MX2014004026A - Anticuerpos fosfoespecificos que reconocen la tau. - Google Patents

Anticuerpos fosfoespecificos que reconocen la tau.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por, o asociados con, ovillos neurofibrilares. En particular, la invención se refiere a anticuerpos que específicamente reconocen y se enlazan a conformadores de la proteína tau patológicos fosforilados, y los métodos y composiciones que comprenden dichos anticuerpos para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de taupatías incluyendo el mal de Alzheimer (AD).

Description

ANTICUERPOS FOSFOESPECÍFICOS QUE RECONOCEN LA TAU Esta solicitud demanda el beneficio de la Solicitud de Patente Europea No. EP12163319.2 presentada el 5 de abril del 2012 y la Solicitud de patente internacional No. PCT/EP2011/067604 presentada el 7 de octubre del 2011, los contenidos de cada una de los cuales están incorporadas por referencia en su totalidad.
La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de enfermedades y transtornos los cuales se causan por o se asocian con ovillos neurofibrilares . En particular, la invención se relaciona a anticuerpos, los cuales reconocen y unen específicamente a los confórmeros de la proteína tau patológicamente fosforilada y a métodos y composiciones que conllevan dichos anticuerpos para el uso terapéutico y de diagnóstico en el tratamiento de tautopatías que incluyen la Enferemedad de Alzheimer (EA) .
Los ovillos neurofibrilares y las hebras de neuropilo (NTs) son las características neuropatológicas graves de la Enfermedad de Alzheimer (EA) . Están compuestos de la proteína tau asociada con microtúbulos que experimentaron modificaciones postraduccionales, que incluyen fosforilación, deamidación e isomerización en los residuos asparaginil o aspartil. Se originan por la agregación de la proteína tau hiper fosforilada y sus confórmeros de EA que comparte esta patología con muchas patologías neurodegenerativas, en particular con tipos específicos de demencia frontotemporal (DFT) .
La Proteína tau es una proteína libremente soluble, "naturalmente desplegada" que une ávidamente los microtúbulos (MTs) para promover su formación y estabilidad. Los MTs son de gran importancia para la integridad citoesqueletal de las neuronas- y por ello la fucnionalidad y la formación correcta de los circuitos neuronales, por consiguiente para el aprendizaje y la memoria. La unión de tau a MT está controlada por la de-fosforilación y fosforilación dinámica, como se demuestra principalmente in vitro y en células no neuronales . Debido al largo número de posibles lugares de fosforilación (>80) , la contribución exacta de cada uno y la identidad de las quinasas responsables quedan en gran parte indefinidas in vivo En un cerebro EA, la patología tau se desarrolla después que, y por eso probablemente en respuesta a la patología amiloide, la cual constituye la esencia de la hipótesis de la cascada amiloide. Esto se basa en y es indicada por estudios en pacientes con EA y síndrome de Down, y es corroborado por estudios en ratones transgénicos con la patología de tau y amiloide combinada (Lewis et al., 2001; Oddo et al., 2004; Ribe et al., 2005; Muyllaert et al, 2006;2008; Terwel et al, 2008).
El momento exacto de ambas patologías en pacientes humanos con EA, así como los mecanismos que vinculan al amiloide a la patología de tau que siguen siendo ampliamente desconocidas, pero se proponeque conllevan la activación de las vías de señalización neuronal que actúan sobre o por GSK3 y cdk5 como los principales "tau quinasas" (revisado por Muyllaert et al, 2006, 2008) .
La hipótesis de que la tauopatía no es un efecto secundario inocente, sino un ejecutor patológico grave en la EA se basa en observaciones genéticas, patológicas y experimentales de sonido que se corroboran entre sí completamente : - En los casos de EA familiar de aparición temprana que se deben a mutaciones en la proteína precursora de amiloide (APP) o presenilina, la causa patógena obligada es la acumulación de amiloide, pero invariablemente la patología comprende una tauopatía colateral, idéntica a la de los casos de EA esporádica de inicio tardío ; - La gravedad de la disfunción cognitiva y la demencia se correlaciona con la tautopatía, no con la patología amiloide, ejemplificada más recientemente por varios estudis clínicos de fase 1 y 2 que incluyen imágenes de PIB-PET para amiloides y se identifican muchos "falsos positivos": individuos cognitivamente normales con una carga alta amiloide cerebral; - En DFT familiar, la tautopatía es provocada por un tau mutante y causa directamente una neurodegeneración, sin la patología amiloide; - En modelos experimentales de ratón los defectos cognitivos causados por la patología amiloide están casi completamente aliviados por la ausencia de la proteína tau (Roberson et al, 2007) .
Los argumentos combinados apoyan la hipótesis de que la proteína tau es un jugador importante en la desaparición cognitiva en la EA y tauopatías neurodegenerativas relacionadas .
Un tratamiento emergente prominente de EA es por inmunoterapia pasiva con mAbs específicos, para borrar los péptidos amiloides y sus agregados que se presumen ser neurotóxicos o sinaptotóxicos .
La inmunoterapia dirigida a la patología tau, tal como se propone aquí, se prevé para contrarrestar los confórmeros de la proteína tau patológicos que se sabe o se postulan para causar la disfunción sináptica y la neurodegeneración .
Otros enfoques terapéuticos que se dirigen a la proteína tau son escasos y consisten principalmente en: Inhibidores de las quinasas que se cree que aumentan la fosforilación de tau a niveles patológicos.
Compuestos que bloquean la agregación citoplasmática de la proteína tau hiperfosforilada.
Estos enfoques sufren varios inconvenientes de especificidad y eficacia, un problema que comparten con los intentos de modificar el metabolismo de APP y el amiloide, todo enfatizando en la importancia de una búsqueda continua de opciones de tratamiento adicionales, incluyendo la inmunoterapia contra tau. De hecho, la inmunoterapia dirigida a la amiloide en un modelo preclínico de ratón con la patología similar de EA combinada demostró también un efecto sobre la patología de tau aunque persistieron los agregados de tau (Oddo et al., 2004) .
Algunas dudas se han suscitado sobre la viabilidad de aproximarse con la proteína tau intracelular mediante inmunoterapia. Estos han sido contrarrestados por el estudio experimental más reciente en un modelo de ratón de tautopatía (Asuni et al., 2007). Ellos mostraron una reducción en la patología de los ovillos y mejoras funcionales mediante la vacunación con una proteína tau derivada de un fosfopéptido . Estos datos corroboran los informes anteriores de la inmunoterapia dirigida a a-sinucleína en la enfermedad de Parkinson (EP) y modelos de enfermedad de cuerpos de Lewy (Masliah et al., 2005, 2011) y del superóxido dismutasa en un modelo de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Urushitiani et al. , 2007). Estas enfermedades son ejemplos en donde las proteínas intracelulares conducen a defectos sinápticos y neurodegeneración por mecanismos todavía no entendidos en su totalidad.
Hay una necesidad no satisfecha de inmunoterapias pasivas y/o activas que trabajan para contrarrestar los confórmeros de proteínas patológicas que se conoce o se presume que causan trastornos neurodegenerativos, tales como la patología amiloide en la EA causados, por ejemplo, por agregados intra-neuronales de la proteína tau hiperfosforilada que son tan normales para la EA como amiloide . Ésta necesidad insatisfecha se cubre mediante la presente invención que proporciona proteínas de unión que reconocen y unen a los principales fosfoepítopos patológicos de la proteína tau. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos específicos contra fosfoepítopos lineales y conformacionales, simples y complejos en la proteína tau, en particular en la proteína tau agregada que se cree que es responsable de la sinapto y neurotoxicidad en tauopatías, que incluyen la EA.
Por consiguiente, la presente invención se relaciona a una modalidad a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la mismo, la cual el péptido o proteína o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un fosfoepítopo en la proteína Tau agregada, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al no fosforilado epítopo y/o a epltopos no relacionados correspondientes, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión a una proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles in vivo de la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble, particularmente en el cerebro, particularmente con una constante de disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM. particularmente de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM, en particular de al menos 400 pM, en particular de al menos 300 pM, en particular de al menos 200 pM, en particular de al menos 100 pM, en particular de al menos 50 pM.
En particular, la constante de disociación está en un intervalo de entre 2 nM y 80 nM, particularmente entre 2 nM y 40 nM, particularmente entre 2 nM y 10 nM.
En un aspecto determinado, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un fosfoepítopo que tiene, o dentro de, la secuencia de aminoácidos VYKSPWSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau AA 393-408 de la SEQ ID NO: 67, por ejemplo, como se expone en la Tabla 1) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404) .
En una segunda modalidad, la presente invención se relaciona a un anticuerpo, en particular a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, la cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y tiene un índice de constante de asociación de 104 M"1 s"1 o mayor, en particular entre 3-5 x 104 M"1 s"1 o mayor, en especial de 105 M"1 s"1 o mayor; particularmente de 2-9 x 105 M"1 s"1 o mayor; particularmente de 106 M"1 s"1 o superior, particularmente de 1-4 x 106 M"1 s"1 o mayor, en especial de 107 M"1 s"1 o mayor.
En particular, el índice de constante de asociación está en un rango de entre 1.6 x 103 y 5 x 105, en particular entre 2,4 x 104 y 5 x 105, entre 3 x 103 y 5 x 105 .
En una tercera modalidad, la presente invención se relaciona a un péptido o proteina de unión o una parte funcional de la misma, particularmente a un anticuerpo, particularmente a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente a un péptido o proteína de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, la cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes, en donde dicho péptido de unión o anticuerpo tiene una alta afinidad de unión a una proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles in vivo de la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y tiene una alta afinidad de unión con una constante disociación de al menos 4 nM y un índice de constante de asociación de 105 M"1 s"1 o mayor, en particular una disociación constante de al menos 3 nM y un índice de constante de asociación de 106 M"1 s" 1 o superior, en particular una constante disociación de al menos 2 nM y un índice de asociación constant de 104 M"1 s"1 o mayor, en particular una constante disociación de por lo menos 1 nM y un índice de asociación constante de 105 M"1 s"1 o mayor, en particular una constante disociación de al menos 200 pM y un índice de constante de asociación de 105 M"1 s"1 o mayor, en particular una constante disociación de al menos 100 pM y un índice de constante de asociación de 106 M"1 s"1 o mayor .
En particular, la constante disociación está en un rango de entre 2 nM y 80 nM y el índice de constante de asociación está en un rango de entre 1.6 x 103 y 5 x 105, en particular la constante disociación está en un rango de entre 2 nM y 40 nM y el índice de constante de asociación está en un rango de entre 2,4 x 104 y 5 x 105, en particular la constante de disociación está en un rango de entre 2 nM y 10 nM y el índice de constante de asociación está en un rango de entre 3 x 103 y 5 x 105.
Una modalidad (4) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles in vivo la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en el que dicho péptido o anticuerpo de unión se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana como se muestra en SEQ ID NO: 67, seleccionada del grupo que consiste de Tau aa 393-401, que comprende una Ser fosforilada en la posición 396 (pS396) , Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
Una modalidad (5) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, en el que dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
Una modalidad (6) se relaciona con el péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 396 a 401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
Una modalidad (7) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, en el que dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
Una modalidad (8) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, en el que dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) .
Una modalidad (9) se refiere al péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, en el que dicho péptido se une a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
Una modalidad (10) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles in vivo de la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 73, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 75, o una secuencia de aminoácidos de al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91% , al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma y/o un segundo dominio de unión que comprende en una secuencia de CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácidos de al menos 95%, particularmente 98%, en particular 99% idéntica a la misma, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 71, o una secuencia de aminoácidos al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idénticas a la misma, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 72, o una secuencia de aminoácidos de al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
En un aspecto, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 73, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 75, y/o (b) un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 72.
Una modalidad (11) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondeintes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 81, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 83, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, en menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma y/o un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 80, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
En un aspecto, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) un primer dominio de unión que comprende un CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 81, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N ° : 83, y/o (b) un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 80.
Una modalidad (12) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluole y es capaz de detectar y/o modular los niveles in vivo de la proteína tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende una secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 93, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 95, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% 6 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores y/o un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, en menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores .
En un cierto aspecto, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o una parte funcional del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 93, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 95, y/o (b) un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos secuencia mostrada en SEQ ID NO: 91.
Una modalidad (13) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, el cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 101, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 103, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, en menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores y/o un segundo dominio de unión que comprende en una secuencia de CDRl con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 98, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 100, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores .
En un aspecto, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende : (a) un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 101, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N °: 103, y/o (b) un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 98, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 100.
Una modalidad (14) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión que tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende en secuencia una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 108, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%. particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores y/o un segundo dominio de unión que comprende en una secuencia de CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 91, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores.
En un aspecto particular, proporcionado en el presente documento es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: (a) un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 106, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 108, y/o (k>) un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91.
En una cierta modalidad, el primer dominio de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en el presente documento es una región variable de la cadena ligera, y el segundo dominio de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en el presente documento es una región variable de la cadena pesada.
En otra modalidad (15) , la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional de la misma, en particular a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades precedentes, el cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y o para epítopos no relacionados correspondientes, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69, 77, 116/92, 118, 97, 105, o una secuencia de aminoácidos particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idénticas a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, o una secuencia de aminoácidos de al menos 80 %, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 86%, particularmente al menos 87%, particularmente al menos 88%, particularmente al menos 89%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
Una modalidad (16) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o a una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tienen una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de solubles in vivo de la proteína Tau fosforilada, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos al menos 98% ó 99% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, o una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92% o 93% idéntica a la misma.
Una modalidad (17) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une a un epítopo no fosforilad y/o a epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tienen una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácidos al menos 93%, 94% o 95% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácidos al menos 88%, 89%, o 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (18) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tienen una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la prote'na Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 116, 92, 118, o una secuencia de aminoácidos de al menos 93%, 94% o 95% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácidos de al menos 90%, 91%, 92% o 93% idéntica a la misma.
Una modalidad (19) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en el que dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácidos al menos 86%, 87%, 88% o 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (20) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o para epítopos no relacionados correspondientes en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID: 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 98%, ó 99% idénticas a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID: 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 88%, 89%, ó 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (21) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, o una secuencia de aminoácidos al menos 93% idéntica a la misma.
Una modalidad (22) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la misma y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácidos de al menos 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (23) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 116, 92, ó 118, o una secuencia de aminoácidos al menos 93 95% idéntica a la misma, y/o una segunda dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácidos al menos 93% idéntica a la misma.
Una modalidad (24) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a la misma, y/o que comprende un segundo dominio de unión de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (25) de la presente invención se refiere a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el que dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 98%, o 99% idénticas a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la misma.
Una modalidad (26) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional de la misma, de acuerdo con la modalidad (16) en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs: 73-75, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs: 70-72.
Una modalidad (27) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la modalidad (17) en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs : 81-83, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs : 78-80.
Una modalidad (28) de la presente invención se refiere a un péptido o preoteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la modalidad (18) en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs : 93-95, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NO: 89-91.
Una modalidad (29) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la modalidad (19) en donde dicho primer dominio de unión contiene las ODRs como se muestra en la SEQ ID NOs : 101-103, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs : 98-100.
Una modalidad (30) de la presente invención se relaciona a un péptido o proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con la modalidad (18) en donde dicho primer dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs: 89, 115, y 91, y dicho segundo dominio de unión contiene las CDRs como se muestra en la SEQ ID NOs: 106-108. todavía otra modalidad (31) , la presente invención se relaciona a un péptido o anticuerpo de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, particularmente un péptido o anticuerpo de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, en el cual el péptido o anticuerpo reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en una proteína Tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína Tau patológica pero, en una modalidad no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión a una proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de in vivo de la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y en donde dicho péptido o anticuerpo de unión comprende un a. un. primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, o un b. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 77 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 76, o un c . un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 116 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88, o una; d. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 92 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88, o un e . un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 97 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 96, o un f . un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 104. g. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 118 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88 En una modalidad (32) de la invención, el péptido de unión de cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo, particularmente un anticuerpo de la IgG2a, IgG2b o el isotipo IgG3, particularmente un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
Una modalidad (33) de la invención se refiere a un polinucleótido que codifica el péptido de unión de cualquiera de las modalidades precedentes.
En una modalidad (34) , dicho polinucleótido comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NOS: 84-87, SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119; b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109 a 114, 117 y 119; c. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:: 84-87. SEQ ID NO: 109-114, 117 y 119; d. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109 a 114, 117 y 119; e. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109 a 114, 117 y 119; f . una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109 a 114, 117 y 119; g. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria que se hibridiza a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de a) - f); h. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se desvía de la secuencia de nucleótidos definida en cualquiera de a) - g) por la degeneración del código genético, en donde dicha molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de a) - h) reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento del mismo, particularmente en la proteína tau humana como se muestra en SEQ ID NO: 67, seleccionado del grupo que consiste de Tau aa 393-401, que comprende un phosphoryiated Ser en la posición 396 (pS396) , Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) , y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , en donde, en una modalidad, dicho péptido de unión tiene una alta afinidad de unión con una constante disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM, particularmente de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM, en particular de al menos 400 pM, particularmente de al menos 300 pM, particularmente de al menos 200 pM, particularmente de al menos 100 pM, particularmente de al menos 50 pM y/o tiene un índice de constante de asociación de 104 M^s"1 o mayor, particularmente de entre 3 - 5 x 104 M"1s"1 o mayor, particularmente de 105 M^s"1 o mayor, perticularmente, de 6-9 x 105 M_1s 1 o mayor, particularmente de 106 ^s"1 o mayor, particularmente de 1 - 4 x 106 M^s"1 o mayor, particularmente de 107 M"1s"1 o mayor, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes En diversas modalidades (35) de la invención, se proporciona un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas, el cual es capaz de reconocer y unirse específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana, especialmente una proteína tau asociada a microtúbulos, particularmente una proteína tau hiperfosforilada agregada y asociada a microtúbulos tal como esa presente en los filamentos helicoidales apareados (PHF) , que son las estructuras predominantes en los ovillos neurofibrilares, hebras de neuropilo y neuritas distróficas pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes.
En una modalidad específica (36) de la invención, la proteína tau humana es la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67.
Los péptidos y anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores se pueden, por lo tanto utilizar (37) para la reducción de los niveles del total de la proteína tau soluble, en particular de la proteína tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o hipocampo , de un mamífero o un humano que contiene niveles incrementados de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble.
Los péptidos y anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores también se pueden usar (38) para reducir los niveles de filamentos helicoidales apareados que contienen la proteína tau hiperfosforilada (pTau PHF) en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y y/o hipocampo, de un mamífero o un humano que contiene niveles incrementados de dichos filamentos helicoidales apareados pTau.
La reducción del nivel del total de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble y/o los filamentos helicoidales apareados pTau en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un mamífero o un humano que contiene los niveles incrementados de dichas variantes de la proteína tau, que contribuyen a las enfermedades, trastornos o condiciones asociados con la proteína tau en dicho mamífero o humano, pueden conducir a una mejora y/o alivio de los síntomas asociados con tales enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína tau (39) .
Los péptidos y anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes se pueden por lo tanto, utilizar (40) en terapia, particularmente en la terapia humana, para alentar o detener la progresión de una enfermedad, trastorno o afección asociadas con la proteína tau .
Los péptidos y anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, además se pueden utilizar (41) en terapia, particularmente en la terapia humana, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con las enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína tau tales como, por ejemplo, deterioro o pérdida de las funciones cognitivas, incluyendo el razonamiento, juicio situacional, capacidad de memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc En una modalidad (42) , la invención se relaciona a los péptidos y los anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes para uso en terapia, en particular para uso en el tratamiento de tauopatías, un grupo de enfermedades y trastornos asociadas con la proteína tau, o para aliviar los síntomas asociados con tauopatías .
En una modalidad (43) , la invención se relaciona a los péptidos y anticuerpos de unión de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes para retener o aumentar la capacidad de la memoria cognitiva en un mamífero que padece una tauopatía.
En otra modalidad específica (44) de la invención, los péptidos y anticuerpos de unión que comprenden al menos una o todas las CDRs de la cadena ligera de anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl; ACI-35-2Al-Ab2 ; ACI-35-4A6-Abl; ACI-35-4A6-Ab2; ACI-35-lD2-Abl; ACI-35-2G5-Abl; ACI-35-2G5-Ab2 ; ACI-35-2G5-Ab3: como se indica en la SEQ ID NOS: 73-75, 81-83, 93-95, 101-103, 106-108 y/o al menos uno o la totalidad de las CDRs de la cadena pesada de anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl; ACI-35-2Al-Ab2; ACI-35 -4A6 -Abl ; ACI-35-4A6-Ab2 ; ACI-35-1D2-Abl; ACI-35-2G5-Abl; ACI-35-2G5-Ab2 ; ACI-35-2G5-Ab3 ; como se muestra en la SEQ ID NOs: 70-72, 78-80, 89-91, 98-100, (89, 115, 91) se utilizan en terapia, particularmente en la terapia humana, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con las enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína tau tales como, por ejemplo, deterioro o pérdida de las funciones cognitivas incluyendo razonamiento, juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial, etc.
En otra modalidad específica (45) de la invención, los péptidos y anticuerpos de unión que comprenden al menos una o todas las CDRs de la cadena ligera de anticuerpos de ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3 como se da en la SEQ ID NOs : 106-108 y/o al menos una o la totalidad de las CDRs de la cadena pesada de anticuerpos de ACI-35-2G5-Ab2 ; ACI-35-2G5-Ab3; como se da en la SEQ ID NOs: 89, 115 y 91, se utilizan en terapia, particularmente en la terapia humana, para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína tau tales como, por ejemplo, deterioro o la pérdida de las funciones cognitivas incluyendo razonamiento, juicio situacional, la memoria, el aprendizaje, la navegación espacial , etc.
La unión de los péptidos o anticuerpos de acuerdo con las modalidades anteriores a ovillos de tau y pTau en cerebros se puede determinar mediante la aplicación de una prueba de inmunoreactividad a la proteína de las secciones del cerebro seleccionados y por una prueba Western Blot de la homogeneidad del cerebro, respectivamente, como se describe en los Ej emplos .
En otra modalidad (46) , la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores , o una combinación de las mismas, en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad (47) , el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas, se utiliza en terapia, en particular en terapia humana para el tratamiento o alivio de los síntomas de enfermedades o trastornos asociados con la protelna tau que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como tauopatías.
Los péptidos de unión, anticuerpos y/o composiciones farmacéuticas de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes (48) para alentar o detener la progresión de una enfermedad, trastorno o condición asociadas con la proteína tau, tras la administración de dichos péptidos de unión, anticuerpos y o composiciones farmacéuticas a un animal, particularmente un mamífero, particularmente un humano, que sufre de dicha enfermedad o condición.
