CN102070718A - 人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10多克隆抗体 - Google Patents

Abstract

人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10多克隆抗体。属于传染病诊断与研究领域。因外显子自身表达蛋白后相对分子质量较小，均为3KD，难于分离和纯化，同时难以保证其免疫原性。针对上述问题，申请人在表达和免疫时采用融合了谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白。而在后期的抗体纯化过程中，采用亲和层析法成功地将GST抗体组分除掉，从而获得了特异性强、效价高的鼠源和兔源的抗人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10的多克隆抗体。为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究及不同tau蛋白异构体分布和对疾病的作用机制研究提供了基础。本发明中的抗体可制成试剂盒，用于疾病的诊断。

Description

人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10多克隆抗体

技术领域：

传染病的诊断与研究。

背景技术：

tau是一组微管蛋白相关蛋白(Microtubule-associated protein，MAP)，由人17号染色体上的基因共同编码。由于转录后的mRNA剪切方式不同，成人脑中存在6种tau蛋白的异构体，大小从352-441个氨基酸不等，由C末端含3个或4个重复序列(是否含外显子10)，以及N末端有0个、1个(外显子2)或2个(外显子2及外显子3)插入序列的0N-tau、1N-tau或2N-tau组合而成。

tau蛋白大多存在于神经元细胞中，也存在于一些少突胶质细胞和星形胶质细胞中。tau蛋白参与了许多神经退行性疾病的发生发展过程，如阿尔氏海默病(Alzheimer disease，AD)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森病(Frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17，FTPD-17)、皮克病(Pick’s disease，PD)、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration，CBD)、进行性核上瘫(Progressivesupranuclear palsy，PSP)，以及克雅氏病(CJD)和吉斯综合症(GSS)等可传播性海绵样脑病(TSEs)。

发明内容：

本发明的目的是制备人微管相关蛋白tau外显子2(E2)、外显子3(E2)、外显子10(E2)特异性多克隆抗体。

因外显子自身表达蛋白后相对分子质量较小，均为3KD，难于分离和纯化，同时难以保证其免疫原性。故针对上述问题，申请人在表达和免疫时采用融合了谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白。而在后期的抗体纯化过程中，采用亲和层析法成功地将GST抗体组分除掉，经蛋白免疫印迹试验和间接酶联免疫吸附试验证实获得了特异性强，效价高的抗人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10的多克隆抗体，并且此制备的多克隆抗体在对重组tau蛋白各异构体的检测中能够得到较好的应用。

附图说明：

图1十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定纯化后的蛋白纯度

泳道1：标准蛋白；泳道2：融合蛋白GST-E2；泳道3：融合蛋白GST-E3；泳道4：融合蛋白GST-E10；泳道5：对照GST蛋白

图2蛋白免疫印迹(WesternBlot)方法鉴定纯化后蛋白

泳道1：融合蛋白GST-E2；泳道2：融合蛋白GST-E3；泳道3：融合蛋白GST-E10；泳道4：对照GST蛋白

图3间接酶联免疫吸附试验法测定兔源、鼠源多克隆抗体的效价

图4蛋白免疫印迹法(WesternBlot)鉴定纯化后的人tau各外显子抗体的特异性

泳道1：GST-E2；泳道2：GST-E3；泳道3：GST-E10；泳道4：GST蛋白，各抗体见图上方。

图5蛋白免疫印迹法(WesternBlot)鉴定所制备抗体的应用情况

具体实施例1

免疫原的制备

由于外显子自身表达蛋白后相对分子质量较小，均为3千道尔顿(KD)，难于分离和纯化，同时难以保证其免疫原性，故申请人在表达和免疫时融合了谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白。

发明结果显示在大肠埃希菌中以可溶形式表达出目的蛋白，并利用亲和层析的纯化方法纯化出人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10重组融合蛋白GST-E2、GST-E3及GST-E10，相对分子质量约为29KD(图1、2)。

1人tau外显子2、3、10原核载体的构建

以人外周血DNA为模板，PCR扩增获得人tau蛋白外显子2、3及10序列。所用引物包括外显子2上游引物：CGGGATCCGAATCTCCCCTGCAGACCC，外显子2下游引物：CGGAATTCTCATTCCGCTGTTGGAGTGCTC  ，外显子3上游引物：CGGGATCCGATGTGACAGCACCCTTAG  ，外显子3下游引物：CGGAATTCTCATGTGGTTCCTTCTGGGATCTCC  ，外显子10上游引物：CGGGATCCGTGCAGATAATTAATAAGAATC  ，外显子10下游引物：CGGGATCCGTGCAGATAATTAATAAGAAGC，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括EcoRI酶切位点。PCR反应条件为94℃3min、94℃1min、55℃30sec、72℃1min和72℃10min，循环30次。PCR扩增产物分别克隆至pMD-18T克隆载体，经测序鉴定正确后，用BamHI及EcoRI游离克隆产物，亚克隆至原核表达载体pGEX-2T，构成重组质粒pGEX-2T-E2、pGEX-2T-E3及pGEX-2T-E10。

