CN113614112A

CN113614112A - MuSK抑制

Info

Publication number: CN113614112A
Application number: CN201980074121.1A
Authority: CN
Inventors: 西尔韦尔·马里亚·万德尔马雷尔; 约翰内斯·贾斯特斯·赫拉德·马里亚·费斯胡伦; 马丁纳·热拉尔迪纳·马里亚·胡伊贝斯; 雅各布·扬·普隆
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-11-05
Also published as: WO2020055240A1; IL281409A; CA3112288A1; EP3850014A1; US20220002438A1; AU2019337338A1; JP2022500387A

Abstract

本文中提供了用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的新方法。本发明还提供了用于治疗所述病症、障碍和/或症状的结合剂。

Description

MuSK抑制

本文中提供了用于在对象中治疗通过抑制MuSK介导的神经肌肉传递(neuromuscular transmission)而减轻的病症、障碍和/或症状的新方法。本发明还提供了用于治疗所述病症、障碍和/或症状的结合剂(binding agent)。

背景技术

神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)是运动神经元与肌纤维接触的位置。在该部位，运动神经元与肌纤维一起产生使得两个细胞之间能够在两个方向上通信的专有结构。运动神经元指示肌肉收缩。涉及数个信号转导级联来调节该通信过程。在神经肌肉传递的中心是运动神经元末梢释放乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)。ACh通过突触间隙扩散至肌纤维。在那里，其结合位于肌纤维膜处的ACh受体(AChR)。这导致肌膜动作电位并且最终导致肌纤维收缩。

足够的ACh的释放和密集聚集(clustered)的AChR的存在是成功的神经肌肉传递和肌肉收缩的先决条件。突触蛋白聚糖(agrin)-低密度脂蛋白受体相关蛋白4(lipoprotein receptor-related protein 4，Lrp4)-肌肉特异性激酶(muscle-specifickinase，MuSK)信号传导级联是AChR聚集的重要调节剂。该信号传导级联对于建立和维持神经肌肉突触是重要的。MuSK在内部转导胞外信号以有助于AChR聚集。ACh释放和与AChR的结合介导肌肉收缩。

许多影响神经肌肉传递的不同试剂是已知的并且经常用于美容和/或治疗环境。一个受欢迎的实例是肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin)，其目前用于数种治疗性和非治疗性应用(例如，用于减少皱纹或治疗肌痉挛)。然而，由于这些毒素的极端毒性和固有的免疫原性，它们的使用通常限于以极低剂量施用以避免副作用(例如不期望的麻痹和/或宿主免疫应答)或使其最小化(Naumann，M.，Boo，L.M.，Ackerman，A.H.&Gallagher，C.J.JNeural Transm (Vienna)120，275-290，(2013))。

A型肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin type A，BoNT/A)是目前用于治疗数种通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的制剂中的活性物质。肉毒毒素是来源于细菌A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum type A)的生物制品。在大多数治疗中，BoNT/A是具有其他蛋白质的复合物的一部分。因此，不能排除这些产品组成的变化(参见例如the content of botulinum neurotoxin in

and

FrevertJ.Drugs R D.2010；10(2)：67-73)。

还已知用肉毒毒素进行治疗具有许多副作用。这样的副作用包括短暂性疲劳、吞咽困难、颈无力、声音嘶哑和局部疼痛。另外，对肉毒毒素治疗有初步响应的许多个体随后变得对该治疗无响应。因此，对于许多个体，肉毒杆菌注射无法提供令人满意的对病症的长期治疗。

需要用于美容和/或治疗性应用的更好的神经肌肉传递阻断剂。

发明概述

本发明人已从自身免疫性重症肌无力(myasthenia gravis，MG)患者中分离数种MuSK单克隆抗体并对其进行表征，并且检查了其功能特征以进一步了解MuSK MG的病理机理。

MG是最常见的神经肌肉突触障碍，在美国每100,000人中就有10至20人受到影响。它是其中针对NMJ蛋白的自身抗体损害神经肌肉传递并引起易疲劳肌无力的使人衰弱的自身免疫病。尽管取决于MG亚型，特定的肌肉亚群对自身免疫攻击更为敏感，但所有骨骼肌均可受到影响。约80％的患者携带针对肌肉烟碱AChR的自身抗体，从而导致AChR MG。在大多数患者中，第一症状是眼外肌无力，并且当疾病进展时，也出现延髓或全身骨骼肌无力。AChR自身抗体导致MG的病理机理与自身抗体同种型(免疫球蛋白(IgG)1和IgG3)密切相关。IgG1和IgG3是促炎性抗体，其可活化补体、结合免疫细胞上的Fc受体并交联和内化抗原。另外，这些AChR抗体可交联AChR并引起AChR的抗原调变，阻断ACh的结合位点，或通过诱导AChR的结构变化来改变对ACh的亲和力。这些效应物功能均通过降低功能性AChR的可用性而导致AChR MG中的疾病，并导致NMJ的功能性损伤和解体。

约5％的MG患者具有针对MuSK的自身抗体，从而导致MuSK MG(Hoch et al.，2001)。MuSK协调AChR聚集和突触下基因表达，并且因此对于NMJ形成和维持至关重要(Burden et al.，2018)。延髓和呼吸肌特别受MuSK自身抗体的影响，所述MuSK自身抗体可导致这些患者中的约40％的呼吸危机(Evoli et al.，2003)。与AChR MG相反，MuSK MG中的自身抗体主要是IgG4同种型(McConville et al.，2004)。用多克隆血清抗体进行的表位作图(epitope mapping)显示疾病严重程度与针对MuSK N-末端Ig样1结构域(Ig-like 1domain)的IgG4反应性相关(Huijbers et al.，2016)。此外，来自MuSK MG患者的经纯化人多克隆IgG4(而不是IgG1-3)的被动转移证实了这些自身抗体的致病性质，因为它们在免疫功能低下的小鼠中诱导了MG(Klooster et al.，2012)。体外研究表明，从血浆中纯化的MuSK IgG4自身抗体阻断了MuSK-Lrp4相互作用，从而诱导AChR去聚集，最终导致神经肌肉传递受损和MG(Huijbers&Zhang 2013；Koneczny et al.，2013；Otsuka et al.，2015)。

本发明人已从来自MuSK MG患者的克隆MuSK特异性记忆B细胞培养物中产生了重组MuSK抗体，以在遗传和功能水平上对其进行表征。这些包括使用不同重链和轻链可变区基因的IgG1、IgG3和IgG4抗体，所述基因在其互补决定区(complementary determiningregion，CDR)中经历了高水平的亲和力成熟，与抗原选择一致。结合实验证实了它们对MuSK的Ig样1结构域的特异性以及它们对小鼠NMJ的亲和力。

已知与MuSK的Ig样1结构域结合的IgG4自身抗体可引起MuSK MG的疾病。IgG4最初在体内以二价单特异性形式(即具有对相同靶抗原具有特异性的两个可变区)产生。然后IgG4随时间进行半IgG的交换(在文献中和本文中称为Fab臂交换(Fab-arm exchange)的过程，参见下文)，从而在体内产生二价双特异性IgG4分子池(即具有对不同靶抗原具有特异性的两个可变区)。因此，在体内IgG4随时间对其原始靶抗原变为在功能上单价(即，尽管其仍具有两个可变区，但其仅保留与原始靶标特异性结合的一个可变区；在该情况下为MuSK的Ig样1结构域)。对于＞99％的IgG4池，这是在24小时内发生的快速过程(前提是满足Fab臂交换的所有要求，其中所需的残基存在于IgG4 Fc尾中)。

本发明人出乎意料地发现，当MuSK抗体对MuSK的Ig样1结构域在功能上是单价时(即当它们仅保留与MuSK的Ig样1结构域特异性结合的一个可变区时)，它们仅抑制突触蛋白聚糖诱导的MuSK磷酸化(并因此抑制MuSK二聚化和活化)。本文中提供的数据首次说明，在MuSK MG患者中观察到的IgG4自身抗体仅在它们变为在功能上单价时(因此在体内在它们进行Fab臂交换之后)才在本质上变成抑制性的。因此，患者IgG4 MuSK抗体进行Fab臂交换的能力显示出对于疾病的发病机理至关重要，因为Fab臂交换使内源性MuSK IgG4对MuSKIg样1结构域具有双特异性且在功能上单价。仅在该状态下，IgG4才作为MuSK活性的抑制剂发挥作用。

本发明人还出乎意料地表明，当MuSK抗体对MuSK的Ig样1结构域是二价和单特异性的时(即当它们具有均与MuSK的Ig样1结构域特异性结合的两个可变区时)，突触蛋白聚糖非依赖性MuSK磷酸化被诱导或提高。因此，本本发明人已表明，针对MuSK的Ig样1结构域的抗体的价决定该抗体是MuSK拮抗剂(二价双特异性抗体或单价单特异性抗体片段)还是激动剂(二价单特异性抗体)。

本发明是完全出乎意料的，因为本文中所给出的数据表明，当迫使保留仅一个与MuSK的Ig样1结构域特异性结合的可变区时，激动剂双价单特异性MuSK Ig-1样结构域抗体可转化为针对相同靶抗原的拮抗剂。

在一个方面中，提供了包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，所述结合剂用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状。

有利地，本文中所述的结合剂不诱导(例如不能够诱导)MuSK二聚化和/或磷酸化和/或活化。

适当地，所述结合剂是结合蛋白。

适当地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的区域是可变区。

适当地，所述MuSK蛋白是人MuSK蛋白。

适当地，所述结合剂是单价的。

适当地，所述结合剂是二价或三价的。在该情况下，二价或三价的结合剂不诱导(例如不能够诱导)MuSK二聚化或活化。

适当地，所述结合剂是抗体。

适当地，所述抗体是单克隆抗体。

适当地，所述抗体是人抗体或人源化抗体。

适当地，所述抗体选自Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体(diabody)、三特异性三链抗体(triabody)、单结构域抗体或双特异性微抗体(minibody)。

适当地，所述抗体是IgG。所述IgG可选自IgG1、IgG2或IgG3。或者，所述IgG可以是体内Fab臂交换能力降低或无体内Fab臂交换能力的IgG4变体。

适当地，所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含降低体内Fab臂交换能力或阻止体内Fab臂交换的一个或更多个氨基酸替换。

适当地，所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含根据EU索引(EUindex)编号的重链的第228位氨基酸处的氨基酸替换和/或第409位氨基酸处的氨基酸替换和/或第405位氨基酸处的氨基酸替换。

适当地，所述对象是人。

适当地，所述病症、障碍和/或症状选自：

(i)由于过度肌肉活动而造成的外部外观变形；或者

(ii)由过度肌肉活动引起的病症、障碍或症状，包括张力障碍(dystonia)、面肌痉挛(facial spasm)、斜视(strabismus)、脑性瘫痪(cerebral palsy)、口吃(stuttering)、慢性紧张性头痛(chronic tension headache)、咽下缩肌痉挛(spasm of the inferiorconstrictor of the pharynx)、疼痛、偏头痛、非自主性痉挛(involuntary spasm)、肌痉挛状态(muscle spasticity)、斜视、职业性痉挛(occupational cramp)、肛裂(analfissure)、磨牙症(brusism)、及其任意组合。

适当地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的仅一个结合区具有选自以下的序列：

a)包含SEQ ID NO：10的VH CDR1、包含SEQ ID NO：11的VH CDR2、包含SEQ ID NO：12的VH CDR3、包含SEQ ID NO：14的VL CDR1、包含SEQ ID NO：15的VL CDR2和包含SEQ IDNO：16的VL CDR3；任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：9的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：13的轻链可变结构域；

b)包含SEQ ID NO：18的VH CDR1、包含SEQ ID NO：19的VH CDR2、包含SEQ ID NO：20的VH CDR3、包含SEQ ID NO：22的VL CDR1、包含SEQ ID NO：23的VL CDR2和包含SEQ IDNO：24的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：17的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：21的轻链可变结构域；

c)包含SEQ ID NO：26的VH CDR1、包含SEQ ID NO：27的VH CDR2和包含SEQ ID NO：28的VH CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：25的重链可变结构域；

d)包含SEQ ID NO：30的VH CDR1、包含SEQ ID NO：31的VH CDR2、包含SEQ ID NO：32的VH CDR3、包含SEQ ID NO：34的VL CDR1、包含SEQ ID NO：35的VL CDR2和包含SEQ IDNO：36的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：29的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：33的轻链可变结构域；

e)包含SEQ ID NO：38的VH CDR1、包含SEQ ID NO：39的VH CDR2、包含SEQ ID NO：40的VH CDR3、包含SEQ ID NO：42的VL CDR1、包含SEQ ID NO：43的VL CDR2和包含SEQ IDNO：44的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：37的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：41的轻链可变结构域；

f)包含SEQ ID NO：46的VH CDR1、包含SEQ ID NO：47的VH CDR2、包含SEQ ID NO：48的VH CDR3、包含SEQ ID NO：50的VL CDR1、包含SEQ ID NO：51的VL CDR2和包含SEQ IDNO：52的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：45的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：49的轻链可变结构域；

g)包含SEQ ID NO：54的VH CDR1、包含SEQ ID NO：55的VH CDR2、包含SEQ ID NO：56的VH CDR3、包含SEQ ID NO：58的VL CDR1、包含SEQ ID NO：59的VL CDR2和包含SEQ IDNO：60的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：53的重链可变结构域和含有SEQ ID NO：57的轻链可变结构域；或者

h)以上任一项的组合。

还提供了在对象中预防、调节或降低皮肤起皱的方法，所述方法包括向所述对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

