JP2014531216A - タウを認識するホスホ特異的抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
・ アミロイドタンパク質前駆体(APP)、すなわちプレセニリンにおける突然変異を原因とする早期発症型の家族性ADの例では、偏性の病態の原因は、アミロイドの蓄積であるが、病態は、後期発症型の散発性ADの例におけるものと同一の付随的なタウオパシーを含むのが不可避であり;
・ 認知障害及び痴呆症の重症度は、タウオパシーと相間があっても、アミロイド病態とはなく、これは、つい最近、臨床相1及び2のいくつかの研究で実証されており、これらの研究は、アミロイドについてのPIB−PET画像化を含み、多くの「偽陽性」、すなわち認知については正常で脳アミロイド量の高い個体を特定し;
・ 家族性FTDでは、タウオパシーは、突然変異体タウによって誘発され、アミロイド病態なしに神経変性を直接引き起こし;
・ 実験的なマウスモデルでは、アミロイド病態により生じる認識障害は、タンパク質タウの非存在により、ほとんど完全に軽減される(Roberson et al, 2007)。
・ タウのリン酸化を病態レベルにまで増加させると考えられているキナーゼの阻害剤、
・ 過剰リン酸化タンパク質タウの細胞質での凝集をブロックする化合物、
が含まれる。
(a) 配列番号73に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号74に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号75に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
(b) 配列番号70に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号71に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号72に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む。
(a) 配列番号81に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号82に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号83に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
(b) 配列番号78に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号79に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号80に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む。
(a) 配列番号93に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号94に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号95に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
(b) 配列番号89に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号90に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む。
(a) 配列番号101に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号102に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号103に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
(b) 配列番号98に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号99に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号100に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む。
(a) 配列番号106に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号107に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号108に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
(b) 配列番号89に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号115に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む。
a. 配列番号69に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号68に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は、
b. 配列番号77に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号76に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は、
c. 配列番号116に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は、
d. 配列番号92に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は、
e. 配列番号97に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号96に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は、
f. 配列番号105に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号104に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;
g. 配列番号118に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは、配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン、
を含む。
a. 配列番号84〜87;配列番号109〜114、117、及び119に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子;
b. 配列番号84〜87、配列番号109〜114、117、及び119に示す配列に対して、少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
c. 配列番号84〜87、配列番号109〜114、117、及び119に示す配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
d. 配列番号84〜87、配列番号109〜114、117、及び119に示す配列に対して、少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
e. 配列番号84〜87、配列番号109〜114及び117、及び119に示す配列に対して、少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
f. 配列番号84〜87、配列番号109〜114、117及び119に示す配列に対して、99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
g. 相補ストランドが、a)〜f)のいずれかの核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸;
h. a)〜g)のいずれかおいて遺伝コードの縮重によって定義されるヌクレオチド配列から逸脱しているヌクレオチド配列を含む核酸分子:
からなる群から選択される核酸分子を含み、
a)〜h)のいずれかに定義される前記核酸分子は、哺乳動物、具体的にはヒトのタウタンパク質上又はその断片上の、具体的には、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 393−401、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 396−401、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 394−400、リン酸化Serを404番目の位置(pS404)に含むタウ aa 402−406、及びリン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 393−400からなる群から選択される、配列番号67に示す、ヒトのタウタンパク質上の、ホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合し、一実施形態では、前記結合ペプチドは、高い結合親和性を有し、少なくとも10nMの、具体的には少なくとも8nMの、具体的には少なくとも5nMの、具体的には少なくとも2nMの、具体的には少なくとも1nMの、具体的には少なくとも500pMの、具体的には少なくとも400pMの、具体的には少なくとも300pMの、具体的には少なくとも200pMの、具体的には少なくとも100pMの、具体的には少なくとも50pMの解離定数を伴い、及び/又は、104M−1s−1以上の、具体的には、3〜5×104M−1s−1の間又はそれ以上の、具体的には105M−1s−1以上の;具体的には6〜9×105M−1s−1又はそれ以上の;具体的には106M−1s−1以上の、具体的には1〜4×106M−1s−1又はそれ以上の、具体的には107M−1s−1以上の会合速度定数を有するが、しかし、一実施形態では、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は非関連エピトープには結合しない。
a. タウタンパク質を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記の請求項のいずれか一項に記載の、結合ペプチド又はその断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させる工程(前記結合ペプチド又は抗体又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させる工程;
c. 免疫複合体の形成を検出する工程;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含む。
a. タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させる工程(結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程;
c. 免疫複合体の形成を検出する工程;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づる工程、
e. 前記免疫複合体の量を対照正常値と比較する工程;
を含み、対照正常値と比較した前記凝集体の量の増加は、前記患者がタウタンパク関連疾患又は状態を患っている、又は発症するリスクのあることを示す。
a. タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその機能部分、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させること(結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させること;
c. 免疫複合体の形成を検出すること;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づけること、
e. 前記免疫複合体の量を対照正常値と比較すること;
を含み、対照正常値と比較した前記凝集体の量の増加は、前記患者が依然として微小残存病変を患っていることを示す。
a. タウ抗原を含むことが疑われる、試料又は体の特定部分若しくは体の面積を、上記実施形態のいずれか一つに記載の、結合ペプチド又はその活性断片、具体的には抗体、具体的にはモノクローナル抗体又はその機能部分に接触させること(前記結合ペプチド又はその断片は、タウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 前記結合ペプチド、具体的には前記抗体、具体的には前記モノクローナル抗体又はその機能部分をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させ;
c. 免疫複合体の形成を検出すること;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在と関連づけること、
e. 前記免疫複合体の量を治療開始の前後で比較すること;
を含み、前記免疫複合体の量の減少が、前記患者が有する治療応答性の潜在能力が高いことを示す。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号149の5’プライマー及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマー対;並びに/又は
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号120、123、124、136、137、138、139、及び140からなる群から選択される5’プライマー、及び、配列番号131、134、及び141〜148からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号51及び169〜174からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合物;並びに/又は
