EP1036172A1 - SEQUENCES CODANT POUR UNE PROTEINE kin17 ET LEURS APPLICATIONS - Google Patents

SEQUENCES CODANT POUR UNE PROTEINE kin17 ET LEURS APPLICATIONS

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Publication number
EP1036172A1
EP1036172A1 EP98958989A EP98958989A EP1036172A1 EP 1036172 A1 EP1036172 A1 EP 1036172A1 EP 98958989 A EP98958989 A EP 98958989A EP 98958989 A EP98958989 A EP 98958989A EP 1036172 A1 EP1036172 A1 EP 1036172A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
seq
fragment
kinl
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98958989A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patricia Kannouche
Philippe Mauffrey
Ghislaine Pinon-Lataillade
Denis Biard
Jaime Francisco Angulo-Mora
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1036172A1 publication Critical patent/EP1036172A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the cDNA sequence coding for the human kinl7 protein, to the cDNA sequences coding for a truncated kinl7 protein, called kinl7 ⁇ RH as well as to the use of said nucleic sequences and said proteins in the regulation of the cell proliferation.
  • the present invention also relates to a procedure for detecting the human Kinl 7 gene and mRNA of the human Kinl 7 gene, by in situ hybridization using oligonucleotides and / or by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention also relates to expression vectors or plasmids which express the above proteins as well as to bacteria containing said vectors or plasmids.
  • the present invention also relates to the use of said vectors for the production and purification of the protein kinl 7 and of its truncated or modified forms and as a medicament (gene therapy).
  • kinl 7 A protein, called kinl 7, has been demonstrated in mice by J.F. Angulo et al. (Mutation Res., 1989, 123-134) and is immunologically linked to the recA protein of E. coli; its identification was possible using anti-recA antibodies from E. coli, in FR 3T3 rat cells.
  • the production of this kinl 7 protein is induced by genotoxic agents, such as ultraviolet radiation. It has a preferentially nuclear location. In addition, it is a minority among cellular proteins and very sensitive to enzymatic proteolysis.
  • JF Angulo et al. identified and expressed the Kinl 7 cDNA (1414 bp) in mice using the above-mentioned Kinl 7 601 fragment as probe.
  • Mouse Kinl 7 cDNA has a single open reading frame, between positions 25 and 1198, which codes for a protein of 391 amino acids
  • This protein has a nuclear localization signal, located between positions 240 and 256, which seems similar to those identified in certain nuclear proteins and which is functional.
  • the chromosomal localization of the gene coding for the murine protein kinl 7 was carried out by in situ hybridization, on chromosome 2, in mice.
  • the human Kinl 7 gene is located on chromosome 10pl5-pl4.
  • the “zinc finger” motif is involved in the binding of the kinl 7 protein to double-stranded DNA.
  • Protein kinl 7 binds preferentially to curved DNA; its binding efficiency is correlated with the importance of the curvature of the DNA.
  • the inventors have now found that, surprisingly, the expression of the kinl 7 protein of mammals (in particular mice and humans) is correlated, in general, with cell proliferation; they have in particular found that the protein kinl 7 inhibits cell proliferation; in addition, an overexpression of kinl 7 protein or of a C-terminal fragment of said kinl 7 protein drastically inhibits cell proliferation. They also found that a truncated protein (deletion of a fragment comprising the homologous region (RH) between the protein kinl 7 and the protein RecA was even more active in the inhibition of cell proliferation.
  • a truncated protein deletion of a fragment comprising the homologous region (RH) between the protein kinl 7 and the protein RecA was even more active in the inhibition of cell proliferation.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid sequence, characterized in that it has the sequence SEQ ID NO: 1 and in that it is capable of expressing a functional human kinl 7 protein.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence, characterized in that it codes for a kinl 7 protein truncated at the level of the region homologous to the recA protein.
  • said nucleic acid sequence codes for a truncated kinl 7 protein which corresponds to a kinl 7 protein in which at least the fragment between amino acids 162 and 201 and at most the fragment between amino acids 55-235 is deleted.
  • said nucleic acid sequence codes for a truncated kinl 7 protein which corresponds to the mouse kinl 7 protein in which the fragment between amino acids 129-228 is deleted and has the sequence SEQ ID NO: 2.
  • said nucleic acid sequence codes for a truncated kinl 7 protein which corresponds to the human kinl 7 protein in which the fragment 129-228 is deleted and has the sequence SEQ ID NO: 3 .
  • the present invention also relates to fragments, of 20 to 40 nucleotides of the sequence SEQ ID NO: 1, for the detection of the gene coding for the human kinl 7 protein and / or of the RNA of the Kinl 7 gene in a biological sample.
  • Such fragments serve in particular as primers for PCR, RT-PCR or in situ hybridization.
  • they can advantageously be marked using a suitable non-radioactive marker (fluorescent substances, ligands such as biotin or a hapten).
  • sequences SEQ ID NO: 5-21 listed in the table below, as well as the sequences SEQ ID NO: 33 and 34.
  • the present invention also relates to fragments of the sequence SEQ ID NO: 1, capable of serving as a probe for DNA-DNA or DNA-RNA hybridization; among such fragments, there may be mentioned the sequence SEQ ID NO: 4, corresponding to positions 207-1208 of the sequence SEQ ID NO: 1 (probe 1000) and the sequences SEQ ID NO: 1 and 5 to 21.
  • the present invention also relates to fragments of a nucleic acid sequence coding for a segment of a mammalian kinl 7 protein (sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 24), which fragments comprise between 300 and 360 nucleotides coding for the C-terminal part of said kinl 7 protein and are capable of controlling cell proliferation.
  • fragments they are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34.
  • the present invention also relates to a method for detecting genomic DNA or a transcription product of the human Kinl 7 gene, by gene hybridization and / or amplification, carried out from a biological sample, which process is characterized in that it comprises:
  • step (1) it can comprise, before step (1):. a step of extracting the nucleic acid to be detected, and
  • At least one gene amplification cycle carried out using a pair of primers selected from the sequences SEQ ID NO: 5-21.
  • the probe of step (1) is optionally labeled with the aid of a marker such as a radioactive isotope, an appropriate enzyme or a fluorochrome.
  • a marker such as a radioactive isotope, an appropriate enzyme or a fluorochrome.
  • said probe consists of the sequence SEQ ID NO: 4.
  • said pair of primers consists of a sequence SEQ ID NO: 16 paired with a sequence SEQ ID NO: 17.
  • the subject of the present invention is also a method for detecting a transcription product of the human Kin11 gene, characterized in that it comprises:
  • RNA to be detected a step of extracting the RNA to be detected, a step of synthesizing the cDNA corresponding to said RNA by reverse transcription in the presence of random primers,
  • At least one gene amplification cycle carried out using a pair of primers selected from the sequences SEQ ID NO: 5-21, and
  • said pair of primers is selected from the group consisting of the following pairs: sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 12, which make it possible to amplify a fragment of 453 bp (fragment A); sequences SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, which make it possible to amplify a fragment of 1265 bp (fragment B) and sequences SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 7, which make it possible to amplify a fragment of 224 bp (fragment C).
  • the amplified cDNA fragments are separated by electrophoresis, preferably on agarose gel, visualized in the presence of ethidium bromide and quantified using the NIH image software (National Institute of Health, USA).
  • the invention also includes the reagents for detecting a nucleic sequence coding for a mammalian kinl 7 protein or a modified fragment of these sequences, characterized in that they include the sequences SEQ ID NO.4-21 , 33 and 34 as well as fragments A of 453 bp, B of 1265 bp and C of 224 bp, optionally labeled.
  • the present invention further relates to a protein kinl7 ⁇ RH, characterized in that it corresponds to a protein kinl 7 truncated at the level of a region homologous to the protein recA.
  • said truncated kinl7 ⁇ RH protein corresponds to a kinl 7 protein in which at least the fragment between amino acids 162 and 201 and at most the fragment between amino acids 55-235 is deleted.
  • said truncated kinl7 ⁇ RH protein corresponds to the mouse kinl7 protein in which the fragment between amino acids 129-228 is deleted and has the sequence SEQ ID NO: 22 (sequence called Mm kinl7 ⁇ RH) .
  • said truncated kinl7 ⁇ RH protein corresponds to a human kinl7 protein in which the fragment 129-228 is deleted and has the sequence SEQ ID NO: 23 (sequence called HS kinl7 ⁇ RH).
  • the present invention also relates to protein kinl 7 fragments, characterized in that they comprise between 100 and 120 amino acids and are located in the C-terminal position; they are preferably selected from the group consisting of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36.
  • sequence SEQ ID NO: 35 corresponds to residues 283-393 of the human kinl 7 sequence (SEQ ID NO: 26); the sequence SEQ ID NO: 36 corresponds to residues 281-391 of the kin17 mouse sequence (SEQ ID NO: 25).
  • the present invention also relates to the use of the fragment between amino acids 55-235, optionally mutated, preferably the fragment between amino acids 129 and 228 of a mammalian kinl 7 protein, for the regulation of protein-DNA curve interaction.
  • mutants in this area of curved protein-DNA interaction constitutes a tool of choice for blocking certain biological processes such as the proliferation, translation or integration of the AIDS virus in the human genome or for transporting effector proteins by the construction of protein fusions binding domain to the curved DNA-repair enzyme, at places where the DNA is curved or curved.
  • the present invention also relates to the use of a mammalian kinl 7 protein or of a C-terminal fragment of 100 to 120 amino acids of said kinl 7 protein, for the preparation of a medicament regulating cell proliferation or fertility.
  • said mammalian kinl 7 protein or said C-terminal fragment of 100 to 120 amino acids is used for the preparation of a medicament inhibiting cell proliferation, in particular intended for the treatment of diseases in which a cellular hyperproliferation.
  • said sequence is selected from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 22, 23, 25, 26, 35 and 36.
  • the present invention also relates to an expression vector, characterized in that it includes a sequence coding for a mammalian protein kinl 7 or for a fragment thereof selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: l, 2, 3, 33, 34.
  • said sequence coding for said kinl 7 protein or said fragment thereof is fused with a gene which codes for a fluorescent protein.
  • Such vectors are especially useful: - for the preparation of a drug controlling cell proliferation,
  • said vector is associated with appropriate regulatory sequences.
  • the present invention also relates to the use of an expression vector including a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 24, 33 and 34 for the preparation of a medicament controlling cell proliferation.
  • said vector is a plasmid, it can be kept in bacteria such as E. coli; we can cite, by way of example, the bacteria MOSBlue (Amersham, France), which has the following genotype: end AI hsdR17 ( r kl2 - m kl2 +) sup E44 thi-1 rec AI gyr A96 rel AI lac [F 'pro A + B + lac q I 2 ⁇ M15 :: Tnl0 (Tc R )]. This gives transformed cMOS bacteria:
  • cMOS bacteria transformed with the plasmid pMOS5 / we (Amersham, France) into which the cDNA HsKinl 7 (defined by SEQ ID NO: 1) was introduced;
  • - PK2 bacteria cMOS bacteria transformed with the plasmid pCMVDT21 (Bourdon et al., 1997, Oncogene) into which the HS Kin17 cDNA (defined by SEQ ID NO: 1) was introduced.
  • FIG. 3 represents an autoradiography of the analysis by hybridization of the total RNA extracted from different human tissues (panel A) or from various human tumor cells (panel B), with the Probe-1000 (SEQ ID NO: 4) .
  • FIG. 4 illustrates the detection of the messenger RNA of the Kin17 gene in the testis of mice by in situ hybridization.
  • FIG. 5 is a schematic representation of the proteins produced by transient transfection. The amino acid sequence is shown linearly. The name of the proteins is indicated on the left of each protein and the size is mentioned on the right.
  • FIG. 6 illustrates the detection of HeLa cells transfected with the vector pCMV f ⁇ Kin ⁇ .
  • the cores are colored blue thanks to DAPI.
  • the green intranuclear staining corresponds to the location of the protein Mm kinl7;
  • FIG. 6 A illustrates the detection of j ⁇ kinH in cells which express a low level of protein Mm kinl7 and
  • FIG. 6B illustrates the detection of Mm kinl7 in cells which express a high level of protein kinl 7; enlargement: x 1000.
  • FIG. 7 represents HeLa cells which express a low level of protein ⁇ kinH (with intranuclear foci having a diameter of about 0.5 ⁇ m; panel A) or cells which express a high level of protein kinl 7 (detection deformations of the DMN nuclear morphology; panel B).
  • FIG. 8 shows the immunodetection of the protein Mm kinl7 ⁇ RH in HeLa cells transfected with the plasmid pCMNKinl7 ⁇ RH.
  • Use of pAbanti-RecA as the first antibody panel A.
  • Detection with the antibody pAb2064 panel B.
  • FIG. 9 corresponds to the analysis by immunocytochemistry and by phase contrast microscopy of the HeLa cells which overproduce the protein Mm kinl7 ⁇ CT.
  • FIG. 10A represents the immunodetection of the protein j ⁇ kin ⁇ RH (in red) and the incorporation of BrdU (in green) in the HeLa cells expressing the protein Mm kinl7 ⁇ RH.
  • BrdU Bromodesoxyuridine
  • thymidine a nucleotide analogue which is incorporated into DNA during replication.
  • FIG. 10B is a summary table which shows the inhibition of DNA replication after formation of deformations of nuclear morphology (DMN), due to the expression of the proteins Mm kinl7 ⁇ RH or
  • FIG. 11 illustrates the genetic map of plasmids pEBVMT ⁇ (pB220) and pEBVMT Mm kinl7 (pB223).
  • FIG. 12 illustrates the analysis by laser scanning cytometry of the protein j ⁇ kinH in the cells of the clone B223.1: 9 months after the transfection, both the B223.1 cells and the B220 cells are seeded at the right rate 3.10 4 cells / cm 2 , three days before starting treatment with heavy metals (ZnCl 2 100 ⁇ M and CdSO 4 1 ⁇ M). 24 hours later, the cells are fixed and stained with an anti-RecA antibody specific for the protein Mm kinl7.
  • Immunocytochemical detection is carried out using the cytometer ACAS 570 (Meridian Inc.). Panels A and B correspond to cells B223.1, with or without heavy metals; panels C and D correspond to B220 cells with or without heavy metals. Each section is analyzed at the same time for the protein Mm kinl7 (left panel) and the propidium iodide (PI) (right panel). The specific fluorescence intensities protein j ⁇ Kinh and PI are represented with arbitrary fluorescence scales.
  • FIG. 13 illustrates the immunocytochemical detection of the protein Mm kin17 in the cells of clone B223.1: 6 months after the transfection, the B223.1 and B220 cells are seeded at the rate of 6.10 4 cells or 10 4 cells / cm 2 , respectively and treated, under the same conditions as those set out for FIG. 12. Staining is carried out with the anti-RecA antibody. Panels A and B correspond to cells B223.1 with or without heavy metals; panels C and D correspond to B220 cells with or without heavy metals. An anti-RecA antibody and a secondary antibody conjugated to fluorochrome Cy2 TM are used to detect the protein Mm kinl7.
  • the fluorescence is analyzed with a Visiolab 1000 program (Biocom) coupled to an Axiophot 2 microscope (Zeiss) and a cooled camera, as specified above (enlargement of each panel: x 100).
