CN108034005B - 识别Tau的磷酸化特异抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及识别Tau的磷酸化特异抗体。本发明涉及在由神经原纤维缠结引起的或与之有关的疾病和病症的治疗中用于治疗性和诊断性应用的方法和组合物，特别是，本发明涉及特异性识别并结合至磷酸化病理蛋白Tau构象体的抗体，以及涉及所述抗体在包括阿尔茨海默氏病(AD)的Tau病的治疗中用于治疗性和诊断性应用的方法和组合物。

Description

识别Tau的磷酸化特异抗体
本申请是申请日为2012年10月05日、中国申请号为201280060349.3、发明名称为“识别Tau的磷酸化特异抗体”的发明申请的分案申请。
相关申请
本申请要求保护于2012年4月5日提交的欧洲专利申请No.EP12163319.2和于2011年10月7日提交的国际专利申请No.PCT/EP2011/067604的利益，其各自内容据此通过引用整体并入。
发明领域
本发明涉及用于在由神经原纤维缠结所引起的或与之有关的疾病和病症的治疗中治疗性和诊断性使用的方法和组合物。特别是，本发明涉及特异性识别并结合至磷酸化病理蛋白tau构象体的抗体，并且涉及包括用于在包括阿尔茨海默氏病(AD)的Tau病(tauopathy)的治疗中治疗性和诊断性使用的所述抗体的方法和组合物。
发明背景
神经原纤维缠结和神经毡线(NT)是阿尔茨海默氏病(AD)的主要神经病理学标志。它们由经历翻译后修饰(包括在天冬酰胺酰或天冬氨酰残基上的磷酸化、脱酰胺化和异构化作用)的微管相关蛋白Tau组成。它们来源于超磷酸化蛋白Tau及其构象体的聚集。AD与多种神经退行性Tau病具有这种病理，特别是与特定类型的额颞叶痴呆(FTD)。
蛋白Tau是易溶解的“天然展开”的蛋白，其与微管(MT)强烈结合以促进它们的组装和稳定。MT对神经元的细胞骨架完整性至关重要，并借此对神经元回路的正确形成与功能，以及因此对学习和记忆力至关重要。Tau与MT的结合受动态磷酸化作用和脱磷酸化作用控制，如主要在体外和在非神经元细胞中所显示的。由于大量可能的磷酸化作用位点(＞80)，每个位点的确切作用以及相关激酶的身份在体内仍非常不明确。
在AD脑中，Tau病理的发展晚于淀粉状蛋白病理，并因此可能响应于淀粉状蛋白病理，这构成了淀粉样蛋白级联反应假说的基本内容。这是基于AD和唐氏综合症患者中的研究的并由这些研究所表明，并且通过在具有混合的淀粉状蛋白和Tau病理的转基因小鼠中的研究所证实(Lewis等人，2001；Oddo等人，2004；Ribe等人，2005；Muyllaert等人，2006；2008；Terwel等人，2008)。
人AD患者中两种病理的确切时机以及将淀粉状蛋白与Tau病理相联系的机制在很大程度上仍是未知的，但是提议其涉及作用于或通过作为主要“Tau-激酶”的GSK3和cdk5的神经元信号通路的激活作用(Muyllaert等人，2006，2008中的综述)。
Tau病不是良性副作用而是AD中的主要病理执行者的假说是基于彼此完全印证的合理的遗传学、病理学和实验观察的：
·在由于淀粉状蛋白前体(APP)或早老素中的突变的早期发病的家族AD病例中，必要的病原学原因是淀粉状蛋白累积，但是一定地，病理包括平行的Tau病，这与晚期发病的散发AD病例相同；
·认知功能障碍和痴呆的严重性与Tau病相关，而不是与淀粉状蛋白病理相关，这通过最近的几项临床I和II期研究(包括淀粉状蛋白的PIB-PET成像并且鉴别了多个“假阳性”：具有高脑淀粉状蛋白负荷的认知正常个体)来举例说明；
·在家族性FTD中，Tau病是通过突变体Tau引起的并直接导致无淀粉状蛋白病理的神经变性；
·在实验小鼠模型中，通过蛋白质Tau的缺失几乎完全减轻了由淀粉状蛋白病理所引起的认知缺陷(Roberson等人，2007)。
组合的论据支持了以下假说：蛋白质Tau是AD和相关神经退行性Tau病中认知死亡(cognitive demise)的主要作用因素。
涌现出的突出的AD治疗是通过使用特异性mAb的被动免疫疗法以清除认为具有神经毒性或突触毒性的淀粉状蛋白肽以及它们的聚集物。
如本发明所提议的，预期靶向Tau病理的免疫疗法抵消已知或假设会导致突触功能障碍和神经变性的病理学蛋白Tau构象体。
尚缺乏靶向蛋白Tau的其他治疗方法，并且所述方法主要包括：
·认为会将Tau的磷酸化作用提高至病理水平的激酶抑制剂
·封闭超磷酸化蛋白Tau的胞质聚集的化合物。
这些方法具有特异性和效力方面的多个缺陷，以及与改变APP和淀粉状蛋白代谢的尝试共有的问题，这些均强调了继续寻找包括抗Tau免疫疗法在内的其它治疗选择的重要性。事实上，在具有综合AD样病理的临床前小鼠模型中靶向淀粉状蛋白的免疫疗法还显示了对Tau病理的作用，尽管Tau聚集物持续存在(Oddo等人，2004)。
对于通过免疫疗法处理胞内蛋白Tau的可行性仍有一些怀疑。最近在Tau病小鼠模型中的实验研究已消除了这些怀疑(Asuni等人，2007)。它们显示出通过用蛋白Tau来源的磷酸肽接种疫苗的缠结病理的减少和功能性改善。这些数据证实了针对帕金森氏症(PD)和路易体疾病模型中α-突触核蛋白的免疫疗法(Masliah等人，2005，2011)和肌萎缩性侧索硬化(ALS)模型(Umshitiani等人，2007)中过氧化物歧化酶的上述报道。这些疾病是其中胞内蛋白通过至今尚未完全了解的机制导致突触缺陷和神经变性的实例。
对于起作用以消除已知或假定会导致神经退行性病症(如通过(例如)超磷酸化蛋白Tau的神经元内聚集物所造成的AD中的淀粉状蛋白病理，所述聚集物对AD来说与淀粉状蛋白一样典型)的病理学蛋白构象体的被动和/或主动免疫疗法的需要仍未得到满足。
发明概述
本发明通过提供识别并且结合Tau蛋白的主要病理学磷酸表位的结合蛋白来满足这种未满足的需要。特别地，本发明提供了抗蛋白Tau上的，特别是据信导致Tau病(包括AD)中突触-和神经-毒性的聚集的Tau蛋白上的线性和构象的，简单和复杂的磷酸表位的特异性抗体。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，所述结合肽或蛋白或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至聚集的Tau蛋白上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内、特别是脑中的可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白水平，特别地其解离常数为至少10nM、特别是至少8nM、特别是至少5nM、特别是至少2nM、特别是至少1nM、特别是至少500pM、特别是至少400pM、特别是至少300pM、特别是至少200pM、特别是至少100pM、特别是至少50pM。
特别地，解离常数为2nM至80nM、特别是2nM至40nM、特别是2nM至10nM的范围。
在某一方面，本文提供了抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段结合至具有在396位(pS396)和在404位(pS404)包含磷酸化Ser的氨基酸序列VYKSPVVSGDTSPRHL(SEQ ID NO：62)(SEQ ID NO：67的Tau aa 393-408，例如，如表1中所述)或在所述氨基酸序列内的磷酸表位。
在第二实施方案中，本发明涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其结合速率常数为104M-1s-1或更高，特别是3-5×104M-1s-1或更高，特别是105M-1s-1或以上；特别是2-9×105M-1s-1或更高；特别是106M-1s-1或更高，特别是1-4×106M- 1s-1或更高，特别是107M-1s-1或更高。
特别地，解离速率常数为1.6x 103至5x 105、特别是2.4x 104至5x105、3x103至5x105的范围。
在第三实施方案中，本发明涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且具有高结合亲合力，其解离常数为至少4nM并且结合速率常数为105M-1s-1或更高，特别是解离常数为至少3nM并且结合速率常数为106M-1s-1或更高，特别是解离常数为至少2nM并且结合速率常数为104M-1s-1或更高，特别是解离常数为至少1nM并且结合速率常数为105M-1s-1或更高，特别是解离常数为至少200pM并且结合速率常数为105M-1s-1或更高，特别是解离常数为至少100pM并且结合速率常数为106M-1s-1或更高。
特别是，解离常数为2nM至80nM的范围且解离速率常数为1.6x 103至5x 105的范围，特别是解离常数为2nM至40nM且解离速率常数为2.4x104至5x105的范围，特别是解离常数为2nM至10nM的范围且解离速率常数为3x103至5x105的范围。
本发明的一个实施方案(4)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且所述结合肽或抗体结合至哺乳动物，特别是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位，所述表位选自在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-401、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 396-401、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 394-400、在404位(pS404)包含磷酸化Ser的Tau aa402-406和在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-400。
一个实施方案(5)涉及根据任何前述实施方案所述的结合肽或抗体，其中所述肽结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的表位，但尤其是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白，其包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-401。
一个实施方案(6)涉及根据任何前述实施方案所述的结合肽或抗体，其中所述肽结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的表位，但尤其是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白，其包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 396-401。
一个实施方案(7)涉及根据任何前述实施方案所述的结合肽或抗体，其中所述肽结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的表位，但尤其是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白，其包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 394-400。
一个实施方案(8)涉及根据任何前述实施方案所述的结合肽或抗体，其中所述肽结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的表位，但尤其是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白质，其包括在404位(pS404)包含磷酸化Ser的Tau aa 402-406。
一个实施方案(9)涉及根据任何前述实施方案所述的结合肽或抗体，其中所述肽结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的表位，但尤其是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白质，其包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser Tau aa 393-400。
本发明的一个实施方案(10)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO：74中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合抗体域依次包含：包含SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、特别是98％、特别是99％同一性的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列、或与其具有至少94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
一方面，本文提供抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
(a)第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
(b)包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：72中所示的氨基酸序列的CDR3。
本发明的一个实施方案(11)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：81中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO：82中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：83中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：79中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：80中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
一方面，本文提供抗体或其功能性部分，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
(a)第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：81中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：82中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：83中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
(b)包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：79中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：80中所示的氨基酸序列的CDR3。
本发明的一个实施方案(12)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：93中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO：94中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：95中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：90中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR中任一个具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在某一方面，本文提供抗体或其功能性部分，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
(a)第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：93中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：94中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：95中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
(b)包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：91中所示的氨基酸序列的CDR3。
本发明的一个实施方案(13)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO：102中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：103中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：99中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：100中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR中任一个具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
一方面，本文提供抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
(a)第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：102中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：103中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
(b)包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：99中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：100中所示的氨基酸序列的CDR3。
本发明的一个实施方案(14)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ IDNO：107中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含：具有SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：115中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在具体的一方面，本文提供抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
(a)第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：107中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
(b)包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：115中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3。
在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗体片段的第一结合结构域是轻链可变区，且本文描述的抗体或其抗体片段的第二结合结构域是重链可变区。
本发明的一个实施方案(15)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：选自SEQ ID NO：69、77、116/92、118、97、105的所示氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：68、76、88、96、104中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列至少80％、特别是至少85％、特别是至少86％、特别是至少87％、特别是至少88％、特别是至少89％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(16)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少98％或99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％、91％、92％或93％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(17)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：77中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少93％、94％或95％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少88％、89％、或90％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(18)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：116、92或118中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少93％、94％或95％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％、91％、92％或93％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(19)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：96中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少86％、87％、88％或90％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(20)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少98％、或99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少88％、89％、或90％同一性的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案(21)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是任何前述实施方案的结合肽或抗体，其中所述结合肽或抗体包括包含SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少93％同一性的氨基酸序列的第二结合结构域。
本发明的一个实施方案(22)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是任何前述实施方案的结合肽或抗体，其中所述结合肽或抗体包括包含SEQ ID NO：77中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二结合结构域。
本发明的一个实施方案(23)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是任何前述实施方案的结合肽或抗体，其中所述结合肽或抗体包括包含SEQ ID NO：116、92或118中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少9395％同一性的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少93％同一性的氨基酸序列的第二结合结构域。
本发明的一个实施方案(24)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是任何前述实施方案的结合肽或抗体，其中所述结合肽或抗体包括包含SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ ID NO：96中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二结合结构域。
本发明的一个实施方案(25)涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是任何前述实施方案的结合肽或抗体，其中所述结合肽或抗体包括包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少98％、或99％同一性的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二结合结构域。
本发明的一个实施方案(26)涉及根据实施方案(16)的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其中所述第一结合结构域分别含有SEQ ID NO：73-75中所示的CDR，并且所述第二结合结构域含有SEQ ID NO：70-72中所示的CDR。
本发明的一个实施方案(27)涉及根据实施方案(17)的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其中所述第一结合结构域分别含有SEQ ID NO：81-83中所示的CDR，并且所述第二结合结构域含有SEQ ID NO：78-80中所示的CDR。
本发明的一个实施方案(28)涉及根据实施方案(18)的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其中所述第一结合结构域分别含有SEQ ID NO：93-95中所示的CDR，并且所述第二结合结构域含有SEQ ID NO：12、90和91中所示的CDR。
本发明的一个实施方案(29)涉及根据实施方案(19)的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其中所述第一结合结构域分别含有SEQ ID NO：101-103中所示的CDR，并且所述第二结合结构域含有SEQ ID NO：98-100中所示的CDR。
本发明的一个实施方案(30)涉及根据实施方案(18)的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其中所述第一结合结构域分别含有SEQ ID NO：89、115和91中所示的CDR，并且所述第二结合结构域含有SEQ ID NO：106-108中所示的CDR。
在另一个实施方案(31)中，本发明涉及结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，特别是根据任何前述实施方案的结合肽或抗体，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力，并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平，并且其中所述结合肽或抗体包含
a.包含SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：68中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
b.包含SEQ ID NO：77中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：76中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
c.包含SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或；
d.包含SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
e.包含SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：96中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
f.包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：104中所示的氨基酸序列的第二结合结构域。
g.包含SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域
在本发明的一个实施方案(32)中，根据任何前述实施方案所述的结合肽是抗体，特别是IgG2a、IgG2b或IgG3同种型抗体，特别是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
本发明的一个实施方案(33)涉及编码根据任一前述实施方案所述的结合肽的多核苷酸。
在一个实施方案(34)中，所述多核苷酸包含核酸分子，其选自：
a.包含编码多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO：84-87、SEQID NO：109-114、117和119中所示的氨基酸序列；
b.包含与SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-114、117和119中所示的序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
c.包含与SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-114、117和119中所示的序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
d.包含与SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-114、117和119中所示的序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
e.包含与SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-114、117和119中所示的序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
f.包含与SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-114、117和119中所示的序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
g.包含互补链与根据a)-f)中任一项的核酸分子杂交的核苷酸序列的核酸分子；
h.包含通过遗传密码的简并度与根据a)-g)中任一项所定义的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸分子，
其中如a)-h)中任一项所定义的所述核酸分子识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的磷酸表位，其选自在396位包含磷酸化Ser(pS396)的Tau aa 393-401，在396位包含磷酸化Ser(pS396)的Tau aa 396-401，在396位包含磷酸化Ser(pS396)的Tau aa 396-400，在404位包含磷酸化Ser(pS404)的Tau aa 402-406和在396位包含磷酸化Ser(pS396)的Tauaa 393-400，其中在一个实施方案中，所述结合肽具有高结合亲合力，其解离常数为至少10nM、特别是至少8nM、特别是至少5nM、特别是至少2nM、特别是至少1nM、特别是至少500pM、特别是至少400pM、特别是至少300pM、特别是至少200pM、特别是至少100pM、特别是至少50pM，和/或其结合速率常数为104M-1s-1或更高，特别是3-5×104M-1s-1或更高，特别是105M- 1s-1或更高；特别是6-9×105M-1s-1或更高；特别是106M-1s-1或更高，特别是1-4×106M-1s-1或更高，特别是107M-1s-1或更高，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位。
在本发明的多个实施方案(35)中，根据前述实施方案中的任一种，提供了结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或它们的组合其能够特异性识别并结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白上的磷酸表位，特别是微管相关蛋白Tau，特别是聚集的微管相关和超磷酸化蛋白Tau，如以双股螺旋形细丝(paired helical filament，PHF)存在的蛋白Tau，其是神经原纤维缠结、神经毡线和营养不良性轴突中的主要结构，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位。
在本发明具体的实施方案(36)中，人Tau蛋白是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白。
因此，根据前述实施方案中任一种所述的结合肽和抗体可以用于(37)降低含有增加的可溶性Tau蛋白和/或可溶性磷酸化Tau蛋白水平的哺乳动物或人脑中(特别是脑皮层和/或海马中)总可溶性Tau蛋白的水平，特别是可溶性磷酸化Tau蛋白的水平。
根据前述实施方案中任一种所述的结合肽和抗体还可以用于(38)降低含有增加的所述pTau双股螺旋形细丝(pTau PHF)水平的哺乳动物或人脑中(特别是脑皮层和/或海马中)含有超磷酸化Tau蛋白的双股螺旋形细丝的水平。
含有增加的所述Tau蛋白变体(其促进哺乳动物或人中的Tau蛋白相关疾病、病症或病况)水平的哺乳动物或人的脑中(特别是脑皮层和/或海马中)的总可溶性Tau蛋白和/或可溶性磷酸化Tau蛋白和/或pTau双股螺旋形细丝的水平的降低可以导致与这些Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状的改善和/或减轻(39)。
因此，根据前述实施方案中任一种所述的结合肽和抗体可以(40)用于治疗，特别是在人治疗中用于减缓或停止Tau蛋白相关疾病、病症或病况的发展。
根据前述实施方案中任一种所述的结合肽和抗体还可以(41)在治疗，特别是对人的治疗中用于改善或减轻与Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况如(例如)认知功能(包括推理、情景判断、记忆能力、学习、特殊导航等)的损伤或丧失。
在一个实施方案(42)中，本发明涉及根据前述实施方案中任一项所述的结合肽和抗体，其用于治疗，特别是用于治疗Tau病(一组Tau蛋白相关疾病和病症)，或用于减轻与Tau病有关的症状。
在一个实施方案(43)中，本发明涉及用于在患有Tau病的哺乳动物中保持或提高认知记忆能力的根据前述实施方案中任一种所述的结合肽和抗体。
在本发明的另一个具体实施方案(44)中，包含如分别在SEQ ID NO：73-75、81-83、93-95、101-103、106-108中给出的抗体ACI-35-2A1-Ab1；ACI-35-2A1-Ab2；ACI-35-4A6-Ab1；ACI-35-4A6-Ab2；ACI-35-1D2-Ab1；ACI-35-2G5-Ab1；ACI-35-2G5-Ab2；ACI-35-2G5-Ab3的轻链CDR中的至少一种或全部，和/或如在SEQ ID NO：70-72、78-80、(12、90、91)、98-100、(89、115、91)中给出的抗体ACI-35-2A1-Ab1；ACI-35-2A1-Ab2；ACI-35-4A6-Ab1；ACI-35-4A6-Ab2；ACI-35-1D2-Ab1；ACI-35-2G5-Ab1；ACI-35-2G5-Ab2；ACI-35-2G5-Ab3的重链CDR中的至少一种或全部的结合肽和抗体用于治疗，特别是在人治疗中用于改善或减轻与Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况如(例如)认知功能(包括推理、情景判断、记忆、学习、特殊导航等)的损伤或丧失。
在本发明的另一个具体实施方案(45)中，包含如分别在SEQ ID NO：106-108中给出的抗体ACI-35-2G5-Ab2；ACI-35-2G5-Ab3的轻链CDR中的至少一种或全部，和/或如SEQID NO：89、115和91中给出的抗体ACI-35-2G5-Ab2；ACI-35-2G5-Ab3的重链CDR中的至少一种或全部的结合肽和抗体用于治疗，特别是在人治疗中用于改善或减轻与Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况如(例如)认知功能(包括推理、情景判断、记忆、学习、特殊导航等)的损伤或丧失。
