CZ131899A3 - Polypeptidy obsahující domény proteinu GAX, které se účastní represe transkripce, odpovídající nukleové kyseliny a jejich použití - Google Patents
Polypeptidy obsahující domény proteinu GAX, které se účastní represe transkripce, odpovídající nukleové kyseliny a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ131899A3 CZ131899A3 CZ991318A CZ131899A CZ131899A3 CZ 131899 A3 CZ131899 A3 CZ 131899A3 CZ 991318 A CZ991318 A CZ 991318A CZ 131899 A CZ131899 A CZ 131899A CZ 131899 A3 CZ131899 A3 CZ 131899A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gax
- protein
- polypeptide
- dna
- activity
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 33
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims description 24
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims description 24
- 101000955037 Homo sapiens Homeobox protein MOX-2 Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 42
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 65
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 23
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 claims description 6
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000057870 human MEOX2 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 claims 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 claims 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 33
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 77
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 44
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 43
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 21
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 21
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 21
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 17
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 15
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 15
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 15
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010081657 Ki antigen Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 101100520094 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) pcm2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030479 Germinal center-associated signaling and motility protein Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 2
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- -1 dTTp Chemical compound 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 2
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 1-nitroso-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CN(N=O)C2=C1 WBQJTPDOGLYTBE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004726 Connectin Human genes 0.000 description 1
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000270722 Crocodylidae Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000030914 Fatty Acid-Binding Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001046426 Homo sapiens cGMP-dependent protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010051925 Intestinal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700041567 MDR Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101000940870 Mus musculus Endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101001128656 Mus musculus Endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000882586 Mus musculus Estrogen receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- ZAZHPBXBNGWCDV-UHFFFAOYSA-N N2-Maltulosylarginine Chemical compound OC1C(O)C(CNC(CCCNC(=N)N)C(O)=O)(O)OCC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 ZAZHPBXBNGWCDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101001000154 Schistosoma mansoni Phosphoglycerate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 101710132316 Transactivation protein Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 102100022422 cGMP-dependent protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000037011 constitutive activity Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N desomorphine Chemical compound C1C2=CC=C(O)C3=C2[C@]24CCN(C)[C@H]1[C@@H]2CCC[C@@H]4O3 LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 108091022862 fatty acid binding Proteins 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 1
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical class [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009703 regulation of cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012760 regulation of cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000002226 simultaneous effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108010029853 transcription factor nuclear factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
- Y10S977/797—Lipid particle
- Y10S977/798—Lipid particle having internalized material
- Y10S977/799—Containing biological material
- Y10S977/80—Nucleic acid, e.g. DNA or RNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Pólypeptidy obsahující domény proteinu GAX, které se účastní represe transkripce, odpovídající nukleové kyseliny a jejich použití κΐ
Oblast techniky
| Předkládaný vynález se týká oblasti týká nových terapeutických molekul a léčení kardiovaskulárních nemocíJ J | léčiv. jej ich | Konkrétně se použití pro |
| Dosavadní stav techniky | ||
| Post-angioplasticá restenóza | je | lokalizovaná |
| hyperproliferativní porucha, která | se | vyvíjí po |
nechirurgickém zásahu na úrovni aterosklerotického plátu. Léčení aterosklerotických lézí angioplastickou metodou velmi často (až u 50% případů v některých studiích)' vede k restenóze jakožto následku mechanického poškození stěny artérie.
Proliferace buněk hladkého svalstva (SMC) v cévní stěně je klíčovou událostí ve vývoji aterosklerózy, restenózy v důsledku angioplastiky a také selhání koronárního bypassu.
SMC jsou normálně v cévní stěně ' v klidovém stavu, ale i jestliže dojde k lézi, která zničí cévní endotel, dostanou se svalové buňky do kontaktu s růstovými faktory v krvi.- Na rozdíl od srdečních, svalových buněk a buněk kosterního svalstva se SMC mohou pod vlivem různých růstových faktorů dediferenciovat a tak znovu iniciovat proliferatvní cyklus. tT ýt feno typové * módi f i kace. SMC j s ou -.důsledkem «výr a zných » zxěnw.··-».·»*·-* na úrovni exprese mnoha genů. Tak např^ ^exprese časných genů, účastnících se buněčné proliferace jako jsou c-fos nebo
1« ··· · · · * t ' * » · » · ο « «·· 9 · · · · · · ·
I ···· ♦ » a aaaa a »ae aaa * v a · · · ·' · aaa a » · *<
c-myc, je výrazně zvýšena, zatímco exprese jiných strukturních genů, jako je např. alfa-aktin specifický pro hladké svalstvo a .také některé isoformy myosinu, podléhá negativní regulaci.
Ačkoliv je zcela jasně známo, že terminální diferenciace buněk kosterního svalstva je regulována tzv. myogenními transkripčrtími faktory jáko je Myo-D, je -dosud známo jen velmi má-lo faktorů účastnících se reverzibilní diferenciace SMC. Studie z poslední doby odhalily existenci transkripčních faktorů, které mají homeobox v různých tkáních t
kardiovaskulárního systémů.1 Takové faktory rozpoznají právě prostřednictvím homeoboxu specifické’' sekvence v' promotorovém. useku jejích cílového . genu·.-a podílejí .se tak na 'regulaci buněčné diferenciace, proliferace a migrace. -· Jeden' z- těchto faktorů . „GAX (Growth-Arrest-Sp.ecifuč_.,h:^Hpmeóbpx.ljeexprimován v různých kardiovaskulárních ' tkáních ' včetně SMC cévní' stěny.' .Geh GAX byl původně identifikován 'v čDNA knihovně krysí aorty.,· Kóduje p-rote.in''<Xobsa-h&j ící-'/··. '101aminokyselin. Sekvence byla popsána a cDNA ’by 1,S'Klonována , (Gorski et al., Mol. Cell- Biol. 1993, 6,- 3722-3733} . .Také lidský ' gen byl identifikován, klonován a·, .sekvencován (David F. Le Page et al., Genomics 1994, 24, 535-540)1 Kóduje protein ze 302 aminokyselin. Gen .GAX má některé vlastnosti ‘ - i < ' ' podobné.genům gasa Gadd, neboť se zdá, že také řídí přechod fází Go/Gi .v buněčném cyklu. Hladina GAX mRNA je v krysích ‘VSMC snížena- lOx po. dvouhodinové'' expozici · PĎGF (Gorski et al., Mol. Cell Biol. 1993-, 6, 3722-3733)'. Takže exprese genu. GAX jě potlačena, v průběhu .mitogennl odpovědi VSMC. Další ·~ .^vlastností^gehu^GAX, j e spec i f i čr.o s t „ j eho„ exp r e s e ..^U* dospělých, ' krys je gen GAX v podstatě exprimován v kardiovaskulárním systému (aorta, srdce). Žádná GAX mRNA nebyla detekována »· »·· ·· * * | * · ·«· · · ♦ · • · · ·' t · · · *
4»e » i «. s ? ®9β # 9 í í « » · * * · · * * * »·« · ♦· · · · · · leží ' mezi Je- zajímavé, že. 'dosud se účastní řízení buněčné pomocí northernového přenosu- v-játrech,' mozku, žaludku a kosterním svalstvu. Avšak gen GAX -. patří do rodiny homeotických genů. Tyto gény kódují transkripční faktory, které obsahují konsensní' (souhlasné). sekvence. . (čili homeodomény), které rozpoznávají specifické úseky DNA (čili homeoboxy) ( viz přehled' Gehring et al., Cell '78, 21-223,
1994). Homeodoména krysího proteinu ' GAX aminokyselinami...· 185.,· a ' -245. identifikované- homeotické geny 'diferencicae/růstu v embryogenezi, což podporuje. terapeutický potenciál genu GAX (přehled viz Lawrence a Morata, Cell 78: 181-189,1994/ Krumlauf, Cell 78: 191-201, 1994)·.' '
Jednou -z vlastností GAX je také to·,, že je .pod vlivem negativní’' regulace,, jakmile SMC proli.ferují, a' to buď ;-''ůh .yiĚbog.Iv Odpověď'’.: na.....růstové’ faktor' nebo’ in vivo jako následek -lézí endotelu cévní stěny. Tato represe je reverzibilní,-.. proteze když SMC· jsou in vitro v klidovém stavu ydíky nedosťát-R-u/ '.sérá,' .-exprese GAX pokračuje'., Poslední výzkum v naší laboratoři' -. ukúzal, , že nadměrná exprese (overexprešsion) GAX v SMC navozená adenovirovým vektorem -blokuje jejich proliferaci (FR95/04234 . (ST 95022)).
Post-angio.plastická restenóza po mechanickém poškození představuje nejčastější ,(50% případů v některých studiích) faktor poškození. Přičemž proliferace SMC je klíčovým prvkem / v tomto jevu, a jelikož je . známa role GAX. v jeho regulaci,,, jeví se GAX. jako vhodný ' terapeutický gen pro preventivní ošetření cévní stěny po angioplastice- (FR95/04234 (ST95022)).
Avšak ' mechanismus působení- . GAX je dosud málo , dok uměn to ván .ιφ Je-wtřebaiií-ješběrt-identif ikovatw cílové** sekvence**·
DNA homeoboxu GAX. Také dosud nebyly provedeny studie funkce různých domén GAX. ' Identifikace funkčních partnerů- GAX £ « ·* · <Ί ♦'»·♦······ ··· »··♦···· • ·· e*.í ’ί.-ϊ-ί.ΪΛ*.··.? «ť:?w**r « *-»·*' * · «· · i · · · · * *
.... . . - 4 představuje’další důležitý aspekt, který umožní identifikovat molekulovou kaskádu, na které závisí GAX a jejíž je součás.tí. '
Důležitost předkládaného vynálezu 'spočívá' v tom, že poskytuje informace právě k'těmto bodům.
V průběhu našeho výzkumů byly použity různé analytické metody pro identifikaci molekul, které reagují s GAX, aby 'bylo možné identifikovat domény GAX nezbytné pro tyto interakce, a aby bylo možné zkoumat význam těchto domén pro.funkci GAX. Pro tento účel byl .použit dvojitýhybridní systém, aby -bylo možné charakterizovat proteiny z knihovny z-lidských plic intrágující s GAX. . '
Tento postup umožnil identifikovat * 1 různé ' molekuly, z nichž jedna, a sice ántigen Ki, je zvláště výhodná. -Ántigen Ki je protein velikosti přibližně 32 kDa.. Byl 'poprvé
--identifikován jako·· jaderný autoantigen ·rozpoznávaný sérem,’ které bylo získáno oď pacientů trpících lupus' erytheraatosus.· (Nikaido et al·., 1989, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79, -209-214} . Nedávné výzkumy, ukázaly, že Ki je nadměrně exprimován .v proliferu-jících buňkách .nebo v buňkách transformovaných . onkogenem (Nikaido . et al., 1989, Exp. CEll Res . 182, 284289) . ' ' Pokusy s koimunopreeipitací '(T.akeushi et al., abstract 1995 Juntendo University,' Tokyo, Japan). ukázaly, že Ki se vyskytuje, ve formě- komplexu s PCNA, markérem prolifeřace (Almendrál et al.,. 1987, Proč.· Nati. Acad. S.ci. USA' 84, 15751579). ’ ' ' . . i
Funkce GAX byla také .zkoumána v pokusech s přechodnou
I 0 transfekcí savčích buněk, pomocí genu GAX fúzovaného i^s* heterologní*„DNA)e,vaz,ebnoui.doménou^a»*réportérovým-»sýstémem,wt.
což umožnilo získat informace o transkripční aktivitě GAX po deleci různých úseků molekuly. Ukázali jsme tak, že, GAX « v · • $ · ···· • · · * β í »9«9 • · ♦ • r a *· »· · · · « ·' · as9 a a · « · • e· působí v podstatě jako represor transkripce. Tato represorová aktivita je. spojena zvláště s prvními 32 aminokyselinami GAX. Dále jsme zjistili, že represorová 'doména je lokalizována v úseku GAX (1 až 222), který v kvasinkách vyžaduje interakci s-Ki. Možnosti využití represorového charakteru GAX a jeho interakce s Ki budou podrobněji popsány dále.
Podstata vynálezu ......
í . .
První aspekt předkládaného' vynálezu se týká fragmentů proteinu GAX, které mají biologické vlastnosti.·
Další aspekt vynálezu se týká domén GAX, které se., podílejí ha biologické'·' aktivitě -GAX. To mohou být- zvláště domény účastnící· se interakce GAX s'jinými molekulami nebo domény zodpovědné za biologickou -akt i Vitu,. - ·-,','
Vynález še také týká· chimérických molekul obsahujících·.
funkční doménu GAX (represi) exprese inhibují interakci
Týká se-také použití GAX pro potlačení, genů, a. také - použití, y sloučenin/.;'· které
GAX s určitými ’ buněčnými’ piartnéry' ;pr,ó * i modulaci aktivity GAX. Vynález se’- také y. týká způsobu f 1 · screeningu (vyhledávání). a/nebo identifikace buněčných’ i - - } i partnerů GAX. Jak' již·· bylo dříve uvedeno, gen GAX má zvláště .výhodné . '' , vlastnosti pro použití v genové terapii hyperproliferativních poruch; zvláště r.estenózy nebo jiných .poruch spojených s proliferací SMG.'· V patentové přihlášce FR95/04234 -.(ST95022) ' bylo ukázáno, .že přenos genu GAX in yivo umožňuje významně snížit p-roliferaci SMC a tím inhibovat redukci luminálního «p r úměr u. ^V* při h 1 á š c.ew FR 9 5 ý 12 8 ;71 (Ξ.Τ 9 5 0 5 7.) by 1 o „ t a k é u k ázáno, že .gen GAX, exprimovaný v nádo-rových buňkách, umožňuje blokovat procesy buněčné transformace. Tyto různé údaje 'ů * 4» 4 »1 44 • 444 «»«4 ♦ 4 4 4 -> «44« »444 44 9 9444 4 49« 444
4 4 4 4 4 €4 4 4 4 ·· ukazují na značný potenciál genu GAX pro'· terapeutické využití.
Přihláška předkládaného vynálezu popisuje identifikaci funkčních domén GAX, konstrukci derivátů GAX vykazujících biologickou aktivitu, .identifikaci partnerů proteinu GAX a vývoj metod, které umožňují testovat jiné partnery a identifikovat sloučeniny schopné interakce s aktivitou těchto.partnerů. Přesněji řečeno, původce ukázal, ze protein GAX ’ projevuje aktivitu jako represor transkripce. Také' ukázal, že aktivita je nesena určitými úseky proteinu GAX, zvláštěpak N-koncovým úsekem. Kromě- toho- výsledky uvedené v příkladech ukazují', že funkční domény GAX se také účastní interakce GAX s buněčným proteinem Ki. Je známo . z literatury, že Ki reaguje s PČNA (Takeushi et al.,' abstract ' 1995· Juntendo ' .Universitýp·4'· Tok-yo,.· Japan)r‘-a že 'PCNA· je nezbytný kofaktor .pro
DNA- polymerázu pro replikaci DNA (Fukuda eť al., .1995, J.
. 3iol. -Jihem·... 270.;· .22527-22534} .' V příkladech bylo také.
ukáz'án.d, 'Jžě-'-GAX réáguje'· s-PCNA, takže je možné· předpokládat, že’ GAX . by/.’také mohl' být součástí replikačního komplexu v buňce. ·,··.··
Prvním předmětem předkládaného vynálezu je .pol.ypepťid, který je buďto celý nebo částečně, fragmentem proteinu GAX, který má transkripční represořovou aktivitu a/nebo, pozitivně či negativně ovlivňuje replikaci DNA. ' .
Výhodnější polypeptid’ podle ’ předkládaného , vynálezu obsahujé přinejmenším.aminokyselinové zbytky ! až 32 lids.kého proteinu GAX. . '
Podle jiného provedení předkládaného vynálezu polypeptid rtob sáhuj e al espoň „aminokyselinové^, zbytky.* 10 4«, a ž»*· 2-30^ lidského, proteinu GAX. . ’ • -» ·» ft ·· *« »i · · k · · · · • « « · · · ♦ k · · · « <·09 « « 9 9··β A 999 999 · 4 · · · ·.
Ι<· « «* · · ♦ « ·
Jako specifi-cké 'příklady polypeptidů podle, předkládaného vynálezů je možné uvést polypeptidy -obsahuj,ící fragmenty zahrnující úseky aminokyselin 1 až 32/ 33 až 302 a 1' až 104 lidského proteinu GAX. Příklady uvedené v .další 'částí ukazují, že takové polypeptidy jsou 'schopny inhibovat-'. transkripci genů a proto uchovávají transkripční represorové vlastnosti GAX.
výhodněji obsahuje uvedený polypeptid navíc, kromě' fragmentu proteinu GAX podle předkládaného vynálezu,, fragment jiného původu. Fragmentem jiného původu se rozumí., polypeptidový fragment,. , který nepochází z proteinu GAX. Může' ' to tedy být jak umělý,' syntetický fragment, tak i . fragment? prpt.e.inu .„apo,d:..„_.;T.ěň.t o_ ..fragment. „j.iného .._půvo du.... mů ž.é—mít-^rů zné.—' funkce.
Může. to být např; markér, který umožňuje -detekovat·' polypeptid' a případně ho sledovat ίη'νύνο. Takovým markérem může být např. epitop rozpoznávaný monoklonální protilátkou.i V odborné literatuře byly popsány mnohé značkovací. sekvence/ .t_zv..___t.argm.s.e,k.v.e.n..c.e.,.^k.t.e.r.é’ s.e__ob.v_y.kl.e použú-vaj-í---Lze—náp-ř— zmínit sekvenci tag-myč. '
Tento fragment může být také fragmentem, který má tu' vlastnost, že stabilizuje polypeptid. . Díky tomu pak celý protein nebo jeho' část má delší plazmatický poločas.: ,
Nakonec to. může.být i^cílový prvek, který'umožňuje, aby <
polypeptid' dosáhl 'rychleji a/nebo s-větší specifičností požadovaného buněčného kompartmentu. Výhodně.· tc. může být .