  • - Figure 14 shows polynucleated B223.1 cells overexpressing the protein Mm kinl7: 8 months after transfection, B223.1 cells are seeded as specified above (see Figure 12). 24 hours after treatment with heavy metals (100 ⁇ M ZnCl 2 and 1 ⁇ M of CdSO 4 ), the cells are fixed and stained with an anti-RecA antibody. Magnification: (A) x 504; (B and C) x 1000; (D and F) x 1260; (E) x 2000. The fluorescence is analyzed with a Visiolab 1000 program.
  • FIG. 15 illustrates the analysis of the cell cycle in HEK293 cells overexpressing the protein Mm kinl7: 6 months after transfection, the cells are seeded at the same dilutions and three days after treatment with heavy metals for 24 hours. The cells are recovered and analyzed. The arrows indicate the polynucleated cells.
  • FIG. 16 illustrates the influence of the overproduction of the protein j ⁇ kinH on the efficiency of B223.1 cells to form clones: 8 months after transfection, cells B220, B223.1 and B223.2 are seeded at 10 3 , 10 2 and 10 1 cells / cm 2 , in the presence of hygromycin B (125 ⁇ g / ml). After 10, 12 and 18 days in culture, respectively, the cells are fixed and stained.
  • FIG. 17 illustrates the rate of proliferation of B223.1 cells: at different times after transfection, cell growth is evaluated.
  • A cells are seeded at the same dilution (10 3 cells / cm 2 ) in the presence of hygromycin B (125 ⁇ g / ml). At different times after sowing, the cells are trypsinized and counted.
  • B to evaluate the efficiency in forming clones, the three cell lines are evaluated at different densities: 10 3 / cm 2 for B220 cells, 2.10 3 / cm 2 for B223.2 and 10 4 / cm cells 2 for B223.1 cells. The experiments are carried out in the presence or absence of hygromycin B (125 ⁇ g / ml).
  • the average of three culture dishes is calculated -O-: B220 cells without hygromycin; - • -: B220 cells with hygromycin; -D- B223.1 cells without hygromycin; - ⁇ -: B223.1 cells with hygromycin: -A- B223.2 cells without hygromycin; - ⁇ -: B223.2 cells with hygromycin.
  • FIG. 18 illustrates the detection, in vivo by fluorescence, of the fusion proteins GFP-kinl7 ⁇ CT (left) and GFP-kinl7SLN-CT (right) after transfection of the HeLa cells with the plasmids pEGFP-Kinl7 ⁇ CT and pEGFP- Kinl7SLN- CT respectively.
  • EXAMPLE 1 Process for Cloning the cDNA of the Human Kinl 7 Gene (fsKinl7).
  • human lymphoblastoid cells called Boleth cells, which have a normal karyotype, were used.
  • 10 7 cells were treated with a denaturing solution; the proteins were removed after centrifugation at 12,000 rpm for 20 min. at 4 ° C (RNA-B, Bioprobe, France).
  • the total RNAs are recovered in the aqueous phase and precipitated by adding a volume of isopropyl alcohol at -20 ° C. and centrifuged.
  • RNAs After resuspension in 1 ml of distilled H 2 O, the RNAs are again precipitated at -20 ° C. in a volume of isopropyl alcohol and 0.2 M NaCl. After recovery by centrifugation and rinsing with 70% ethanol, the RNAs are resuspended in water and stored at -80 ° C. The RNAs thus obtained were subsequently used in the reverse transcription (RT) reaction of the RNAs, for the synthesis of the corresponding complementary DNAs.
  • the cDNAs obtained are treated by a reaction of chain polymerization (PCR), in the presence of a thermostable polymerase, to obtain a fragment of the HS ⁇ TM cDNA! 7.
  • PCR chain polymerization
  • ATACCTTCAACTCTGCGTCCTT were used as follows: 1 ⁇ g of total RNA was mixed with 5 mM of MgCl 2 , IX PCR buffer, 1 mM of dNTPs, 1 U / ml of RNase inhibitor, 2.5 mM oligo d (T) 16 and 2.5 U / ml reverse transcriptase. The mixture is incubated for 20 min. at room temperature to allow the oligo d (T) 16 sequence to hybridize with the polyA + ends of the RNAs and to initiate reverse transcriptase. The mixture is then incubated for 20 min. at 42 ° C then 5 min. at 99 ° C and 5 min at 5 ° C.
  • the sequence of the fragment of 1000 base pairs is determined according to the automatic sequencing technique described in Tissier A. et al., 1996, cited above.
  • the sequence SEQ ID NO: 4 corresponding to a fragment of the cDNA jjsKinl 7 is 86% identical to that of mouse Mm ⁇ in l.
  • the encoded polypeptide is 92.4% identical. It is the isolation of this fragment of the cDNA ⁇ ⁇ Kinl7 that actually allowed to start cloning the j-jsKin cDNA! 7 complete (FIG. 2: Comparison of the sequences of the cDNA fragments // £ _ £ "/ 7 with the mouse Kinl 7 cDNA).
  • EXAMPLE 2 Screening of a human cDNA library: cloning and determination of the nucleotide sequence of the DNA complementary to the ff ⁇ KinH gene.
  • the radiolabeled fragment of 1000 base pairs of the cDNA of the gene ⁇ jsKinl7 (called probe-1000; SEQ ID NO: 4) was used as a probe to screen a library of human cDNAs obtained from messenger RNAs expressed in of the testes and inserted into the vector ⁇ gtl 1.
  • the DNA of the phages which hybridize with the probe were purified and the human cDNA was sequenced.
  • PROTOCOL The library was obtained from poly A + RNA purified from human testes.
  • the complementary DNAs were obtained using as primer a poly d (T) sequence.
  • T poly d
  • nucleotide sequences corresponding to the restriction site of the digestion enzyme EcoRI were grafted on either side of the ends of the cDNAs.
  • all the cDNAs are inserted into the EcoRI site of the vector ⁇ gtl 1.
  • 250,000 recombinant ⁇ gtl l bacteriophages containing human cDNAs are incubated for 20 min. at 37 ° C with 0.3 ml of 6334 receptor bacteria (16 h preculture at 37 ° C), then mixed with 9 ml of LB agarose medium, heated to 48 ° C.
  • the whole is poured onto 140 mm diameter petri dishes containing LB-agar medium.
  • the dishes were incubated at 42 ° C for 5 hours and then at 37 ° C, 16 h, until the lyses of the plates arrived at confluence.
  • a dry nitrocellulose filter (Schleicher & Shuell, BA85) is then deposited for 1 min. on the surface of the box, marked asymmetrically with Indian ink. This gives a replica of the lysis ranges on the filter.
  • the fragment of 1000 radiolabelled pairs (Probe- 1000) (SEQ ID NO: 4) of the cDNA of the gene ⁇ ⁇ Kinl7 is used for screening according to the following treatments: a) Denaturation and immobilization of the bacteriophage ⁇ gtll DNA on nitrocellulose filters.
  • the filters are placed for 5 min., Face in contact with the phages upwards, on Whatmann paper sheets soaked in denaturing solution (0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl), to allow lysis of the phages and denaturation DNA.
  • a second series of filters is brought into contact for 2 min. with the lyses beaches, on the surface of the box. They will be treated in the same way as the first fingerprint.
  • the boxes containing the phages are stored at 4 ° C in the dark.
  • the DNA fixed on the filters is then hybridized with the radiolabelled probe-1000 (Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 1989).
  • the second series of filters with fingerprints were hybridized with a radiolabelled probe corresponding to the mouse KinII cDNA (Angulo et al., NAR, 1991, cited above).
  • b-2) - Hybridization The filters are incubated in the hybridization solution in which the probe-1000 (S ⁇ Q ID NO: 4) or the radio-labeled probe-1400 (previously denatured at 100 ° C for 10 min.) has been added. Incubation is carried out for 16 hours at 65 ° C. After hybridization, the filters are washed as follows:
  • lysis areas which gave a positive result by autoradiography were identified on the Petri dishes and taken and resuspended in 100-300 ⁇ l of SM buffer (0.1 M NaCl, 10 "3 M SO 4 , 0.02 M Tris-HCl pH 7.5, 0.01% gelatin) containing 5 ⁇ l of chloroform.
  • SM buffer 0.1 M NaCl, 10 "3 M SO 4 , 0.02 M Tris-HCl pH 7.5, 0.01% gelatin
  • the same protocol used for screening subsequently purifies the positive phages and their DNA to determine the size of the inserts and cDNA sequence Purification of DNA from phage ⁇ gtll and determination of the nucleotide sequence of DNA complementary to the gene
  • EXAMPLE 3 Methods of characterizing the expression of the Kin17 gene by detection of the messenger RNA and of the encoded protein. Immunodetection of the kinl 7 protein (mouse and human) in cultured cells.
  • the cells cultivated on coverslips are washed 3 times with PBS, then fixed with the aid of a methanol acetone solution (3v / 7v) for 10 minutes at -20 ° C. Immunodetection is then carried out at room temperature in a humid chamber. After rehydration of the cells for 10 min. in PBS, the slides are incubated for 10 min. in a solution of 3% H 2 O 2 in PBS. After 3 washes of 5 min. with PBS, the slides are incubated for 30 min. in 5% goat serum in PBS. The coverslips are then rinsed 3 times 5 min.
  • the slides are then mounted with improved Aquamount (BDH, Gurr) and observed with an AXIOPHOTE 2 microscope from Cari ZEISS equipped for indirect immunofluorescence and with a cooled camera (CCD camera, Coolview, Photonic Science, UK) which is controlled by a computer.
  • Aquamount BDH, Gurr
  • AXIOPHOTE 2 microscope from Cari ZEISS equipped for indirect immunofluorescence and with a cooled camera (CCD camera, Coolview, Photonic Science, UK) which is controlled by a computer.
  • RNA of the fisKinU gene by in situ hybridization in T lymphocytes.
  • oligonucleotide Labeling of the oligonucleotide with digoxygenin.
  • 100 ⁇ m of a synthetic oligonucleotide of 40 nucleotides (SEQ ID NO: 16 or 17) are used and labeled with the Dig-11-dUTP at the 3 ′ end, using the Boehringer Mannheim kit (Dig Oligonucleotides Tailing Kit. Ref. 1417231).
  • the labeling of the probes is controlled using an anti-digoxygenin antibody, coupled to alkaline phosphatase (development by a solution of NBT-BCIP). Hybridization conditions and disclosure of hybrids.
  • NEN Ref. NEL 7331 After hybridization, the slides are washed successively 3 times for 10 min. in SSC2X, SSC1X, SSC0.5X buffer at room temperature, then 3 times for 5 min. in 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20 (TNT). The cells are then incubated with a blocking buffer composed of 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl and 0.5% of blocking reagent for 30 min. After blocking, immunodetection is carried out for 90 min. with an anti-digoxygenin antibody coupled to peroxidase (Boerhinger Mannheim, Ref 1207733).
  • the antibody is used at a 1/100 dilution in the blocking buffer of the hybridization kit (TSA TM Direct). The incubation is followed by 3 rinses of 5 min. in TNT buffer then peroxidase is detected by the action of tyramide coupled to fluorescein for 5 min. as described by the supplier (TSA TM Direct, NEN). After 3 washes of 5 min. in TNT, the cells are stained with a 10 " solution 3 ⁇ g / ml of 4 ', 6-diamidino-2 phenylindole (DAPI) for 10 min.
  • TSA TM Direct hybridization kit
  • DAPI 6-diamidino-2 phenylindole
  • the slides are then rinsed in TNT buffer before being mounted at using Vectasheild ® , a fluorescent protective assembly product (Vector Laboratories, ref: H- 1000) .Fluorescein is observed at 525 nm and DAPI at 425 nm with an AXIOPHOTE 2 microscope from Cari ZEISS equipped for immunofluorescence indirect and with a cooled camera, as specified above.
  • Vectasheild ® a fluorescent protective assembly product (Vector Laboratories, ref: H- 1000) .Fluorescein is observed at 525 nm and DAPI at 425 nm with an AXIOPHOTE 2 microscope from Cari ZEISS equipped for immunofluorescence indirect and with a cooled camera, as specified above.
  • testes are removed and immediately included at -20 ° C in the OCT inclusion medium (OCT compound, Tissue-Tek, Miles. Ref. 4583).
  • OCT compound OCT compound, Tissue-Tek, Miles. Ref. 4583.
  • 10 ⁇ m thick sections are made using a cryostat at -20 ° C. They were used immediately or frozen and kept at -80 ° C until use.
  • the first step is binding to 4% paraformaldehyde, then the protocol is identical to that described above, for the detection of the human gene in T lymphocytes.
  • antisense probe 5'-CCA GGC CTC TTC TCA CCT GCT CCT CAA TGA ACT TGG CAG T-3 '(SEQ ID NO: 17) and sense probe: 5' -ACT GCC AAG TTC ATT GAG GAG CAG GTG AGA AGA GGC CTG G-3 '(SEQ ID NO: 16).
  • a specific hybridization is observed in the zygote spermatocytes ( Figure 4).
  • RNA of the ffsKinU gene Detection of the messenger RNA of the ffsKinU gene by hybridization of the ⁇ RNs immobilized on the membrane with a radiolabelled DNA probe.
  • the amount of Kinll transcript present in different tissues is determined by the Northern method (electrophoresis, transfer and hybridization of RNAs).
  • Nylon membranes are used on which 2 ⁇ g of poly A + RNA from different human tissues are transferred (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas, spleen, thymus, prostate, testicle, ovary, small intestine, colon and peripheral blood lymphocyte, MTN, Clontech).
  • Prehybridization and hybridization are carried out in an oven (Amersham hybridization ovenl shaker).
  • the membrane is placed in tubes and incubated at 42 ° C for 5 hours with 15 ml of hybridization solution (50% formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS) in the presence of 50 ⁇ g / final ml of sonicated herring sperm DNA (previously denatured at 100 ° C for 10 min. then placed in ice).
  • the membrane is then incubated in the hybridization solution in which the radiolabelled probe-1000 (SEQ ID NO: 4) (previously denatured at 100 ° C for 10 min) was added. Incubation is carried out for 16 hours at 42 ° C.
  • the membrane is washed twice 20 min., At room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS, twice 15 min., At 42 ° C in 0.5 X SSC , 0.1% SDS then once 15 min., At 60 ° C in 0.1X SSC, 0.1% SDS.
  • the filters are then brought into contact with X-OMAT AR (Kodak) or Hyperfilm-MP (Amersham) films at -80 ° C for 60-100 hours.
  • Panel A of FIG. 3 shows the autoradiography obtained after hybridization of the total ARs extracted from different human tissues with the probe-1000.
  • RNA jjsKinl The rate of messenger RNA jjsKinl? years of various cells derived from human tumors (promyelocytic leukemia (HL60), adenocarcinoma of the cervical gland (HeLa S3), leukemia chronic myeloid (K-562), lymphocytic leukemia blast (MOLT-4), Burkitt's lymphoma Raji, adenocarcinoma colorectal (SW480), lung carcinoma (A549, melanoma (G361)) has been determined.
