KR102485568B1 - 신규한 알츠하이머 모델, 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

알츠하이머병은 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 타우 단백질 과인산화가주요 원인인 것으로 알려져 있다. 그러나 알츠하이머병을 온전하게 구현할 수 있는 세포모델, 및 동물모델이 부재하여 치료 후보약물의 스크리닝 및 연구에 한계가 있는 실정이다.
본 발명은 신규한 알츠하이머 모델에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질로 처리된 신경 세포 모델에 관한 것이다. 상기 세포는 알츠하이머병의 특징을 그대로 구현 가능하므로 알츠하이머병의 치료제 개발을 위한 신규한 약물 스크리닝 플랫폼으로서 활발하게 이용 가능할 것으로 기대된다.

Description

신규한 알츠하이머 모델, 및 이의 제조 방법{Novel Alzheimer's model and a manufacturing method for thereof}

본 발명은 신규한 알츠하이머 모델, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병은 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 1907년 독일의 정신과 의사인 알로이스 알츠하이머(Alois　Alzheimer) 박사에 의해 최초로 보고되었다. 알츠하이머병은 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과가 특징적이다. 초기에는 주로 최근 일에 대한 기억력에서 문제를 보이다가 진행하면서 언어기능이나 판단력 등 다른 여러 인지기능의 이상을 동반하게 되다가 결국에는 모든 일상 생활 기능을 상실하게 된다. 최근 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균수명이 늘어나고, 뇌졸중, 알츠하이머 질환(AD), 파킨슨 병 등의 노인성 신경계 질환들이 증가하고 있으나, 그 중 가장 흔하게 나타나고 있는 것이 알츠하이머병이다.

알츠하이머병은 베타 아밀로이드(beta-amyloid)라는 작은 단백질이 과도하게 만들어져 뇌에 침착되면서 뇌 세포에 유해한 영향을 주는 것이 발병의 핵심 기전인 것으로 보인다. 이외에도, 뇌 세포의 골격 유지에 중요한 역할을 하는 타우 단백질(tau　protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상 등도 뇌 세포 손상에 기여하여 발병에 영향을 미치는 것으로 연구되었다. 대표적인 뇌 병리 소견인 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 관련되며, 신경섬유다발은 타우 단백질 과인산화와 연관이 있다.

알츠하이머병의 근본적인 치료방법은 아직 개발되지 않았으며, 아세틸콜린 분해효소 억제제와 같이 증상을 완화시키고 진행을 지연시킬 수 있는 약물이 임상현장에서 사용되고 있을 뿐이다. 따라서 알츠하이머병의 근본적인 치료법을 찾기 위한 연구가 매우 활발하게 시도되고 있으나, 알츠하이머병을 온전하게 구현할 수 있는 세포모델, 및 동물모델이 부재하여 치료 후보약물의 스크리닝 및 연구에 한계가 있는 실정이다.

따라서 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 각고의 노력을 지속한 끝에 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명은 신규한 알츠하이머 모델에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질로 처리된 신경 세포 모델에 관한 것이다. 상기 세포는 알츠하이머병의 특징을 그대로 구현 가능하므로 알츠하이머병의 치료제 개발을 위한 신규한 약물 스크리닝 플랫폼으로서 활발하게 이용 가능할 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 신규한 알츠하이머 모델, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 퇴행성 신경질환이란, 광의로는 신경세포(nerve cell)가 퇴행하는 병태 전부를 포함하지만, 일반적으로는 뇌혈관장해, 외상, 대사이상 등 뚜렷한 신경계세포 외의 요인이 될 수 있는 것은 포함하지 않는다. 알츠하이머병(Altzheimer Disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성측색경화증, 헌팅턴무도병(Huntingtons disease)을 포함하는 폴리글루타민병, 프리온질병(human prion dis-ease) 등을 포함한다. 현대 의학에서 명확한 발전 원인이나 치료 방법에 대한 이해가 부족한 실적이다.

본 발명의 일 구체예에서 알츠하이머병이란, 상기 퇴행성 신경질환의 일종으로서 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 1907년 독일의 정신과 의사인 알로이스 알츠하이머(Alois　Alzheimer) 박사에 의해 최초로 보고되었다. 알츠하이머병은 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과가 특징적이다. 초기에는 주로 최근 일에 대한 기억력에서 문제를 보이다가 진행하면서 언어기능이나 판단력 등 다른 여러 인지기능의 이상을 동반하게 되다가 결국에는 모든 일상 생활 기능을 상실하게 된다. 최근 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균수명이 늘어나고, 뇌졸중, 알츠하이머 질환(AD), 파킨슨 병 등의 노인성 신경계 질환들이 증가하고 있으나, 그 중 가장 흔하게 나타나고 있는 것이 알츠하이머병이다.