如实施例中所述的，可以分别通过应用所选择的脑切片的蛋白免疫反应性试验和通过脑匀浆液的免疫印迹法来确定根据前述实施方案所述的肽或抗体与Tau缠结和pTau在脑上的结合。
在另一个实施方案(46)中，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或它们的组合，以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案(47)中，根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，或多核苷酸，或药物组合物，或它们的组合用于治疗，特别是在人治疗中用于治疗或减轻Tau蛋白相关疾病或病症(包括神经退行性病症，如Tau病)的症状。
因此，一旦将所述结合肽、抗体和/或药物组合物施用至患有这些疾病或病况的动物，特别是哺乳动物，特别是人，则根据前述实施方案中任一种所述的结合肽、抗体和/或药物组合物可以用于(48)减缓或停止Tau蛋白相关疾病、病症或病况的发展。
一旦将所述结合肽、抗体和/或药物组合物施用至患有这些疾病或病况的动物，特别是哺乳动物，特别是人，则根据前述实施方案中任一种所述的结合肽、抗体和/或药物组合物还可以用于(49)改善或减轻与Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况如(例如)认知功能(包括推理、情景判断、记忆能力、学习、特殊导航等)的损伤或丧失。
在一个实施方案(50)中，根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，或多核苷酸，或它们的组合，或药物组合物用于治疗由神经原纤维病变的形成所引起的或与之有关的疾病和病症，所述神经原纤维病变是Tau病中主要的脑病理，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，包括但不限于，阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病
Figure GDA0001615266380000191
包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤和不显示单独的淀粉状蛋白病理的其它疾病或病症，其包括但不限于关岛型肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease，type C)、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆(Tangle only dementia)、脑炎后帕金森氏综合征、肌强直性营养不良。
在一个实施方案(51)中，根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合用于治疗阿尔茨海默氏病。
在本发明的一个实施方案(52)中，提供了用于检测和/或调节动物，特别是哺乳动物或人的(特别是)体内，特别是脑中(特别是脑皮层和/或海马中)的可溶性和/或、寡聚和/或不溶性磷酸化Tau水平的方法，其包括向所述动物，特别是向所述哺乳动物或人施用根据前述实施方案中任一项所述的结合肽或其功能性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性片段、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在一个方面，调节涉及降低含有增加的可溶性Tau蛋白和/或可溶性磷酸化Tau蛋白水平的动物，特别是哺乳动物或人的脑中(特别是脑皮层和/或海马中)可溶性Tau蛋白，特别是可溶性磷酸化Tau蛋白的水平。
在本发明的一个实施方案(53)中，提供了降低含有增加的不溶性Tau蛋白，特别是pTau双股螺旋形细丝(pTau PHF)的动物，特别是哺乳动物或人的脑中(特别是脑皮层和/或海马中)不溶性Tau蛋白，特别是含有超磷酸化Tau蛋白的双股螺旋形细丝(pTau PHF)的水平的方法，其包括向所述动物，特别是向所述哺乳动物或人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在一个实施方案(54)中，本发明涉及减缓或停止动物，特别是哺乳动物或人中Tau蛋白相关疾病、病症或病况的发展的方法，其包括向患有这种疾病或病况的所述动物，特别是向所述哺乳动物或人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在一个实施方案(55)中，本发明涉及用于改善或减轻动物，特别是哺乳动物或人中与Tau蛋白相关疾病、病症或病况有关的症状的方法，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况如(例如)认知功能(包括推理、情景判断、记忆能力、学习、特殊导航等)的损伤或丧失，其包括向患有这种疾病或病况的所述动物，特别是向所述哺乳动物或人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在一个实施方案(56)中，本发明涉及保持或提高患有Tau病的哺乳动物中认知记忆能力的方法。
在本发明的另一个实施方案(57)中，提供了用于治疗Tau蛋白相关疾病或病症(包括神经退行性疾病或病症，如Tau病)的方法，其包括向患有这种疾病或病症的动物，特别是向哺乳动物，但尤其是向人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在本发明的一个实施方案(58)中，提供了治疗由神经原纤维病变的形成所引起的或与之有关的疾病和病症的方法，所述神经原纤维病变是Tau病中主要的脑病理，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，其包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，包括但不限于，阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤和不显示单独的淀粉状蛋白病理的其它疾病或病症，其包括但不限于关岛型肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆(Tangle only dementia)、脑炎后帕金森氏综合征、肌强直性营养不良，所述方法包括向患有这种疾病或病症的动物，特别是向哺乳动物，但尤其是向人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合。
在本发明的另一个实施方案(59)中，提供了通过向所述动物或人施用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性片段、或多核苷酸、或药物组合物，或它们的组合，来在患有神经退行性病症(如Tau病)的动物，特别是哺乳动物或人中引起被动免疫应答的方法。
在本发明的另一个实施方案(60)中，提供了诊断患者中Tau蛋白相关疾病、病症或病况的方法，包括检测根据前述实施方案中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分与样品中或与原位Tau蛋白的表位的免疫特异性结合，包括以下步骤：
a.使怀疑含有Tau蛋白的样品或具体身体部分或身体区域与根据前述权利要求中任一项的结合肽或其片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分接触，其中所述结合肽或抗体或其片段与所述Tau蛋白的表位结合；
b.允许所述结合肽，特别是所述抗体，特别是所述单克隆抗体或其功能性部分与Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与样品中或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联。
在本发明的另一个实施方案(61)中，提供了用于诊断患者中对Tau蛋白相关疾病、病症或病况的易患情况的方法，包括检测根据前述实施方案中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分与样品中或与原位Tau蛋白的表位的免疫特异性结合，其包括以下步骤：
a.使怀疑含有Tau抗原的样品或具体身体部分或身体区域与根据前述实施方案中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分接触，所述肽或其片段与所述Tau蛋白的表位结合；
b.允许所述结合肽，特别是所述抗体，特别是所述单克隆抗体或其功能性部分与Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联；
e.将所述免疫复合物的量与正常对照值进行比较。
其中，与正常对照值相比，所述聚集物的量的增加表明所述患者患有Tau蛋白相关疾病或病况或具有发展Tau蛋白相关疾病或病况的风险。
在本发明的一个实施方案(62)中，提供了在用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性片段治疗后监测患者中最小残留疾病的方法，其中所述方法包括：
a.使怀疑含有Tau抗原的样品或具体身体部分或身体区域与根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分接触，所述肽或其片段与所述Tau蛋白的表位结合；
b.允许所述结合肽，特别是所述抗体，特别是所述单克隆抗体或其功能性部分与Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联，
e.将所述免疫复合物的量与正常对照值进行比较，
其中，与正常对照值相比，所述聚集物的量的增加表明所述患者仍患有最小残留疾病。
在一个实施方案(63)中，提供了预测用根据前述实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分、或多核苷酸、或药物组合物治疗的患者的响应性的方法，包括
a.使怀疑含有Tau抗原的样品或具体身体部分或身体区域与如中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分接触，所述肽或其片段与所述Tau蛋白的表位结合；
b.允许所述结合肽，特别是所述抗体，特别是所述单克隆抗体或其功能性部分与Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联，
e.比较治疗开始前后所述免疫复合物的量，
其中所述聚集物的量的减少表明所述患者具有响应于治疗的高潜能。
抗-Tau抗体及其片段可用于本发明的上述方法中。在上述方法中，通过使含有抗体或其片段的样品与附接至固体载体的抗-Tau抗体或其片段相接触对所述样品进行免疫富集以增加样品中Tau蛋白的浓度。
在步骤(a)之前，通过使所述样品与附接至固体载体的抗-Tau抗体或其片段相接触对所述样品进行免疫富集以增加样品中Tau蛋白的浓度。
在另一个实施方案(64)中，本发明涉及用于检测和诊断Tau蛋白相关疾病、病症或病况的测试试剂盒，其包含根据前述实施方案中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分。
在一个实施方案(65)中，所述测试试剂盒包含容纳根据前述实施方案中任一项的一种或多种结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分的容器，和出于结合Tau抗原以形成免疫复合物并检测所述免疫复合物的形成从而将所述免疫复合物的存在或不存在与Tau抗原的存在或不存在相关联的目的使用所述结合肽或抗体的说明书。
在又另一个实施方案(66)中，本发明涉及在哺乳动物上、特别是如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位，其选自在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-401、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 396-401、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tauaa 394-400、在404位(pS404)包含磷酸化Ser的Tau aa 402-406和在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-400。
在一个实施方案(67)中，所述表位由在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa393-401组成。
在一个实施方案(68)中，所述表位由在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa396-401组成。
在一个实施方案(69)中，所述表位由在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa394-400组成。
在一个实施方案(70)中，所述表位由在404位(pS404)包含磷酸化Ser的Tau aa402-406组成。
在一个实施方案(71)中，所述表位由在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa393-400组成。
在另一个实施方案(72)中，本发明涉及产生根据前述权利要求中任一项的结合肽或其活性片段，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分的细胞系。
在一个实施方案(73)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3136于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-4A6-48。
在一个实施方案(74)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3137于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A6-2G5-30。
在一个实施方案(75)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3138于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A6-2G5-41。
在一个实施方案(76)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3139于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-18。
在一个实施方案(77)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3140于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-40。
在一个实施方案(78)中，本发明涉及细胞系，其是作为DSM ACC3141于2011年9月6日保藏的杂交瘤细胞系A6-1D2-12。
在一个实施方案(79)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性部分，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3139于2010年8月30日提交的杂交瘤细胞系A4-2A1-18的DNA的PCR扩增获得
a.用于扩增第一结合结构域的包含SEQ ID NO：149的5′-引物和SEQ ID NO：51的3′-引物的引物对；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：120、123、124、136、137、138、139和140的5′-引物和选自SEQ ID NO：131、134和141-148的3′-引物的引物混合物。
在一个实施方案(80)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性部分，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3137于2011年8月30日提交的杂交瘤细胞系A6-2G5-30的DNA的PCR扩增获得
a.用于扩增第一结合结构域的包含选自SEQ ID NO：51和169-174的5′-引物和SEQID NO：51的3′-引物的引物混合物；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：124、127和150-158的5′-引物和选自SEQ ID NO：130和159-168的3′-引物的引物混合物。
在一个实施方案(81)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性部分，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3140于2011年8月30日提交的杂交瘤细胞系A4-2A1-40的DNA的PCR扩增获得：
a.用于扩增第一结合结构域的包含选自SEQ ID NO：178、179和180的5′-引物和SEQ ID NO：51的3′-引物的引物混合物；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：121、127、139、154、155和175的5′-引物和选自SEQ ID NO：128、129、147、176和177的3′-引物的引物混合物。
在一个实施方案(82)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性部分，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3138于2011年8月30日提交的杂交瘤细胞系A6-2G5-41的DNA的PCR扩增获得：
a.用于扩增第一结合结构域的包含选自SEQ ID NO：51和188-192的5′-引物和SEQID NO：51的3′-引物的引物混合物；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：120、124、126、181、182和183的5′-引物和选自SEQ ID NO：144、145和184-187的3＇-引物的引物混合物。
在一个实施方案(83)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性部分，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3136于2011年8月30日提交的杂交瘤细胞系A4-4A6-48的DNA的PCR扩增获得
a.用于扩增第一结合结构域的包含选自SEQ ID NO：50和201-204的5′-引物和SEQID NO：51的3′-引物的引物混合物；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：121、137、151和193-197的5′-引物和选自SEQ ID NO：131、141、144、166、198、199和200的3′-引物的引物混合物。
在一个实施方案(84)中，本发明涉及包含轻链(VL)和/或重链(VH)域的单克隆抗体或其功能性片段，其由位于核苷酸片段上的多核苷酸编码，所述核苷酸片段可以使用下列引物通过作为DSM ACC3141于2011年9月6日提交的杂交瘤细胞系A6-1D2-12的DNA的PCR扩增获得
a.用于扩增第一结合结构域的包含选自SEQ ID NO：209-214和219-221的5′-引物和SEQ ID NO：215的3′-引物的引物混合物；和/或
b.用于扩增第二结合结构域的包含选自SEQ ID NO：216、217和218的5′-引物和SEQ ID NO：208的3′-引物的引物混合物。
在一个实施方案(85)中，根据前述实施方案中任一项所述的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、骆驼抗体、双链抗体或者修饰或设计的抗体。
在一个实施方案(86)中，本发明提供了用于产生根据前述实施方案中任一项所述的结合肽或抗体的方法，包括以下步骤：在适合的培养基中培养根据任何前述实施方案的细胞系，以及任选地从所述细胞系或培养基中纯化所述结合肽或抗体。
在另一个实施方案(87)中，本发明提供了检测脑样品中磷酸Tau(pTau)多聚体的方法，包括
a.将所述样品与根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段接触，其抗体或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体或其片段与所述tau蛋白结合以形成免疫复合物；和
c.检测所述免疫复合物的形成，特别是通过应用ELISA测定。
特别是，本发明在具体实施方案(88)中涉及一种死后检测来自怀疑患有tau相关疾病或病症的受试者和来自健康对照受试者的脑样品中的磷酸Tau(pTau)多聚体的方法，包括：
a.使所述受试者的脑样品与根据前述权利要求中任一项的抗体或其片段接触，所述肽或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体与所述Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成，特别是通过应用ELISA测定和
d.使用相同条件将由所述受试者获得的样品中免疫复合物的量或强度与由对照样品的免疫复合物的量或强度进行比较，
其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量或强度的增加表明所述患者已患有tau相关疾病或病症。
在一个实施方案(89)中，与正常对照值相比，所述测试样品中观察到的增加为30％至50％，特别是30％至45％。
在一个实施方案(90)中，本发明提供了根据任一前述实施方案的结合肽或蛋白或其功能性部分，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，其抗体或片段显示有利的pK特征。特别是，所述抗体或片段在施用后具有多达10天的高血清浓度，这表明有利地支持所述抗体用作治疗性抗体的用途的药动学(PK)特征。(Deng等人，Expert Opin DrugMetab Toxicol，2012，8(2)141-60；Putman等人，Trends Biotech，2010(28)509-516；Bai，S.Clin Pharmacokinet 2012；51(2)：119-135。
本申请涉及下述技术方案。
1.一种抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或抗体片段对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平。
2.一种抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段结合至具有在396位(pS396)和在404位(pS404)包含磷酸化Ser的氨基酸序列VYKSPVVSGDTSPRHL(SEQ ID NO：62)(SEQ ID NO：67的Tau aa 393-408)或在所述氨基酸序列内的磷酸表位。
3.如技术方案2所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段是调节哺乳动物脑中的可溶性和/或不溶性Tau水平的调节抗体。
4.如技术方案3所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段调节脑皮层和/或海马中的可溶性和/或不溶性Tau水平。
5.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段降低总可溶性和/或不溶性tau蛋白的水平。
6.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段降低可溶性和/或不溶性磷酸化tau蛋白的水平。
7.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段降低含有超磷酸化tau蛋白的双股螺旋形细丝的水平。
8.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段降低总可溶性tau蛋白、可溶性磷酸化tau蛋白和pTau双股螺旋形细丝的水平。
9.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述哺乳动物是人。
10.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少10nM的解离常数。
11.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少82nM、5nM、至少2nM；至少1nM、至少500pM、至少300pM、至少200pM、至少100pM的解离常数。
12.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有104M-1s-1或更大；105M-1s-1或更大、106M-1s-1或更大的解离速率常数。
13.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少4nM且解离速率常数为105M-1s-1或更大。
14.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少3nM且解离速率常数为106M-1s-1或更大。
15.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少2nM且解离速率常数为104M-1s-1或更大。
16.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少1nM且解离速率常数为105M-1s-1或更大。
17.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少200pM且解离速率常数为105M-1s-1或更大。
18.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段具有高结合亲合力，其解离常数为至少100pM且解离速率常数为106M-1s-1或更大。
19.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或抗体片段结合至选自以下的表位：
a.在396位(pS396)包含磷酸化Ser的VYKSPVVSG(SEQ ID NO：67的Tau aa 393-401)；
b.在396位(pS396)包含磷酸化Ser的SPVVSG(SEQ ID NO：67的Tau aa 396-401)；
c.在396位(pS396)包含磷酸化Ser的YKSPVVS(SEQ ID NO：67的Tau aa 394-400)；
d.在404位(pS404)包含磷酸化Ser的DTSPR(SEQ ID NO：67的Tau aa 402-406)；和
e.在396位(pS396)包含磷酸化Ser的VYKSPVVS(SEQ ID NO：67的Tau aa 393-400)。
20.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至在哺乳动物Tau蛋白上，特别是在所述人Tau蛋白，但特别是包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-401(VYKSPVVSG)的如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位。
21.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至在哺乳动物Tau蛋白上，特别是在所述人Tau蛋白，但特别是包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 396-401(SPVVSG)的如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位。
22.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至在哺乳动物Tau蛋白上，特别是在所述人Tau蛋白，但特别是包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 394-400(YKSPVVS)的如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位。
23.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至在哺乳动物Tau蛋白上，特别是在所述人Tau蛋白，但特别是包括在404位(pS404)包含磷酸化Ser的Tau aa 402-406(DTSPR)的如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位。
24.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至在哺乳动物Tau蛋白上，特别是在所述人Tau蛋白，但特别是包括在396位(pS396)包含磷酸化Ser的Tau aa 393-400(VYKSPVVS)的如SEQ ID NO：67中所示的人Tau蛋白上的表位。
25.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：包含SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：74中所示的氨，基酸序列的CDR2，和包含SEQ IDNO：75中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含：包含SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列、或与其具有至少95％、特别是98％、特别是99％同一性的氨基酸序列的CDR1，包含SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列、或与其具有至少94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列的CDR2，和包含SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列、或与其具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR3。
26.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
a.第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：73中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：75中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
b.包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：72中所示的氨基酸序列的CDR3。
27.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO：81中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：82中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ IDNO：83中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含：具有SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：79中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：80中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
28.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
a.第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：81中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：82中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：83中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
b.包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：79中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：80中所示的氨基酸序列的CDR3。
29.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO：93中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：94中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ IDNO：95中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含：具有SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：90中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR中任一个具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
30.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
a.第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：93中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：94中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：95中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
b.包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：90中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：91中所示的氨基酸序列的CDR3。
31.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：102中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ IDNO：103中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域依次包含：具有SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：99中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：100中所示的氨基酸序列的CDR3、或与上述CDR中任一个具有至少至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
32.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
a.第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：102中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：103中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
b.包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：99中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO：100中所示的氨基酸序列的CDR3。
