OA11034A - Polypeptides comprenant des domaines de la protéine gax impliqués dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'aoutres protéines acides nucleiques correspondants et leurs utilisations - Google Patents

Description

1 011034

La présente invention concerne le domaine thérapeutique. Elleconcerne plus particuliérement de nouvelles molécules thérapeutiques et leurutilisation pour le traitement de pathologies cardio-vasculaires.

La resténose post-angioplastie est un désordre hyperprolifératif localisé qui sedéveloppe consécutivement à une intervention non chirurgicale au niveau de la plaqued'athérosclérose. Ainsi, le traitement d'une lésion athéroscléreuse par angioplastierésulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en uneresténose consécutive à la blessure mécanique dè la paroi artérielle.

La prolifération des cellules musculaires lisses (CML) dans la paroi vasculaireest un événement clé dans le développement de l'athérosclérose, dans la resténoseaprès angioplastie ainsi que dans l'échec des pontages coronariens. Les CML sontnormalement quiescentes dans la paroi vasculaire mais, à la suite d'une lésiondétruisant l'endothélium vasculaire, elles se retrouvent au contact des facteurs decroissance sanguins. Contrairement aux cardiomyocites et aux cellules du musclesquelettique, les CML peuvent, en réponse à divers facteurs de croissance, sedédifférencier et réenclencher de'nouveau leur cycle prolifératif. Ces modificationsphénotypiques des CML résultent de profonds changements au niveau de l’expressionde nombreux gènes. A titre d’exemple l’expression de gènes précoces, impliqués dansla prolifération cellulaire tels que c-fos ou c-myc, se voit remarquablement augmentéealors que l'expression d'autres gènes de structure tel que l'alpha-actine muscle lissespécifique ainsi que certains isoformes de la myosine subit une régulation négative.

Bien qu'il soit clairement établi que la différenciation terminale des cellulesmusculaires squelettiques est régulée par des facteurs transcriptionnels ditsmyogéniques tels que Myo-D, très peu de facteurs impliqués dans la différenciationréversible des CML sont connus à ce jour. Des études récentes ont révélé l'existencede facteurs transcriptionnels possédant une homéo-boite dans différents tissus dusystème cardio-vasculaire. De tels facteurs, reconnaissent grâce à leur homéo-boite,des séquences d'ADN spécifiques dans les régions promotrices de leur gènes cible etinterviennent ainsi dans la régulation de la différenciation, de la prolifération ou de lamigration cellulaire. L’un de ces facteurs gax (Growth-Arrest-Specific Homeobox) estexprimé dans différents tissus cardio-vasculaires dont les CML de la paroi vasculaire.Le gène gax a été initialement identifié à partir d'une banque d'ADNc d'aorte de rat. Ilcode pour une protéine de 303 acides aminés. Sa séquence a été caractérisée et son 2 011034 cDNA cloné (Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). Le gène gax humaina également été clone et sequence (David F. Le Page et al.,Genomics 1994,24,535-540). Il code pour une proteine de 302 acide amines. Le gène gax possède certainespropriétés similaires aux gènes gas et Gadd puisqu'il semble également contrôler la 5 transition G0/G1 du cycle cellulaire. Ainsi les niveaux d'ARNm de gax sont réduitsdans les CMLV de rat d'un facteur 10 après deux heures d'exposition au PDGF(Gorski et al., Mol.Cell.Biol. 1993, 6, 3722-3733). L'expression du gène gax est doncréprimée au cours de la réponse mitogénique des CMLV. Une autre caractéristique dugène gax réside dans sa spécificité d'expression. En effet, chez le rat adulte, le gène 10 gax est essentiellement exprimé dans le système cardiovasculaire (aorte, coeur). Laprésence d'ARNm de gax n'a pas été mise en évidence par Northern Blot dans le foie,le cerveau, l'estomac et le muscle squelettique. Par ailleurs, le gène gax appartient à lafamille des gènes homéotiques. Ces gènes codent pour des facteurs transcriptionnelsqui contiennent des séquences consensus (ou homéodomaines) reconnaissant des 15 régions spécifiques de l'ADN (ou homéoboîtes) (revue : Gehring et al. Cell, 78 : 211-223, 1994). L'homéodomaine de la protéine gax de rat est compris entre les acidesaminés 185 et 245. De manière intéressante, les gènes homéotiques identifiés à ce joursont impliqués dans le contrôle de la différenciation/croissance cellulaire au cours del'embryogénèse ce qui renforce le potentiel thérapeutique du gène gax (revue : 20 Lawrence et Morata Cell 78 : 181-189, 1994; Krumlauf, Cell 78 : 191-201, 1994). L’une des caractéristique de GAX est qu il subit une régulation négative dèsque les CML prolifèrent que ce soit in vitro en réponse à des facteurs de croissance ouin vivo à la suite d'une lésion de l'endothélium de la paroi vasculaire. Cette répressionest réversible car lorsque les CML sont rendues quiescentes par déprivation en sérum, 25 in vitro, l'expression de GAX reprend. Des travaux de notre laboratoire ont récemmentmontré que la surexpression de GAX dans des CML par un vecteur adénoviral bloqueleur prolifération FR 95/04234(ST95022).

La resténose post-angioplastie consécutive à la blessure mécanique représentele facteur d échec le plus fréquent (50% des cas dans certaines études). La 30 prolifération des CML étant un élément clé de ce phénomène, connaissant son rôlerégulateur de la prolifération de GAX, ce dernier apparaît comme un gènethérapeutique de choix pour le traitement préventif de la paroi vasculaire aprèsangioplastie FR 95/04234(ST95022).

Toutefois, le mécanisme d'action de GAX demeure, cependant, très peu 35 documenté. Il demeure à identifier des séquences d'ADN cibles de l'homéo-boite de 3 θΠ034 GAX. De plus une étude de la fonction des différents domaines de GAX n a pas, à cejour, été réalisée. L’identification de partenaires fonctionnels de GAX constitue enfinune facette importante qui permettra de définir la cascade moléculaire dont dépendGAX ou dont il est à la source.

La présente invention a précisément pour intérêt d'apporter des informationssur ces points.

Au cours de ce travail , différentes approches analytiques ont étéadopté pour identifier des molécules interagissant avec GAX, pour déterminer le domaine de GAX nécessaire à cette interaction et pour étudier l'importance des < différents domaines dans la fonction de GAX. Pour ce faire, le système double hybridea été utilisé afin de caractériser des protéines interagissant avec GAX à partir d'unebanque de poumon humain.

Cette approche a permis d'identifier différentes molécules dont une, l'antigèneKi, est particulièrement intéressante. L’antigène Ki est une protéine d’environ 32KDa. Elle a été identifié pour la première fois comme un autoantigène nucléairereconnu par des sera provenant de patients atteints de lupus érythémateux (Nikaido etal. 1989, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79, 209-214). Des travaux récents ont montréque Ki est surexprimée dans des cellules en prolifération ou transformées par unoncogène (Nikaido et al. 1989, Exp. Cell Res. 1989,182,284-289). Des expériencesde coimmunoprécipitation ( Takeushi et al. abstract 1995 Juntendo University, Tokyo,Japan) ont montré que Ki existe sous forme d’un complexe avec PCNA un marqueurde prolifération (Almendral et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84,1575-1579)..

La fonction de GAX a été également étudiée dans des expériences detransfection transitoire de cellules de mammifères en utilisant GAX fusionnée à undomaine de liaison à l'ADN hétérologue et un système de gène reporter permettant derenseigner sur l'activité transcriptionnelle de GAX après délétion de différentesrégions de la molécule. Il a ainsi été montré que GAX agit essentiellement comme unrépresseur de la transcription. Cette activité de répression est liée plusparticulièrement aux 32 premiers acides aminés de GAX. De plus, ce domainerépresseur est localisé dans la région (1-222) de GAX requise pour l’interaction avecKi dans la levure. Les applications potentielles du caractère répresseur de GAX et deson interaction avec Ki seront développées ci-après. 4 . 011034

Un premier aspect de l’invention concerne donc des fragments de la proteineGAX douées de propriétés biologiques.

Un autre aspect de l’invention concerne des domaines de GAX impliqués dansl’activité biologique de GAX. Il peut s’agir notamment de domaines impliqués dansl’interaction de GAX avec d’autres molécules ou de domaines responsables d’uneactivité biologique. L’invention concerne également des molécules chimériquescomprenant un domaine fonctionnel de GAX. Elle concerne également l’utilisation deGAX pour réprimer l’expression de gènes, ainsi que l’utilisation de composés inhibantl’interaction de GAX avec certains partenaires1 cellulaires pour moduler l’activité deGAX. Elle concerne également une méthode pour le criblage et/ou l’identification departenaires cellulaires de GAX.

Comme indiqué ci-avant, le gène gax possède des propriétés particulièrementavantageuses pour des applications de thérapie génique des désordreshyperprolifératifs, notamment de la resténose ou d’autres pathologies associées a uneprolifération des CML. Il a été démontré dans la demande FR95/04234 (ST95022)que le transfert du gène gax in vivo permet de réduire considérablement laprolifération des CML, et ainsi, d’inhiber la réduction du diamètre luminal. Il aégalement été montré dans la demande FR 95/12871 (ST95057) que le gène gax,exprimé dans des cellules tumorales, permettait de s’opposer au processus detransformation cellulaire. Ces différents éléments démontrent le potentiel du gène gaxpour des approches thérapeutiques.

La présente demande décrit maintenant l’identification de domainesfonctionnels de GAX, la construction de dérivés de GAX présentant une activitébiologique, l’identification de partenaires de la proteine GAX et la mise au point deméthodes permettant la recherche d’autres partenaires et l’identification de composéscapables d’interagir sur l’activité de ces partenaires. Plus précisément, lademanderesse a maintenant montré que la proteine GAX était douée d’activitérepresseur de la transcription. Elle a également montré que cette activité était portéepar certaines régions de la protéine GAX, en particulier la région N-terminale. Lesrésultats présentés dans les exemples montrent en outre que les domaines fonctionnelsde GAX sont également impliqués dans l’interaction de GAX avec une proteinecellulaire, Ki. Il est connu dans la littérature Ki intéragit avec PCNA (Takeushi et al.abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) et que celui ci est un cofacteur 5 011034 indispensable à l’ADN polymérase pour la réplication de l’ADN (Fukuda et al. 1995, J. Biol. Chem. 270, 22527-22534).11 a été démontré dans les exemples que Gaxinteragit avec PCNA, ainsi il est envisageable que GAX puisse également êtreimpliquée dans des complexes réplicatifs dans la cellule.

Un premier objet de l’invention concerne plus particulièrement un polypeptidecaractérisé en ce qu’il s’agit en tout ou partie d’un fragment de la proteine GAXpossédant une activité de represseur de la transcription et/ou affectant positivement ounégativement la réplication de l’ADN.

Plus preferentiellement, le polypeptide selon l’invention comprend au moins lesrésidus 1 à 32 de la proteine GAX humaine.

Selon une autre mode de réalisation, le polypeptide selon l’invention comprendau moins les résidus 104 à 230 de la proteine GAX humaine. A titre d’exemples particuliers de polypeptides selon l’invention, on peut citerles polypeptides comprenant les fragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la proteine GAXhumaine. Les exemples présentés plus loin montrent que de tels polypeptides sontcapables d’inhiber la transcription de gènes et conservent donc les propriétés derepresseur transcriptionnel de GAX.

Plus préférentiellement, ce polypeptide comprend, outre un fragment de laproteine GAX conforme à la présente invention, un fragment d’origine differente. Onentend par fragment d’origine differente un fragment polypeptidique non-issu de laproteine GAX. 11 peut s’agir d’un fragment synthétique, artificiel, d’un fragment deproteine, etc. Ce fragment d’origine differente peut avoir differentes fonctions.

Il peut par exemple constituer un marqueur permettant de détecter lepolypeptide et eventuellement de le tracer in vivo. Un tel marqueur peut être parexemple un épitope reconnu par un anticorps monoclonal. A cet egard, differentessequences de marquage, dites sequences Tag, ont été décrites dans la littérature et sonthabituellement utilisées. On peut mentionner la sequence tag-myc.