1 . 1 Ϊ jaderná -lokalizační sekvence (NLS), polypeptid vykazující . svou. aktivitu v-buněčném 'jádře: V odborné' literatuře byly * popsány různé signály NLS, např. signál T antigenu viru 'SV40, signál p53 apod. .
» * 9 • · » · • ι· ♦ · 0 « ···β « 0 • · « ··· · c· ·· ·· • · · * * • · · ' ♦
99» »»» • · # a- μ ·*
Fragment j inéhd ·původu může navíc udělovat polypeptidu· další biologickou ' funkci nebo může podporovat aktivitu represorové domény. Jako zvláště výhodný příklad je možné zmínit proteinovou . doménu schopnou vázat se na DNA specifickým způsobem. Takový, typ .chimérických molekul umožňuje vázat ' DNA ve specifických úsecích a ‘inhibovat transkripci genů· lokalizovaných v těchto úsecích. Jako příklad je možné uvést· DNA vazebnou'' .'doménu, kvasinkového proteinu GAL4. Takový konstrukt, je popsán v příkladech. Tyto konstrukty lze použít pro regulaci, exprese genů v kvasinkách nebo genů, které jsou řízeny expresními signály obsahujícími vazebné místo pro protein GAL 4. Jiné proteinové domény -pro ______vazbu DNA_ ~jsou např. Lex... A, .. DNA. „ .vazebná.,„doména..._.j!.ade.rn.ého.„.
receptoru jako je .např. estrocfe.nový-receptor ' nebo jakýkoliv jiný- člen této rodiny' -apod. -Může7’.· to' také'úbyť peptid, -který umožňuje na jedné straně sekreci celého nebo části GAX. a. na .druhé straně jeho'· cílení ' ..na . membránový j .récepto.r, který, umožňuje jeho' internalizaci a tím'*' zvyšuje .schopnost ' difúze a aktivitu domén GAX, což, se/ nazývá, _e.f.e.k.t.em__t.yp.u_ nezúčastněného'diváka('bystander effectJ . V tomto smyslu je možné použít .zvláště, celý transferin .nebo jeho · část nebofragmenty .molekul .extracelulární matrix,- které rozpoznávají integriny na povrchu SMC.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou zvláště důležité z hledis-.ka . terapeutického využití a také z hlediska, .aplikovaného výzkumu. , .' ;
• Terapeutická aktivita polypeptidu podle .vynálezu je' spojena s jejich schopností potlačovat transkripci .nebo ^cvl i vňo vať~r ěp li kac r DNÁ7~aHalog icky*j alí^*^ ťe i^GAÍ?'“]'i* proto kapacitu regulovat expresi jiných proteinů.
* · « · « »··· • ·* » > · b · · * v · · · · I » * * • 4 <
«· «· ♦ * v ♦ · ·« «· «
** ·- 9 -
Vzhledem k tomu se předkládaný vynález týká také použiti proteinu GAX nebo jeho fragmentu podle vynálezu pro represi' genové transkripce a/nebo pozitivní neb negativní ovlivnění t replikace DNA.
Také vzhledem k analogii 's chováním proteinu GAX, mohou tyto fragmenty výhodně nahradit GAX ve funkci- represořu ' , 1 * I 'transkripceAvšak za předpokladu, že z proteinu'GAX obsahuji cel.ou. .nebo část domény,·' 'která se- podílí na represi transkripce,'. j e možné se domnívat, že budou méně citlivé -na různé změny, kterým je protein GAX vystaven. .· Tyto
-· polypeptidy,samy o sobě' nebo jejích deriváty, mohou projevovat, ve zvýšené míře transkrip-ční represní vlastnosti, ve 'srovnání s přirozeným proteinem GAX.
, . ' ' , Také- lze předpokládat jejich použití pro identifikaci· y'-.k .. -•-7<:’ribvý'chj':-p’a:rtn:eřů-r'prot'einůGAX.· Vz-hiedem' k-tomu je předmětem předkládaného vynálezu ' také způsob . screeningu a/nebo .-^identifikace· polypeptídů interagujících s„ proteinem GAX nebo:
..V-ty sjdoménami'.'GAX,'·'-spočívájící . v tom, že se používá polypeptid ' . podle vynálezu.' Výhodněji se polypeptid vybere z fragmentů obsahujících aminokyseliny 1 až 32 a, 33 až. 302 z proteinu GAX. ' ·. . . ,
Původce neočekávaně ukázal, že doména proteinu GAX může specificky reagovat s jiným buněčným proteinem, a sice proteinem Ki. Jak .již bylo vysvětleno dříve, Ki je autoantigen, který se- vyskytuje v průběhu auťo.imunitních onemocnění jako je lupus erythematosus. Byl popsán, jako jaderná .molekula, jejíž -exprese, se zvyšuje, - v průběhu proliferace. a také při transformaci fibroblastů o.nkogenem. ^^^^...Ukázal i. jsme ž e^.u^ kvas ine k-^j e ~ N- koncová «·» čá st—GAX · nezbytná pro interakci s Ki. Rekombinantní protein Ki • «' ·-· « ·» ·ί •« · «··* «·*.« « · · · » « · · « ·»»· · v · ···· · ··· ··· v « · · · • ν· · ·· , « · · ·· rozpoznává specificky GAX přenesený na nitrocelulózovou membránu z ďenaturačního'polyakrylamidového gelu.
Předkládaný vynález, se také' týká polypeptid, který je fragmentem proteinu GAX-.schopným reagovat s proteinem Ki., Ί Výhodněji je 'to fragment zahrnující aminokyseliny -1 až í
nebo 104 až 223 z proteinu GAX.
Velmi'překvapivě ukázal původce také, že doména proteinu
GAX může specificky interagovat s markérem proliferace PCNA (Proiiferating Cell Nuclear, Antigen) . Kromě toho bylo již popsáno v odborné literatuře, že Ki se vyskytuje, vě formě komplexu s PCNA. Ki proto zřejmě reaguje jak s GAX -tak s PCNA, a to tak, že vytváří přinejmenším bipartitní komplex _______s jedním z „těchtcg prpteinůc__á_výhodně.„třip.ar.t.i.t.iní „.komplex...___
Vytváření těchto komplexů hraje hlavní roli v. průběhu. - ; buněčného cyklu (aktivaci nebo-'inhibici) . - Takže • předkládaný · vynález se táké týká ' polypeptidu, který je fragmentem proteinu GAX schopným, interakce s Ki a/nebo ' PCNA,' - -/ ..:
a vytvářejícího alespoň bipartitní nebo alespoň tripartitní '·’ //' komplexy s těmito proteiny._ _„_
Další předmět předkládaného vynálezu se- týká 'jakékoliv nukleové kyseliny kódující polypeptid,.jak je definován výše.
• {
Může to být sekvence přirozeného nebo umělého původu, zvláště pak genomová DNA,' cDNA, mRNA, hybridní . sekvence nebo. ' .· syntetické Či sem-i syntetické sekvence. Nukleová kyselina může ' být· z člověka·., zvířete, rostliny, bakterie, viru atd. Lze- ji získat jakoukoliv technikou, známou odborníkovi,- zvláště screeningen knihoven, .chemickou' syntézou, případněkombinací f
různých metod, včetně chemické nebo enzymatické modifikace·
... s e k'y e nce*“ z i s kahě*scr e eh i n g em k*n i KovenT* Ť y t c·1' nu 1-:1 e o ve* kyTel'i n y mohou' být vloženy do vektorů, .jako jsou např. ' plazmidové vektory.· ’ ’ ♦ · ·· • ·· · ♦ · ·.
předkládaného « a ·«* · *
- ii - ;
Výhodně je nukleová kyselina podle vynálezu cDNA.
Nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou využít pro přípravu sond nebo antisense molekul {s orientací proti směru normální 'transkripce) , které pak metodou hybridizace umožňují detekovat přítomnost nebo expresi -nukleových kyselin • kódujících polypeptidy obsahující represorové domény podle vynálezu, nebo inhibovat expresi takových polýpeptidů. Co se týká sond, ty výhodně obsahují více než 10 baží, výhodněji 10 až 300 baží; ' .
Nukleové .kyseliny 'podle vynálezu se mohou užít pro expresi a/nebo produkci polypeptidu in vitro, in vivo nebo ex vívo pro účely genové nebo buněčné terapie.
Proto se předkládaný vynález týká y-t-aké , expresní kazety, která obsahuje r.ukleoyóu '.kvseiiňu popsanou výše, která je řízen promotorem, který dovoluje její expresi. V rámci vynálezu je možné-.užit' různě'promotory. 'j soů to. sekvence,· které- umožňují' exprés-i-- nukleové '.kyseliny v savčí . buňce. · .
Promotor je' výhodně vybrán, z promotorů, které jsou funkční v lidských buňkách. Výhodněji je to takový promotor-,' který umožňuje ' expresi sekvence nukleové kyseliny v hyperproliferativní buňce (rakovinná buňka, restenóza apod.j. Mohou .se tedy použít různé promotory. Může to být jakýkoliv promotor, nebo z něho odvozená sekvence stimulující nebo reprimující (potlačující)·.' transkripci genu specificky nebo nespecificky, indukované nebo neindukované, silně nebo slabě. Lzé uvést zvláště promotorové sekvence eukaryotických nebo^virovýchw· genů -Tak**· nap řť*** to ”*mo ho u“ být** promotorové’ sekvence pocházející z genomu. cílových ' buněk. Mezi eukaryotickými promotory mohou být zmíněny zvláště všeobecně « « ** 4« fr · » • « * « v « ····»« * • · · «·« · ·♦ '· »· # • « · # · • * * » · · • · * * « «·· ··» • « · * »* ·· rozšířené promotory {jako např.. promotor genů HPRT, PGK, alfa-aktinu, tubůlinu, DHFR apod.), promotory intermediárních' filament (promotor GFAP,' desminu, fimentinu, promotor genů neurofilament a keratinu apod.), promotory terapeutických *genů (např. promotory genů MDR,. CFTR, faktoru VIII a Apol apod.), tkáňově specifické promotory (promotor genu pyruvátkinázy-, -villinu, střevního proteinu vázajícího' mastné kyseliny, nebo alfa-aktinu hladkého, svalstva apod.), buněčně specifické promotory dělících se buněk, jako jsou' např. rakovinné buňky, nebo promotory odpovídající na podnět (receptor steroidních' hormonů, -recéptor kyseliny retinové, glukokortikoidový receptor apod.) a nebo· tzv. inducibilní. promotory.. také to- -moho-u být -promotorové sekvence odvozené
-----z-tvi-řového-'-genomu,· -jako jsoun“ápř.' promb tory genů ΈΪΑ.' ”a MLP ‘ adeňovirů,:yčasňý promotor . CMV ' nebo promotor LTR RSV apod. navíc- mohou být promotor úseky modifikovány připojením ,, aktivačních. nebo..-regulačních sekvencí dovolujících tkáňově spécifick&ú nebo-převládající expresi.
Předkládaný vynález- poskytuje . terapeutické agens, které —umd-ž-ňu-j-e——t-í-m-7-ž-e—má s'ch'opn'o's't potlačovat! transkripci, zasahovat při různých buněčných dysfunkcích. Nukleové kyseliny nebo expresní kazety podle 'vynálezu se mohou injikovat jako takové přímo do místa, které má být ošetřeno, .nebo .se mohou' inkubovat přímo s buňkami, které mají být· ošetřeny nebo zničeny.. Bylo. vskutku publikováno, ž,e nahá .(neobálená) DNA . může . proniknout do buňky bez zvláštního vektoru. Avšak podle předkládaného' vynálezu je výhodné pro podávání použit vektor, který- umožní (I) zvýšit účinnost .průniku do buňky, (II) zlepšit zacílení a (lili zvýšit extray.
a- intracelulární stabilitu.
·· »♦ ι ·. · ♦ · * • » ♦ « ♦·· ♦ * ♦!*·»· ·*· • » »·
I
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je nukleová kyselina nebo kazeta vložena do expresního vektoru. Použitý vektor může být chemického původu (liposomy, nanočástice, pěptidové komplexy, lipidové nebo kationtové polymery apod.), virového původu .(retroviry, adenovirý, herpetické víry, AAV, virus vakcinie apod.) nebo.p.lazmidového původu. ... . -..
Použití virových vektorů je . založeno ňe přirozených transfekčních vlastnostech virů. Je možné - takto využít retroviry, adenovirý, herpetické viry a viry asociované s adenovirý. Takové vektory se ukázaly z hlediska transfekce. V tomto· směru je předkládaného 'vynálezu defektní rekombinántn-í retrovirus; iuj.eho.ž—..'genom- obsahu-je -nu-kieovoď 'kyselinu' 'podlé 'vynálezu? dalším· 'předmětem·· -vynalezu je defektní rekombinantní adenovirus, jehož genom,obsahuje nukleovou kyselinu popsanou výše.
Vektor podle předkládaného vynálezu může být také ag-ens jiné než virus, schopné podpořit přenos a. expresi nukleové _k.ys,elin-y—v— euka-rys-fe-i-ek-é—buňce-—-Chemické—rréb’0 KočKěmfckeT’
Ί syntetické nebo' přirozené vektory představují výhodnou alternativu . k přirozeným virům, zejména vzhledem >k jejich pohodlnému použití·, bezpečnosti a také vzhledem k tomu, že nemají žádný horní limit co se týká velikosti přenášené DNA. tyto syntetické vektory mají dvě· hlavní funkce, a sice j zhutnit . DNA, . která je přenášena, a. podpořit .její přichycení k buňce, á také podpořit její průnik do buňky přes plasmatickou membránu,, a pokud je ' to třeba, také přes zvláště účinné výhodným podle dvojitou jadernou membránu.
povaha nukleových polykátiontové náboje.
Aby se překonal polyaniontová' kyselin mají nevirové vektory • >*·· « · φ»« · ' ·· * • · • · · φ' Φ « Φ 1 • · · φ · · · •
• * ·.
φ · φ • »· · «« φ
- 14 - - i
Nukleové kyseliny nebo vektory' podle předkládaného vynálezu mohou · být formulovány 1 pro podávání topickou, perorální,' parenterální·, jntranazální, · intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární'nebo transdermální cestou apod. Výhodně se nukleová kyselina nebo vektor podle1 . .
vynálezu· použijí v injikovátelné formě./ Mohou se proto smíchat .s jakýmkoliv,farmaceuticky přijatelným vehikulem-pro ' injekční' přípravek, zejména -pro 'přímou inj.ekci na., úrovni . ošetřovaného místa. To mohou být zejména izotonické.-sterilní , roztoky nebo suché, zejména lyofilizované, přípravky, které po přidání, v.· závislosti na případu,' sterilizované vody nebo fyziologického roztoku, umožňují přípravu roztoků pro injekce,. Dávky, nukleové kyseliny pou-žité--pro· injekci, · a· -také -•počet·—podá-v-án-í-r--mů-ž-e.—být—up ra ve no- - ~v—zú visTo 'Sťi^ŤnaJ' různých'“'' parametrech, a'- obzvláště' · v /Zúvisípst-i^· na.'-cgehu/' vektoru, způsobu, podáváni, příslušné patologie, ' nebo- -alternativně požadované délky léčby . , .. ‘;.··. ···
Vynález se také ' týká·' jakéhokoliv ./farmaceutického l1' přípravku obsahujícího'' alespoň jednu . nukleovou- kyselinu. -definovanou—výše-—--:—: ---“— :—
Vynález se také týká jakéhokoliv .- farmaceutického přípravku obsahujícího alespoň jeden.vektor definovaný;výše.
Vzhledem k jejich antiproliferativním ’ vlastnostem jsou. farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu zvláště' vhodné léčeni hyperproliferativních poruch, jako jsou zvláště rakoviny a' reštenóza; Předkládaný vynález tak poskytuje zvláště. účinný způsob , destrukce . buněk., zvláště hyperproliferativních’.· buněk. Je proto využitelný pro • . , . t l destrukci nádorových buněk nebo buněk hladkého svalstva cévní
.....|l, I l|i 1111,IIII >11i***>*,(*Wmi*,í,^***‘*^mí 11 «II «WWMMWW»** stěny '{restenózy) .. Je zvláště vhodný pro' léčení rakoviny. Jako· příklady lze uvést střevní adenokarcicnomy, rakoviňu ·« « « ' ·« ·· * · · * · · • t « v ·« · • ·♦·* » »·♦ ·»· * · · . « * «« »·
1.5 štítné žlázy, plicní karcinomy, myeloidní leukémie, kolorekťální karcionomy, rakovinu prsu, plicní rakovinu, rakovinu žaludku, rakovinu jícnu, ' B-lymfomy, rakovinu vaječníků, rakovinu močového měchýře, glioblastomery, hepatokarcinom, rakovinu kostí , kožní rakoviny, rakovinu pankreatu, ledviny nebo prostaty; rakovinu hrtanu, rakoviny hlavy ‘ a krku, anogenitální rakoviny s HPV pozitivitou, EBV-pozitivní rakoviny nosohltanu'·apod.
Kromě toho se předkládaný vynález týká jakéhokoliv použití sloučenin inhibujícich aktivitu proteinu. Ki a/nebo PCNA pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva.
Předkládaný vynález se také týká použití sloučenin podle ' . vynálezu pro vytváření bi- a. . tripartitních . komplexů ____s „P.roteinenem....Ki. .a/nebo.....PCNA -p-ro - pozi-t-ivní -nebo· -negativní—' . ovlivnění, průběhu'’buněčného .cyklů.' .·
Předkládaný' vynález' je .dále podrobněji popsán pomocí příkladů.a obrázků, .které mají vynález ilustrovat a v žádném případě ho nijak- neomezujd.yv.Ů'-'<·.
Popis obrázků . .
Obr. 1.: Northernová analýza exprese proteinu Ki na mRNA extrahovaných z různých tkání. , . '
Obr.' 2.: Jaderná lokalizace KiHA v transfekovaných buňkách detekovaná imunoflůorescenční metodou.