还提供了治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的方法；所述方法包括向对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

适当地，所述病症、障碍和/或症状选自：

(i)由于过度肌肉活动而造成的外部外观变形；或者

(ii)由过度肌肉活动引起的病症、障碍或症状，包括张力障碍、面肌痉挛、斜视、脑性瘫痪、口吃、慢性紧张性头痛、咽下缩肌痉挛、疼痛、偏头痛、非自主性痉挛、肌痉挛状态、斜视、职业性痉挛、肛裂、磨牙症、及其任意组合。

适当地，所述结合剂是结合蛋白。

适当地，所述MuSK蛋白是人MuSK蛋白。

适当地，所述结合剂是单价的。

适当地，所述结合剂是抗体。

适当地，所述抗体是单克隆抗体。

适当地，所述抗体是人抗体或人源化抗体。

适当地，所述抗体选自Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。

适当地，IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含降低或阻止体内Fab臂交换能力的一个或更多个氨基酸替换。

适当地，IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含根据EU索引编号的重链的第228位氨基酸处的氨基酸替换和/或第409位氨基酸处的氨基酸替换和/或第405位氨基酸处的氨基酸替换。

适当地，所述对象是人。

h)以上任一项的组合。

在另一个方面中，提供了包含一个或更多个结合区的抗体，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，其中与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的仅一个结合区具有选自以下的序列：

h)以上任一项的组合。

在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语“包含/包括”和“包含/含有”及其变化形式意指“包括但不限于”，并且其不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。

在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则单数涵盖复数。特别地，除非上下文另外要求，否则本说明书中没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团将被理解为可适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

以下进一步详细描述本发明的多个方面。

附图简述

在下文中参照附图进一步描述本发明的一些实施方案，其中：

图1示出了患者来源的重组MuSK抗体与整体装片耳长提肌(levator aurislongus muscle)中小鼠NMJ结合。标度(scale marker)为25μm。

图2示出了患者来源的重组MuSK抗体可根据抗体价活化或抑制MuSK磷酸化和AChR聚集。二价单特异性重组MuSK抗体(克隆#11-3F6和13-3B5)在存在和不存在突触蛋白聚糖的情况下活化MuSK磷酸化(A)。MuSK磷酸化的活化是剂量依赖性的(B)。与11-3F6相比，克隆13-3B5略微更强效。生物素对照抗体不影响(突触蛋白聚糖依赖性)MuSK磷酸化。由这些重组MuSK单克隆产生的单价Fab片段抑制了MuSK磷酸化(C)。当暴露于生物素对照抗体或其Fab片段时，突触蛋白聚糖依赖性AChR聚集不受影响(D)。与来源于相同单克隆的Fab片段相比，二价单特异性重组IgG4单克隆MuSK抗体显著提高了AChR聚集，但是突触蛋白聚糖依赖性AChR聚集仍低于抗生物素对照(对于IgG4：P＝0.0004，对于Fab片段：P＝0.0001，单因素ANOVA Dunnett校正，11-3F6IgG4相对于Fab：P＝0.0003，13-3B5 IgG4相对于Fab：P＝0.03，抗生物素IgG4相对于Fab：P＝0.3，未配对t检验)。Fab片段将AChR聚集降低至经纯化患者IgG4的水平和“无突触蛋白聚糖”状态。此外，二价单特异性抗体独产于突触蛋白聚糖显著提高了AgrR聚集(11-3F6：P＝0.03，13-3B5：P＝0.2单因素ANOVA Dunnett校正)。数据表示平均值±SEM。比例尺表示50μm。

图3示出了从MuSK MG患者中分离的8个B细胞克隆的MuSK反应性结果。MuSK是在酵母和大肠杆菌(E.Coli)中产生的。将分离自MuSK MG患者和健康供体的MuSK反应性B细胞克隆进行单细胞分选，并分化为浆细胞。使用亚类(a)特异性(抗IgG1或抗IgG4或抗IgG总)二抗，在ELISA中测试来自这些单细胞培养物的培养基的MuSK(在大肠杆菌中产生)反应性。在这些实验中，分离了8个MuSK反应性B细胞克隆，其中7个产生B细胞受体(B cell receptor，BCR)序列。克隆之间针对MuSK蛋白的反应性水平不同。还测试了来源于健康供体组群和MuSK MG患者二者的具有MuSK非反应性克隆的大量孔。在该测定中，来自健康供体的一个克隆(11-1B3)显示出与MuSK具有一些反应性。

图4示出了对于分离自MuSK MG患者的MuSK克隆所观察到的反应性对MuSK具有特异性，而对于分离自健康供体的MuSK克隆(11-1B3)所观察到的反应性对MuSK不具有特异性。还使用酵母中产生的MuSK对4个MuSK MG克隆测试了MuSK反应性的特异性，并将其与相同体系中产生的对照抗原(乙酰胆碱受体α亚基)进行比较。来自健康供体的“MuSK”阳性克隆(11-1B3)对酵母中产生的MuSK未显示出反应性，表明该抗体/BCR序列识别了大肠杆菌相关蛋白，而不是MuSK特异性的。分离自MuSK MG患者的MuSK克隆(11-3F6、11-7C5、11-8G4和11-3D9)针对酵母产生的MuSK显示出明显的反应性。

图5示出了使用Clustal W比对程序进行的序列比对。

图6-使用Labrijn，2014，Nature Protocols and Genmab，Labrijn，2013，PNAS中详述的方法产生了抗MuSK/抗HIV-b12交换的异种特异性IgG4抗体，将其调整为IgG4。在小鼠离体耳长提肌中的神经肌肉接头(NMJ)中测试了这些抗体的MuSK结合。还并行测试了等同的抗MuSK同种特异性抗体。数据证实，异种特异性MuSK IgG4抗体(13-3B5/HIV IgG4和11-3F6/HIV IgG4)和同种特异性MuSK IgG4抗体(13-3B5 IgG4和11-3F6 IgG4)二者均在NMJ处与MuSK结合。

图7-异种特异性MuSK IgG4抗体引起对突触蛋白聚糖诱导的MuSK磷酸化的抑制，而同种特异性MuSK IgG4抗体在不存在突触蛋白聚糖的情况下使磷酸化活化。

图8示出了同种特异性相对于异种特异性musk抗体对体内神经肌肉性能具有不同的作用。nod/scid小鼠在第0、3和7天i.p.注射5μg/gbw重组抗体。两个克隆的异种特异性(功能上单价)形式诱导快速且严重的肌无力和体重减轻。同种特异性11-3F6 IgG4没有诱导肌无力或体重减轻。I.p.＝腹膜内，gbw＝克体重。

发明详述

本发明人已使用从MuSK MG患者获得的MuSK抗体的可变结构域，制备了对于MuSK的Ig样1结构域是二价且单特异性的重组IgG1和IgG4抗体。

出乎意料地，患者来源的重组MuSK单克隆抗体(IgG1和IgG4二者)活化而不是抑制MuSK磷酸化(图2A)。在不存在和存在突触蛋白聚糖两种情况下均观察到了该作用。MuSK磷酸化的活化是浓度依赖性的(图2B)，并且在两个克隆之间略有不同。这表明，结合Ig样1结构域的患者来源的二价单特异性MuSK抗体在体外有助于MuSK的二聚化和活化。

然而，重组单克隆IgG1和IgG4二者均参与二价单特异性抗体-抗原相互作用。为了探究患者中Fab臂交换的IgG4 MuSK抗体的双特异性和功能单价的功能作用，本发明人通过木瓜蛋白酶消化从这些重组抗体产生了单价Fab片段。在体外，与患者血清来源的抗MuSKIgG4类似，这些Fab片段抑制了突触蛋白聚糖依赖性MuSK磷酸化(图2C)和AChR聚集(图2D)。相比之下(并且与体外活化MuSK磷酸化一致)，与来自相同单克隆的Fab片段相比，二价单特异性单克隆MuSK抗体活化了突触蛋白聚糖依赖性AChR聚集。此外，AChR聚集可使用独立于突触蛋白聚糖的二价单特异性抗体部分来诱导(图2D)。因此，单价MuSK结合阻断了AChR聚集途径，而二价单特异性MuSK抗体刺激MuSK，并且可在该组织培养模型中有助于或诱导AChR聚集。

NMJ处的AChR聚集对于成功的神经肌肉传递和肌肉收缩至关重要(Burden etal.，2018)。在患者中耐受较低水平的AChR聚集，直至其达到临界阈值。例如，对于MuSK MG，在被动转移了MuSK抗体的小鼠中存在AChR聚集的剂量依赖性降低(Klooster et al.，2012)。因此，AChR聚集提高将导致神经肌肉传递改善。在患者中神经肌肉传递的少量提高可以是治疗有效的(如由例如乙酰胆碱酯酶治疗所示例的，该治疗是AChR MG患者的一线对症治疗)。有利地，本文中所述的二价单特异性MuSK抗体因此可用作治疗剂来改善NMJ处的AChR聚集和突触稳定性。

本发明已使用抗体进行示例。然而，一般概念也适用于具有对MuSK Ig样1结构域具有特异性的结合区的其他结合剂。作为一个实例，本文中提供的数据证明二价单特异性MuSK Ig样1结合剂(即具有两个结合区(二者均对MuSK Ig样1结构域具有特异性)的结合剂)可充当MuSK激动剂(通过诱导MuSK二聚化和/或磷酸化和/或活化)，而二价双特异性MuSK Ig样1结合剂(即具有两个结合区(其中仅一个对MuSK Ig样1结构域具有特异性)的结合剂)可充当MuSK拮抗剂(通过阻止MuSK二聚化和/或磷酸化和/或活化)。

本文中所述的本发明基于以下发现：包含一个或更多个结合区(其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合)的结合剂可在NMJ处通过抑制MuSK磷酸化而用作MuSK拮抗剂。MuSK磷酸化的降低损害了神经肌肉传递。因此，本文中所述的结合剂可用于在对象中诱导短暂或长期的局部肌无力(轻瘫(paresis))。有利地，本文中所述的结合剂因此可用作肉毒毒素治疗的替代治疗。

相对于其他已知的神经肌肉传递拮抗剂(例如肉毒毒素)，本文中所述的结合剂具有许多优点：

·肉毒毒素是组成可在批次之间变化的多蛋白生物制品，这使得其活性难以预测或重现。估计仅在欧盟(EU)每年使用约400,000只小鼠来测试每个新的Botox批次的效力(Taylor et al.，2019，ALTEX 36(1)，81-90)。本文中所述的结合剂可在严格的GCLP要求下作为例如单克隆抗体产生，且批次之间没有任何(或最小的)变化。有利地，本文中所述的结合剂因此将不需要与肉毒毒素同样严格批次间测试。

·肉毒毒素作用于突触前神经侧并且还通过逆行轴突运输运输至中枢神经系统，这可能导致不期望的副作用。

·本文中所述的结合剂靶向突触后肌膜，不太可能被运动神经元内化，因此不应对突触前神经造成伤害。

·本文中所述的结合剂对于已发生针对肉毒毒素的变应性反应(或处于发生针对肉毒毒素的变应性反应的风险之中)的对象可以是有用的替代物。

·本文中所述的结合剂对于已发生针对肉毒毒素的免疫反应(或处于发生针对肉毒毒素的免疫反应的风险之中)的对象可以是有用的替代物。

·本文中所述的结合剂(例如结合蛋白，例如抗体)可在IgG4背景下开发。这样的结合剂不能活化补体，因此不引起任何膜损伤并且不引起局部炎症。

·本文中所述的结合剂的尺寸可变化并且可制成具有良好动力学的形式。例如，scFv可用于更有效地到达靶位点，或者可产生具有更长半衰期的多聚体IgM样分子。

结合剂

本文中描述了包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

有利地，该结合剂通过抑制MuSK磷酸化和/或二聚化来抑制MuSK活性(其进而抑制MuSK的功能)。换句话说，本文中所述的结合剂不(例如不能够)诱导MuSK磷酸化和/或二聚化。结合剂可用于在对象中抑制神经肌肉传递。

因此，该结合剂可用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状。

如以下更详细定义的，“抑制”是指降低或减少并且因此涵盖部分抑制(例如，在对象中抑制一些但不是全部的MuSK二聚化和/或磷酸化和/或活化；以及在对象中抑制一些但不是全部的神经肌肉传递)。

在一个具体实例中，结合剂是包含一个或更多个结合区的结合蛋白，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。在该情况下，结合蛋白可以是以下更详细描述的抗体，其中结合区域是可变区。在该实例中，抗体可包含一个或更多个可变区，其中仅一个可变区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

结合剂(例如结合蛋白，例如抗体)可以是单价或多价的。本文中使用的“单价”结合剂具有仅一个结合区(在本文中也称为抗原结合位点)。本文中使用的“多价结合剂”是指具有多个(即多于一个)结合区(即多个抗原结合位点)的结合剂。因此，多价结合剂可具有两个、三个、四个、五个、六个或更多个结合区/抗原结合位点。举例来说“二价”结合剂是具有两个结合区/抗原结合位点的多价结合蛋白，而“三价”结合蛋白是具有三个结合区/抗原结合位点的多价结合蛋白。

除非上下文另外指出，否则术语“结合区”、“抗原结合位点”和“表位结合位点”在本文中可互换使用。

作为一个实例，结合剂可具有仅一个结合区(即与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区)而没有其他结合区。在该情况下，结合剂是单价的。