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号124、127、及び150〜158からなる群から選択される5’プライマー、及び、配列番号130、及び159〜168からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号178、179、及び180からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合物;並びに/又は
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号121、127、139、154、155、及び175からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号128、129、147、176、及び177からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号51、及び188〜192からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合物;並びに/又は、
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号120、124、126、181、182、及び183からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号144、145、及び184〜187からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマーの混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号50、及び201〜204からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号51の3’プライマーを含むプライマーの混合物;並びに/又は
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号121、137、151、及び193〜197からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号131、141、144、166、198、199、及び200からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマー混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 第1の結合ドメインを増幅する、配列番号209〜214、及び219〜221からなる群から選択される5’プライマー、及び配列番号215の3’プライマーを含むプライマー混合物;並びに/又は
b. 第2の結合ドメインを増幅する、配列番号216,217、及び218からなる群から選択される5’プライマー、及び、配列番号208からなる群から選択される3’プライマーを含むプライマー混合物、
を用いてPCR増幅により得ることができるヌクレオチド断片上に位置するポリヌクレオチドによりコードされる。
a. 試料を、上記請求項のいずれか一つに記載の抗体又はその断片に接触させること(ペプチド又はその断片が、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること;
c. 免疫複合体の形成を、具体的にはELISAアッセイを適用して検出することを含む。
a. 両対象の脳ホモジネートを、上記請求項のいずれか一つに記載の抗体又はその断片に接触させること(ペプチド又はその断片が、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する);
b. 抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること;
c. 免疫複合体の形成を、具体的にはELISAアッセイを適用して検出すること、及び
d. タウ随伴疾患を患っていることが疑われる対象から得られた試料中の免疫複合体の量又は強度を、対照試料のそれと比較することを含み、
対照値と比較した前記免疫複合体の量又は強度の増加は、前記患者が微小残存病変を患っていたことを示す。
配列番号46〜57は、VH/VK順方向及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列を表す。
配列番号62は、タウ抗原、ペプチドT3のアミノ酸配列を表す(表1を見られたい)。
配列番号67は、タウ40とも称される、ヒトタウの最長のアイソフォーム(441 aa)のアミノ酸配列を表す。
配列番号68は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号69は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号70は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号71は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号72は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号73は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号74は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号75は、モノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号76は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号77は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号78は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号79は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号80は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号81は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号82は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号83は、モノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号84は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号85は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号86は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号87は、ハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−1D2−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号88は、それぞれハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18、A4−2A1−40、及びA4−4A6−48により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号89は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、ACI−35−4A6−Ab2、ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号90は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号91は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、ACI−35−4A6−Ab2、ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号92は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号93は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号94は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号95は、モノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号96は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号97は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号98は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号99は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号100は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の重鎖可変領域(VH)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号101は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号102は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号103は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号104は、それぞれハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30、及びA6−2G5−41により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号105は、それぞれハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30、及びA6−2G5−41により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号106は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の軽鎖可変領域(VK)のCDR1のアミノ酸配列を表す。
配列番号107は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の軽鎖可変領域(VK)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号108は、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の軽鎖可変領域(VK)のCDR3のアミノ酸配列を表す。
配列番号109は、それぞれハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18、A4−2A1−40、及びA4−4A6−48により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、及びACI−35−4A6−Ab2の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号110は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号111は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB1の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号112は、ハイブリドーマ細胞株A6−2G5−08により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号113は、それぞれハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30、及びA6−2G5−41により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号114は、それぞれハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30、及びA6−2G5−41により産生される、それぞれモノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号115は、モノクローナル抗体ACI−35−2G5−AB2、及びACI−35−2G5−AB3の重鎖可変領域(VH)のCDR2のアミノ酸配列を表す。
配列番号116は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号117は、ハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−2A1−Ab1の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号118は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のアミノ酸配列を表す。
配列番号119は、ハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48により産生されるモノクローナル抗体ACI−35−4A6−Ab2の軽鎖可変領域(VK)のヌクレオチド配列を表す。
配列番号120〜221は、VH/VK順方向及び逆方向プライマーのヌクレオチド配列を表す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で使用されるとおり、交換可能であり、ペプチド結合により連結されるアミノ酸から構成される生体分子を意味するように定義される。
1) アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リシン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
この研究の目的は、抗タウmAbs(モノクローナル抗体)を生成してスクリーニングすることであった。ハイブリドーマを、タウワクチン免疫化マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞株との融合により生成した。ハイブリドーマを、ワクチン調製に使用したリン酸化及び非リン酸化タウ抗原ペプチドだけでなく、リン酸化及び非リン酸化の両方の完全長タウタンパク質に対する反応性について評価した。ハイブリドーマのスクリーニングもまた、タウタングルに対するハイブリドーマ上清の反応性について、タウトランスジェニックマウス脳切片上での免疫化学を用いて実行した。
1.1.1 融合
ハイブリドーマの産生には、ACI−35(タウ393−408[pS396、pS404])をワクチン投与した野生型C57BL/6マウスを用いた。マウスを、0日目に、その後、再び4日目に、ACI−35ワクチンを用いて追加免疫し、融合を7日目に実行した。
8×96ウェルプレートをまず、IgGに発現に関して2回、スクリーニングした。陽性発現するクローンをその後、24ウェルプレートに移し、増殖細胞の細胞上清(=クローン)を、タウELISAスクリーン、及び免疫組織学的TAUPIRスクリーンにおいて試験した。ELISA及び/又はTAUPIRでの陽性の上清をT25フラスコに移して、クローンを再び、タウELISAスクリーン及びTAUPIRスクリーンにおいて、IgG発現に関してスクリーニングした。
ELISAプレート(Costar;シグマ社(Sigma))を、コーティング緩衝液中の50μl/ウェルの抗マウスIgG抗体(AbDセロテック社(AbD Serotec)、ドイツ、デュッセルドルフ)で、16時間4℃でコーティングした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、ウェルを、100μl/ウェルのブロッキング溶液で1時間、外界温度でブロッキング処理した。希釈しないハイブリドーマ上清(1ウェルあたり50μl)を、1時間、外界温度でインキュベートした。洗浄の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、又はIgM(AbDセロテック社)の混合物を、1時間、外界温度で塗布した。最終洗浄の後、HRP基質(TMB;3−3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)を用いて検出を実行し、プレートを405nmで、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。結果は、光学濃度(O.D.)で表現する。
ハイブリドーマELISAスクリーンを、タウペプチド(ACI−35、T3.5:タウ393−408[pS396/pS404;ポリペプチドラボラトリーズ(PolyPeptide Laboratories)、デンマーク、ヒレレズ)、対応する非リン酸化タウペプチド(T3.6:タウ393−408、ポリペプチドラボラトリーズ)、リン酸化完全長(441aa)タウタンパク質(pタウタンパク質、Vandebroek et al., 2005)、及び完全長(441aa)タウタンパク質(タウタンパク質、シグマケム社(SignalChem)、カナダ、リッチモンド)上で実行した。最後に、ウシ血清アルブミン(BSA)を、陰性対照として用いた。
TAUPIR実験を、実施例3.1.2.からのプロトコルに従って行った。
ELISAプレートを、炭酸塩−重炭酸塩コーティング緩衝液pH9.6(シグマ社、スイス、ブーフス)中の5ug/mlの抗マウスIgG F(ab’)2断片特異抗体(ジャクソンラボラトリーズ、米国、ペンシルベニア州、ボルチモア)を用いて一晩、4℃でコーティングした。プレートを洗浄後、希釈しないハイブリドーマ上清、陽性対照IgG1抗体(1ug/mlで6E10:コーバンス社(Covance)、米国、カリフォルニア州、エメリービル)又は陰性対照(培地単独)を、1時間、室温でインキュベートした。洗浄工程の後、二次AP結合ヤギ抗マウスIgG(1+2a+2b+3のサブクラス)Fcγ断片特異抗体(ジャクソンラボラトリーズ、米国、ペンシルベニア州、ボルチモア)を、プレート上で2時間、37℃でインキュベートした。最終洗浄の後、pNPP(パラニトロフェニルリン酸塩)、すなわちAPに対するホスファターゼ基質で検出を行ない、プレートを、405nmで、ELISAプレートリーダーを用いて読みとった。結果を、結果を、O.D.(光学濃度)として表現する。
融合の結果得られた、8×96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生に関してスクリーニングした。試験した768ウェル(8×96ウェル)から、IgG産生に対して陽性の48ウェルを、ワクチンホスホペプチド、及び完全長ホスホタウに最も良好に結合した結果に基づいて選択した。選択は、ELISAによる、ペプチド及び完全長ホスホタウタンパク質への結合、並びに、非ホスホペプチド及び非ホスホ完全長タウタンパク質と比較した場合の選択性に基づいた。24とおりの選別されたハイブリドーマを、ハイブリドーマあたり2プレートに1個の細胞/ウェルで、及び1プレートに0.5個の細胞/ウェルで播種して、サブクローンニングした。上清を再び試験して、ホスホペプチド及びホスホタンパク質に結合させて結合プロファイルを確認し、その後、6週間の培養後に安定性を評価した。その後、8とおりの安定クローンを選択し、「方法」に記載のELISA及びTAUPIRを用いて、アイソタイプ判定及び結合に関して試験した。
生成した抗体は、pタウペプチドへの高い特異性を示し、非リン酸化ペプチドには限界でしか結合しなかった。
ハイブリドーマ細胞からの、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を、クローニングし、抗体結合の特徴だけでなく、DNA配列、相補性決定領域(CDR)の位置を決定した。
目的は、タウリポソームワクチンで免疫されたマウスに由来するサブクローニングされたハイブリドーマから生成した抗体のホスホタウ(pタウ)結合を測定することであった。これを試験するため、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を用いて、リポソームワクチン調製に使用したリン酸化及び非リン酸化タウ抗原ペプチドだけでなく、リン酸化及び非リン酸化された両方の完全長タウタンパク質への、精製抗体の結合を測定した。
3.1.1. ELISA:ホスホタウ結合アッセイ
精製抗体のタウ又はpタウへの結合を試験するため、ELISAアッセイを使用した。簡潔には、Nunc MaxiSorp 96ウェルプレート(ヌンク社(Nunc)、デンマーク、ロスキレ)を、1μg/mLの完全長(441 aa)タウタンパク質(シグナルケム社(SignalChem)、カナダ,リッチモンド)、又はリン酸化完全長(441 aa)タウタンパク質(Vandebroek et al., 2005)でコーティングした。加えて、プレートを、10μg/mLのタウ由来のワクチンペプチド、タウ393−408(S396及びS404上でリン酸化された、又はそうでないもの)でコーティングした。ワクチン調製で使用しなかった異なるpタウエピトープのタウ及びpタウ配列への交差反応性について試験するため、プレートを、10μg/mLの以下のペプチド:タウ393−408(S396及びS404上でリン酸化された、又はそうでないもの)でコーティングした。コーティングは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、4℃で一晩、行った。プレートを、0.05%のTween20/PBSを用いて完全に洗浄した後、0.05%のTween20/PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて1時間、37℃でブロッキング処理した。試験される抗体をその後、20から0μg/mLの間の、8又は16とおりの2倍希釈系列に加え、37°Cで2時間、インキュベートした。プレートをその後、前述のとおり洗浄し、AP結合抗マウスIgG二次抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、英国、サフォーク)を1/6000に希釈して、0.05%のTween20/PBS中に、37℃で2時間、加えた。洗浄の後、プレートを、pニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(pNPP;グマアルドリッチ社、スイス、ブーフス)すなわちホスファターゼ基質溶液を用いてインキュベートし、30分、1、2、又は16時間の培養時間の後に、405nmで、ELISAプレートリーダーを用いて読み取った。
TAUPIR染色のために、脳断片を、TPLHマウス(hTauP301Lの最長のアイソフォーム(441aa)を発現するトランスジェニックマウス)、老いた(18月齢より高齢)ダブルトランスジェニックbiGT(TPLHと交配させたGSK−3βトランスジェニックマウス)マウス、及びダブルトランスジェニックbiAT(TPLHと交配させたhAPPV717Iトランスジェニックマウス)マウスから得た。陰性対照については、タウノックアウトマウス(TKO;6月齢)からの断片を使用した。脳断片を、5分間、PBS中で洗浄した後、15分間、室温で、PBS:MeOH(1:1)中の1.5%のH2O2中でインキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロッキング処理した。断片を3回、PBST(PBS/0.1%のTritonX100)中で洗浄した後、それらを30分間、室温でPBST+10%のFCS(ウシ胎仔血清)ブロッキング溶液中でインキュベートした。試験している抗タウ抗体を用いるインキュベーションを一晩、4℃で、以下の抗体濃度:PBST/10%FCS中、0.0053μg/mLのACI−35−2A1−Ab1、0.0048μg/mLのACI−35−2A1−Ab2、0.015μg/mLのACI−35−4A6−Ab1、0.0047μg/mLのACI−35−1D2−Ab1、0.0055μg/mLのACI−35−2G5−Ab1、並びに、0.01μg/mLのACI−35−2G5−Ab2及びACI−35−2G5−Ab3、を用いて行った。断片を次に3回、PBST中で洗浄した後、PBST/10%FCS中のHRP結合ヤギ抗マウス(ダコ社(Dako)、デンマーク、グロスストルプから購入)二次抗体を用いて、一時間、室温でインキュベートした。検出に先立って、断片を3回、PBSTで洗浄し、50mMのトリス/HCl、pH7.6中で5分、インキュベートした。検出は、ジアミノベンジジン(DAB:50mMのトリスHClを10ml+30%のH2O2を3μlの中に1錠剤;MPバイオケミカルズ社(MP Biomedicals)米国、オハイオ州、ソロン)中で3分間、断片をインキュベートすることにより、実行した。反応を、断片を3回、PBST中で洗浄することにより停止させた。断片をその後、シラン処理したガラスプレートに移し、ウォームプレート上で2時間、50℃で風乾した。対比染色を、マイヤーヘマトキシリン(フルカケミ社(Fluka Chemie)、スイス、ブーフス)を用いた1分間の培養を用いて実行した後、水道水を流して4分間の洗浄工程を実行した。断片を、50%、70%、90%のエタノール槽に通し、100%のエタノール槽に2回通した後、キシロール中を2回、1分間通すことにより脱水させた。最後に断片を、DePeX(BDHケミカル社(BDH Chemicals Ltd.)、英国、プール)を用いてマウントし、撮像のため上にカバースリップガラスを置いた。
抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−2A1−Ab2、ACI−35−1D2−Ab1、ACI−35−2G5−Ab2、及びACI−35−2G5−Ab3は、リン酸化ヒトタウタンパク質への高い結合活性と特異性を示し(表2)、より詳細には、対応するワクチンにおいて使用した抗原性ホスホタウペプチドへの高い結合活性と特異性を示した。非リン酸化タウへの、又は他のリン酸化及び非リン酸化タウ由来の試験ペプチドへの交差反応性は、観察されなかった。抗体ACI−35−4A6−Ab1は、その選択のとおり、ワクチン調製に使用した抗原性ホスホタウペプチドへのみ高い結合活性を示した。ワクチン調製に使用した抗原性ペプチドの、非リン酸化対応物への低い交差反応性が見出され、これはクローン選択にもとづいて予測されていたものである。抗体ACI−35−2G5−Ab1は、ワクチン調製において使用した抗原性リン酸化タウペプチドへのみ、高い結合活性と特異性を示した。ワクチンにおいて使用した抗原性ペプチド配列の一部を含むT4.5リン酸化ペプチドへの小さい交差反応性が観察された。
4.1 方法
4.1.1 SPR結合アッセイ
すべてのSPR実験を、Biacore X機器(GEヘルスケア社(GE Healthcare))上で実行した。センサーチップSA(カルボキシメチルデキストランに由来するストレプトアビジン)は、GEヘルスケア社から購入した。ランニング緩衝液(Running buffer)は、PBS(ダルベッコPBS、シグマ社 D8537)であった。まず、結合しないストレプトアビジンを、16mMのNaOH(aq)を8パルス(それぞれ約1μL)、注入することにより、センサー表面から除去した。ホスホタウペプチドをその後、PBS中に可溶化して、最終ペプチド濃度1μMにし、その後、センサーチップのフローセル(fc)2の上に、5μl/分で注入(35μL)した。カップリングの後、最終の固定化レベルの130RUが得られた。チップ表面への抗体の結合を研究するため、ランニング緩衝液を連続して2倍希釈することにより、いくつかの抗体濃度を調製した。注入を、fc1及び2の両方の上に、流量50μL/分で120秒間、実行した。フローセル1は誘導体化させず、fc1の応答をfc2から引き算して、機器ノイズ及び、バルク反射率の変化を補正した。各注入の後、表面をランニング緩衝液で即座に、100秒間洗浄した。残存するあらゆる結合した抗体をチップから除去し、表面の再生を、1μLの10mMグリシン−HCl、pH1.7を注入することにより実行した。動態解析を、数値積分のアルゴリズム、及びBIAevaluation 3.0を用いた大域解析を用いて実行した。異なる濃度抗体の注入に関して得られたセンサーグラム(sensogram)を重ね合わせ、ベースラインをゼロに調節した。曲線のフィッティングのために、すべてのデータを同時に1:1均質(ラングミュア(Lungmuir))モデルにフィッティングした。
