0089473), la inhibición de transportadores de fármacos ABC (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.º 2003/0073713); el revestimiento de
anticuerpos con una transferrina y modulación de la actividad de uno o más receptores de transferrina (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.º 2003/0129186) y cationización de los anticuerpos (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. N.º 5,004,697).
Un sujeto puede recibir administraciones únicas o repetidas del péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento activo de los mismos, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, durante un período de tiempo prolongado. La duración de la administración puede ser de entre 1 semana y hasta 12 meses o más. Durante este período, el péptido de unión, anticuerpo o composición farmacéutica se pueden administrar una vez por semana, una vez cada dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, etc., o con menor o mayor frecuencia según las necesidades del sujeto que deba tratarse.
En una realización adicional, la presente invención proporciona métodos y kits para la detección y el diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau que incluyen enfermedades o trastornos neurodegenerativos como Tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran tanto patologías Tau como amiloide que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral de proteínas priónicas, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide característica que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia de Guam, enfermedad neuronal motora no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia argirofílica granulosa, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-pontonigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de ovillos neurofibrilares predominantes, parkinsonismo posencefálico, distrofia miotónica. Las anomalías patológicas pueden ser provocadas por o estar asociadas con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la Tauopatía.
Además, la presente invención proporciona métodos y kits para el diagnóstico de una predisposición a enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau, que incluyen enfermedades o trastornos neurodegenerativos como Tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran de forma conjunta tanto patologías Tau como amiloide, o para controlar una enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención y como se describe en la presente memoria. Estos métodos incluyen métodos inmunológicos conocidos usados comúnmente para detectar o cuantificar sustancias en muestras biológicas o en una afección in situ.
El diagnóstico de una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau o de una predisposición a una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau en un sujeto que lo necesita, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, que incluye enfermedades o trastornos neurodegenerativos como Tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que manifiestan tanto patologías Tau como amiloide, se puede lograr mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, particularmente de un anticuerpo, particularmente de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de los mismos, a un epítopo de la proteína Tau en una muestra o in situ, que incluye hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene la proteína Tau entre en contacto con un anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína Tau, permitir que el anticuerpo se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico, detectar la formación del complejo inmunológico y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína Tau en la muestra o parte o área corporal específica, opcionalmente comparar la cantidad del complejo inmunológico con un valor de control normal, en donde un aumento en la cantidad del complejo inmunológico en comparación con un valor de control normal indica que el sujeto padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
El control de una enfermedad residual mínima en un sujeto, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, luego del tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención se puede lograr mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, particularmente de un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de los mismos, a un epítopo de la proteína Tau en una muestra o in situ, que incluye hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene la proteína Tau entre en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, que se une a un epítopo de la proteína Tau, permitir que el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico, detectar la formación del complejo inmunológico y
correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína Tau en la muestra o parte o área corporal específica, opcionalmente comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico con un valor de control normal, en donde un aumento en la cantidad de dicho complejo inmunológico en comparación con un valor de control normal indica que el sujeto aún puede padecer una enfermedad residual mínima.
La predicción de la capacidad de respuesta de un sujeto, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención se puede lograr mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión, particularmente de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo de los mismos, a un epítopo de la proteína Tau en una muestra o in situ, que incluye hacer que la muestra o una parte o área corporal específica que se sospecha que contiene la proteína Tau entre en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, que se une a un epítopo de la proteína Tau, permitir que el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se una a la proteína Tau para formar un complejo inmunológico, detectar la formación del complejo inmunológico y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína Tau en la muestra o parte o área corporal específica, opcionalmente comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento, en donde una disminución en la cantidad de dicho complejo inmunológico indica que dicho paciente tiene un alto potencial de responder al tratamiento.
Las muestras biológicas que se pueden usar en el diagnóstico de una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau, para el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau, que incluye enfermedades o trastornos neurodegenerativos como Tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran patologías tanto Tau como amiloide, o para controlar la enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención y como se describe en la presente memoria son, por ejemplo, fluidos como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, moco, fluido cerebroespinal, fluido linfático y similares o muestras de tejido o células obtenidas de un organismo, tal como tejido neural, cerebral, cardiaco o vascular. Para determinar la presencia o ausencia de la proteína Tau en una muestra, cualquier inmunoensayo conocido por los expertos en la técnica se puede usar como, por ejemplo, ensayos que utilizan métodos de detección indirectos usando reactivos secundarios para la detección, ensayos de ELISA e inmunoprecipitación y aglutinación. Se proporciona una descripción detallada de estos ensayos, por ejemplo, en Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988 555-612, WO96/13590 a Maertens y Stuyver, Zrein et al. (1998) y WO96/29605.
Para el diagnóstico in situ, el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, de la invención o cualquier parte activa o funcional de los mismos se puede administrar al organismo que se diagnosticará mediante los métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial, de manera que pueda ocurrir una unión específica entre un anticuerpo de acuerdo con la invención con una región epitópica en la proteína amiloide. El complejo de antígeno/péptido de unión se puede detectar convenientemente a través de una etiqueta unida al péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento funcional de los mismos, o cualquier otro método de detección conocido en la técnica.
Los inmunoensayos usados en aplicaciones de diagnóstico o en aplicaciones de diagnóstico de una predisposición a una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau, que incluye enfermedades o trastornos neurodegenerativos como Tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran tanto patologías Tau como amiloide, o para controlar una enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención y como se describe en la presente memoria comúnmente dependen de los reactivos etiquetados, péptidos de unión o reactivos secundarios para detección. Estas proteínas o reactivos se pueden etiquetar con compuestos generalmente conocidos por los expertos en la técnica que incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas que incluyen, pero no se limitan a, partículas coloreadas, tales como oro coloidal y perlas de látex. De estas, el etiquetado radioactivo se puede usar para casi todos los tipos de ensayos y con la mayoría de las variantes. Las etiquetas conjugadas con enzimas son particularmente útiles cuando deba evitarse la radioactividad o cuando se necesiten resultados rápidos. Los fluorocromos, si bien requieren equipos costosos para su uso, proporcionan un método de detección muy sensible. Los péptidos de unión útiles en estos ensayos son los que se describen y reivindican en la presente memoria que incluyen anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos policlonales purificados por afinidad.
De manera alternativa, el péptido de unión de acuerdo con la invención, que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se puede etiquetar indirectamente mediante reacción con sustancias etiquetadas que tienen una afinidad con la inmunoglobulina, tal como la proteína A o G o segundos anticuerpos. El péptido de unión de acuerdo con la invención, que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se puede conjugar con una segunda sustancia y se puede detectar con una tercera sustancia etiquetada que tiene afinidad con la segunda sustancia conjugada con el anticuerpo. Por ejemplo, el péptido de unión de acuerdo con la invención que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se puede conjugar con biotina y el conjugado de biotina/péptido de unión detectado usando avidina o estreptavidina etiquetada. De manera similar, el péptido de unión se puede conjugar con un hapteno y el conjugado de hapteno/péptido de unión se puede detectar usando péptido de unión anti-hapteno etiquetado.
Los expertos en la técnica conocerán estas y otras etiquetas adecuadas que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. La unión de estas etiquetas a los péptidos de unión o fragmentos de los mismos se puede lograr utilizando técnicas estándar comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas típicas son descritas por Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin Chim. Acta 70:1-31), y Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 (Clin. Chim Acta 57:140) Las técnicas de acoplamiento mencionadas en el último es el método de glutaraldehído, el método de periodato, el método de dimaleimida, y otras.
Los inmunoensayos actuales utilizan un método de anticuerpo doble para detectar la presencia de un analito, en donde el anticuerpo se etiqueta indirectamente mediante reactividad con un segundo anticuerpo que se ha etiquetado con una etiqueta detectable. El segundo anticuerpo es preferiblemente uno que se une a anticuerpos del animal del que deriva el anticuerpo monoclonal. En otras palabras, si el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón, el segundo anticuerpo etiquetado es un anticuerpo anti-ratón. Para el anticuerpo que se usará en el ensayo descrito en la presente memoria, esta etiqueta es preferiblemente una perla recubierta con anticuerpo, particularmente una perla magnética. Para el anticuerpo que se empleará en el inmunoensayo descrito en la presente memoria, la etiqueta es preferiblemente una molécula detectable, tal como una sustancia radioactiva, fluorescente o electroquimioluminiscente.
Un sistema de anticuerpo doble alternativo, a menudo denominados sistemas de formato rápido dado que se adaptan a determinaciones rápidas de la presencia de un analito, también se puede emplear dentro del alcance de la presente invención. El sistema requiere afinidad alta entre el anticuerpo y el analito. De acuerdo con una realización de la presente invención, la presencia de la proteína amiloide se determina usando un par de anticuerpos, cada uno específico para la proteína amiloide. Uno de dichos pares de anticuerpos se denomina en la presente memoria "anticuerpo detector" y el otro de dichos pares de anticuerpos se denomina en la presente memoria "anticuerpo de captura". El anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede usar como un anticuerpo de captura o un anticuerpo detector. El anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede usar como un anticuerpo de captura y un anticuerpo detector, juntos en un único ensayo. Una realización de la presente invención, por lo tanto, usa el método de sándwich de anticuerpo doble para detectar la proteína amiloide en una muestra de fluido biológico. En este método, el analito (proteína amiloide) está intercalado entre el anticuerpo detector y el anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura se encuentra irreversiblemente inmovilizado en un soporte sólido. El anticuerpo detector contendría una etiqueta detectable para identificar la presencia del sándwich de anticuerpo y analito y, por lo tanto, la presencia del analito.
Los ejemplos de sustancias de fase sólida incluyen, pero no se limitan a, placas de microtitulación, tubos de prueba de poliestireno, perlas y portaobjetos magnéticos, plásticos o de vidrio conocidos en el campo del radioinmunoensayo e inmunoensayo de enzimas. Los métodos para acoplar anticuerpos a fases sólidas también son conocidos por los expertos en la técnica. Más recientemente, se ha empleado una cantidad de material poroso como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos como soportes sólidos.
La presente invención también se refiere a un kit de diagnóstico para detectar la proteína Tau en una muestra biológica que comprende una composición como se definió anteriormente. Además, la presente invención se refiere al kit de diagnóstico mencionado en última instancia que, además de una composición como se definió anteriormente, también comprende un reactivo de detección como se definió anteriormente. El término "kit de diagnóstico" se refiere, en general, a cualquier kit de diagnóstico conocido en la técnica. Más específicamente, el último término se refiere a un kit de diagnóstico como se describe en Zrein et al. (1998).
Es aun otro objeto de la presente invención proporcionar inmunosondas novedosas y kits de prueba para la detección y el diagnóstico de enfermedades y afecciones asociadas con la proteína Tau, que comprenden péptidos de unión de acuerdo con la presente invención. Para inmunosondas, los péptidos de unión se unen directa o indirectamente a una molécula indicadora adecuada, por ejemplo, una enzima o un radionúclido. El kit de prueba incluye un recipiente que contiene uno o más péptidos de unión de acuerdo con la presente invención e instrucciones para usar los péptidos de unión con el fin de unirse al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de manera que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlacione con la presencia o ausencia de la proteína Tau.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación y análisis de hibridomas y anticuerpos
El objetivo de este estudio fue generar y analizar mAb (anticuerpos monoclonales) anti-Tau. Se generaron hibridomas mediante fusión de células de bazo de ratón inmunizadas con vacuna Tau con una línea celular de mieloma. Se evaluaron los hibridomas para determinar la reactividad contra proteína Tau de longitud completa fosforilada y no fosforilada, así como los péptidos antigénicos Tau fosforilados y no fosforilados usados en la preparación de vacunas. También se realizó análisis de hibridoma para determinar la reactividad de hibridomas sobrenadantes para ovillos de Tau usando inmunoquímica en cortes de cerebro de ratón transgénico Tau.
