JPH06510427A - Ｔａｕ／ニューロフィラメント蛋白質キナーゼｐｋ４０及びｐｋ３６ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ＴＡＵ／ニューロフィラメント蛋白質キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６本発明は新 規ＴＡＵ／ニューロフィラメント蛋白質キナーゼ、そのためのＤＮＡ配列及びそ れに関連する細胞系、ならびにキナーゼの阻害剤及びキナーゼに関する免疫検定 に関する。

発明の背景 神経細胞に特異的な中間フィラメント（ＩＦ）であるニューロフィラメント（Ｎ Ｆ）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の見掛けのＭ、が６８ｋＤ、１６０ｋＤ及び２００ ｋＤのそれぞれＮＦ−ＬＳＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈと名付けられた３個のサブユニ ットの集合体である。３個のサブユニットはすべて高度に保存されたヘリカルロ ッドドメインを含む。重い方の２個のサブユニットは伸ばされたＣ−末端尾部ド メインも有し、それは重度にリン酸化されている。２個の重いＮＦ−サブユニッ トのｃＤＮＡ由釆配列により、ラットＮＦ−Ｍ、ヒトＮＦ−Ｍ及びヒトＮＦ−Ｈ のＣ−末端ドメインにそれぞれ５．１２及び４０個のＬｙｓ−３ｅｒ−Ｐｒ。

（Ｖａ　Ｌ　Ａ］　ａＳＸ）の繰り返しが存在することが明らかになった（Ｎａ ｐｏｌｉｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７；Ｍｙｅｒｓ　ｅｔａｌ、、１９８ ７及びＬｅｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）ｏこれらの配列は数個のホスホエピ トープ−特異的抗−ＮＦ−ｍＡｂのエピトープを形成する（Ｌｅｅ　ｅ　ｔ　ａ 　１．．１９８８）、ＮＦ及びそのリン酸化の生理学的重要性はまだ良く理解さ れていない（Ｍａｔｕｓにより精査、１９８８）。それらに関連する証拠が軸索 直径の調節に含まれることを示唆している（Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９８７；ＰＩｅｓａｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）ｏ抗体修飾と組み合わせ た電子顕微鏡研究（Ｈｉ　ｒｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）及び生化学 的証拠（Ｍｉｎａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）は、ＮＦ−ＨをＮＦと微小管 ネットワークの相互作用における成分とする傾向がある。ＮＦのリン酸化状態と チューブリンの重合を促進する能力は試験管内で関連している（Ｍｉｎａｍｉ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８５）。

共通の第２メツセンジヤーにより活性化されないＮＦ−キナーゼの存在及び予想 されるそれらに性質のいくつかが、イカ（Ｐａｎｔ　ｅｔａｌ、、１９７８．１ ９８６）及びミクシコラ（Ｍｙｘ　ｉ　ｃｏ　Ｉ　ａ）（Ｓｈｅｃｋｅｔ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８２）の巨大軸索の押し出された軸索漿についての生体内リン酸 化研究から仮定された。ＮＦ−細胞骨格と共精製し、高塩条件下で解離すること ができる精製ＮＦ−キナーゼの試験管内特性化は、これまで活性に集中していた （Ｒｕｎｇｅ　ｅｔａｌ、、１９８１；Ｔｏｒｕ−Ｄｅｌｂａｕｆｆｅ　ｅｔ　 ａｌ、。

１９８３）。現在これらのいずれかの活性が第２メツセンジヤー依存性である証 拠はない。そのようなキナーゼの混合物から６７ｋＤの１つの活性が精製され、 見掛は上均質にされた（Ｗｉｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９）。このキナーゼは基質としてＮＦ−Ｈを選ぶが、完全に脱リン酸化さ れている場合のみである。微小管と共精製されるｃＡＭＰ−依存性キナーゼはＮ Ｆ−トリブレット中のＮＦ−Ｍを優先的にリン酸化することが示された（Ｌａｔ ｅｒｒｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１）。

いずれの場合もリン酸化の化学量論又は部位は未知であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上 のＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈの見掛けのＭ、の変位（ｓｈｉｆｔ）も示されていない 。脱リン酸化サブユニットにリン酸基が高い化学量論比で挿入されるとそのよう な変位が予想される。ＮＦ−ＭのＫＳＰ−リン酸化の不均質な状態を伴う予想よ り小さいゲル変位が、ヒトＮＦ−Ｍクローンでトランスフェクションしたマウス Ｌ細胞中の特性化されていないキナーゼによって起こる（Ｐｌｅａｓｕｒｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９９０）。

抗−ラット−ＮＦ　ｍＡｂ　０７−５（Ｊａｒｒｅｔｓｖｉｌｌｅ。

ＭＤ、　Ｕ、　Ｓ、　ＡのＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−ＭｅｙｅｒからＳＭＩ−３ ４として商業的に入手可能）はアルツハイマー病患者からの脳組織の神経原繊維 タンゲルを染色するが（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５）　 、６０才の患者の小脳篭細胞軸索及びある種の運動ニューロン軸索を除いて正常 なヒトの脳組織を染色しない（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ　＆　Ｉｎｇｒａｍ、１９８ ９）ことが見いだされると、異常なＮＦ−リン酸化に可能な病原的役割が考えら れた。他方、ＳＭＩ−３４エピトープが排他的に核層部に局在するが、ＮＦ−ホ スホエピトープと反応する他のほとんどのｍＡｂは優先的に軸索を染色するとい う報告がある（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）。

しかし一連のｍＡｂとＮＦ、微小管付属蛋白質ＴＡＵ及びタンゲルならびにらせ んフィラメント対（ｐａｉｒｅｄ　ｈｅｌｉｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）（Ｐ ＩＦ）の主成分の交差反応性に関する免疫化学的証拠（Ｇｒｕｎｄｋｅ−１ｑｂ ａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６；Ｋｏｓｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６；Ｗｏ ｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６；Ｎｕｋｉｎａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）はＰ ＨＦの主成分としてＴＡＵを指摘している。この推論はＰＨＦからＴＡＵ−由来 ペプチドが単離されたが（Ｗｉｓｃｈｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）ＮＦ−由 来ペプチドは得られない（Ｋｏｎｄｏ　ｅｔ　ａ　１．．１９８８）ことにより 強化される。ＴＡＵと交差反応する多くの抗−ＮＦ　ｍＡｂ、その中でもＳＭＩ −３１（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−Ｍｅｙｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ から商業的に入手可能）及びＲＴ９７は、ＮＦ蛋白質中のリン酸化ＫＳＰ−配列 繰り返しを認識する（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８）。ＰＨＦはＲＴ９７と強く反応するがＳＤＳで長時間処理した後のみ であり、このリン酸化エピトープがＰＨＦ中で非周辺位置に存在することを示唆 している（Ｒａｓｏｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）。

証拠の数本の線は、アルツハイマー病（ＡＤ）のＴＡＵ分子のＣ−末端部分にお けるリン酸化の異常な量又は異常な部位を示している（Ｇｒｕｎｄｋｅ−１ｑｂ ａｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６；Ｋｏｎｄｏ　ｅｔａｌ、、１９８８；Ｉｑｂａ ｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）。ＴＡＵの異常リン酸化の形態が、神経原繊維タ ンゲルにおけるＰＨＦを特徴とする神経学的状態の発生に責任があるか、又は含 まれるなら、そのリン酸化を起こす因子の同定が非常に重要であることは明白で ある。

発明の概略 本発明は単離され、基本的に純粋な非骨格−付属キナーゼ（ｎｏｎｓｋｅｌｅｔ ａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅｓ）を含む組成物を提供し、そのキ ナーゼは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で脱リン酸化ＮＦ−Ｍの見掛けのＭ、を天然のＮＦ −ＭのＭ、に向かって変位させるのに十分な程度まで脱リン酸化ＮＦ−Ｍをリン 酸化することができる。さらにキナーゼは脱リン酸化ＴＡＵ及び天然のＴＡＵの 両方をリン酸化することができ、完全に脱リン酸化されたＮＦ−トリブレット及 び精製された脱リン酸化ＮＦ−Ｍをリン酸化し、その上にホスホ−エピトープを 再構築することができる。キナーゼは過剰のＡＴＰによって阻害もされる。

１つのキナーゼ、ＰＫ４０は見掛けの分子量が４３ｋＤであり、見掛けの分子量 を完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍの分子量から天然のＮＦ−Ｍの分子量に完全 に変位させるのに十分な程度まで、完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍをリン酸化 することができる。このキナーゼはＴＡＵの場合に完全な変位、及びＮＦ−Ｈの 場合に部分的な変位を起こすこともできる。特にそれはＰＩＦから抽出されたヒ トＴＡＵ蛋白質に特有の別のＴＡＵを模する程度までＴＡＵをリン酸化すること ができる。それはさらにＴＡＵの両ＫＳＰ部位をリン酸化することができ、ＴＡ Ｕ−１エピトープを排除することができる。

もう１つのキナーゼ、ＰＫ３６は見掛けの分子量が３５ｋＤであり、見掛けの分 子量を完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍの分子量から天然のＮＦ−Ｍの分子量に 向かって少なくとも部分的に変位させるのに十分な程度まで、完全に脱リン酸化 されたＮＦ−Ｍをリン酸化することができる。

本発明の他の態様では、新規検定法を提供する。検定法の１つは哺乳類キナーゼ の検出法を含む。哺乳類由来であり、問題のキナーゼを含むかどうかが未知であ る生物材料の両分を調製する。画分はリン酸化蛋白質に特徴的で試験抗体と反応 性のエピトープを実質的に含まない。画分を、キナーゼが存在すると蛋白質のリ ン酸化を許す条件下でエピトープを含まない脱リン酸化蛋白質と接触させる。そ の後画分を、試験抗体を用いてエピトープの存在に関して調べる。画分は完全に 脱リン酸化された神経蛋白質と接触させるのが好ましい。エピトープの存在（ま 、１ノン酸化神経蛋白質に関連するエピトープと反応性の抗体、例えばＳＭＩ− ３１抗体又はＳＭＩ−３４抗体を用いて検出することができ、抗体とエピトープ の免疫沈降複合体の存在下で発色する試薬を用いることができる。

その後錯体の存在の定量的尺度として発色を測定することができる。

類似の免疫検定法において、哺乳類由来であり、問題のキナーゼを含むかどうか が未知の生物材料の画分を調製する。画分は、リン酸化の特定の状態の蛋白質に 特徴的で試験抗体と反応性のエピトープを実質的に含まない。（リン酸化の特定 の状態には完全に脱リン酸化された状態が含まれる。）画分を、哺乳類キナーゼ が存在すると蛋白質のリン酸化を許す条件下でエピトープを特徴とする蛋白質と 接触させる。抗体を用いて調べているエピトープの存在に関して調べる。エピト ープが消えていたら、キナーゼが存在する。有用な抗体の例にはＳＭＩ−３３及 びＴＡＵ−１が含まれる。好ましい基質には前記の抗体と反応性の神経蛋白質、 例えばリン酸化ＴＡＵが含まれる。

本発明の他の新規免疫検定法は、蛋白質のリン酸化の特定の状態に特徴的なエピ トープと反応性の抗体の利用、及び抗体と結合しないリン酸化の状態の蛋白質の 利用を含む。そのような免疫検定法は、抗体を含む第１容器及び蛋白質を含む第 ２容器を有する容器を含むキットの形態であることができる。蛋白質は神経蛋白 質であることが好ましい、蛋白質は脱リン酸化ＴＡｔ）であることが最も好まし い。

本発明のさらに別の新規免疫検定法は脱リン酸化ＮＦを用いる。好ましい具体例 は、完全に脱リン酸化されたＮＦ−トリブレット、完全に脱リン酸化されたＮＦ −Ｍ及び完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｈを用いる検定法を含む。

本発明の他の特徴に従い、本発明の新規キナーゼに対する抗体を提供する。ＰＫ ４０及びＰＫ３６と結合することができ、好ましくは選択的に特異的なモノクロ ーナル及びポクローナル抗体を提供する。抗体はＰＫ４０又はＰＫ３６のいずれ かのキナーゼ活性を阻害することができるのが最も好ましい。これらの抗体は中 でも、ＰＫ４０又はＰＫ３６の存在を検出するために用いることができる。

本発明は、ＰＫ４０又はＰＫ３６のリン酸化活性の阻害に十分な量のＰＫ４０又 はＰＫ３６の阻害剤を細胞中に導入することにより、細胞の神経蛋白質リン酸化 活性を阻害する方法も提供する。好ましい阻害剤には、ＰＫ４０又はＰＫ３６の 基質のフラグメント、ＰＫ４０又はＰＫ３６に選択的に特異的な抗体及びＡＴＰ 又はＡＴＰ類似体が含まれる。阻害剤はニューロフィラメントタンゲルの形成を 妨げるのに十分な量で投与するのが最も好ましい。

さらに別の本発明の態様に従い、ＰＫ４０又はそのユニークフラグメント及びＰ Ｋ３６又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチドを含むベ クターを提供する。同様にＰＫ４０又はそのユニークフラグメントあるいはＰＫ ３６又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチドを用いて形 質転換又はトランスフェクションされた細胞系を提供する。細胞系の生産物も提 供する。

本発明のこれらの、及び他の特徴を好ましい具体例に関する詳細な記載と共に下 記にさらに詳細に記載する。

図面の簡単な説明 図１はＰＫ３６及びＰＫ４０の存在を示している染色ゲル（１２％５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ）の写真である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は１つの特徴において新規キナーゼ、ＰＫ４０及びＰＫ３６の同定を含む 。ＰＫ４０及びＰＫ３６は実施例１−４に記載の通りウシ脳から単離され、基本 的に純粋である。“基本的に純粋”という用語は組成物中の材料の少なくとも４ ０％が問題のキナーゼであることを意味する。キナーゼは組成物中の材料の少な くとも８０％に相当するのが好ましく、少なくとも９０％に相当するのが最も好 ましい。いずれの場合も本発明の組成物は従来の方法でアミノ酸配列決定をする のに十分純粋であり、さらに問題のキナーゼに対する抗体の生成及び同定をする のに十分純粋にすることができる。ＰＫ４０及びＰＫ３６は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上 の見掛けの分子量（Ｍ、）がそれぞれ４０ｋＤ及び３６ｋＤである。

ＰＫ４０の独特の性質は、本発明の精製法の間に見掛けの分子量がわずかに変位 する（Ｃ＜１）ことである。これは精製の間にＰＫ４０がリン酸化されるためで あると思われる。キナーゼは非細胞骨格−付属である。“非細胞骨格−付属”と いう用語は、キナーゼが高−塩抽出条件下でＮＦ−細胞骨格と共精製されないこ とを意味する。ＰＫ４０は通常チロシンリン酸化形態で単離されるが、ＰＫ３６ はそうではない。

キナーゼは脱リン酸化された多様な天然の基質をリン酸化することができる。天 然の基質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で特徴的な移動度を有し、それは基質が脱リン酸 化されると変化する。これらの脱リン酸化基質を、基質のリン酸化を許す条件下 で本発明のキナーゼを用いて処理すると、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、選ばれた 特定の基質及びキナーゼならびに適用条件に依存して脱リン酸化基質の見掛けの Ｍ、が天然の基質のそれに向かって移動度変位する。“変位”は移動度の検出可 能な変化である。

″完全変位”は、前に脱リン酸化されていた基質の移動度が本発明のキナーゼで 処理した後に天然の基質の移動度と同一となることを意味する。

“部分的変位”は移動度が脱リン酸化基質の移動度と天然の基質の移動度の間で 動いたことを意味する。“変位なし”は、本発明のキナーゼで脱リン酸化基質を 処理した後に検出できる移動度の変化がないことを意味する。

ＰＫ４０は完全−説リン酸化ＮＦ−Ｍ　（ｃｄＮＦ−Ｍ）をリン酸化し、５ＤＳ −ＰＡＧＥ上でｃｄＮＦ−Ｍの見掛けのＭ、を天然のＮＦ−ＭのＭ、に完全に変 位させることができる。ＰＫ４０は完全−説リン酸化ＮＦ−Ｈ（ｃｄＮＦ−Ｈ） の部分的変位を起こす。さらにＰＫ４０は完全−説リン酸化された天然のウシＴ ＡＵ、又はクローンＨｔａｕ４０（Ｇｏｅｄｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、１９８９）か らＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で発現された純粋なヒトＴＡＵイソ型の完全変位 を起こすことができる。これに関し、ＰＫ４０は飽和リン酸化条件下でイソ型パ ターンを変化させ、それはＰＨＦから抽出されたヒトＴＡＵ蛋白質のパターンと 非常に類似している。この、及び他のパターン変化は下記にてさらに詳細に議論 する。ＰＫ４０は又、ＴＡＵの両ＫＳＰ部位をリン酸化し、ＴＡＵ１エピトープ を排除する。