33.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：具有SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：107中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ IDNO：108中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含：具有SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO：115中所示的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3，或与上述CDR中任一个具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
34.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其抗体或其片段识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段包含：
a.第一结合结构域，其包含：包含SEQ ID NO：106中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：107中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列的CDR3；和/或
b.包含氨基酸序列的第二结合结构域，所述氨基酸序列包含：包含SEQ ID NO：89中所示的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO：115中所示的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO：91中所示的氨基酸序列的CDR3。
35.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含选自SEQ ID NO：69、77、116、92、118、97、105的所示氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：68、76、88、96、104中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列至少60％、至少70％、至少80％、特别是至少85％、特别是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、特别是至少95％、特别是至少96％、特别是至少97％、特别是至少98％、特别是至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
36.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其功能片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少98％或99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％、91％、92％或93％同一性的氨基酸序列。
37.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其功能片段包含第一结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：77中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少93％、94％或95％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少88％、89％、或90％同一性的氨基酸序列。
38.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其功能片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含：SEQ ID NO：116、92或118中所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少93％、94％或95％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少90％、91％、92％或93％同一性的氨基酸序列。
39.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其功能片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQID NO：96中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少86％、87％、88％或90％同一性的氨基酸序列。
40.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其识别并特异性结合至在哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其功能片段包含第一结合结构域和/或第二结合结构域，所述第一结合结构域包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少98％、或99％同一性的氨基酸序列；所述第二结合结构域包含SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少88％、89％、或90％同一性的氨基酸序列。
41.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其包含：
a.包含SEQ ID NO：69中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：68中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
b.包含SEQ ID NO：77中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：76中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
c.包含SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
d.包含SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
e.包含SEQ ID NO：97中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：96中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
f.包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：104中所示的氨基酸序列的第二结合结构域；或
g.包含SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列的第一结合结构域和/或包含SEQ IDNO：88中所示的氨基酸序列的第二结合结构域。
42.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或完全人抗体或其功能性片段。
43.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其具有IgG2b、IgG2a或IgG3同种型。
44.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
45.如前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述抗体或其片段结合至病理蛋白Tau构象体，但是不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位。
46.一种多核苷酸，其编码如上述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段。
47.如技术方案46所述的多核苷酸，其包含选自以下的核酸分子：
a.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：35-45；SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-112和117-119中所示的序列具有至少85％序列同一性；
b.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：35-45；SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-112和117中所示的序列具有至少90％序列同一性；
c.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：35-45；SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-112和117-119中所示的序列具有至少95％序列同一性；
d.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：35-45；SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-112和117-119中所示的序列具有至少98％序列同一性；
e.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：35-45；SEQ ID NO：84-87、SEQ ID NO：109-112和117-119中所示的序列具有至少100％序列同一性；
f.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列的互补链与a)-d)中任一项的核酸分子杂交；或
g.包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列因遗传密码的简并度与a)-e)中任一项定义的核苷酸序列不同：
其中如a)-g)中任一项中所定义的所述核酸分子编码抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段识别并特异性结合至在哺乳动物、特别是在人Tau蛋白或其片段上，特别是病理蛋白tau构象体上的磷酸表位，但是不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述抗体或抗体片段对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有高结合亲合力并且能够检测和/或调节体内可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白的水平。
48.一种药物组合物，包含治疗有效量的根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、或其组合，以及药学上可接受的载体。
49.如技术方案48所述的药物组合物，其包含根据前述技术方案中任一项所述的至少两个抗体或其功能片段，其识别并结合至所述哺乳动物Tau蛋白上的两个不同磷酸表位。
50.如技术方案48或49所述的药物组合物，其进一步包含识别并结合至促淀粉样变蛋白或肽的另外的抗体或其功能性片段。
51.根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸或药物组合物、或其组合，用于治疗，特别是用于治疗哺乳动物、特别是需要这种治疗的人中的神经退行性疾病或病症诸如Tau病。
52.根据技术方案51所述的抗体或其功能片段、多核苷酸、药物组合物、或其组合，用于治疗哺乳动物中的神经退行性疾病或病症，其中所述神经退行性疾病或病症是Tau病。
53.根据技术方案51或52所述的抗体或其功能片段、多核苷酸、药物组合物、或其组合，用于治疗哺乳动物中的神经退行性疾病或病症诸如Tau病，其中所述哺乳动物是人。
54.根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，用于治疗或减轻哺乳动物、特别是患有这种缺陷的人中的认知缺陷。
55.根据技术方案54所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，其中哺乳动物、特别是人中的认知缺陷的治疗或减轻导致认知缺陷发展的停止。
56.根据技术方案54所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，其中哺乳动物、特别是人中的认知缺陷的治疗或减轻导致所治疗的受试者中认知记忆能力的保持的提高，特别是完全恢复。
57.根据技术方案52所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，其中所述Tau病选自阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、关岛型肌萎缩性侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、脑炎后帕金森氏综合征和肌强直性营养不良。
58.根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，用于治疗阿尔茨海默氏病或额颞叶痴呆。
59.根据技术方案51所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病症显示tau和淀粉状蛋白病理共存。
60.根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，用于治疗由神经原纤维病变的形成所引起的或与之有关的疾病和病症，所述神经原纤维病变是Tau病中主要的脑病理，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，所述疾病或病症包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉状蛋白血管病、创伤性脑损伤和不显示单独的淀粉状蛋白病理的其他疾病或病症，其包括但不限于关岛型肌萎缩性侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、额颞叶痴呆、Ha1levorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、脑炎后帕金森氏综合征和肌强直性营养不良。
61.根据技术方案54、55、56或58所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸、或药物组合物，其中所述哺乳动物是人。
62.一种用于治疗、减轻或防止遭受神经退行性疾病或病症诸如Tau病的方法，包括向患有此类疾病或病症的的哺乳动物施用根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、多核苷酸或药物组合物、或其组合。
63.根据技术方案62所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病症是Tau病。
64.根据技术方案63所述的方法，其中所述Tau病选自阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉状蛋白血管病、创伤性脑损伤、关岛型肌萎缩性侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、脑炎后帕金森氏综合征、肌强直性营养不良。
65.如技术方案62、63或64所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
66.一种用于在患有神经退行性病症诸如Tau病的动物、特别是哺乳动物或人中引起被动免疫应答的方法，所述方法通过向所述动物或人施用根据前述技术方案中任一项所述的抗体或其功能性片段、或药物组合物、或其组合。
67.一种用于诊断患者中的Tau蛋白相关疾病、病症或病况或对Tau蛋白相关疾病、病症或病况的易患情况的方法，包括检测抗体或其活性片段与样品中或原位tau蛋白的表位的免疫特异性结合，其包括以下步骤：
a.使怀疑含有所述Tau抗原的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据前述技术方案中任一项的抗体或其片段接触，所述肽或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品中或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，
其中与正常对照值相比，所述聚集物的量的增加表明所述患者患有或处于发展tau蛋白相关疾病或病况的风险。
68.一种用于监测使用根据前述技术方案中任一项所述的抗体或药物组合物治疗后患者中的最小残留疾病的方法，其中所述方法包括：
a.使怀疑含有所述Tau抗原的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据前述技术方案中任一项的抗体或其片段接触，所述肽或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体与所述Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联，
其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量的增加表明所述患者仍患有最小残留疾病。
69.一种用于预测使用根据前述技术方案中任一项的抗体或药物组合物治疗的患者的反应性的方法，包括：
a.使怀疑含有所述Tau抗原的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据技术方案1-45中任一项的抗体或其片段接触，所述肽或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体与所述Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联，
e.比较治疗开始前后所述免疫复合物的量，
其中，所述免疫复合物的量的减少表明所述患者仍患有最小残留疾病。
70.如技术方案67-69中任一项所述的方法，其中将所述免疫复合物的存在或不存在与样品中或具体身体部分或区域中Tau抗原的存在或不存在相关联的步骤包括将所述免疫复合物的量与正常对照值进行比较的步骤。
71.如技术方案67-70中任一项所述的方法，其中所述样品是脑匀浆或脑脊液。
72.一种死后检测来自怀疑患有tau相关疾病或病症的受试者的脑样品中的磷酸Tau(pTau)多聚体的方法，包括：
a.使所述受试者的脑样品与根据前述技术方案中任一项的抗体或其片段接触，所述肽或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体与所述Tau抗原结合以形成免疫复合物；
c.检测所述免疫复合物的形成；和
d.使用相同条件将由所述受试者获得的样品中免疫复合物的量或强度与由健康对照受试者获得的免疫复合物的量或强度进行比较，
其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量或强度的增加表明所述患者已患有tau相关疾病或病症。
73.如技术方案72所述的方法，其中与正常对照值相比，所述测试样品中观察到的增加为30％至100％。
74.如技术方案67-73中任一项所述的用于诊断Tau蛋白相关疾病的方法，其中，在步骤(a)之前，通过使所述样品与附接至固体载体的抗-Tau抗体或其片段相接触对所述样品进行免疫富集以增加样品中Tau蛋白的浓度。
75.用于检测和诊断tau蛋白相关疾病、病症或病况的测试试剂盒，其包含根据技术方案1-45所述的抗体。
76.根据前述技术方案所述的测试试剂盒，包含容纳根据技术方案1-45中任一项所述的一种或多种抗体或其功能性片段的容器，和出于结合Tau抗原以形成免疫复合物并检测所述免疫复合物的形成从而将所述免疫复合物的存在或不存在与Tau抗原的存在或不存在相关联的目的使用所述抗体的说明书。
77.一种选自以下的表位：在396位(pS396)包含磷酸化Ser的VYKSPVVSG(SEQ IDNO：67的Tau aa 393-401)、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的SPVVSG(SEQ ID NO：67的Tauaa 396-401)、在396位(pS396)包含磷酸化Ser的YKSPVVS(SEQ ID NO：67的Tau aa 394-400)、在404位(pS404)包含磷酸化Ser的DTSPR(SEQ ID NO：67的Tau aa 402-406)、和在396位(pS396)包含磷酸化Ser的VYKSPVVS(SEQ ID NO：67的Tau aa 393-400)。
78.一种细胞系，产生根据前述技术方案中任一项所述的抗体。
79.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3136于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-4A6-48。
80.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3137于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A6-2G5-30。
81.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3138于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A6-2G5-41。
82.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3139于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-18。
83.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3140于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-40。
84.如技术方案78所述的细胞系，其是作为DSM ACC3141于2011年9月6日保藏的杂交瘤细胞系A6-1D2-12。
85.一种载体，包含技术方案46或47所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是可操作连接的。
86.一种宿主细胞，包含如技术方案85所述的载体。
87.如技术方案86所述的宿主细胞，产生根据技术方案1-45中任一项所述的抗体、或其功能性片段。
88.如技术方案86或技术方案87所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。
89.如技术方案86或技术方案87所述的宿主细胞，其是中国仓鼠卵巢细胞。
90.一种用于产生如前述技术方案中任一项所述的抗体、或其功能性片段的方法，其包括在适合于表达抗体或片段的条件下培养如技术方案86-89中任一项所述的宿主细胞，以及回收所述抗体或片段。
91.一种检测脑样品中磷酸Tau(pTau)多聚体的方法，包括
a.将所述样品与根据技术方案1-45中任一项所述的抗体或其片段接触，其抗体或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b.允许所述抗体或其片段与所述tau蛋白结合以形成免疫复合物；和
c.检测所述免疫复合物的形成。
附图和序列说明
附图
图1显示用ACI-35-2A1-Ab1(左图)、ACI-35-2G5-Ab3(中图)和对照抗体(HT7；右图)检测在来自对照和AD受试者的人脑匀浆中的磷酸化Tau多聚体的结果。
图2A和2B)显示用市售抗体检测人脑匀浆中的总Tau和p-Tau的结果。
图3A、3B、3C显示在用ACI-35-2A1-Ab1(3A)、ACI-35-1D2-Ab1(3B)和ACI-35-2G5-Ab3(3C)检测人脑匀浆中的磷酸-Tau。
图4A、4B、4C显示使用AlphaLISA，用ACI-35-2A1-Ab1(4A)、ACI-35-1D2-Ab1(4B)和ACI-35-2G5-Ab3(4C)抗体检测人AD和对照(Ctrl)脑中的Tau-pS396的结果。****p＜0.0001，**p＜0.01(通过Mann-Whitney试验)。
图5A和5B显示在用ACI-35-2G5-Ab3治疗Tau转基因小鼠后在杏仁核(5A)和海马(5B)中的Tau-pT231(AT180)IHC染色的结果。
图6A和6B显示在用ACI-35-2G5-Ab3治疗Tau转基因小鼠后在杏仁核(6A)和海马(6B)中的总Tau(HT7)IHC染色。
图7显示使用不同GSK3β条件产生的Tau-pS396的SDS-PAGE，和使用ACI-35-2G5-Ab3抗体印迹的膜。
图8显示使用ACI-35-2G5-Ab3-BT和Tau-13抗体的特异性AlphaLISA测定设置。
图9显示检测来自一个AD供体的人S1脑部分中的Tau-pS396；由通过IP富集的样品和非-IP样品获得的信号的比较。
图10显示使用IP，随后AlphaLISA，用ACI-35-2G5-Ab3抗体检测人AD和对照(Ctrl)CSF中的Tau-pS396的结果。***p＝0.0003(Mann-Whitney试验)。
序列
SEQ ID NO：46-57示出了VH/VK正向和反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62示出了Tau抗原、肽T3的氨基酸序列(参见表1)。
SEQ ID NO：67示出了也称为Tau40的tau的最长同种型(441aa)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：68示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-18产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：69示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-18产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：70示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的重链可变区(VH)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：71示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的重链可变区(VH)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：72示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的重链可变区(VH)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：73示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：74示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：75示出了单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：76示出了通过杂交瘤细胞系A6-1D2-12产生的单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：77示出了通过杂交瘤细胞系A6-1D2-12产生的单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：78示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的重链可变区(VH)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：79示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的重链可变区(VH)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：80示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的重链可变区(VH)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：82示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：83示出了单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：84示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-18产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的重链可变区(VH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：85示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-18产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab1的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：86示出了通过杂交瘤细胞系A6-1D2-12产生的单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的重链可变区(VH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：87示出了通过杂交瘤细胞系A6-1D2-12产生的单克隆抗体ACI-35-1D2-Ab1的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：88示出了分别通过杂交瘤细胞系A4-2A1-18、A4-2A1-40和A4-4A6-48分别产生的单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-2A1-Ab2和ACI-35-4A6-Ab2的重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：89示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的重链可变区(VH)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：90示出了单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-2A1-Ab2和ACI-35-4A6-Ab2分别的重链可变区(VH)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：91示出了单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-2A1-Ab2、ACI-35-4A6-Ab2、ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的重链可变区(VH)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：92示出了通过杂交瘤细胞系A4-2A1-40产生的单克隆抗体ACI-35-4A1-Ab2的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：93示出了单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab2的轻链可变区(VK)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：94示出了单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab2的轻链可变区(VK)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：95示出了单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab2的轻链可变区(VK)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：96示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-08产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：97示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-08产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：98示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的重链可变区(VH)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：99示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的重链可变区(VH)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：100示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的重链可变区(VH)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：101示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：102示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：103示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-Ab1的轻链可变区(VK)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：104示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-30和A6-2G5-41分别产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的重链可变区(VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：105示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-30和A6-2G5-41分别产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：106示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的轻链可变区(VK)的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：107示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的轻链可变区(VK)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：108示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的轻链可变区(VK)的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：109示出了通过杂交瘤细胞系A4-2A1-18、A4-2A1-40和A4-4A6-48分别产生的单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-2A1-Ab2和ACI-35-4A6-Ab2分别的重链可变区(VH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：110示出了通过杂交瘤细胞系A4-2A1-40产生的单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab2的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：111示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-08产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB1的重链可变区(VH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：112示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-08产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB1的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：113示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-30和A6-2G5-41分别产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的重链可变区(VH)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：114示出了通过杂交瘤细胞系A6-2G5-30和A6-2G5-41分别产生的单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3分别的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：115示出了单克隆抗体ACI-35-2G5-AB2和ACI-35-2G5-AB3的重链可变区(VH)的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：116示出了通过杂交瘤细胞系A4-2A1-18产生的单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：117示出了通过杂交瘤细胞系A4-2A1-18产生的单克隆抗体ACI-35-2A1-Ab1的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：118示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-48产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab2的轻链可变区(VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：119示出了通过杂交瘤细胞系A4-4A6-48产生的单克隆抗体ACI-35-4A6-Ab2的轻链可变区(VK)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：120-221示出了VH/VK正向和反向引物的核苷酸序列。