1.1 Métodos
1.1.1 Fusión
Se usó un ratón C57BL/6 tipo silvestre vacunado con ACI-35 (Tau 393-408 [pS396, pS404]) para la producción de hibridomas. El ratón se estimuló con vacuna ACI-35 el día 0 y luego nuevamente el día 4 y la fusión se realizó el día
7.
Se fusionaron 6x107 (ACI-35) esplenocitos del ratón inmunizado con 2x107 células de mieloma SP2-O-Ag14 en una relación de 3 esplenocitos /1 célula de mieloma.
Las fusiones generaron 8x96 placas de pocillos y los clones se nombraron de acuerdo con la placa (1-8) luego la fila (A-G) y finalmente la columna (1-12).
1.1.2 Método de análisis para seleccionar los clones
Las 8x96 placas de pocillos se analizaron dos veces en primer lugar para determinar la expresión de IgG. Los clones con expresión positiva luego se transfirieron en placas de 24 pocillos y los sobrenadantes celulares (=clones) de células crecientes se analizaron en un análisis ELISA Tau y un análisis de inmunohistoquímica TAUPIR. Se transfirieron sobrenadantes positivos en ELISA y/o TAUPIR a matraces T25 y se analizaron los clones nuevamente para determinar la expresión de IgG en un análisis ELISA Tau y análisis TAUPIR.
1.1.3 Análisis de IgG
Se recubrieron placas de ELISA (Costar; Sigma) con 50 µl/pocillo de anticuerpo IgG anti-ratón (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemania) en amortiguador de recubrimiento durante 16 h a 4 °C. Después de lavar las placas con PBS/Tween, los pocillos se bloquearon con 100 µl/pocillo de solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Se incubaron sobrenadantes de hibridoma no diluidos (50 µl por pocillo) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, se aplicó una mezcla de IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgM (AbD Serotec) anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de un lavado final, se realizó la detección con sustrato de HRP (TMB; 3-3',5,5'-tetrametilbencidina), y las placas se leyeron a 405 nm usando un lector de microplacas. Los resultados se expresan como densidad óptica (O.D.).
1.1.4 Análisis ELISA de hibridomas Tau
Se realizó el análisis ELISA de hibridomas en péptido pTau (ACI-35, T3.5: Tau393-408[pS396/pS404; PolyPeptide Laboratories, Hillerød, Dinamarca), el péptido Tau no fosforilado correspondiente (T3.6: Tau393-408, PolyPeptide Laboratories), proteína Tau de longitud completa fosforilada (441aa) (pTau protein, Vandebroek et al., 2005) y proteína Tau de longitud completa (441aa) (Tau protein, SignalChem, Richmond, Canadá). Finalmente, se usó albúmina de suero bovino (BSA) como control negativo.
Las placas se recubrieron con 10 µg/ml de péptido Tau correspondiente y 1 µg/ml de proteína Tau correspondiente durante la noche a 4 °C. Después de lavar cada pocillo con PBS-0,05 % de Tween 20 y bloquear con 1 % de BSA en PBS-0,05 % de Tween 20, se agregaron sobrenadante de hibridoma no diluido o medio de control negativo a las placas y se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Después del lavado, las placas se incubaron con anticuerpo total IgG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EUA) durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, las placas se incubaron con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), el sustrato de fosfatasa para AP, y se leyeron a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como O.D. (Densidad Óptica).
1.1.5 Análisis de IHC de hibridomas: Unión de anticuerpos anti-Tau a ovillos en secciones de cerebro de ratones transgénicos (TAPIR)
Se realizaron experimentos TAUPIR de acuerdo con el protocolo del EJEMPLO 3.1.2.
1.1.6 Análisis de IgG en matraces T25
Se recubrieron placas ELISA con 5 ug/ml de anticuerpo específico de fragmento F(ab')2 IgG anti-ratón (Jackson
Laboratories, Baltimore, PA, EUA) en amortiguador de recubrimiento de carbonato-bicarbonato pH 9,6 (Sigma, Buchs, Suiza) durante la noche a 4 °C. Después de lavar las placas, se incubaron sobrenadante de hibridoma no diluido, anticuerpo IgG1 de control positivo (6E10 a 1 ug/ml: Covance, Emeryville, CA, EUA) o control negativo (medio de cultivo solo) durante 1 h a RT. Después de una etapa de lavado, se incubó el anticuerpo específico de fragmento Fcγ IgG (subclases 1+2a+2b+3) de cabra anti-ratón conjugado con AP secundario (Jackson Laboratories, Baltimore, PA, EUA) en las placas durante 2 h a 37 °C. Después de un lavado final, se realizó la detección con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato), el sustrato fosfatasa para AP, y las placas se leyeron a 405 nm usando un lector de placas de ELISA. Los resultados se expresan como O.D. (Densidad Óptica).
1.2 Resultados
Los sobrenadantes celulares de 8x96 placas de pocillos generados de la fusión se analizaron para la producción de IgG. De 768 pocillos (8x96 pocillos) analizados, se seleccionaron 48 pocillos positivos para la producción de IgG en función de la mejor unión al fosfo-péptido de vacuna, y al fosfo-Tau de longitud completa. La selección se basó en la unión al péptido y proteína fosfo-Tau de longitud completa mediante ELISA y también a selectividad al compararla con el péptido no fosfo y proteína Tau de longitud completa no fosfo. Se subclonaron 24 hibridomas seleccionados al sembrar 2 placas por hibridoma en 1 célula/pocillo y 1 placa a 0,5 célula/pocillo. Los sobrenadantes se analizaron nuevamente para determinar la unión a fosfo-péptido y fosfo-proteína para verificar el perfil de unión, luego de lo cual se evaluó la estabilidad en un cultivo de 6 semanas. Luego se seleccionaron ocho clones estables y se analizaron para la producción de isotipos y la unión usando ELISA y TAUPIR como se describe en los Métodos.
1.3. Conclusión
Los anticuerpos generados han demostrado alta especificidad a péptidos pTau solamente con unión marginal a péptidos no fosforilados.
Se seleccionaron un total de 8 clones para la subclonación adicional y se secuenciaron (véase la Tabla 6 y la Tabla 7) y se depositaron 6 clones en DSMZ (véase la Tabla 10).
Los clones madre positivos mencionados anteriormente se cultivaron adicionalmente en placas de 96 pocillos, luego placas de 24 pocillos y finalmente matraces T25. En cada etapa, los sobrenadantes de los clones de hibridoma se analizaron mediante ELISA, Taupir y transferencia Western.
Ejemplo 2: Clonación de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo
Se clonan los genes de región variable pesada y ligera de anticuerpo de las células de hibridoma y se determinan las secuencias de ADN y la ubicación de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), así como las características de unión al anticuerpo.
Se preparó ARN total de 3 x 106 células de hibridoma (1 vial) usando el mini kit Qiagen RNeasy (N.° Cat: 74104). Se eluyó ARN en 50 uL de agua y se comprobó en un gel de agarosa al 1,2 %.
Se prepararon ADNc VH y VK usando transcriptasa inversa con cebadores de región constante de IgG y kappa. Los ADNc de primera cadena se amplificaron mediante PCR usando un gran conjunto de cebadores de secuencia de señal. Los ADNc amplificados se purificaron con gel y se clonaron en el vector pGem® T Easy (Promega). Se analizaron los clones de VH y VK obtenidos para inserciones del tamaño esperado. Se determinó la secuencia de ADN de clones seleccionados en ambas direcciones mediante secuenciamiento de ADN automático. Se determinaron las ubicaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en las secuencias con referencia a otras secuencias de anticuerpo (Kabat EA et al., 1991).
EJEMPLO 3: Estudios de unión I
El objetivo fue medir la unión de fosfo-Tau (pTau) de los anticuerpos generados a partir de los hibridomas subclonados derivados de ratones inmunizados con las vacunas liposómicas de Tau. Para evaluar esto, se usó un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) para medir la unión de los anticuerpos purificados a proteína Tau de longitud completa fosforilada y no fosforilada, así como los péptidos antigénicos Tau fosforilados y no fosforilados usados para la preparación de vacunas liposómicas.
Se completó el análisis mediante otros dos métodos. Se realizó inmunohistoquímica (IHC) en secciones de cerebro de un animal transgénico Tau (TAUPIR) usando un anticuerpo anti-Tau como el anticuerpo primario. De manera adicional, se realizó transferencia western (WB) en homogenados de proteína en el cerebro de ratones transgénicos Tau, usando un anticuerpo anti-Tau como el anticuerpo de transferencia.
3.1 Métodos
3.1.1. ELISA: Ensayo de unión a fosfo-Tau
Para evaluar la unión de los anticuerpos purificados a Tau y pTau, se usó un ensayo ELISA. En resumen, se recubrieron placas Nunc MaxiSorp de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1 µg/mL de proteína Tau de
longitud completa (441 aa) (SignalChem, Richmond, Canadá) o proteína Tau de longitud completa fosforilada (441 aa) (Vandebroek et al., 2005). De manera adicional, se recubrieron placas con 10 µg/mL del péptido de vacuna derivada de Tau, Tau393-408 (fosforilada o no en S396 y S404). Para analizar la reactividad cruzada con las secuencias de Tau y pTau de distintos epítopos de pTau que no se usaron en la preparación de vacunas, las placas se recubrieron con 10 µg/mL de los siguientes péptidos: Tau393-408 (fosforilada o no en S396 y S404), los recubrimientos se realizaron durante la noche en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a 4 °C. Las placas se lavaron completamente con 0,05 % de Tween 20/PBS y luego se bloquearon con 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) en 0,05 % de Tween 20/PBS durante 1 h a 37 °C. El anticuerpo analizado luego se agregó en 8 o 16 series de diluciones dobles de entre 20 y 0 µg/mL, y se permitió incubar durante 2 h a 37 °C. Las placas luego se lavaron como se describió anteriormente, y se agregó anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) a una dilución 1/6000 en 0,05 % de Tween 20/PBS durante 2 horas a 37 °C. Después del lavado, se incubaron las placas con p-nitrofenil fosfato disódico hexahidrato (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) solución de sustrato de fosfatasa, y se leyeron a 405 nm luego de períodos de incubación de 30 min, 1, 2 o 16 h usando un lector de placas ELISA.