  • the protocol for detecting the SKinl I transcript used is the same as that described for the detection of ARM Kinll in human tissues (see example A membrane is used on which 2 ⁇ g of poly A + RNA from different tumor cells have been immobilized (MTN, Clontech).
  • Panel B in FIG. 3 represents the autoradiography obtained after hybridization of the probe-1000 with the Total RNA extracted from different human tumor cells. After quantification of the signals obtained for ffsKinll RNA compared to those calculated for actin RNA, it is found that the expression of the ff K l I gene is very varied. ble according to the line: a very weak expression is observed in the HL60 cells, whereas a difference of a factor of 15 is observed in the K-562 cells or of a factor of 10 in the cells derived from colorectal adenocarcinoma. Tumor cells therefore seem to regulate the expression of the HSKin11 gene differently.
  • EXAMPLE 5 Study of the transient overexpression of the mouse kinl 7 protein ( Mr ⁇ kinl7) and of its truncated forms in human cells.
  • All the plasmids used for this study were constructed from the vector pCMVDT21 which allows high expression of the transgene (Bourdon et al., 1997).
  • the open reading phase of the mouse kinase cDNA (Angulo et al., 1991, NAR, cited above) is inserted into the vector pCMVDT21 digested with the restriction enzyme Xhol to obtain the plasmid pCMVKin17.
  • the cDNA called M m Kinl I ⁇ CT is also used. It corresponds to a deletion of the fragment between nucleotide 854 and nucleotide 1034 of the cDNA Mm Kin l 7 , and has already been described (Mazin et al., 1994, cited above).
  • This cDNA codes for a protein truncated in its C-terminal region, called protein kinl7 ⁇ CT (deleted in the C-terminal region), which has a molecular weight of 32407 Daltons.
  • This Kinll ACT cDNA is inserted into the vector pCMVDT21; the plasmid pCMVKinl7 ⁇ CT is thus obtained.
  • a second mutant is obtained by deleting the cDNA ⁇ f m Kinll from nucleotide 412 to nucleotide 705.
  • Such a nucleic acid codes for a truncated protein (absence of 99 amino acids between residues 129 and 228), at a region containing the sequence homologous to the RecA protein.
  • This mutated protein was named Mm kinl7 ⁇ RH (deleted in the
  • the cDNA ⁇ f Kinl7 ⁇ RH is generated as follows: a) PCR amplification of the 5 'region of the cDNA M m Kinll (between nucleotides 1 to 411) from the vector pcD2Kinl7 (Angulo et al., 1991 ) using the pair of oligonucleotides: 5'-AAGCTGCTGCAGCAGCTTATCGGG-3 '(SEQ ID NO: 29) and 5'- GGTACCTTTAC ACAAGCCCTCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 30). b) PCR amplification of the 3 ′ region of the cDNA M m Kinll (between nucleotides 706-1352) using the primers:
  • the region homologous to the RecA protein (RH, aa 163 to 201) and the nuclear localization signal (SLN, aa 235 to 285) are presented in hatched rectangles.
  • the deleted residues are numbered according to their respective position in the sequence of the protein kinl 7 and are indicated as discontinuities.
  • HeLa cells which are human cells derived from an adenocarcinoma of the cervical gland (reference ATCC CCL-2). 10% of transfected cells are obtained.
  • the transfection is carried out as follows: the HeLa cells are seeded in 35 mm diameter boxes in which a glass slide has been previously deposited. The cells are incubated in a DMEM medium containing 4.5 g / l of glucose, 10% of fetal calf serum and 1% of penicillin-streptomycin at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per dish.
  • the cells are incubated with the following mixture: for each transfection, 3 ⁇ g of DNA are mixed with 10 ⁇ l of 2.5 M CaCl 2 in a final volume of 100 ⁇ l. The precipitate is homogenized and added dropwise to 100 ⁇ l of transfection buffer (274 mM NaCl; 1 mM KCl; 1.5 mM Na 2 HPO 4 , 12 H 2 O; 11 mM D (+) Glucose; 25 mM HEPES ; adjusted to pH 7.15 and sterilized by filtration). The mixture is incubated for 20 minutes at room temperature then deposited dropwise on the cells. The incubation lasts 16 hours at 37 ° C.
  • the cells are then rinsed 3 times with PBS, then put back in DMEM medium containing 10% of FCS and 1% of penicillin-streptomycin for 24 hours at 37 ° C.
  • the transfected human cells are fixed with a methanol / acetone solution (3v / 7v) at -20 ° c for 10 min., Then dried at room temperature. rature ambient for 10 min., in order to analyze by indirect immunofluorescence the localization of the protein Mm kinl7 overproduced.
  • kinl7 protein by indirect immunofluorescence.
  • the fixed cells are rehydrated for 10 min. in PBS, then incubated in a humid chamber for 1 h 30 min at 37 ° C with the antibody pAb2064 diluted 1/100 in PBS in the presence of 3% BSA. After 3 washes of 5 minutes in PBS at room temperature and with shaking, the cells are incubated with the second rabbit anti-immunoglobulin antibody produced in goats, coupled to fluorochrome Cy TM 2 (Jackson Immuno Research Laboratories), diluted to 1 / 500, for 45 minutes at 37 ° C and in the dark.
  • FIG. 6 corresponds to a photograph of the HeLa cells transfected with the plasmid pCMVKinl7 containing the cDNA ⁇ ⁇ m K. inll under the control of the promoter Cytomegalovirus. Labeling of DNA with DAPI enables cell nuclei to be distinguished in blue. Green intranuclear staining corresponds to indirect labeling of the overproduced Mm kin17 protein in transfected cells.
  • the protein Mm kinl7 is localized essentially in discrete intranuclear foci.
  • the overexpression of the protein Mm kinl7 ⁇ RH leads to the formation of intranuclear aggregates.
  • the vector pCMVKinl7 ⁇ RH is transfected into human cells under the same conditions as those described above.
  • the detection of the protein Mm kinl7 ⁇ RH by the indirect immunofluorescence method is carried out either using the anti-kinl7 antibody (pAb2064) or the anti-RecA antibody (French Patent No. 2,706,487, Angulo et al., Biochemistry , 1991, cited above). It is observed that the antibody pAbanti-RecA is unable to detect the protein Mm kinl7 ⁇ RH (FIG.
  • the cell nuclei are stained with DAPI.
  • the distribution of the protein Mm kinl7 ⁇ RH is different from that of the protein Mm kinl7. Indeed, the protein Mm kinl7 ⁇ RH forms large intranuclear aggregates in all of the transfected cells regardless of the amount of protein overproduced. This could indicate that the deletion of amino acids between 129 and 228 increases the binding of the protein Mm kinl7 ⁇ RH to another nuclear component such as DNA or chromatin.
  • Other biochemical approaches have shown that the solubility of the protein Mm kinl7 ⁇ RH is different from that of the protein Mm kinl7.
  • the presence of the protein Mm kinl7 ⁇ RH produces deformations of the nuclear morphology (DMN) of HeLa cells.
  • HeLa cells are transfected with the plasmid pCMVKinl7 ⁇ RH, then cells expressing the protein Mjj -kin ⁇ RH are detected by indirect immunofluorescence. Analysis by phase contrast microscopy shows that 100% of the transfected cells show alterations in nuclear morphology ( Figure 8, phase contrast). When the cells overproduce the protein Mm kinl7 ⁇ CT, it is impossible to detect this type of DMN ( Figure 9).
  • DMNs are correlated with inhibition of DNA replication.
  • the expression of the proteins Mm kinl7 and Mm kinl7 ⁇ RH is demonstrated to produce DMNs and affect nuclear biological processes such as replication.
  • a summary of the results is presented in Figure 10.
  • the m m Kinll ⁇ RH cDNA is introduced into human HeLa cells. After expression of the plasmid, the kin17 protein is detected by indirect immunofluorescence using an antibody labeled with rhodamine (red coloration). In parallel, in the same cells, the rate of DNA replication is detected by the incorporation of BrdU (green coloring); the genomic DNA contained in the nuclei is visualized by the DAPI (blue color) ( Figure 10). The overexpression of the protein Mm kinl7 ⁇ RH completely inhibits the incorporation of BrdU (FIG. 10).
  • Clonogenicity test of cells overexpressing protein kinl 7 or its mutated forms The plasmids pCMVDT21, pCMVKinl7, pCMVKinl7 ⁇ RH or pCMNKinl7 ⁇ CT were cotransfected with the plasmid pEGFP- ⁇ l (Clontech) in HeLa cells, which are then incubated for 20 days in a medium containing a selection marker (geneticin). The colonies formed are counted. The number of colonies formed by the cells transfected with the plasmid pCMVDT21 is considered to be 100%.
  • the protein kinl 7 allows the formation of 10% of colonies.
  • the protein kinl7 ⁇ RH allows the formation of 20% of colonies.
  • the protein kinl7 ⁇ CT allows the formation of 70% of colonies.
  • the plasmids used for this study were constructed from the vector pEGFP-C3 which expresses the GFP protein (Green Fluorescent Protein, Clontech). It was inserted into the cDNA phase which codes for GFP, the cDNA called MmKinl7 ⁇ CT. This gives the plasmid pEGFP-Kinl7 ⁇ CT which expresses the GFP-kinl7 ⁇ CT fusion protein which has a molecular weight of 60 kDa.
  • a second fusion protein was created by inserting in phase cDNA which codes for GFP, the cDNA called MmKinl7SLN-CT which codes for the nuclear localization signal as well as for the C-terminal part of the protein kinl 7 , named protein kinl7SLN-CT.
  • MmKinl7SLN-CT which codes for the nuclear localization signal as well as for the C-terminal part of the protein kinl 7 , named protein kinl7SLN-CT.
  • FIG. 18 shows the detection, in vivo, of these two proteins in HeLa cells: while the fusion protein GFP-kinl7 ⁇ CT has a diffuse nuclear localization, the protein GFP-kinl7SLN-CT essentially shows a localization in the form of nuclear foci similar to those formed by the protein kinl 7.
  • HEK 293 cells Transformed human embryo kidney cells "HEK- Ad5), established from embryonic kidneys transformed by fragments of Adenovirus 5 (Graham FL et al., J Gen. Virol, 1977, 36, 59-72). cells capable of expressing the Mm kinl7 protein. It has been assumed that the overproduction of mouse kinl7 protein in human cells has a biological effect very close to that of the human protein, given the conservation of sequences observed between humans and the mouse (FIGS. 2A and 2B).
  • EBV expression vectors carrying the m m Kin17 cDNA.
  • the cDNA ⁇ f m Kinll is introduced into expression vectors derived from the Epstein Barr virus (EBV vectors) under the control of a very powerful viral promoter ("human cytomegalovirus immediate-early promoter” or "IE HCMV ”) or a promoter inducible by heavy metals (mMT-I mouse promoter of the metallothionein gene I).
  • IE HCMV Epstein Barr virus
  • mMT-I mouse promoter of the metallothionein gene I a very powerful viral promoter
  • mMT-I mouse promoter of the metallothionein gene I a promoter inducible by heavy metals
  • vectors have the following advantages: 1) maintain an episomal (extrachromosomal) stability in human cells; 2) persist in a low number of copies per cell (1 to 20 in the established lines); 3) replicate once per cell cycle; 4) segregate between daughter cells like chromosomes; 5) have an extremely low background of spontaneous mutagenesis 6) do not disturb the functional integrity of the transfected cells; 7) allow the selection of the cells which carry them by the fact of conferring resistance to hygromycin or to geneticin (G418).
  • the vector pEBVCMV Mm Kinl7 (or pB291 ) and the vector pEBVCMVAS Mm Kin17 (or pB291AS in which the cDNA M m KinI was inserted in the "antisense” position).
  • the vectors are amplified in the DH5 bacterium and purified on "Qiagen" columns according to the recom- supplier mandates. This DNA is then used to transfect human cells.
  • Eukaryotic cells were grown in 6-well dishes containing 2 ml of medium per well. Subsequently, 1 to 2 ⁇ g of DNA per well are transfected (depending on the cell type) by precipitation with calcium chloride (Biard et al ,. Biochim. BioPhys. Acta, 1992; Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, supra). The cells are incubated at 37 ° C overnight and the medium is replaced with fresh medium without antibiotics. 48 hours after transfection, the cellular proteins are analyzed by the "Western Mot" technique or immunohistochemistry as described previously (Biard et al, Rad. Res., 1997; Biard et al, Arch. Dermatol. Res. , 1997).
  • the purification of the plasmids by the "Hirt” technique allows their characterization by DNA-DNA hybridization or by transformation of the DH5 ⁇ bacteria and amplification (Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, cited above).
  • the cell cultures are continued in the presence of 250 ⁇ g / ml of hygromycin in the medium for 4 days, then with 125 ⁇ g / ml of hygromycin or of geneticin (750 ⁇ g / ml for 4 days, then 250 ⁇ g / ml), in order to determine clonogenic growth and establish continuous lines.
  • H1299 cells are human lung epithelial cells that were established after removal from a patient with non-small cell lung cancer (NSCLC). These tumor cells show inactivation of the p53 gene.
  • the expression of the cDNA M m Ki 11 under the control of the powerful promoter IE HCMV leads to a very significant reduction in the number of colonies formed 14 days after the transfection and that in the presence of the selection marker (hygromycin or geneticin).
  • the expression of cDNA Tf m Kinll antisense enables the establishment of numerous clones. Therefore, it appears that an ectopic expression of the protein Mm kin17 in tumor cells H 1299 causes a significant selective disadvantage. It is therefore very difficult, if not impossible, to establish lines derived from H 1299 cells continuously expressing the protein Mm kinl7.
  • HEK 293 cells which overexpress the protein M fi ⁇ l 7 -
  • These HEK 293 cells have the following characteristics: 1) on 4 to 5 fragments of the viral genome, integrated into their genome (12% of the left end and one copy of 9% of the right end) (Aiello L. et al., Virology, 1979, 94, 460-469), only the transcripts of the left end are detected; 2) transformed character and loss of contact inhibition; 3) secrete their own growth factors and therefore grow in a low serum environment; 4) moderate tumorigenicity (15% of nude mice with tumors); 5) transfection efficiency greater than 30%. (observed 48 h after transfection of a vector pEBVCMVlacZ or of a vector pEBVCMVEGFP).
  • HEK 293 cells transfected with other EBV vectors such as the pEBVCMVlacZ, pEBVMTlacZ, or pEBVCMVlacI vectors maintain stable expression of the gene of interest (here the bacterial genes lacZ or lacl) for many months, or even many years (Biard et al., Cancer Res., 1992, cited above).
  • HEK 293 cells are transfected with the vector pEBVMT Mm Kin17. In this vector, the expression of the m m Kin11 cDNA is controlled by the mMT-I promoter.
  • the basal expression of the cDNA ⁇ f m Kin! 7 is considerably lower than that obtained with the IE promoter HCMV.
  • expression can be increased by the use of heavy metals in the culture medium.
  • Several stable clones were isolated and analyzed, which express a very low level of Mm kin17 protein. The advantage of this system is that the introduction of 100 ⁇ M of Zn and 1 ⁇ M of Cd into the culture medium activates the promoter mMT-I and increases the expression of the cDNA M m Kinl I (FIG. 12).