Ce fragment peut également être un fragment ayant la propriété de stabiliser lepolypeptide. Il peut s’agir à cet effet de tout ou partie d’une protéine ayant une demi-vie plasmatique élevée. 6 011

Enfin, il peut également s'agir d'un élément de ciblage, permettant aupolypeptide d’atteindre plus rapidement et/ou plus spécifiquement des compartimentscellulaires particuliers. Avantageusement, il s’agit d’un signal de localisation nucléaire(NLS), le polypeptide exerçant principalement son activité dans le noyau des cellules.Differents signaux NLS ont été décrits dans la littérature comme par exemple celui del’antigène T du virus SV40, celui de p53 etc..

Le fragment d’origine différente peut en outre conférer au polypeptide unefonction biologique supplémentaire ou favoriser l’activité du domaine represseur. A t titre d’exemple tout particulièrement avantageux, on peut citer un domaine protéiquecapable de lier l’ADN de maniéré spécifique. Ce type de molécule chimérique permetainsi de lier l’ADN en des régions particulières et d’inhiber la transcription de gèneslocalisés au niveau de ces régions. A titre d’exemple spécifiques on peut citer ledomaine de liaison a l’ADN de la protéine GAL4 de levure. De telles constructionssont décrites dans les exemples. Elles peuvent être utilisées pour réguler l’expressionde gènes chez la levure ou de gènes placés sous le contrôle d’un signal d’expressioncomprenant le site de liaison de la protéine GAIN. D’autres domaines protéiques deliaison à l’ADN peuvent être par exemple Lex A, le domaine de liaison à l’ADN d’unrécepteur nucléaire comme le récepteur aux oestrogènes ou tout autre membre decette famille, etc... Il peut également s’agir d’un peptide permettant d’une part lasécrétion de tout ou partie de GAX, ainsi que son ciblage vers des récepteursmembranaires permettant son internalisation et augmentant ainsi la diffusibilité et ledomaine d’activité de GAX par un effet de type “Bystander“. A ce titre on peut plusparticulièrement utiliser tout ou partie de la transferrine ou des fragment de moléculede la matrice extracellulaire pouvant reconnaître des intégrines à la surface des CML.

Les polypeptides selon l'invention sont particulièrement intéressants sur le planthérapeutique et celui de la recherche appliquée. L'activité thérapeutique des polypeptides revendiqués est liée plusparticulièrement à leur aptitude à réprimer la transcription ou à affecter la réplicationde l'ADN, par analogie avec la protéine GAX et donc à leur conférer un pouvoir deréguler l'expression d'autres protéines. 7 011034

Dans cette perspective, la présente invention vise également l'utilisation de laprotéine GAX ou d'un fragment tel que revendiqué pour réprimer la transcription degène et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN.

En raison de cette analogie de comportement avec la protéine GAX, cesfragments peuvent avantageusement lui être substitué dans sa fonction de répresseurde transcription. Par ailleurs, compte-tenu du fait qu'ils ne comprennent de la protéineGAX que tout ou partie de son domaine impliquée dans la répression de transcription,on peut penser qu'ils seront moins sensibles aux différentes altérations auxquelles est t sujette la protéine GAX. Ces polypeptides en tant que tels ou des dérivés peuventdonc manifester un caractère répresseur de la transcription accrue comparativement àcelui de la protéine GAX naturelle.

On peut également envisager de les utiliser afin d'identifier de nouveauxpartenaires de la protéine GAX. A cet égard la présente invention a également pourobjet un procédé pour le criblage et/ou l’identification de polypeptides interagissantavec la proteine GAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre unpolypeptide selon l'invention. Plus préférentiellement ce polypeptide est choisi parmiles fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX. A ce titre, la demanderesse a montré de manière inattendue qu'un domaine dela protéine GAX pouvait interagir de manière spécifique avec une autre protéinecellulaire, la protéine Ki. Comme explicité précédemment, Ki est un autoantigène quiapparaît lors de maladies auto-immune comme le lupus érythémateux. Elle est décritecomme une molécule nucléaire dont l'expression augmente au cours de la proliférationcellulaire ainsi que dans des fibroblastes transformés par un oncogène.

Nous avons pu montrer que, dans la levure, la partie N-terminale de GAX estnécessaire pour l'interaction avec Ki. La protéine recombinante Ki reconnaîtspécifiquement GAX transféré sur un filtre de nitrocellulose à partir d'un gel depolyacrylamide dénaturant.

La présente invention vise également précisément un polypeptide caractérisé ence qu'il s'agit d'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec la protéineKi. 8 011034

Plus préférentiellement, il s'agit du fragment 1 à 32 ou 104 à 223 de la protéine GAX.

La demanderesse a également montré de manière très inattendue qu'undomaine de la protéine GAX pouvait interagir de manière spécifique avec le marqueurde prolifération PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Ce facteur estindispensable à la réplication de l'ADN et joue également un rôle dans les phénomènesde réparation de l'ADN.

La présente invention concerne donc un polypeptide caractérisé en ce qu'ils'agit d'un fragment de la protéine GAX, capable d'interagir avec PCNA.

Par ailleurs, il a été décrit dans la littéraure que Ki existait sous forme d'un complexeavec PCNA. Ki peut donc interaragir à la fois avec GAX et PCNA en formant uncomplexe au moins bipartite avec l'une ou l'autre de ces protéines et de préférence uncomplexe tripartite. La formation de ces complexes a un rôle important dans laprogression du cycle cellulaire (activation ou inhibition).

Ainsi, la présente invention vise également un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agitd'un fragment de la protéine GAX capable d'interagir avec Ki et/ou PCNA et deformer un complexe au moins bipartite ou au moins tripartite avec ces protéines.

Lin autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codantpour un polypeptide tel que defini ci-avant. Il peut s'agir de séquences d'originenaturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, deséquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Cet acidenucléique peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc. Ilpeut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment parcriblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtesincluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblagede banques. Ils peuvent par ailleurs être incorporés dans des vecteurs, tels que desvecteurs plasmidiques.

Avantageusement, l’acide nucléique selon l’invention est un ADNc.

Les acides nucléiques de l’invention peuvent etre utilises pour la production desondes ou de molécules antisens permettant, par hybridation, de detecter la présence 9 011034 ou l’expression d’acides nucléiques codant pour des polypeptides portant un domainerepresseur selon l’invention, ou d’inhiber l’expression de tels polypeptides. S’agissantde sondes, celles-ci comportent preferentiellement plus de 10 bases et,avantageusement, de 10 a 300 bases.

Les acides nucléiques de l’invention peuvent etre utilisés pour l'expressionet/ou la production de polypeptides in vitro, in vivo ou ex vivo, dans des approches dethérapie génique ou cellulaire. < A cet effet, la présente invention concerne des cassettes d'expression contenantun acide nucléique tel que défini ci-dessus, sous contrôle d'un promoteur permettantson expression.

Differents promoteurs peuvent etre utilises dans le cadre de l’invention. Ils’agit de sequences permettant l’expression d’un acide nucléique dans une cellulemammifère.

Le promoteur est avantageusement choisi parmi les promoteurs fonctionnelsdans les cellules humaines. Plus préférentiellement, il s'agit d'un promoteur permettantl'expression d'une séquence d’acide nucléique dans une cellule hyperproliférative(cancéreuse, resténose, etc). A cet égard, différents promoteurs peuvent être utilisés. Ilpeut ainsi s'agir de tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant latranscription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible.On peut citer notamment les séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux.Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellulecible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser en particulier de promoteursubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, alpha-actine, tubuline, DHFR etc), depromoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine,vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (parexemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), depromoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéineintestinale de liaison des acides gras, alpha-actine du muscle lisse, etc), des promoteurscellules spécifiques de type cellules en division comme les cellules cancéreuses ouencore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes,récepteur de l'acide rétinoïque, récepteur de glucocorticoïdes, etc) ou dits inductibles.De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que 10

par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteurprécoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régionspromotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, derégulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.

La présente invention fournit maintenant de nouveaux agents thérapeutiquespermettant, par leur aptitude à réprimer la transcription, d'interférer avec de nombreuxdysfonctionnements cellulaires. Dans ce but, les acides nucléiques ou cassettes selonl'invention peuvent être injectés tels quels au 'niveau du site à traiter, ou incubésdirectement avec les cellules à détruire ou traiter. Il a en effet été décrit que les acidesnucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention- utiliser un vecteurd'administration, permettant d'améliorer (i) l'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii)le ciblage et (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.

Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré de la présenteinvention l'acide nucléique ou la cassette est incorporé(e) dans un vecteurd'expression. Le vecteur utilisé peut être d'origine chimique (liposome, nanoparticule,complexe peptidique, lipides ou polymères cationiques, etc) virale (rétrovirus,Adénovirus, virus de l'herpès, AAV, virus de la vaccine, etc) ou plasmidique. L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles detransfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser par exemple les adénovirus, lesherpès virus, les rétrovirus et les virus adéno associés. Ces vecteurs s'avèrentparticulièrement performants sur le plan de la transfection. A cet égard, un objetpréféré selon l'invention réside dans un rétrovirus recombinant défectif dont legénome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant. Un autre objetparticulier de l'invention réside dans un adénovirus recombinant défectif dont legénome comprend un acide nucléique tel que défini ci-avant.

Le vecteur selon l'invention peut également être un agent non viral capable depromouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des celluleseucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques, synthétiques ou naturels,représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour desraisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en cequi concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux 011034 11 fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir safixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le caséchéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique desacides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques. L'acide nucléique ou le vecteur utilisé dans la présente invention peut êtreformulé en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale,intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. Depréférence, l'acide nucléique ou le vecteur est utilisé sous une forme injectable. Il peutdonc être mélangé à tout véhicule pharmâceutiquement acceptable pour uneformulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site àtraiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou decompositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eaustérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différentsparamètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administrationutilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. L'invention concerne également toute composition pharmaceutiquecomprenant au moins un acide nucléique tel que défini ci-avant.

Elle concerne également toute composition pharmaceutique comprenant aumoins un vecteur tel que défini ci-avant.

En raison de leurs propriétés antiprolifératives, les compositionspharmaceutiques selon l'invention sont tout particulièrement adaptées pour le traitementdes désordres hyperprolifératifs, tels que notamment les cancers et la resténose. Laprésente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour ladestruction de cellules, notamment de cellules hyperprolifératives. Elle est ainsiapplicable à la destruction des cellules tumorales ou des cellules de muscle lisse de laparoi vasculaire (resténose). Elle est tout particulièrement appropriée au traitement descancers. A titre d'exemple, on peut citer les adénocarcinomes du colon, les cancers de lathyroïde, les carcinomes du poumon, les leucémies myéloïdes, les cancers colorectaux,les cancers du sein, les cancers du poumon, les cancers gastriques, les cancers del'oesophage, les lymphomes B, les cancers ovariens, les cancers de la vessie, lesglioblastomes, les hépatocarcinomes, les cancers des os, de la peau, du pancréas ou 12 011034 encore les cancers du rein et de la prostate, les cancers de l'oesophage, les cancers dularynx, les cancers tête et cou, les cancers ano-génitaux HPV positifs, les cancers dunasopharynx EBV positifs, etc.

Par ailleurs, la présente invention s'étend en outre à toute utilisation de composésinhibant l’activité de la proteine Ki et ou de PCNA pour inhiber la prolifération decellules musculaires lisses.

La présente invention concerne également l'utilisation de composés selon l'invention pour la formation d'un complexe bi- ou tri-partite avec les protéines Ki et/ou PCNA pour < affecter positivement ou négativement la progression du cycle cellulaire.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples etfigures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1 : Analyse par northern blotting de 1' expression de la protéine Ki a partir desmARNs extraits de différents tissus.

Figure 2 : Localisation nucléaire de KiHA dans des cellules transfectées par laméthode d'immunofluorescence.