3.1.2. TAUPIR y transferencia Western: Unión de anticuerpo anti-Tau a ovillos Tau en secciones de cerebro de un animal transgénico Tau (TAPIR)
Para la tinción de TAUPIR, las secciones de cerebro fueron de ratones TPLH (ratones transgénicos que expresan la isoforma más larga (441 aa) de hTauP301L), ratones biGT transgénicos dobles (ratones transgénicos GSK-3β cruzados con TPLH) >18 meses de edad, y ratones biAT transgénicos dobles (ratones transgénicos hAPPV717I cruzados con TPLH). Como control negativo, se usaron secciones de ratones inactivados Tau (TKO; 6 meses de edad). Se lavaron secciones de cerebro durante 5 min en PBS y luego se incubaron durante 15 min a RT en 1,5 % de H2O2 en PBS:MeOH (1:1) para bloquear la actividad de peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones 3 veces en PBST ((PBS/0,1 % TritonX100) se incubaron durante 30 min a RT en PBST+10 % de solución de bloqueo de FCS (suero fetal bovino). La incubación con el anticuerpo anti-Tau que se analiza se realizó durante la noche a 4 °C usando las siguientes concentraciones de anticuerpo: ACI-35-2A1-Ab1 a 0,0053 µg/mL, ACI-35-2A1-Ab2 a 0,0048 µg/mL, ACI-35-4A6-Ab1 a 0,015 µg/mL, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,0047 µg/mL, ACI-35-2G5-Ab1 a 0,0055 µg/mL y ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 a 0,01 µg/mL en PBST/10 % de FCS. A continuación, las secciones se lavaron 3 veces en PBST antes de la incubación con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con HRP (adquirido de Dako, Glostrup, Dinamarca) en PBST/10 % de FCS durante 1 h a RT. Antes de la detección, se lavaron las secciones 3 veces con PBST y se incubaron en 50 mM de Tris/HCl pH 7,6 durante 5 min. La detección se realizó mediante la incubación de las secciones durante 3 min en diaminobencidina (DAB: 1 comprimido en 10 ml de 50 mM de Tris.HCl + 3 µl de H2O2 30 %; MP Biomedicals, Solon, OH, EUA). La reacción se detuvo lavando las secciones 3 veces en PBST. Luego, las secciones se transfirieron a placas de vidrio silanizado y se secaron al aire en una placa caliente a 50 °C durante 2 horas. La contratinción se realizó usando incubación con hematoxilina de Mayers (Fluka Chemie, Buchs, Suiza) durante 1 min, seguido de una etapa de lavado durante 4 min en agua corriente. Las secciones se deshidrataron pasándolas en un baño de etanol al 50 %, 70 %, 90 % y dos veces en 100 % y luego en Xylol 2 veces durante 1 min. Finalmente, las secciones se montaron con DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra) en cubreobjetos de vidrio para imagenología.
Se realizó tinción adicional (transferencia Western) en proteínas de homogenados de cerebro separados en SDS-PAGE (10 %) de ratones de tipo silvestre (FVB), ratones transgénicos Tau (TPLH y biGT) o ratones inactivados Tau (TKO). Para la transferencia Western, se usaron los anticuerpos en las siguientes concentraciones: ACI-35-2A1-Ab1 a 0,53 µg/mL, ACI-35-2A1-Ab2 a 0,48 µg/mL, ACI-35-4A6-Ab1 a 0,5 µg/mL, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,47 µg/mL, ACI-35-2G5-Ab1 a 0,55 µg/mL, ACI-35-2G5-Ab2 a 0,33 µg/mL y ACI-35-2G5-Ab3 a 0,5 µg/mL.
3.2 Resultados
El anticuerpo ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-2A1-Ab2, ACI-35-1D2-Ab1, ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 demostró actividad de unión y especificidad elevadas a la proteína Tau humana fosforilada (Tabla 2), más específicamente al péptido fosfo-Tau antigénico usado en la vacuna correspondiente. No se observó reactividad cruzada con Tau no fosforilada, o con otros péptidos derivados de Tau fosforilada o no fosforilada analizados. El anticuerpo ACI-35-4A6-Ab1, según su selección, demostró actividad de unión elevada solamente con el péptido fosfo-Tau antigénico usado en la preparación de la vacuna. Se descubrió baja reactividad cruzada con la contraparte no fosfo del péptido antigénico usado en la preparación de la vacuna con respecto a lo que se esperaba en función de la selección de clones. El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab1 demostró actividad de unión elevada solamente con el péptido fosfo-Tau antigénico usado en la preparación de la vacuna. Se observó poca reactividad cruzada con el fosfo-péptido T4.5 que comprende parte de la secuencia de péptidos antigénicos usados en la vacuna.
Se usaron TAUPIR y WB para observar la unión a ovillos de Tau en el cerebro de ratones con Tauopatía avanzada (biGT > 18 meses), y a Tau de longitud completa en homogenados desnaturalizados derivados de estos ratones. Se analizaron diferentes regiones del cerebro: corteza y la parte CA1, CA3 y giro dentado (DG) del hipocampo. Los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1 y ACI-35-2A1-Ab2 mostraron los mejores resultados de TAUPIR con una tinción citoplásmica densa e hilos del neurópilo evidentes, especialmente en las regiones CA1 y CA3 del hipocampo. El anticuerpo ACI-35-4A6-Ab1 fue negativo en TAUPIR solamente con estructuras tipo ovillo esporádicas apenas visibles levemente teñidas. El anticuerpo ACI-35-1D2-Ab1 demostró una correcta tinción de TAUPIR citoplásmica
con hilos del neurópilo en la región CA1. El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab1 fue negativo en TAUPIR con tinción nuclear y solamente un poco de tinción de ovillos. Finalmente, los anticuerpos ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 demostraron tinción de TAUPIR citoplásmica correcta similar con hilos del neurópilo observados en CA1 y CA3 del hipocampo. La valoración de calidad de tinción usando signos de + o -se muestra en la Tabla 2. Se transfirieron homogenados de cerebro de ratones transgénicos Tau, lo que muestra que todos los anticuerpos se unieron bien a las bandas de Tau esperadas (Tabla 2, clasificada como +) con ACI-35-1 D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab1, que también muestra unión no específica adicional (-/+).
Ejemplo 4: Estudios de unión II
4.1 Métodos
4.1.1 Ensayo de unión de SPR
Todos los experimentos de SPR se llevaron a cabo en un instrumento Biacore X (GE Healthcare). El chip sensor SA (dextrano de carboximetilo derivado de estreptavidina) se adquirió de GE Healthcare. El amortiguador de ejecución fue PBS (PBS de Dulbecco, Sigma D8537). La estreptavidina unida no covalentemente se retiró en primer lugar de la superficie del sensor mediante la inyección de 8 pulsos (cada uno ∼1 µL) de 16 mM de NaOH (ac). Luego se solubilizó péptido fosfo-Tau en PBS para proporcionar una concentración de péptido final de 1 µM y luego se inyectó (35 µL) en celda de flujo (fc) 2 del chip sensor a 5 µl/min. Después del acoplamiento, se obtuvo un nivel de inmovilización final de 130 RU. Para estudiar la unión de los anticuerpos a la superficie del chip, se prepararon varias concentraciones de anticuerpos mediante diluciones dobles en serie con amortiguador de ejecución. La inyecciones se realizaron en fc 1 y 2 a una velocidad de flujo de 50 µL/min durante 120 s. La celda de flujo 1 no generó derivaciones y las respuestas de fc 1 se restaron de fc 2 para corregir el ruido del instrumento y los cambios refractarios masivos. Después de cada inyección, se lavaron las superficies inmediatamente con amortiguador de ejecución durante 100 s. Para retirar cualquier anticuerpo unido restante del chip, se realizó regeneración de la superficie mediante la inyección de 1 µL de 10 mM de Glicina-HCl pH 1,7. Los análisis cinéticos se realizaron usando algoritmos para integración numérica y análisis global usando BIAevaluation 3.0. Los sensogramas obtenidos para inyecciones de anticuerpo a distintas concentraciones se superpusieron y las líneas de referencia se ajustaron a cero. Para el ajuste de la curva, todos los datos se ajustaron simultáneamente a un modelo homogéneo
1:1 (Langmuir).
Péptidos usados
4.2 Resultados
La unión de los anticuerpos anti-Tau al péptido Tau fosforilado se controló en tiempo real usando SPR. Los análisis de las fases de asociación y disociación de unión del anticuerpo se podrían usar para determinar la constante de velocidad de asociación (ka), constante de velocidad de disociación (kd), así como la constante de disociación KD.
Se descubrió que todos los anticuerpos se unieron específicamente al péptido T3.30 en la superficie de dextrano de carboximetilo no derivada en el intervalo de 46 → 734 nM del anticuerpo analizado (o 11,5 → 184 nM para ACI-35-4A6-Ab1). Los análisis cinéticos de los sensogramas revelaron la constante de disociación KD para que la interacción de unión entre los distintos anticuerpos y T3.30 sea de entre 2 y 82 nM. Por lo tanto, esto demuestra que los anticuerpos reconocen el fosfopéptido T3.30 con afinidad muy alta (Tabla 3).
Ejemplo 5: Estudios de unión III ELISA en muestras de cerebro humano (ELISA para detección de multímeros de Tau fosforilada)
5.1 Métodos
5.1.1. Muestras humanas: Preparación de muestras de cerebro humano usadas para los ensayos descritos en la presente memoria
La corteza post-mortem temporal para diez muestras con enfermedad de Alzheimer (AD) y diez controles con coincidencia de edad se obtuvieron del Brain Endowment Bank de la Universidad de Miami. La edad promedio al fallecimiento para los pacientes con AD (siete mujeres, tres hombres) fue 81,1 ± 7,3 años y para los controles (sin síntomas neurológicos; nueve mujeres, un hombre) fue 87,0 ± 5,8 (no difiere significativamente de los pacientes con AD según prueba t de Student). Todas las muestras fueron de origen caucásico. Las muestras de AD fueron caracterizadas para la etapa de enfermedad de Braak (Braak y Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259) como se muestra en la Tabla 4.
La corteza post-mortem temporal para diez muestras de AD y diez controles con coincidencia de edad se homogeneizaron de acuerdo con el siguiente protocolo. Los fragmentos de cerebro se pesaron y homogeneizaron en 9 volúmenes de 25 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de inhibidores de fosfatasa que contienen EGTA (30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido okadaico, 1 mM de PMSF, 5 mM de Na4P2O7) e inhibidores de proteasa (Complete Mini; Roche, Suiza). La homogeneización se realizó en hielo usando un recipiente de vidrio. Esto constituye la fracción de homogenado total (TH). Se midieron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Sigma).
5.1.2. Configuración de ELISA 1: Ensayo de configuración de ELISA 1 para detectar la presencia de multímeros de Tau fosforilada en homogenados de cerebro cortical post-mortem humanos de individuos afectados con AD y controles con coincidencia de edad
Se recubrieron placas de 96 pocillos de microtitulación con anticuerpos durante la noche a 4 °C a 5 µg/ml en amortiguador de carbonato/bicarbonato. Después de 4 lavados en PBS-Tween, las placas se saturaron con PBS-Tween 10 % BSA durante 1 h a 37 °C. Luego se agregaron homogenados de cerebro a los pocillos a una concentración de 100 ng/µL en 50 µL de PBS, y se incubaron durante 2 h a 37 °C. Después de lavar las placas, el mismo anticuerpo usado para el recubrimiento, pero biotinilado, se incubó durante 1 h a 37 °C a una concentración final de 5 µg/mL. Las placas se lavaron y luego de la adición de avidina-peroxidasa (Vectastain ABC kit, Vector Laboratories) y su sustrato (ABTS, Roche 10881420), se leyeron las placas en distintos momentos. Los valores se expresan como promedio OD ±SD para 10 sujetos con AD y 10 sujetos de control.
5.2 Resultados
Los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 se analizaron para determinar su capacidad de detectar multímeros de fosfoTau (pTau) en homogenados de cerebro de sujetos con AD y de control, usando una configuración de ELISA 1 específica de fosfo y multímero. Observamos una diferencia muy significativa (p<0,001) entre AD y los controles con coincidencia de edad (n=10) en este ensayo para ambos anticuerpos (Figura 1). Usando homogenados corticales post-mortem humanos de cerebro con AD y de control con coincidencia de edad, demostramos la capacidad de los anticuerpos anti-pTau ACI-35-2A1-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 de detectar multímeros de Tau-pS396 en muestras de cerebro humano post-mortem.
Ejemplo 6: Estudios de unión IV -Transferencias Western en muestras de cerebro humano.
