CA2250099A1 - Sequences en amont du gene sm22, vecteurs les contenant et leurs utilisations therapeutiques, notamment dans le traitement des maladies vasculaires - Google Patents
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Abstract
Séquences d'ADN comprenant: un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes; et une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique. Cette séquence, ou un vecteur la contenant, peut être utilisée pour le traitement des maladies coronariennes, en particulier de la resténose.
Description
CA 022~0099 1998-09-25 W O 97/35974 PCT~R97/00543 SEQUENCES EN AMONT DU GENE SM 22, VECTEURS LES
CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS THERAPEUTIQUES, NOTAM M ENT
DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES VASCULAIRES
-La présente invention est relative à des sequences en amont d'un gene exprimé dans les cellules du muscle lisse! tel que SM 22, ainsi qu'à des vecteurs les contenant.
Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces vecteurs et séquences ~n en thérapeutique, par exemple pour la production de polypeptides actifs localement ou de manière systémique, notamment des polypeptides immunogènes, des polypeptides régulateurs endogènes tels que les cytokines, ou encore pour la production d'ARN d'intérêt thérapeutique.
par exemple un AF~N anti-sens . De maniere particulière, I'invention a pour objet l'utilisation des vecteurs et séquences nucléotidiques dans le traitement des maladies vasculaires.
L'atherosclérose est une maladie dégénérative des artères associant les lesions de l'artériosclérose et de l'athérome, et combinant ainsi un durcissement des artères et une dégénéréscence graisseuse de ~o leur tunique interne. Cette insuffisance coronarienne est généralement remédiée par une angioplastie coronaire percutanée consistant à
introduire dans le réseau artériel coronaire un cathéter muni à son extrémité d'un ballonnet, d'avancer le cathéter jusqu'au niveau de la sténose et de gonfler le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi et de rétablir ainsi un calibre coronaire permettant une perfusion rnyocardique suffisante.
Cette technique de revascularisation myocardique est très largement utilisée (~0 000 interventions par an en France et 500 000 interventions par an aux Etats-Unis) mais est cependant limitée par la ~o réapparition, dans les mois suivants l'opération, d'une nouvelle lésion au site dilaté, ou resténose, dans environ 30 % des cas.
Les divers traitements proposés pour traiter ce type de lésions sont résumés dans l'article de FELDMAN et STEG: "Perspective de la thérapie génique de la resténose" (Médecine/Sciences, synthèse 1996 12, 47-55) CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F~97/00543 Deux mécanismes sont responsables des resténoses :
I'hyperplasle intimale et le remodelage artériel. Le premier de ces mécanismes, I'hyperplasie intimale est due à la proliferation des cellules musculaires lisses dans l'intima, qui aboutit à la synthèse d'une volumineuse matrice extra cellulaire. Cette activation serait induite par la libération locale de facteurs de croissance, et de cytokines, ainsi que par la suppression de la synthèse de certains peptides endothéliaux antiproliferants. Le second mécanisme, le remodelage artériel, consiste en une réduction du calibre de l'artère sans modification de l'épaisseur n de la paroi, et donc sans prolifération de cellules.
Ces auteurs décrivent diverses tentatives destinées à inhiber l'hyperplasie intimale, par thérapie génique, mais dont les resultats se sont révéles peu satisfaisants, pour diverses raisons. L'inefficacité du transfert est une des raisons généralement invoquée pour expliquer ces , resultats. Ce problème a été partiellement résolu par l'utilisation de vecteurs adénoviraux, mais d'autres problèmes sont apparus, liés à
l'immunogénicité de ces virus, au risque de recombinaison avec des adénovirus sauvages ou au risque de dissémination de ces vecteurs dans la circulation systemique.
Ces auteurs citent en outre l'utilisation de séquences promotrices spécifiques des cellules vasculaires, comme la préproendothéline, ou des complexes adénovirus-ligand, comme constituant des voies de recherche très intéressantes, sans pour autant développer ces aspects.
La demande WO 96/05.321 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) décrit
CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS THERAPEUTIQUES, NOTAM M ENT
DANS LE TRAITEMENT DES MALADIES VASCULAIRES
-La présente invention est relative à des sequences en amont d'un gene exprimé dans les cellules du muscle lisse! tel que SM 22, ainsi qu'à des vecteurs les contenant.
Elle a en outre pour objet l'utilisation de ces vecteurs et séquences ~n en thérapeutique, par exemple pour la production de polypeptides actifs localement ou de manière systémique, notamment des polypeptides immunogènes, des polypeptides régulateurs endogènes tels que les cytokines, ou encore pour la production d'ARN d'intérêt thérapeutique.
par exemple un AF~N anti-sens . De maniere particulière, I'invention a pour objet l'utilisation des vecteurs et séquences nucléotidiques dans le traitement des maladies vasculaires.
L'atherosclérose est une maladie dégénérative des artères associant les lesions de l'artériosclérose et de l'athérome, et combinant ainsi un durcissement des artères et une dégénéréscence graisseuse de ~o leur tunique interne. Cette insuffisance coronarienne est généralement remédiée par une angioplastie coronaire percutanée consistant à
introduire dans le réseau artériel coronaire un cathéter muni à son extrémité d'un ballonnet, d'avancer le cathéter jusqu'au niveau de la sténose et de gonfler le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi et de rétablir ainsi un calibre coronaire permettant une perfusion rnyocardique suffisante.
Cette technique de revascularisation myocardique est très largement utilisée (~0 000 interventions par an en France et 500 000 interventions par an aux Etats-Unis) mais est cependant limitée par la ~o réapparition, dans les mois suivants l'opération, d'une nouvelle lésion au site dilaté, ou resténose, dans environ 30 % des cas.
Les divers traitements proposés pour traiter ce type de lésions sont résumés dans l'article de FELDMAN et STEG: "Perspective de la thérapie génique de la resténose" (Médecine/Sciences, synthèse 1996 12, 47-55) CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F~97/00543 Deux mécanismes sont responsables des resténoses :
I'hyperplasle intimale et le remodelage artériel. Le premier de ces mécanismes, I'hyperplasie intimale est due à la proliferation des cellules musculaires lisses dans l'intima, qui aboutit à la synthèse d'une volumineuse matrice extra cellulaire. Cette activation serait induite par la libération locale de facteurs de croissance, et de cytokines, ainsi que par la suppression de la synthèse de certains peptides endothéliaux antiproliferants. Le second mécanisme, le remodelage artériel, consiste en une réduction du calibre de l'artère sans modification de l'épaisseur n de la paroi, et donc sans prolifération de cellules.
Ces auteurs décrivent diverses tentatives destinées à inhiber l'hyperplasie intimale, par thérapie génique, mais dont les resultats se sont révéles peu satisfaisants, pour diverses raisons. L'inefficacité du transfert est une des raisons généralement invoquée pour expliquer ces , resultats. Ce problème a été partiellement résolu par l'utilisation de vecteurs adénoviraux, mais d'autres problèmes sont apparus, liés à
l'immunogénicité de ces virus, au risque de recombinaison avec des adénovirus sauvages ou au risque de dissémination de ces vecteurs dans la circulation systemique.
Ces auteurs citent en outre l'utilisation de séquences promotrices spécifiques des cellules vasculaires, comme la préproendothéline, ou des complexes adénovirus-ligand, comme constituant des voies de recherche très intéressantes, sans pour autant développer ces aspects.
La demande WO 96/05.321 (Rhone Poulenc Rorer S.A.) décrit
2~ aussi des adenovirus recombinants défectifs comportant un gène suicide pour le traitement de la resténose. Le gène suicide peut être placé sous le contrôle d'un promoteur actif dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Seul le promoteur de l'actine c~ du muscle lisse est cité dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre. Aucun exemple d'utilisation ~n d'une telle construction ne vient illustrer cette demande.
Les protéines constituant les muscles lisses ont fait l'objet d'études parcellaires Ainsi la protéine SM 22, qui constitue un des premiers marqueurs à apparaître lors de la différenciation des cellules de muscles lisses, a éte étudiée et la partie codante de son gène a été séquencée CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F1~97/00543 chez la souris (SOLWAY et AL, 1995, J. Biol. Chem, 270,22, 13460-13469) et chez le rat (KEMP et AL, 1995, BlOCti~M. J. 310,1037-1043).
Les sequences du gène de poulet et du gène humain ont aussi été
détermines (Nishida et al, 1991, Biochem. Int., 23,663-668 pour le gène de poulet; Thweatt et al, 1992, Biochem. Biophyse. Res. Comm., 187,1-7 pour le gène humain).
Le gène codant pour la protéine SM 22 alpha chez la souris est composé de cinq exons et comprend 6,2 kb. Il est présent en une seule copie dans le génome. SOLWAY et al. ont montré que les 441 paires de base en amont de la région codante du gène étaient nécessaires et suffisantes pour induire un taux important de transcription d'un gène reporteur, dans des cultures cellulaires primaires d'aortes de rats et dans les lignées A7rs. Ils ont dlautre part mis en evidence que les ARN
messagers de ce gène etaient exprimés à des taux importants dans , I'aorte, dans l'utérus, dans les poumons et dans l'intestin.
KEMP et al (1995, BIOCHEM. J. 310, 1037-1043.) ont cloné et séquencé le fragment de 1,9 kb en amont de la séquence codante du gène SM 22 de rat. Des délétions effectuées dans le fragment ont montré que la région du promoteur comprise entre les nucléotides +65 et -303 etaient plus actives qu'un fragment de 1,5 kb comprenant une partie importante de la région du gène non traduite, ce qui suggérerait la présence de séquences régulatrices à l'extrémité 5' du promoteur.
OSBOURN et AL (1995, Gene, 154, 249-253) ont aussi étudié la région 5' en amont du gène SM 22 du rat. Ils ont mis en évidence la présence de deux introns dans cette région.
On notera que ces études ont été faites in vitro en utilisant des cultures de cellules primaires de l'aorte, et non in vivo. Or, ces conditions d'expérimentation ne sont pas représentatives de l'activité
des gènes dans les cellules de l'organisme.
~o De plus, elles ne concernent qu'une région très limitée de la partie non codante du gène situee à l'extrémité 5', c'est-a-dire la partie en avai du nucleotide-441.
Plus récemment Li et ai. (1996, J. Cell. Biol~ 132, 849-859) ont étudié la régulation du gène SM22 à l'aide de souris transgéniques.
CA 022~0099 1998-09-2~
WO97/35974 ~ PCTIF1~97/00543 Néanmoinsl cet article ne mentionne aucune application de vecteurs portant des fragments de ce gène, et en tout état de cause aucune application thérapeutique.
En outre un nombre limité de constructions ont été fabriquées, et de manière genérale seul l'effet sur des embryons, et non sur des adultes, a eté testé.
Les auteurs déduisent de leur étude que les séquences comprises entre les nucléotides -2735 et -445 ne contiennent pas d'éléments régulateurs musculaires essentiels.
]o Le demandeur s'est attaché à identifier in vivo, sur des individus adultes l'activité des diverses régions constituant la région en amont de la séquence codante exprimée du gène de la protéine SM 22. Il s'est d'autre part attaché à déterminer si des modifications dans cette séquence induisait les changements dans l'expression du gène dans les différents tissus.
Il a mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible, en modifiant la région en 5' du gène de la protéine SM 22 de souris, d'obtenir, chez des individus adultes, une expression spécifique d'un gène reporteur dans les muscles lisses des artères et en particulier de ~o l'aorte.
Il a en outre montré que les séquences identifiées par Ll et al.
(1996, précédemment cités) comme ne contenant pas de séquences régulatrices essentielles, contenaient au contraire des séquences indispensables à une expression spécifique du gène SM 22 chez ~, I'adulte.
Il a enfin montré de manière surprenante que des séquences introniques étaient nécessaires pour l'induction d'une expression spécifique dans les artères.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN
.() caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d~une séquence hybridant dans des conditions fortement stringentes à ladite sequence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo de ce gène dans des cellules des artères, et CA 022~0099 1998-09-2~
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique .
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique ou oligonucléotide d'origine naturelle ou obtenue par synthèse chimique présentant une homologie avec la séquence SEQID n~1 d'au moins 70 %.
On entend par séquence nucléotidique d'origine naturelie, un fragment d'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse de l'ARN messager cellulaire ou encore un fragment d'ADN génomique obtenu après clivage de l'ADN cellulaire à l'aide d'enzymes de restriction.
On entend par séquence nucléotidique obtenue par synthèse chimique un fragment d'ADN de séquence connue géneré par synthèse automatique de polynucléotides, par exempie à l'aide d'un appareil automatique adapté.
On entend par protéine ou ARN d'intérêt thérapeutique une molécule susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les artères et/ou capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou 20 humorale.
Pour la présente invention, le terme "conditions fortement stringentes" est utilisé dans le sens donne par Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.
CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions. A titre préféré, les ~, conditions d'hybridation sont telles que décrites par Maniatis (édition de 1982). Trois lavages destinés à éliminer les fragments non hybridés sont nécessaires et sont effectués à 65~C en présence de 0,2 SSC et 0,1 %
SDS, en l'absence de formamide.
De manière avantageuse, ladite séquence comprend un fragment ,o de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +4135, dont la séquence SEQ ID n~1 est donnée en annexe, de séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +65 dont la séquence SEQ ID n~ 2 est donnée en annexe ou encore de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et -445 dont la séquence SEQ ID N~3 est donnée en annexe.
CA 022~0099 1998-09-2~
Elle peut aussi comprendre un fragment de la séquence SEQ ID N~
4.
Un tel fragment peut en particulier comprendre au moins une partie de la séquence SEQ ID N~5 qui correspond à la partie en amont de I'extrémité 5' de la partie codante comprise entre les nucléotides -2126 et -1340. Une telle séquence SEQ ID N~5 dont la sequence est donnée en annexe constitue un objet de la présente invention.
Les séquences SEQ ID n~ 2 et SEQ ID n~ 1 sont comprises respectivement dans les plasmides p2126nlz et p21261NTnlz portées par les souches deposées le 25 mars 1996 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n~ 1-1685 et 1-1686.
L'invention a également pour objet les séquences hybridant dans des conditions de forte stringence avec les séquences SEQ ID n~ 1, SEQ ID n~2, SEQ IDn~3etSEQ ID N~5.
Les séquences incluant la séquence du premier intron du gène SM
22, et en particulier la séquence SEQ ID N~ 1 constituent des modes de mise en oeuvre particulièrement avantageux de la présente invention, car elles permettent une expression de protéines ou ARN d'intérêt thérapeutique, chez l'adulte, spécifique des artères.
La présente invention n'est néanmoins pas restreinte à des séquences contenant des fragments du gène de souris, mais concerne toute autre séquence de toute autre espèce ayant les mêmes propriétés, à savoir d'induire spécifiquement une expression d'un gène dans les cellules des artères. Ainsi, I'homme du métier pourra avantageusement se reférer à l'article de KEMP et AL (1995, précédement cité) qui décrit la séquence en amont du gène de rat de la protéine SM 22. La présente invention couvre aussi toute séquence comprenant des fragments des séquences en amont de gènes de la protéine SM 22, modifiées par exemple par délétion de certaines structures qui conservent des fonctions identiques ou similaires a celles de la sequence complète.
La protéine d'intérêt thérapeutique peut être une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique, telle que la thymidine kinase du virus de l'herpès. Cette protéine présente la particularité de transformer le ganciclovir (Merck Index, reférence 4262), un analogue de la CA 022~0099 1998-09-2~
guanosine, en un dérivé qui bloque la synthèse de l'ADN dans les cellules en réplication. L'introduction d'un gène codant pour cette protéine dans les séquences selon la présente invention permet donc de bloquer la prolifération des cellules dans le cas de l'hyperplasie intimale.
- ~ Une sequence codant la thymidine kinase est notamment décrite parCaruso et Klatzmann (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 182-186).
~adite protéine d'intérêt thérapeutique peut aussi être une protéine présentant un effet cytostatique, telle que la protéine codée par le gène Rb (Chang et al., 1995, Science, 267, 518-522), ou par le gène eNOS
o (Hamon et al., 1994, Circulation, 90, 1357-1362) Elle peut aussi être une protéine présentant une activité lipolytique, telle qu'une lipoprotéine lipase. De telles protéines sont codées par les séquences décrites par Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) et Ming Sun Liu (1994~ J. Biol. Chem, 269-11417).
Elle peut aussi être un facteur de croissance des cellules endotheliales. Une telle protéine peut être en particulier une interleukine.
Elle peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, ou l'actine, ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le 2() collagène ou l'élastine.
Elle peut être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90 11092, et en particulier un antigène viral tel que la glycoprotéine gp120 ou la protéine Nef du VIH
(virus de l'immunodéficience humaine).
~, De manière générale, ladite protéine peut être une ou plusieurs proteines présentant un intérêt thérapeutique ou vaccinal, telles que des protéines d'intéret immunothérapeutique, par exemple des interleukines, les facteurs de croissance, par exemple les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou le NGF (Nerve Growth Factor), des protéines ,o pouvant induire une réponse immunitaire, que ce soit une immunité
humorale, cytotoxique ou cellulaire, ou des protéines permettant de complementer l'activité d'un gène normalement exprimé chez l'individu à
traiter mais qui ne l'est plus, soit par mutation ou délétion de sa sequence.
CA 022~0099 1998-09-2~
Cette séquence peut aussi coder pour un ARN d'intérêt thérapeutique. Un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p 53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90 11092, déposée par la société VICAL.
La présente invention a en outre pour objet des vecteurs caractérises en ce qu'ils contiennent une séquence selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. Un tel vecteur peut contenir tout autre séquence d'ADN nécessaire à l'expression de la protéine, ou de l'ARN, d'intérêt thérapeutique dans les tissus cibles, et en particulier peut contenir une origine de réplication efficace dans les cellules des artères, en particulier dans les cellules du muscle lisse.
Un tel vecteur peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène à
remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la séquence selon l'invention. Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité sera remplacé par le gène porté par le vecteur ou la séquence et que l'on désire voir s'exprimer dans l'organisme.
Une telle méthode de recombinaison homologue peut être du type 20 de celle décrite par Le Mouellic et al., (1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, - 87, 4712-4716) ou dans la demande PCT WO 91/06.667.
Un tel vecteur peut etre un vecteur dérivé d'un adénovirus. Des adénovirus adaptés à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux decrits par FELDMAN et STEG (1996, précédemment ~, cité) ou OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781-784) ou encore dans la demande FR 94.03.151 (Institut Pasteur, Inserm). Ces virus sont généralement rejetés par l'individu, du fait de leur trop forte immunogénicité. Néanmoins, des souches de ces virus ont été
sélectionnées afin de diminuer leur caractère immunogène. En tout état ~o de cause, ces vecteurs, meme présentant une forte immunogénicite, peuvent etre utilisés dans le cadre de la présente invention, car les artères sont traitées durant des périodes de temps relativement courtes, de l'ordre de quelques semaines, compatibles avec les temps de rejet des adénovirus par le système immunitaire de l'hôte.
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On notera néanmoins que l'introduction des séquences selon la présente invention dans les vecteurs décrits ci-dessus n'est pas indispensable, et que les cellules des artères peuvent être directement transfectées par de l'ADN comprenant ces sequences.
Les séquences nucléiques selon la présente invention peuvent etre introduites après couplage covalent de l'acide nucléique avec des composés favorisant leur pénétration dans les cellules ou leur transport vers le noyau, les conjugués resultants étant éventuellement encapsulés dans des microparticules polymères, comme dans la demande I0 internationale WO 94/27238 de Meidsorb Technologies International.
Selon un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être incluses dans un système de transfection comprenant des polypeptides favorisant leur penétration dans les cellules, comme dans la demande internationale WO 95/10534 de Seikagaku Corporation.
Ces vecteurs ou sequences peuvent être administrés in situ par tout moyen connu de l'homme du métier. Ainsi, ils peuvent être délivrés in situ à l'aide d'un cathéter à ballonnet recouvert de canaux, tel que décrit par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité).
Iis peuvent aussi être administrés au cours d'une opération, ou en ~o dénudant l'aorte. Un autre mode d'administration consiste à introduire un grillage de faible maillage imprégné d'ADN comprenant ces séquences, le long de l'aorte; tel que décrit par Feldman et al. (1995. J. Clin.
Invest. . 95. 2662-2671).
Ces séquences ou vecteurs peuvent avantageusement être administrés sous la forme d'une composition les contenant, par exemple dans un gel facilitant leur transfection dans les cellules des artères. Un tel gel peut être un complexe de poly-L Iysine et de lactose, tel que décrit par MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21, n~4, 871-878) ou du poloxamer 407 tel que décrit par PASTORE (1994, Circulation, 90, I-~o 517). Ils peuvent aussi être mis en solution dans une solutiontamponnée ou être associés à des liposomes.
La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant de telles séquences, vecteurs ou compositions. ainsi qu'à des-compositions pharmaceutiques les contenant en quantités CA 022~0099 1998-09-2~
pharmaceutiquement efficaces ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles.