Obr. 3.; Interakce in vitro mezi proteiny GAX aKi detekovaná ;| „ r .·........... jr.r|[·,.,..,. .... - ................ .. ................r.i.;iT-·-;-'..-Γ.'-·πΓ -.......‘ ~~ - a) obarvením pomocí Coomassie modři.
b) Far-westernovou analýzou. ' • * ·· > ' ·· ·· . > · · · · e a « «1 # a · a a · · < · « · /' a, ···« * a · »· · ««» aaa * a a a a a a aai a aa a «· a·
Obr. 4. :
A} Schéma konstrukce reportérového genu exprimujíčího bakteriální , chloramfenikolacetyltransferázu ' (CAT) pod kontrolou umělého promotoru.
B) Test enzymové aktivity CAT (CAT-assay) v.buněčných ·' '.extraktech po transfekci expesnimi vektory obsahujícími ER, ' ' 'GALVPlo a ER-GAL VP16. ' '
Obr. 5.: Porovnání konstruktů různých delečních mutantů GAX s celým proteinem GAX (aminokyseliny 1 až 302)
Obr. 6.:' Test enzymové aktivity CAT (CAT-assayj různých -''C-C ý)čhiměř”GAL-GÁX 1 . A) bez-aktivátoru ER . ,
B) s aktivátorem ER.
;','ÁObr.. 7.: Interakce'mezi GST-GAX a PCNA.
Příklady provedení vynálezu
Materiál a metody '
Zde uvádíme přehled materiálů ' .a metod použitých v následujících příkladech
A) Materiál '
1) Použitý kmen kvasinek:
, Jako nás troj „,.pro_te shovění, fú zní, kniho vnyw z „pl icn i tkáně« dvojitým hybridním' systémem byl ' použit kmen -YCM79
5. cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801,.
• » ·· · ··' ·· • < · · ·' · · · ,· ♦ a ť.· · · » ♦ · · . ·
1^···· · · · ···· · ·· ·*· • · · · · · · ««· · *· * ·· ·· trpl-901, leu2-3 112, canl, gal4-54, gal80-538, metl6:URA3Pgall IOIACz, HIS3::GAL7BLE) . '
Kmen se.pěstoval v následujících kultivačních médiích:
YPD kompletní médium: - kvasinkový extrakt (10g/l) (Difco)
- Bactopeptone (20g/l) (Difco)
- glukóza (20 g/1)' (Merck)'
Médium bylo zpevněno přidáním 20 g/1 agaru (Difco).
YNB minimální médium: - kvasinkový dusíkatý základ (bez amino-kyšelín) (6,7 g/1) (Difco)
- glukóza (20 g/1) (Merck)
Médium může -být zpevněno přidáním 20 g/1 agaru (Difco). .
Aby se na tomto ' médiu umožnil ýrůst auxotrofn.ích' kvasinek,·' 'je nezbytné k‘němu; přidat aminokyseliny- nebo·.' dusíkatou’ bázi7 kterou”'potřebují,“ v množství 50 m'g/ml .· '”· ......
2) Použité kmeny bakterií : ’
Jako· prostředek pro amplifikaci a izolaci použitých rekombinantních plazmidů byl použit-kmen TG1 E. coli' genotypu'' supE, hsdDS, thi; O(lac-proAB) , F' [tra D36 pro A+B+ laclq. . lačŽĎMTS]- “ : : ~ 1—;-'——;-—
Pro produkci rekombinantních proteinů se ' použily bakterie. E. coli ,BL-21s získané od firmy Pharmacia. Mají genotyp -F’ ompT hsdSD (rt-Kb'} 9&1 dcm (DE3) . '
BL-21' jé vhodný ' kmen pro tvorbu rekombinantních proteinů, protože nemá žádnou próteázu a jeho- membrána je fragilní a .ize ji snadno porušit pouhou sonikací.' E. coli BL-21· má systém pro , represi RNA polymerázy T7. Tato represe., může být zrušena IPTG, což umožňuje kontrolu genů umístěných downstream (po směru čtení·), od vazebného místa- pro RNA
I*’·· ....... .- '. OK. ............................... 11111^1*1 ................ ( I ..........................ι·ιιιιιιιιμ·>·ι<.ιι* .· ...........................
polymerázu T7. Bakterie'jsou pěstovány ve 2 ml LB média (NaCl 5 g/1, Trypton .10 g/1, kvasinkový extrakt· 5 g/1) ve třepačce .
• 9 * ♦ ·· · »· »· · ♦ « · « · · «·· · · · · · · '· s** ·-, ·»· · » · ♦····· ··· « 4 · · · · ««· · ·· · , *· , **
- 18 - · - · . ' při 37 °C přes noc. 1 ml této předběžné kultury se pěstuje opět v 50 ml' 2χ·- YT média (NaCl .5 g/1, Trypton 16 g/1, kvasinkový extrakt 10 g/1) ve 37 °C, dokud bakterie nedosáhnou optické denzity. (OD) 0, 4' při 600 nm (exponenciální růstová fáze) . Bakteriální kultura se zchladí na ledu a odstředí se ve 3300 rpm po dobu 20· minut. - ,.
Kompetentní .. bakterie ; ' coli ' .pro produkci rekombinantních proteinů jsou připraveny kalei-umchloridovou metodou. To se’ učiní tak, že bakterie se dají do 5. ml roztoku 0,1 M CaCl2 (1/10 tkáňové kultury), opět se stočí vé 33,00 rpm po dobu 10 minut. Pak se opět; dají do 1 ml roztoku 0,1 M CaClí obsahujícího· 17/5 % glycerol. Bakterie se rozdělí na poměrné části''a' uskladní při -8,0’-°C. ‘ '3) Použité plazmidy: ' .· - ' ’ ' ' ' .· ' '
Byly použity vektory' řad pGBT -a pAS (Clontech) , kyvadlové- (shuttle) plazmidy, , které/-maří kvasinkový a bakteriální počátek replikace, ·-.'‘který“Λ>~}ίιη *·umožňuje replikovat se v těchto dvou organisméch vyso-kým počtem·· kopií. Tyto plazmidy obsaEuj_í - mhohbcěŤňě Jclonovací místo- (polylinker) situované po směru čtení’ od sekvence' kódující DNA vazebnou doménu GAL4 a proti směru čtení, od’ terminátoru, pro vytvoření fúzního' proteinu·. Obsahují také gen TRPÍ ze 5/ cerevísiae, který umožňuje , geneticky kompléméntovat kvasinky genotypu trpí tak, aby bylo možné je selektovat na minimálním -médiu neobsahujícím tryptofan. Tyto vektory nesou gen pro ampicilinovou rezistenci, který umožňuje selektovatbakterie, který ho mají, na médiu obsahujícím ampicilin.
Vektory., řady, pGAD (Clontech) jsou vektory, které umožňují v kvasinkách expresi fúzních proteinů mezi třansaktivační doménou GAL4 a požadovaným proteinem nebo • 00 0 00 00 0 0 0 0 0 »- 0 0 '0 · · 0 0 · 0r · '0 ·
000· « 0 0 0000 · 000 ···
0 0 0 · * • ·· ·' ·* ··
- 19 proteinů kódovaných cDNA' získanou z plicní knihovny, vloženou na úrovni místa EcoRI-Xhol,
| Vektory | řady | .pET29 (Novagen) | jsou vektory, | které |
| umožňují expresi | rekombinantních | proteinů v E. | coli | |
| fúzovaných se | značkou.S (S tag). | |||
| Vektory | řady | pGEX (Pharmacia) | .jsou. vektory, | které |
| umožňují expresi | rekombinantních | proteinů v- E-. | coli |
fúzovaných s .glutathion-S-transferázou (GST) ..
.-Vektory 'řady Bluescript (Stratágene) a také vektory řady pI.C (J. Lawrence Marsh et al., Gene, 32, ' 481-485, 1984) a pMTL (Steve P'. Chambers et al., Gene, 68, 139-149, 1998)
- jsou vektory, .které umožňují provádět' klonování.
-plazmid pGEX-2T-hGAX je plazmid pou-žitý pro transformaci '“'bakterii-' El Včoií' *ΒΙ-2Ϊ1 Tento ' plazmid‘ byl“'získán Z plazmidu......- -......
pGEX?.2T' a-: byl-; -poskytnut '-Dr. K. ·-Walshem. z St. Elizabeth's Medical ’ Center v Bostonu·. Základní plazmid pGEX-2T (Pharmacia) umožňuje .produkovat protein GAX fúzovaný s gluťathlon-Srtrá-hsěráz'oú (GST) , protein, který má 'silno.u afinitu-pro’glutathion? Fúze GŠT-GAX usnadňuje purifi-kaci GAX afiňí'fbu k , agarózovým pěrlTckánr s: rn'a'vá'z'a'ným— g!u'tathřonem~ —1——
Kromě toho existuje štěpné, místo pro trombin,'. které pak umožňuje štěpit chiméru mezi GST a GAX. Pod kontrolu hybridního promotoru tac a operátoru lac je vložena cDNA hGAX. Represor láci připojením.k operátoru lac zabraňuje RNA polymeráze v posunu: Tato represe je zrušena analogem, laktózy, íšopropyl-p-D-thiogalaktosidem (IPTG), který se . spojuje s láci. Komplex lacI-IPTG se. nemůže již dále vázat . k operátoru lac, tudíž není déle .překážka pro RNA polymerázu.
|W> .............. W I '1,1 ................................................... li mil ||Ι|<||<|Μ*000·Φ0ΙΊ||^ i 0 • ft · · · · ··· ··« · ♦ ♦ · • * · · ♦ · · · * · · ,·^ ·««· » · · ·«·«' · ··· ··· ··'«· · ·»» «' ·· * ·· ·· . . -. .- . . - . - 20 - ,
4) Protein Ki ,
Příprava a purifikace
Klonovali jsme gen pro protein Ki fúzovaný k epitopu myc v plazmidu pET-29 (Novagen) z plazmidu pGAD obsaženého ve kvasinkách. Plazmid' pET-29- .produkuje protein· fúzovaný k epitopu nazvaném značka S, který , umožňuje purifikaci KI áfin-itou k agarózovým kuličkám s navázaným proteinem S... <Chiméra SmycKI je pod kontrolou promotoru T7- a operátoru lac. BL-21s jsou transformovány plazmídem pET-29-mycKI,. Jako v případě proteinu GST-GAX jsou bakterie pěstovány dokud se. nezíská- OD 0,7 při 600 nm,'Pak je indukována exprese SmycKI 0,1 mM IPTG a RNA polymerázou T7 tvořenou' BL-21s. Bakterie jsou -Sonikovány.· Supernatant - se pak purifiku.je následující 'metodou’;------Purif ikace—SmycKI-. se --provádí- a-fini tni---metodou-
- s,'agarózovými perličkami ' s navázaným proteinem Ξ . Metoda je •stejná- jako pro. GST-GAX kromě toho, že pryskyřice se' promyje -v roztoku obsahujícím 20 mM Tris pH 7,5, 0,15 M.NaCl á 0,1% Triton- X-100. Eluce a dialýza jsou- stejné jako pro GST-GAX.
Bj~ Me t ody— ---—— -—o-—-—---——:—:-<Metody obvykle používané 'v molekulární biologii jsou odborníkům dobře známy a jsou hojně popsány .v literatuře (Maniatis'T. et al·., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual,. Cold Spring Harbor Laboratory,' Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel,. F.M. et al., (ed.) , „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York,' 1987).,
1) Systém dvojitého hybridu .
Tento systém je metoda klonování pomocí .interakcí in vivo v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae, .jejíž princip je založen na modulární struktuře kvasinkového transkripčního• · · · Φ ·* · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 *9 -. 9999 9 9 · ·»·» · • ·' · · 9
999 · «« 4·· ·· · 9 · • · · • « »« ··
- 21 faktoru GAL4 (7). Transkripční' aktivátor GAL4- má dvě nezávislé- domény, které „máji odlišné funkce. DNA vazebná.
'doména (GALDB pro vazbu GAL· DNA), umožňuje GAL4 navázat se- na specifickou, sekvenci DNA na úrovni promotorové oblasti genu.
GAL4 še poté sám nalézá stéricky blízko k transkripčnímu . .
mechanismu a pomocí své transaktivační 'domény (GALTA) zvyšuje rychlost, ve- které je iniciována transkripce,, na 'sousedním genu, pravděpodobně interakcemi s RNA polymerázou nebo _ přidruženými proteiny. Princip , dvoj itého .hybridního systému spočívá v' odděleném fúzování GALDB a GALTA. ke dvěma odlišným' . .
proteinům X a.Y, které tvoři, pokud navzájem reagují, aktivní transkripční komplex.
—2-}- -Tes tování- - kvasinek - -technikou.-- PGR: - (pol-ymerázcvá - řetě zová- -reakce) ' . . · ΆY-_. .ý—.
Testování se provádělo přímo na kvasinkách'Každá ’ . ' ' kvasinková kolonie se dala do. roztoku 10 μΐ vody obsahující.
* — · i-* z- -l
0,08% Tween.20. Tween je. neiontový de.tergent, který -umo-žřnijé.-j . — ·<ζΑ· zvýšit lyži .kvasinek během prvního stupně zahřátí na 95-.-°C.’ '.' —r’V^n-árs-l-edujl-cí-ch—stadi-í-ch—působí.—T-ween-—2-9—j-a-k-o—-př-í-p-ra-ve-k-y™—-+ . který chrání Taq DNA polýmerazu. Kvasinková suspenze se' doplní na konečný objem 20 μ1 obsahující následující konečné koncentrace nebo množství:' 10 pm primer 1, 1Ó pm primer 2, jednotka Taq DNA polymerázy, 75 mM Tris pH 9, 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 2,5 mM MgCl2 a 125 μΜ každého ze '4 deoxyribonukleotidů .·(dATP, dTTp, dGTP a dCTP) . Na- konci.'PCR se .část směsi analyzuje', na· agarózovém gelu. Takto je tedy možné zjistit, pro daný pár primerů a pro každý -kvasinkový kmen, zda je v kvasinkách obsažena již identifikovaná ( sekvence 'DNA.
«· ·· * · « <
'9 · 9 I
- 22 3) Příprava plazmidových DNA . Velká množství ‘ DNA se připraví .za použití rychlé preparační soupravy Promega.
' Malá množství DNA jsou připravena následujícím způsobem: bakterie obsahující plazmid se pěstují alespoň 4 hodiny ve 2 ml LB média v třepačce s mícháním. . · Poté se,stočí 2 minuty při 14 000 rpm' v mikrozkumavkách ' (Eppendorf), a pak je· pelet resuspendován ve 100 μΐ roztoku I- .(50. mM -glukóza, 25 -mM pufr Tris-HCl' pH 8,. 10 mM EDTA pH.8)’, lyžován s 200 μΐ roztoku II (0,2 mM NaOH, 1% SDS). Lyzpovací roztok se poté neutralizuje se 150 μΐ roztoku III (3M octan sodný, 11,5% (v'/v) ledová kyselina octová) . Po třepání zkumavek,· ' dokud se nezíská chomáčkovi;tý přecipitát, ·' se přidá směsi
150 μΐ fěhoíZčhl’dró‘form j{'50%' fenoíá ' 50_%' chloroform,' saturováno vodou) a vše se 30 s. -třepey '. Vodná ''fáze - obsahuj ící; DNA . se získá zpět stočením 2 minuty ve 14 000 rpm. Pak se precipituje . DNA přidáním 0,5 objemu- isopropanolu a pak se· stočí 5 minut ve 14 CCO tpm a-usuší. n'á' vzdůchu a''nakonec se rozpustí ve 20 μΐ TE RNAse (roztok ÍO-mM Trís-HOl a 1 mM EDTA s 50’ pg/ml RNAse) .
4) Syntéza' a enzymová amplifikace. DNA metodou PCR (polymerázová.řetězová reakce) '
Reakce PCR' .se provádějí v konečném objemu 100 μΐ v.přítomnosti templátové DNA, dNTP (0,2 mM). Pufru PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,5, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,01% želatina), 0,5 pg každého oligonukleotidu a ’ 2,5 IU AmpliTaq DNA polymeráty (Perkin Elmer) s formamidem. (5%) nebo bez něho.
..Směs____se_.převrství__ 2 kapkami _ parafinového oleje, aby se omezilo vypařování vzorku. Použitý přístroj byl „Crocodile II od firmy Appligene.· Pro templát jsme použili denatůrační • * «· ·· 44 *44 4 · * 4 4**4
4 * 4 4·· «444 *44« · · 4 ·*4· * *44 444 • · 4 4 4 4 4 »44 4 44 · ·'· ·4
- 23 teplotu .90 °C, teplotu pro hybridizaci oligonuklěotidů k templátu o 5 až 10 stupňů nižší než byla separační teplota oligonuklěotidů a teplotu pro extenzi enzymem 72 °C.
Fragmenty získané PCR,· které sloužily ' pro klonování, jsou systematicky opětně sekvencovány po klonování, aby se zkontrolovaly možné mutace objevující' se během ámplifikace.
Oligodeoxynukleótidy jsou chemicky' syntetizovány fo-sforamiditovou metodou za použití. β-kyanoetylóvých ochranných ' skupin -(Sinha, 1984}. Po· syntéze jsou ochranné skupiny odstraněny ošetřením s hydroxidem amonným a dvě precipitace' butanolem umožňují purifikovať a koncentrovat oligodeoxynukleotidy (Sawadogo, 1991), Koncentrace DNA se určí měřením optické denzity při. 260' nnt.'.5/· -Dt-gače· . - '
Všechny ligační reakce se provádějí v 14 °C přes noc .v- .konečném obj.emu. .10 μΐ, za přítomnosti 100 až 200 ng vektoru, 0,.5 .Jaž^Ž^hg. inzertu;· 40· IU enzymu T4 DNA ligázy (Biolabs) a ligačního' pufru (50 mM Tris-HCl 'pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM
DTT, , 1 mM-.ATP) . Negativní kontrola spočívá· v ligaci vektoru bez inzer.tu/
Doplnění přečnívajících 5'.-konců se provádí, kde je to třeba, před ligaci Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I z E. coli (Biolabs) podle dodavatelových instrukcí·. Odstranění přečnívajících 3' konců se provádí v přítomnosti DNAr polymerázy fága T4 (Biblabs) použité podle- doporučení výrobce. . · ,6) ^Tr an s f ormáce^bakterií ,...... ...... , „.......... .......... ..... .