6.1 Métodos
6.1.1. Muestras humanas: El mismo método para la preparación de muestras humanas que se describe en elMétodo 5.1.1.
6.1.2. Transferencias Western: Ensayo de transferencia Western para detectar la presencia de Tau fosforilada en homogenados de cerebro cortical post-mortem humanos de individuos afectados con AD y controles con coincidencia de edad
Los anticuerpos Tau anti-humanos usados en este estudio fueron ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 de ratón, todos dirigidos contra Tau-pS396. El anticuerpo TAU-13 monoclonal de ratón (Abcam ab24636) dirigido contra Tau humana total, y el anticuerpo monoclonal de conejo E178 dirigido contra Tau-pS396 (Abcam ab32057) se usaron como controles. 20 µg de cada homogenado total se cargaron por carril en 10 % de gel prefabricado de poliacrilamida Bis-TRIS (Nupage Novex 10 % Bis-TRIS Midi Gel, Invitrogen). Las proteínas se resolvieron según la recomendación del fabricante en amortiguador de ejecución NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen NP0001). La transferencia de proteína se realizó durante 3 h en 25 mM de TRIS pH 8,6, 190 mM de amortiguador de glicina, 20 % de metanol, en hielo en membranas de PVDF (Immobilon-FL, Millipore IPFL00010). Las membranas se bloquearon durante 1 h en amortiguador de bloqueo Licor (Odyssey) diluido 1/3 en PBS. Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios en las siguientes concentraciones: TAU-13 a 0,6 µg/mL, E178 diluido 1/5000, ACI-35-2A1-Ab1 a 0,53 µg/mL, ACI-35-1D2-Ab1 a 0,47 µg/mL y ACI-35-2G5-Ab3 a 0,5 µg/mL, diluidos 1/3 en amortiguador Licor y 2/3 PBS con 0,1 % de Tween-20 (PBS-T). Después de 4 lavados en PBS-T, las membranas se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-ratón acoplado con el tinte LICOR 800 (IRDye de cabra anti-ratón 800 CW, Odyssay) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron nuevamente 4 veces con PBS-T, y se escanearon para la reproducción de imágenes usando el sistema LICOR.
6.2 Resultados
Los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 se analizaron para determinar su capacidad de detectar fosfoTau (pTau) en homogenados de cerebro de sujetos con AD y de control, usando transferencias Western específicas de fosfo. Todas las muestras de corteza humana post-mortem se caracterizaron en primer lugar usando anticuerpos comerciales contra Tau humana: anticuerpos Tau anti-total (TAU-13) y Tau anti-pS396 (E178). Como se muestra en la Figura 2A, usando el anticuerpo TAU-13, detectamos en todas las muestras el marcador de Tau característico correspondiente a distintas isoformas de Tau en el intervalo de 50-70 kDa. De manera interesante, en homogenados de cerebro con AD también observamos un cambio relativo en el patrón de migración de Tau esperado para la presencia de Tau hiperfosforilada en cerebros con AD. Confirmando esta hipótesis, el
anticuerpo Tau anti-pS396 comercial distinguió muy bien los controles y AD (Figura 2B). De hecho, el anticuerpo Tau anti-pS396 reveló tres bandas inmunorreactivas principales correspondientes a isoformas hiperfosforiladas de Tau en todos los homogenados de cerebro con AD y con una intensidad muy baja, o ausentes en los controles sanos. Además, las muestras de AD mostraron pruebas inmunorreactivas de TAU-13 de peso molecular alto que probablemente refleja la presencia de Tau agregada (Figura 2A).
La transferencia Western con ACI-35-2A1-Ab1 reveló la presencia de dos bandas de proteína inmunorreactiva del tamaño esperado para fosfo Tau en los homogenados de cerebro con AD pero no en los controles (Figura 3A). Las inmunorreacciones débiles mediante transferencia Western usando ACI-35-2A1-Ab1 puede explicarse mediante la presencia de dos bandas no específicas principales a ∼35 y ∼40 kDa. La transferencia Western con ACI-35-1 D2-Ab1 reveló la presencia de dos bandas de proteína inmunorreactiva del tamaño esperado para fosfo Tau en los homogenados de cerebro con AD pero no en los controles (Figura 3B). Las inmunorreacciones débiles mediante transferencia western usando ACI-35-1D2-Ab1 se pueden explicar mediante la presencia de bandas no específicas a ∼40 y ∼50 kDa, así como 4 bandas no específicas entre 80 kDa y 150 kDa. La transferencia western con ACI-2G5-Ab3 reveló la presencia de tres bandas inmunorreactivas principales que corresponden a isoformas (hiper)fosforiladas de Tau en todos los homogenados de cerebro con AD y ausentes en los controles sanos, salvo por un sujeto de control (C22), que tiene historial familiar de AD (Figura 3C). Este informe demostró que ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 pueden distinguir entre AD y los controles con coincidencia de edad con respecto a la presencia de Tau pS396 en corteza post-mortem humana y, por lo tanto, estos anticuerpos monoclonales reconocen isoformas Tau patológicas asociadas con AD.
Ejemplo 7: Estudios de unión V -Configuración 1 (ELISA en muestras de cerebro humano)
7.1 Métodos
7.1.1. Muestras humanas. El mismo método para la preparación de muestras humanas que el que se describe en el Método 5.1.1., salvo por la última parte, preparación de la fracción S1.
7.1.2. Fracción de proteína Tau S1: Subdivisión de fracciones de homogenados totales para obtener proteínas Tau soluble y fosfo-Tau.
Para preparar la fracción de Tau soluble (S1) usada para el ensayo de AlphaLISA, se dividió la mitad del volumen de fracción de TH y se almacenó a -80 °C. El resto de la fracción de TH se procesó adicionalmente mediante la adición de Triton X-100 hasta una concentración final de 0,4 %. Las muestras se mezclaron y se agitaron en vórtex varias veces antes de centrifugarse a 5'000 rpm durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante constituye la fracción S1. Las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C. Las concentraciones de proteína se midieron usando reactivo Bradford.
7.1.3. AlphaLISA: Ensayo AlphaLISA para detectar la presencia de Tau fosforilada en homogenados de cerebro cortical post-mortem humanos de individuos afectados con AD y controles con coincidencia de edad.
Los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3, todos dirigidos contra Tau-pS396, se biotinilaron usando el kit de biotinilación EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC (Thermo Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un exceso molar de veinticinco veces de Biotina en anticuerpo en la reacción de etiquetado. Después de la biotinilación, se retiró el exceso de biotina libre mediante diálisis contra PBS usando los dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO (Thermo Scientific). Los anticuerpos biotinilados se designan ACI-35-2A1-Ab1-BT, ACI-35-1D2-Ab1-BT y ACI-35-2G5-Ab3-BT. Se conjugó anticuerpo Tau-13 con perlas aceptoras alfa activadas (Perkin Elmer) usando el siguiente protocolo: Se mezclaron 0,1 mg de solución de anticuerpo Tau-13 (purificado en columna de proteína A) con 1 mg de sedimentos de perlas aceptoras AlphaLISA y complementada con amortiguador de fosfato 0,13 M (pH 8,0) hasta un volumen de reacción final de 200 µL. A continuación, se agregó 1,25 µL de 10 % de Tween-20 y 10 µL de una solución de 25 mg/mL de NaBH3CN y el tubo se incubó durante 48 h a 37 °C con leve rotación (7 rpm). Después de la reacción de conjugación, se bloquearon los sitios activos en las perlas mediante la adición de 10 µL de una solución de carboxi-metoxilamina y se incubaron adicionalmente a 37 °C durante 1 h. Finalmente, las perlas se lavaron dos veces con 200 µL de Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 y se almacenaron 4 °C en 200 µL de amortiguador de almacenamiento (PBS con 0,05 % de Proclin-300) que dio como resultado una concentración de perlas aceptoras AlphaLISA final de 5 mg/ml.
AlphaLISA es un ensayo homogéneo basado en quimioluminiscencia de proximidad de perlas. Si las perlas donantes y aceptoras alfa se encuentran próximas entre sí, luego de la excitación láser, una cascada de reacciones químicas produce una señal amplificada. Después de la excitación a 680 nm, el fotosensibilizador contenido en las perlas donantes convierte el oxígeno ambiente en especies de oxígeno singlete más reactivas. Estos singletes difusos (hasta 200 nm, en 4 µseg de una semivida) y produce una reacción quimioluminiscente en las perlas aceptoras, lo que produce emisión de luz. La configuración del ensayo fue el siguiente:
Se diluyeron previamente muestras de S1 en amortiguador de ensayo alfa (PerkinElmer AL000C) para obtener una concentración madre de 20 µg/mL. Los siguientes reactivos se agregaron a una placa de 384 pocillos blanca
OptiPlate (PerkinElmer) hasta un volumen final de 50 µL: Homogenado de cerebro S1 (5 µL), 10 µL de ACI-35-2A1Ab1-BT, ACI-35-1D2-Ab1-BT o ACI-35-2G5-Ab3-BT para una concentración de anticuerpo final de 0,2 nM, 0,5 nM o 0,5 nM, respectivamente, y 10 µL de conjugado de perlas aceptoras Tau13 para una concentración de perlas final de 2,5 µg/mL. La mezcla de reacción se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, y se agregaron 25 µL de perlas donantes de estreptavidina y se incubaron adicionalmente durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. La lectura se realizó usando el instrumento EnSpire Alpha y el análisis se realizó con EnSpire Workstation versión 3.00. El análisis estadístico de los datos se realizó usando el software GraphPad Prism. Los resultados se presentan como unidades alfa ± SD.
7.2 Resultados
Se usó un ensayo AlphaLISA para analizar los anticuerpos ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 para determinar la capacidad de detectar Tau-pS396 en homogenados de cerebro humano post-mortem, y para distinguir AD de los controles con coincidencia de edad. Todos los anticuerpos detectaron Tau-pS396 (Figura 4A, 4B, 4C). La diferencia en la detección de señales entre AD y los controles (n=10) también fue muy significativa para todos los anticuerpos, lo que demuestra un aumento de señal en los cerebros de los sujetos con AD; ACI-35-2A1-Ab1 (p<0,0001), ACI-35-1D2-Ab1 (p<0,0001) y ACI-35-2G5-Ab3 (p=0,002). En conclusión, se usó la tecnología AlphaLISA para demostrar la capacidad de ACI-35-2A1-Ab1, ACI-35-1D2-Ab1 y ACI-35-2G5-Ab3 de detectar pS396-Tau en los cerebros de sujetos con AD, y para diferenciar entre los donantes con AD y de control.
Ejemplo 8: Eficacia in vivo del anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3
8.1 Métodos
8.1.1. Configuración del estudio: Efectos de tratamiento in vivo de 2 administraciones de anticuerpo antipTau ACI-35-2G5-Ab3 en ratones transgénicos Tau
A ratones transgénicos Tau hembras y machos (TMHT) con C57BL/6xDBA como trasfondo, de 6-7 meses de edad, se les administraron mediante inyección i.p 3 o 10 mg/kg de ACI-35-2G5-Ab3 o vehículo de control (PBS) dos veces, con una semana de separación. El día 14, los animales se sometieron a eutanasia, los cerebros se cosecharon y procesaron para inmunohistoquímica (IHC). Para determinar la patología Tau en el hipocampo y la amígdala, se etiquetaron 5 cortes (1 de cada nivel) por cerebro usando anticuerpos AT180 (para Tau-pT231) y HT7 (para Tau humana total) y, posteriormente, se evaluó el área inmunorreactiva usando software Image Pro Plus (v6.2). Se midieron los objetos inmunorreactivos por encima de una restricción de tamaño (30 µm2 en la amígdala, 7 µm2 en el hipocampo) y por encima de un umbral de intensidad dinámico. El área total y la intensidad de los objetos y el umbral individual se presentaron automáticamente. Si se usa, se definió un umbral dinámico como intensidad promedio dentro de un área de intensidad (AOI) más un factor por la desviación estándar de intensidades de pixeles dentro del AOI. El tamaño de la región se midió mediante delineación manual del hipocampo y la amígdala. Los datos del área AT180 y HT7 IR se normalizaron con la región (en el hipocampo) o tamaño de AOI (en amígdala).