2人tau蛋白外显子融合蛋白GST-E2、GST-E3、GST-E10的表达、纯化及鉴定

将转化重组质粒pGEX-2T-E2、E3、E10的工程菌常规活化后按1∶100接种入100ml Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃剧烈振摇培养至光密度值600(OD₆₀₀)＝0.5-0.7时，分别选取不同诱导时间(2h、3h、4h)，不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(1mM、0.5mM、0.1mM、)，不同诱导温度(37℃、30℃、25℃)，以摸索最佳表达条件，而后离心收菌重悬于5ml PBS(加入100μlTriton X-100)中，冰浴下超声破菌(功率400W，25次，每次10sec，间隔10sec)，12,000rpm 4℃离心10min后分离上清和沉淀。沉淀用500μl磷酸盐缓冲液(PBS)重悬。分别取上清和沉淀各20μl，按比例加入5×蛋白加样缓冲液，100℃变性5min，进行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定蛋白的表达形式，结果见图1。

取2ml 50％的谷胱甘肽琼脂糖4B(Glutathoine Sepharose 4B)柱至离心管中，4,000rpm离心5min，弃上清。再用5倍体积的PBS缓冲液洗两次，备用。将预处理好的Glutathoine Sepharose 4B加至待纯化样品中，在摇床上振摇4h，使融合蛋白与亲和填料充分结合。亲和吸附结束后4,000rpm离心5min，收集Glutathoine Sepharose 4B并转移至5ml离心管中；然后加入2倍体积洗涤缓冲液室温下振摇5min，4,000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤15次；最后加入2倍体积的洗脱缓冲液，室温下振摇10min，4,000rpm离心5min，收集洗脱液上清，并再次洗脱，重复洗脱约10次，分别收集洗脱液上清。将每次洗脱的蛋白各取20μl，按比例与5×蛋白加样缓冲液混和，100℃变性10min，进行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离，考马斯亮蓝染色，观察纯化情况。把纯化的蛋白溶液置于透析袋中，在无菌的PBS中，4℃透析过夜。

将每次洗脱的蛋白各取20μl，按比例与5×Loading buffer混合，100℃变性5min，进行12％SDS-PAGE电泳分离，60mA电流通电1h将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶封闭膜2h，一抗(鼠源抗GST单克隆抗体，工作浓度1∶4,000，用5％脱脂奶稀释)37℃作用2h，用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3次×5min，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，工作浓度1∶5,000，用5％脱脂奶稀释)37℃作用1h，充分洗涤后用增强化学显色(ECL)法显色，结果见图2。

具体实施例2

免疫程序

将经纯化的GST-E2、GST-E3、GST-E10融合蛋白与等量的弗氏完全佐剂混和乳化，分别免疫新西兰大白兔及Balb/c小鼠。兔分4点背部皮下注射，每只兔抗原注射量约800μg，浓度1.0mg/ml；Balb/c小鼠腹部皮下多点注射，每只鼠抗原注射量约100μg，浓度0.5mg/ml。首次免疫14d后，将等量抗原与弗氏不完全佐剂混和乳化进行加强免疫，每间隔1周进行1次，共四次。加强免疫时，每只兔抗原注射量约500μg，浓度1.0mg/ml；每只鼠抗原注射量约80μg，浓度0.5mg/ml。最后1次加强免疫3d后，兔采取颈动脉放血，Balb/c小鼠采取心脏取血，分离血清，加入0.1％叠氮钠，-20℃冻存。

具体实施例3

多克隆抗体的纯化及滴度测定

1利用蛋白A(Protein A)对多克隆抗体的纯化

用2～5倍柱体积的磷酸盐缓冲液(PBS)平衡Protein G柱，将鼠源抗血清用PBS稀释后与平衡后的ProteinG柱结合。然后用5-10倍的洗涤液(150mmol/L氯化钠、2mmol/L乙二胺四乙酸、磷酸盐缓冲液，pH7.0)进行洗涤，用适当体积的洗脱液(100mmol/L甘氨酸，pH2.7)进行洗脱。洗脱出的液体用中和液(1mol/L盐酸三羟甲基氨基甲烷，pH9.0)进行中和，使pH值为7.0。