对于多价的本文中所述的结合剂(例如结合蛋白，例如抗体)，结合剂(例如结合蛋白，例如抗体)仅具有一个与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区。换句话说，多价结合剂的其余结合区(即多价结合剂的第二、第三、第四、第五等结合区)不与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合；它们与不同的抗原/表位特异性结合。通常来说，多价结合剂的其余结合区(即多价结合剂的第二、第三、第四、第五等结合区)与不同抗原特异性结合(例如它们不与MuSK特异性结合)。然而，为了避免疑问，在一个替代实例中，多价结合剂的其余结合区(即多价结合剂的第二、第三、第四、第五等结合区)可与MuSK蛋白的另一区(例如Ig样2结构域、Ig样3结构域、卷曲结构域等)特异性结合，前提是多价结合剂不(例如不能够)诱导MuSK磷酸化和/或二聚化和/或活化。用于确定是否发生MuSK活化和/或二聚化和/或磷酸化的方法是本领域中公知的。

作为一个实例，结合剂可具有两个结合区(即与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的一个结合区，以及对另外的抗原/表位具有特异性的另一个结合区(即，其不与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合))。在该情况下，结合剂可以是二价的(并且双特异性的)。该类型的结合剂还可被称为对于MuSK蛋白的Ig样1结构域的“功能上单价”(即它可仅通过一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域结合)。

作为另一个实例，结合剂可具有三个结合区(即与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的一个结合区，和对另外的(一个或两个)抗原/表位具有特异性的另外两个结合区(即另外两个结合区均不与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合))。在该情况下，结合蛋白可以是三价的(并且双特异性或三特异性的)。如前，该类型的结合剂还可被称为对于MuSK蛋白的Ig样1结构域的“功能上单价”(即它可仅通过一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域结合)。

在一个具体实例中，本文中所述的结合剂是抗体。在该情况下中，抗体的结合区可以是可变区。

术语“可变区”是指包含一个或更多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白遗传基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一个编码的Ig结构域的免疫球蛋白区。更具体地，该术语是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。因此，免疫球蛋白的可变区通常由两个可变结构域(即重链可变结构域和轻链可变结构域)构成。天然抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(framework region，FR)和三个高变区(hypervariable region，HVR)。(参见，例如Kindt et al.Kuby Immunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007))。单VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。

术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如根据Kabat et al，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991)的轻链可变结构域的第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基以及重链可变结构域的第31至35位(H1)、第50至65位(H2)和第95至102位(H3)残基)和/或来自“高变环”的那些残基(例如根据Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987)的轻链可变结构域中的第26至32位(L1)、第50至52位(L2)和第91至96位(L3)以及重链可变结构域中的第26至32位(L1)、第53至55位(H2)和第96至101位(H3)残基)。

每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，针对重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，v区由15至30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的段(stretch)组成，所述段被每个长度为9至15个氨基酸或更长的称为“高变区”的极度可变的较短区隔开。每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本发明的抗体可包含一个或更多个结合区(即可变区)，其中仅一个结合区(即可变区)与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。在抗体的情况下，术语可变区和结合区在本文中可互换使用。每个可变区可包含轻链可变结构域(VL)的CDR(即VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3)和/或重链可变结构域(VH)的CDR(即VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3)。如本文中其他地方所述，来自VL或VH之一的CDR可足以赋予抗原结合特异性(即与MuSK的Ig样1结构域特异性结合)。在其他情况下，抗原结合特异性(即与MuSK的Ig样1结构域的特异性结合)可通过存在来自VL和VH二者的CDR 1、2和3获得。

下面提供了赋予对MuSK的Ig样1结构域的抗原结合特异性的CDR组合的一些具体实例。已使用IMGT/V-QUEST程序版本：3.4.17(2019年2月19日)-IMGT/V-QUEST参照目录发布：201910-2(2019年3月5日)(http：//imgt.org/IMGT_vquest/vquest)对CDR序列进行了鉴定，选择了智人(homo sapiens)序列。这些CDR组合形成了与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的抗体(包括Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体)的结合区(即可变区)：

1)包含GFNFSTYT(SEQ ID NO：10)的CDR1、包含ISSRSAYK(SEQ ID NO：11)的CDR2和包含ARDFFQLGPPRFDS(SEQ ID NO：12)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：9的序列的VH)的情况下。

2)包含QRISSF(SEQ ID NO：14)的CDR1、包含GAS(SEQ ID NO：15)的CDR2和包含QQSYSPMYT(SEQ ID NO：16)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：13的序列的VL)的情况下。

3)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：10、11和12(重链)的CDR与SEQ ID NO：14、15和16(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：9(重链)与SEQ：13(轻链)的可变结构域的组合获得。

4)包含GFTFSSYT(SEQ ID NO：18)的CDR1、包含IGSNGDYI(SEQ ID NO：19)的CDR2和包含ARGQLAVAGTHFDY(SEQ ID NO：20)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：17的序列的VH)的情况下。

5)包含QKVNKY(SEQ ID NO：22)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：23)的CDR2和包含QQSYSPLCT(SEQ ID NO：24)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：21的序列的VL)的情况下。

6)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：18、19和20(重链)的CDR与SEQ ID NO：22、23和24(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：17(重链)与SEQ：21(轻链)的可变结构域的组合获得。

7)包含GFTFSDFT(SEQ ID NO：26)的CDR1、包含IGSSGTFI(SEQ ID NO：27)的CDR2和包含ARGRIAVAGTHFDL(SEQ ID NO：28)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：25的序列的VH)的情况下。

8)包含GYTFTGQY(SEQ ID NO：30)的CDR1、包含INPSSGVT(SEQ ID NO：31)的CDR2和包含ATLSLGVYYVGMVA(SEQ ID NO：32)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：29的序列的VH)的情况下。

9)包含GLAQQH(SEQ ID NO：34)的CDR1、包含KDI(SEQ ID NO：35)的CDR2和包含QSGDRTATSVL(SEQ ID NO：36)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：33的序列的VL)的情况下。

10)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：30、31和32(重链)的CDR与SEQ ID NO：34、35和36(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：29(重链)与SEQ：33(轻链)的可变结构域的组合获得。

11)包含GFDFSAST(SEQ ID NO：38)的CDR1、包含VSGDSHHI(SEQ ID NO：39)的CDR2和包含ARERLLRLGVGFDS(SEQ ID NO：40)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ IDNO：37的序列的VH)的情况下。

12)包含QRISGF(SEQ ID NO：42)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：43)的CDR2和包含QQSYSPLYT(SEQ ID NO：44)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：41的序列的VL)的情况下。

13)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：38、39和40(重链)的CDR与SEQ ID NO：42、43和44(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：37(重链)与SEQ：41(轻链)的可变结构域的组合获得。

14)CDR可以是如下：包含GFTFSSYT(SEQ ID NO：46)的CDR1、包含ISSGGHYI(SEQ IDNO：47)的CDR2和包含ARERLLRLGVGFDF(SEQ ID NO：48)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：45的序列的VH)的情况下。

15)包含QSISGY(SEQ ID NO：50)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：51)的CDR2和包含QQSYSALYT(SEQ ID NO：52)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：49的序列的VL)的情况下。

16)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：46、47和48(重链)的CDR与SEQ ID NO：50、51和52(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：45(重链)与SEQ：49(轻链)的可变结构域的组合获得。

17)包含GFTFSSYW(SEQ ID NO：54)的CDR1、包含LNEDGSTT(SEQ ID NO：55)的CDR2和包含VSDLSGKDEH(SEQ ID NO：56)的CDR3。这些CDR可任选地在VH(例如包含SEQ ID NO：53的序列的VH)的情况下。

18)包含QSLLHSNGYYW(SEQ ID NO：58)的CDR1、包含LGF(SEQ ID NO：59)的CDR2和包含MQGLQ TPYT(SEQ ID NO：60)的CDR3。这些CDR可任选地在VL(例如包含SEQ ID NO：57的序列的VL)的情况下。

19)例如在VH和VL的情况下的SEQ ID NO：54、55和56(重链)的CDR与SEQ ID NO：58、59和60(轻链)的CDR。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：53(重链)与SEQ：57(轻链)的可变结构域的组合获得。

上述CDR可在抗体(例如IgG)的情况下。例如，IgG可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

例如，在上述选项1、2、3、7、11、12或13中提供的CDR和可变结构域序列可存在于IgG1抗体Fc序列的情况下。示例性的序列可以是SEQ ID NO：61或其变体(参见例如SEQ IDNO：65、66或67的Fc区)的序列。

例如，在上述选项8、9和10中提供的CDR和可变结构域序列可存在于IgG4抗体Fc序列的情况下。示例性的序列可以是SEQ ID NO：64或其变体(参见例如SEQ ID NO：69的Fc区)的序列。

例如，在上述选项14、15或16中提供的CDR和可变结构域序列可存在于IgG3抗体Fc序列的情况下。示例性的序列可以是SEQ ID NO：63或其变体(参见例如SEQ ID NO：68的Fc区)的序列。

如上详细描述的，本文中所述的抗体(包括Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体)包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：9的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ IDNO：13的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：9的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：13的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，结合区包含SEQ ID NO：9的重链可变结构域和SEQ ID NO：13的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：9的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：13的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：9的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：13的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：9的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：13的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQ ID NO：16的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：10的VH CDR1、具有SEQ ID NO：11的VH CDR2和具有SEQ ID NO：12的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：14的VL CDR1、具有SEQ ID NO：15的VL CDR2和具有SEQID NO：16的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的抗体结合区包含：具有与SEQ ID NO：17的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ ID NO：21的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：17的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：21的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：17的重链可变结构域和SEQ ID NO：21的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：17的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：21的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：17的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：21的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：17的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：21的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQ ID NO：24的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：18的VH CDR1、具有SEQ ID NO：19的VH CDR2和具有SEQ ID NO：20的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：22的VL CDR1、具有SEQ ID NO：23的VL CDR2和具有SEQID NO：24的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：25的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：25的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：26的VH CDR1、具有SEQ ID NO：27的VH CDR2和具有SEQ ID NO：28的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：25的重链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：25的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ IDNO：26的VH CDR1、具有SEQ ID NO：27的VH CDR2和具有SEQ ID NO：28的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：26的VH CDR1、具有SEQ ID NO：27的VH CDR2和具有SEQ ID NO：28的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：26的VH CDR1、具有SEQ ID NO：27的VH CDR2和具有SEQ ID NO：28的VHCDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：29的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ IDNO：33的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：29的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：33的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：29的重链可变结构域和SEQ ID NO：33的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：29的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：33的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：29的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：33的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：29的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：33的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQ ID NO：36的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：30的VH CDR1、具有SEQ ID NO：31的VH CDR2和具有SEQ ID NO：32的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：34的VL CDR1、具有SEQ ID NO：35的VL CDR2和具有SEQID NO：36的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：37的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ IDNO：41的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：37的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：41的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：37的重链可变结构域以及SEQ ID NO：41的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：37的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：41的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：37的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：41的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：37的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：41的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQ ID NO：44的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：38的VH CDR1、具有SEQ ID NO：39的VH CDR2和具有SEQ ID NO：40的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：42的VL CDR1、具有SEQ ID NO：43的VL CDR2和具有SEQID NO：44的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：45的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ IDNO：49的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：45的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：49的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：45的重链可变结构域以及SEQ ID NO：49的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：45的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：49的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：45的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：49的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：45的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：49的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQ ID NO：52的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：46的VH CDR1、具有SEQ ID NO：47的VH CDR2和具有SEQ ID NO：48的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：50的VL CDR1、具有SEQ ID NO：51的VL CDR2和具有SEQID NO：52的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含：具有与SEQ ID NO：53的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；以及具有与SEQ IDNO：57的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

优选地，重链可变结构域具有与SEQ ID NO：53的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个；并且轻链可变结构域具有与SEQ ID NO：57的多肽具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列并且包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

最优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ ID NO：53的重链可变结构域以及SEQ ID NO：57的轻链可变结构域。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：53的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及含有与SEQ ID NO：57的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含含有与SEQ ID NO：53的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列的重链可变结构域；以及SEQ ID NO：57的轻链可变结构域。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VH CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含SEQ IDNO：53的重链可变结构域；以及轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO：57的多肽序列相比具有至少1、2、3、4或5个保守替换的多肽序列。优选地，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VLCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VHCDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQ ID NO：60的VL CDR3中的至少一个，特别地至少两个，更特别地至少3个。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

在一个实施方案中，与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区包含重链CDR：具有SEQ ID NO：54的VH CDR1、具有SEQ ID NO：55的VH CDR2和具有SEQ ID NO：56的VHCDR3，以及轻链CDR：具有SEQ ID NO：58的VL CDR1、具有SEQ ID NO：59的VL CDR2和具有SEQID NO：60的VL CDR3。优选地，所述抗体选自抗体、Fab、双特异性Fab2、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。所述抗体包含一个或更多个结合区，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合(例如通过上述序列)。

本文中使用的术语“同源性”和“同一性”可互换使用。如下进行序列之间的序列同源性或同一性的计算。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，出于最佳比对可将空位引入第一与第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中并且出于比较目的可忽略非同源序列)。在一个优选实施方案中，出于比较目的比对的参考序列的长度为该参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，以及甚至更优选至少70％、75％、80％、82％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是相同的(本文中使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸酸或核酸“同源性”)。考虑到空位的数目和每个空位的长度(为了两个序列的最佳比对而需要引入)，两个序列之间的百分比同一性是由序列共有的相同位置的数目的函数。