8.2 Resultados
El anticuerpo pTau AT180 detecta pTau endógena y humana (doblemente fosforilada en Thr231 y Ser235). Para los ratones transgénicos Tau usados en este estudio, las mediciones histológicas AT180 se concentraron en las neuronas del hipocampo y de la amígdala. Los ratones tratados con ACI-35-2G5-Ab3 presentaron una reducción significativa para intensidad promedio y normalizada total de AT180 de etiquetado somal, tanto en amígdala e hipocampo (Figura 5A y 5B), que muestra la reducción de pTau positiva para AT180 somal total en ratones tratados.
Para Tau humana total (transgénica), se usó el anticuerpo HT7. HT7 reconoce Tau humana normal entre el residuo 159 y 163. Las mediciones histológicas se concentraron en somas inmunorreactivas de neuronas del hipocampo y de la amígdala. Los ratones tratados con ACI-35-2G5-Ab3 presentaron un área inmunorreactiva de HT7 reducida, así como la intensidad de HT7 total y promedio de la inmunorreactividad en la amígdala (Figura 6A). En el hipocampo, lo mismo se observó para intensidad promedio (Figura 6B). Sin embargo, se observó un aumento en el etiquetado de HT7 para el área inmunorreactiva, y la intensidad total en el hipocampo en los ratones tratados a 10 mg/kg. Este aumento observado en el hipocampo se debió principalmente a tres ratones del total de ocho ratones analizados.
El tratamiento con ACI-35-2G5-Ab3 disminuyó significativamente los niveles de pTau inmunorreactivos AT180 en ambas regiones analizadas, por lo tanto, en somas de neuronas del hipocampo y de la amígdala. En la amígdala, la intensidad total de etiquetado disminuyó tanto para pTau inmunorreactiva AT180 como Tau humana total inmunorreactiva HT7. El tratamiento con una dosis de 3 mg/kg también disminuyó significativamente la intensidad de HT7 promedio en ambas regiones. Sin embargo, en 10 mg/kg, el área inmunorreactiva de HT7 promedio y la intensidad total en el hipocampo aumentaron con respecto a la de los ratones tratados con control, lo que sugiere que un tratamiento con ACI-35-2G5-Ab3 conlleva un cambio con respecto a pTau patológica.
Ejemplo 9: Mapeo de epítopos de anticuerpos anti pTau
9.1 Métodos
El mapeo de epítopos de anticuerpos monoclonales de ratón Tau anti-fosfo se realizó mediante ELISA usando distintas genotecas de péptido fosfo y no fosfo. Las secuencias de aminoácidos de la genoteca de péptidos T3 usadas se muestran en la Tabla 11A. Cada genoteca consistió en péptidos biotinilados cortos que abarcan las secuencias fosfo y no fosfo presentes en la vacuna de péptidos. De manera adicional, se generó una genoteca de péptidos que sustituye cada residuo de una secuencia de péptidos que se une al anticuerpo con Alanina (Ala), como se muestra en las Tablas 11B y 11C. Cada genoteca consistió en péptidos biotinilados cortos que abarcan las secuencias fosfo y no fosfo presentes en la vacuna de péptidos. Las genotecas de péptidos se adquirieron de ANAWA Trading SA. Las genotecas de péptidos se adquirieron de ANAWA Trading SA. El mapeo de epítopos se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mimotopes). En resumen, las placas recubiertas con estreptavidina (NUNC) se bloquearon con 0,1 % de BSA en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 °C. Después del lavado con PBS-0,05 % de Tween 20, las placas se recubrieron durante 1 h a RT con los distintos péptidos de cada genoteca, se diluyeron con 0,1 % de BSA, 0,1 % azida de sodio en PBS hasta una concentración final de 10 µM. Después del lavado, las placas se incubaron durante 1 h a RT con el anticuerpo que se analizará diluido hasta 40 ng/ml en 2 % de BSA, y 0,1 % de azida de sodio en PBS. Las placas se lavaron nuevamente y se incubaron con anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) a una dilución de 1/6000 durante 1 h a RT. Después de un lavado final, las placas se incubaron con solución de sustrato de fosfatasa de hexahidrato disódico de fosfato p-nitrofenilo (pNPP; Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y se leyeron a 405 nm luego de 2 h de incubación usando un lector de placas ELISA. La unión se consideró positiva si la densidad óptica (O.D.) fue al menos 2 veces más que la O.D. de fondo.
9.2 Resultados
Como resultado de los experimentos de mapeo de epítopos, se pudieron identificar los epítopos que incluyen el residuo de aminoácido fosforilado requerido (ver la Tabla 5) al cual se unen de manera específica los anticuerpos descritos en la presente memoria.
 Tau aa 393-401, con requisito para pS396 (ACI-35-2A1-Ab1; ACI-35-2A1-Ab2)
 Tau aa 396-401, con requisito para pS396 (ACI-35-4A6-Ab1)
 Tau aa 394-400, con requisito para pS396 (ACI-35-1D2-Ab1)
 Tau aa 402-406, con requisito para pS404 (ACI-35-2G5-Ab1)
 Tau aa 393-400, con requisito para p396 (ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3)
Ejemplo 10: Fosforilación de Tau en serina 396 (pS396) usando cinasa GSK3β y análisis de transferencia Western / SDS-PAGE
10.1 Métodos
Se incubó la isoforma más larga de Tau de longitud completa humana (TAU441; SignalChem) a una concentración final de 16 µM (20 µg de Tau/25 µL de reacción) con 0,018 U de GSK3β/pmol de Tau en amortiguador de fosforilación que contenía HEPES pH 7,64 (40 mM), EGTA (5 mM), MgCl2 (3 mM) y ATP (2 mM) durante 1, 6, o 20 h a 4, 30 o 37 °C. Una unidad de GSK3β es descrita por el fabricante (New England BioLabs) como la cantidad de enzima que transferirá 1 pmol de fosfato de ATP a fosfopéptido CREB (KRREILSRRPpSYR) en 1 minuto a 30 °C. Tau fosforilada con GSK3β (pTau-GSK3β) se analizó con anticuerpos dirigidos contra Tau fosforilada en serina 202, 396, 404, 409, treonina 181, 205, y 231, y Tau total, ejecutados en ELISA directos y transferencias Western (WB), para optimizar y verificar la actividad de cinasa y la especificidad (no se muestra). De manera adicional, las sondas se analizaron para determinar la presencia de GSK3β usando un anticuerpo anti-GSK3α/β (BioSource Invitrogen). Para todas las WB, se diluyó pTau-GSK3β mediante la adición de un volumen igual de amortiguador de muestra A (125 mM de Tris-HCl pH 6,8, 4 % [p/v] de sulfato de dodecil sódico [SDS], 20 % de glicerol, 0,01 % de bromofenol azul, 5 % de β-mercaptoetanol), y las muestras se calentaron hasta 95 °C durante 10 min. 30 µg de la muestra se cargaron a un gel Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) y se ejecutaron en amortiguador MOPS SDS (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,45 µm en amortiguador de transferencia (25 mM de Tris pH 8,6, 190 mM de glicina, 20 % de metanol). Para verificar la transferencia de proteína, las membranas se tiñeron con Ponceau S durante 5 min. Luego, las membranas se lavaron y luego se bloquearon durante 1 hora en amortiguador de bloqueo (5 % de BSA en TBS [50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl]). Las membranas se transfirieron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios en amortiguador de bloqueo y 0,1 % de Tween. La transferencia con el ACI-35-2G5-Ab3 se realizó en dilución de anticuerpo 0,5 µg/mL.
10.2 Resultados
Tau tratada con GSK3β dio como resultado presencia elevada de fosforilación en Tau serina 396 (Tau-pS396), como
se verifica usando los anticuerpos específicos a distintos residuos de Tau fosfo-serina y -treonina (no se muestran). La Figura 7 muestra un SDS-PAGE para Tau-pS396 generado usando distintas condiciones de GSK3β, y se transfirió la membrana usando el anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3. El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3, específico para TaupS396, demostró una buena señal para Tau-pS396, con bandas también observadas que sugieren que se une a dímeros de Tau-pS396 (Figura 7, carriles 11 y 13). No se observaron bandas en ausencia de tratamiento con GSK3β (carriles 6-8 y 14-15).
Ejemplo 11: Detección de fosforilación de Tau (pSer396) en muestras de fluido cerebroespinal (CSF) humano
11.1 Métodos
11.1.1 Muestras humanas -muestras de cerebro post-mortem
La corteza post-mortem temporal de un donante con enfermedad de Alzheimer (AD) AD19 se obtuvo del Brain Endowment Bank de la Universidad de Miami. Agradecemos la generosidad del Brain Endowment Bank de la Universidad de Miami por proporcionar las muestras para este estudio. La información demográfica acerca del donante se muestra en la Tabla 12 a continuación, donde también se indica la etapa Braak de la enfermedad (Braak y Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259).
11.1.2. Preparación de fracción de homogenado S1 de cerebro post-mortem
La corteza post-mortem temporal del donante AD19 se homogeneizó de acuerdo con el siguiente protocolo. El fragmento de cerebro se pesó y homogeneizó en 9 volúmenes de 25 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de inhibidores de fosfatasa que contienen EGTA (30 mM de NaF, 0,2 mM de Na3VO4, 1 nM de ácido okadaico, 1 mM de PMSF, 5 mM de Na4P2O7 e inhibidores de proteasa (Complete Mini; Roche 04 693 124 001). La homogeneización se realizó en hielo usando un recipiente de vidrio. Esto constituye la fracción de homogenado total (TH). Se dividió la mitad del volumen de fracción de TH y se almacenó a -80 °C. El resto de la fracción de TH se procesó adicionalmente mediante la adición de Triton X-100 hasta una concentración final de 0,4 %. La muestra se mezcló y se agitó en vórtex varias veces antes de centrifugarse a 5'000 rpm durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante constituye la fracción S1. La muestra se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C. La concentración de proteína se midió usando reactivo Bradford (Sigma B6916-500).
11.1.3 Muestras de CSF humano
Las muestras de fluido cerebroespinal (CSF) de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) leve a moderada clínicamente confirmada y donantes de control voluntarios sanos (Ctrls) fueron proporcionadas por Charité School of Medicine Berlin. Agradecemos la generosidad de Charité School of Medicine Berlin por proporcionar las muestras para este estudio. Las muestras se dividieron en alícuotas, se almacenaron a -80 °C y se usaron sin procesamiento adicional. La información demográfica y clínica sobre donantes de muestras de CSF se muestra en la Tabla 13 a continuación.