Transformace bakterií plazmidem .' se. provádí podle následujícího postupu: celý objem ligace. (10 μΐ) se použije • « ·· ·* • · φ * * * φ « · φ • · « · ·»-·' · · φ . · »·»φ φ Φ««·» 9 Β«· ·♦· • · Φ Φ · · · · «ΦΒ Φ ΦΦ · ΦΦ ·· k transformaci bakterií TG1, které jsou učiněny kompetentními metodou Chunga ét al., (PNAS, 86, 2172-2175, 1988),.
Bakterie TGl se pěstují v tekutém LB médiu po .několik hodin v inkubátoru s třepáním ve 37 ,°C, dokud se nedosáhne OD ;ίΐ
0,6 při 600 nm. Médium se .poté stočí v 6000 rpm 10’· minut.' „a ’ Bakterie se učiní kompetentními přenesením peletu bakterií do objemu TSB (LB médium ·.+ · 100 g/1 PEG 4000,' 5% DMSO, 10 mM MgCl2, 10· mM. MgSOJ odpovídajícímu' 1/10 objemu, počátečního kultivačního média. Po inkubaci ve 4 °C po dobu od 30 do,60 minut, se 200 μΐ bakterií přivede do kontaktu s ligačními produkty 15 minut na ledu. Po přidání 200 μΐ LB se bakterie inkubují 30 minut při 30 °C, a pak se vysejí na médium LB ' s ampicilinem.
7}' Separace' a extrakce DNA - .
Separace DNA se provádí podle velikosti elěktroforézou.
Aby. se tak učinilo, použijí se různé gely podle velikosti ' .' fragmentů, které-maji-být separovány: --1% agarózový- gel (Gibco BRL) v pufru TBE (90 mM Tris baze, ^9O hřiM-bbřAET- 2~ mM_ED TA)- proTe parac i—v e~l_k ých- f ř agmerrt ú~BNA —-(větších než 500 bp) ' - -2% agarózový gel z agarózy NuSieve. (EMC Bioproducts) v pufru TBE pro separaci malých. fragmentů (menších než 500 bp) . '
Všechny migrace. na agařózovém' gelu nebo na polyákrylamidovém .gelu se - provádějí v pufru TBE a v přítomnosti standardu pro. určení- molekulové hmotnosti („žebříček· 'standardů 1 kb, Gibco BRL) . DNA se smísí s 1/10 objemu nanášecí modře (200 g/1 fikolu, 0,5 g/1 bromofenolové modři, 50 mM EDTA) před nanesením na gel. Po migraci ve .
• · ař » »·»···«»»· • · · · · · · ··«· rW,^. —·.,* *·»· | 4 «···«· »4* 44 · • V 4 · · · · «·« * 4* · 4« ··
-25.100 V a obarvení ethidiumbromidem (koncentrace 0,5 pg/ml gelu) se pásy vizualizujípod UV lampou.
Extrakce DNA z pásu v ágarózovém gelu se provádí elektroelucí následovně: kousek gelu obsahující fragment DNA je vyříznut skalpelem, a umístěn v dialyzační trubičce, uzavřené dvěma svorkami a -obsahující 100 až 500 μΐ TBE.' Vše se umístí do' nádržky pro elektrofořézu, která' se vyštaví . elektrickému poli 100' V.· DNA po opuštění gelu-se1 pur-ifikujedvěma extrakcemi fenol/chloroform, poté následují· dvě extrakce chloroformem, a pak se precipituje za přítomnosti· 0,3 M octanu sodného a 2,5 objemů absolutního etanolu. Po stočení (5 minut při 14 0Ó0 rpm) se pelet DNA usuší,· a poté 'se nasaje do' 20 μΐ vody.
8) Fluorescenční' sekvencování plazmi.dové- DŇA__· ;;/V<·' ·.
Sekvencováni se . provádí podle metody dle' Sangera- za použití 4 dideoxyribonukleotidů majících,-..., -'odlišný,., fluorescenční markér. Inkorporace .-jednoho·' . 'z/těchto· '· dideoxyribonukleotidů způsobí zastavení replikace
Taq polymerázou DNA, .která se sekvencuje. Tato reakce' dává fragmenty DNA různé velikosti, všechny konči na 3' jedním ze '4 dideoxyribonukleotidů.. · gg· p-lazmidu' a 4 pm příměru se přidají' k . 9, 5 μΐ . „předsměsi poskytnuté, firmou Applied· Biosystems ,pod jménem • Prism®. Konečný' objem by měl být 20. μΐ, aby se provedla . reakce- PCR s 25 cykly, které se, skládají z denaturačniho· kroku 30 sekund v 96 °C, nasedání primerů 15 sekund v 50· °C a extenze -4 minuty v 60 °C.
, Ί .. Fragmenty,...DNA^z.ískané^po _ amp 1 ifikaciser,purifikují_,. na ..
vylučovací koloně (Chromaspin-30 od firmy Clontech) a jsou poté usušeny ve vakuu v přístroji Speed Vac..-Vše se nasaje do • ♦ ·· φ a· ·····»*»·>
• · · ·**· · » > · — ·· λ- ·-«···«· ····· ««« 0«β • · β · · · *»♦ * ·· · ·· ··
Η
- 26 5 μΐ směsi sestávající z , 24 μΐ EDTA (50 mM) a 120 μΐ deionizovaného formamidu. Po denaturaci v 96 °C 3 minuty se 3'až 5 μΓ nanesou, na gel pro elektrofórézu. Různé fragmenty DNA se separují podle velikosti a postupně projdou- před laserovým čtecím zařízením sekvenátoru DNA typu 370 ,.(Applied Bio.systems) , kde.se detekují .různé typy fluorescence.
9) Příprava plazmidů z knihovny,plicní tkáně (Clontech®)
Fúzní knihovna cDNA plicní tkáně se prodává ve formě 1 ‘ bakterií.. Tato ’ knihovna pochází z klonování . na úrovni místa EcoRI-Xhol .plazmidů·· pGAĎ424 (viz 'Materiál) z cDNA odpovídající celkové RNA buněk lidských plic.
Po zkontrolování ' titru knihovny -se 2 μΐ bakterií z piícní fúznV knihoýny,f předtím přenesené do .8 ml LB, vyseje na pevné · médium .-ták,- '' aby .· ‘ nesplývaly, prd . udržení reprezentativnosti této- knihovny. Vyseli jsme 16- misek o ploše 77 0 cm2, které m obsahovaly. .LB médium s ampicilinem. Kolonie, kteréýse· Obj;evúly,?'?j-šou odebrány po jedné na misku.,, s 30 ml tekutého LB s ampicilinem. Získané suspenze jsou poté umístěny v Erlenmeyeřovych-baňkačh a ínkubovány v'třepačce ve 37 °C po 3 hodiny.· DNA.· se poté z těchto .kmenů extrahuje technikou maxipreparace (Maxiprep). Koncentrace DNA se určuje v- 2 60 nm. ' 10) Transformace.kvasinek píazmidem
Kvasinky, které se předem'pěstovaly1 ve 100' ml tekutéhomédia, se sklízí po- stočení v · 3000· rpm . 3 minuty a resuspendují v 1 mí sterilní vody.' Po stočení v 3000 rpm minuty-se buněčný.pelet resuspenduje' v 1 ml sterilní vody * I !»> I · II I···»·» ** .: ' ΙΙΙ··Μ>^ίΙ|^»·»·ι^|ι>«ιι>·«>»|·|Μι···^»^>|·>Μ>Ι UM apoté se opět stočí. Tento postup se opět opakuje, aby se odstranily všechny,stopy kultivačního média. Kvasinky se pak' 1 « « 4« 4 ·· ·· *·· « 4 * 4 · · 1 *44 4 ·*· 4···
4-4 4444 4 * * 4444 4 444 4·Ι
4 ♦ · 4 4 « «44 « ·.·' · *♦
- -27 nasají do 1 ml transformačního roztoku I (0,1 M LiAc, 10 M Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) a' pak se stočí v 300Ό rpm 3 minuty. Buněčný pelet se opět nasaje do 1 ml transformačního- roztoku I. .Do 50 μΐ této kvasinkové suspenze se vnese 50 pg DNA z lososího spermatu a 1 až 5 pg plazmidové DNA.. Pak se přidá 300 μΐ transformačního roztoku II (0,1 M LiAc, 10 M Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA ve 40% PEG40oo) a-vše se inkubuje ve 28 °C 30 minut. Poté se na- transformační směs aplikuje tepelný šok ve vodní lázni ve 4 0 °C 15 minut, a 'pak se vše stočí.v 15 000 rpm L minutu, aby se sklidil'buněčný pelet. Tento pelet se přenése do 200 μΐ vody, a poté. se vyseje na minimální médium s agarern,. které neobsahuje· některé aminokyseliny v závislosti na markérech' . poskytnutých transformačním plazmidem.· Kvasinky ;se poté pěstují -72 hodin've .28- - °C. Ve specifickém případe transformace kvasinek plicní cDNA ;knihovnou..se .postup provádí následujícím způsobem:
-Použité-. kvasinky obsahují plazmid pGAL4DB-GAX. 'ěxprimující 'protein' GAX· ve formě ' fúzované k DNA vazebné “doméně-GAbd v—Pěstuj-í^se- ve^S-SO- mi- mini-má-irtí-h-o—média—Y-PG- -ve28. °C š'třepáním, dokud se nedosáhne denzity 107 buněk /ml. Buňky se poté sklidí,stočením v 3000 rpm-10 minut a přenesou do 250 ml . vody. Po .dalším stočení se buněčný pelet přenese do, 100 ml .vody a- opět stočí. Pelet se.poté přenese do. 10 ml transformačního roztoku I- a inkubuje 1 hodinu ve' 28 °G s třepáním. Po stočení jsou buňky opět přeneseny do 2,5 ml transformačního . roztoku I, 100 μΐ plicní cDNA knihovny a 20 ml transformačního roztoku II, a poté se inkubují 1 hodinuve -28 ' °C s třepáním. Na tuto transformační směs se aplikuje - tepelný šok' ve 42 °C po dobu 20 minut. Stočeni (3000 rpm 5 minut) se opakuje třikrát za· sebou, pokaždé se ·» · ·· « ·· ·· « « 4 · · · · ·«« · · · · »··· ; *-· «·♦· * ···.·♦ ·· ··· ··· · · » * 4 * «· · ·· ·♦ i ., · - ·· . . ---28- pelet přenese do 10 ml sterilní vody. Potřetí se pelet přenese do 2,5, ml PBS. Tak byl odstraněn PEG, který je toxický pro buňky. 2,4 ml této suspenze, se použije .k inokuiaci 250 ml minimálního média obsahující1 aminokyseliny His, Lys,. Met a baze, Ura a Ade, a pěstuje, se přes' noc na · .> třepačce ve 28 °C.· Zbývajících 100' μ·1 této suspenze slouží pro kontrolu·, .účinnosti transformace, což sé· provádí v ředěních této suspenze IQ’2,' 10.'3 a 10“4. Kultura rostoucí přes noc se stočí (3000' rpm 5 minut),' a promyje sterilní vodou dvakrát po sobě. Pelet se poté, přenese do 2-,.5 - ml vody.
2,4 ml,, které· se doplní na 10 ml sterilní vodou, se použijí
J· k inokuiaci 10 misek o ploše 435 cm2, které obsahují, médium YNB+Lys+Met+His+Ade,. a inkubúje se . po .3 dny. Zbývajících . .. . „ . 100-μΙ -.se-· -použije k provedení téhož·· postupu, jako· během -·-určení rychlosti, transformace, aby. -se - určila rychlost / amplifikáce· počtu kolonií během celonoční kultivace. / 1 . 11) Izolace kvasinkové (genomové a plazmidové) .DNA :. Množství kvasinkového klonu odebrané průměrnou očkovací : „—^.^g.rn.yě.líQTj—s-e^-um-í-s-t-í—do—2-0Ό-^μ-1—ro-z-to-k-u—-T-E-L-T- -(-2-%—-T-r-i-ton-^X-1-ΟΟτ,—
1% SDS, ' 100 mM NaCÍ,· 10 mM Tris pH 8, 1- mM-'EDTA) v přítomnosti 3 g skleněných perliček o průměru 450 μη *
. a .200 μΐ1 fenol/'chloroformu. Tato směs se vortexuje 15 minut, a poté. se stočí 2 minuty ve 14 000 rpm. Supernatant 'se sbírá ' ' bez odstranění proteinového koláče1 a DNA obsažená v této fází , .
se precipituje s 2,5 objemy absolutního etanolu·. Po stočení ‘ 2 minuty ve 14 000 rpm se DNA pelet usuší a přenese do 20 ,μΐ
TE-RNase. Tento roztok . DNA, který odpovídá směsi genomové , . a plazmidové DNA,/ slouží přímo k transformaci bakterií. Pouze '« .. f ...... )l 1' ........................ H|lll> I ΙΗ)»>«<Ι|Μ··<»·«»·*^Μ·ΙΙ»Ι|Ι·<»Ι|ιΜ*Μ<··Ι»·Ι^·ι!.......
• . plazmidové DNA je schopná replikace v bakteriích a může být analyzována technikou minipreparace.
/
- 29 • » · · ·· ·» •« « · · * · β · « • φ · ,♦ · · · · * . «··· · · V ···· « ·«· ·· ***** * ··· * ·· · ·* ·»
12} Test aktivity β-galaktosidázy i ·- '
Nitrocelulózová membrána je předem vložena do Petriho misky obsahující oddělené kvasinkové klony. Pomocí fenoménu.· adsorpce' se získá přesný obraz' pozice, klonů. Tato' membrána se poté-ponoří na 30 sekund do tekutého dusíku,aby se rozrušily kvasinky, a 'tím se uvolnila β-galaktosidázová. aktivita.
Po roztátí se nitrocelulózová membrána uloží, kolonieminavrch, do další Petriho. misky obsahující '-filtrační papír Whatman předem impregnovaný 1,5 ml roztoku PBS (60 mM Na2.HPO4·, '40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, ’ pH 7) a 10 až 30 μί X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indo.lyl-p-D-galaktos'id) v 50 ' mg/ml ' v Ν,Ν-dimetylformamidu. Miska se poté. umístí do inkubátoru při 37 °c s .uzavřeným- víčkem, aby se -zabránilo' vyschnutí., »
-Doba-do objevení se modré-barvy může 'být-'vysoce variabilní, -od několika minut do- několika; hodin.'/'/'Té-nto/tesť by- měl být' vždy prováděn za přítomnosti pozitivní -kontroly,,, jejíž interakce je známa a rychle vytváří modré zbaryení.
13) Konstrukce expresních vektorů, a reportérového--genu ' -a-)—Ex-p-res-n-í—ve-k-feo-ry————— ---------——-- - ——=—cDNA' pro estrogenový receptór (ER) -se' získá, -reverzní transkripcí (RT) s pomocí komerční soupravy (First sťrand cDNA synthesis kit od firmy Pharmacia) z celkové . RNA extrahované z myšího u.ter.u, což je následováno amplifikací PCR. Použili jsme pár specifických příměrů hybridizujících na 5-'-konci s prvními 20 nukleotidy . z. ER a vnášejících místo ' EcoRI . hned v protisměru čtení od prvního kodonu.
(5'-gagcgaa11cATGACCATGACC Č T TCACAC, sekvence' id. č. 6,nukleotidy kurzívou představují místo EcoRI a podtržená velká
M lili lili Ulil. III iWWWWWWÍIIMf»· I —«|Ί 11 11 HH lim lilii ' písmena první kodon), na. 3'-konci zpětný primer - začíná ve stopovacím kodonu ER, 'a také vnáší , místo EcoRI ή, » · «« » v ♦ » w · * • · ' · ·» · (5'-gagcgaattcACTGATCGTGTTGGGGAAGC, sekvence id. ' č. 7, nukleotidy kurzívou představují místo EcoRI a podtržená velká písmena stopovací kodon). Získaný PCR fragment byl purifikován, štěpen s EcoRI a poté klonován v tomtéž místě do expresního vektoru pCDNA 3 (Invitrogen) . Tento vektor je nazván pCMV-ER: Různé, deleční- mutanty' GAX fúzovaného k DNA vazebné doméně GAL4 (p.CMV-GALDB/GAX,. viz příklad ,9j , byly také klonovány do-vektoru-pCDNA 3. . '
b) .Reportérový gen'
Reportérový gen byl sestrojen podle- strategie popsané ' Martinezem et al:. (Martinez et al., Mol. Cell-Biol., 11,
2937—2945,1991) kromě toho,· že použitý klonovací vektor je. .pGSCAT ’ (C lontech, v CAT _ ;=_ chlcramf enikolacetyltransfěráza) .
Syntetizovali yjsme.-t-'dvojvláknový oligoňukleotid (viz níže) obsahující dvě specifická místa (tučně),.' jedno rozpoznávané
DNA vazebnou doménou. GAL4 ;..(.Ga.l-1.7mer, Carey et al., J. Mol.