Los péptidos de unión, anticuerpos composiciones farmacéuticas de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes se pueden usar además (49) para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la proteína tau tales como, por ejemplo, deterioro o pérdida de las funciones cognitivas incluyendo razonamiento, juicio situacional, capacidad de memoria, aprendizaje, navegación espacial, etc, después de la administración de dichos péptidos de unión, anticuerpos y/o composiciones farmacéuticas a un animal, particularmente un mamífero, particularmente un humano, que sufre de tal enfermedad o condición.
En una modalidad (50) , el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas, se utiliza en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por, o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedades o trastornos los cuales manifiestan tantopatologías amiloides y tau incluyendo, pero no limitado a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilística, el Síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussier-Scheinker, la miositis por cuerpos de inclusión, y la angiopatía amiloide cerebral causad por la proteína prión, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos los cuales no muestran una patología amiloide distinta incluyendo, pero no limitado a, la esclerosis lateral amiotrófica/complejo de demencia-parkinsonismo de Guam, enfermedad de las neuronas motoras que no es de Guam con ovillos neurofibrilares , la demencia con granos argirófilos, degeneración corticobasal , los ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, enfermedad Hallevorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, la enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, la demencia única con ovillos, Parkinson Postencefálico, la distrofia miotónica.
En una modalidad (51) , el péptido de unión o una parte funcional de la misma, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas, se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer En una modalidad (52) de la invención, se proporciona un método para detectar y/o modular los niveles de la proteína Tau fosforilada soluble y/o, oligomérica y/o insoluble, especialmente in vivo, particularmente en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que comprende administrar a dicho animal, en particular a dicho mamífero o humano, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas.
En un aspecto, la modulación se refiere a la reducción de los niveles de la proteína tau soluble, en particular de la proteína tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano que contiene niveles incrementados de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble.
En una modalidad (53) de la invención, se proporciona un método para reducir los niveles de la proteína tau insoluble, particularmente de los filamentos helicoidales apareados que contienen la proteína tau hiperfosforilada (ptau PHF) en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano, que contiene niveles incrementados de la proteína tau insoluble, particularmente de los filamentos helicoidales apareados pTau (pTau PHF) que comprende administrar a dicho animal, en particular a dicho mamífero o humano, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas .
En una modalidad (54), la presente invención se refiere a un método para alentar o detener la progresión de una enfermedad, trastorno o afección asociados a la proteína tau en un animal, particularmente un mamífero o humano que comprende administrar a dicho animal, en particular mamífero o humano, que sufre de dicha enfermedad o condición, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores.
En una modalidad (55) , la presente invención se refiere a un método para mejorar o aliviar los síntomas asociados con enfermedades, trastornos o condiciones asociados a la proteína tau tales como, por ejemplo, deterioro o pérdida de las funciones cognitivas incluyendo razonamiento, juicio situacional, capacidad de memoria, aprendizaje, navegación espacial, etc, en un animal, particularmente un mamífero o un humano, que comprende administrar a dicho animal, en particular a dicho mamífero o humano, que sufre de dicha enfermedad o condición, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas.
En una modalidad (56) , la presente invención se refiere a un método para mantener o aumentar la capacidad de la memoria cognitiva en un mamífero que padece una tauopatía.
En todavía otra modalidad (57) de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociados a la proteína tau incluyendo una enfermedad o trastorno neurodegenerativo tal como una tauopatía que comprende administrar a un animal, particularmente a un mamífero, pero especialmente a un humano, que sufre de dicha enfermedad o trastorno, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, o una combinación de las mismas.
En una modalidad (58) de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por, o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares , la patología cerebral predominante en una tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedades o trastornos que manifiestan tanto patologías amiloides y tau incluyendo, pero no limitado a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, Demencia pugilística, Síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión, y angiopatía amiloide cerebral causada por la proteína prión, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta incluyendo , pero no limitado a, la esclerosis lateral amiotrófica/ complejo de demencia-parkinsonismo de Guam, enfermedad de las neuronas motoras que no es de Guam con ovillos neurofibrilares , la demencia con granos argirófilos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, la enfermedad de Hallevorden-Spatz , atrofia múltiple del sistema, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis subaguda esclerosante, demencia sólo con ovillos, Parkinsonismo Postencefálitico, la distrofia miotónica, cuyo método comprende administrar a un animal, particularmente a un mamífero, pero especialmente a un humano, que sufre de tal enfermedad o trastorno, el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas.
En otra modalidad (59) de la invención, se proporciona un método para inducir una respuesta inmune pasiva en un animal, particularmente un mamífero o un humano, que sufre de un trastorno neurodegenerativo tal como una tauopatía por la administración a dicho animal o humano el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, o una combinación de las mismas.
En todavía otra modalidad (60) de la invención, se proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad asociada a una proteína tau, trastorno o condición en un paciente, que comprende detectar la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de a. poner en contacto la muestra o una parte del cuerp específico o área del cuerpo que sea posible que contenga la proteína tau, con un péptido de unión o un fragmento del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho péptido o anticuerpo de uñón o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, para unirse a la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica.
En todavía otra modalidad (61) de la invención, un método para diagnosticar una predisposición a la enfermedad, trastorno o afección asociado a la proteína tau, en un paciente que comprende la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye las etapas de a. poner en contacto la muestra o una parte específica del cuerpo o un área del cuerpo que sea posible que contenga el antígeno de tau, con un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en el cual el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, dijo particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, para unirse al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno de tau en la muestra o una parte del cuerpo o área específica; e. comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal; en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o condición asociada con a proteína tau.
En una modalidad (62) de la invención, se proporciona un método para el control de la enfermedad residual mínima en un paciente después del tratamiento con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmacéutica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde dicho método comprende : a. poner en contacto la muestra o una parte del cuerpo o un área específica que es posible que contenga el antígeno de tau, con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en el cual el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, para unirse al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno de tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, e. la comparación de la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal, en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente todavía sufre de una enfermedad residual mínima .
En una modalidad (63) , se proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un paciente que se está tratando con el péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido, o una composición farmaceútica, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, que comprende a. poner en contacto la muestra o una parte del cuerpo o área específica que es posible que contenga el antígeno de tau, con un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, en el cual el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitir que dicho péptido de unión, en particular dicho anticuerpo, particularmente dicho anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, se una al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico,-y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, e. la comparación de la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento, en donde una disminución en la cantidad de dicho agregado indica que dicho paciente tiene un alto potencial de responder al tratamiento.
Los anticuerpos y fragmentos anti-Tau de los mismos se pueden utilizar en los métodos anteriores de la invención. En los métodos anteriores la muestra que contiene el anticuerpo o fragmento del mismo puede ser inmune enriquecido para aumentar la concentración de la proteína Tau en la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Tau o un fragmento del mismo unido a un soporte sólido.
Antes de la etapa (a) , la muestra es inmune enriquecida para aumentar la concentración de la proteína Tau en la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Tau o un fragmento del mismo unido a un soporte sólido En otra modalidad (64) , la invención se relaciona a un equipo de prueba para la detección y diagnóstico de enfermedades transtornos o condiciones asociados a la proteína tau, que comprenden un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes.
En una modalidad (65) dicho equipo de prueba comprende un recipiente que contiene uno o más péptidos de unión o fragmentos activos del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores y las instrucciones para el uso de los péptidos o anticuerpos de unión para el propósito de unir a un antigeno de tau para formar un complejo inmunológico y la detección de la formación del complejo inmunológico de tal forma que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlaciona con la presencia o ausencia del antígeno tau.
En todavía otra modalidad (66) , la presente invención se relaciona a un epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana como se muestra en LA SEQ ID NO: 67, seleccionado del grupo que consiste de Tau aa 393-401, que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
En una modalidad (67) , dicho epítopo consiste de Tau aa 393-401, que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
En una modalidad (68) , dicho epítopo consiste de Tau aa 396-401 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
En una modalidad (69) , dicho epítopo consiste de Tau aa 394-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
En una modalidad (70) , dicho epítopo consiste de Tau aa 402-406 que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) .
En una modalidad (71) , dicho epítopo consiste de Tau aa 393-400 que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
En otra modalidad (72) , la invención se relaciona a una línea celular que produce un péptido de unión o un fragmento activo del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores .
En una modalidad (73) , la invención se relaciona a una línea celular, la cual es la línea celular de hibridoma 4A-4A6-48 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3136.
En una modalidad (74) , la invención se relaciona a una línea celular, la cual es la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3137.
En una modalidad (75) , la invención se relaciona a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositado el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3138.
En una modalidad (76) , la invención se relaciona a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3139.
En una modalidad (77) , la invención se relaciona a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3140.
En una modalidad (78) , la invención se relaciona a una línea celular, que es la línea celular de hibridoma A6- 1D2-12 depositado el 6 de septiembre del 2011 como DSM ACC3141.
En una modalidad (79) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, que está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que pueden obtener por una amplificación PCR de ADN de la línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto del 2011, como DSM ACC3139 utilizando a . un par de iniciadores que comprende un 51 -iniciador de la SEQ ID NO: 149 y un 3' -iniciador de la SEQ ID NO: 51 para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5' seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOS: 120, 123, 124, 136, 137, 138, 139, y 140 y un 3 ' -iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs : 131, 134, y 141-148, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una modalidad (80) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, que está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que puede obtenerse por la amplificación PCR de ADN de la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3137 utilizando a. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 51 y 169-174 y un 3' -iniciador de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 124, 127, y 150-158 y un 3' -iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 130, y 159-168 , para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una modalidad (81) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, que está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que puede obtenerse por una amplificación PCR de ADN de la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3140 utilizando a. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 178, 179 y 180 y un 3' -iniciador de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 121, 127, 139, 154, 155, y 175 y un 3' -iniciador seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID N ° : 128, 129, 147, 176, y 177, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una modalidad (82) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, que está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que puede obtenerse por la amplificación PCR del ADN de la línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3138 utilizando a. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 51 y 188-192 y un 3 '-iniciador de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOS: 120, 124, 126, 181, 182 y 183 y un 3' -iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs : 144, 145 y 184-187, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una modalidad (83) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, la cual está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que puede obtenerse por la amplificación PCR del ADN de la línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositado el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3136 utilizando a. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'- iniciadro seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 50 y 201-204 y un 3' -iniciador de la SEQ ID NO: 51, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs : 121, 137, 151 y 193-197 y un 3' -iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 131, 141, 144 , 166, 198, 99 y 200, para la amplificación de un segundo dominio de unión .
En una modalidad (84) , la invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo que comprende una cadena ligera (VL) y/o una cadena pesada (VH) de dominio, que está codificada por un polinucleótido que se encuentra en un fragmento de nucleótidos que se pueden obtener mediante una amplificación PCR del ADN de la línea celular de hibridoma A6-1D2-12 depositado el 6 de septiembre del 2011 como DSM ACC3141 utilizando a. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 209-214, y 219-221 y un 3' -iniciador de la SEQ ID NO: 215, para la amplificación de un primer dominio de unión, y/o b. una mezcla de iniciadores que comprenden un 5'-iniciador seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NOs: 216, 217 y 218 y un 3 '-iniciador de la SEQ ID NO: 208, para la amplificación de un segundo dominio de unión.
En una modalidad (85) , el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo de camélido, un diacuerpo, o un anticuerpo modificado o manipulado.
En una modalidad (86) , la invención proporciona un método para producir los péptidos o anticuerpos de unión de cualquiera de las modalidades anteriores, que comprende la etapa de cultivar la línea celular de cualquiera de las modalidades anteriores en un medio de cultivo adecuado y, opcionalmente, la purificación de los péptidos o anticuerpos de unión de la linea celular o medio de cultivo.
En otra modalidad (87) , la presente invención proporciona un método para detectar los multímeros fosfoTa (pTau) en una muestra de cerebro que comprende a. poner la muestra en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína fosfoTau : b. permitiendo que el anticuerpo se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico, en particular mediante la aplicación de un ensayo ELISA.
En particular, la invención se relaciona en una modalidad específica (88) a un método de detección post mortem de multímeros fosfoTau (pTau) en homogeneizados de cerebro de un sujeto que es posible que sufra de una enfermedad o transtorno asociado con tau y de un sujeto de control sano que comprende a. Poner una muestra de homogeneizados de cerebro de ambos sujetos en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína fosfoTau; b. permitiendo que el anticuerpo se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico, en particular mediante la aplicación de un ensayo de ELISA y d. comparando la cantidad o intensidad del complejo inmunológico en la muestra obtenida del sujeto que es posible que sufre de una enfermedad asociada a tau o a la de la muestra de control, en donde un aumento en la cantidad o intensidad de dicho complejo inmunológico en comparación con el valor de control indica que dicho paciente ha sufrido de una enfermedad residual mínima.
En una modalidad (89) , el aumento observado en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control es entre 30% y 50%, en particular entre 35% y 45%.
En una modalidad (90) la invención proporciona un péptido o una proteína de unión o una parte funcional del mismo, particularmente a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores, el cual el anticuerpo o fragmento muestra un perfil de pK favorable. En particular, dicho anticuerpo o fragmento tiene una alta concentración en suero hasta después de 10 días de la administración, lo que indica un perfil de farmacocinética (PK) que favorablemente apoya el uso de dichos anticuerpos como un anticuerpo terapéutico. {Deng et al, Expert Opin Drug Metab Toxicology, 2012, 8 (2) 141-60;.. Putman y otros, Trends Biotech, 2010 (28) 509-516; Bai, S. Clin Pharmacokinet 2012; 51 (2) : 119-135) .
Breve descripción de las figuras y secuencias FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados de la detección de multímeros Tau fosforilados por ACI-35-2Al-Abl (panel izquierdo) , ACI-35-2G5-Ab3 (panel central) , y un anticuerpo de control (HT7; panel derecho) en homogeneizados cerebrales humanos del control y los sujetos con EA.
La Figura 2A y 2B muestra resultados de detección del total y p-Tau por anticuerpos comerciales en los homogeneizados de cerebro humano.
La Figura 3A, 3B, 3C, muestra la detección de fosfo-Tau por ACI-35-2Al-Abl (fig.3A) , de ACI-35-lD2-Abl (fig.3B) , y ACI-35-2G5-Ab3 (fig.3C) en homogeneizados de cerebro humano.
La Figura 4A, 4B, 4C, muestra los resultados de la detección de Tau-pS396 en humano con EA y el control (Ctrl) cerebral por ACI-35-2Al-Abl (fig.4A), ACI-35-lD2-Abl (fig.4B) , y ACI-35-2G5-Ab3 (fig.4C) anticuerpos que usan AlphaLISA. **** P <0.0001, ** p <0.01 mediante la prueba de Mann-Whitney.
La Figura 5A y 5B muestra los resultados de Tau-pT231 (AT180) tinción IHC en la amígdala (fig.5A) y el hipocampo (fig.5B), después del tratamiento de ratones transgénicos Tau con ACl-35-2G5-Ab3.
La Figura 6A y 6B muestra resultados de tau total (HT7) de la tinción IHC en la amígdala (fig.6A) y el hipocampo (fig.6B), después del tratamiento de ratones Tau transgénicos con ACI-35-2G5-Ab3.
La Figura 7 muestra un SDS-PAGE para Tau-pS396 generada utilizando diferentes condiciones de GSK3 , y la membrana se secó usando el anticuerpo de ACI-35-2G5-Ab3.
La figura 8 muestra la configuración específica del ensayo AlphaLISA usando ACI-35-2G5-Ab3-BT y los anticuerpos Tau-3.
La Figura 9 muestra la detección de Tau-pS396 en la fracción de cerebro humano SI de un donante con EA; comparando de la señal obtenida a partir de muestras enriquecidas por las muestras de IP y no IP.
La figura 10 muestra los resultados de la detección de Tau-pS396 en la EA humana y control (Ctrl) de CSF por el anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 utilizando IP seguidas de AlphaLISA. *** p = 0.0003 mediante la prueba de Mann-Whitney .
SECUENCIAS La SEQ ID NO: 46-57 representa las secuencias de nucleótidos de VH/VK iniciadores directos e inversos .
La SEQ ID NO: 62 representa la secuencia de aminoácidos del antígeno de Tau, péptido T3 (véase en la Tabla 1) .
La SEQ ID NO: 67 representa la secuencia de aminoácidos de la isoforma más larga de la tau humana (441 aa) también llamada Tau40.
La SEQ ID NO: 68 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
La SEQ ID NO: 69 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
La SEQ ID NO: 70 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 71 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 72 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 73 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 74 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 75 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl .
La SEQ ID NO: 76 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
La SEQ ID NO: 77 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
La SEQ ID NO: 78 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena sada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACl-35-lD2-Abl La SEQ ID NO: 79 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl .
La SEQ ID NO: 80 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl .
La SEQ ID NO: 81 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de AC -35-lD2-Abl .
La SEQ ID NO: 82 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl .
La SEQ ID NO: 83 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl .
La SEQ ID NO: 84 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
La SEQ ID NO: 85 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal ACI-35-4A6-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-18.
La SEQ ID NO: 86 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) deñ anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
La SEQ ID NO: 87 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-lD2-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-1D2-12.
La SEQ ID NO: 88 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl , ACI-35-2Al-Ab2, y ACI-35-4A6-Ab2 , respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1 -40 y A4-4A6-48, respectivamente .
SEQ ID NO: 89 representa la secuencia aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-2Al-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente .
La SEQ ID NO: 90 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-2Al-Ab2, y ACI-35-4A6-Ab2 , respectivamente.
La SEQ ID NO: 91 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-2Al-Ab2, ACI-35-4A6-Ab2, ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente.
La SEQ ID NO: 92 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 La SEQ ID NO: 93 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de AC -35-2Al-Ab2.
La SEQ ID NO: 94 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Ab2.
La SEQ ID NO: 95 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de AC -35-2Al-Ab2.
La SEQ ID NO: 96 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
La SEQ ID NO: 97 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de la región variable (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
La SEQ ID NO: 98 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 99 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 100 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 101 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 102 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 103 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-Abl .
La SEQ ID NO: 104 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
La SEQ ID NO: 105 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
La SEQ ID NO: 106 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente.
La SEQ ID NO: 107 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente.
La SEQ ID NO: 108 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente.
La SEQ ID NO: 109 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-2Al-Ab2 , y ACI-35-4A6-Ab2 , respectivamente, producido por línea celular de hibridoma A4-2A1-18, A4-2A1-40 y A4-4A6-48, respectivamente .
La SEQ ID NO: 110 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Ab2 producido por la línea celular d hibridoma A4-2A1-40.
La SEQ ID NO: 111 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB1 producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
La SEQ ID NO: 112 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB1 producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-08.
La SEQ ID NO: 113 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-41, respectivamente.
La SEQ ID NO: 114 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3 , respectivamente, producido por la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 y A6-2G5-4, respectivamente.
La SEQ ID NO: 115 representa la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2G5-AB2 y ACI-35-2G5-AB3.
La SEQ ID NO: 116 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1 -18.
La SEQ ID NO: 117 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-2Al-Abl producido por la línea celular de hibridoma A4-2A1 -18.
La SEQ ID NO: 118 representa la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-48.
La SEQ ID NO: 119 representa la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (VK) del anticuerpo monoclonal de ACI-35-4A6-Ab2 producido por la línea celular de hibridoma A4-4A6-48.
La SEQ ID NO: 120 a 221 representan las secuencias de nucleótidos de los iniciadores VH/VK directos e inversos.
Definición de los Términos Los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína", como se usa en el presente documento, son de forma intercambiable y se definen en el sentido de una biomolécula compuesta de aminoácidos ligados por un enlace peptídico.
El término "péptidos", o "péptido de unión" se utilizan aquí de forma intercambiable y se refieren a cadenas de aminoácidos (normalmente L-aminoácidos) cuyos carbonos alfa están ligados a través de enlaces peptídicos formados por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alfa de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. El aminoácido terminal en un extremo de la cadena (es decir, el amino terminal) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (es decir, el carboxi terminal) tiene un grupo carboxilo libre.
Como tal, el término "amino terminal" (abreviada N-terminal) se refiere al grupo alfa-amino libre en el aminoácido en el amino terminal del péptido, o para el grupo alfa-amino (grupo imino cuando participa en una unión de péptido) de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro del péptido. Del mismo modo, el término "carboxi terminal" (abreviado C-terminal) se refiere al grupo carboxilo libre en el aminoácido en el carboxi terminal de un péptido, o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro del péptido. Un péptido de unión puede constituir anticuerpos tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, diacuerpos, anticuerpos de camélidos, etc, o partes funcionales de los mismos tales como se define en el presente documento.
Los términos "fragmento del mismo" o "fragmento" se usa en el presente documento en el contexto de un péptido que se refieren a un fragmento de péptido funcional que tiene esencialmente la misma actividad (biológica) como un péptido intacto definido en el presente documento. Los términos cuando se usa en el presente documento en el contexto de un anticuerpo se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende una porción de un anticuerpo intacto que contiene una unión de antígeno o región del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2/ y fragmentos Fv; diacuerpos; moléculas de anticuerpo de cadena única, incluyendo moléculas Fv (scFv) de cadena única, y anticuerpos biespecífieos y multiespecífieos y/o fragmentos de anticuerpos.
Normalmente, los aminoácidos que forman un péptido se numeran en orden, comenzando en el amino terminal y aumentando en la dirección hacia el carboxi terminal del péptido. Por lo tanto, cuando se dice que un aminoácido para "sigue" a otro, ese aminoácido está posicionado más cerca de la terminal de carboxi del péptido que el aminoácido anterior .
El término "residuo" se utiliza en el presente documento para referirse a un aminoácido que se incorpora en un péptido mediante una unión de amida. Como tal, el aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural o, a menos que de otro modo sea limitado, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural (es decir, miméticos de aminoácidos) . Además, un mimético de enlace de amida incluye las modificaciones del esqueleto peptídico bien conocido por los expertos en la técnica.
La frase "que consiste esencialmente" se usa en el presente documento para excluir todos los elementos que puedan alterar sustancialmente las propiedades esenciales de los péptidos a los cuales se refiere la frase. Por lo tanto, la descripción de un péptido "que consiste esencialmente en..." excluye cualquier sustitución, adición o supresión de aminoácidos, que alterarían sustancialmente la actividad biológica de ese péptido.
Además, un experto reconocerá que, como se ha mencionado anteriormente, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales, las cuales alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos del 5%, más normalmente menos del 1%) en una secuencia codificada son variaciones modificadas conservativamente, donde las alteraciones dan como resultado en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A) , Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , tirosina (Y) , Triptófano (W) .