알츠하이머병은 베타 아밀로이드(beta-amyloid)라는 작은 단백질이 과도하게 만들어져 뇌에 침착되면서 뇌 세포에 유해한 영향을 주는 것이 발병의 핵심 기전인 것으로 보인다. 이외에도, 뇌 세포의 골격 유지에 중요한 역할을 하는 타우 단백질(tau　protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상 등도 뇌 세포 손상에 기여하여 발병에 영향을 미치는 것으로 연구되었다. 대표적인 뇌 병리 소견인 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 관련되며, 신경섬유다발은 타우 단백질 과인산화와 연관이 있다.

알츠하이머병의 근본적인 치료방법은 아직 개발되지 않았으며, 아세틸콜린 분해효소 억제제와 같이 증상을 완화시키고 진행을 지연시킬 수 있는 약물이 임상현장에서 사용되고 있을 뿐이다. 따라서 알츠하이머병의 근본적인 치료법을 찾기 위한 연구가 매우 활발하게 시도되고 있으나, 알츠하이머병을 온전하게 구현할 수 있는 세포모델, 및 동물모델이 부재하여 치료 후보약물의 스크리닝 및 연구에 한계가 있는 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 타우(Tau) 단백질이란, 분자량이 50,000~70,000을 나타내는 미소관결합단백질(microtubule associated protein)의 일종으로, 미세소관을 결합시키고 붕괴를 막아 신경세포의 안정성을 유지하는 기능을 수행하는 단백질이다. 뇌신경 세포 내의 비정상적인 타우 단백질(tau)의 응집은 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD) 및 다른 여러 신경퇴행성 질병들 (집합적으로, 타우병증(tauopathies)이라 부름)에 있어서 주된 특징이다 (Biochimica et Biophysica Acta, 01 Jan 2005, 1739(2-3):331-354). 건강한 신경에서, 타우는 축색돌기(axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화(polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관(microtubules)을 안정화한다. 병리학적으로 과인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성한다(Mol Neurodegeneration 4, 13 (2009). https://doi.org/10.1186/1750-1326-4-13). 여러 해에 걸쳐서, 타우 응집에 대한 구조적 골격이 제안된 바 있으며, 10개의 가용성 모노머들로부터 불용성 필라멘트가 형성되고, 이러한 필라멘트가 신경섬유매듭(neurofibrillary tangles, NFTs)이라 불리우는 고차원 구조로 결합된다는 증거들이 제안된 바 있다. 그러나, 아직까지도 타우병증에 있어서 신경섬유매듭들의 병리생리학적 중요성, 이러한 과정을 유발하는 원인 및 분자적 메카니즘에 대해서는 그다지 알려진 바가 없는데, 이는 생리학적 조건 하에서 타우 응집을 연구하기 위한 신뢰성 있는 모델이 존재하지 않는다는 점 때문이다. 이러한 연유로, 타우 응집으로 인한 알츠하이머병의 특징을 구현하는 세포 모델, 또는 동물 모델의 필요성이 증가되고 있는 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 가이드 단백질(guide peptide)이란, 타겟하는 단백질의 N-터미널(N-terminal)에 결합되어 타겟 단백질의 기능이 과발현되거나 또는 억제되도록 유도하는 단백질을 의미한다. 따라서 가이드 단백질과 타겟 단백질이 결합된 융합 단백질의 측면에서 가이드 단백질의 C-터미널에 타겟 단백질이 위치하며, 가이드 단백질과 타겟 단백질 사이에 링커(linker) 등이 위치할 수 있다. 상기 방향성은 본 발명에서 기대하는 가이드 단백질의 기능에 중요한 요소로 작용한다. 예를 들어, 본 발명의 도 1에서와 같이, 타겟 단백질(Tau-4R)의 N-터미널에 결합된 HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), GST(glutathione Stransferase), FD(T4 fibritin foldon domain), DDT(D-dopachrome tautomerase), SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein), CDA(human cytidine deaminase), NPM(nucleophosmin 1), HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication), HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform) 등을 가이드 단백질로 이용할 수 있다. 상기의 타겟 단백질이란 퇴행성 신경질환 진행에 관여하는 단백질이면 모두 가능하고, 이에 제한하는 것은 아니나, Tau, Aβ, 또는 apoE인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 Tau, Aβ₄₀, Aβ₄₂, apoE2, apoE3, apoE4, 또는 apoJ인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에서 가이드 올리고머화(guided oligomerization; GO)란, 가용성 및 생물 활성 구조의 임의의 병원성 단백질, 또는 펩티드의 올리고머 컨포머 세트를 제조하는 방법으로, 상기의 가이드 단백질과 결합된 상태의 타겟 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및 육량체를 포함한다. 이를 올리고머 컨포머 세트라 칭한다. 상기 올리고머 컨포머 세트는 박테리아, 효모, 곤충 및 포유 동물 세포를 이용하는 임의의 발현 시스템을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 약물 스크리닝 플랫폼이란, 본 발명의 가이드 올리고머화 컨포머 세트를 이용하여 타겟 질병의 치료 효과가 예상되는 후보 약물의 스크리닝을 수행하는 시스템을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질을 제공하고, 상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 융합단백질을 제공하며, 상기 가이드 단백질은 HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), GST(glutathione Stransferase), FD(T4 fibritin foldon domain), DDT(D-dopachrome