Biol., 209,,’ '423-432', .-~l’989l á druhé je souhlasná sekvence z „Estrogen Řesponsive- Element (ERE, Beato, M., Cell, 56, _ 33-5---3-4-4 z .. i-gg-Sju -která^váže eStrogencvý^re~čeptortTento“
... ' * adaptérový oligonu-kleotid má ha 5'-konci přečnívající místo Xhol, a na 3'-k’onci místo·.Xbal, která umožňují klonování na místa Xhol a Xbal z pGSCAT. Sekvence id. č. 8:
.tccjagAGGTCATATTGACCTaagcttCGGGTCGGAGTACTGTCCTCCGACTGCcatatgt , cTCCAGTATAACTGGAttcgaaGCCCAGCCTCATGACAGGAGGCTGACGgtatacacfatc '
Xhol ERE . , Gal~17mer . ‘ , Xbal ι»Μΐ·Μ.··|ΙΙ ll i I ΙΙΙ|Ι>»»<ί*>ΙΙ»·<|»><«Ι<ΜΜ·Ι>·ΙΙΙ' .......UK II 11 unii • * · 4 ·· *« v · * · »»·« ·« · · · · · · · · » a ·«·· · · « ···· * ··· ··· ♦ ’ a · · · · * ·«·' 1 · ♦ ·*» ,*
-'31 Princip tohoto reportérového genů (pEREG-lCAT, obr. 4, přiklad 11) je založen na faktu, že ER je. transkripční aktivátor, který -má, jak je tomu V případě myšího .ER, ' konstitutivní ,, , aktivitu, která , še zvyšuje jako odpověď na jeho přirozený ligand 17'p-estradiol. Tento systém. byl použit Martinezem et al. ke. studování synergie mezi ER a druhým transkripčním faktorem NF1, jehož transkripční aktivační · doména byla
- --.-fúzována . k DNA vazebné doméně kvasinkového proteinu GAL4
--(GALDB), Tento reportérový konstrukt tedy umožňuje, přičítat transkripční- rychlost pouze jednomu nebo druhému transkripčnímu faktoru- nebo 'jejich kooperaci,· bez interference způsobené, endogenními molekulami. Tento systém z
nám proto -umožňuje studovat transkripční aktivitu celého nebo _ ;;části proteinu GAX fúzovaného ke GALDB (obr. 5, . 6 a příklady vý/-: i .1-2, 13) . ' : Byl zkonstruován také plazmid exprimující luciferázový gen ..pod. kontrolou promotoru CMV (pCMV-Luc) . Tento konstrukt '.'.-'.'byl '-získán'' po klonování PCR fragmentu (ohraničeného - na
- 5'- a B^-konci místem -BamHI) ’ obsahujícím promotor CMV
-z--vektoru— pGDNA-3—(-Invi-trogenj—do-'m'rs'ta^“BgTrr’^v'e'ktoru_^pGL3~'”'^' ' . Basic (Promega). Tento plazmid sloužil jako vnitřní standard ’ί ' . ' ve všech přechodných- '.transfekčních .pokusech, které jsou v následujících příkladech.
14) Pokusy s přechodnou transfekcí
Všechňý studie jsme prováděli na myších' embryonálních f ibroblaste.ch . NIH-3T3 (ATCC) . Tyto buňky byly rutinně udržovány v-DMEM (Gibco) doplněném se 100' U/ml penicilinu (Gibco), 100 gg/ml streptomycinu (Gibco), 2 mM L-glutaminem
- - . ..:-,-1111.,1^.1 ......mm ............ ii .......1 lín 111»................ni........... ......................i·................................ ........................ ......................... ' lil.......................... . . (Gibco) a 10% fetálním telecím sérem (FCS, Gibco) . Toto
- médium bude označováno zkratkou DMEM-GPS/FCS.
• · ·· · ·· ·· « * » * ♦ É »»«« • ' » « · · · · · ·· · • ··«· · · · *··· · «·· ♦·· • · · · · ««« « «· « *· ··
Pro experimenty s přechodnou transfekcí jsou NIH-3T3 inokulovány v hustotě 100 000 buněk na jamku' na 24-jam.kové kultivační destičky (Falcon) v objemu 1 ml DMEM-GPS/FCS. 16 až 20 hodin později po' přichycení a rozšíření buněk, jsou buňky promyty 0,5 ml DMEM-GPS (bez FCS) , a poté,opět umístěny, do 0,5 ml DMEM-GPS. Na kultivační jamku se poté přidá 50 μΐ transfekční směsi. . Směs. se získá, jak 1 je. shrnuto t · v následující tabulce 3. , . ' .Tabulka 3
| i* · | 2* | 3* | 4* | |
| PCMV-Luc | 50 ng | 50 ng | 50 ng | 5.0 ng- |
| PERÉG1CAT*' | 650 ng | 650 ng | 650 ng j | 650.. ή g - |
| PCMV-ER ' | 150 ng | 1-501'n.g V·-’'·' | ||
| PCMV-GALDB/GAX | - | - | 150 ng | 150 ng |
| PCDNA3.” | 300 ng | - | - | |
| Lipofektamin’*’ | 8 pg | 8 ůg . | 8 μα | 8 pg . - ... ' |
| H2O'qs | 50 pl | 50 μΐ | ;5 0.yl | 50 μΐ |
* Různé směsi, očíslované od 1 do 4, byly navrženy ke studiu bazální aktivity promotoru EREG1CAT, aktivity' ER nebo samotného GALDB/GAX a konečně simultánního účinku 'ER i
a GALDB/GAX, v příslušném pořadí.
** K.doplnění každé směsi na 10 pg. je použit pCDNA3. 1 ' *** Lipofektamin v koncentraci .2 pg/μΙ (Gibco) je použit v poměru 8/1 (lipofektamin/DNA).
Buňky jsou přivedeny do kontaktu s různými transfekčními směsmi na 4 hodiny ve 37 °C za standardních kultivačních
Μ · * · „Luciferase luminometru podmínek. DMEM-GPS, s transfekční směsí, je poté nahrazeno lml DMEM-GPS/FCS, a buňky jsou poté udržovány v kultuře 24 hodin. Každé transfekce se provádí minimálně ve 4 jamkách. Na konci 24hodinového období ' jsou buňky promyty 0,5 ml Dulbeccova PBS- (Gibco} a'poté jsou sklizeny do 0,5. ml. 0,2% roztoku trypsinu v PBS (Gibco) . ..T.rypsin je neutralizován s 1-0: μΐ FCS.'' . Tato buněčná suspenze se. . stočí 2 ' minuty v 10 000 g, supernatant' -se odsa.j-e a --pak' jsou buňky r.esuspendovány ve' 150 μΐ 0,25 M Tris-HCl v- pH 7,8. 50 μΐ ,této suspenze'se použije k testování luciferázové aktivity podleAssáy System .Kit (Promega) a s’ pomocí LUMAT - ÁB 9501 (EG&G Berthold). Cytosolové proteiny z buněk ve .zbývajících' 150 μΐ se, extrahují 5 cykly zmrazení/roztátí (tekutý dusík/37- °C) . Extrakty, relativně standardizované, k .luciferázové -_akt ivitě’,' j-sou -poté použity k testování CAT aktivity podle metody, dříve popsané Gormanem.
I et al. (Gorman et al·., Mol. Cell B.iol., 5-, 1044.-10.51, 1982) .
15) Interakce in vitro mezi 'proteiny Ki a-GÁX
- - — -T-a-feo—i-n-t-era-k-ee—me-z-i-p-rot-e-i-ný—K-i—a—GAX-<-i-n'^ví-t-ro· '-se—z-koumámetodou Far-westernového přenosu.'
Zatímco westernový . přenos spočívá .v elektroforeťické separaci proteinů, na denaturačním gelu následovaném elektrickým přenosem' proteinů na nitrocelulózovou .membránu a přímé či nepřímé imunodetekci, Far-westérnový přenos je westernový přenos,, ke kterému se přidal krok interakce protein-protein mezi cílovou molekulou zmobilizovanou . na nitrocelulózové .membráně a faktorem v roztoku.
WNMI tm»' ' ··♦· • ·**· ·
I * · ·
I » · · • » · ··*
- 34 a) Elektroforéza
Vzorky se zahřejí 10 minut v 95 °C v denaturačním pufru pro proteiny obsahujícím- 50 inM' Tris pH 6,8, 2% SDS (dodecyísulfát sodný), 10% glycerol, 300 mM β-merkaptoetanol a 0,1% bromofenolovou modř. . 10 ml 'vzorků se nanese na· Tris-glycinový 14% akrylamidóvý gel (Tris-Glycine ’Gels, Novex), Migrace trvá 1 hodinu při konstantním napětí .120 V v separačním pufru pro proteiny (35 mM SDS, 1,92 M glycin a‘ 85 mMTřis pH 8,3}.. Molekulová hmotnost proteinů se určuje paralelní migrací obarveného a .přenosného standardu, molekulové' hmotnosti (MultiMark™ Multi-Colored Standard, Novex). Tento gel se provádí v dvojím provedení, aby bylo možno- paralelně jeden z nich obarvit modří Coomasie ('30% . .metanol,, 60% voda> . 10%. kyselina. octová, 0,.l% modř Cbomasie)..
: Barvení-trvalo .1 -hodinu. Odbarvení se provádělo, několik hodin několikanásobnou výměnou odbarvovacího roztoku (30% metanol, 10% kyselina-octová, 60%. .voda) . Detekční limit této metody je 50- -ng ''-proteinů-;;- Takto' obarvený gel nám proto umožnil vizualizovat v.šečřiny nanesené proteiny. Další gel. je použit ___,p.r_o_ _,AF.ar-.w.e s_t.e.rnp_V-ý_-př.eno.s21.___^.________ > b) Polosuchý přenos na nitrocelulózovou membránu . Nitrocelulózová- membrána (Hybond C, Amersham) a gel se umístily mezi .3 vrstvy-.papíru Whatman předem ponořeného do přenosového, pufru (150 mM glycin, 25'mM Tris, ‘20% metanol,' voda ti, pH 8,3). Přenos trval' 40 minut při' 2,5 mA/cm2 gelu (Millíblot™ - Graphite Electroblotter II, Milíipore),.
i
c) Interakce protein-protein.
*-w-*^embTáTT*jT*Taru7ovária<*To*^ňuniTr*^T^ř1epTM',,^wpTTwt^pTot'e místnosti v PBS obsahujícím5%' (w/v) odtučněné'sušené mléko «ν »«* * ·· ·· • ♦ » ··*' * * » · • * » · · · · · · · · • -«··· « · · «··· * ·ν· *·· • · \ ♦ · t v. ·.
i·· « ·* · · ·· , ' - 35 (Gloria) a 0,2% (v/v) Tween 20. Pak je 1 hodinu ponořena za třepání při teplotě místnosti do 5 ml PBS obsahujícího 5%
- (w/v) odtučněné sušené · mléko (Gloria·), 0,2% (v/v) Tween 20 a 75 pg Ki. Jakmile je inkubace .kompletní, membrána' je 3x .promyta 10 minut v PBS obsahujícím 0,2% (v/v) Tweeh 20.· Aby se vizualizovala interakce mezi GST-GAX imobilizovaným na nitrocelulózové· membráně a mycKi, je tento detekován, stejně jako, GST-GAX, pomocí myší monoklonální protilátky namířené proti epitopu myc (Santa Cruz) a. králičí polyklonální protilátky spojené s peroxidázou namířené .proti myším IgG . (Nordic Immunology).
Příklad 1
- - Konstrukce vektoru umožňujícího expresi'fúzního proteinu mezi
GAX.a DNA vazebnou doménou GAL4 ·
·.. . 'Screening knihovny za .použití dvojitého hybridního . : systému vyžaduje', aby protein GAX byl fúzován k DNA vazebné domény transaktivačního proteinu GAL4 . Exprese tohoto ^fúzní.ho_ proteinu se provádí za použití vektoru pGBTIO (viz Materiál' • a metody), -do kterého jsme vložili, a to do téhož čtecího rámce jako je sekvence odpovídající DNA vazebné doméně GAL4' (GAL4DB)', fragment kódující celý protein GAX nebo jeho část.
' < i .Konkrétní fragment zahrnuje fragment EcoRI-SalI pocházející, z pHGAX·, který je vložen na úrovni místa EcoRI-SalI' z pGBTIO, takže vznikl plázmid pCM199. '
Konstrukt se sekvencoval, což umožňovalo zkontrolovat, že protein- GAX je -vskutku v tomtéž _ otevřeném čtecím rámci, »---- j a ko- protein* f ragmen tu- odpoví dá j' ící* GAL4DB.' ' . ' ý ' 1 Γ'Ι,Ί • φ ·V · ···· »·· « · ·' ···« • « ♦ · · · · ···« • ·««· · · * ···· 4 ·»4 »♦· ♦ « · · · « · • · · V r « · . ·· » ·
- 36 Příklad 2
Screening fúzní knihovny plicní tkáně
Testování fúzní knihovny umožňuje identifikovat klony produkující proteiny fúzované k transaktivační doméně GAL4, schopné interagovat s proteinem GAX nebo jěho'doménami. Tato interakce .umožňuje rekonstituovat transaktivátor, který bude , poté schopný vyvolat .expresi reportérových genů URA3, - BLE a iacZ u kmene YCM79.
Pro tento screening jsme vybrali ’ fúzní knihovnu vytvořenou z cDNA .získané z lidských plic. Protože nám byla. poskytnuta tato knihovna 've formě bakterií, nejdříve se, z knihovny purifikovala plazmidová DNA.
. 2.1)· Izolace plazmidové DNA z fúzní knihovny y ' y .y“.···' ' .?.
Plazmidová DNA z knihovny cDNA plicní · tkáně ’ se· extrahovala podle protokolu. Clontech® (viz Materiál a,metody,. - odstavec 10). Během této izolace- bylo důležité:vžáchdváfe.
> reprezentativnost knihovny, což znamená· zachovat počet'· ---—ne-zá-vi-s-i-ýeh—pi-a-zmidů-,-“které“'ýi—tvoří^._j“ičhž““j“e _7xÍC|57“”^”~^’'” .Abychom se uchránili ztráty plazmidů z knihovny během' ř 1 5 této izolace, byla dávka -plazmidové DNA,' kterou jsme vytvořili, získána .z.velkého počtu izolovaných 'bakteriálních kolonií odpovídajícímu více než třikrát, reprezentativnosti knihovny, což je 25xlOe kolonií. ' ,
2.2) Transformace knihovnou- plicní tkáně a selekce pomocí testu na β-galaktosidázbvou aktivitu ' '
Během testování je nutné zachovat pravděpodobnost.....že.
je . přítomný každý nezávislý plazmid z fúzní' knihovny v alespoň ' jedné kvasince ve stejnou dobu . jako plazmid « ·
| • · » · · · * t · · · · • « · « · · · * »»·· · · · *··· | • · * · • · * · • Φ ··· | ||
| ·♦···. • 41 · i k ·. - - 37 - . ...... _ Ϊ | • » « · · · | ||
| GAL4DB-GAX. | Aby se | tato pravděpodobnost zachovala | > je |
| důležité mít | dobrou | účinnost transformace kvasinek. | Proto |
.jsme vybrali protokol pro transformaci kvasinek dávající účinnost 105 transformovaných buněk na μ5 DNA. Dále, protože společná' transformace (kotransformace). kvasinek se dvěma .odlišnými- plazmidy snižuje tuto účinnost, preferovali ‘ .jsme použiti kvasinek předem, 'transformovaných -plazmidem pGAL4DB-GAX. ' Tento kmen. kvasinek.’byl transformován se 100 plazmidové DNA z fúzní knihovnyToto množství DNA nám umožnilo získat, ' po vyhodnocení (viz Materiál- a metody) , 4,2xl07 transformovaných' buněk, což odpovídá číslu většímu než byl počet nezávislých plazmidů, které tvoří knihovnu. . Podle tohoto výsledku se může zdát·, ' že prakticky všechny, 'plazmidy z knihovny sloužily k transformaci 'kvasinek. Selekce transformovaných ',buriěk,-y,schopných-. ·. rekonstituovat' funkční*' transaktivátor GAL4, -se · prováděla- -na. médiu YNB+Lys+Met+His+Adei Na konci-, této selekce- se získalo 190 klonů s feno typem-Ur a* á'PGal^ vv ; . ' ' ' .Př.íkl.ad_.3_._-----.------------— r
Identifikace inzertů vybraných plazmidů: demonstrace interakce s Ki
Plazmidy jsou extrahovány z kvasinek,- zavedeny do bakteriía poté izolovány, jak je popsáno v části Materiál a metody. Sékvencování. se provádělo pomocí - oligonukleotidu CTATTCGATGATGAAGATACCCC (sekvence id. č. 1) komplementárního k oblasti . GAL4TA v sousedství místa inzerce cDNA plicní knihovny, 52 bp od místa EcoRI'.
„............. , ............ .. ........................ ..............................ihimi—ii ................... ,! ' I j' ......V»·-..........
Srovnání sekvencí . se sekvencemi obsaženými v databankách GEenBank a EMBL (European-Molécular Biology Lab « ·* -*· · · · • x · * · · • »·»· * 4 * • * · · »♦· · ·· • » · * · • · · ι « · · ·· * *· · ·«« · · · • · · «· »·
- 3 8τ Evropská laboratoř molekulární biologie) ukázalo, Že jeden z plazmidu takto identifikovaných obsahuje cDNA identickou s faktorem Ki identifikovaným jako autoantigen. u pacientů trpících lupus. Tento plazmid byl nazván pCM282, Tento plazmid, když je, transformován do kvasinek společně s pCM199,. je· 'zcela schopný aktivovat své reportérové geny, jak je ukázáno v'tabulce. 1 . níže. Tato tabulka navíc ukazuje, že .aktivace ' je specifická, což indikuje, že Ki je schopný specifické interakce s GAX. .
• Tabulka 1
| 1 Vektory | Aktivita β-Gal |
| .pCM199 + pGAD424 | : . 0 |
| ' pCM199'.+ pCM282 | .+ |
| pGBTIO. + pCM282 | 0 ' |
| -pGBTjO + pGAD424 | 0 |
Kříklacbb^ ·” . ’. ,
Konstrukce .vektorů umožňujících expresi fúzního proteinu mezi různými, delečními mutanty GAX a DNA. vazebné' domény GAL4 V kvasinkách
Tento příklad popisuje konstrukci vektorů kódujících různé varianty proteinu../GAX, které mohou být použity pro určení závislosti funkce na' struktuře tohoto, proteinu a zejména pro demonstraci aktivních domén a-domén odpovědných za interakci s proteinem Ki.____________ .... ..........- ‘ .....----:.1.......·ί--.ιν-,τ--ν.
Delece aminokyselin C-.koncové, části -153- se získá štěpením plazmidu pCM199 s Eagl-Sall, poté se odstraní malý
0 0.·· 0 · ·
0.00 0 000 0 0·
0000 00 0 000· 0 ·00 ·· 0 · 0.00 · • 000 · 0 ·, ···· ' - · .-39fragment, konce se zaplní (zatupí) ošetřením Klenowovým enzymem a degradují. Plazmid takto získaný se nazval pČM238. Kóduje protein obsahující aminokyselinové'zbytky 1-104 z GAX.'