发明详述
术语的定义
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是可互换的并且定义为表示由通过肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
术语“肽”或“结合肽”在本文中是可互换使用的并且表示氨基酸(通常是L-氨基酸)链，其α碳通过一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应所形成的肽键连接。位于所述链的一端的末端氨基酸(即，氨基末端)具有游离氨基，而位于所述链的另一端的末端氨基酸(即，羧基末端)具有游离羧基。照此，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指位于所述肽的氨基末端的氨基酸上的游离α-氨基，或位于所述肽内任何其它位置的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”(缩写为C-末端)是指位于肽的羧基末端的氨基酸上的游离羧基，或位于所述肽内的任何其它位置的氨基酸的羧基。结合肽可以组成抗体，如多克隆或单克隆抗体、人或人源化抗体、双链抗体、骆驼抗体等，或如本文所定义的其功能性部分。
如本文在肽的上下文中所使用的术语“其片段”或“片段”是指功能性肽片段，其具有与本文所定义的完整肽基本相同的(生物)活性。该术语当在本文的肽的上下文中所使用时是指包含完整抗体中含有完整抗体的抗原结合或可变区的一部分的抗体片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)分子；以及双特异性和多特异性抗体和/或抗体片段。
通常，对构成肽的氨基酸依次编号，从氨基末端开始并沿着向所述肽的羧基末端的方向增加。因此，当据称一个氨基酸“紧随”另一个时，则该氨基酸的位置比前一个氨基酸更接近于所述肽的羧基末端。
本文所使用的术语“残基”表示通过酰胺键引入到肽中的氨基酸。照此，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或除非另外限制，则可以涵盖以与所述天然存在的氨基酸类似的方式起作用的已知的天然氨基酸的类似物(即，氨基酸模拟物)。此外，酰胺键模拟物包括本领域技术人员熟知的肽主链修饰。
本文所使用的短语“基本由......组成”来排除将显著改变所述短语所涉及的肽的基本性质的任何元素。因此，“基本由......组成”的肽的描述排除了将显著改变所述肽的生物活性的任何氨基酸取代、添加或缺失。
此外，技术人员将认识到，如上所述，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5％，更通常地小于1％)的单个取代、缺失或添加是保守修饰变化，其中所述变化导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。在本领域中，提供功能相似氨基酸的保存性置换表是熟知的。下列6组分别含有彼此为保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
短语“分离的”或“生物纯的”是指显著或基本不含通常在其天然状态中与之相伴存在的组分的材料。因此，本文所述的肽不含通常与它们的原位环境有关的材料。通常，本文所述的分离的免疫原性肽是至少约80％纯的，通常至少约90％并且优选地至少约95％纯的，如通过银染色凝胶上的谱带强度所测量的。
可以通过多种本领域中熟知的方法来指明蛋白质的纯度或均质性，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并随后通过染色显像。出于某些目的，将需要高分辨率并且使用了HPLC或相似的纯化方法。
当所述免疫原性肽的长度相对较短时(即，小于约50个氨基酸)，则通常使用标准化学肽合成技术来合成它们。
其中将序列的C末端氨基酸连接到不溶性载体上并随后顺序添加序列中剩余的氨基酸的固相合成法是本文所述的免疫原性肽的化学合成的优选方法。用于固相合成的技术是本领域技术人员所知的。
可选地，本文所述的免疫原性肽是使用重组核酸方法合成的。通常，这包括产生编码所述肽的核酸序列，将所述核酸置于受特定启动子控制的表达盒中，在宿主中表达所述肽，分离所表达的肽或多肽，并且如果需要，使所述肽复性。足以指导技术人员进行这些程序的技术见于文献中。
一旦表达，可以根据标准程序纯化重组肽，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱色谱法、凝胶电泳等。优选约50％至95％均质性的基本纯的组合物，并且最优选80％至95％或以上均质性的用作治疗剂。
本领域技术人员将认识到化学合成、生物表达或纯化后，所述免疫原性肽可以具有基本不同于组成肽天然构象的构象。在这种情况下，通常需要变性并减少抗增殖肽并然后使所述肽重折叠成优选构象。减少并变性蛋白质以及引起重折叠的方法对本领域技术人员来说是熟知的。
可以通过(例如)表明与免疫血清或与所产生的抗所述蛋白本身的抗血清之间的反应来确认纯化蛋白的抗原性。
如本文所使用的术语“一个/种”和“所述”定义以表示“一个或多个”并且除非在不适合的情况下，否则包含复数。
如本文所使用的术语“检测”表示使用用于检测生物分子的已知技术(如免疫化学或组织学方法)并且是指定性或定量确定研究中生物分子的存在或浓度。
“分离的”表示不含至少一些与其一起天然存在的组分的生物分子。
如本文所使用的术语“抗体”或“其功能性片段”是本领域公认的术语并且被理解为是指与已知抗原，特别是与免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分结合的分子或分子的活性片段，即含有免疫特异性结合抗原的结合位点的分子。根据本发明所述的免疫球蛋白可以是任何类型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)或分类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
“抗体”旨在本发明的范围内以包括单克隆抗体、多克隆、嵌合、单链、双重特异性、猿源化、人和人源化抗体、骆驼抗体、双链抗体及其功能性片段或其活性片段。与已知抗原结合的分子的活性片段的实例包括Fab和F(ab′)2片段，其包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物和如上所述的任何抗体和片段的表位结合片段。
这些活性片段可以通过多种技术来源于本发明的抗体。例如，可以用酶(如胃蛋白酶)切割纯化的单克隆抗体并进行HPLC凝胶过滤。然后，可以收集含有Fab片段的适合部分并通过膜过滤等浓缩。有关抗体活性片段分离的一般技术的进一步说明，参见，例如，Khaw，B.A.等人，J.Nucl.Med.23：1011-1019(1982)；Rousseaux等人，Methods Enzymology，121：663-69，Academic Press，(1986)。
“人源化抗体”是指一类工程抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的CDR，而所述分子其余的免疫球蛋白来源的部分来源于一个(或多个)人免疫球蛋白。
人源化抗体还可以是指具有可变区的抗体，其中其框架区中的一个或多个具有人或灵长类氨基酸。另外，可以改变框架支持残基(framework support residue)以保持结合亲合力。获得“人源化抗体”的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。(参见，例如，Queen等人，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等人，Bio/Technoloy，9：421(1991))。
“人源化抗体”还可以通过能够在大型动物(例如，兔)中产生亲合力成熟的人样多克隆抗体的新型基因工程方法获得。(http：//www.rctech.com/bioventures/therapeutic.php)。
术语“完全人抗体”或“人”抗体是指来源于具有人抗体基因的转基因小鼠或来源于人细胞的抗体。然而，对于人免疫系统来说，“完全人”、“人”和“人源化”抗体之间的差异可以忽略或者可以是不存在的，并且照此所有三种可以具有相同的效力和安全性。
术语“单克隆抗体”也是本领域中公认的并且是指在实验室中从单个克隆大量产生的并且仅识别一个抗原的抗体。通常通过将常规的短寿命的抗体产生B细胞融合至快速生长细胞例如癌细胞(有时称为“永生”细胞)来制备单克隆抗体。所得的杂交细胞或杂交瘤快速增殖，从而获得了产生大量抗体的克隆。
术语“抗原”是指可以在生物中，特别是在动物中，更特别是在哺乳动物(包括人)中引起免疫应答的实体或其片段。所述术语包括免疫原和负责抗原性或抗原决定簇的区域。
如本文所使用的，术语“可溶性的”表示部分或完全溶解于水溶液中。
还如本文所使用的，术语“免疫原性的”是指引起或提高针对免疫原性试剂的抗体、T细胞及其他反应性免疫细胞的产生并促进在人或动物中的免疫应答的物质。
当个体针对所施用的本发明的免疫原性组合物产生足够的抗体、T细胞及其它反应性免疫细胞以缓解或减轻待治疗病症时，发生免疫应答。
术语“杂交瘤”是本领域公认的并且本领域技术人员认为其是指通过抗体产生细胞和永生细胞(例如，多发性骨髓瘤细胞)的融合产生的细胞。这种杂交细胞能够产生抗体的连续供应。对于融合方法的更详细说明，参见上述“单克隆抗体”的定义和以下实施例。
如本文所使用的术语“载体”表示其中可以引入或可以连接抗原肽或超分子构造的结构，借此将抗原肽或所述肽的部分提供或暴露于人或动物的免疫系统。可以在本发明的背景中将可以适合地在动物或人疗法中使用的任何颗粒(如，例如，囊泡、颗粒或颗粒体)用作载体。
术语“载体”还包括递送方法，其中可以通过递送机构将包含所述抗原肽的超分子抗原构造组合物输送至所需位点。该递送系统的一个实例利用了胶体金属，如胶体金。
可以在本发明所述的超分子抗原构造组合物中使用的载体蛋白包括(但不限于)麦芽糖结合肽“MBP”；牛血清白蛋白“BSA”；钥孔血蓝蛋白(keyhole Iympet hemocyanin)“KLH”；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲状球蛋白；任何种的血清白蛋白；任何种的丙种球蛋白；同基因细胞；具有Ia抗原的同基因细胞；和D-和/或L-氨基酸的聚合物。
此外，术语“治疗有效量”或“药物有效量”是指当施用于人或动物时，足以在所述人或动物中导致治疗效果的结合肽的量。本领域的技术人员按照常规程序能够容易地确定所述有效量。
“pTau PHF”、“PHF”和“双股螺旋形细丝”在本文中同义地使用并且表示缠绕成螺旋形的约10nm的双股细丝，其在电镜中可见的周期为160nm。宽度在10至22nm之间变化。PHF是阿尔兹海默氏病(AD)的神经原纤维缠结和神经毡线中的主要结构。PHF还可以在一些但不是全部与神经炎斑有关的营养障碍性轴突中可见。PHF的主要组分是微管相关蛋白Tau的超磷酸化形式。PHF是由通过二硫键连接的反向平行的超磷酸化Tau蛋白组成的。PHF Tau可被截去其C末端20个氨基酸残基。PHF形成的潜在机制还不确定，但是Tau的超磷酸化可以使其从微管脱离，从而提高Tau的可溶性混合。
在本发明的范围内，据证实抗体引起的对根据本发明所述的抗原组合物的应答在很大程度上是T细胞依赖的。在该方面使用了裸鼠模型，对裸鼠接种并测量抗体应答以评价根据本发明的抗原组合物在免疫的裸鼠中引起的Aβ-特异性抗体应答。裸鼠具有Foxn1nu突变并因此由于缺乏适当的胸腺而具有降低的T细胞功能。
如本文所使用的“药物有效量”是指足以治愈或至少部分停止所治疗的疾病、病症或病况或与此相关的任何并发症的药物组合物中活性成分的剂量。
本发明提供了识别并结合Tau蛋白的主要病理磷酸表位的结合肽。特别地，本发明提供了抗蛋白Tau上的线性和构象的、简单和复杂的磷酸表位的特异性抗体，据信所述磷酸表位导致了Tau病(包括AD)中的突触-和神经-毒性。
因此，本发明在一个实施方案中涉及结合肽或其功能性片段，特别是涉及抗体，特别是单克隆抗体或其功能性片段，所述结合肽或抗体识别并且特异性结合至在哺乳动物上，特别是在人Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，特别是结合至病理蛋白Tau构象体，但是在一个实施方案中，其不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位，其中所述结合肽或抗体具有高结合亲合力，其解离常数为至少10nM、特别是至少8nM、特别是至少5nM、特别是至少2nM、特别是至少1nM，特别是至少500pM、特别是至少400pM、特别是至少300pM、特别是至少200pM、特别是至少100pM、特别是至少50pM。
如本文所使用的“可溶性Tau”蛋白是指由完全溶解的Tau蛋白/肽单体，或由Tau样肽/蛋白，或由修饰或截短的Tau肽/蛋白，或由Tau肽/蛋白单体的其它衍生物和由Tau蛋白寡聚物组成的蛋白质。“可溶性Tau”特别地排除了神经原纤维缠结(NFT)。
如本文所使用的“不溶性Tau”分别是指Tau肽或蛋白，或Tau样肽/蛋白，或修饰或截短的Tau肽/蛋白或形成寡聚或聚合结构的Tau肽/蛋白的其它衍生物的多个聚集单体，它们体外在水溶液培养基中和体内在哺乳动物或人体中，更特别地在脑中均是不溶的，但是特别是指Tau或修饰或截短的Tau肽/蛋白或其衍生物的多个聚集单体，它们在哺乳动物或人体中，更特别地在脑中是不溶的。“不溶性Tau”特别地包括神经原纤维缠结(NFT)。
如本文所使用的“单体Tau”或“Tau单体”是指完全溶解的Tau蛋白，其在水溶液培养基中无聚集的复合物。
“聚集Tau”、“寡聚Tau”和“Tau寡聚物”分别是指Tau肽或蛋白，或Tau样肽/蛋白，或修饰或截短的Tau肽/蛋白或形成寡聚或聚合结构的Tau肽/蛋白的其它衍生物的多个聚集单体，它们体外在水溶液培养基中和体内在哺乳动物或人体中，更特别地在脑中是不溶的或可溶的，但是特别是指Tau或修饰或截短的Tau肽/蛋白或其衍生物的多个聚集单体，它们在哺乳动物或人体中，更特别地在脑中是不溶的。
“调节抗体”是指如本文在各个实施方案中所述的抗体或其功能性片段，其可上调(例如，激活或刺激)、下调(例如，抑制或遏抑)或以其它方式改变含有增加的可溶性tau蛋白和/或可溶性磷酸化tau蛋白的水平的动物(特别是哺乳动物或人)体内，特别是脑中(特别是脑皮层和/或海马中)的可溶性和/或不溶性和/或寡聚Tau蛋白(特别是可溶性磷酸化tau蛋白)的功能性质、生物活性或水平。调节抗体或其功能片段可用来调节tau蛋白或直接或间接编码所述tau蛋白的多肽。在某些实施方案中，调节抗体或其功能片段降低可溶性和/或不溶性和/或寡聚、特别是可溶性和不溶性tau蛋白，特别是可溶性和不溶性和寡聚tau蛋白的水平。一方面，可溶性和/或不溶性和/或寡聚tau蛋白是含有增加的tau蛋白和/或磷酸化tau蛋白(特别是可溶性tau蛋白和/或可溶性磷酸化tau蛋白)的水平的动物(特别是哺乳动物或人)的脑中(特别是脑皮层和/或海马中)的磷酸化tau蛋白，特别是可溶性磷酸化tau蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的根据本文所述和所要求保护的实施方案中任一项的结合肽或其功能性部分，特别是抗体，特别是单克隆抗体或其功能性部分，或包含编码所述结合肽或抗体的核酸序列的多核苷酸，或它们的组合，以及药学上可接受的载体。
适合的药用载体、稀释剂和/或赋形剂在本领域中是公知的并且包括(例如)磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液(如油/水乳状液)、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。
可以使用已知技术将包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段的根据本发明所述的结合肽制备成生理学可用的制剂，并且其可以包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。例如，包括任何功能等效的结合肽或其功能性部分的根据本发明和如本文所述的结合肽，特别地包括任何功能等效的抗体或其功能性部分的本发明的单克隆抗体与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂结合以形成治疗性组合物。适合的药用载体、稀释剂和/或赋形剂在本领域中是熟知的并且包括(例如)磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液(如油/水乳状液)、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。
可以根据本领域技术人员所知的标准方法完成根据本发明的药物组合物制剂。
可以将本发明的组合物以适合的药学有效量以固体、液体或气溶胶的形式施用给受试者。固体组合物的实例包括丸剂、乳膏剂和可植入的剂量单位。丸剂可以口服施用。治疗性乳膏剂可以局部施用。可植入剂量单位可以在(例如)肿瘤位点上局部施用或者可以(例如)皮下植入以全身释放治疗性组合物。液体组分的实例包括适合于肌内、皮下、静脉内、皮下、动脉内注射的制剂和用于局部和眼内施用的制剂。气溶胶制剂的实例包括用于向肺部施用的吸入器制剂。
所述组合物可以通过标准施用途径施用。一般地，可以通过局部、口服、直肠、鼻、皮内、腹膜内或胃肠外(例如，静脉内、皮下或肌内)途径施用所述组合物。
另外，可以将所述组合物引入到缓释基质(如可生物降解的聚合物)中，将所述聚合物植入到需要递送的位置(例如，肿瘤位点)附近。所述方法包括单次剂量的施用，以预定时间间隔的重复剂量的施用和在预定时间段内的持续施用。
如本文所使用的缓释基质是由通过酶促或酸/碱水解或通过溶解可降解的材料(通常是聚合物)制成的基质。一旦插入体内，所述基质通过酶和体液开始起作用。期望的是，缓释基质选自生物相容性材料，如脂质体、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和聚硅氧烷。优选的生物可降解基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)中的一种的基质。
本领域普通技术人员熟知的组合物的剂量将取决于多种因素，如(例如)要治疗的病况、所使用的具体的组合物和其他临床因素，如患者的体重、尺寸、性别和一般健康状况、体表面积、要施用的具体的化合物或组合物、同时施用的其他药物和施用途径。
根据本发明所述的组合物可以结合包含生理活性物质或化合物的其它组合物施用，所述生理活性物质或化合物如(例如)在Tau病和/或淀粉样变性(一组与参与阿尔茨海默氏病的淀粉状蛋白或淀粉状蛋白样蛋白(如淀粉状蛋白β蛋白)有关的疾病和病症)的药物治疗中使用的已知的化合物。
另一种生理活性物质或化合物可以通过与根据本发明的治疗性疫苗相同或相似的机制或通过独立的作用机制或通过多个相关和/或独立的作用机制来发挥其生物效应。
通常，另一种生物学活性化合物可以包括神经传递增强因子(neutron-transmission enhancer)、精神治疗药、乙酰化胆碱脂酶抑制剂、钙通道阻断剂、生物胺、苯并二氮
Figure GDA0001615266380000551
镇定剂、乙酰胆碱合成、储存或释放增强子、乙酰胆碱突触后受体激动剂、单胺氧化酶-A或-B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾族抗炎药、抗氧化剂和含血清素的受体拮抗剂。
特别地，所述生物活性剂或化合物可以包含至少一种化合物，其选自：抗氧化应激化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂，如哌仑西平和代谢产物、3-氨基-1-丙烷磺酸(3APS)、1，3-丙烷二磺酸(1，3PDS)、分泌酶激活剂、[β]-和7-分泌酶抑制剂、Tau蛋白、神经递质、β片层阻断肽、抗炎分子、“非典型抗精神病药物”，如(例如)氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)，如他克林、利凡斯的明、多奈哌齐和/或加兰他敏及其它药物和营养添加剂，如(例如)维生素B12、半胱氨酸、乙酰胆碱前体、卵磷脂、胆碱、银杏、乙酰基-L-卡尼汀、艾地苯醌、丙戊茶碱或黄嘌呤衍生物，以及根据本发明的结合肽，其包括抗体、特别是单克隆抗体及其活性片段和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂，以及用于疾病治疗的说明书。
在其他实施方案中，根据本发明所述的组合物可以包含烟酸或美金刚，以及根据本发明的结合肽，其包括抗体、特别是单克隆抗体及其活性片段和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
在本发明的另一个实施方案中，提供了组合物，其包含用于阳性和阴性精神病症状(其包括幻觉、错觉、思维内容障碍(表现为显著的思维不连贯、出轨、答非所问)和怪异或混乱的行为以及快感缺乏、情感障碍、冷漠和社会退缩)的治疗的“非典型抗精神病药物”，如(例如)氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平，以及根据本发明的结合肽，其包括抗体、特别是单克隆抗体及其活性片段和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。
除根据本发明所述的结合肽以外，可以适合地在组合物中使用的其它化合物为在例如WO 2004/058258中公开的那些(尤其参见第16和17页)，其包括治疗药物靶标(第36-39页)、链烷磺酸和烷醇硫酸(第39-51页)、胆碱酯酶抑制剂(第51-56页)、NMDA受体拮抗剂(第56-58页)、雌激素(第58-59页)、非甾族抗炎药(第60-61页)、抗氧化剂(第61-62页)、过氧化物酶增殖剂激活受体(PPAR)激动剂(第63-67页)、降胆固醇剂(第68-75页)；淀粉状蛋白抑制剂(75-77页)、淀粉状蛋白形成抑制剂(第77-78页)、金属螯合剂(第78-79页)、抗精神病药和抗抑郁药(第80-82页)、营养添加剂(第83-89页)和提高脑中生物活性物质可用性的化合物(参见第89-93页)和前体药物(第93和94页)，该文档作为参考并入本文，但特别是在如上所述页中提及的化合物。
蛋白质药物活性物质可以以每剂量1ng至10mg之间的量存在。通常，施用方案应在0.1μg至10mg根据本发明所述的抗体之间的范围内，特别是在1.0μg至1.0mg的范围内，并且更特别是在1.0μg至100μg之间的范围内，并且这些范围内的所有各个数值也是本发明的一部分。如果通过连续输注进行施用，则更适合的剂量可以在每公斤体重每小时0.01μg至10mg单位之间的范围内，并且这些范围内的所有各个数值也是本发明的一部分。
施用通常将是肠胃外施用，例如，静脉内或皮下施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳状液。非水性溶剂包括(但不限于)丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性溶剂可以选自水、醇/水溶液、乳状液或混悬液，其包括盐水和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖-氯化钠液、乳酸林格氏液或非挥发性油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖液的那些)等等。还可以存在防腐剂，如(例如)抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
所述药物组合物还可以包含蛋白质载体，如(例如)血清白蛋白或免疫球蛋白，特别是人源的。根据预期用途，其它生物活性剂可以存在于本发明的药物组合物中。
当结合靶标位于脑中时，本发明的某些实施方案提供了根据本发明所述的结合肽，其包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段以穿过血脑屏障。某些神经退行性疾病与血脑屏障的渗透性增加有关，从而使得根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)可以容易地进入脑中。当血脑屏障完整无损时，存在用于将分子输送穿过血脑屏障的几种本领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法和基于受体和通道的方法。
输送根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于彻底绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中开口。绕过(circumvention)方法包括但不限于向脑中直接注射(参见，例如，Papanastassiou等人，Gene Therapy 9：398-406(2002))和在脑中植入递送装置(参见，例如，Gill等人，NatureMed.9：589-595(2003)；和Gliadel Wafers(TM)，Guildford Pharmaceutical)。在所述屏障中产生开口的方法包括(但不限于)、超声(参见，例如，美国专利公布No.2002/0038086)、渗透压(例如，高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier andits Manipulation，Vols 1&2，Plenum Press，N.Y.(1989))、通过(例如)血管舒缓激肽或可透化剂A-7的透化作用(参见，例如，美国专利No.5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)、和用含有编码所述结合肽或抗原结合片段的基因的载体转染跨在血脑屏障上的神经元(参见，例如，美国专利公布No.2003/0083299)。
输送根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于将根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)包埋在脂质体中，所述脂质体与结合血脑屏障血管内皮上的受体的其活性片段相连(参见，例如，美国专利申请公布No.20020025313)，和在低密度脂蛋白颗粒(参见，例如，美国专利申请公布No.20040204354)或载脂蛋白E(参见，例如，美国专利申请公布No.20040131692)中涂覆根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)。
用于输送根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂提高血脑屏障的渗透性(参见，例如，美国专利申请公布No.2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见，例如，美国专利申请公布No.2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如，美国专利申请公布No.2003/0073713)；用转铁蛋白涂覆抗体并调节所述一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见，例如，美国专利申请公布No.2003/0129186)，和使所述抗体阳离子化(参见，例如，美国专利No.5,004,697)。
可以在延长的一段时间内向受试者提供根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)或根据本发明的药物组合物的单次或重复施用。施用持续时间可以在1周至多至12个月或以上之间。在此期间，根据待治疗受试者的需要，可以将所述结合肽、抗体或药物组合物每周施用一次，每两周、三周、四周等施用一次，或以更高或更低的频率施用。
在其它实施方案中，本发明提供了用于检测和诊断Tau蛋白相关疾病、病症或病况的方法和试剂盒，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况包括神经退行性疾病或病症(如Tau病)，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，其包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，包括但不限于，阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤和不显示单独的淀粉状蛋白病理的其它疾病或病症，其包括但不限于关岛型肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆(Tangle onlydementia)、脑炎后帕金森氏综合征、肌强直性营养不良。所述病理异常可以由神经原纤维病变的形成引起或与其有关，所述神经原纤维病变是Tau病中主要的脑病理。
另外，本发明提供了用于诊断对Tau蛋白相关疾病、病症或病况的易患情况的方法和试剂盒，所述Tau蛋白相关疾病、病症或病况包括神经退行性疾病或病症(如Tau病)，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，其包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，或用于监测患者中最小残留疾病或用于预测患者对使用根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)或根据本发明和如本文所述的组合物的治疗的反应性的方法和试剂盒。这些方法包括一般用于检测或定量生物样品中或原位条件下的物质的已知免疫学方法。
可以通过检测本发明的结合肽(特别是抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)与样品中或原位Tau蛋白的表位的免疫特异性结合来实现在对其有需要的受试者(特别是哺乳动物，更特别是为人)中Tau蛋白相关疾病或病况的诊断或对Tau蛋白相关疾病或病况的易患情况的诊断，所述Tau蛋白相关疾病或病况包括神经退行性疾病或病症(如Tau病)，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症，其包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症，所述诊断包括将怀疑含有Tau蛋白的样品或具体身体部分或身体区域与结合Tau蛋白表位的抗体接触，允许所述抗体与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物，检测所述免疫复合物的形成并将所述免疫复合物的存在或不存在与样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，任选地将所述免疫复合物的量与正常对照值相比较，其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量的增加表明所述受试者患有Tau蛋白相关疾病或病况或具有发展Tau蛋白相关疾病或病况的风险。
可以通过检测本发明的结合肽(特别是抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段)与样品中或原位Tau蛋白的表位的免疫特异性结合来实现在使用根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)或根据本发明的组合物治疗后在受试者，特别是哺乳动物，更特别是人中对最小残留疾病的监测，所述监测包括将怀疑含有Tau蛋白的样品或具体身体部分或身体区域与结合Tau蛋白表位的根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)接触，允许根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物，检测所述免疫复合物的形成并将所述免疫复合物的存在或不存在与样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，任选地将所述免疫复合物的量与正常对照值相比较，其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量的增加表明所述受试者可能仍患有最小残留疾病。
可以通过检测结合肽(特别是单克隆抗体或其活性片段)与样品中或原位Tau蛋白的表位的免疫特异性结合来实现对受试者(特别是哺乳动物，更特别是人)对使用根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)或根据本发明的组合物的治疗的反应性的预测，所述预测包括将怀疑含有Tau蛋白的样品或具体身体部分或身体区域与结合Tau蛋白表位的根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)接触，允许根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物，检测所述免疫复合物的形成并将所述免疫复合物的存在或不存在与样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，任选地比较治疗开始前后所述免疫复合物的量，其中所述免疫复合物的量的减少表明所述患者具有对治疗起反应的高潜能。
可用于诊断Tau蛋白相关疾病或病况(包括神经退行性疾病或病症如Tau病，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症(包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症))，用于诊断对Tau蛋白相关疾病或病况的易患情况，或用于监测患者中最小残留疾病或用于预测患者对使用根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)或根据本发明和如本文所述的组合物的治疗的反应性的生物样品为(例如)液体，如血清、血浆、唾液、胃液分泌、粘液、脑脊液、淋巴液等，或者得自生物的组织或细胞样品，如神经、脑、心脏或血管组织。对于样品中Tau蛋白存在与否的确定，可以使用本领域普通技术人员所知的任何免疫测定，如(例如)使用用于检测的第二试剂的利用间接检测方法的测定、ELISA以及免疫沉淀和凝集测定。这些测定的详细说明可见于，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，New York1988555-612)；授权于Maertens和Stuyver的WO96/13590；Zrein等人(1998)和WO96/29605。