De tels séquences, vecteurs ou compositions peuvent être avantageusement utiiisés pour la fabrication de médicaments pour la délivrance au niveau des artères d'un ADN (ADNc ou ADN génomique) pouvant exprimer notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, pour le traitement des maladies coronariennes, et en particulier pour ie traitement de la resténose. Elles peuvent néanmoins être aussi utilisées pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de o mutations fragilisant les vaisseaux. Un tel médicament pourrait, par exemple, comprendre une séquence ou un vecteur selon l'invention capable dexprimer un gène codant pour une protéine normale de la desmine ou une protéine d'adhésion du muscle du type CAM.
La présente invention a aussi pour objet des ARN exprimés à partir des séquences et vecteurs objets de la présente invention, et en particulier des ARN messager.
La présente invention a aussi pour objet un procéde de criblage de molécules in vitro, en vue de tester leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM 22. Un tel procédé
70 comprendra, par exemple, une première étape suivant laquelle on transfecte des cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'invention, comprenant un gène reporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la proteine SM 22. Dans une seconde étape, les cellules ainsi transfectées sont ~, incubées en presence de la molécule à tester, puis l'expression du gène reporteur est quantifiée.
Les cellules utilisées pour la transfection sont avantageusement des cellules de muscle lisse, en particulier des cellules de l'aorte, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme d'une lignée ~o cellulaire stable.
Dans le cas où les cellules sont transfectées par des constructions telles que p2126nlz ou p21261NTnlz, la quantification de la bêta-galactosidase produite sera avantageusement effectuée par lecture optique, par exemple en utilisant la trousse de détection commercialisée par Boehringer sous la référence 1 669 893 (catalogue Boehringer-CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 1~ PCT/~R97/00543 Mannheim - ~ Biochemicals ~, 1996, page 236, béta-Gal Reporter Gene Assay, Chemiluminescent).
Dans un autre mode de réalisation du procedé de criblage in vitro selon l'invention, le gène reporteur est le gène codant pour la luciférase - ~ Dans ce cas, la quantification de l'expression de la luciférase est avantageusement effectuée par chimioluminescence, par exemple au moyen de la trousse de diagnostic commercialisée par Boehringer sous la référence 1 758 241 (catalogue Boehringer-Mannheim ~ Biochemicals ~, 1996, Luciferase Reporter Gene Assay).
n La présente invention est aussi relative à des animaux transgéniques et en particulier des souris portant une séquence ou un vecteur tel que défini ci-dessus dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacée par un gène reporteur.
La présente invention est enfin relative à un procédé de détection ' de mutations de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22. De telles mutations sont en effet susceptibles de modifier l'expression du gène codant pour la protéine SM22, en particulier diminuer ou même abolir l'expression de ce gène dans les muscles lisses. De telles mutations seraient de nature à entraîner une modification du fonctionnement du muscle lisse, la protéine SM22 étant apparentée à une famille de protéines impliquées dans la régulation de la fixation du calcium, du type calponine (Ayme-Southgate et al, 1989, J.
Cell. Biol.). Un tel procédé de détection de mutations peut être avantageusement le procédé objet de la demande de brevet français FR-93 10821.
De manière complémentaire, des séquences selon l'invention modifiees de telle sorte qu'elles permettent une augmentation de l'expression du gène SM22 font également partie de l'invention.
De telles souris transgéniques peuvent être utilisées pour cribler ~n des molécules pour leur activité sur les séquences régulatrices gène codant pour la protéine SM 22. Des molécules peuvent être administrées à des souris, puis après sacrifice, des coupes histologiques sont effectuées afin de mettre en evidence les tissus colorés par le gène reporteur.
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Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du metier pourra avantageusement se référer au manuel suivant: "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989), ou à l'une de ses récentes rééditions.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent:
La figure 1 représente la carte de restriction et la structure exon/intron du site SM 22, comprenant la région -2474 à +6030 (par rapport au site d'initiation de la transcription). Les exons sont représentés par des carrés blancs tandis que les flèches indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 2 représente l'alignement de trois séquences répétees de type B1, dans lesquelles les échanges de base sont indiquées.
, La figure 3 est un autoradiogramme illustrant l'identification du site d'initiation de la transcription. Le puits P correspond à l'amorce utilisée.
La figure 4A représente la séquence de la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription, et de l'exon du gène SM 22. Les sites de fixation des différents facteurs sont indiques, ainsi que les différentes ~o séquences concensus. Les lignes discontinues indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 4B est une carte de restriction schematique du gène SM
22.
La figure 4C est une carte de restriction détaillée du gène SM 22.
~, La figure 5 illustre la fabrication du plasmide p352nlz.
La figure 6 illustre la fabrication du plasmide p2126 nlz.
La figure 7 illustre la fabrication du plasmide p21261NTnlz.
Les figures 8A et 8B illustrent l'expression du gene lacZ dans des embryons de souris transgéniques. Les figures 8A, 8B, représentent .n respectivement des embryons aux stades 12,5 et 15,5 jours.
Les figures 9A à 9D représentent des coupes histologiques d'embryons colorés à l'aide de lacZ. La figure 9A représente une coupe d'un embryon au stade 12,5 jours au niveau du coeur, montrant une coloration intense exclusivement dans le myocarde du ventricule droit (RV) et dans les parois des artères. (abréviations: AA: coude de la CA 022~0099 1998-09-2~
quatrième artère aortique; CA: artère carotidienne; E: oesophage; Iv:
ventricule gauche: PA: partie proximale de l'aorte; PT: tronc pulmonaire; RA: atrium droit; RV: ventricule droit; T trachée; V:
veine cardinale droite et gauche).
- ~ La figure 9B représente une coupe à travers la région abdominale dlun embryon au stade 14,5 jours, montrant une coloration des artères ombilicales (UA) et l'absence de marquage des viscères (B: vessie; D:
duodenum; H: gros intestin; L: foie; M: intestin grêle; ST: estomac).
La figure 9D est une coupe a travers les segments de la queue au ]() stade 12l5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a).
La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant à l'artère ombilicale au stade de 12l5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m~ et une absence de ~, marquage de l'endothélium (e).
Les figures lOA à lOC illustrent l'expression du transgène dans des souris adultes.
La figure lOA représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère ~o pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc). Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma). Le marquage de lacZ (figure 1 OB) montre que l'expression du transgène est restreinte a l'artère! tandis que l'immunofluorescence avec des anticorps ~, SM 22 (figure 1 OC) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon.
La figure 11 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gene codant la thymidine kinase du ,n virus de l'herpès.
Les figures 12A à 12D illustrent l'expression de la construction SM 445 nlz dans des embryons de 15,5 jours p.c. (figures 12A à 12C) et dans un adulte de 2 mois (figure 1 2D).
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WO 97/35974 PCT/F~197/00543 EXEMPLES:
Matériels et méthodes 1. Clonaqe et caractérisation du ~ene de la souris SM 22 Environ 1 o6 phages recombinants d'une banque génomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D.
Plachov, Munster, Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL l/Eco RV de 890 bp de l'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 ( Almendral et al, 1989; Exp. Cell Res. 181, 518-530), comme sonde. La sonde a été marquée radioactivement par initiation n aléatoire et l'ADN a été hybridée sur des filtres laissés durant une nuit à
65~C dans un tampon de Church. Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0, 1 % SDS à 65DC et des plaques positives ont été
purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques. L'un des clones isolés s'est révélé contenir un locus SM 22 entier. Il a été ensuite cartographié a l'aide d'enzymes de restriction et sous-cloné. Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de l'ADN génomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées.
~o La séquence du gène SM 22 a éte déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc.
Natl. Acad Sci. 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).
2. Hvbridation de type Northern, extension par amorce, ~, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse De l'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18.
5294-5299) modifiés. Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex (Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilisé en suivant les instructions du ;o fabricant.
Les analyses par hybridation de type Northern ont eté effectuees en utilisant des gels d~agarose contenant du formaldéhyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hybond-N (Amersham Life Science, Little Chalfont. Royaume Uni) selon les méthodes connus de I'homme du métier.
, . . . .
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W0 97/3~974 ~ 5 PCT/FR97/00543 Pour les analyses par extension d'amorce, un oligonucléotide synthétique de 30 nucléotides (P27N1) complementaire de la sequence +36 à +65 de l'ADN complémentaire du gène SM 22 présentant la séquence SEQ ID N~ 6:
(5'-AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGMGGAG-3), a été
marqué par de la polynucléotide kinase T4. 5 I~g d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybridés à 55~C avec 1-2 X 105 cpm de sonde purifiée et la réaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier. Les résuitats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide dénaturants à 6 %. Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription.
La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +112 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1) de l'ADN
complémentaire SM 22, tel que décrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci, 85, 8998-9002).
En vue des analyses de protection par la RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabrique et cloné par la méthode des bouts collants dans le site HinC ll du vecteur pBluescript SK+. La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée. Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I à
~, la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32P-CTP. La sonde (3 X 105 cpm) a été hybridée avec 5 ,ug d'ARN messager d'utérus de souris à 42~C durant une nuit Après hybridation, les échantillons ont été incubés avec des RNases A
et T ( 1 heure à 37~C), précipités, et analysés comme décrits pour ;o l'analyse par extension d'amorce.
Les protéines constituant les muscles lisses ont fait l'objet d'études parcellaires Ainsi la protéine SM 22, qui constitue un des premiers marqueurs à apparaître lors de la différenciation des cellules de muscles lisses, a éte étudiée et la partie codante de son gène a été séquencée CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F1~97/00543 chez la souris (SOLWAY et AL, 1995, J. Biol. Chem, 270,22, 13460-13469) et chez le rat (KEMP et AL, 1995, BlOCti~M. J. 310,1037-1043).
Les sequences du gène de poulet et du gène humain ont aussi été
détermines (Nishida et al, 1991, Biochem. Int., 23,663-668 pour le gène de poulet; Thweatt et al, 1992, Biochem. Biophyse. Res. Comm., 187,1-7 pour le gène humain).
Le gène codant pour la protéine SM 22 alpha chez la souris est composé de cinq exons et comprend 6,2 kb. Il est présent en une seule copie dans le génome. SOLWAY et al. ont montré que les 441 paires de base en amont de la région codante du gène étaient nécessaires et suffisantes pour induire un taux important de transcription d'un gène reporteur, dans des cultures cellulaires primaires d'aortes de rats et dans les lignées A7rs. Ils ont dlautre part mis en evidence que les ARN
messagers de ce gène etaient exprimés à des taux importants dans , I'aorte, dans l'utérus, dans les poumons et dans l'intestin.
KEMP et al (1995, BIOCHEM. J. 310, 1037-1043.) ont cloné et séquencé le fragment de 1,9 kb en amont de la séquence codante du gène SM 22 de rat. Des délétions effectuées dans le fragment ont montré que la région du promoteur comprise entre les nucléotides +65 et -303 etaient plus actives qu'un fragment de 1,5 kb comprenant une partie importante de la région du gène non traduite, ce qui suggérerait la présence de séquences régulatrices à l'extrémité 5' du promoteur.
OSBOURN et AL (1995, Gene, 154, 249-253) ont aussi étudié la région 5' en amont du gène SM 22 du rat. Ils ont mis en évidence la présence de deux introns dans cette région.
On notera que ces études ont été faites in vitro en utilisant des cultures de cellules primaires de l'aorte, et non in vivo. Or, ces conditions d'expérimentation ne sont pas représentatives de l'activité
des gènes dans les cellules de l'organisme.
~o De plus, elles ne concernent qu'une région très limitée de la partie non codante du gène situee à l'extrémité 5', c'est-a-dire la partie en avai du nucleotide-441.
Plus récemment Li et ai. (1996, J. Cell. Biol~ 132, 849-859) ont étudié la régulation du gène SM22 à l'aide de souris transgéniques.
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WO97/35974 ~ PCTIF1~97/00543 Néanmoinsl cet article ne mentionne aucune application de vecteurs portant des fragments de ce gène, et en tout état de cause aucune application thérapeutique.
En outre un nombre limité de constructions ont été fabriquées, et de manière genérale seul l'effet sur des embryons, et non sur des adultes, a eté testé.
Les auteurs déduisent de leur étude que les séquences comprises entre les nucléotides -2735 et -445 ne contiennent pas d'éléments régulateurs musculaires essentiels.
]o Le demandeur s'est attaché à identifier in vivo, sur des individus adultes l'activité des diverses régions constituant la région en amont de la séquence codante exprimée du gène de la protéine SM 22. Il s'est d'autre part attaché à déterminer si des modifications dans cette séquence induisait les changements dans l'expression du gène dans les différents tissus.
Il a mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible, en modifiant la région en 5' du gène de la protéine SM 22 de souris, d'obtenir, chez des individus adultes, une expression spécifique d'un gène reporteur dans les muscles lisses des artères et en particulier de ~o l'aorte.
Il a en outre montré que les séquences identifiées par Ll et al.
(1996, précédemment cités) comme ne contenant pas de séquences régulatrices essentielles, contenaient au contraire des séquences indispensables à une expression spécifique du gène SM 22 chez ~, I'adulte.
Il a enfin montré de manière surprenante que des séquences introniques étaient nécessaires pour l'induction d'une expression spécifique dans les artères.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN
.() caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d~une séquence hybridant dans des conditions fortement stringentes à ladite sequence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo de ce gène dans des cellules des artères, et CA 022~0099 1998-09-2~
- une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique .
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique ou oligonucléotide d'origine naturelle ou obtenue par synthèse chimique présentant une homologie avec la séquence SEQID n~1 d'au moins 70 %.
On entend par séquence nucléotidique d'origine naturelie, un fragment d'ADN complémentaire obtenu par transcription inverse de l'ARN messager cellulaire ou encore un fragment d'ADN génomique obtenu après clivage de l'ADN cellulaire à l'aide d'enzymes de restriction.
On entend par séquence nucléotidique obtenue par synthèse chimique un fragment d'ADN de séquence connue géneré par synthèse automatique de polynucléotides, par exempie à l'aide d'un appareil automatique adapté.
On entend par protéine ou ARN d'intérêt thérapeutique une molécule susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les artères et/ou capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou 20 humorale.
Pour la présente invention, le terme "conditions fortement stringentes" est utilisé dans le sens donne par Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.
CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions. A titre préféré, les ~, conditions d'hybridation sont telles que décrites par Maniatis (édition de 1982). Trois lavages destinés à éliminer les fragments non hybridés sont nécessaires et sont effectués à 65~C en présence de 0,2 SSC et 0,1 %
SDS, en l'absence de formamide.
De manière avantageuse, ladite séquence comprend un fragment ,o de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +4135, dont la séquence SEQ ID n~1 est donnée en annexe, de séquence comprise entre les nucléotides -2126 et +65 dont la séquence SEQ ID n~ 2 est donnée en annexe ou encore de la séquence comprise entre les nucléotides -2126 et -445 dont la séquence SEQ ID N~3 est donnée en annexe.
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Elle peut aussi comprendre un fragment de la séquence SEQ ID N~
4.
Un tel fragment peut en particulier comprendre au moins une partie de la séquence SEQ ID N~5 qui correspond à la partie en amont de I'extrémité 5' de la partie codante comprise entre les nucléotides -2126 et -1340. Une telle séquence SEQ ID N~5 dont la sequence est donnée en annexe constitue un objet de la présente invention.
Les séquences SEQ ID n~ 2 et SEQ ID n~ 1 sont comprises respectivement dans les plasmides p2126nlz et p21261NTnlz portées par les souches deposées le 25 mars 1996 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de l'lnstitut Pasteur (CNCM) respectivement sous les n~ 1-1685 et 1-1686.
L'invention a également pour objet les séquences hybridant dans des conditions de forte stringence avec les séquences SEQ ID n~ 1, SEQ ID n~2, SEQ IDn~3etSEQ ID N~5.
Les séquences incluant la séquence du premier intron du gène SM
22, et en particulier la séquence SEQ ID N~ 1 constituent des modes de mise en oeuvre particulièrement avantageux de la présente invention, car elles permettent une expression de protéines ou ARN d'intérêt thérapeutique, chez l'adulte, spécifique des artères.
La présente invention n'est néanmoins pas restreinte à des séquences contenant des fragments du gène de souris, mais concerne toute autre séquence de toute autre espèce ayant les mêmes propriétés, à savoir d'induire spécifiquement une expression d'un gène dans les cellules des artères. Ainsi, I'homme du métier pourra avantageusement se reférer à l'article de KEMP et AL (1995, précédement cité) qui décrit la séquence en amont du gène de rat de la protéine SM 22. La présente invention couvre aussi toute séquence comprenant des fragments des séquences en amont de gènes de la protéine SM 22, modifiées par exemple par délétion de certaines structures qui conservent des fonctions identiques ou similaires a celles de la sequence complète.
La protéine d'intérêt thérapeutique peut être une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique, telle que la thymidine kinase du virus de l'herpès. Cette protéine présente la particularité de transformer le ganciclovir (Merck Index, reférence 4262), un analogue de la CA 022~0099 1998-09-2~
guanosine, en un dérivé qui bloque la synthèse de l'ADN dans les cellules en réplication. L'introduction d'un gène codant pour cette protéine dans les séquences selon la présente invention permet donc de bloquer la prolifération des cellules dans le cas de l'hyperplasie intimale.
- ~ Une sequence codant la thymidine kinase est notamment décrite parCaruso et Klatzmann (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 182-186).
~adite protéine d'intérêt thérapeutique peut aussi être une protéine présentant un effet cytostatique, telle que la protéine codée par le gène Rb (Chang et al., 1995, Science, 267, 518-522), ou par le gène eNOS
o (Hamon et al., 1994, Circulation, 90, 1357-1362) Elle peut aussi être une protéine présentant une activité lipolytique, telle qu'une lipoprotéine lipase. De telles protéines sont codées par les séquences décrites par Reyner (1995, Nature Genetics, 10, 28) et Ming Sun Liu (1994~ J. Biol. Chem, 269-11417).
Elle peut aussi être un facteur de croissance des cellules endotheliales. Une telle protéine peut être en particulier une interleukine.
Elle peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, ou l'actine, ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le 2() collagène ou l'élastine.
Elle peut être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90 11092, et en particulier un antigène viral tel que la glycoprotéine gp120 ou la protéine Nef du VIH
(virus de l'immunodéficience humaine).
~, De manière générale, ladite protéine peut être une ou plusieurs proteines présentant un intérêt thérapeutique ou vaccinal, telles que des protéines d'intéret immunothérapeutique, par exemple des interleukines, les facteurs de croissance, par exemple les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) ou le NGF (Nerve Growth Factor), des protéines ,o pouvant induire une réponse immunitaire, que ce soit une immunité
humorale, cytotoxique ou cellulaire, ou des protéines permettant de complementer l'activité d'un gène normalement exprimé chez l'individu à
traiter mais qui ne l'est plus, soit par mutation ou délétion de sa sequence.
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Cette séquence peut aussi coder pour un ARN d'intérêt thérapeutique. Un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p 53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90 11092, déposée par la société VICAL.
La présente invention a en outre pour objet des vecteurs caractérises en ce qu'ils contiennent une séquence selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. Un tel vecteur peut contenir tout autre séquence d'ADN nécessaire à l'expression de la protéine, ou de l'ARN, d'intérêt thérapeutique dans les tissus cibles, et en particulier peut contenir une origine de réplication efficace dans les cellules des artères, en particulier dans les cellules du muscle lisse.
Un tel vecteur peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène à
remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la séquence selon l'invention. Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité sera remplacé par le gène porté par le vecteur ou la séquence et que l'on désire voir s'exprimer dans l'organisme.
Une telle méthode de recombinaison homologue peut être du type 20 de celle décrite par Le Mouellic et al., (1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, - 87, 4712-4716) ou dans la demande PCT WO 91/06.667.
Un tel vecteur peut etre un vecteur dérivé d'un adénovirus. Des adénovirus adaptés à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux decrits par FELDMAN et STEG (1996, précédemment ~, cité) ou OHNO et al (1994, Sciences, 265, 781-784) ou encore dans la demande FR 94.03.151 (Institut Pasteur, Inserm). Ces virus sont généralement rejetés par l'individu, du fait de leur trop forte immunogénicité. Néanmoins, des souches de ces virus ont été
sélectionnées afin de diminuer leur caractère immunogène. En tout état ~o de cause, ces vecteurs, meme présentant une forte immunogénicite, peuvent etre utilisés dans le cadre de la présente invention, car les artères sont traitées durant des périodes de temps relativement courtes, de l'ordre de quelques semaines, compatibles avec les temps de rejet des adénovirus par le système immunitaire de l'hôte.
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On notera néanmoins que l'introduction des séquences selon la présente invention dans les vecteurs décrits ci-dessus n'est pas indispensable, et que les cellules des artères peuvent être directement transfectées par de l'ADN comprenant ces sequences.