Figures 3 : Interaction in vitro entre les protéines Ki et GAX A) bleu de coomassie B) Far Westren Blotting

Figure 4 : A) Représentation de la construction du gène Reporter exprimant lachloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d’unpromoteur artificiel. B) . Dosage de l’activité enzymatique CAT dans des extraits cellulairesaprès transfection avec des vecteurs d'expression incorporant respectivement ER,GAL VP 16 et ER-GAL VP 16.

Figure 5: Comparaison de constructions de différents mutants de délétion de GAX parrapport à la protéine GAX en entier 1-302. 13 011034

Figures 6: Dosage de l'activité enzymatique CAT avec différentes chimères GAL-GAX

A) Sans activateur ER

B) en présence d'activateur ER

Figure 7 : Interaction entre GST-GAX et PCNA.

MATERIEL et METHODES

A) MATERIEL 1) Souche de levure utilisée:

La souche YCM79 du genre S.cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, cide2-101, lys2-801, trp 1-901, Ieu2-3,1I2, canl, gal4-542, gal80-538, met T6::URA3-pGAL 1/10-LacZ, HIS3::GAL7BLE) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusionde poumon par le système deux hybrides.

Elle est cultivée sur les milieux de culture suivants:.

Milieu YPD complet: -Extrait de levures (1 Og/1) (Difco) -Bactopeptone (20g/l) (Difco) -Glucose (20g/l) (Merck)

Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d’agar (Difco).

Milieu YNB minimum:-Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco) - Glucose (20g/l) (Merck)

Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d’agar (Difco).

Pour permettre la croissance des levures auxotrophes sur ce milieu, il est nécessaired’y ajouter les acides aminés ou les bases azotées, pour lesquelles elles sontdépendantes à 50mg/ml. 2) Souches de bactéries utilisées :

La souche TGI d’Escherichia coli de génotype supE, hsdD5, thi, D(lac-proAB), F’[traD36 pro A+B+ lacl^ lacZDM15] a été employée comme moyen d’amplification etd’isolement de plasmides recombinants utilisés. 14 011034

Pour la production de protéines recombinantes, les bactéries E.coli utilisées sont lesBL-21 obtenues chez Pharmacia. E.coli . Elles possèdent le génotype F' ompT hsdSb(rb.mb) gai dcm (DE3). BL-21 est une souche de choix pour la production de protéines recombinantes car ellene possède pas de protéase et sa membrane est fragile, facile à casser par simplesonication. E.coli BL-21 possède un système de répression de la T7 ARN polymérase.Cette répression peut être levée par l'IPTG ce qui permet le contrôle de gènes placésen aval du site de liaison de la T7 ARN polymérase. Les bactéries sont mises enculture dans 2 ml du milieu LB (NaCl 5 g/1, Tryptone 10 g/l, Extrait de levure 5 g/1)dans un agitateur à 37°C toute la nuit. 1 ml de cette préculture est remis en culturedans 50 ml du milieu 2xYT (NaCl 5 g/1, Tryptone 16 g/1, Extrait de levure 10 g/1) à37°C jusqu à ce que les bactéries atteignent une densité optique (D.O.) de 0,4 à 600nm (phase exponentielle de croissance). La culture des bactéries est refroidie sur laglace. Elles sont centrifugées à 3300 rpm pendant 20 mn.

Les bactéries E. Coli, compétentes pour la production des protéines recombinantes,sont préparées par la méthode du chlorure de calcium. Pour ce faire, les bactéries sontmises en solution dans 5 ml de CaC12 à 0,1 M. (1/10 de la culture). Elles sontcentrifugées à nouveau à 3300 rpm pendant 10 mn. Elles sont remises en solution dans1 ml de CaC12 0,1 M contenant 17,5 % de glycérol. Elles sont aliquotées et conservéesà - 80°C. 3) Plasmides mis en oeuvre:

Les plasmides mis en oeuvre sont: . Les vecteurs de la série pGBT et pAS, (Clontech),des plasmides navettes quipossèdent une origine de réplication bactérienne et de levure leur permettant de serépliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ces plasmidescontiennent un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour ledomaine de liaison à l’ADN de GAL4· et en amont d’un terminateur pour former uneprotéine de fusion. Ils contiennent également le gène TRP1 de S. cerevisiae qui permetde complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sur un milieuminimum ne contenant pas de tryptophane. Ces vecteurs portent le gène de résistance 15 011034 à l’ampiciîline qui permet de sélectionner les bactéries les possédant sur un milieucontenant de l’ampicilline. . Les vecteurs de la série pGAD, (Clontech) des vecteurs qui permettent l’expressionchez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et uneprotéine d’intérêt ou codée par l’ADNc provenant d’une banque de poumon, inséré auniveau d’un site EcoRI Xhol. . Les vecteurs de la série pET29 (Novagen) des vecteurs qui permettent l’expression de protéines recombinantes chez coli en fusion avec le tagS. { . Les vecteurs de la série pGEX (Pharmacia) des vecteurs qui permettent l’expressionde protéines recombinantes chez coli en fusion avec La Glutathione S-Transférase(GST). . Les vecteurs de la série Bluescript (Strata gène) des vecteurs permettant d’effectuerles clonages de même que la série des pIC (J. Lawrence Marsh et al. Gene, 1984, 32,481-485) et pMTL(Steve P. Chambers et al., Gene, 1998, 68, 139-149) . Le plasmide pGEX-2T-hGAX est le plasmide mis en oeuvre pour la transformationdes E. Coli BL-21. Ce plasmide a été obtenu à partir du plasmide pGEX-2T et a étéfourni par le Docteur K.Walsh de St. Elizabeth's Medical Center à Boston. Leplasmide pGEX-2T de base (Pharmacia) permet de produire la protéine GAXfusionnée à la Glutathion-S-Transférase (GST), protéine qui a une forte affinité pour leGlutathion. La fusion GST-GAX facilitera la purification de GAX par affinité sur desbilles d'agarose couplées au Gluthation. De plus, il existe un site de coupure par lathrombine qui permet ultérieurement de scinder la chimère entre GST et GAX.L'ADNc hGAX est inséré sous le contrôle du promoteur hybride tac et de l'opérateurlac. Le répresseur lacl en se fixant sur l'opérateur lac, empêche l'ARN polymérased'avancer. Cette répression est levée par un analogue du lactose, l'isopropyl-B-D-thiogalactoside (IPTG) qui s'associe avec lacl. Le complexe lacI-IPTG ne peut plus sefixer sur l'opérateur lac, l'ARN polymérase n'a donc plus d'obstacle. 4) Protéine Ki

Production et purification

Nous avons cloné le gène de la protéine Ki fusionné à un épitope myc dans le plasmidepET-29 (Novagen) à partir du plasmide pGAD contenu dans la levure. Le plasmide 16 011034 pET-29 produit la protéine fusionnée à l'épitope appelé S-Tag qui permet lapurification de Kl par affinité sur des billes d'agarose couplées à la S-protéine . Lachimère SmycKI est sous le contrôle du promoteur T7 et de 1 opérateur lac. Les BL-21 sont transformées par le plasmide pET-29- mycKI. Comme pour la protéine GST-GAX, elles sont mises en culture jusqu'à une D.O. de 0,7 à 600 nm. Puis, l'expressionde SmycKI est induite par 0,1 mM d'IPTG et par la T7 ARN polymérase produite parles BL-21. Les bactéries sont soniquées. Le surnageant est ensuite purifié par laméthode suivante. La purification de SmycKI se fait par affinité sur des billes d'agarosecouplées à la S-protéine. La méthode est la même que pour GST-GAX excepté que larésine est lavée dans une solution contenant 20 mM de Tris pH7,5, 0,15 M de NaCl et0,1% de Triton X-100. L'élution et la dialyse sont les mêmes que pour GST-GAX.

B) METHODES

Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire sont bien connuesde l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature [Maniatis T. etcoll., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring ITarbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y,, 1982; Ausubel F.M. et coll. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley &amp; Sons, New York, 1987], I). Le système double-hybride

Ce système est une méthode de clonage par interaction in vivo chez Saccharomycescerevisiae dont le principe est fondé sur la structure modulaire du facteurtranscriptionnel de levure GAIN (7). L'activateur de transcription GAL4 a deuxdomaines indépendants ayant des fonctions différentes. Le domaine de liaison à l'ADN(GALDB pour GAL DNA Binding) permet à GAIN de se fixer sur une séquencespécifique d'ADN au niveau de la région promotrice d'un gène. GAL4 se trouve alorsstériquement proche de la machinerie transcriptionnelle et grâce à son domainetransactivateur (GALTA), il augmente la fréquence avec laquelle la transcription estinitiée sur le gène adjacent, probablement par des interactions avec l'ARN polyméraseou des protéines associées. Le principe du système double-hybride consiste à fusionnerséparément GALDB et GALTA à deux protéines X et Y différentes qui, lorsqu'ellesinteragissent, reconstituent un complexe transcriptionnel actif. 17 2) Criblage des levures par la technique PCR (Polymerase Chain Reaction)

Le criblage a été fait directement sur les levures. Chaque colonie de levures est mise ensolution dans 10 μΐ d'eau contenant 0,08% de Tween 20. Le Tween est un détergentnon ionique qui permet d'augmenter la lyse des levures lors de la première étape dechauffage à 95°C. Pour les étapes ultérieures, le Tween 20 agit comme un agentprotecteur de la Taq ADN polymérase. La suspension de levures est complétée à un volume final de 20 μΐ contenant les quantités ou les concentrations finales suivantes : ( 10 picomoles d'amorce 1, 10 picomoles d'amorce 2, 1 unité de Taq ADN polymérase,75 mM de Tris pH9, 20 mM de (NH4)2SO4, 0,01% de Tween 20, 2,5 mM de MgC12et 125 μΜ de chacun des 4 désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP et dCTP). Àl'issue de la PCR, une fraction du mélange est analysée sur un gel d'agarose. On peutainsi savoir, pour un couple donné d'amorces et pour chaque clone de levure, s'il s'agitd'une séquence d'ADN déjà identifiée. 3) Préparation des ADNs plasmidiques.

Les grandes quantités d’ADN sont préparées en utilisant le Kit de préparation rapided’ADN de Proméga.

Les petites quantités d’ADN sont préparées de la manière suivante: les bactériescontenant le plasmide sont cultivées pendant au moins 4 heures dans 2ml de milieu LBdans un shaker à agitation. Elles sont ensuite centrifugées pendant 2 minutes à 14000rpm dans des tubes Ependorf, puis le culot est remis en suspension dans 100μ1 de lasolution I (50mM de glucose, 25mM de tampon Tris HCl pH8, lOmM EDTA pH8),lysées par 200μ1 de la solution II (0.2M de NaOH, 1% de SDS). La solution de lyseest ensuite neutralisée par 150μ1 de la solution III (3M d’acétate de potassium, 11.5%(v/v) d’acide acétique glacial). Après agitation des tubes jusqu’à obtenir un précipitéfloconneux, 150μ1 d’un mélange de phénol/Chloroforme (50% de phénol et 50% dechloroforme saturés en eau) sont ajoutés, et l’ensemble est agité 30 secondes. Laphase aqueuse contenant l’ADN est récupérée après centrifugation pendant 2 minutesà 14000 rpm. L’ADN est ensuite précipité par addition de 0,5 volume d’isopropanolpuis centrifugé 5 minutes à 14000 rpm et séché à l’air pour enfin être repris dans 20μ1 18 011034 de TE RNAse (solution de Tris-HCl lOmM et d’EDTA ImM avec 50μg/ml de RNAse). 4) Synthèse et Amplification enzymatique d’ADN ou PCR (Polymerase Chain

Reaction).