Las frases "aislados" o " puro biológicamente" se refiere a un material el cual es sustancialmente o esencialmente libre de componentes los cuales normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, los péptidos descritos en el presente documento no contienen materiales asociados normalmente con su entorno in situ. Normalmente, los péptidos aislados, inmunogénicos descritos en el presente documento son al menos aproximadamente 80% puros, habitualmente al menos aproximadamente 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente 95% como se mide por una banda de intensidad en un gel teñido con plata.
La pureza u homogeneidad de proteínas se puede indicar por un número de métodos bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido por la visualización sobre tinción. Para ciertos propósitos se necesitará alta resolución y HPLC o un medio similar para la purificación utilizada.
Cuando los péptidos inmunogénicos son relativamente cortos en longitud (es decir, menos de aproximadamente 50 aminoácidos) , que a menudo son sintetizados utilizando técnicas de síntesis peptídica química estándar.
La síntesis en fase sólida en la cual el aminoácido C-terminal de la secuencia está unido a un soporte insoluble seguido por adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es un método preferido para la síntesis química de los péptidos inmunogénicos descritos en el presente documento. Las técnicas para una síntesis en fase sólida son conocidos por los expertos en la técnica.
Alternativamente, los péptidos inmunogénicos descritos en el presente documento se sintetizan usando una metodología de ácido nucleico recombinante . Generalmente, esto implica crear una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido, colocando el ácido nucleico en un cásete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresando el péptido en un huésped, aislando el péptido o polipéptido expresado y, si se requiere, renaturalizando el péptido. Las técnicas suficientes para guiar a un experto a través de tales procedimientos se encuentran en la literatura .
Una vez expresados, los péptidos recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Se prefieren las composiciones sustancialmente puras de aproximadamente 50% a 95% de homogeneidad, y de 80% a 95% o de mayor homogeneidad es el más preferido para su uso como agentes terapéuticos.
Un experto en la técnica reconocerá que después de la síntesis química, la expresión biológica o la purificación, los péptidos inmunogénicos pueden poseer una conformación sustancialmente diferente que las conformaciones nativas de los péptidos constituyentes. En este caso, a menudo es necesario para desnaturalizar y reducir el péptido antiproliferante y luego para hacer que el péptido se vuelva a plegar en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar proteínas e inducir el re plegamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La antigenicidad de la proteína purificada se puede confirmar, por ejemplo, mediante la demostración de la reacción con el suero inmune, o con antisueros producidos contra la proteína misma.
Los términos "un", "una" y "el" como se usa en el presente documento se definen en significado de "uno o más", e incluyen el plural a menos que el contexto no sea apropiado .
Los términos "detección" o "detectado" como se usa en el presente documento significa el uso de técnicas conocidas para la detección de moléculas biológicas tales como inmunoquímica o métodos histológicos y se refieren a la determinación cualitativa o cuantitativamente que determina la presencia o concentración de la biomolécula bajo investigación.
Por "aislado" se entiende una molécula biológica libre de al menos algunos de los componentes con los que se produce naturalmente.
Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" o "partes funcionales de los mismos" tal como se utiliza en la presente documento es un término reconocido en la técnica y se entiende que se refieren a moléculas o fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos, en particular a moléculas de inmunoglobulina y a porciones activas inmunológicamente de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. La inmunoglobulina de acuerdo con la invención puede ser de cualquier tipo (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) o clase (IgGl, lgG2, IgG3 , lgG4, IgAl y IgA2) o subclases de la molécula de inmunoglobulina.
Los "anticuerpos" están destinados dentro del alcance de la presente invención para incluir anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena única biespecífieos, simianizados, anticuerpos humanos y humanizados, anticuerpos de camélidos, diacuerpos, así como partes funcionales o fragmentos activos de los mismos. Los ejemplos de fragmentos activos de moléculas que se unen a antígenos conocidos incluyen fragmentos de Fab y F(ab*)2# incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de Fab de inmunoglobulina y fragmentos de unión a un epítopo de cualquiera de los anticuerpos y fragmentos mencionados anteriormente .
Estos fragmentos activos se pueden derivar de un anticuerpo de la presente invención mediante un número de técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales purificados pueden ser escindidos con una enzima, tal como pepsina, y ser sujeto a filtración en gel de HPLC. La fracción apropiada que contiene fragmentos Fab se puede recoger y concentrarse por una filtración de membrana y similares. Para una descripción adicional de las técnicas generales para el aislamiento de fragmentos activos de anticuerpos, véase, por ejemplo, Khaw, B. A. et al.J. Nucl.Med. 23: 1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Métodos de Enzimología, 121:663-69, Academic Press, (1986).
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado que tiene sus CDRs derivadas de una inmunoglobulina de donante no humano, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula siendo derivadas de uno (o más) inmunoglobulina humana.
Un anticuerpo humanizado puede referirse además a un anticuerpo que tiene una región variable donde uno o más de sus regiones de sus regiones de estructura tienen aminoácidos humanos o primates. Además, los residuos de soporte de estructura se pueden alterar para preservar la afinidad de unión. Los métodos para obtener "anticuerpos humanizados" son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Queen et al., Proc . Nati Acad Sci EE.UU., 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Tecnología, 9:421 (1991))..
Un "anticuerpo humanizado" se puede obtener también por un nuevo enfoque de ingeniería genética que permite la producción de anticuerpos policlonales parecidos a los humanos madurados por afinidad en animales grandes tales como, por ejemplo, conejos (http: //www. rctech. com/bioventures/therapeutic .php) .
El término "anticuerpo completamente humano" o anticuerpo "humano" pretende referirse a un anticuerpo derivado a partir de ratones transgénicos que llevan genes de anticuerpos humanos o de las células humanas . Para el sistema inmunológico humano, sin embargo, la diferencia entre los anticuerpos "completamente humanos" "humano", "humanizado", y pueden ser insignificantes o inexistentes y, como tal, los tres pueden ser de igual eficacia y seguridad. término "anticuerpo monoclonal" también es bien reconocido en la técnica y se refiere a un anticuerpo que es producido en masa en el laboratorio a partir de un único clon y que sólo reconoce un antígeno. Los anticuerpos monoclonales se hacen normalmente por la fusión de una célula B productora de anticuerpos normalmente de corta duración a una célula de crecimiento rápido, tal como una célula de cáncer (a veces referida como una célula "inmortal"). La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rápidamente, creando un clon que produce grandes cantidades del anticuerpo.
El término "antígeno" se refiere a una entidad o fragmento del mismo que puede inducir una respuesta inmune en un organismo, en particular un animal, más particularmente un mamífero, incluyendo un humano. El término incluye inmunógenos y regiones responsables de la antigenicidad o determinantes antigénicos .
Como se usa en el presente documento, el término "soluble" significa parcial o totalmente disuelto en una solución acuosa.
También como se utiliza en el presente documento, el término "inmunogénico" se refiere a sustancias las cuales provocan o potencian la producción de anticuerpos, células T y otras células inmunitarias reactivas dirigidas contra un agente inmunogénico y contribuye a una respuesta inmune en humanos o animales .
Una respuesta inmune ocurre cuando un individuo produce suficientes anticuerpos, células T y otras células inmunitarias reactivas contra las composiciones inmunogénicas administradas de la presente invención para moderar o aliviar el trastorno a tratar.
El término "hibridoma" es reconocido en la técnica y se entiende por los expertos comunes en la técnica para referirse a una célula producida por la fusión de una célula productora de anticuerpos y una célula inmortal, por ejemplo, una célula de mieloma múltiple . Esta célula híbrida es capaz de producir un suministro continuo de anticuerpos. Véase la definición de "anticuerpo monoclonal" anterior y los Ejemplos a continuación para obtener una descripción más detallada del método de fusión.
El término "portador", como se usa en el presente documento significa una estructura en la que el péptido antigénico o la construcción supramolécular se pueden incorporar en o se pueden asociar con, planteando o exponiendo por ello los péptidos antigénicos o parte del péptido para el sistema inmunológico de un humano o animal.
Cualquier partícula que se puede utilizar convenientemente en la terapia animal o humana, tales como, por ejemplo, una vesícula, una partícula o un cuerpo de partículas se pueden usar como un portador en el contexto de la presente invención.
El término "portador" comprende, además, métodos de administración en donde las composiciones de construcción antigénicas supramoleculares que comprenden que el péptido antigénico puede ser transportado a los lugares deseados por los mecanismos de administración. Un ejemplo de tal sistema de administración utiliza metales coloidales tales como oro coloidal .
Las proteínas portadoras que se pueden utilizar en las composiciones de construcciones antigénicas supramoleculares de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, péptido de unión a maltosa "MBP"; albúmina de suero bovino "BSA" ; hemocianina de lapa californiana "KLH"; ovoalbumina; flagelina; tiroglobulina ; albúmina de suero de cualquier especie; gamma globulina de cualquier especie; células singénicas; células singénicas que llevan antígenos, y polímeros de D-y/o L-aminoácidos .
Además, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de péptido de unión que, cuando se administra a un humano o animal, es suficiente para dar lugar a un efecto terapéutico en dicho humano o animal. La cantidad eficaz se determina fácilmente por un experto normal en la técnica después de los procedimientos de rutina. "pTau PHF" , " PHF" , y "filamentos helicoidales apareados" se utilizan en el presente documento como sinónimos y se refieren a pares de aproximadamente 10 nm filamentos de la herida en hélices con una periodicidad de 160 nm visible en microscopía electrónica. El ancho varía entre 10 y 22 nm. Los PHF son las estructuras predominantes en los ovillos neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer (EA) y hebras de neuropilo. Los PHF también se puede ver en algunas pero no todas las neuritas distróficas asociadas con las placas neuríticas. El componente principal de PHF es una forma hiperfosforilada de microtúbulos asociados con la proteína tau. Los PHF se compone de las proteínas tau hiper-fosforilados antiparalelas ligadas por puentes de disulfuro. Los PHF tau se puede truncar de sus residuos de 20 aminoácidos C-terminales . Los mecanismos que subyacen a la formación de PHF son inciertos, pero la hiper-fosforilación de tau pueden desengancharlo de los microtúbulos , aumentando la piscina soluble de tau.
Dentro del alcance de la presente invención, se demostró que el anticuerpo inducido por la respuesta a la composición antigénica de acuerdo a la invención es en gran parte de las células T independientes. Un modelo de ratón desnudo se utilizó en este respeto y ratones desnudos fueron vacunados y las respuestas de los anticuerpos se midieron para evaluar la respuesta del anticuerpo ?ß especifica inducida por la composición antigénica de acuerdo con la invención en los ratones desnudos inmunizados . Los ratones desnudos llevan la mutación Foxnlnu y, como consecuencia, han reducido la función de las células T debido a la falta de un timo adecuada.
Una "cantidad farmacéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento se refiere a una dosis del ingrediente activo en una composición farmacéutica adecuada para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad, trastorno o condición a tratar o de cualquier complicación asociada con el mismo.
La presente invención proporciona péptidos de unión a reconocer y unirse a fosfoepítopos patológicamente principales de la proteína tau. En particular, la presente invención proporciona anticuerpos específicos contra fosfoepítopos lineales y conformacionales , simples y complejos en la proteína tau que se cree que son responsables de sinapto y neuro toxicidad en las tauopatías, incluyendo la EA.
Por consiguiente, la presente invención se relaciona en una modalidad a un péptido de unión o una parte funcional del mismo, en particular a un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, la cual el péptido o anticuerpo de unión reconoce y se une específicamente a un fosfoepítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero, en una modalidad, no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes, en donde dicho péptido o anticuerpo de unión tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 10 nM, particularmente de al menos 8 nM, particularmente de al menos 5 nM, en particular de al menos 2 nM, particularmente de al menos 1 nM, particularmente de al menos 500 pM , particularmente de al menos 400 pM particularmente de al menos 300 pM, particularmente de al menos 200 pM, particularmente de al menos 100 pM, particularmente de al menos 50 pM.
La proteína "Tau soluble" como se usa en el presente documento se refiere a proteínas que consisten de dos monómeros de proteína/péptido Tau completamente solubilizada o de péptidos/proteínas similares a Tau o de péptidos/proteínas Tau modificadas o truncadas o de otros derivados de monómeros de péptidos/proteínas Tau, y de oligómeros de la proteína tau. La "Tau soluble" excluye particularmente ovillos neurofibrilares (NFT) .
La "Tau insoluble" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a monómeros agregados múltiples de péptidos o proteínas Tau, o de péptidos/proteínas similares a Tau, o de péptidos/proteínas Tau truncadas o modificadas o de otros derivados de péptidos/proteínas Tau que forman estructuras poliméricas u oligoméricas las cuales son insolubles tanto in vitro en un medio acuoso e in vivo en el cuerpo de un mamífero o humano, más particularmente en el cerebro, pero particularmente a monómeros agregados múltiples de Tau o de o péptidos/proteínas Tau truncadas o modificadas o de sus derivados, que son insolubles en el cuerpo de un mamífero o humano, más particularmente en el cerebro, respectivamente. La "Tau insoluble" particulaqrmente incluye ovillos neurofibrilares (NFT) .
El "Tau monomérico" o "monómero de Tau" como se usa en el presente documento, se refiere a las proteínas Tau completamente solubilizadas sin complejos agregados en un medio acuoso.
La "Tau agregada", "Tau oligomérica" y "oligómero Tau" se refieren a múltiples monómeros agregados de péptidos o proteínas Tau, o de péptidos/proteinas similares a Tau o de péptidos/proteinas Tau truncadas o modificadas o de otros derivados de péptidos/proteinas Tau que forman estructuras poliméricas u oligoméricas las cuales son insolubles o solubles tanto in vitro en medio acuoso e in vivo en el cuerpo de un mamífero o humano, más particularmente en el cerebro, pero particularmente a monómeros agregados de tau múltiples o péptidos/proteinas de Tau modificadas o truncadas o de derivados de los mismos, que son insolubles o solubles en el cuerpo de un mamífero o humano, más particularmente en el cerebro, respectivamente.
Un "anticuerpo de modulación" se refiere a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo como se describe en el presente documento en las diversas modalidades, que pueden o aumentar (por ejemplo, activar o estimular) , disminuir (por ejemplo, inhibir o suprimir) o de otra manera cambiar una propiedad funcional, la actividad biológica o el nivel de solubilidad y/o insolubilidad y/u oligoméricidad de la proteína Tau, particularmente de la proteína Tau fosforilada soluble, in vivo, en particular en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, en particular un mamífero o un humano que contiene un aumento de los niveles de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble. Un anticuerpo de modulación o un fragmento funcional del mismo pueden actuar para modular una proteína tau o un polipéptido que codifica dicha proteína tau, ya sea directamente o indirectamente. En ciertas modalidades, un anticuerpo de modulación o un fragmento funcional del mismo reduce los niveles de solubilidad y/o insolubilidad y/u oligoméricidad, particularmente de la proteína tau soluble e insoluble, particularmente la proteína tau soluble e insoluble y oligomérica. En un aspecto, la proteína tau soluble y/o insoluble y/u oligomérica es la proteína tau fosforilada, particularmente la proteína tau fosforilada soluble, en el cerebro, particularmente en la corteza cerebral y/o el hipocampo, de un animal, particularmente un mamífero o un humano que contiene un aumento de los niveles de la proteína tau y/o la proteína tau fosforilada, particularmente de la proteína tau soluble y/o la proteína tau fosforilada soluble" .
En una modalidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión o una parte funcional del mismo, particularmente un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, o un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho péptido o anticuerpo de unión, de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas y reivindicadas en el presente documento, o una combinación de los mismos, en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un portador farmacéuticamente aceptable .
Los portadores farmacéuticos adecuados, diluyentes y/o excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc.
Los péptidos de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, se pueden preparar en una formulación fisiológicamente aceptable y pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente y/o excipiente usando técnicas conocidas. Por ejemplo, los péptidos de unión de acuerdo con la invención y como se describe en el presente documento incluyendo cualquier péptido de unión equivalente funcionalmente o partes funcionales de los mismos, en particular, los anticuerpos monoclonales de la invención incluyendo cualquier anticuerpo equivalente funcionalmente o partes funcionales de los mismos, se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente y/o excipiente para formar una composición terapéutica. Los portadores farmacéuticos adecuados, diluyentes y/o excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc La formulación de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo de acuerdo con la metodología estándar conocida por aquellos de expert s ordinarios en la técnica.
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar a un sujeto en forma de un sólido, líquido o aerosol a una dosis adecuada, farmacéuticamente eficaz. Los ejemplos de composiciones sólidas incluyen pildoras, cremas y unidades de dosificación implantables . Las pildoras se pueden administrar por vía oral. Las cremas terapéuticas pueden administrarse por vía tópica. Unidades de dosificación implantables se pueden administrar localmente, por ejemplo, en el sitio del tumor, o se pueden implantar para la liberación sistemática de la composición terapéutica, por ejemplo, por vía subcutánea. Los ejemplos de composiciones líquidas incluyen formulaciones adaptadas para inyección intramuscular, subcutánea, intravenosa, intra arterial, y formulaciones para administración tópica e intraocular. Los ejemplos de formulaciones de aerosol incluyen formulaciones de inhaladores para la administración a los pulmones.
Las composiciones pueden ser administradas por rutas de administración estándar. En general, la composición se puede administrar por vía tópica, oral, rectal, nasal, intradermal, intraperitoneal , o parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, o intramuscular) rutas.
Además, la composición se puede incorporar en las matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, los polímeros que están siendo implantantados en la proximidad de donde se desea el suministro, por ejemplo, en el sitio de un tumor. El método incluye la administración de una dosis única, la administración de dosis repetidas a intervalos de tiempo predeterminados, y la administración sostenida durante un periodo de tiempo predeterminado .
Una matriz de liberación sostenida, como se usa en el presente documento, es una matriz hecha de materiales, normalmente polímeros, que son degradables por hidrólisis enzimática o base/ácido o por disolución. Una vez insertada en el cuerpo, la matriz sufre la acción de las enzimas y fluidos corporales. La matriz de liberación sostenida se elige deseablemente por materiales biocompatibles tales como liposomas, polilácticos (ácido poliláctico) , poliglicólido (polímero de ácido glicólico) , polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) , polianhídridos, poli (orto) ásteres , polipéptidos , ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílieos , ácidos grasos, fosfolípidos , polisacáridos, ácidos nucleicos, ácidos poliamino, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, propileno polivinílico, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de uno de cualquiera de polilactida, poliglicólido, o polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) .
Es bien conocido para los expertos normales en la técnica pertinente que la dosis de la composición dependerá de varios factores tales como, por ejemplo, la condición de que se está tratando, la composición particular utilizada, y otros factores clínicos tales como el peso, tamaño , sexo y estado de salud general del paciente, área de superficie corporal, el compuesto particular o la composición a ser administrada, otros fármacos que se administran de forma concurrente, y la vía de administración.
La composición de acuerdo con la invención se puede administrar en combinación con otras composiciones que comprenden una sustancia biológicamente activa o compuesto tal como, por ejemplo, un compuesto conocido utilizado en el medicamento de tauopatías y/o de amiloidosis, un grupo de enfermedades y trastornos asociados con amiloide o proteína similar amiloide tal como la proteína amiloide ß implicados en la enfermedad de Alzheimer.
La otra sustancia biológicamente activa o compuesto pueden ejercer su efecto biológico por el mismo o un mecanismo similar al de la vacuna terapéutica de acuerdo con la invención o por un mecanismo no relacionado de acción o por una multiplicidad de mecanismos relacionados y/o no relacionados de acción.
En general, el otro compuesto biológicamente activo puede incluir potenciadores de neutrones de transmisión, medicamentos psicoterapéuticos , inhibidores de la acetilcolinesterasa, bloqueadores de los canales de calcio, aminas biogénicas, tranquilizantes de benzodiazepina, la síntesis de la acetilcolina, el almacenamiento o la liberación de potenciadores, agonistas de receptores postsinápticos de acetilcolina, la monoamino oxidasa-A o -inhibidores B, antagonistas de receptor de glutamato de D-aspartato-N-metil, los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, antioxidantes, y antagonistas de los receptores serotoninérgicos .
En particular, el agente biológicamente activo o compuesto pueden comprender al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos contra el estrés oxidativo, compuestos anti-apoptóticos, quelantes de metales, inhibidores de la reparación del ADN, tales como pirenzepina y metabolitos, 3 -amino-1-propanosulfónico (3APS) , 1 , 3-propanodisulfonato (1.3PDS), activadores secretasa, [beta] - y los inhibidores de 7-secretasa, las proteínas tau, neurotransmisor, interruptores /3 hojas, las moléculas antiinflamatorias, "antipsicóticos atípicos", como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol u olanzapina o inhibidores de la colinesterasa (ChEls) tales como tacrina, rivastigmina, donepezilo, y/o galantamina y otros fármacos y suplementos nutritivos tales como, por ejemplo, vitamina B 12, la cistedna, un precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acyetyl-L-carnitina, idebenona, propentofilina, o un derivado de xantina, junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente y las instrucciones para el tratamiento de enfermedades .
En una modalidad adicional, la composición según la invención puede comprender niacina o memantina junto con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente .
En todavía otra modalidad de las composiciones de la invención se proporcionan que comprenden "antipsicóticos atípicos", tales como, por ejemplo, clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol o la olanzapina para el tratamiento de los síntomas psicóticos positivos y negativos, incluyendo alucinaciones, delirios, trastornos del pensamiento (manifestado por una marcada incoherencia, descarrilamiento, tangencialidad) , y un comportamiento extraño o desorganizado, así como la anhedonia, afecto plano, apatía, y aislamiento social, junto con el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, y, opcionalmente , un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente y/o un excipiente.
Otros compuestos que se pueden utilizar adecuadamente en las composiciones, además del péptido de unión de acuerdo con la invención, son los descritos, por ejemplo, en el documento WO 2004/058258 (ver especialmente las páginas 16 y 17) que incluye los objetivos terapéuticos del fármaco (página 36-39) , ácidos alcanosufónicos y ácido alcanosulfúricos (páginas 39-51) , inhibidores de la colinesterasa (páginas 51-56) , antagonistas de receptores DA (páginas 56-58) , estrógenos (páginas 58-59) , fármacos antiinflamatorios no esteroideos (páginas 60 a 61) , antioxidantes (páginas 61-62) , receptores activados por proliferadores peroxisomas (PPAR) , agonistas (páginas 63-67) , agentes agentes de disminución de colesterol (páginas 68-75) , inhibidores de amiloide (páginas 75-77) , inhibidores de la formación de amiloide (páginas 77-78) , quelantes de metal (páginas 78-79) , antipsicóticos y antidepresivos (páginas 80-82) , suplementos nutricionales (páginas 83-89) y los compuestos que aumentan la disponibilidad de sustancias biológicamente activas en el cerebro (consulte las páginas 89 a 93) y profármacos (páginas 93 y 94) , cuyo documento se incorpora en el presente documento por referencia, pero especialmente los compuestos mencionados en las páginas indicadas anteriormente.