  • a clone, called cells B223.1 (FIG.
  • the protein ⁇ kinH is detected in the transfected cells by immunocytochemical staining; while no signal is observed with the B220 cells (FIGS. 12C and D), an intense signal is detected in all the cells
  • B223.1 cells When B223.1 cells are seeded at a density of 10 3 cells / cm 2 , it is observed that in the absence of heavy metals, these cells are unable to grow after 7 days in culture; they remain round and do not spread out ( Figure 12 and 17A). While the B223.1 cells begin to grow after 7 days in culture, the other two cell lines arrive almost at confluence (FIG. 17A). When these different cell lines are grown at different densities to take into account their efficiency in forming plaques, a reduced proliferation rate of B223.1 cells is observed, in comparison with the other two lines (FIG. 17B).

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Abstract

Séquence d'ADNc codant pour la protéine kin17 humaine, séquence d'ADNc codant pour une protéine kin17 tronquée, ainsi qu'utilisation desdites séquences nucléiques et desdites protéines dans la régulation de la prolifération cellulaire. Procédé de détection du gène Kin17 humain et de l'ARNm du gène Kin17 humain, par hybridation in situ à l'aide d'oligonucléotides et/ou par amplification en chaîne par polymérase (PCR). Vecteurs d'expression ou plasmides qui expriment les protéines précitées.

Description

SEQUENCES CODANT POUR UNE PROTEINE kinl7 ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à la séquence d'ADNc codant pour la protéine kinl7 humaine, aux séquences d'ADNc codant pour une protéine kinl7 tronquée, appelée kinl7ΔRH ainsi qu'à l'utilisation desdites séquences nucléiques et desdites protéines dans la régulation de la prolifération cellulaire.
La présente invention est également relative à une procédure de détection du gène Kinl 7 humain et de TARNm du gène Kinl 7 humain, par hybridation in situ à l'aide d'oligonucléotides et/ou par amplification en chaîne par polymerase (PCR).
La présente invention est également relative à des vecteurs d'expression ou plasmides qui expriment les protéines précitées ainsi qu'aux bactéries contenant lesdits vecteurs ou plasmides.
La présente invention est également relative à l'utilisation desdits vecteurs pour la production et la purification de la protéine kinl 7 et de ses formes tronquées ou modifiées et comme médicament (thérapie génique).
Une protéine, dénommée kinl 7 a été mise en évidence chez la souris par J.F. Angulo et al. (Mutation Res., 1989, 123-134) et est immunologiquement reliée à la protéine recA d'E. coli ; son identification a été possible à l'aide d'anticorps anti- recA d'E. coli, chez des cellules de rat FR 3T3. La production de cette protéine kinl 7 est induite par les agents génotoxiques, comme le rayonnement ultra-violet. Elle a une localisation préférentiellement nucléaire. De plus, elle est minoritaire parmi les protéines cellulaires et très sensible à la protéolyse enzymatique.
Elle est vraisemblablement impliquée dans le métabolisme de l'ADN, dans la mesure où elle augmente lors de certaines phases cellulaires de la synthèse de l'ADN et dans la réparation, dans la mesure où elle s'accumule dans le noyau après altération de l'ADN.
Il a été montré (D.S.F. Biard et al., Radiation Research, 1997, 147, 442-450) que l'expression de cette protéine kinl 7 chez le rat est augmentée en présence de radiations ionisantes et qu'elle intervient dans la réparation de l'ADN (A. Tissier et al, Genomics, 1996, 38, 238-242). Poursuivant leurs travaux, J.F. Angulo et al. (Biochimie, 1991, 73, 251-256) ont caractérisé des anticorps anti-recA monospécifiques, aptes à être utilisés pour détecter l'expression de ladite protéine kinl 7 par des vecteurs d'expression. Ces Auteurs ont ainsi mis en valeur un fragment d'ADNc, dénommé Kinl 7m, dérivé de TARN embryonnaire de souris et exprimant un polypeptide (kinl7200) qui présente des réactions croisées avec les anticorps anti-recA.
La comparaison de la séquence du polypeptide (kin200) codé par cet ADNc avec la séquence de la protéine recA a conduit à la mise en évidence de séquences communes correspondant à des séquences situées entre les aminoacides 309-347 de la recA.
Dans Nucleic Acids Research (1991, 19, 5117-5123), J.F. Angulo et al. ont identifié et exprimé l'ADNc de Kinl 7 (1414 pb) chez la souris en utilisant le fragment Kinl 7601 précité, comme sonde.
L'ADNc Kinl 7 de souris présente un seul cadre de lecture ouvert, entre les positions 25 et 1198, qui code pour une protéine de 391 aminoacides
(protéine ^jjάnll), qui présente un domaine de liaison au zinc (motif en « doigt de zinc ») entre les résidus 28 et 50 et un déterminant antigénique du même type que celui de la protéine recA entre les positions 162 et 201.
Cette protéine présente un signal de localisation nucléaire, situé entre les positions 240 et 256, qui semble similaire à ceux identifiés dans certaines protéines nucléaires et qui est fonctionnel.
La localisation chromosomique du gène codant pour la protéine kinl 7 murine a été effectuée par hybridation in situ, sur le chromosome 2, chez la souris. Le gène Kinl 7 humain est localisé sur le chromosome 10pl5-pl4. Le motif en « doigt de zinc » est impliqué dans la liaison de la protéine kinl 7 à l'ADN double-brin.
La protéine kinl 7 se lie préférentiellement à l'ADN courbe ; son efficacité de liaison est corrélée à l'importance de la courbure de l'ADN.
Deux protéines présentant différentes modifications (délétions), soit au niveau du motif en « doigt de zinc » (kinl7 Δl), soit au niveau de l'extrémité C- terminale de la protéine (kinl 7 Δ2), conservent la propriété de se lier préférentielle- ment à l'ADN courbe ; ces propriétés montrent que le motif en « doigt de zinc » n'est pas essentiel pour une liaison préférentielle à cet ADN courbe et qu'un autre domaine reconnaissant l'ADN courbe est impliqué (Mazin et al., N.A.R., 1994, 22, 20, 4335- 4341) et est situé entre les aminoacides 71 et 281. Poursuivant leurs travaux, J.F. ANGULO et al. ont également montré la présence de protéine kinl 7 chez d'autres mammifères que la souris et notamment chez l'homme. Par exemple, D.S.F. Biard et al. (Arch. Dermatol Res., 1997, 289, 448-456) ont détecté, à l'aide d'anticorps anti-kinl7 de souris la protéine kinl 7 humaine (HSkinl7) dans les cellules de la peau et ont montré que les taux de protéine HSkinl7 augmentent dans les kératinocytes épithéliaux en phase de prolifération (après 7 jours de culture) alors que ces taux chutent en phase de différenciation.
Cependant, malgré la détection de la protéine Hskinl7, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'isoler effectivement la séquence codante de cette protéine humaine et ce même en utilisant des sondes d'origine murine. Par exemple, le fragment d'acide nucléique, d'origine humaine, décrit dans le Brevet français n° 2 706 487 ne permet pas d'exprimer la protéine kinl 7 humaine, ni d'isoler la séquence nucléique complète apte à une expression effective de cette protéine HSkinl7.
Les Inventeurs ont maintenant trouvé que, de manière surprenante, l'expression de la protéine kinl 7 de mammifère (notamment souris et homme) est corrélée, de manière générale, avec la prolifération cellulaire ; ils ont en particulier trouvé que la protéine kinl 7 inhibe la prolifération cellulaire ; en outre, une surexpression de protéine kinl 7 ou d'un fragment C-terminal de ladite protéine kinl 7 inhibent drastiquement la prolifération cellulaire. Ils ont, en outre trouvé, qu'une protéine tronquée (délétion d'un fragment comprenant la région homologue (RH) entre la protéine kinl 7 et la protéine RecA était encore plus active dans l'inhibition de la prolifération cellulaire.
En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à des médicaments aptes à réguler la prolifération cellulaire, à base de ces séquences. La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO:l et en ce qu'elle est apte à exprimer une protéine kinl 7 humaine fonctionnelle.
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine kinl 7 tronquée au niveau de la région homologue à la protéine recA.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique, elle code pour une protéine kinl 7 tronquée qui correspond à une protéine kinl 7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kinl 7 tronquée qui correspond à la protéine kinl 7 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129- 228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:2. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kinl 7 tronquée qui correspond à la protéine kinl 7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:3.
La présente invention a également pour objet des fragments, de 20 à 40 nucléotides de la séquence SEQ ID NO:l, pour la détection du gène codant pour la protéine kinl 7 humaine et/ou de TARN du gène Kinl 7 dans un échantillon biologique.
De tels fragments servent notamment d'amorces pour la PCR, la RT- PCR ou l'hybridation in situ. Selon les cas, ils peuvent avantageusement être marqués à l'aide d'un marqueur non-radioactif convenable (substances fluorescentes, ligands tels que la biotine ou un haptène).
Parmi lesdits fragments, on peut citer en particulier les séquences SEQ ID NO:5-21, répertoriées dans le Tableau ci-après, ainsi que les séquences SEQ ID NO:33 et 34.
La présente invention a également pour objet des fragments de la séquence SEQ ID NO:l, aptes à servir de sonde pour l'hybridation ADN- ADN ou ADN-ARN ; parmi de tels fragments, on peut citer la séquence SEQ ID NO:4, correspondant aux positions 207-1208 de la séquence SEQ ID NO:l (sonde 1000) et les séquences SEQ ID NO:l et 5 à 21.
La présente invention a également pour objet des fragments d'une séquence d'acide nucléique codant pour un segment d'une protéine kinl 7 de mammifère (séquences SEQ ID NO:l et SEQ ID NO:24), lesquels fragments comprennent entre 300 et 360 nucléotides codant pour la partie C-terminale de ladite protéine kinl 7 et sont aptes à contrôler la prolifération cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits fragments, il sont sélectionnés dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:33 et la SEQ ID NO:34.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de l'ADN génomique ou d'un produit de transcription du gène humain Kinl 7, par hybridation et/ou amplification génique, réalisé à partir d'un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) une étape au cours de laquelle l'on met en contact un échantillon biologique à analyser avec au moins une sonde sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1-21 et
(2) une étape au cours de laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique-sonde.
Conformément audit procédé, il peut comprendre, préalablement à l'étape (1) : . une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, et
. au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la sonde de l'étape (1) est éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un iso- tope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ladite sonde est constituée par la séquence SEQ ID NO:4.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite paire d'amorces est constituée par une séquence SEQ ID NO: 16 appariée avec une séquence SEQ ID NO: 17.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'un produit de transcription du gène humain Kinll, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape d'extraction de l'ARN à détecter, - une étape de synthèse de l'ADNc correspondant audit ARN par transcription inverse en présence d'amorces aléatoires,
- au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21, et
- la détection du produit amplifié. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ladite paire d'amorces est sélectionnée dans le groupe constitué par les paires suivantes : séquences SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO :12, qui permettent d'amplifier un fragment de 453 pb (fragment A) ; séquences SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19, qui permettent d'amplifier un fragment de 1265 pb (fragment B) et séquences SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO:7, qui permettent d'amplifier un fragment de 224 pb (fragment C). De manière avantageuse, les fragments d'ADNc amplifiés sont séparés par électrophorèse, de préférence sur gel d'agarose, visualisés en présence de bromure d'éthidium et quantifiés à l'aide du logiciel NIH image (National Institute of Health, USA).
Conformément à l'invention, elle englobe également les réactifs de détection d'une séquence nucléique codant pour une protéine kinl 7 de mammifère ou un fragment modifié de ces séquences, caractérisés en ce qu'ils incluent les séquences SEQ ID NO.4-21, 33 et 34 ainsi que les fragments A de 453 pb, B de 1265 pb et C de 224 pb, éventuellement marqués.
La présente invention en outre pour objet une protéine kinl7ΔRH, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl 7 tronquée au niveau d'une région homologue de la protéine recA.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine kinl7ΔRH tronquée, elle correspond à une protéine kinl 7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine kinl7ΔRH tronquée correspond à la protéine kinl 7 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:22 (séquence dénommée Mmkinl7ΔRH). Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine kinl7ΔRH tronquée correspond à une protéine kinl 7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:23 (séquence dénommée HSkinl7ΔRH).
La présente invention a également pour objet des fragments de protéine kinl 7, caractérisés en ce qu'ils comprennent entre 100 et 120 acides aminés et sont situés en position C-terminale ; ils sont de préférence sélectionnés dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:35 et la SEQ ID NO:36.
De tels fragments inhibent, de manière inattendue, la prolifération cellulaire ; la séquence SEQ ID NO:35 correspond aux résidus 283-393 de la séquence humaine de kinl 7 (SEQ ID NO:26) ; la séquence SEQ ID NO:36 correspond aux résidus 281-391 de la séquence de souris de kinl7 (SEQ ID NO:25).
La présente invention a également pour objet l'utilisation du fragment compris entre les aminoacides 55-235, éventuellement muté, de préférence le fragment compris entre les aminoacides 129 et 228 d'une protéine kinl 7 de mammi- fère, pour la régulation de l'interaction protéine-ADN courbe.
En effet, l'obtention de mutants dans ce domaine d'interaction protéine-ADN courbe constitue un outil de choix pour bloquer certains processus biologiques comme la prolifération, la traduction ou l'intégration du virus du SIDA dans le génome humain ou pour transporter des protéines effectrices par la construc- tion de fusions protéiques domaine de fixation à l'ADN courbe-enzyme de réparation, à des endroits où l'ADN est courbe ou courbé.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine kinl 7 de mammifère ou d'un fragment C-terminal de 100 à 120 acides aminés de ladite protéine kinl 7, pour la préparation d'un médicament régulant la prolifération cellulaire ou la fertilité.
Conformément à l'invention, on utilise ladite protéine kinl 7 de mammifère ou ledit fragment C-terminal de 100 à 120 acides aminés, pour la préparation d'un médicament inhibant la prolifération cellulaire, notamment destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une hyperprolifération cellulaire. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:22, 23, 25, 26, 35 et 36.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence codant pour une protéine kinl 7 de mammifère ou pour un fragment de celle-ci sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 2, 3, 33, 34. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence codant pour ladite protéine kinl 7 ou ledit fragment de celle-ci est fusionnée avec un gène qui code pour une protéine fluorescente.
De tels vecteurs sont notamment utiles : - pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire,
- comme outil de détection, notamment pour visualiser les sites et la progression de la réparation de l'ADN et les centres de biosynthèse intranucléaire.