ＰＫ３６はｃｄＮＦ−Ｍをリン酸化し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でｃｄＮＦ　−Ｍの 見掛けのＭ、を天然のＮＦ−ＭのＭ、まで、少なくとも部分的に変位させること ができる。これは又、ＴＡＵに関して部分的変位を起こすこともできる。

両キナーゼは通常の第２メツセンジヤー、すなわち細胞膜の外側がペプチドホル モンなどのソゲナル又は刺激を受けた時に細胞内で生産される小分子（例えばｃ ＡＭＰ、ｃＧＭＰ、カルシウム、Ｃａ◆ホスファチジルセリン及びＣａ／ＣＡＭ ）により活性化されない。

ＰＫ４０及びＰＫ３６の活性のＡＴＰ依存性及び阻害を実施例６に記載の通りに 決定した。ＡＴＰに関するＰＫ４０の見掛けのに、は９３±１２μＭであり、Ｐ Ｋ３６は５０μＭである。これらの値は比較的高いＡＴＰ濃度の必要性を反映し ている。しかし両キナーゼは過剰のＡＴＰにより、すなわちＡＴＰがＭｇ２＋に 対して比較的小過剰の場合に強く阻害される。さらにＰＫ３６はＷａｌｓｈ阻害 剤により阻害されるがＰＫ４０は阻害されない。

これらの新規キナーゼの同定は、本明細書に記載の新規キナーゼ免疫検定法を用 いることにより可能になった。この免疫検定法はｍＡｂ　５Ｍ１−３１及び５Ｍ ｌ−３４との免疫反応性のないＮＦ蛋白質を必要としており、検定によりこれら の抗体により認識されるエピトープ、すなわち繰り返しリン酸化ＫＳＰ配列に特 異的なキナーゼ活性が測定される。

そのような免疫反応性をな（すために、ＮＦ蛋白質は実施例１に記載の通りに完 全に脱リン酸化される。かくして“完全脱リン酸化”は５Ｍｌ−３１及び５Ｍｌ −３４抗体と非反応性であることを意味する。そのような脱リン酸化基質を用い 、５Ｍｌ−３１及び５Ｍｌ−３４との免疫反応性の再出現を測定することにより キナーゼ活性、すなわちＫＳＰ配列の再リン酸化を検定することができる。かく して完全−脱リン酸化ＮＦ蛋白質をウシ脳上澄み液からの異なる硫酸アンモニウ ム画分と共にインキュベートし、実施例２に記載の通りに５Ｍｌ−３１及び５Ｍ ｌ−３６エビトープの再構築を異なる両分において検定した。

やはり実施例２に記載されている比色免疫検定法を用い、リン酸化活性のレベル を定量的に測定することができる。そのような検定法の場合、リン酸化ＮＦ蛋白 質に特徴的なエピトープの存在を、５Ｍｌ−３１又は５Ｍｌ−３４などの抗体と リン酸化ＮＦ蛋白質の間の免疫沈降鎖体の存在下で発色する試薬を用いて調べる ことができる。発色の量を決定し、かくして形成された錯体の量の定量的尺度と する。そのような測定値は調べた試料中に存在するＫＳＰ−特異的リン酸化活性 と関連している。

この場合も完全−説リン酸化神経蛋白質を基質として用いることができるが、必 ずしも基質として完全−説リン酸化材料を必要しない場合もある。

本発明はウシＰＫ４０及びＰＫ３６に対応するヒトキナーゼをコードする核酸、 及びヒトキナーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングの方法にも関する。精 製ウシキナーゼを実施例１１に記載の通りに配列決定する。配列に関するこの情 報を用いてオリゴヌクレオチドプローブを構築し、ｃＤＮＡライブラリにおいて ヒトキナーゼをコードする遺伝子を同定するために用いる。遺伝コードの縮重の ために、はとんどのアミノ酸は１個より多いコドンにより表される。従ってプロ ーブにおいて、ゲノム中のコドンに実際に対応するコドンの割合を増加させるた めに、ウシキナーゼから選ばれて対応するオリゴヌクレオチドプローブの合成に 用いられるアミノ酸配列は縮重が最少量である領域からの配列である。

特に各キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６の場合のペプチド配列の最少縮重コドン配 列に対応する放射性標識合成オリゴヌクレオチドノ１イブ井ソド形成プローブ配 列が製造され、実施例１２に記載の通りにヒト細胞からのｃＤＮＡライブラリを スクリーニングするために用いられる。ＰＫ４０の場合、ユニークフラグメント に対応するコドン配列、配列番号：１及び２を用いるのが好ましい。

コドン類が各キナーゼのアミノ酸配列と一致するクローンが得られる。

か（して重複した部分的クローンから、ウシＰＫ４０及びＰＫ３６に対応する各 ヒトキナーゼに関する全長ｃＤＮＡ配列が同定され、全ｃＤＮＡ配列を含む組み 替えベクター分子が得られる。対応するヒトキナーゼのそれぞれがウシＰＫ４０ 又はＰＫ３６のいずれかに実質的相同性を有するオリゴヌクレオチドによりコー ドされるので、そのようなりローユング法を用いることができる。従って十分な 相同性があり、本明細書に記載のハイブリッド形成法によりヒトｃＤＮＡを同定 することができる。

オリゴヌクレオチドを含むベクターは、ｃＤＮＡ配列を含むが必ずしもそれを発 現しないベクターを意味する。ｃＤＮＡの発現のためには、それを真核又は原核 発現調節ＤＮＡ配列に作用的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合しなければならない。

そのような組み替え分子は当該技術における熟練者により日常的技術を用い不必 要な実験を行うことな（容易に製造され、同定される。これらの組み替えベクタ ー分子を用いて形質転換又はトランスフェクションされた細胞はヒトキナーゼ又 はそのフラグメントを発現することができる。別の場合、ウシＰＫ４０及びＰＫ ３６の単離に用いられた本実施例に記載の方法に従ってヒトキナーゼを単離する ことができる。

ヒトＰＫ４０及びＰＫ３６キナーゼは過剰のＡＴＰにより阻害され、脱リン酸化 ニューロフィラメント及びＴＡＵ蛋白質をリン酸化し、特にこれらの蛋白質のＫ ＳＰ配列をリン酸化する。本明細書でヒトキナーゼは、本発明の記載の通りに同 定される非骨格−付属キナーゼを意味し、ヒ）ＰＫ４０及びヒ１４’に３６を含 む。実施例の場合を除き、本明細書及び請求の範囲で用いられるＰＫ４０及びＰ Ｋ３６は、天然に存在する、及びクローニングされた哺乳類ＰＫ４０及びＰＫ３ ６を意味する。実施例の場合は、他に特に言及されていなければＰＫ４０及びＰ Ｋ３６はウシＰＫ４０及びＰＫ３６を意味する。ヒトＰＫ４０及びＰＫ３６はウ シＰＫ４０及びＰＫ３６に対応するヒトキナーゼを意味する。

本発明の他の特徴に従い、ポリクローナル及びモノクローナルの両抗体を本発明 のキナーゼに対して誘起し、その後必要ならキナーゼのリン酸化活性を阻害する その能力に基づいて選択することができる。モノクローナル抗体はＭｉｌｓｔｅ ｉｎ及びＫｏｈｌｅｒによ′り記載の方法で得られる。その方法は動物に免疫原 を注射し、動物の膵臓から細胞を取り出し、それらを骨髄腫細胞と融合させて／ ％イブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞を形成し、それを試験管内で再生産 することを含む。ハイブリドーマの集団をスクリーニングし、免疫原上の特定の 抗原部位（こ対する１個の抗体種を分泌する各クローンを単離する。モノクロー ナル抗体はＰＫ４０又はＰＫ３６キナーゼの存在又は不在を検出するの１ご有用 である。さらにモノクローナル又はポリクローナル抗体はＰＫ４０及びＰＫ３６ キナーゼの阻害剤として有用である。

ＰＫ４０はＥＰＫキナーゼとの配列相同性を有するので、そのようなＥＰＫキナ ーゼと反応しないようにある好ましい抗体を選択すること力（理解されるであろ う。そのような抗体の製造は十分に当該技術における熟練者の程度内である。

本発明はＰＫ４０及び／又はＰＫ３６の阻害剤の同定を含む。ＰＫ４０又はＰＫ ３６の阻害剤は、ＰＫ４０又はＰＫ３６のリン酸化活性を阻害するような方法で ＰＫ４０又はＰＫ３６に結合すること力（できる分子である。本発明は、ＰＫ４ ０及びＰＫ３６が過剰のＡＴＰにより強（阻害されることを明らかにする。他の 阻害剤は、本明細書に記載の検定を用いて、例えば推定阻害剤をキナーゼに加え 、混合物につき実施例２に記載の定量比色免疫検定法を行うことにより、当該技 術における熟練者が同定することができる。かくして種々のＡＴＰの類似体及び 複合体を、ＰＫ４０又はＰＫ３６のリン酸化活性を阻害する能力に関してスクリ ーニングすることができる。類似体の例は文献において容易に得られ、全文特許 データベースを含む種々のデータベースを用いて評価することができる。従つて 阻害剤は、特に帯電基の分布においてＡＴＰの分子構造と類似し得る。阻害剤は 種々の方法でそれが神経細胞に入ることができるように修飾することができる。

例えばＡＴＰ類似体の帯電基をジブチリル−サイクリック−ＡＭＰと同様にして エステル化により修飾することができる。

何千個の推定阻害剤中何十個を、最初は例えば１０００個の候補を含む混合物中 で、その後混合物による阻害が確立された後に例えば１００個を含む二次混合物 中で、その後１０個、そして１個の阻害剤をスクリーニングすることができる。

他の阻害剤には、ＫＳＰ結合部位蛋白質又は本発明のキナーゼの１つに結合する 蛋白質、例えば基質、基質のフラグメント、抗体、抗体のフラグメント及びこれ らのいずれかの１本鎖抗体構築物又は構築類似体などのペプチドが含まれるが、 これらに限られるわけではない。ＰＫ４０又はＰＫ３６の基質は生体内でＰＫ４ ０及び／又はＰＫ３６が作用する蛋白質である。本明細書で用いられるＰＫ４０ 及び／又はＰＫ３６の基質の阻害フラグメントは、基質の少なくとも１部の構造 的類似体であり、ＰＫ４０及び／又はＰＫ３６に結合して本来の基質に関するＰ Ｋ４０及び／又はＰＫ３６のリン酸化活性を消滅させる（ｔ　ｉ　ｔ　ｒａ　ｔ ｅ　ｏｕｔ）ことができるペプチドである。そのようなフラグメントは例えばニ ューロフィラメント又はＴＡＵ蛋白質などのＰＫ４０及び／又はＰＫ３６の基質 を切断し、それにより作られたフラグメントの、本来の基質に関するキナーゼの リン酸化活性を妨げる能力を調べることにより同定し、製造することができる。

別の場合、少なくとも１個のＫＳＰ部位を含み、細胞質の蛋白質分解酵素による 分解に抵抗性であるＰＫ４０又はＰＫ３６基質の構造的類似体を製造することが できる。そのようなフラグメントは日常的技術を用い、不必要な実験を行うこと な（当該技術における熟練者が容易に製造し、同定することができる。例えばそ れらは本発明のキナーゼの基質の既知の配列に関する情報から製造することがで きる。

本発明の利用は、本発明のキナーゼの１つの阻害剤を細胞に投与することである 。これは細胞中のリン酸化活性を低下させ、又らせんフィラメント対又はタンゲ ルの形成を減少あるいは妨げるように作用することができる。これにより例えば 細胞保持ならびに神経退行疾患及び老化へのそのようなリン酸化活性の寄与の分 析が可能になる。

本発明の治療的利用は、アルツハイマー病及び正常な老化に特徴的な神経退行状 態を処置するために、本発明のキナーゼの１つの阻害剤をそのような処置を必要 としている患者に投与することである。そのような阻害剤はらせんフィラメント 対の形成を減少させることができる。

阻害剤は治療的に許容し得る量で患者に投与される。“患者”という用語は哺乳 類を含むものとする。“治療的に許容し得る量”は、患者の疾、轡又は退行状態 の進行を改善するあるいは遅延させることができる量である。治療的に許容し得 る量は、患者に基づいて決定することができ、少なくとも部分的に患者の大きさ 、処置するべき症候の重度、求める結果及び用いる特定の阻害剤に関する考慮に 基づくであろう。治療的に許容し得る量は、そのような因子を用いて日常的実験 程度で当該技術における熟練者が決定することができる。

本明細書にて議論される通り、阻害剤にはＡＴＰ、ＡＴＰ類似体、ＫＳＰ結合部 位蛋白質又は本発明のキナーゼの１つに結合する蛋白質、例えば基質、基質のフ ラグメント、抗体、抗体のフラグメント及び１本鎖抗体構築物などのペプチドが 含まれるが、これらに限られるわけではない。

本発明の阻害剤の投与は、阻害剤が標的細胞に達することを可能にするいずれの 方法によっても行うことができる。典型的方法には阻害剤の経口的、直腸内、腹 膜内、皮下、静脈内及び局所的投与が含まれる。他のデリバリ−系には持続性放 出デリバリ−系が含まれる。好ましい持続性放出デリバリ−系は、持続性放出ペ レット又はカプセル中で本発明の阻害剤を放出することができる系である。多く の種類の持続性放出デリバリ−系を利用することができる。これらには（ａ）阻 害剤がマトリックス内の形態で含まれている腐食系（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ　ｓｙ ｓｔｅｍ）、米国特許第４，４５２，７７５号（ｋｅｎｔ）及び第４．　６６７ ゜０１４号（Ｎｅｓｔｏｒ　ｅｔ　ａｌ、）明細書に記載：及び（ｂ）活性成分 が制御された速度でポリマー中を浸透する拡散系、米国特許第３゜８３２．２５ ２号（Ｈｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、）及び第３，８５４．４８０号（Ｚａ　 ｆ　ｆ　ａ　ｒｏｎ　ｉ）明細書に記載、が含まれるがこれらに限られるわけで はない。さらに、ポンプに基づくハードウェア（ｈａｒｄｗａｒｅ）デリバリ− 系を用いることができ、そのいくつかは脳中に直接埋植するように適合させられ ている。

血流を介して阻害剤をプリバーするこれらの系のために克服しなければならない 特別の問題は、血漿と中枢神経系の間の物質交換を制御している血液脳関門を横 切ることである。多くの物質はこの関門を通過することができない。血液脳関門 を横切って阻害剤を輸送する１つの方法は、阻害剤を第２の分子、担体にカップ リングさせる方法であり、担体はペプチド又は非蛋白質部分である。担体は血液 脳関門に浸透できるように選ばれる。担体の例は脂肪酸、イノシトール、コレス テロール及びグルコース誘導体である。別の場合担体は、脳内皮細胞中の特別な 輸送系、例えばインスリン又はインスリン一様成長因子Ｉ及びＩＩの移動のため の輸送系を通って脳に入る化合物であることができる。阻害剤と担体のこの組み 合わせは、プロドラッグと呼ばれる。中枢神経系に入ると、プロドラッグはその ままで残ることができ、あるいは担体と阻害剤の間の化学的結合が加水分解され 、それにより阻害剤から担体を分離することもできる。

血液脳関門を横切って阻害剤を輸送する別の方法は、リポソームの利用である。

リポソームは脂質が水性懸濁液に分散された時に得られる単−又は多区分体であ る。壁又は膜は連続脂質二重層を含み、それが内部水空間を封入している。その ような小胞は治療薬を封入し、デリノく−するのに用いることができる。国際公 開第Ｗ０　９１１０４０１４号（Ｃｏ１１ｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、）明細書は、治 療薬がリポソーム内に封入され、リポソームの外層に通常血液脳関門を横切って 輸送される分子が付加されているリポソームデリバリ−系につき記載している。

そのようなリポソームは、それに限られるわけではないがインスリン及びインス リン一様成長因子Ｉ及びＩＩの輸送を含み、血液脳関門を横切って特殊なリガン ドを輸送する内在性脳輸送系を標的とすることができる。別の場合そのようなり ガントのための脳内皮細胞レセプターに対する抗体をリポソーム外層に付加する ことができる。米国特許第４．　７０４．　３５５号（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）明 細書は抗体をリポソームにカップリングする方法も記載している。さらに米国特 許第４，７０４．３５５号明細書はＡＴＰを封入するリポソームの製造につき記 載している。

本発明は初期アルツハイマー病のための診断試験として用いることができる新規 検定法についても記載する。検定法ではＰＫ４０及びＰＫ３６に対応するヒトキ ナーゼによるヒト細胞中の神経蛋白質リン酸化活性のレベルを測定する。正常な 、及び試験患者からの皮膚線維芽細胞を試験管内で成育する。ＡＴＰ製造からの 酸化的リン酸化の脱共役剤を異なる濃度で皮膚線維芽細胞に加え、リン酸化神経 蛋白質と関連する免疫学的エピトープの存在を決定する。アルツハイマー病から の線維芽細胞は、正常な患者からの線維芽細胞より低濃度の脱共役剤でこの効果 を示す。