Les séquences nucléiques selon la présente invention peuvent etre introduites après couplage covalent de l'acide nucléique avec des composés favorisant leur pénétration dans les cellules ou leur transport vers le noyau, les conjugués resultants étant éventuellement encapsulés dans des microparticules polymères, comme dans la demande I0 internationale WO 94/27238 de Meidsorb Technologies International.
Selon un autre mode de réalisation, les séquences nucléiques peuvent être incluses dans un système de transfection comprenant des polypeptides favorisant leur penétration dans les cellules, comme dans la demande internationale WO 95/10534 de Seikagaku Corporation.
Ces vecteurs ou sequences peuvent être administrés in situ par tout moyen connu de l'homme du métier. Ainsi, ils peuvent être délivrés in situ à l'aide d'un cathéter à ballonnet recouvert de canaux, tel que décrit par FELDMAN et STEG (1996, précédemment cité).
Iis peuvent aussi être administrés au cours d'une opération, ou en ~o dénudant l'aorte. Un autre mode d'administration consiste à introduire un grillage de faible maillage imprégné d'ADN comprenant ces séquences, le long de l'aorte; tel que décrit par Feldman et al. (1995. J. Clin.
Invest. . 95. 2662-2671).
Ces séquences ou vecteurs peuvent avantageusement être administrés sous la forme d'une composition les contenant, par exemple dans un gel facilitant leur transfection dans les cellules des artères. Un tel gel peut être un complexe de poly-L Iysine et de lactose, tel que décrit par MIDOUX (1993, Nucleic Acid Research, 21, n~4, 871-878) ou du poloxamer 407 tel que décrit par PASTORE (1994, Circulation, 90, I-~o 517). Ils peuvent aussi être mis en solution dans une solutiontamponnée ou être associés à des liposomes.
La présente invention est en outre relative à des médicaments contenant de telles séquences, vecteurs ou compositions. ainsi qu'à des-compositions pharmaceutiques les contenant en quantités CA 022~0099 1998-09-2~
pharmaceutiquement efficaces ainsi que des excipients pharmaceutiquement compatibles.
De tels séquences, vecteurs ou compositions peuvent être avantageusement utiiisés pour la fabrication de médicaments pour la délivrance au niveau des artères d'un ADN (ADNc ou ADN génomique) pouvant exprimer notamment un gène codant pour une protéine d'intérêt, pour le traitement des maladies coronariennes, et en particulier pour ie traitement de la resténose. Elles peuvent néanmoins être aussi utilisées pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de o mutations fragilisant les vaisseaux. Un tel médicament pourrait, par exemple, comprendre une séquence ou un vecteur selon l'invention capable dexprimer un gène codant pour une protéine normale de la desmine ou une protéine d'adhésion du muscle du type CAM.
La présente invention a aussi pour objet des ARN exprimés à partir des séquences et vecteurs objets de la présente invention, et en particulier des ARN messager.
La présente invention a aussi pour objet un procéde de criblage de molécules in vitro, en vue de tester leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM 22. Un tel procédé
70 comprendra, par exemple, une première étape suivant laquelle on transfecte des cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'invention, comprenant un gène reporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la proteine SM 22. Dans une seconde étape, les cellules ainsi transfectées sont ~, incubées en presence de la molécule à tester, puis l'expression du gène reporteur est quantifiée.
Les cellules utilisées pour la transfection sont avantageusement des cellules de muscle lisse, en particulier des cellules de l'aorte, soit sous la forme d'une culture primaire, soit sous la forme d'une lignée ~o cellulaire stable.
Dans le cas où les cellules sont transfectées par des constructions telles que p2126nlz ou p21261NTnlz, la quantification de la bêta-galactosidase produite sera avantageusement effectuée par lecture optique, par exemple en utilisant la trousse de détection commercialisée par Boehringer sous la référence 1 669 893 (catalogue Boehringer-CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 1~ PCT/~R97/00543 Mannheim - ~ Biochemicals ~, 1996, page 236, béta-Gal Reporter Gene Assay, Chemiluminescent).
Dans un autre mode de réalisation du procedé de criblage in vitro selon l'invention, le gène reporteur est le gène codant pour la luciférase - ~ Dans ce cas, la quantification de l'expression de la luciférase est avantageusement effectuée par chimioluminescence, par exemple au moyen de la trousse de diagnostic commercialisée par Boehringer sous la référence 1 758 241 (catalogue Boehringer-Mannheim ~ Biochemicals ~, 1996, Luciferase Reporter Gene Assay).
n La présente invention est aussi relative à des animaux transgéniques et en particulier des souris portant une séquence ou un vecteur tel que défini ci-dessus dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacée par un gène reporteur.
La présente invention est enfin relative à un procédé de détection ' de mutations de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22. De telles mutations sont en effet susceptibles de modifier l'expression du gène codant pour la protéine SM22, en particulier diminuer ou même abolir l'expression de ce gène dans les muscles lisses. De telles mutations seraient de nature à entraîner une modification du fonctionnement du muscle lisse, la protéine SM22 étant apparentée à une famille de protéines impliquées dans la régulation de la fixation du calcium, du type calponine (Ayme-Southgate et al, 1989, J.
Cell. Biol.). Un tel procédé de détection de mutations peut être avantageusement le procédé objet de la demande de brevet français FR-93 10821.
De manière complémentaire, des séquences selon l'invention modifiees de telle sorte qu'elles permettent une augmentation de l'expression du gène SM22 font également partie de l'invention.
De telles souris transgéniques peuvent être utilisées pour cribler ~n des molécules pour leur activité sur les séquences régulatrices gène codant pour la protéine SM 22. Des molécules peuvent être administrées à des souris, puis après sacrifice, des coupes histologiques sont effectuées afin de mettre en evidence les tissus colorés par le gène reporteur.
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Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du metier pourra avantageusement se référer au manuel suivant: "SAMBROK et al (Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 1989), ou à l'une de ses récentes rééditions.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent:
La figure 1 représente la carte de restriction et la structure exon/intron du site SM 22, comprenant la région -2474 à +6030 (par rapport au site d'initiation de la transcription). Les exons sont représentés par des carrés blancs tandis que les flèches indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 2 représente l'alignement de trois séquences répétees de type B1, dans lesquelles les échanges de base sont indiquées.
, La figure 3 est un autoradiogramme illustrant l'identification du site d'initiation de la transcription. Le puits P correspond à l'amorce utilisée.
La figure 4A représente la séquence de la région 5' en amont du site d'initiation de la transcription, et de l'exon du gène SM 22. Les sites de fixation des différents facteurs sont indiques, ainsi que les différentes ~o séquences concensus. Les lignes discontinues indiquent la position des séquences répétées de type B1.
La figure 4B est une carte de restriction schematique du gène SM
22.
La figure 4C est une carte de restriction détaillée du gène SM 22.
~, La figure 5 illustre la fabrication du plasmide p352nlz.
La figure 6 illustre la fabrication du plasmide p2126 nlz.
La figure 7 illustre la fabrication du plasmide p21261NTnlz.
Les figures 8A et 8B illustrent l'expression du gene lacZ dans des embryons de souris transgéniques. Les figures 8A, 8B, représentent .n respectivement des embryons aux stades 12,5 et 15,5 jours.
Les figures 9A à 9D représentent des coupes histologiques d'embryons colorés à l'aide de lacZ. La figure 9A représente une coupe d'un embryon au stade 12,5 jours au niveau du coeur, montrant une coloration intense exclusivement dans le myocarde du ventricule droit (RV) et dans les parois des artères. (abréviations: AA: coude de la CA 022~0099 1998-09-2~
quatrième artère aortique; CA: artère carotidienne; E: oesophage; Iv:
ventricule gauche: PA: partie proximale de l'aorte; PT: tronc pulmonaire; RA: atrium droit; RV: ventricule droit; T trachée; V:
veine cardinale droite et gauche).
- ~ La figure 9B représente une coupe à travers la région abdominale dlun embryon au stade 14,5 jours, montrant une coloration des artères ombilicales (UA) et l'absence de marquage des viscères (B: vessie; D:
duodenum; H: gros intestin; L: foie; M: intestin grêle; ST: estomac).
La figure 9D est une coupe a travers les segments de la queue au ]() stade 12l5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a).
La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant à l'artère ombilicale au stade de 12l5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m~ et une absence de ~, marquage de l'endothélium (e).
Les figures lOA à lOC illustrent l'expression du transgène dans des souris adultes.
La figure lOA représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère ~o pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc). Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma). Le marquage de lacZ (figure 1 OB) montre que l'expression du transgène est restreinte a l'artère! tandis que l'immunofluorescence avec des anticorps ~, SM 22 (figure 1 OC) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon.
La figure 11 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gene codant la thymidine kinase du ,n virus de l'herpès.
Les figures 12A à 12D illustrent l'expression de la construction SM 445 nlz dans des embryons de 15,5 jours p.c. (figures 12A à 12C) et dans un adulte de 2 mois (figure 1 2D).
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WO 97/35974 PCT/F~197/00543 EXEMPLES:
Matériels et méthodes 1. Clonaqe et caractérisation du ~ene de la souris SM 22 Environ 1 o6 phages recombinants d'une banque génomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D.
Plachov, Munster, Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL l/Eco RV de 890 bp de l'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 ( Almendral et al, 1989; Exp. Cell Res. 181, 518-530), comme sonde. La sonde a été marquée radioactivement par initiation n aléatoire et l'ADN a été hybridée sur des filtres laissés durant une nuit à
65~C dans un tampon de Church. Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0, 1 % SDS à 65DC et des plaques positives ont été
purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques. L'un des clones isolés s'est révélé contenir un locus SM 22 entier. Il a été ensuite cartographié a l'aide d'enzymes de restriction et sous-cloné. Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de l'ADN génomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées.
~o La séquence du gène SM 22 a éte déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc.
Natl. Acad Sci. 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).
2. Hvbridation de type Northern, extension par amorce, ~, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse De l'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18.
5294-5299) modifiés. Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex (Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilisé en suivant les instructions du ;o fabricant.
Les analyses par hybridation de type Northern ont eté effectuees en utilisant des gels d~agarose contenant du formaldéhyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hybond-N (Amersham Life Science, Little Chalfont. Royaume Uni) selon les méthodes connus de I'homme du métier.
, . . . .
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W0 97/3~974 ~ 5 PCT/FR97/00543 Pour les analyses par extension d'amorce, un oligonucléotide synthétique de 30 nucléotides (P27N1) complementaire de la sequence +36 à +65 de l'ADN complémentaire du gène SM 22 présentant la séquence SEQ ID N~ 6:
(5'-AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGMGGAG-3), a été
marqué par de la polynucléotide kinase T4. 5 I~g d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybridés à 55~C avec 1-2 X 105 cpm de sonde purifiée et la réaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier. Les résuitats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamide dénaturants à 6 %. Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription.
La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +112 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1) de l'ADN
complémentaire SM 22, tel que décrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl. Acad. Sci, 85, 8998-9002).
En vue des analyses de protection par la RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabrique et cloné par la méthode des bouts collants dans le site HinC ll du vecteur pBluescript SK+. La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée. Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I à
~, la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32P-CTP. La sonde (3 X 105 cpm) a été hybridée avec 5 ,ug d'ARN messager d'utérus de souris à 42~C durant une nuit Après hybridation, les échantillons ont été incubés avec des RNases A
et T ( 1 heure à 37~C), précipités, et analysés comme décrits pour ;o l'analyse par extension d'amorce.
3. Culture cellulaire et transfection Les lignées cellulaires NIH 3T3, 10T112 et 8/47 ont ete cultivees dans du DMEM (Life Technologies, Inc, Vienne, Autriche) complémentées avec 10 % de sérum de foetus de veau (Hyclone Inc.,Etats-Unis~ à 37~C, dans une atmosphère de Co2 à 7%.
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4 PCTIFR97/00543 Pour les expériences de transfection, des cellules confluentes ont été étalées, repiquées dans des boîtes de Petri de 6 cm, et laissées croître jusqu'à obtenir approximativement une confluence de 75 % avant ajout du melange de transfection.
Les transfections ont été effectuées en utilisant le réactif Lipofectamine commercialisé par Life Technolo~ies Inc..
En résumé 24 1~9 de Lipofectamine ont été ajoutés à 6 ,ug de plasmide portant le gène reporteur superenroulé et 2 1~9 de PCMV(3 gal comme témoin interne. Après ajout de 3 ml de DMEM, le cocktail de transfection a été ajouté aux cellules. Au bout de 6 heures, ce mélange a été remplacé avec du milieu de croissance contenant 10 % de sérum et à nouveau changé au bout de 12 heures. L'expression du produit du gène reporteur a été analysée après 24 heures. Pour les expériences de stimulation par le sérum, des cellules transfectées ont eté placées dans du DMEM contenant 20 % de sérum, 24 heures avant d'être récoltées.
4. Dosaqe de la CAT et de la ~-qalactosidase Les cellules ont été prélevées sur des boîtes de pétri avec un racloir à cellules, centrifugées, resuspendues dans 150 ,ul de tampon Z
(100 mM de phosphate de sodium, pH 7,5, 1mM MgCI2, 10 nM KCI, 50 ~o nM~ - mercaptoethanol) et Iysées par trois cycles de congélation/décongélation Les débris ont été éliminés par centrifugation à basse vitesse et l'activité de la 13-galactosidase a ete déterminée à partir de 2 à 20 1~l de surnageant selon les procédés connus de l'homme du metier. Pour la détermination de l'activité CAT
selon GORMAN et al (1982 Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051), de 10 à 100 ,ul de Iysat ont été utilisés. Afin de tenir compte des variations dans l'efficacité de transfection I'activité CAT a été normalisée avec l'activité
13gal.
Les transfections ont été effectuées en utilisant le réactif Lipofectamine commercialisé par Life Technolo~ies Inc..
En résumé 24 1~9 de Lipofectamine ont été ajoutés à 6 ,ug de plasmide portant le gène reporteur superenroulé et 2 1~9 de PCMV(3 gal comme témoin interne. Après ajout de 3 ml de DMEM, le cocktail de transfection a été ajouté aux cellules. Au bout de 6 heures, ce mélange a été remplacé avec du milieu de croissance contenant 10 % de sérum et à nouveau changé au bout de 12 heures. L'expression du produit du gène reporteur a été analysée après 24 heures. Pour les expériences de stimulation par le sérum, des cellules transfectées ont eté placées dans du DMEM contenant 20 % de sérum, 24 heures avant d'être récoltées.
4. Dosaqe de la CAT et de la ~-qalactosidase Les cellules ont été prélevées sur des boîtes de pétri avec un racloir à cellules, centrifugées, resuspendues dans 150 ,ul de tampon Z
(100 mM de phosphate de sodium, pH 7,5, 1mM MgCI2, 10 nM KCI, 50 ~o nM~ - mercaptoethanol) et Iysées par trois cycles de congélation/décongélation Les débris ont été éliminés par centrifugation à basse vitesse et l'activité de la 13-galactosidase a ete déterminée à partir de 2 à 20 1~l de surnageant selon les procédés connus de l'homme du metier. Pour la détermination de l'activité CAT
selon GORMAN et al (1982 Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051), de 10 à 100 ,ul de Iysat ont été utilisés. Afin de tenir compte des variations dans l'efficacité de transfection I'activité CAT a été normalisée avec l'activité
13gal.
5. Production des souris transqéniques Des inserts des plasmides pnlz2126 et p21261NTnlz. déposés auprès de la CNCM respectivement sous les n~1-1685 et n~1-1686, ont eté isolés par digestion avec Sal l/Pme 1, suivie d'une électrophorèse sur gel, puis d'une purification utilisant le kit Geneclean (Bio 101. Ia Jolla, CA) puis resuspendus dans 10 mM de Tris Hcl pH 7,5, 0,25mM EDTA.
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Les animaux transgéniques ont été produits comme décrits précédemment par Ll et al (1993, Development, 17713, 947-959).
Des souris portant le transgène ont été Identifiées par PCR et hybridation de type Southern en utilisant une sonde ADN. La construction pnlz2126 a permis d'obtenir trois animaux positifs sur 17 souris, deux d'entre elles transmettant et exprimant cette construction.
Pour la construction p21261NTnlz deux animaux positifs sur les 28 testes ont été obtenus et à nouveau un seul exprime et transmet cette construction.
Les souris transgéniques ont été rétro-croisées avec des souris c57/bl et les colorations histochimiques ont été effectuées avec des souris hémizygotes pour le transgène.
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Les animaux transgéniques ont été produits comme décrits précédemment par Ll et al (1993, Development, 17713, 947-959).
Des souris portant le transgène ont été Identifiées par PCR et hybridation de type Southern en utilisant une sonde ADN. La construction pnlz2126 a permis d'obtenir trois animaux positifs sur 17 souris, deux d'entre elles transmettant et exprimant cette construction.
Pour la construction p21261NTnlz deux animaux positifs sur les 28 testes ont été obtenus et à nouveau un seul exprime et transmet cette construction.
Les souris transgéniques ont été rétro-croisées avec des souris c57/bl et les colorations histochimiques ont été effectuées avec des souris hémizygotes pour le transgène.
6.Colorations histochimiques Des embryons entiers ou des tissus d'adultes ont ete fixes durant , 15 à 30 minutes à 4~C dans du formaldéhyde à 1 % dans du tampon A
(100 mM de phosphate de sodium, pH 7,3,2 mM Mgc12, 0,1% de sodium de deoxycholate, et 0.2 % NP-40). Après rinçage, les spécimens ont été
colorés durant une nuit à 30 ~C dans du tampon A contenant 1 mg/ml de X - gal (Sigma, St Louis, I\/lissouri), 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5mM de ferricyanure de potassium, et 20 mM de Tris-CI pH 7,3. Les echantillons colorés ont alors eté rincés, déshydratés à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, clarifiés dans du xylène, et enrobés dans de la paraffine. Les coupes histologiques ont éte e~ectuées avec une épaisseur de 7 à 10 ,um et à nouveau colorées avec ~, de l'hématoxline d'Ehrlich et de l'éosine. Les embryons ont d'autre part pu être à nouveau clarifiés à l'aide d'un melange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle.
Pour l'immunohistocoloration, les tissus de souris ont été fixés dans 3 % de paraformaldéhyde dans du tampon PBS à 4~C durant 3 ,() heures, puis enrobés dans un milieu Tissue-Tek (Reichert-Jung, Vienne) et sectionnés sur un cryo-microtome à des épaisseurs de 5 à 10 ,um. Les coupes sélectionnées ont éte montees et colorées en utilisant un antic~rps monoclonal dirigé à l'encontre de la SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations, 55, 1-1~), à une dilution 1/30 ainsi qu'en utilisant un anticorps secondaire marque Cy3 (Biological Detection Systems, CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/FR97/00!j43 USA). Les coupes ont été examinées à l'aide d'un microscope à
fluorescence.
EXEMPLE 1.
Caractérisation du locus SM 22 Le criblage par hybridation de la banque génomique de souris a conduit à l'isolement de trois clones se recouvrant, contenant le gène complet de la SM 22. Une carte de restriction, qui est partiellement reproduite sur la figure 1 a été établie et les exons ont été localisés par hybridation à l'aide de sondes oligonucléotidiques synthétiques.
n Les régions présentant un intérêt ont été sous clonées et séquencées.
La sequence a été déterminée entre les positions -2474 et +110 en aval du site de polyadenylation et a été comparée dans la banque de données EMBL. Le gène couvre 5923 bp à partir du site de debut de la , transcription jusqu'au site de polyadenylation et la séquence codante est partagée en 5 exons (figure 1). Toutes les frontières exon-intron correspondent à des séquences consensus.
Le premier exon contient seulement une séquence leader en 5' et le codon de départ de la transcription est donc localisé dans le second exon separé du site de départ de la transcription par plus de 4kbp de séquence d'intron.
Deux signaux de polyadenylation potentiels ont été localisés au position 5905 et 5913 et plusieurs régions TGT placées en aval du site de polyadénylation, prennent vraisemblablement part dans la terminaison de la transcription.
L'analyse de la sequence révèle de plus la présence de trois séquences répétées (figure 2) qui présentent des homologies importantes avec les eléments répétés de type B1, dont certains sont transcrits par la RNA polymérase lll et codent pour des ARN 5S. On ~n notera que toutes les séquences répétées sont dans une orientation inverse par rapport au locus SM 22.
Le site de départ de la transcription a eté cartographiée par analyse par extension d'amorce (figure 3). Un oligonucléotide antisens complémentaire de l'extrémité 3' de l'exon 1 conduit à l'obtention de quatre produits d'extension qui diffèrent seulement par une paire de CA 022~0099 1998-09-2~
bases (bp) en longueur, le plus long d'entre eux étant de 65 bp. Le produit de la transcription démarre donc avec un G, 77bp en amont du codon d'initiation de la transcription Les produits d'extension les plus courts ont eté vraisemblablement causés par une terminaison prématurée de l'extension de l'amorce dûe à
des modifications (capping) à extrémité 5' de l'ARN messager.