La materia activa farmacéuticamente proteaginoso puede estar presente en cantidades entre 1 ng y 10 mg por dosis. Generalmente, el régimen de administración debe estar en el rango de entre 0.1 µg y 10 mg del anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en un rango de 1.0 pg a 1.0 mg, y más particularmente en un rango de entre 1.0 µ? y 100 g con todos los números individuales que caen dentro de estos rangos también siendo parte de la invención. Si la administración se produce a través de la infusión continua de una dosis más adecuada puede estar en el rango de entre 0.01 g y 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por hora con todos los números individuales que caen dentro de estos rangos también siendo parte de la invención.
La administración será generalmente parenteralmente, por ejemplo por vía intravenosa o por vía subcutánea. Las preparaciones para administración parenteral incluyen acuosas estériles o soluciones no acuosas, suspensiones y emulsiones. Los disolventes no acuosos incluyen, sin limitarse a, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los solventes acuosos pueden ser seleccionados entre el grupo que consiste en agua, alcohol/soluciones acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados . Los portadores parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los portadores intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer) y otros. Los conservantes también pueden estar presentes, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc La composición farmacéutica puede comprender además portadores proteaginosos tales como, por ejemplo, albúmina de suero o inmunoglobulina, en particular de origen humano. Otros agentes biológicamente activos pueden estar presentes en la composición farmacéutica de la invención dependiente del uso previsto.
Cuando el objetivo de unión se encuentra en el cerebro, ciertas modalidades de la invención proporcionan el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, para atravesar la barrera sangre-cerebro . Ciertas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con un aumento en la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro, de tal manera que el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales o fragmentos activos del mismo se puede introducir fácilmente en el cerebro. Cuando la barrera sangre-cerebro permanece intacta, existen varias técnicas de aproximación conocidas transporte de moléculas a través de ella, incluyendo, pero no limitado a, métodos físicos, métodos basados en lípidos, y del receptor y los métodos basados en el canal.
Los métodos físicos de transporte del péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos del mismo a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, pero no se limitan a, eludir la barrera sangre-cerebro en su totalidad, o mediante la creación de aberturas en el barrera sangre-cerebro . Los métodos de elusión incluyen, pero no se limitan a, inyección directa en el cerebro (ver, por ejemplo, Papanastassiou et al, Gene Therapy 9:. 398-406 (2002)) y la implantación de un dispositivo de administración en el cerebro (ver, por ejemplo, Gilí et al, Nature Med 9: 589-595 (2003), y Gliadel obleas (TM) , Guildford Farmacéutica) . Los métodos de creación de aberturas en la barrera incluyen, pero no se limitan a, ultrasonido (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. N ° 2002/0038086) , presión osmótica (por ejemplo, mediante la administración de manitol hipertónico (Neuwelt, EA, Implicación de la barrera Sangre -cerebro y su manipulación, Vols 1 y 2, Plenum Press, Nueva York (1989)), la permeabilización por, por ejemplo, bradiquinina o permeabilizador A-7 (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Núms. 5,112 596, 5,268,164, 5,506,206, y 5,686,416), y la transfección de neuronas que se sitúan en la barrera sangre-cerebro con vectores que contienen genes que codifican el péptido de unión o fragmento de un antígeno de unión (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2003/0083299) .
Los métodos basados en lípidos de transporte del péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales , o un fragmento activo del mismo a través de la barrera sangre-cerebro incluyen, pero no se limitan a, encapsulando dsel péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento activo del mismo en liposomas que se conectan a los fragmentos activos de los mismos que unen a los receptores en el endotelio vascular de la barrera sangre-cerebro (ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente EE.UU. No. de publicación 20020025313) , y el recubrimiento del péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos del mismo en partículas de lipoproteínas de baja densidad (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 20040204354) o apolipoproteína E (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. No. de publicación 2004031692) .
Los métodos del receptor y los basados en canal de transporte del péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos del mismo a través de la barrera sangre- cerebro incluyen, pero no se limitan a, el uso de bloqueadores de glucocorticoides para aumentar la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. Núms. 2002/0065259, 2003/0162695, y 2005/0124533); la activación de los canales de potasio (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2005/0089473), inhibidores de transportadores de fármacos ABC (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente EE.UU. publicación No. 2003/0073713) ; el recubrimiento de anticuerpos con una transferrina y la actividad moduladora de uno o más receptores de transferrina (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2003/0129186), y la cationización de los anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5,004,697).
Las administraciones únicas o repetidas del péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento activo del mismo, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden proporcionar a un sujeto durante un período prolongado de tiempo. La duración de la administración puede ser de entre 1 semana y hasta 12 meses o más. Durante este tiempo el péptido, anticuerpo o composición farmacéutica de unión puede ser administrada una vez por semana, una vez cada dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, etc, o con una frecuencia mayor o menor dependiendo de las necesidades del sujeto a ser tratado.
En una modalidad adicional, la presente invención proporciona métodos y equipos para la detección y diagnóstico de enfermedades asociadas con la proteína tau, trastornos o condiciones, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas o trastornos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades neurodegenerativas o trastornos que incluyen las enfermedades o trastornos que manifiestan tanto patologías tau como de amiloide incluyendo, pero no limitado a, la Enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión, y la angiopatía amiloide cerebral de proteína prión, daño cerebral traumático y además de las enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta incluyendo, pero no limitado a, esclerosis lateral amiotrófica/complejo de Parkinsonismo demencia de Guam, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con granos argirófilos, degeneración corticobasal , ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, la enfermedad Hallevorden-Spatz , atrofia sistémica múltiple, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, la degeneración Pallido-ponto-nigral, la enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, la demencia sólo con ovillos de panencefalitis esclerosante subaguda, el Parkinsonismo postencefálico, la distrofia miotónica. Las anormalidades patológicas pueden ser causadas por, o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares , la patología cerebral predominante en la tauopatía.
Además, la presente invención proporciona métodos y equipos para el diagnóstico de una predisposición a enfermedades asociadas a la proteína tau, trastornos o condiciones, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas o trastornos tales como tauopatías que incluyen enfermedades o trastornos que muestran ambas comanifestaciones patologías tau y amiloide, o para el seguimiento de la enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición según la invención y como se describe en el presente documento. Estos métodos incluyen métodos inmunológicos conocidos comúnmente utilizados para la detección o la cuantificación de sustancias en muestras biológicas o en una en condiciones in situ.
El diagnóstico de una enfermedad o condición asociada a la proteína tau o de una predisposición a una enfermedad asociada a la proteína tau o condición en un sujeto en necesidad del mismo, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, incluyendo enfermedades neurodegenerativas o trastornos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedades o trastornos que se manifiestan tanto en patologías de amiloide y tau, se puede lograr detectando la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo del mismo, a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye poner la muestra o un área de la parte específica del cuerpo o área del cuerpo que se sospecha que contiene la proteína tau en contacto con un anticuerpo que se une a un epítopo de la proteína tau, permitiendo que el anticuerpo se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico, la detección de la formación del complejo inmunológico y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, comparar opcionalmente la cantidad de complejo inmunológico a un valor de control normal, en el que un aumento en la cantidad de complejo inmunológico en comparación con un valor de control normal indica que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o condición asociada a la proteína tau.
El monitoreo de enfermedad mínima residual en un sujeto, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, después del tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención, que incluye anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos del mismo, o una composición de acuerdo con la invención puede lograrse mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión de la invención, en particular de un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in si tu, que incluye poner la muestra o una parte específica del cuerpo o área del cuerpo que se sospecha que contiene la proteína tau en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, que se une a un epítopo de la proteína tau, permitiendo que el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, para unirse a la proteína tau para formar un complejo inmunológico, la detección de la formación del complejo inmunológico y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte del cuerpo específica o área, comparando opcionalmente la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal, en el que un aumento en la cantidad de dicho complejo inmunológico compara con un valor de control normal que indica que el sujeto puede todavía sufrir de una enfermedad residual mínima.
La predicción de la capacidad de respuesta de un sujeto, particularmente un mamífero, más particularmente un humano, a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención puede lograrse mediante la detección de la unión inmunoespecífica de un péptido de unión, en particular de un anticuerpo monoclonal o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que incluye poner la muestra o una parte específica del cuerpo o área del cuerpo que se sospecha que contiene la proteína tau en contacto con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, que se une a un epítopo de la proteína tau, permitiendo que el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, paarticularmnete anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, a unirse a la proteína tau para formar un complejo inmunológico, la detección de la formación del complejo inmunológico y correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia de la proteína tau en la muestra o parte del cuerpo específica o área, comparar opcionalmente la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento, en el que una disminución en la cantidad de dicho complejo inmunológico indica que dicho paciente tiene un alto potencial de ser sensible al tratamiento.
Las muestras biológicas que pueden utilizarse en el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada a la proteína tau, para el diagnóstico de una predisposición a una enfermedad o condición asociada a la proteína tau, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas o trastornos tales como tauopatías que comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades neurodegenerativas o trastornos incluyendo enfermedades o trastornos que se manifiestan tanto en patologías tau y amiloide, o para el seguimiento de la enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención y como se describe en el presente documento son, por ejemplo, fluidos tales como suero, plasma, saliva, secreciones gástricas, moco, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático y similares o las muestras de tejido o de células obtenidas de un organismo tal como neuronal , cerebro, tejido cardíaco o vascular. Para la determinación de la presencia o ausencia de la proteína tau en una muestra, cualquier inmunoensayo conocido por los expertos normales en la técnica puede ser utilizado tal como, por ejemplo, ensayos que utilizan métodos de detección indirecta utilizando reactivos secundarios para la detección, ensayos ELISA e inmunoprecipitación y aglutinación. Una descripción detallada de estos ensayos es, por ejemplo, dado en Harlow y Lañe, Anticuerpos: A Manuel de laboratorio (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988 555-612, WO96/13590 a Maertens y Stuyver, Zrein et al, (1998) y WO96/29605.
Para el diagnóstico in situ, el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, de la invención o cualquier parte activa y funcional de la misma puede administrarse al organismo a ser diagnosticado por métodos conocidos en la técnica, tales como , por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, inyección intraarterial de tal manera que se puede producir una unión específica entre un anticuerpo de acuerdo con la invención con una región eptitópica en la proteína amiloide. El complejo péptido/antígeno de unión puede convenientemente ser detectada a través de una etiqueta unida al péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, o un fragmento funcional del mismo o cualquier otro método conocido en la técnica de detección.
Los inmunoensayos utilizados en aplicaciones de diagnóstico o en aplicaciones para diagnosticar una predisposición a una enfermedad o condición asociados a la proteína tau, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas o trastornos tales como tauopatías que comprenden un grupa heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedades o trastornos que se manifiestan tanto en patologías tau y amiloide, o para el seguimiento de la enfermedad residual mínima en un paciente o para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento con un péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y los fragmentos activos de los mismos, o una composición de acuerdo con la invención y como se describe en el presente documento normalmente se basan en antígenos marcados, péptidos de unión, o reactivos secundarios para la detección. Estas proteínas o reactivos se pueden marcar con compuestos generalmente conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo enzimas, radioisótopos, y fluorescentes, sustancias luminiscentes y cromogénicas incluyendo, pero no limitado a partículas de color, tales como oro coloidal y perlas de látex. De éstos, el etiquetado radiactivo puede ser utilizado para casi todos los tipos de ensayos y con la mayoría de las variaciones. Las etiquetas conjugado con enzima son particularmente útiles cuando la radioactividad debe evitarse o cuando se necesitan resultados rápidos. Los fluorocromos, aunque requiere un equipo costoso para su uso, proporcionan un método muy sensible de detección. Los péptidos de unión útiles en estos ensayos son los divulgados reivindicados en el presente documento incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, y anticuerpos monoclonales purificados con afinidad.
Alternativamente, el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, puede etiquetarse indirectamente mediante reacción con sustancias etiquetadas que tienen afinidad para la inmunoglobulina, tales como proteina A o G o anticuerpos segundos. El péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, puede conjugarse con una segunda sustancia y detectarse con una tercera sustancia etiquetada que tiene una afinidad por la segunda sustancia conjugada al anticuerpo. Por ejemplo, el péptido de unión de acuerdo con la invención, incluyendo anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales y fragmentos activos de los mismos, pueden conjugarse con biotina y el conjugado de péptido de unión / biotina detectado usando avidina o estreptavidina etiquetada. Del mismo modo, el péptido de unión puede estar conjugado a un hapteno y el péptido de unión/hapteno conjugado detectado usando péptido de unión anti-hapteno etiquetado.
Aquellos expertos en la técnica conocerán de estos y otras etiquetas adecuadas las cuales pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. La unión de estas etiquetas a los péptidos de unión o fragmentos de los mismos se puede lograr utilizando técnicas estándares comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas normales se describen por Kennedy, JH, et al "1976 (Clin. Chim.Acta 70: 1-31), y Schurs, A.H.W.M., et al.1977 (Clin. Chim Acta 57:1-40). Las técnicas de acoplamiento mencionadas en esta última son el método del glutaraldehído, el método del peryodato, el método de dimaleimida, y otros, todos los cuales se incorporan por referencia en el presente documento .
Los inmunoensayos actuales utilizan un método de doble anticuerpo para detectar la presencia de un analito, en donde, el anticuerpo está etiquetado indirectamente por la reactividad con un segundo anticuerpo que se ha etiquetado con una etiqueta detectable . El segundo anticuerpo es preferiblemente uno que une los anticuerpos del animal del que se deriva el anticuerpo monoclonal. En otras palabras, si el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de ratón, a continuación, el segundo anticuerpo etiquetado es un anticuerpo anti ratón. Para el anticuerpo a ser utilizado en el ensayo descrito en el presente documento, esta etiqueta es preferiblemente una perla de anticuerpos recubiertos, particularmente una perla magnética. Para el anticuerpo a ser empleado en el inmunoensayo descrito en el presente documento, la etiqueta es preferiblemente una molécula detectable tal como una sustancia radiactiva, fluorescente o electroquimioluminiscente .
Un sistema de doble anticuerpo alternativa, a menudo se refiere a sistemas de formato rápido, ya que se adaptan a las determinaciones rápidas de la presencia de un analito, también se pueden emplear dentro del alcance de la presente invención. El sistema requiere de una alta afinidad entre el anticuerpo y el analito. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la presencia de la proteína amiloide se determina usando un par de anticuerpos, cada uno específico para la proteína amiloide. Uno de dichos pares de anticuerpos se denominan en este documento como un "anticuerpo detector" y el otro de dicho par de anticuerpos se denomina en el presente documento como un "anticuerpo de captura" . El anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede utilizar ya sea como un anticuerpo de captura o un anticuerpo detector. El anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede utilizar tanto como un anticuerpo de captura y detector, juntos en un único ensayo. Una modalidad de la presente invención por lo tanto utiliza el método de doble anticuerpo intercalado para la detección de proteína amiloide en una muestra de fluido biológico. En este método, el analito (proteína amiloide) se intercala entre el anticuerpo detector y el anticuerpo de captura, el anticuerpo de captura está inmovilizado de forma irreversible sobre un soporte sólido. El anticuerpo detector contendría una etiqueta detectable, con el fin de identificar la presencia de un anticuerpo-analito intercalado y por lo tanto la presencia del analito.
Las sustancias ejemplares en fase sólida incluyen, pero no se limitan a, placas de microtitulación, tubos de ensayo de poliestireno, perlas magnéticas, plásticas o de vidrio y las diapositivas que son bien conocidas en el campo del radioinmunoensayo y el inmunoensayo enzimático. Los métodos para conectar anticuerpos a fases sólidas también son bien conocidos por los expertos en la técnica. Más recientemente, un número de material poroso tal como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos han sido empleados como soportes sólidos.
La presente invención también se refiere a un equipo para detectar la proteína tau en una muestra biológica que comprende una composición como se definió anteriormente. Además, la presente invención se refiere al último equipo de diagnóstico, además de una composición como se definió anteriormente, también comprende un reactivo de detección como se define anteriormente. El término "equipo de diagnóstico" refiere en general a cualquier equipo de diagnóstico conocido en la técnica. Más específicamente, este último término se refiere a un equipo de diagnóstico como se describe en Zrein et al. (1998) .
Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar nuevos immunopruebas y equipos de prueba para la detección y diagnóstico de enfermedades y condiciones asociadas a la proteína tau, que comprenden péptidos de unión de acuerdo con la presente invención. Para las immunopruebas, los péptidos de unión están directa o indirectamente unidos a una molécula informativa adecuada, por ejemplo, una enzima o un radionúclido . El equipo de prueba incluye un contenedor que contiene uno o más péptidos de unión de acuerdo con la presente invención y las instrucciones para el uso de los péptidos de unión para el propósito de unión al antígeno tau para formar un complejo inmunológico y la detección de la formación del complejo inmunológico de tal manera que la presencia o ausencia del complejo inmunológica se correlaciona con la presencia o ausencia de la protelna tau.
EJEMPLOS Ej emplo 1 : Generación y selección de hibridomas y anticuerpos El objetivo de este estudio fue generar y seleccionar mAbs anti-Tau (anticuerpos monoclonales) . Los hibridomas fueron generados por la fusión de las células esplénicas del ratón inmunizado con la vacuna tau con una línea célular de mieloma. Los hibridomas se evaluaron para la reactividad contra ambas proteínas Tau de extensión completa fosforilada y no fosforilada, así como los péptidos antigénicos Tau fosforilados y no fosforilados utilizados en la preparación de la vacuna. La selección del hibridoma se realizó también para la reactividad de hibridomas sobrenadantes para ovillos tau usando inmunoquímica rebanadas de cerebro de ratón transgénico Tau. 1.1 Métodos 1.1.1 Fusión Un ratón de tipo salvaje C57BL/6 vacunado con ACI-35 (Tau393-408 [pS396, pS404] ) se utilizó para la producción de hibridoma. El ratón fue reforzado con vacuna de ACI-35 en el día 0 y luego de nuevo el día 4 y la fusión se realizó en el día 7.
Los esplenocitos 6 xlO7 (ACI-35) , del ratón inmunizado se fusionaron con células mieloma 2 x 107 SP2-0-Agl4 en un índice de 3 esplenocitos/1 célula mieloma.
Las fusiones resultaron en 8x96 placas de pocilios y los clones fueron nombrados de acuerdo a la placa (1-8) después, la fila (A-G) y finalmente la columna (1-12) . 1.1.2 Método de selección para seleccionar clones Las placas de pocilios 8x96 fueron seleccionados primero dos veces para la expresión de IgG. Los clones que expresan positivos se transfirieron a 24 placas de pocilios y sobrenadantes celulares (= clones) de células de crecimiento fueron probados en una selección de ELISA Tau y una selección TAUPIR inmunohistoquímica. Los sobrenadantes positivos en ELISA y/o TAUPIR se transfirieron a matraces T25 y los clones se seleccionaron de nuevo para la expresión de IgG en la selección de ELISA Tau y la selección TAUPIR.
Selección IgG Las placas ELISA (Costar, Sigma) se recubrieron con 50 µ| /pocilio de anticuerpo IgG de anti-ratón (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemania) en un tampón de recubrimiento durante 16 horas a 4°C. Después de lavar las placas con PBS/Tween, los pocilios se bloquearon con 100 µ| /pocilio de solución de bloqueo durante l hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes de hibridoma sin diluir (50 µ| por pocilio) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente . Después de un lavado, una mezcla de peroxidasa de rábano picante (HRP) IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, o IgM (AbD Serotec) antiratón conjugado se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final, la detección se realizó con sustrato de HRP (TMB; 3-3', 5 , 5 ' -tetrametilbenzidina) , y las placas se leyeron a 405 nm utilizando un lector de microplacas . Los resultados se expresan como densidad óptica (O.D. ) . 1.1.4 Selección ELISA Tau Hibridomas La selección ELISA Hibridomas se realizó en un péptido pTau (ACI-35, T3.5: Tau393 -408 [pS396/pS404 ; Laboratorios Polipéptido, Hillersid, Dinamarca) , el correspondiente no fosforilado de péptido Tau (T3.6: Tau393-408, Laboratorios polipéptido) , fosforilado de extensión completa (441aa) la proteína Tau ( proteína pTau, Vandebroek et al, 2005) y proteína Tau (441aa) de extensión completa (proteína Tau , SignalChem, Richmond, Canadá) . Finalmente la albúmina de suero bovino (BSA) se utilizó como control negativo .
Las placas fueron recubiertas con 10 ug/ml de péptido Tau correspondiente y l ug/ml de la proteína Tau correspondiente durante la noche a 4°C. Después de lavar cada pocilio con PBS-0.05% de Tween 20 y el bloqueo con 1% de BSA en PBS-0.05% de Tween 20, sobrenadante de hibridoma sin diluir o control negativo medio se añadieron a las placas y se incubó a 37°C durante 2 horas. Después de lavar las placas fueron incubadas con fosfatasa alcalina (AP) -conjugada IgG anti-ratón de anticuerpos totales (Laboratorios Jackson, Baltimore, PA, EE.UU.) durante 2 horas a 37°C. Después de lavar las placas se incubaron con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato) , el sustrato de fosfatasa para AP, y se leyó a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como O.D. (densidad óptica) . 1.1.5 Selección de hibridomas IHC: La unión de anticuerpos anti-Tau de ovillos en secciones de cerebro ratones transgénicos (TAUPIR) Los experimentos TAUPIR se realizaron según protocolo del Ej emplo 3.1.2. 1.1.6. Selección igG matraces T25 Las placas de ELISA se recubrieron con 5ug/ml de igG anti-ratón F (ab')2 fragmento de anticuerpo específico (Laboratorios Jackson, Baltimore, PA, EE.UU.) en el recubrimiento de carbonato-bicarbonato de tampón pH 9.6 (Sigma, Buchs, Suiza) durante la noche a 4°C. Después de lavar los platos, sobrenadante de hibridoma sin diluir, anticuerpos IgGl de control positivo (6E10 a lug/ml : Covance, Emeryville, CA, USA) o de control negativo (sólo medio cultivo) se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, la cabra AP-conjugada secundaria anti-ratón IgG (subclases l+2+a+2b+3) fragmento FCY de anticuerpo específico (Laboratorios Jackson, Baltimore, PA, EE.UU.) se incubó en las placas durante 2 horas a 37°C. Después de un lavado final, la detección se realizó con pNPP (para-nitro-fenil-fosfato) , el sustrato de fosfatasa para AP, y las placas se leyeron a 405 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados se expresan como O.D. (densidad óptica) . 1.2 Resultados Los sobrenadantes de las células de las placas de pocilios 8x96 resultantes de la fusión se seleccionaron para la producción de IgG. Fuera de 768 pocilios (8x96 pocilios) evaluados, se seleccionaron 48 pocilios positivos para la producción de IgG en base a la mejor unión a la vacuna fosfo-péptido, y la fosfo-Tau de extensión completa. La selección se basa en la unión del péptido y la proteina fosfo-Tau de extensión completa por ELISA, y también a la selectividad cuando se compara con la proteína Tau no-fosfo-péptido y no fosfo de extensión completa. 24 hibridomas seleccionados se subclonaron mediante la siembra de 2 platos por hibridoma a 1 célula/pocilio y 1 placa a 0.5 células/pocilio. Los sobrenadantes se probaron de nuevo para la unión a fosfo-péptido y fosfo-proteína para verificar el perfil de unión, después de lo cual se evaluó la estabilidad en un cultivo de 6 semanas . Ocho clones estables se seleccionaron y se probaron para la isotipificación, y la unión usando ELISA y TAUPIR como se describe en los Métodos. 1.3. Conclusión Los anticuerpos generados han demostrado una alta especificidad para péptidos pTau con sólo unión marginal a los péptidos no fosforilados .