对于原位诊断，可以通过本领域中已知的方法将根据本发明所述的结合肽(包括根据本发明的抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段，或其任何活性和功能性片段)施用于待诊断的生物，所述方法如(例如)静脉内、鼻内、腹膜内、脑内、动脉内注射，从而使得根据本发明的抗体和淀粉状蛋白上的表位区之间可以发生特异性结合。可以通过连接到根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体，或其功能性片段)上的标记物或任何其它本领域已知的检测方法方便地检测结合肽/抗原复合物。
在诊断应用中使用的或者在用于诊断对Tau蛋白相关疾病或病况(包括神经退行性疾病或病症如Tau病，其包括一组异质性的神经退行性疾病或病症(包括显示出Tau和淀粉状蛋白病理共存的疾病或病症))的易患情况，或用于监测患者中最小残留疾病或用于预测患者对使用根据本发明的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)或根据本发明和如本文所述的组合物的治疗的反应性的应用中使用的免疫测定通常依赖于标记的抗原、结合肽或用于检测的第二试剂。可以用本领域技术人员通常所知的化合物标记这些蛋白质或试剂，其包括酶、放射性同位素和荧光、发光和生色物质，其包括但不限于着色的颗粒，如胶体金和乳胶珠。在这些中，放射性标记可以用于几乎所有类型的测定并且具有最多的变化。当必须避免放射性或当需要快速结果时，酶结合的标记物是特别有用的。尽管对于它们的使用需要昂贵的设备，但是荧色物提供了非常敏感的检测方法。在这些测定中有用的结合肽是在本文的权利要求中公开的那些，其包括抗体，特别是单克隆抗体、多克隆抗体和亲合纯化的多克隆抗体。
可选地，可以通过与对免疫球蛋白具有亲合力的标记的物质(如蛋白A或G或二抗)反应来间接标记根据本发明所述的结合肽(其包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)。可以将根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)与第二物质结合并用对结合至所述抗体的第二物质具有亲合力的标记的第三物质来检测。例如，根据本发明所述的结合肽(包括抗体，特别是单克隆抗体及其活性片段)可以结合至生物素并使用标记的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素检测的结合肽/生物素结合物。类似地，所述结合肽可以结合至半抗原并使用标记的抗半抗原结合肽检测结合肽/半抗原结合物。
本领域技术人员将知道可以根据本发明使用的这些及其它适合的标记物。可以使用本领域技术人员一般所知的标准技术完成这些标记物与结合肽或其片段的结合。Kennedy，J.H.等人，1976(Clin.Chim.Acta 70：1-31)和Schurs，A.H.W.M.等人，1977(Clin.Chim Acta 57：1-40)描述了典型技术。后者中提到的偶联技术为戊二醛法、高碘酸盐法、二马来酰亚胺法等，所有技术作为参考并入本文。
目前免疫测定利用双抗体法来检测分析物的存在性，其中通过与已用可检测标记物标记的二抗反应来间接标记所述抗体。所述二抗优选地是与从中获得所述单克隆抗体的动物的抗体结合的抗体。换句话说，如果所述单克隆抗体是小鼠抗体，那么所述标记的二抗是抗小鼠抗体。对于要在本文所述的测定中使用的抗体，该标记物优选地为抗体涂覆的珠，特别是磁性珠。对于要在本文所述的免疫测定中使用的抗体，所述标记物优选地为可检测分子，如放射性、荧光或电化学发光物质。
在本发明的范围内还可以使用通常称为快速格式系统(fast format systems)的替代性双抗体系统，这是由于它们适合于分析物存在性的快速测定。该系统需要抗体和分析物之间的高亲合力。根据本发明的一个实施方案，使用分别对淀粉状蛋白特异的一对抗体确定淀粉状蛋白的存在性。所述抗体对中的一个在本文中被称为“检测抗体”，而所述抗体对中的另一个在本文中被称为“捕获抗体”。根据本发明所述的单克隆抗体可以用作捕获抗体或检测抗体中的任一种。根据本发明所述的单克隆抗体还可以在单个测定中一起用作捕获抗体和检测抗体两者。因此，本发明的一个实施方案使用双抗体夹心法来检测生物液体样品中的淀粉状蛋白。在该方法中，将分析物(淀粉状蛋白)夹在检测抗体和捕获抗体之间，而将所述捕获抗体不可逆地固定在固体载体上。检测抗体将含有可检测标记物，以鉴别抗体-分析物夹心的存在性，并因此鉴别分析物的存在性。
示例性固相物质包括但不限于微量滴定板、聚苯乙烯试管、磁性、塑料或玻璃珠和载玻片，它们在放射免疫测定和酶免疫测定领域中是熟知的。用于将抗体连接至固相的方法也是本领域技术人员所熟知的。最近，已将多种多孔材料如尼龙、硝化纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维及其它多孔聚合物用作固体载体。
本发明还涉及用于检测生物样品中Tau蛋白的诊断试剂盒，其包含如上定义的组合物。此外，本发明涉及后一种诊断试剂盒，除如上定义的组合物之外，所述试剂盒还包含如上定义的检测试剂。一般说来，术语“诊断试剂盒”是指本领域中已知的任何诊断试剂盒。更特别地，后一个术语是指如Zrein等人(1998)所述的诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于Tau蛋白相关疾病和病况的检测和诊断的新型免疫探针和测试试剂盒，其包含根据本发明的结合肽。对于免疫探针，所述结合肽直接或间接地连接至适合的报告分子，例如，酶或放射性核素。所述测试试剂盒包含容纳根据本发明的一个或多个结合肽的容器和出于结合Tau抗原以形成免疫复合物并检测所述免疫复合物的形成、从而将所述免疫复合物的存在或不存在与Tau蛋白的存在或不存在相关联的目的使用所述结合肽的说明书。
实施例
实施例1：杂交瘤和抗体的产生和筛选
本研究的目的是产生和筛选抗Tau mAb(单克隆抗体)。通过Tau疫苗免疫的小鼠脾与骨髓瘤细胞系的融合产生杂交瘤。评价了杂交瘤对在疫苗制备中使用的磷酸化和非磷酸化全长Tau蛋白以及磷酸化和非磷酸化Tau抗原性肽的反应性。还使用免疫化学在Tau转基因小鼠脑切片上通过杂交瘤上清液对Tau缠结的反应性来进行杂交瘤筛选。
1.1方法
1.1.1融合
将用ACI-35(Tau 393-408[pS396，pS404])接种的野生型C57BL/6小鼠用于杂交瘤产生。在第0天并且在第4天再次用ACI-35疫苗强化小鼠，并且在第7天进行融合。
将来自免疫小鼠的6×107(ACI-35)个脾细胞与2×107个SP2-O-Ag14骨髓瘤细胞以3个脾细胞/1个骨髓瘤细胞的比例融合。
该融合产生了8×96孔板，并且根据板(1-8)，然后根据行(A-G)，最后根据列(1-12)来命名克隆。
1.1.2用于选择克隆的筛选法
首先将8×96孔板对IgG表达筛选两次。然后将阳性表达克隆转移到24孔板中并在Tau ELISA筛选和免疫组织化学TAUPIR筛选中测试生长细胞的细胞上清液(＝克隆)。将ELISA和/或TAUPIR中的阳性上清液转移到T25三角瓶中并且在Tau ELISA筛选和TAUPIR筛选中再次对克隆筛选IgG表达。
1.1.3 IgG筛选
在4℃用50μl/孔的抗小鼠IgG抗体(AbD Serotec，Düsseldorf，Germany)在涂覆缓冲液中的溶液涂覆ELISA板(Costar；Sigma)16小时。在用PBS/Tween清洗板之后，在室温下将孔用100μl/孔的封闭溶液封闭1小时。在室温下，将未稀释的杂交瘤上清液(50μl/孔)孵育1小时。在清洗后，在室温下将辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgM(AbD Serotec)的混合物应用1小时。最终清洗后，用HRP底物(TMB，3-3′，5，5′-四甲基联苯胺)进行检测，并使用酶标仪在405nm对板读数。结果表示为光密度(O.D.)。
1.1.4杂交瘤Tau ELISA筛选
对pTau肽(ACI-35，T3.5：Tau393-408[pS396/pS404；PolyPeptide Laboratories，
Figure GDA0001615266380000641
Denmark)、相应的非磷酸化Tau肽(T3.6：Tau393-408，PolyPeptideLaboratories)、磷酸化全长(441aa)Tau蛋白(pTau蛋白，Vandebroek等人，2005)和全长(441aa)Tau蛋白(Tau蛋白，SignalChem，Richmond，Canada)进行杂交瘤ELISA筛选。最后，将牛血清白蛋白(BSA)用作阴性对照。
在4℃用10μg/ml相应的Tau肽和1μg/ml相应的Tau蛋白涂覆板过夜。在用PBS-0.05％吐温20清洗每个孔并用1％BSA在PBS-0.05％吐温20中的溶液封闭后，将未稀释的杂交瘤上清液或培养基阴性对照加入到板中并在37℃孵育2小时。清洗后，在37℃将板与碱性磷酸酶(AP)结合的抗小鼠IgG总抗体(Jackson Laboratories，Baltimore，PA，USA)一起孵育2小时。清洗后，将板与作为AP的磷酸酶底物的pNPP(对硝基磷酸苯酯)一起孵育，并使用ELISA酶标仪在405nm读数。结果表示为O.D.(光密度)。
1.1.5杂交瘤IHC筛选：抗Tau抗体与转基因小鼠脑切片中的缠结的结合(TAUPIR)
根据实施例3.1.2的规程进行TAUPIR实验。
1.1.6T25三角瓶IgG筛选
在4℃，用5ug/ml抗小鼠IgG F(ab′)2片段特异性抗体(Jackson Laboratories，Baltimore，PA，USA)在pH 9.6的碳酸盐-碳酸氢盐涂覆缓冲液(Sigma，Buchs，瑞士)中的溶液涂覆ELISA板过夜。清洗板后，在室温下将未稀释的杂交瘤上清液、阳性对照IgG1抗体(6E10，浓度1ug/ml：Covance，Emeryville，CA，USA)或阴性对照(仅培养基)孵育1小时。清洗步骤后，在37℃将第二AP-结合的山羊抗小鼠IgG(亚类1+2a+2b+3)Fcγ片段特异性抗体(Jackson Laboratories，Baltimore，PA，USA)在板上孵育2小时。最终清洗后，用作为AP的磷酸酶底物的pNPP(对硝基磷酸苯酯)进行检测，并使用ELISA酶标仪在405nm对板读数。结果表示为O.D.(光密度)。
1.2结果
对由融合产生的来自8×96孔板的细胞上清液筛选IgG的产生。在所测试的768个孔中(8×96孔板)，基于与疫苗磷酸肽和全长磷酸-Tau的最佳结合选择对IgG产生是阳性的48个孔。选择是基于通过ELISA的与肽和全长磷酸-Tau蛋白的结合，以及同时基于当与非磷酸-肽和非磷酸全长Tau蛋白比较时与选择性的结合。通过将每种杂交瘤以1个细胞/孔接种2个板和以0.5个细胞/孔接种1个板，对24种所选择的杂交瘤进行亚克隆。再次测试上清液与磷酸-肽和磷酸-肽的结合以验证结合特征，之后在6周培养中评价稳定性。然后选择八个稳定的克隆并使用方法中所述的ELISA和TAUPIR测试其同种型和结合。
1.3结论
所产生的抗体表现出对pTau肽的高特异性，而与非磷酸化肽仅有轻微结合。
选择总计8种克隆用于进一步亚克隆(参见表6和表7)并且将6种克隆在DSMZ保藏(参见表10)。
将如上所述的阳性母克隆在96孔板中进一步培养，然后在24孔板中培养，最后在T25三角瓶中培养。在每个阶段，通过ELISA、Taupir和免疫印迹筛选杂交瘤克隆的上清液。
实施例2：抗体轻链知重链可变区的克隆
将来自杂交瘤细胞的抗体重和轻可变区基因克隆并且确定DNA序列和互补决定区(CDR)的位置以及抗体结合特征。
使用Qiagen RNeasy微型试剂盒(Cat No：74104)从3×106个杂交瘤细胞(1个小瓶)中制备总RNA。将RNA在50uL水中洗脱并在1.2％的琼脂糖凝胶上检验。
使用反转录酶通过IgG和κ恒定区引物制备VH和VKcDNA。使用较大的一组信号序列引物通过PCR扩增第一链cDNA。将扩增的DNA进行凝胶纯化并克隆到载体
Figure GDA0001615266380000661
T Easy(Promega)中。将所获得的VH和VK克隆筛选预期大小的插入。通过自动DNA测序双向确定所选克隆的DNA序列。参考其它抗体序列确定了序列中互补决定区(CDR)的位置(Kabat EA等人，1991)。
实施例3：结合研究I
目的是测量从来源于用Tau脂质体疫苗免疫的小鼠的亚克隆杂交瘤所产生的抗体的磷酸-Tau(pTau)结合。为了进行该测试，将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于测量纯化抗体与磷酸化和非磷酸化全长Tau蛋白以及用于脂质体疫苗制备的磷酸化和非磷酸化Tau抗原性肽的结合。
通过两种其他方法完成筛选。使用抗Tau抗体作为一抗对来自Tau转基因动物(TAUPIR)的脑切片进行免疫组织化学(IHC)。另外，使用抗Tau抗体作为印迹抗体对来自Tau转基因小鼠的脑蛋白匀浆进行免疫印迹(WB)。
3.1方法
3.1.1ELISA：磷酸Tau结合测定
为了测试纯化抗体与Tau和pTau的结合，使用了ELISA测定。简言之，用1μg/mL全长(441个aa)Tau蛋白(SignalChem，Richmond，加拿大)或磷酸化全长(441个aa)Tau蛋白涂覆Nunc MaxiSorp 96孔板(Nunc，Roskilde，丹麦)(Vandebroek等人，2005)。另外，用10μg/mL的Tau源性疫苗肽，Tau393-408(在S396和S404磷酸化或未磷酸化)涂覆板。为了测试与在疫苗制备中未使用的Tau和具有不同pTau表位的pTau序列的交叉反应性，用10μg/mL的下列肽涂覆板：Tau 393-408(在S396和S404磷酸化或未磷酸化)。在4℃在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中涂覆过夜。用0.05％的吐温20/PBS彻底清洗板，然后在37℃用1％牛血清白蛋白(BSA)在0.05％吐温20/PBS中的溶液封闭1小时。然后，以在20至0μg/mL之间的8或16个两倍稀释系列加入测试抗体，并允许在37℃孵育2小时。然后如上所述清洗板，并且在37℃以在0.05％吐温20/PBS中的1/6000稀释液加入AP结合的抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Suffolk，England)2小时。清洗后，将板与p-硝基苯磷酸二钠六水合物(pNPP；Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，并在30min、1、2或16小时的孵育时间后使用ELISA酶标仪在405nm读数。
3.1.2.TAUPIR和Western印迹：抗Tau抗体与Tau转基因动物脑切片中Tau缠结的结合(TAUPIR)
对于TAUPIR染色，脑切片来自于TPLH小鼠(表达hTauP301L的最长同种型(441aa)的转基因小鼠)、年老的(＞18个月大)双转基因biGT小鼠(与TPLH杂交的GSK-3β转基因小鼠)，和双转基因biAT小鼠(与TPLH杂交的hAPPV717I转基因小鼠)。作为阴性对照，使用了来自Tau敲除小鼠(TKO；6个月大)的切片。将脑切片在PBS中清洗5分钟，然后在室温下在含1.5％H2O2的PBS：MeOH(1∶1)中的溶液中孵育15分钟以封闭内源过氧化物酶活性。在PBST(PBS/0.1％TritonX100)中清洗切片3次后，将它们在室温下在PBST+10％FCS(胎牛血清)封闭溶液中孵育30分钟。在4℃，用下列抗体浓度与所测试的抗Tau抗体过夜孵育：在PBST/10％FCS中的0.0053μg/mL的ACI-35-2A1-Ab1、0.0048μg/mL的ACI-35-2A1-Ab2、0.015μg/mL的ACI-35-4A6-Ab1、0.0047μg/mL的ACI-35-1D2-Ab1、0.0055μg/mL的ACI-35-2G5-Ab1以及0.01μg/mL的ACI-35-2G5-Ab2和ACI-35-2G5-Ab3。在用PBST再次清洗切片3次后，在室温下与HRP结合的山羊抗小鼠(购自Dako，Glostrup，丹麦)二抗在PBST/10％FCS中的溶液孵育1小时。检测前，用PBST清洗切片3次并在50mM Tris/HCl pH 7.6中孵育5分钟。通过将切片在二氨基联苯胺(DAB：1片溶于10ml的50mM Tris.HCl+3μl H2O230％；MP Biomedicals，Solon，OH，USA)中孵育3分钟来进行检测。通过用PBST清洗切片3次来终止反应。然后，将切片转移到硅烷化玻璃板上并在50℃在加热板上空气干燥2小时。通过与迈尔氏苏木精(Fluka Chemie，Buchs，瑞士)孵育1分钟，然后在流动的自来水中清洗4分钟来进行复染色。经由在50％、70％、90％乙醇浴中通过以及在100％乙醇浴中通过两次，然后在二甲苯中通过2次(每次1分钟)使切片脱水。最后，用DePeX(BDH Chemicals Ltd.，Poole，England)将切片固定在玻璃盖玻片下用于成像。
对SDS-PAGE(10％)分离的来自野生型小鼠(FVB)Tau转基因小鼠(TPLH和biGT)、或Tau敲除小鼠(TKO)的脑匀浆蛋白进行另外的染色(Western印迹)。对于Western印迹，使用下列浓度的抗体：0.53μg/mL的ACI-35-2A1-Ab1、0.48μg/mL的ACI-35-2A1-Ab2、0.5μg/mL的ACI-35-4A6-Ab1、0.47μg/mL的ACI-35-1D2-Ab1、0.55μg/mL的ACI-35-2G5-Ab1、0.33μg/mL的ACI-35-2G5-Ab2和0.5μg/mL的ACI-35-2G5-Ab3。
3.2结果
抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-2A1-Ab2、ACI-35-1D2-Ab1、ACI-35-2G5-Ab2和ACI-35-2G5-Ab3显示与磷酸化人Tau蛋白的高结合活性和特异性(表2)，与相应的疫苗中所用的抗原磷酸-Tau肽的特异性更高。观察到与非磷酸化Tau，或与所测试的其他磷酸化和非磷酸化Tau源性肽无交叉反应性。抗体ACI-35-4A6-Ab1，根据其选择，仅与疫苗制备中所用的抗原磷酸-Tau肽表现出高结合活性。发现与疫苗制备中所用的抗原肽的非磷酸对应物的交叉反应性较低，这是基于克隆选择而期望的。抗体ACI-35-2G5-Ab1仅与疫苗制备中所用的抗原磷酸-Tau肽表现出高结合活性。观察到与T4.5磷酸-肽(包含疫苗中所用的抗原肽序列的部分)的交叉反应性较低。
使用TAUPIR和WB观察与具有晚期Tau病(biGT＞18个月)的小鼠的脑中的Tau缠结、以及与来源于这些小鼠的变性匀浆中的全长Tau的结合。分析不同脑区：皮层以及海马的CA1、CA3和齿状回(DG)部分。抗体ACI-35-2A1-Ab1和ACI-35-2A1-Ab2通过致密的胞质染色和清楚的神经毡线(尤其在海马的CA1和CA3区中)表现出最佳TAUPIR结果。抗体ACI-35-4A6-Ab1在TAUPIR中是阴性的，仅有微弱的散发缠结如轻微染色的结构。抗体ACI-35-1D2-Ab1通过CA1区中的神经毡线显示良好的胞质TAUPIR染色。抗体ACI-35-2G5-Ab1在TAUPIR中是阴性的，具有细胞核染色和仅有一些缠结染色。最终，ACI-35-2G5-Ab2和ACI-35-2G5-Ab3抗体表现出类似的良好胞质TAUPIR染色，在海马的CA1和CA3中观察到神经毡线。使用+或-符号对染色质量的评级示于表2中。对来自Tau转基因小鼠的脑匀浆印迹，显示所有抗体与期望的Tau珠结合良好(表2，评级为+)，其中ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab1也显示另外的非特异性结合(-/+)。
实施例4：结合研究II
4.1方法
4.1.1SPR结合测定
所有SPR实验均在Biacore X仪(GE Healthcare)上进行。传感器芯片SA(链霉亲和素衍生化的羧甲基葡聚糖)购自GE Healthcare。运行缓冲液为PBS(Dulbecco’s PBS，SigmaD8537)。通过进样16mM NaOH(水溶液)的8个脉冲(各～1μL)，首先从传感器表面除去非共价结合的链霉亲和素。然后将磷酸-tau肽溶解于PBS中以得到1μM的最终肽浓度，接着以5μl/min在传感器芯片的流通池(fc)2上进样(35μL)。偶联后，获得130RU的最终固定化水平。为了研究抗体与芯片表面的结合，通过用运行缓冲液的连续2倍稀释液制备数个浓度的抗体。以50μL/min的流速在fc1和2上进行进样120秒。流通池1是未衍生化的并且从fc2扣除fc1的响应以修正仪器噪声和本体折射率变化。每次进样后，直接用运行缓冲液清洗表面100秒。为了从芯片除去任何剩余的结合抗体，通过进样1μL的10mM Glycine-HCl pH 1.7进行表面再生。使用BIAevaluation 3.0，利用数值积分和全局分析的算法进行动力学分析。对不同浓度的抗体进样所获得的传感图并且将基线调至零。对于曲线拟合，同时将所有数据拟合至1∶1均质(Langmuir)模型。
所使用的肽
Figure GDA0001615266380000691
4.2结果
使用SPR实时监测抗Tau抗体与磷酸化Tau肽的结合。抗体结合的缔合相和解离相的分析可以用于确定结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和解离常数KD。
发现所有抗体在46→734nM所分析抗体的范围内(或对于ACI-35-4A6-Ab1，11.5→184nM)在未衍生化的羧甲基葡聚糖表面上与肽T3.30特异性结合。传感图的动力学分析揭示，不同抗体和T3.30之间的结合相互作用的解离常数KD为2至82nM。因此，这表明抗体以很高的亲合力识别磷酸肽T3.30(表3)。
实施例5：结合研究III对人脑样品的ELISA(检测磷酸化Tau的多聚体的ELISA)
5.1方法
5.1.1.人样品：用于此处描述的测定的人脑样品的制备
从迈阿密大学的脑捐赠银行(Brain Endowment Bank)获得10例阿尔茨海默氏病(AD)和10例年龄相仿的对照的短暂死后皮层。AD患者(七位女性，三位男性)的平均死亡年龄为81.1±7.3岁，而对照(无神经学症状；九位女性，一位男性)的平均死亡年龄为87.0±5.8(通过学生t检验，未与AD患者显著不同)。所有样品具有Caucasian来源。针对表4中所示的Braak疾病阶段(Braak和Braak(1991)Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.Acta Neuropathol 82：239-259)标准AD样品。
根据下列方案将10例AD和10例年龄相仿的对照的短暂死后皮层匀浆化。将脑片段称重并在9体积的含有磷酸酶抑制剂(30mM NaF、0.2mM Na3VO4、1nM冈田酸、1mM PMSF、5mMNa4P2O7)和蛋白酶抑制剂(Complete Mini；Roche，Switzerland)的25mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA中匀浆化。使用玻璃罐在冰上进行匀浆化。这构成总匀浆部分(TH)。使用Bradford试剂(Sigma)测量蛋白浓度。
5.1.2.设置1 ELISA：检测来自受AD影响的个体和年龄相仿的对照的人死后皮层脑匀浆中磷酸化Tau的多聚体的存在的设置1ELISA测定
在4℃用5μg/ml在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的抗体涂覆多滴定96孔板过夜。在PBS-Tween中清洗4次后，在37℃用PBS-Tween 10％BSA饱和板1小时。然后将脑匀浆在50μLPBS中以100ng/μL浓度加至孔中，且在37℃孵育2小时。清洗板后，在37℃将与用于涂敷的抗体相同(但生物化)的抗体以5μg/mL的最终浓度孵育1小时。对板清洗且在添加抗生物素蛋白-过氧化物酶(Vectastain ABC试剂盒，Vector Laboratories)及其底物(ABTS，Roche10881420)后在不同时间点对板读数。值被表示为10例AD和10例对照受试者的平均OD±SD。
5.2结果
使用磷酸-和多聚体-特异性设置1ELISA，对抗体ACI-35-2A1-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3测试它们检测来自AD和对照受试者的脑匀浆中磷酸Tau(pTau)多聚体的能力。我们观察到在针对两个抗体的测定中，在AD和年龄相仿的对照(n＝10)之间存在高显著性(p＜0.001)差异(图1)。使用来自AD和年龄相仿的对照脑的人死后皮层匀浆，我们证明ACI-35-2A1-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3抗-pTau抗体检测死后人脑样品中Tau-pS396的多聚体的能力。
实施例6：结合研究IV-对人脑样品的Western印迹。
6.1方法
6.7.7.人样品：与方法5.1.1中所述的相同的用于制备人样品的方法。
6.1.2.Western印迹：检测来自受AD影响的个体和年龄相仿的对照的人死后皮层脑匀浆中磷酸化Tau的存在的Western印迹测定
用于该研究的抗-人Tau抗体为小鼠ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3(所有均针对Tau-pS396)。针对总人Tau的小鼠单克隆TAU-13抗体(Abcam ab24636)和针对Tau-pS396的兔单克隆抗体E178(Abcam ab32057)用作对照。将每个泳道的20μg每种总匀浆加载到10％聚丙烯酰胺Bis-TRIS预制凝胶(Nupage Novex 10％Bis-TRIS MidiGel，Invitrogen)上。如由制造商所推荐的，在NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(InvitrogenNP0001)中解析蛋白质。在冰上，在PVDF膜(Immobilon-FL，Millipore IPFL00010)上在25mMTRIS pH 8.6、190mM羟基苯丙氨酸、20％甲醇中进行蛋白质印迹3小时。将膜在于PBS中1/3稀释的Licor封闭缓冲液(Odyssey)中封闭1小时。用下列浓度的一抗将膜孵育过夜：0.6μg/mL的TAU-13、以1/5000稀释的E178、0.53μg/mL的ACI-35-2A1-Ab1、0.47μg/mL的ACI-35-1D2-Ab1和在Licor缓冲液中1/3稀释且用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS-T)2/3稀释的0.5μg/mL的ACI-35-2G5-Ab3。在PBS-T中清洗4次后，在室温用与LICOR 800染料偶联的山羊抗-小鼠抗体(山羊抗小鼠IRDye 800CW，Odyssay)孵育膜1小时，用PBS-T再清洗4次，且使用LICOR系统扫描图像再现。
6.2结果
使用磷酸特异性Western印迹，对抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3测试它们用于检测来自AD和对照受试者的脑匀浆中的磷酸Tau(pTau)的能力。首先使用市售抗人Tau抗体：抗-总Tau(TAU-13)和抗-pS396Tau(E178)抗体表征所有死后人皮层样品。如图2A中所示，使用TAU-13抗体，我们检测所有样品中在50-70kDa范围内的对应不同Tau同种型的特征性Tau梯。有趣的是，我们也观察到在AD脑匀浆中Tau的迁移模式的相对变化，如对于AD脑中的超磷酸化Tau所期望的。由于确认这种假设，市售抗-pS396Tau抗体非常清楚地辨别对照和AD(图2B)。事实上，抗-pS396Tau抗体揭示，在所有AD脑匀浆中存在对应Tau的(超)-磷酸化同种型的三个主要免疫反应性条带，而在健康对照中具有非常弱的强度、或不存在。此外，AD样品表现出高分子量TAU-13免疫反应性涂片，有可能反映聚集Tau的存在(图2A)。
用ACI-35-2A1-Ab1的Western印迹揭示，对于AD脑匀浆中而不是对照中的磷酸Tau存在期望尺寸的两个免疫反应性蛋白条带(图3A)。通过western印迹使用ACI-35-2A1-Ab1的免疫反应较弱可通过存在～35和～40kDa的两个主要非特异性条带来解释。用ACI-35-1D2-Ab1的Western印迹揭示，对于AD脑匀浆中而不是对照中的磷酸Tau存在期望尺寸的两个免疫反应性蛋白条带(图3B)。通过western印迹使用ACI-35-1D2-Ab1的免疫反应较弱可通过存在～40和～50kDa的非特异性条带、以及80kDa至150kDa的4个非特异性条带来解释。用ACI-2G5-Ab3的Western印迹揭示，在所有AD脑匀浆中存在对应Tau的(超)-磷酸化同种型的三个主要免疫反应性蛋白条带，而在健康对照中不存在，除了一位具有AD家族史的对照受试者(C22)之外(图3C)。该报道显示ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3可辨别AD和年龄相仿的对照之间的人死后皮层中pS396Tau的存在，因此这些单克隆抗体识别AD-相关病理Tau同种型。
实施例7：结合研究V-设置1(对人脑样品的ELISA)
7.1方法
7.7.1.人样品。与方法5.1.1中所述的相同的用于制备人样品的方法，除了最后部分-S1部分制备之外。
7.1.2.S1 Tau蛋白部分：获得可溶性Tau和磷酸-Tau蛋白的，总匀浆部分的亚分级
为了制备用于AlphaLISA测定的可溶性Tau(S1)部分，将半体积的TH部分等份并贮存在-80℃。通过添加Triton X-100以达到0.4％的最终浓度来进一步处理TH部分的剩余部分。将样品充分混合并涡旋数次，随后在4℃以5’000rpm离心5min。上清液构成S1部分。将样品等份并贮存在-80℃。使用Bradford试剂测量蛋白浓度。
7.1.3.AlphaLISA：检测来自受AD影响的个体和年龄相仿的对照的人死后皮层脑匀浆中磷酸化Tau的存在的AlphaLISA测定
根据制造商的用法说明，使用EZ-Link Micro磺基-NHS-LC-生物素化试剂盒(Thermo Scientific)使抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3(所有均针对Tau-pS396)生物素化。相比于抗体25倍摩尔过量的生物素用于标记反应。生物素化后，通过使用Slide-A-Lyzer MINI透析装置，10K MWCO(Thermo Scientific)进行PBS透析来除去过量的游离生物素。生物素化抗体被称为ACI-35-2A1-Ab1-BT、ACI-35-1D2-Ab1-BT和ACI-35-2G5-Ab3-BT。使用下列方案将抗体Tau-13与活化Alpha受体珠(Perkin Elmer)结合：将0.1mg Tau-13抗体溶液(经Protein A柱纯化)与1mg AlphaLISA受体珠团粒混合并用0.13M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)补充以达到200μL的最终反应体积。接下来，加入1.25μL的10％Tween-20和10μL的25mg/mL NaBH3CN溶液并于37℃在轻微旋转(7rpm)下将管孵育48h。结合反应后，通过添加10μL的羧基-甲氧基胺溶液来封闭珠上的活性位点，并且在37℃进一步孵育1h。最终，将珠用200μL的0.1M Tris-HCl pH 8.0清洗两次并在4℃贮存于200μL贮存缓冲液(含有0.05％Proclin-300的PBS)中，这导致最终AlphaLISA受体珠浓度为5mg/ml。
AlphaLISA是基于珠近接化学发光的均质测定。如果在激光激发时Alpha供体和受体珠很靠近，化学反应的级联产生放大的信号。在680nm激发时，供体珠中所含的光敏剂将环境氧转化成更具反应性的单线态氧物种。这些单线态扩散(多达200nm，在半衰期的4微秒内)并在受体珠中产生化学发光反应，导致光发射。测定如下设定：
将S1样品在Alpha测定缓冲液(PerkinElmer AL000C)中预稀释以获得20μg/mL储备浓度。将下列试剂加至384孔白色OptiPlate(PerkinElmer)以达到50μL的最终体积：S1脑匀浆(5μL)、10μL的ACI-35-2A1-Ab1-BT、ACI-35-1D2-Ab1-BT或ACI-35-2G5-Ab3-BT(分别0.2nM、0.5nM或0.5nM的最终抗体浓度)和10μL的Tau13-受体珠结合物(2.5μg/mL的最终珠浓度)。将反应混合物在室温孵育1h，加入25μL链霉亲和素供体珠，并在室温于暗处进一步孵育2h。使用EnSpire Alpha仪器进行读出并使用EnSpire Workstation 3.00版进行分析。使用GraphPad Prism软件进行数据的统计学分析。结果以Alpha单位±SD呈示。
7.2结果
AlphaLISA测定用于测试抗体ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3的检测死后人脑匀浆中Tau-pS396的能力，以及用于辨别来自年龄相仿的对照的AD。所有抗体检测出Tau-pS396(图4A、4B、4C)。所有抗体的AD和对照(n＝10)之间信号检测的差异也具有高度显著性，显示AD受试者的脑中的信号增加；ACI-35-2A1-Ab1(p＜0.0001)、ACI-35-1D2-Ab1(p＜0.0001)和ACI-35-2G5-Ab3(p＝0.002)。总之，AlphaLISA技术用于验证ACI-35-2A1-Ab1、ACI-35-1D2-Ab1和ACI-35-2G5-Ab3检测AD受试者的脑中pS396-Tau的能力，以及区分AD和对照供体。
实施例8：ACI-35-2G5-Ab3抗体的体内效力
8.1方法
8.1.1.研究设置：Tau转基因小鼠中2次施用抗-pTau抗体ACI-35-2G5-Ab3的体内处理效应
通过i.p注射3或10mg/kg的ACI-35-2G5-Ab3、或媒介物对照(PBS)两次，间隔一周，施用6-7月龄的具有C57BL/6xDBA背景的雌性和雄性Tau转基因小鼠(TMHT)。第14天，对动物施以安乐死，收获并处理脑用于免疫组织化学(IHC)。对于海马和杏仁核中的Tau病理的确认，使用AT180(对于Tau-pT231)和HT7(对于总人Tau)抗体标记每个脑的5个切片(每个水平1个)，随后使用Image Pro Plus(v6.2)软件评价免疫反应性区域。测量免疫反应性对象高于尺寸限制(在杏仁核中为30μm2，在海马中为7μm2)并且高于动态强度阈值。自动填写对象的总面积和强度以及各个阈值。如果使用，将动态阈值定义为强度区域(AOI)的平均强度加上因子乘以AOI内像素强度的标准偏差。通过海马和杏仁核的手动描述测量区域。将AT180和HT7IR区域数据标准化为区域大小(海马中)或AOI大小(杏仁核中)。
8.2结果
AT180pTau抗体检测内源性和人pTau(在Thr231和Ser235双重磷酸化)。对于该研究中使用的Tau转基因小鼠，AT180组织学测量结果集中于海马和杏仁核神经元。对于杏仁核和海马中的神经元体细胞标记的AT180平均和标准化总强度，用ACI-35-2G5-Ab3处理的小鼠显著减少(图5A和5B)，显示经处理小鼠中的总神经元体细胞AT180阳性pTau减少。
对于总人(转基因)Tau，使用HT7抗体。HT7识别残基159和163之间的正常人Tau。组织学测量结果集中于海马和杏仁核神经元的免疫反应性体细胞。用ACI-35-2G5-Ab3处理的小鼠具有减少的HT7免疫反应性区域，以及杏仁核中免疫反应性的总HT7强度和平均HT7强度(图6A)。在海马中，观察到相同的平均强度(图6B)。但是，对于免疫反应性区域观察到HT7标记的增加，和以10mg/kg处理的小鼠的海马中的总强度。在海马中观察到的这种增加主要是由于所研究的共8只小鼠中的三只小鼠。
ACI-35-2G5-Ab3处理显著降低所研究的两个区域中、因此在海马和杏仁核神经元中的体细胞的AT180免疫反应性pTau水平。在杏仁核中，对于AT180免疫反应性pTau和HT7免疫反应性总人Tau而言标记的总强度降低。用3mg/kg的剂量的处理也使两个区域中的平均HT7强度显著下降。但是，在10mg/kg时海马中的平均HT7免疫反应性区域和总强度相比于对照处理的小鼠有所增加，表明ACI-35-2G5-Ab3处理导致来自病毒pTau的变化。
实施例9：抗pTau抗体的表位作图
9.1方法
使用不同的磷酸和非磷酸肽文库通过ELISA对抗磷酸Tau小鼠单克隆抗体进行表位作图。表11A中示出了所使用的肽文库T3的氨基酸序列。每个文库由横跨存在于肽疫苗中的磷酸和非磷酸序列的短生物素化肽组成。此外，如表11B和11C中所示，用丙氨酸(Ala)取代结合至抗体的肽序列的每个残基来产生肽文库。每个文库由横跨存在于肽疫苗中的磷酸和非磷酸序列的短生物素化肽组成。肽文库购自ANAWA Trading SA。肽文库肽文库购自ANAWA Trading SA。根据生产商(Mimotopes)的说明书进行表位作图。简言之，用0.1％BSA在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液在4℃封闭抗生蛋白链菌素涂覆的板(NUNC)过夜。用PBS-0.05％吐温20清洗后，在室温下用含0.1％BSA，0.1％叠氮化钠的PBS溶液稀释至10μM最终浓度的来自每个文库的不同的肽涂覆板1小时。清洗后，在室温下将板与用含2％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS溶液稀释至40ng/ml的待测试抗体一起孵育1小时。再次清洗板并与1/6000稀释的AP结合的抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Suffolk，England)在室温下孵育1小时。最终清洗后，将板与对硝基苯磷酸二钠六水合物(pNPP；Sigma-Aldrich，Buchs，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，并在孵育2小时后使用ELISA酶标仪在405nm读数。如果光密度(O.D.)为背景O.D.的至少2倍时，则认为结合是阳性的。