抗タウ抗体の、リン酸化タウペプチドへの結合を、SPRを用いてリアルタイムで監視した。抗体結合の結合相及び解離相の解析を用いて、解離定数KDだけでなく、会合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)を決定することができた。
5.1 方法
5.1.1. ヒト試料:本明細書に記載のアッセイに使用されるヒト脳試料の調製
アルツハイマー病(AD)の10人、及び年齢適合対照10人に関しての死後の側頭皮質を、マイアミ大学の脳遺贈バンク(Brain Endowment Bank)から得た。AD患者(女性7人、男性3人)に関してに死亡時の平均年齢は、81.1±7.3歳であり、対照(神経学的症状なし;女性9人、男性1人)については、87.0±5.8歳であった(スチューデントt検定によれば、AD患者との有意差無し)。すべての試料は、白人起源であった。AD試料を、表4に示すとおり、ブラーク(Braak)病期(Braak and Braak (1991) Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259)に関して評価した。
マルチタイター96ウェルプレートを、炭酸塩/重炭酸塩緩衝剤中、抗体を用い一晩、4℃、5μg/mlでコーティングした。PBS−Tween中で4回の洗浄の後、プレートに、PBS−Tween中10%のBSAを、37℃で1時間、染み込ませた。脳ホモジネートをその後、ウェルに、50μLのPBS中、100ng/μLの濃度で加え、37℃で2時間、インキュベートした。プレートを洗浄した後、コーティングに使用したのと同じ抗体、しかしビオチン化したものを、37℃で1時間、5μg/mLの最終濃度でインキュベートした。プレートを洗浄し、アビジンぺルオキシダーゼ(Vectastain ABC kit、ベクターラボラトリーズ社(Vector Laboratories))、及びその基質(ABTS、ロッシュ 10881420)を加えた後、プレートを、異なる時点で読み取った。値は、AD10人、及び対照対象10人に関して、平均のOD±SDとして表現される。
抗体ACI−35−2A1−Ab1、及びACI−35−2G5−Ab3を、AD及び対照の対象からの脳ホモジネート中のホスホタウ(pタウ)マルチマーを検出する能力に関して、ホスホ及びマルチマー特異的なセットアップ1のELISAを用いて試験した。我々は、両抗体についてのこのアッセイにおいて、ADと年齢適合対照(n=10)との間の高度に有意な(p<0.001)差異を観察した(図1)。AD及び年齢適合対照の脳からのヒト死後皮質ホモジネートを用いて、我々は、死後ヒト脳試料におけるタウ−pS396のマルチマーを検出する、ACI−35−2A1−Ab1及びACI−35−2G5−Ab3抗pタウ抗体の能力を実証した。
6.1 方法
6.1.1. ヒト試料:方法5.1.1に記載のヒト試料を調製する同じ方法
6.1.2 ウェスタンブロット:ADに冒された個体及び年齢適合対照からのヒト死後皮質脳ホモジネートにおけるリン酸化タウの存在を検出するウェスタンブロットアッセイ
抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−1D2−Ab1、及びACI−35−2G5−Ab3を、AD及び対照の対象からの脳ホモジネートにおけるホスホタウ(pタウ)を検出するその能力について、ホスホ特異的ウェスタンブロットを用いて試験した。すべての死後ヒト皮質試料をまず、ヒトタウに対する市販の抗体を用いて評価した:抗総タウ(TAU−13)及び抗pS396タウ(E178)抗体。図2Aに示すとおり、我々は、TAU−13抗体を用いて、すべての試料に、50〜70kDaの範囲の異なるタウアイソマーに対応する特徴的なタウラダーを検出した。興味深いことに、AD脳ホモジネートでは、我々はまた、AD脳における過剰リン酸化タウの存在に関して予想されていた、タウの移動パターンにおける相対的なずれを観察した。市販の抗pS396タウ抗体は、この仮説を確認し、対照とADを非常に良好に識別した(図2B)。実際、抗pS396タウ抗体は、タウの(過剰)リン酸化アイソフォームに対応する、三つの主要な免疫反応性バンドを、すべてのAD脳ホモジネートにおいて、そして健康な対照には、非常に弱い強度で、又は存在しないことを明らかにした。加えて、AD試料は、凝集タウの存在を反映する可能性の高い、高分子量のTAU−13免疫反応性塗抹を示した(図2A)。
7.1 方法
7.1.1. ヒト試料。方法5.1.1.に記載の方法と同じであるが、最後の部分、S1画分の調整は別であるヒト試料を調製する方法
7.1.2. S1タウタンパク質画分:可溶性タウ及びホスホタウタンパク質を得る、総ホモジネート画分の細分画
AlphaLISAアッセイに使用する可溶性タウ(S1)画分の調整のため、TH画分を等分して、半分の体積を−80℃で保存した。残りのTH画分をさらに処理し、Triton X−100を加えて最終濃度0.4%にした。試料をよく混合して、何回か攪拌した後、5’000rpmで5分間、4℃で遠心分離した。上清は、S1画分を構成する。試料を等分し、−80℃で保存した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬を用いて測定した。
抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−1D2−Ab1、及びACI−35−2G5−Ab3は、すべてタウpS396に対するものであり、EZ−Link Micro Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit(サーモサイエンティフィック社(Thermo Scientific))を用いて、製造元の推奨に従ってビオチン化した。標識化反応においては、抗体に対して25倍のモル過剰なビオチンを使用した。ビオチン化の後、Slide−A−Lyzer MINI透析デバイス、10K MWCO(サーモサイエンティフィック社)を用いて、PBSに対する透析により、過剰な遊離ビオチンを除去した。ビオチン化抗体を、ACI−35−2A1−Ab1−BT、ACI−35−1D2−Ab1−BT、及びACI−35−2G5−Ab3−BTと表した。抗体Tau−13を、活性化したAlphaアクセプタービーズ(Alpha Acceptor beads)(パーキンエルマー社(Perkin Elmer))に、以下のプロトコルを用いて結合させた:0.1mgのTau−13抗体溶液(タンパク質Aカラムで精製)を、1mgのAlphaLISAアクセプタービーズペレットと混合し、0.13Mのリン酸塩緩衝液(pH8.0)で補充して200μLの最終反応体積にした。次に、10%のTween−20を1.25μL及び25mg/mLのNaBH3CNの溶液10μLを加え、チューブを37℃で48時間、軽度の回転数(7rpm)で回転させてインキュベートした。結合反応の後、ビーズ上の活性部位を、10μLのカルボキシメトキシルアミン溶液を加えることによりブロッキング処理し、さらに、37℃で1時間、インキュベートした。最後に、ビーズを2回、200μLの0.1MトリスHCl、pH8.0で洗浄し、200μLの保存緩衝液(0.05%のプロクリン300を含むPBS)中に4°Cで保存し、最終的に、AlphaLISAアクセプタービーズ濃度を5mg/mlにした。
S1試料をAlphaアッセイ緩衝液(パーキンエルマー AL000C)中であらかじめ希釈して、20μg/mLの貯蔵濃度を得た。以下の試薬を384ウェルの白色のOptiPlate(パーキンエルマー)に加えて、50μLの最終体積にした:S1脳ホモジネート(5μL)、10μLのACI−35−2A1−Ab1−BT、ACI−35−1D2−Ab1−BT、又はACI−35−2G5−Ab3−BTは、それぞれ0.2nM、0.5nM、又は0.5nMの最終抗体濃度、及び10μLのタウ13−アクセプタービーズ結合体は、2.5μg/mLの最終ビーズ濃度。反応混合物を、1時間、室温でインキュベートし、25μLのストレプトアビジンドナービーズを加えて、さらに2時間、室温、暗所でインキュベートした。読み出しは、EnSpire Alpha機器を用いて行い、分析は、EnSpire Workstation version 3.00を用いて行った。データの統計分析を、GraphPad Prismソフトウェアを用いて実行した。結果を、Alpha単位±SDとして表示する。
AlphaLISAアッセイを使用して、抗体ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−1D2−Ab1、及びACI−35−2G5−Ab3を、死後ヒト脳ホモジネート中のタウpS396を検出し、ADを年齢適合対照から識別する能力について試験した。すべての抗体が、タウpS396を検出した(図4A、4B、4C)。ADと対照(n=10)の間の信号検出の差異はまた、すべての抗体について高度に有意であり、AD対象の脳において信号の増加を示した;ACI−35−2A1−Ab1(p<0.0001)、ACI−35−1D2−Ab1(p<0.0001)、及びACI−35−2G5−Ab3(p=0.002)。結論として、AlphaLISA技術を使用して、ACI−35−2A1−Ab1、ACI−35−1D2−Ab1、及びACI−35−2G5−Ab3の、AD対象の脳におけるpS396タウを検出し、ADと対照のドナーを差別化する能力を実証した。
8.1 方法
8.1.1. 研究のセットアップ:タウトランスジェニックマウスにおける、抗pタウ抗体ACI−35−2G5−Ab3の投与例2例の、インビボでの治療効果
C57BL/6xDBAの背景を有する、6〜7月齢の雌及び雄のタウトランスジェニックマウス(TMHT)に、i.p.注射により3又は10mg/kgのACI−35−2G5−Ab3、又はビヒクル(PBS)を2回、1週間空けて投与した。14日目に、免疫組織学(IHC)のために、動物を安楽死させ、脳を採取し、処理した。海馬及び扁桃体におけるタウ病態の定量のために、脳1個あたり、5枚の切片(各高さから1枚)を、AT180(タウpT231に関して)及びHT7(総ヒトタウ抗体に関して)抗体を用いて標識し、続いて、免疫活性な面積を、Pro Plus(v6.2)ソフトウェアを用いて評価した。免疫活性な対象を、サイズ制限(扁桃体では30μm2、海馬では7μm2)以上、及び動態強度閾値以上で測定した。対象の全面積及び強度、並びに各閾値は、自動的に保管した。もし使用した場合には、動態閾値は、強度面積(area of intesity)(AOI)内の平均強度に加えてAOI内のピクセル強度の標準偏差を係数倍したものとして定義した。領域サイズは、海馬及び扁桃体を手作業で線引きして測定した。AT180及びHT7のIR面積データは、(海馬では)領域、又は(扁桃体では)AOIサイズで規格化した。
AT180pタウ抗体は、内因性でヒトのヒトpタウ(Thr231及びSer235で二重にリン酸化された)を検出する。この研究で使用したタウトランスジェニックマウスに関しては、AT180の組織学的測定は、海馬の及び類扁桃の神経細胞に対して集中的に行った。ACI−35−2G5−Ab3で治療したマウスは、扁桃体と海馬の両方で、体細胞標識のAT180の平均強度及び規格化された総和強度について有意な減少を有し(図5A及び5B)、治療マウスにおける、体細胞のAT180陽性pタウ全体の減少を示していた。
9.1 方法
抗ホスホタウマウスのモノクローナル抗体のエピトープマッピングを、異なるホスホ及び非ホスホペプチドライブラリーを用いてELISAにより実行した。使用したペプチドライブラリーT3のアミノ酸配列を、表11Aに示す。各ライブラリーは、ペプチドワクチン中に存在するホスホ及び非ホスホ配列にまたがる、短いビオチン化ペプチドからなる。加えて、ペプチドライブラリーを、抗体に結合するペプチド配列の各残基をアラニン(Ala)で置換して生成し、それらは表11B及び11Cに示すとおりである。各ライブラリーは、ペプチドワクチンに存在するホスホ及び非ホスホ配列にまたがる短いビオチン化ペプチドからなる。ペプチドライブラリーは、ANAWAトレーディングSA社(ANAWA Trading SA)から購入した。ペプチドライブラリーは、ANAWAトレーディングSA社Aから購入した。エピトープマッピングを、製造元(ミモトープス社(Mimotopes))の指示に従って行った。簡単に述べると、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート(NUNC社)を、リン酸塩緩衝正常生理食塩水(PBS)中、0.1%のBSAで、4℃で一晩、ブロッキング処理した。PBS−0.05%のTween 20で洗浄の後、プレートを室温で1時間、各ライブラリーからの異なるペプチドでコーティングし、PBS中、0.1%のBSA、0.1%のアジ化ナトリウムで希釈して、10μMの最終濃度とした。洗浄の後、プレートを室温で1時間、PBS中の2%BSA及び0.1%アジ化ナトリウム中に40ng/mlに希釈した試験抗体でインキュベートした。プレートを再び洗浄した後、AP結合抗マウスIgG二次抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、英国、サフォーク)を用いて、1/6000希釈で1時間、室温でインキュベートした。最終洗浄の後、プレートを、p−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物(pNPP;シグマアルドリッチ社、スイス、ブーフス)ホスファターゼ基質溶液でインキュベートし、2時間のインキュベートした後、405nmで、ELISAプレートリーダーを用いて読み取った。もし、光学強度(O.D.)が、バックグラウンドO.Dの少なくとも2倍であった場合には、結合は陽性であると考えた。
エピトープマッピング実験の結果として、本明細書に開示の抗体が特異的に結合する、必須のリン酸化アミノ酸残基(表5を見られたい)を含め、エピトープを同定することができた。