De manière avantageuse, ledit vecteur est associé à des séquences appropriées de régulation.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 2, 3, 24, 33 et 34 pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire. De manière préférée, ledit vecteur est un plasmide, il peut être gardé dans des bactéries telles que E. coli ; on peut citer, à titre d'exemple, la bactérie MOSBlue (Amersham, France), qui possède le génotype suivant : end AI hsdR17 (r kl2-m kl2+)sup E44 thi-1 rec AI gyr A96 rel AI lac [F' pro A+ B+ lacqI 2ΔM15::Tnl0(TcR)]. On obtient ainsi des bactéries cMOS transformées :
- bactérie PKI : bactérie cMOS transformée avec le plasmide pMOS5/we (Amersham, France) dans lequel l'ADNc HsKinl 7 (défini par la SEQ ID NO: 1) a été introduit ;
- bactérie PK2 : bactérie cMOS transformée avec le plasmide pCMVDT21 (Bourdon et al., 1997, Oncogene) dans lequel l'ADNc HSKin17 (défini par la SEQ ID NO:l) a été introduit.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la détection des produits PCR par électrophorèse sur gel. L'ADN est révélé par coloration au bromure d'éthidium. Comme marqueurs de poids moléculaire, des fragments d'ADN de taille connue sont présents dans la colonne A. - les figures 2A et 2B illustrent la comparaison des séquences nucléiques (figure 2A) et protéiques (figure 2B) fisKinl 7 et MmKinl 7. Nucléotides = 86 % d'identité, acides aminés = 92,4 % d'identité.
- la figure 3 représente une autoradiographie de l'analyse par hybridation des ARN totaux extraits de différents tissus humains (panneau A) ou de diffé- rentes cellules tumorales humaines (panneau B ), avec la Sonde-1000 (SEQ ID NO:4).
- la figure 4 illustre la détection de l'ARN messager du gène Kinl 7 dans le testicule de souris par hybridation in situ.
- la figure 5 est une représentation schématique des protéines produites par transfection transitoire. La séquence des acides aminés est représentée de façon linéaire. Le nom des protéines est indiqué à gauche de chaque protéine et la taille est mentionnée à droite.
- la figure 6 illustre la détection des cellules HeLa transfectées avec le vecteur pCMVf^Kinπ. Les noyaux sont colorés en bleu grâce au DAPI. La coloration intranucléaire verte correspond à la localisation de la protéine Mmkinl7 ; la figure 6 A illustre la détection de j^kinH dans des cellules qui expriment un taux faible de protéine Mmkinl7 et la figure 6B illustre la détection de Mmkinl7 dans des cellules qui expriment un taux fort de protéine kinl 7 ; agrandissement : x 1000.
- la figure 7 représente des cellules HeLa qui expriment un taux faible de protéine ^kinH (avec des foyers intranucléaires présentant un diamètre d'environ 0,5 μm ; panneau A) ou des cellules qui expriment un taux fort de protéine kinl 7 (détection des déformations de la morphologie nucléaire DMN ; panneau B).
- la figure 8 représente l'immunodétection de la protéine Mmkinl7ΔRH dans les cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMNKinl7ΔRH. Utilisation de pAbanti-RecA comme premier anticorps (panneau A). Détection avec l'anticorps pAb2064 (panneau B). - la figure 9 correspond à l'analyse par immunocytochimie et par microscopie en contraste de phase des cellules HeLa qui surproduisent la protéine Mmkinl7ΔCT.
- la figure 10 montre que la déformation de la morphologie nucléaire est corrélée à une inhibition de la réplication de l'ADN. La figure 10A représente l'immunodétection de la protéine j^kinπΔRH (en rouge) et l'incorporation de BrdU (en vert) dans les cellules HeLa exprimant la protéine Mmkinl7ΔRH. Le BrdU (Bromodésoxyuridine) est un analogue de nucléotide (thymidine) qui s'incorpore dans l'ADN au cours de la réplication. La figure 10B est un tableau récapitulatif qui montre l'inhibition de la réplication de l'ADN après formation des déformations de la morphologie nucléaire (DMN), due à l'expression des protéines Mmkinl7ΔRH ou
Mmkin1 7'
- la figure 11 illustre la carte génétique des plasmides pEBVMTΔ (pB220) et pEBVMTMmkinl7 (pB223). - la figure 12 illustre l'analyse en cytométrie à balayage laser de la protéine j^kinH dans les cellules du clone B223.1 : 9 mois après la transfection, à la fois les cellules B223.1 et les cellules B220 sont ensemencées à raison de 3.104 cellules/cm2, trois jours avant de commencer le traitement aux métaux lourds (ZnCl2 100 μM et CdSO4 1 μM). 24 heures après, les cellules sont fixées et colorées avec un anticorps anti-RecA spécifique de la protéine Mmkinl7. La détection immunocyto- chimique est réalisée à l'aide du cytomètre ACAS 570 (Meridian Inc.). Les panneaux A et B correspondent aux cellules B223.1, avec ou sans métaux lourds ; les panneaux C et D correspondent aux cellules B220 avec ou sans métaux lourds. Chaque section est analysée en même temps pour la protéine Mmkinl7 (panneau gauche) et l'iodiure de propidium (PI) (panneau droit). Les intensités de fluorescence spécifiques à la protéine j^kinH et au PI sont représentées avec des échelles de fluorescence arbitraires.
- la figure 13 illustre la détection immunocytochimique de la protéine Mmkinl7 dans les cellules du clone B223.1 : 6 mois après la transfection, les cellules B223.1 et B220 sont ensemencées à raison de 6.104 cellules ou 104 cellules/cm2, respectivement et traitées, dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 12. La coloration est réalisée avec l'anticorps anti-RecA. Les panneaux A et B correspondent aux cellules B223.1 avec ou sans métaux lourds ; les panneaux C et D correspondent aux cellules B220 avec ou sans métaux lourds. On utilise un anticorps anti-RecA et un anticorps secondaire conjugué au fluorochrome Cy2™ pour détecter la protéine Mmkinl7. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000 (Biocom) couplé à un microscope Axiophot 2 (Zeiss) et une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus (agrandissement de chaque panneau : x 100). - la figure 14 montre des cellules polynucléées B223.1 surexprimant la protéine Mmkinl7 : 8 mois après la transfection, des cellules B223.1 sont ensemencées comme précisé ci-dessus (voir figure 12). 24 heures après le traitement aux métaux lourds (100 μM ZnCl2 et 1 μM de CdSO4), les cellules sont fixées et colorées avec un anticorps anti-RecA. Agrandissement : (A) x 504 ; (B et C) x 1000 ; (D et F) x 1260 ; (E) x 2000. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000.
- la figure 15 illustre l'analyse du cycle cellulaire dans des cellules HEK293 surexprimant la protéine Mmkinl7 : 6 mois après la transfection, les cellules sont ensemencées aux mêmes dilutions et trois jours après un traitement aux métaux lourds pendant 24 heures. Les cellules sont récupérées et analysées. Les flèches indiquent les cellules polynucléées.
- la figure 16 illustre l'influence de la surproduction de la protéine j^kinH sur l'efficacité des cellules B223.1 à former des clones : 8 mois après la transfection, les cellules B220, B223.1 et B223.2 sont ensemencées à 103, 102 et 101 cellules/cm2, en présence d'hygromycine B (125 μg/ml). Après 10, 12 et 18 jours en culture, respectivement, les cellules sont fixées et colorées.
- la figure 17 illustre le taux de prolifération des cellules B223.1 : à différents moments après la transfection, la croissance cellulaire est évaluée. (A) : des cellules sont ensemencées à la même dilution (103 cellules/cm2) en présence d'hygromycine B (125 μg/ml). A différents moments après l'ensemencement, les cellules sont trypsinisées et comptées. (B) : pour évaluer l'efficacité à former des clones, les trois lignées cellulaires sont évaluées à différentes densités : 103/cm2 pour les cellules B220, 2.103/cm2 pour les cellules B223.2 et 104/cm2 pour les cellules B223.1. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence d'hygromycine B (125 μg/ml). Pour chaque courbe, la moyenne de trois boîtes de culture est calculée -O- : cellules B220 sans hygromycine ; -•- : cellules B220 avec hygromycine ; -D- cellules B223.1 sans hygromycine ; -β- : cellules B223.1 avec hygromycine : -A- cellules B223.2 sans hygromycine ; -<- : cellules B223.2 avec hygromycine.
- la figure 18 illustre la détection, in vivo par fluorescence, des protéines de fusion GFP-kinl7ΔCT (à gauche) et GFP-kinl7SLN-CT (à droite) après transfection des cellules HeLa avec les plasmides pEGFP-Kinl7ΔCT et pEGFP- Kinl7SLN-CT respectivement.
Dans ces figures, les différentes colorations apparaissent sous forme grisée. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Procédé de clonage de l'ADNc du gène Kinl 7 humain ( fsKinl7). Pour isoler l'ADNc du gène fj^KinU, des cellules lymphoblastoïdes humaines, appelées cellules Boleth, qui possèdent un caryotype normal, ont été utilisées. 107 cellules ont été traitées avec une solution dénaturante ; les protéines ont été éliminées après centrifugation à 12000 rpm pendant 20 min. à 4°C (RNA-B, Bioprobe, France). Les ARNs totaux sont récupérés dans la phase aqueuse et précipités par addition d'un volume d'alcool isopropylique à -20°C et centrifugés. Après resuspension dans 1 ml d'H2O distillée, les ARNs sont de nouveau précipités à -20°C dans un volume d'alcool isopropylique et 0,2 M de NaCl. Après récupération par centrifugation et rinçage avec de l'éthanol à 70 %, les ARNs sont remis en suspension dans de l'eau et conservés à -80°C. Les ARNs ainsi obtenus ont été utilisés par la suite dans la réaction de transcription inverse (RT) des ARNs, pour la synthèse des ADNs complémentaires correspondants. Les ADNc obtenus sont traités par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), en présence d'une polymerase thermostable, pour obtenir un fragment de l'ADNc HS^™! 7.
Obtention d'un fragment de 1000 nucléotides de l'ADNc humain parRT-PCR. Des oligonucléotides, dérivés de la séquence nucléotidique de l'ADNc Kinl 7 de souris (couple d'oligonucléotides SEQ ID NO:27 = TCAAAGACAACTGTTGCTGGC et SEQ ID NO:28
ATACCTTCAACTCTGCGTCCTT) ont été utilisés de la façon suivante: 1 μg d'ARN totaux ont été mélangé à 5 mM de MgCl2, IX tampon de PCR, 1 mM de dNTPs, 1 U/ml d'inhibiteur de RNase, 2,5 mM d'oligo d(T)16 et 2,5 U/ml de transcriptase inverse. Le mélange est incubé 20 min. à température ambiante pour permettre à la séquence d'oligo d(T)16 d'hy brider avec les extrémités polyA+ des ARNs et d'initier la transcriptase inverse. Le mélange est ensuite incubé 20 min. à 42°C puis 5 min. à 99°C et 5 min à 5°C. Ces différentes incubations permettent la transcription inverse des ARN messagers en ADN complémentaire. La PCR est réalisée en utilisant les oligonucléotides SEQ ID NO:27 et 28 précités. Après PCR, les produits de l'amplification ont été séparés dans un gel d'agarose à 1,5 %. La présence d'ADN est révélée par du bromure d'éthidium (figure 1). Les marqueurs de taille présents dans la colonne A de la figure 1, ont permis de déterminer la taille des produits d'amplification. Un fragment d'ADN de 1000 paires de bases est clairement détectable dans le cas d'une amplification réalisée sur l'ADNc obtenu (colonne C). Par contre, on constate que lorsque l'on omet de mettre l'enzyme qui permet l'étape de transcription inverse, ce fragment d'ADN est absent (colonne B). Ceci démontre bien la présence de l'ARN messager njfi«17 dans les cellules humaines ; le fragment de 1000 paires de bases obtenu (SEQ ID NO:4) n'est pas dû à une contamination d'ADN génomique.
La séquence du fragment de 1000 paires de bases est déterminée selon la technique de séquençage automatique décrite dans Tissier A. et al., 1996, précité. La séquence SEQ ID NO:4, correspondant à un fragment de l'ADNc jjsKinl 7 est identique à 86 % à celle de souris Mm^in l. Le polypeptide codé est identique à 92,4 %. C'est l'isolement de ce fragment de l'ADNc }{^Kinl7 qui a effectivement permis d'entreprendre le clonage de l'ADNc j-jsKin! 7 complet (Figure 2 : Comparaison des séquences des fragments d'ADNc //£_£ «/ 7 avec l'ADNc Kinl 7 de souris). EXEMPLE 2 : Criblage d'une banque d'ADNc humain : clonage et détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire du gène ff^KinH. Le fragment radiomarqué de 1000 paires de bases de l'ADNc du gène }jsKinl7 (appelée Sonde- 1000; SEQ ID NO:4) a été utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADNc humains obtenus à partir d'ARNs messagers exprimés dans des testicules et insérés dans le vecteur λgtl 1. L'ADN des phages qui hybrident avec la sonde ont été purifiés et l'ADNc humain a été séquence. PROTOCOLE : La banque a été obtenue à partir d'ARN poly A+ purifiés à partir de testicules humains. Les ADN complémentaires ont été obtenus en utilisant comme amorce une séquence de poly d(T). Après transcription inverse et dégradation des ARNs qui ont servi de matrice, des séquences nucléotidiques correspondant au site de restriction de l'enzyme de digestion EcoRI ont été greffées de part et d'autre des extrémités des ADNc. Après digestion par l'enzyme EcoRI, tous les ADNc sont insérés au site EcoRI du vecteur λgtl 1. 250 000 bactériophages λgtl l recombinants contenant des ADNc humains sont incubés 20 min. à 37°C avec 0,3 ml de bactéries réceptrices 6334 (préculture de 16 h à 37°C), puis mélangés avec 9 ml de milieu LB agarose, chauffé à 48°C. L'ensemble est coulé sur des boîtes de Pétri de 140 mm de diamètre contenant du milieu LB-agar. Les boîtes ont été incubées à 42°C pendant 5 heures puis à 37°C, 16 h, jusqu'à ce que les plages de lyses arrivent à confluence. Un filtre de nitrocellulose sec (Schleicher & Shuell, BA85) est ensuite déposé pendant 1 min. sur la surface de la boîte, marquée de façon asymétrique avec de l'encre de chine. On obtient de cette façon une réplique des plages de lyse sur le filtre. Le fragment de 1000 paires radiomarqué (Sonde- 1000) (SEQ ID NO:4) de l'ADNc du gène }{^Kinl7 est utilisé pour le criblage selon les traitements suivants : a) Dénaturation et immobilisation de l'ADN du bactériophage λgtll sur des filtres de nitrocellulose.
Les filtres sont placés pendant 5 min., face en contact avec les phages vers le haut, sur des feuilles de papier Whatmann imbibées de solution dénaturante (0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl), pour permettre la lyse des phages et la dénaturation de l'ADN. Les filtres sont ensuite transférés pendant 5 min. dans la solution de neutralisation (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH = 7,4), puis lavés pendant 10 min. dans du tampon 2X SSC, et ensuite séchés à 80°C, sous vide, pendant 2 heures. Une deuxième série des filtres est mise en contact pendant 2 min. avec les plages de lyses, à la surface de la boîte. Ils seront traités de la même façon que la première empreinte. Les boîtes contenant les phages sont conservées à 4°C dans l'obscurité. L'ADN fixé sur les filtres est alors hybride avec la sonde- 1000 radiomarquée (Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 1989). La deuxième série des filtres avec des empreintes ont été hybrides avec une sonde radiomarquée correspondant à l'ADNc Kinll de souris (Angulo et al., N.A.R., 1991, précité). b) Hybridation des ADNs recombinants et détection des phages qui s'hybrident avec la sonde.