Se seleccionaron un total de 8 clones para su posterior subclonación y se secuenciaron (ver Tabla 6 y Tabla 7) y 6 clones fueron depositados en DSMZ (ver Tabla 10) .
Los clones madre positivos mencionados anteriormente se cultivaron además en 96 placas de pocilios, después, 24 placas de pocilios y finalmente matraces T25. En cada etapa, los sobrenadantes de los clones de hibridoma se seleccionaron mediante ELISA, Taupir y Western Blot.
Ejemplo 2: La clonación de las regiones variables de la cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo Los genes de la región variable pesada y ligera de un anticuerpo de las células de hibridoma se clonan y las secuencias de ADN y la ubicación de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) , determinado, así como los anticuerpos que unen características.
El RNA total se preparó a partir de 3xl06 células de hibridoma (1 vial) utilizando el mini equipo Qiagen R easy (Cat. NO: 74104). El RNA se eluyó en 50 uL de agua y verificado en un gel de agarosa al 1.2%.
La VH y VK cADNs se prepararon usando la transcriptasa inversa con IgG y los iniciadores de región constante kappa. La primera cadena de cDNAs fueron amplificadas por la PCR usando un gran conjunto de iniciadores de secuencia de señales. Los ADNs amplificados se purificaron en gel y se clonó en el vector pGEM® T Easy (Promega) . Los clones VH y VK obtenidos se seleccionaron para insertos del tamaño esperado. La secuencia de ADN de los clones seleccionados se determinó en ambas direcciones por secuencia automática de ADN. Las localizaciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en las secuencias se determinaron con referencia a otras secuencias de anticuerpos (Kabat EA et al /., 1991).
Ejemplo 3: Estudios de unión I El objetivo era medir la fosfo-Tau (pTau) de unión de los anticuerpos generados a partir de hibridomas subclonados derivados de ratones inmunizados con las vacunas liposomales tau. Para probar esto, se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para medir la unión de los anticuerpos purificados a proteínas -Tau de extensión completa tanto fosforilada y no fosforilada, así como los péptidos antigénicos Tau fosforilados y no fosforilados utilizados para la preparación de la vacuna liposomal.
La selección se completó con otros dos métodos. La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en secciones de cerebro de un animal transgénico Tau (TAUPIR) utilizando un anticuerpo anti-tau como el anticuerpo primario. Adicionalmente, se realizó una western blot (WB) en homogeneizados de proteínas de cerebro de ratones transgénicos Tau, utilizando un anticuerpo anti-tau como el anticuerpo de transferencia. 3.1 Métodos 3.1.1. ELISA: Ensayo de unión fosfo-Tau Para probar la unión de los anticuerpos purificados a Tau y pTau, se utilizó un ensayo ELISA.
Brevemente, Nunc axiSorp 96 placas de pocilios (Nunc, Rosktlde, Dinamarca) se recubrieron con 1 pg/mL de extensión completa (441 aa) proteína Tau (SignalChem, Richmond, Canadá) o extensión completa fosforilada (441 aa) proteína Tau (Vandebroek et al., 2005). Además, las placas se recubrieron con 10 ug/mL del péptido de la vacuna derivada-Tau, Tau393-408 (fosforilada o no en S396 y S404) . Para la prueba de reactividad cruzada a Tau y secuencias de diferentes epítopos pTau que no se utilizaron en la preparación de vacuna Tau y ptau, las placas se recubrieron con 10 g/mL de los siguientes péptidos:, Tau393-408 (fosforilada o no en S396 y S404), El recubrimiento se realizó durante la noche en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4°C. Las placas se lavaron a fondo con 0.05% Tween20/PBS y luego se bloquearon con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en 0.05% Tween20/PBS durante 1 hora a 37°C. El anticuerpo que está siendo probado después, se añadió en una dilución 8 ó 16 doble serie entre 20 y 0 µ?/mL, y se pemitió incubar durante 2 horas a 37°C. Las placas se lavaron a continuación como se ha descrito anteriormente, y la IgG anti-ratón conjugada -AP anticuerpo secundario (Jackson Laboratorios de inmunoinvestigación, Suffolk, Inglaterra) se añadió a 1/6000 de dilución en 0.05% Tween20/PBS durante 2 horas a 37°C. Después de lavar, las placas se incubaron con p-nitrofenil fosfato disódico hexahidrato (pNPP, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) solución de sustrato de fosfatasa, y se leyó a 405 nm después de 30 min, los tiempos de incubación 1, 2 ó 16 hrs. utilizando un lector de placas ELISA. 3.1.2. TAÜPIR y Western-blots : La unión del anticuerpo anti-Tau a ovillos Tau en secciones del cerebro de un animal transgénico Tau (TAUPIR) Para la tinción TAUPIR, secciones de cerebro de ratones fueron de ratones TLPH (ratones transgénicos que expresan la isoforma más larga (441aa) de hTaup301L) , Edad (> 18 meses) doble transgénico biGT (GSK-3 ratones transgénicos cruzados con TPLH) ratones y doble biAT transgénico (hAPPV7171 ratones transgénicos cruzados con TPLH) ratones. Como control negativo, las secciones de los ratones knock-out Tau (TKO, 6 meses de edad) fueron utilizados. Las secciones del cerebro se lavaron durante 5 min en PBS y luego se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en 1.5% H202 en PBS: MeOH (1:1) para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Después de lavar las secciones 3 veces con PBST (PBS/0.1% TritonXlOO) que se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en PBST + 10% de FCS (suero de ternera fetal) solución de bloqueo. La incubación con el anticuerpo anti-Tau que está siendo probada se llevó a cabo durante la noche a 4°C usando las siguientes concentraciones de anticuerpos: ACI-35-2Al-Abl a 0.0053 ug/mL, ACI-35-2Al-Ab2 a 0.0048 g/mL, ACI-35-4A6-Abl a 0.015 ug/mL, ACI-35-1D2-AB1 en 0.0047 g/mL, ACi-35-2G5-Abl a 0.0055 ug/mL, y ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 a 0,01 µg/mL en PBST/10% de FCS. Las secciones después se lavaron 3 veces con PBST antes de la incubación con un conjugado HRP de cabra anti-ratón (comprado de Dako, Glostrup, Dinamarca) anticuerpo secundario en PBST/10% de FCS durante 1 hora a TA.
Antes de la detección, las secciones se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron en 50 mM Tris/HCI pH7.6 durante 5 min. La detección se realizó por incubación de las secciones durante 3 min en Diaminobenzidina (DAB: 1 tableta en 10 mi 50 mM. Tris.HCl + 3 µ? H202 30%; MP Biomedicals, Solón, OH, EE.UU.).
La reacción se detuvo lavando las secciones 3 veces en PBST. Las secciones fueron después transferidas sobre placas silanizadas de vidrio y se secó al aire en una placa caliente a 50°C durante 2 horas. La contratinción se realizó mediante la incubación con hematoxilina Mayers (Fluka Chemie, Buc s, Suiza) durante 1 min, seguido de una etapa de lavado durante 4 min en el chorro de agua. Las secciones se deshidrataron mediante el paso en 50%, 70%, 90% y dos veces en 100% de baño de etanol a continuación en xilol 2 veces durante 1 min. Finalmente las secciones fueron montadas con DePeX (BDH Chemicals Ltd., Poole, Inglaterra) bajo placas para cubrir de vidrio para imágenes.
La tinción adicional (Western-blot) se llevó a cabo en SDS-PAGE (10%) proteínas de homogeneizadas de cerebro separadas de ratones de tipo salvaje (FVB) ratones transgénicos Tau (TPLH y biGT) o ratones knock-out Tau (TKO) . Para Western blot, se utilizaron anticuerpos en las siguientes concentraciones: ACI-35-2Al-Abl a 0.53 µ?/mL, ACI-35-2Al-Ab2 a 0.48 ug/mL, ACI-35-4A6-Abl a 0.5 yg/mL. ACI-35-1 D2-A l a 0.47 yg/mL, de ACI-35-2G5-Abl a 0.55 yg/mL, ACI-35-2G5-Ab2 a 0.33 ug/mL, y ACI-35-2G5-Ab3 en 0.5 pg/mL. 3.2 Resultados Los anticuerpos ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-2Al-Ab2 , ACI-35-1 D2-A l, ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 demostraron alta actividad de unión y especificidad a la proteína Tau humana fosoforilada (Tabla 2) , más específicamente al péptido fosfo-Tau antigénico usado en la vacuna correspondiente. No se observó reactividad cruzada a Tau no fosforilada, o a otros péptidos probados derivados de Tau fosforilados y no fosforilados . El anticuerpo de ACI-35-4A6-Abl, como por su selección, muestra alta actividad de unión sólo para el péptido antigénico fosfo-Tau utilizado en la preparación de vacuna. La baja reactividad cruzada se encontró que la contraparte no fosfo del péptido antigénico usado en la preparación de vacuna que se esperaba sobre la base de la selección de clones. El anticuerpo de ACI-35-2G5-Abl, muestra alta actividad de unión sólo para el péptido fosfo-Tau antigénico utilizado en la preparación de vacuna. Una pequeña reactividad cruzada se observó al fosfo-péptido T4.5, que comprende parte de la secuencia de péptido antigénico usado en la vacuna.
TAUPIR y WBs fueron utilizados para observar la unión a ovillos Tau en los cerebros de ratones con tauopatía avanzada (biGT > 18 meses) , y al Tau de etensión completa en los homogeneizados desnaturalizadas derivados de estos ratones. Se analizaron diferentes regiones del cerebro: la corteza y CAI, CA3 y giro dentado (DG) parte del hipocampo. Los anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl y ACI-35-2Al-Ab2 muestran los mejores resultados de TAUPIR con una tinción citoplásmica densa y las hebras de neurópilos claros, especialmente en las regiones CAI y CA3 del hipocampo. Los anticuerpos ACI-35-4A6-Abl fueron negativos en TAUPIR con sólo ovillos esporádicos borrosos como las estructuras ligeramente teñidas . Los anticuerpos ACI-35-1 D2-Abl mostró una buena tinción citoplasmática TAUPIR con hebras de neuropilo en la región CAI. Los anticuerpos ACI-35-2G5-Abl fueron negativos en TAUPIR con tinción nuclear y sólo algunos ovillos teñidos. Por último, los anticuerpos de ACI-35-2G5-Ab2 y ACI-35-2G5-Ab3 muestran buena tinción citoplásmica TAUPIR similar con las hebras de neuropilo observados en el CAI y CA3 del hipocampo. El índice de la calidad de la tinción utilizando signos + o - se muestra en la Tabla 2. Los cerebros homogeneizados de ratones transgénicos Tau fueron borrados, lo que demuestra que todos los anticuerpos ligados a pocilios para esperar a bandas Tau (Tabla 2, valorado como +) , con ACI-35-1 D2-Abl y ACI-35-2G5-Abl que también muestra adicional unión no específica (-/+) .
Ejemplo 4; Estudios de unión II 4.1 Métodos 4.1.1 Ensayo de unión SPR Todos los experimentos de SPR se llevaron a cabo en un instrumento Biacore X (GE Healthcare) . El chip sensor SA (estreptavidina derivatizada carboximetil dextrano) se adquirió de GE Healthcare. El tampón de migración era PBS (PBS, Sigma D8537 de Dulbecco) . No covalentemente ligado a la estreptavidina se eliminó en primer lugar a partir de la superficie del sensor mediante la inyección de 8 pulsos (cada ~1 µ? de 16 mM NaOH(ac) . A continuación, un péptido fosfo-tau se solubilizó en PBS para dar una concentración final de péptido de 1 µ? y luego se inyecta (35 µ?.) sobre la célula de flujo (fe) 2 del chip sensor a 5 pL/min. Después del acoplamiento, se obtuvo un nivel de inmovilización definitiva de 130 RUs. Para estudiar la unión de los anticuerpos a la superficie del chip, varias concentraciones de anticuerpos se prepararon por diluciones en serie de 2 veces con tampón de migración. Las inyecciones se realizaron tanto sobre fe 1 y 2 a una índice de flujo de 50 µ?,/t??? durante 120 s. La célula de flujo 1 no fue derivado y respuestas de fe 1 se restará de fe 2 para corregir el ruido del instrumento y los cambios refractivos del volumen. Después de cada inyección, las superficies se lavaron inmediatamente con un tampón de migración de 100 s. Para eliminar cualquier anticuerpo unido restante del chip, la regeneración de la superficie se realizó mediante la inyección de 1 µL de 10 mM de glicina-HCl pH 1.7. Los análisis cinéticos se realizaron utilizando algoritmos para la integración numérica y el análisis global usando BIAevaluación 3.0. Los sensogramas obtenidos para las inyecciones de anticuerpo a diferentes concentraciones se cubrieron y las líneas de base se ajustaron a cero. Para el ajuste de curvas, todos los datos se ajustaron simultáneamente a un 1:1 modelo homogéneo (Langmuir) .
Los péptidos usados T3.3 Biotina-LC unión lot MI89P9-P12-2 (64% puro) 0 GVYKS [P03H2] PWSGDTS [PO lot MI89P9-P12-3 (87% puro) 3H2] PRHL-NH2 4.2 Resultados La unión de los anticuerpos anti-tau al péptido Tau fosforilado se controló en tiempo real usando SPR. Los análisis de las fases de asociación y disociación de la unión de anticuerpos se podrían utilizar para determinar el índice constante de asociación (ka) , el índice constante de disociación (kd),así como la constante de disociación KD.
Se encontró que todos los anticuerpos de unirse específicamente al péptido T3.30 sobre la superficie de dextrano de carboximetilo no derivatizado en el rango de 46 -> 734 nM de anticuerpo analizado (ó 11.5-> 184 nM para ACI-35-4A6-Abl) . Los análisis cinéticos de los sensogramas revelaron la constante de disociación KD para la interacción de unión entre los diferentes anticuerpos y T3.30 a ser entre 2 y 82 nM. Esto por lo tanto demuestra que los anticuerpos reconocen el T3.30 fosfopéptido con muy alta afinidad (Tabla 3) .
Ejemplo 5: Estudios de unión III ELISA en muestras de cerebro humano (ELISA para la detección de multímeros de Tau fosforilada) 5.1 Métodos 5.1.1. Las muestras humanas: La preparación de muestras de cerebros humanos utilizados para los ensayos descritos aquí La corteza post-mortem temporal para diez de la enfermedad de Alzheimer (EA) y diez controles de la misma edad se obtuvieron del Banco de Donación de Cerebros de la Universidad de Miami. La edad media de muerte para los pacientes con EA (siete mujeres y tres varones) fue 81.1 + 7.3 años y para los controles (libres de síntomas neurológicos; nueve hembras, un macho) fue de 87.0 ± 5.8 (no significativamente diferente de los pacientes EA por una prueba T student) . Todas las muestras eran de origen caucásico. Las muestras de EA se caracterizaron por la etapa de la enfermedad Braak (Braak y Braak (1991) Etapas neuropatológicas de los cambios relacionados con el Alzheimer. Acta Neuropatol 82:239-259) como se muestra en la Tabla 4.
La corteza post-mortem temporal por diez EA y diez controles de la misma edad se homogeneizaron de acuerdo con el siguiente protocolo. Los fragmentos del cerebro de pesaron y homogeneizaron en 9 volúmenes de 25 mM de Tris-HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de EGTA que contenía inhibidores de fosfatasa (30 mM NaF, 0.2 mM de Na3V04 , 1 nM ácido okadaico, 1 mM de PMSF, 5 mM de Na4P207) y los inhibidores de la proteasa (Complete Mini, Roche, Suiza) . La homogeneización se realizó en hielo usando un potter de vidrio. Esto constituye la fracción total de homogeneizado (TH) . Las concentraciones de proteína se midieron usando reactivo de Bradford (Sigma) . 5.1.2. Configuración 1 ELISA: Configuración 1 ensayo de ELISA para detectar la presencia de multímeros de Tau fosforilada en un homogeneizado de cerebro cortical post-mortem humano de las personas afectadas por EA y los controles de la misma edad 96 placas de pocilos de múltiples niveles se recubrieron con anticuerpos durante la noche a 4°C a 5 yg/ml en un tampón de carbonato/bicarbonato. Después de 4 lavadas en PBS-Tween, las placas se saturaron con PBS-Tween 10% de BSA durante 1 hora a 37°C. Los homogeneizados de cerebro se añadieron a continuación a los pocilios a una concentración de 100 nq/\i en 50 iL PBS, y se incubaron durante 2 horas a 37°C a una concentración final de 5 pg/mL. Se lavaron las placas y después de añadir avidinperoxidasa (equipo Vectastain ABC, Vector Laboratories) y su sustrato (ABTS, Roche 10881420) las placas se leyeron a diferentes puntos de tiempo. Los valores se expresan con significado de OD +SD para 10 AD y 10 sujetos control. 5.2 Resultados Los anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl y ACI-35-2G5-Ab3 fueron probados por su capacidad para detectar fosfoTau (pTau) multímeros en homogeneizados de cerebro de EA y de sujetos de control, utilizando un fosfo-y-multímero de configuración específica 1 de ELISA. Se observó una diferencia altamente significativa (p <0.001) entre EA y los controles de la misma edad (n=10) en este ensayo para ambos anticuerpos (Figura l) . Usando homogeneizados corticales post mortem humanos de EA y el cerebro de control de la misma edad, se demostró la capacidad de los anticuerpos anti-pTau ACI-35-2Al-Abl y ACI-35-2G5-Ab3 para detectar multímeros de Tau-pS396 en las mustras de cerebro humano post- mortem.
Ejemplo 6: Estudios de unión IV - Western-blots en muestras de cerebro humano. 6.1 Métodos 6.1.1. Las muestras humanas : el mismo método para la preparación de muestras humanas, como se describe en el Método 5.1.1. 6.1.2. Western-blots : El ensayo de Western-blot para detectar la presencia de Tau fosforilada en homogeneizados de cerebro cortical post-mortem humanos de las personas afectadas por EA y los controles de la misma edad Los anticuerpos Tau anti-humanos utilizados en este estudio fueron el ratón de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-1 D2-Abl, y ACI-35-2G5-Ab3 , todos dirigidos contra Tau-pS396.
El anticuerpo TAU-13 monoclonal del ratón (Abcam ab24636) dirigido contra la Tau humana total, y el E178 anticuerpo monoclonal de conejo dirigido contra la Tau-pS396 (Abcam ab32057) se utilizaron como controles. 20 µg de cada homogeneizado total se carga por carril de sobre 10% poliacrilamida en un gel de Bis-TRIS prefabricado (NuPAGE Novex 10% Bis-TRIS Midi Gel, Invitrogen) . Las proteínas fueron resueltas como se recomienda por el fabricante en NuPAGE MOPS SDS tampón de migración (Invitrogen NP0001) . La transferencia de proteínas se llevó a cabo durante 3 horas en 25 mM TRIS pH 8.6, 190 mM de tampón de Glicina, 20% de metanol, en el hielo en membranas de PVDF (Immobilon-FL, Millipore IPFL00010) . Las membranas fueron bloqueadas durante 1 hora en el tampón de bloqueo Licor (Odyssey) diluido 1/3 en PBS . Las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios a las siguientes concentraciones: TAU-13 a 0.6 ug/mL, E178 diluido 1/5000, de ACI-35-2Al-Abl a 0.53 g/mL, ACI-35-1 D2-Abl en 0.47 g/mL, y ACI -35-2G5-Ab3 a 0.5 pg/mL, diluido 1/3 en tampón de Licor y 2/3 de PBS con 0.1% de Tween-20 (PBS-T) . Después de 4 lavadas en PBS-T, las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-ratón de cabra acoplada con el LICOR 800 colorante (de cabra anti-ratón IRDye 800 CW, Odyssay) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo 4 veces con PBS-T, y escaneado de para reproducción de imagen utilizando el sistema LICOR. 6.2 Resultados Los anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-1 D2-Abl, y ACI-35-2G5-Ab3 fueron probados por su capacidad para detectar fosfoTau (pTau) en homogeneizados de cerebro de EA y de sujetos de control, utilizando un Western-blots fosfo-específicos. Todas las muestras de corteza humanas post mortem fueron primero caracterizadas utilizando anticuerpos comerciales contra la Tau humana: Tau anti-total (TAU- 13) y anti-pS396 Tau (E178) anticuerpos. Como se muestra en la Figura 2A, utilizando el anticuerpo TAU-13, se detectó en todas las muestras la característica escala Tau correspondientes a diferentes isoformas de tau en el rango de 50-70 kDa. Curiosamente, en los homogeneizados de cerebro de EA también se observó un cambio relativo en el patrón de migración de Tau como se esperaba para la presencia de Tau hiper-fosforilada en cerebros con EA. Confirmando esta hipótesis, el anticuerpo Tau anti-pS396 comercial discrimina muy bien los controles y EA (Figura 2B) . De hecho, el anticuerpo Tau anti-pS396 reveló tres principales bandas inmunorreactivas correspondientes a (hiper) -isoformas fosforiladas de Tau en todos los homogeneizados de cerebro de EA y con una intensidad muy débil o ausente en los controles sanos. Además, las muestras de EA muestran un alto peso molecular TAU-13 frotis inmunorreactiva que probablemente refleja la presencia de agregados de Tau (Figura 2A) .