序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可使用数学算法来完成。在一个优选实施方案中，使用Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法，使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入到GCG软件包中的GAP程序(可在http：//www.gcg.com获得)中。在又一个优选实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(可在http：//www.gcg.com获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。特别优选的参数组(并且如果从业者不确定应该应用什么参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内，则应使用该参数组)是BLOSUM62评分矩阵，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5。

或者，可使用Meyers et al.(1989)CABIOS 4：11-17)的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)，12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入到ALIGN程序(2.0版)中。

本文中使用的术语“保守氨基酸替换”是指用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基。本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在结合的情况下，术语“特异”和“特异性地”在本文中可互换使用，以指示其他生物分子不与与目的生物分子(其中目的生物分子是MuSK蛋白的Ig样1结构域)特异性结合的结合区(例如CDR，可变区等)显著结合。在一些实例中，通过ELISA或亲和力测定的手段，与除MuSK蛋白的Ig样1结构域之外的生物分子结合的水平导致可忽略的(例如，不可测定的)结合亲和力。

“可忽略的结合”意指比与MuSK蛋白的Ig样1结构域的结合小至少约85％，特别地至少约90％，更特别地至少约95％，甚至更特别地至少约98％，但尤其是至少约99％以及多至100％的结合。

结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域的结合亲和力可使用标准结合测定例如表面等离激元共振技术(

GE-Healthcare Uppsala，Sweden)确定。本文中使用的术语“表面等离激元共振”是指一种光学现象，其允许例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用。有关进一步描述，参见Jonsson，U.，et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.，et al.(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，et al.(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，et al.(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

例如，在抗体与预定抗原/表位结合的情况下的“特异性结合”意指当例如使用抗体作为分析物在BIAcore 3000装置中通过表面等离激元共振(surface plasmonresonance，SPR)技术确定时，以对应于以下KD(平衡解离常数)的亲和力结合：约10^-7M或更小，例如约10^-8M或更小，例如约10^-9M或更小、约10^-10M或更小或约10^-11M或者甚至更小(其中低KD指示高亲和力)。该术语还意指抗体以对应于以下KD的亲和力与预定抗原/表位结合：比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如牛血清白蛋白、酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍，例如低至少100倍，例如低至少1000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力较低的量取决于抗体的KD，使得当抗体的KD非常低(即，抗体非常特异且结合非常良好)时，则对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。本文中使用的术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。

本文中所述的其他结合剂的“特异性结合”的等同亲和力值是本领域中公知的。

本文中所述的结合区可对MuSK蛋白的Ig样1结构域内的表位具有特异性(即与之特异性结合)。本文中使用的术语“表位”是指靶分子(例如，抗原，例如蛋白质，例如MuSK蛋白的Ig样1结构域)上与结合剂(例如，结合蛋白例如抗体或抗体片段)结合的位点。表位是分子(例如氨基酸或糖侧链)的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。表位可由靶分子的连续残基(例如，氨基酸残基)或相邻非连续残基(例如，氨基酸残基)二者形成。由连续残基(例如，氨基酸残基)形成的表位通常也称为线性表位。表位通常包含至少5个并且多至约12个残基，主要为6至10个残基(例如氨基酸残基)。表位也可以是构象的(即非线性的)。

在一个实例中，MuSK蛋白是人MuSK蛋白。人MuSK蛋白已被充分表征。最近Valenzuela et al.对MuSK蛋白进行了测序，并对该蛋白进行了表征(参见WO97/21811)。它是位于NMJ处肌细胞的细胞表面上的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)，并且具有如SEQ ID NO：1中所示的序列。人MuSK蛋白可通过UniprotKB标识符：O15146来标识。人MuSK基因信息可在Ensembl ref：ENSG00000030304中找到。该基因具有七种转录物，概述如下：

表1：人MuSK的七种转录物。

MuSK的胞外区包含三个Ig样结构域和一个卷曲样结构域。MuSK中的第一N-末端Ig样结构域(在本文中也称为Ig样1结构域)是MuSK与Lrp4结合所必需的(Zhang et al.，2011)。第一Ig样1结构域的溶剂暴露表面上的单个残基I96的突变阻止了MuSK与Lrp4的结合以及对突触蛋白聚糖的响应(Stiegler et al.，2006；Zhang et al.，2011)。第一Ig样1结构域相对侧上的疏水表面介导MuSK同源二聚化，这对于MuSK反磷酸化至关重要。虽然MuSK由肌肉而不是由运动神经元表达，但MuSK对于突触前以及突触后分化是至关重要的(Burden et al.，2013)。MuSK通过在肌肉中聚集Lrp4来调节突触前分化，其通过不仅用作突触蛋白聚糖的受体和MuSK的配体，而且还用作突触前分化的直接逆行信号来双向发挥功能。除其在突触形成期间的作用之外，MuSK也是维持成人突触所必需的，因为抑制成人肌肉中MuSK表达导致突触前和突触后分化的严重缺陷(Hesser et al.，2006)。

如本文中所述，结合剂的一个结合区对人MuSK蛋白的Ig样1结构域(本文中也称为MuSK的免疫球蛋白样1结构域；MuSK Ig样1结构域；或MuSK的第一Ig样1结构域等)内的表位具有特异性(即与之特异性结合)。人MuSK蛋白的Ig样1结构域具有SEQ ID NO：2中所示的序列：

因此，本文中使用的“单特异性”结合剂是指仅包含一个抗原结合位点或包含多个(例如两个、三个、四个、五个等)各自相同(或至少其中的每一个与靶抗原中的相同表位结合)的抗原结合位点(例如可变区)的结合剂。如本文中所述，在用作MuSK拮抗剂的结合剂的情况下，如果例如，结合剂(例如结合蛋白例如抗体)仅具有一个结合区并且该结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，则其可以是单特异性的。

对于本文中所述的具有多个结合区的结合蛋白，结合剂必须是“多特异性的”(例如双特异性或三特异性等)。这是因为本文中所述的结合剂可仅具有一个对MuSK蛋白的Ig样1结构域具有特异性的结合区。因此，“双特异性”结合剂包含两个不同的抗原结合位点(并且因此双特异性结合蛋白与两个不同的抗原/表位结合)。

结合剂可以是本领域中已知的任何合适的结合剂。本文中所述结合剂的一些非限制性实例包括但不限于适配体(例如核酸适配体、肽适配体、aptabody、黏合素(affimer))、结合蛋白(例如抗体、抗体模拟物、骆驼科抗体、duobody等)和小分子。其他合适的结合剂也是公知的，并且本领域技术人员可使用常规实验程序容易地确定。

本文中使用的“适配体”是指核酸适配体和/或肽适配体。适配体的一些实例包括黏合素(肽适配体的演化)和aptabody(通过两种DNA适配体的杂交形成)，它们也是公知的并且本领域技术人员可使用常规实验程序容易地确定。

在一个实例中，结合剂是结合蛋白。合适的结合蛋白的一些实例包括抗体和抗体模拟物。抗体的一些实例在本文中其他地方提供。合适的抗体模拟物的一些实例包括亲和体分子(包括affimab)亲合蛋白(affilin)、肽适配体(包括黏合素)、affitin、α抗体(alphabody)、anticalin、亲和聚体(avimer)、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobodV)、纳米CLAMP等，它们也是公知的并且本领域技术人员可使用常规实验程序容易地确定。

如本文中其他地方所述，并且如实施例中所示，结合剂可以是抗体。本文中使用的术语“抗体”是指与已知抗原结合的分子或分子的活性片段，特别地其是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原的结合位点的分子。本文中所述的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类别(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，并且可基于来自任何物种的重链序列。例如，物种可以是但不限于狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、小鼠、大鼠等。该物种可以是灵长类(例如非人灵长类)。在一个优选实例中，该物种是人。

术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、人抗体和人源化抗体及其活性片段。与已知抗原结合并且有用的分子的活性片段的一些实例包括Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、duobody、三特异性三链抗体、单结构域抗体和双特异性微抗体，其包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和以上提及的任何抗体和片段的表位结合片段。

在一个具体实例中，抗体可以是单克隆抗体。本文中使用的术语“单克隆抗体”是指可在实验室中从单个克隆大量产生并且识别仅一种抗原的抗体。单克隆抗体可通过本领域中已知的任何合适的技术产生(例如，通过在HEK或昆虫细胞中产生，或通过产生B细胞杂交瘤)。

本文中使用的术语“嵌合抗体”是指包含来自一种来源或物种(即非人灵长类、人、狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、小鼠、大鼠等)的可变区(即结合区)和来源于不同来源或物种的至少一部分恒定区的单克隆抗体，其通常通过重组DNA技术制备。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是实例。这样的嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，其包含编码小鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本公开内容涵盖的其他形式的“嵌合抗体”是其中该类别或亚类已从原始抗体的类别或亚类被修饰或改变的那些，例如对它们进行改变以使得它们是补体和Fc受体结合缺陷的。用于产生嵌合抗体的方法涉及本领域目前公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison，S.L.，et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利No.5,202,238和美国专利No.5,204,244。

在一个具体实例中，本文中所述的抗体是补体和Fc受体结合缺陷的。

在一个具体实例中，抗体可以是人抗体或人源化抗体。

本文中使用的术语“人源化抗体”或“抗体的人源化形式”是指其中框架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一些实例中，将VH和VL的CDR接枝到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。参见，例如Riechmann，L.，et al.，Nature 332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，et al.，Nature 314(1985)268-270。重链和轻链可变框架区可来源于相同或不同的人抗体序列。重链和轻链二者可能是有效抗原(MuSK)结合所必需的。人抗体序列可以是天然人抗体的序列。人重链和轻链可变框架区例如在Lefranc，M.-P.，Current Protocols in Immunology(2000)-Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37中列出并且例如可通过IMGT(国际免疫遗传学信息系统

(the international ImMunoGeneTics information

)(http：//imgt.cines.fr)或通过http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk访问。任选地，框架区可通过进一步突变来修饰。示例性的CDR对应于识别针对嵌合抗体的上述抗原的那些表示序列。在一些实例中，这样的人源化形式与人恒定区嵌合。

本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是公知的(van Dijk，M.A.，and van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库(repertoire)或选择的转基因动物(例如，小鼠)中产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中导致在抗原攻击后产生人抗体(参见，例如Jakobovits，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，et al.，Nature 362(1993)255-258；Brueggemann，M.D.，etal.，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体也可在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，and Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，et al.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole，A.，et al.和Boerner，P.，et al.的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole，A.，et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Liss，A.R.(1985)p.77；和Boerner，P.，et al.，J.Immunol.147(1991)86-95)。

在一个具体实例中，抗体可选自Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。

另一些实例包括单结构域抗体，例如在骆驼科(包括但不限于美洲驼和羊驼)；以及软骨鱼(包括但不限于本领域中公知的鲨鱼)中发现的那些。

本文中使用的“单链抗体”是指单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird et al.，1988，Science 242：423-426，Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883；或者双特异性单链Fv(WO 03/11161)。典型的scFv接头是本领域中公知的，通常长度为10至25个氨基酸并且包含甘氨酸和丝氨酸。

单结构域抗体片段(VHH或纳米抗体)，例如由骆驼科产生的没有轻链并且其中单个N-末端结构域完全能够结合抗原的功能性抗体也是本文中所述结合剂的一个实例。这样的片段也可形成二价VHH或五抗体(即具有5个VHH结构域)。

本文中使用的“二-scFv”是指二聚化的scFV。

本文中使用的“微抗体”是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化的抗体样蛋白质。参见Hu et al.，1996，Cancer Res.56：3055-3061。在一些情况下，scFv可与Fc区连接，并且可包含一些或整个铰链区。

本文中使用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VH和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以是指处于孤立状态的该区，或者是在全长抗体或抗体片段或fab融合蛋白的情况下的该区。

术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”应理解为限定包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以是指处于孤立状态的该区，或者是在本文中所述抗体分子的情况下的该区，以及全长免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。通常来说，Fab区包含抗体的整个轻链。可采用Fab区来限定免疫球蛋白分子的“一个臂”。它包含该Ig的表位结合部分。天然免疫球蛋白的Fab区可通过木瓜蛋白酶消化作为蛋白水解片段获得。“F(ab’)2部分”是胃蛋白酶消化的免疫球蛋白的蛋白水解片段。“Fab’部分”是还原F(ab’)2部分的二硫键而产生的产物。本文中使用的术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”还可包含限定抗体臂(参见上文)的C-末端端的铰链区。该铰链区对应于全长免疫球蛋白内CH1结构域的C-末端发现的铰链区，在该铰链区处抗体分子的臂可被用来限定Y。在本领域中使用术语铰链区，因为免疫球蛋白在该区具有一些柔性。

本文中使用的“Fc融合体”意指其中一种或更多种多肽与Fc可操作地连接的蛋白质。在本文中Fc融合体意指与现有技术(Chamow et al.，1996，Trends Biotechnol 14：52-60；Ashkenazi et al.，1997，Curr Opin Immunol 9：195-200)中使用的术语“免疫黏附素”、“Ig融合体”、“Ig嵌合体”和“受体球蛋白”(有时具有破折号)同义。Fc融合体将免疫球蛋白的Fc区与融合配偶体组合，所述融合配偶体通常可以是任何蛋白质、多肽或小分子。Fc融合体的非Fc部分(即融合配偶体)的作用是介导靶标结合，并因此它在功能上类似于抗体的可变区。事实上，任何蛋白质或小分子均可与Fc连接以产生Fc融合体。蛋白质融合配偶体可包括但不限于受体的靶结合区、黏附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白质或蛋白质结构域。小分子融合配偶体可包括将Fc融合体引导至治疗靶标的任何治疗剂。这样的靶标可以是任何分子，例如与疾病相关的胞外受体。