9.2结果
通过表位作图实验，可以鉴别包括本文所公开的抗体特异性结合的所需的磷酸化氨基酸残基(参见表5)在内的表位。
·Tau aa 393-401，其需要pS396(ACI-35-2A1-Ab1；ACI-35-2A1-Ab2)
·Tau aa 396-401，其需要pS396(ACI-35-4A6-Ab1)
·Tau aa 394-400，其需要pS396(ACI-35-1D2-Ab1)
·Tau aa 402-406，其需要pS404(ACI-35-2G5-Ab1)
·Tau aa 393-400，其需要p396(ACI-35-2G5-Ab2；ACI-35-2G5-Ab3)
实施例10：使用GSK3β激酶和SDS-PAGE/Western-印迹分析在丝氨酸396(pS396)的Tau的磷酸化
10.1方法
在4、30或37℃，将最终浓度为16μM(20μg Tau/25μL反应)的人全长Tau的最长同种型(TAU441；SignalChem)用0.018U GSK3β/pmol Tau在含有HEPES pH 7.64(40mM)、EGTA(5mM)、MgCl2(3mM)和ATP(2mM)的磷酸化缓冲液中孵育1、6或20h。制造商(New EnglandBioLabs)将一单位的GSK3β定义为在30℃于1分钟内将1pmol磷酸从ATP转移至CREB磷酸肽(KRREILSRRPpSYR)的酶的量。利用在直接ELISA和Western印迹(WB)上运行的针对在丝氨酸202、396、404、409、苏氨酸181、205和231磷酸化的Tau以及总Tau的抗体探测用GSK3β磷酸化的Tau(pTau-GSK3β)，以优化且验证激酶活性和特异性(未示出)。此外，使用抗-GSK3α/β抗体(BioSource Invitrogen)探测印迹中GSK3β的存在。对于所有WB，通过加入等体积的样品缓冲液A(125mM Tris-HCl pH 6.8、4％[w/v]十二烷基硫酸钠[SDS]、20％甘油、0.01％溴酚蓝、5％β-巯基乙醇)稀释pTau-GSK3β，并将样品加热至95℃10分钟。将30μg样品加载到4-12％的Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上并在MOPS SDS缓冲液(Invitrogen)中运行。将蛋白质转移到转移缓冲液(25mM Tris pH 8.6、190mM甘氨酸、20％的甲醇)中的0.45μm PVDF膜上。为了验证蛋白质的转移，用丽春红(Ponceau S)对膜染色5min。接着清洗并在封闭缓冲液(5％BSA在TBS[50mM Tris-HCl，pH 7.6，150mM NaCl]中的溶液)中封闭1小时。在4℃用在封闭缓冲液和0.1％吐温中的一抗将膜印迹过夜。以0.5μg/mL抗体稀释液用ACI-35-2G5-Ab3进行印迹。
10.2结果
用GSK3β处理的Tau导致在Tau丝氨酸396(Tau-pS396)的磷酸化的存在性较高，如使用对不同Tau磷酸-丝氨酸和-苏氨酸残基具有特异性的抗体验证(未示出)。图7显示使用不同GSK3β条件产生的Tau-pS396的SDS-PAGE，以及使用ACI-35-2G5-Ab3抗体印迹的膜。Tau-pS396特异性ACI-35-2G5-Ab3抗体对于Tau-pS396显示良好的信号，也观察到条带，表明其结合至Tau-pS396二聚体(图7，泳道11和13)。在不存在GSK3β处理下没有观察到条带(泳道6-8和14-15)。
实施例11：人脑脊液(CSF)样品中Tau(pSer396)的磷酸化的检测
11.1方法
11.1.1人样品-死后脑样品
从迈阿密大学的脑捐赠银行获得1例阿尔茨海默氏病(AD)供体AD19的短暂死后皮层。我们友好地致谢迈阿密大学的脑捐赠银行为本研究提供样品。关于供体的人口统计信息示于下表12中，其中也指示Braak疾病阶段(Braak和Braak(1991)Neuropathologicalstageing ofAlzheimer-related changes.Acta Neuropathol 82：239-259)。
样品ID 性别 死亡年龄 诊断年龄 疾病持续时间 疾病阶段
AD19 F 81 77 4 Braak V
表12.用于该研究的脑样品AD19的描述
11.1.2.由死后脑制备匀浆部分S1
根据下列方案将AD19供体的短暂死后皮层匀浆化。将脑片段称重并在9体积的含有磷酸酶抑制剂(30mM NaF、0.2mM Na3VO4、1nM冈田酸、1mM PMSF、5mM Na4P2O7)和蛋白酶抑制剂(Complete Mini；Roche 04693124001)的25mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1mMEDTA、1mM EGTA中匀浆化。使用玻璃罐在冰上进行匀浆化。这构成总匀浆部分(TH)。将半体积的TH部分等份并贮存在-80℃。通过添加Triton x-100以达到0.4％的最终浓度来进一步处理TH部分的剩余部分。将样品充分混合并涡旋数次，随后在4℃以5’000rpm离心5min。上清液构成S1部分。将样品等份并贮存在-80℃。使用Bradford试剂测量蛋白浓度(SigmaB6916-500)。
11.1.3人CSF样品
通过柏林慈善医学院(Charité School of Medicine Berlin)提供来自临床上确认的轻度至中度阿尔茨海默氏病(AD)患者和健康志愿者对照供体(Ctrl)的脑脊液(CSF)样品。我们友好地致谢柏林慈善医学院为本研究提供样品。将样品等份，贮存在-80℃并在无进一步处理下使用。关于CSF样品供体的人口统计信息和临床信息示于下表13中。
Figure GDA0001615266380000781
表13.关于CSF样品供体的人口统计信息和临床信息
11.1.4CSF Tau的免疫富集
11.1.4.1抗体偶联
对于CSF Tau的免疫富集，使用市售人Tau抗体(克隆HT7，Thermo Scientmc MN1000)。为了使HT7与Protein G Dynabeads(Life Technologies 10004D)偶联，对于每个样品通过涡旋使1.5mg(50μL)Protein G Dynabeads重悬浮并将其转移至1.7mL MaximumRecovery管(Axygen MCT-175-L-C)。将管放置在磁性支撑物(DynaMag，Life Technologies123.21D)上以便将珠聚集在管侧并除去缓冲液。使用Hula Mixer(Life Technologies)以10/20rpm，25°/10倾斜度，5°/2振动10min将1μg在200μLPBS中的HT7与Protein GDynabeads珠结合，之后将管放置在磁体上，去除缓冲液，通过平缓移液用200μLPBS/0.02％Tween 20将管清洗1次，用200μL结合缓冲液(20mM磷酸Na，150mM NaCl，新鲜制备)清洗2次。使用磁体总能去除清洗缓冲液。对于HT7与Protein G Dynabeads交联，将HT7-珠重悬浮于250μL的5mM溶解于结合缓冲液中的BS3溶液(Sigma-Aldrich S5799)并在室温(RT)在旋转下(如上相同的设置)孵育30min，通过添加12.5μL淬灭缓冲液(1M Tris-HCl pH 7.5)15min来终止反应，随后用200μLPBS/0.02％Tween 20清洗3次。
11.4.2CSF Tau免疫富集
在未稀释下使用CSF并将每个供体的1mL CSF转移至含有HT7交联珠的管，于4℃在连续旋转(10rpm)下孵育1小时。去除磁体上未结合的材料后，将珠用200μLPBS/0.02％Tween 20清洗并在70℃将Tau在含20μL1％十二烷基硫酸钠(SDS)的PBS中洗脱10min。为了避免珠沉降，将管立刻混合(每分钟在加热卧式搅拌器中以300rpm进行5秒)。孵育后，通过将管放置在磁体上来收集洗脱的样品。
作为阳性对照，也从人脑匀浆富集Tau。在PBS中制备来自AD19的人脑S1部分的系列稀释液(0.5μg/mL、0.17μg/mL、0.056μg/mL、019μg/mL、0.006μg/mL、0.002μg/mL、0.0007μg/mL)。然后如上所述处理每个样品(1mL)并在25μL 1％SDS中洗脱。
11.1.5 AlphaLISA.
11.1.5.1 AlphaLISA测定描述
AlphaLISA是利用基于珠的Alpha技术的均质测定。基于灵敏度和最小数量的步骤作为技术平台选择AlphaLISA。简言之，该测定是基于珠邻接。在680nm激发时，含有供体珠的光敏剂将环境氧转化成单线态氧物种。这些扩散(多达200nm，在半衰期的4微秒内)并在受体珠中产生化学发光反应，导致光发射。
我们实验中所用的测定设置如下(也参见图8)：
·与Alpha受体珠偶联的Pan-Tau抗体Tau-13(Abcam ab24636)结合存在于样品中的人Tau并形成“Tau蛋白-Tau-13抗体-受体珠”复合体
·检测抗体ACI-35-2G5-Ab3-BT结合至人Tau的pS396并允许使链霉亲和素涂敷的(SAv)Alpha供体珠与复合体结合。
将所有试剂带入反应后，使用EnSpire Alpha 2390Reader对化学发光信号读数。
11.1.5.2ACI-35-2G5-Ab3抗体的生物素化
为了用于AlphaLISA测定，根据制造商用法说明，使用EZ-Link Micro磺基-NHS-LC-生物素化试剂盒(Thermo Scientific 21935)使抗体ACI-35-2G5-Ab3生物素化。相比于抗体25倍摩尔过量的生物素用于标记反应中。生物素化后，使用50’000MWCO Spin-X UF500浓缩器(Coming 431480)通过在PBS中清洗抗体四次来去除过量的游离生物素。生物素化ACI-35-2G5-Ab3抗体以ACI-35-2G5-Ab3-BT表示。
11.1.5.3 Tau-13抗体与AlphaLISA受体珠的偶联
为了用于AlphaLISA测定，将抗体Tau-13与活化Alpha受体珠(Perkin Elmer6772001)结合。使用下列结合方案：将0.1mg Tau-13抗体溶液(在Protein A柱上纯化)与1mg AlphaLISA受体珠团粒混合并用0.13M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)补充以达到200μL的最终反应体积。接下来，加入1.25μL的10％Tween-20和10μL的25mg/mL NaBH3CN溶液并于37℃在轻微旋转(7rpm)下将管孵育48h。结合反应后，通过添加10μL的羧基-甲氧基胺溶液来封闭珠上的活性位点，并且在37℃进一步孵育1h。最终，将珠用200μL的0.1M Tris-HCl pH 8.0清洗两次并在4℃贮存于200μL贮存缓冲液(具有0.05％Proclin-300的PBS)中，这导致最终AlphaLISA受体珠浓度为5mg/ml。
11.1.5.4使用脑pS396-Tau确定检测限
免疫富集的Tau脑样品、S1脑部分样品和缓冲液空白用于该实验。使用384孔白色OptiPlate(PerkinElmer 6007291)在50μL最终体积中分析每个样品。用Alpha测定缓冲液(PerkinElmer AL000C)进行所有试剂的稀释。
·5μL样品(1/10的最终体积，因此测定中的最终蛋白浓度对应1/10的样品浓度)。
·加入10μL0.5％SDS(对于S1脑部分样品)或10μL普通缓冲液(plain buffer)(对于免疫富集的Tau脑样品)。
·15μLACI-35-2G5-Ab3-BT抗体(最终浓度：5nM)与Tau13-受体珠结合物(最终珠浓度：2.5μg/mL)混合
·在室温孵育1小时
·20μL链霉亲和素供体珠(最终珠浓度：25μg/mL)
·在室温孵育30min(避光)
·使用EnSpire Alpha仪器读出并使用EnSpire Workstation 3.00版分析
11.1.5.5 CSF中免疫富集的pS396-Tau的确定
使用384孔白色OptiPlate(PerkinElmer 6007291)在50μL最终体积中分析每个样品。用Alpha测定缓冲液(PerkinElmer AL000C)进行所有试剂的稀释。
·来自每个供体的5μL免疫沉淀的洗脱液
·20μLACI-35-2G5-Ab3-BT抗体(最终浓度：5nM)与Tau13-受体珠结合物(最终珠浓度：2.5μg/mL)混合
·在RT孵育1h
·25μL链霉亲和素供体珠(最终珠浓度：25μg/mL)
·在RT孵育30min(避光)
·使用EnSpire Alpha仪器读出并使用EnSpire Workstation 3.00版分析
11.1.6统计分析
使用GraphPad Prism软件进行数据的统计分析。
11.2结果
预备实验表明，存在于人CSF中的pS396的量太低未被检测出。为此，开发与高灵敏度检测偶联的免疫免疫富集方案。首先使用人AD死后脑材料验证免疫富集方案。未经处理的脑匀浆样品与Tau免疫富集的样品的并行比较揭示，在相应的浓度时，Tau13/ACI-35-2G5-Ab3AlphaLISA测定的检测限达到0.5μg/mL(对于未经处理的样品)，而为0.002-0.006μg/mL(对于免疫富集的样品)，表明100倍富集(图9)。
接下来，对活供体CSF样品应用免疫富集方案(对于轻度至中度AD患者，n＝17；对于年龄相仿的健康志愿者，n＝16)。获得的数据(图10)表明：a)在免疫富集的方案之后Tau13/ACI-35-2G5-Ab3AlphaLISA检测出所有人CSF样品中的pS396-Tau；和b)更重要的是，观察到当与对照相比，AD CSF中pS396-Tau的量显著增加(p＝0.0003，Mann-Whitney检验)。
总之，开发免疫富集/免疫检测方法，允许检测人CSF中的pS396-Tau。轻度至中度AD的CSF中pS396-Tau的增加表明，该方法可成功地用于临床生物标记研究以评估疾病进展、患者分类和治疗效力。ACI-35-2G5-Ab3抗体检测出所有人CSF样品中的pS396-Tau，且更重要的是，当与对照相比，该抗体能够辨别AD CSF。
Figure GDA0001615266380000821
表2.针对与靶标的结合筛选杂交瘤
Figure GDA0001615266380000831
可仅在相同测定(ELISA、或TAUPIR或WB)中，在相同列内比较结合强度。
-结合得不好或不存在；+结合得好；++结合得非常好；+++结合得极好(优于‘结合得非常好’)
表3.抗-tau抗体的结合亲和力
Figure GDA0001615266380000832
a通过HPLC进行分析，磷酸-肽纯度为64％。
b通过HPLC进行分析，磷酸-肽纯度为87％。
表4.用于该研究的AD受试者的描述
Figure GDA0001615266380000833
Figure GDA0001615266380000841
表5.抗体结合所需的Tau氨基酸和磷酸残基。
杂交瘤 抗体 表位<sup>*</sup>
A4-2A1-18 ACI-35-2A1-Ab1 Tau aa 393-401，其需要pS396
A4-2A1-40 ACI-35-2A1-Ab2 Tau aa 393-401，其需要pS396
A4-4A6-18 ACI-35-4A6-Ab1 Tau aa 396-401，其需要pS396
A6-1D2-12 ACI-35-1D2-Ab1 Tau aa 394-400，其需要pS396
A6-2G5-08 ACI-35-2G5-Ab1 Tau aa 402-406，其需要pS404
A6-2G5-30 ACI-35-2G5-Ab2 Tau aa 393-400，其需要pS396
A6-2G5-41 ACI-35-2G5-Ab3 Tau aa 393-400，其需要pS396
*基于人Tau的最长同种型(Tau441)
Figure GDA0001615266380000851
Figure GDA0001615266380000861
Figure GDA0001615266380000871
Figure GDA0001615266380000881
Figure GDA0001615266380000891
Figure GDA0001615266380000901
Figure GDA0001615266380000911
Figure GDA0001615266380000921
Figure GDA0001615266380000931
Figure GDA0001615266380000941
表9.也称为Tau40的人Tau的最长同种型(441aa)
Figure GDA0001615266380000951
保藏：
表10.依据布达佩斯条约的条款，将下列杂交瘤细胞系以AC免疫有限公司(ACImmune SA)，PSE-EPFL Building B，1015Lausanne/瑞士和勒芬天主教大学(KatholiekeUniversiteit Leuven)，Waaistraat 6-Box 5105，B-3000 Leuven/Belgium的名义保藏在位于布伦瑞克Inhoffenstrasse 7B，38124 Braunschweig的“德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)”：
保藏物名称 保藏号 保藏日期
A4-4A6-48 DSMACC3136 2011年8月30日
A6-2G5-30 DSMACC3137 2011年8月30日
A6-2G5-41 DSMACC3138 2011年8月30日
A4-2A1-18 DSMACC3139 2011年8月30日
A4-2A1-40 DSMACC3140 2011年8月30日
A6-1D2-12 DSMACC3141 2011年9月6日
Figure GDA0001615266380000961
表11B.用于pS396特异性抗体的表位作图的丙氨酸(Ala)置换肽文库
Figure GDA0001615266380000971
表11C.用于pS404特异性抗体的表位作图的丙氨酸(Ala)置换肽文库
Figure GDA0001615266380000972
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序列表
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勒芬天主教大学
<120> 药物组合物
<130> 103112PC
<140>
<141> 2012-10-05
<150> EP 12 16 3319.2
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<151> 2011-10-07
<160> 221
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
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<220>
<221> 来源
<222> 1..115
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<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Tyr Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 115
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<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 115
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<220>
<221> 来源
<222> 1..115
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/生物体="小家鼠"
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Tyr Tyr Ala Val Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..120
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gln Leu Arg Leu Arg Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..119
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 5
Glu Val Lys Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Tyr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Thr Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Lys Ala Leu Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..113
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<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Glu
85 90 95
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 7
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
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/生物体="小家鼠"
<400> 7
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser
20 25 30
His Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Ala His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<220>
<221> 来源
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/生物体="小家鼠"
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
His Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Ala His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 9
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
His Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
Ala His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..107
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..113
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 10
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..10
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 12
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
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/生物体="小家鼠"
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Asp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 小家鼠
<220>
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met His
1 5 10
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
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Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 小家鼠
<220>
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<223> /分子类型="蛋白质"
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<400> 17
Arg Gly Gln Leu Arg Leu Arg Leu Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
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<213> 小家鼠
<220>
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<223> /分子类型="蛋白质"
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Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
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<223> /分子类型="蛋白质"
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<400> 19
Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Thr Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..8
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 20
Ala Leu Gly Arg Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 21
Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 22
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 23
Gln Glu His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 24
Arg Ser Ser Gln Arg Leu Val His Ser His Gly Lys Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 25
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 26
Ser Gln Thr Ala His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 27
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser His Gly Lys Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 28
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser His Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..11
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 29
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 30
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 31
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 32
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 33
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 34
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 35
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 35
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata tacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta accgtggtgg aactacttac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagttactac 300
gccgtgggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 36
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 36
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctgggacttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata tacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta accgtggtgg aactacttac 180
aaccagaagt ttaagggcaa ggccacgttg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagttactac 300
gccgtgggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 37
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 37
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta accgtggtgg aactacttac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacgttg actgtagaca cgtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagttactac 300
gccgtgggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 38
<211> 360
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..360
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 38
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcac cctctggatt cactttcagt gactatggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg gactggagtg ggttgcatac attagtagtg gcagtagtac catctactat 180
ggagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagaagggga 300
cagctcaggc tacgcctgtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 39
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..357
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 39
gaggtgaagc tgatggaatc tggaggaggc ttggtacacc ctggggcttc tctgagactc 60
tactgtgcag cttctggatt cacctttact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120
ccagggaagg cacctgagtg gttggctttg attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180
gagtatactg catctgttaa gggtcggttc accatctcca gagataattc ccaaaacatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagggct gaggacagtg ccacttatta ctgtgtaaaa 300
gctctgggac gttacttcga tgtctggggc acagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 40
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..339
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 40
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtgttttt aatagtggca atcaaaagaa ctctttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cagtcttacc 240
atcagcagtg tgcaggctga ggacctggca gattacttct gtcaggaaca ttataccact 300
cctcccacgt tcggtactgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 41
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 41
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaggcttgta cacagtcatg gaaaaaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccggttt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaactgc acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 42
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 42
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtcatg gaaaaaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccggttt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaactgc acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 43