Kompletní· štěpení pCM199 s BglII a Sáli a poté degradace ' vektoru po ošetření Klenowovým enzymem umožňuje zachovat prvních 32 aminokyselin z GAX. Plazmid takto, získaný se nazval pCM244. Kóduje protein obsahující aminokyselinové zbytky 1-32 z GAX. . · .. ' .
Kompletní štěpení pCM199 s BglII a Sáli umožňuje izolovat fragment přibližně 270 bp a 572 bp. První fragment 1 se klonuje do pGBTll v místě BamHI-SalI za vzniku plazmidu pCM245, který umožňuje fúzi 79 aminokyselin Č-koncové. části s GAL4DB. Druhý fragment se klonuje do pGBTIO v místě BamHI za vzniku plazmidu... pCM246, který umožňuje- fúzi aminokyselin·' 33 až.222- s GAL 4 DB.. ' ’ .: ' ’’ '1'
Plazmid pCM280 se získal . štěpením. pCM2'46 s' DraliΓ ' a Pstl. Po ošetřeníΈ T4 polymerázou se plazmid liguje sám se sebou. Kóduje protein obsahují.cí .aminokyselinové' zbytky 33-63:z GAX.
. __ _ - Pla.zmid. _.pCML9.9^—j-e—š-těpen- -s-Nde I— - -a—Pst I~— -Inzer sb” klonuje do plazmidu pASI za vzniku plazmidu pCM301. 'Tento plazmid umožňuje expresi proteinu GAX zkráceného o těchto prvních 32 aminokyselin fúzovaných ke GAL4DB. Kóduje protein' zahrnující aminokyselinové zbytky 33-302 z GAX.'
Struktura fúzních proteinů exprimoyaných těmito; různými vektory je ukázána ná obrázku 1. ·. ' '
4 • 4 · • 4 · «··* ·
• 44 4
V
4· · · 4· 44 • 4 4 4 4 4 4
4*4 4 4 4 44 4 • 4 4444 « 44« 444
4' 4 4 4
4 44 4·
Příklad 5
Lokalizace zóny interakce GAX s KI
Kvasinkový kmen yCM79 byl. transformován různými vektory / popsanými v příkladech 1 a- 4 současně: jako pCM282 nebo. jako pGAD424. · β-Gal aktivitase. detekovala,' 'jak je popsáno v Materiálu a .metodách. Získané výsledky jsou .ukázány· v následující tabulce 2.
Tyto výsledky umožňují definovat ' oblast GAX, .která interaguje. s faktorem' Ki (tabulka 2).' Vskutku,' oblasti způsobující ztrátu aktivity tím,, že' chyběj'!, umožňuji učinit závěr, že· jsou nezbytné .' pro interakci, ale nejsou dostačující. Tedy, ..oblasti' aminokyselin 1 až 32 a'104 až 223 se zdají být důležité pro interakci . s Ki, Fakt, že pCM238 .nedává pozitivní signál pro β-Galý 'svěděl.;prd'to, , že'existuje C-koncová oblast 104-302 GÁX, 'kt‘éřá 'je. nezbytná pro. interakci v kvasinkách. ' .
Tabulka 2
| Vektory : | β-Gal.. aktivita |
| pCM199 + pGAD424 ,· | 0 |
| pCM199 + pCM282 | .+ |
| pCM238 + pGAD42 4 | 0 '. ' |
| pCM238 +' pCM2 82 ''. | 0 |
| pCM244 + pGAD424. | 0 |
| PČM244 + pCM282 | o |
| PCM245 + pGAD424' | 0 |
| pCM2 45 + pCM2.8'2 | ;.......o ....................... |
ι:
* · ·» Φ φφ φφ φ* · φφφ · · φ · · φ· φφφφ t · φ ·
Φ φ·φ· · φ φ φφ·φ · ·φφ φφ* φ · φ φ » « φ
Φ·· . φ φ· Φ φφ φ·
-- 41 Tabulka 2 - pokračování
| Vektory | β-Gal aktivita |
| pCM246 + pGAD424 | 0 ' |
| pCM246 + pCM282 | 0 |
| pCM280 + pGAD424 | + |
| pCM28 0 .+' pCM282 | + |
| pGBTIO + pCM282 | 0 |
| ' pCM301 + pCM282 | 0 ' |
Příklad 6.- ' ' .
Profil exprese mRNA v různých tkáních a jaderná lokalizace . přechodně, exprincváného. proteinu
- -- ý .Pro-;-ridentifi.kácí'· partnerů ' GAX byl dvojitě hybridní *· · i 7 kvasinkový kmen, .jíž obsahující plazmid umožňující expresi fúze GAL-GAX/^(1-302) . ..jako'-nástrahy, transformován plicní. knihovnou . ODŇA''-fúzovanou ke., GAL4TA, dostupnou v laboratoři (příklad .2), Přeď amplifikací jsme byli schopni získat více než -41 milionů nezávislých klonů a 'pouze 190 klonů, ve kterých jsou expr-imovány tři . selektovatelné geny (tjď gen URA3, gen LacZ a géh BLE)·. Mezi těmito 190 klony bylo možno identifikovat 9- cDNA kódujících různé proteiny. Zejména nás zajímala taý která kóduje Ki antigen.
Gen Ki se .zdá být všudypřítomný, jak naznačuje analýza jeho- exprese northernovým přenosem (obrázek 1) za' použití. mRNA extrahovaných .z různých tkání (membrány s přenesenou z . ' mRNA, lidských tkání.Multipie Tissue Northern Blots od· firmy . 1 1Clontech)., ^.která^dete kovala» mRNAwpř zbli žně w-vellkos ti*—31l,*'kbr*w‘l
4
4*44 ·
4
444 4
4 4'9
4· 44« « 4 4 4 4 4 4
444444 44*
4 4 4 4
4 44 44
Může ' být zmíněn výskyt formy mRNA v srdci a kosterních svalech podstupující odlišnou maturaci' (1,4 kb) r
Konstrukce- vektoru umožňujícího expresi proteinu Ki fúzovaného se značkou HA v savčích buňkách se prováděla následujícím způsobem: fragment Ncol-Xhol -z plazmidu pCM282 je vložen do plazmídu pASl na úrovni míst Ncol-Xhol za vzniku plazmidu .pCM322. Dále je fragment EcoRI-Dral z plazmídu pCM322 vložen .do expresního'· vektoru' pCDNA3 na úrovni míst EcoRI-EcoRV. Získaný plazmid pCM323 umožňuje expresi proteinu Ki fúzovaného se značkou HA v savčích buňkách.
Nepřímou imunofluorescencí je ukázáno, že KiHA je lokalizován v jádře, v buňkách transfekovaných touto chimérou' (viz obrázek· 2) . . : rříkl.ad 7 . . ,
Exprese a purifikace proteinu Ki fúzovaného se -7; ;7-.>.'značkou Sa zhačkou myc
.. Následující oligonukleotiďy byly spolu hybridizovány, fosforylovány a pak ligovány s' pET29B předem naštěpeným Ncol.
CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC (sekvence id. -č. 2) ' a ' '
CATGGATCCACGŤGCAGGTCCTCQTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATAAGCTT (sekvence id. č. 3) . . . '
Získaný plazmid,'byl nazván p'CM320. Gen kódující protein'Ki je amplifikován pomocí PCR s oligonukleótidovými primery „CGCGGATGCGATGGCGTCG-TTGCTGw-w^ (s e kvence-^**^! dť***-^ ěr**^**4 )* a GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGŤCTČTGC (sekvence id. č. 5) . Získaný • 4 ·· · *· ·· • * · · · φ ···· · ·. · ' 4 4 * · * · 4 • ·»·» · 4 4 ·♦·· 4 ···' ··· · · 4 4 · »ι • 4 « * ·· 4 ···· i
¢..
fragment·se štěpí s-BamHI-XhoI a pak se po ligaci vloží do míst BamHI-XhoI' plazmidu pBCks za vzniku plazmidu pCM305.
Druhý uvedený je poté ' naštépen BamHI-XhoI. Tím uvolněný 1 inzert je ligován do místa BamHI a Xhol pCM320 za vzniku plazmidu . pCM321. Exprese á purifikace rekombinantního proteinu se provádějí podle dodavatelových (Novageh) instrukcí za použití pČM321.·
Příklad 8
I
Exprese a purifikace proteinu GAX -fúzovaného s GST . - .
.. Kolonie BL-2'1 transformované plazmidem pGEX-2T-h-GAX jsou předpěstovány ve 30 ml ,LB s ampicilinem (50 μς/ια!') ‘ ve , 37- °C-· přes noc. 5 ml této předkultury se kultivuje opět .v 500 ml LB ' s'ampicilínem ve 37 °C, dokud se nedosáhne optickét--denzity 0,7 v- 600 nm. Exprese -GST-GAX je indukována 0,lmM
IPTG 2 hodiny ve 30 °C. Kultura se stočí v'6000 rpm 10-.minut. Bakteriální .'pelety. se resuspenďují v 10 ml chladného . ?3,S· a poté ' se rozdělí do 10. zkumavek Eppendorf. Bakteriální
-^pr-ote-iny—sé—-extrahuj 1--sonikaci- ' lO'mihut s'cyk'ly'’ •‘12”*’ s a pauzami 24 s,' což je následováno stočením v 15'000 rpm po 15 minut. Supernatantý se spojí a vytvoří rozpustnou frakci, která bude použita pro puřifikaci. Zbývající pelety ' představují nerozpustnou frakci. .
Purifikace GAX se provádí GST afinitní- metodou s agarózovými perličkami spojeným s glutathionem.. - '
Supernatant získaný, po sonikaci bakterií se inkubuje s pryskyřicí jednu hodinu na rotační třepačce při. teplotě , místnosti. Dále se pryskyřice, ke které je navázán protein,
,.r ... i γι .ii -. m 11 ~ τψ—i.r γΊι......---,11-:-1-1--71----------- ........... λιπ.** stočí v 1000 rpm 10 minut. Jakmile je odstraněn supernatant, pryskyřice se 3x promyje s 50 ml PBS obsahujícím 1% • 9
9*9
999*
999 999
- 44 -Triton X-100 20 minut, na rotační třepačce. GST-GAX 'může být eluován z pryskyřice. guanidiniumthiokyanátem. Eluce se provádí l,5x objemem pryskyřice 2M guanidiniumthiokyanátem, 20 mM Tris pH 7,5, 0,15 M NaCl a 0,1% Tritonem X-100 na rotační třepačce 30 minut. Eluát se dialyzuje proti. PBS přes noc, aby se 'Odstranil guanidiňiumthiokyanát. Protein se uskladní v PBS ve. 4 ŮG. k proteinovému preparátu· se přidá 1/200 --směsi -inhibitorů proteáz v rovnoměrném množství (Leupeptin 1 mg/ml, Pepstatin. 1 mg/ml, Aprotinin. 1 mg/ml, Benzamidín 500 mM)
Příklad 9 - * .
Interakce in vitró mezi proteiny Ki a GAX.
. Proý'· studiům^: interakce ' ‘mezi 'GAX, a Ki, in· .vítr o jsme vytvořili dva -chimérické rékombinantní proteiny v Escher.ichia coli. GST-GAX, .yse1 --purifikoval na , pryskyřici spojené s glutathionemý pomocd/dcatalýtičkého' místa glutathion-S-transferázy (GST), SmycKi--nesoucí epitop myc a epitop S umožňující puríf-ikae-i—na-p-ryskyři-cr-spO j-ené's' proteinem''S .
Příslušná· množství bovinního albuminu,. proteinu GST nebo GST-GAX ' po štěpení trombinem (místo vytvořené mezi GST a. GAX), a také stoupající množství GST-GAX, byla separována na denaturačnim polyakrylamidovém gelu, a poté- obarvena modří Coomasie (obrázek 3 A).
Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu z gelu.totožného s gelem v oddíle A. Membrána se inkubovala postupně v'přítomnosti SmycKi., v roztoku obsahujícím myší monoklonální protilátku namířenou, proti- epitopu mýc (Santa
... _ff—f- I» lil ''n 'I!»1'»· ....... 1111,1
Cruz) a nakonec'v.roztoku pro detekci protilátek .anti-myc.
♦ * ·· ♦ #· ·» ·· · ··* a · * « • ♦ » «··« «··· • ···· a · ♦ ♦ ··· · ··· «·« • · · · · « · ··· v »· * ·· «·
- - 45 Naše výsledky jasně ukazují, že Ki specificky rozpoznává GST-GAX způsobem . závislým , na dávce, zatímco u bovinního albuminu'nebo· GST není pozorována žádná reakce. Mělo by být zaznamenáno, že po štěpení trombinem Ki stále interaguje s GAX (obrázek 3 B). .
Příklad 10 .... .
Konstrukce vektorů umožňujících expresi fúzního proteinu mezi' různými delečními mutanty GAX· a DNA vazebné domény' GAL4 v savčích buňkách
10*1) Konstrukce plazmidových vektorů
Plazmidy p.CM199 a pCM30.1 jsou štěpeny s HindlII'.· Inzerty . ..se klonují· ve správné- orientaci ' -der pCDNA3 (Invitrogen)'..
v místě '.HindlII za vzniku .plazmidů pCM291 a ,pCM327, umožňující expresi, fúzí v savčích buňkách.
' ·- (Plazmidy ' pCM238, pCM244, pCM301,. pCM246 ' a pCM280, jsou , štěpený s HindlII a Nael. Inzerty sé klonují ve správné orientaci—do..-pCDNA3--. (Inv-i-trogenj-- v místě- -HindiII-EčbRV :zá' • v.zniku plazmidů pCM292, pČM326, pCM327, pCM294· a pCM295, t
•umožňující expresi fúzí v savčích buňkách.
10.2) Konstrukce virových vektorů
Jeden·, 'aspekt vynálezu spočívá v konstrukci a použití· virových vektorů umožňujících přenos a expresi in vivo nukleových kyselin, jakjsou definovány výše.
Co se- týče konkrétně adenovirů, byly charakterizovány různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Mezi těmito sérotypy .je podle předkládaného vynálezu výhodné použití typu 2 nebo 5 lidského adenovirů (Ad2 nebo *« 4
4« *· • · · * ···· » * «4»· ··«» ···· · · · ···* · «·« 4·4 ··
- 46 »· ··
Ad5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz patentová přihláška WO94/26914) . Mezi adenoviry zvířecího původu, .které mohou být použity v rámci předkládaného vynálezu, mohou být zmíněny adenoviry původu psího, bovinního,' myšího (příklad: MAVI, Beard et al., Virology, 75, 8L, 1990), ovčího, prasečího, ptačího nebo alternativně opičího- (příklad:· SAV) . Výhodně je adenovirus zvířecího původu adenovirus psí, výhodněji adenovirus CAV [například kmen. Manhattan nebo A2 6/51 . (ATCC VR-800)]. Výhodně, jsou podle předkládaného vynálezu použity adenoviry lidského - nebo psího nebo smíšeného původu.
Neúplné adenoviry podle vynálezu výhodně zahrnují IT.R, sekvenci umožňující ’ enkapsidaci (zabalení) .a nukleovou kyselinu podle' vynálezu. Ještě výhodněji je v genomu adenovirů vynálezu, alespoň .oblast El nefunkční. Uvažovaný virový..gen může být učiněn nefunkčním· každou technikou·' zňáirÍQ.ů odborníkům, zejména úplnou supresí·, substitucí, Částečnou.' delecí nebo· adicí jedné nebo více baží v uvažovaných, genech. Takové modifikace mohou být získány in vitno (na -izolovaně, y DNA) ' nebo in šitu, například prostřednictvím technik'.', genetického.,inženýrství.,'. .-..nebo- -'--alternativně- v- -ošetřením mutagenními přípravky. Další' oblasti mohou' · být 'také modifikovány, a to zejména oblast E3 (viz WO95/02697), E2 ' (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697),. Podle1 výhodného provedení zahrnuje adenovirus podle vynálezu .-deleci v oblastech El a E4. Podle dalšího, výhodného provedení zahrnuje deleci v oblasti El na úrovni, do které jsou vloženy' oblast E4 a nukleotiodová sekvence podle předkládaného vynálezu (viz FR94/13355). Ve virech podle vynálezu delece v oblasti El výhodně zaujímá úsek *· nukleotidů 455 až 3329 na adenovirové sekvenci Ad5.
• » *♦ * 44 44
4 4 · 4 4 · 4 4 • •4 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4444 4 4 4 4444 4 4·4 444
4 4 4 4 '4 4
444' 4 44 4 - 4« 44 ' - 47. - -.- .
' 1
Neúplné rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny jakoukoliv technikou odborníkům známou (Levrero et al., Gene 101, 195, 1991, EP 185 573, Graham EMBO J. 3, 2917, 1984). Mohou být zejména připraveny homologní rekombinací mezí adenovirem a plazmidem nesoucím inter alia nukleovou . sekvenci nebo kombinaci nukleových- sekvencí vynalezu. Homologní. rekombinace 'nastává po společné transfek.ci uvedenýmadenovirem a plazmidem do příslušné, buněčné., linie. Použitá buněčná linie by měla být výhodně (i)' transformovatelná uvedenými prvky a (ii) ’ zahrnovat .sekvence schopné doplnit neúplnou část adenovirového genomu, výhodně, v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Jako příkladbuněčné - linie může být zmíněna linie /lidských embryonálních ledvin 2-93 (Graham et al., J. Gen. 'Virol.,· 36, 59, 1977),která obsahuje konkrétně7,··'- lěváu-ý.čášt -genomu- -adenoviru Ad5 (12 .%) integrovanou do’ svého genomu .nebo linie : schopné. , ' doplnit funkce Έ1 a E4, jak' ‘jsou .konkrétně popsány, v přihláškách č. WO94/26914 á' WC'95/O2'697 nebo;' v- Yeh et al.