・ タウ aa 393−401、pS396(ACI−35−2A1−Ab1;ACI−35−2A1−Ab2)を必須
・ タウ aa 396−401、pS396(ACI−35−4A6−Ab1)を必須
・ タウ aa 394−400、pS396(ACI−35−1D2−Ab1)を必須
・ タウ aa 402−406、pS404(ACI−35−2G5−Ab1)を必須
・ タウaa 393−400、p396(ACI−35−2G5−Ab2; ACI−35−2G5−Ab3)を必須
10.1 方法
16μM(20μgのタウ/25μLの反応物)の最終濃度での、ヒト完全長タウの最長のアイソフォーム(TAU441;シグマケム社(SignalChem))を、HEPES、pH7.64(40mM)、EGTA(5mM)、MgCl2(3mM)、及びATP(2mM)を含むリン酸化緩衝液中、0.018単位(U)のGSK3β/pmolのタウで、1、6、又は20時間、4、30、又は37℃で、インキュベートした。GSK3βの1単位は、製造元(ニューイングランドバイオラボ社(New England BioLabs))によって、1pmolのホスフェートを30℃でATPからCREBリン酸化ペプチド(KRREILSRRPpSYR)に1分間で転写する酵素量として定義される。GSK3βでリン酸化されたタウ(pタウ−GSK3β)を、セリン202、396、404、409、トレオニン181、205、及び231の位置でリン酸化されたタウ、並びに総タウに対する抗体を用い、直接ELISA及びウェスタンブロット(WB)上で泳動させて調べ、キナーゼ活性及び特異性(示さず)を最適化し実証した。加えて、ブロットを、GSK3βの存在について、抗GSK3α/β抗体(バイオソース社、インビトロジェン社)を用いて調べた。すべてのWBについて、pタウ−GSK3βを、等体積の試料緩衝液A(125mMのトリスHCl、pH6.8、4%[w/v]のドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、20%のグリセロール、0.01%のブロモフェノールブルー、5%のβ−メルカプトエタノール)を加えて希釈し、試料を95℃に10分間、加熱した。30μgの試料を、4〜12%のビストリスゲル(インビトロジェン社)上に載せて、MOD SDS緩衝液(インビトロゲン社)中で泳動させ、タンパク質を、転写緩衝液(25mMのトリス、pH8.6、190mMのグリシン、20%のメタノール)中の、0.45μmのPVDFメンブレンに転写した。タンパク質の転写を確認するため、メンブレンを、Ponceau Sで5分間、染色した。続いてメンブレンを洗浄した後、1時間、ブロッキング緩衝液(TBS[50mMのトリスHCl、pH7.6、150μmMのNaCl]中、5%のBSA)中でブロッキング処理した。メンブレンを4℃で一晩、ブロッキング緩衝液、及び0.1%のTween中、一次抗体で染色した。ACI−35−2G5−Ab3を用いたブロットを、0.5μg/mLの抗体希釈で行った。
GSK3βで治療したタウは、異なるタウホスホセリン及びタウホスホトレオニン残基(示さず)に特異的な抗体を用いて確認したとおり、タウセリン396(タウ−pS396)でのリン酸化が高度に存在する結果となった。図7に、異なるGSK3β条件を用いて生成したタウpS396に関するSDS−PAGE、及びACI−35−2G5−Ab3抗体を用いてブロットしたメンブレンを示す。ACI−35−2G5−Ab3抗体は、タウpS396について特異的であり、タウpS396関して良好な信号を示し、ともに観察されたバンドは、これがタウpS396ダイマーに結合することを示唆している(図7、レーン11、及び13)。GSK3β治療が存在しない場合には、バンドは観察されなかった(レーン6〜8、及び14〜15)。
11.1 方法
11.1.1 ヒト試料−死後脳試料
1人のアルツハイマー病(AD)のドナー、AD19の死後の側頭皮質が、マイアミ大学の脳遺贈バンクから得られた。我々は、この研究のための試料提供に関し、マイアミ大学の脳遺贈バンクに心から感謝する。ドナーに関する人口統計学的情報を以下の表12に示し、その中でブラーク病期(Braak and Braak (1991) Neuropathologicalstageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 82:239-259)もまた表示する。
AD19ドナーの死後の側頭皮質を、以下のプロトコルに従って、ホモジネートした。脳断片を計量し、ホスファターゼ阻害剤(30mMのNaF、0.2mMのNa3VO4、1nMのオカダ酸、1mMのPMSF、5mMのNa4P2O7)及びプロテアーゼ阻害剤(Complete Mini、ロッシュ社(Roche) 04 693 124 001)を含む、9体積の25mMのトリスHCl、pH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA中でホモジネートした。ホモジネートは、ガラス製ポッターを用い氷上で行った。これは、総ホモジネート(Total Homogenate(TH))画分を構成する。TH画分を、半分の体積に等分し、−80℃で保存した。TH画分の残りをさらにTriton x−100を加えて処理し、0.4%の最終濃度にした。試料をよく混合し、数回攪拌した後、5’000rpmで5分間、4℃で遠心分離した。上清はS1画分から構成される。試料を等分して、−80℃で保存した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬(シグマ社 B6916−500)を用いて測定した。
臨床的に確認された軽度〜中程度のアルツハイマー病(AD)患者、及び健康なボランティア対照ドナー(Ctrl)からの脳脊髄液(CSF)試料の提供を、ベルリン医科大学チャリテ(CharitE School of Medicine Berlin)から受けた。我々は、試料提供について、ベルリン医科大学チャリテに、心から感謝する。試料を等分して−80℃で保存し、それ以上処理せずに使用した。CSF試料ドナーに関する人口学的及び臨床的な情報を、以下の表13に示す。
11.1.4.1 抗体カップリング
CSFタウの免疫濃縮に関しては、市販のヒトタウ抗体(クローンHT7、サーモサイエンティフィック社 MN 1000)を使用した。HT7をタンパク質Gダイナビーズ(Dynabrads)(ライフテクノロジーズ(Life Technologies) 10004D)にカップリングさせるため、各試料に対して、1.5mg(50μL)のタンパク質Gダイナビーズを、攪拌により再懸濁させて、1.7mLのMaximum Recoveryチューブ(アキシジェン社(Axygen) MCT−175−L−C)に移した。ビーズをチューブ側面に集めて緩衝液を除去するため、チューブを磁気支持体(DynaMag、ライフテクノロジーズ社 123.21D)上に置いた。200μLのPBS中、1μgのHT7を、Hula Mixer(ライフテクノロジーズ社)を用い、10/20rpm、25°/10のtilt、 5°/2のvibroで10分間、タンパク質Gダイナビーズに結合させた後、チューブを磁石上に置き、緩衝液を除去し、チューブを1回、200μLのPBS/0.02%のTween20を用い優しいピペット操作で、そして2回、200μLの結合緩衝液(新たに調製した、20mMのリン酸Na、150mMのNaCl)で、洗浄した。洗浄緩衝液は常に、磁石上で除去した。HT7をタンパク質Gダイナビーズへ架橋させるために、HT7−ビーズを、結合緩衝液中に溶解させた5mMのBS3溶液(シグマアルドリッチ社 S5799)250μLの中に再懸濁させて、室温(RT)で30分間、回転させて(上のセッティングと同じ)、インキュベートし、12.5μLのクエンチング緩衝液(1MのトリスHCl、pH7.5)を15分間、加えて反応を停止させた後、200μLのPBS/0.02%のTween 20で3回、洗浄した。
CSFを希釈せずに使用し、各ドナーについて1mLのCSFを、HT7架橋ビーズを含むチューブに移し、4℃で1時間、連続回転(10rpm)下でインキュベートした。結合しなかった物質を磁石上で除去した後、ビーズを200μLのPBS/0.02%のTween 20で洗浄し、タウを、PBS中、20μLの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中に、70℃で10分間、溶出した。ビーズの沈降を避けるために、チューブを短時間(加熱した水平ミキサー中、300rpmで1分ごとに5秒間)混合した。このインキュベーションの後、チューブを磁石上に置いて、溶出試料を集めた。
11.1.5.1 AlphaLISAアッセイの記述
・ Alphaアクセプタービーズにカップリングした、汎タウ(Pan−Tau)抗体タウ−13(アブカム社(Abcam) ab24636)が、試料中に存在するヒトタウに結合し、「タウタンパク質−タウ−13抗体−アクセプタービーズ」複合体を形成する。
・ 検出抗体ACI−35−2G5−Ab3−BTが、ヒトタウのpS396に結合することにより、ストレプトアビジン(SAv)でコーティングしたAlphaドナービーズが複合体に結合する。
すべての試薬を反応させた後、化学発光信号を、EnSpire Alpha 2390リーダーを用いて読み出す。
AlphaLISAアッセイで使用するため、抗体ACI−35−2G5−Ab3を、製造元の指示に従って、EZ−Link Micro Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit(サーモサイエンティフィック社 21935)を用いてビオチン化した。抗体に対し25倍過剰のモル数のビオチンを、標識反応に用いた。ビオチン化の後、過剰の遊離ビオチンを除去し、抗体を4回、PBS中で、50’000 MWCO Spin−X UF 500 Concentrator(コーニング社(Corning) 431480)を用いて洗浄した。ビオチン化したACI−35−2G5−Ab3抗体を、ACI−35−2G5−Ab3−BTと表示する。
AlphaLISAアッセイで使用するため、抗体タウ−13を、活性化Alphaアクセプタービーズ(パーキンエルマー社(Perkin Elmer) 6772001)に結合させた。以下の結合プロトコルを使用した:0.1mgのタウ−13抗体溶液(タンパク質Aカラム上で精製)を、1mgのAlphaLISAアクセプタービーズのペレットと混合し、0.13Mのリン酸塩緩衝液(pH8.0)で補充し、最終反応体積の200μLとした。次に、10%のTween−20を1.25μL、及び25mg/mLのNaBH3CN溶液10μLを加え、チューブを37℃で48時間、優しく回転(7rpm)させてインキュベートした。結合反応の後、ビーズ上の活性部位を、10μLのカルボキシメトキシルアミン溶液を加えることによりブロッキング処理し、さらに37℃で1時間、インキュベートした。最後に、ビーズを2回、200μLの0.1Mトリス−HCl、pH8.0で洗浄し、200μLの保存緩衝液(0.05%のプロクリン−300を含むPBS)中、最終のAlphaLISAアクセプタービーズ濃度5mg/mlとして、4℃で保存した。
免疫濃縮したタウ脳試料、S1脳画分試料及び緩衝液ブランクを、この実験に使用した。各試料を、50μLの最終体積中で、384ウェルの白色OptiPlate(パーキンエルマー社 6007291)を用いて分析した。すべての試薬の希釈を、Alphaアッセイ緩衝液(パーキンエルマー社 AL000C)を用いて行った。
・ 5μLの試料(最終体積の1/10、従って、アッセイにおける最終タンパク質濃度は、試料濃度の1/10に相当する)。
・ S1脳画分試料については0.5%のSDS、10μLを、又は免疫濃縮されたタウ脳試料については10μLの単独の緩衝剤を加えた。
・ 15μLのACI−35−2G5−Ab3−BT抗体(最終濃度:5nM)をタウ13−アクセプタービーズ結合体と混合させた(最終ビーズ濃度:2.5μg/mL)。
・ 室温で1時間、インキュベート。
・ 20μLのストレプトアビジンドナービーズ(最終ビーズ濃度:25μg/mL)。
・ 室温30分、インキュベート(遮光)。
・ EnSpire Alpha機器を用いて読み取り、EnSpire Workstation version 3.00を用いて分析。
各試料を、50μLの最終体積中で、384ウェルの白色OptiPlate(パーキンエルマー社 6007291)を用いて分析した。すべての試薬の希釈を、Alphaアッセイ緩衝液(パーキンエルマー社 AL000C)を用いて行った。
・ 各ドナーから免疫沈降させた溶出物5μL。
・ 20μLのACI−35−2G5−Ab3−BT抗体(最終濃度:5nM)を、タウ13−アクセプタービーズ結合体と混合(最終ビーズ濃度:2.5μg/mL)。
・ 室温で1時間、インキュベート。
・ 25μLのストレプトアビジンドナービーズ(最終ビーズ濃度:25μg/mL)。
・ 室温で30分、インキュベート(遮光)。
・ EnSpire Alpha機器で読み出し、EnSpire Workstation version 3.00で分析。
データの統計解析を、GraphPad Prismソフトウェアを用いて実行した。
予備実験からは、ヒトCSF中に存在するpS396の量が、検出するには少なすぎることが示された。この理由から、高感度免疫検出と組み合わせた免疫学的濃縮プロトコルを開発した。免疫学的濃縮プロトコルを最初に、ヒトAD死後脳物質を用いて確認した。未処理の脳ホモジネート試料の、タウ免疫学的濃縮試料との対照比較から、対応する濃度では、タウ13/ACI−35−2G5−Ab3 AlphaLISAアッセイの検出限界は、未処理の試料については0.5μg/mL、免疫学的に濃縮した試料については0.002〜0.006μg/mLの間に達し、100倍の濃縮を示すことが明らかになった(図9)。
表10. 以下のハイブリドーマ細胞株を、AC Immune SA社 スイス ローザンヌ 1015 PSE−EPFLビルディング B(PSE−EPFL Building B, 1015 Lausanne/Switzerland)、及びルーヴェンカトリック大学 ベルギー ルーヴェン 3000、 ワアイストラート 6−Box 5105(Waaistraat 6 − Box 5105, 3000 Leuven/Belgium)の名のもとで、「ドイツ微生物収集および細胞培養(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)GmbH (DSMZ)ブラウンシュヴアイヒ 38124 インホッフェンシュトラーセ 7B(Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig)」に、ブダペスト条約の定めるところに従って寄託した:
Claims (91)
- 哺乳動物のタウタンパク質上又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する抗体又はその機能断片であって、前記抗体又は抗体断片が、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで検出、及び/又は調節することができる抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)及び404番目の位置(pS404)に含むアミノ酸配列VYKSPVVSGDTSPRHL(配列番号62)(配列番号67のタウ aa 393−408)を有する、又はその内部にあるホスホエピトープに結合する、抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、哺乳動物の脳における可溶性及び/又は不溶性タウのレベルを調節する調節抗体である、請求項2に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、大脳皮質及び/又は海馬おける可溶性及び/又は不溶性タウのレベルを調節する、請求項3に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、可溶性及び/又は不溶性の総タウタンパク質のレベルを低下させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、可溶性及び/又は不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを低下させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、過剰リン酸化タウタンパク質を含む対らせん状フィラメントのレベルを低下させる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、可溶性の総タウタンパク質、可溶性リン酸化タウタンパク質、及びpタウ対らせん状フィラメントのレベルを低下させる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、少なくとも10nMの解離定数を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、少なくとも82nM、5nM、少なくとも2nM;少なくとも1nM、少なくとも500pM、少なくとも300pM、少なくとも200pM、少なくとも100pMの解離定数を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が、104M−1s−1以上;105M−1s−1以上、106M−1s−1以上の会合速度定数を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも4nMの解離定数、及び105M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも3nMの解離定数、及び106M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも2nMの解離定数、及び104M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも1nMの解離定数、及び105M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも200pMの解離定数、及び105M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が高い結合親和性を有し、少なくとも100pMの解離定数、及び106M−1s−1以上の会合速度定数を伴う、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又は抗体断片が:
a. リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含む、VYKSPVVSG(配列番号67のタウ aa 393−401);
b. リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含む、SPVVSG(配列番号67のタウ aa 396−401);
c. リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含む、YKSPVVS(配列番号67のタウ aa 394−400);
d. リン酸化Serを404番目の位置(pS404)に含む、DTSPR(配列番号67のタウ aa 402−406);及び
e. リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含む、VYKSPVVS(配列番号67のタウ aa 393−400)
からなる群から選択されるエピトープに結合する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。 - 前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 393−401(VYKSPVVSG)を含む配列番号67に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項1〜19のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 396−401(SPVVSG)を含む配列番号67に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項1〜20のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 394−400 (YKSPVVS)を含む配列番号67に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項1〜21のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特にリン酸化Serを404番目の位置(pS404)に含むタウ aa 402−406(DTSPR)を含む配列番号67に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項1〜22のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又はその断片が、哺乳動物のタウタンパク質上の、具体的にはヒトタウタンパク質上の、しかし特に、リン酸化Serを396番目の位置(pS396)に含むタウ aa 393−400(VYKSPVVS)を含む配列番号67に示すヒトタウタンパク質上のエピトープに結合する、請求項1〜23のいずれかに記載の抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜24のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号73に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号74に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号75に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%若しくは100%それに同一なアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号70に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも95%、具体的には98%、具体的には99%それに同一なアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号71に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも94%、95%、96%、97%、98%、又は99%、それに同一なアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号72に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%若しくは100%、それに同一なアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜25のいずれかに記載の抗体又はその機能断片抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
a. 配列番号73に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号74に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号75に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む、第1の結合ドメイン;及び/又は
b. 配列番号70に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号71に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号72に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む、第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。 - 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜26のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号81に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号82に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号83に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%若しくは100%、それに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号78に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号79に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号80に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、それに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜27のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
a. 配列番号81に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号82に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号83に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
b. 配列番号78に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号79に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号80に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。 - 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜28のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号93に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号94に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号95に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3と含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号89に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号90に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3と含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜29のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
a. 配列番号93を含むアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号94に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号95に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