そのようなエピトープの出現はキナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６の阻害からの解放 を意味する。

ＰＫ４０又はＰＫ３６に選択的に特異的な抗体も、組織試料中に存在するＰＫ４ ０又はＰＫ３６の量を定量することにより、神経蛋白質リン酸化活性のレベルの 評価に用いることができる。疾患状態は、キナーゼが多量に存在することが特徴 であると思われる。

実施例１ 新規キナーゼ免疫検定法はｍＡｂ　５Ｍｌ−３１及び５Ｍｌ−３４との免疫反応 性のないＮＦ蛋白質を必要とする。これらの免疫検定法ではこれらのエピトープ 、すなわち繰り返しＫＳＰ配列に関して特異的なキナーゼ活性を測定する。粗編 抽出物は非常に多数の蛋白質キナーゼを含むので、そのような特異性が必要であ った。そのような免疫反応性をなくすために、ＮＦ蛋白質は完全に脱リン酸化し なければならない。ＮＦ−トリブレット蛋白質及び各ＮＦ−サブユニットを調製 し、それを以下の要領で脱リン酸化する。

ＮＦ−トリブレット蛋白質を“天然”又は“再構築“の２通りの方法の１つによ り調製した。“天然”のＮＦ−トリブレットの調製は、以前に記載された方法の 修正法であった（Ｔｏｋｕｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３；Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７）。新しく得たウシを髄（１００− １５０ｇ、Ａｒｅｎａ　＆　５ｏｎｓ、　Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、　ＭＡ）から鞘 を除去し、かみそりの刃で細かく刻み、４℃にて３１の１０ｍＭ　ＴｒｉｓＳｐ Ｈ７，０１５０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＥＧＴＡ。

１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ中に２時間放置し、膨潤させた。

上澄み液をデカンテーションし、膨潤した組織を１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む同 様の緩衝液（等張緩新液）２００ｍｌ中でＵｌｔｒａ−Ｔｕｒａｘを用い、２／ ３速で１分間均質化した。１２．０００ｘｇで１５分間遠心した後、沈澱を２０ ０ｍ１の等張緩新液中で、全速にて１分間、２回再均質化した。遠心の上澄み液 を合わせ、固体スクロースを加えることにより（１モル／１）スクロース中で０ ．８５Ｍとした。１００゜０００ｘｇで４時間遠心すると、約２００ｍｇのゼラ チン状沈澱が得られ、それを１００ｍ１の吸着緩衝液：１０ｍＭ　リン酸カリウ ム、ｐＨ７，４，８Ｍ　ウレア（混合床イオン交換体ＡＧ　５０１−Ｘ８　（Ｄ ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ上で１−２時間脱イオン）、０．５％　β−メルカプト−エ タノール（β−ＭＥ）中に溶解した（遅いＵｌｔｒａ　Ｔｕｒａｘ均質化を用い て）。この溶液を、吸着緩衝液中で予備平衡化したヒドロキシアパタイト（ＨＴ Ｐ、４０ｇ、乾燥重量、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に４℃にて１０分間振ることによ り、ＮＦを吸着した。吸着剤を１５，０００ｘｇで１０分間沈降させ、その後１ ００ｍ１の吸着緩衝液、８５ｍ１の１３０ｍＭ　ＫＰＯ４、ｐＨ７，０，８Ｍ　 ウレア、０，５％　β−ＭＥで３回、及び５０ｍ１の３００ｍＭならびに２５０ 　ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｏ４、ｐＨ７，０，８Ｍ　ウレア、０．５％　β−ＭＥで１回 づつ洗浄した（各回１０分間）。最後の２回の洗浄の上澄み液は多量のＮＦ−Ｌ ＳＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈを含み、それらを合わせ、ＩＬのｌＱｍＭ　ＭＥＳ。

ｐＨ６，８，１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１ｍＭＥＧＴＡに ３回透析することによりＮＦ−トリブレットを再構築した。

３７℃で３０分間インキュベートし、１２０．ＯＯＯｘｇで６時間遠心した後、 ４０　６０ｍｇのＮＦ−トリブレット蛋白質が得られた。ゼラチン状沈澱をガラ ス−テフロンホモジナイザーを用いて４０％グリセロール中で再均質化し、２． ５−３ｍｇ／ｍｌの懸濁液を形成し、−２０℃で保存した。

各ＮＦ−サブユニットの分離の場合は、以前に記載された方法（Ｔ。

ｋｕｔａｋｅ、１９８４）を修正した。天然のＮＦ−トリブレット沈澱をｌＱｍ Ｍ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，６Ｍ　ウレア、０．５％β−ＭＥ（出発緩 衝液）中に取り上げ（０，５−１ｍ１／ｍｇ　ＮＦ蛋白質）、１００，０００ｘ ｇで１時間遠心し、４０ｘ１．５ｃｍ　ＤＥＡＥ−セファ０−スカラム（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）上に負荷した。ＮＦサブユニットは室温で、出発緩衝液及び４０ ０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６，８，６Ｍ　ウレア、０．５％　β−ＭＥに より形成された直線勾配を６００ｍ１用いて１０１０−ｌ５／時間で溶離した。

画分を集め（１２０画分、各５ｍ１）、画分４１−４８．７１−８０及び８５− ９４をプールした。これらは５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりそれぞれ純粋なＮＦ− Ｈ，ＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｌを含んだ。３種の画分を真空透析により２−３ｍ１に 濃縮し、水中に透析した。１００，０００ｘｇで１時間遠心した後ＮＦ−Ｌが透 明なゼラチン状沈澱として得られ、ＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈは硫酸アンモニウムに より沈澱した。−２０℃で保存するために、純粋なサブユニットを４０％グリセ ロール中で均質化（ＮＦ−Ｌ）又は溶解（ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈ）Ｌ、約１ｍｇ／ ｍｌの蛋白質の保存濃厚液を形成した。別の場合ＮＦ−サブユニットはＭｏｎｏ Ｑ５１５カラム上のＦＰＬＣにより分離した（Ｋａｒｌｓｓｏｎ　ｅｔａｌ、、 １９８７）。

“再構築”ＮＦ−トリブレットは、適したカラム画分を再度組み合わせた後に“ 天然”のＮＦ−トリブレット蛋白質の再構築に関して上記で記載した方法と同様 にして３種の精製サブユニットから再構築した。

ＮＦ−１−リブレットの脱リン酸化はＥ　コリ　アルカリ性ホスファターゼを用 いて行った。１ｍｌ　（２，５−３ｍｇ）のＮＦ−トリブレット保存溶液を、５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ ＜、領５ｍＭ　ＺｎＳＯ４，１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び５μｇのロイペプチンを含む 合計２ｍｌ中で１０単位（約４００μｇ）のＥ　コリ　アルカリ性ホスファター ゼ（ＩＩＩ−Ｎ型、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉ　ｃａ　Ｉ　ｓ）と共に３７°Ｃで５ 日間インキュベートした。ＮＦ−トリブレット蛋白質を４℃及び１００，０００ ｘｇで１時間遠心することによりホスファターゼから分離した。ペレットを２ｍ ｌの水中で再均質化することにより２回洗浄した。最終的ペレット（収率４０− ５０％）をガラス−テフロンホモジナイザーにより４０％のグリセロール中に再 懸濁し、約０．５ｍｇ／ｍｌの保存溶液を形成し、−２０℃で保存した。脱リン 酸化されたＮＦ−トリブレットは数週間保存する間に凝集する傾向がある。脱リ ン酸化反応の分析５ＤＳ−ＰＡＧＥの後に、染色の前にゲルにつき５ＤＳ−非含 有緩衝液中の“ウェスタン−プロット電気泳動”を６時間行うことによりホスフ ァターゼ及び伴う不純物を除去した。

サブユニットＮＦ−Ｍ（７）脱リン酸化は、ＮＦ−Ｍ　（０，５ｇ）　をＮＦ− トリブレットの場合に用いた条件と同一の緩衝条件下の合計体積１ｍｌ中で２単 位（８０μｇ）のＥ、コリ　アルカリ性ホスファターゼと共に５日間インキュベ ートすることにより行った。１０ｍＭ　Ｂ１５Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，０，１００ｍ Ｍ　ＮａＣｌで平衡化した５０ｘｌＮ５ｃｍ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００カラ ム（５０−１２（ｂｚｍ、流量１０ｍ１／時間）上で混合物をゲル濾過すること によりホスファターゼを除去した。排除容積の回りのＮＦ−Ｍ含有画分をプール しく４ｍ］）、水中に透析し、５ｐｅｅｄＶａｃ中で濃縮し、４０％グリセロー ルを含む０．３ｍｇ／ｍｌ保存溶液として一２０℃で保存した。収量は２７０ｇ ｇ（５４％）であった。

サブユニットＮＦ−Ｈの脱リン酸化は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８５，１ｍ　 Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１５μｇ　ロイペプチンを含む合 計体積１．５ｍｌ中の３７℃で１２０ｇｇのコウシ腸アルカリ性ホスファターゼ と共にＮＦ−Ｈ（１，０５ｍｇ）を６日間インキュベートすることにより行った 。ホスファターゼからの分離、濃縮及び保存はＮＦ−Ｍの場合の記載と同様であ った。収量は７００μｇ（６７％）であった。

両ＮＦ−サブユニットの脱リン酸化反応は、１−１．５μｇのＮＦ−蛋白質をニ トロセルロース上にスポットすることにより監視した。遮蔽、ＳＭＩ−３１及び ＳＭＩ−３４を用いた染色、ならびにプロットの発色は、イムノ−ドツトプロッ ト検定法に関する記載と同様にして行った。

“天然“のトリブレットにおけるＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈの脱リン酸化に伴う５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ　（１，５ｍｍゲル（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、１９７０）、７．５％ア クリルアミド）上の見掛けのＭ、の変位は実際に数分以内で完了した。しかしＳ ＭＩ−３１及びＳＭＩ−３４免疫反応性を完全に排除して本発明の免疫検定法に 適した基質を形成するのに５日間インキュベートすることが必要であった。ホス ファターゼは脱リン酸化トリブレットの沈降を繰り返すことにより定量的に除去 された。ＦＰＬＣ−精製サブユニットから°゛再構築”されたＮＦ−１−リブレ ットにおけるＮＦ−Ｍ及びＭＦ−Ｈサブユニットの脱リン酸化は、ゲル変位、Ｓ ＭＩ−３１反応性の除去及びＳＭＩ−３３エピトープの精製により監視すると、 ずっとゆっくり起こった。ｍＡｂ　ＳＭＩ−３３（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−Ｍ ｅｙｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は非−リン酸化ＫＳＰ配列に特異 的である、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８゜ＳＭＩ−３１反応性の消失は５日 間インキュベートした後でさえ完了しなかった。

ＦＰＬＣ−精製ＮＦ−Ｍは、ＮＦ−トリブレットの場合に用いた条件と類似の条 件下でＥ　コリ　アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸化され、ＳＭＩ−３ １及びＳＭＩ−３４に対して非反応性となったがＦＰＬＣ−精製ＮＦ−Ｈはなラ ナかった。ＦＰＬＣ−精製ＮＦ−Ｈ（７）場合、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上ノ見掛け（ ７）Ｍ、（７）変位及びＳＭＩ−３１ならびニ５Ｍｌ−３４免疫反応性の除去は 、高濃度のＥ、コリ　アルカリ性ホスファターゼを用いて５日間インキュベート した後でさえ不完全なままであった。しかしＦＰＬＣ−精製ＮＦ−Ｈ（７）ＳＭ Ｉ−３１及びＳＭＩ−３４との免疫反応性は、コウシ腸アルカリ性ホスファター ゼ（特殊分子生物学等級（ｓｐｅｃｉａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｇｒａｄｅ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ）と共に５日間インキュベートした後に除去された。ＮＦ−Ｍはどち らのホスファターゼを用いても完全に脱リン酸化された。ホスファターゼはゲル 濾過により除去した。ＮＦの熱処理及び凍結は、蛋白質が凝集する傾向があるの で避けた。

実施例２ ＫＳＰ−リン酸化キナーゼの検出のための免疫検定法の好ましい方法は以下の通 りである。脱リン酸化ＮＦ−トリブレット蛋白質を脳上澄み液の３５−４５％硫 酸アンモニウム画分と共にインキュベートした（Ｂ章を参照）。合計体積３０μ ｌの５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳＳｐＨ７，０１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ　ＡＴＰ 、２ｍＭ　ＤＴＴ中で、５μｇの脱リン酸化された天然のＮＦ−１−リブレット 又は１゜２μｇの脱リン酸化された純粋なサブユニットＮＦ−Ｍ又はＮＦ−Ｈを 基質として用い、ＮＦを含まない標準検定と共にイムノ−ドツトプロット検定法 を行った。

３７°Ｃで１８時間インキュベートした後、１０ｍＭ　ＰＢＳ、ｐＨ７゜２を用 いて検定液を１００μｌに希釈し、５０μｍのアリコートをニトロセルロース（ ０，２２μｍ５Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈ［１１１）上にスポット した。１０ｍＭ　ＰＢＳ、ｐＨ７，２中で３％ＢＳＡと共に１時間インキュベー トすることによりプロットを遮蔽し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／１０ ｍＭ　ＰＢＳ中で１回洗浄した。抗体を、滅菌された１０ｍＭ　ＰＢＳ、　ｐＨ １，２，０，５％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ−Ｘ１００．１０％　ウシ胎児血清中で希 釈した。プロットをＳＭＩ　ｍＡｂと共に少なくとも２時間インキュベートした 。その後プロットを５回洗浄した。マウス　ｍＡｂは、１：２００希釈のホース ラディツシュ−パーオキシダーゼ−結合ヒツジ−抗−マウス抗体（Ｃａｐｐｅｌ 　Ｃｏ、）と反応させ、５０ｍＭ　ＴＢＳＳｐＨ７，５，３３％　エタノール中 で０．０５％　４−クロロ−１−ナフトール（Ｓｉｇｍａ）及び領　０５％　Ｈ ２Ｏ，を用いて５−２０分間染色することにより検出した。すべてのインキュベ ーション及び洗浄は室温で行った。インキュベーションは５０μｍ溶液／ｃｍ２ 膜にてプラスチックバッグ中で密閉した。

ＳＭＩ−３１及びＳＭＩ−３４エピトープを再構築した。脱リン酸化ＮＦ−トリ ブレットを含まない標準免疫検定が陰性なので、反応性はＮＦ−特異的であった 。しかしこれらの部位特異的キナーゼ免疫検定法は、半定量的ではあるが、粗形 態の間にキナーゼの性質のいくつかを評価することができる。

前記の方法はパラメーターを含み、それらは以下のように最適化された。所望の 活性を含む両分の決定のために、イムノ−ドツトプロット−検定法（０，５ｍＭ 　Ｍｇ”、０．５ｍＭ　ＡＴＰ）を脳上澄み液全体の種々の硫酸アンモニウム画 分を用いて行った。標準検定はＮＦ蛋白質を含まなかった。３５−４５％画分が 再構築５Ｍｌ−３１及びＳＭＩ−３４エピトープに関する最も強い反応性を含む ことが見いだされた。脱リン酸化された天然のＮＦ−トリブレットを含まない対 応する標準免疫検定がこの両分に関してほとんど陰性なので、この活性はＮＦ− 特異的であった。０．８Ｍ　ＫＣＩを含む細胞骨格抽出物の４０−５５％及び５ ５−７０％ＡＳ−画分において、永久性の低いＮＦ−特異的活性が追加して検出 されたが、この場合主要ＮＦ−キナーゼ活性が予想されていた。

３５−４５％画分におけるキナーゼの可溶性は、リン酸化された天然のＮＦ−１ −リブレットと共に３７℃で１５分間、又は５ｍ　Ｍｇ／ＡＴＰの不在下又は存 在下で５ｈｅｌａｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ　（１９７３）の方法に従い［４Ｍ　グ リセロール、１ｍＭ　ＧＴＰ、３７°０１３０分間］、集合され、可溶化された 冷微小管と共にインキュベートした後に、低塩濃度（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝 液、ｐＨ７）下で活性が共沈降しなかった時に確認された。

検定を行うための最適インキュベーション時間、ｐＨ及びＮａＣ＋濃度は、３５ −４５％画分を用いて決定した。検定は０．５ｍＭ　Ｍｇ”を用いて行った（他 に指示がなければ）。１ｍＭのＡＴＰ濃度にて１８時間のインキュベーション時 間が最適であった。ｐＨ及びＮａＣ１に関する検定は１８時間のインキュベーシ ョン時間で行った。検定応答はｐＨ７，０、低塩条件（５０ｍＭ又はそれ以下； １０．２０．５０．７５及び１００ｍＭを調べた）及び１ｍＭ　ＡＴＰで最適で あった。