11.1.4 Inmunoenriquecimiento de Tau CSF
11.1.4.1 Acoplamiento de anticuerpo
Para el inmunoenriquecimiento de Tau CSF, se usó un anticuerpo Tau humano comercial (clon HT7, Thermo
Scientific MN 1000). Para acoplar HT7 a Dynabeads de proteína G (Life Technologies 10004D), para cada muestra, se resuspendieron 1,5 mg (50 µL) de Dynabeads de proteína G mediante mezcla en vórtex y se transfirieron a un tubo de recuperación máxima de 1,7 mL (Axygen MCT-175-L-C). Los tubos se colocaron en un soporte magnético (DynaMag, Life Technologies 123.21 D) para concentrar las perlas en el costado del tubo y para retirar el amortiguador. La unión de 1 µg de HT7 en 200 µL de PBS a Dynabeads de proteína G se realizó usando un Hula Mixer (Life Technologies) a 10/20 rpm, 25 °/inclinación 10, 5 °12 vibro durante 10 min, luego de lo cual los tubos se colocaron en el imán, se retiró el amortiguador y los tubos se lavaron una vez mediante pipeteo leve con 200 µL de PBS/0,02 % de Tween 20 y dos veces con 200 µL de amortiguador de conjugación (20 mM de fosfato de Na, 150 mM de NaCl, preparado en el momento). Los amortiguadores de lavado siempre se retiraron usando el imán. Para reticular HT7 a las Dynabeads de proteína G, se resuspendieron las perlas de HT7 en 250 µL de solución de BS3 5 mM (Sigma-Aldrich S5799) disuelta en amortiguador de conjugación y se incubó con rotación (la misma configuración que anteriormente) durante 30 min a temperatura ambiente (RT), la reacción finalizó mediante la adición de 12,5 µL de amortiguador de inactivación (Tris-HCl 1M pH 7,5) durante 15 min seguido de tres lavados con 200 µL de PBS/0,02 % de Tween 20.
11.1.4.2 Inmunoenriquecimiento de Tau CSF
Se usó CSF sin diluir y se transfirieron 1 mL de CSF para cada donante al tubo que contenía las perlas reticuladas de HT7 y se incubó durante 1 h a 4 °C en rotación continua (10 rpm). Después de retirar el material no unido en el imán, las perlas se lavaron con 200 µL de PBS/0,02 % de Tween 20 y se eluyó Tau en 20 µL de sulfato de dodecilo sódico (SDS) al 1 % en PBS a 70 °C durante 10 min. Para evitar la sedimentación de las perlas, los tubos se mezclaron brevemente (300 rpm en el mezclador horizontal calentado, durante 5 segundos, cada minuto). Después de esta incubación, las muestras eluidas se recogieron colocando los tubos en el imán.
Como control positivo, Tau también se enriqueció a partir de homogenados de cerebro humano. Para esto, se prepararon diluciones en serie de fracción S1 de cerebro humano de donante AD19 en PBS (0,5 µg/mL, 0,17 µg/mL, 0,056 µg/mL, 0,019 µg/mL, 0,006 µg/mL, 0,002 µg/mL, 0,0007 µg/mL). Cada muestra (1 mL) luego se trató como se describió anteriormente y se eluyó en 25 µL de SDS al 1 %.
11.1.5 AlphaLISA.
11.1.5.1 Descripción de ensayo AlphaLISA
AlphaLISA es un ensayo homogéneo que utiliza la tecnología Alpha basada en perlas. AlphaLISA se seleccionó como plataforma de tecnología basada en sensibilidad y cantidad mínima de etapas. En resumen, el ensayo se basa en la proximidad de las perlas. Luego de la excitación a 680 nm, el fotosensibilizador que contenía perlas donantes convierte el oxígeno ambiente en especies de oxígeno singlete, estas se dispersan (hasta 200 nm, en 4 µseg de una semivida) y producen una reacción qumioluminiscente en las perlas aceptoras, lo que genera la emisión de luz.
La configuración del ensayo usada en estos experimentos fue la siguiente (véase también la Figura 8):
 El Anticuerpo Pan-Tau Tau-13 (Abcam ab24636), acoplado a perlas aceptoras Alpha, se une a Tau humana presente en la muestra y forma el complejo "proteína Tau-perlas aceptoras de anticuerpo Tau-13".
 El anticuerpo de detección ACI-35-2G5-Ab3-BT se une al pS396 de Tau humana y permite la unión de las perlas donantes Alpha recubiertas con estreptavidina (SAv) con el complejo.
Luego de llevar todos los reactivos a la reacción, se lee la señal quimioluminiscente usando el lector EnSpire Alpha 2390.
11.1.5.2 Biotinilación de anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3
Para usarlo en el ensayo AlphaLISA, el anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 se biotiniló usando el kit de biotinilación EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC (Thermo Scientific 21935), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó un exceso molar de veinticinco veces de Biotina en el anticuerpo en la reacción de etiquetado. Después de la biotinilación, se retiró el exceso de biotina libre mediante lavado del anticuerpo cuatro veces en PBS usando 50'000 MWCO Spin-X UF 500 Concentrator (Corning 431480). El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 biotinilado se indica como ACI-35-2G5-Ab3-BT.
11.1.5.3 Acoplamiento del anticuerpo Tau-13 a perlas aceptoras AlphaLISA.
Para usarlos en el ensayo AlphaLISA, se conjugó el anticuerpo Tau-13 con las perlas aceptoras Alpha activadas (Perkin Elmer 6772001). Se utilizó el siguiente protocolo de conjugación: Se mezclaron 0,1 mg de solución de anticuerpo Tau-13 (purificado en columna de proteína A) con 1 mg de sedimentos de perlas aceptoras AlphaLISA y complementada con amortiguador de fosfato 0,13 M (pH 8,0) hasta un volumen de reacción final de 200 µL. A continuación, se agregaron 1,25 µL de 10 % de Tween-20 y 10 µL de una solución de 25 mg/mL de NaBH3CN y el tubo se incubó durante 48 h a 37 °C con leve rotación (7 rpm). Después de la reacción de conjugación, se bloquearon los sitios activos en las perlas mediante la adición de 10 µL de una solución de carboxi-metoxilamina y
se incubaron adicionalmente a 37 °C durante 1 h. Finalmente, las perlas se lavaron dos veces con 200 µL de 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0 y se almacenaron 4 °C en 200 µL de amortiguador de almacenamiento (PBS con 0,05 % de Proclin-300) que dio como resultado una concentración de perlas aceptoras AlphaLISA final de 5 mg/ml.
11.1.5.4 Límite de determinación de detección usando pS396-Tau de cerebro
Se usaron muestras de cerebro Tau inmunoenriquecidas, muestras de fracción de cerebro S1 y de amortiguador en blanco para este experimento. Cada muestra se analizó en 50 µL de volumen final usando una placa blanca de 384 pocillos OptiPlate (PerkinElmer 6007291). Las diluciones de todos los reactivos se realizaron con amortiguador de ensayo Alpha (PerkinElmer AL000C).
 5 µL de muestra (1/10 del volumen final, por lo tanto, la concentración de proteína final en el ensayo corresponde a 1/10 de la concentración de la muestra).
 Se agregaron 10 µL de SDS al 0,5 % para muestras de fracción de cerebro S1 o 10 µL de amortiguador puro para las muestras de cerebro Tau inmunoenriquecidas.
 Se mezclaron 15 µL de anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3-BT (concentración final: 5 nM) con conjugado de perlas aceptoras y Tau13 (concentración final de perlas: 2,5 µg/ml)
 Incubación a temperatura ambiente durante 1 hora.
 20 µL de perlas donantes de estreptavidina (concentración final de perlas: 25 µg/mL)
 Incubación a temperatura ambiente durante 30 min (protegida de la luz).
 Lectura usando el instrumento EnSpire Alpha y el análisis con EnSpire Workstation versión 3.00.
11.1.5.5 Determinación de pS396-Tau inmunoenriquecida en CSF
Cada muestra se analizó en 50 µL de volumen final usando una placa blanca de 384 pocillos OptiPlate (PerkinElmer 6007291). Las diluciones de todos los reactivos se realizaron con amortiguador de ensayo Alpha (PerkinElmer AL000C).
 5 µL de eluato inmunoprecipitado de cada donante.
 Se mezclaron 20 µL de anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3-BT (concentración final: 5 nM) con conjugado de perlas aceptoras y Tau13 (concentración final de perlas: 2,5 µg/mL)
 Incubación a RT durante 1 h.
 25 µL de perlas donantes de estreptavidina (concentración final de perlas: 25 µg/ml)
 Incubación a RT durante 30 min (protegida de la luz).
 Lectura usando el instrumento EnSpire Alpha y el análisis con EnSpire Workstation versión 3.00.
11.1.6 Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos se realizó usando el software GraphPad Prism.
11.2 Resultados
Los experimentos preliminares indicaron que la cantidad de pS396 presente en CSF humano era demasiado baja para la detección. Por este motivo, se desarrolló un protocolo de inmunoenriquecimiento acoplado a inmunodetección de sensibilidad alta. El protocolo de inmunoenriquecimiento se validó en primer lugar usando material de cerebro post-mortem AD humano. La comparación paralela de las muestras de homogenados de cerebro no tratado con muestras inmunoenriquecidas Tau reveló que en las concentraciones correspondientes el límite de detección del ensayo AlphaLISA Tau13/ACI-35-2G5-Ab3 se alcanzó a 0,5 µg/mL para las muestras no tratadas y entre 0,002-0,006 µg/mL para las muestras inmunoenriquecidas, lo que indica un enriquecimiento de 100 veces (Figura 9).
A continuación, se aplicó el protocolo de inmunoenriquecimiento en las muestras de CSF de donantes vivos (n=17 para pacientes con AD leve a moderada y n=16 para voluntarios sanos con coincidencia de edad). Los datos obtenidos (Figura 10) demuestran que: a) luego del protocolo de inmunoenriquecimiento, AlphaLlSA Tau13/ACI-35-2G5-Ab3 detectó pS396-Tau en todas las muestras de CSF humano; y b) de manera más importante, se observó un aumento significativo en la cantidad de pS396-Tau en CSF de AD en comparación con el control (p=0,0003, prueba de Mann-Whitney).
En conclusión, se desarrolló un protocolo de inmunoenriquecimiento/inmunodetección, lo que permite la detección de pS396-Tau en CSF humano. El aumento de pS396-Tau en CSF de AD leve a moderada sugiere que este método se podría usar satisfactoriamente en estudios de biomarcadores clínicos para evaluar el avance de la enfermedad, estratificación de los pacientes y eficacia de la terapia. El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 detectó pS396-Tau en todas las muestras de CSF humano y, de manera más importante, el anticuerpo pudo distinguir el CSF AD en comparación con el control.
Tabla 1. Secuencia de Tau, descripción de vacuna y anticuerpo
Tabla 2. Análisis de hibridomas para la unión a la diana
Tabla 3. Afinidad de unión de los anticuerpos anti-Tau
Tabla 4. Descripción de los sujetos con AD usados para este estudio
ID del sujeto con AD
Sexo Edad al fallecimiento Edad al diagnóstico Duración de enfermedad la Etapa Braak de AD
AD 18
F 82 66 16 Braak V
AD 19
F 81 77 4 Braak V
AD 20
M 88 82 6 Braak V
AD 21
F 82 77 5 Braak VI
AD 22
M 62 49 13 Braak V
AD 23
F 76 65 11 Braak VI
AD 24
F 86 84 2 Braak V
AD 25
M 81 78 3 Braak V
AD 26
F 88 83 5 Braak V
AD 27
F 85 82 3 Braak V
Tabla 5. Aminoácidos Tau y fosforesiduos requeridos para la unión al anticuerpo.