tautomerase), SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein), CDA(human cytidine deaminase), NPM(nucleophosmin 1), HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication), 및 HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 융합단백질을 제공하며, 상기 융합단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체 입체 구조인 것인 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하고, 상기 형질전환체는 개체로부터 분리된 세포인 것인 형질전환체를 제공하며, 상기 형질전환체는 인간을 제외한 개체인 것인 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질을 제조하는 단계; 및, (b) 상기 융합단백질을 신경 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 알츠하이머병 세포 모델의 제조방법을 제공하고, 상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 알츠하이머병 세포 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 가이드 단백질은 HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), GST(glutathione Stransferase), FD(T4 fibritin foldon domain), DDT(D-dopachrome tautomerase), SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein), CDA(human cytidine deaminase), NPM(nucleophosmin 1), HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication), 및 HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인,알츠하이머병 세포 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 융합단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체 입체 구조인 것인 알츠하이머병 세포 모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질을 제조하는 단계; (b) 상기 융합단백질을 신경 세포에 처리하는 단계; 및, (c) 상기 신경 세포에 알츠하이머병 치료용 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 가이드 단백질은 HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), GST(glutathione Stransferase), FD(T4 fibritin foldon domain), DDT(D-dopachrome tautomerase), SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein), CDA(human cytidine deaminase), NPM(nucleophosmin 1), HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication), 및 HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 융합단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 육량체 입체 구조인 것인 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질로 처리된 신경 세포 모델에 관한 것이다. 상기 세포는 알츠하이머병의 특징을 그대로 구현 가능하므로 알츠하이머병의 치료제 개발을 위한 신규한 약물 스크리닝 플랫폼으로서 활발하게 이용 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, Tau-4R에 대하여 가이드 올리고머화를 적용하여 제조한 올리고머 세트의 모식도이다. 도 1에서 Tau-4R(회색)은 N 터미널의 가이드 펩티드(흰색) 및 트롬빈 절단 부위(검정)를 포함하는 스페이서 펩티드와 연결된 재조합 단백질로 표현된다. 가이드 펩타이드의 올리고머 구조 및 Tau-4R과의 융합 구조로서 DA / DB는 이량체, TA / TB / TC는 삼량체, QA는 사량체, PA는 오량체, HA / HB는 육량체이고, Mw(kDa)는 융합 구조로서 올리고머의 크기이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 세트 인큐베이션 없이(A), 또는 인큐베이션과 함께(B) SDS-PAGE에서 확인한 결과이다. 도 2에서 M은 molecular weight standard, 1번 레인은 M-4R (monomeric Tau-4R), 2번 레인은 DA-4R, 3번 레인은 DB-4R, 4번 레인은 TA-4R, 5번 레인은 TB-4R, 6번 레인은 DA-4R, 7번 레인은 PA-4R, 8번 레인은 HA-4R이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 세트를 SH-SY5Y 세포를 대상으로 독성 시험한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 세트를 마우스 배아로부터 유도된 해마 신경세포에 처리한 후, 세포의 형태를 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 세트를 마우스 배아로부터 유도된 해마 신경세포에 처리한 후, 세포 독성을 시험한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 삼량체 TA-4R와 TB-4R을 마우스 배아로부터 유도된 해마 신경세포에 농도별 트롬빈과 함께 공동 처리한 후, 세포의 형태를 관찰한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 삼량체 TA-4R와 TB-4R을 마우스 배아로부터 유도된 해마 신경세포에 농도별 트롬빈과 함께 공동 처리한 후, 세포 독성을 시험한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 제조된 올리고머 삼량체(TB-4R), 사량체(QA-4R), 또는 오량체(PA-4R)의 LC50 값을 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 타우 단백질의 가이드 올리고머화(guided oligomerization; GO) 세트 제조