最適Ｍｇ”及びＡＴＰ濃度の決定のために、ＳＭＩ−３１及びＳＭＩ−３４抗体 を用いてイムノ−ドツトプロット−検定法を行った。酵素の量は以下の通りに変 化させた＋０．０４、領　０９．０．１３．０．１８．０２２．０．３３及び０ ４４μｇの粗酵素。標準検定は０．４マイクログラムの粗酵素を用いてＮＦを用 いずに行った。Ｍ　ｇ　２÷及びＡＴＰ濃度は１．０．２．０及び４．０ｍＭで あった。

最適Ｍｇ２＋及びＡＴＰ濃度はそれぞれ２ｍＭ及び１ｍＭであることが見いださ れた。ＡＴＰ　［５ｍＭ］はキナーゼ活性を阻害した。Ｍｎ”１はＭｇ　２−の 約２倍有効であった。ＧＴＰはＡＴＰに代わることはできなかった。２０ｍＭよ り高いＮａＣ１の濃度は検定応答を減少させた。（Ｎ　Ｈ４）　２ＳＯ４を同程 度のイオン強度で用いた場合も同一の減少が観察されたので、この効果はナトリ ウム又は塩素イオンに特異的なものではなく、イオン強度に帰せられる。

別の場合ＰＫ４０及びＰＫ３６の定量的比色免疫検定法を用いることができる。

そのような検定法ではｍＡｂの、脱リン酸化ヒト又は他の種のニューロフィラメ ント、ＴＡＵ蛋白質あるいは組み替えＴＡＵ蛋白質への結合をＰＫ４０及びＰＫ ３６により測定する。キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６は単独で、又は−緒にして 、−次抗体としてのｍＡｂ　３μｍ−３１，５μｍ−３４（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｒ−Ｍｅｙｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｊａｒｒｅｔｓｖｉｌ　 Ｉｅ、ＭＤ）に基づく定量的ＥＬＩ　ＳＡ−型検定法により検定した。第２抗体 はホースラディツシュ−パーオキシダーゼ−結合ヒツジ抗−マウス抗体（Ｃａ　 ｐ　ｐｅｌｃｏ、）であり、その後８２０２及び“ＡＢＴＳ”　（２，２°　− アジノービス−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）・２Ｎ■］４ ）を用いて発色させ、色の抽出（ｃｏｌｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉ。

ｎ）及び測定を行う。異なる量のＰＫ４０及び／又はＰＫ３６を６μｌの２５０ ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，０／１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１２μｍの２５ ｍＭ　ＡＴＰ及び４０−１６０ｇｇの脱リン酸化ウシニューロフィラメントトリ ブレット蛋白質と共に合計体積３０μｍ中でインキュベートした。３７℃で１８ 時間インキュベートし、１０ｍＭＰＢＳを用いて１５０μｌに希釈した。各検定 液（２０μｌ）をニトロセルロース膜にドツトとして適用し、膜をウシ血清アル ブミンで遮蔽し、各ドツトを打ち出した。次にそれらを５μｍ−３１ｍＡｂ（１ ：５００．１００μｍ）と共に２５°Ｃで６時間インキュベートした。各ドツト をＴｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１００を含む１ｍｌのＰＢＳを用いて５回洗浄した。

ヒツジ抗−マウス　Ａｂ、１　：　２００を用いて２５℃で６時間、２回目のイ ンキュベーションを行い、１ｍＩ　ＰＢＳ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて５ 回洗浄した。各ドツトを個別にクエン酸塩ｐＨ４，０１０゜０３％　Ｈ２Ｏ２中 で０，１％　ＡＢＴＳを用い、室温で３０分間振ることにより発色させた。反応 により上澄み液中に可溶性の色が得られ、それを４１５ｎｍで測定した。

実施例３ キナーゼのリン酸化活性の検定のための別の方法は、３２ｐ検定による方法であ った。免疫検定法の場合と同一の緩衝系における放射性検定法には基質として５ μｇのＨＴＰ−精製された天然のＮＦ−１−リプレット（ＮＦ以外に３μｇの基 質蛋白質）、及び１ｌ５０−２５０ｃｐ／ピコモルのガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰを 含んだ。約１ピコモル／分／検定までの活性の場合、検定応答は１５分間隔内で 直線的なのでインキュベーション時間は３７°Ｃで１５分であった。検定は、氷 上で冷却し、２０μｌの２５ｍＭ　ＥＤＴＡを加え、直後に１０％　ＴＣＡ／２ ％　ピロリン酸ナトリウム（ＰＰＡ）で湿潤させたガラスフィルター（Ｗｈａｔ ｍａｎＧＦ／Ａ）上に混合物を移すことにより停止させた。ガラスフルイタ−を １０％　ＴＣＡ／２％　ＰＰＡ中で１時間にて２回、及び少な（とも３時間にて １回洗浄し、最後にエタノール中で洗浄し、空気乾燥した。

５ｍｌのＬｉｑｕｉｓｃｉｎｔ”　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎ。

５ｔｉｃｓ）を用いて２０分間シンチレーション計数（ＢｅｃｋｍａｎＬＳ　２ ３０）することにより放射性を評価した。検定は、いくつかの明記された場合に 二重におこなった以外は日常的に三重に行い、ＮＦを含まない標準検定を平均値 から引き去った。

この検定法のための好ましい基質は、下記実施例９の方法に記載されている通り に調製されたＴＡＵである。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析する検定液は、等量の試料緩衝液を用いて停止し、３ 分間煮沸し、７．５％ゲル上で移動させた。クーマシーブルーで染色シタ後、脱 色し、Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ紙上で乾燥し、ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘスク リーン強調装置（ｓｃｒｅｅｎ　１ｎｔｅｓｉｆｉｅｒ）を用いて一７０℃でオ ートラジオグラフィーを行った。

定量測定のために各ＮＦ−サブユニットの放射性バンドを切り出し、２０ｍ１の 水中に浸したＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中に入れ、試料のＣｅｒｅｎｋｏｖ放 射を計数した。計数効率は約３０％であった。

実施例４ キナーゼ精製法は、４℃で３５−４５％　ＡＳ−画分を多様なりロマトグラフィ ー媒体にさらすことにより最適化した。はとんどすべての場合にＳＭＩ抗体を用 いて検定される活性は失われた。これらの損失は４Ｍ　ＮａＣ１の存在下でさえ 起こり、ＮａＣｌはそれだけで標準実験における酵素の残存に影響しなかった。

（ＮａＣ１はキナーゼ又は可能な必須のサブユニットのクロマトグラフィー媒体 への結合を防ぐために加えた。）しかし溶液中にＭｇ−ＡＴＰが含まれるとい（ っがの媒体への活性が安定化されることが見いだされた。活性の残存を減少させ るために、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａｇａｒｏｓｅ、ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ及び 第４アンモニウムイオン交換体がＭｇ−ＡＴＰの存在下で有用なりロマトグラフ ィー媒体であることが見いだされた。

ＫＳＰ−リン酸化キナーゼの精製のための好ましい方法は以下の通りである。段 階Ｉ：新しいウシ脳（湿潤重量３５０−４５０ｇ）から髄膜及び血管を除去し、 ３５０ｍ１の均質化緩衝液（１０ｍＭ　Ｂｉｓ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，０，１ ５０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＰＭＳ Ｆ、５μｇ／ｍｌ　ｏイペブチン）中の４°ＣにてＵｌ　ｔｒａｔｕｒａｘ又は ５ｏｒｖａｌｌ　Ｏｍｎｉ−ｍｉｘｅｒを用いて３分間均質化した。２０．ＯＯ Ｏｘｇで２０分間遠心した後、ペレットを３００ｍ１の均質化緩衝液で２回抽出 した。１００゜０００ｘｇで１時間遠心することにより濁った上澄み液を透明に した。

アンモニアでｐＨを８．　０−８．　５に保ちながら固体硫酸アンモニウムを約 １時間かけてゆっくり加えた。３５％−４５％飽和の間で得られた沈澱を、２０ ．ＯＯＯｘｇで２０分間遠心することにより集め、２０ｍ１の１０ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ、ｐＨ７，０，１ｍＭ　ＭｇＣＬ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ及び１ｍＭ　ＤＴＴ中 に再溶解し、この緩衝液に対して粗＜　（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）透析し、約 ２０ｍｇ／ｍｌの蛋白質の“粗酵素”保存溶液を形成し、これは活性をほとんど 失わずに４℃で数週間保存することができた。

段階４　Ｉ　：　２０ｍ１の粗酵素をＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ出発緩衝液（５ ｍＭ　酢酸マグネシウム、５ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０％　グリセロ ール、領　０２％　ナトリウムアジド、Ｂ１５ＴｒｉｓでｐＨ６，０に調節）中 に透析し、出発緩衝液で平衡化した３ｘ２．５ｃｍのＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ カラム上に負荷した。カラムを６０ｍ１の出発緩衝液を用い、約５０ｍ１／時間 で洗浄し、その後キナーゼを１段階で８５ｍＭ　酢酸マグネシウム、５ｍＭ　Ａ ＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ。

１０％　グリセロール、０．０２％　ナトリウムアジド、ｐＨ６，０を用いて１ ５ｍ１の容積の両分として溶離した。

段階ＩＩＩ：多量の活性を含む、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー の合わせた画分を１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，１ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭ　 ＤＴＴ中に透析した。その後蛋白質を５ｐｅｅｄＶａｃ中で約３ｍｌに濃縮し、 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００　５ｕｐｅｒｆ　ｉｎｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） の９５ｘ２．５ｃｍ　カラム上に負荷し、濾過緩衝液（４８ｍＭ　Ｂ１５Ｔｒｉ ｓ、ｐＨ７，０，５ｍＭＭｇＣＬ、５ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２ ％　ナトリウムアジド）を用いて溶離した。１．５−２ｍ１／時間の流量で１５ ５ｍ１を溶離した後、５ｍｌの画分を集めた。

集めた５ｍｌの画分（１０−２８）を、ＮＦ−トリブレットと共に１８時間イン キュベートした後、５Ｍｌ−３１及び５Ｍｌ−３４抗体を用いてイムノ−ドツト プロット−検定法で調べた。両分は３２ｐ−検定法（ＮＦ−４リプレツトと共に ３０分間インキュベート）も行い、キナーゼ活性の存在も調べた。キナーゼ活性 は非常に広いピークとして溶離された（１４−２３）。部分的精製ＮＦ−キナー ゼを用いたリン酸化により製造した３２ｐ−標識され、脱リン酸化された天然の ＮＦ−トリプレットからの検定条件下におけるホスフェートの放出を監視するこ とにより、関連するキナーゼ画分において有意なＮＦ−特異的ホスファターゼ活 性は検出されなかった。さらに画分につき１２％　５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳 動を行った。ＰＫ４０及びＰＫ３６のバンドが同定でき（矢印、図１）　、ＰＫ ４０は画分１７−１９で最も顕著であり、ｐＫ３６は画分２１及び２２で最も顕 著であった。その後これらの画分を検定法において使用した。

段階ＩＶ：　５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従い有意な量のＰＫ４０　（１７−１９） 及びＰＫ３６　（２１−２２）を含むゲル濾過画分をプールし、Ｍｏｎｏ　Ｑ出 発緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ８，０，２０ｍＭＭｇＣ１，，５ｍＭ 　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２％　ナトリウムアジド）中に透析し、出発 緩衝液で平衡化したＨＲ５１５Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＦＰＬＣ−カラム（Ｐｈ　ａ　ｒ ｍａ　ｃ　ｉ　ａ）上に負荷した。ＰＫ４０の溶離は１ｍｌ／分の流量にて５ｍ ｌの出発緩衝液から開始し、その後７ｍｌから６０ｍＭ　ＭｇＣ１，までの直線 勾配、５ＱｍＭ　ＭｇＣ１，にて７ｍｌの無勾配溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｅ ｌｕｔｉｏｎ）、及び最後に溶離緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５ＳｐＨ８，０ ，１１０ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２％　ナト リウムアジド）を用いて形成した１１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚまでの直線勾配により 溶離した。ＰＫ３６の場合の勾配プロファイルは同一であった。

種々の画分につき多様な検定を行い、それには：ドットプロット検定法；３２Ｐ −検定法、及び１２％　５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動が含まれる。画分内の活 性はイムノ−ドツトプロ・ソトー検定法及び３２ｐ−検定法により示された。

ドツトプロット検定法及び３２Ｐ−検定法におけるＰＫ４０画分の活性は、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥゲル上の特定の画分の移動と関連し、重要なことに５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより明らかになった特定のバンドと関連した。画分の活性はゲル電気泳動の ４０ｋＤバンドの存在と関連した。検定により、ＰＫ４０によるＮＦ−Ｍ及びＮ Ｆ−Ｈの比較的顕著なリン酸化が明らかになった。

ＮＦ−キナーゼのピーク画分（ＰＫ４０：１１−１２；ＰＫ３６：１２−１３） をプールし、保存緩衝液（２０ｍＭ　Ｂｉ　ｓＴｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，０，２ｍ Ｍ　ＭｇＣｌ２．２ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０゜０２％　ナトリウムア ジド）中に透析し、保存のために微小濃縮器（ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｏｒｓ）（Ａｍｉｃｏｎ　１０）中で約１０倍に濃縮した。凍結すると酵素は安 定である。活性は４℃で数日保存され、５サイクルの凍結−解凍の後もほとんど 失われなかった。これらのプールされた画分を下記の組成物で使用した。

３５ｋＤ及び４０ｋＤ蛋白質のキナーゼとしての同定に用いられたＰＫ３６及び ＰＫ４０の比較的純粋な混合物は、ゲル濾過画分１６−２３をプールし、２０ｍ Ｍ　１１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ（７）連続直線勾配の１７ｍ１を用いてＭｏｎｏ　 Ｑから溶離した後に得た。

ＰＫ４０及びＰＫ３６の蛋白質キナーゼとしての同定をさらに確認するために、 上記の通りにして（Ｍｏｎｏ　Ｑからの溶離に関する上記の方法を参照）得た両 キナーゼの非常に豊富な混合物をポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上で分離 し、雨量白質の移動を以下の通りにしてゲルスライスから溶離したＮＦ−キナー ゼ活性と関連づけた。

ＰＫ４０／３６混合物をＳＤＳ、１ｍＭ　ＤＴＴ及び５ｍＭ　ＭｇＡＴＰを含む １０％　ＰＡＧＥ上で電気泳動させた。寸法が約２ｍｍのゲルスライスを少量の 水中に終夜をかけて溶離した。上澄み液のアリコートをＮＦ−キナーゼ活性及び ５ｚｐ−検定法による活性に関して評価し、その後ＮＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び オートラジオグラフィーを行った。

比較的弱いＮＦ−キナーゼ活性は、各ゲルスライスにおける３６ｋＤ蛋白質の存 在（１２％　５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の分析の通り）と厳密に関連しているが、４０ ｋＤのキナーゼはＳＤＳからの再生に成功しなかったようである。

やはり４０ｋＤ蛋白質のキナーゼとしての同定の証明のためにＰＫ４０／３６混 合物を非−変性７．５％　ＰＡＧＥ上で分離する類似の実験を行った。この場合 主要キナーゼとして現れた４０ｋＤ蛋白質は非常に良（活性と関連した。

段階Ｖ：ＰＫ４０を非変性７．５％　ＰＡＧＥ上で分取的に移動させ、電気−溶 離器（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅｒ）（モデルＵＥＡ、Ｉｎｔｅｒｔｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴ）でゲル スライスから、４℃及び１２０Ｖにおける２回の連続した３０分の移動で、７． ５Ｍ　酢酸アンモニウム、１０ｍＭ　ＭＣ−ＡＴＰ、２ｍＭ　ＤＴＴ及び微量の ブロモフェノールブルーを含む捕獲緩衝液中に溶離するとＰＫ４０の最も良い組 成物が得られた。

溶離緩衝液は２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３，１９２ｍＭ　グリシン、２ｍＭ 　Ｍｇ−ＡＴＰ及び１ｍＭ　ＤＴＴを含んだ。キナーゼは２０ｍＭ　Ｂ１５Ｔｒ ’ｉｓ　ｐＨ７，０１２ｍＭ　Ｍｇ−ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴの保存緩衝液中に 透析し、微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ　１０）で約１０倍に濃縮した。