Ces résultats ont éte confirmés par l'analyse par protection par la RNAse I qui conduit à un fragment protégé de 65bp et par le clonage et ie sequençage du produit d'extension derivé d'une réaction indépendante avec une amorce antisens située dans le second exon du gène.
Ces résultats sont en accord avec ceux de Solway et al (1995 précédemment cité). Des différences de séquences mineures entre ces deux resultats sont vraisemblablement dues à des variations alléliques 15 entre les différentes souches de souris.
La séquence TTTAM en position -28bp (figure 4) est en relation étroite avec la sequence TATAM et a vraisemblablement la fonction d'une boîte TAT~. L'analyse par ordinateur de la séquence en 5' révèle la présence de plusieurs sites potentiels de liaison pour des facteurs 2() ainsi que pour des eléments qui sont connus comme contribuant à la régulation de la transcription de gène musculaires (figure 4). Au total 11 boîtes de type E (CANNTG), quatre motifs du type Mef-2/rSRF
(YTAWAMTAR), quatre éléments de liaison SRF potentiels (CC(A/T)6GG), cinq sites de liaision AP-2 (CCCMNSSS) et cinq motifs 2~ SP1 (GGGCGG) ont été localises. Enfin, un élément similaire au motif TGT3-3, récemment identifié comme site de liaison d'un facteur nucléaire du muscle lisse et comme contribuant à la régulation de la transcription de l'actine alpha du muscle lisse, a été localisé (figure 4).
3() Clonaqe et construction de plasmides recombinants pour la création de souris transqéniques 1 Fabrication de pnlz Le plasmide pGEM7 (c'est-à-dire le plasmide pGEM-72F (+/-), commercialisé par Promega Corp., Madison, Wi, USA. Séquences .~ disponibles dans Gen Bank, sous les numéros suivants: X65310 et X
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WO 9713~i974 PCT/FR97tO0543 '~O
65311) comprend un gène de résistance à l'ampicilline, un gène lac Z et une origine de réplication. Il comprend 3000 paires de base. Il a été
digéré avec Nae l/Bsp 1201. L'extrémité sortante Bsp 1201 du vecteur a été rendue ~ bouts francs ~ avec l'enzyme de Klenow, et le plasmide a été refermé en présence d'un linker Sal I de 10 pb. Le fragment lacZ de pGEM 7 a donc été déleté, un site Sal I introduit, et un site Bsp 1201 restauré.
Un site Pme I a été introduit par insertion d'un linker Pme I avec des extrémités simple-brin sortantes Nsi 1, dans le site Nsi I de la o construction.
Finalement, le gène lacZ couplé au signal de localisation nucléaire a été isolé à partir de pDes2.2nlz (Ll et al, 1993, précédemment cité) avec Hind lll et Sac I donnant deux fragments du gene rapporteur.
Les deux fragments ont été insérés entre les sites Hind lll et Sac I
du vecteur pGEM7 modifié et vérifiés pour leur orientation. Cette procédure donne le vecteur pnlz sans promoteur.
2. Fabrication de p352nlz La figure 5 illustre la fabrication de ce plasmide.
Un fragment PCR de 417 pb couvrant la région -352 à +65 du gène 2n SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N~ 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 à + 4135, a été produit et inséré dans le site Hinc ll rendu bout-franc du vecteur pBluescriptSK+. La séquence du fragment PCR a été vérifiée. Le fragment est récupéré par les sites Xba I et Xho I et inséré dans le 2~ plasmide pBLCAT 3 dans les sites correspondants, générant le recombinant p352CAT. Pour créer p352nlz, le fragment Xba l/Xhol de p352CAT a été inséré dans les sites correspondants de pnlz.
3. Fabrication de p2126nlz Pour créer p2126nlz, un fragment Bsp 1201/Sph I de 1,9 kb ,() recouvrant la région -2126 à -206 du locus SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N~ 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 à + 4135, a été insére dans les sites respectifs de p352nlz. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n~ 1-1685. Sa fabrication est illustrée par la figure 6.
,~ .
CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F~97100543 4. Fabrication de p21261NTnlz La fabrication de ce plasmide est illustrée par la figure 7.
Un fragment Bsp 12011Hind lll de 5,8 kb recouvrant la région -2126 à +3651 du locus SM 22 a été inséré dans les sites correspondants de pnlz, donnant plNt-nlz. Ensuite un fragment PCR de 496 pb de la base +3648 à +4143 du locus SM 22 a été généré en utilisant une amorce en amont et une amorce en aval conçue pour introduire un site Hind lll en position 4135-4140. Ce produit de PCR a été digéré avec Hind lll et lié
dans le site Hind lll de plNT-nlz pour donner p21261NT-nlz. La o construction p21261NTnlz contient donc 2126 paires de bases de la région en 5' du début de transcription, le premier exon, le premier intron entier et 15 paires de bases du deuxième exon avec les quatre dernières paires de bases mutées de CATG en GCTT pour éliminer le codon d'initiation de traduction et introduire un site Hind lll comme mentionné ci-dessus. La partie de l'insert dérivé du promoteur de SM 22 contenu dans le plasmide p2126 INTnlz est constitué par la séquence SEQ ID N~1. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n~1-1686. Sa fabrication est illustrée par la figure 7.
EXEMPLE 3:
Expression des constructions p2126 nlz et p2126 INTnlz dans les animaux transqeniques Deux constructions utilisant le gène reporteur lacZ avec signal de localisation nucléaire du virus SV 40 ont été fabriquées, comme décrit dans l'exemple 2.
La première construction, p2126nlz contient 2126 bp de la région en amont et le premier exon (65 bp). La seconde construction p21261NTnlz est identique à la première à l'exception de l'addition du premier intron et des premières 1 2bp du second exon.
Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, chacune des ~n constructions a donné naissance à au moins une souris transgénique exprimant le gène reporteur.
Les embryons obtenus de 12.5 à 15,5 jours après le coit (dpc) ont été colorés de manière à mettre en évidence l'activité 13gal. Les expressions des deux constructions sont identiques, à tous les stades CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F'R97/00543 observés. bien que p21261NTnlz donne une coloration un petit peu plus intense.
L'expression a été détectée en premier lieu au jour 8!5 dans la région du coeur de l'embryon et dans les vaisseaux de l'enveloppe cardiaque. Au jour 9,5, I'expression de lacZ dans le coeur augmente et est confinée au ventricule droit! aux artères.
Entre 12,5 et 15,5 jours une ségrégation du marquage en fonction des régions devient évident, le marquage étant confiné au ventricule droit (figures 8A et 8B). Les coupes montrent que l'expression a lieu dans le myocarde du ventricule droit, avec des marquages mineurs dans le ventricule gauche et dans l'adrium droit (figure 9A).
Cette expression dans le coeur est seulement transitoire. et n'apparaît pas chez l'adulte Elle est vraisemblablement inhibée dans les phases tardives du développement des foetus. L'expression précoce est ]~ aussi observée dans les segments du rostre à partir de 9,5 jours qui s'étend aux segments caudaux à 10,5 jours, et atteint des niveaux importants à 11,5 jours.
L'expression diminue à partir de 12,5 jours dans les segments du rostre (figure 8B) et finalement n'est plus détectable à 14,5 jours (figure 20 1 OE).
Les coupes montrent que l'expression du transgène est restreinte à
la région myotomale des segments (figure 9 D).
La plus grande partie de l'expression a lieu dans le système vasculaire de l'embyron en développement. A partir de 9,5 jours, ~, I'expression est détectée dans l'aorte dorsale. A 10,5 jours, la coloration de l'aorte dorsale et des coudes aortiques augmente et à 11,5 jours, I'expression lacZ est clairement visible dans l'aorte dorsale, les coudes aortiques, les artères iliaques, les artères ombilicales, les artères de la carotide et dans les vaisseaux majeurs de la tête.
r,() L'expression du transgène dans les vaisseaux augmente à partir de 12,5 jours, date à laquelle les vaisseaux intercostaux peuvent être facilement vus (Figure 8A).
A 15.5 jours (figure 8B), lacZ est présent dans les vaisseaux majeurs, incluant ceux des membres et de la queue, et la coloration du tronc pulmonaire devient visible. L'expression dans le système CA 022~0099 1998-09-2~
vasculaire persiste chez l'adulte et est clairement visible dans l'aorte dans le tronc pulmonaire et dans l'artère pulmonaire drolte (figure 1 OA), ainsi que dans les vaisseaux des intestins (figure 10B), dans la vessie et dans l'uterus.
Des coupes histologiques révèlent mieux les différences dans l'expression du transgène dans les artères et dans les veines. La section de l'embryon à 12!~ jours (figure 9A) montre un niveau d'expression très élevée dans les couches musculaires des artères de la carotide, de la quatrième artère du coude de l'aorte, du tronc pulmonaire proximal et de la partie proximale de l'aorte ascendante, tandis que les parties gauche et droite des veines cardinales antérieures restent non colorées.
L'absence d'expression du transgène dans les veines musculaires ressort à l'évidence des coupes du ductus venosus, ainsi que des veines portales et ombilicales. La même situation est observée chez l'adulte, où
I'expression ne peut jamais être détectée dans les veines caves (figure 1 OA) ni dans les veines pulmonaires.
Ces observations mettent en évidence des différences qui n'avaient jusqu'alors pas été mises en évidence entre les couches de muscles lisses des artères et des veines. D'autres vues des artères 20 montrent que l'expression est restreinte à la couche de muscles et est absente de l'endothelium (figure 9C).
Il est de plus évident, au vu de l'ensemble des observations (figures 8A, 8B), que l'expression du transgène est absente des muscles lisses des viscères. Ceci est inattendu, car le gène SM 22 endogène est ~, supposé être exprimé dans les tissus musculaires lisses vasculaires et des viscères. Dans les coupes histologiques de la région abdominale d'embryon à 14.5 jours, les couches de muscles de l'estomac, de l'intestin et de la vessie en développement sont facilement reconnaissables (figure 9C). L'expression du transgène dans cette région est clairement détectée dans les arteres ombilicales, mais pas dans les couches de muscles des viscères de l'estomac, du duodenum, de l'intestin grêle et du gros intestin, et de la vessie, où aucune expression lacZ n'est observée. En outre, aucune expression n'est observée dans l'oesophage et dans la trachée (figure 9A)I ainsi que dans les bronches du poumon.
CA 022~0099 1998-09-2~
La coloration du tissu musculaire de l'adulte donne essentiellement les mêmes résultats. La figure 1 OB montre que l'expression du transgène est absente dans les muscles du colonl alors que le vaisseau mésentère est très fortement coloré par lacZ. Par contre, Ja coloration par immunofluorescence de la coupe d'une région intestinale similaire montre que la protéine SM 22 endogène est présente dans les deux tissus (figure 1 OC). L'absence d'expression du transgène dans les muscles lisses des viscères de l'adulte est de plus confirmée par des colorations de l'oesophage, de la trachée, de la vessie, du canal n déférent et de l'utérus pour l'activité l~gal. En aucun cas, il ne peut être détectée une expression (3gal dans les couches musculaires de ces tissus.
Curieusement, une coloration importante est observée dans le cytoplasme des cellules épithéliales du lumen du canal déférent et dans I'épithélium des conduits rénaux. Ceci est vraisemblablement dû a une activité galactosidase endogène, la coloration étant aussi visible dans les animaux non transgèniques témoins.
EXEMPLE 4:
Fabrication d'une construction comportant des reqions 20 réqulatrices du qène SM 22 et le qène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès (SM 22 INT-TK).
Le fragment HIV-LTR ~-167, + 80) est délété du plasmide pLTR-TK par digestion Hind lll dont les extrémités sont rendues bout franc avec l'enzyme de Klenow, suivie d'une digestion Xho 1. Le plasmide 2~ refermé en insérant un linker contenant les sites Xhol en 5', les sites Hind lll et Bsp 1201 dans l'ordre 5'->3' et une extrémité 3' bout-franc pour donner le vecteur p-TK. Un fragment Bsp 1201/Hind lll de 5.8 kb recouvrant la région -2126 à + 3648 du locus SM 22 est inséré dans p-TK pour obtenir SM 22 INT-TK. Ce fragment est compris dans I'enchaînement de nucléotides de la SEQ ID N~1.
Cette construction est schématiquement représentée sur la figure 1 1 .
EXEMPLE 5:
Fabrication du plasmide p445 nlz portant le fraqment -445 à +
65 du qène SM22 fusionné au qène lacZ, et obtention de transqènes CA 022~0099 1998-09-2~
Matériels et methodes Construction de p445nlz Le plasmide p2126nlz a été coupé par Xba I qui a un site unique dans le ~ polylinker ~ en 5' en amont de la séquence SM 22 . Les extrémités 5' protudantes du fragment ont été remplies à l'aide de la polymérase Klenow, par du dNTP.
Après précipitation le fragment a été coupé par Pst I qui a un site unique en position -445 relativement au nucléotide +1 de début de la transcription.
Les extremités 3' protudantes de la coupure Pst I ont été
hydrolysées à la polymérase Klenow sans dNTP. Le fragment comprenant les séquences plasmidiques plus la séquence SM 22 de -445 à + 65 fusionnée au gène lacZ a été purifié à partir d'un gel d'agarose et refermé par la ligase T4.
Pour les expériences de transgénèse le fragment injecté dans les oeufs de souris a été purifié à partir d'une double digestion Pst l/Nsi I du plasmide p2126nlz.
Les résultats obtenus avec cette construction et ceux obtenus avec p2126 INTlacZ et p21261acZ pour comparaison, figurent dans le tableau 20 ci-après.
Les propriétés de régulation transcriptionnelle de la séquence du gène SM 22 entre les nucléotides -445 et +65 ont été analysees in vivo dans des souris transgéniques par deux méthodes. La première méthode appelée analyse transitoire consiste à analyser le patron ~, d'expression du gène lacZ directement dans les embryons fondateurs FO à un stade donné. La deuxième méthode consiste à établir des lignées stables à partir de fondateurs FO adultes.
1. Analyse transitoire L'analyse transitoire a permis d'obtenir quatre embryons ayant intégré le transgène p445nlz dans leur génome sur un total de 13 embryons. Parmi les quatre embryons positifs analysés à 12.5 jours de développement, un embryon n'exprimait pas le transgène. Deux embryons présentaient un patron d'expression identique à celui de la lignée p2126 INT nlz au même stade, c'est-à-dire spécifique des cellules musculaires lisses artérielles et enfin un troisième embryon présentait , CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/3S974 PCT/F'R97/00543 2~) les mêmes territoires d'expression artérielle additionnés de divers sites d'expression ectopique essentiellement diffus dans le mésenchyme embryonnaire.
2. ~i~nées stables Deux lignées stables indépendantes ont été établies à partir d'un male (lignée nC1 ) et d'une femelle (lignée n~9).
L'expression du transgène a été analysee dans l'embryon au stade 15,5 jours pour la lignée 1 et 17,5 jours de développement dans la lignée 9. Les deux iignées préséntent le même type d'expression dans les artères: au niveau du coeur, le transgène est exprimé dans l'aorte dorsale et le tronc pulmonaire artériel.
A la différence des lignées obtenues avec les transgènes p2126nlz et p2126 INTnlz, les deux lignées p445nlz expriment lacZ très fortement dans les parois de l'oesophage et de la trachée respiratoire qui sont composées de muscie lisse à ce stade.
Les deux lignées présentent des différences entre elles dans certaines régions de l'embryon Pour la lignée n~1, le transgène s'exprime fortement dans les bronchioles en continuité de la trachée à
15,5 jours ce qui n'est pas observé dans la lignée n~9 à 17,5 jours où
2() lacZ n'est trouvé que dans la trachée. Cette différence peut être due soit à une modification de la régulation due à des sites d'intégration differents dans les deux lignées, soit à la différence de stade qui fait que l'expression de lacZ peut être réprimée entre le jour 15,5 et 17,5.
Dans les deux lignées on trouve donc une expression du transgène dans des organes qui contiennent une forte composante de cellules musculaires lisses. Il est intéressant de noter qu'il s'agit d'une partie au moins des cellules musculaires lisses de type respiratoire, la trachée, et une partie des cellules musculaires lisses de type viscéral, I'oesophage.
Enfin des sites d'expression ectopiques différents, c'est-à-dire où la .() présence de la proteine ou de l'ARN SM 22 endogène n'a pas été
reportée, ont été trouvés dans les deux lignées. La lignée 1 présente entre autre une expression forte très localisée dans les deux doigts posterieurs de chaque membre. La lignée 9 exprime fortement lacZ dans les régions antérieures du cerveau.
CA 022~0099 1998-09-2~
L'expression de cette construction à deux stades de l'évolution est illustrée par les figures 12A à 12D qui représentent des embryons de 15.5 jours p.c. (12A, 12B, 12C) et un adulte de 2 mois (12 D) SM 445 nlz colorés pour l'activité ~-galactosidase. On note l'expression dans le tissu - ~ musculaire lisse des artères, de l'oesophage et des bronches sur les figures 12A, B, C ainsi que dans des sites ectopiques comme la moëlle épinière (12B) ou les deux doigts postérieurs de chaque membre (12A).
On note aussi l'absence d'expression dans l'aorte thoracique ou le tronc pulmonaire artériel chez l'adulte (12D). Seule une expression dans la trachée est maintenue.
Les résultats obtenus montrent qu'une séquence de 450 paires de bases est suffisante pour garder la même expression dans l'embryon et le foetus mais pas chez l'adulte.