Hibridoma
Anticuerpo Epítopo *
A4-2A1-18
ACl-35-2A1-Ab1 Tau aa 393-401, con requisito para pS396
A4-2A1-40
ACl-35-2A1-Ab2 Tau aa 393-401, con requisito para pS396
A4-4A6-18
ACl-35-4A6-Ab1 Tau aa 396-401, con requisito para pS396
A6-1D2-12
ACl-35-1D2-Ab1 Tau aa 394-400, con requisito para pS396
A6-2G5-08
ACl-35-2G5-Ab1 Tau aa 402-406, con requisito para pS404
A6-2G5-30
ACI-35-2G5-Ab2 Tau aa 393-400, con requisito para pS396
A6-2G5-41
ACI-35-2G5-Ab3 Tau aa 393-400, con requisito para pS396
*En función de la isoforma más larga de Tau humana (Tau441)
Tabla 6. Secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera (VH y VK) y las CDR
Tabla 7. Secuencia de nucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera (VH y VK)
Anticuerpo
Hibridoma VH VK
ACI-35-4A6-Ab1
A4-4A6-18
ACI-35-1D2-Ab1
A6-1D2-12
ACI-35-2A1-Ab1
A4-2A1-18
48 49 50
Anticuerpo
Hibridoma VH VK
ACI-35-2A1-Ab2
A4-2A1-40
ACI-35-4A6-Ab2
A4-4A6-48
ACI-35-2G5-Ab1
A6-2G5-08
Anticuerpo
Hibridoma VH VK
ACI-35-2G5-Ab2
A6-2G5-30
ACI-35-2G5-Ab3
A6-2G5-41
Tabla 8. Cebadores usados para secuenciamiento de CDR de regiones variables de anticuerpo
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
A4-4A648
IgG2b Cebadores VH 5' ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATGTTCTT 193
ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATGCTCTT 194
GGGAATTCATGGAATGCACCTGGGTTTTCCTCTT 137
GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTTTTCCTCTT 195
GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTT 196
GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 197
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATTCTCTT 151
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121
3' CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAGACGATGG 198
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGGATGG 199
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGATGG 200
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGGTGG 141
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGATGG 166
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144
Cebadores VK 5' ACTAGTCGACATGATGTACCCGGCTCAGTTTCTGGG 201
ACTAGTCGACATGAGGACTTCGATTCAGTTCTTGGG 202
ACTAGTCTACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 203
ACTAGTCGACATGAAGTTGTCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 204
ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A4-4A618
IgG2b Cebadores VH 5' ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 205
ATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRT 206
ATGGRATGGASCKKIRTCTTTMTCT 207
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
3' CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 208
Cebadores VK 5' ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 209
ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 210
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 211
ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT 212
ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG 213
ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 214
3' ACTGGATGGTGGGAAGATGGA 215
A6-1D212
IgG2a Cebadores VH 5' ATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT 216
ATGGRCAGRCTTACWTYYTCATTCCT 217
ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT 218
3' CCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG 208
Cebadores VK 5' ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT 219
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 209
ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT 210
ATGAGGRCCCCTGCTCAGVVTTYTTGGIVVTCTT 220
ATGGGCVVTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG 221
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 211
ATGGATTTVVCARGTGCAGATTVVTCAGCTT 212
ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG 213
ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG 214
3' ACTGGATGGTGGGAAGATGGA 215
A4-2A118
IgG2b Cebadores VH 5' GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATTCTCTT 136
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTTCTCTT 123
GGGAATTCATGGAATGCACCTGGGTTTTCCTCTT 137
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 138
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATCCTCTT 139
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124
ACTAGTCGACATGGGATGAGCTTATCATCCTCTT 140
3' CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGGTGG 141
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGGATAAACGGGTGG 142
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGGGTGG 134
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGACGGGTGG 143
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGATGG 145
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGGGATAAACGGGTGG 146
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACCGGTGG 147
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGGTGG 148
Cebadores VK 5' ACTAGTCGACATGGTGTCCACAGCTCAGTTCCTTG 149
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A4-2A140
IgG2b Cebadores VH 5' GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCATCCTCTT 139
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTCCTCTT 154
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTTCTCTT 155
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTT 127
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121
ACTAGTCGACATGGATGGAGCTTATCATCCTCTT 175
3' CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGTGG 176
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACCGGTGG 147
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGATGG 129
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGGGTGG 177
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGGGTGG 128
Cebadores VK 5' ACTAGTCGACATGAGGTACTCGGCTCAGTTCCTGGG 178
ACTAGTCGACATGAGGTCCCCGGCTCAGTTCCTGGG 179
ACTAGTCGACATGAGGACGTCGATTCAGTTCTTGGG 180
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A6-2G508
IgG2a Cebadores VH 5' GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTT 121
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCATTCTCTT 122
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTTCTCTT 123
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124
GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTCTTTTCTT 125
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTCCTCTT 126
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTTC 127
3' CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGGGTGG 128
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGATGG 129
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGTGG 130
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGATGG 131
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAGACGGGTGG 132
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAGATGATGG 133
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGGGTGG 134
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAAACGATGG 135
Cebadores 5' ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 50
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
VK
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A6-2G530
IgG2b Cebadores VH 5' GGGAATTCATGAAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 150
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATTCTCTT 151
GGGAATTTATGGAATGGAGCTGGGTCTTCCTCTT 152
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTTTCCTCTT 127
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTT 153
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTCCTCTT 154
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTTCTCTT 155
ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTT 156
ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTTATCATCTTCTT 157
ACTAGTCGACATGTAGATGTGGTTAAACTGGGT 158
3' CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGGGGATAAACGGATGG 159
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAAGGGATAGACGGATGG 160
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAGACGGGTGG 161
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAGACGGATGG 162
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGGATGG 163
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAATGGATAACGATGG 164
CCCAAGCTTCCAGGGGCCAGTGGATAAACGATGG 165
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACGGTGG 130
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGTGGATAAACGATGG 166
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAACGATGG 167
CCCAAGCTTCCAGGGACCATGGATAAACGGGTGG 168
Cebadores VK 5' ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACATACTCTGG 169
Subclon
Isotipo Ab Secuencias cebadoras SEQ ID NO
ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAGTCACATACTCTGG 170
ACTAGTCGACTGGGCATCAGATGAGTCACATACTCTGG 171
ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACAGACCCAGG 172
ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATTCTCTGG 173
ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATATTCAGG 174
CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
A6-2G541
IgG2b Cebadores VH 5' GGGAATTCATGGAATGGACCTGGGTCATCCTCTT 181
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTTTTCTCTT 120
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTTATCCTCTT 182
GGGAATTCATGGAATGGAGCTGGGTTATTCTCTT 124
GGGAATTCATGGAATGCAGCTGGGTCTTCCTCTT 126
GGGAATTCATGAATGGATCTGGGTTATTCTCTT 183
3' CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGGTGG 184
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGACGGGTGG 185
CCCAAGCTTCCAGGGACCAATGGATAAACAGATGG 186
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGATGG 144
CCCAAGCTTCCAGGGACCAGGGGATAAACGGATGG 145
CCCAAGCTTCCAGGGACCAAGGGATAAACGGGTGG 187
Cebadores VK 5' GGGAATTCATGGAGACACATTCCCAGGTCTTT 188
GGGAATTCATGGAGTCACAGTCTCAGGTCTTT 189
ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGGAGTCACATTTTCAGG 190
ACTAGTCGACATGGGCATCAAGATGAAGTCACATATTCAGG 191
ACTAGTCGACATGGGCTTCAAGATGAAGTCACATTCTCAGG 192
CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA 51
Subclon Isotipo Ab Secuencias cebadoras
SEQ ID NO
3' CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA
51
Codones degenerados: R = A o G S = C o G D = A o G o T
B = C o G o T
Y = C o T M = A o C H = A o C o T
K = G o T W = A o T V = A o G o C
Tabla 9. Isoforma más larga de Tau humana (441aa), también denominada Tau40
Isoforma más larga de Tau humana (441 aa), también denominada Tau40 (SEQ ID NO: 67)
Isoforma 2 de proteína Tau asociada a microtúbulos [Homo sapiens]
Secuencia de referencia de NCBI: NP_005901.2

Tabla 10. Las siguientes líneas celulares de hibridoma se depositaron a nombre de AC Immune SA, PSE-EPFL Edificio B, 1015 Lausana/Suiza y Katholieke Universiteit Leuven, Waaistraat 6 -Casilla 5105, 3000 Leuven/Bélgica en "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) en Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, según las disposiciones del Tratado de Budapest:
Depósitos:
Nombre de hibridoma
Número de depósito Fecha de depósito
A6-1 D2-12
DSM ACC3141 6 de septiembre de 2011
N.° de péptido
393 394 395 396 397 398 399 400
T3-Ala.A1
V Y K S P V V S
T3-Ala.A2
V Y K S(p) P V V S
T3-Ala.A3
A Y K S(p) P V V S
T3-Ala.A4
V A K S(p) P V V S
T3-Ala.A5
V Y A S(p) P V V S
T3-Ala.A6
V Y K A P V V S
T3-Ala.A7
V Y K S(p) A V V S
T3-Ala.A8
V Y K S(p) P A V S
T3-Ala.A9
V Y K S(p) P V A S
T3-Ala.A10
V Y K S(p) P V V A
Tabla 11C. Genoteca de péptido de sustitución de alanina (Ala) usada para mapeo de epítopo de anticuerpos específicos de pS404
N.° de péptido
400 401 402 403 404 405 406 407
T3-Ala.B1
S G D T S P R H
T3-Ala.B2
S G D T S(p) P R H
T3-Ala.B3
A G D T S(p) P R H
T3-Ala.B4
S A D T S(p) P R H
T3-Ala.B5
S G A T S(p) P R H
T3-Ala.B6
S G D A S(p) P R H
T3-Ala.B7
S G D T A P R H
T3-Ala.B8
S G D T S(p) A R H
T3-Ala.B9
S G D T S(p) P A H
T3-Ala.B10
S G D T S(p) P R A
Lista de referencia
5 Alonso A.D., et al. (1997), Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 94, 298-303 Alving et al.,(1992) Infect. Immun. 60:2438-2444 Asuni et al., (2007) J Neurosc. 27 (34), 9115-29 Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259) Braak H., et al. (1993), Eur.Neurol., 33, 403-408
10 Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003) Greenberg S.G., et al. (1992), J Biol.Chem., 267, 564-569. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612 Hodgson et al.,(1991) Bio/Technoloy, 9:421 Hoffmann R., et al (1997), Biochemistry, 36, 8114-8124.