下表１はＰＫ４０及びＰＫ３６の濃縮の詳細である。

表１１種々のクロマトグラフィ一段階を経たＰＫ４０及びＰＫ３６の濃縮段　階 　比活性６　全活性’　［ｍｇ］ＰＫ４０　ＰＫ３６　ＰＫ４０　ＰＫ３６　Ｐ Ｋ４０　ＰＫ３６りＡＳ−分別　′２９０ ＩＩ　）　ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｏ，５５２３，６４３ｎＩ）Ｓｅｐｈａ ｄｅｘＧ２００　１．４５　１．１５　３，８０　２．２７　２．０　２．ＯＩ Ｖ）ＭｏｎｏＱＦＰＬＣ３，８２，８０，７３０，３９０，１９０，１４Ｖ）分 取ゲル−電気泳動　５．２−ｂｏ、６７　−　０．１３　−°　測定せず。ＮＦ −特異的活性はバックグラウンドに対して低すぎた。

１　分取５ＤＳ−ゲルからのＰＫ３６の電気溶離は不成功であった。

゛　ナノモル３２Ｐ−ＰＯ４トランスファー／分／ｍｇ蛋白質６　ナノモル３２ Ｐ−ＰＯ４トランスファー／分ＰＫ４０を含むＭｏｎｏＱ画分につきさらに２次 元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル分離法を行った（０’Ｆａｒｒｅｌｌ法）。ポリクロー ナル抗−ＥＲＫ抗体である抗−ラットＭＡＰキナーゼＲ２（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、Ｃａｔ　＃４０６−１８２）を 用いてウェスタンプロット検定法を行った。ウェスタン分析によりたった１つの ＥＲＫ蛋白質の存在が明らかにされたが、３個のイソ型を区別することができた 。

実施例５ ＰＫ４０及びＰＫ３６の基質特異性を以下の通りに決定した。調べた神経蛋白質 の中で、脱リン酸化ＮＦ−Ｍに対するＰＫ４０の特異性が最も衝撃的であった。

他の基質はそれより効果が低かった。特異性の順序は脱リン酸化ＮＦ−Ｍ＞＞Ｔ ＡＵ＞ＮＦ−Ｍ＝ＮＦ−Ｌ＞脱リン酸化ＮＦ−Ｈ＞ＮＦ−Ｈ’ｔ’あった。ＰＫ ３６はＰＫ４０より特異的活性カ低り、基質特異性はＮＦ−Ｌ＝ＴＡＵ＝脱リン 酸化Ｎす−Ｍ＞ＮＦ−Ｍ＞＞ＮＦ−Ｈ＝脱リす酸化ＮＦ−Ｈであった。い（つか の微小管付属蛋白質も両方のキナーゼの良い基質であった。

組機小管−組成物中のＭＡＰ２は、ＴＡＵ蛋白質と同等か又はそれ以上のＰＫ４ ０及びＰＫ３６、特にＰＫ４０の基質であった。ＭＡＰ＃２は両キナーゼにより バックグラウンドより高いレベルにリン酸化される（ＰＫ４０　：　２．５ｘ　 ；　ＰＫ３６　：　１．５ｘ　；　ＣＥＲＥＮＫＯＶ計数により決定）。ＭＡＰ ２のバックグラウンド標識は、環状微小管に固有の第２メツセンジヤー非依存活 性の故に行った。リシンの豊富なヒストンＩＩＩ型（コウシ胸腺、Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）がＰＫ３６及びＰＫ４０の両方に対する最も好ましい基質 であった。これは、リジンの豊富なヒストンＩＩＩ型をあまりリン酸化せず、Ｔ ＡＵ及びＭＡＰ２を含む微小管付属蛋白質をリシンの豊富なヒストンＩＩＩ型よ り実質的に高度にリン酸化する他のすべての既知のＥＲＫキナーゼと全く対照的 な特徴である。酸性蛋白質であるホスビチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）及びチューブリン（コウシ脳から、Ｄｒ、Ｆ、Ｓｏｌｏｍｏｎ、Ｄｅｐｔ、ｏ ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭＩＴから寄贈）はＰＫ３６及びＰＫ４０のいずれの場合 も基質として非常に悪かった。

実施例６ ＰＫ４０及びＰＫ３６のＡＴＰ依存性及び阻害を、懸濁液中のＮＦ−トリブレッ トの凝集状態から生ずる不確かさを避けるための第２基質として可溶性脱リン酸 化ＮＦ−Ｍを用い、２ｍＭ　Ｍｇ２＋にて決定した。

両キナーゼの場合に最適値は０．５−１ｍＭ　ＡＴＰであった。両キナーゼのＡ ＴＰに関する見掛けのに、値を、阻害が開始されるより十分低いＡＴＰ濃度の範 囲に関してＷｏｏｌｆ−Ｈａｎｅｓプロット（Ｄ　ｉ　ｘｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｂ ｂ、１９７９）から算出した。第２基質、ＮＦ−Ｍの３通りの異なる濃度におけ るに、、及びＰＫ４０の３回の測定は類似の値を与え（平均上標準偏差：９３± １２μＭ）、ＰＫ４０のＡＴＰ−親和性にＮＦ−Ｍの濃度がほとんど影響を与え ないことを示した。ＰＫ３６の平均に、、は約５０μＭであった。

ＰＫ３６及び特にＰＫ４０は、Ｍｇ　２＋の量を越える遊離の（非錯体化）ＡＴ Ｐの３ｍＭ過剰に相当する５ｍＭのＡＴＰの存在下で強（阻害され、標準レベル のそれぞれ１４％及び７％となった。対照的に過剰のＭｇ２′″（１ｍＭ　ＡＴ Ｐより５ｍＭ過剰、又は５ｍＭ　ＡＴＰより５ｍＭ過剰）の場合は、ＰＫ４０に 対してほとんど又は全く阻害が観察されなかったがＰＫ３６の活性は有意に低下 した。

キナーゼの活性は１５０ｍＭ　ＮａＣｌの存在下でも２７％（ＰＫ４０）及び４ ０％（ＰＫ３６）に低下した。Ｗａｌｓｈ阻害剤にる阻害はＰＫ３６の場合のみ に観察され、ＩＣ６ｏは５０μＭと算出された。

前記を下表２にまとめる。

表２．ＰＫ４Ｑ及びＰＫ３５の相対的活性［％］への塩化ナトリウム、過剰のマ グネシウム及びＡＴＰ、ならびにＷａｌｓｈ阻害剤の影響ＰＫ４０”　ＰＫ３６ ’ 即　１００″±６．９　１００＋１．１２ｍＭ２ｍＭ　Ｍｇ２ １ｍＭ　ＡＴＰ ２ｍＭ　Ｍｇ２　７．２±６．９　１４±０．　５５ｍＭ　ＡＴＰ ５ｍＭ　Ｍｇ２　１０７＋３．５　４０＋０．２１ｍＭ　ＡＴＰ ５ｍＭ　Ｍｇ２　７８±７．１　３８±２．２５ｍＭ　ＡＴＰ ＮａＣ１２７＋１．８　４０±０．　８５０ｍＭ Ｗａｌｓｈ阻害剤ＥＭＥ ４．５　１０２±５．３　１０３±０．　５１．５　１０７±３．７　８７±０ ．　６４５　１０１±１．　１　５８±３．３Ｗａｌｓｈ阻害剤の検定を除いて 値は３回の検定の平均を示す（士標準偏差）；Ｗａｌｓｈ阻害剤の場合は二重に 行った。

”ＰＫ４０の組成物：表１、段階■を参照、ＰＫ３６の組成物：表１、段階ｒｖ を参照。

ｂすべでの値は標準の％として相対的活性を示す。

実施例７ ＰＫ４０及びＰＫ３６のリン酸化活性を他のキナーゼと比較した。５Ｍ１−３１ 免疫検定法、すなわち５Ｍｌ−エピトープの再構築の測定により、脱リン酸化Ｎ Ｆ−トリプレット及び脱リン酸化ＮＦ−Ｍ中のＫＳＰ配列のリン酸化は、ＰＫ４ ０及びＰＫ３６の混合物を用いると起こったが、ＰＫＣ，カルシウム／カルモジ ュリン依存性キナーゼＩＩ、ｃＡＭＰ−依存性キナーゼ又は第２メツセンジャー −非依存性微小管付属キナーゼを用いると起こらなかった。

Ｃａ”／カルモジュリンー依存性キナーゼＩＩ及び蛋白質キナーゼＣヲ用イタリ ン酸化ハ、３０μｌ＋７）５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐ）１７．５、ｌＱｍＭ　Ｍ ｇ”、５ｍＭ　Ｃａ”、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、２ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ及 びそれぞれ５Ｏａｇ／ｍｌのカルモジュリン及びホスファチジルセリン、ならび に５μｇのＮＦ−）リブレット蛋白質中、ＰＫ４０及びＰＫ３６は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ上で重いＮＦ−サブユニットの移動度の変位を引き起こし、高モル比でリン 酸基を挿入した。ＰＫ４０及びＰＫ３６により重いＮＦ−サブユニットに挿入さ れるリン酸基の最大数の決定のために、上記の段階Ｖ及び段階ＩＶの精製活性を 、その濃度を増加させながら脱リン酸化ＮＦ−Ｍ及び脱リン酸化ＮＦ−Ｈと共に インキュベートした。５ＤＳ−ＰＡＧＥはＮＦ−Ｍ及びＮＦ−ＨのＭ、をかなり 過剰に評価するので、ＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈの正しい分子量をＫａｕｆｍａｎｎ 　ｅｔ　ａｔ、（１９８４）により決定されたそれぞれ１１０ｋＤ及び１４０ｋ Ｄと仮定することにより、リン酸化の化学量論を決定した。完全脱リン酸化ＮＦ −Ｍ及び脱リン酸化ＮＦ−ＨのＰＫ４０及びＰＫ３６による飽和リン酸化を、（ ｉ）１８時間の検定にて３２ｐ−挿入により監視されるリン酸化の程度（モルＮ Ｆ−Ｍ当たりのモルＰＯ４）に対して測定される酵素活性の量の増加、（ｉｉ） ７．５％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　上０）　ケル移動度変位、及ヒ（ｉ　 ｉ　ｉ）　５Ｍｌ−３１及び５Ｍｌ−３４免疫検定法を分析することにより測定 した。ＰＫ４０及び３６の混合物も調べた。

ＰＫ４０は最高１５個のリン酸基をＮＦ−Ｍ中に挿入し、それは単離ウシＮＦ− Ｍで観察されるリン酸基の数（Ｅｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４）と良く対応 しており、又５ＤＳ−ＰＡＧＥ上でＮＦ−Ｍバンドを天然のＮＦ−Ｍの見掛けの Ｍ、より高く完全に変位させた。対照的にＮＦ−Ｈの場合は部分的変位しか達成 されず、最高で７個のリン酸基がおそらく約４０ＫＳＰ一部位を有する分子中に 導入された。ＰＫ３６によるＮＦ−Ｍのリン酸化は、実質的ゲル移動度変位を伴 ってＩＯＭ　リン酸基／Ｍ　ＮＦ−Ｍで飽和すると思われたが、おそらく不均一 なリン酸化状態の故にＮＦ−Ｍバンドは拡散されて残った。ＰＫ３６に関する基 質としてのＮＦ−Ｈの劣性と関連してＮＦ−）（はＰＫ３６によりあまりリン酸 化されず、実際にゲル変位を示さなかった。両キナーゼは５Ｍｌ−エピトープを 再構築したが、ＮＦ−Ｈ及びＰＫ３６の場合は弱い再構築のみであった。ＮＦ− Ｍの最大リン酸化は２種のキナーゼの混合物を用いても実質的に高（な（、ＰＫ ４０及びＰＫ３６がＮＦ−Ｍに対して太き（重複した部位−特異性を有すること を示した。７−１３個のリン酸基の挿入の後、ＮＦ−Ｍは天然のＮＦ−Ｍと同程 度のゲル移動度を有した。５Ｍｌ−免疫活性応答はゲル移動度変位と関連性を示 したが、低いリン酸化のレベル、すなわち〈５モルＰＯ４１モルＮＦ−Ｍでは応 答しなかった。５Ｍｌ−３４免疫検定法は５Ｍｌ−３１検定法より高いレベルの リン酸化を必要とした。

実施例９ ＰＫ４０は脱リン酸化された、及び天然のＴＡＵの両方の性質に多様な変化を引 き起こし、その変化は病理学的に興味深い。

ＴＡＵへのＰＫ４０の影響をさらに確認するためにウシＴＡＵを調製した。用い られた方法は４℃で行うのが好ましく、高温で行った場合に通常起こるリン酸化 を含まない生成物を与える。

ＴＡＵをＢａｕｄｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）に従い新しいウソ脳から調 製した。簡単に記載すると、１ｋｇの脳組織を、それぞれ２ｍＭのＥＤＴＡ及び ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ及びそれぞれ５ｍｇ／Ｉのア プロチニン、ロイペプチン、アンチベイン、アンチキモトリプシン及びペプスタ チンＡを含む１１の１００ｍＭ　リン酸カリウム（ＫＰＯ４）緩衝液、ｐＨ６， ５中で均質化した。１５゜０００ｘｇの遠心で組織の細胞破片を除去し、ＩＩの ＫＰＯ４緩衝液で再抽出した。上澄み液を硫酸アンモニウム中で４５％とし、２ ０．　０００ｘｇにて遠心した後に沈澱を集め、再均質化し、ＫＰＯ４緩衝液中 に粗く透析した。透析液をあらかじめ膨潤させた８ｇのＣＭ−３ｅｐｈａｄｅｘ 上に吸着させ、非結合物質をＫＰＯ４緩衝液で洗浄することにより除去し、ＴＡ Ｕ含有画分をＫＰＯ４１０，５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ６゜５で溶離した。ＭＣｌ０ ４を３％まで加え、沈澱した物質を遠心により除去し、Ｔｒｉｓ−中和上澄み液 中の粗ＴＡＵ４５％硫酸アンモニウムで沈澱させた。ペレツトを５ｍｌの水中に 取り上げ、５ＱｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ６ ，９（Ｍｏｎｏ　Ｓ出発緩衝液）中に透析した。３０ｍ１の０−５００ｍＭのＮ ａＣ１の直線勾配を用いて　５／Ｓ　Ｍｏｎｏ　Ｓ　カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）上のＦＰＬＣを行い、それによりＴＡＵを２５０ｍＭ　ＮａＣ１付近の広い ピークとして溶離した。ＴＡＵ含有画分を水中に透析し、５分間煮沸することに より少量の汚染プロテアーゼ活性を破壊した。

３００μｇの天然のウシＴＡＵを６Ｏａｇのコウシ腸アルカリ性ホスファターゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び２ＯａｇのＥ、コリ　アルカ リ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　ＩＩＩ−Ｎ型）と共に３５０μＩの５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ、容重　５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４及びＺｎ５Ｏａ、０．１ｍＭ 　ＰＭＳＦ、各１０μｇ／ｍｌ　アプロチニン、ロイペプチン、アンチペイン、 ペプスタチン及びアンチキモトリプシン（すべてＳ　ｉｇｍａ）　、ｐＨ８，０ 中の３７℃にて３日間インキュベートすることにより、脱リン酸化ＴＡＵ蛋白質 を調製した。室温で１０μｍのＨＣＩ　０４を用いて沈澱させることによりホス ファターゼを除去した。上澄み液をＴｒｉｓを用いて中和し、水中に透析した。

１Ｏａｇの天然又は脱リン酸化ウシＴＡＵ　（上記の別法に従って調製）及び３ μｇのバクテリアにより発現されたヒトＴＡＵイソ型ｈＴａｕ４０を約２５ピコ モル／分のＰＫ４０又はＰＫ３６と共に３７℃で１８時間インキュベートするこ とにより、ＰＫ４０及びＰＫ３６リン酸化によって起こるウシ及びヒトＴＡＵ蛋 白質のゲル移動度変位を測定した。分析は１０％　５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオート ラジオグラフィーにより行った。

Ｄｒ、Ｅ、Ｍ、Ｍａｎｄｅ　］　ｋｏｗから蛋白質として戴いたクローンＨｔａ ｕ４０　（Ｇｏｅｄｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）からＥ、コリ中で発現さ れた純粋な４２ＫＤのヒトＴＡＵイソ型を用いて類似の結果が得られた。上記の 飽和条件下でＰＫ４０は最高１４個のリン酸基を４２ｋＤ　ＴＡＵイソ型中に挿 入した。ＰＫ３６はＮＦ−Ｍの場合と同様に、ＴＡＵ蛋白質において部分的な移 動度変位を起こした。

脱リン酸化ウシＴＡＵ及び天然のウシＴＡＵのＰＫ４０による飽和リン酸化は１ ０％　５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度を有意に減少させ、イソ型パターンを特徴的 に変化させた。試験管内で生産された別のＴＡＵは、天然のＴＡＵを用いても脱 リン酸化ＴＡＵを用いても、ＰＨＦから抽出されたヒトＴＡＵ蛋白質のパターン と非常に密接に類似したパターンを与えた。正常なヒト脳からのＴＡＵに対する ＰＨＦから抽出されたヒトＴＡＵ蛋白質のパターンにおける変位は、（Ｇｏｅｄ ｅｒｔ　ｅｔａｌ、、１９９２）において明確に記載されており、その変位は完 全に高リン酸化によるものであることが示された。