서열번호 1로 표시되는 전장 타우는 N-말단 프로젝션 도메인(N-terminal projection domain, aa1-165), 프롤린이 풍부한 영역(proline-rich region, aa166-242), MT 결합 영역(MT binding region; MTBR, aa243-367) 및 C-터미널 도메인(C-terminal domain, aa368-441)으로 구성되고, Tau-4R이라고도 명명되는 MT 결합 영역(MTBR)은 R1 (aa243-273), R2 (aa274-304), R3 (aa305-335) 및 R4 (aa336-367)라는 부분적으로 반복되는 4 개의 시퀀스를 포함한다. 상기의 Tau-4R은 β- 가닥을 형성하는 경향이 있어, 타우 응집의 원인으로 지목된다(J Neurosci, 2008. 28(3): p. 737-48.).

상기 Tau-4R에 대하여 가이드 올리고머화(guided oligomerization; GO)를 적용하여 도 1에 기재된 올리고머 세트를 제조하였다. 보다 구체적으로, 표적은 N-말단 부분이 가이드 펩티드 및 프로테아제인 트롬빈에 의해 인식되고 절단되는 짧은 스트레치 아미노산으로 구성된 융합 구조로 표현된다. 가이드 펩티드의 상세한 서열 정보 및 아미노산 위치는 표 1에 나타내었다.

Targets & Guide Peptide	GenBank Accession No.	AA position
Tau-4R	NM_001123066.2(서열번호 2)	255-441
HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)	NM_004712.3(서열번호 3)	1-221
GST(glutathione Stransferase)	AAA72682.1(서열번호 4)	1-228
FD(T4 fibritin foldon domain)	NC_000866(서열번호 5)	457-483
DDT(D-dopachrome tautomerase)	NM_001084392.1(서열번호 6)	1-118
SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein)	AF252861.1(서열번호 7)	106-256
CDA(human cytidine deaminase)	NM_001785.2(서열번호 8)	1-146
NPM(nucleophosmin 1)	NM_002520.6(서열번호 9)	1-122
HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication)	EU569043.1(서열번호 10)	1-102
HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform)	NM_005348.2(서열번호 11)	293-732

상기 제조된 올리고머 세트 각 4 ㎍을 4-20 % 농도 구배(gradient) SDS-PAGE 젤에서 인큐베이션 없이, 또는 95℃에서 5분간 인큐베이션과 함께 확인하고, 단백질은 코마시 블루로 염색하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 실험 결과, Tau-4R의 안정적으로 유지되는 올리고머 구조들, 즉 삼량체, 사량체, 오량체 및 육량체는 열처리되지 않았을 때 SDS-PAGE 젤에서 상대적으로 더 천천히 이동하였다. 그러나 모든 올리고머 구조가 안정적으로 유지되는 것은 아니었다. 이량체로서 DA-4R (레인 2), DB-4R (레인 3), 및 삼량체로서 TB-4R (글루타티온 S- 트랜스퍼 라제) (레인 5)는 SDS-PAGE 젤을 이동하는 동안 올리고머로서의 정체성을 유지하기에 충분히 안정화되지 못한 것으로 나타났다. 반면, TA-4R (레인 4), QA-4R (레인 6), PA-4R (레인 7) 및 HA-4R (레인 8)은 SDS-PAGE에서 올리고머 상태를 우수하게 유지하였다.

실시예 2. 타우 단백질 올리고머 세트의 세포 독성 확인

상기 실시예 1에서 제조한 타우 올리고머 세트의 세포 독성을 신경 세포주(cell line), 또는 초대 배양 세포(primary cell)에서 확인하였다.

먼저 신경 세포주에 대한 독성 확인을 위해 인간의 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y를 96-well 배양 접시에 6 x 10⁵ cells/ml 밀도로 파종하고, 다음날 100 nM의 Tau-4R 올리고머 세트를 포함하는 low-serum medium(3.5% FBS)으로 교체하였다. 세포 생존율을 PrestoBlue를 이용하여 3일간 매일 측정하였고, 각 측정값을 음성대조군 기준으로 % 환산하여 도 3에 나타내었다. 실험 결과, 모든 올리고머 중에서 QA-4R이 가장 세포 독성이 큰 것으로 나타났다. TA-4R과 PA-4R도 낮은 수준이지만 세포 독성이 있었으나, 단량체, 이량체, 및 육량체는 세포 독성이 거의 없었다. 이 결과는 삼량체, 사량체, 및 오량체와 같은 Tau-4R 올리고머 입체 구조가 세포 독성을 야기한다는 것을 의미한다. Tau-4R 올리고머에 의해 야기된 세포 독성은 Tau-4R에 노출된 후 하루가 지난 후에 그 효과가 현저하게 증가하였다.