本文中使用的术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如可能是其可变结构域，或者至少是其抗原结合位点。抗体片段的一些实例包括双链抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体例如在Huston，J.S.，Methods in Enzymol.203(1991)46-88中进行了描述。抗体片段可通过许多本领域已知的技术来源于本文中所述的抗体。例如，经纯化的单克隆抗体可用酶(例如胃蛋白酶)切割，并进行HPLC凝胶过滤。然后可收集含Fab片段的适当级分，并通过膜过滤等进行浓缩。关于用于分离抗体活性片段的一般技术的进一步描述，参见，例如Khaw，B.A.et al.J.Nucl.Med.23：1011-1019(1982)；Rousseaux et al.Methods Enzymology，121：663-69，Academic Press，1986。

本文中提供的结合蛋白可由已被密码子优化以提高蛋白质在适当宿主(例如HEK细胞或昆虫细胞)中表达的核酸分子编码。密码子优化和蛋白质产生技术是本领域中公知的，并且可容易地适于产生本文中所述的结合蛋白。

在一个具体实例中，本文中所述的结合蛋白可以是IgG。IgG可选自IgG1、IgG2或IgG3。在一个替代实例中，本文中所述的结合蛋白可以是IgG4变体(在以下更详细地描述)。

在体内，IgG4自然进行Fab臂交换，这使其在功能上是双特异性的，从而防止抗原的交联和内化(van der Neut Kolfschoten et al.，2007)。本文中使用的术语“Fab臂交换”或“FAE”意指一种抗体的一个完整的重-轻链对(半分子或半IgG)与另一种抗体的一个完整的重-轻链对(半分子或半IgG)的交换和重组。换句话说，本文中(以及在更广泛的文献中)使用的“Fab臂交换”是指导致人IgG4“半分子”交换(半IgG交换-参见例如：Schuurmanet al.，mAbs 4：6，636-636Nov/Dec 2012)的过程。Fab臂交换也称为IgG4混编(shuffling)，其中天然IgG4铰链二硫键对还原的敏感性提高使得重链分离并随机重新缔合以产生IgG4分子与随机重链和轻链对的混合群(Aalberse et al.，1999.Int ArchAllergy Immunol 118：187-189；Labrijn，et al，2009，Nat Biotechnol 27：767-771；Schuurman et al，2001.Mol Immunol 38：1-8；van der Neut Kolfschoten et al，2007.Science 317：1554-1557)。还参见Makaraviciute A，Jackson CD，Millner PA，RamanavicieneA.J Immunol Methods.2016 Feb；429：50-6。因此，术语“Fab臂交换”、“半抗体交换”和“半IgG交换”在本文中可互换使用。

在本发明的情况下，以及在具有多个可变结构域的结合蛋白(例如双特异性结合蛋白，其具有仅一个对MuSK蛋白的Ig样1结构域具有特异性的可变区)的情况下，有利的是：降低或去除IgG4进行Fab臂交换的能力(即以确保结合蛋白保留仅一个与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的可变区，并且因此保留了其MuSK拮抗剂特性)，或使用将与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区引入到IgG1(或IgG2或IgG3)背景中，其中所得IgG是双特异性的(即仅具有一个与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的结合区，如本文中其他地方所述)。

因此，本文中所述的结合蛋白可以是体内Fab臂交换能力降低的IgG4变体(例如，IgG4可能不能进行Fab臂交换)。该类型的结合蛋白特别有用，因为IgG4抗体被认为是“抗炎”抗体，因为它们不能与补体结合或募集免疫细胞(Lighaam et al.，2016)。因此，当将本文中所述的IgG4变体施用于本文中所述的对象时(与等同的IgG1、IgG2或IgG3相比)不太可能诱导炎性应答。

因此，可产生体内Fab臂交换能力降低的IgG4抗体变体用于本文中所述的方法，其中IgG4变体包含两个可变区，其中结合蛋白中仅一个可变区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

本文中使用的“体内Fab臂交换能力降低”的IgG4变体是指在相同的(体内)条件下，Fab臂交换率低于参照IgG4抗体的IgG4。“能力降低”是指Fab臂交换率的降低(例如，在限定时间段内(从测试开始例如向对象如小鼠或人对象施用IgG4的点开始设定)Fab臂交换率降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％)。用于测量Fab臂交换率的方法是本领域中已知的。

IgG4混编/Fab臂交换的降低可通过检测与由包含IgG4铰链或CH3区(其不包含所述一个或更多个氨基酸替换)的IgG4分子所产生的半抗体分子或臂交换的量相比的以下的降低来确定：由本文中所述的IgG4变体(例如，其在铰链或CH3区包含一个或更多个氨基酸替换)所产生的半抗体分子的量、新的双特异性抗体或臂交换的检测量。本领域公知的任何测定均可用于检测半抗体产生和双特异性抗体分子。对于用于检测双特异性抗体产生的测定的实例参见，例如Van der Neut Kolfschoten et al，2007，Science，317：1554-1557。

本文中使用的“不能进行Fab臂交换”的IgG4变体意指该IgG4变体不能在体内(例如，当在24小时时间段内(从向对象例如小鼠对象或人对象施用IgG4的点开始设定)测量时)或体外(例如，当使用还原剂例如谷胱甘肽时)将一种抗体的一个完整重-轻链对(半分子)与另一种抗体的一个完整重-轻链对(半分子)进行交换和重组。换句话说，在该情况下，二价且双特异性(即一只臂与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，并且一只臂与无关蛋白结合)的IgG4变体将不能进行Fab臂交换，并且因此将在体内(例如，当在限定时间段内(从测试开始例如向对象如小鼠对象或人对象施用IgG4的点开始设定)测量时)保持双特异性。用于确定IgG4是否进行Fab臂交换的方法是本领域已知的并且如上所述。

在一个实例中，IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含降低体内Fab臂交换能力的一个或更多个氨基酸替换。

例如，IgG4变体不能进行Fab臂交换，因为它包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含根据EU索引编号的重链的第228位氨基酸处的氨基酸替换和/或第405位氨基酸处的氨基酸替换和/或第409位氨基酸处的氨基酸替换(参见Edelman et al.，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63(1)：78-85和Huijbers 2016)。人IgG4铰链或CH3区中的这些替换中的一个或更多个导致链内二硫键形成显著降低，从而导致IgG4“半抗体”分子减少以及IgG4分子的异质性/混编降低(Bloom et al.1997，Protein Sci，6：407-415；Angal etal，1993，Molecular Immunology，30(1)：105-108))。也有公开报道这些铰链或CH3突变(或缺乏Fab臂交换所需残基的突变形式)可能降低IgG4混编并提高体内IgG4分子的半衰期(Labrijn，et al，2009，Nat Biotechnol 27：767-771；Stubenrauch，et al，2010，DrugMetab Dispos 38：84-91)。

因此，本文中所述的IgG4变体可在IgG4铰链或CH3区中包含一个或更多个氨基酸替换，其中相对于包含IgG4铰链或CH3区(其不包含所述一个或更多个氨基酸替换)的抗体，IgG4混编降低。在一个具体实例中，IgG4铰链或CH3区包含单个氨基酸替换(在根据EU索引编号的重链的第228位处(例如S228P)、或第409位氨基酸处(例如R409K)、或第405位氨基酸处(例如F405L)中任一个)。在另一个具体实例中，IgG4铰链或CH3区包含两个氨基酸替换(在根据EU索引编号的重链的第228位处(例如S228P)和第409位处(例如R409K)；或第228位处(例如S228P)和第405位处(例如F405L)；或者第405位处(例如F405L)和第409位处(例如R409K))。在另一个具体实例中，IgG4铰链或CH3区包含三个氨基酸替换(在根据EU索引编号重链的第228位处(例如S228P)、第405位处(例如F405L)和第409位处(例如R409K))。在另一些具体实例中，IgG4区另外包含另一些氨基酸替换；适当的替换是本领域中公知的。

对象的治疗

本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状。

本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)还可用于在对象中预防、调节或降低皮肤起皱。

术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用。

在某些实例中，对象是哺乳动物。因此，对象是指例如狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、小鼠、大鼠等。对象可以是灵长类(例如非人灵长类)。在一个优选实例中，对象是人。

对象通常是需要在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的对象。

本文中提供的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于美容(即非治疗性)或治疗性目的，如下所概述的。

结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可有利地用于在对象中预防、调节或降低皮肤起皱。在一个实例中，这样的用途被认为是“美容的”和/或“非治疗性的”。

因此，提供了在对象中预防、调节或降低皮肤起皱的方法，其中所述方法包括向对象施用本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)。在一个实例中，这样的方法被认为是“美容的”和/或“非治疗性的”。

本文中使用的术语“美容的”和“非治疗性的”可互换使用，并且旨在是指以在对象中解决(例如改善、预防或调节)美容的非病理状况为意图而进行的干预。例如，美容治疗可用于恢复或改善对象的外观。

因此，本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于在对象中预防、调节或降低皮肤起皱。出于该目的用于施用结合剂的合适方法是本领域中公知的，并且包括但不限于注射。

预防、调节或降低皮肤起皱的方法也可被认为是增强皮肤组织的放松(relaxation)或松弛(slackening)的方法。所述方法可包括以有效增强皮下存在于皮肤组织的肌肉或肌肉群的去神经以增强皮肤组织的放松或松弛的量向该皮肤组织局部施用本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)。在一些实例中，皮下施用结合剂(例如结合蛋白例如抗体)。

优选地，皮肤组织的放松或松弛导致皮肤的皱纹或细纹减少。

有利地，本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)也可用于治疗性目的。本文中使用的术语“治疗性的”旨在是指对对象的“治疗”。

本文中使用的术语“治疗”被认为包括以预防病症、障碍或症状的发生或改变其病理状况为意图而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防或预防性措施二者，其中目的是预防或减慢(减少)目标病症、障碍或症状。本文中使用的术语“疾病”和“障碍”可互换使用。

本文中使用的术语“对象”是指患有特定病症、障碍或症状或者处于患有特定病症、障碍或症状的风险之中的个体(例如，人或非人灵长类)。对象可以是患者，即需要根据本发明进行治疗的对象。对象可能已接受了针对所述病症、障碍或症状的治疗。或者，对象在根据本发明进行治疗之前未进行治疗。

本文中提供的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍或症状。

从本文正文将清楚的是，所述结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于抑制神经肌肉传递。在该情况下，“抑制”神经肌肉传递涵盖降低或减少神经肌肉传递(例如，当将不存在结合剂的情况下的神经肌肉传递水平与存在结合剂的情况下的神经肌肉传递水平进行比较时)。为了避免疑问，“抑制”、“降低”、“降低的”“减少”、或“减少的”以及等同术语在本文中通常全部用来意指统计学上显著的量的降低。“抑制”、“降低”、“降低的”“减少”、或“减少的”通常意指与对照(即在不存在结合剂的情况下)相比降低至少10％，例如与对照(即在不存在结合剂的情况下)相比降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多至并包括100％降低，或10％至100％之间的任何降低；或者与对照(即在不存在结合剂的情况下)相比至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍降低、或1.0倍至10倍之间的任何降低或更大。

技术人员将充分意识到通过抑制神经肌肉传递而减轻的疾病或病症，因为肉毒毒素A的使用已广泛用于药物和美容治疗多年(参见，例如Jankovic(2004)Botulinum inclinical practice.J Neurol Neurosurg Psychiatry 75 951-957)。特别是，通过肉毒毒素A介导的突触传递抑制而减轻的一些疾病或病症选自：张力障碍、面肌痉挛、斜视、由于脑性瘫痪引起的肌张力过高、口吃、慢性紧张性头痛、咽下缩肌痉挛、疼痛、偏头痛或美容治疗例如减少皱纹、眉头皱纹等。

本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于在对象中治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍或症状。提供了治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍或症状的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)。因此，提供了体内治疗方法，其可以是预防性和/或治疗性的。

本文中使用的治疗或预防“通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状”旨在包括治疗或预防：继发于痉挛或非自主肌肉动作的疼痛，对象中的神经障碍或病症，由非自主性痉挛、肌痉挛状态、斜视、职业性痉挛、肛裂、偏头痛、磨牙症、及其任意组合引起的病症或疾病。

在一个实例中，疼痛是与神经肌肉障碍相关的疼痛。

在一个实例中，由非自主性肌痉挛引起的病症或疾病选自：半面痉挛、睑痉挛、喉发声障碍(laryngeal dysphoria)、头张力障碍、颈张力障碍、肢张力障碍或直肠痉挛。

本文中使用的治疗或预防“通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状”还旨在包括在对象中校正由于过度肌肉活动而造成的外部外观变形。

本文中使用的“过度肌肉活动”是指与正常相比肌肉活动提高。可使用本文中所述的结合剂来校正的外部外观变形的一些实例包括肌痉挛和抽搐。

本文中使用的治疗或预防“通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状”(在本文中也称为治疗或预防“由过度肌肉活动引起的病症、障碍或症状”)也旨在包括在对象中治疗或预防肌肉或肌肉群中的痉挛或非自主性收缩。痉挛或非自主性收缩的一些非限制性实例包括睑痉挛、斜视、痉挛性斜颈、局灶性张力障碍、下颌张力障碍、职业性张力障碍、角膜溃疡(保护性上睑下垂)、痉挛性发声障碍(喉张力障碍)或面部运动障碍例如梅热综合征(Meige syndrome)、半面痉挛、面部神经的异常再生或眼睑张开失用。