2~
TABLEAU
Constructions N~ de naissances Nomenclature Expression Adulte Embryon p 21261NTlacZ
F23 artères, aorte, artère pulmonaire p21261acZ M4 artères aorte, artère pulmonaire ventricule droit ventricule droit SM445 8 n~1 artère+no sp p4451acZ n~6 artèresseules n~7 n~1 artères seules 17 M1 artère+no sp pas d'expression F9 artère + no sp pas d'expression LISTE DE SEQUENCES
~1) INFORI~ATIONS GEI~ERALES:
(i) DEPOSANT:
~A) NOI~: INSTITUT PASTEUR
t B ) RUE: 2 8 RUE DU DOCTEUR ROUX
(C) VILLE: PARI5 (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTA~: 7 5 0 15 (A) NOI~: UNIVERSITE PARIS 7 (B) RUE: 1 PLACE JUSSIEU
(C) VILLE: PARIS
( E ) PAYS: . RANCE
(F) CODE POSTAL: 75005 ~ ITR- D~ Ll INVEI~TION: SEQU~ NCES r I~ A' ONT DU GENE S'~122 (iii) ;~OI~RE DE SEQUENCES:.~
(iV) ,-ORI~E DECHI~FRABLE PAR OR3I~ATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: F10PDY disk ( B ) ORDINATE~R: IB~ PC COmDatiD1e (C) SYSTE~E D' EXPLOITATION: PC-DOSJI~S-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Re1eaSe -.1.0, Version .1.30 (OE3) I~FOR~ATIO~lS POUR LA SEQ ~ ~o 1 (i~ CA~C~STIQUES DE LA SEQIJ~'C--:
(A)LO~GUI~ 6261 p~.es dcbases (B) m~ ~
(C) ~'OI~BRE DF BR~S: dou~lc (D) CO~FIGUR~TIO~ ~ caire (ii) ~YPE DE MOLECULE: AD~ (Sc~onLique) ~iii) HYPOl~TIQUE: ~'ON
(~i) OR~GlNE:
(,.~) ORG~ISME: SOU~IS
GG GCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGl 1 1 1 lAT AGcTcTTGGG
CTG&GAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TccTccATGc TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACMCCA GACCTG{~GAT
TTG&G&TCTT ACTGATGTGT
TGGGAG&TGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC
TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC
CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT
ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC AcAcAGcACc TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG
TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAG&CCAAGG TTTTAAAGGC
TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGC;GGG
GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
1111 l lGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGCiCCCTCC
TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC
CCGAGTGCTG GGATTAAAG~
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA
AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGcTG&&AA
GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG
TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT G&ATTGAGCG
TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGccTGAGG
GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTGG~GA
TGG~ACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC C 1 1 1 1 AAGAA
GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAG&G GCAGAGGAGA GcTGGTTcTG
TCTCCACTGT GmGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGcAGTTGTc mAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGcTAGGTG
CAAGATAAGT GG&&ACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG AcTATTTTGA
AGGGAGGGAG GGTGACACTG
TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGccAGGc CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GcTGcTAAAc AAGGCACTCC CTAGAGAAGA
CA 02250099 l998-09-25 WO 97/35974 ~1 PCT/FR97/00543 GTCCACTGTA GGCAGATAG& TGACAG&TGG CAGATAG&TG
ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT G&GACCCTGT
TCCTCCCAAA GG&TCTTGGT
G&TTCCCCTT G&&GCTCTCT AAAGGATGTC AGTG&GCTGT
TGCCACATCT ATATAAGAG&
ACTAGTCTTC TG&AATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC
AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG
GTCTGCTTGT TGTCCAGG&T
CTCTGCTACA TG&AGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC
TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AG~cATccAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT
TTTGCGTTG& AGC 1 1 1 l'GTC
TAGAAATACC CTGGTGC~GCT GCCAAACCAC CAcccATATC
CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGA'l 1 1 1 111 TTTTGGTTTT
~1 1 1 1 '1 1 l GT
TT(~l 11 l'AAG TTAGcATAcA AAGTAATACA TTTCATCATG
GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC
TTGTAl 111 1 GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACG&CTGAGC CATcTCTCcA
GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA
ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT
GTTCGTACG& CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGcAT
GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TC; 1 1 1 1 CCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG 1 1 1 1 1 1 GTTT
TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATcAGGcT
GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC
GCCACCACTG TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AG{icTGAGTA
GAGGCTAGGA GGAAGGG&CA
CCGCAGTCAC CG&CTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT
CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGC~ TGC;TCGGGGG TTGGC;G{iGAG GG&GCAGGCC
ACACAGTGGG GTGTGGGAGC;
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAG~''l 11'1' GAGTCCTCCA G>AG'CTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CccTTTccTT
CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
CCTATAG> TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC T(~ 1 1 1 1 1 CTC
TCAATGTTGG
TGTTGC;GCTC AG~;GAATGCT TTG{~AGAAGG TG&TGGGAAc TGGAGAAGGG AAGATCAGTT
wo 97/3s974 PCT/F~97/00543 TACCATACCT GTG~GCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC
ACTTGGTAGC CTTGGAAAG'G
CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG
GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAG{iGGAACG TGAGGAAG~C GTTTGGATAG TGCCTGGTTG
CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
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GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GccTcccccT
TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAG>ccTG
CCCATAAAAG Gl 111 lCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC
TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT
TTCCCCAAAT ATG&AGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGG{~CGGC CCGGGGTGGT GAGccAAGcA
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G&CGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC AcTGccTAGG
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GATGGTCCCC AGGGCTAATG
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CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAG&Gcc TG~;l 1 1 1 l CT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT
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ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGcTGc;&
ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGcTTGGTcc AGTTTGA~G TAGGAG&TCA
WO 97/35974 3 3 PCT/F'R97/00543 TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC
ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC AccccATcTc GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAG~TTTGC
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CAGCTGGCCC G&GACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC
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GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAG&AG
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CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATcccACTCA
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TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC
TGCCTG~TTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA
GGCCTTTGAG GCMCAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTG&C TAGcAGATTc TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGcTG{~C
CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT G>CTCCCT GAGAATGCCG CT~l 111CTG
AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTC; 1 1 1 1 l GT CAGCTGCGCT TTGGG{~GATG
AACTTTGCTC TTCTG&CTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGcTAG
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AATTTGGAG& ACATG&CTTC TG&AAAACCT CTcTAGTGcT
TTTCTGGCTA GTCTTGC;CAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCG> GATGcAG&Gc TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA
AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AG&AGCiCTGA AGcAGcicAAG
ATCTCTGTTA GTTGGAG&CC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GccAGAcAGT
GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAAcAA
AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGcccTGGG
CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TcTAGGcccA
GC~GGTTGTCA AAATAGTCCA
CAG~CCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGl 1 1 1 1 ATAAAcAAAA
TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAG&CTATT TTCATTACAA TAGAGGccAT
ATGGTCTGTA AAGTCT~
TATTTACTCT GcT(~llllAc ATAAAAAGTT GACAGACTCT
TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGG>C
TCTGCAGCAA GTG>AAAG
CTG&TCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGG& TCCCCTCAGA
GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCllllCT
CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
CA 022~0099 l998-09-2~
W097t35974 35 PCTn~7/00543 (2) INFORI-5ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2190 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) .~YPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANIS~E: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2 :
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCAT~ ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTA~ GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC
CA 022~0099 1998-09-2~
wog7/35974 36 PCTn~7/00543 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3( GATTcTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3t CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 4~
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCC~ GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5~.
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 6( TTTTGGTTTG '~ GA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6~
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7.
TGGGATTAAA C-GCGIGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT ~AAAGGACG 7 GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTcA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 8~
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10~
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC lOE
TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 13~
CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTcTGccAT GCACTTGGTA 15~
TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGccTGGT TGCGGCCAGG 168 CTGcAGTcAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGcAAGAA GGTGGCTTGT 17~
CA 022~0099 1998-09-2~
TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 18~
CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA 18f AGli'l"l"l''l"l'CC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 19:
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 19, TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 21( AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 21~
CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 21' CA 02250099 l998-09-25 W097l35974 PCTn~7/OOS43 (2) INFO~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: ~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR~ 1 paires de bases (B) TYPE: nucle~ti~
(C) NO'~BRE DE BRINS: doubl~
(D) CONFIGURATION: linéair~
(ii) TYPE DE :~OLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISI~E: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No:3 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCAT~'l''l"l"l"l' ATAGcTcTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA T~AAGAC~AC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC
CA 022~0099 l998-09-2~
TGTGTcTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4 TTTTGGTTTG 'l~ llGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6 CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT ll GTGG&GACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 13 CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGC~G GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 15 C
PCT/F~97/00543 INFO~ATIO~S POU~ ~A SEQ ID ~O: 4 ~i) CA~ACI'E~STIQUES DE L~ SEQU~NCE:
(A) I,O~TGUEU~ . paires dc bas~s (~3) ~fpF.: ~ucl~otidc (C) I~OMB~E DE~ BRI~S: doublc ~D) CONFIGU~ATION: liDe2ire (ii) lYPE DE MOLECULE: ~DN (~énomique) (iii) HYPO~HETIQUE: ~'ON
(~i) ORI&~'E:
(A) ORGA~SME: SOI~IS
FEUILLE RE~ ; (REGLE 91) ISA/EP
41 PCTn~R97/00543 TCTAGAGGCC ACGGMCGGT GCCMGCACA CAGTCCCm TGCCTCmC
ACGGGAGCAG
GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT
GTCCTTGGCC
CTGTCTCACC AAAGGACTCA GGGCTGGm CTGAGTTTCC GTCCAGTATT
TAGCCMGTC
CTGTGTT~GT CACGTAGGCC TMGAGCCTT GGCGTTTACA GAGTCACCCA
GCTCTGGCCC
CTGGCATTCT GGTCCTTGGC GTTTACAGAG TCACCCAGCT CCAGGCCCCT
GGCACmGG
TACTTGGTTG CCCTTCACTC CACCAGGTCC ATTCCAGATG CCAAGAGTGG
GccccAGGAA
TGTGTrrCCT TCTCTCCACC ATG I I I TTAT AGCTCTTGGG CTGGG~GMG
AGGCGGGTCT
GGGTCmGT TTcTGAGcTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA
ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA MGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT
ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TAmTGGCC TTCCCGTCTC
G I I I CTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCMGC CACCCATTGA
TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG
TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCA~3CAGGC ACACAGCP~CC T~3ACTACCCA
CCACGTATGT
~ AACGTCAGT A T CC I I I CCA GCCAGCTCTG CAG,~TGGGTG TCCAGGCTGT
GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG n " AAAGGc TGTTCAGGAA
TGG~TGGCAA
C'CAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TG I 1 1 GGGGG GGGGGTGGTT
TTGG m GTT
TCTGTAQACC
AGGCTGGCCT TGMCTCAGA AATCTGCCTG CC~CTGCCTC CCGAGTGCTG
GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGA I I I ! ATT TAGATTATAA AAAGGACGGG
Amt~GGG~
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC
T~GAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CAC,~AGGAGG TGCTGGAGrr CTATGC~CCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATT(;AGCG TCTGAGGCTG
CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CT~CCTGAGG GTTCTCTCCT
TCCCTCTCTC
TACTCCT'TCC TCCCTCTCCC, CTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTG~;GGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC C I I i I AAGAA GTTGCATTCA
GTGAGTGTGT
GAGA(~ATAGC ACAGATA(~GG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TcTccAcTGT
GmGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTMCCCTA
ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG MGCTAGGTG CAAGATAAGT
GGG~;AC CCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCrTT CACGATAAC~G ACTATmGA AGGGAGGGAG
GGTGACACTG
pcT~Rs7loos43 ~ 2 TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTT~CCAGGC CTTAAACATC
CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGcAcTcc CTAGAGAAGA
TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC
CTTGGAAAGG
CCACmGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA
TCTCATAATA
AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT
GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGCCTTGI I r GTCCCTTGCA
GGTTCCmG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTC I I I CTCA
TTGMGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAAcAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG
1 lCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAMGCAT
GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT
ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGC;CGGC CC~GGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG
GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCC T AGG CGGCC I I I M
ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT
CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCMGT CATGG~AGCA GAAGGGCTGT
GGGCTCA~TT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA G 1 1 I G~ I GGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA
CCATTCTCTG
TGTTAGACM AAAGTCTGGG, TAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC
AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ~CTGTCCCAC CCATAGG T GT
ATGGGCTATG
TGT~AGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA AcTccATcTT
TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC
AGGGCTMTG
CAACTCGGGG GAGccAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG
ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATcAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG
CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCC I ~ CA GACTAGCCT~ GGATAGGGCC TG~
TTCC I I I I CT
CTCTC l L; I C; I CTCTCTCTCT CT~ ;C 1~ 1 C I CTCTC 1 G ~ ~ I CTCTC 1 Cl I IC~;I I I I
C I ~; I I I CA CTCTCTC I T-T CTMTTTcTT ~ I TC I I ~ CT~ I I C l I I AGACAG
G~ ; tC 1~ TGTAGcccTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG
CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC MGTGCTGGG ATTAAAGGcG
TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGmGCT mTGATGGC AGcTTGGTcc AG I I I GAAAG
TAGGAGGTCA
GTCCACTGTA GC;CAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG AcAGATAGGT
GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG A~CTGGGACT GG c~CA~CCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA
GGGTCTTGGT
~3 GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGcTGT TGCCACATCT
ATATAAGAGG
AcTAGTcTTc TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAA~TGCTC
ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT
TGTCCAC~;GGT
CTCTGCTACA TGGAGGcccc TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA
CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGcATccAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG
AGCTTTTGTC
TAG~AATACC CTGGTGGGCT GccAAAccAc CACCCATATC CCTCTCTCCT
CTCTGCTGCC
TCTA~GATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGA ~ I I I I GGTTTT G I I ~ rGT
TTG I 5 1 1 AAG TTAG CATACA AAGTMTACA I I I CATCATG GCATTTGGA(~
ATACATATAT
ATTTTAI I IGCTCTCCTGGCCTCTTCTCAAAGAGACTTCl CTGGACmC
TTGTA I I I I I
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT
GGAC I I I CTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG
CATGACCTGA
CCCAGACCTG AcAGATGTcA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG
CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAAcm CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC
CTCCTCCCA
TC I I I I CCTC TAGTGGCTAG TGATG I I I GG I I I I I I G I I I TGAGACAGGG
l~TCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCAC I I I GT AGATC~GGCT GGCCTCCAAC
TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCC-AG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG
TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA
GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC I I I I t3TGGTT CCTTGTCGCA
GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG T GGTCGGGGG TTGGGGGCiAG GGGGcAGGcc ACACAGTGGG
GTGTGGGAGG
G~TAGCTGT TGACAACTTC CCAJI~cAGA~ CCAGGC I I I 1- GAGTCCTCCA
GGGTP~GCTTG
AGAGGGTACT CA~A~AGCCG TGTCCATGTC CCC I 1 I CCTT CACCTCAGGG
AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCA I I rCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC
TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATCCT TTGGAG~AGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG
AAGA~CAGTT
TP~CTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT
ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACA( ;ACAC ,~CCCC,~ T CTC GAAGAGCTCT
ATTAAGcTcc AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGG I I I GC TCCCACTTCA
CAAGCAGAGA
ACTCATMCT GMGGGGGTG ACAGCACAGG GGMGGGAAA GCAAGATGTT
TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC
CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGC I I I CA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC
CTGTCATCTG
. . .
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG
GGTTGGI I IG
GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT
GCTCCTATAG
GCMCAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG
AGGP~CTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC
ACMCAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGMTGCCG CTGl I I I CTG AGAACCCTTG
GACTCTGGTG
GC I I I ATCAG GTCTTTl~GT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACmGCTC
rrCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG
CTACTGGCTG
MTTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT mCTGGCTA
GTCTTGGCAA
AGTAAP~AATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG
AG~CCTTTCT
GTAC~AAAl~ AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC
TGTTGAAGCA
CGCCTT T AAT CCCAvCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG A~CTCTGTTA
GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT
CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACA~AC TAT~AAACAA AGAGAAGGCC
GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATAC~CCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAG
P~CTGCAG~A
~ AAGCAAGCA ATG~GGGACA GGAGGrrGGC TCTAGGCCCA GGGG~TGTCA
AAATAC~TCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCT~i I I I I I ATAAACAAAA TTTTATTGGC
ACACATTGG, TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCC~T ATGGTCTGTA
AAGTCTAAAA
TAI I IACTCTGCTGI I ITAcAtAP~AGl~GACAGACTCTTGGTCTAG~C
TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTl~TCTGAG GTTCA~G I I I CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA
GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC
TGC'rTAGCAC
AMTGMGTA ~AGTAACTTG CTGGCTC l I I GTTc-T I I I CT CCACACTCTA
T~C I r i A~:;CT
CTGCCTCMC ATG
, CA 022~0099 1998-09-2S
WO 97/35974 45 PCTI~iR97/00543 ( 2 ) INFORI~ATIONS POUR LA SEQ ID NO
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 7~5 paires de bases (B) TYPE: nuclP otide (C) NOMBRE DE 3RINS double (D) CONFIGURATION: li~éaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (oe nomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(Vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: SOURIS
(Xi) DESCRIPTION-DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:~
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATG11111 ATA~CTCTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT ~111C1GAGC ~ 'b'1"1'L'1'AT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 1 CAA~ LL~L~L~L CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 1 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2~
TC~11LL1~1 GCC1GGC1AC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GC~CCr~TT 3C
GA'1"1'L'1'~'~'AA ACATGTGACC L1~1GC1~CCAA GCATTGCTTA CA&GAGCAGG ATACTGAAAG 3~
'1'~'1'~'1'L'1'L-'1'L- CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4, GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GL'1'~'1''1'CAGG 5~
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGG'L''1'~'1"1' b11L~ 1GGG GGGGGGGTGG 6C
~1111L-b11LG '111LL1IL1L~A GACAGGGTTT C~1L~1~b~ GG CCC1GGCCCT CCTGGAACCC 6 ACTCTGTAGA CCAGG~l~GC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7, ~efer~Ce~
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~ er, ~T P., ~e~ley, D. F, S~lie, L. B. ~nd Kay, C. ~~ (I 987a~. TsoI~ n a~ld rh~ o~ of an ablmdant a~d no~el 22-l~a protein (SM 2~ ~m ~hickeTl gi~
o~ mt-s~l~ J. B~ol. C~ , 262f'J, 29~g-;~993.
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(100 mM de phosphate de sodium, pH 7,3,2 mM Mgc12, 0,1% de sodium de deoxycholate, et 0.2 % NP-40). Après rinçage, les spécimens ont été
colorés durant une nuit à 30 ~C dans du tampon A contenant 1 mg/ml de X - gal (Sigma, St Louis, I\/lissouri), 5 mM de ferrocyanure de potassium, 5mM de ferricyanure de potassium, et 20 mM de Tris-CI pH 7,3. Les echantillons colorés ont alors eté rincés, déshydratés à l'aide de concentrations croissantes d'éthanol, clarifiés dans du xylène, et enrobés dans de la paraffine. Les coupes histologiques ont éte e~ectuées avec une épaisseur de 7 à 10 ,um et à nouveau colorées avec ~, de l'hématoxline d'Ehrlich et de l'éosine. Les embryons ont d'autre part pu être à nouveau clarifiés à l'aide d'un melange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle.
Pour l'immunohistocoloration, les tissus de souris ont été fixés dans 3 % de paraformaldéhyde dans du tampon PBS à 4~C durant 3 ,() heures, puis enrobés dans un milieu Tissue-Tek (Reichert-Jung, Vienne) et sectionnés sur un cryo-microtome à des épaisseurs de 5 à 10 ,um. Les coupes sélectionnées ont éte montees et colorées en utilisant un antic~rps monoclonal dirigé à l'encontre de la SM 22 (Duband et al, 1993, Differentiations, 55, 1-1~), à une dilution 1/30 ainsi qu'en utilisant un anticorps secondaire marque Cy3 (Biological Detection Systems, CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/FR97/00!j43 USA). Les coupes ont été examinées à l'aide d'un microscope à
fluorescence.
EXEMPLE 1.
Caractérisation du locus SM 22 Le criblage par hybridation de la banque génomique de souris a conduit à l'isolement de trois clones se recouvrant, contenant le gène complet de la SM 22. Une carte de restriction, qui est partiellement reproduite sur la figure 1 a été établie et les exons ont été localisés par hybridation à l'aide de sondes oligonucléotidiques synthétiques.
n Les régions présentant un intérêt ont été sous clonées et séquencées.
La sequence a été déterminée entre les positions -2474 et +110 en aval du site de polyadenylation et a été comparée dans la banque de données EMBL. Le gène couvre 5923 bp à partir du site de debut de la , transcription jusqu'au site de polyadenylation et la séquence codante est partagée en 5 exons (figure 1). Toutes les frontières exon-intron correspondent à des séquences consensus.
Le premier exon contient seulement une séquence leader en 5' et le codon de départ de la transcription est donc localisé dans le second exon separé du site de départ de la transcription par plus de 4kbp de séquence d'intron.
Deux signaux de polyadenylation potentiels ont été localisés au position 5905 et 5913 et plusieurs régions TGT placées en aval du site de polyadénylation, prennent vraisemblablement part dans la terminaison de la transcription.
L'analyse de la sequence révèle de plus la présence de trois séquences répétées (figure 2) qui présentent des homologies importantes avec les eléments répétés de type B1, dont certains sont transcrits par la RNA polymérase lll et codent pour des ARN 5S. On ~n notera que toutes les séquences répétées sont dans une orientation inverse par rapport au locus SM 22.
Le site de départ de la transcription a eté cartographiée par analyse par extension d'amorce (figure 3). Un oligonucléotide antisens complémentaire de l'extrémité 3' de l'exon 1 conduit à l'obtention de quatre produits d'extension qui diffèrent seulement par une paire de CA 022~0099 1998-09-2~
bases (bp) en longueur, le plus long d'entre eux étant de 65 bp. Le produit de la transcription démarre donc avec un G, 77bp en amont du codon d'initiation de la transcription Les produits d'extension les plus courts ont eté vraisemblablement causés par une terminaison prématurée de l'extension de l'amorce dûe à
des modifications (capping) à extrémité 5' de l'ARN messager.
Ces résultats ont éte confirmés par l'analyse par protection par la RNAse I qui conduit à un fragment protégé de 65bp et par le clonage et ie sequençage du produit d'extension derivé d'une réaction indépendante avec une amorce antisens située dans le second exon du gène.
Ces résultats sont en accord avec ceux de Solway et al (1995 précédemment cité). Des différences de séquences mineures entre ces deux resultats sont vraisemblablement dues à des variations alléliques 15 entre les différentes souches de souris.
La séquence TTTAM en position -28bp (figure 4) est en relation étroite avec la sequence TATAM et a vraisemblablement la fonction d'une boîte TAT~. L'analyse par ordinateur de la séquence en 5' révèle la présence de plusieurs sites potentiels de liaison pour des facteurs 2() ainsi que pour des eléments qui sont connus comme contribuant à la régulation de la transcription de gène musculaires (figure 4). Au total 11 boîtes de type E (CANNTG), quatre motifs du type Mef-2/rSRF
(YTAWAMTAR), quatre éléments de liaison SRF potentiels (CC(A/T)6GG), cinq sites de liaision AP-2 (CCCMNSSS) et cinq motifs 2~ SP1 (GGGCGG) ont été localises. Enfin, un élément similaire au motif TGT3-3, récemment identifié comme site de liaison d'un facteur nucléaire du muscle lisse et comme contribuant à la régulation de la transcription de l'actine alpha du muscle lisse, a été localisé (figure 4).
3() Clonaqe et construction de plasmides recombinants pour la création de souris transqéniques 1 Fabrication de pnlz Le plasmide pGEM7 (c'est-à-dire le plasmide pGEM-72F (+/-), commercialisé par Promega Corp., Madison, Wi, USA. Séquences .~ disponibles dans Gen Bank, sous les numéros suivants: X65310 et X
CA 022~0099 1998-09-2~
WO 9713~i974 PCT/FR97tO0543 '~O
65311) comprend un gène de résistance à l'ampicilline, un gène lac Z et une origine de réplication. Il comprend 3000 paires de base. Il a été
digéré avec Nae l/Bsp 1201. L'extrémité sortante Bsp 1201 du vecteur a été rendue ~ bouts francs ~ avec l'enzyme de Klenow, et le plasmide a été refermé en présence d'un linker Sal I de 10 pb. Le fragment lacZ de pGEM 7 a donc été déleté, un site Sal I introduit, et un site Bsp 1201 restauré.