Transferencia de Western con ACI-35-2Al-Abl reveló la presencia de dos bandas de proteínas inmunorreactivas de tamaño esperado para fosfo Tau en los homogeneizados de cerebro de EA, pero no en los controles (Figura 3A) . Inmunorreacciones débiles por Western blot usando ACI-35-2A1-Abl pueden ser explicados por la presencia de dos bandas principales no específicas a -35 y -40 kDa. La Transferencia de Western con ACI-35-l-Abl D2 reveló la presencia de dos bandas de proteínas inmunorreactivas de tamaño esperado para fosfo Tau en los homogeneizados de cerebro de EA, pero no en los controles (Figura 3B) . Las Inmunorreacciones débiles por Western blot usando ACI-35-1 D2-Abl pueden explicarse por la presencia de bandas no específicas en ~40 y ~50 kDa, así como 4 bandas no específicas entre 80 kDa y 150 kDa. La transferencia de Western con ACI-2G5-Ab3 reveló la presencia de tres principales bandas inmunorreactivas correspondientes a (hiper) -isoformas fosforiladas de tau en todos los homogeneizados de cerebro de EA y ausente en los controles sanos, excepto para un sujeto de control (C22) , que tiene una historia familiar de EA (Figura 3C) . Este informe demuestra que ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-1 D2- Abl, y ACI-35 -2G5 -Ab3 , pueden discriminar entre EA y los controles de la misma edad para la presencia de pS396 Tau en la corteza post-mortem humana, y por lo tanto estos anticuerpos monoclonales reconocen isoformas de Tau patológicamente asociadas a EA.
Ejemplo 7: Estudios de unión V - Configuración 1 (ELISA en muestras de cerebro humano) 7.1 Métodos 7.1.1. Las muestras humanas. El mismo método para la preparación de muestras humanas como se describe en el Método 5.1.1., excepto para la última parte, La preparación de la fracción SI. 7.1.2. La fracción de la proteína Tau SI: El subfraccionamiento de las fracciones homogeneizadas totales para obtener proteínas Tau solubles y fosfo-Tau.
Para preparar la fracción (SI) de Tau soluble utilizada para el ensayo de AlphaLISA, la mitad del volumen de la fracción de TH fue alícuotada y se almacenó a -80 C. El resto de la fracción de TH se procesó adicionalmente mediante la adición de Tritón X-100 a una concentración final de 0.4%. Las muestras se mezclaron bien y se agitaron en vórtex varias veces antes de ser centrifugada a 5?00 rpm durante 5 min a 4°C. El sobrenadante constituye la fracción SI. Las muestras se alicuotaron y se almacenaron a -80°C. Las concentraciones de proteína se midieron utilizando el reactivo de Bradford. 7.1.3. AlphaLISA: ensayo AlphaLISA para detectar la presencia de Tau fosforilada en los homogeneizados cerebrales corticales post-mortem humanos de las personas afectadas por EA y los controles de la misma edad.
Los anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-1 D2-Abl, y ACI-35-2G5-Ab3, todos dirigidos contra Tau-pS396, se biotinizaron utilizando el equipo EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-biotinilación (Thermo Scientific) , según las instrucciones del fabricante. Veinticinco veces el exceso molar de biotina sobre el anticuerpo se utilizó en la reacción de etiqueta. Después de la biotinilación, el exceso de biotina libre se removió por diálisis contra PBS utilizando la Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Dispositivos, 10K MWCO (Thermo Scientific) . Los anticuerpos biotinilizados se designan como ACI-35-2Al-Abl-BT, ACI-35-lD2-Abl-BT, y ACI-35-2G5-Ab3-BT. El anticuerpo Tau-13 se conjugó a las perlas aceptantes alfa activadas (Perkin Elmer) usando el siguiente protocolo: 0.1 mg de solución de anticuerpo Tau-13 (purificado en columna de Proteína A) se mezcló con 1 mg de bolitas de AlphaLISA aceptante de perlas y complementado con 0.13 de tampón de fosfato (pH 8.0) hasta un volumen final de reacción de 200 UL. A continuación, se añadieron 1.25 de 10% de Tween-20 y 10 \iL de una solución de 25 mg/mL de NaBH3CN y el tubo se incubó durante 48 h a 37°C con una rotación suave (7 rpm) . Después de la reacción de conjugación, los sitios activos sobre perlas se bloquearon mediante la adición de 10 ]i de una solución de carboxi-metoxilamina y se incubaron adicionalmente a 37 °C durante 1 h. Finalmente, las perlas se lavaron dos veces con 200 i de 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 y se almacenaron a 4°C en un tampón de almacenamiento 200 L (PBS con 0.05% de Proclin-300) que resultó en una final AlphaLISA concentración de perlas aceptantes de 5 mg/ml.
AlphaLISA es un ensayo homogéneo basado en la proximidad de la perla de quimioluminiscencia. Si el donante Alfa y las perlas aceptantes están en estrecha proximidad, tras la excitación de láser, una cascada de reacciones químicas produce una señal amplificada. Tras la excitación a 680 nm, el fotosensibilizador contenido en las perlas donantes convierte el oxígeno del ambiente en especies más reactivas de oxígeno singlete. Estos singletes difusan (hasta 200 nm, dentro de 4 isec de la mitad de la vida) y producen una reacción quimioluminiscente en las perlas aceptantes, dando lugar a la emisión de luz. El ajuste del ensayo fue como sigue: Las muestras SI fueron pre-diluidas en un tampón de ensayo Alfa (PerkinElmer AL000C) para obtener una concentración almacenada de 20 ug/mL. Los siguientes reactivos se añadieron a una OptiPlate blanca de 384 pocilios (PerkinElmer) a un volumen final de 50 i : el homogeneizado de cerebro SI (5 pL) , 10 pL de ACI-35-2Al-Abl-BT, ACI-35-1D2-Abl-BT, o de ACI-35-2G5-Ab3-BT para una concentración final de anticuerpo de 0.2 nM, 0.5 nM, ó 0.5 nM, respectivamente, y 10 pL de perlas aceptantes Taul3 conjugado para un concentración de perlas final de 2.5 µ??p?. La mezcla de reacción se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, y se añadió 25 µ?. de perlas donantes de estreptavidina y se incubó adicionalmente durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. La lectura se realizó utilizando instrumentos Enspire Alfa y análisis usando Enspire Workstation versión 3.00. Se realizó un análisis estadístico de los datos utilizando el software GraphPad Prism. Los resultados se presentan como unidades Alpha +Sd 7.2 Resultados Un ensayo AlphaLlSA se utilizó para probar los anticuerpos de ACI-35-2Al-Abl, de ACI-35-lD2-Abl, y ACI-35-2G5-Ab3 para la capacidad de detectar Tau-pS396 los homogeneizados de cerebro humano post-mortem, y para discriminar EA de los controles de la misma edad. Todos los anticuerpos detectados Tau-pS396 (Figura 4A, 4B, 4C) . La diferencia en la detección de la señal entre EA y los controles (n=10) fue también muy importante para todos los anticuerpos, que muestran un aumento de la señal en el cerebro de los sujetos con EA; ACI-35-2Al-Abl (p<0.0001), ACI-35-1D2 -Abl (p <0.0001), y ACI-35-2G5-Ab3 (p=0.002). En conclusión, se utilizó la tecnología AlphaLlSA para demostrar la capacidad de ACI-35-2Al-Abl, ACI-35-lD2-Abl, y ACI-35-2G5-Ab3 para detectar pS396-Tau en los cerebros de sujeto con EA, y para diferenciar entre los donantes de EA y de control.
Ejemplo 8: La eficacia in vivo de anticuerpos de ACI-35-2G5-Ab3 8.1 Métodos 8.1.1. Configuración del estudio: En los efectos del tratamiento in vivo de 2 administraciones de anti-anticuerpos anti-pTau ACI-35-2G5-Ab3 en ratones transgénicos Tau Ratones transgénicos Tau femenino y masculino (TMHT) con un sntecedente C57BL/6xDBA, a una edad de 6-7 meses, se administraron por inyección ip 3 ó 10 mg/kg de ACI-35-2G5-Ab3, o control de portador (PBS) dos veces, una semana de diferencia. En el día 14, los animales fueron sacrificados, los cerebros se plantaron y se procesaron para inmunohistoquímica (IHC) . Para la determinación de la patología Tau en el hipocampo y la amígdala 5 rebanadas (1 de cada nivel) por cerebro fueron etiquetados utilizando AT180 (para Tau-pT231) y anticuerpos HT7 (para Tau humana total) y área inmunorreactiva posteriormente fueron evaluados utilizando Image Pro Plus (v6.2) de software. Los objetos inmunorreactivos se miden sobre una restricción de tamaño (30 µp?2 en la amígdala, 7 µp?2 en el hipocampo) y por encima de un umbral de intensidad dinámica. El área total y la intensidad de los objetos y el umbral individual se llenaron de forma automática. Si se utiliza, un umbral dinámico se define como intensidad media dentro del área de intensidad (AOI) más un factor de veces la desviación estándar de las intensidades de píxel dentro del AOI . El tamaño de la región se midió por delineación manual del hipocampo y la amígdala. Los datos del área de AT180 y HT7 IR se normalizaron a la región (en el hipocampo) o tamaño AOI (en la amígdala) . 8.2 Resultados El anticuerpo AT180 pTau detecta la pTau endógena y humana (doblemente fosforilada en Thr231 y Ser235) . Para los ratones transgénicos Tau utilizados en este estudio, AT180 mediciones histológicas se concentraron en las neuronas hipocampales y de la amígdala. Los ratones tratados con ACI-35-2G5-Ab3 tuvo una reducción significativa para significar AT180 y normalizar la intensidad suma del etiquetado somal, tanto en la amígdala y el hipocampo (Figura 5A y 5B) , que muestra la reducción de sobretodo la pTau AT180-positiva somal en los ratones tratados.
Para la Tau (transgénica) humana total, se utilizó el anticuerpo HT7. El HT7 reconoce la tau humana normal entre los residuos 159 y 163. Las mediciones histológicas concentradas en las neuronas de la amígdala e hipocampales de inmunorreactividad somata. Los ratones tratados con ACI-35-2G5-Ab3 habían reducido el área HT7 inmunorreactiva, así como la suma y la intensidad media HT7 de la inmunorreactividad en la amígdala (Figura 6A) . En el hipocampo, lo mismo se observó para la intensidad media (Figura 6B) . Sin embargo, se observó un aumento en el etiquetado HT7 para el área inmunorreactiva, y la intensidad suma en el hipocampo en los ratones tratados a 10 mg/kg. Este incremento observado en el hipocampo se debió principalmente a tres ratones de un total de ocho ratones investigados.
El tratamiento ACI-35-2G5-Ab3 disminuyó significantemente los niveles de pTAu inmunorreactiva en ambas regiones investigadas, por tanto, en la somata de las neuronas del hipocampales y de la amígdala. En la amígdala, la intensidad suma del etiquetado se disminuyó para ambos la pTau inmunorreactiva AT180 y la Tau humana total inmunorreactiva HT7. El tratamiento con una dosis de 3 mg/kg también se redujo significativamente la intensidad media HT7 en ambas regiones. Sin embargo, en 10 mg/kg el promedio del área inmunoreactiva HT7 y la intensidad suma en el hipocampo se incrementó sobre la de los ratones tratados de control, lo que sugiere que un tratamiento de ACI-35-2G5-Ab3 conduce cambiar de pTau patológica.
Ejemplo 9; Un mapeo de epítopos de anticuerpos anti pTau 9.1 Métodos El mapeo de epítopos de los anticuerpos monoclonales de ratón Tau anti-fosfo se realizó mediante ELISA utilizando diferentes bibliotecas de péptidos no fosfo y fosfo. Las secuencias de aminoácidos de la biblioteca de péptido T3 usada, se muestran en la Tabla 11A. Cada biblioteca consistía en péptidos biotinilados cortos que abarcan las secuencias presentes en la vacuna de péptidos fosfo y no fosfo. Además, una biblioteca de péptidos se generó sustituyendo cada residuo de una secuencia de péptido que se une al anticuerpo con alanina (Ala) , como se muestra en las Tablas 11B y 11C. Cada biblioteca consistió de péptidos biotinilados cortos que abarcan secuencias fosfo y no fosfo presentes en la vacuna de péptido. Las bibliotecas de péptidos se adquirieron de ANAA Trading SA. Las bibliotecas de péptidos se adquirieron de ANAWA Trading SA.
El mapeo de epítopos se hizo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Mimotopos) . Brevemente, las placas recubiertas con estreptavidina (NUNC) se bloquearon con 0,1% de BSA en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4°C. Después de lavar con PBS-0.05% de Tween20, las placas se recubrieron durante 1 hora a TA con los diferentes péptidos de cada biblioteca, diluidas en 0.1% de BSA, 0.1% de azida sódica en PBS a una concentración final de 10 µ?. Después del lavado, las placas se incubaron durante 1 hora a TA con el anticuerpo que se va a probar diluido a 40 ng/ml en 2% de BSA, y 0.1% de azida sódica en PBS. Las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con un anticuerpo secundario IgG anti-ratón AP-conjugado (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Suffolk, Inglaterra) a 1/6000 de dilución durante 1 hora a TA. Después de un lavado final, las placas se incubaron con p-nitrofenil fosfato disódico hexahidrato ( NPP, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) solución de sustrato de fosfatasa, y se leyó a 405 nm después de 2 horas de incubación usando un lector de placas ELISA. La unión se considera positiva si la densidad óptica (O.D.) era por lo menos 2 veces más sobre el antecedente de O.D. 9.2 Resultados Como resultado de los experimentos de mapeo epítopos, los epítopos pueden ser identificados incluyendo el residuo fosforilado requerido de aminoácidos (véase la tabla 5) a la que los anticuerpos divulgados en el presentes documento se unen específicamente .
. Tau aa 393-401, con el requisito para pS396 (ACI-35-2Al-Abl; ACI-35-2Al-Ab2) . Tau aa 396-401, con el requisito para pS396 (ACI-35-4A6-Abl) . Tau aa 394-400, con el requisito para pS396 (ACI- 35-lD2-Abl) . Tau aa 402-406, con el requisito para pS404 (ACI-35-2G5-Abl) . Tau aa 393-400, con el requisito para P396 (ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3) Ejemplo 10: La fosforilación de Tau en la serina 396 (pS396) usando quinasa GSK3 , y el análisis de SDS-PAGE / estern-blot 10.1 Métodos La isoforma aás larga de tau de extensión completa humana (TAU441; SignalChem) a una concentración final de 16 µ? (20 µg Tau/25 L reacción) se incubó con 0.018 U GSK3 /pmol de Tau en un tampón de fosforilación que contiene HEPES pH 7.64 (40 mM) , EGTA (5 mM) , MgCl2 (3 mM) , y el ATP (2 mM) durante 1, 6, ó 20 horas a 4, 30, 6 37°C. Una unidad de GSK3 se define por el fabricante (New England Biolabs) como la cantidad de enzima que transferirá i pmol de fosfato del ATP a fosfopéptido CREB (KRREILSRRPpSYR) en 1 minuto a 30°C. La Tau fosforilada con GSK3 (pTau-GSK3p) se sondeó con anticuerpos dirigidos contra la Tau fosforilada en la serina 202, 396, 404, 409, treonina 181, 205, y 231, y el total de Tau, corren en directo a ELISA y estern-blots (WBs) , para optimizar y verificar la actividad de la quinasa y la especificidad (que no se muestra) . Además, se probaron las blots para la presencia de GSK3 usando un anticuerpo anti-GSK3a^ (BioSource Invitrogen) . Para todos los WBs, se diluyó la pTau-GSK3 mediante la adición de un volumen igual de tampón de muestra A (125 mM de Tris-HCl pH 6,8, 4% [w/v] de sulfato de dodecil de sodio [SDS] , 20% de glicerol, 0.01% de azul de bromofenol, 5% ß-mercaptoetanol) , y las muestras se calentaron a 95°C durante 10 min.30 ]iq de la muestra se cargó en un gel de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) y se ejecutan en un tampón MOPS SDS (Invitrogen) . Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0.45 µp? en un tampón de transferencia (25 mM Tris pH 8.6, glicina 190 mM, 20% metanol) . Para verificar la transferencia de la proteína, las membranas se tiñeron con Ponceau S durante 5 min. Las membranas se lavaron a continuación y después se bloquearon durante 1 hora en un tampón de bloqueo (5% de BSA en TBS [50 mM de Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM de NaCl] ) . Las membranas se transfirió durante la noche a 4°C con los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo y 0.1% de Tween. Transfiriendo con la ACI-35-2G5-Ab3 se realizó una dilución del anticuerpo a 0,5 ug/ml. 10.2 Resultados La Tau tratada con T3?3ß resultó en gran presencia de la fosforilación en la serina 396 Tau (Tau-pS396) , como se verificó usando anticuerpos específicos para diferentes fosfo-serina Tau y residuos de treonina (no mostrado) . La Figura 7 muestra un SDS-PAGE para Tau-pS396 generada utilizando diferentes condiciones de GSK3p, y la membrana se transfirió usando el anticuerpo de ACI-35-2G5-Ab3. El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 , específico para Tau-pS396, demostró una buena señal para Tau-pS396, con bandas también observaron lo que sugiere que se une a los dímeros Tau-pS396 (Figura 7, carriles 11 y 13) . No se observaron bandas en ausencia de GSK3 tratamiento (carriles 6-8 y 14-15) .
Ejemplo 11: La detección de la fosforilación de Tau (pSer396) en muestras de líquido cefalorraquídeo humano (CSF) 11.1 Métodos 11.1.1 Las muestras humanas-muestras de cerebro post-mortem Corteza post-mortem temporal de un donante con la enfermedad de Alzheimer (EA) AD19 se obtuvo del Banco de Donación de Cerebros de la Universidad de Miami. Reconocemos amablemente al Banco de Donación de cerebros de la Universidad de Miami por proporcionar muestras para este estudio. La información demográfica sobre el donante se muestra en la Tabla 12 a continuación, donde la etapa de la enfermedad de Braak (Braak y Braak (1991) etapas neuropatológicas de los cambios relacionados con el Alzheimer. Acta Neuropathol 82:239-259) también está indicado.
Tabla 12. Descripción de la muestra de cerebro AD19 utilizada en este estudio 11.1.2. Preparación de la fracción homogeneizada SI a partir de cerebro post-mortem La Corteza post mortem temporal del donante Adl9 se homogeneizó de acuerdo con el siguiente protocolo. Un fragmento de cerebro fue pesado y homogeneizado en 9 volúmenes de 25 mM de Tris-HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de EGTA que conteniene inhibidores de fosfatasa (30 mM NaF, 0,2 mM de Na3vO4, 1 nM ácido okadaico, 1 mM de PMSF, 5 mM Na4P207) y los inhibidores de la proteasa (Complete Mini, Roche 04 693 124 001) . La homogeneización se realizó en hielo usando un potter de vidrio. Esto constituye la fracción total de homogeneizado (TH) . La mitad del volumen de la fracción de TH se alícuoteó y se almacenó a -80°C. El resto de la fracción de TH se procesó adicionalmente mediante la adición de Tritón x-100 a una concentración final de 0.4%. La muestra se mezcló bien y se agitó con vortex varias veces antes de ser centrifugada a 5?00 rpm durante 5 min a 4°C. El sobrenadante constituye la fracción SI. La muestra se alícuoteó y se almacenó a -80°C. La concentración de proteína se midió utilizando reactivo de Bradford (Sigma B6916-500) . 1 1 .1.3 Muestras de CSF Humanos Las muestras del líquido cefalorraquídeo (CSF) clínicamente confirmó de leve a moderada los pacientes de la enfermedad de Alzheimer (EA) y los donantes de control voluntarios sanos (Ctrls) fueron proporcionados por la Escuela de Medicina de la Charité de Berlín. Reconocemos amablemente a la Escuela de Medicina de la Charité de Berlín por proporcionar muestras para este estudio. Las muestras alícuotearon, se almacenaron a -80°C y se utilizaron sin más transformación. La información demográfica y clínica sobre los donantes de muestras de CSF se muestra en la Tabla 13 a continuación.
Tabla 13. La información demográfica y clínica sobre los donantes de muestras de CSF 11.1.4 Inmuno-enriquecimiento de Tau CSF 11.1.4.1 Acoplamiento de anticuerpo Para el inmuno-enriquecimiento de Tau CSF, se utilizó un anticuerpo Tau comercial humano (HT7 clon, Termo MN Científico 1000) . Para acoplar HT7 a la proteína G Dynabeads (Life Tecnologies 10004D) , para cada muestra 1.5 mg (50 µ??) la proteína G Dynabeads se resuspendieron mediante agitación con vórtex y se transfirieron a un tubo de 1.7 mi de Recuperación Máxima (Axygen MCT-175-LC) . Los tubos se colocaron en un soporte magnético (Dynamag, Life Technologies 123, 21D) con el fin de concentrar las perlas en el lado del tubo y para eliminar el tampón. La unión de 1 g HT7 en 200 µL de PBS a la proteína G Dynabeads se realizó usando un mezclador de Huía (Life Technologies) a 10/20 rpm, 25°/10 de inclinación, 5°/2 vibro durante 10 min, después de lo cual los tubos se colocaron en el imán, el tampón se retira y los tubos se lavaron una vez por pipeteo suave con 200 µL PBS/0.02% de Tween 20 y dos veces con 200 µL tampón de conjugación (20 mM fosfato Na, 150 mM de NaCl , preparado recientemente) . Los tampones de lavado se eliminaron utilizando siempre el imán. Para el enlace cruzado de HT7 a la proteína G Dynabeads, las perlas HT7 se resuspendieron en 250 ]i . de 5 mM de solución de BS3 (Sigma-Aldrich S5799) disuelto en un tampón de conjugación y se incubó con rotación (misma configuración como anteriormente) durante 30 min a temperatura ambiente (TA) , la reacción se terminó mediante la adición de 12.5 µ? de tampón de inactivación (1 M Tris-HCl pH 7.5) durante 15 minutos seguido de tres lavados con 200 µL PBS/0.02% de Tween 20. 11.1.4.2 Inmuno-enriquecimiento de CSF de Tau La CSF se utiliza sin diluir y 1 mL de CSF para cada donante se transfirió al tubo que contiene las perlas de enlace cruzado HT7 y se incubó durante 1 hr a 4°C bajo rotación continua (10 rpm) . Después de eliminar el material no unido en el imán, las perlas se lavaron con 200 uL PBS/0.02% de Tween 20 y la Tau se eluyó en 20 L 1% de sulfato de dodecil de sodio (SDS) en PBS a 70°C durante 10 min. Con el fin de evitar la sedimentación de las perlas, los tubos se mezclaron poco (300 rpm en el mezclador horizontal calentado, durante 5 segundos, cada minuto) . Después de esta incubación, las muestras eluidas se recogieron mediante la colocación de los tubos en el imán.