本发明人已表明，本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可在NMJ处通过抑制MuSK磷酸化而用作拮抗剂。MuSK磷酸化的降低使AChR聚集受损，并随后阻断神经肌肉传递。因此，本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于在对象中诱导短暂的局部肌无力(例如轻瘫)。也可诱导长期的局部肌无力/轻瘫(例如，通过多轮施用)。因此，它们可用作肉毒神经毒素施用的替代物。

A型肉毒神经毒素(BoNT A型或BoNT/A)由于其在局部注射微量(1pM浓度)后引起非常长的神经肌肉轻瘫的能力而被证明具有重要的医学意义(Pirazzini-M et al.，Pharmacol Rev 2017；69：200)。在过去的30年中，BoNT/A和其他肉毒神经毒素已被成功地用于医学和美容目的。这些毒素使NMJ沉默并且还可阻断神经递质从许多类型的神经元中释放。事实上人体的每一部分(包括脑)[Botulinum toxin therapy forneuropsychiatric disorders，US 20040180061 A1]可使用BoNT/A治疗。已成功用于美容治疗的BoNT/A形式的一个实例是保妥适(Botox)。由于NMJ的轻瘫是可逆的，肌肉的持续放松需要每三到四个月重复注射。BoNT/A不仅可阻断横纹肌的神经支配，还可阻断平滑肌的神经支配。因此，基于肉毒杆菌的治疗最近已扩展到包括从张力障碍到胃肠和泌尿障碍的令人眼花缭乱的近百种病症的组。

本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可用于以治疗有效量施用于对象。“治疗有效量”意指将引发所寻求的对象的生物学或医学响应的药物、化合物、抗体或药用结合剂的量。因此，在本文中所述的治疗性应用中，以足以至少部分地阻止症状或者疾病及其并发症的量向对象施用药剂和/或其组合物。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效量或剂量”。对于该用途有效的量将取决于疾病的严重程度以及患者的体重和总体状况。

本文中所述的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)可以是包含所述结合剂和一种或更多种其他组分的组合物(例如药物组合物)的一部分。组合物可以是包含本文中所述的结合剂和可药用赋形剂、佐剂、稀释剂和/或载体的组合物。组合物可常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、辅助免疫增强剂例如佐剂和细胞因子以及任选地其他治疗剂或化合物。

本文中使用的“可药用”是指不是生物学上或其他方面不期望的物质，即，该物质可与选择的结合剂一起施用于个体，而不会引起任何不期望的生物学作用或以有害方式与包含它的药物组合物的其他组分中的任一种相互作用。

赋形剂是包括出于扩大制剂或在最终剂型中赋予活性成分治疗性增强(例如有助于药物吸收或溶解性)的目的与活性成分(例如本文中提供的结合蛋白)一起配制的天然或合成物质。赋形剂还可用于制造过程，以除帮助体外稳定性(例如在预期的保质期内阻止变性)之外还帮助处理有关的活性物质(例如通过有助于粉末流动性或非黏特性)。可药用赋形剂是本领域中公知的。因此，合适的赋形剂可由本领域普通技术人员容易地确定。举例来说，合适的可药用赋形剂包括水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等。

佐剂是改变制剂中其他试剂的作用的药理学和/或免疫学试剂。可药用佐剂是本领域中公知的。因此，合适的佐剂可由本领域普通技术人员容易地确定。

稀释剂是进行稀释的物质。可药用稀释剂是本领域中公知的。因此，合适的稀释剂可由本领域普通技术人员容易地确定。

载体在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与制剂的其他成分相容。术语“载体”表示与活性成分组合以有利于应用的天然或合成的有机或无机成分。可药用载体是本领域中公知的。因此，合适的载体可由本领域普通技术人员容易地确定。

一般来说，结合剂(例如结合蛋白例如抗体)以药学有效量施用。实际施用的结合剂的量通常将由医师根据相关情况包括待治疗的病症，选择的施用途径，实际施用的化合物，个体患者的年龄、体重及响应，患者症状的严重程度等来确定。

药物组合物可通过多种途径包括经口、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内施用。组合物通常以单位剂型存在以有助于准确给药。术语“单位剂型”是指适合作为用于人对象和其他哺乳动物的单一剂量的物理上离散的单位，每个单位包含与合适的药物赋形剂相关的预定量的活性物质，其经计算以产生期望的治疗效果。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充的、预测量的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下为丸剂、片剂、胶囊剂等。在这样的组合物中，呋喃磺酸化合物通常是次要组分(按重量计约0.1％至约50％，或优选按重量计约1％至约40％)，其余部分为多种载剂或载体和有助于形成期望给药形式的加工助剂。

适合于经口施用的液体形式可包括具有缓冲剂、助悬剂和分散剂、着色剂、矫味剂等的合适的水性或非水性载剂。固体形式可包括例如以下成分中的任一种或相似性质的化合物：黏合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。

可注射组合物通常基于可注射无菌盐水或磷酸缓冲盐水或本领域中已知的其他可注射载体。如前所述，这样的组合物中的活性化合物通常为次要组分，通常为按重量计约0.05％至10％，其余部分是可注射载体等。

通常将经皮组合物配制为包含活性成分的表面软膏剂或乳膏剂，其量通常为按重量计约0.01％至约20％，优选按重量计约0.1％至约20％，优选按重量计约0.1％至约10％，并且更优选按重量计约0.5％至约15％。当配制为软膏剂时，活性成分通常将与石蜡或水混溶的软膏剂基质组合。

优选地，所述组合物是可注射或经皮组合物。

用于药物组合物的上述组分仅是代表性的。另一些物质以及加工技术等在Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th edition，1985，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania的第8部分中进行了阐述。

本文中所述的化合物还可以以持续释放形式或从持续释放药物递送系统施用。代表性的持续释放物质的描述可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences。

本文中所述的化合物可作为单独的活性剂施用，或者它们可与其他试剂组合施用，所述其他试剂包括表现出相同或相似治疗活性并被确定对于这样的组合施用安全且有效的其他化合物。

方法

提供了在对象中预防、调节或降低皮肤起皱的方法，所述方法包括向对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

该方法被认为是美容的。

合适结合剂、对象、药物组合物、用于施用的手段和用于确定成功施用的测试的特征在以上进行了详细描述并且同样适用于该方面。

还提供了治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的方法；所述方法包括向对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

所述结合剂用于以治疗有效量施用于合适的对象。

治疗有效量可足以在对象中降低MuSK活性，并且从而在对象中减轻与神经肌肉传递水平升高(提高或异常)相关的病症、障碍和/或症状。

合适结合剂、对象、病症、障碍和症状、药物组合物、用于施用的手段和用于确定成功治疗的测试的特征在以上进行了详细描述并且同样适用于该方面。

本文中使用的“降低”是指下调。

本文中使用的“升高”是指高于正常、提高或上调。

本文中使用的“MuSK活性”是指根据标准技术如在体内或体外确定的MuSK蛋白、多肽或核酸分子(例如在表达MuSK的细胞或组织中)的生物学活性和功能活性二者。MuSK活性包括在NMJ处细胞膜上的MuSK二聚化、MuSK磷酸化或对AChR聚集的刺激。MuSK活化可导致诱导或维持突触后分化。

用于测量神经肌肉传递的数种方法是本领域中已知的，例如，可使用肌电图或电生理学证据。

药物的制备

在另一个方面中，本发明提供了包含一个或更多个结合区的结合剂(例如结合蛋白例如抗体)在制备用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的药物中的用途，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。该药物用于以治疗有效量施用于合适的对象。

合适结合剂、对象、障碍和症状、药物组合物、用于施用的手段和用于确定成功治疗的测试的特征在以上进行了详细描述并且同样适用于该方面。

通过参考以下非限制性实施例可更好地理解本发明，所述非限制性实施例作为本发明的示例提供。给出以下实施例以更充分地举例说明本发明的一些优选实施方案，并且然而，决不应将其解释为限制本发明的广泛范围。

实施例

以下提供的数据表明，与MuSK的Ig样1结构域结合的功能上单价的MuSK抗体(分离自患者)作为拮抗剂发挥作用。相反地，相同的二价单特异性形式的抗体作为激动剂发挥作用。由于血清IgG4因Fab臂交换而在功能上也是单价的，并且IgG4患者的MuSK抗体在动物模型和人中引起MG，因此这些抗体的单价被认为是MuSK MG病理生理学的决定性因素。

结果

对所包括的MuSK MG患者的描述

为了分离MuSK特异性B细胞，从两名MuSK MG患者中分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。这些患者的临床特征在表2中进行了描述。产生最高数目的MuSK特异性B细胞的患者在利妥昔单抗治疗之后复发。

表2：PBMC提取时来自研究对象的临床特征。

来自MuSK MG患者的MuSK自身抗体的分离和遗传特征

抗原特异性单细胞分选产生了八个来自两名MuSK MG患者的MuSK结合B细胞。患者1的循环MuSK克隆的频率为约7个/1亿个PBMC，并且患者2的频率为2.5个/1亿个PBMC。表3中给出了MuSK自身抗体特征的概述。对于8个产生MuSK自身抗体的克隆中的6个，本发明人可分离重链(V_H)和轻链(V_L)的可变区序列。对于一个克隆，仅可对V_H可变区进行测序。

表3：MuSK自身抗体特征

有趣的是，分离的大多数抗体是IgG1同种型。另外，本发明人鉴定了一个IgG4克隆和一个IgG3克隆。

Fab臂交换是IgG4的重要特征并且可能影响MuSK自身抗体的功能特征(Konecznyet al.，2017)。先前有关多克隆纯化级分的工作表明MuSK MG IgG4具有进行Fab臂交换的能力(Koneczny et al.，2017)。本发明人对分离的MuSK单克隆抗体的V_H进行了测序，并证实这些抗体确实具有进行Fab臂交换所需的第228位处的丝氨酸和第409位处的精氨酸(数据未示出)。

Fab的N-连接糖基化对于例如类风湿关节炎ACPA自身抗体中的抗原结合可能是重要的(van de Bovenkamp et al.，2018)。因此，本发明人评估了单克隆MuSK自体抗体可变区中NXST(其中X不能为P)基序的存在。在仅一个克隆中，发现了这样的基序，表明Fab的糖基化对于所有MuSK自身抗体不是必需的。

重组MuSK单克隆自身抗体的功能特征

自身抗体结合表位是自身免疫病病理机理的重要决定因素。MuSK的Ig样1结构域先前被认为是多克隆IgG4患者抗体级分和血清中的MuSK的主要免疫原性区(Huijbers etal.，2016)。对于五种患者来源的MuSK抗体，表位可定位到MuSK的第一Ig样1结构域(表3)。迄今为止，尚未鉴定出针对其他结构域的单克隆自身抗体。为了建立MuSK自身抗体的功能特征，由IgG1分离的克隆和IgG4分离的克隆产生了重组抗体。为了评估MuSK MG中自身抗体同种型的重要性，将这些可变区中的每一个均克隆到IgG1和IgG4骨架二者中。

为了评估重组患者来源的IgG1和IgG4 MuSK抗体在NMJ突触后膜处与MuSK结合的能力，本发明人对分离的小鼠骨骼肌进行了免疫染色。重组单克隆抗体的IgG1和IgG4形式二者均与NMJ明显结合(图1，示出了IgG4重组抗体的数据)。

成功的神经肌肉传递依赖于适当聚集的AChR，并且因此通过突触蛋白聚糖-Lrp4-MuSK信号传导级联严格进行协调(Burden et al.，2018)。突触蛋白聚糖由运动神经末梢释放，结合Lrp4，并且Lrp4随后结合并刺激MuSK二聚化和转磷酸化。MuSK磷酸化的活化刺激了多种胞内信号传导级联，其中的一个在AChR聚集中达到顶峰。经纯化的患者IgG4 MuSK自身抗体抑制MuSK-Lrp4相互作用、MuSK磷酸化，并且由此降低C2C12肌管培养物和小鼠中的AChR聚集(Huijbers&Zhang 2013，Koneczny et al.，2013)。有趣的是，当评估患者来源的MuSK单克隆抗体对MuSK磷酸化的作用时，重组IgG1和IgG4(二价单特异性)抗体二者均强烈活化而不是抑制MuSK磷酸化(图2A)。在不存在和存在突触蛋白聚糖两种情况下均观察到了该作用。此外，MuSK磷酸化的活化是浓度依赖性的(图2B)，并且在两个克隆之间略微不同。通过木瓜蛋白酶消化从相同抗体产生的单价Fab抗体片段抑制MuSK磷酸化(图2C)。

然而，重组单克隆IgG1和IgG4二者均参与二价单特异性抗体-抗原相互作用。为了探究患者中Fab臂交换的IgG4 MuSK抗体的双特异性和功能单价的功能作用，本发明人通过木瓜蛋白酶消化从这些重组抗体产生了单价Fab片段。在体外，与患者血清来源的抗MuSKIgG4类似，这些Fab片段抑制了突触蛋白聚糖依赖性MuSK磷酸化(图2C)和AChR聚集(图2D)。