초대배양 세포에 대한 독성 확인은 마우스 배아로부터 해마 신경세포(hippocampal neuronal cells)를 유도 배양하여 이용하였다. 상기 초대배양 세포를 24-well 배양 접시에 1.2 x 10⁵ cells/ml 밀도로 파종하고, 3일간 추가 배양한 후, 100 nM의 Tau-4R 올리고머 세트를 포함하는 low-serum medium(3.5% FBS)으로 교체하였다. 트롬빈을 첨가하거나, 또는 첨가하지 않은 두 그룹으로 분리하여 진행하였다. 트롬빈과의 공동 처리는 N-말단으로부터 가이드 펩티드를 제거함으로써 표적 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있고, 또는 신경 보호 효과와 신경증을 유발할 수 있다. 따라서 Tau-4R, 및 트롬빈과 조합된 임의의 표적 단백질을 이용한 치료는 생체 내 신경 병리학적 상태를 더 잘 반영할 것으로 기대하였다. 세포를 Tau-4R 올리고머 세트로 처리하고 6일 후의 세포의 형태를 도 4에 나타내었다. 상기 결과로부터 신경 세포주를 이용한 결과와 마찬가지로, 일차 해마 신경 세포에 대해서도 TA-4R, QA-4R, 및 PA-4R을 포함하여 올리고머성 Tau-4R이 투여된 시험군에서 독특한 신경 변성이 발생한 것을 알 수 있었다. 특히, TA-4R의 신경 퇴행 활성은 트롬빈의 존재에 의해 악화되는 것으로 분석되었다. HA-4R 또한 TA-4R보다는 약하지만 트롬빈의 영향으로 신경 변성이 발생하였다. 그러나 트롬빈만 단독으로 처리되거나 M-4R이 처리된 경우에는 신경 독성이 나타나지 않았다. 성상 세포와 같은 비 뉴런 세포는 시험된 모든 조건에서 생존 및 증식에 영향을 받지 않은 채 유지되었다(도 4의 배양보조세포(feeder cells) 참조).

이후 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 간단하게, 세포를 well 당 0.5 ml의 lysis buffer로 처리하고, 100㎕를 분주하여 항-SNAP25 마우스 모노클로날 일차항체로 전처리 코팅된 ELISA 플레이트로 전이하였다. SNAP25는 뉴런 세포에서만 발현되므로 뉴런 세포의 특징으로 이용된다. 이후에 플레이트를 세척하고, 친화성-정제된 토끼 폴리클로날 이차항체로 처리하고, 포획된 SNAP25의 정도를 토끼 IgG 및 TMB 기질을 인식하는 HRP-접합된 항체를 사용하여 정량화하였다. 이를 음성대조군을 기준으로 % 환산하여 도 5에 나타내었다. 실험 결과, 건강한 생존 가능 신경 세포의 마커인 SNAP25 수준은 Tau-4R 올리고머 세트의 세포 독성 결과와 일치하는 것으로 나타났다(도 3 및 5 비교). 신경 독성 및 세포 독성의 효과는 사량체 > 삼량체 = 오량체 > 단량체 = 이량체 = 육량체의 순서 인 것으로 분석되었다.

또한, 0.5U, 2.0U, 또는 8.0U의 트롬빈 첨가 시 마우스 해마 신경세포(초대배양 세포)에 대한 타우 올리고머 삼량체로서의 TA-4R와 TB-4R의 세포 독성 효과를 시험하였다. 올리고머 이량체와 삼량체의 경우에는 입체 구조가 상당히 불안정하기 때문에 실험적으로 결정되지 않는 한 어떤 형태의 구조가 보다 생리학적으로 영향을 미치는지 확신하기 어렵다. 이는 도 2에서 TA-4R와 TB-4R의 이동 양상으로도 확인할 수 있다. 따라서 삼량체인 TA-4R와 TB-4R을 다양한 트롬빈 농도와 함께 처리한 결과를 도 6과 도 7에 나타내었다. 실험 결과, 세포 형태 관찰에서 두 종류의 삼량체 모두 급격한 신경 퇴화를 유발하여 신경 독성 효과가 있는 것으로 나타났으나, 비 뉴런 세포에서는 눈에 띄는 영향을 미치지 않았다. 따라서 동일한 조건 하에서, 비-뉴런 세포의 증식 및 생존은 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 6의 배양보조세포(feeder cells) 참조). 두 삼량체를 비교하면, TB-4R에 비하여 TA-4R의 신경 독성이 보다 현저하였다. 또한 TB-4R를 고려할 때, 신경 독성은 트롬빈의 농도가 증가될수록 저하되었다.