根据西格玛(SIGMA)试剂盒说明书的要求，用10倍柱体积的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液将脱盐(Desalting)柱平衡，用10倍柱体积的绑定缓冲液平衡ProteinA柱，再将ProteinA柱与脱盐(Desalting)柱连接，将兔源抗血清用绑定缓冲液稀释后与平衡后的Protein A柱结合。然后用10倍的绑定缓冲液进行洗涤，用5倍体积的洗脱液进行洗脱。洗脱出的液体即为pH值7.0纯化后的IgG。所用的磷酸盐缓冲液、洗涤液及洗脱液均用0.45μm滤器过滤后使用。对纯化后的抗体分别命名为GR2、GR3、GM2、GM3、GM10。

2抗体中GST组分的去除

(1)填料的准备：将溴化氰活化的琼脂糖4B(CNBr-activated Sepharose 4B)干粉用1mM盐酸溶解成填料备用(1g干粉可溶解成3.5ml填料)。

(2)抗原(蛋白)偶联：用偶联缓冲液(0.1M碳酸氢钠、0.5M氯化钠、pH8.3)溶解GST蛋白(每mL填料可结合5-10mg蛋白)，并将混合好的偶联缓冲液与填料混合，一般室温1h或4℃过夜，温和阵摇，勿用转子剧烈摇动，这样会破坏琼脂糖珠子，大大降低偶联效果。

(3)用5倍体积偶联缓冲液冲洗偶联后的填料，将多余未偶联的蛋白洗掉。

(4)加入0.1M盐酸三羟甲基氨基甲烷，pH8.0封闭多余活性位点。

(5)用5倍柱体积的不同pH值洗液清洗偶联后的填料，至少三次循环(0.1M乙酸钠，0.5M氯化钠，pH4.0/0.1M盐酸三羟甲基氨基甲烷，0.5M氯化钠，pH8.0)。

(6)向偶联好的填料中加入ProteinA纯化后的抗体(小于1/2柱床体积)，室温1h或4℃过夜，使填料中的GST蛋白与抗体中的抗性部分充分反应。2100rpm，离心3min，即为纯化后的抗体。分别命名为R2c、R3c、M2c、M3c、M10c。

3纯化后抗体的滴度测定

(1)抗体的敏感性检测

应用间接酶联免疫吸附试验方法对纯化后抗体的敏感性进行检测。经包被液稀释后的GST-E2、GST-E3、GST-E10融合蛋白及GST蛋白(约200ng/孔)加入酶标板，4℃包被过夜；5％脱脂奶37℃封闭4h；将待测孔分别加入含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液倍比稀释纯化后的抗体，用相应的免疫前兔血清作阴性对照，PBS作空白对照，37℃2h；分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶16,000稀释)，37℃1h；TMB显色，2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪测定(A_450nm)OD值，结果见图3。

(2)抗体的特异性检测

应用蛋白免疫印迹(Western Blot)方法对纯化后抗体的特异性进行检测。将GST-E2、GST-E3、GST-E10融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转至硝酸纤维滤膜上，5％脱脂奶封闭膜1h。一抗(1∶1,000稀释的纯化后多克隆抗体)37℃作用2h，二抗(1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)37℃作用1h，充分洗涤后用ECL法显色，结果见图4。

具体实施例4

多克隆抗体GR₂、GR₃、GM₂、GM₃、GM₁₀的应用效果试验

应用蛋白免疫印迹(Western Blot)方法对纯化后抗体的特异性进行检测。将重组tau蛋白各异构体(含HIS标签)经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转至硝酸纤维滤膜上，5％脱脂奶封闭膜1h。一抗(1∶1,000稀释的纯化后多克隆抗体)37℃作用2h，二抗(1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)37℃作用1h，充分洗涤后用ECL法显色，结果见图5。

通过对重组的六种人tau异构体的蛋白免疫印迹试验来看，制备的多克隆抗体能够较好的识别含有相应外显子的重组异构体蛋白，而不识别不含有相应外显子的重组异构体蛋白。可知本发明的多克隆抗体特异性较好，能够应用于传染病的诊断和研究。

Claims (3)

1.免疫原：三种融合蛋白GST-E2、GST-E3、GST-E10。GST-E2代表GST蛋白与具有人tau蛋白外显子2氨基酸序列的E2融合表达的重组蛋白；GST-E3代表GST蛋白与具有人tau蛋白外显子3氨基酸序列的E3融合表达的重组蛋白；GST-E10代表GST蛋白与具有人tau蛋白外显子10氨基酸序列的E10融合表达的重组蛋白。

2.多克隆抗体：五种特异性抗人tau蛋白外显子2、外显子3和外显子10的鼠源和兔源多克隆抗体。

3.免疫原及多克隆抗体的制备和纯化方法。

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