１０％　５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で天然のウシＴＡＵの多数のイソ型が３個のイソ型 パターンに変換される。これは天然のヒトＴＡＵがリン酸化された場合に生産さ れる３個のイソ型の見掛けのパターンと同一である。

ウシＴＡＵの組成物のいくつかの場合、移動度が最小のイソ型はリン酸化の後に あまり顕著でなくなり、基本的にいくつかのＰＨＦ−抽出物で観察された２個の イソ型のパターンが形成される。リン酸化のレベル及びそれに伴う構造的変化は 、部分的にリン酸化された天然のＴＡＵ及び基質としての脱リン酸化ＴＡＵの場 合と大体同様である。

クローンｈＴａｕ４０からバクテリアにより発現された４２ｋＤヒトＴＡＵイソ 型は、ＰＫ４０リン酸化においてウシＴＡＵと類似の挙動を示す。ケル移動度変 位は見掛けの大きさの約１５ｋＤ増加に相当する。

ＰＫ３６はｈＴａｕ４０を同程度にリン酸化することができず、その結果部分的 な移動度変位を起こすのみである。ＨＴａｕ４０が不均質に見えるのは、３倍高 い濃度のキナーゼにおいてもパターンが変化しなかったので、おそら＜ＰＫ３６ リン酸化の最終状態を反映している。ＰＫ３６リン酸化の前にＰＫ４０で予備処 理をすると、ＰＫ４０のみの場合と同一の完全に変位したバンドを与えた（示し ていない）。

ウシＴＡＵをＰＫ４０で処理してもＰＨＦ−ＴＡＵの高リン酸化ＴＡＵと免疫化 学的に類似のリン酸化ＴＡＵを与えるのに十分な程度までＴＡＵをリン酸化する が、ＰＫ３６はそうではない。脱リン酸化ウシＴＡＵ及び天然のウシＴＡＵを２ ５ピコモル／分のＰＫ４０又は１５ピコモル／分のＰＫ３６と１８時間インキュ ベートし、モノクローナル抗体ＴＡＵ−１（ＳＩＧＭＡ）（抗原として０．１５ μｇＴＡＵ）；５Ｍｌ３３（抗原として０．５μｇＴＡＵ）；　ＳＭＩ　３１　 （抗原として１μｇＴＡＵ）；及び５Ｍｌ３４　（抗原として２μｇＴＡＵ）を 用いて精査した。

ＴＡＵ−１はリン酸化エピトープを直接認識しないがリン酸塩で処理したＰＨＦ −ＴＡＵ蛋白質はＴＡＵ−１に結合する（Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌ　ｅｔ　 ａｌ、１９８６）、ＳＭＩ−３３もリン酸化エピトープを直接認識しないが脱リ ン酸化ＴＡＵ上、及び天然のＴＡＵ上のエピトープを認識する。このエピトープ はすべてのウシＴＡＵイソ型の配列中に２個存在する（Ｈｉｍｍｌｅｒ　ｅｔ　 ａｌ、１９８８）脱リン酸化ＫＳＰ配列（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）で あると思われる。

逆にＳＭＩ−３１エピトープは天然又は脱リン酸化ＴＡＵ中に存在せず、ＫＳＰ 部位が通常リン酸化されていないことと一致する。

ウェスタンブロッティングにより決定される通り、天然のウシＴＡＵをＰＫ４０ で処理するとＴＡＵ−１及びＡＭＩ−３３に対する免疫反応性が完全に排除され るが、ＡＭＴ−３１及びＳＭＩ−３４との非常に強い抗体結合反応を生じ、これ らは両方共リン酸化エピトープを検出する。

これはＰＨＦ中で起こるようなＫＳＰ部位のリン酸化を示す。（これらのウェス タンプロット上で電気泳動移動度の減少も検出された。）ウェスタンプロット上 のＰＩＦ−ＴＡＵの場合（Ｇｒｕｎｄｋｅ−１ｑｂａｌ　ｅｔ　ａｌ、１９８６ ）と同様にＴＡＵ−１１ピトーブがタンゲルにおいてリン酸化によりｉｎ　５ｉ ｔｕで遮蔽されるのでＴＡＵ−１結合へのＰＫ４０処理の効果は特に興味深い。

対照的にＴＡＵのＰＫ３６処理により起こる唯一の有意な免疫化学的変化は非常 に低下した５Ｍｌ３３活性であり、ＴＡＵ−１活性は脱リン酸化ウシＴＡＵから 実質的に変化しなかった。ＰＫ３６はＰＫ４０より効果の低いＴＡＵのリン酸化 キナーゼである。

以前にいくつかのキナーゼがＴＡＵ蛋白質のＰＩＦ−ＴＡＵへの変換に役割を果 していることが示唆された。しかしＰＫ４０と異なり、いずれもＴＡＵに既知の 病理学的変化を与えない。従って構造的及び免疫化学的変化、ならびにリン酸化 の化学量論の基準により、ＥＲＫ−ファミリーの新しいメンバーであるＰＫ４０ がアルツハイマー病（ＡＤ）　、ダウン症候群（ＤＳ）及び正常な老化に特徴的 な異常なＴＡＵ−高リン酸化を行うことができる。部分的重複部位−特異性を有 するＰＫ３６は同程度のＴＡＵ−変化を起こすことができなかった。

多様な免疫組織化学的及び生化学的研究がタンゲル形成に先行する現象としてＴ ＡＵ−高リン酸化を指摘している。ＰＫ４０はＴＡＵの高リン酸化において重要 な役割を果す。ＰＫ４Ｑの慢性的高調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は軸索の 退行及び神経細胞の機能的一体性との抵触を起こし得る。

実施例１０ 化学的手段によりＡＴＰ生産から酸化的リン酸化を脱共役させると、特殊な条件 下で培養した健康な患者からの線維芽細胞に免疫学的エピトープを出現させる。

（Ｂｉａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）ａこの観察は、これらのエピトープの 出現を、ＡＴＰ生産から酸化的リン酸化が脱共役された場合と同様にＡＴＰ量が 減少した時に阻害から解放されるキナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６の活性を結び付 けることにより、初期アルツハイマー病の診断に用いることができる。脱共役は 脱共役剤、例えばＣＣＣＰ　（カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾ ン）の使用により、又は酸素の排除により行うことができる。初期神経細胞退行 の診断試験は、神経細胞が退行する種々の状態、例えばアルツハイマー病、パー キンソン病、ハンチントン舞踏病、正常な老化、及び脳梗塞に適用できる。

キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６を用いた初期アルツハイマー病の診断試験につき 記載する。調べるべき患者から皮膚線維芽細胞の初代培養を得る。これらを０． １ｍＭ　ジブチリル環状−ＡＭＰ、Ｏ，ｌμｇ／ｍ１　７３神経成長因子、１０ μｇ／ｍｌ　混合ウシガングリオシド及び５％ヒヨコ胚油抽出物含むＤｕｌｂｅ ｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地中で成育する。ＡＴＰ生産からの酸化的リン酸化の 脱共役剤、すなわちＣＣＣＰ（カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾ ン）の存在下で、又は酸素を排除すると、細胞は免疫学的エピトープ（Ａｌｚ− ５０、ＰＨＦ−エピトープ、ＳＭＩ−３１／５Ｍｌ−３４−隅性ＴＡＵ／ニュー ロフィラメントエピトーブ）を示し、キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６の阻害から の解放を示す。アルツハイマー病患者からの細胞は正常な細胞より低い濃度の脱 共役剤でこの効果を示す。かくして調べるべき患者からの細胞を、脱共役剤の濃 度を増加させて、又は酸素濃度を減少させて“滴定”する。それらはＡＴＰ濃度 の減少効果に対する抵抗性が低いことにより正常な患者からの細胞と区別される 。

純粋なＰＫ４０を得るために、キナーゼを濃縮して含むＭｏｎｏ　ＱＦＰＬＣ画 分からの約１５０μｇの全蛋白質を、幅が５０ｍｍのスロットに負荷し、厚さが １．５ｍｍの１２％　５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。４°ＣでＬＭ　ＫＣｌ中 に短時間浸すことにより、主蛋白質を視覚化した。ＰＫ４０に相当するバンドを 切り出し、細かく刻み、１ｍＭＤＴＴを含む３ｍｌの水中でＭｉｎｉ−Ｔｕｒａ ｘを用いて均質化した。

懸濁液を透析バッグ中に密閉し、水、１ｍＭ　ＤＴＴと共に終夜震盪した。遠心 によりゲルフラグメントを除去し、上澄み液を凍結乾燥した。

キナーゼのペプチドマツピング 凍結乾燥物は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で見掛は上均質な４０ｋＤ蛋白質を２０μｇ含 む。２０μｇのキナーゼを５００μＬの還元緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩１０ ．５Ｍ　トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン　ｐＨ８，６）に溶解し た。ｐＨをアンモニアを用いて８，６に調節した。１５μＬのＩＭ　ジチオトレ イトールを加えた。窒素下の５２℃で２時間還元を行った。その後３０μＬのＩ Ｍ　ヨード酢酸ナトリウム溶液を加え、試料を室温の暗所にて３０分間インキュ ベートした。

過剰の試薬を５００ｍＬ（７）領　５　Ｍ　ウＬ’　７　／　０　、　１　Ｍ　 Ｎ　Ｈ４ＨＣＯ５ｐＨ８，６に対して終夜透析することにより除去した（カット オフ１ｋＤ）（４時間後に完全な緩衝液交換）。透析後、配列決定等級の（ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ　ｇｒａｄｅ）　トリプシン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ ｉｍ）を１＝２０の比率で加えた。蛋白質を３７℃で１８時間切断した。その後 溶液を約２５０μＬに濃縮した。反応は４℃に冷却することにより停止した。濃 縮後、ペプチドをＨＰＬＣで分離した。

ＨＰＬＣによるトリプシンペプチドの分離試料をＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　ＲＰ−１ ８ＨＰＬＣカラム（ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ　５ｅｒｖｉｃｅｓ 　２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ：５ｕ材料、３００オングストローム）を備えたＨＰ 　１０９０　ＨＰＬＣ−系に注入し、試料を０．１％　ＴＦＡ及び０−７０％ア セトニトリル勾配を用いて４０℃にて０．７ｍｌ／分で集めた。ＬＫＢ／Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｒａｃモデル２２１１からの画分収集器を用い、単一 ペプチドを領　５分画分として集めた。ペプチドの溶離を２１０．２８０及び２ ９５ｎｍで監視し、０．３５ｍ１画分を集めた。分離の後に単一画分を凍結乾燥 した。

クロマトグラフィー条件：流量　０．７ｍＬ／分、カラム温度　４００Ｃ１検出 　２１０ｎｍ、２８０ｎｍ及び２９５ｎｍ、溶媒Ａ　Ｏ９１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ　 ６０％アセトニトリル１０．１％　ＴＦＡ、勾配５分間０％Ｂ、１２０分間　７ ０％Ｂ、１２５分間１００％Ｂ、１３０分間Ｏ％Ｂ、１４０分間０％Ｂ０ 用いた化学品はすべて生化学又は分析用品質であり、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｄ−８０ ００Ｍｕｎ　ｉ　ｃｈ）　、Ｐｈａ　ｒａｃ　ｉ　ａ／ＬＫＢ　（Ｄ−７８００ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、Ｍｅｒｋ（Ｄ−６１００Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、５ｅｒｖ ａ（Ｄ−６９００Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ（配列決定用化学品、Ｄ−６１０８）、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ又はＰｉｅ ｒｃｅ　（ＰＴＨ−アミノ酸標準；Ｒｏｄｋｆｏｒｄ、ＩＬ　６１１０５　Ｕ、 Ｓ、Ａ、）、配列決定等級トリプシンの場合Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｄ−６８ ００Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購入した。

透析管はＲｅ１ｃｈｅｌｔ　Ｃｈｅｍｉｅｔｅｃｈｎｉｋ　（Ｄ−６９００Ｈｅ ｉｄｅｌｂｅｒｇ）からであった。

気相蛋白質配列決定装置モデル４７０ＡはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓから購入した。わずかに修正した標準的配列決定プログラムを用いた。配列は それぞれの装置マニュアルにて詳細に記載する。

フェニルチオヒダントインアミノ酸（ＰＴＨ−ａａ）の検出のために、Ｋｏｎｔ ｒｏｎ　（Ｄ−４０００Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ）データシステム　ＭＴ４５０を 備えたＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　ＰＨ１０８２からのＨＰＬＣ系及びＷ ａｔｅｒｓ　（Ｄ−５０９０１，ｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）からのオートサンプラー ＷＩＳＰ　７２０８を用いた。

ＰＴＨ−検出の場合に用いたＭｅｒｃｋからのＳｕｐｅｒｓｐｈｅｒＴＭ材料を 充填したＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ）は、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔ ｏｇｒａｐｈｉｅ　５ｅｒｖｉｃｅ　（Ｄ−５１５３Ｌａｎｇｅ　ｒｗｅｈｅ） から購入した。

ペプチド地図は、ダイオードアレー（ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ）検出器ＨＰ１０ ４０Ａを備えたＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　ＨＰ１０９０及び積分ソフト ウェア（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ）を有する化学ステーショ ン（ｃｈｅｍｓ　ｔａｔ　１ｏｎ）で実験した。ペプチドマツピングのためのＨ ＰＬＣ−カラムはＣＳ−Ｃｈｒ。

ｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ　５ｅｒｖｉｃｅから購入した（Ｎｕｃｌｅｉｏｓｉｌ 　ＲＰ−１９；２５０ｍｍｘ４．６ｍｍ；５μ材料；　３００オＡｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの気相蛋白質配列決定装ｆ１４７０Ａを用いてＮ− 末端配列分析を行った。ＰＴＨ−アミノ酸の変換のために２０％の三フッ化酢酸 （Ｔ　Ｆ　Ａ）の代わりにＩＭのメタノール性ＨＣＩを用いるわずかな修正を行 った標準的配列決定プログラムを用いた。５０−１００ピコモルのキナーゼペプ チドを配列決定に用いた。

ＰＴＨ−アミノ酸の同定のために、Ｍｅｒｃｋ　５ｕｐｅｒｓｐｈｅｒ　７Ｍカ ラムに基づ＜ＨＰＬＣ系を用いた（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ　Ｆ。

１９８５、“Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ　１ｓｏｃｒａｔｉｃ　５ｅｐａｒａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｈｙｄａｎｔｏｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　 ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３２６・３２ １−３２７）。系は無勾配で運転した。

麦作・流量　１．５ｍＬ／分、検出　２６９ｎｍ、炉温　６１°Ｃ１可動相　６ ８．５％の１０ｍＭ　酢酸ナトリウム、ｐＨ４，９／３１．５％のアセトニトリ ル、ＩＬ当たり５ｍＬのジクロロメタンを補足。

各配列決定装置の運転の前にすべてのＰＴＨ−アミノ酸の標準を２５ピコモル用 いてキャリブレーションを行った。

生成されたトリプシン消化物は配列番号：１−１５として示すレタ。

これらのトリプシン消化物の配列（配列番号：１−１５）を、ラット脳ｃＤＮＡ クローン（Ｂｏｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、１９９１）由来のＥＲＫＩ及びＥＲ Ｋ２蛋白質の既知のアミノ酸配列と比較した。配列番号：３−１５はＥＲＫ−キ ナーゼファミリーの蛋白質と非常に密接に一致しティた。ＥＲＫは細胞周期−付 属（ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ｃｄｃ２キナーゼとの相同 性が最も高く（約４０％）、従ってＰＫ４０は細胞周期−付属ＥＲＫキナーゼフ ァミリーに属すると考えることができる。配列番号＝６はヌクレオチド結合のた めのセリン／トレオニンキナーゼの共通部位、ｃｔｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ Ｔｙｒ　Ｇａｙを含む（Ｈａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）。

配列番号＝１及び２はＥＲＫ蛋白質のいずれとも相同でなかった。

実施例１２ キナーゼＰＫ４０及びＰＫ３６をコードするｃＤＮＡのクローニング法を記載す る。ＰＫ４０及びＰＫ３６のそれぞれに関するペプチド配列の最もユニークなコ ドンに対応する放射性標識合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを 製造する。