Six filtres ont été placés chacun dans un tube et incubés pendant 3 heures à 65°C dans la solution d'hybridation (5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,5 % SDS), en présence de 50 μg/ml final d'ADN de sperme de hareng soniqué (préalablement dénaturé à 100°C, pendant 10 min., puis placé dans la glace). b-1)- Marquage radioactif des sondes : 30 ng d'ADN correspondant au fragment de 1000 pdb de l'ADNc ffsKinll (sonde -1000 de séquence SEQ ID NO:4) ou correspondant à l'ADNc Kinll de souris (sonde- 1400) ont été chauffés 10 min. à 100°C et incubés en présence d'amorces (hexamères), d'un désoxyribo- nucléotide marqué au phosphore radioactif ([α-32p]-dCTP), des trois autres désoxy- ribonucléotides triphosphates non radioactifs et de la fraction Klenow de la polymerase I d'E. coli. Le marquage est effectué à 37°C pendant 30 min., puis la sonde est purifiée sur tamis moléculaire (SΕPHADΕX G50, Pharmacia). Le taux d'incorporation de la radioactivité est mesuré à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. L'activité spécifique des sonde-1000 et sonde-1400 étaient de 0,8-3x10^ cpm/μg (Random Primed DNA Labeling Kit. Boehringer). b-2)- Hybridation: Les filtres sont incubés dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde-1000 (SΕQ ID NO:4) ou la sonde-1400 radio- marquée (préalablement dénaturée à 100°C pendant 10 min.) a été ajoutée. L'incubation est réalisée pendant 16 heures à 65°C. Après hybridation, les filtres sont lavés de la façon suivante :
3 lavages de 10 min. dans du tampon 2 X SSC, 0,1 % SDS à température ambiante, 1 lavage de 45 min. dans du tampon 1 X SSC, 0,1 % SDS à 65°C. Après élimination de l'excès de radioactivité, les filtres sont mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) qui sont placés à - 80°C pendant 16 heures. c) Isolement des phages qui possèdent l'ADNc du gène }jsKinl7. Les plages de lyse qui ont donné un résultats positif par autoradio- graphie ont été repérées sur les boîtes de Pétri et prélevées et remises en suspension dans 100-300 μl de tampon SM (0,1 M NaCl, 10"3 M SO4, 0,02 M Tris-HCl pH 7,5, 0,01 % de gélatine) contenant 5 μl de chloroforme. Le même protocole utilisé pour le criblage permet par la suite de purifier les phages positifs ainsi que leur ADN pour déterminer la taille des inserts et la séquence de l'ADNc. Purification de l'ADN du phage λgtll et détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire du gène
On procède comme décrit dans le Brevet français n° 2 706 487. EXEMPLE 3 : Méthodes de caractérisation de l'expression du gène Kinl 7 par détection de l'ARN messager et de la protéine codée. Immunodétection de la protéine kinl 7 (de souris et humaine) dans des cellules en culture.
Les cellules cultivées sur lamelles sont lavées 3 fois avec du PBS, puis fixées à l'aide d'une solution de méthanol acétone (3v/7v) pendant 10 minutes à - 20°C. L'immunodétection est ensuite réalisée à température ambiante en chambre humide. Après réhydratation des cellules pendant 10 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées 10 min. dans une solution de 3% de H2O2 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. avec du PBS, les lamelles sont incubées 30 min. dans 5 % de sérum de chèvre dans du PBS. Les lamelles sont ensuite rincées 3 fois 5 min. dans du PBS, puis incubées pendant 2 heures avec un anticorps dirigé contre la protéine kinl 7, dénommé pAb2064 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité) ou un anticorps anti-RecA, dilué au 1/100 dans du PBS. Après 3 rinçages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de lapin biotinylé, produit chez la chèvre, dilué au 1/200 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont recouvertes pendant 30 min. avec le réactif ABC (Vectastain, Elite ABC Kit, Vector Laboratories) qui contient de l'avidine et de la peroxydase de raifort biotinylée, puis de nouveau rincées 3 fois 5 min. dans du PBS. La peroxydase est révélée par la diaminobenzidine (Polysciences Inc.), utilisée à la concentration de 0,5 mg/ml en présence de 0,01% de H2O2 dans du tampon Tris pH 7,4. La réaction est arrêtée après quelques minutes, par immersion des lamelles dans l'eau. Les lamelles sont ensuite montées avec Aquamount amélioré (BDH, Gurr) et observées avec un microscope AXIOPHOTE 2 de Cari ZEISS équipé pour rimmunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie (caméra CCD, Coolview, Photonic Science, UK) qui est contrôlée par un ordinateur.
Détection de l'ARN messager du gène fisKinU par hybridation in situ dans les lymphocytes T. Les lymphocytes humains, déposés sur les lames par cytocentri uga- tion, ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min., rincés au PBS puis déshydratés par passages successifs dans des solutions à 70 %, 90 % et 100 % d'alcool, avant d'être conservés à -80°C. Après hydratation dans du PBS, toutes les étapes de la détection ont été réalisées dans une chambre humide. Les lames sont incu- bées pendant 10 min. avec une solution de H2O2 à 3% dans du PBS, puis rincées 3 fois 5 min. dans du PBS. Les lames sont successivement traitées pendant 10 min. par des solutions de glycine 0,1 M dans du PBS et de Triton X-100, 0,3 % également dans du PBS avant d'être incubées pendant 2 heures à 37°C dans le tampon de préhybridation (50 % de formamide désionisé, SSC 4x, solution de Denhardt lx, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0,125 mg/ml d'ARN de transfert et 0,8 % de sarcosyle).
Marquage de l'oligonucléotide à la digoxygénine. On utilise 100 pm d'un oligonucléotide synthétique de 40 nucléotides (SEQ ID NO:16 ou 17) et marqués par la Dig-11-dUTP à l'extrémité 3', à l'aide de la trousse Boehringer Mannheim (Dig Oligonucléotides Tailing Kit. Réf. 1417231). Le marquage des sondes est contrôlé à l'aide d'un anticorps anti-digoxygénine, couplé à la phosphatase alcaline (révélation par une solution de NBT-BCIP). Conditions d'hybridation et révélation des hybrides.
Sur chaque lame comprenant des lymphocytes fixés, ont été déposés 100 μl de solution d'hybridation composée de 4 pmoles de sonde marquée pour 96 μl de tampon de préhybridation. L'hybridation est réalisée à 37°C pendant 16 heures. La révélation a été réalisée à l'aide de la trousse TSA™ Direct (kit
NEN Réf. NEL 731). Après hybridation, les lames sont lavées successivement 3 fois pendant 10 min. dans du tampon SSC2X, SSC1X, SSC0,5X à température ambiante, puis 3 fois pendant 5 min. dans du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05 % (TNT). Les cellules sont ensuite incubées avec un tampon de blocage composé de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M et 0,5 % de réactif bloquant pendant 30 min. Après blocage, l'immunodétection est réalisée pendant 90 min. avec un anticorps anti-digoxygénine couplé à la peroxydase (Boerhinger Mannheim, Ref 1207733 ). L'anticorps est utilisé à une dilution au 1/100 dans le tampon de blocage de la trousse d'hybridation (TSA™ Direct). L'incubation est suivie de 3 rinçages de 5 min. dans le tampon TNT puis la peroxydase est détectée par action de la tyramide couplée à la fluorescéine pendant 5 min. comme décrit par le fournisseur (TSA™ Direct, NEN). Après 3 lavages de 5 min. dans le TNT, les cellules sont colorées avec une solution de 10"3 μg/ml de 4',6-diamidino-2 phénylindole (DAPI) pendant 10 min. Les lames sont ensuite rincées dans le tampon TNT avant d'être montées à l'aide du Vectasheild®, un produit de montage protecteur de la fluorescence (Vector Laboratories, ref: H- 1000). La fluorescéine est observée à 525 nm et le DAPI à 425 nm avec un microscope AXIOPHOTE 2 de Cari ZEISS équipé pour rimmunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus.
Détection de l'ARN messager du gène MmKinl7 par hybridation in situ dans les testicules de souris.
Les testicules sont prélevés et inclus immédiatement à -20°C dans le milieu d'inclusion OCT (OCT compound, Tissue-Tek, Miles. Réf. 4583). Des coupes de 10 μm d'épaisseur sont réalisées au cryostat à -20°C. Elles ont été utilisées immédiatement ou congelées et gardées à -80°C jusqu'à utilisation. La première étape est la fixation au paraformaldéhyde 4 %, puis le protocole est identique a celui décrit ci- dessus, pour la détection du gène humain dans les lymphocytes T. Les sondes utilisées pour la souris sont les oligonucléotides synthétiques : sonde anti-sens = 5'-CCA GGC CTC TTC TCA CCT GCT CCT CAA TGA ACT TGG CAG T-3' (SEQ ID NO: 17) et sonde sens : 5' -ACT GCC AAG TTC ATT GAG GAG CAG GTG AGA AGA GGC CTG G-3' (SEQ ID NO: 16). On observe une hybridation spécifique au niveau des spermatocytes zygotènes (Figure 4).
Détection de l'ARN messager du gène ffsKinU par hybridation des ΛRN immobilisés sur membrane avec une sonde d'ADN radiomarquée.
La quantité de transcrit Kinll présent dans différents tissus est déterminée par la méthode de Northern (électrophorèse, transfert et hybridation des ARNs). On utilise des membranes de Nylon sur lesquelles 2 μg d'ARN poly A+ de différents tissus humains sont transférés (coeur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas, rate, thymus, prostate, testicule, ovaire, petit intestin, colon et lymphocyte du sang périphérique, MTN, Clontech). La préhybridation et l'hybridation sont effectuées dans un four (hybridization ovenl shaker d'Amersham). La membrane est placée dans des tubes et incubée à 42°C pendant 5 heures avec 15 ml de solution d'hybridation (50 % formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,5 % SDS) en présence de 50 μg/ml final d'ADN de sperme de hareng soniqué (préalablement dénaturé à 100°C pendant 10 min. puis placé dans la glace). La membrane est ensuite incubée dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde- 1000 radiomarquée (SEQ ID NO:4) (préalablement dénaturée à 100°C pendant 10 min) a été ajoutée. L'incubation est réalisée pendant 16 heures à 42°C. Pour éliminer l'excès de sonde, la membrane est lavée deux fois 20 min., à température ambiante dans du 2 X SSC, 0,1 % SDS, deux fois 15 min., à 42°C dans du 0,5 X SSC, 0,1 % SDS puis une fois 15 min., à 60°C dans du 0,1X SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont ensuite mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) ou Hyperfilm-MP (Amersham) à -80°C pendant 60-100 heures. Le panneau A de la Figure 3 montre l' autoradiographie obtenue après hybridation des AR totaux extraits de différents tissus humains avec la Sonde- 1000. Il existe une expression préférentielle du gène ffSKinll dans certains tissus comme le testicule, l'ovaire, le coeur, le muscle squelet- tique ou le petit intestin alors qu'il est pratiquement indécelable dans d'autre tissus comme le rein, le poumon ou le cerveau. EXEMPLE 4 : Détection de l'ARN HsKinU dans des lignées tumorales humaines.
Le taux d'ARN messager jjsKinl ? dans différentes cellules dérivées des tumeurs humaines (leucémie promyélocytaire (HL60), adénocarcinome de la glande cervicale (HeLa S3), leucémie myéloïde chronique (K-562), leucémie lympho- blastique (MOLT-4), lymphome de Burkitt Raji, adénocarcinome colorectal (SW480), carcinome du poumon (A549, mélanome (G361)) a été déterminé. Le protocole de détection du transcrit SKinl I utilisé est le même que celui décrit pour la détection de l'ARM Kinll dans les tissus humains (voir exemple 3). On utilise une membrane sur laquelle 2 μg d'ARN poly A+ de différentes cellules tumorales ont été immobilisés (MTN, Clontech). Le panneau B de la Figure 3 représente l' autoradiographie obtenue après hybridation de la sonde- 1000 avec les ARN totaux extraits de différents cellules tumorales humaines. Après quantification des signaux obtenus pour l'ARN ffsKinll par rapport à ceux calculé pour l'ARN d'actine, on constate que l'expression du gène ff K l I est très variable suivant la lignée : on observe une expression très faible dans les cellules HL60, alors qu'on observe une différence d'un facteur 15 dans les cellules K-562 ou d'un facteur 10 dans les cellules dérivées de l' adénocarcinome colorectale. Les cellules tumorales semblent donc réguler différemment l'expression du gène HSKinll. EXEMPLE 5 : Etude de la surexpression transitoire de la protéine kinl 7 de souris (Mrπkinl7) et de ses formes tronquées dans des cellules humaines.
On a observé que les fibroblastes BALB/c 3T3 lorsqu'ils sont stimulés à proliférer présentent une accumulation intranucléaire de la protéine Mmkinl7 dans les cellules en phase S (réplication de l'ADN). Pour mieux cerner le rôle de la protéine kinl 7 sur la prolifération cellulaire, on a testé l'effet d'une surexpression de la protéine Mmkinl7 sur la prolifération cellulaire. Un système de transfection transitoire, qui permet de surexprimer la protéine Mmkinl7 dans les cellules de mammifères en culture, a été utilisé. Les vecteurs obtenus expriment bien la protéine Mmkinl7 (vérification par des techniques d'immunofluorescence indirecte à l'aide des anticorps polyclonaux pAb2064 dirigés contre la protéine Mmkinl7 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité et Brevet français n° 2 706 487).
On observe l'effet de la surexpression transitoire de différentes formes tronquées de la protéine kinl 7 sur la prolifération cellulaire. Construction des vecteurs d'expression eucaryotes.