15 Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991 Kennedy, J. H., et al., 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31) Khaw, B. A. et al. (1982) J. Nucl. Med. 23:1011-1019 Lewis et al., (2000) Nature Genetics, 25 :402-405 20 Masliah et al., (2005) Neuron, 46(6), 857-68 Masliah et al., (2011) PLoS ONE, Volume 6(4), e19338, pp-1-17 Muhs et al., (2007) Proc Natl Acad Sci USA, 104(23), 9810-5 Muyllaert et al, (2006) Rev Neurol, 162(10), 903-907
Muyllaert et al, (2008) Genes Brain Behav., Suppl. 1, 57-66 Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N. Y. (1989)) Nicolau et. al. (2002) Proc Natl. Acad. Sci USA 99, 2332-2337 Nicoll et al., (2003) Nature Med, 9, 448-452 Oddo et al., (2004) Neuron, 43, 321-332 Queen et al.,(1989) Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002) Reig S., et al. (1995), Acta Neuropathol., 90, 441-447 Ribe et al., (2005) Neurobiol Dis, 20(3), 814-22 Roberson et al, (2007) Science, 316 (5825), 750-4 Rosenmann et al., (2006) Arch Neurol, 63(10), 1459-67 Rousseaux et al. Methods Enzymology, (1986), Academic Press 121:663-69 Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 {Clin. Chim Acta 57:1-40 Terwel et al., (2006) J Biol Chem, 280, 3963-3973 Terwel et al, (2008) Am J pathol., 172(3), 786-98 Urushitiani et al., (2007) Proc. Natl Acad Sci USA, 104(79, 2495-500 Vandebroek et al., "Phosphorylation and Aggregation of Protein Tau in Humanized Yeast Cells and in Transgenic
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Patente de EE.UU. N.º 5,004,697
Lista de secuencias
5 <110> AC Immune S.A. Katholieke Universiteit Leuven
<120> COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
<130> 103112PC 10
<140>
<141> 2012-10-05
<150> EP 12 16 3319.2 15 <151> 2012-04-05
<150> PCT/EP2011/067604
<151> 2011-10-07 20 <160> 221
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1 25 <211> 115
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 30 <221> FUENTE
<222> 1..115
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 1 35
<210> 2
<211> 115 40 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 45 <222> 1..115
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 2
<210> 3
<211> 115 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..115
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 3
<210> 4
<211> 120
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..120 25 <223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 4
<210> 5
<211> 119 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..119
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 5
<210> 6
<211> 113
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..113 25 <223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 6
<210> 7
<211> 112
<212> PRT 5 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..112 10 <223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 7
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus 20
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..112
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 25
<400> 8
30 <210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..112
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
40 <400> 9
<210> 10
<211> 107 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..107
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 10
<210> 11
<211> 113
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..113 25 <223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 11
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..10
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..17
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 25
<400> 13
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..6
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 14
45 <210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..10
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
55 <400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..17
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 16
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus 15
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..11
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 20
<400> 17
25 <210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..10
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
35 <400> 18
<210> 19 40 <211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 45 <221> FUENTE
<222> 1..19
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<400> 19 50
<210> 20
<211> 8 55 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 60 <222> 1..8
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus 10
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..17
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 15
<400> 21
20 <210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..7
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
30 <400> 22
35 <210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
40 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..9
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
45 <400> 23
<210> 24 50 <211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 55 <221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 24 60
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..7
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 25
15 <210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..9
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
25 <400> 26
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 35 <221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 27
<210> 28
<211> 16 45 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 28
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..11
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 29
<210> 30 10 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 15 <221> FUENTE
<222> 1..7
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 30
<210> 31
<211> 9 25 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 30 <222> 1..9
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 31
<210> 32
<211> 17
<212> PRT 40 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..17 45 <223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 32
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus 55
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..7
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 60
<400> 33
<210> 34
<211> 9 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..9
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 34
<210> 35
<211> 345
<212> DNA 20 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..345 25 <223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 35
<210> 36
<211> 345
<212> DNA
<213> Mus musculus 35
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..345
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus" 40
<400> 36
45 <210> 37
<211> 345
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220> 5 <221> FUENTE
<222> 1..345
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 37 10
15 <210> 38
<211> 360
<212> DNA
<213> Mus musculus
20 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..360
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
25 <400> 38
<210> 39 30 <211> 357
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220> 35 <221> FUENTE
<222> 1..357
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 39 40
<210> 40
<211> 339 5 <212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..339
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 40
<210> 41
<211> 336
<212> DNA 20 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..336 25 <223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 41
30
<210> 42
<211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
35
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..336
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 42
<210> 43 10 <211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220> 15 <221> FUENTE
<222> 1..336
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 43 20
<210> 44
<211> 321 25 <212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 30 <222> 1..321
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 44
<210> 45
<211> 339
<212> DNA 40 <213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..339
<223> /tipo_mol="DNA" /organismo="Mus musculus"
<400> 45
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial 15
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..34
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial" 20
<400> 46
gggaattcat graatgsasc tgggtywtyc tctt 34
25 <210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
30 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..35
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
35 <220>
<221> variation
<222> 30..30
<223> /sustitución="n=i"
40 <400> 47
cccaagcttc cagggrccar kggataracn grtgg 35
<210> 48 45 <211> 32
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220> 50 <221> FUENTE
<222> 1..32
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 48
55 gggaattcat gragwcacak wcycaggtct tt 32
<210> 49
<211> 41
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..41
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 49
actagtcgac atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 41
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..39
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 50
actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 39
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..30
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 51
cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..36
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 52
actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt 36
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> secuencia artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..33
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="secuencia artificial"
<400> 53
gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..39
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 54
actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcct 39
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..33
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 55
actagtcgac atgaagwtgt ggbtraactg grt 33
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..39
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
<221> característica_misc
<222> 27..27
<223> /nota="n=i"
<400> 56
actagtcgac atggagwcag acacacnsct gytatgggt 39
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..37
<223> /tipo_mol="DNA" /nota="Descripción de la secuencia artificial: cebador" /organismo="Secuencia Artificial"
<400> 57
actagtcgac atggtyctya tvttrctgct gctatgg 37
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..30
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-37" /organismo="Secuencia Artificial"
10 <220>
<221> VARIANTE
<222> 18..18
<223> serina fosforilada
15 <220>
<221> VARIANTE
<222> 26..26
<223> serina fosforilada
20 <400> 58
<210> 59 25 <211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
30 <221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-33" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
35 <221> VARIANTE
<222> 14..14
<223> serina fosforilada
<400> 59 40
<210> 60
<211> 16 45 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221>
FUENTE 50 <222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-39" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
<221>
VARIANTE 55 <222> 7..7
<223> treonina fosforilada
<220>
<221>
VARIANTE 60 <222> 9..9
<223> serina fosforilada
<400> 60
5 <210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
10 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-39" /organismo="Secuencia Artificial"
15 <220>
<221> VARIANTE
<222> 7..7
<223> serina fosforilada
20 <220>
<221> VARIANTE
<222> 10..10
<223> treonina fosforilada
25 <400> 61
<210> 62 30 <211> 16
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
35 <221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-35" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
40 <221> VARIANTE
<222> 4..4
<223> serina fosforilada
<220>
45 <221> VARIANTE
<222> 12..12
<223> serina fosforilada
<400> 62 50
<210> 63
<211> 18 55 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> FUENTE 60 <222> 1..18
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-36" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
<221> VARIANTE
<222> 4..4
<223> serina fosforilada
5 <220>
<221> VARIANTE
<222> 9..9
<223> serina fosforilada
10 <400> 63
<210> 64 15 <211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
20 <221> FUENTE
<222> 1..17
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-34" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
25 <221> VARIANTE
<222> 3..3
<223> serina fosforilada
<220>
30 <221> VARIANTE
<222> 6..6
<223> treonina fosforilada
<220>
35 <221> VARIANTE
<222> 13..13
<223> treonina fosforilada
<220>
40 <221> VARIANTE
<222> 15..15
<223> serina fosforilada
<400> 64 45
<210> 65
<211> 12 50 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221>
FUENTE 55 <222> 1..12
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-42" /organismo="Secuencia Artificial"
<220>
<221>
VARIANTE 60 <222> 3..3
<223> serina fosforilada
<400> 65
5 <210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
10 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..10
<223> /tipo_mol="proteína" /nota="Descripción de la secuencia artificial: ACI-43" /organismo="Secuencia Artificial"
15 <220>
<221> VARIANTE
<222> 6..6
<223> serina fosforilada
20 <400> 66
<210> 67 25 <211> 441
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> 30 <221> FUENTE
<222> 1..441
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Homo sapiens"
<400> 67 35
<210> 68 5 <211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 10 <221> FUENTE
<222> 1..117
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 68 15
<210> 69
<211> 112 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 10 <222> 1..112
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 69
<210> 70 20 <211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 25 <221> FUENTE
<222> 1..10
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 70 30
<210> 71
<211> 17 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 40 <222> 1..17
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 71
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus 10
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..8
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 15
<400> 72
20 <210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..16
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
30 <400> 73
<210> 74 35 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 40 <221> FUENTE
<222> 1..7
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 74
<210> 75
<211> 9 50 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> FUENTE 55 <222> 1..9
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
<400> 75
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus 5
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..119
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 10
<400> 76
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus 20
<220>
<221> FUENTE
<222> 1..112
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus" 25
<400> 77
30 <210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <220>
<221> FUENTE
<222> 1..12
<223> /tipo_mol="proteína" /organismo="Mus musculus"
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<221> FUENTE
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<212> DNA
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<221> FUENTE
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<212> DNA
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<221> FUENTE
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<212> DNA
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<212> DNA
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<221> FUENTE
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<212> DNA
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<220>
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25 <220>
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20 <220>
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25 <400> 221
atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en la proteína Tau de mamífero o a un fosfoepítopo en un fragmento de la proteína Tau de mamífero, en donde dicho fosfoepítopo tiene o está comprendida en la secuencia de aminoácidos VYKSPVVSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau aa 393-408 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404), en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble con una constante de disociación en un intervalo de entre 2 nM y 80 nM, y una constante de velocidad de asociación en un intervalo de entre 1,6 x 102 y 5 x 105 y puede detectar y/o modular los niveles de Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble in vivo y en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
    una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 108, y una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 91.
    2 El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una constante de disociación inferior a 10 nM.
  2. 3.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
  3. 4.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es del isotipo IgG2b, IgG2a o IgG3.
  4. 5.
    Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  5. 6.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una combinación de las mismas, en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
  6. 7.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, un polinucleótido o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una combinación de las mismas, para su uso en terapia, particularmente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo, tal como una Tauopatía en un mamífero, particularmente un humano que necesita dicho tratamiento.
  7. 8.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o composición farmacéutica, o una combinación de los mismos, para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 para el tratamiento o alivio de déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano que padece dicho déficit, y opcionalmente: (i) donde el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano, conlleva la interrupción del avance de los déficits cognitivos, o (ii) donde el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un humano, conlleva un aumento de la retención, particularmente una restitución completa de la capacidad de memoria cognitiva en el sujeto tratado.
  8. 9.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o composición farmacéutica, o una combinación de los mismos, para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 para el tratamiento de enfermedades y trastornos provocados por o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la Tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos que incluyen enfermedades o trastornos que muestran la presencia tanto de patologías Tau como amiloide que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión y angiopatía amiloide cerebral de proteínas priónicas, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide característica que incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismodemencia de Guam, enfermedad neuronal motora no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia argirofílica granulosa, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, demencia frontotemporal, enfermedad de Hallervorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia de ovillos neurofibrilares predominantes, parkinsonismo posencefálico y distrofia miotónica.
  9. 10.
    Un método in vitro para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau o una predisposición a enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína Tau en una muestra, que comprende las etapas de:
    a.
    hacer que la muestra que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con el anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
    b.
    permitir que el anticuerpo se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
    c.
    detectar la formación del complejo inmunológico; y
    d.
    correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la muestra,
    donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
  10. 11.
    El método de la reivindicación 10, en donde los multímeros fosfoTau (pTau) se detectan en una muestra postmortem de un sujeto que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno asociado con Tau.
  11. 12.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en donde la muestra es una muestra de fluido cerebroespinal o una muestra de cerebro.
  12. 13.
    El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una combinación de las mismas, para su uso en un método in vivo para el diagnóstico de una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau o una predisposición a una enfermedad, trastorno o afección asociados con la proteína Tau en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína Tau en una parte o área corporal específica que comprende las etapas de:
    a.
    hacer que la parte o área corporal que se sospecha que contiene el antígeno Tau entre en contacto con el anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína Tau;
    b.
    permitir que el anticuerpo se una al antígeno Tau para formar un complejo inmunológico;
    c.
    detectar la formación del complejo inmunológico; y
    d.
    correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno Tau en la parte o área corporal específica,
    en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad o afección asociada con la proteína Tau.
  13. 14.
    Los kits de prueba para la detección y el diagnóstico de enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la proteína Tau que comprenden el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  14. 15.
    Una línea celular que produce el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  15. 16.
    La línea celular de la reivindicación 15, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3137; línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto de 2011 como DSM ACC3138.
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