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttcta cacagtcatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccggttt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactgc acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..321
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 44
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 45
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..339
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 45
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 46
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 46
gggaattcat graatgsasc tgggtywtyc tctt 34
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变异
<222> 30..30
<223> /替换="n=i"
<400> 47
cccaagcttc cagggrccar kggataracn grtgg 35
<210> 48
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..32
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 48
gggaattcat gragwcacak wcycaggtct tt 32
<210> 49
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 49
actagtcgac atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 41
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..39
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 50
actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 39
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..30
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 51
cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 52
actagtcgac atgggatgga gctrtatcat sytctt 36
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 53
gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..39
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 54
actagtcgac atggactcca ggctcaattt agttttcct 39
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 55
actagtcgac atgaagwtgt ggbtraactg grt 33
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..39
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> misc_feature
<222> 27..27
<223> /注释="n=i"
<400> 56
actagtcgac atggagwcag acacacnsct gytatgggt 39
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..37
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 57
actagtcgac atggtyctya tvttrctgct gctatgg 37
<210> 58
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..30
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-37"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 18..18
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 26..26
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 58
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
20 25 30
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-33"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 14..14
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 59
Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu
1 5 10 15
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-39"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 7..7
<223> 磷酸化苏氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 9..9
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 60
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
1 5 10 15
<210> 61
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-39"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 7..7
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 10..10
<223> 磷酸化苏氨酸
<400> 61
Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg
1 5 10 15
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-35"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 4..4
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 12..12
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 62
Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
1 5 10 15
<210> 63
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..18
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-36"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 4..4
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 9..9
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 63
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ile Asp
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-34"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 3..3
<223> 磷酸化丝氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 6..6
<223> 磷酸化苏氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 13..13
<223> 磷酸化苏氨酸
<220>
<221> 变体
<222> 15..15
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 64
Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Pro
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..12
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-42"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 3..3
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 65
His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..10
<223> /分子类型="蛋白质"
/注释="人工序列的描述: ACI-43"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变体
<222> 6..6
<223> 磷酸化丝氨酸
<400> 66
Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
1 5 10
<210> 67
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<222> 1..441
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="智人"
<400> 67
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..117
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Asp Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 69
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..10
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 70
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 71
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Asp Arg Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..8
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 72
Asp Asp Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 73
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 74
Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 75
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..119
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 76
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Ala Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Cys Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Leu Arg Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 77
Asn Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..12
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 78
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser
1 5 10
<210> 79
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 79
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Ala Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 80
Leu Leu Arg Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 81
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 82
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..8
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 83
Leu Gln Tyr Leu Ser Ser Leu Thr
1 5
<210> 84
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..351
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 84
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttctgaagc ctggggcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atagtgatcg tactaagtac 180
aatgagaagt tcaagcgcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagggatgat 300
tacgcctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 85
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 85
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaactttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 86
<211> 357
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..357
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 86
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120
cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180
tataacgcat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240
ttcctcaaga tcacctgtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcggtta 300
ctgcgtcctt atgctttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 87
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 87
aacattttga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60
atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 240
atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcttcaata cctctcctcg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 88
<211> 115
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..115
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 88
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Glu Gly Arg Phe Ala Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..10
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 89
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 90
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..6
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 91
Glu Gly Arg Phe Ala Tyr
1 5
<210> 92
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 位置
<222> 3..3
<223> Xaa是Met或Val
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 92
Asp Ile Xaa Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Lys Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 93
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 94
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 95
Met Gln His Leu Lys Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 96
<211> 115
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..115
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 96
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Trp Asp Val Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 97
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 97
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..10
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 98
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn
1 5 10
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 99
Arg Ile Tyr Pro Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 100
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..6
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 100
Phe Trp Asp Val Thr Tyr
1 5
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..16
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 101
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..7
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 102
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 103
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 104
<211> 115
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..115
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 104
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr His Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Glu Gly Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..107
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/生物体="小家鼠"
<400> 105
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..11
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 106
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 107
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<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
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<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 107
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..9
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 108
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 109
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
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/生物体="小家鼠"
<400> 109
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
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catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactagctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtgt aagagagggg 300
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<210> 110
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
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/生物体="小家鼠"
<400> 110
gatattrtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
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ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct aaaatctccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 111
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 111
caggtccagc tgaagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaaactg 60
tcctgcaagg cttctggcta cactttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattgcaagg atttatcctg gaagaggtaa tatttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaaa aatcctccag cactgcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagattctgg 300
gacgtgactt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345
<210> 112
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 112
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
ttcctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 113
<211> 345
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..345
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 113
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgtaagg cttctggatt cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactagctac 180
caccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgt aagagaggga 300
agatttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..321
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 114
gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..17
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
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Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr His Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
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100 105 110
<210> 117
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 117
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
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agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct aaaatctccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 118
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..112
<223> /分子类型="蛋白质"
/生物体="小家鼠"
<400> 118
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Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Lys Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 119
<211> 336
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> 来源
<222> 1..336
<223> /分子类型="DNA"
/生物体="小家鼠"
<400> 119
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
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tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 120
<211> 34
<212> DNA
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 120
gggaattcat ggaatgcagc tgggtttttc tctt 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 121
gggaattcat ggaatggagc tgggtctttc tctt 34
<210> 122
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 122
gggaattcat ggaatgcagc tgggtcattc tctt 34
<210> 123
<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 123
gggaattcat ggaatggagc tgggtttttc tctt 34
<210> 124
<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 124
gggaattcat ggaatggagc tgggttattc tctt 34
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 125
gggaattcat ggaatggagc tgggttattc tctt 34
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 126
gggaattcat ggaatgcagc tgggtcttcc tctt 34
<210> 127
<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
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<400> 127
gggaattcat ggaatggagc tgggttttcc tcttc 35
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 128
cccaagcttc cagggaccaa tggataacgg gtgg 34
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 129
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<211> 34
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 130
cccaagcttc cagggaccaa tggataaacg gtgg 34
<210> 131
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 131
cccaagcttc cagggaccaa tggataaacg gatgg 35
<210> 132
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 132
cccaagcttc cagggaccag tggatagacg ggtgg 35
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 133
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<210> 134
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 134
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<210> 135
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 135
cccaagcttc caggggccaa tggataaacg atgg 34
<210> 136
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 136
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 137
gggaattcat ggaatgcacc tgggttttcc tctt 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 138
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 139
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 140
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 141
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 142
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 143
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 144