Tous les plasmides utilisés pour cette étude ont été construits à partir du vecteur pCMVDT21 qui permet une expression élevée du transgène (Bourdon et al., 1997). La phase ouverte de lecture de l'ADNc Kinl l de souris (Angulo et al., 1991, N.A.R., précité) est insérée dans le vecteur pCMVDT21 digéré par l'enzyme de restriction Xhol pour obtenir le plasmide pCMVKinl7. On utilise aussi l'ADNc appelé MmKinl IΔCT. Il correspond à une délétion du fragment compris entre le nucléotide 854 et le nucléotide 1034 de l'ADNc MmKinl7, et a déjà été décrit (Mazin et al., 1994, précité). Cet ADNc code pour une protéine tronquée dans sa région C-terminale, nommée protéine kinl7ΔCT (délétée dans la région C-terminale), qui a un poids moléculaire de 32407 Daltons. Cet ADNc Kinll ACT est inséré dans le vecteur pCMVDT21 ; on obtient ainsi le plasmide pCMVKinl7ΔCT. Un deuxième mutant est obtenu en délétant l'ADNc ^fmKinll du nucléotide 412 au nucléotide 705. Un tel acide nucléique code pour une protéine tronquée (absence de 99 amino-acides entre les résidus 129 et 228), au niveau d'une région contenant la séquence homologue à la protéine RecA. Cette protéine mutée a été nommée Mmkinl7ΔRH (délétée dans la
Région Homologue). L'ADNc ^f Kinl7ΔRH est généré de la façon suivante : a) Amplification par PCR de la région 5' de l'ADNc MmKinll (entre les nucléotides 1 à 411) à partir du vecteur pcD2Kinl7 (Angulo et al., 1991) en utilisant le couple d'oligonucléotides : 5'-AAGCTGCTGCAGCAGCTTATCGGG-3' (SEQ ID NO:29) et 5'- GGTACCTTTAC ACAAGCCCTCTCGCC-3 ' (SEQ ID NO:30). b) Amplification par PCR de la région 3' de l'ADNc MmKinll (entre les nucléotides 706-1352) en utilisant les amorces :
5 '-GGTACCAGTGCACTGAAGCTGCTGGGG -3' (SEQ ID NO:31) et 5'-ATTTACCCAACTATTCACTA -3' (SEQ ID NO:32). Les deux produits d'amplification sont ensuite ligués entre eux au site Y nl (séquence soulignée). Le séquençage de la jonction des deux fragments a montré que le cadre de lecture de la protéine kinl 7 est intacte. L'ADN ainsi obtenu est inséré dans le vecteur pCMVDT21 pour donner le plasmide pCMVKinl7ΔRH. La Figure 5 montre la représentation schématique des différentes protéines exprimées. La séquence des acides aminés est représentée de façon linéaire. Le nom des protéines est indiqué à gauche de chaque protéine et la taille est mentionnée à droite. La Région Homologue à la protéine RecA (RH, aa 163 à 201) et le Signal de Localisation Nucléaire (SLN, aa 235 à 285) sont présentés dans des rectangles hachurés. Les résidus délétés sont numérotés en fonction de leur position respective dans la séquence de la protéine kinl 7 et sont indiqués comme des discontinuités.
Transfection transitoire de vecteurs d'expression dans les cellules humaines.
Les différentes constructions ont été transfectées dans des cellules HeLa, qui sont des cellules humaines issues d'un adénocarcinome de la glande cervicale (référence ATCC CCL-2). On obtient 10 % de cellules transfectées. La transfection s'effectue de la façon suivante : les cellules HeLa sont ensemencées dans des boîtes de 35 mm de diamètre dans lesquelles une lamelle de verre a préalablement été déposée. Les cellules sont incubées dans un milieu DMEM contenant 4,5 g/1 de glucose, 10 % de sérum de veau foetal et 1 % de pénicilline-streptomycine à une densité de 2xl05 cellules par boîte. 24 heures plus tard, les cellules sont incubées avec le mélange suivant : pour chaque transfection, on mélange 3 μg d'ADN à 10 μl de CaCl2 2,5 M dans un volume final de 100 μl. Le précipité est homogénéisé et additionné goutte à goutte à 100 μl de tampon de transfection (274 mM NaCl ; 1 mM KCl ; 1,5 mM Na2HPO4, 12 H2O ; 11 mM D(+) Glucose ; 25 mM HEPES ; ajusté à pH 7,15 et stérilisé par filtration). Le mélange est incubé pendant 20 minutes à température ambiante puis déposé goutte à goutte sur les cellules. L'incubation dure 16 heures à 37°C. Les cellules sont ensuite rincées 3 fois avec du PBS, puis remises dans du milieu DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine pendant 24 heures à 37°C. Les cellules humaines transfectées sont fixées avec une solution de méthanol/acétone (3v/7v) à -20°c pendant 10 min., puis séchées à tempe- rature ambiante pendant 10 min., afin d'analyser par immunofluorescence indirecte la localisation de la protéine Mmkinl7 surproduite.
Détection de la protéine kinl7 par immunofluorescence indirecte. Les cellules fixées sont réhydratées 10 min. dans du PBS, puis incubées en chambre humide lh30 à 37°C avec l'anticorps pAb2064 dilué au 1/100 dans du PBS en présence de 3 % BSA. Après 3 lavages de 5 minutes dans du PBS à température ambiante et sous agitation, les cellules sont incubées avec le deuxième anticorps anti-immunoglobulines de lapin produit chez la chèvre, couplé au fluorochrome Cy™ 2 (Jackson Immuno Research Laboratories), dilué au 1/500, pendant 45 minutes à 37°C et dans l'obscurité. Les lamelles sont ensuite lavées 3 fois 10 minutes dans du PBS et incubées dans une solution de 10"3 μg/ml de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Les lamelles sont ensuite rincées à l'eau avant d'être collées sur une lame avec un produit de montage (Glycergel, Dako). La Figure 6 correspond à une photographie des cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7 contenant l'ADNc }^mK.inll sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus. Le marquage de l'ADN par le DAPI permet de distinguer, colorés en bleu, les noyaux des cellules. La coloration intranucléaire verte correspond au marquage indirect de la protéine Mmkinl7 surproduite dans les cellules transfectées.
La protéine Mmkinl7 est localisée essentiellement dans des foyers intranucléaires discrets.
On a détecté des cellules qui expriment un taux faible de protéine Mmkinl7. La localisation est clairement nucléaire et on observe une concentration de la protéine Mmkinl7 dans des foyers intranucléaires d'un diamètre d'environ 0,5 μm (Figure 7 A). Lorsque la protéine kinl 7 est exprimée en grande quantité, elle forme des foyers intranucléaires plus gros, avec des dimensions similaires, voire plus grandes que les nucléoles (Figure 7B). Ce résultat montre que la protéine kinl 7 produite par le vecteur pCMVKinl7 s'exprime, que les anticorps pAb2064 reconnais- sent sa forme native et qu'elle présente une localisation nucléaire. Ces résultats confirment qu' vivo, le signal de localisation nucléaire est bien fonctionnel. La localisation de la protéine Mmkinl7 dans des foyers intranucléaires discrets semble refléter la compartimentalisation fonctionnelle des processus biologiques qui ont lieu dans le noyau. En effet, des profils similaires ont déjà été observés pour d'autres protéines impliquées, soit dans le complexe multiprotéique de réplication, soit dans le complexe de transcription ou encore pour des protéines intervenant dans l'épissage alternatif des ARNm.
La surexpression de la protéine Mmkinl7ΔRH conduit à la formation d'aggrégats intranucléaires. Le vecteur pCMVKinl7ΔRH est transfecté dans les cellules humaines dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. La détection de la protéine Mmkinl7ΔRH par la méthode d' immunofluorescence indirecte est réalisée soit en utilisant l'anticorps anti-kinl7 (pAb2064) ou l'anticorps anti-RecA (Brevet français n° 2 706 487, Angulo et al., Biochimie, 1991, précité). On observe que l'anticorps pAbanti-RecA est incapable de détecter la protéine Mmkinl7ΔRH (Figure 8, panneaux A : cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7ΔRH et traitées pour l'immunodétection avec l'anticorps pAbanti-RecA). Ceci démontre que la région homologue à la protéine RecA est effectivement responsable de la réactivité croisée entre la protéine kinl 7 et les anticorps pAbanti-RecA. En revanche, la protéine kinl7ΔRH est facilement détectée en utilisant l'anticorps pAb2064 (Figure 8, panneaux B : cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7ΔRH et traitées pour l'immunodétection avec l'anticorps pAb2064). On observe une coloration verte nucléaire correspondant au marquage indirect de la protéine kinl7ΔRH surproduite dans les cellules transfectées. Les noyaux des cellules sont colorés avec le DAPI. La distribution de la protéine Mmkinl7ΔRH est différente de celle de la protéine Mmkinl7. En effet, la protéine Mmkinl7ΔRH forme de larges aggrégats intranucléaires dans toutes les cellules transfectées indépendamment de la quantité de protéine surproduite. Ceci pourrait indiquer que la délétion des amino-acides entre 129 et 228 augmente la liaison de la protéine Mmkinl7ΔRH à un autre composant nucléaire comme l'ADN ou la chromatine. D'autres approches biochimiques ont montré que la solubilité de la protéine Mmkinl7ΔRH est différente de celle de la protéine Mmkinl7.
La présence de la protéine Mmkinl7ΔRH produit des déformations de la morphologie nucléaire (DMN) des cellules HeLa. On transfecte des cellules HeLa avec le plasmide pCMVKinl7ΔRH, puis on détecte par immunofluorescence indirecte les cellules exprimant la protéine Mjj-kinπΔRH. L'analyse par microscopie en contraste de phase montre que 100 % des cellules transfectées présentent des altérations de la morphologie nucléaire (Figure 8, contraste de phase). Lorsque les cellules surproduisent la protéine Mmkinl7ΔCT il est impossible de détecter ce type de DMN (Figure 9). Dans le cas de la production des faibles quantités de protéine t^kinH, on observe la formation de foyers intranucléaires et les cellules présentent une morphologie nucléaire normale sans altérations (comme décrit plus haut). Par contre, la surexpression d'une quantité importante de protéine ^^kinH mène à la formation de très gros foyers intranucléaires qui ressemblent à la distribution de la protéine Mmkinl7ΔRH et dans ce cas, les cellules présentent systématiquement des DMN (Figure 7). Le fait que 100 % des cellules qui expriment la protéine Mmkinl7ΔRH ont des altérations de la morphologie nucléaire indique le phénotype dominant de ce mutant.
Les DMN sont corrélées à une inhibition de la réplication de l'ADN.
On démontre que l'expression des protéines Mmkinl7 et Mmkinl7ΔRH produisent des DMN et affectent des processus biologiques nucléaires comme la réplication. Un résumé des résultats est présenté à la figure 10. L'ADNc MmKinll ΔRH est introduit dans des cellules humaines HeLa. Après expression du plasmide, la protéine kinl7 est détectée par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps marqué à la rhodamine (coloration rouge). En parallèle, dans les mêmes cellules, on détecte le taux de réplication de l'ADN par l'incorporation de BrdU (coloration verte) ; l'ADN génomique contenu dans les noyaux est visualisé par le DAPI (coloration bleue) (figure 10). La surexpression de la protéine Mmkinl7ΔRH inhibe complètement l'incorporation du BrdU (figure 10).
Test de clonogénéicité des cellules surexprimant la protéine kinl 7 ou ses formes mutées. Les plasmides pCMVDT21, pCMVKinl7, pCMVKinl7ΔRH ou pCMNKinl7ΔCT ont été cotransfectés avec le plasmide pEGFP-Νl (Clontech) dans des cellules HeLa, qui sont ensuite incubées pendant 20 jours dans un milieu contenant un marqueur de sélection (généticine). Les colonies formées sont comptées. Le nombre de colonies formées par les cellules transfectées avec le plasmide pCMVDT21 est considéré comme 100 %.
La protéine kinl 7 permet la formation de 10 % de colonies. La protéine kinl7ΔRH permet la formation de 20 % de colonies.
La protéine kinl7ΔCT permet la formation de 70 % de colonies. La présence de la protéine kin 17 ou kinl7ΔRH affecte considérable- ment la croissance des cellules, alors que la protéine kin 17ΔCT n'a pas d'action inhi- bitrice sur la prolifération cellulaire.
Effets de la surproduction de la protéine kin!7ΔCT et rôle du fragment C-terminal.
- Construction des vecteurs exprimant des protéines de fusion. Les plasmides utilisés pour cette étude ont été construits à partir du vecteur pEGFP-C3 qui exprime la protéine GFP (Green Fluorescent Protein, Clontech). Il a été inséré en phase de l'ADNc qui code pour la GFP, l'ADNc appelé MmKinl7ΔCT. On obtient ainsi le plasmide pEGFP-Kinl7ΔCT qui exprime la protéine de fusion GFP-kinl7ΔCT qui a un poids moléculaire de 60 kDa. Une deuxième protéine de fusion a été créée en insérant en phase de l'ADNc qui code pour la GFP, l'ADNc appelé MmKinl7SLN-CT qui code pour le signal de localisation nucléaire ainsi que pour la partie C-terminale de la protéine kinl 7, nommée protéine kinl7SLN-CT. On obtient ainsi le plasmide pEGFP-Kinl7SLN-CT qui exprime la protéine de fusion GFP-kinl7SLN-CT qui a un poids moléculaire de 46 kDa. - Résultats :
La détection de la protéine kinl7ΔCT par immunofluorescence indirecte montre que cette protéine tronquée a plutôt une distribution nucléaire homogène avec une forte réduction du nombre de foyers intranucléaires. D'autre part, la sur- production de cette protéine kinl7ΔCT ne génère jamais de déformation intra- nucléaire. De plus, sa présence dans les cellules n'affecte ni la réplication de l'ADN ni la prolifération cellulaire. Ces différents résultats montrent que la région peptidique responsable de la formation des foyers intranucléaires, des altérations de la morphologie nucléaire et de l'inhibition de la prolifération cellulaire semble être la région C- terminale.
Pour vérifier cette hypothèse, la localisation subcellulaire des protéines de fusion GFP-kinl7ΔCT (délétée dans la région C-terminale) et GFP- kinl7SLN-CT (possède le SLN et la région C-terminale de la protéine kinl 7) a été déterminée. La figure 18 montre la détection, in vivo, de ces deux protéines dans les cellules HeLa : alors que la protéine de fusion GFP-kinl7ΔCT présente une localisation nucléaire diffuse, la protéine GFP-kinl7SLN-CT montre essentiellement une localisation sous forme de foyers nucléaires similaires à ceux formés par la protéine kinl 7. Ainsi, ces observations démontrent que la région C-terminale de la protéine kin 17 est capable de diriger une protéine hétérologue (la GFP) dans les foyers intranucléaires et suggèrent fortement que c'est cette région qui est responsable des effets cytotoxiques observés lors de la surproduction de la protéine kinl 7. EXEMPLE 6 : Obtention des cellules humaines qui ont une expression stable de la protéine Mmkinl7. Effet sur la prolifération cellulaire. Pour confirmer les effets produits par l'expression transitoire de la protéine Mmkinl7, on a cherché à isoler des cellules qui expriment en continu la protéine Mmkinl7 et à déterminer l'effet de cette expression ectopique sur la survie cellulaire, la prolifération et la morphologie des cellules. On a utilisé l'ADN complémentaire ^fmKinl I de souris porté par des vecteurs navettes "EBV" afin de transfecter des cellules humaines en culture, appelées HFK293. Les cellules HEK 293 ("Transformed human embryo kidney cells "HEK- Ad5), établies à partir de reins embryonnaires transformés par des fragments de l'Adénovirus 5 (Graham F.L. et al., J Gen. Virol, 1977, 36, 59-72). On cherche à sélectionner des cellules capables d'exprimer la protéine Mmkinl7. On a supposé que la surproduction de la protéine kinl 7 de souris dans les cellules humaines a un effet biologique très proche de la protéine humaine étant donné la conservation des séquences observée entre l'homme et la souris (figure 2A et 2B).