b. 配列番号89に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号90に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。 - 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜30のいずれかに記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号101に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号102に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号103に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号98に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号99に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号100に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを、順番に含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜31のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
a. 配列番号101を含むアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号102に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号103に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
b. 配列番号98に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号99に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号100に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。 - 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜32のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が、配列番号106に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号107に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号108に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号89に示すアミノ酸配列を伴うCDR1と、配列番号115に示すアミノ酸配列を伴うCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、前記CDRのいずれか一つに同一なアミノ酸配列を伴うCDR3とを含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜33のいずれかに記載の抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片が:
a. 配列番号106を含むアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号107に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号108に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含む第1の結合ドメイン;及び/又は
b. 配列番号89に示すアミノ酸配列を含むCDR1と、配列番号115に示すアミノ酸配列を含むCDR2と、配列番号91に示すアミノ酸配列を含むCDR3とを含むアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン
を含む、抗体又はその機能断片。 - 配列番号69、77、116、92、118、97、105から選択される示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、それらと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/又は、配列番号68、76、88、96、104に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、具体的には少なくとも85%、具体的には少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、具体的には少なくとも95%、具体的には少なくとも96%、具体的には少なくとも97%、具体的には少なくとも98%、具体的には少なくとも99%、若しくは100%、それらと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号69に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも98%若しくは99%、それと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン;及び/又は、配列番号68に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも90%、91%、92%、若しくは93%、それと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号77に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも93%、94%、若しくは95%、それと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン;及び/又は、配列番号76に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも88%、89%、若しくは90%、それと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜37のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号116,92、若しくは118に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも93%、94%、若しくは95%、それらと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン;及び/又は、配列番号88に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも90%、91%、92%、若しくは93%、それと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号97に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも99%、それと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン;及び/又は、配列番号96に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも86%、87%、88%、若しくは90%、それと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 哺乳動物のタウタンパク質上、又はその断片上のホスホエピトープを認識しそれに特異的に結合する、請求項1〜39のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片であって、前記抗体又はその機能断片が、配列番号105に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも98%若しくは99%、それと同一なアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン;及び/又は、配列番号104に示すアミノ酸配列、若しくは少なくとも88%、89%、若しくは90%、それと同一なアミノ酸配列を含む第2の結合ドメインを含む、抗体又はその機能断片。
- 請求項1〜40のいずれか一項に記載の、抗体又はその機能断片であって:
a. 配列番号69に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号68に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
b. 配列番号77に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号76に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
c. 配列番号116に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
d. 配列番号92に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
e. 配列番号97に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号96に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
f. 配列番号105に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号104に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン;又は
g. 配列番号118に示すアミノ酸配列を含む第1の結合ドメイン、及び/若しくは配列番号88に示すアミノ酸配列を含む第2の結合ドメイン、
を含む、抗体又はその機能断片。 - ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、若しくは完全ヒト抗体、又はそれらの機能断片である、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- IgG2b、IgG2a、又はIgG3アイソタイプである、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記哺乳動物のタウタンパク質が、ヒトのタウタンパク質である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 前記抗体又はその断片が、病態タンパク質タウコンフォーマーには結合するが、対応する非リン酸化エピトープ、及び/又は非関連エピトープには結合しない、請求項1〜44のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体又はその機能断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項46のポリヌクレオチドであって:
a. 配列番号35〜45;配列番号84〜87、配列番号109〜112、及び117〜119に示す配列に対して、少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
b. 配列番号35〜45;配列番号84〜87、配列番号109〜112、及び117に示す配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
c. 配列番号35〜45;配列番号84〜87、配列番号109〜112、及び117〜119に示す配列に対して、少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
d. 配列番号35〜45;配列番号84〜87、配列番号109〜112、及び117〜119に示す配列に対して、少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
e. 配列番号35〜45;配列番号84〜87、配列番号109〜112、及び117〜119に示す配列に対して、100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;
f. 相補ストランドが、a)〜d)のいずれかの核酸分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸;又は
g. a)〜e)のいずれかおいて遺伝暗号の縮重によって定義されるヌクレオチド配列から逸脱しているヌクレオチド配列を含む核酸分子:
からなる群から選択される核酸分子を含み、a)〜g)のいずれかに定義される前記核酸分子は、哺乳動物上の、具体的には、ヒトタウタンパク質上の、又はその断片上のホスホエピトープ、具体的には病態タンパク質タウコンフォーマーを認識しそれに特異的に結合するが対応する非リン酸化エピトープ及び/又は非関連エピトープには結合しない抗体又はその機能断片をコードし、前記抗体又は抗体断片は、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質に高い結合親和性を有し、可溶性の、オリゴマーの、及び不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルを、インビボで検出、及び/又は調節することができる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1〜47のいずれか一項に記載の抗体若しくはその機能断片、又はその組み合わせを、治療有効量で、薬剤的に許容できる担体とともに含む薬剤組成物。
- 哺乳動物のタウタンパク質上の二つの異なるホスホエピトープを認識しそれに結合する、請求項1〜48のいずれか一項に記載の少なくとも二つの抗体又はその機能断片を含む、請求項48に記載の薬剤組成物。
- アミロイド形成したタンパク質又はペプチドを認識しそれに結合する、さらなる抗体又はその機能断片をさらに含む、請求項48又は49に記載の薬剤組成物。
- 治療に使用する、具体的には、哺乳動物における、タウオパシー等の神経変性疾患、又は障害の、具体的にはそうした治療を必要とするヒトにおけるその治療に使用する、請求項1〜50のいずれか一項に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせ。