Les réactions de PCR sont effectuées dans un volume final de ΙΟΟμΙ en présence de lamatrice d’ADN, de dNTP (0,2mM), de tampon PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM,MgCl2 ImM, KC1 5 mM, gélatine 0,01%), de 0,5 μ g de chacun des oligonucléotideset de 2,5 UI d’Ampli Taq DNA polymérase (Perkin Elmer) avec ou sans formamide(5%). Le mélange est recouvert de 2 gouttes d’huile de paraffine pour limiterl’évaporation de l’échantillon. L’appareil utilisé est le “Crocodile 11“ d’Appli gène.Nous avons utilisé une température de dénaturation de la matrice de 90°C, unetempérature d’hybridation des oligonucléotides à la matrice inférieure de 5 à 10 degrésà la température de séparation des oligonucléotides et une température d’élongationpar l’enzyme à 72°C.

Les fragments obtenus par PCR, servant pour des clonages sont systématiquementresequencé une fois cloné, de manière à vérifier l’absence d’éventuelle mutationapparue lors de l’amplification.

Les oligodéoxynucléotides sont synthétisés chimiquement selon la méthode desphosphoramidites en utilisant des groupements protecteurs B-cyanoéthyles (Sinha1984). Après synthèse, les groupements protecteurs sont éliminés par traitement àl'ammoniaque et deux précipitations au butanol permettent de purifier et de concentrerles oligodéoxynucléotides (Sawadogo,1991). La concentration en ADN est déterminéepar mesure de la densité optique à 260 nm. 5) Ligatures

Toutes les réactions de ligature sont effectuées à +14°C pendant une nuit dans unvolume final de 10 μΐ en présence de 100 à 200 ng de vecteur, 0.5 à 2 pg d’insert, 40UI d’enzyme T4 DNA ligase (Biolabs) et un tampon de ligature (Tris-HCl 50 mM pH7,8; MgCl2 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 mM). Le témoin négatif est constitué par laligature du vecteur en l’absence d’insert. 19 011034

Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué le cas échéant avantligature par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d’E coli (Biolabs) selonles spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes esteffectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon lesrecommandations du fabricant. 6) Transformation des bactéries

La transformation des bactéries par un plasmide est effectuée selon le protocolesuivant : La totalité du volume de ligature (ΙΌμΙ) est utilisée pour transformer lesbactéries TGI rendues compétentes par la méthode de Chung et al, ( PNAS,1988 86,2172-2175).

Les bactéries TGI sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelquesheures dans une étuve à agitation à 37°C, jusqu’à obtenir une DO de 0,6 à 600nm. Lemilieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont renduescompétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSOzQcorrespondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à4°C pendant 30 à 60 minutes, 200μΐ de bactéries sont mises au contact des produits deligature pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 200μ1 de LB, les bactériessont incubées 30 mn à 37°C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.

7) Séparation et extraction des ADN

La séparation des ADN est réalisée en fonction de leur taille par électrophorèse. Pource faire; différents gels sont utilisés en fonction de la taille des fragments à séparer: -gel d’agarose à 1% (Gibco BRL) dans un tampon TBE (Tris base 90mM;Borate 90mM; EDTA 2mM) pour la séparation de grands fragments d’ADN(supérieurs à 500pdb) -gel d’agarose NuSieve à 2% (FMC Bioproducts) dans un tampon TBEpour la séparation de petits fragments (inférieurs à 500 pdb).

Toute migration sur gel d’agarose ou sur gel de polyacrylamide est réalisée dans untampon TBE et en présence d’un marqueur de poids moléculaire (1Kb ladder, GibcoBRL). L’ADN est mélangé avec 1/10 du volume du bleu de dépôt (200g/l de Ficoll,0,5g/l de bleu de bromophénol, 50mM d’EDTA) avant d’être déposé sur gel. Après 20 011034 migration à 100 Volts et coloration au bromure d’éthydium (concentration 0.5pg/mlde gel), les bandes sont visualisées sous la lampe à UV. L'extraction de l’ADN de la bande d’un gel d’agarose est réalisée par électroélutioncomme suit: Le morceau de gel contenant le fragment d’ADN est découpé au scalpelet mis dans un boudin de dialyse fermé par deux pinces et contenant de 100 à 500μ1 deTBE. L’ensemble est mis dans une cuve à électrophorèse ou il subit un champélectrique de 100 Volts. L’ADN, après être sorti du gel, est ensuite purifié par deuxextractions au phénol/chloroforme suivies de deux extractions au chloroforme, puisprécipité en présence d’acétate de sodium 0,3M et de 2,5 volume d’éthanol absolu.Après centrifugation (5 mn à 14000 rpm) le culot d’ADN est séché puis repris dans20pl l’eau. 8) Séquençage fluorescent des ADN plasmidiques.

Le séquençage est fait suivant le méthode de Sanger en utilisant 4didéoxyribonucléotides possédant un marqueur fluorescent différent. L’incorporationde l’un de ces didéoxyribonucléotides produit un arrêt dans la réplication par la Taqpolymérase de l’ADN à séquencer. Cette réaction donnera des fragments d’ADN detailles différentes, tous terminés en 3’ par un des 4 didéoxyribonucléotides.

Un pg d’un plasmîde et 4 picomoles d’un primer sont ajoutés à 9,5μΐ d’un “prémix”fourni par Applied Biosystems sous le nom de Prism© Le volume final doit être de20μ1 pour effectuer une PCR pendant 25 cycles se décomposant en une étape dedénaturation à 96°C pendant 30 secondes, une étape d’hybridation à 50°C pendant 15secondes et une étape d’élongation à 60ôC pendant 4 minutes.

Les fragments d’ADN, obtenus après amplification, sont purifiés sur colonned’exclusion (Chromaspin-30 de Clontech); et sont ensuite séchés au Speed Vac.L’ensemble est repris par 5μ1 d’un mélange formé de 24μ1 d’EDTA (50mM) et 120μ1de formamide désionisée. Après dénaturation à 96°C pendant 3 minutes, 3 à 5μ1 sontdéposés sur un gel d’électrophorèse. Les différents fragments d’ADN sont séparéssuivant leur taille et vont passer successivement devant un lecteur laser de l’Appareil370 DNA sequencer (Applied Biosystems) où les différentes fluorescences vont êtredétectées. 9) Préparation de plasmides de la banque de poumon (Clontech®). 011034 21

La banque de fusion d’ADNc de poumon est vendue sous forme de bactéries. Cettebanque provient du clonage, au niveau du site EcoRI-XhoI du plasmide pGAD424(Materiel et Méthodes), d’ADNc correspondant aux ARN totaux de cellules depoumon humaines.

Après vérification du titre de la banque, 2μ1 de bactéries de la banque de fusion de poumon, mises au préalablement dans 8 ml de LB, sont étalées de façon non confluente sur un milieu solide afin de garder la représentativité de cette banque. Nous2 avons ainsi étalé 16 boites de 770 cm contenant un milieu LB+ampicrlline. Lescolonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicillineliquide. Les suspensions obtenues sont ensuite mises dans un Erlen et mises à incuberdans un shaker à 37°C pendant 3 heures. L’ADN est ensuite extrait de ces souches parla technique de la Maxiprep. La concentration en ADN sera déterminée à 260nm. 10) Transformation de la levure par un plasmide.

Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées aprèscentrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes et mises en suspension dans 1ml d’eaustérile. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 3 minutes le culot cellulaire est remisen suspension dans 1 ml d’eau stérile puis centrifugé à nouveau. Cette opération estrépétée une nouvelle fois afin d’éliminer toute trace du milieu de culture. Les levuressont ensuite reprises par 1 ml de la solution I de transformation (LiAc 0.1M, Tris-HClpH 7,5 lOmM, EDTA ImM). puis centrifùgées à 3000 rpm pendant 3 minutes. Leculot cellulaire est repris à nouveau dans 1 ml de la solution I de transformation. 50μ1de cette suspension de levures sont mis en présence de 50pg d’ADN de sperme desaumon et de 1 à 5 pg d’ADN plasmidique. 300μ1 d’une solution II de transformation(LiAc 0.1M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA ImM dans du PEG4000 40%) sontensuite ajoutés, puis l’ensemble est mis à incuber à 28°C pendant 30 minutes. Un chocthermique est ensuite appliqué sur le mélange de transformation dans un bain-marie à40°C pendant 15 minutes puis l’ensemble est centrifugé à 15000 rpm pendant 1 mnafin de récolter le culot cellulaire. Ce culot est repris dans 200μΐ d’eau puis étalé surun milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant auxmarqueurs apportés par le plasmide transformant. Les levures sont ensuite mises àcultiver pendant 72 heures à 28°C.

Dans le cas particulier de la tranformation de la levure par la banque d’ADNc depoumon, on procède comme suit: 22 01 U34

La levure utilisée contient le plasmide pGAL4DB-GAX exprimant la proteine GAX sous forme fusionnée au domaine de liaison à l’ADN de GALA Elle est cultivée dans7 250ml de milieu minimum YPG à 28°C sous agitation jusqu’à une densité de 10 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation à 3000rpm pendant 10 minutes et reprises dans 250ml d’eau. Après une nouvelle centrifugation le culot cellulaire est repris dans 100ml d’eau et à nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28°C sous agitation. Après centrifugation les cellules sont à nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 pl de la banque d’ADNc de poumon et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28°C sous

agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42°C pendant 20 minutes. Une centrifugation (3000 rpm pendant 5mn) est répétée 3 fois de suite, en reprenant à chaque fois le culot avec 10 ml d’eau stérile. La troisième fois le culot est repris avec 2,5 ml de PB S. Ainsi le PEG toxique pour les cellules a été éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemmencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys,Met et les bases Ura et Ade et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28°C. Les 100 μΐ de cette suspension restants servent-2 -3 -4 à vérifier l’efficacité de la transformation; pour cela des dilutions de 10 , 10 et 10 de cette suspension ont été réalisées. La culture de nuit est centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée à l’eau stérile deux fois de suite. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d’eau. 2,4 ml, dont le volume est amené à 10ml dans de l’eau stérile, sont2 utilisés pour ensemencer 10 boites de 435 cm contenant un milieuYNB+Lys+Met+His+Ade, et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 pl restants sontutilisés pour effectuer les mêmes opérations que lors de la détermination du taux detransformation, afin de déterminer le taux d’amplification du nombre de colonies aucours d’une nuit de culture. Π) Préparation de L’ADN (génomique et plasmidique) de levure

La valeur d’une anse moyenne d’un clone de levure est mise dans 200μ1 d’une solutionTELT (Triton XI00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM), enprésence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200μ1 dephénol/chloroforme. Ce mélange est vortexé pendant 15 minutes, puis centrifugépendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galetteprotéique et l’ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d’éthanolabsolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d’ADN est 23 - 011034 séché et repris dans 20μ1 de TE-RNAse. Cette solution d’ADN, qui correspond à unmélange d’ADN génomique et plasmidique, sert directement à transformer desbactéries. Seul l’ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries etpeut être analysé par la technique de miniprep. 12) Test d’activité de la β-galactosidase.

Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenantles clones de levure individualisés. Grâce au phénomène d’adsorption on obtient uneimage fidèle de l’emplacement des clones. Cette feuille est ensuite plongée dans l’azoteliquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l’activitéβ-galactosidase. Après décongélation, la feuille de nitrocellulose est déposée, coloniesvers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman préalablementimbibé de 1,5ml de solution PBS (Na2HPO4 60mM, NaH2PÛ4 40mM, ICCl ÎOmM,MgSO4 ImM, pH7) et de 10 à 30μ1 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) à 50mg/ml dans du Ν,Ν-diméthylformamide. La boite est ensuite placéedans une étuve à 37°C couvercle fermé pour éviter le dessèchement . Le tempsd’apparition de la couleur bleue peut être très variable, de quelques minutes à plusieursheures. Ce test doit toujours se faire en présence d’un témoin positif dont l’interactionest connue et vire rapidement au bleu. 13) Construction des vecteurs d’expression et du gène reporter a) Vecteurs d'expression

Le cDNA du récepteur aux oestrogènes (ER) est obtenu par transcription inverse (RT)à l’aide d’un kit commercial (first strand cDNA synthesis Kit de Pharmacia), à partird’ARN total extrait d’utérus de souris, suivie d’une amplification par PCR. Nousavons utilisé un couple d’amorces spécifiques s’hybridant, en 5’ avec les 20 premiersnucléotides de ER et introduisant un site EcoR I juste en amont du premier codon (5’-gagcgoo/mATGACCATGACCCTTCACAC SEQ ID N°6, les nucléotides en italiquereprésentent le site EcoR I et en capitales soulignées le premier codon), du côté 3’l’amorce retour débute au codon stop de ER et introduisant également un site EcoR I(5’- ^cgaatic AÇTGATCGTGTTGGGGAAGC SEQ ID N°7, les nucléotides enitalique représentent le site EcoR I et en capitales soulignées le codon stop). Lefragment PCR obtenu a été purifié, digéré par EcoRI puis cloné au même site dans levecteur d’expression pCDNA 3 (Invitrogen). Ce vecteur est appelé pCMV-ER. Les 24 011034 différents mutants de délétions de GAX fusionnés au domaine de liaisons à l’ADN deGAL4 (pCMV-GALDB/GAX, voir exemple 9) ont également été clonés dans levecteur pCDNA 3. b) Gène reporter 5 Le gène reporter a été construit selon la stratégie décrite par Martinez et al (Martinezet al. 1991,Mol. Cell. Biol. 11,2937-2945) excepté que le vecteur de clonage utiliséest le pG5CAT (Clontech, CAT = Chloramphenicol Acetyl Transférase). Nous avonssynthétisé un oligonucléotide double brin ( ci dessous) contenant deux sites spécifiques(en caractères gras) l’un reconnu par le domaine de liaison à l’ADN de GAL4 (Gal- 10 17mer, Carey et al. 1989, Mol. Biol. 209,423-432) et l’autre est une séquenceconsensus du “Estrogen Responsive Elément11 (ERE, Beato M.‘ 1989, Cell 56,335-344) qui lie le récepteur aux oestrogènes. Cet oligonucléotide adaptateur possède en5’ un site Xhol protrusif et en 3’ un site Xbal qui ont permis le clonage dans les sitesXho 1 et Xba I de pG5CAT. 15 SEQIDN°8 tcgagAGGTCATATTGACCTaagcttCGGGTCGGAGTACTGTCCTCCGACTGCcatatgt

c/rCCAGTATAACTGGAt.tcgaaGCCCAGCCTCATCA.CAGGAGGCTGACGgtatacacfatcXhol EBE Ga.l-17zaez Xba. I 20

Le principe de ce gène reporter (pEREGICAT, Fig. 4, exemple 11)) repose sur le faitque ER est un activateur transcriptionnel possédant, dans le cas du ER murin, uneactivité constitutive qui augmente en réponse à son ligand naturel, l’oestradiol 17-B.Ce système a été utilisé par Matinez et al. pour étudier la synergie entre ER et un 25 second facteur transcriptionnel, NF1, dont le domaine activateur de la. transcription aété fusionné au domaine de liaison à l’ADN de la protéine de levure GAL4 (GALDB).Ce reporter permet, ainsi, de rendre compte du taux de transcription dû uniquement àl’un ou l’autre des facteurs transcriptionnels ou de leur coopération sans interférencedue à des molécules endogènes. Ce système nous permet donc d’étudier l’activité 30 transcriptionnelle de toute ou partie de la protéine GAX fusionnée au GALDB (Fig. 5,6 et exemples 12,13). 25 • 011034

Un plasmide exprimant le gène de 1a. luciférase sous le contrôle du promoteur CMV(pCMV-Luc) a été construit. Cette construction a été obtenue après clonage d’unfragment de PCR (flanqué en 5’ et en 3’ d’un site BamHI) contenant le promoteurCMV du vecteur pCDNA3 (Invitrogen), dans le site BglII du vecteur pGL3-Basie(Promega). Ce plasmide servira de standard interne dans toutes les expériences detransfeciion transitoire qui suivent. 14) Expériences de cotransfedion transitoire

Toutes les études ont été réalisées dans les fibroblastes embryonnaire murins NIH-3T3(ATCC). Ces cellules ont été entretenues en routine dans du DMEM (GIBCO)supplémenté avec 100 (J/ml de pénicilline (GIBCO), 100 pg/ml de streptomycine(GBCO), 2 mM L-glutamine (GBCO) et 10% de sérum de veau foetal (SVF,GIBCO).Ce milieu sera désigné par l’abbréviation DMEM-GPS/SVF.

Pour les expériences de transfeciion transitoire les N1H-3T3 sont ensemencées à unedensité de 100000 cellules par puit d’une plaque de culture de 24 puits (Falcon), dansun volume de 1ml de DMEM-GPS/SVF. 16 à 20 heures plus tard, après attachementet étalement des cellules, les cellules sont lavées avec 0,5 ml de DMEM-GPS (sansSVF) puis remises dans 0,5 ml de DMEM-GPS. 50 pl d’un mélange de transfeciionsont ensuite ajoutés par puit de. culture. Ce mélange est obtenu comme le résume letableau 3 ci dessous. pCMV-Luc ‘ „1 - 1 w 50 ng 50 ng “^50ng^ 50 ng pEREGICAT* 650 ng 650 ng 650 ng 650 ng pCMV-ER 150 ng - 150 ng pCMV-GALDB/GAX - 150 ng 150 ng pCDNA3** 300 ng - - - Lipofectamine*** 8 pg 8 Pg 8 PS 50 pl 50 pl 50 pl 50 pl

Tableau 3 *Les différents mélanges, numérotés de 1 à 4, sont conçus pour étudierrespectivement, l’activité basale du promoteur EREG1CAT, l’activité de ER ou deGADB/GAX seuls et enfin l’effet simultané de ER et de GALDB/GAX. 26 - 011034 ** pCDNA3 est utilisé pour compléter chaque mélange à 10 pg total

La llpofectamine à 2 pg/μΐ (gibco) est utilisée à un rapport de 8/1 (lipofectamie/ADN). 5 Les cellules sont mises en contact avec les différents mélanges de transfection pendant4 heures à 37°C dans les conditions standard de culture. Le DMEM-GPS, avec lemélange de transfection, est ensuite remplacé par 1 ml de DMEM-GPS/SVF puis lescellules sont maintenues en culture pendant 24 heures. Chaque transfection esteffectuée sur au minimum 4 nuits. 10 A la fin de la période de 24 heures, les cellules sont lavées avec 0,5 ml de Dulbecco’sPBS (GIBCO) puis récoltées dans 0,5 ml d’une solution de trypsine 0,2% dans duPBS (GIBCO). La trypsine est neutralisée par 10 μΐ de S VF. Cette suspensioncellulaire est centrifugée pendant 2 min à 10000 g, le surnageant est retiré puis lescellules sont resuspendues dans 150 ul de Tris-HCl 0,25 M à pH 7,8. 50 μΐ de cette 15 suspension sont utilisés pour doser l’activité Iuciférase selon le Kit “luciferase AssaySystem11 (Promega) et à l’aide du luminomètre LUMAT LB 9501 (EG&amp;G Berthold).Les protéines cytosoliques des cellules dans les 150 μΐ restants sont extraites par 5cycles de congelations/décongélation (azote liquide/37jC). Ces extraits, normalisés parrapport à l’activité luciferase, sont ensuite utilisés pour doser l’activité CAT selon la 20 méthode précédemment décrite par Gorman et ai (Gorman et al. 1982, Mo/. Ce//. Biol.5,1044-1051).

15) interaction in vitro entre les proteines Ki et GAX

Elle est réalisée par la méthode du Far-Western Biotting. 25 Alors que le Western Biotting consiste en une séparation électrophorétique deprotéines sur un gel dénaturant suivi d'un électrotransfert des protéines sur unemembrane de nitrocellulose et d'une immunodétection directe ou indirecte, le Far-Western Biotting est u.n Western Biotting auquel est ajouté une étape d'interactionprotéine-protéine entre une cible immobilisée sur la membrane de nitrocellulose et un 30 facteur en solution. 27 011034 a) Electrophorèse

Les échantillons sont chauffés 10 minutes à 95°C dans un tampon de dénaturationpour protéines contenant 50 mM de Tris nï’6.8, 2% de SDS (Sodium DodécylSulfate), 10% de glycérol, 300 mM de b-mercaptoéthanol et 0,1% de bleu debromopbénol. 10 ml des échantillons sont déposés sur un gel Tris-Glycine 14%Acrylamide (Tris-Glycine Gels, Novex). La migration se fait pendant 1 heure à unvoltage constant de 120 V dans un tampon de séparation pour protéines (35 mM deSDS, 1,92 M. de Glycine et 85 mM de Tris pH8,3). Le poids moléculaire des protéinessera déterminé par la migration en parallèle d'un standard de poids moléculaire coloréet transférable (MultiMarkTM Multi-Colored Standard, Novex). Ce gel est fait endouble pour pouvoir en parallèle colorer l'un des deux au bleu de Coomassie(Méthanol 30%, eau 60%, Acide acétique 10%, Bleu de Coomassie 0,1%). Lacoloration est de 1 heure. La décoloration s'effectue, pendant plusieurs heures, enchangeant plusieurs fois la solution décolorante (Méthanol 30%, Acide acétique 10%,eau 60%). La limite de détection de cette méthode est de 50 ng de protéines. Ce gelcoloré nous permet donc de visualiser toutes les protéines déposées. L'autre gel estutilisé pour le "Far-Western Blotting". bjTransfert semi-sec sur une membrane de nitrocellulose

La membrane de nitrocellulose (Hybond C de Amersham) et le gel sont pris entre 3épaisseurs de papier Whatman préalablement immergé dans le tampon de transfert(Glycine 150 m.M, Tris 25 mM, Méthanol 20%, eau qsp 1 litre, pH8,3) Le transferts'effectue pendant 40 minutes à 2,5 rnA/cm2 de gel (appareil MilliblotTM-GraphiteElectroblotter II, Millipore). c) Interaction protéine-protéine

La membrane est saturée pendant 30 minutes sous agitation et à température ambiantedans du PRS contenant 5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Gloria) et 0,2% (v/v) deTween 20. Ensuite, elle est immergée pendant 1 heure sous agitation et à températureambiante dans 5 ml de PBS contenant 5% (p/v) de lait écrémé en poudre (Gloria),0,2% (v/v) de Tween 20 et 75 μ g de Kl. L'incubation terminée, la membrane est lavée3 fois pendant 10 minutes dans du PBS contenant 0,2% (v/v) de Tween 20. Afin deviualiser l’interaction entre GST-GAX immobilisé sur la membrane de nitrocellulose etmycKi, celui ci est révéler comme pour GST-GAX à l'aide d'un anticorps monoclonal 28 011034 de souris dirigé contre l'épitope myc (Santa Cruz) et d’un anticorps polyclonal de lapincouplé, à la peroxidase, dirigé contre les IgG de souris (Nordic Irnmunology).

EXEMPLES EXEMPLE l: Construction d’wn vecteur permettant Γexpression d’une protéinede. fusion entre GAX et Ig domaine de liaison à l’ADN de GAL4

Le criblage d’une banque utilisant le système double hybride nécessite que la protéineGAX soit fusionnée au domaine de liaison à l’ADN de la protéine transactivatriceGAL4. L’expression de cette protéine de fusion est réalisée grâce au vecteur pGBTIO(cf matériels et méthodes), dans lequel nous avons introduit, dans le même cadre delecture que la séquence correspondant au domaine de liaison à l’ADN de GAL4(GAL4DB), un fragment codant pour tout ou partie de la proteine GAX. Un. fragmentparticulier comprend le fragment EcoRl-Sall issu de phGAX, qui est inséré au niveaudu site EcoRl-Sall de pGBTIO pour donner le plasroide pCM199.

La construction a été séquencée ce qui permet de vérifier que la proteine GAX est biendans la. même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant auGAL4DB. EXEMPLE 2: Criblage de la Banque de fusion de,poumon.