cccaagcttc cagggaccaa gggataaacg gatgg 35
<210> 145
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 145
cccaagcttc cagggaccag gggataaacg gatgg 35
<210> 146
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 146
cccaagcttc caggggccag ggataaacgg gtgg 34
<210> 147
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
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<400> 147
cccaagcttc caggggccaa tggataaacc ggtgg 35
<210> 148
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 148
cccaagcttc cagggaccag tggataaacg gtgg 34
<210> 149
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 149
actagtcgac atggtgtcca cagctcagtt ccttg 35
<210> 150
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
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<400> 150
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 151
gggaattcat ggaatgcagc tgggttattc tctt 34
<210> 152
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 152
gggaatttat ggaatggagc tgggtcttcc tctt 34
<210> 153
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 153
gggaattcat ggaatgcagc tgggtcatcc tctt 34
<210> 154
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 154
gggaattcat ggaatgcagc tgggttttcc tctt 34
<210> 155
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 155
gggaattcat ggaatgcagc tgggtctttc tctt 34
<210> 156
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 156
actagtcgac atgggatgga gctatatcat cctctt 36
<210> 157
<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 157
actagtcgac atgggatgga gcttatcatc ttctt 35
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<211> 33
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 158
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<211> 35
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 159
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<210> 160
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
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cccaagcttc caggggccaa gggatagacg gatgg 35
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<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 161
cccaagcttc cagggaccag gggatagacg ggtgg 35
<210> 162
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 162
cccaagcttc cagggaccag gggatagacg gatgg 35
<210> 163
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 163
cccaagcttc caggggccag tggataaacg gatgg 35
<210> 164
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 164
cccaagcttc caggggccaa tggataacga tgg 33
<210> 165
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 165
cccaagcttc caggggccag tggataaacg atgg 34
<210> 166
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 166
cccaagcttc cagggaccag tggataaacg atgg 34
<210> 167
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 167
cccaagcttc cagggaccaa tggataacga tgg 33
<210> 168
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 168
cccaagcttc cagggaccat ggataaacgg gtgg 34
<210> 169
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 169
actagtcgac atgggcatca agatgaagtc acatactctg g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..40
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 170
actagtcgac atgggcatca agatgagtca catactctgg 40
<210> 171
<211> 38
<212> DNA
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<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 171
actagtcgac tgggcatcag atgagtcaca tactctgg 38
<210> 172
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 172
actagtcgac atgggcatca agatgaagtc acagacccag g 41
<210> 173
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 173
actagtcgac atgggcttca agatgaagtc acattctctg g 41
<210> 174
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 174
actagtcgac atgggcttca agatgaagtc acatattcag g 41
<210> 175
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 175
actagtcgac atggatggag cttatcatcc tctt 34
<210> 176
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 176
cccaagcttc cagggaccaa gggataaacg gtgg 34
<210> 177
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 177
cccaagcttc caggggccag tggataaacg ggtgg 35
<210> 178
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 178
actagtcgac atgaggtact cggctcagtt cctggg 36
<210> 179
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 179
actagtcgac atgaggtccc cggctcagtt cctggg 36
<210> 180
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 180
actagtcgac atgaggacgt cgattcagtt cttggg 36
<210> 181
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 181
gggaattcat ggaatggacc tgggtcatcc tctt 34
<210> 182
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 182
gggaattcat ggaatgcagc tgggttatcc tctt 34
<210> 183
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..33
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 183
gggaattcat gaatggatct gggttattct ctt 33
<210> 184
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 184
cccaagcttc cagggaccag gggataaacg ggtgg 35
<210> 185
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..31
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 185
cccaagcttc cagggaccaa gggacgggtg g 31
<210> 186
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 186
cccaagcttc cagggaccaa tggataaaca gatgg 35
<210> 187
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 187
cccaagcttc cagggaccaa gggataaacg ggtgg 35
<210> 188
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..32
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 188
gggaattcat ggagacacat tcccaggtct tt 32
<210> 189
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..32
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 189
gggaattcat ggagtcacag tctcaggtct tt 32
<210> 190
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 190
actagtcgac atgggcttca agatggagtc acattttcag g 41
<210> 191
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 191
actagtcgac atgggcatca agatgaagtc acatattcag g 41
<210> 192
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..41
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 192
actagtcgac atgggcttca agatgaagtc acattctcag g 41
<210> 193
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 193
actagtcgac atgggatgga gcttatcatg ttctt 35
<210> 194
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 194
actagtcgac atgggatgga gcttatcatg ctctt 35
<210> 195
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 195
gggaattcat ggaatggacc tgggttttcc tctt 34
<210> 196
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 196
gggaattcat ggaatggacc tgggtctttc tctt 34
<210> 197
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 197
gggaattcat gaaatggagc tgggttattc tctt 34
<210> 198
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 198
cccaagcttc caggggccaa tggatagacg atgg 34
<210> 199
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..35
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 199
cccaagcttc cagggaccaa gggatagacg gatgg 35
<210> 200
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..34
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 200
cccaagcttc cagggaccaa gggatagacg atgg 34
<210> 201
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 201
actagtcgac atgatgtacc cggctcagtt tctggg 36
<210> 202
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..36
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 202
actagtcgac atgaggactt cgattcagtt cttggg 36
<210> 203
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..39
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 203
actagtctac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 39
<210> 204
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..39
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 204
actagtcgac atgaagttgt ctgttaggct gttggtgct 39
<210> 205
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..26
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 205
atgggatgga gctrtatcat sytctt 26
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..23
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 206
atgaagwtgt ggbtraactg grt 23
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..25
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变异
<222> 15
<223> /替换="n=i"
<400> 207
atggratgga sckknrtctt tmtct 25
<210> 208
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..26
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<220>
<221> 变异
<222> 21
<223> /替换="n=i"
<400> 208
ccagggrcca rkggatarac ngrtgg 26
<210> 209
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..25
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 209
atggagacag acacactcct gctat 25
<210> 210
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..29
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 210
atggagwcag acacactsct gytatgggt 29
<210> 211
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<222> 1..29
<223> /分子类型="DNA"
/注释="人工序列的描述：引物"
/生物体="人工序列"
<400> 211
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29
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atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29
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atggtyctya tvtccttgct gttctgg 27
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<212> DNA
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atggtyctya tvttrctgct gctatgg 27
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actggatggt gggaagatgg a 21
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atgaaatgca gctggrtyat sttctt 26
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atggrcagrc ttacwtyytc attcct 26
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atgatggtgt taagtcttct gtacct 26
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atgragwcac akwcycaggt cttt 24
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atgaggrccc ctgctcagwt tyttggnwtc tt 32
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<400> 221
atgggcwtca agatgragtc acakwyycwg g 31

Claims (53)

1.一种抗体或其片段，其识别并特异性结合至哺乳动物Tau蛋白或其片段上的磷酸表位，其中所述抗体或其片段对可溶性、寡聚和不溶性磷酸化Tau蛋白具有解离常数在2 nM至80 nM的范围中的结合亲合力，其中所述片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双链抗体(diabody)、或单链抗体分子，其中所述抗体或其片段包含轻链可变区，其包含：由SEQ IDNO: 93中所示的氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO: 94中所示的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO: 95中所示的氨基酸序列组成的CDR3；和重链可变区，其包含：由SEQID NO: 12中所示的氨基酸序列组成的CDR1、由SEQ ID NO: 90中所示的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO: 91中所示的氨基酸序列组成的CDR3。
2.如权利要求1中所述的抗体或其片段，其包含由SEQ ID NO: 116、92或118中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和/或由SEQ ID NO: 88中所示的氨基酸序列组成的重链可变区。
3.如权利要求1中所述的抗体或其片段，其是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、或人源化抗体或其片段。
4.如权利要求2中所述的抗体或其片段，其是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、或人源化抗体或其片段。
5.如权利要求1中所述的抗体或其片段，其具有IgG2b、IgG2a或IgG3同种型。
6.如权利要求2中所述的抗体或其片段，其具有IgG2b、IgG2a或IgG3同种型。
7.如权利要求3中所述的抗体或其片段，其具有IgG2b、IgG2a或IgG3同种型。
8.如权利要求4中所述的抗体或其片段，其具有IgG2b、IgG2a或IgG3同种型。
9.如权利要求1中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
10.如权利要求2中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
11.如权利要求3中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
12.如权利要求4中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
13.如权利要求5中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
14.如权利要求6中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
15.如权利要求7中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
16.如权利要求8中所述的抗体或其片段，其中所述哺乳动物Tau蛋白是人Tau蛋白。
17.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段结合至病理蛋白Tau构象体，但是不结合至相应的非磷酸化表位和/或非相关表位。
18.一种多核苷酸，其编码如上述权利要求中任一项所述的抗体或其片段。
19.如权利要求18所述的多核苷酸，其以SEQ ID NO: 109编码重链可变区，和/或，以SEQ ID NO: 110、117或119编码轻链可变区。
20.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段或其组合，以及药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其包含至少两种抗体或其片段，其识别并结合至所述哺乳动物Tau蛋白上的两种不同磷酸表位。
22.如权利要求20或21所述的药物组合物，其进一步包含识别并结合至促淀粉样变蛋白或肽的另外的抗体或其片段。
23.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段在制备供一种用于在哺乳动物中治疗、减轻或防止遭受神经退行性疾病或病症的方法使用的药物中的用途，其中所述神经退行性疾病或病症是Tau病。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述Tau病选自阿尔茨海默氏病、克-雅二氏病、拳击员痴呆、唐氏综合征、GSS病、包涵体肌炎和朊蛋白脑淀粉状蛋白血管病、创伤性脑损伤、关岛型肌萎缩性侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、具有神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、钙化性弥散神经原纤维缠结、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、额颞叶痴呆、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩症、C型尼曼-皮克病、苍白球脑桥黑质变性、皮克病、进行性皮质下胶质增生症、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结型痴呆、脑炎后帕金森氏综合征、肌强直性营养不良。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述Tau病是阿尔茨海默氏病或额颞叶痴呆。
26.根据权利要求23所述的用途，其中所述神经退行性疾病或病症显示tau和淀粉状蛋白病理共存。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗或减轻患有神经退行性疾病或病症的哺乳动物中的认知缺陷。
28.根据权利要求27所述的用途，其中哺乳动物中的认知缺陷的治疗或减轻导致认知缺陷发展的停止。
29.根据权利要求27所述的用途，其中哺乳动物中的认知缺陷的治疗或减轻导致所治疗的哺乳动物中认知记忆能力的保持的提高。
30.如权利要求23-26、28和29中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
31.如权利要求27所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
32.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段在制备供一种用于诊断患者中的Tau蛋白相关疾病、病症或病况或对Tau蛋白相关疾病、病症或病况的易患情况的方法使用的试剂或试剂盒中的用途，其中所述方法包括检测抗体或其片段与样品中或原位tau蛋白的表位的免疫特异性结合，其包括以下步骤：
a. 使怀疑含有所述Tau蛋白的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段接触，所述抗体或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b. 允许所述抗体或其片段与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c. 检测所述免疫复合物的形成；和
d. 将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品中或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，
其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量的增加表明所述患者患有或处于发展tau蛋白相关疾病或病况的风险。
33.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段在制备供一种用于监测使用根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段或根据权利要求20-22中任一项所述的药物组合物治疗后患者中的最小残留疾病的方法使用的试剂或试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a. 使怀疑含有所述Tau蛋白的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段接触，所述抗体或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b. 允许所述抗体或其片段与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c. 检测所述免疫复合物的形成；和
d. 将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，
其中与正常对照值相比，所述免疫复合物的量的增加表明所述患者仍患有最小残留疾病。
34.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段在制备供一种用于预测使用根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段或根据权利要求20-22中任一项所述的药物组合物治疗的患者的反应性的方法使用的试剂或试剂盒中的用途，其中所述方法包括：
a. 使怀疑含有所述Tau蛋白的所述样品或具体身体部分或身体区域与根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段接触，所述抗体或其片段结合所述Tau蛋白的表位；
b. 允许所述抗体或其片段与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c. 检测所述免疫复合物的形成；和
d. 将所述免疫复合物的存在或不存在与所述样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联，
e. 比较治疗开始前后所述免疫复合物的量，
其中，所述免疫复合物的量的减少表明所述患者具有响应于治疗的高潜能。
35.如权利要求32-34中任一项所述的用途，其中将所述免疫复合物的存在或不存在与样品或具体身体部分或区域中Tau蛋白的存在或不存在相关联的步骤包括将所述免疫复合物的量与正常对照值进行比较的步骤。
36.如权利要求32-34中任一项所述的用途，其中所述样品是脑匀浆或脑脊液。
37.如权利要求32-34中任一项所述的用途，其中，在步骤(a)之前，通过使所述样品与附接至固体载体的抗-Tau抗体或其片段相接触对所述样品进行免疫富集以增加样品中Tau蛋白的浓度。
38.一种死后检测来自怀疑患有tau相关疾病或病症的受试者的脑样品或脑脊液(CSF)样品中的磷酸Tau(pTau)多聚体的方法，包括：
a. 使所述受试者的脑样品或CSF样品与根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段接触，所述抗体或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b. 允许所述抗体或其片段与所述Tau蛋白结合以形成免疫复合物；
c. 检测所述免疫复合物的形成；和
d. 使用相同条件将由所述受试者获得的样品中免疫复合物的量或强度与由健康对照受试者获得的免疫复合物的量或强度进行比较，
其中与对照值相比，所述免疫复合物的量或强度的增加表明所述患者已患有tau相关疾病或病症。
39.如权利要求38所述的方法，其中与对照值相比，所述测试样品中观察到的增加为30%至100%。
40.如权利要求38或39中所述的方法，其中，在步骤(a)之前，通过使所述样品与附接至固体载体的抗-Tau抗体或其片段相接触对所述样品进行免疫富集以增加样品中Tau蛋白的浓度。
41.一种用于检测和诊断tau蛋白相关疾病、病症或病况的测试试剂盒，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段。
42.根据权利要求41所述的测试试剂盒，其包含容纳一种或多种根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段的容器，和出于结合Tau蛋白以形成免疫复合物并检测所述免疫复合物的形成从而将所述免疫复合物的存在或不存在与Tau蛋白的存在或不存在相关联的目的使用所述抗体的说明书。
43.一种细胞系，其产生根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段。
44.如权利要求43所述的细胞系，其是作为DSM ACC3139于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-18。
45.如权利要求43所述的细胞系，其是作为DSM ACC3140于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-2A1-40。
46.如权利要求43所述的细胞系，其是作为DSM ACC3136于2011年8月30日保藏的杂交瘤细胞系A4-4A6-48。
47.一种载体，其包含根据权利要求18或19所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是可操作连接的。
48.一种宿主细胞，其包含如权利要求47所述的载体。
49.如权利要求48所述的宿主细胞，其产生根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段。
50.如权利要求48或权利要求49所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。
51.如权利要求48或权利要求49所述的宿主细胞，其是中国仓鼠卵巢细胞。
52.一种用于产生如权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段的方法，其包括在适合于表达抗体或其片段的条件下培养如权利要求48-51中任一项所述的宿主细胞，以及回收所述抗体或其片段。
53.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段在制备供一种检测脑样品或脑脊液(CSF)样品中磷酸Tau (pTau)多聚体的方法使用的试剂或试剂盒中的用途，其中所述方法包括
a. 将所述样品与根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其片段接触，其中所述抗体或其片段结合所述磷酸Tau蛋白的表位；
b. 允许所述抗体或其片段与所述tau蛋白结合以形成免疫复合物；和
c. 检测所述免疫复合物的形成。
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