特に、配列番号：１及び２に対応するプローブがＰＫ４０をコードするｃＤＮＡ のクローニング法に最も適している。

ＰＫ４０のためのオリゴヌクレオチドプローブ（例えば配列番号＝１及び２）な らびにＰＫ３６のためのオリゴヌクレオチドプローブを用い、多様な供給源から 商業的に入手可能なヒト胎児脳細胞からのポリ（Ａ）”ＲＮＡから形成したラム ダｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラルをスクリーニングする。ハイブリッド形成条件 は、テトラメチルアンモニウムクロリド中の最後の洗浄を省略する以外はＣａｔ ｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）により記載された通りである。陽性のプラークか らのＤＮＡ挿入片をプラスミドベクターｐＢ１ｕｅ−ｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＭ１３ ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に直接サブ クローニングする。同一のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを用い たコロニーハイブリッド形成により陽性のプラスミドサブクローンを同定する。

プラスミドＤＮＡの小試料（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を陽性のコロニ ーから調製する。

オリゴヌクレオチド結合部位からすぐ上流のヌクレオチド配列を、配列決定プラ イマーとしてｓｚｐ末端標識オリゴヌクレオチドを用い、伸長反応で非放射性標 識オリゴヌクレオチドを用い、２本鎖配列決定により決定する（Ｃｈｅｎ　ａｎ ｄ　Ｓｅｅｂｕｒｇ、１９８５）ｏブライミング部位から上流のコドン類が既知 のアミノ酸配列と一致するサブクローンを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ）ＤＢＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント又は改変バクテリオフ ァージＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａ ｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を伸長反応に用い、ジデオキシ連鎖停止法に よりその全体を配列決定する。サブクローンをその末端から、１組の制限部位か らの両方向から配列決定する。コドン類が各キナーゼのアミノ酸配列と一致する クローンを得る。全長ｃＤＮＡ配列を、各キナーゼに関する重複部分クローンか ら組み立てる。

引用文献 Ｂｌａｎｃｈａｒｄ　ＢＪ、　Ｉｎｇｒａｍ　ＶＭ　（１９８９）　Ａｇｅ−ｒ ｅｌａｔｅｄｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　 ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ’ｎｕｍａｎｂｒａｉｎｓ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　ｏｆ　Ａ ｇｉｎｇ　１０：２５３−２５８゜Ｂｌａｓｓ　ＪＰ、　Ｂａｋｅｒ　ＡＣ，Ｌ ｉ　−ｗｅｎ　Ｌ　Ｅｌａｃｋ　ＲＳ　（１９９０）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ａ賃Ｕｎｃｏｕｐｌｅｒ　ｏ ｆＯｘｉｄａｔｉｖｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ；　Ａｒｃｈ、Ｎｅｕ ｒｏｌ、４７°８６４−８６８　。

Ｂｏｕｌｔｏｎ、Ｔ、Ｇ、、Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｊ、Ｓ、ａｎｄＣｏｂｂ、Ｍ、Ｈ ，（１９９１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎ（１ｐｔｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏ ｆ　ＥＲＸＩ、ａｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ＫＡＰ２　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、３０゜２７Ｂ−２８６゜ ｃａｔｅ　Ｒ，Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ　Ｒ，Ｈｅ５Ｓ１０ｎ　Ｃ，Ｔｉｚａｒｄ 　Ｒ，Ｆａｒｂｅｒ　Ｎ。

Ｃｈｅｕｎｇ　Ａ、　Ｎ１ｎｆａ　Ｅ、　Ｆｒｅｙ　Ａ、　Ｇａ５ｈ　Ｄ、　Ｃ ｈｏｗ　Ｅ、　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｒ。

Ｂｅｒｔｏｎｉｓ　Ｊ、Ｔｏｒｒｅｓ　Ｇ、　Ｗａｌｌｎｅｒ　Ｂ、Ｒａｍａｃ ｈａｎｃｌｒａｎ　Ｆ。

Ｒａｇｉｎ　Ｒ，Ｍａｎｇａｎａｒｏ　Ｔ、　ＭａｃＬａｕｇｈｌｉｎ　Ｄ、　 Ｄｏｎａｈｏｅ　Ｐ（１９８６）、Ｃｅ１ｌ　４５：６８５−６９８゜Ｃｈｅｎ 　Ｅ、　５ｅｅｂｕｒｑ　Ｐ　（１９８５）、　ＤＮＡ　４：１６５−１７０゜ Ｃｒｅｗｓ、Ｃ，Ｍ、、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｉ、Ｐ、Ａ、、ａｎｄ　Ｅｒ１ ｋｓｏｎ、只、Ｌ。

（１９９１）　Ｍｏｕｓｅ　ＥＲＫ−１ｑｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｓ　ａ　 ５ｅｒｉｎｅ／１ｈｒｅｏｎｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｔｈａｔ　 ｈａｓ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔ。

ｐｎｏｓ、ｐｈｏｒｙｌａｔｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８８°　８８４５−８８４９゜ Ｄｉｘｏｎ　トＩ、ＷｅｂＤ　ＥＤ　（１９７９）　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、 ｐｐ　６０−６２゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＧｏｅ ｄｅｒｔ　ト１．　５ｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ　ＭＧ、Ｊａｋｅｓ　Ｒ，Ｒｕｔｈ ｅｒｆｏｒｄ　Ｄ　。

Ｃｒｏｗｔｈ＝ｒ　ＲＡ　（１９８９）　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ 　ｏｆ　ｈｕｍａｎｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔ ｅｉｎ　ＴＡＵ：　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　’ａｎｄ１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　 ｉｎ　ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅｓ　ｏｆＡｌｚｈｅｉｍ ｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｎ　３＋５１９−５２６゜Ｇｏｅｄｅｒ ｔ　Ｍ、　５ｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ　ＭＧ、　Ｃａ１ｒｎｎｓ　ＮＪ、　Ｃｒｏ ｗｔｈｅｒ　ＲＡ（１９９２）ＴＡＵ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉ ｍｅｒ’ｓ　Ｐａ１ｒｅｄ　ＨｅｉｌｉｃａｌＦｉｌａｍｅｎｔｓ：　Ａｂｎｏ ｒｍａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｌ　Ｓｉｘ　Ｂｒａｉ ｎＩｓｏｆｏｒｍｓ、Ｎｅｕｒｏｎ　８：１５９−１６８゜Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉ ｑｂａｌ　Ｉ、　Ｉｑｂａｌ　Ｋ、　Ｔｕｎｇ　Ｙ−Ｃ，Ｑｕｉｎｌａｎ　Ｍ。

Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ　ＨＭ、Ｂｉｎｄｅｒ　ＬＩ　（１９８６）Ａｂｎｏｒｍ ａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍ１ｃｒｏｔｕｂｕｌｅ −ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｆｏｔｅｉｎ（ＴＡＵ）　１ｎ　Ａｌｚｈｅｌｍｅ ｒ　ＣｙｔＯ６ｋｅｌｅｔａｌ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃ ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：４９１３−４９１７Ｈａｇｅｓｔｅｄｔ　Ｔ、Ｌ ｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ　Ｂ、Ｗｉｌｌｅ　Ｈ，Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ　Ｅ−ト１゜ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗ　Ｅ　（１９８９）　Ｔａｕ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｅｃｏｍ ｅｓ　ｌｏｎｇ　ａｎｄ　５ｔｉｆｆｕｐｏｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏ ｎ：　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎｐａｒａｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａ ｔｉｏｎ、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　１０９：１６４３−１６５１゜Ｈａｎｋｓ 、Ｓ、に、、Ｑｕｉｎｎ＋　Ａ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ、Ｔ、、（１９８ Ｂ）Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ：　ｃｏｎ、５ｅｒｖ ｅｄ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：Ｈ ｉｍｍｌｅｒＡ、ＤｒｅｃｎｓｅｌＤ、ＫｉｒｓｃｎｎｅｒＫｖＪ、Ｍａｒｔｉ ｎＤＷ（１９Ｂ９）Ｔａｕ　ｃｏｎｓｉｓｔｓ　ｏｆ　ａ　Ｓｅｔ　Ｏｒ　ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ　Ｗ：Ｌｔｎ　ｒｅｐｅａｔｅｄＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｍｉｃｒ ｏｔｕｂｕｌｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｓ　ａｎｄ　ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｅｉｏｌ　９： １３８１−１３８８゜ＨｉｒｏｋａｗａＮ、ＧｌｉｃｋｓｍａｎｈＡ、Ｗｉｌｌ ａｒｄＫｌヨ（１９８４）Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｎｖｎａｌｉ ａｎ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｗｉｔｈｉｎ　 ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、Ｊ　Ｃｅ１１　Ｂｉｏ １９８：１５２３−１５３６゜ Ｈｏｆｆｍａｎ　ＰＮ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　ＤＷ、Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＪＷ、Ｌ ａｎｄｅｒ　ＰＷ。

Ｃｏｗａｎ　ＮＪ、Ｐｒ１ｃｅ　ＤＬ　（１９８７）　Ｎｅｕｔｏｆｉｌａｍｅ ｎｔ　ｑｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：　ａ　ｍａｊｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ ｎｔ　ｏｆ　ａｘｏｎａｌ　ｃａｌｉｂｅｒＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳＡ　８４：３４７２−７６゜Ｉｑｂａｌ　’に、　Ｇｒｕｎｄｋｅ− Ｉｑｂａｌ　Ｉ、　Ｓｍ１ｔｈ　ＡＪ、　Ｇｅｏｒｇｅ　Ｌ、　ＴｕｎｇＹ−Ｃ ，Ｚａｉｄｉ　Ｔ　（１９８９）　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ８６：５６４６−５６５０゜ Ｋａｒｌｓｓｏｎ　Ｊ−Ｅ、　Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ　ＬＥ、　Ｈａｇｌｉｄ　Ｋ Ｇ　（１９８７）　Ａ　ｒａｐｉ６ＨＰＬＣｍｅｔｈＯｄ　ｔｏ　５ｅｐａｒａ ｔｅ　ｔｈｅ　ｔｒｉｐｌｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆｎｅｕｒｏｆｉｌａｍ ｅｎｔ Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　４９：１３７５−１３１Ｂ。

Ｋａｕｆｍａｎｎ　Ｅ、Ｇｅ１ｓｌｅｒ　Ｎ、’　Ｗｅｂｅｒ　Ｋ　（１９８４ ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｏｖｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｓ　ｔｈｅ　 ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅｈｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１７０：８１−８４゜ＫｏｎＣ５ｏＪ、 ＨｏｎｄａＴ、ＭｏｒｉＨ，ＨａｍａｄａＹ、ＭｉｕｒａＲ，ＯｇａｗａｒａＭ 、Ｉｈａｒａ　Ｙ　（１９８Ｂ）　Ｔｈｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｔｈｉｒｄ　ｏ ｆ　ＴＡＵ　ｉｓｔｉｇｈｔｌｙ　ｂｏｕｎｄ　ｔｏ　ｐａｉｒｅｄ　ｈｅｌｉ ｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔｓ、Ｎｅｕｒｏｎｌ　：８２７−８３４　。

Ｋｏｓｉｋ　ＫＳ、Ｊｏａｃｈｉｍ　ＣＬ、５ｅｌｋｏｅ　Ｄ、７　（１９８６ ）Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＡＵ　 （ｔ＞　ｉｓ　ａ　ｍａｊｏｒ８３：４０４４−４０４８ Ｌａｅｍｍｌｉ　ｔＪＫ　（１９７０）　Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃ ｔｕｒａｌ　ＤｒＯｔｅｉｎＳｄｕｒｉｒ＋ｑ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｒｍｌｙ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４゜Ｎａｔｕｔ ｅ　２２７：６８０−６８５ＬｅｅｓＪＦ、ＳｈｎｅｉｄｍａｎＰＳ、５ｋｕｎ ｔｚＳＦ、ＣａｒｄｅｎＭＪ。

Ｌａｚｚａｒｉｎｉ　ＲＡ　（１９８Ｂ）　Ｔｈｅ　５ｔｔｕｃｔｕｔｅ　ａｎ ｄ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅｈｕｍａｎ　ｈｅａｖｙ　ｎｅｕｒ ｏｆｉｌａｍｅｎｔ　５ｕｂｕｎｉｔ　（ＮＦ−Ｈ）　ａｎｄ　ｔｈｅｇｅｎｅ 　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｉｔ、ｚト＋Ｂｏ　、ｙ　７＋１９４７−１９５５Ｌｅｔ ｅｒｒｉｅｒＪ−Ｆ、ＬｉｅｍＲＫＨ，５ｈｅｌａｎｓｋｉ）ｉＬ（１９８１） Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　 １５０，０００　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ 　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ　ｂｙ　ａ　ｃｙｃｌｉｃＡＫＰ−ｄｅｐｅｎ ｄｅｎｔ、　ｍ１ｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎｉｓｅ、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　９０ニア５５−７６０゜Ｌｉｎｄｗａ ｌｌ　Ｇ、　Ｃｏ１ｅ　ＲＤ　（１９８４）　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ 　ａｆｆｅｃｔｓｔｈｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＴＡｔＪ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔ ｏ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｉｅａｓｓｅｍｂｌｙ、　Ｊ　Ｂｉｏ ｌ　Ｃｈｅｍ　２５９：５３０１−５３０５Ｍａｔｕｓ　Ａ　（１９８Ｂ）　Ｎ ｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ −ｗｎｅｒｅ、ｗｈｅｎ　ａｎｄ　ｗｈｙ、ＴｌＮ５１１：２９１−２９２゜Ｍ ｉｌｓｔｅｉｎ、Ｋｏｈｌｅｒ　（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５ −４９７゜Ｍｉｎａｍｉ　Ｙ、　５ａｋａｉ　Ｈ（１９８３）　Ｎｅｔｗｏｒｋ 　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐ ｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｂｕｌｉｎ：　２００Ｋ　５ｕｂｕｎ ｉｔ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｔｒｉｐｌｅｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｂｕｌｉｎ、Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　９４：２ ０２３−２０３．３゜Ｍｉｎａｍｉ　Ｙ、５ａｋａｉ　Ｈ（１９８５）　Ｄｅｐ ｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　５ｕｐｐｒｅｓｓｅｓｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔ ｙ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｔｏ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｕｂｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１１３５＋２３９−２４ ２゜Ｍｙｅｒｓ　？％１．Ｌａｚｚａｒｉｎｉ　ＲＡ、Ｌｅｅ　ＶＭ−Ｙ、５ｃ ｈｌａｅｐｆｅｒ　ＷＷ。

Ｎｅ１ｓｏｎ　ＤＬ　（１９８７）Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｍ１ｄ−ｓｉｚｅ　ｎ ｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ田）ｕｎｉｔ：　ａ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｐｒｏｔ ｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　 ｉｔｓ　ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｆｉｌａｍｅｎ ｔｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ、ＥＭＥＯＪ　６°６１７−１６２６Ｎａｐｏｌｉｔ ａｎｏＥＷ、Ｃコ】ｉｎＳＳＭ、ＣｏｌｍａｎＤＲ，ＬｉｅｍＲＫＨ（１９８７ ）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｎ 　ｖｉｔｒｏ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｒａｔ　Ｎ’Ｆ−Ｍ、　ｔｈｅ　ｍ １ｄｄｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔＮｕｋｉｎａ　Ｎ、　Ｋｏｓｉ ｋ　ＫＳ、　５ｅｌｋｏｅ　ＤＪ　（１９８７）　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏ ｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ　ｐａｉｒｅｄ　ｈｅｌｉｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔｓ　 ｂｙ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　ｉｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈＴＡＵ　ｐｒ ｏｔｅｉｎ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４：３４１ ５−３４：Ｌ９゜０’Ｆａｒｒｅｌｌ　ＰＨ，（１９７５）　Ｈｉｇｈ　Ｒｅ５ ｏｌｕｔｉｏｎ　２　ＤｉｍｉｎｓｉｏｎａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｎｏｓｅｓ　ｏ ｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　５　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　Ｖｏｌ　２５０．　Ｐ゛４ ００７−２２゜ Ｐａｎｔ　ＨＣ，５ｈｅｃｋｅｔ　Ｇ、　Ｇａ１ｎｅｒ　Ｈ，Ｌａ５ｅｋ　ＲＪ 　（１９７Ｂ）Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｐｈｏｓ ｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｑｕｉｄｇｉａｎｔ　ａｘｏｎ、Ｊ　 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　７８：Ｒ２３−１２７゜Ｐｅｐｉｎｓｋユ、Ｒ，５ｉｎｃ ｌａｉｒ　Ｌ、Ｂｒｏｗｎｉｎｑ　Ｊ、’Ｍａｔｔａｌｉａｎｏ　Ｒ。