추가로 삼량체(TB-4R), 사량체(QA-4R), 오량체(PA-4R) 올리고머 융합단백질의 LC50을 결정하기 위한 시험을 진행하였다. 이를 위해, 인간의 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y를 96-well 배양 접시에 6 x 10⁵ cells/ml 밀도로 파종하고, 다음날 다양한 농도의 TB-4R, QA-4R, 또는 PA-4R를 포함하는 low-serum medium(3.5% FBS)으로 교체하였다. 3일 배양 후, 세포 생존율을 PrestoBlue를 이용하여 측정하였고(n=3), 각 평균값을 음성대조군 기준으로 % 환산하여 도 8에 나타내었다. R-제곱 값(R-squared values)은 추세선 상에 표시하였고, LC50 값은 Prism software를 이용하여 계산하였다. 실험 결과, TB-4R, QA-4R, 및 PA-4R의 LC50 값은 각각 36 nM, 16 nM, 73 nM으로 나타나, QA-4R > TB-4R > PA-4R의 순으로 독성이 강한 것을 알 수 있었다. 또한 종래 세포 독성을 야기하는 공지된 융합단백질들이 μM 수준에서 LC50 값을 형성하는데 비해서, 본 발명의 융합단백질은 nM 수준에서 LC50 값을 형성하는 것을 알 수 있었다.

상기 실시예 결과로부터, 본 발명의 가이드 단백질이 타겟 단백질의 기능을 조절하는데 우수한 효과가 있으며, 가이드 단백질과 결합된 상태의 타겟 단백질의 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 및 육량체를 포함하는 올리고머 컨포머 세트가 목적하는 질병의 치료 약물 스크리닝을 위한 우수한 세포모델, 또는 동물모델에 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 가이드 단백질로서 HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), GST(glutathione Stransferase), FD(T4 fibritin foldon domain), DDT(D-dopachrome tautomerase), SCL(Streptococcus pyogenes collagen-like protein), CDA(human cytidine deaminase), NPM(nucleophosmin 1), HFQ(a host factor for bacteriophage Qβ RNA replication), 또는 HSP90α(heat-shock protein 90 alpha isoform)가 타겟 단백질로서 Tau-4R의 N-말단에 결합된 올리고머 컨포머 세트를 신경세포에 적용할 경우, 신경세포가 알츠하이머병의 특징을 그대로 구현하는 바, 알츠하이머병의 치료 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서 이용 가능하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