Les vecteurs d'expression EBV portant l'ADNc MmKinl7. L'ADNc ^fmKinll est introduit dans des vecteurs d'expression déri- vés du virus d'Epstein Barr (vecteurs EBV) sous le contrôle d'un promoteur viral très puissant ("human cytomegalovirus immediate-early promoter" ou "IE HCMV") ou d'un promoteur inductible par les métaux lourds (promoteur de souris mMT-I du gène de la métallothionéine I). Ces plasmides sont dérivés de ceux déjà publiés (Biard et al., Biochim. BioPhys. Acta, 1992, 1130, 68-74 ; Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, 200, 263-271). Ces vecteurs ont les avantages suivants : 1) se maintiennent de façon épisomale (extrachromosomique) stable dans les cellules humaines ; 2) persistent en nombre faible de copies par cellule (1 à 20 dans les lignées établies) ; 3) se répliquent une fois par cycle cellulaire ; 4) se ségrègent entre les cellules filles comme les chromosomes ; 5) présentent un bruit de fond de mutagenèse spontanée extrêmement faible 6) ne perturbent pas l'intégrité fonctionnelle des cellules transfectées ; 7) permettent la sélection des cellules qui les portent par le fait de conférer la résistance à l'hygromycine ou à la généticine (G418).
Les étapes de clonage dans les vecteurs EBV et d'analyse de ces vecteurs ont déjà été décrites (Biard et al,. Biochim. BioPhys. Acta, 1992 ; Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, précités). Parmi les plasmides construits, 4 d'entre eux ont plus particulièrement été étudiés : le vecteur pEBVMTMmKinl7 (ou pB223) (figure 11), le vecteur pEBVMTΔ (ou pB220) (figure 11), le vecteur pEBVCMVMmKinl7 (ou pB291) et le vecteur pEBVCMVASMmKinl7 (ou pB291AS dans lequel l'ADNc MmKinIl a été inséré en position "anti-sens"). Après le clonage, les vecteurs sont amplifiés dans la bactérie DH5 et purifiés sur des colonnes "Qiagen" selon les recom- mandations du fournisseur. Cet ADN est alors utilisé pour transfecter les cellules humaines.
La transfection des cellules humaines.
Les cellules d'eucaryotes ont été cultivées dans des boîtes 6-puits contenant 2 ml de milieu par puits. Par la suite, 1 à 2 μg d'ADN par puits sont trans- fectés (selon le type cellulaire) par précipitation avec du chlorure de calcium (Biard et al,. Biochim. BioPhys. Acta, 1992 ; Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, précités). Les cellules sont incubées à 37°C toute la nuit et le milieu est remplacé par du milieu frais sans antibiotique. 48 heures après la transfection, les protéines cellulaires sont analy- sées par la technique de "Western Mot" ou d'immunohistochimie comme décrit précédemment (Biard et al, Rad. Res., 1997; Biard et al, Arch. Dermatol. Res., 1997). La purification des plasmides par la technique de "Hirt" permet leur caractérisation par hybridation ADN- ADN ou par transformation des bactéries DH5α et amplification (Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, précité). Les cultures cellulaires sont poursuivies en présence de 250 μg/ml d'hygromycine dans le milieu pendant 4 jours, puis avec 125 μg/ml d'hygromycine ou de généticine (750 μg/ml pendant 4 jours, puis 250 μg/ml), afin de déterminer la croissance clonogénique et d'établir des lignées continues.
Effet de la surexpression de la protéine Mmkinl 7 dans des cellules tumorales H1299.
Les cellules H1299 (ATCC CRL-5803) sont des cellules épithéliales humaines du poumon qui ont été établies après prélèvement d'un patient atteint d'un carcinome pulmonaire NSCLC ("non small cell lung cancer"). Ces cellules tumorales présentent une inactivation du gène p53. L'expression de l'ADNc MmKi l 1 sous le contrôle du promoteur puissant IE HCMV entraîne une diminution très importante du nombre de colonies formées 14 jours après la transfection et cela en présence du marqueur de sélection (hygromycine ou généticine). Dans les mêmes conditions, l'expression de l'ADNc ^fmKinll anti-sens permet l'établissement de très nombreux clones. De ce fait, il ressort qu'une expression ectopique de la protéine Mmkinl7 dans les cellules tumorales H 1299 entraîne un désavantage sélectif important. Il est donc très difficile, voire impossible d'établir des lignées dérivées des cellules H 1299 exprimant en continu la protéine Mmkinl7.
Obtention des cellules HEK 293 immortelles qui surexpriment la protéine M fi^l 7- Ces cellules HEK 293 présentent les caractéristiques suivantes: 1) sur 4 à 5 fragments du génome viral, intégrés dans leur génome (12 % de l'extrémité gauche et une copie de 9 % de l'extrémité droite) (Aiello L. et al., Virology, 1979, 94, 460-469), seuls les transcrits de l'extrémité gauche sont détectés ; 2) caractère transformé et perte de l'inhibition de contact ; 3) sécrètent leurs propres facteurs de crois- sance et donc poussent en milieu faible en sérum ; 4) tumorigénicité modérée (15 % des souris nudes présentant des tumeurs) ; 5) efficacité de transfection supérieure à 30 %. (observée 48 h après la transfection d'un vecteur pEBVCMVlacZ ou d'un vecteur pEBVCMVEGFP).
On observe que 48h après la transfection du vecteur pEBVCMVMn-Kinl 7, un grand nombre de cellules expriment la protéine Mmkinl 7 à un niveau très élevé. Après sélection à l'hygromycine (250 μg/ml), on observe dans tous les cas un nombre très important de clones, ce nombre étant toujours plus important que celui observé après transfection du vecteur contrôle pEBVCMVASMmKinl7. Ainsi, 14 jours après la sélection, la viabilité des cellules est compatible avec l'expression de la protéine ^^ά ll. Après plusieurs semaines, on constate une perte progressive du nombre de cellules exprimant la protéine Mmkinl7. Ceci se reproduit dans de nombreuses expérience de transfection. Cela indique que l'expression ecto- pique de la protéine Mmkinl7 entraîne un désavantage sélectif des cellules HEK 293, qui entraîne leur disparition. En revanche, les cellules HEK 293 transfectées par d'autres vecteurs EBV, comme les vecteurs pEBVCMVlacZ, pEBVMTlacZ, ou pEBVCMVlacI maintiennent une expression stable du gène d'intérêt (ici les gènes bactériens lacZ ou lacl) pendant de nombreux mois, voire de nombreuses années (Biard et al., Cancer Res., 1992, précité). On transfecte des cellules HEK 293 avec le vecteur pEBVMTMmKinl7. Dans ce vecteur, l'expression de l'ADNc MmKinll est contrôlée par le promoteur mMT-I. De ce fait, l'expression basale de l'ADNc ^fmKin!7 est considérablement plus faible que celle obtenue avec le promoteur IE HCMV. De plus, l'expression peut être augmentée par l'utilisation de métaux lourds dans le milieu de culture. On a isolé et analysé plusieurs clones stables qui expriment un taux très faible de protéine Mmkinl7. L'avantage de ce système est que l'introduction de 100 μM de Zn et 1 μM de Cd dans le milieu de culture active le promoteur mMT-I et augmente l'expression de l'ADNc MmKinl I (figure 12). Un clone, dénommé cellules B223.1 (figure 12), puisqu'il porte le vecteur pEBVMTMmKinl7 (ou pB223), présente une expression basale assez élevée de la protéine j^kinπ, alors que le clone dénommé pB223.2 présente une expression basale basse de la protéine Mmkinl7. La caractérisation de ce clone pendant plus de 8 mois en culture continue a montré que le taux de la protéine Mmkinl7 est corrélé avec une diminution très importante de la prolifération cellulaire.
La protéine ^kinH est détectée dans les cellules transfectées par coloration immunocytochimique ; alors que l'on n'observe aucun signal avec les cellules B220 (figure 12C et D), un signal intense est détecté dans toutes les cellules
B223.1, 24 heures après un traitement aux métaux lourds avec un anticorps anti-recA (figure 12A et 12B).
On observe également des différences d'expression dans la population de cellules B223.1.
En utilisant la microscopie conventionnelle avec un filtre étroit pour analyser l'émission du fluorochrome Cy2™, on observe moins de 1 % de cellules B223.1 surexprimant la protéine Mmkinl7, en l'absence de stimulation avec les métaux lourds (figure 13 A) ; après stimulation aux métaux lourds, on détecte un fort signal spécifique, localisé dans les noyaux des cellules B223.1 (figure 13B).
Dans ces conditions expérimentales, la protéine endogène HSkinl7 n'est pas détectable (figure 12C et 13C). On observe également une diminution de la croissance clonogénique des cellules B223.1, une incapacité à pousser à faible densité, et une mauvaise adhérence au support de culture (figure 13B). Les cellules B223.1 sont souvent géantes et polynucléées (figure 14). On observe plus de cellules polynucléées dans la population de cellules B223.1 que dans les deux autres lignées cellulaires (B220 et B223.2) (figure 15). Elles présentent des structures nucléaires multilobées ainsi que des micronoyaux. Ces résultats indiquent que la viabilité des cellules humaines HEK 293 est compatible avec une expression constitutive faible de la protéine Mmkinl7. En revanche, un taux d'expression élevé affecte négativement la prolifération cellulaire. Ces résultats indiquent que la surexpression de la protéine Mmkinl7 compromet la viabilité cellulaire. Tous ces résultats renforcent l'hypothèse selon laquelle la protéine Mmkinl7 devrait intervenir dans le contrôle (négatif) de la prolifération cellulaire (figure 16).
Lorsque les cellules B223.1 sont ensemencées à une densité de 103 cellules/cm2, on observe qu'en l'absence de métaux lourds, ces cellules sont incapables de croître après 7 jours en culture ; elles restent rondes et ne s'étalent pas (figure 12 et 17A). Alors que les cellules B223.1 commencent à croître après 7 jours en culture, les deux autres lignées cellulaires arrivent presque à confluence (figure 17A). Lorsque ces différentes lignées cellulaires sont mises en croissance à différentes densités pour tenir compte de leur efficacité à former des plaques, on observe un taux de prolifération réduit des cellules B223.1, en comparaison avec les deux autres lignées (figure 17B). Dans la mesure où l'on n'observe aucune différence en présence ou en l'absence d'hygromycine, B, on doit considérer que ces résultats ne sont pas dus à une différence de sensibilité au milieu de sélection (figure 17B). Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO:l et en ce qu'elle est apte à exprimer une protéine kinl 7 humaine fonctionnelle. 2°) Séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine kin 17 tronquée au niveau d'une région homologue à la protéine recA. 3°) Séquence d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine kinl 7 tronquée qui correspond à une protéine kinl 7, dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété. 4°) Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kinl 7 tronquée qui correspond à la protéine kin 17 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129- 228 est délété et en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO:2. 5°) Séquence selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kin 17 tronquée qui correspond à la protéine kinl7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO:3. 6°) Fragments de la séquence SEQ ID NO:l, pour la détection du gène codant pour la protéine kinl 7 humaine et/ou de l'ARN du gène Kinl l dans un échantillon biologique. 7°) Fragments selon la revendication 6, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:4-21 et 33. 8°) Procédé de détection de l'ADN génomique ou d'un produit de transcription du gène humain Kinl I, par hybridation et/ou amplification génique, réalisé à partir d'un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) une étape au cours de laquelle l'on met en contact un échantillon biologique à analyser avec au moins une sonde sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1-21 et 33 et (2) une étape au cours de laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique-sonde.
9°) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la sonde de l'étape (1) est éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
10°) Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que ladite sonde est constituée par la séquence SEQ ID NO:4.
11°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il peut comprendre, préalablement à l'étape (1) : . une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, et
. au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21, de préférence à l'aide de la paire d'amorces SEQ ID NO:16 et SEQ ID NO: 17.
12°) Procédé de détection d'un produit de transcription du gène humain Kinll, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape d'extraction de l'ARN à détecter,
- une étape de synthèse de l'ADNc correspondant audit ARN par transcription inverse en présence d'amorces aléatoires,
- au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21, et
- la détection du produit amplifié.
13°) Procédé de détection selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite paire d'amorces est sélectionnée dans le groupe constitué par les paires suivantes : séquences SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO :12, qui permettent d'amplifier un fragment de 453 pb ; séquences SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19, qui permettent d'amplifier un fragment de 1265 pb et séquences SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO:7, qui permettent d'amplifier un fragment de 224 pb.
14°) Procédé de détection selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que la détection est effectuée par électrophorèse sur gel et révélation convenable, suivi éventuellement d'une quantification. 15°) Protéine kinl7ΔRH, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl7 tronquée au niveau d'une région homologue à la protéine recA.
16°) Protéine kinl7ΔRH selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl 7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété.
17°) Protéine kinl7ΔRH selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite protéine kin 17 tronquée correspond à la protéine kin 17 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:22 (séquence dénommée Mmkinl7ΔRH).
18°) Protéine kinl7ΔRH selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite protéine kin 17 tronquée correspond à une protéine kin 17 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:23 (séquence dénommée HSkinl7ΔRH). 19°) Fragment d'une séquence d'acide nucléique codant pour un segment d'une protéine kinl 7 de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend entre 300 et 360 nucléotides codant pour la partie C-terminale d'une protéine kinl 7 de mammifère (SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :24) et est apte à contrôler la prolifération cellulaire. 20°) Fragment selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:33 et la SEQ ID NO:34.
21°) Fragment de protéine kinl 7, caractérisé en ce qu'il comprend entre 100 et 120 acides aminés, situés en position C-terminale de la séquence SEQ ID NO :25 ou de la séquence SEQ ID NO :26. 22°) Fragment selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par la SEQ ID NO:35 et la SEQ ID NO:36.
23°) Utilisation d'une protéine kinl 7 de mammifère ou d'un fragment de protéine selon l'une quelconque des revendications 21 et 22, pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire. 24°) Utilisation selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament inhibant la prolifération cellulaire, notamment destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une hyperprolifération cellulaire.
25°) Utilisation d'une protéine kinl 7 de mammifère ou d'un fragment de protéine selon l'une quelconque des revendications 21 et 22, pour la préparation d'un médicament contrôlant la fertilité.
26°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisée en ce que ladite séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:22, 23, 25, 26, 35 et 36. 27°) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence codant pour une protéine kinl 7 de mammifère ou un fragment de celle-ci sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 2, 3, 33 et 34.
28°) Vecteur d'expression selon la revendication 27, caractérisé en ce que ladite séquence codant pour ladite protéine kin 17 ou ledit fragment de celle-ci est fusionnée avec un gène qui code pour une protéine fluorescente.
29°) Utilisation d'un vecteur d'expression incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 2, 3, 24, 33 et 34, pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire.
30°) Utilisation d'un vecteur d'expression incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 2, 3, 24, 33 et 34, comme outil de détection, notamment pour visualiser les sites et la progression de la réparation de l'ADN et les centres de biosynthèse intranucléaire.
31°) Utilisation du fragment compris entre les aminoacides 55-235, de préférence le fragment compris entre les aminoacides 129 et 228 d'une protéine kin 17 de mammifère pour la régulation de l'interaction protéine- ADN courbe.
32°) Réactifs de détection d'une séquence nucléique codant pour une protéine kinl 7 de mammifère ou un fragment modifié de ces séquences, caractérisés en ce qu'ils incluent les séquences SEQ ID NO:4-21, 33 et 34 ainsi que les fragments A de 453 pb, B de 1265 pb et C de 224 pb, éventuellement marqués.
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