Le criblage d’une banque de fusion permet d’identifier des clones produisant desprotéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec laprotéine GAX ou des domaines de celle-ci. Cette interaction permet de reconstituer untransactivateur qui va alors être capable d’induire l’expression des gènes rapporteursURA3, BLE et LacZ dans la souche YCM79.

Pour effectuer ce criblage nous avons choisi une banque de fusion réalisée à partird’ADNc provenant de poumon humain. Comme cette banque nous a été fournie sousforme de bactéries, l’ADN plasmidique de la banque a tout d’abord été purifié. 2.1) Préparation de l’ADN plasmidique d’une banque de fusion.. 011034 29 L’ADN plasmidique de la banque d’ADNc de poumon a été extrait suivant le protocole Clontech (voir matériels et méthodes, § 10). Lors de cette préparation il était important de préserver la représentativité de la banque, c’est à dire, conserver le6 nombre de plasmides indépendants qui la constitue et qui sont au nombre de 7.10 5 plasmides.

Afm de nous préserver de la perte de plasmides de la banque au cours de cettepréparation, le lot d’ADN plasmidique que nous avons constitué a été obtenu à partird’un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de trois foisla représentativité de la banque soit 25.10^ colonies. 10 2.2) Transformation par banque de poumon et. sélection par le test d’activité beta- galactosidase.

Lors du criblage il est nécessaire de préserver 1a. probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide GAL4DB-GAX. Pour préserver cette probabilité il est 15 important d’avoir une bonne efficacité de transformation de la levure. Pour cela nous5 avons choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 10'cellules transformées par pg d’ADN. De plus comme la cotransformation de la levurepar deux plasmides différents réduit cette efficacité, nous avons préféré utiliser une-levure préalablement transformée par le plasmide pGAL4DB-GA.X. Cette souche de 20 levure a été transformée par lOOpg d’ADN plasmidique de la banque de fusion. Cettequantité d’ADN nous a permis d’obtenir après estimation (voir matériels et méthodes)4,2 10 cellules transformées, ce qui correspond à un nombre supérieur au nombre deplasmides indépendants que constitue la banque. D’après ce résultat nous pouvonspenser que la quasi totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les 25 levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer untransactivateur GAIN fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Met+His+Ade.A l’issu de cette sélection 190 clones avec un phénotype Ura+ et bGal+ ont étéobtenus. EXEMPLE 3: Identification des inscris des plasmides sélectionnes : Mise en 30 evidence d’une interaction avec Ki 011034 30

Les plasmides sont extraits de la. levure, introduits dans la bactérie puis préparéscomme décrit dans la partie materiels et méthodes. Le séquençage a été réalisé à partirde l’oligonucléotide CTATTCGATGATGAAGATACCCC (SEQ ID N°l)complémentaire de la région de GAL4TA à. proximité du site d’insertion de la banquede cDNA de poumon, à 52 pdb du site EcoRI.

La comparaison des séquences avec les séquences contenues dans les banques dedonnées GENBank et E’MBL (European Molecular Biology Lab) a montré qu’un desplasmides ainsi identifiés comporte un ADNc identique au facteur Ki, identifié chezdes patients atteints de lupus comme auloanti gène. Ce plasmi.de est baptisé pCM.282.Ce plasmide, quand il est cotransformé dans la levure avec pCMl99, est bien capabled’activer les gènes rapporteurs de celle-ci comme le montre le Tableau î ci-dessous.Ce Tableau montre en outre que l’activation est spécifique, ce qui indique que Ki estcapable d’interagir de manière spécifique avec GAX.

Vecteurs Activité beta-ga! pCM199 + pGAD424 0 pCM199 + pCM282 + pGBTIO + pCM282 0 pGBTIO + pGAD424 0

Tableau 1 EXEMPLE. 4: Construction de vecteurs permettant J*expression dans la levure d’une protéine de fusion entre .différents., délétants de GAX. et,..te.doinajn^deliaison à PAON de GAL4

Cet exemple décrit la construction de vecteurs codant pour differents variants de laproteine Gax, utilisables pour déterminer la structure/fonction de cette protéine etnotamment, mettre en évidence les domaines actifs et les domaines responsables del’interaction avec la proteine Ki. 011034 31

La délétion des 153 aminoacides C-terminaux est obtenue en digérant le plasmide pCM199 par Eagl-Sal 1, puis le petit fragment, est éliminé, les extrémités sont rendues blunt par traitement à la klenow et religuées. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pCM238. Il code pour une proteine comportant les résidus 1-104 de GAX.

La digestion totale par Bgl2 et Sali de pCM199 puis la reîigation du. vecteur aprestraitement à la klenow permet de conserver les 32 premiers aminoacides de GAX. Leplasmide ainsi obtenu est appelle pCM244. il code pour une proteine comportant lesrésidus 1-32 de GAX.

La digestion totale par Bgl2 et. Sali de pCM199 permet d’isoler un fragment d’environ270pb et 572pb. Le premier fragment est cloné dans pGBTll au site Bamhl-Sallpour obtenir le plasmide pCM245 qui permet la fusion des 79 aminoacides C-ter avecle GAL4DB. Le second fragment est cloné dans pGBÏlO au site Bamhl pour obtenirle plasmide pCM246 qui permet la fusion des aminoacides 33 à 222 avec le GAL4DB.

Le plasmide pCM280 est obtenu en digérant pCM246 par Dra3 et pstl. Aprestraitement a la T4 polymerase le plasmide est refermé sur lui même. ïl code pour uneproteine comportant les résidus 33-63 de GAX.

Le plasmide pCM199 est digéré par Ndel et Pstl. L’insert est cloné dans le plasmidepASl pour donné le plasmides pCM.301. Ce plasmide permet l’expression de laprotéine GAX délétée de ces 32 premiers aminoacides fusionnée au GAL4DB. 11 codepour une proteine comportant les résidus 33-302 de GAX.

La structure de la proteine de fusion exprimée par ces differents vecteurs estrepresentee sur la figure 1.

EXEMPLE 5:. Localisation de b zone d* interaction de GAX avec KL

La souche de levure yCM79 est transformée par les différents vecteurs décrits dansles exemples l et 4 en même temps que pCM282 ou que pGAD424. L’activité Beta-gal est révélée comme décrit dans le materiel et méthodes. Les résultats obtenus sontprésentes dans le Tableau 2 ci-dessous. 011034 32

Vecteurs Activité beta-gal pCM199 + pGAD424 0 pCM199 + pCM282 pCM238 + pGA.D424 0 pCM238 + pCM282 0 pCM244 + pGAD424 0 pCM244 + pCM282 0 pCM245 + pGAD424 0 pCM245 + pCM282 . 0 pC’M246 + pGAD424 0 pCM246 + pCM282 0 pCM280 + pGAD424 + pCM280 + pCM282 + pGBTIO + pCM282 0 pCM30l + pCM282 0

Tableau 2

Ces résultats permettent de révéler la région de GAX qui interagit avec le facteur Ki(Tableau 2). En effet, les régions faisant perdre l'activité par leur absence permettentde conclure qu’elles sont nécéssaires à l’interaction mais non suffisantes. Ainsi lesrégions 1 à 32 et 104 à 223 semblent importantes pour l’interaction avec Ki. Le faitque pCM238 ne donne pas de signal positif en Beta-gal, suggère qu’il existe une régionC-Term 104-302 de Gax nécéssaire à l’interaction en levure. 33 011034 EXEMPLE 6 : Profil, dPexpression .de IM.RNm dans différents.....tissus.......et localisation nucléaire de h protéine exprimée transitoirement:

Afin d'identifier des partenaires de GAX nous avons transformer notre souche delevure double hybride, possédant déjà le plasmide permettant l'expression de la fusionGAL-GAX (1-302) comme appât, par une banque d'ADNc de poumon fusionnée auGAL4 TA, disponible au laboratoire (exemple 2). Nous avons pu obtenir avantamplification plus de 41 millions de clones indépendants et seulement 190 clones danslesquels les trois gènes de sélection (i.e. le gène URA3, le gène LacZ et le gène BLE)sont exprimés. 9 ADNc codant pour des protéines différentes ont pu être identifiesparmi ces 190 clones. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés a celuicodant pour l'antigène Ki.

Le gène Ki semble ubiquitaire comme le suggère l'analyse par northern blotting (FigureI) de son expression ά partir des rnRNA extrait de differents tissus (human MultipleTissu Northern Blots, Clontech) révélant un rnRNA d'environ 3 kb . On peut noter laprésence d'une forme de ntRNA subissant une maturation differente (1,4 kb) dans lecoeur et les muscles squelettiques.

La construction d'un vecteur permettant l'expression de la protéine Ki fusionnée au tagMA dans les cellules de mammifère a été réalisé de la manière suivante; le fragmentNcol-Xhol du plasmide pCM282 est inséré dans le plasmide pASl au niveau des sitesNcol-Xhol pour obtenir le plasmide pCM32.2. Puis le fragment EcoRl-Dral duplasmide pCM.322 est inséré dans le vecteur d'expression pCDNA3 au niveau des sitesEcoRl-EcoRV. Le plasmide obtenu, pCM323 permet l'expression de la protéine kifusionnée au tag HA dans les cellules de mammifère.

Par immunofluorescence indirecte., il est montré que KiHA a une localisation nucléairedans des cellules transfectées par cette chimère (Figure 2). EXEMPLE 7: Expression et purification de la proteine Ki fusionnée au. tag S ettagrnvc. 34 011034

Les oligos suivants sont hybridés ensemble, phosphorilés puis ligués avec pET29Bpréalablement digéré par Ncol. CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC(SEQ ÏD N°2) et CÀTGGATCCACGTGCAGGTCCTCCTCGGAGAÏCAGCTTCTGCTCCATAAGCTT (SEQ ÏD N°3)

Le plasmide obtenu est nommé pCM320. Le gène codant pour la protéine Ki estamplifié par PCR avec les oligos CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG (SEQ ÏDN°4) et GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC (SEQ 1D N°5). Le 10 fragment obtenu est digéré par Bamhl Xhol puis introduit, après ligation, aux sitesbamHl-Xhol du plasmide pBCks pour donner le plasmide pCM3O5. Ce dernier estensuite digéré par Bamhl Xhol. L’insert ainsi libéré est ligué au site Bamhl et Xholde pCM320 pour donner le plasmide pCM321. L’expression et la purification de laprotéine recombinante sont réalisées suivant les indications du fournisseur (Novagen) à 15 partir de pCM321

EXEMPLE 8: Expression et purification de la proteine GAX fusionné à la GST

Des colonies de BL-21 transformées par le plasmide pGEX-2T-h-GAX sont mises enpréculture dans 30 mi de LB avec ampicilline (50 pg/ml) à 37°C toute la nuit. 5 ml de 20 cette préculture sont remis en culture dans 500 ml de LB avec ampicilline à 37°C jusquà une densité optique de 0,7 à 600 nm. L'expression de GST-GAX est induite par 0,1raM d'IPTG pendant 2 heures à 30°C. La culture est centrifugée à 6000 rpm pendant10 mn. Les culots de bactéries sont remis en solution dans 10 ml de BBS froid puisrépartis dans 10 tubes eppendorf. Les protéines bactériennes sont extraites par 25 sonication pendant 10 minutes avec des cycles de 12 secondes et des pauses de 24secondes suivi d'une centrifugation de 15000 rpm pendant 15 minutes. Les surnageantssont regroupés et constituent la fraction soluble qui sera utilisée pour la purification.Les culots restant représentent la fraction insoluble. 35 011034 jusqu à une densité optique de 0,7 à 600 nm. L'expression de GST-GAX est induitepar 0,1 mM d'IPTG pendant 2 heures à 30°C. La culture est centrifugée à 6000 rpmpendant 10 mn. Les culots de bactéries sont remis en solution dans 10 ml de PBSfroid puis répartis dans 10 tubes eppendorf. Les protéines bactériennes sont extraitespar sonication pendant 10 minutes avec des cycles de 12 secondes et des pauses de 24secondes suivi d'une centrifugation de 15000 rpm pendant 15 minutes. Lessurnageants sont regroupés et constituent la fraction soluble qui sera utilisée pour lapurification. Les culots restant représentent la fraction insoluble.