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165 170 175 Ala Ala Glu Lys Pro Ala Asp Lys Glu Ala Asn Gln Thr Pro Glu Arg 180 185 190 Arg Asn Gly Asn Met Ala Lys Thr Pro Val Ala Asn Asn His Arg Arg 195 200 205 Leu Pro Ala Thr Gly Glu Gln Ala Asn Pro Phe Phe Thr Ala Ala Ala 210 215 220 Val Ala Val Met Thr Thr Ala Gly Val Leu Ala Val Thr Lys Arg Lys 225 230 235 240 Glu Asn Asn <210> 8 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Gln Lys Arg Pro Ala Cys Thr Leu Lys Pro Glu Cys Val Gln 1 5 10 15 Gln Leu Leu Val Cys Ser Gln Glu Ala Lys Lys Ser Ala Tyr Cys Pro 20 25 30 Tyr Ser His Phe Pro Val Gly Ala Ala Leu Leu Thr Gln Glu Gly Arg 35 40 45 Ile Phe Lys Gly Cys Asn Ile Glu Asn Ala Cys Tyr Pro Leu Gly Ile 50 55 60 Cys Ala Glu Arg Thr Ala Ile Gln Lys Ala Val Ser Glu Gly Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Phe Arg Ala Ile Ala Ile Ala Ser Asp Met Gln Asp Asp Phe Ile 85 90 95 Ser Pro Cys Gly Ala Cys Arg Gln Val Met Arg Glu Phe Gly Thr Asn 100 105 110 Trp Pro Val Tyr Met Thr Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Ile Val Met Thr 115 120 125 Val Gln Glu Leu Leu Pro Ser Ser Phe Gly Pro Glu Asp Leu Gln Lys 130 135 140 Thr Gln 145 <210> 9 <211> 294 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Asp Ser Met Asp Met Asp Met Ser Pro Leu Arg Pro Gln Asn 1 5 10 15 Tyr Leu Phe Gly Cys Glu Leu Lys Ala Asp Lys Asp Tyr His Phe Lys 20 25 30 Val Asp Asn Asp Glu Asn Glu His Gln Leu Ser Leu Arg Thr Val Ser 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Lys Asp Glu Leu His Ile Val Glu Ala Glu Ala 50 55 60 Met Asn Tyr Glu Gly Ser Pro Ile Lys Val Thr Leu Ala Thr Leu Lys 65 70 75 80 Met Ser Val Gln Pro Thr Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ile Thr Pro 85 90 95 Pro Val Val Leu Arg Leu Lys Cys Gly Ser Gly Pro Val His Ile Ser 100 105 110 Gly Gln His Leu Val Ala Val Glu Glu Asp Ala Glu Ser Glu Asp Glu 115 120 125 Glu Glu Glu Asp Val Lys Leu Leu Ser Ile Ser Gly Lys Arg Ser Ala 130 135 140 Pro Gly Gly Gly Ser Lys Val Pro Gln Lys Lys Val Lys Leu Ala Ala 145 150 155 160 Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp 165 170 175 Asp Asp Asp Asp Phe Asp Asp Glu Glu Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val 180 185 190 Lys Lys Ser Ile Arg Asp Thr Pro Ala Lys Asn Ala Gln Lys Ser Asn 195 200 205 Gln Asn Gly Lys Asp Ser Lys Pro Ser Ser Thr Pro Arg Ser Lys Gly 210 215 220 Gln Glu Ser Phe Lys Lys Gln Glu Lys Thr Pro Lys Thr Pro Lys Gly 225 230 235 240 Pro Ser Ser Val Glu Asp Ile Lys Ala Lys Met Gln Ala Ser Ile Glu 245 250 255 Lys Gly Gly Ser Leu Pro Lys Val Glu Ala Lys Phe Ile Asn Tyr Val 260 265 270 Lys Asn Cys Phe Arg Met Thr Asp Gln Glu Ala Ile Gln Asp Leu Trp 275 280 285 Gln Trp Arg Lys Ser Leu 290 <210> 10 <211> 102 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Met Ala Lys Gly Gln Ser Leu Gln Asp Pro Phe Leu Asn Ala Leu Arg 1 5 10 15 Arg Glu Arg Val Pro Val Ser Ile Tyr Leu Val Asn Gly Ile Lys Leu 20 25 30 Gln Gly Gln Ile Glu Ser Phe Asp Gln Phe Val Ile Leu Leu Lys Asn 35 40 45 Thr Val Ser Gln Met Val Tyr Lys His Ala Ile Ser Thr Val Val Pro 50 55 60 Ser Arg Pro Val Ser His His Ser Asn Asn Ala Gly Gly Gly Thr Ser 65 70 75 80 Ser Asn Tyr His His Gly Ser Ser Ala Gln Asn Thr Ser Ala Gln Gln 85 90 95 Asp Ser Glu Glu Thr Glu 100 <210> 11 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Pro Glu Glu Thr Gln Thr Gln Asp Gln Pro Met Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu 20 25 30 Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Thr Leu 50 55 60 Thr Asp Pro Ser Lys Leu Asp Ser Gly Lys Glu Leu His Ile Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Asn Lys Gln Asp Arg Thr Leu Thr Ile Val Asp Thr Gly Ile 85 90 95 Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys 100 105 110 Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile 115 120 125 Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val 130 135 140 Ala Glu Lys Val Thr Val Ile Thr Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Trp Glu Ser Ser Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val Arg Thr Asp Thr 165 170 175 Gly Glu Pro Met Gly Arg Gly Thr Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu 180 185 190 Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Ile Lys Glu Ile Val Lys 195 200 205 Lys His Ser Gln Phe Ile Gly Tyr Pro Ile Thr Leu Phe Val Glu Lys 210 215 220 Glu Arg Asp Lys Glu Val Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Lys Glu Asp 225 230 235 240 Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ser Glu Asp Lys Pro 245 250 255 Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Gly 260 265 270 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu 275 280 285 Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile 290 295 300 Thr Asn Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp 305 310 315 320 Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu 325 330 335 Phe Arg Ala Leu Leu Phe Val Pro Arg Arg Ala Pro Phe Asp Leu Phe 340 345 350 Glu Asn Arg Lys Lys Lys Asn Asn Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val 355 360 365 Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro Glu Tyr Leu Asn Phe 370 375 380 Ile Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg 385 390 395 400 Glu Met Leu Gln Gln Ser Lys Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Leu 405 410 415 Val Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe Thr Glu Leu Ala Glu Asp Lys Glu 420 425 430 Asn Tyr Lys Lys Phe Tyr Glu Gln Phe Ser Lys Asn Ile Lys Leu Gly 435 440 445 Ile His Glu Asp Ser Gln Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Leu Leu Arg 450 455 460 Tyr Tyr Thr Ser Ala Ser Gly Asp Glu Met Val Ser Leu Lys Asp Tyr 465 470 475 480 Cys Thr Arg Met Lys Glu Asn Gln Lys His Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly 485 490 495 Glu Thr Lys Asp Gln Val Ala Asn Ser Ala Phe Val Glu Arg Leu Arg 500 505 510 Lys His Gly Leu Glu Val Ile Tyr Met Ile Glu Pro Ile Asp Glu Tyr 515 520 525 Cys Val Gln Gln Leu Lys Glu Phe Glu Gly Lys Thr Leu Val Ser Val 530 535 540 Thr Lys Glu Gly Leu Glu Leu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys 545 550 555 560 Gln Glu Glu Lys Lys Thr Lys Phe Glu Asn Leu Cys Lys Ile Met Lys 565 570 575 Asp Ile Leu Glu Lys Lys Val Glu Lys Val Val Val Ser Asn Arg Leu 580 585 590 Val Thr Ser Pro Cys Cys Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gly Trp Thr Ala 595 600 605 Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Leu Arg Asp Asn Ser Thr 610 615 620 Met Gly Tyr Met Ala Ala Lys Lys His Leu Glu Ile Asn Pro Asp His 625 630 635 640 Ser Ile Ile Glu Thr Leu Arg Gln Lys Ala Glu Ala Asp Lys Asn Asp 645 650 655 Lys Ser Val Lys Asp Leu Val Ile Leu Leu Tyr Glu Thr Ala Leu Leu 660 665 670 Ser Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp Pro Gln Thr His Ala Asn Arg Ile 675 680 685 Tyr Arg Met Ile Lys Leu Gly Leu Gly Ile Asp Glu Asp Asp Pro Thr 690 695 700 Ala Asp Asp Thr Ser Ala Ala Val Thr Glu Glu Met Pro Pro Leu Glu 705 710 715 720 Gly Asp Asp Asp Thr Ser Arg Met Glu Glu Val Asp 725 730