相比之下，(并且与体外活化MuSK磷酸化一致)，与Fab片段相比，二价单特异性单克隆MuSK抗体活化了突触蛋白聚糖依赖性AChR聚集。此外，AChR聚集可使用独立于突触蛋白聚糖的二价单特异性抗体部分来诱导(图2D)。因此，单价MuSK结合阻断了AChR聚集途径，而二价单特异性MuSK抗体刺激MuSK，并且可在该组织培养模型中有助于或诱导AChR聚集。

这些观察表明，具有两个MuSK Ig样1结构域结合位点的药剂具有活化MuSK的能力，而具有仅一个MuSK Ig样1结构域结合位点的药剂(与用患者经纯化的IgG4或Fab片段所见到的类似)抑制MuSK活化。

MuSK抗体表征

分离了与MuSK的Ig样1结构域结合的MuSK抗体(分离自具有MuSK血清抗体的重症肌无力患者)并对其进行测序，如下详细说明的。如图3和4中所示，从MuSK MG患者获得了总共八种MuSK Ig样1结构域反应性抗体(11-3D9、11-3F6、11-8G4、13-3B5、13-3D10、13-4D3、14-2E9和11-7C5)。

对与MuSK蛋白的Ig样1结构域的结合具有特异性的可变区序列/结合区

获得了这些克隆中七个克隆(11-3D9、11-3F6、11-8G4、13-3B5、13-3D10、13-4D3和14-2E9)的可变区氨基酸序列。抗体的可变区通常由重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)构成。VH和VL中的每一个通常具有CDR1、CDR2和CDR3序列，这些序列共同赋予对靶抗原的特异性(即VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3共同赋予对靶抗原的特异性)。然而，如本文中先前所述的，单个VH或VL结构域(即VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3；或VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)也可能足以赋予抗原结合特异性。

对于六个克隆，已成功对重链可变结构域和轻链可变结构域二者进行测序-对于一个克隆(11-8G4)，仅成功获得了重链可变结构域序列。下面提供了每个克隆的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。轻链的类型也如下所示。HC＝重链；LC＝轻链；VH＝重链可变结构域；VL＝轻链可变结构域。具有下划线的氨基酸序列表示CDR(从氨基酸序列的N至C末端：CDR1、CDR2、CDR3)。

已使用IMGT/V-QUEST程序版本：3.4.17(2019年2月19日)-IMGT/V-QUEST参照目录发布：201910-2(2019年3月5日)(http：//imgt.org/IMGT_vquest/vquest)对抗体序列进行分析，选择了智人序列。

11-3D9 VH(SEQ ID NO：9)

换句话说，重链可变结构域(VH)CDR可以是如下：包含GFNFSTYT(SEQ ID NO：10)的CDR1、包含ISSRSAYK(SEQ ID NO：11)的CDR2和包含ARDFFQLGPPRFDS(SEQ ID NO：12)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：9的序列的VH的情况下。

11-3D9 VLk(SEQ ID NO：13)：

换句话说，轻链可变结构域(VL)CDR可以是如下：包含QRISSF(SEQ ID NO：14)的CDR1、包含GAS(SEQ ID NO：15)的CDR2和包含QQSYSPMYT(SEQ ID NO：16)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：13的序列的VL的情况下。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：10、11和12(重链)的CDR与SEQ ID NO：14、15和16(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：9(重链)与SEQ：13(轻链)的可变结构域的组合来获得。

11-3F6 VH(SEQ ID NO：17)：

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GFTFSSYT(SEQ ID NO：18)的CDR1、包含IGSNGDYI(SEQ ID NO：19)的CDR2和包含ARGQLAVAGTHFDY(SEQ ID NO：20)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：17的序列的VH的情况下。

11-3F6 VLk(SEQ ID NO：21)：

换句话说，轻链可变结构域CDR可以是如下：包含QKVNKY(SEQ ID NO：22)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：23)的CDR2和包含QQSYSPLCT(SEQ ID NO：24)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：21的序列的VL的情况下。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：18、19和20(重链)的CDR与SEQ ID NO：22、23和24(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：17(重链)与SEQ：21(轻链)的可变结构域的组合来获得。

11-8G4 VH(SEQ ID NO：25)(未得到该抗体的VL序列)

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GFTFSDFT(SEQ ID NO：26)的CDR1、包含IGSSGTFI(SEQ ID NO：27)的CDR2和包含ARGRIAVAGTHFDL(SEQ ID NO：28)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：25的序列的VH的情况下。

13-3B5 VH(SEQ ID NO：29)：

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GYTFTGQY(SEQ ID NO：30)的CDR1、包含INPSSGVT(SEQ ID NO：31)的CDR2和包含ATLSLGVYYVGMVA(SEQ ID NO：32)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：29的序列的VH的情况下。

13-3B5 VL1可变区(SEQ ID NO：33)

换句话说，轻链可变结构域CDR可以是如下：包含GLAQQH(SEQ ID NO：34)的CDR1、包含KDI(SEQ ID NO：35)的CDR2和包含QSGDRTATSVL(SEQ ID NO：36)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：33的序列的VL的情况下。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：30、31和32(重链)的CDR与SEQ ID NO：34、35和36(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：29(重链)与SEQ：33(轻链)的可变结构域的组合来获得。

13-3D10 VH(SEQ ID NO：37)

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GFDFSAST(SEQ ID NO：38)的CDR1、包含VSGDSHHI(SEQ ID NO：39)的CDR2和包含ARERLLRLGVGFDS(SEQ ID NO：40)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：37的序列的VH的情况下。

13-3D10 VLk(SEQ ID NO：41)

换句话说，轻链可变结构域CDR可以是如下：包含QRISGF(SEQ ID NO：42)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：43)的CDR2和包含QQSYSPLYT(SEQ ID NO：44)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：41的序列的VL的情况下。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：38、39和40(重链)的CDR与SEQ ID NO：42、43和44(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：37(重链)与SEQ：41(轻链)的可变结构域的组合来获得。

13-4D3 VH(SEQ ID NO：45)

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GFTFSSYT(SEQ ID NO：46)的CDR1、包含ISSGGHYI(SEQ ID NO：47)的CDR2和包含ARERLLRLGVGFDF(SEQ ID NO：48)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：45的序列的VH的情况下。

13-3D4 VLk(SEQ ID NO：49)

换句话说，轻链可变结构域CDR可以是如下：包含QSISGY(SEQ ID NO：50)的CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：51)的CDR2和包含QQSYSALYT(SEQ ID NO：52)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：49的序列的VL的情况下。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：46、47和48(重链)的CDR与SEQ ID NO：50、51和52(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：45(重链)与SEQ：49(轻链)的可变结构域的组合来获得。

14-2E9 VH(SEQ ID NO：53)

换句话说，重链可变结构域CDR可以是如下：包含GFTFSSYW(SEQ ID NO：54)的CDR1、包含LNEDGSTT(SEQ ID NO：55)的CDR2和包含VSDLSGKDEH(SEQ ID NO：56)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：53的序列的VH的情况下。

14-2E9 LCk(SEQ ID NO：57)

换句话说，轻链可变结构域CDR可以是如下：包含QSLLHSNGYYW(SEQ ID NO：58)的CDR1、包含LGF(SEQ ID NO：59)的CDR2和包含MQGLQTPYT(SEQ ID NO：60)的CDR3。这些CDR可任选地在包含SEQ ID NO：57的序列的VL的情况下。

SEQ ID NO：54、55和56(重链)的CDR可与SEQ ID NO：58、59和60(轻链)的CDR在一起。也可将SEQ ID NO：53(重链)与SEQ：57(轻链)的可变结构域组合。

抗原特异性可通过SEQ ID NO：54、55和56(重链)的CDR与SEQ ID NO：58、59和60(轻链)的CDR的组合来获得。例如，抗原特异性可通过SEQ ID NO：53(重链)与SEQ：57(轻链)的可变结构域的组合来获得。

Fc区序列

从5个克隆中留下足够的cDNA以确定抗体的Fc序列。参见以下亚类分析。参考序列获自ensemble.org。

参考序列

IgG1(SEQ ID NO：61)

IgG2(SEQ ID NO：62)

IgG3(SEQ ID NO：63)

IgG4(SEQ ID NO：64)

将由B细胞克隆产生的cDNA送出以用于桑格测序(sanger sequencing)。这给出了关于抗体Fc序列的明确数据。使用https：//web.expasy.org/translate/翻译DNA序列。

11-3D9克隆氨基酸序列(从cDNA翻译而来)-SEQ ID NO：65

11-8G4克隆氨基酸序列(从cDNA翻译而来)-SEQ ID NO：66

13-3D10克隆氨基酸序列(从cDNA翻译而来)-SEQ ID NO：67

13-4D3克隆氨基酸序列(从cDNA翻译而来)-SEQ ID NO：68

13-3B5克隆氨基酸序列(从cDNA翻译而来)-SEQ ID NO：69

使用多重序列比对程序Clustal W(1.83)，本发明人得出结论，11-3D9、11-8G4、13-3D10全部具有标准的IgG1序列(参见图5)。13-3B5具有标准的IgG4 Fc尾并且13-4D3具有IgG3 Fc序列。13-4D3的所有变体在ensemble.org上均是已知的。颜色编码指示不同抗体与其匹配的亚类参考序列之间的相似性。还用IgG1特异性抗体在ELISA中确定了11-3F6和14-2E9的亚类特异性(参见图3)。

讨论

这项研究最显著和出乎意料的发现之一是以下事实：(患者来源的)MuSK抗体价以及因此MuSK自身抗体同种型是其抑制MuSK功能和诱导MG的能力的关键决定因素。结合MuSK的Ig样1结构域的二价单特异性MuSK重组抗体作为激动剂发挥作用，并独立于突触蛋白聚糖在肌管培养物中活化MuSK磷酸化(和AChR聚集)。原始的IgG1和IgG4抗体二者均显示出该作用。相反，类似于经纯化的患者IgG4和IgG总，由这些抗体产生的功能上单价的Fab片段抑制了突触蛋白聚糖依赖性MuSK磷酸化(和AChR聚集)(Huijbers&Zhang et al.2013，Koneczny et al.，2013)。因此，患者IgG4进行Fab臂交换的能力显示出对于疾病的发病机理至关重要，因为Fab臂交换使内源产生的MuSK IgG4对MuSK抗原具有双特异性和功能上单价。先前的研究表明患者IgG4具有进行Fab臂交换的能力(Koneczny et al.2017 Jautoimmunity)，并且本文中所述MuSK单克隆的序列证实存在该过程所需的残基。数据表明，与MuSK Ig样1结构域结合的二价单特异性MuSK抗体具有二聚化和活化MuSK的能力，而功能上单价的MuSK Ig样1结构域抗体具有抑制MuSK二聚化并且因此抑制MuSK活化的能力。

总而言之，MuSK抗体价是功能作用的关键决定因素。具有两个MuSK Ig样1结构域结合位点的二价单特异性抗体刺激MuSK，而具有仅一个MuSK Ig样1结构域结合位点的单价或双特异性抗体阻断MuSK功能。

综上所述，该结果表明，MuSK抗体的功能单价对于诱导肌无力特征是至关重要的。

材料&方法

患者选择

在莱顿大学医疗中心(Leiden University Medical Center)在我们的MG门诊部中招募了MuSK MG患者，并基于以下对其进行选择：存在阳性MuSK抗体测试(RSR ltd)和与MG一致的临床特征。该研究是根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)进行的，得到了当地医学伦理委员会的批准，并且所有患者均签署了知情同意书。

从MuSK MG患者分离单克隆自身抗体

从低温保存的PBMC分离MuSK结合记忆B细胞，选择CD19⁺、CD20⁺、CD27⁺细胞(CD19-BV421 HIB19 BD、CD20-AF700 2H7 BD、CD27-APCHy7 M-T271 BD、0.1％BSA、2mM EDTA/dPBS，所有单克隆均是小鼠抗人)。为了去除死细胞和非B细胞，包括转储通道(dumpchannel)(7-AAD、00-6993-50、CD3/FITC UCHT1 BD和CD14/FITC M5E2、BD和CD56/FITCHCD56 Biolegend)。通过使用用R-PE(AS-72113，Anaspec)标记的大肠杆菌(Huijbers etal.，2016)中产生的重组MuSK以及用DyLight 650(Kostas Lazardinis和SocratesTzartos的友善的礼物，Dylight650 NHS酯，Thermofisher)标记的酵母中产生的MuSK进行抗原特异性细胞的选择。在96孔板中，在RPMI培养基中在辐照的L-CD40L饲养细胞(来自Kees van Kooten的友善的礼物)上培养单细胞，所述RPMI培养基补充有：1％青霉素、链霉素、-50μM β-巯基乙醇(M3148，Sigma)、20μg/ml人脱铁运铁蛋白(T2036，Sigma-Aldrich，用蛋白A琼脂糖凝胶[GE Healthcare(1ng/ml IL1b(201-LB-005、R&D)耗尽人IgG、50ng/mlIL-21(PHC0215，Thermofisher)、0.3ng/ml TNFa(210-TA-005，Thermofisher)、0.5μg/mlR848(SML0196，Sigma)(Lighaam et al.，2014)。每名患者使用平均5千万个PBMC来分离1至6个抗原特异性细胞。在两周之后，使用先前所述的MuSK ELISA(Huijbers et al.，2016)测试该培养基的MuSK反应性抗体。简言之，将重组MuSK在maxisorp板(NUNC)上包被过夜。第二天，将板用PBS洗涤，并用PBS中的2％酪蛋白0.01％吐温封闭。为了检测MuSK结合抗体，将培养基在封闭缓冲液中以1∶10孵育，并使用碱性磷酸酶标记的山羊抗人抗体(兔抗人IgG AP，309-055-008 Jackson实验室)和PNP作为底物检测结合的抗体。在Biotek读板仪上于405nm处读取板。