Como control positivo, la Tau también se enriqueció a partir de homogeneizados de cerebro humanos . Para esta serie de diluciones de fracción SI de cerebro humano desde el donante AD19 se prepararon en PBS (0.5 pg/mL, 0.17 pg/mL, 0.056 g/mL, 0.019 g/mL, 0.006 pg/mL, 0.002 g/mL, 0.0007 µg/mL) . Cada muestra (1 mL) se trató como se describió anteriormente y se eluyó en 25 pL 1% de SDS. 11.1.5 AlphaLISA. 11.1.5.1 AlphaLISA descripción de ensayo AlphaLISA es un ensayo homogéneo que utiliza la tecnología Alpha basado en perlas. AlphaLISA fue seleccionada como una plataforma tecnológica basada en la sensibilidad y el número mínimo de pasos. Brevemente, el ensayo se basa en la proximidad de las perlas. Tras la excitación a 680 nm, el fotosensibilizador que contiene perlas donantes convierte oxígeno ambiente en especies de oxígeno singlete, estos difusa (hasta 200 nm, dentro de 4 sec de la mitad de la vida) y producir una reacción quimioluminiscente en las perlas aceptantes, dando lugar a la emisión de luz.
La configuración del ensayo usado en nuestros experimentos fue la siguiente (ver también la figura 8) : . Anticuerpo pan-Tau Tau-13 (Abcam ab24636) , acoplado a las perlas aceptantes Alpha que une la Tau humana presente en la muestra y forma el complejo "proteína Tau Tau-13 perlas aceptantes de anticuerpo" . La detección de anticuerpos ACI-35-2G5-Ab3-BT se une al pS396 de la Tau humana y permite la unión de las estreptavidina recubiertas (SAv) perlas de los donantes Alfa al complejo.
Después de poner todos los reactivos en la reacción, la señal quiraioluminiscente se lee usando Enspire Alpha 2390 Reader. 11.1.5.2 Biotinilación de anticuerpos ACI-35-2G5-Ab3 Con el fin de ser utilizado en el ensayo de AlphaLISA, el anticuerpo de ACI-35-2G5-A 3 fue biotinilado usando el equipo EZ-Link Micro sulfo-NHS-LC-biotinilación (Thermo Scientific 21935) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticinco veces el exceso molar de biotina se eliminó lavando el anticuerpo cuatro veces en PBS usando 50?00 MWCO Spin-X de UF 500 Concentrador (Corning 431480). El anticuerpo ACI-35-2G5-Ab3 biotinilado se indica como ACI-35-2G5-Ab3-BT. 11.1.5.3 El acoplamiento del anticuerpo Tau-13 a perlas aceptantes AlphaLISA.
Con el fin de ser utilizado en el ensayo de AlphaLISA, el anticuerpo Tau-13 se conjugó a las perlas aceptantes alfa activadas (Perkin Elmer 6.772.001). El siguiente protocolo de conjugación se utiliza: 0.1 mg de solución de anticuerpo Tau-13 (purificado en la columna de Proteína A) se mezcló con 1 mg de perlas aceptantes AlphaLISA y complementado con un tampón de fosfato 0.13 M (pH 8.0) hasta un volumen final de reacción de 200 L. A continuación, se añadieron 1.25 µ]1? de 10% de Tween-20 y 10 µ??? de una solución de NaBH3CN 25 mg/ml y el tubo se incubó durante 48 h a 37°C con una rotación suave (7 rpm) . Después de la reacción de conjugación, los sitios activos sobre las perlas se bloquearon mediante la adición de 10 µ?? de una solución de carboxi-metoxilamina y se incubaron adicionalmente a 37°C durante 1 h. Finalmente, las perlas se lavaron dos veces con 200 iL de 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 y se almacenaron a 4°C en un tampón de almacenamiento de 200 µL (PBS con 0.05% de Proclin-300) que resultó en una final concentración de perlas aceptantes AlphaLISA de 5 mg/ml. 11.1.5.4 Límite de determinación á detección utilizando el cerebro pS396-Tau Muestras de cerebro Tau Immuno enriquecido, SI muestras de fracciones cerebro y los espacios en blanco de tampón se utilizaron para este experimento. Cada muestra se analizó en 50 µ?,? volumen final usando un OptiPlate blanco de 384 pocilios (PerkinElmer 6007291) . Las diluciones de todos los reactivos se realizaron con un tampón de ensayo Alfa (PerkinElmer AL000C) .
. Muestra de 5 \xL (1/10 del volumen final, por lo tanto, la concentración final de proteína en el ensayo corresponde a la 1/10 de la concentración de la muestra) . . 10 al 0.5% de SDS para las muestras de fracciones cerebro SI o 10 ]i se añadió tampón sin formato para las muestras de cerebro de Tau inmuno-enriquecido . 15 i del anticuerpo de ACI-35-2G5-Ab3-BT (concentración final: 5 nM) se mezcla con las perlas aceptantes conjugadas Taul3 (concentración final de la perla: 2.5 ug/mL) . La incubación a temperatura ambiente durante 1 hr . 20 uL de perlas de los donantes de estreptavidina (concentración final de la perla: 25 µ?/p?) La incubación a temperatura ambiente durante 30 min (protegido de la luz) . La lectura usando instrumento Enspire Alfa y el análisis usando Enspire Workstation versión 3.00 11.1.5.5 La determinación de Tau-pS396 inmuno-enriquecido en CSF Cada muestra se analizó en 50 µ?. volumen final usando un OptiPlate blanco de 384 pocilios (PerkinElmer 6007291) . Las diluciones de todos los reactivos se realizaron con un tampón de ensayo Alfa (PerkinElmer AL000C) . . 5 de eluido inmunoprecipitado de cada donante 20 µL del anticuerpo de ACI-35-2G5-Ab3 -BT (concentración final: 5 nM) se mezcla con las perlas aceptantes conjugadas Taul3 (concentración final de la perla: 2.5 pg/mL) . La incubación a temperatura ambiente durante 1 h .25 yL de perlas de los donantes de estreptavidina (concentración final de la perla: 25 ug/ml) . La incubación a temperatura ambiente durante 30 min (protegido de la luz) . La lectura usando instrumento Enspire Alfa y el análisis usando Enspire Workstation versión 3.00 11.1.6 Análisis estadístico Se realizó un análisis estadístico de los datos utilizando el software GraphPad Prism. 11.2 Resultados Los experimentos preliminares indicaron que la cantidad de pS396 presente en CSF humano era demasiado bajo para la detección. Por esta razón, se ha desarrollado un protocolo de inmuno-enriquecimiento acoplado a la inmuno-detección de alta sensibilidad. El protocolo de inmuno-enriquecimiento fue validado utilizando material cerebral post-mortem EA humano. Comparación lado a lado de las muestras de homogeneizado de cerebro no tratadas con muestras de inmuno-enriquecido Tau reveló que en concentraciones correspondientes, se alcanzó el límite de detección del ensayo Taul3/ACI-35-2G5-Ab3 AlphaLISA a 0.5 g/mL para las muestras no tratadas y a entre 0.002-0.006 ug/mL para las muestras de i muno-enriquecído, lo que indica un enriquecimiento de 100 veces (Figura 9) . A continuación, el protocolo de inmuno-enriquecimiento se aplicó en las muestras de CSF de donante vivo (n=17 para pacientes con EA leve a moderada y n=16 para voluntarios sanos de la misma edad) . Los datos obtenidos (Figura 10) demuestran que: a) siguiendo elprotocolo de inmuno-enriquecimiento de la Taul3/ACI-35-2G5-Ab3 AlphaLISA detectó pS396-Tau en todas las muestras de CSF humanas, y b) que es más importante, un aumento significativo en la cantidad de pS396-Tau en EA CSF se observó cuando se comparó con el control (p=0.0003, prueba de Mann-Whitney) .
En conclusión, un protocolo de inmuno-enriquecimiento/inmuno-detección fue desarrollado, lo que permite la detección de pS396-tau en CSF humano. El aumento de pS396-Tau en el CSF de la EA leve a moderada sugiere que este método podría ser utilizado con éxito en los estudios de biomarcadores clínicos para evaluar la progresión de la enfermedad, la estratificación del paciente y la eficacia de la terapia. El anticuerpo de ACI-35-2G5-Ab3 detecta pS396-Tau en todas las muestras de CSF humanos, y lo más importante, el anticuerpo fue capaz de discriminar CSF de EA en comparación con el control .
Tabla 1. Descripción del anticuerpo, vacuna y secuaencia de Tau *Basado la isoforma más larga de la Tau humana (Tau441) . p indica el residuo fosforilado.
Tabla 2. La selección de hibridomas para unir al objetivo 1 La intensidad de la unión solo se puede comparar dentro de la misma columna, dentro del mismo ensayo (ELISA, o TAUPIR, o WB) .
- Una mala unión o ausente; + Buena unión; ++ Muy Buena unión; +++ Excelente unión (mejor que muy buena unión) Tabla 3. Afinidad de unión de los anticuerpos anti-Tau Tabla 5. Los aminoácidos y fosfo residues de Tau requeridos para la unión de anticuerpos .
*Basado en la isoforma más larga de la Tau humana (Tau441) Tabla 6. La secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH and VK) y las CDRs Tabla 7. La secuencia de neucleótidos de las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VK) Anticuerpo Hibridoma VH VK ACI- 35 - AS- A4- 4A6- 18 CAGGTCCAACTGCAGCAGCC GGGGCTG GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACT Abl AGCTTCTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA CTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATC ACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACC AAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGT TTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGA CAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAA AGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTG CACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGA GATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGAT AACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTG CGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGC ATCTACAAACTTTCCAACCGATTTTC GCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATC TGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCA CTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGC GTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCT AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGA ATTATTGTGCAAGGGATGATTACGCCTG TCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAG GTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTG GTTCACATGTTCCTCCGACGTTCGGT GTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA 84) (SEQ ID NO: 85) ACI •35 -1D2- A6 -1D2 -12 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTG AACATTTTGATGACACAGTCGCCATC Abl GGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAG ATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAA TCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCA AGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGT CTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCT CAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCA GGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCT GAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGC GGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGAT AGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTG GATGACAAGCGCTATAACGCATCCCTGA CTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGA AGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATAC ATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAG CTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATC GCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACT ACCTGTGTGGACACTGCAGATACTGCCA CTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGA CATACTACTGTGCTCGGTTACTGCGTCC AGACCTGGCAGTTTATTACTGTCTTC TTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGA AATACCTCTCCTCGCTCACGTTCGGT ACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ GCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA ID NO: 86) (SEQ ID NO: 87) ACI- 35- 4A6- A4 -4A6 -48 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTG GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACC Ab2 AGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA CTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGT GATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACG CAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGT TTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGA AAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAA AGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTG CACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGA GATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGT GGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTG GGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGG ATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTC GCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTC AGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCA CTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGC GTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTG AGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCT AGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGA ATTATTGTGTAAGAGAGGGGCGGTTTGC TGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAAC TTACTGGGGTCATGGGACTCTGGTCACT ATCTAAAATCTCCGTACACGTTCGGA GTCTCTGCA (SEQ ID NO : 109) GGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 119) ACI 35 -2G5- A6 -2G5 -08 CAGGTCCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCTG GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACT Abl AGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAA CTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATC ACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACT AAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGT TTCACTGACTACTATATAAACTGGGTGA CAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAA AGCAGAGGCCTGGACAGGGACTTGAGTG CACCTATTTAGAATGGTTCCTGCAGA GATTGCAAGGATTTATCCTGGAAGAGGT AACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTG AATATTTACTACAATGAGAAGTTCAAGG ATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTC GCAAGGCCACACTGACTGCAGAAAAATC TGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCA CTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGC GTGGATCAGGGACAGATTTCACACTC AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCT AAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGA ATTTCTGTGCAAGATTCTGGGACGTGAC TCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAG TTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACT GTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGA GTCTCTGCA (SEQ ID NO: 111) GGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 112) ACI -35- 2G5- A6--2G5--30 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAA Ab2 AGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA ATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACA GATATCCTGTAAGGCTTCTGGATTCACG GGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGT TTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGA CAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTG AGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTG GTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTC GATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGT CTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCC GGTACTAGCTACCACCAGAAGTTCAAGG TACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCG GCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTC CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAG CTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGC ATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTG AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCT CAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTT ATTACTGTGTAAGAGAGGGAAGATTTGC CTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGT TTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACT ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTG GTCTCTGCA (SEQ ID NO: 113) GAAATAAAA (SEQ ID NO: 114) ACI -35 -2G5- A6 -2G5 -41 GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTG GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAA Ab3 AGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA ATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACA GATATCCTGTAAGGCTTCTGGATTCACG GGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGT TTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGA CAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTG AGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTG GTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTC GATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGT CTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCC GGTACTAGCTACCACCAGAAGTTCAAGG TACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCG GCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTC CTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAG CTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGC ATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTG AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCT CAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTT ATTACTGTGTAAGAGAGGGAAGATTTGC CTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGT TTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACT ACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTG GTCTCTGCA (SEQ ID NO: 113) GAAATAAAA (SEQ ID NO: 114) Tabla 8. Los iniciadores utilizados para la secuencia CDR de las regiones variables del anticuerpo.
Tabla 9. LLa isoforma más larga de la Tau humana (441aa) , también llamada Tau40 La isoforma más larga de la MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL Tau humana (441aa) , también GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD llamada Tau40 (SEQ ID NO: AGLKESPLQT PTEDGSEEPG 67) SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG Microtúbulo-asociado con la HVTQARMVSK SKDGTGSDDK isoforma 2 de la proteina KAKGADGKTK lATPRGAAPP GQKGQANATR Tau [Homo sapiens] IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS NCBI Secuencia de RTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK referencia: NP 005901.2 SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK lETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD EVSASLAKQG L (SEQ ID NO: 67) Depósitos : Tabla 10. Las siguientes líneas celulares de hibridoma se depositaron en el nombre de AC Immune SA, PSE-EPFL Edificio B, 1015 Lausanne/Switzerland y Katholieke Universiteit Leuven, Waaistraat 6 - Box 5105, 3000 Leuven/Belgium con el "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) en Braunschweig, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest: Tabla 11A. Biblioteca de peptides utilizada para el mapeo de epítopo .
Biblioteca de peptide para T3 Tau( 41 (número de aminoácido Aminoácido V Y K S(P) P V V s G T S<P) P R H L Péptldo no.
Fosfo-péptldos s s s ? s s ? s s s S(P) ., . , . .. . Péptido no.
No fosfo péptldos r s s s s s s s s D P s s s s s D T s s ? s T3.3G -T— — T— ?— -P— — R— Tabla 11B. Alanina (Ala) biblioteca de peptide de sustitución utilizada para el mapeo de epítopo de los anticuerpos específicos de pS396.
Tabla 11C. Alanina (Ala) biblioteca de páptido de sustitución utilizado para el mapeo de epítopo de los anticuerpos específicos de pS404 LISTA DE REFERENCIAS Alonso C. , et al . (1997), Proc.
Nati.
Acad .
Ciencia.
EE.UU., 94, 298-303 Alving et al., (1992) Infect .
Immun . 60:2438-2444 Asuni et al., (2007) J Neurosc. 27 (34), 9115-29 Braak y Braak (1991) stageing neuropatológico de los cambios relacionados con el Alzheimer.
Acta Neuropathol 82:239-259) Braak H. , et al . (1993), Eur.
Neurol., 33, 403-408 Gilí et al., Nature Med.. 9: 589-595 (2003) Greenberg SG, et al. (1992) , J. Biol..
Chem., 267, 564-569.
Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988 555-612 Hodgson et al., (1991) BioATechnoloy, 9:421 Hoffmann R. , et al (1997), Biochemistry, 36, 81 14 a 8124.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Las secuencias de proteínas de Interés inmunológico, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., 1991 Kennedy, JH, et al., 1976 (Clin.
Chim.
Acta 70: 1 -31) Khaw, BA et al. (1982) J. Nucí.
Med. 23: 101 1 a 1019 Lewis et al., (2000) Nature Genetics, 25 :402-405 Masliah et al., (2005) Neuron, 46 (6), 857-68 Masliah et al., (201 1) PLoS ONE, Volumen 6 (4), el9338, pp-1-17 Muhs et al., (2007) Proc Nati Acad Sci EE.UU., 104 (23), 9810-5 Muyllaert et al, (2006) Rev Neurol, 162 (10), 903-907 Muyllaert et al, (2008) Genes Cerebro Behav., Supl. 1, 57-66 Neuwelt, EA, Implicación de la barrera sangre-cerebro y su manipulación, Vols 1 & 2, Plenum Press, Nueva York (1989)) Nicolau et. al. (2002) Proc Nati.
Acad.
Sci. EE.UU. 99, 2332-2337 Nicoll et al., (2003) Nature Med. , 9, 448-452 Oddo et al., (2004) Neuron, 43, 321-332 Queen et al., (1989) Proc.
Nati Acad Sci EE.UU., 86:10029-10032 . Papanastassiou et al, Gene Therapy 9: 398-406 (2002) Reig S . , et al . (1995), Acta Neuropathol . , 90, 441-447 Ribe et al. , (2005) Neurobiol Dis, 20 (3), 814-22 Roberson et al, (2007) , Science, 316 (5825) , 750-4 Rosenmann et al., (2006) Arch Neurol, 63 (10), 1459-1467 Rousseaux et al.
Métodos de Enzimología, (1986), Academic Press 121: 663-69 Schurs, AHWM, et al. 1977 {Clin.
Chim Acta 57: 1 -40 Terwel et al., (2006) J. Biol . Chem. , 280, 3.963 hasta 3.973 Terwel et al, (2008) Am J Pathol., 172 (3), 786-98 Urushitiani et al., (2007) Proc .
Nati Acad Sci EE.UU., 104 (79, 2495-500 Vandebroek et al., "La fosforilación y agregación de la proteína tau en Humanizado Las células de levadura y en el ratón transgénico Cerebro " ; séptima Conferencia Internacional sobre Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, Sorrento, Italia, 9 a 13 marzo 2005, pp 15-19 Wagner et al (2002) Journal of liposomas Investigación Vol. 12 (3) , pp 259-270 WO 2004/058258 WO 96/13590 WO 96/29605 Publicación de Patente de EE.UU No. 2002/0038086 Publicación de Patente de EE.UU No. 2003/0083299 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2002/0025313 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2004/0204354 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2004/0131692 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2002/0065259 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2003/0162695 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2005/0124533 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2005/0089473 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2003/0073713 Publicación de Patente de EE.UU. No. 2003/0129186 Patente de EE.UU. No. 5,112,596, Patente de EE.UU. o. 5,268,164, Patente de EE.UU. No. 5,506,206, Patente de EE.UU. No. 5,686,416 Patente de EE.UU. o. 5,004,697

Claims (91)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en la proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en donde dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión a una proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de la proteína Tau fosforilada in vivo soluble, oligomérica e insoluble.
2. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo se une a un fosfo-epítopo que tiene, o dentro de, la secuencia de aminoácidos VYKSPWSGDTSPRHL (SEQ ID NO: 62) (Tau AA 393-408 de SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) y en la posición 404 (pS404) .
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2 o un fragmento funcional del mismo, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo es un anticuerpo de modulación que modula los niveles de la Tau solubles e/o insolubles en el cerebro de un mamífero .
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3 o un fragmento funcional del mismo, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo modula los niveles de Tau solubles e/o insolubles en la corteza cerebral y/o hipocampo.
5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo reduce los niveles del total de la proteína tau soluble e/o insoluble.
6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo reduce los niveles de la proteína tau fosforilada soluble e/o insoluble.
7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo reduce los niveles de los filamentos helicoidales apareados que contienen la proteína tau hiperfosforilada .
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo reduce los niveles del total de la proteína tau soluble, de la proteína tau fosforilada soluble y los filamentos helicoidales apareados de la pTau.
9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho mamífero es un humano.
10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una constante de disociación de al menos 10 nM.
11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una constante de disociación de al menos 82 nM, 5 nM, al menos 2 nM; al menos 1 nM, al menos 500 pM, al menos 300 pM, por lo menos 200 pM, al menos, 100 pM.
12. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene un índice de constante de asociación de 104 M^s"1 o mayor; de 105 M^s"1 o mayor, de 106 M^s"1 o mayor.
13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 4 nM y un índice de constante de asociación de 105 ^s"1 o mayor.
14. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 3 nM y un índice de constante de asociación de 106 M^s"1 o mayor.
15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 2 nM y un índice de constante de asociación de 104 M^s-1 o mayor.
16. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 1 nM y un índice de constante de asociación de 105 M^s"1 o mayor.
17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 200 pM y un índice de constante de asociación de 105 M^s"1 o mayor.
18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo tiene una alta afinidad de unión con una constante de disociación de al menos 100 pM y un índice de constante de asociación de 106 M^s"1 o mayor.
19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del anticuerpo se une a un epítopo seleccionado del grupo que consiste en: a.VYKSP SG (Tau aa 393-401 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) ; b. SPWSG (Tau aa 396-401 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) ; c. YKSPWS (Tau aa 394-400 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) ; d. DTSPR (Tau aa 402-406 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) y e. VYKSPWS (Tau aa 393-400 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
20. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo en una proteína Taude mamíferos, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-401 (VYKSPWSG) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
21. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo en una proteína Tau de mamíferos, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 396-401 (SPWSG) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
22. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo en una proteína Tau de mamíferos, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 394-400 (YKSPWS) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
23. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo en una proteína Tau de mamíferos, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 402-406 (DTSPR) que comprende un Ser fosforilado en la posición 404 (pS404) .
24. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo en una proteina Tau de mamíferos, particularmente en la proteína tau humana, pero especialmente la proteína tau humana como se muestra en la SEQ ID NO: 67, que comprende Tau aa 393-400 (VYKSPWS) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 73, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 75, o una secuencia de aminoácidos, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma y/o un segundo dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácidos al menos 95%, particularmente 98%, en particular 99% idéntica a la misma, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71, o una secuencia de aminoácidos al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a la misma, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 72, o una secuencia de aminoácidos de al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
26. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: a . un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 73, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 75 , y/o b. un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de amino ácido que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 71, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 72.
27. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 81, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 83, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma y/o un segundo dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 78, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 80, o una secuencia de aminoácidos al menos al menos 60%, en menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
28. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: a. un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 81, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 82, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 83 , y/o b. un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de amino ácido que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 78, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 79, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 80.
29. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 93, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 95, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% o 100% idéntica a cualquiera de las CDRs de arriba y/o un segundo dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N ° : 91, o una secuencia de aminoácidos al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores .
30. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: a. un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 93, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 94, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 95 , y/o b. un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 90, y una CDR3 que comprende la secuencia aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 91.
31. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 101, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 103, o un grupo amino secuencia de ácido al menos 60%, al menos 70%. al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, en particular al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores y/o un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 98, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 100, o una secuencia de aminoácidos al menos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, en particular al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a una cualquiera de las CDRs anteriores .
32. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: a. un primer dominio de unión que comprende una CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 101, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 103 , y/o b. un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 98, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 99, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 100.
33. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 106, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 108, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a una cualquiera de las CDRs anteriores y/o un segundo dominio de unión que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 91, o una secuencia de aminoácidos en menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95 %, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a cualquiera de las CDRs anteriores.
34. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, cuyo anticuerpo o fragmento del mismo reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende: a. un primer dominio de unión que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 106, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 107, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 108, y/o b. un segundo dominio de unión que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 89, una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 115, y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 91.
35. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo que comprende un primer dominio de unión comprende la secuencia de amino ácido se muestra seleccionada de SEQ ID NO: 69, 77, 161, 92, 118, 97, 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, en particular al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idénticas a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, 76, 88, 96, 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, particularmente al menos 85%, particularmente al menos 90%, al menos 91%, en menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, particularmente al menos 95%, particularmente al menos 96%, particularmente al menos 97%, particularmente al menos 98%, particularmente al menos 99% ó 100% idéntica a la misma.
36. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos al menos 98% o 99% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68, o una secuencia del aminoácido de al menos 90%, 91%, 92% ó 93% idéntica a la misma.
37. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 77, o una secuencia de aminoácidos al menos 93%, 94% ó 95% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 76, o una secuencia de aminoácidos al menos 88%, 89%, ó 90% idéntica a la misma.
38. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 116, 92, ó 118, o una secuencia de aminoácidos al menos 93%, 94% ó 95% idénticas a la misma, y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88, o una secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92% ó 93% idéntica a la misma.
39. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 97, o una secuencia de aminoácidos al menos 99% idéntica a la misma, y/o un segundo dominio de unión comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 96, o una secuencia de aminoácidos al menos 86%, 87%, 88% ó 90% idéntica a la misma.
40. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo, que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en una proteína Tau de mamífero o en un fragmento de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105, o una secuencia de aminoácidos al menos 98%, ó 99% idéntica a la misma: y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 104, o una secuencia de aminoácidos al menos 88%, 89%, ó 90% idéntica a la misma.
41. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional del mismo que comprende: a. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 69 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 68; o b. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 77 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 76; o c . un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 116 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o d. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 92 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88; o e. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 97 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 96, o f . un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 105 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 104, o g. un primer dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 118 y/o un segundo dominio de unión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 88.
42. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el cual es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo completamente humano o un fragmento funcional del mismo.
43. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma que es de la IgG2b, IgG2a o el isotipo IgG3.
44. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el que dicha proteína Tau de mamífero es una proteína tau humana.
45. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une a un confórmero de la proteína Tau patológica, pero no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes .
46. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores o un fragmento funcional de la misma.
47. El polinucleótido de la reivindicación 46 que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117-119; b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117; c. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117-119; d. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 98% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117-119; e. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene 100% de identidad de secuencia a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35-45, SEQ ID NO: 84-87, SEQ ID NO: 109-112 y 117-119; f . una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la cadena complementaria que se hibridiza a la molécula de ácido nucleico de cualquiera de a) - d) ; o g. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que se desvía de la secuencia de nucleótidos definida en cualquiera de a) - e) por la degeneración del código genético: en donde dicha molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de a) - g) que codifica un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo que reconoce y se une específicamente a un fosfo-epítopo en un mamífero, particularmente en la proteína tau humana o en un fragmento de la misma, particularmente a un confórmero de la proteína tau patológica, pero no se une al epítopo no fosforilado y/o a epítopos no relacionados correspondientes, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una alta afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada soluble, oligomérica e insoluble y es capaz de detectar y/o modular los niveles de la proteína Tau fosforilada in vivo soluble, oligomérica e insoluble .
48. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de los mismos, en una cantidad terapéuticamente efectiva junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
49. La composición farmacéutica de la reivindicación 48, que comprende al menos dos anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que reconocen y se unen a dos fosfo-epítopos diferentes de la proteína Tau de mamífero.
50. La composición farmacéutica de la reivindicación 48 ó 49, que comprende además un anticuerpo adicional o un fragmento funcional del mismo que reconoce y se une a una proteína de la amígdala o péptido.
51. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de los mismos, para uso en terapia, en particular para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o trastorno tal como una tauopatía en un mamífero, particularmente un ser humano en necesidad de tal tratamiento.
52. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo, polinucleótido, composición f rmacéutica, o una combinación de los mismos según la reivindicación 51 para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o trastorno en un mamífero, en el que la enfermedad neurodegenerativa o trastorno es una tauopatía.
53. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo, polinucleótido, composición farmacéutica, o una combinación de los mismos según la reivindicación 51 ó 52, para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o trastorno tal como una tauopatía en un mamífero, en el que el mamífero es un humano.
54. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un ser humano que padece de tal déficit.
55. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica según la reivindicación 54, en el que el tratamiento o alivio de los déficits cognitivos en un mamífero, particularmente un ser humano, conduce a una detención en la progresión de los déficits cognitivos.
56. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o una composición farmacéutica según la reivindicación 54, en el que el tratamiento o alivio de los déficit cognitivos en un mamífero, particularmente un ser humano, conduce a un aumento en la retención, en particular una restauración completa de la capacidad de la memoria cognitiva en el tema tratado.
57. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o una composición farmacéutica según la reivindicación 52 en el que la tauopatia se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, esclerosis lateral amiotrófica/complejo de demencia de parkinsonismo de Guam, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares , demencia con granos argirófilos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, la demencia frontotemporal, enfermedad Hallevorden-Spatz , atrofia de sistemas múltiples, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia sólo con ovillos Parkinsonismo postencefálica y la distrofia miotónica.
58. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento ám la enfermedad de Alzheimer o la demencia frontotemporal .
59. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica según la reivindicación 51, en el que la enfermedad neurodegenerativa o trastorno muestra la presencia de patologías tanto tau como amiloide .
60. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos que son causados por, o asociados con la formación de lesiones neurofibrilares, la patología cerebral predominante en la tauopatía que comprende un grupo heterogéneo de enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo enfermedades o trastornos que muestran la presencia de patologías tanto tau como amiloide incluyendo, pero no limitado a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker , miositis por cuerpos de inclusión, y la angiopatía amiloide cerebral de la proteína prión, lesión cerebral traumática y otras enfermedades o trastornos que no muestran una patología amiloide distinta incluyendo, pero no limitado a, la esclerosis lateral amiotrófica/Complejo de demencia de parkinsonismo de Guam, la enfermedad motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con granos argorófilos, la degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, la demencia frontotemporal, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, la degeneración Pallido -ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia sólo con ovillos Parkinsonismo postencefálico y la distrofia miotónica.
61. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, polinucleótido, o la composición farmacéutica según la reivindicación 54, 55, 56, ó 58, en el que el mamífero es un humano .
62. Un método para el tratamiento, alivio, o la protección contra una enfermedad neurodegenerativa o trastorno tal como una tauopatía que comprende el administrar a un mamífero, que sufre de una enfermedad o trastorno tal, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, un polinucleótido o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una combinación de las mismas.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, en el que la enfermedad neurodegenerativa o trastorno es una tauopatía.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la tauopatía se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, demencia pugilística, síndrome de Down, la enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, miositis por cuerpos de inclusión, y la angiopatía amiloide cerebral de la proteína prión, lesión traumática cerebral, la esclerosis lateral amiotrófica/el complejo de demencia parkinsonismo de Guam, enfermedad de la motoneurona no de Guam con ovillos neurofibrilares, demencia con granos agirófilos, degeneración corticobasal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17, demencia frontotemporal, enfermedad de Hallevorden-Spatz, atrofia sistémica múltiple, la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, degeneración Pallido-ponto-nigral, enfermedad de Pick, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda demencia sólo con ovillos Parkinsonismo postencefálica, la distrofia miotónica.
65. El método de la reivindicación 62, 63, ó 64, en el que el mamífero es un humano.
66. Un método para inducir una respuesta inmune pasiva en un animal, particularmente un mamífero o un humano, que sufre de un trastorno neurodegenerativo tal como tauopatía por la administración a dicho animal o humano un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una combinación de las mismas.
67. Un método para el diagnóstico de una proteína Tau asociada a la enfermedad, trastorno o estado o una predisposición a la enfermedad asociada a la proteína tau, trastorno o condición en un paciente que comprende el detectar la unión inmunoespecífica de un anticuerpo o un fragmento activo del mismo a un epítopo de la proteína tau en una muestra o in situ, que comprende las etapas de: a. con lo que la muestra o una parte del cuerpo o área específica del cuerpo se sospecha que contiene el antígeno de tau en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitiendo que el anticuerpo se una al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno de tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, en donde un aumento en la cantidad de dicho agregado en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o condición asociados a la proteína tau.
68. Un método para el seguimiento de la enfermedad residual mínima en un paciente después del tratamiento con un anticuerpo o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho método comprende : a. Poner la muestra o una partedel cuerpo o área específica del cuerpo que se sospecha que contiene el antígeno de tau en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitiendo que el anticuerpo se una al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico; y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno de tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, en donde un aumento en la cantidad de dicho complejo inmunológico en comparación con un valor de control normal indica que dicho paciente todavía sufre de una enfermedad residual mínima.
69. Un método para predecir la capacidad de respuesta de un paciente que está siendo tratado con un anticuerpo o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende a. Poner la muestra o una parte del cuerpo o área específica del cuerpo que se sospecha que contiene el antígeno de tau, en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-45, en las cuales el péptido o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína tau; b. permitiendo que el anticuerpo se una al antígeno de tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico : y d. correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antigeno de tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica, e. la comparación de la cantidad de dicho complejo inmunológico antes y después del inicio del tratamiento, en donde una disminución en la cantidad de dicho complejo inmunológico indica que dicho paciente tiene un alto potencial de ser sensible al tratamiento.
70. El método de cualquiera de las reivindicaciones 67-69, en el que el paso de correlacionar la presencia o ausencia del complejo inmunológico con la presencia o ausencia del antígeno de tau en la muestra o parte del cuerpo o área específica implica una etapa de comparar la cantidad de dicho complejo inmunológico a un valor de control normal.
71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 67-70, en el que la muestra es un homogeneizado de cerebro o líquido cefalorraquídeo.
72. Un método de detección post mortem de los multímeros fosfoTau (ptau) en una muestra del cerebro de un sujeto que se sospecha que padece una enfermedad asociada con tau o trastorno que comprende: a. Poner una muestra de cerebro del sujeto en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína phosphoTau; b. permitiendo que el anticuerpo se una a la proteína tau para formar un complejo inmunológico; c. detectar la formación del complejo inmunológico, y d. la comparación de la cantidad o intensidad del complejo inmunológico en la muestra obtenida del sujeto a la cantidad o intensidad del complejo inmunológico obtenido a partir de un sujeto de control sano utilizando las mismas condiciones, en donde un aumento en la cantidad o intensidad de dicho complejo inmunológico en comparación con el valor de control indica que dicho paciente había sufrido de una enfermedad o transtorno asociados con tau
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el aumento observado en la muestra de ensayo en comparación con la muestra de control es entre 30% y 100%.
74. El método para el diagnóstico de una enfermedad asociada a la proteína tau de cualquiera de las reivindicaciones 67-73, en donde, antes de la etapa (a) , la muestra es inmuno-enriquecida para aumentar la concentración de la proteína tau en la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo anti-Tau o un fragmento del mismo unidos a un soporte sólido.
75. Los equipos de prueba para la detección y diagnóstico de enfermedades, trastornos o condiciones asociados a la proteína tau que comprenden un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1-45.
76. Un equipo de ensayo según la reivindicación anterior que comprende un recipiente que contiene uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-45 y las instrucciones para el uso de los anticuerpos para el propósito de unir a un antígeno de tau para formar un complejo inmunológico y detectar la formación del complejo inmunológico de tal forma que la presencia o ausencia del complejo inmunológico se correlaciona con la presencia o ausencia del antígeno tau.
77. Un epítopo seleccionado del grupo que consiste de VYKSPWSG (Tau aa 393-401 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , SPWSG (Tau aa 396-401 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , YKSPWS (Tau aa 394-400 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) , DTSPR (Tau aa 402-406 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilad en la posición 404 (pS404), y VYKSPWS (Tau aa 393-400 de la SEQ ID NO: 67) que comprende un Ser fosforilado en la posición 396 (pS396) .
78. Una línea celular que produce un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
79. La línea celular de la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A4-4A6-48 depositada el 30 de agosto del 2011, como DS ACC3136.
80. La línea celular de conformidad con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-30 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3137.
81. La línea celular de conformidad con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A6-2G5-41 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3138.
82. La línea celular de conformidad con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-18 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3139.
83. La línea celular de conformidad con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A4-2A1-40 depositada el 30 de agosto del 2011 como DSM ACC3140.
84. La línea celular de conformidad con la reivindicación 78, que es la línea celular de hibridoma A6- 1D2-12 depositada el 6 de septiembre del 2011 como DSM ACC3141.
85. Un vector que comprende el polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 46 ó 47, en el que dicho polinucleótido está ligado operativamente.
86. Una célula huésped que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 85.
87. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 86 que produce el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-45, o un fragmento funcional de la misma.
88. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 86 o la reivindicación 87, que es de células de mamíferos .
89. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 86 o la reivindicación 87, que es una célula de ovario de hámster chino
90. Un procedimiento para producir el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o un fragmento funcional del mismo que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 86-89, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o fragmento, y recuperar el anticuerpo o fragmento.
91. Un método de detección de los multímeros de la fosfoTau (pTau) en una muestra de cerebro que comprende a. Poner la muestra en contacto con un anticuerpo o un fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-45, que el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo de la proteína fosfoTau,- b. permitiendo que el anticuerpo o fragmento de la misma que se unen a la proteína tau para formar un complejo inmunológico; y c. detectar la formación del complejo inmunológico.
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2764022B9 (en) 2011-10-07 2017-02-22 AC Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau
SG11201406347TA (en) 2012-04-05 2014-11-27 Ac Immune Sa Humanized tau antibody
RU2018132044A (ru) 2012-07-03 2018-10-19 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
AU2013302540B2 (en) 2012-08-16 2018-02-15 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
CN105121465B (zh) 2013-03-13 2020-09-08 普罗塞纳生物科技公司 Tau免疫疗法
EP2970452A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AC Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
GB201319656D0 (en) * 2013-11-07 2013-12-25 Univ Leuven Kath A yeast model for synergistic toxicity
WO2015122922A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Ipierian, Inc. Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
ZA201608812B (en) * 2014-06-26 2019-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau
KR20170023124A (ko) * 2014-06-26 2017-03-02 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 미세소관-연관 단백질 타우에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편
TWI664190B (zh) 2014-06-27 2019-07-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗－ｔａｕ抗體
WO2016007414A1 (en) * 2014-07-08 2016-01-14 New York University Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
DE102014013571A1 (de) * 2014-09-18 2016-03-24 Aj Roboscreen Gmbh Monoklonaler Antikörper gegen humanes TAU-Protein
JP6679582B2 (ja) 2014-09-30 2020-04-15 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ タウの動態測定
JO3576B1 (ar) 2015-02-26 2020-07-05 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ tau واستخداماتها
SG10201911349YA (en) 2015-06-05 2020-01-30 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
JO3711B1 (ar) * 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
EP3334761B1 (en) * 2015-08-13 2023-07-19 New York University Antibody-based molecules selective for the {p}ser404 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
KR20230070336A (ko) 2016-05-02 2023-05-22 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
US10889638B2 (en) 2016-05-02 2021-01-12 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
FI3452507T3 (fi) 2016-05-02 2022-12-15 Tau-immuunihoito
PE20190227A1 (es) * 2016-07-12 2019-02-13 H Lundbeck As Anticuerpos especificos para la tau hiperfosforilada y sus metodos de uso
JP6949102B2 (ja) 2016-08-09 2021-10-13 イーライ リリー アンド カンパニー 併用療法
KR102645073B1 (ko) 2016-12-07 2024-03-11 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
EP3551220A1 (en) * 2016-12-07 2019-10-16 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
EP3565836A1 (en) * 2017-01-04 2019-11-13 H. Lundbeck A/S Antibodies specific for hyperphosphorylated tau for the treatment of ocular diseases
BR112019017021A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-14 Denali Therapeutics Inc anticorpos anti-tau e métodos de uso dos mesmos
EA039569B1 (ru) * 2017-03-14 2022-02-11 Х. Лундбекк А/С Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения
WO2018204546A2 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
KR20200130350A (ko) * 2018-03-05 2020-11-18 얀센 파마슈티카 엔.브이. 항-phf-타우 항체 및 이의 용도
EP3774889A4 (en) * 2018-03-11 2021-12-08 Koorosh Shahpasand CONFORMITY INDEPENDENT ANTIBODIES AGAINST NEUROTOXIC TAU PROTEINS
SG11202010094TA (en) * 2018-05-03 2020-11-27 Univ Washington Methods of diagnosing and treating based on site-specific tau phosphorylation
US11085935B2 (en) 2018-05-03 2021-08-10 Washington University Methods of treating based on site-specific tau phosphorylation
EP3829634A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Eli Lilly and Company Combination therapy
BR112021016947A2 (pt) 2019-03-03 2021-11-03 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos que reconhecem tau
CN113748343A (zh) * 2019-03-28 2021-12-03 H.隆德贝克有限公司 pS396测定用于诊断TAU蛋白病的用途
TWI832183B (zh) * 2019-08-06 2024-02-11 香港商新旭生技股份有限公司 結合至病理性tau種類之抗體及其用途
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
US20240003918A1 (en) 2020-11-30 2024-01-04 Enigma Biointelligence, Inc. Non-invasive assessment of alzheimer's disease
IL303638A (en) * 2020-12-16 2023-08-01 Voyager Therapeutics Inc tau binding compounds
CN112694532B (zh) * 2021-01-12 2023-04-18 倍而达药业（苏州）有限公司 抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段及应用
CN113533746B (zh) * 2021-07-22 2022-05-10 深圳市天大生物医疗器械有限公司 一种P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN114002435A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
CN117003863A (zh) * 2022-04-28 2023-11-07 厦门大学 针对p-tau 217的抗体及其用途
CN114778856B (zh) * 2022-05-30 2023-03-17 苏州宇测生物科技有限公司 磷酸化tau蛋白检测试剂盒
CN117866087B (zh) * 2024-03-11 2024-05-17 江西赛基生物技术有限公司 一种抗pTau181单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5112596A (en) 1990-04-23 1992-05-12 Alkermes, Inc. Method for increasing blood-brain barrier permeability by administering a bradykinin agonist of blood-brain barrier permeability
ATE262584T1 (de) * 1991-08-09 2004-04-15 Massachusetts Inst Technology Verwendung eines inhibitors von tau/neurofilament-proteinkinase pk40
DE69233723T2 (de) * 1991-12-06 2009-02-05 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verwendung von Proteinkinasen zur Diagnose und Behandlung der Alzheimer Krankheit
WO1994002178A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Targeting of liposomes to the blood-brain barrier
EP0804584B2 (en) 1994-10-21 2008-07-09 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotype 7 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
US5756662A (en) 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
WO1997034145A1 (fr) 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant
AU5508798A (en) * 1996-11-19 1998-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
AU2001273361A1 (en) 2000-07-11 2002-01-21 Molecular Geriatrics Corporation Reagents and methods for identification of binding agents
US6514221B2 (en) 2000-07-27 2003-02-04 Brigham And Women's Hospital, Inc. Blood-brain barrier opening
AU2001286930A1 (en) 2000-08-30 2002-03-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
US7034036B2 (en) 2000-10-30 2006-04-25 Pain Therapeutics, Inc. Inhibitors of ABC drug transporters at the blood-brain barrier
US20030083299A1 (en) 2000-11-04 2003-05-01 Ferguson Ian A. Non-invasive delivery of polypeptides through the blood-brain barrier
AT500379B8 (de) * 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
DE10121982B4 (de) 2001-05-05 2008-01-24 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Nanopartikel aus Protein mit gekoppeltem Apolipoprotein E zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke und Verfahren zu ihrer Herstellung
CA2450073C (en) 2001-07-25 2017-08-29 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for modulating blood-brain barrier transport
US20030162695A1 (en) 2002-02-27 2003-08-28 Schatzberg Alan F. Glucocorticoid blocking agents for increasing blood-brain barrier permeability
KR101111477B1 (ko) 2002-12-03 2012-02-23 블랜체트 록펠러 뉴로사이언시즈 인스티튜트 치료제와 연결된 콜레스테롤을 포함하는 접합체
EP1585520A1 (en) 2002-12-24 2005-10-19 Neurochem (International) Limited Therapeutic formulations for the treatment of beta-amyloid related diseases
WO2005025511A2 (en) 2003-09-10 2005-03-24 Cedars-Sinai Medical Center Potassium channel mediated delivery of agents through the blood-brain barrier
UA102368C2 (ru) * 2005-12-12 2013-07-10 Ас Иммуне С.А. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ В ОТНОШЕНИИ β-АМИЛОИДА 1-42 МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ ИМЕЮТ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
US8012936B2 (en) 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
WO2008050383A1 (fr) * 2006-10-23 2008-05-02 Pioneer Corporation Dispositif de reproduction vidéo, système d'affichage vidéo et support d'enregistrement
US20080220449A1 (en) * 2007-02-08 2008-09-11 Oligomerix, Inc. Biomarkers and assays for Alzheimer's disease
US9555032B2 (en) 2007-06-13 2017-01-31 Research Development Foundation Methods for treatment and prevention of tauopathies and amyloid beta amyloidosis by modulating CRF receptor signaling
AU2008311367B2 (en) * 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
CN101965365A (zh) * 2007-10-19 2011-02-02 伊缪纳斯制药株式会社 能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用
ES2885398T3 (es) * 2009-03-18 2021-12-13 Ac Immune Sa Método para uso terapéutico
UA107571C2 (xx) * 2009-04-03 2015-01-26 Фармацевтична композиція
EP3329932A1 (en) 2009-06-10 2018-06-06 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins
IN2012DN00446A (es) 2009-07-30 2015-05-15 Pfizer Vaccines Llc
CN102070718A (zh) 2010-03-23 2011-05-25 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人tau蛋白外显子2、外显子3、外显子10多克隆抗体
JP6371526B2 (ja) 2010-10-07 2018-08-08 エーシー イミューン エス．エー． タウを認識するリン酸化部位特異的抗体
EP2764022B9 (en) 2011-10-07 2017-02-22 AC Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau
SG11201406347TA (en) * 2012-04-05 2014-11-27 Ac Immune Sa Humanized tau antibody
WO2013166302A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing systems and methods

Also Published As

Publication number Publication date
EP2764022B9 (en) 2017-02-22
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CN104080806B (zh) 2018-01-19
US9540434B2 (en) 2017-01-10
US20170137502A1 (en) 2017-05-18
WO2013050567A1 (en) 2013-04-11
JP2014531216A (ja) 2014-11-27

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