Un site Pme I a été introduit par insertion d'un linker Pme I avec des extrémités simple-brin sortantes Nsi 1, dans le site Nsi I de la o construction.
Finalement, le gène lacZ couplé au signal de localisation nucléaire a été isolé à partir de pDes2.2nlz (Ll et al, 1993, précédemment cité) avec Hind lll et Sac I donnant deux fragments du gene rapporteur.
Les deux fragments ont été insérés entre les sites Hind lll et Sac I
du vecteur pGEM7 modifié et vérifiés pour leur orientation. Cette procédure donne le vecteur pnlz sans promoteur.
2. Fabrication de p352nlz La figure 5 illustre la fabrication de ce plasmide.
Un fragment PCR de 417 pb couvrant la région -352 à +65 du gène 2n SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N~ 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 à + 4135, a été produit et inséré dans le site Hinc ll rendu bout-franc du vecteur pBluescriptSK+. La séquence du fragment PCR a été vérifiée. Le fragment est récupéré par les sites Xba I et Xho I et inséré dans le 2~ plasmide pBLCAT 3 dans les sites correspondants, générant le recombinant p352CAT. Pour créer p352nlz, le fragment Xba l/Xhol de p352CAT a été inséré dans les sites correspondants de pnlz.
3. Fabrication de p2126nlz Pour créer p2126nlz, un fragment Bsp 1201/Sph I de 1,9 kb ,() recouvrant la région -2126 à -206 du locus SM 22, dont la séquence se retrouve dans la séquence SEQ ID N~ 1 qui comprend l'enchaînement des nucléotides - 2126 à + 4135, a été insére dans les sites respectifs de p352nlz. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n~ 1-1685. Sa fabrication est illustrée par la figure 6.
,~ .
CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F~97100543 4. Fabrication de p21261NTnlz La fabrication de ce plasmide est illustrée par la figure 7.
Un fragment Bsp 12011Hind lll de 5,8 kb recouvrant la région -2126 à +3651 du locus SM 22 a été inséré dans les sites correspondants de pnlz, donnant plNt-nlz. Ensuite un fragment PCR de 496 pb de la base +3648 à +4143 du locus SM 22 a été généré en utilisant une amorce en amont et une amorce en aval conçue pour introduire un site Hind lll en position 4135-4140. Ce produit de PCR a été digéré avec Hind lll et lié
dans le site Hind lll de plNT-nlz pour donner p21261NT-nlz. La o construction p21261NTnlz contient donc 2126 paires de bases de la région en 5' du début de transcription, le premier exon, le premier intron entier et 15 paires de bases du deuxième exon avec les quatre dernières paires de bases mutées de CATG en GCTT pour éliminer le codon d'initiation de traduction et introduire un site Hind lll comme mentionné ci-dessus. La partie de l'insert dérivé du promoteur de SM 22 contenu dans le plasmide p2126 INTnlz est constitué par la séquence SEQ ID N~1. Ce plasmide a été déposé le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n~1-1686. Sa fabrication est illustrée par la figure 7.
EXEMPLE 3:
Expression des constructions p2126 nlz et p2126 INTnlz dans les animaux transqeniques Deux constructions utilisant le gène reporteur lacZ avec signal de localisation nucléaire du virus SV 40 ont été fabriquées, comme décrit dans l'exemple 2.
La première construction, p2126nlz contient 2126 bp de la région en amont et le premier exon (65 bp). La seconde construction p21261NTnlz est identique à la première à l'exception de l'addition du premier intron et des premières 1 2bp du second exon.
Comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes, chacune des ~n constructions a donné naissance à au moins une souris transgénique exprimant le gène reporteur.
Les embryons obtenus de 12.5 à 15,5 jours après le coit (dpc) ont été colorés de manière à mettre en évidence l'activité 13gal. Les expressions des deux constructions sont identiques, à tous les stades CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/35974 PCT/F'R97/00543 observés. bien que p21261NTnlz donne une coloration un petit peu plus intense.
L'expression a été détectée en premier lieu au jour 8!5 dans la région du coeur de l'embryon et dans les vaisseaux de l'enveloppe cardiaque. Au jour 9,5, I'expression de lacZ dans le coeur augmente et est confinée au ventricule droit! aux artères.
Entre 12,5 et 15,5 jours une ségrégation du marquage en fonction des régions devient évident, le marquage étant confiné au ventricule droit (figures 8A et 8B). Les coupes montrent que l'expression a lieu dans le myocarde du ventricule droit, avec des marquages mineurs dans le ventricule gauche et dans l'adrium droit (figure 9A).
Cette expression dans le coeur est seulement transitoire. et n'apparaît pas chez l'adulte Elle est vraisemblablement inhibée dans les phases tardives du développement des foetus. L'expression précoce est ]~ aussi observée dans les segments du rostre à partir de 9,5 jours qui s'étend aux segments caudaux à 10,5 jours, et atteint des niveaux importants à 11,5 jours.
L'expression diminue à partir de 12,5 jours dans les segments du rostre (figure 8B) et finalement n'est plus détectable à 14,5 jours (figure 20 1 OE).
Les coupes montrent que l'expression du transgène est restreinte à
la région myotomale des segments (figure 9 D).
La plus grande partie de l'expression a lieu dans le système vasculaire de l'embyron en développement. A partir de 9,5 jours, ~, I'expression est détectée dans l'aorte dorsale. A 10,5 jours, la coloration de l'aorte dorsale et des coudes aortiques augmente et à 11,5 jours, I'expression lacZ est clairement visible dans l'aorte dorsale, les coudes aortiques, les artères iliaques, les artères ombilicales, les artères de la carotide et dans les vaisseaux majeurs de la tête.
r,() L'expression du transgène dans les vaisseaux augmente à partir de 12,5 jours, date à laquelle les vaisseaux intercostaux peuvent être facilement vus (Figure 8A).
A 15.5 jours (figure 8B), lacZ est présent dans les vaisseaux majeurs, incluant ceux des membres et de la queue, et la coloration du tronc pulmonaire devient visible. L'expression dans le système CA 022~0099 1998-09-2~
vasculaire persiste chez l'adulte et est clairement visible dans l'aorte dans le tronc pulmonaire et dans l'artère pulmonaire drolte (figure 1 OA), ainsi que dans les vaisseaux des intestins (figure 10B), dans la vessie et dans l'uterus.
Des coupes histologiques révèlent mieux les différences dans l'expression du transgène dans les artères et dans les veines. La section de l'embryon à 12!~ jours (figure 9A) montre un niveau d'expression très élevée dans les couches musculaires des artères de la carotide, de la quatrième artère du coude de l'aorte, du tronc pulmonaire proximal et de la partie proximale de l'aorte ascendante, tandis que les parties gauche et droite des veines cardinales antérieures restent non colorées.
L'absence d'expression du transgène dans les veines musculaires ressort à l'évidence des coupes du ductus venosus, ainsi que des veines portales et ombilicales. La même situation est observée chez l'adulte, où
I'expression ne peut jamais être détectée dans les veines caves (figure 1 OA) ni dans les veines pulmonaires.
Ces observations mettent en évidence des différences qui n'avaient jusqu'alors pas été mises en évidence entre les couches de muscles lisses des artères et des veines. D'autres vues des artères 20 montrent que l'expression est restreinte à la couche de muscles et est absente de l'endothelium (figure 9C).
Il est de plus évident, au vu de l'ensemble des observations (figures 8A, 8B), que l'expression du transgène est absente des muscles lisses des viscères. Ceci est inattendu, car le gène SM 22 endogène est ~, supposé être exprimé dans les tissus musculaires lisses vasculaires et des viscères. Dans les coupes histologiques de la région abdominale d'embryon à 14.5 jours, les couches de muscles de l'estomac, de l'intestin et de la vessie en développement sont facilement reconnaissables (figure 9C). L'expression du transgène dans cette région est clairement détectée dans les arteres ombilicales, mais pas dans les couches de muscles des viscères de l'estomac, du duodenum, de l'intestin grêle et du gros intestin, et de la vessie, où aucune expression lacZ n'est observée. En outre, aucune expression n'est observée dans l'oesophage et dans la trachée (figure 9A)I ainsi que dans les bronches du poumon.
CA 022~0099 1998-09-2~
La coloration du tissu musculaire de l'adulte donne essentiellement les mêmes résultats. La figure 1 OB montre que l'expression du transgène est absente dans les muscles du colonl alors que le vaisseau mésentère est très fortement coloré par lacZ. Par contre, Ja coloration par immunofluorescence de la coupe d'une région intestinale similaire montre que la protéine SM 22 endogène est présente dans les deux tissus (figure 1 OC). L'absence d'expression du transgène dans les muscles lisses des viscères de l'adulte est de plus confirmée par des colorations de l'oesophage, de la trachée, de la vessie, du canal n déférent et de l'utérus pour l'activité l~gal. En aucun cas, il ne peut être détectée une expression (3gal dans les couches musculaires de ces tissus.
Curieusement, une coloration importante est observée dans le cytoplasme des cellules épithéliales du lumen du canal déférent et dans I'épithélium des conduits rénaux. Ceci est vraisemblablement dû a une activité galactosidase endogène, la coloration étant aussi visible dans les animaux non transgèniques témoins.
EXEMPLE 4:
Fabrication d'une construction comportant des reqions 20 réqulatrices du qène SM 22 et le qène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès (SM 22 INT-TK).
Le fragment HIV-LTR ~-167, + 80) est délété du plasmide pLTR-TK par digestion Hind lll dont les extrémités sont rendues bout franc avec l'enzyme de Klenow, suivie d'une digestion Xho 1. Le plasmide 2~ refermé en insérant un linker contenant les sites Xhol en 5', les sites Hind lll et Bsp 1201 dans l'ordre 5'->3' et une extrémité 3' bout-franc pour donner le vecteur p-TK. Un fragment Bsp 1201/Hind lll de 5.8 kb recouvrant la région -2126 à + 3648 du locus SM 22 est inséré dans p-TK pour obtenir SM 22 INT-TK. Ce fragment est compris dans I'enchaînement de nucléotides de la SEQ ID N~1.
Cette construction est schématiquement représentée sur la figure 1 1 .
EXEMPLE 5:
Fabrication du plasmide p445 nlz portant le fraqment -445 à +
65 du qène SM22 fusionné au qène lacZ, et obtention de transqènes CA 022~0099 1998-09-2~
Matériels et methodes Construction de p445nlz Le plasmide p2126nlz a été coupé par Xba I qui a un site unique dans le ~ polylinker ~ en 5' en amont de la séquence SM 22 . Les extrémités 5' protudantes du fragment ont été remplies à l'aide de la polymérase Klenow, par du dNTP.
Après précipitation le fragment a été coupé par Pst I qui a un site unique en position -445 relativement au nucléotide +1 de début de la transcription.
Les extremités 3' protudantes de la coupure Pst I ont été
hydrolysées à la polymérase Klenow sans dNTP. Le fragment comprenant les séquences plasmidiques plus la séquence SM 22 de -445 à + 65 fusionnée au gène lacZ a été purifié à partir d'un gel d'agarose et refermé par la ligase T4.
Pour les expériences de transgénèse le fragment injecté dans les oeufs de souris a été purifié à partir d'une double digestion Pst l/Nsi I du plasmide p2126nlz.
Les résultats obtenus avec cette construction et ceux obtenus avec p2126 INTlacZ et p21261acZ pour comparaison, figurent dans le tableau 20 ci-après.
Les propriétés de régulation transcriptionnelle de la séquence du gène SM 22 entre les nucléotides -445 et +65 ont été analysees in vivo dans des souris transgéniques par deux méthodes. La première méthode appelée analyse transitoire consiste à analyser le patron ~, d'expression du gène lacZ directement dans les embryons fondateurs FO à un stade donné. La deuxième méthode consiste à établir des lignées stables à partir de fondateurs FO adultes.
1. Analyse transitoire L'analyse transitoire a permis d'obtenir quatre embryons ayant intégré le transgène p445nlz dans leur génome sur un total de 13 embryons. Parmi les quatre embryons positifs analysés à 12.5 jours de développement, un embryon n'exprimait pas le transgène. Deux embryons présentaient un patron d'expression identique à celui de la lignée p2126 INT nlz au même stade, c'est-à-dire spécifique des cellules musculaires lisses artérielles et enfin un troisième embryon présentait , CA 022~0099 1998-09-2~
WO 97/3S974 PCT/F'R97/00543 2~) les mêmes territoires d'expression artérielle additionnés de divers sites d'expression ectopique essentiellement diffus dans le mésenchyme embryonnaire.
2. ~i~nées stables Deux lignées stables indépendantes ont été établies à partir d'un male (lignée nC1 ) et d'une femelle (lignée n~9).
L'expression du transgène a été analysee dans l'embryon au stade 15,5 jours pour la lignée 1 et 17,5 jours de développement dans la lignée 9. Les deux iignées préséntent le même type d'expression dans les artères: au niveau du coeur, le transgène est exprimé dans l'aorte dorsale et le tronc pulmonaire artériel.
A la différence des lignées obtenues avec les transgènes p2126nlz et p2126 INTnlz, les deux lignées p445nlz expriment lacZ très fortement dans les parois de l'oesophage et de la trachée respiratoire qui sont composées de muscie lisse à ce stade.
Les deux lignées présentent des différences entre elles dans certaines régions de l'embryon Pour la lignée n~1, le transgène s'exprime fortement dans les bronchioles en continuité de la trachée à
15,5 jours ce qui n'est pas observé dans la lignée n~9 à 17,5 jours où
2() lacZ n'est trouvé que dans la trachée. Cette différence peut être due soit à une modification de la régulation due à des sites d'intégration differents dans les deux lignées, soit à la différence de stade qui fait que l'expression de lacZ peut être réprimée entre le jour 15,5 et 17,5.
Dans les deux lignées on trouve donc une expression du transgène dans des organes qui contiennent une forte composante de cellules musculaires lisses. Il est intéressant de noter qu'il s'agit d'une partie au moins des cellules musculaires lisses de type respiratoire, la trachée, et une partie des cellules musculaires lisses de type viscéral, I'oesophage.
Enfin des sites d'expression ectopiques différents, c'est-à-dire où la .() présence de la proteine ou de l'ARN SM 22 endogène n'a pas été
reportée, ont été trouvés dans les deux lignées. La lignée 1 présente entre autre une expression forte très localisée dans les deux doigts posterieurs de chaque membre. La lignée 9 exprime fortement lacZ dans les régions antérieures du cerveau.
CA 022~0099 1998-09-2~
L'expression de cette construction à deux stades de l'évolution est illustrée par les figures 12A à 12D qui représentent des embryons de 15.5 jours p.c. (12A, 12B, 12C) et un adulte de 2 mois (12 D) SM 445 nlz colorés pour l'activité ~-galactosidase. On note l'expression dans le tissu - ~ musculaire lisse des artères, de l'oesophage et des bronches sur les figures 12A, B, C ainsi que dans des sites ectopiques comme la moëlle épinière (12B) ou les deux doigts postérieurs de chaque membre (12A).
On note aussi l'absence d'expression dans l'aorte thoracique ou le tronc pulmonaire artériel chez l'adulte (12D). Seule une expression dans la trachée est maintenue.
Les résultats obtenus montrent qu'une séquence de 450 paires de bases est suffisante pour garder la même expression dans l'embryon et le foetus mais pas chez l'adulte.
2~
TABLEAU
Constructions N~ de naissances Nomenclature Expression Adulte Embryon p 21261NTlacZ
F23 artères, aorte, artère pulmonaire p21261acZ M4 artères aorte, artère pulmonaire ventricule droit ventricule droit SM445 8 n~1 artère+no sp p4451acZ n~6 artèresseules n~7 n~1 artères seules 17 M1 artère+no sp pas d'expression F9 artère + no sp pas d'expression LISTE DE SEQUENCES
~1) INFORI~ATIONS GEI~ERALES:
(i) DEPOSANT:
~A) NOI~: INSTITUT PASTEUR
t B ) RUE: 2 8 RUE DU DOCTEUR ROUX
(C) VILLE: PARI5 (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTA~: 7 5 0 15 (A) NOI~: UNIVERSITE PARIS 7 (B) RUE: 1 PLACE JUSSIEU
(C) VILLE: PARIS
( E ) PAYS: . RANCE
(F) CODE POSTAL: 75005 ~ ITR- D~ Ll INVEI~TION: SEQU~ NCES r I~ A' ONT DU GENE S'~122 (iii) ;~OI~RE DE SEQUENCES:.~
(iV) ,-ORI~E DECHI~FRABLE PAR OR3I~ATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: F10PDY disk ( B ) ORDINATE~R: IB~ PC COmDatiD1e (C) SYSTE~E D' EXPLOITATION: PC-DOSJI~S-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Re1eaSe -.1.0, Version .1.30 (OE3) I~FOR~ATIO~lS POUR LA SEQ ~ ~o 1 (i~ CA~C~STIQUES DE LA SEQIJ~'C--:
(A)LO~GUI~ 6261 p~.es dcbases (B) m~ ~
(C) ~'OI~BRE DF BR~S: dou~lc (D) CO~FIGUR~TIO~ ~ caire (ii) ~YPE DE MOLECULE: AD~ (Sc~onLique) ~iii) HYPOl~TIQUE: ~'ON
(~i) OR~GlNE:
(,.~) ORG~ISME: SOU~IS
GG GCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGl 1 1 1 lAT AGcTcTTGGG
CTG&GAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TccTccATGc TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACMCCA GACCTG{~GAT
TTG&G&TCTT ACTGATGTGT
TGGGAG&TGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC
TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC
CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT
ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC AcAcAGcACc TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG
TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAG&CCAAGG TTTTAAAGGC
TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGC;GGG
GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
1111 l lGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGCiCCCTCC
TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC
CCGAGTGCTG GGATTAAAG~
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA
AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGcTG&&AA
GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG
TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT G&ATTGAGCG
TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGccTGAGG
GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTGG~GA
TGG~ACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC C 1 1 1 1 AAGAA
GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAG&G GCAGAGGAGA GcTGGTTcTG
TCTCCACTGT GmGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGcAGTTGTc mAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGcTAGGTG
CAAGATAAGT GG&&ACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG AcTATTTTGA
AGGGAGGGAG GGTGACACTG
TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGccAGGc CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GcTGcTAAAc AAGGCACTCC CTAGAGAAGA
CA 02250099 l998-09-25 WO 97/35974 ~1 PCT/FR97/00543 GTCCACTGTA GGCAGATAG& TGACAG&TGG CAGATAG&TG
ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT G&GACCCTGT
TCCTCCCAAA GG&TCTTGGT
G&TTCCCCTT G&&GCTCTCT AAAGGATGTC AGTG&GCTGT
TGCCACATCT ATATAAGAG&
ACTAGTCTTC TG&AATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC
AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG
GTCTGCTTGT TGTCCAGG&T
CTCTGCTACA TG&AGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC
TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AG~cATccAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT
TTTGCGTTG& AGC 1 1 1 l'GTC
TAGAAATACC CTGGTGC~GCT GCCAAACCAC CAcccATATC
CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGA'l 1 1 1 111 TTTTGGTTTT
~1 1 1 1 '1 1 l GT
TT(~l 11 l'AAG TTAGcATAcA AAGTAATACA TTTCATCATG
GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC
TTGTAl 111 1 GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACG&CTGAGC CATcTCTCcA
GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA
ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT
GTTCGTACG& CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGcAT
GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TC; 1 1 1 1 CCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG 1 1 1 1 1 1 GTTT
TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATcAGGcT
GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC
GCCACCACTG TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AG{icTGAGTA
GAGGCTAGGA GGAAGGG&CA
CCGCAGTCAC CG&CTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT
CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGC~ TGC;TCGGGGG TTGGC;G{iGAG GG&GCAGGCC
ACACAGTGGG GTGTGGGAGC;
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAG~''l 11'1' GAGTCCTCCA G>AG'CTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CccTTTccTT
CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
CCTATAG> TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC T(~ 1 1 1 1 1 CTC
TCAATGTTGG
TGTTGC;GCTC AG~;GAATGCT TTG{~AGAAGG TG&TGGGAAc TGGAGAAGGG AAGATCAGTT
wo 97/3s974 PCT/F~97/00543 TACCATACCT GTG~GCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC
ACTTGGTAGC CTTGGAAAG'G
CCACTTTGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG
GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAG{iGGAACG TGAGGAAG~C GTTTGGATAG TGCCTGGTTG
CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGcAAG~AGG
TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GccTcccccT
TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAG>ccTG
CCCATAAAAG Gl 111 lCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC
TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT
TTCCCCAAAT ATG&AGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGG{~CGGC CCGGGGTGGT GAGccAAGcA
GACTTCCATG GGCAG~;&AGG
G&CGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC AcTGccTAGG
CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CcAGAcAccG
AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGcA
GAAG&GCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG
TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT
TGACTGGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AA ATTCAGTC AcTGTcccAc CCATAGGTGT ATGGGCTATG
T&TTAGGCCC AAAGAGCiTGA CAAATGAG&C CAAGGGAACA
ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAG{~A GTGAcccAcT
GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAG&AG GTAGCCCCCT CAG&cAGTGG
AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG
CAGGCATGTG CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAG&Gcc TG~;l 1 1 1 l CT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT
( ; 1 1 l'(,C; 1 1 1 1 CTCTCTI~CA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTT(.; 1 1 1 1 1 1 TCTTT~
GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AAcTcAcTcT
TTAGACCAG& CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGcTGc;&
ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGcTTGGTcc AGTTTGA~G TAGGAG&TCA
WO 97/35974 3 3 PCT/F'R97/00543 TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC
ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC AccccATcTc GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAG~TTTGC
TCCCACTTCA CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGA,~A
GCAAGATGTT TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC G&GACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC
CACTCCCATC CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAG&AG
GTGG&&GAGC CTGTCATCTG
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT
CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATcccACTCA
GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC
TGCCTG~TTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA
GGCCTTTGAG GCMCAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTG&C TAGcAGATTc TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGcTG{~C
CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT G>CTCCCT GAGAATGCCG CT~l 111CTG
AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTC; 1 1 1 1 l GT CAGCTGCGCT TTGGG{~GATG
AACTTTGCTC TTCTG&CTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGcTAG
AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAG& ACATG&CTTC TG&AAAACCT CTcTAGTGcT
TTTCTGGCTA GTCTTGC;CAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCG> GATGcAG&Gc TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA
AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AG&AGCiCTGA AGcAGcicAAG
ATCTCTGTTA GTTGGAG&CC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GccAGAcAGT
GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAAcAA
AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGcccTGGG
CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TcTAGGcccA
GC~GGTTGTCA AAATAGTCCA
CAG~CCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGl 1 1 1 1 ATAAAcAAAA
TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAG&CTATT TTCATTACAA TAGAGGccAT
ATGGTCTGTA AAGTCT~
TATTTACTCT GcT(~llllAc ATAAAAAGTT GACAGACTCT
TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGG>C
TCTGCAGCAA GTG>AAAG
CTG&TCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGG& TCCCCTCAGA
GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCllllCT
CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
CA 022~0099 l998-09-2~
W097t35974 35 PCTn~7/00543 (2) INFORI-5ATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2190 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) .~YPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANIS~E: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2 :
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCAT~ ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTA~ GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC
CA 022~0099 1998-09-2~
wog7/35974 36 PCTn~7/00543 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GCCACCCATT 3( GATTcTGTAA ACATGTGACC CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG 3t CACCACGTAT GTAAACGTCA GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT 4~
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCC~ GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG 5~.