La purification de GAX se fait par affinité de la GST sur des billes d'agarose coupléesau Glutathion.

Le surnageant obtenu après sonication des bactéries est incubé avec la résine pendantune heure sur un agitateur rotatif à température ambiante. Ensuite, la résine surlaquelle la protéine s'est liée est centrifugée à 1000 rpm pendant 10 minutes. Lesurnageant éliminé, la résine est lavée 3 fois par 50 ml de PBS contenant 1% deTriton X-100 pendant 20 minutes sur 1 agitateur rotatif. GST-GAX peut être élué de larésine par de la guanidine thioeyanate. L élution se fait par 1,5 fois le volume derésine de 2M de guanidine thioeyanate, de 20 mM de Tris pH7,5, de 0,15 M de NaClet de 0,1% de Triton X-100 sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes. L'éluat estdialysé contre du PBS toute la nuit pour éliminer la guanidine thioeyanate. Laprotéine est conservée dans du PBS à 4°C. Un cocktail d inhibiteurs de protéases àquantité égale (Leupeptine lmg/ml, Pepstaline lmg/ml, Aprotinine lmg/ml,Benzamidine 500 mM) est ajouté au 1/200 ème à la préparation protéique.

EXEMPLE 9 : Interaction in vitre entre les protéines Ki et GAX

Pour étudier P interaction de GAX et de Ki in vitro, nous avons produits deuxprotéines recombinantes chimériques dans Escherichia Coli. GST-GAX a été purifiéesur une résine couplée au glutathion grâce au site catalytique de la glutathione 5-transférase (GST); SmycKi portant un épitope myc et l’épitope S permettant lapurification sur une résine couplée à la protéine S.

Les quantités indiquées d’albumine bovine, de la protéine GST ou de GST-GAXaprès digestion par la thrombine (site créé entre GST et GAX),, ainsi que des 36 011034 quantités croissantes de GST-GAX, ont été séparées sur un gel dénaturant depolvacrylamide puis colorées au bleu de coomassie (Figure 3 A).

Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose à partir d’un gelidentique à celui en A. La membrane a été incubée successivement en présence deSmycKi, dans une solution contenant un anticorps monoclonal de souris dirigé contrel’épitope myc (Santa Cruz) et finalement dans une solution, pour la détection del’anticorps anti-myc.

Nos résultats montrent clairement que Ki reconnaît spécifiquement GST-GAX et demanière dose dépendente, alors qu’aucune réaction n’est observée avec l’albuminebovine ou GST. Noter qu’après digestion par la thrombine Ki interagit toujours avecGAX (Figure 3 B). EXEMPLE 10 ; Construction de vecteurs permettant l’expression, dans Sescellules de mammifère d’une protéine de fusion entre différents délétants deGAX et le domaine de Maison àJ’ADN de GAL4 10.1. Construction de vecteurs plasmidiques.

Les plasmides pCM199 et pCM30I sont digérés par HindiII. Les inserts sont clonésdans la correcte orientation dans pCDNA3 (invitrogen) au site HindiII pour donnerrespectivement les plasmides pCM291 et pCM327, permettant l’expression desfusions dans des cellules de mammifère.

Les plasmides pCM238, pCM244, pCM301, pCM246, et pCM280 sont digérés parHindiII et Nael. Les inserts sont clonés dans la correcte orientation dans pCDNA3(invitrogen) au site HindlIl-EcoRV pour donner respectivement les plasmidespCM'292, pCM326, pCM327, pCM294 et pCM295, permettant l’expression desfusions dans des cellules de mammifère. 10.2. Construction de vecteurs viraux 37 011034

Selon un mode particulier, l'invention réside dans la construction et l'utilisation devecteurs viraux permettant le transfert et l'expression in vivo des acides nucléiquestels que définis ci-avant. S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et 5 les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, onpréfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adenovirus humains de type2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adenovirus d'origine animale (voir demandeWO94/26914). Parmi les adenovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de laprésente invention on peut citer les adenovirus d'origine canine, bovine, murine, 10 (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ouencore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale estun adenovirus canin, plus préférentiellement un adenovirus CAV2 [souche manhattanou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre del'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. 15 Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, uneséquence permettant l'encapsidation et un acide nucléique selon l'invention. Encoreplus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El aumoins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnelpar toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression 20 totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le oules gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur del'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique,ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuventégalement être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2 25 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5 (WO95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selonl'invention comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode deréalisation préféré, il comprend une délétion dans région El au niveau de laquellesont insérés la région E4 et la séquence nucléique de l'invention (Cf FR94 13355). 30 Dans les virus de l’invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellementdes nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés partoute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., gène 101 (1991) 195, 011034 38 EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent êtrepréparés par recombinaison homologue entre un adenovirus et un plasmide portantentre autre une séquence nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques del’invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desditsadenovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaireutilisée doit de préférence (i) être transformable par îesdits éléments, et (ii), comporterles séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adenovirus défectif,de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titred'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain. 293(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dansson génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignéescapables de complémenter les fonctions El et E4 telles que décrites notamment dansles demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697 ou dans Yeh et al., J. Virol. 70 (1996)559.

Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon lestechniques classiques de biologie moléculaire.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taillerelativement réduite, qui s'intégrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, demanière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre decellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciationcellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chezl'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprendenviron 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR)de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste dugénome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : lapartie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication viraleet l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène capcodant pour les protéines de capside du virus. L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivoa été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; DS4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentesconstructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétéset remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (surcellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. 39 011034

Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (parexemple un adenovirus), d'un plasmide contenant une séquence nucléique ou unecombinaison de séquences nucléiques de l'invention bordée de deux régions répétées 5 inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes repet cap) d'AAV. Une lignée cellulaire utilisable est par exemple la lignée 293. D’autressystèmes de production sont décrits par exemple dans les demandes WO9S/14771 ;WO95/13365; WO95/13392 ou WO95/06743. Les AAV recombinants produits sontensuite purifiés par des techniques classiques. 10

Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteursrecombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield etal., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. gènet. Eng.7 (1985) 235; McCormick, BioTeehnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les 15 rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ilsconstituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome desrétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et troisrégions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés desrétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et 20 remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurspeuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment leMoMuLV ("murine Moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLA/), le MSV("murine Moloney sarcoma virus"), le HaSV ("Harvey sarcoma virus"); le SNV("spleen necrosis virus"); le RSV ("Rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend. 25 Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention comportant uneséquence nucléique nucléique ou une combinaison de séquences nucléiques selonl'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidationet ladite séquence nucléique est construit, puis utilisé pour transfecter une lignéecellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales 30 déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donccapables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont étédécrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4-,861,719); la lignéePsiCRIP (W090/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, lesrétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour 35 supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation 40 011034 étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al,, J. Virol. 61 (1987) 1639).Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniquesclassiques. 10.3 - Vecteurs chimiques 5 Les acides nucléiques ou les vecteurs d’expression plasmidiques décrits les exemplesprécédents peuvent etre administres tels quels in vivo ou ex vivo. Il a en effet etemontre que les acides nucléiques nus pouvaient transfecter les cellules. Cependant,pour améliorer l’efficacite de transfert, on préféré utiliser dans le cadre de l’inventionun vecteur de transfert. Il peut s’agir d’un vecteur viral (exemple 9.2.) ou d’un agent 10 de transfection synthétique.

Parmi les vecteurs synthétiques développés, on préfère utiliser dans le cadre del'invention les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n,(PCT/FR/OOO98) polyéthylène imine (WO96/02655) et DEAE dextran ou encore leslipides cationiques ou lipofectants. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et 15 de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, onpeut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) différents lipidescationiques ou neutres (DOTM.A, DOGS, DOPE, etc) ainsi que des peptides d'originenucléaire. En outre, le concept de la transfection ciblée a été développé, médiée par unrécepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère 20 cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à uncouplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteurmembranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblagedu récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines deshépatocytes a ainsi été décrit. La préparation d'un composition selon l'invention 25 utilisant un tel vecteur chimique est réalisée selon toute technique connue de l'hommedu métier, généralement par simple mise en contact des différents composants.

EXEMPLE 11 : Mise a» point d’une méthode, permettant P étudede Pactivltétranscriptionnelle de GAX 30 Nous avons utilisé un système de transfection transitoire pour étudier l’activitétranscriptionnelle propre aux fusions GALDB-GAX ainsi que leur effet sur desactivateurs transcriptionnels comme le récepteur aux oestrogènes (ER) ou le domaine 41 011034 d’activation acide de la protéine VP 16 du virus Herpes simplex fusionné à GALDB.Afin de quantifier l’activité transcriptionnelle de chacun ou de la combinaison deplusieurs facteurs, nous avons construit un gène cible (Reporter) exprimant lacbloramphenicol acétyle transférase bactérienne (CAT) sous le contrôle d’un 5 promoteur artificiel. Ce promoteur contient une boite TATA, provenant du gène El Bde l’adénovirus Ad2 (El.B TATA), en amont du site d’initiation de la transcription dugène CAT (Figure 4 A). Une protéine TBP du complexe TFIID, reconnaît la boiteTATA et positionne le complexe de preinitiation (TFIID + TFII A,B,E,F) lequelrecrute l’ARN polymérase de type II (PolII) qui va initier la transcription du gène 10 CAT. En amont de ce promoteur basal nous avons inséré un site de liaison GALDB(17mer) qui sera reconnu par les chimères GALDB-GAX ou GALDB-VP16. Nousavons également cloné en amont du 17 mer un élément de réponse aux oestrogènes(ERE) sur lequel ER se lie pour activer la transcription. Ce reporter nous permettrad’étudier les différentes combinaisons schématisées, une activation ou une repression 15 de la transcription se traduira par une modification de la quantité de CAT dans unecellule. Le dosage de l’activité enzymatique CAT dans les extraits cellulaires aprèsiransfection est utilisée pour mesurer l’effet transcriptionnel. ER et GAL4-VP16 sont des activateurs transcriptionnels très forts. L’activité CAT estaugmentée de plus de 100 fois par ER et environ 85 fois par GAL4-VP16. La 20 coexpression de ER et GAL4-VP16 résulte en une activité CAT de plus de 300 foiscelle du reporter non activé et supérieure à la somme des deux activateurs exprimésindividuellement. Ceci suggère que ER et GAL4-VP16, malgré l’encombrementsterique, peuvent occuper et activer le même promoteur (Figure 4 B).

25 EXEMPLE 12 : Etude de P activité transcriptionnelle de, fusions GALDB-GAX et Identification d’un domaine represseur de la transcription

Le gène GAX code pour une protéine de 302 acides aminés chez l’homme. Lastructure primaire de cette protéine présente différents domaines dont la fonction resteinconnue. GAX appartient à une famille de gènes dite à homeoboite (HOMEOBOX). 30 l’Homeobox est nécessaire à la reconnaissance et à la liaison de ces protéines sur desséquences d’ADN spécifiques présentes sur le promoteur des gènes cibles dont ils 011034 42 contrôlent l’expression. A ce jour aucune séquence d’ADN reconnue par GAX n’a étéidentifiée. GAX possède une région riche en résidus Histidine (HIS) dans sa partie N-terminale dont la fonction est inconnue.