Ｓｍａｒｔ　Ｊ、　Ｃｈｏｗ　Ｅ、　Ｆａｌｂｅｌ　Ｔ、　Ｒｉｂｏｌｉｎｉ　 Ａ、　Ｇａｒｖｉｎ　Ｊ。

Ｗａｌｌｎｅｒ　Ｂ　（１９８６）、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６１＋４２３ ９−４２４６゜Ｐｌｅａｓｕｒｅ　ＳＪ、　５ｅｌｚｅｒ　ＫＥ、　Ｌｅｅ　Ｖ Ｍ−Ｙ　（１９８９）　Ｌａｍｐｒｅｙｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ　ｃｏｍ ｂｉｎｅ　ｉｎ　ｏｎｅ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｔｈｅ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆｅ ａｃｈ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＮＦ　ｔｒｉｐｌｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｕｔ 　ａｒｅ　ｈｉｇｈｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ゛ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｌａ ｒｇｅ　ａｘｏｎｓ、　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ９：６９８−７０９゜ Ｐｌｅａｓｕｒｅ　ＳＪ、　Ｌｅｅ　ＶＭ−Ｙ、　Ｎｅ１ｓｏｎ　ＤＬ　（１９ ９０）　５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏ’ｎ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ｍ１ｄｄｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＸＪｅｉｇｈｔ　ｈｕｍａｎｎ ｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　 ｎｏｎ−：ｑｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｓ、Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１０：２４２ Ｂ−２４３７Ｒａｓｏｏｌ　ＣＧ、　５ｅｌｋｏｅ　ＤＪ（１９８４）　Ａｌｚ ｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉ ｌａｍｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　１ｎＳＤＳ−ｉｎｓｏｌｕ ｂｌｅ　ｐａｉｒｅｃｌｈｅｌｉｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔｓ、　Ｂｒａｉｎ　 Ｒｅ５３２２：１９４−１９８゜ Ｒｕｎｑｅ、　Ｍｓ、　Ｅｌ−Ｍａｇｈｒａｂｉ　ＭＲ，Ｃ１ａｕｓ　ＴＨ，Ｐ ｉｌｋｉｓ　ＳＪ。

Ｗｉｌｌｘａｍｓ　ＲＣ（１９８１）　Ａ　ＭＡＰ−２−ｓｔｌｍｕｌａｔｅｄ 　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗ ｉｔｈ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０：１７５−：Ｌａｏ。

５ｈｅＣｋｅｔ　Ｇ、　Ｌａ５ｅｋ　ＲＪ　（１９Ｂ２）　Ｎｅｕｒｏｆｉｌａ ｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｐｎｏｓｐｆｉｏｒｙｌａｔｉｏｎ、：Ｉ　Ｂｉｏｌ 　Ｃｈｅｍ　２５１４７ＢＢ−４７９５゜５ｔｅｉｎｅｒ　Ｌ、Ｐａｒｄｏ　Ａ 、　Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ　Ｍ　（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８： ４０６Ｂ−４０７３゜ ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　ＮＨ，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　ＬＡ　（１９８３ｊ 　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ　ｐｈ ｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ａｎｄｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ｆｏ ｒｍｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ　ｉｎ　５ｉｔｕ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　八ｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔＪｓＡ　ＢＯ：６１２６−６１３０ ゜ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔ）ＳＡ　Ｂ２ ＋４２７４−４２７６ＴＯｋｕｔａｋｅ　Ｓ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ　ＳＢ、ｐａ ｃｈｔｅｒ　ＪＳ、Ｌｉｅｍ　ＲＸＨ（１９８３）Ａ　ｂａｔｃｈｗｉｓｅ　ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅ ｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３５：１０２−１０５゜ Ｔｏｋｕｔａｋｅ　Ｓ　（１９８４）　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒｉｐｌｅｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆ ｉｌａｍｅｎｔ　ｂｙ　ＤＥ−５２ｃｏｌｕｍｎｅｈｔｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 　ｄｅｐｅｎｄｓ　ｕｐｏｎ　ｕｔｅａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、Ａｎａ ｌＢｉｏｃｈｅｍ　１４０：２０３−２０７゜Ｔｏｒｕ−Ｄｅｌｂａｕｆｆｅ　 Ｄ、Ｐｉｅｒｒｅ　Ｍ　（１９８３）Ａ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　 ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｓ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　：Ｌ６２：２３０−２３４゜Ｕｅｄａ　Ｋ、Ｍａｓ ｌｉａｈ　Ｅ、５ａｉｔｏｈ　Ｔ、Ｂａｋａｌｉｓ　ＳＬ、５ｃｏｂｌｅ　Ｈ。

Ｋｏｓｉｋ　ＫＳ　（１９９０）　Ａｌｚ−５０ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ　ａ　ｐ ｎｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｅｐｉｔｏｐｅ　ｏｆ　ＴＡＵ　ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１０：３２９５−３３０４゜Ｗｉｂｌｅ　ＢＡ、Ｓｍ１ ｔｈ　ＫＥ、Ａｎｑｅｌｉｄｅｓ　ＫＪ　（１９８９）Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａ ｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ−ｓ ｐｅｃｉｆｉｃ　ｋｉｎａｓｅ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　Ｂ６：”１２０−７２４゜Ｗ ｉｓｃｈｉｋＣＭ、ＮｏｖａｋＭ、ＥｄｗａｒｄｓＰＣ，ＫｌｕｇＡ、Ｔｉｃｈ ｅｌａａｒＷ。

Ｃｒｏｗｔｈｅｒ　ＲＡ　（１９８Ｂ）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｃｈａｒａｃｔ ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｃｏｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｉｒｅｄ　ｈ ｅｌｉｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａ１ｚｈｅｉｍｅ＋＝ｄｉｓｅａｓｅ 　（１９８Ｂ）、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：４８ ８４−４８８８゜Ｗｏｎｇ　Ｊ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ　ＳＢ、Ｌｉｅｍ　ＲＫＨ （１９８４）　Ａｎ　１ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｖａｒｉａｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　 １５０，０００−Ｄａｌｔｏｎ　ｎｅｕｒｏｆｌｌａｍｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔ ｉｄｅ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２５９：１０８６７−１０８７４゜Ｗｏｏ ｄ、ＪＧ、Ｍｉｒｒａ　５５．　Ｐｏ１ｌｏｃｋ　ＮＪ、Ｂｉｎｄｅｒ　ＬＩ　 （１９８６）Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅｓ　ｏｆ　Ａｌｚ ｈｅｉｍｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｓｈａｒｅａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍ ｉｎａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｘｏｎａｌｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＡＵ　（ｔ）、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡ Ｃａｄ、ＳＣｉ、ＵＳＡ　８３：４０４０−４０４３ｉ電１表 配列番号：１ 配列の長さ＝１４ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｒ。

１５１゜ 配列番号＝２ 配列の長さ・１２ 配列の型　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類・ペプチド 配列 配列番号　３ 配列の長さ　１４ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 ｘａａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｇｌｕ１５１゜ 配列番号：４ 配列の長さ、１４ 配列の型二アミノ酸 トポロジー、直鎖状 配列の種類・ペプチド 配列 Ｘａａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｖｉｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｇｌｕｌ　１０ 配列番号　５ 配列の長さ、１５ 配列の型二アミノ酸 トポロン−・直鎖状 配列の種類・ペプチド 配列 １１ｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈ３ｓ　 Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒｌ　５　１０　１５ 配列番号二６ 配列の長さ、１５ 配列の型・アミノ酸 トポロン−０直鎖状 配列の種類　ペプチド 配列 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｒ　Ｌ＝ｕ　Ｓ＝ｒ　Ｔｙｒ　１１＝　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ配列番号＝７ 配列の長さ＝１４ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｉｃｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　 Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒｌ　５　１０ 配列番号＝８ 配列の長さ＝８ 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直鎮状 配列の種類：ペプチド 配列 Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｘａａｌ　５ 配列番号−９ 配列の長さ：９ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類　ペプチド 配列 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｘａａ配 列番号＝１０ 配列の長さ＝８ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｌｙｓ配列番号： １１ 配列の長さ二８ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎮状 配列の種類　ペプチド 配列 １１ｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｘａａ配列番号： １２ 配列の長さ　７ 配列の型　アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類、ペプチド 配列 Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｘａａ配列番号：１３ 配列の長さニア 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 ＡＳｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ配列番号・１４ 配列の長さ−６ 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列の種類　ペプチド 配列 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕｌ　５ 配列番号＝１５ 配列の長さ　６ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｘａａ　５ｅｒフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９／９９　９ ３５９−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２Ｊ／／　Ａ　６１　Ｋ　３７／６４　８３１４−４ＣＩ

Claims (56)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で脱リン酸化ＮＦ−Ｍの見掛けのＭｒを天然のＮＦ−Ｍ のＭｒに向かって変位させるのに十分な程度まで脱リン酸化ＮＦ−Ｍをリン酸化 することができる、単離され、基本的に純粋な非骨格−付属キナーゼを含む組成 物。
2. ２．キナーゼがＴＡＵの両ＫＳＰ部位をリン酸化することができ、ＴＡＵ上のＴ ＡＵエピトープを排除することができる、請求の範囲１に記載の組成物。
3. ３．キナーゼが完全に脱リン酸化されたＮＦ−トリプレット又は精製脱リン酸化 ＮＦ−Ｍ上のホスホーエピトープをリン酸化し、再構築することができる、請求 の範囲１に記載の組成物。
4. ４．キナーゼが過剰のＡＴＰにより阻害されることができる、請求の範囲１に記 載の組成物。
5. ５．キナーゼのＫｍがＡＴＰに関して約９３である、請求の範囲１に記載の組成 物。
6. ６．キナーゼが完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍを、完全に変位させるのに十分 な程度までリン酸化することができ、キナーゼが完全に脱リン酸化されたＮＦ− Ｈを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｈの見掛けのＭｒが 天然のＮＦ−ＨのＭｒに向かって部分的に変位するのに十分な程度までリン酸化 することができる、請求の範囲１に記載の組成物。
7. ７．キナーゼが完全に脱リン酸化されたＴＡＵを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で完全に 脱リン酸化されたＴＡＵの見掛けのＭｒが天然のＴＡＵのＭｒに向かって完全に 変位するのに十分な程度までリン酸化することができる、請求の範囲１に記載の 組成物。
8. ８．キナーゼがＴＡＵを、ＰＨＦから抽出されたヒトＴＡＵ蛋白質に特徴的なＳ ＤＳ−ＰＡＧＥパターンを生ずるのに十分な程度までリン酸化することができる 、請求の範囲１に記載の組成物。
9. ９．キナーゼが配列番号：１及び２に特徴づけられる配列を有する、請求の範囲 １に記載の組成物。
10. １０．キナーゼの見掛けの分子量が４０ｋＤである、請求の範囲１−９のいずれ か１つに記載の組成物。
11. １１．キナーゼが完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で完 全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍの見掛けのＭｒが天然のＮＦ−ＭのＭｒに向かっ て少なくとも部分的に変位するのに十分な程度までリン酸することができる、請 求の範囲１に記載の組成物。
12. １２．キナーゼのＫｍがＡＴＰに関して約５０である、請求の範囲１１に記載の 組成物。
13. １３．キナーゼの見掛けのＭｒが３６ｋＤである、請求の範囲１及び１１−１３ に記載の組成物。
14. １４．キナーゼを含むかどうかが未知であり、リン酸化の特定の状態にある蛋白 質に特徴的で試験抗体と反応性のエピトープを実質的に含まない哺乳類由来の生 物材料の画分を準備し、哺乳類キナーゼが存在する場合に神経蛋白質をリン酸化 させる条件下でエピトープを含まない蛋白質と画分を接触させ、試験抗体を用い てエピトープの存在に関して調べる段階を含む、哺乳類キナーゼの検出法。
15. １５．キナーゼを含むかどうかが未知であり、リン酸化の特定の状態にある蛋白 質に特徴的で試験抗体と反応性のエピトープを実質的に含まない哺乳類由来の生 物材料の画分を準備し、哺乳類キナーゼが存在する場合に蛋白質をリン酸化させ る条件下でエピトープを含む蛋白質と画分を接触させ、試験抗体を用いてエピト ープの存在に関して観べる段階を含む、哺乳類キナーゼの検出法。
16. １６．画分を神経蛋白質と接触させることをさらに特徴とする、請求の範囲１５ に記載の方法。
17. １７．画分を完全に脱リン酸化された神経蛋白質と接触させることをさらに特徴 とする、請求の範囲１４又は１５に記載の方法。
18. １８．画分を完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｈと接触させることをさらに特徴と する、請求の範囲１４又は１５に記載の方法。
19. １９．画分を完全に脱リン酸化されたＴＡＵと接触させることをさらに特徴とす る、請求の範囲１４又は１５に記載の方法。
20. ２０．試験抗体がＳＭＩ−３１、ＳＭＩ−３３及びＳＭＩ−３４から成る群より 選ばれる試験抗体である、請求の範囲１４−１５のいずれか１つに記載の方法。
21. ２１．蛋白質のリン酸化の特定の状態に特徴的なエピトープと反応性の抗体、及 び抗体と結合しないリン酸化の状態の蛋白質を含む免疫検定法。
22. ２２．蛋白質が神経蛋白質である、請求の範囲２１に記載の免疫検定法。
23. ２３．蛋白質か天然の蛋白質に対して脱リン酸化されている、請求の範囲２１に 記載の免疫検定法。
24. ２４．蛋白質がＴＡＵである、請求の範囲２１に記載の免疫検定法。
25. ２５．蛋白質がＴＡＵである、請求の範囲２３に記載の免疫検定法。
26. ２６．脱リン酸化ＮＦを用いる免疫検定法。
27. ２７．検定が完全に脱リン酸化されたＮＦ−トリプレットを用いる、請求の範囲 ２６に記載の免疫検定法。
28. ２８．検定が完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｍを用いる、請求の範囲２６に記載 の免疫検定法。
29. ２９．検定が完全に脱リン酸化されたＮＦ−Ｈを用いる、請求の範囲２６に記載 の免疫検定法。
30. ３０．ＰＫ４０に選択的に特異的なモノクローナル抗体。
31. ３１．ＰＫ４０のキナーゼ活性に結合し、阻害することができるモノクローナル 抗体。
32. ３２．請求の範囲３０に記載のモノクローナル抗体を用いたＰＫ４０検出のため の免疫検定法。
33. ３３．ＰＫ４０に選択的に特異的なポリクローナル抗体。
34. ３４．抗体がＰＫ４０のキナーゼ活性を阻害することができる請求の範囲３３に 記載のポリクローナル抗体。
35. ３５．請求の範囲３３に記載のポリクローナル抗体を用いたＰＫ４０検出のため の免疫検定法。
36. ３６．ＰＫ３６に選択的に特異的なモノクローナル抗体。
37. ３７．ＰＫ３６のキナーゼ活性に結合し、阻害することができるモノクローナル 抗体。
38. ３８．請求の範囲３６に記載のモノクローナル抗体を用いたＰＫ３６検出のため の免疫検定法。
39. ３９．ＰＫ３６に選択的に特異的なポリクローナル抗体。
40. ４０．抗体がＰＫ３６のキナーゼ活性を阻害することができる請求の範囲３９に 記載のポリクローナル抗体。
41. ４１．請求の範囲３９に記載のポリクローナル抗体を用いたＰＫ３６検出のため の免疫検定法。
42. ４２．細胞中にＰＫ４０又はＰＫ３６の阻害剤を、ＰＫ４０又はＰＫ３６のリン 酸化活性を阻害するのに十分な量で導入することを含む、細胞の神経蛋白質リン 酸化活性を阻害する方法。
43. ４３．ＰＫ４０又はＰＫ３６の基質のフラグメントを細胞中に導入する、請求の 範囲４２に記載の方法。
44. ４４．ＰＫ４０に結合できる抗体を細胞中に導入する、請求の範囲４２に記載の 方法。
45. ４５．ＰＫ３６に結合できる抗体を細胞中に導入する、請求の範囲４２に記載の 方法。
46. ４６．ＡＴＰ又はその類似体を細胞中に導入する、請求の範囲４２に記載の方法 。
47. ４７．ニューロフィラメントタングルの形成を妨げるのに十分な量で阻害剤を投 与する、請求の範囲４２に記載の方法。
48. ４８．ＰＫ４０又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチド を含むベクター。
49. ４９．オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求の範囲４８に記載のベクター 。
50. ５０．オリゴヌクレオチドがヒトＰＫ４０又はそのユニークフラグメントに相当 する、請求の範囲４８に記載のベクター。
51. ５１．ＰＫ３６又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチド を含むベクター。
52. ５２．オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求の範囲５１に記載のベクター 。
53. ５３．オリゴヌクレオチドがヒトＰＫ３６又はそのユニークフラグメントに相当 する、請求の範囲５１に記載のベクター。
54. ５４．ＰＫ４０又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチド を用いて形質転換又はトランスフェクションされた細胞系。
55. ５５．ＰＫ３６又はそのユニークフラグメントをコードするオリゴヌクレオチド を用いて形質転換又はトランスフェクションされた細胞系。
56. ５６．請求の範囲５４又は５５のいずれか１つの細胞系により生産されたキナー ゼ。