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG 6( TTTTGGTTTG '~ GA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6~
ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7.
TGGGATTAAA C-GCGIGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA TTTAGATTAT ~AAAGGACG 7 GGATTTGGGG AATCCTGTCT AGTGAATTcA GGACGTAATC AGTGGCTGGG AAGCAAGAGC 8~
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10~
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC lOE
TAACCCTGAG CCTGTCTCAC CTGTCCCTTC CCAAGACCAC TGAAGCTAGG TGCAAGATAA 13~
CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGCAG GATGACCCAT GTTcTGccAT GCACTTGGTA 15~
TATCTCATAA TAAAGGGGAA CGTGAGGAAG GCGTTTGGAT AGTGccTGGT TGCGGCCAGG 168 CTGcAGTcAA GACTAGTTCC CACCAACTCG ATTTTAAAGC CTTGcAAGAA GGTGGCTTGT 17~
CA 022~0099 1998-09-2~
TTGTCCCTTG CAGGTTCCTT TGCTCGGGCC AAACTCTAGA ATGCCTCCCC CTTTCTTTCT 18~
CATTGAAGAG CAGACCCAAG TCCGGGTAAC AAGGAAGGGT TTCAGGGTCC TGCCCATAAA 18f AGli'l"l"l''l"l'CC CGGCCGCCCT CAGCACCGCC CCGCCCCGAC CCCCGCAGCA TCTCCAAAGC 19:
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA 19, TGGGCAGGGA GGGGCGCCAC GGGGCGGCAG AGGGGTGACA TCACTGCCTA GGCGGCCTTT 21( AAACCCCTCA CCCAGCCGGC GCCCCGGCCC GTCTGCCCCA GCCCAGACAC CGAAGCTACT 21~
CTCCTTCCAG TCCACAAACG ACCAAGCCTT 21' CA 02250099 l998-09-25 W097l35974 PCTn~7/OOS43 (2) INFO~ATIONS POUR LA SEQ ID NO: ~
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR~ 1 paires de bases (B) TYPE: nucle~ti~
(C) NO'~BRE DE BRINS: doubl~
(D) CONFIGURATION: linéair~
(ii) TYPE DE :~OLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISI~E: SOURIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No:3 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCAT~'l''l"l"l"l' ATAGcTcTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA T~AAGAC~AC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC
CA 022~0099 l998-09-2~
TGTGTcTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4 TTTTGGTTTG 'l~ llGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG CCCTGGCCCT CCTGGAACCC 6 CAGAATTGGG GATGGGACTC AGAGACACCA CTAAAGCCTT ACCTTTTAAG AAGTTGCATT ll GTGG&GACCC TTTCTGAGGT GGTAGGATCT TTCACGATAA GGACTATTTT GAAGGGAGGG 13 CCCTAGAGAA GATACCATAC CTGTGGGC~G GATGACCCAT GTTCTGCCAT GCACTTGGTA 15 C
PCT/F~97/00543 INFO~ATIO~S POU~ ~A SEQ ID ~O: 4 ~i) CA~ACI'E~STIQUES DE L~ SEQU~NCE:
(A) I,O~TGUEU~ . paires dc bas~s (~3) ~fpF.: ~ucl~otidc (C) I~OMB~E DE~ BRI~S: doublc ~D) CONFIGU~ATION: liDe2ire (ii) lYPE DE MOLECULE: ~DN (~énomique) (iii) HYPO~HETIQUE: ~'ON
(~i) ORI&~'E:
(A) ORGA~SME: SOI~IS
FEUILLE RE~ ; (REGLE 91) ISA/EP
41 PCTn~R97/00543 TCTAGAGGCC ACGGMCGGT GCCMGCACA CAGTCCCm TGCCTCmC
ACGGGAGCAG
GAGTCCCAGT GCCTGTCGTG GAAAGGGAGG AACATGCCAG GTCCCTGTGT
GTCCTTGGCC
CTGTCTCACC AAAGGACTCA GGGCTGGm CTGAGTTTCC GTCCAGTATT
TAGCCMGTC
CTGTGTT~GT CACGTAGGCC TMGAGCCTT GGCGTTTACA GAGTCACCCA
GCTCTGGCCC
CTGGCATTCT GGTCCTTGGC GTTTACAGAG TCACCCAGCT CCAGGCCCCT
GGCACmGG
TACTTGGTTG CCCTTCACTC CACCAGGTCC ATTCCAGATG CCAAGAGTGG
GccccAGGAA
TGTGTrrCCT TCTCTCCACC ATG I I I TTAT AGCTCTTGGG CTGGG~GMG
AGGCGGGTCT
GGGTCmGT TTcTGAGcTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC TACGGTTGCA
ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA MGACAACCA GACCTGGGAT TTGGGGTCTT
ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TAmTGGCC TTCCCGTCTC
G I I I CTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCMGC CACCCATTGA
TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT ACTGAAAGTG
TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCA~3CAGGC ACACAGCP~CC T~3ACTACCCA
CCACGTATGT
~ AACGTCAGT A T CC I I I CCA GCCAGCTCTG CAG,~TGGGTG TCCAGGCTGT
GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG n " AAAGGc TGTTCAGGAA
TGG~TGGCAA
C'CAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TG I 1 1 GGGGG GGGGGTGGTT
TTGG m GTT
TCTGTAQACC
AGGCTGGCCT TGMCTCAGA AATCTGCCTG CC~CTGCCTC CCGAGTGCTG
GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGA I I I ! ATT TAGATTATAA AAAGGACGGG
Amt~GGG~
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA GCAAGAGCTC
T~GAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CAC,~AGGAGG TGCTGGAGrr CTATGC~CCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATT(;AGCG TCTGAGGCTG
CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CT~CCTGAGG GTTCTCTCCT
TCCCTCTCTC
TACTCCT'TCC TCCCTCTCCC, CTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTG~;GGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC C I I i I AAGAA GTTGCATTCA
GTGAGTGTGT
GAGA(~ATAGC ACAGATA(~GG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG TcTccAcTGT
GmGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC TTTMCCCTA
ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG MGCTAGGTG CAAGATAAGT
GGG~;AC CCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCrTT CACGATAAC~G ACTATmGA AGGGAGGGAG
GGTGACACTG
pcT~Rs7loos43 ~ 2 TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTT~CCAGGC CTTAAACATC
CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC AAGGcAcTcc CTAGAGAAGA
TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC ACTTGGTAGC
CTTGGAAAGG
CCACmGAA CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG GTAACTGCTA
TCTCATAATA
AAGGGGAACG TGAGGAAGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG CGGCCAGGCT
GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG TGCCTTGI I r GTCCCTTGCA
GGTTCCmG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT TTC I I I CTCA
TTGMGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAAcAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG CCCATAAAAG
1 lCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC TCCAMGCAT
GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT TTCCCCAAAT
ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGC;CGGC CC~GGGTGGT GAGCCAAGCA GACTTCCATG
GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCC T AGG CGGCC I I I M
ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CCAGACACCG AAGCTACTCT
CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCMGT CATGG~AGCA GAAGGGCTGT
GGGCTCA~TT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA G 1 1 I G~ I GGG TGGAATTGGG TCCCTAGAGA
CCATTCTCTG
TGTTAGACM AAAGTCTGGG, TAAAATGCC TAGGATGATT TGACTGGGGC
AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ~CTGTCCCAC CCATAGG T GT
ATGGGCTATG
TGT~AGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAACA AcTccATcTT
TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT GATGGTCCCC
AGGGCTMTG
CAACTCGGGG GAGccAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG AGGACTAAAG
ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATcAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG CAGGCATGTG
CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCC I ~ CA GACTAGCCT~ GGATAGGGCC TG~
TTCC I I I I CT
CTCTC l L; I C; I CTCTCTCTCT CT~ ;C 1~ 1 C I CTCTC 1 G ~ ~ I CTCTC 1 Cl I IC~;I I I I
C I ~; I I I CA CTCTCTC I T-T CTMTTTcTT ~ I TC I I ~ CT~ I I C l I I AGACAG
G~ ; tC 1~ TGTAGcccTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT TTAGACCAGG
CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC MGTGCTGGG ATTAAAGGcG
TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGmGCT mTGATGGC AGcTTGGTcc AG I I I GAAAG
TAGGAGGTCA
GTCCACTGTA GC;CAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG AcAGATAGGT
GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG A~CTGGGACT GG c~CA~CCCT GGGACCCTGT TCCTCCCAAA
GGGTCTTGGT
~3 GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGcTGT TGCCACATCT
ATATAAGAGG
AcTAGTcTTc TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC AGAA~TGCTC
ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG GTCTGCTTGT
TGTCCAC~;GGT
CTCTGCTACA TGGAGGcccc TTTCCACAGC CTAACCTCTC TACCTGCTGA
CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGcATccAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT TTTGCGTTGG
AGCTTTTGTC
TAG~AATACC CTGGTGGGCT GccAAAccAc CACCCATATC CCTCTCTCCT
CTCTGCTGCC
TCTA~GATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGA ~ I I I I GGTTTT G I I ~ rGT
TTG I 5 1 1 AAG TTAG CATACA AAGTMTACA I I I CATCATG GCATTTGGA(~
ATACATATAT
ATTTTAI I IGCTCTCCTGGCCTCTTCTCAAAGAGACTTCl CTGGACmC
TTGTA I I I I I
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA GCCCTTCTTT
GGAC I I I CTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA ATCTTGAGAG
CATGACCTGA
CCCAGACCTG AcAGATGTcA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT GTTCGTACGG
CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAAcm CTGGAGACTG AGAAGTGCAT GTGAGGACAC
CTCCTCCCA
TC I I I I CCTC TAGTGGCTAG TGATG I I I GG I I I I I I G I I I TGAGACAGGG
l~TCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCAC I I I GT AGATC~GGCT GGCCTCCAAC
TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCC-AG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC GCCACCACTG
TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA GAGGCTAGGA
GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC I I I I t3TGGTT CCTTGTCGCA
GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG T GGTCGGGGG TTGGGGGCiAG GGGGcAGGcc ACACAGTGGG
GTGTGGGAGG
G~TAGCTGT TGACAACTTC CCAJI~cAGA~ CCAGGC I I I 1- GAGTCCTCCA
GGGTP~GCTTG
AGAGGGTACT CA~A~AGCCG TGTCCATGTC CCC I 1 I CCTT CACCTCAGGG
AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCA I I rCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC
TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATCCT TTGGAG~AGG TGGTGGGAAC TGGAGAAGGG
AAGA~CAGTT
TP~CTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CCTCCCTTCC ACCCTGCAAT
ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACA( ;ACAC ,~CCCC,~ T CTC GAAGAGCTCT
ATTAAGcTcc AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CCAGG I I I GC TCCCACTTCA
CAAGCAGAGA
ACTCATMCT GMGGGGGTG ACAGCACAGG GGMGGGAAA GCAAGATGTT
TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC CACTCCCATC
CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGC I I I CA TGGGAAGGAG GTGGGGGAGC
CTGTCATCTG
. . .
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT CAGAAGCAGG
GGTTGGI I IG
GCTGACTAGG
TCTGGCTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC TGCCTGCTTT
GCTCCTATAG
GCMCAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGCAGATTC TCTGCCCTGG
AGGP~CTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC CCACACGGGC
ACMCAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGMTGCCG CTGl I I I CTG AGAACCCTTG
GACTCTGGTG
GC I I I ATCAG GTCTTTl~GT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG AACmGCTC
rrCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG AGAAAGATAG
CTACTGGCTG
MTTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT mCTGGCTA
GTCTTGGCAA
AGTAAP~AATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGCAGGGC TTCCTGTTCG
AG~CCTTTCT
GTAC~AAAl~ AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA AGCCAGACTC
TGTTGAAGCA
CGCCTT T AAT CCCAvCACTC AGGAGGCTGA AGCAGGCAAG A~CTCTGTTA
GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT GCAACCCTTT
CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACA~AC TAT~AAACAA AGAGAAGGCC
GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATAC~CCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG CTCCACCAG
P~CTGCAG~A
~ AAGCAAGCA ATG~GGGACA GGAGGrrGGC TCTAGGCCCA GGGG~TGTCA
AAATAC~TCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCT~i I I I I I ATAAACAAAA TTTTATTGGC
ACACATTGG, TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCC~T ATGGTCTGTA
AAGTCTAAAA
TAI I IACTCTGCTGI I ITAcAtAP~AGl~GACAGACTCTTGGTCTAG~C
TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTl~TCTGAG GTTCA~G I I I CAGAGGGGTC TCTGCAGCAA
GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA GTGGAAGGCC
TGC'rTAGCAC
AMTGMGTA ~AGTAACTTG CTGGCTC l I I GTTc-T I I I CT CCACACTCTA
T~C I r i A~:;CT
CTGCCTCMC ATG
, CA 022~0099 1998-09-2S
WO 97/35974 45 PCTI~iR97/00543 ( 2 ) INFORI~ATIONS POUR LA SEQ ID NO
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR 7~5 paires de bases (B) TYPE: nuclP otide (C) NOMBRE DE 3RINS double (D) CONFIGURATION: li~éaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (oe nomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(Vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: SOURIS
(Xi) DESCRIPTION-DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:~
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATG11111 ATA~CTCTTG GGCTGGGAGA
AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT ~111C1GAGC ~ 'b'1"1'L'1'AT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG 1 CAA~ LL~L~L~L CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC CAGACCTGGG ATTTGGGGTC 1 TTACTGATGT GTTGGGAGGT GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC 2~
TC~11LL1~1 GCC1GGC1AC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG ATCCCACCAA GC~CCr~TT 3C
GA'1"1'L'1'~'~'AA ACATGTGACC L1~1GC1~CCAA GCATTGCTTA CA&GAGCAGG ATACTGAAAG 3~
'1'~'1'~'1'L'1'L-'1'L- CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG GCACACAGCA CCTGACTACC 4, GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA GGTTTTAAAG GL'1'~'1''1'CAGG 5~
AATGGATGGC AAGCAGGATC TAAGAGGAGG GGGGG'L''1'~'1"1' b11L~ 1GGG GGGGGGGTGG 6C
~1111L-b11LG '111LL1IL1L~A GACAGGGTTT C~1L~1~b~ GG CCC1GGCCCT CCTGGAACCC 6 ACTCTGTAGA CCAGG~l~GC CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC 7, ~efer~Ce~
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Claims (36)
1. Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique d'un gène dans des cellules eucaryotes, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
2. Séquence d'ADN selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo d'un gène dans les cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
- un fragment de la séquence en amont de la partie codante du gène de la protéine SM 22, ou d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence à ladite séquence en amont, ledit fragment étant susceptible d'induire une expression spécifique in vivo d'un gène dans les cellules des artères, et - une séquence codant pour une protéine, ou un ARN, d'intérêt thérapeutique.
3. Séquence selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine, ou ledit ARN, est susceptible d'inhiber la croissance des cellules du muscle lisse, d'activer la croissance des cellules endothéliales, de consolider les parois des artères et/ou d'induire une réponse immunitaire.
4. Séquence selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides -2126 et +4135 du gène de souris de la protéine SM22 (SEQ ID n° 1.)
5. Séquence selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit fragment est compris dans la séquence située entre les nucléotides - 2126 à +65 du gène de souris de la proteine SM 22 (SEQ
ID N°2).
ID N°2).
6. Séquence selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle contient au moins une partie de la séquence située entre les nucléotides -2126 et -445 du gène de la souris de la protéine SM 22 (SEQ ID N° 3).
7. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine induisant la formation d'un composé cytotoxique.
8. Séquence selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine est la thymidine kinase du virus de l'herpès.
9. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente un effet cytostatique.
10. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique présente une activité
lipolytique.
lipolytique.
11. Séquence selon la revendication 10, caractérisée en que ladite protéine est la lipoprotéine lipase.
12. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est un facteur de croissance des cellules endothéliales.
13. Séquence selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit facteur est une interleukine.
14. Séquence selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite protéine d'intérêt thérapeutique est une protéine musculaire ou de structure tissulaire.
15. Séquence selon l'une des revendications 1 a 6, caractérisée en ce que l'ARN d'intérêt thérapeutique est l'ARN antisens de la protéine p53.
16. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de souris de la protéine SM 22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID N°5 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes:
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT
ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT
GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC
CAGACCTGGG ATTTGGGGTC TTACTGATGT GTTGGGAGGT
GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG
ATCCCACCAA GCCACCCATT GATTCTGTAA ACATGTGACC
CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG
GCACACAGCA CCTGACTACC CACCACGTAT GTAAACGTCA
GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA
GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG AATGGATGGC AAGCAGGATC
TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG
CCCTGGCCCT CCTGGAACCC ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC
CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA
TTTAGATTAT AAAAAGGACG GGATT
GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT
ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA AGAGGCGGGT CTGGGTCTTT
GTTTCTGAGC TTTGTTCTAT GTTCCTCCAT GCTACGGTTG
CAATTGTTTT CTATGAACGA GTACATTCAA TAAAGACAAC
CAGACCTGGG ATTTGGGGTC TTACTGATGT GTTGGGAGGT
GCAGGAGCCT CCGTGTCCCA TTTATTTTGG CCTTCCCGTC
TCGTTTCTGT GCGTGGCTAC ATTGGGAATG ACCTTCCTTG
ATCCCACCAA GCCACCCATT GATTCTGTAA ACATGTGACC
CTTGCTCCAA GCATTGCTTA CAGGAGCAGG ATACTGAAAG
TGTGTCTGTG CCCTCTCCTG ATAACCCCTC CCTTCAGCAG
GCACACAGCA CCTGACTACC CACCACGTAT GTAAACGTCA
GTATCCTTTC CAGCCAGCTC TGCAGATGGG TGTCCAGGCT
GTGCATGATG CACCTCAAGT GGGCAGAGCT TGCAGGCCAA
GGTTTTAAAG GCTGTTCAGG AATGGATGGC AAGCAGGATC
TAAGAGGAGG GGGGGTTGTT GTTGTTTGGG GGGGGGGTGG
TTTTGGTTTG TTTTTTTTGA GACAGGGTTT CTCTGTGTGG
CCCTGGCCCT CCTGGAACCC ACTCTGTAGA CCAGGCTGGC
CTTGAACTCA GAAATCTGCC TGCCTCTGCC TCCCGAGTGC
TGGGATTAAA GGCGTGTGCC CATCGAGGAG GGAGATTTTA
TTTAGATTAT AAAAAGGACG GGATT
17. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séQuence SEQ ID n° 1 suivante, ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes:
GGGCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG
CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC
TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT
TTGGGGTCTT ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC
TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC
CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT
ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC
TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG
TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC
TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG
GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC
TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC
CCGAGTGCTG GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA
AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA
GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG
TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG
TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG
GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTGGGGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA
GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG
TCTCCACTGT GTTTGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC
TTTAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGCTAGGTG
CAAGATAAGT GGGGACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA
AGGGAGGGAG GGTGACACTG
TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGCCAGGC
CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC
AAGGCACTCC CTAGAGAAGA
GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG
ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT
TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT
GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT
TGCCACATCT ATATAAGAGG
ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC
AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG
GTCTGCTTGT TGTCCAGGGT
CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC
TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT
TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC
TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC
CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT
GTTTTTTTGT
TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG
GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC
TTGTATTTTT
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA
GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA
ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT
GTTCGTACGG CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT
GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT
TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT
GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC
GCCACCACTG TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA
GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT
CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC
ACACAGTGGG GTGTGGGAGG
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT
GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT
CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC
TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC
TGGAGAAGGG AAGATCAGTT
TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC
ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG
CCACTTTGM CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG
GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAGGGGGAACG TGAGGMGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG
CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG
TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT
TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG
CCCATAAAAG GTTTTTCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC
TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT
TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA
GACTTCCATG GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG
CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CcAGAcAccG
AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA
GMGGGCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG
TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT
TGACTGZGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ACTGTCCCAC
CCATAGGTGT ATGGGCTATG
TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAAcA
ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT
GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG
AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG
CAGGCATGTG CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC
TGCTTTTTCT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT
CTTTCCTTTT
CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT
CTTTAGACAG
GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT
TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG
ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC
AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA
TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CcTccCTTCC
ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC
GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CcAGGTTTGc TCCCACTTCA CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA
GCAAGATGTT TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC
CACTCCCATC CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG
GTGGGGAGC CTGTCATCTG
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT
CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA
GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGC;CTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC
TGCCCTGCTTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA
GGCCTTTGAG GCAACAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGcAGATTC
TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC
CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG
AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG
AACTTTGCTC TTCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG
AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT
TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGcAGGGc TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA
AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGcAGGcAAG
ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT
GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA
AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG
CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA
GGGGTTGTCA AAATAGTCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA
TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT
ATGGTCTGTA AAGTCTAAAA
TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT
TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGGTC
TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA
GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT
CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
GGGCCCCAGGAA
TGTGTTTCCT TCTCTCCACC ATGTTTTTAT AGCTCTTGGG
CTGGGAGAAG AGGCGGGTCT
GGGTCTTTGT TTCTGAGCTT TGTTCTATGT TCCTCCATGC
TACGGTTGCA ATTGTTTTCT
ATGAACGAGT ACATTCAATA AAGACAACCA GACCTGGGAT
TTGGGGTCTT ACTGATGTGT
TGGGAGGTGC AGGAGCCTCC GTGTCCCATT TATTTTGGCC
TTCCCGTCTC GTTTCTGTGC
GTGGCTACAT TGGGAATGAC CTTCCTTGAT CCCACCAAGC
CACCCATTGA TTCTGTAAAC
ATGTGACCCT TGCTCCAAGC ATTGCTTACA GGAGCAGGAT
ACTGAAAGTG TGTCTGTGCC
CTCTCCTGAT AACCCCTCCC TTCAGCAGGC ACACAGCACC
TGACTACCCA CCACGTATGT
AAACGTCAGT ATCCTTTCCA GCCAGCTCTG CAGATGGGTG
TCCAGGCTGT GCATGATGCA
CCTCAAGTGG GCAGAGCTTG CAGGCCAAGG TTTTAAAGGC
TGTTCAGGAA TGGATGGCAA
GCAGGATCTA AGAGGAGGGG GGGTTGTTGT TGTTTGGGGG
GGGGGTGGTT TTGGTTTGTT
TTTTTTGAGA CAGGGTTTCT CTGTGTGGCC CTGGCCCTCC
TGGAACCCAC TCTGTAGACC
AGGCTGGCCT TGAACTCAGA AATCTGCCTG CCTCTGCCTC
CCGAGTGCTG GGATTAAAGG
CGTGTGCCCA TCGAGGAGGG AGATTTTATT TAGATTATAA
AAAGGACGGG ATTTGGGGAA
TCCTGTCTAG TGAATTCAGG ACGTAATCAG TGGCTGGGAA
GCAAGAGCTC TAGAGGAGCT
CCAGCTTATT ATGACCCTTC CTTCAGATGC CACAAGGAGG
TGCTGGAGTT CTATGCACCA
ATAGCTTAAA CCAGCCAGGC TGGCTGTAGT GGATTGAGCG
TCTGAGGCTG CACCTCTCTG
GCCTGCAGCC AGTTCTGGGT GAGACTGACC CTGCCTGAGG
GTTCTCTCCT TCCCTCTCTC
TACTCCTTCC TCCCTCTCCC TCTCCCTCTC TCTGTTTCCT GAGGTTTCCA
GAATTGGGGA
TGGGACTCAG AGACACCACT AAAGCCTTAC CTTTTAAGAA
GTTGCATTCA GTGAGTGTGT
GAGACATAGC ACAGATAGGG GCAGAGGAGA GCTGGTTCTG
TCTCCACTGT GTTTGGTCTT
GGGTACTGAA CTCAGACCAT CAGGTGTGAT AGCAGTTGTC
TTTAACCCTA ACCCTGAGCC
TGTCTCACCT GTCCCTTCCC AAGACCACTG AAGCTAGGTG
CAAGATAAGT GGGGACCCTT
TCTGAGGTGG TAGGATCTTT CACGATAAGG ACTATTTTGA
AGGGAGGGAG GGTGACACTG
TCCTAGTCCT CTTACCCTAG TGTCTCCAGC CTTGCCAGGC
CTTAAACATC CGCCCATTGT
CACCGCTCTA GAAGGGGCCA CCCTTGACTT GCTGCTAAAC
AAGGCACTCC CTAGAGAAGA
GTCCACTGTA GGCAGATAGG TGACAGGTGG CAGATAGGTG
ACAGATAGGT GACAGGTGGA
GGAGCTTTGG AACTGGGACT GGACAGCCCT GGGACCCTGT
TCCTCCCAAA GGGTCTTGGT
GGTTCCCCTT GGGGCTCTCT AAAGGATGTC AGTGGGCTGT
TGCCACATCT ATATAAGAGG
ACTAGTCTTC TGGAATTTAG GTGTGATCTC TCAGGGATGC
AGAAATGCTC ACCCTTACTG
TCATTTTATG GGCTGAGGTA CCACAGGCAG ATATACCCTG
GTCTGCTTGT TGTCCAGGGT
CTCTGCTACA TGGAGGCCCC TTTCCACAGC CTAACCTCTC
TACCTGCTGA CAGGAGGGCT
GGATGGCCAC AGGCATCCAA CGTGCGCATC ATGCAGGTGT
TTTGCGTTGG AGCTTTTGTC
TAGAAATACC CTGGTGGGCT GCCAAACCAC CACCCATATC
CCTCTCTCCT CTCTGCTGCC
TCTAAGATGA CAGCTTGATT TTTCTTATAG TGATTTTTTT TTTTGGTTTT
GTTTTTTTGT
TTGTTTTAAG TTAGCATACA AAGTAATACA TTTCATCATG
GCATTTGGAC ATACATATAT
ATTTTATTTG CTCTCCTGGC CTCTTCTCAA AGAGACTTCT CTGGACTTTC
TTGTATTTTT
GGTTGTGAGC CTAGCCTTTA ACGGCTGAGC CATCTCTCCA
GCCCTTCTTT GGACTTTCTA
CTTCATACTT CCCACCAGTC TGGGAAGAAG GGCACATGGA
ATCTTGAGAG CATGACCTGA
CCCAGACCTG ACAGATGTCA AGGCTGCAGT GTATGCTCTT
GTTCGTACGG CTTGTTCTTA
GTCCTGCAGT TCAGAACTTT CTGGAGACTG AGAAGTGCAT
GTGAGGACAC TCTCCTCCCA
TCTTTTCCTC TAGTGGCTAG TGATGTTTGG TTTTTTGTTT
TGAGACAGGG TTTCTCTGTA
TAGCCCTAGC TATCCTGGAA CTCACTTTGT AGATCAGGCT
GGCCTCCAAC TCAGAAATCT
GCCTGCCTCT GCCTCCCGAG TGCTGGGACT AAAGGCGTGC
GCCACCACTG TCCAGTCAGG
AGTAGAAGGA AACTGTAAGG TGCTTGAGAC AGGCTGAGTA
GAGGCTAGGA GGAAGGGGCA
CCGCAGTCAC CGGCTCCATG ACTCTGTGAC TTTTGTGGTT
CCTTGTCGCA GCGGTTCCTG
GTGGTGGTGG TGGTCGGGGG TTGGGGGGAG GGGGCAGGCC
ACACAGTGGG GTGTGGGAGG
GAATAGCTGT TGACAACTTC CCAACAGAAA CCAGGCTTTT
GAGTCCTCCA GGGTAGCTTG
AGAGGGTACT CAGAAAGCCG TGTCCATGTC CCCTTTCCTT
CACCTCAGGG AAGTAAGTTG
CCTATAGGGT TGTCATTTCA ATGAGGTCTT CTGGTTATTC TGTTTTTCTC
TCAATGTTGG
TGTTGGGCTC AGGGAATGCT TTGGAGAAGG TGGTGGGAAC
TGGAGAAGGG AAGATCAGTT
TACCATACCT GTGGGCAGGA TGACCCATGT TCTGCCATGC
ACTTGGTAGC CTTGGAAAGG
CCACTTTGM CCTCAATTTT CTCAACTGTT AAATGGAGTG
GTAACTGCTA TCTCATAATA
AAGGGGGAACG TGAGGMGGC GTTTGGATAG TGCCTGGTTG
CGGCCAGGCT GCAGTCAAGA
CTAGTTCCCA CCAACTCGAT TTTAAAGCCT TGCAAGAAGG
TGGCTTGTTT GTCCCTTGCA
GGTTCCTTTG CTCGGGCCAA ACTCTAGAAT GCCTCCCCCT
TTCTTTCTCA TTGAAGAGCA
GACCCAAGTC CGGGTAACAA GGAAGGGTTT CAGGGTCCTG
CCCATAAAAG GTTTTTCCCG
GCCGCCCTCA GCACCGCCCC GCCCCGACCC CCGCAGCATC
TCCAAAGCAT GCAGAGAATG
TCTCCGGCTG CCCCCGACAG ACTGCTCCAA CTTGGTGTCT
TTCCCCAAAT ATGGAGCCTG
TGTGGAGTGA GTGGGGCGGC CCGGGGTGGT GAGCCAAGCA
GACTTCCATG GGCAGGGAGG
GGCGCCACGG GGCGGCAGAG GGGTGACATC ACTGCCTAGG
CGGCCTTTAA ACCCCTCACC
CAGCCGGCGC CCCGGCCCGT CTGCCCCAGC CcAGAcAccG
AAGCTACTCT CCTTCCAGTC
CACAAACGAC CAAGCCTTGT AAGTGCAAGT CATGGGAGCA
GMGGGCTGT GGGCTCAATT
AGATCCCCTA GTCTCTTCTA GTTTGCTGGG TGGAATTGGG
TCCCTAGAGA CCATTCTCTG
TGTTAGACAA AAAGTCTGGG TTAAAATGCC TAGGATGATT
TGACTGZGGGC AAAAGAATAA
ATGGGGTGAG AGGGAGGCTC AAATTCAGTC ACTGTCCCAC
CCATAGGTGT ATGGGCTATG
TGTTAGGCCC AAAGAGGTGA CAAATGAGGC CAAGGGAAcA
ACTCCATCTT TGGATCTCCA
AGAAGGTGAG GGGCTAAGTT CTGGAAAGCA GTGACCCACT
GATGGTCCCC AGGGCTAATG
CAACTCGGGG GAGCCAGGAG GTAGCCCCCT CAGGCAGTGG
AGGACTAAAG ATCTTATTTT
TTGTAGCGCT AGGGATCAAA CCCCAGGGCG CTATGTGTGG
CAGGCATGTG CTCCATCTAC
CACAGAAGTT TAATCCTTCA GACTAGCCTG GGATAGGGCC
TGCTTTTTCT TTCCTTTTCT
CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTTT
CTTTCCTTTT
CTCTCTTTCA CTCTCTCTTT CTAATTTCTT TTTCTTTTTT TCTTTCTTTT
CTTTAGACAG
GGTTTCTCTG TGTAGCCCTG GCTGTTCTGG AACTCACTCT
TTAGACCAGG CTGGCCTCGA
ATCTCAGAAA TCTACCTGCC TCTGCCTCCC AAGTGCTGGG
ATTAAAGGCG TGTGCCACCA
CTGCCCAGCT AAGGTTTGCT TTTTGATGGC AGCTTGGTCC
AGTTTGAAAG TAGGAGGTCA
TACTGTGTAA ACTCACTGGT TAAAGTACCC CcTccCTTCC
ACCCTGCAAT ACACACACAC
ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCATCTC
GAAGAGCTCT ATTAAGCTCC
AGGTGCACTG TAGTTCACAG ACTGCATCTT CcAGGTTTGc TCCCACTTCA CAAGCAGAGA
ACTCATAACT GAAGGGGTG ACAGCACAGG GGAAGGGAAA
GCAAGATGTT TAGAGTCTGA
CAGCTGGCCC GGGACCAGAG CCATGTGGTA ATGTTTGCTC
CACTCCCATC CACCTCCACG
GCTGTGATGT GGAGAAGGTC CCCGCTTTCA TGGGAAGGAG
GTGGGGAGC CTGTCATCTG
CTCCATGCTC ACACAATTTT TCTCTCAACC AATGACCTCT
CAGAAGCAGG GGTTGGTTTG
CAAAATTCTT CAGATACCTC AACAGATGGC ATCCCACTCA
GGCTATCCCT GCTGACTAGG
TCTGC;CTCCA GCCCTGACTG TATCTACCCA GGGACCTACC
TGCCCTGCTTT GCTCCTATAG
CCTTCCTCCG TGTCTGGGTC CCCAGAGAGC TGCCGGCATA
GGCCTTTGAG GCAACAGCTG
GCATACAGGC CAGGCTTCCC ATGCTCTGGC TAGcAGATTC
TCTGCCCTGG AGGACTTTGA
CTGCATGGTT TCTCTCACTG CTGCAACAGT CAGAGCTGGC
CCACACGGGC ACAACAGCGC
ACTTCCATCT GGGTCTCCCT GAGAATGCCG CTGTTTTCTG
AGAACCCTTG GACTCTGGTG
GCTTTATCAG GTCTTTTTGT CAGCTGCGCT TTGGGGGATG
AACTTTGCTC TTCTGGCTTC
TGGGTCAGAG GGTAAAGATT TGGTGGCAAC CGGTAGCTAG
AGAAAGATAG CTACTGGCTG
AATTTGGAGG ACATGGCTTC TGGAAAACCT CTCTAGTGCT
TTTCTGGCTA GTCTTGGCAA
AGTAAAAATG CTCTGATAGC CAGCCCGGGT GATGcAGGGc TTCCTGTTCG AGGCCTTTCT
GTACAAAATT AGTGAGACAT TGCCTCAAAA CTATGAAACA
AGCCAGACTC TGTTGAAGCA
CGCCTTTAAT CCCAGCACTC AGGAGGCTGA AGcAGGcAAG
ATCTCTGTTA GTTGGAGGCC
AGTCTACAGG AAAGTTCTAC AACAGCAGAG GCCAGACAGT
GCAACCCTTT CTGGGGGTGT
GGGGGAGGAA AACCCAACAA AAACACAAAC TATAAAACAA
AGAGAAGGCC GAGGACAAAG
CTTAGCAATG CATACTTCCC TTTCTATGTG AAGCCCTGGG
CTCCACCAGT ACTGCAGAAA
GAAGCAAGCA ATGAGGGACA GGAGGTTGGC TCTAGGCCCA
GGGGTTGTCA AAATAGTCCA
CAGGCCAAAG GCAGCCTGAT GTCTGTTTTT ATAAACAAAA
TTTTATTGGC ACACATTGGT
TATGTATCAG CTAGGCTATT TTCATTACAA TAGAGGCCAT
ATGGTCTGTA AAGTCTAAAA
TATTTACTCT GCTGTTTTAC ATAAAAAGTT GACAGACTCT
TGCTCTAGAC TGACAAATAT
CTAAGACCTT GTTTTCTGAG GTTCAAGTTT CAGAGGGGGTC
TCTGCAGCAA GTGGGTAAAG
CTGGTCTAGG TCATGCTATG ATGTCTAGGG TCCCCTCAGA
GTGGAAGGCC TGCTTAGCAC
AAATGAAGTA AAGTAACTTG CTGGCTCTTT GTTCTTTTCT
CCACACTCTA TACTTTAGCT
CTGCCTC
18. Séquence d'ADN située en amont de la partie codante du gène de la souris de la protéine SM22 caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une partie de la séquence SEQ ID n° 2 suivante. ou une séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions stringentes:
SEQ ID No: 2 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10:
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 10;
GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 12~
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA l98
SEQ ID No: 2 GGGCCCCAGG AATGTGTTTC CTTCTCTCCA CCATGTTTTT ATAGCTCTTG GGCTGGGAGA
TGCACCTCTC TGGCCTGCAG CCAGTTCTGG GTGAGACTGA CCCTGCCTGA GGGTTCTCTC 10:
CTTCCCTCTC TCTACTCCTT CCTCCCTCTC CCTCTCCCTC TCTCTGTTTC CTGAGGTTTC 10;
GTGTTTGGTC TTGGGTACTG AACTCAGACC ATCAGGTGTG ATAGCAGTTG TCTTTAACCC 12~
ATGCAGAGAA TGTCTCCGGC TGCCCCCGAC AGACTGCTCC AACTTGGTGT CTTTCCCCAA l98
19. Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n°1-1685 portant le plasmide p2126nlz comprenant la séquence selon la revendication 18.
20. Souche déposée le 25 mars 1996 auprès de la CNCM sous le n° 1-1686 portant le plasmide p2126lNTnlz comprenant la séquence selon la revendication 17.
21. Vecteur caractérisé en qu'il contient une séquence selon l'une des revendications 1 à 16.
22. Vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il contient une origine de réplication efficace dans les cellules des artères.
23. Vecteur selon l'une des revendications 21 et 22 caractérisé en ce qu'il est un dérivé d'un adénovirus.
24. ARN caractérisé en ce qu'il est capable d'être exprimé par une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 a 23.
25. Composition caractérisée en ce qu'elle contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23.
26. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que la séquence ou le vecteur sont compris dans une composition facilitant leur transfection dans les cellules.
27. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'elle comprend un gel qui est un complexe de poly-L-lysine et de lactose.
28. Médicament caractérisé en ce qu'il contient une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23.
29. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une séquence nucléique ou d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à
23, et des excipients pharmaceutiquement compatibles.
23, et des excipients pharmaceutiquement compatibles.
30. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies coronariennes.
31. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement de la resténose.
32. Utilisation d'un vecteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des mutations fragilisant les vaisseaux.
33. Animaux transgéniques caractérisés en ce qu'ils portent une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à
23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intéret thérapeutique est remplacé par un gène reporteur.
23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intéret thérapeutique est remplacé par un gène reporteur.
34. Procédé de criblage de molécules in vitro pour leur activité sur les séquences régulatrices du gène codant pour la protéine SM22 comprenant les étapes suivantes:
- transfection de cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur, - incubation des cellules transfectées avec la molécule à tester, et - quantification de l'expression du gène réporteur.
- transfection de cellules avec une séquence ou un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16 et 21 à 23, dans lequel le gène codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique est remplacé par un gène reporteur, - incubation des cellules transfectées avec la molécule à tester, et - quantification de l'expression du gène réporteur.
35. Procéde de détection de mutations sur la région comportant la séquence selon l'une des revendications 1 à 16 ou le vecteur selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé par une altération de l'expression du gène placé en aval de ladite séquence.
36. Procédé d'expression de protéines d'interêt thérapeutique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les produits selon l'une des revendications 1 à 24.
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