Pour comprendre la fonction de GAX différentes régions du gène GAX humain ont 5 été délétées pour produire des protéines tronquées aussi bien dans leur partie N-terminale que C-terminale, les nombres indiquent la position du premier et du dernieracide aminé de chaque mutant de délétion par rapport à GAX entier 1-302 (Figure 5).Ne connaissant pas de séquence d’ADN reconnue naturellement par GAX, nousavons créés des chimères entre les différents mutants de délétion et un domaine de 10 liaison à l’ADN heterologue (fusionné à leur partie N-terminale) provenant du facteurtranscriptionnel de levure GAL4 (GALDB). Des vecteurs d’expression ont étéconstruits pour exprimer transitoirement les différentes chimères dans des cellules demammifère en culture

Les différentes chimères GAL-GAX ont été exprimées seules ou en présence de ER 15 pour étudier leur effet respectivement sur la transcription basale ou sur l’activitétranscriptionnelle de ER. GAX entier, dans le contexte de la fusion GAL-GAX1-302, diminue de plus de 8 foisl’activité CAT par rapport au reporter non activé. Cette répression est faiblementaffectée lorsque les 32 acides aminés N-terminaux de GAX sont absents (GAL- 20 GAX33-302) mais elle est totalement levée lorsqu’une délétion supplémentaire supprime la partie C-terminale de GAX (GAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminéssuffisent dans le contexte de GAL-GAX1-32 pour diminuer l’activité CAT (Figure 6A).

La coexpression de GAL-GAX1-302 et de ER résulte en une activité CAT plus 25 25 fois inférieure à celle obtenue avec ER seul. Cette répression comme en A est due au32 premiers acides aminés de GAX (comparer GAL-GAX1-302, GAL-GAX33-302 etGAL-GAX33-222). Ces 32 acides aminés N-terminaux (GAL-GAX1-32) diminuentl’activité de ER seulement de 2 fois (comparer GAL-GAX 1-3 2, GAL-GAX1-104) etnécessitent au minimum la présence des résidus 33 à 222 pour une activité maximale 30 (Figure 6 B). 43

Les séquences faisant perdre l'activité lorsqu'elles sont absentes sont recherchées,permettant de conclure qu'elles sont nécéssaires à l'interaction mais non suffisantes.

Les résultats présentés, montrent que GAX réprime la transcription du gène reporterutilisé. Cette répression est essentiellement due à un peptide N-terminal (1 à 32) dontl’activité optimale nécessite la présence de la région 33 à 222 de GAX et depréférence la présence de la région 33-104 de Gax.

En utilisant les différentes délétions de GAX fusionnés au domaine de liaison à f l'ADN de GAL4, nous avons pu identifier dans la levure ( par le système doublehybride, Exemple 5) les régions de GAX importantes pour l'interaction avec Ki. 11s'agit de la partie N-terminal jusqu’au résidu 222. Cette région comprend, commenous l’avons montré plus haut, le domaine répresseur de GAX.

EXEMPLE 13 : Interaction in vitro entre GAX et PCNA 13.1 Clonage de î'ADNc du "Proliferating Cell Nuclear Antigen" humain (PCNA) etproduction d'une protéine recombinante

Le clonage de I'ADNc de PCNA est effectué par transcription reverse et PCR. Lapremière étape de transcription reverse (RT) est réalisée avec le kit "First StrandcDNA synthesis" de Pharmacia. L'ARN total est extrait de cellules musculaires lisseshumaines en culture primaire (Clonetics) selon la méthode décrite par P.Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem. 1987, 162: 156-159). 10 pg de cet ARNtotal est repris dans 20 pl d'eau sont chauffés 10 minutes à 65°C , refroidit sur glacepuis mélangés à 11 pl de "Bulk First Strand réaction mix" du kit de RT (Cloned,FPLCpwre®,Murine Reverse Transcriptase, RNase/DNase-Free BSA,dATP,dCTP,dGTP, and dTTP), 1 pl de DTP et Ipl d'amorces pD(N)6. Laréaction de RT est incubée 1 heure à 37°C. La réaction est arrêtée en chauffant 5minutes à 90°C puis refroidie sur glace.

La deuxième étape consiste en une amplification par PCR de I'ADNc PCNA. Lesamorces utilisées pour la réaction PCR sont les suivantes : 1 5'-CGCGcraattcTGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGG- 31

FEARLVQG 2 5 ' - GGTCcraattcTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC- 3 1

*SGEEDEIK

Les deux amorces introduisent un site EcoRI (minuscules soulignées). Lesacides aminés de PCNA contenus dans les amorces sont représentés par leur code 44 011c 34 (majuscules) en dessous des codons correspondants. * représente le codon stop de PCNA. 8 pl de la réaction RT , décrite ci-dessus, sont complétés à un volume final de 50 plcontenant les quantités ou les concentrations finales suivantes : 50 picomolesd'amorce 1, 50 picomoles d'amorce 2, une unité de Taq ADN polymérase (PerkinFJmer), 5 pl de MgCl2 (25 mM), 2 pl d'un mélange 200 mM des 4 désoxynucléotides(dATP, dTTP, dGTP et dCTP) et 5 pl du tampon PCR concentré 10 fois (PerkinElmer). L'amplification PCR est réalisée dans des tubes Micoamp1M (Perkin Elmer) à l'aided'un thermocycleur PTC-100IM (MJ Research, Inc.). Cette amplification consiste enune étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min suivie de 30 cycles comprenant uneétape de dénaturation de 15 sec à 95°C, une étape d'hybridation de 30 sec à 55°C etune étape d'extension de 1 min à 72°C. Ces trentes cycles sont suivis d'une extensionsupplémentaire de 5 min puis les réations PCR sont conservées à 10°C.

La réalisation pratique du clonage de PCNA dans le vecteur PCRII (Invitrogen)s'effectue avec le "Original TA Cloning® Kit" (Invitrogen). 3 pl de produit de PCR, 1pl de tampon de ligature 10X, 2 pl de vecteur pCRII (25 ng/pl), 3 pl d'eau et 1 pl deT4 ADN ligase sont incubés à 16 °C pendant 16 heures. 2 ml de cette réaction de ligature sont utilisés pour transformer des bactéries TGIcompétentes comme précédemment décrit. Les bactéries sont ensuit.es cultivées à37°c pendant 16 heures sur milieu solide LB contenant 1,5% d'Agar , 100 pg/mld'ampicilline en présence de X-gal pour la sélection bleu blanc des clonesrecombinants (alpha complémentation de la β-galactosidase).

Les clones recombinants (colonies blanches) sont repris dans 10 pl d'eau et confirmésdans les mêmes conditions que la PCR après la réaction de RT décrite ci-dessusexcepté que du triton. X-100 à une concentration finale de 0,01% v/v est ajouté à laréaction.

Plusieurs clones positifs sont utilisés pour faire des mini-préparations d'ADN, ceuxdont la partie 5' de l'insert PCNA est positionné en aval du site EcoRV de pCRII sontséquencés et retenus pour l'étape de clonage suivante.

Clonage de PCNA dans le plasmide pET29 est réalisé de la façon suivante : lefragment PCNA EcoRV- Hind III issu de PCRII-PCNA est inséré au niveau du siteEcoRV-Hind III de pET-29. Ce plasmide est alors utilisé pour la production de laprotéine recombinante chimère S-PCNA. Les étapes de transformation, de productionet de purification de S-PCNA sont identiques à celles utilisées pour la production del’antigène Ki fusionné à l’épitope myc.

13,2 Etude de l'interaction in vitro de GAX avec PCNA

Cette étude a été réalisée en suivant la même méthode utilisée dans l'exemple 9 pourétudier l'interaction entre les protéines recombinantes GST-GAX et SmycKi. 45

011 G

Des quantités croissantes de GST recombinante et de la chimère GST-GAX (50, 250,500 et 750 ng) ont été séparées sur un gel de polyacrylamide à 14% dénaturant(Novex). Les protéines sont transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose,laquelle est ensuite incubée dans une solution contenant la protéine recombinante S- 5 PCNA suivie d'un immunornarquage de PCNA à l'aide d'un anticorps monoclonalanti-PCNA (santa Cruz).

La figure 7 montre une faible interaction entre GST et PCNA uniquement aux hautesdoses de GST (500 et 750 ng). L'affinité de GST-GAX pour PCNA est très nettementsupérieure a celle avec GST. 10 Cette interaction spécifique entre GAX et PCNA suggère que l'activitéantiproliférative de GAX est mediée par une séquestration de PCNA. Le fait que Kipuisse interagir à la fois avec GAX et avec PCNA est en faveur de la formation decomplexes bi ou tripartite qui pourraient jouer un rôle important (activation ouinhibition) dans la progression du cycle cellulaire. 011034 46

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: 10 (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE - POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON

(C) VILLE: ANTONY

(E) PAYS: FRANCE (F) CODE POSTAL: 92165 (il) TITRE DE L' INVENTION : Polypeptides comprenant des domaines de la protéineimpliqués dans la répression de la transcription et/ou interagissant avec d'auprotéines, acides nucléique.s correspondants et leurs utilisations. (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: 15 (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (OEB) 20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple 25 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: 30 CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:35 (a) LONGUEUR: 50 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc 40

(iii) HYPOTHETIQUE: NON 47 011034

(iii) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: C.ATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGC.TGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC 50 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 53 paires de bases' (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTC.T GCÏCCATAAG CTT 53 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 4:

CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG 25 011034 48 (2) INFORMATION POUR LA SEQ WHO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(ii. i) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(Üi) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: GAGCGAATTC ATGACCATGA CCCTTCACAC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE; acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: 49 011034

GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 60 paires de bases (B) TYPE; acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(Üi) ΑΝΤΙ-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N°8:

TC.GAGAGGTC ATATTGACCT AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCC'TCCGAC TGCCATATGT

CTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG

ACGGTATACAGATC

Claims (21)

1. 50 011034 REVENDICATIONS

   1. Polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d’un fragment de la proteine GAX humainecomprenant au moins les résidus 1 à 32 la proteine GAX et possédant une activité derepresseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication del’ADN.
2. 2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend en outre, au moins lesrésidus 140 à 230 de la proteine GAX humaine.
3. 3. Polypeptide caractérisé en ce qu’il comprend au moins un fragment choisi parmi lesfragments 1-32, 33-302 et 1-104 de la proteine GAX humaine et possédant une activité derepresseur de la transcription et/ou affectant positivement ou négativement la réplication del’ADN.
4. 4. Polypeptide caractérisé en ce qu’il comprend au moins un fragment choisi parmi lesfragments 1 à 32 et 104 à 223 de la proteine GAX et capable d'interagir avec la proteine Ki.
5. 5. Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu’il est capable d’interagiravec PCNA.
6. 6. Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu’il est capable d’interagiravec Ki et/ou PCNA et de former un complexe au moins bipartite ou au moins tripartite avecces protéines.
7. 7. Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend outre un fragment de la proteine GAXpossédant une activité de represseur de la transcription, au moins un fragment d’originedifferente.
8. 8. Polypeptide selon la revendication 7 caractérisé en ce que ce fragment d’origine différente estdoté d’une activité biologique, est un marqueur ou un élément de ciblage.
9. 9. Acide nucléique codant pour un polypeptide selon l’une des revendications 1 à 7.
10. 10. Acide nucléique selon la revendication ^.caractérisé en ce qu’il s’agit d'un ADNc. 51 011034
11. 11. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou 10 souscontrôle d'un promoteur.
12. 12. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou 10 ou unecassette d'expression selon la revendication 11.
13. 13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu’il s'agit d’un vecteur viral.
14. 14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu’il s’agit d’un adénovirus.
15. 15. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu’il s’agit d’un rétrovirus.
16. 16. Utilisation polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 pour reprimer la transcriptionde gènes et/ou affecter positivement ou négativement la réplication de l'ADN.
17. 17. Utilisation de composés inhibant l’activité de la proteine Ki et/ou de PCNA pourl'obtention d'un médicament destiné à inhiber la prolifération de cellules musculaires lisses.
18. 18. Utilisation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 7 pour la formation d'uncomplexe bi- ou tri-partite avec les protéines Ki et/ou PCNA et affecter positivement ounégativement la progression du cycle cellulaire.
19. 19. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polypeptideselon l'une des revendications 1 à 7 ou un vecteur selon l'une des revendications 12 à 15.
20. 20. Procédé pour le criblage et/ou l’identification de polypeptides interagissant avec la proteineGAX ou un domaine de GAX caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'unedes revendications 1 à 7.
21. 21.Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide choisi parmiles fragments là 32 et 33 à 302 de la protéine GAX