Claims (17)

1. 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질로서,
   상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 것이고,
   상기 가이드 단백질은 FD(T4 fibritin foldon domain), CDA(cytidine deaminase), 및 NPM(nucleophosmin 1)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 융합단백질.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 융합단백질은 삼량체, 사량체, 또는 오량체 입체 구조인 것인, 융합단백질.
   
5. 제 1항의 융합단백질을 코딩하는 유전자.
   
6. 제 5항의 유전자를 포함하는 벡터.
   
7. 제 6항의 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 형질전환체는 개체로부터 분리된 세포인 것인, 형질전환체.
   
9. 제 7항에 있어서,
   상기 형질전환체는 인간을 제외한 개체인 것인, 형질전환체.
   
10. (a) 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질을 제조하는 단계; 및,
    (b) 상기 융합단백질을 신경 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 알츠하이머병 세포 모델의 제조방법으로서,
    상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 것이고,
    상기 가이드 단백질은 FD(T4 fibritin foldon domain), CDA(cytidine deaminase), 및 NPM(nucleophosmin 1)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 제조방법.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 제 10항에 있어서,
    상기 융합단백질은 삼량체, 사량체, 또는 오량체 입체 구조인 것인, 알츠하이머병 세포 모델의 제조방법.
    
14. (a) 타우 단백질에 가이드 단백질이 결합된 융합단백질을 제조하는 단계;
    (b) 상기 융합단백질을 신경 세포에 처리하는 단계; 및,
    (c) 상기 신경 세포에 알츠하이머병 치료용 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법으로서,
    상기 타우 단백질은 Tau-4R인 것인 것이고,
    상기 가이드 단백질은 FD(T4 fibritin foldon domain), CDA(cytidine deaminase), 및 NPM(nucleophosmin 1)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 스크리닝 방법.
    
15. 삭제
16. 삭제
17. 제 14항에 있어서,
    상기 융합단백질은 삼량체, 사량체, 또는 오량체 입체 구조인 것인, 알츠하이머병 치료용 물질의 스크리닝 방법.

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