- 哺乳動物における神経変性疾患又は障害の治療に使用し、神経変性疾患又は障害はタウオパシーである、請求項51に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、薬剤組成物、又はそれらの組み合わせ。
- 哺乳動物におけるタウオパシー等の、神経変性疾患又は障害の治療に使用し、哺乳動物はヒトである、請求項51又は52に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、薬剤組成物、又はそれらの組み合わせ。
- 哺乳動物における認識障害の治療又は軽減、具体的には、そうした障害を患うヒトにおけるその治療又は軽減に使用する、請求項1〜53に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- 哺乳動物、具体的にはヒトにおける認識障害の治療又は軽減の結果として、認識障害の進行が停止する、請求項54に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- 哺乳動物、具体的にはヒトにおける認識障害の治療又は軽減の結果として、治療対象における認識記憶能力の維持が増大する、具体的には完全に回復する、請求項54に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- タウオパシーが、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、筋萎縮性側索硬化症/グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病(neurofibrillary tangle)を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、C型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される、請求項52に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- アルツハイマー病又は前頭側頭性認知症の治療に使用する、請求項1〜57に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- 神経変性疾患又は障害が、タウとアミロイド両方の病態の存在を示す、請求項51に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含むがこれらには限定されない、タウ及びアミロイド両方の病態の存在を示す疾患又は障害を含む神経変性疾患又は障害と、外傷性脳損傷と、筋萎縮性側索硬化症/グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、C型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィー含むが、これらには限定されない、明瞭なアミロイド病態を示さないさらなる疾患又は障害との、異種の群を含むタウオパシーにおける主要な脳病態である神経原線維病変の形成に起因する又は関連する疾患及び障害の治療に使用する、請求項1〜59に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- 哺乳動物がヒトである、請求項54、55、56、又は58に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、又は薬剤組成物。
- タウオパシー等の神経変性疾患又は障害を治療、軽減、予防する方法であって、そうした疾患又は障害を患う哺乳動物に、請求項1〜61に記載の、抗体若しくはその機能断片、ポリヌクレオチド、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを投与することを含む方法。
- 神経変性疾患又は障害がタウオパシーである、請求項62に記載の方法。
- タウオパシーが、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、パンチドランカー、ダウン症候群、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群、封入体筋炎、及びプリオンタンパク質脳アミロイド血管症、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症/グアム島パーキンソン痴呆症候群、神経原線維変化病を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、頭側頭型認知症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、多系統萎縮症、ニーマン−ピック病、C型、淡蒼球−橋脳−黒質退行変性、ピック病、進行性皮質下膠質症、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型老年認知症、脳炎後パーキンソン症候群、及び筋強直性ジストロフィーからなる群から選択される、請求項63に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項62、63、及び64に記載の方法。
- タウオパシー等の神経変性障害を患う動物、具体的には哺乳動物又はヒトにおいて、請求項1〜65のいずれか一項に記載の、抗体若しくはその機能断片、若しくは薬剤組成物、又はその組み合わせを、前記動物又はヒトに投与することにより、受動免疫応答を誘導する方法。
- 患者における、タウタンパク質随伴疾患、障害若しくは状態、又はタウタンパク質随伴疾患、障害、若しくは状態の素因を診断する方法であって、タウタンパク質のエピトープへの、抗体又はその活性断片の免疫特異的結合を、試料において又はインサイチュで検出することを含み:
a. タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項1〜66のいずれか一項に記載の、タウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させる工程;
b. 抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程;
c. 免疫複合体の形成を検出する工程;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含み、正常の対照値と比較した前記凝集体の量の増加が、前記患者がタウタンパク関連疾患又は状態を患っている、又は発症するリスクのあることを示す方法。 - 上記請求項のいずれか一項に記載の抗体又は薬剤組成物を用いた治療の後の患者における微小残存病変を監視する方法であって、前記方法が:
a. タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項1〜67のいずれか一項に記載の抗体又はその断片に接触させ、そのペプチド又はその断片が、タウタンパク質のエピトープに結合する工程;
b. 抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程;
c. 免疫複合体の形成を検出する工程;及び
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、若しくは面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程
を含み、正常の対照値と比較した前記免疫複合体の量の増加が、前記患者が依然として微小残存病変患っていることを示す方法。 - 上記請求項のいずれか一項に記載の抗体又は薬剤組成物を用いて治療されている患者の反応性を予測する方法であって、
a. タウ抗原を含むと疑われる、試料又は体の特定部分又は体の面積を、請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体又はその断片に接触させ、そのペプチド又はその断片が、タウタンパク質のエピトープに結合する工程;
b. 抗体をタウ抗原に結合させて免疫複合体を形成させる工程;
c. 免疫複合体の形成を検出する工程;
d. 免疫複合体の存在又は非存在を、試料、又は体の特定部分、又は面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程、及び
e. 前記免疫複合体の量を治療の開始前後で比較する工程
を含み、前記免疫複合体の量の減少が、前記患者が有する治療反応性の潜在能力が高いことを示す方法。 - 免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は体の特定部分又は面積におけるタウ抗原の存在又は非存在に関連づける工程が、前記免疫複合体の量を正常の対照値と比較する工程を含む、請求項67〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 試料が、脳ホモジネート又は脳脊髄液である、請求項67〜70のいずれか一項に記載の方法。
- タウ随伴疾患又は障害を患っていることが疑われる対象からの脳試料中のホスホタウ(pタウ)マルチマーを死後検出する方法であって:
a. 対象の脳試料を、請求項1〜71のいずれか一項に記載の、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させる、こと;
b. 抗体をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること;
c. 免疫複合体の形成を検出すること、及び
d. 対象から得られた試料中の免疫複合体の量又は強度を、健康な対照対象から同一条件を用いて得られた免疫複合体の量又は強度と比較すること
を含み、対照値と比較した前記免疫複合体の量又は強度の増加が、前記患者がタウ随伴疾患又は障害を患っていたことを示す方法。 - 対照試料と比較した、試験試料中に観察される増加が30%から100%の間にある、請求項72に記載の方法。
- 工程(a)に先立って、固体支持体に付着させた抗タウ抗体又はその断片と接触させることにより、試料を免疫濃縮して試料中のタウタンパク質の濃度を増加させる、請求項67〜73のいずれか一項に記載の、タウタンパク質随伴疾患を診断する方法。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体を含む、タウタンパク質随伴疾患、障害、又は状態を検出し診断する試験キット。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の一つ又は複数の抗体又は機能断片を入れた容器と、タウ抗原を結合させて免疫複合体を形成させ複合体の形成を検出して免疫複合体の存在又は非存在をタウ抗原の存在又は非存在に関連づける目的で該抗体を使用するための指示書とを含む、請求項1〜75のいずれか一項に記載の試験キット。
- リン酸化Serを396の位置(pS396)に含むVYKSPVVSG(配列番号67のタウ aa 393−401)、リン酸化Serを396の位置(pS396)に含むSPVVSG(配列番号67のタウ aa 396−401)、リン酸化Serを396の位置(pS396)に含むYKSPVVS(配列番号67のタウ aa 394−400)、リン酸化Serを404の位置(pS404)に含むDTSPR(配列番号67のタウ aa 402−406)、及びリン酸化Serを396の位置(pS396)に含むVYKSPVVS(配列番号67のタウ aa 393−400)からなる群から選択されるエピトープ。
- 請求項1〜77のいずれかに記載の抗体を産生する細胞株。
- DSM ACC3136として、2011年8月30日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−4A6−48である、請求項78に記載の細胞株。
- DSM ACC3137として、2011年8月30日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−2G5−30である、請求項78に記載の細胞株。
- DSM ACC3138として、2011年8月30日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−2G5−41である、請求項78に記載の細胞株。
- DSM ACC3139として、2011年8月30日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−2A1−18である、請求項78に記載の細胞株。
- DSM ACC3140として、2011年8月30日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A4−2A1−40である、請求項78に記載の細胞株。
- DSM ACC3141として、2011年9月6日に寄託されたハイブリドーマ細胞株A6−1D2−12である、請求項78に記載の細胞株。
- 請求項46又は47に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリヌクレオチドが機能可能に連結するベクター。
- 請求項85に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜45のいずれか一項に記載の抗体、又はその機能断片を産生する、請求項86に記載の宿主細胞。
- 哺乳動物の細胞である、請求項86又は87のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項86又は87のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜89のいずれかに記載の抗体、又はその機能断片を産生する方法であって、請求項86〜89のいずれか一項に記載の宿主細胞を、抗体又は断片の発現に適切な条件下で培養すること、及び抗体又は断片を回収することを含む方法。
- 脳試料中のホスホタウ(pタウ)マルチマーを検出する方法であって、
a. 試料を、請求項1〜45のいずれか一項に記載の、ホスホタウタンパク質のエピトープに結合する抗体又はその断片に接触させること;
b. 抗体又は断片をタウタンパク質に結合させて免疫複合体を形成させること;及び
c. 免疫複合体の形成を検出すること
を含む方法。
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