(J.. , Virol., 7, -559, 1996)·. Dále,”’adenoviry, které se pomno.žil.yj.so.u .. zís-káný-- -zpět - a- pu-rifíkovány-·; -obvyklými ' technikami molekulární biologie./”
Co se týče virů přidružených k adenovirům (AAV), jsou to DNA víry relativně malé velikosti, které se integrují do genomu buněk, které infikovaly, stabilním a místně ' specifickým -způsobem.- Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez vyvolání jakéhokoliv, vlivu- na buněčný růst, morfologií nebo diferenciaci. Kromě, toho.se zdá, že nejsou zapojeny do patologických procesů u člověka. Genom AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Zahrnuje přibližně
...............’,..... ........- ............... — - ........... , J'i! ,. π............
tf ^-^Ι4»ι44Μ4»»*4Ι*<ΜΙΙΜ|<ΜΜ4>44Μ···4Ι»······4Φ·4··^^^^^^^ ' · 4700 baží a na každém- konci obsahuje invertovanou koncovou repetici (inverted terminál repeat - ITR) o přibližně 145’ * · • · · • ·♦·· *
Μ ·*
- 48 bazích, sloužící pro virus jako' .počátek replikace. Zbytek genomu je rozdělen do dvou esenciálních oblastí., nesoucích funkce pro enkapsidaci: levá část genomu, která obsahuje gen rep zapojený do virové replikace a exprese virových genů, pravá část genomu, která i obsahuje gen cap kódující proteiny virové.kápsidy.
Použití vektorů pocházejících z AAV pro přenos genů in vitro a in vivo byl v odborné literatuře již popsán (viz zejména WO91-/18088, WO93/09239, US 4 797 368,' US 5 139 941, EP.-488 528). Tyto uvedené, přihlášky popisují různé konstruktyderivované z AAV, ve kterých jsou odstraněny geny rep a/nebo cap .a jsou nahrazeny požadovanými geny, a jejich použití k přenosu těchto genů in vitro (na buňky ve’tkáňové kultuře) ' nebo .in vivo (přímo doorganismu). Neúplné rekombinanty.AAV .podlé vynálezu-.mohou .být., připraveny.,,spo,léčnou . transfekcí do buněčné ’ linie - infikované lidským pomocným virem’ (helper virus) .(to může býtrnapř. adenovirus)., píazmidem obsahujícím .nuJc-reovaiiiy^-še-kv.enGi·' -..nebo kombinaci nukleových sekvencí vynálezu /ohraničenou;· -dvěma AAV invertovanými terminálními repeticemi (ITR), á píazmidem;. nesoucím. AAV ..enkapsidační ..geny. .(geny rep a cap) .. Buněčná linie, která'může být- použita, je například’ linie 293. Další 'způsoby přípravy jsou popsány například v přihláškách WO95/14771, WO95/13365, WÓ95/13392nebo WO95/O6743i Vytvořené rekombinantní AAV jsou poté puri-fikovány obvyklými technikami.
, Co se ’ týče . herpesvirů a . retrovirů,- ' konstrukce rekombiňantních .vektorů byly široce popsány v literatuřevizzejména Břeakfield et . al., New Bioiogist, 3, 203, '1991, EP 453242,. EP 178220, Bernstein et al., Gěnet; Eng., 7, 235, —ígasruicCormick, jBioŤechnology, 3, 689, 1985, apod. Retroviry jsou konkrétně integrativní viry, které selektivně infikují ·· ·
- 49 i dělící se buňky. Proto tvoří vektory zajímavé pro použití v případě rakovinných onemocnění. Genom retrovirů obsahuje esenciálně dvě LTR, enkapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag,' pol a- env). V rekombinantních· vektorech pocházejících, z retrovirů jsou' obecně geny gag, pol a env Odstraněny, kompletně, nebo částečně, a- jsou nahrazeny požadovanou heterologní . sekvencí, nukleové kyseliny. Tyto vektory 'mohou být' tvořeny z různých typů .retrovirů, jako zejména MoMuLV („Moloney murineL leukemia virus - virus Moloneyho myši. leukemie, také nazýván 'MoMLV), MSV („murine Moloney sarcoma virus ' - virus myšího Moloneyóvy sarkomu), HaSV („Harvěy sarcoma virus - virus Harveyova sarkomu), SNV („spleen necrosis virus - nekrotický virus sleziny), RSV („Rous sarcoma virus - virus Rousova sarkomu)· nebo Friendův ''virus. ·. Pro konstrukci rekombinantních retrovirů· podle vynálezu, které obsahují nukleovou sekvenci nebo .kombinaci nukléových sekvencí' podle vynálezu, . se vytvoří plazmid
..obsahující zejména LTR, enkapsidační sekvenci a uvedenou nukleovou · sekvenci,. a pak je použit pro transfekči' takzvané enkapsidační-..buněčné,--linie schopné, poskytnout- v plazmidu neúplné retrovirové' funkce působící v trans. Obecně jsou enkapsidační linie tudíž schopné exprimovat geny·' gag, pol a env. Takové enkapsidační linie byly popsány·· v předchozím stavu techniky,, zejména' linie PA317 (US 4 861 719), linie'
PsiCRIP. (WO9Q/02806) á linieGP+envAm-12 ' (WO89/07150) . Kromě toho mohou rekombinantní retroviry obsahovat modifikace . na úrovni· LTR, aby potlačovaly · transkripční aktivitu, a 'také rozšířené enkapsidační sekvence ' obsahující část genu gag (Bender et al., J, Virol’., 61, 1639', 1987). Vytvořené rekombinantní retroviry jdou poté purifikovány obvyklými technikami'·.
• « *9» * · · · « · · ··· · · · *
9··· » · · ···· · ··· ··· » · * · · ·
».· « ·* · *· **
- 50 - . .
10.3) Chemické vektory
Nukleové kyseliny ' nebo, popsané plazmidové ' expresní vektory v předchozích příkladech ' mohou být podávány jako· takové in vivo nebo ex vivo. Skutečně bylo ukázáno, že'.prosté nukleové kyseliny mohou transformovat buňky. Ale aby se Zvýšila účinnost přenosu, je výhodné použít v rámci vynálezu, přenosový vektor.· Může to být viróvý vektor' (příklad /9.2),. nebo, syntetický transfekční prostředek. .. '
Ze všech vyvinutých syntetických vektorů je výhodné použít v'rámci, vynálezu kationtové polymery polylysinového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098), polyetylenimin' (WO96/Q2655)· a dextran-DEAE, nebo - alternativně kationtové lipidy nebo· lipofektanty. Mají tu Vlastnost, že; ..kondenzují DNA a podporuj í j-ej-í · spojení.· s· buněčnou'-membránou·./ '-'Jako· -příklad za všechny mohou, být zmíněny lipopóíyaminý (Íipofektamin, transfektam apod.)., různé kationtové. nebo neutrální 'lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE apod.), a- také-, peptidy jaderného,-původu.
Navíc ' byla vyvinuta· koncepce 'cílené ..'fřánsfekče, zprostředkované ..recepťor.em, - která - využívá /princip .kondenzace DNA na základě kationtového polymeru, za'směrování připojení komplexu k membráně' následkem, chemické vazby mezi kationtóvým polymerem a ligandem ' membránové receptoru přítomného na povrchu buněčného typu, který se má ;transfekovat. Tak bylo popsáno testovaní receptoru pro transferin, pro inzulín nebo receptoru pro asialoglykoproteiny hepatocytů. Příprava', prostředku podle vynálezu za použití takového chemického vektoru se provádí podle technik odborníkovi známých, obecně jednoduše tak, že se různé složky přivedou do. kontaktu.
.... -...................—------— I II Wťl limu.......I www·
» » ♦ · «ί · · · · · ···· » · · *··* *
- ·51
Příklad 11
Vývoj metody umožňující 'studovat transkripční aktivitu GAX
Pro studování transkripční aktivity specifické pro fúze
GALDB-GAX, a' také pro -jejich účinek, na. transkripční aktivátory, jako je estrógendvý .receptor (ER) nebo kyselá aktivační doména proteinu VP16 viru Herpes simplex fúzovaná k GALDB, jsme použili přechodný transfekční systém. Aby se kvantifikovala, .t-raňskripční ' aktivita každého faktoru nebo kombinace několika faktorů, 'vytvořili jsme cílový (reportérový) .gen exprimující bakteriální chloramfenikolacetyltransferázu (CAT) pod kontrolou1 umělého, promotoru.
Tento promotor .obsahuje TATA ' box, pocházející z genu E1B . adénoviru Ad2 (E1B TATA), v protisměru od místa' počátku ' , t transkrigbb':genu_ CAT (obrázek 4A) . · Protein TBP komplexu TFIID ‘rozpozná--TATAbox a umístí preíniciační komplex (TFÍID + TFII
A,B,E,F), -který rekrutuje. RNA polymerázu typu II '(Polil), která iniciuje·..transkripci . ..genu CAT. V protisměru tohoto bazálního .promotbru ' j-smel·vložili-GALDB vazebné místo (17mer), které je rozeznáváno, chimérami GALDB-GAX nebo ,GALDB-VP16. Také. jsme klonovali' v protisměru od 17meru estr.ogenový responzivní element *(ERE), , ke kterému se váže ER, aby se aktivovala, transkripce. Tento reportérový konstrukt nám umožni studovat' ,různé kombinace, přičemž aktivace nebo represe transkripce má za následek modifikace množství CAT v buňce.. Pro hodnocení transkripčního'účinků se používá test enzymatické- aktivity CAT v buněčných extraktech .. po transfekcí.' ' , . ' .
ER a GAL4-VP16 jsou velmi silné transkripční aktivátory.Ak t i vi t a^CAT** j s*·* ER* z výš eňa1** více^^něž*** 10 Ó x ’ a ' GAL’4- VP fó' přibližně 85x. Společná exprese ER-a GAL4-VP16 má za následek ·· * φ · * «»·· e> ··· *·· • * * · aktivitu CAT, která j.e 300x větší než aktivitaneaktivovaného reportérového genu a. větší než součet aktivity dvou aktivátorů exprimovaných jednotlivě. To svědčí proto, že ER a' GAL4-VP16 navzdory .stérickým překážkám, mohou- obsadit a aktivovat stejný promotor .(obrázek 4B) ...
Příklad 12 Studie transkripční aktivity fúzí GALDB-GAX a' identifikace transkripční represorové domény'
Gen- GAX člověka kóduje protein ósložený ze 302 aminokyselin. Primární struktura tohoto proteinu odhaluje různé domény, .jejíchž funkce zůstává neznámá. GAX patří do 'rodiny takzvaných homeobox genů. Homeobox je nezbytný pro replikaci a'pro vazbu těchto proteinů na. specifické ' sekvence-·.. 'DNA přítomné v promotoru cílových genů, jejichž expresi kontrolují. Do současností nebyla identifikována' žádná DNA' ‘sekvence rozpoznávaná GAX'. GAX' má oblast bohatou na histidinové (HIS) zbytky na své N-koncové ’ části, ' jejichž funkce zůstává neznámá, _ ''...... ' .......
Pro porozumění funkce GAX byly odstraněny různé oblasti lidského genu GAX tak, aby se vytvořily zkrácené proteiny jak na jejich N-koncové, tak. na jejich C-koncové části· (obr. .5) . Čísla, indikuj i 'pozici první a poslední aminokyseliny každé deleční mutanty relativně k celému proteinu GAX zahrnujícímu aminokyseliny 1-302 . (obr. 5). Neznajíce DNA sekvenci, která je přirozeně rozpoznávána -GAX, tvořili jsme chiméry mezi· různými delečními' mutantami a heterologní DNA vazebnou ' doménou (fúzovanou k jejich N-koncové části) pocházející·· z^kvásinkóvého^třanŠkripcního faktoru GAL4 (GALDB). Pro
| • * • · 4 · | * | • 4 4 4 · | 4 • a | 4 | 1 « · 9 4 | 4 4 4 · |
| • | 4 | • | • | - 4 | ||
| ♦ 4 | 4 | • 4 | • | 4 4 | 4 |
přechodnou expresi různých chimér v kultivovaných savčích buňkách byly konstruovány expresní vektory.;
Různé chiméry GAL-GAX byly exprimovány .samotné nebo • v přítomnosti ER, aby se mohl studovat jejich účinek .na'.
bazální transkripci a na transkripční aktivitu ER.
Celý GAX, v kontextu fúze GAL-GAX1-302 snižuje· více než 8x aktivitu CAT relativně k neaktivovanému reportérovému genu. Tato., represe je slabě ovlivněna, když chybí 36 aminokyselin na N-koncové části GAX (GAL-GAX33-302}, ale je kompletně zvýšena,' když další delece potlačí C-koncovou část t ' ' I
GAX (GAL-GAX33-222}. Tyto 32 aminokyseliny dostačují v kontext GAL-GAX1-32 snížit aktivitu CAT (obrázek 6A}.·
Společná exprese GAL-GAX1-302 a'.EŘ má. za, následek aktivitu · CAT více než 25x nižší než jaká se . získá při samotném .ER. Tato.. represe, .jako v případě A, je způsbběňát.,.; prvními 32 aminokyselinami’ GAX (srovnej GAL-GAX 1-30 2,-'GÁL-. GAX33-302 a GAL-GAX33-222). Těchto'32 aminokyselin N-koncové části (GAL-GAX1-32) snižuje aktivitu .ER . pouze dvakrát (srovnej GAL-GAX1-32, GAL-GÁX1-104) ..a pro maximální -aktivitu vyžaduje alespoň přítomnost, aminokyselinových zbytků 3.3 .až 222 (obrázek 6B)
Tímto 'způsobem jsou hledány sekvence způsobující svou nepřítomností ztrátu aktivity, což umožňuje usuzovat,' že jsou . nutné pro interakci, ale nejsou dostačující.
Předkládané výsledky ' ukazují, ) že , GAX potlačuje transkripci použitého reportérového genu. Tato represe je esenciálně, způsobená peptidem N-koncové části (aminokyseliny 1 až 32), jehož .optimální aktivita vyžaduje přítomnost useku aminokyselin 33 až 222 GAX, a výhodně přítomnost oblasti aminokyselin 33 až 104 GAX.
>. « ' * 9 · • · · ♦ » · ·♦ * · ·«« · ·* · « β * « «· «· • ♦
Za použití různých delecí GAX fúzovaných k DNA vazebné doméně GAL4 jsme byli schopni ve kvasinkách identifikovat (dvojitým hybridním systémem, viz příklad. 5) oblasti GAX, které jsoudůležité pro interakce- s Ki. Je to N-koncová část až ke zbytku 222. Tato oblast obsahuje, jak, jsme již ukázali výše, represórovou doménu GAX. ·.
Příklad 13
Interakce -in vatro mezi GAX a PCNA
13.1) Klonování cDNA lidského '.„jaderného antigenu proliferujicí.· buňky' (PCNÁ, . Proliferating .Cell Nuclear Antigen) a vytvoření rekómbinantního proteinu
Klonování cDNA . PCNA.·-'se?<'přováděíóx.irě.veřzní. ;transkripcí, a následnou. PCR. První - křo-k- reverzní ’-'traňskripče (RT) se provádí s použitím soupravy.„First. Strand cDNA synthesis od firmy Pharamcia. Celková RNA ...se ;extrah.úýe.z:--primární kul tury buněk lidského hladkého svalstva' (Cloňetics) · podle metody popsané .autory..P. Ghromczynski a--,N. Sacchi (Anal. Biochem.,' 162, 156-159, 1987), 10. pg této: ’ celkové RNA -se přenese do μΐ vody, zahřeje se 10 minut' v 65 .°C, ochladí na ledu a pak se smísí s 11 μΐ reakční směsi „Bulk First Strand ze1 soupravy RT (Cioned, FPLCpure®, myší reverzní .transkriptáza, i I
RNase/Dnase-Free BSA, dATP, dCTP, dGTP a dTTP) , 1 μΐ DTT a μΐ primerů pD(N)6. Reakce RT se inkůbuje 1 hodinu ve 37 °C, zastaví se zahřátím 5 minut v 90 °C, a poté se ochladí , na ledu..· Druhý krok spočívá v. amplifikaci cDNA PCNA pomocí PCR. Použité oligonukleotidové' primery pro reakci PCR jsou
....................... WIIHIÍ následující: . '
,.. ,, · ·. »»
t.. · , , · · * · · , . *»·· e a » β * *··· · · ,···· · *·* ··· • . · · · · · · ··· * ,· · ·· ··
- 55. 1: 5'-CGČGgaattcTGTTCGAGGCGCGCCTGGŤCCAGG-3' FE.ARLVQG : 5 ' -GGT.CgaattcTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC'-3 *SGEEDEIK
Tyto dva primeřy vnášejí místo EcoRI '(malá podtržená s
písmena) , .Aminokyseliny PCNA obsažené v primerech jsou představované jejich' kódem (velká písmena) pod odpovídajícími kodony. * představuje stopovací kodon.
- 8 μΐ reakce RT popsané výše se upraví na konečný objem50 μΐ obsahující následující konečná množství ‘ nebo, koncentrace: 50 pm primeru 1, 50 pm primeru 2, .jedna, jednotka Ta.q DNA polymerázy ' (Perkin .Elmer) , 5 μΐ MgCl2 (25 mM) , 2 μΐ :.2QfcmM/'směsi. 4 deoxynukleotidů (dATP, dTTP, dGTP- a dCTP) »a ,5-μ1 -lOx koncentrovaného pufru pro PCR (Perkin Elmer). Amplifikace PCR. s.e- provádí ve zkumavkách Micoamp™ (Perkin Elmer) .'s/pórnočí;'.te'rmocykl'ovače. PTC-100™ (MJ Research, lne.). Tato amplifikace '7spočívá z‘denaturačního kroku 2 miputy. v 95; °C. následovaného 30 cykly,. které obsahují denaturaci15 sekund v ,· 95 °C, nasedání primeru 30 sekund v 55 °C a extenzi 1 minutu v 72 °C. Těchto 30 cyklů je následováno dalšími- 5-minutami extenze, a poté se reakce PCR uchováváji. v 10 °C..