RNA分离、cDNA产生和抗体序列分离

在两周之后，将板进行旋转并去除上清液以进行上述抗体分析。将包含MuSK抗体产生细胞的单孔用150μl Qiazol裂解，并使用标准氯仿萃取和异丙醇/乙醇沉淀分离RNA。将RNA在8μl H₂O中再水化，并在-80℃下储存直至进一步使用。使用Smartscribe逆转录酶(Takara Bio Europe)、寡dT40引物和模板转换寡核苷酸直接合成cDNA(无需进行预扩增或纯化)，进行10轮扩增(表4中的引物序列)。通过ARTISAN PCR获得全长V(D)J。Koning etal.，2017。HC引物代表重链。

表4：引物序列。

其中“dT40”代表40个T核苷酸其后为VN，其中“v”代表A、C或G核苷酸中任一个并且“N”代表任何核苷酸(参见https：//www.mathworks.com/help/bioinfo/ref/baselookup.html)。在BC-TSO中，“rG”代表核糖鸟苷并且G+代表一种经LNA修饰的鸟苷。在hkappaLC反向引物中，“M”代表A或C核苷酸，并且在hlambdaLC反向引物中，“Y”代表C或T核苷酸。

重组抗体产生、纯化和表征

以IgG1和IgG4骨架pcDNA3.1载体在Geneart(Thermofisher)订购了重链和轻链序列，并使用FreeStyleTM 293表达培养基(12338，ThermoFisher)中的Fectin(12347-019，Thermofisher)在Freestyle HEK293-F细胞悬液(R790-07，Thermofisher)中进行转染。为了提高转染和产生效率，将细胞与SV40大T抗原hp21和hp27(来自Theo Rispens的友善的礼物)共转染。6天之后收集培养物，通过离心去除细胞碎片，并使用HiTrapTM蛋白A亲和柱(17-0402-01，GE Healthcare)在Akta pure(GE Healthcare)上纯化IgG。将抗体针对PBS进行透析，过滤灭菌并在-20℃下储存。使用木瓜蛋白酶根据制造商的说明(20341，ThermoFisher)并进行以下调整来从这些重组抗体产生Fab片段：抗体的输入浓度为0.5mg/mL，并且13-3B5的消化持续时间为1小时，且11-3F6和抗生物素的消化持续时间为3小时(当消化进行多于1小时时13-3B5丢失)。在RT下用蛋白A琼脂糖珠(11134515001，Roche)头对头(head over head)进行总IgG和Fc片段耗尽2小时。

为了确定使用了等量的MuSK特异性Fab，在用小鼠抗人Fab(1∶1000，SA1-19255，Pierce)和兔抗小鼠碱性磷酸酶抗体(1∶750，D0314，Dako)替换上述抗体组合的MuSK ELISA中测量了与其亲本抗体相比的浓度。使用相同的一抗和驴抗小鼠800CW(1∶10.000，925-32212，Licor)在western印迹中比较MuSK Fab浓度确定了生物素Fab浓度。使用OdysseyCLx(Licor)检测结合的抗体。

为了确定重组抗体和培养基产生的抗体的结合特性，我们进行了表位作图ELISA，如前所述(Huijbers et al.，2016)。将MuSK蛋白的截短形式在maxisorp板上固定，并暴露于来自单细胞培养物1∶10的抗体或暴露于重组抗体。还使用重组抗体在4℃下以1∶100对小鼠耳长提肌进行免疫染色过夜。用AlexaFluor488缀合的α-银环蛇毒素(Lifetechnologies)标记突触区中的AChR，并用AlexaFluor594缀合的山羊抗人IgG(Lifetechnologies)检测结合的重组抗体。在Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜上对肌肉成像，并使用Las X软件进行分析。

为了确定抗体抑制MuSK磷酸化和AChR聚集的能力，我们将C2C12肌管培养物(Celllines service)暴露于它们，如前所述(Huijbers&Zhang et al 2013 PNAS)。在存在或不存在100ng/mL重组抗体或Fab片段的情况下，用0.1nM突触蛋白聚糖(550-AG-100，R&Dsystems)刺激分化的肌管。对于MuSK磷酸化数据，在暴露30分钟之后开始进行MuSK的免疫沉淀。然后将肌管裂解，并在4℃下过夜孵育期间，使用5μL/样品兔抗MuSK多克隆血清(ab94276或ab94277，Steve Burden的友善的礼物)使MuSK沉淀(Huijbers&Zhang etal.2013 PNAS)。使用蛋白A琼脂糖珠(11134515001，Roche)使结合的抗原-抗体复合物沉淀，将其充分洗涤。随后将样品在SDS-PAGE凝胶上运行并转移至PDVF膜。使用山羊抗大鼠MuSK(1∶2000，AF562，R&D systems)和小鼠抗磷酸酪氨酸克隆4G10(1∶1000，05-321，Millipore)作为一抗，以及驴抗小鼠680RD(1∶10,000，926-68072，Licor)和驴抗山羊800CW(1∶10,000，926-32214，Licor)来检测MuSK和磷酸化的MuSK。使用Odyssey CLx(Licor)检测结合的抗体。

在不存在或存在0.1nM突触蛋白聚糖的情况下，在将肌管暴露于100ng/mL重组抗体或Fab片段16小时之后，研究了AChR聚集。随后，将细胞用分化培养基(DMEM，31966Gibco，2％热灭活的马血清26050-088，Gibco，1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺)洗涤3次，并在37℃下与分化培养基中的0.5μg/mL AlexaFluor488缀合的α-银环蛇毒素(B13422，ThermoFisher)一起孵育30分钟。染色之后，将细胞在4％福尔马林溶液中固定5分钟，用PBS洗涤，并使用hardset封固剂(H-1500，Vector实验室)封固。随机选择在每种条件下分成两个盖玻片的20个视场，并用Leica DM5500显微镜成像。使用ImageJ(1.48v)对AChR聚集计数和尺寸进行分析。

统计

所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。处理组之间差异的统计学显著性用Student t检验进行检验，并在适当情况下对多重检验进行校正。P值＜0.05的差异被认为是统计上显著的。

除非本文中另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Singleton and Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，2d Ed.，John Wiley and Sons，NY(1 94)和Hale and Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology，HarperPerennial，NY(1991)向本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。虽然与本文中所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实践中，但是本文中描述了优选的方法和材料。相应地，通过参考作为整体的说明书更全面地描述了紧下方限定的术语。同样，除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示“一个/种或更多个/种”。除非另外指出，否则分别地，核酸以5’至3’的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。应理解，本发明不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可根据其被本领域技术人员所使用的情况而变化。

将读者的注意力引导至与本申请有关的与本说明书同时或在本说明书之前提交并且与本说明书一起公开以供公众查看的所有文件和文献，并且所有的这样的文件和文献的内容均通过引用并入本文。

本说明书(包括任何所附的权利要求书、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤均可以以任意组合的形式进行组合，其中这样的特征和/或步骤中的至少一些互相排斥的组合除外。

除非另有明确说明，否则本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中所公开的每个特征可被具有相同、等同或类似目的的替代特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅为等同或类似特征的同类系列的一个实例。

本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求书、摘要和附图)中所公开的特征中的任何新的一个或任何新组合，或者如此公开的任何方法或过程的步骤中的任何新的一个或任何新组合。

序列：

SEQ ID NO：1 MuSK(人-同种型205)：

SEQ ID NO：2人MuSK蛋白的Ig样1结构域：

对于序列9至69，参见以上实施例部分。对于序列70至78，参见图5。

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Claims

1.包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，所述结合剂用于在对象中治疗通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状。

2.根据权利要求1所述应用的结合剂，其中所述结合剂是结合蛋白。

3.根据权利要求2所述应用的结合剂，其中与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的区域是可变区。

4.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中所述MuSK蛋白是人MuSK蛋白。

5.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中所述结合剂是单价的。

6.根据权利要求1至4中任一项所述应用的结合剂，其中所述结合剂是二价或三价的。

7.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中所述结合剂是抗体。

8.根据权利要求7所述应用的结合剂，其中所述抗体是单克隆抗体。

9.根据权利要求7或权利要求8所述应用的结合剂，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

10.根据权利要求7至9中任一项所述应用的结合剂，其中所述抗体选自Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。

11.根据权利要求7至10中任一项所述应用的结合剂，其中所述抗体是IgG。

12.根据权利要求11所述应用的结合剂，其中所述IgG选自IgG1、IgG2或IgG3。

13.根据权利要求11所述应用的结合剂，其中所述IgG是体内Fab臂交换能力降低或无体内Fab臂交换能力的IgG4变体。

14.根据权利要求13所述应用的结合剂，其中所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含降低体内Fab臂交换能力或阻止体内Fab臂交换的一个或更多个氨基酸替换。

15.根据权利要求13或14所述应用的结合剂，其中所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含根据EU索引编号的重链的第228位氨基酸处的氨基酸替换和/或第409位氨基酸处的氨基酸替换和/或第405位氨基酸处的氨基酸替换。

16.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中所述对象是人。

17.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中所述病症、障碍和/或症状选自：

(i)由于过度肌肉活动而造成的外部外观变形；或者

18.根据任一前述权利要求所述应用的结合剂，其中与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的所述仅一个结合区具有选自以下的序列：

a)包含SEQ ID NO：10的VH CDR1、包含SEQ ID NO：11的VH CDR2、包含SEQ ID NO：12的VH CDR3、包含SEQ ID NO：14的VL CDR1、包含SEQ ID NO：15的VL CDR2和包含SEQ ID NO：16的VL CDR3；任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：9的重链可变结构域和含有SEQID NO：13的轻链可变结构域；

b)包含SEQ ID NO：18的VH CDR1、包含SEQ ID NO：19的VH CDR2、包含SEQ ID NO：20的VH CDR3、包含SEQ ID NO：22的VL CDR1、包含SEQ ID NO：23的VL CDR2和包含SEQ ID NO：24的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：17的重链可变结构域和含有SEQID NO：21的轻链可变结构域；

d)包含SEQ ID NO：30的VH CDR1、包含SEQ ID NO：31的VH CDR2、包含SEQ ID NO：32的VH CDR3、包含SEQ ID NO：34的VL CDR1、包含SEQ ID NO：35的VL CDR2和包含SEQ ID NO：36的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：29的重链可变结构域和含有SEQID NO：33的轻链可变结构域；

e)包含SEQ ID NO：38的VH CDR1、包含SEQ ID NO：39的VH CDR2、包含SEQ ID NO：40的VH CDR3、包含SEQ ID NO：42的VL CDR1、包含SEQ ID NO：43的VL CDR2和包含SEQ ID NO：44的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：37的重链可变结构域和含有SEQID NO：41的轻链可变结构域；

f)包含SEQ ID NO：46的VH CDR1、包含SEQ ID NO：47的VH CDR2、包含SEQ ID NO：48的VH CDR3、包含SEQ ID NO：50的VL CDR1、包含SEQ ID NO：51的VL CDR2和包含SEQ ID NO：52的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：45的重链可变结构域和含有SEQID NO：49的轻链可变结构域；

g)包含SEQ ID NO：54的VH CDR1、包含SEQ ID NO：55的VH CDR2、包含SEQ ID NO：56的VH CDR3、包含SEQ ID NO：58的VL CDR1、包含SEQ ID NO：59的VL CDR2和包含SEQ ID NO：60的VL CDR3，任选地，其中所述结合区包含含有SEQ ID NO：53的重链可变结构域和含有SEQID NO：57的轻链可变结构域；或者

h)以上任一项的组合。

19.在对象中预防、调节或降低皮肤起皱的方法，所述方法包括向所述对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

20.治疗或预防通过抑制神经肌肉传递而减轻的病症、障碍和/或症状的方法；所述方法包括向对象施用包含一个或更多个结合区的结合剂，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病症、障碍和/或症状选自：

(i)由于过度肌肉活动而造成的外部外观变形；或者

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述结合剂是结合蛋白。

23.根据权利要求22所述的方法，其中与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的区域是可变区。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述MuSK蛋白是人MuSK蛋白。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述结合剂是单价的。

26.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述结合剂是二价或三价的。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述结合剂是抗体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述抗体选自Fab、双特异性Fab₂、三特异性Fab₃、scFv、双特异性二-scFv、双特异性scFv-Fc、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、单结构域抗体或双特异性微抗体。

31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgG。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述IgG选自IgG1、IgG2或IgG3。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述IgG是体内Fab臂交换能力降低或无体内Fab臂交换能力的IgG4变体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含降低或阻止体内Fab臂交换能力的一个或更多个氨基酸替换。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述IgG4变体包含IgG4恒定区，所述IgG4恒定区包含根据EU索引编号的重链的第228位氨基酸处的氨基酸替换和/或第409位氨基酸处的氨基酸替换和/或第405位氨基酸处的氨基酸替换。

36.根据权利要求19至35中任一项所述的方法，其中所述对象是人。

37.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中所述结合剂是抗体，并且与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的所述仅一个结合区具有选自以下的序列：

h)以上任一项的组合。

38.包含一个或更多个结合区的抗体，其中仅一个结合区与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合，其中与MuSK蛋白的Ig样1结构域特异性结合的所述仅一个结合区具有选自以下的序列：

h)以上任一项的组合。