Vlastní klonování. PCNA do vektoru PČRII (Invitrogen) -.se provádí ‘s „Originál ’ TA. Cloning® Kit '(Invitrogen). 3 μΐ produktu PCR, 1 μΐ - lOx ligačního pufru, 2 μΐ vektoru pCRII (25 .ng/μΐ), 3 μΐ vody a 1 μΐ T4 DNA ligázy se inkubují hodin v 16 °G. 2 μΐ této ligační reakce -se’ použijí k transformaci kompetentních bakterií TG1, jak bylo již popsáno výše. Bakterie se poté pěstují 16 hodin v 37 °C na v · • · ·· « · · · » • * · · · • ······ « • * · · ·· · ·· • ♦ * · · • · ij á > β «·«· * ··· ··· • ♦ · « · · ··
- 56 pevném LB-médiu obsahujícím 1,5% agar, 100 gg/ml ampicilinu, v přítomnosti X-gal pro modrobílou selekci rekombínantních klonů (alfa komplementace β-galaktosidázy).'
I '
Rekombinantní klony (bílé kolonie) se' přenesou do 10 μΐ vody a ověří se pomocí PCR za stejných podmínek jako. PCR po reakci RT popsané výše,·' kromě, toho, že se' k reakci přidá 1 Triton Χ-10Ό v konečné-koncentraci 0,01% v/v.
Několik pozitivních klonů se použije pro' minipreparace . '
DNA, a ty, ve kterých, je 5'-koncová část, inzertu PCNA umístěna . po· 'směru čtení od místa' EcoRV- z pCRII, jsou šekvencovány a'uschovány pro následující klonování.
Klonování PCNA do plazmiďu pET29 se provádí' následujícím způsobem:, PCNA . fragment EcoRV-HindlII pocházející- ž PCRITPCNA je.' vložen na- úrovni místa EcoRV-HindlII pET-29’. Tento •plazmid · ·'· se · -poté .'použije -pro produkci · chimérického- y\ , rekombinantního proteinu S-PCNA., Kroky transformace, produkce a purifikace S-PCNA jsou totožné s kroky použitými pro .produkci' antigenu Ki fúzovaného s-epitopem myc. 13.2) Studie interakce GAX sPCNA in .vitro ...
Tato' studie_ se prováděla podle' stejně metody použité v příkladu , 9 pro studování interakce mezi rekombinantními proteiny GST-GAX a SmycKi. Stoupající množství .rekombinantního.' GST a chiméry GST-GAX '(50, 250, 500 a 750 ng) se separovaly'. ria 14% denaturačním polyakrylamidovém' gelu (Novex).. Proteiny jso.u přenesené z·, gelu na nitrocelulózovou membránu, tato membrána je pak inkubována v roztoku' obsahujícím ' rekombinantní protein S-PCNA, pak .následuje imunologické značení PCNA pomocí morioklonální protilátky anti-PCNA (Santa Cruz) . ·' » F ♦· ·
I fr · · · · · * t · · » ««O Q • ···«·* »····♦ • · ♦ · · «»« · ·· ·
- 57 I l
Obrázek 7 ukazuje slabou interakci mezi GST a PCNA pouze ve vysokých dávkách GST (500 a 750 ng) . Afinita GST-GAX ,k PCNA je podstatně větší než afinita GST.
Tato specifická interakce mezi GAX a PCNA svědčí pro to, že antiproliferační aktivita GAX je zprostředkována sekvestrací (maskováním) PCNA. Fakt, že Ki může interagovat .jak s GAX tak s PCNA, je ve prospěch tvorby dvoj- nebo trojdílných komplexů, které mohou hrát hlavni, roli (aktivaci nebo inhibici) v buněčném cyklu.
V1
4.4 · · 4
4 4 4 * ♦··♦ 4 · • 4 » · ·
44 4 · 4 · • 9 * • ·· 9 · a 9 o •·♦ 4«·
4
4 4·
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
{A} DÉLKA:. 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina . ' (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: 'CDNA ' '(i i i) HYPOTETICKÁ:'ne . , .
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi). POPIS SEKVENCE:'SEKVENCE S' IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
CTATTCGATG ATGAAGATÁC CCC 23 (2)' INFORMACE-PRÍ>;OEKyEŇOí/S -IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2: .
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ' .(A) DÉLKA: 50 párů ba.zí ' (B) TYP: ..nukleová kyselina ;(C). TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ' (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne ' ' (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
GATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGCTGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC 50 « · · v v
U · * Φ *' « · O Q 9 6 * • ···· · · · ·♦· • · · · · ··· · ·· * *« ·*
- 59 (2) INFORMACE PRO: SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
. (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 53 párů baží (B) ' TYP: nukleová kyselina (C) TYP -VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)'TYP MOLEKULY: cDNA . . (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (xi) POPIS SEKVENCE:· SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTCT GCTCCATAAG
CTT .53
..(2)- INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(Ϊ)-CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP:, nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:' jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) T.YP MOLEKULY: cDNA ' (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne ' (xi)- POPIS -SEKVENCE: SEKVENCE Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:·
CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG / - 25
| 1 | - 60 - | « • b • • * • b b | • ·» b b b b >9 Q 9 b >····* « b e b b b · · ’ |
| 4 2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: | ČÍSLEM 5: | ||
| (A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché 1 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ:· ne ' | - |
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne _ (xi) POPIS.SEKVENCE: SEKVENCE S'IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM/6 V '2''· ' : (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: · · .
(A) DÉLKA: 3.0 párů baží . ' z - (B) TYP: nukleová kyselina i ' · ' · ' (C) TYP VLÁKNA: jednoduché - - (D) TOPOLOGIE; lineární · ' (íi) TYP MOLEKULY: cDNA . ' -v (iii) HYPOTETICKÁ: ne í · (iv) ' OPAČNÁ ORIENTACE: .ne .
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
GAGCGAATTC ATGACCATGA CCCTTCACAC
W * - iii « *
4
4 4 • 4 ··* • 4 β 9 ·
*. *···
- 61 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů baží .
(B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché · (D) TOPOLOGIE: lineární .
(ii) TYP MOLEKULY:' cDNA ' (iii) HYPOTETICKÁ: ne ' (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne . . ...
(xi) POPIS SEKVENCE:. SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCE 5 IDENTIFIKAČNÍM. ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTER!STJKA'-SEKVENCE·':' · (A) DÉLKA: 60 párů baží · (B) TYP: nukleová kyselina (O- TYP VLÁKNA: dvojité^'/ ··-' ). ..... ' (D). TOPOLOGIE: lineární .
(ii) TYP MOLEKULY: cDNA ;
(iii) HYPOTETICKÁ: ne. ’ ' ’ (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne - ;
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE.S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
TCGAGAGGTC ATATTGACCT-AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCCTCCGAC TGCCATATGT /
CTCCAG TAŤAACTGGA' TŤCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG.ACGGTATACAGATC
Claims (5)
- PATENTOVÉ - .NÁROKY1. Polypeptid, který je fragmentem lidského proteinu GAX obsahujícím alespoň aminokyselinové zbytky 1 až 32 proteinu GAX, a který projevuje transkripční represorovou 'aktivitu a/nebo pozitivně či -negativně, ovlivňuje replikaci DNA.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje dále alespoň aminokyselinové zbytky 140;až 230 lidského proteinu GAX.
- 3. Polypeptid, který obsahuje alespoň jeden-fragment vybraný z fragmentů zahrnujících úseky aminokyselin 1 až 32, 33 až302 a 1 až 104 lidského, proteinu GAX, a-.který projevujetranskripční represorovou aktivitu a/nebo pozitivně' ‘'či negativně ovlivňuje replikaci DNA.’4-. Polypeptid, k.terý obsahuje alespoň jeden .fragment vybraný ’· z fragmentů zahrnuj ících úseky aminokyselin 1 až, 32 . a 104 až , 22.3,- proteinu.. GAX, a který je, schopen interakce s proteinem Ki.5. Polypeptid podle, kteréhokoliv z nároků. 1 až 3, který je schopen interakce s' PCNA. ‘ .6. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3,- který'je schopen- .interakce s Ki a/nebo PCNA, a který tvoří s těmito ' proteiny alespoň bipartitní nebo alespoň tripartitní komplex.« « ·· · 9« ** • · · «·· · · · · • « · 4··« ♦ · · ♦ » »ai« · ♦ * ···· * ··· ··· • · » i « · · **« · ·· · · ··7·. Polypeptid, který obsahuje kromě frágmentu proteinu GAX, který projevuje transkripční represorovou' aktivitu, také alespoň jeden fragment jiného původu,8 . „Polypeptid podle nároku 7-, kde fragment j iného ’ původu má biologickou.aktivitu nebo má funkci značky - (markér) nebo je to prvek umožňující' zacílení. .:.-9, Nuklěová kyselina,' -která kóduje polypeptid podle ·. kteréhokoliv ž nároků 1 až 7.10. -Nuklěová kyselina podle nároku 9, která je DNA.11. ; Expresní kazeta, která' obsahuje nukleovou kyselinu podle ,y/·· nároku 9 ^nebo 10 řízenou promotorem.12. Expresní, vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle '•-'A·. 'náróku ?9· nebo 10 nebo expresní kazetu podle nároku 11.· , ' 1 I-13.-Vektor podle nároku 12, který je virový vektor.1 f '14. Vektor podle nároku 13, který je adenovirus.15. Vektor, podle nároku 13, který je re.trovirus.16. Použiti polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro potlačení (represi) transkripce 'genů a/nebo pro pozitivní či, negativní ovlivnění- replikace DNA. .Ij MMIiMU* <111 • 9
- 4« ·4 · 4B ···♦ «9' ·44« 4 • »4 · · » ··· 4 • ·9« ♦ · • - · · 9 • «4 ·9 ·4· «9«9 « * - .• · - 64 17. Použití sloučeniny inhibující aktivitu proteinu Ki a/nebo , PCNA pro získání léčiva určeného pro inhibici proliferace buněk hladké svalové tkáně.18. Použití pólypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1. až 7 -. pro vytvoření bipartitního· nebo tripartitního komplexu'', s proteinem Ki a/nebo PCNA a, pro pozitivní či negativní,. ..ovlivnění průběhu buněčného . cyklu. ,19/ Farmaceutický přípravek 'Vyznačující- se t i m, že obsahuje alespoň jeden polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15. i. -· . /Způsob vyhledávání a/nebo identifikace polypept-iďu reagujícího s proteinem GAX- nebo doménou proteinu GAX, . : ,.' /<-.· .ý y-.z^.n ;a dující, se tím, že se použije
- 7?r’-ý'poíypěptiď:podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.21. < Způsob podle- 'nároku 20 vyznačující'·' se ť í m, že se polypeptid vybere z fragmentů zahrnujících .aminokyselinové zbytky 1 až 32 a- 33 až 302 proteinu GAX.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9612730A FR2754822B1 (fr) | 1996-10-18 | 1996-10-18 | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ131899A3 true CZ131899A3 (cs) | 1999-07-14 |
Family
ID=9496803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ991318A CZ131899A3 (cs) | 1996-10-18 | 1997-10-16 | Polypeptidy obsahující domény proteinu GAX, které se účastní represe transkripce, odpovídající nukleové kyseliny a jejich použití |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6121005A (cs) |
| EP (1) | EP0941243A1 (cs) |
| JP (1) | JP2001503615A (cs) |
| KR (1) | KR20000049249A (cs) |
| CN (1) | CN1237980A (cs) |
| AP (1) | AP9901510A0 (cs) |
| AU (1) | AU741586B2 (cs) |
| BG (1) | BG63548B1 (cs) |
| BR (1) | BR9711947A (cs) |
| CA (1) | CA2268045A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ131899A3 (cs) |
| EA (1) | EA003694B1 (cs) |
| FR (1) | FR2754822B1 (cs) |
| HU (1) | HUP9903956A3 (cs) |
| IL (1) | IL129478A0 (cs) |
| NO (1) | NO991830L (cs) |
| NZ (1) | NZ335283A (cs) |
| OA (1) | OA11034A (cs) |
| PL (1) | PL332874A1 (cs) |
| SK (1) | SK51199A3 (cs) |
| WO (1) | WO1998017686A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA979390B (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001289652A1 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-08 | Aventis Pharma S.A. | Compositions and methods for regulating the cell cycle using a ki gene or polypeptide |
| US8124598B2 (en) | 2006-09-14 | 2012-02-28 | Sharon Sageman | 7-keto DHEA for psychiatric use |
| US20100160274A1 (en) * | 2007-09-07 | 2010-06-24 | Sharon Sageman | 7-KETO DHEA for Psychiatric Use |
| JP2013522169A (ja) * | 2010-02-24 | 2013-06-13 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | 炎症および好中球減少症の処置のための化合物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
| US5554181A (en) * | 1994-05-04 | 1996-09-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Stent |
| GB9422175D0 (en) * | 1994-11-03 | 1994-12-21 | Univ Dundee | Indentification of the p21 waf1-pcna interaction site and therapeutic applications thereof |
| FR2732357B1 (fr) * | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| FR2740344B1 (fr) * | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
-
1996
- 1996-10-18 FR FR9612730A patent/FR2754822B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-15 US US08/950,860 patent/US6121005A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-16 HU HU9903956A patent/HUP9903956A3/hu unknown
- 1997-10-16 BR BR9711947A patent/BR9711947A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 CN CN97199823A patent/CN1237980A/zh active Pending
- 1997-10-16 PL PL97332874A patent/PL332874A1/xx unknown
- 1997-10-16 EP EP97911277A patent/EP0941243A1/fr not_active Withdrawn
- 1997-10-16 AP APAP/P/1999/001510A patent/AP9901510A0/en unknown
- 1997-10-16 KR KR1019990703354A patent/KR20000049249A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 IL IL12947897A patent/IL129478A0/xx unknown
- 1997-10-16 NZ NZ335283A patent/NZ335283A/en unknown
- 1997-10-16 JP JP51902498A patent/JP2001503615A/ja active Pending
- 1997-10-16 EA EA199900387A patent/EA003694B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-10-16 CA CA002268045A patent/CA2268045A1/fr not_active Abandoned
- 1997-10-16 AU AU48713/97A patent/AU741586B2/en not_active Ceased
- 1997-10-16 WO PCT/FR1997/001850 patent/WO1998017686A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1997-10-16 SK SK511-99A patent/SK51199A3/sk unknown
- 1997-10-16 CZ CZ991318A patent/CZ131899A3/cs unknown
- 1997-10-20 ZA ZA9709390A patent/ZA979390B/xx unknown
-
1999
- 1999-04-16 NO NO991830A patent/NO991830L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-04-16 BG BG103342A patent/BG63548B1/bg unknown
- 1999-04-16 OA OA9900083A patent/OA11034A/fr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BG103342A (en) | 2000-05-31 |
| FR2754822B1 (fr) | 1998-11-27 |
| EP0941243A1 (fr) | 1999-09-15 |
| EA199900387A1 (ru) | 1999-10-28 |
| JP2001503615A (ja) | 2001-03-21 |
| NO991830D0 (no) | 1999-04-16 |
| FR2754822A1 (fr) | 1998-04-24 |
| KR20000049249A (ko) | 2000-07-25 |
| US6121005A (en) | 2000-09-19 |
| AP9901510A0 (en) | 1999-06-30 |
| BR9711947A (pt) | 1999-08-24 |
| CA2268045A1 (fr) | 1998-04-30 |
| HUP9903956A3 (en) | 2002-01-28 |
| OA11034A (fr) | 2003-03-06 |
| AU4871397A (en) | 1998-05-15 |
| SK51199A3 (en) | 2000-04-10 |
| PL332874A1 (en) | 1999-10-25 |
| HUP9903956A2 (hu) | 2000-03-28 |
| IL129478A0 (en) | 2000-02-29 |
| CN1237980A (zh) | 1999-12-08 |
| AU741586B2 (en) | 2001-12-06 |
| NZ335283A (en) | 2001-02-23 |
| EA003694B1 (ru) | 2003-08-28 |
| NO991830L (no) | 1999-06-16 |
| BG63548B1 (bg) | 2002-04-30 |
| ZA979390B (en) | 1998-05-12 |
| WO1998017686A1 (fr) | 1998-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6090618A (en) | DNA constructs and viral vectors comprising a smooth muscle promoter | |
| KR100304033B1 (ko) | 세포증식질환치료용약제학적조성물 | |
| AU749467B2 (en) | Compositions and methods for inducing gene expression | |
| Gupta et al. | Transcription enhancer factor 1 interacts with a basic helix-loop-helix zipper protein, Max, for positive regulation of cardiac α-myosin heavy-chain gene expression | |
| RU2214280C2 (ru) | Способы и компоненты индукции опухоль-специфической цитотоксичности | |
| US7772367B2 (en) | C-terminal p53 palindromic peptide that induces apoptosis of cells with aberrant p53 and uses thereof | |
| CA2216878A1 (en) | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis | |
| KR20220044811A (ko) | Crispr/cas13을 사용하는 표적화된 트랜스-이어맞추기 | |
| JPH11503011A (ja) | 条件発現系 | |
| CZ131899A3 (cs) | Polypeptidy obsahující domény proteinu GAX, které se účastní represe transkripce, odpovídající nukleové kyseliny a jejich použití | |
| US5786171A (en) | Aortic preferentially expressed gene and uses thereof | |
| JP2000512491A (ja) | 細胞の腫瘍抑制因子の状態を決定するための方法および構成物 | |
| EP0846761A1 (en) | A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof | |
| JPH09510343A (ja) | 新規な腫瘍抑制遺伝子 | |
| US6544948B1 (en) | ΔP62, variants thereof, amino acid sequences coding therefor and their uses in gene therapy for cancer | |
| US5861307A (en) | Human s-myc-like polypeptide and a gene coding for said polypeptide | |
| MXPA99003470A (en) | Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use | |
| JP2002509433A (ja) | 心筋および骨格筋に特異的な核酸、ならびにその製造方法および使用 | |
| AU3981899A (en) | A single gene encoding aortic-specific and striated-specific muscle cell isoforms, its regulatory sequences and uses thereof | |
| WO2000060083A1 (en) | Novel protein associated with cell stress response | |
| MXPA97008877A (en) | P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy | |
| CA2268457A1 (en) | Mammalian rad1 genes, polypeptides and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |