FR2772046A1 - Sequences codant pour une proteine kin17 et leurs applications - Google Patents
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Abstract
Séquence d'ADNc codant pour la protéine kin17 humaine, séquences d'ADNc codant pour une protéine kin17 tronquée, ainsi qu'utilisation desdites séquences nucléiques et desdites protéines dans la régulation de la prolifération cellulaire. Procédure de détection du gène Kin17 humain et de l'ARNm du gène Kin17 humain, par hybridation in situ à l'aide d'oligonucléotides et/ ou par amplification en chaîne par polymérase (PCR).Vecteurs d'expression ou plasmides qui expriment les protéines précitées.
Description
La présente invention est relative à la séquence d'ADNc codant pour la protéine kinl7 humaine, aux séquences d'ADNc codant pour une protéine kinl7 tronquée, appelée kinl7ARH ainsi qu'à l'utilisation desdites séquences nucléiques et desdites protéines dans la régulation de la prolifération cellulaire.
La présente invention est également relative à une procédure de détection du gène Kini 7 humain et de l'ARNm du gène Kinl 7 humain, par hybridation in situ à l'aide d'oligonucléotides et/ou par amplification en chaîne par polymérase (PCR).
La présente invention est également relative à des vecteurs d'expression ou plasmides qui expriment les protéines précitées ainsi qu'aux bactéries contenant lesdits vecteurs ou plasmides.
La présente invention est également relative à l'utilisation desdits vecteurs pour la production et la purification de la protéine kinl7 et de ses formes tronquées ou modifiées et comme médicament (thérapie génique).
Une protéine, dénommée kinl7 a été mise en évidence chez la souris par J.F. Angulo et al. (Mutation Res., 1989, 123-134) et est immunologiquement reliée à la protéine recA d'E. colt, son identification a été possible à l'aide d'anticorps antirecA d'E. coli, chez des cellules de rat FR 3T3. La production de cette protéine kin17 est induite par les agents génotoxiques, comme le rayonnement ultra-violet. Elle a une localisation préférentiellement nucléaire. De plus, elle est minoritaire parmi les protéines cellulaires et très sensible à la protéolyse enzymatique.
Elle est vraisemblablement impliquée dans le métabolisme de l'ADN, dans la mesure ou elle augmente lors de certaines phases cellulaires de la synthèse de l'ADN et dans la réparation, dans la mesure où elle s'accumule dans le noyau après altération de l'ADN.
Il a été montré (D.S.F. Biard et al., Radiation Research, 1997, 147, 442-450) que l'expression de cette protéine kinl7 chez le rat est augmentée en présence de radiations ionisantes et qu'elle intervient dans la réparation de l'ADN (A.
Tissier et al., Genomics, 1996, 38, 238-242).
Poursuivant leurs travaux, J.F. Angulo et al. (Biochimie, 1991, 73, 251-256) ont caractérisé des anticorps anti-recA mono spécifiques, aptes à être utilisés pour détecter l'expression de ladite protéine kinl7 par des vecteurs d'expression. Ces
Auteurs ont ainsi mis en valeur un fragment d'ADNc, dénommé Kini 7i, dérivé de l'ARN embryonnaire de souris et exprimant un polypeptide (kin17200) qui présente des réactions croisées avec les anticorps anti-recA.
Auteurs ont ainsi mis en valeur un fragment d'ADNc, dénommé Kini 7i, dérivé de l'ARN embryonnaire de souris et exprimant un polypeptide (kin17200) qui présente des réactions croisées avec les anticorps anti-recA.
La comparaison de la séquence du polypeptide (kin200) codé par cet
ADNc avec la séquence de la protéine recA a conduit à la mise en évidence de séquences communes correspondant à des séquences situées entre les aminoacides 309347 de la recA.
ADNc avec la séquence de la protéine recA a conduit à la mise en évidence de séquences communes correspondant à des séquences situées entre les aminoacides 309347 de la recA.
DansNucleicAcidsResearch (1991, 19, 5117-5123), J.F. Angulo et al. ont identifié et exprimé l'ADNc de Kinl7 (1414 pb) chez la souris en utilisant le fragment Kin17601 précité, comme sonde.
L'ADNc Kinl7 de souris présente un seul cadre de lecture ouvert, entre les positions 25 et 1198, qui code pour une protéine de 391 aminoacides (protéine M*"kinl7), qui présente un domaine de liaison au zinc (motif en doigt de zinc ) entre les résidus 28 et 50 et un déterminant antigénique du même type que celui de la protéine recA entre les positions 162 et 201.
Cette protéine présente un signal de localisation nucléaire, situé entre les positions 240 et 256, qui semble similaire à ceux identifiés dans certaines protéines nucléaires et qui est fonctionnel.
La localisation chromosomique du gène codant pour la protéine kinl7 murine a été effectuée par hybridation in situ, sur le chromosome 2, chez la souns.
Le motif en doigt de zinc est impliqué dans la liaison de la protéine kinl7 à l'ADN double-brin.
La protéine kinl7 se lie préférentiellement à l'ADN courbe, son efficacité de liaison est corrélée à l'importance de la courbure de l'ADN.
Deux protéines présentant différentes modifications (délétions), soit au niveau du motif en doigt de zinc (kinl7 A1), soit au niveau de l'extrémité Cterminale de la protéine (kinl7 A2), conservent la propriété de se lier préférentiellement à l'ADN courbe , ces propriétés montrent que le motif en doigt de zinc n'est pas essentiel pour une liaison préférentielle à cet ADN courbe et qu'un autre domaine reconnaissant l'ADN courbe est impliqué (Mazin et al., N.A.R., 1994, 22, 20, 43354341) et est situé entre les aminoacides 71 et 281.
Poursuivant leurs travaux, J.F. ANGULO et al. ont également montré la présence de protéine kinl7 chez d'autres mammifères que la souris et notamment chez l'homme. Par exemple, D.S.F. Biard et al. (Arch. Dermatol. Res., 1997, 289, 448-456) ont détecté, à l'aide d'anticorps anti-kinl7 de souris la protéine kinl7 humaine (Hskinl7) dans les cellules de la peau et ont montré que les taux de protéine Hskinl7 augmentent dans les kératinocytes épithéliaux en phase de prolifération (après 7 jours de culture) alors que ces taux chutent en phase de différenciation.
Cependant, malgré la détection de la protéine final7, il n'a pas été possible jusqu'à présent d'isoler effectivement la séquence codante de cette protéine humaine et ce même en utilisant des sondes d'origine murine.
Par exemple, le fragment d'acide nucléique, d'origine humaine, décrit dans le Brevet français n" 2 706 487 ne permet pas d'exprimer la protéine kinl7 humaine, ni d'isoler la séquence nucléique complète apte à une expression effective de cette protéine FEkinl7.
Les Inventeurs ont maintenant trouvé que, de manière surprenante, la protéine kinl7 de mammifère (notamment souris et homme) intervient, de manière générale, sur la prolifération cellulaire, ils ont en particulier trouvé que la protéine kinl7 régule la prolifération cellulaire, en particulier, une surexpression de protéine kinl7 inhibe la prolifération cellulaire.
Ils ont, en outre trouvé, qu'une protéine tronquée (délétion d'un fragment comprenant la région homologue (RH) entre la protéine kinl7 et la protéine
RecA) était encore plus active dans l'inhibition de la prolifération cellulaire.
RecA) était encore plus active dans l'inhibition de la prolifération cellulaire.
En conséquence, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à des médicaments aptes à réguler la prolifération cellulaire, à base de ces séquences.
La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence SEQ ID NO: 1 et en ce qu'elle est apte à exprimer une protéine kinl7 humaine fonctionnelle.
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine kinl7 tronquée au niveau de la région homologue de la protéine recA.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique, elle code pour une protéine kit 17 tronquée qui correspond à une protéine kinl7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les arninoacides 55-235 est délété.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kinl7 tronquée qui correspond à la protéine kinl7 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:2.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence d'acide nucléique code pour une protéine kinl7 tronquée qui correspond à la protéine kinl7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:3.
La présente invention a également pour objet des fragments, de 20 à 40 nucléotides de la séquence SEQ ID NO: 1, pour la détection du gène codant pour la kinl 7 humaine et l'ARN du gène Kinl 7 dans un échantillon biologique.
De tels fragments servent notamment d'amorces pour la PCR, la RT
PCR ou l'hybridation in situ.
PCR ou l'hybridation in situ.
Parmi lesdits fragments, on peut citer en particulier les séquences
SEQ ID NO:5-21, répertoriées dans le Tableau ci-après:
SEQ ID NO:5-21, répertoriées dans le Tableau ci-après:
<tb> Hu89D <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:5) <SEP> CTCAGGAGACGCTTTGGCACTA
<tb> Hu857R <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:6)
<tb> Hu3r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:7) <SEP> TCTTTTCGTTTCACTGATGCT
<tb> Hu4d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:8) <SEP> GGCAGAGAAATAT <SEP> CATAACAAAAA <SEP>
<tb> Hu5d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:9)
<tb> Hu6d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 10) <SEP> TTTTCAGCTACTATCGTTCATT
<tb> Hu8d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:11) <SEP> CGAGTGCACTGAAGACGATAGG
<tb> <SEP> Hu9r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:12) <SEP> ATTCTTTTCGTTTCACTGAT
<tb> Hu10r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:13) <SEP> GGCAATACCAGCGTAGCTTCTGCAGC
<tb> Hu11r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:14) <SEP> CTCTGATGAGATTCGGACATACAAT
<tb> Hu12r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:15) <SEP> TCTCCTGAGAAGTTCTAGAAA
<tb> Hu-KPNd <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:16) <SEP> ACTGCCAAATTTATTGAAGAGCAAGTGAGAAGAGGCCTGG
<tb> Hu-KPNr <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:17) <SEP> CCAGGCCTCTTCTCACTTGCTCTTCAATAAATTTGGCAGT <SEP>
<tb> HsKinlOd <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:18) <SEP> AGAAAGTGATCGCTGCCGTGGT
<tb> HsKin1251r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:19) <SEP> GCGAACACCAATTTGATGCTTTAAGA
<tb> Hu174D <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:20) <SEP> ITCAGAGACAACTATTGCTGGC <SEP>
<tb> <SEP> Hu1170R <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:21) <SEP> ATCCTTCAACTCTGCGTCCTT
<tb>
La présente invention a également pour objet des fragments de la séquence SEQ ID NO: 1, aptes à servir de sonde pour l'hybridation ADN-ADN ou
ADN-ARN, parmi de tels fragments, on peut citer la séquence SEQ ID NO:4, correspondant aux positions 207-1208 de la séquence SEQ ID NO:1 (sonde 1000) et les séquences SEQ ID NO:1 et 5 à 21
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de l'ADN génomique ou d'un produit de transcription du gène humain KIN17, par hybridation et/ou amplification génique, réalisé à partir d'un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend
(1) une étape au cours de laquelle l'on met en contact un échantillon biologique à analyser avec au moins une sonde sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1-21 et
(2) une étape au cours de laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique-sonde.
<tb> Hu857R <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:6)
<tb> Hu3r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:7) <SEP> TCTTTTCGTTTCACTGATGCT
<tb> Hu4d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:8) <SEP> GGCAGAGAAATAT <SEP> CATAACAAAAA <SEP>
<tb> Hu5d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:9)
<tb> Hu6d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 10) <SEP> TTTTCAGCTACTATCGTTCATT
<tb> Hu8d <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:11) <SEP> CGAGTGCACTGAAGACGATAGG
<tb> <SEP> Hu9r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:12) <SEP> ATTCTTTTCGTTTCACTGAT
<tb> Hu10r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:13) <SEP> GGCAATACCAGCGTAGCTTCTGCAGC
<tb> Hu11r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:14) <SEP> CTCTGATGAGATTCGGACATACAAT
<tb> Hu12r <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:15) <SEP> TCTCCTGAGAAGTTCTAGAAA
<tb> Hu-KPNd <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:16) <SEP> ACTGCCAAATTTATTGAAGAGCAAGTGAGAAGAGGCCTGG
<tb> Hu-KPNr <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:17) <SEP> CCAGGCCTCTTCTCACTTGCTCTTCAATAAATTTGGCAGT <SEP>
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<tb> <SEP> Hu1170R <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:21) <SEP> ATCCTTCAACTCTGCGTCCTT
<tb>
La présente invention a également pour objet des fragments de la séquence SEQ ID NO: 1, aptes à servir de sonde pour l'hybridation ADN-ADN ou
ADN-ARN, parmi de tels fragments, on peut citer la séquence SEQ ID NO:4, correspondant aux positions 207-1208 de la séquence SEQ ID NO:1 (sonde 1000) et les séquences SEQ ID NO:1 et 5 à 21
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de l'ADN génomique ou d'un produit de transcription du gène humain KIN17, par hybridation et/ou amplification génique, réalisé à partir d'un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend
(1) une étape au cours de laquelle l'on met en contact un échantillon biologique à analyser avec au moins une sonde sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1-21 et
(2) une étape au cours de laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique-sonde.
Conformément audit procédé, il peut comprendre, préalablement à l'étape (1) :
une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, et
au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21.
une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, et
au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parmi les séquences SEQ ID NO:5-21.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la sonde de l'étape (1) est éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ladite sonde est constituée par une séquence SEQ ID NO:4.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite paire d'amorces est constituée par une séquence SEQ ID Nô: 16 appariée avec une séquence SEQ ID Nô: 17.
La présente invention a également pour objet une protéine kinl7, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl7 tronquée au niveau d'une région homologue de la protéine recA.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine kinl7 tronquée, elle correspond à une protéine kinl7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les anilnoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine kinl7 tronquée correspond à la protéine kinl7 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129-228 est délété et présente la séquence
SEQ ID NO:22 (séquence dénommée rvmkinl7hRH).
SEQ ID NO:22 (séquence dénommée rvmkinl7hRH).
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine kinl7 tronquée correspond à une protéine kinl7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:23 (séquence dénommée Hskinl7ARH).
La présente invention a également pour objet l'utilisation du fragment compris entre les aminoacides 55-235, éventuellement muté, de préférence le fragment compris entre les aminoacides 129 et 228 d'une protéine kinl7 de mammifère, pour la régulation de l'interaction protéine-ADN courbe.
En effet, l'obtention de mutants dans ce domaine d'interaction protéine-ADN courbe constitue un outil de choix pour bloquer certains processus biologiques comme la prolifération, la traduction ou l'intégration du virus du SIDA dans le génome humain ou pour transporter des protéines effectrices par la construction de fusions protéiques domaine de fixation à l'ADN courbe-enzyme de réparation, à des endroits où l'ADN est courbe ou courbé.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine kinl7 de mammifère, pour la préparation d'un médicament régulant la prolifération cellulaire ou la fertilité.
Conformément à l'invention, on utilise ladite protéine kinl7 de mammifère, pour la préparation d'un médicament inhibant la prolifération cellulaire, notamment destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une hyperprolifération cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:22,
SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 et SEQ ID NO:26.
SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 et SEQ ID NO:26.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence codant pour une protéine kinl7 de mammifère sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID
NO:1, 2, 3.
NO:1, 2, 3.
De manière avantageuse, ledit vecteur est associé à des séquences appropriées de régulation.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 3 et 24 pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire.
De manière préférée, ledit vecteur est un plasmide, il peut être gardé dans des bactéries telles que E. coli , on peut citer, à titre d'exemple, la bactérie
MOSBlue (Amersham, France), qui possède le génotype suivant:
end AI hsdR17 (r m ktz+)sup E44 thi-l rec AI gyr A96 rel AI lac [F' pro A+ B+ lacqIq 2#M15::Tn10(TcR)].
MOSBlue (Amersham, France), qui possède le génotype suivant:
end AI hsdR17 (r m ktz+)sup E44 thi-l rec AI gyr A96 rel AI lac [F' pro A+ B+ lacqIq 2#M15::Tn10(TcR)].
On obtient ainsi des bactéries cMOS transformées
- bactérie PK1 bactérie cMOS transformée avec le plasmide pMOSBlue (Amersham, France) dans lequel l'ADNc HsKinl 7 (défini par la SEQ ID NO: 1) a été introduit;
- bactérie PK2 bactérie cMOS transformée avec le plasmide pCMVDT21 (Bourdon et al., 1997, Oncogene) dans lequel l'ADNc HsKinl 7 (défini par la SEQ ID NO:1) a été introduit.
- bactérie PK1 bactérie cMOS transformée avec le plasmide pMOSBlue (Amersham, France) dans lequel l'ADNc HsKinl 7 (défini par la SEQ ID NO: 1) a été introduit;
- bactérie PK2 bactérie cMOS transformée avec le plasmide pCMVDT21 (Bourdon et al., 1997, Oncogene) dans lequel l'ADNc HsKinl 7 (défini par la SEQ ID NO:1) a été introduit.
Outre les dispositions qui précèdent, I'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels:
- la figure 1 illustre la détection des produits PCR par électrophorèse sur gel. L'ADN est révélé par coloration au bromure d'éthydium. Comme marqueurs de poids moléculaire, des fragments d'ADN de taille connue sont présents dans la colonne A.
- la figure 1 illustre la détection des produits PCR par électrophorèse sur gel. L'ADN est révélé par coloration au bromure d'éthydium. Comme marqueurs de poids moléculaire, des fragments d'ADN de taille connue sont présents dans la colonne A.
- les figures 2A et 2B illustrent la comparaison des séquences nucléiques (figure 2A) et protéiques (figure 2B) HsKinl 7 et ginl 7. Nucléotides = 86 % d'identité, acides aminés = 92,4 % d'identité.
- la figure 3 représente une autoradiographie de l'analyse par hybridation des ARN totaux extraits de différents tissus humains (panneau A) ou de différentes cellules tumorales humaines (panneau B), avec la Sonde-1000 (SEQ ID NO:4).
- la figure 4 illustre la détection de l'ARN messager du gène Kini 7 dans le testicule de souris par hybridation in situ.
- la figure 5 est une représentation schématique des protéines produites par transfection transitoire. La séquence des acides aminés est représentée de façon linéaire. Le nom des protéines est indiqué à gauche de chaque protéine et la taille est mentionnée à droite.
- la figure 6 illustre la détection des cellules HeLa transfectées avec le vecteur pCMVMmKin17. Les noyaux sont colorés en bleu grâce au DAPI. La coloration intranucléaire verte correspond à la localisation de protéine Mmkin17 ; la figure 6A illustre la détection de N*nkinl7 dans des cellules qui expriment un taux faible de protéine Mmkin17 et la figure 6B illustre la détection de Mmkin17 dans des cellules qui expriment un taux fort de protéine kinl7 , agrandissement : x 1000.
- la figure 7 représente des cellules HeLa qui expriment un taux faible de protéine Mmkin17 (avec des foyers intranucléaires présentant un diamètre d'environ 0,5 m; panneau A) ou des cellules qui expriment un taux fort de protéine kinl7 (détection des déformations de la morphologie nucléaire DMN, panneau B).
- la figure 8 représente l'immunodétection de la protéine Mmkin17#RH dans les cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7ARH.
Utilisation de pAbanti-RecA comme premier anticorps (panneau A). Détection avec l'anticorps pAb2064 (panneau B).
- la figure 9 correspond à l'analyse par immunocytochimie et par microscopie en contraste de phase des cellules HeLa qui surproduisent la protéine Mmkin17#CT.
- la figure 10 montre que la déformation de la morphologie nucléaire est corrélée à une inhibition de la réplication de l'ADN. La figure 10A représente l'immunodétection de la protéine Mmkin17#RH (en rouge) et l'incorporation de BrdU (en vert) dans les cellules HeLa exprimant la protéine Mmkin17#RH. Le BrdU (Bromodésoxyuridine) est un analogue de nucléotide (thymidine) qui s'incorpore dans l'ADN au cours de la réplication. La figure 10B est un tableau récapitulatif qui montre l'inhibition de la réplication de l'ADN après formation des DMN, due à l'expression des protéines Mmkin17#RH ou Mmkin17.
- la figure 11 illustre la carte génétique des plasmides pEBVMTh (pB220) et pEBVMTMmkin17 (pB223).
- la figure 12 illustre l'analyse en cytométrie à balayage laser de la protéine Mmkin17 dans les cellules du clone B223.1 : 9 mois après la transfection, à la fois les cellules B223.1 etles cellules B220 sont ensemencées à raison de 3.104 cellules/cm2, trois jours avant de commencer le traitement aux métaux lourds (ZnCl2 100 uM et CdSO4 1 M). 24 heures après, les cellules sont fixées et colorées avec un anticorps anti-RecA spécifique de la protéine as"kinl7. La détection immunocytochimique est réalisée à l'aide du cytomètre ACAS 570 (Meridian Inc.). Les panneaux A et B correspondent aux cellules B223. 1, avec ou sans métaux lourds; les panneaux C et D correspondent aux cellules B220 avec ou sans métaux lourds. Chaque section est analysée en même temps pour la protéine Mmkinl7 (panneau gauche) et l'iodiure de propidium (PI) (panneau droit). Les intensités de fluorescence spécifiques à la protéine
Mmkin17 et au PI sont représentées avec des échelles de fluorescence arbitraires.
Mmkin17 et au PI sont représentées avec des échelles de fluorescence arbitraires.
- la figure 13 illustre la détection immunocytochimique de la protéine
Mmkin17 dans les cellules du clone B223. 1 : 6 mois après la transfection, les cellules
B223.1 et B220 sont ensemencées à raison de 6. 104 cellules ou 104 cellules/cm2, respectivement et traitées, dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 12. La coloration est réalisée avec l'anticorps anti-RecA. Les panneaux A et B correspondent aux cellules B223.l avec ou sans métaux lourds, les panneaux C et D correspondent aux cellules B220 avec ou sans métaux lourds. On utilise un anticorps anti
RecA et un anticorps secondaire conjugué au fluorochrome Cy21M pour détecter la protéine Mmkin17. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000 (Biocom) couplé à un microscope Axiophot 2 (Zeiss) et une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus (agrandissement de chaque panneau : x 100).
Mmkin17 dans les cellules du clone B223. 1 : 6 mois après la transfection, les cellules
B223.1 et B220 sont ensemencées à raison de 6. 104 cellules ou 104 cellules/cm2, respectivement et traitées, dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 12. La coloration est réalisée avec l'anticorps anti-RecA. Les panneaux A et B correspondent aux cellules B223.l avec ou sans métaux lourds, les panneaux C et D correspondent aux cellules B220 avec ou sans métaux lourds. On utilise un anticorps anti
RecA et un anticorps secondaire conjugué au fluorochrome Cy21M pour détecter la protéine Mmkin17. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000 (Biocom) couplé à un microscope Axiophot 2 (Zeiss) et une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus (agrandissement de chaque panneau : x 100).
- la figure 14 montre des cellules polynucléées B223. 1 surexprimant la protéine Mmkin17 : 8 mois après la transfection, des cellules B223.1 sont ensemencées comme précisé ci-dessus (voir figure 12). 24 heures après le traitement aux métaux lourds (100 pLM ZnCl2 et 1 pLM de CdSO4), les cellules sont fixées et colorées avec un anticorps anti-RecA. Agrandissement : (A) x 504 , (B et C) x 1000 (D (D et
F) x 1260 , (E) x 2000. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000.
F) x 1260 , (E) x 2000. La fluorescence est analysée avec un programme Visiolab 1000.
- la figure 15 illustre l'analyse du cycle cellulaire dans des cellules
HEK293 surexprimant la protéine Mmkin17 : 6 mois après la transfection, les cellules sont ensemencées aux mêmes dilutions et trois jours après un traitement aux métaux lourds pendant 24 heures. Les cellules sont récupérées et analysées. Les flèches indiquent les cellules polynucléées.
HEK293 surexprimant la protéine Mmkin17 : 6 mois après la transfection, les cellules sont ensemencées aux mêmes dilutions et trois jours après un traitement aux métaux lourds pendant 24 heures. Les cellules sont récupérées et analysées. Les flèches indiquent les cellules polynucléées.
- la figure 16 illustre l'influence de la surproduction de la protéine ss, kinl7 sur l'efficacité des cellules B223.1 à former des clones : 8 mois après la transfection, les cellules B220, B223.1 et B223.2 sont ensemencées à 103, 102 et 10' cellules/cm2, en présence d'hygromycine B (125 zg/ml). Après 10, 12 et 18 jours en culture, respectivement, les cellules sont fixées et colorées.
- la figure 17 illustre le taux de prolifération des cellules B223. 1 : à différents moments après la transfection, la croissance cellulaire est évaluée. (A) : des cellules sont ensemencées à la même dilution (103 cellules/cm2) en présence d'hygromycine B (125 pg/ml). A différents moments après l'ensemencement, les cellules sont trypsinisées et comptées. (B) : pour évaluer l'efficacité à former des clones, les trois lignées cellulaires sont évaluées à différentes densités : 103/cm2 pour les cellules B220, 2. 103/cm2 pour les cellules B223.2 et 104/cm2 pour les cellules
B223. 1. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence d'hygromycine B (125 Rg/ml). Pour chaque courbe, la moyenne de trois boîtes de culture est calculée -0-: cellules B220 sans hygromycine, --: cellules B220 avec hygromycine ; -#-: cellules B223. 1 sans hygromycine, I : cellules B223. 1 avec hygromycine : -À- cellules B223.2 sans hygromycine, - < -: cellules B223.2 avec hygromycine.
B223. 1. Les expériences sont réalisées en présence ou en l'absence d'hygromycine B (125 Rg/ml). Pour chaque courbe, la moyenne de trois boîtes de culture est calculée -0-: cellules B220 sans hygromycine, --: cellules B220 avec hygromycine ; -#-: cellules B223. 1 sans hygromycine, I : cellules B223. 1 avec hygromycine : -À- cellules B223.2 sans hygromycine, - < -: cellules B223.2 avec hygromycine.
Dans ces figures, les différentes colorations apparaissent sous forme grisée.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Procédé de clonage de l'ADNc du gène Kinl 7 humain (HsKin1 7).
Pour isoler l'ADNc du gène HsKin17, des cellules lymphoblastoïdes humaines, appelées cellules Boleth, qui possèdent un caryotype normal, ont été utilisées. 107 cellules ont été traitées avec une solution dénaturante, les protéines ont été éliminées après centrifugation à 12000 rpm pendant 20 min. à 4 C (RNA-B, Bioprobe,
France). Les ARNs totaux sont récupérés dans la phase aqueuse et précipités par addition d'un volume d'alcool isopropylique à -200C et centrifugés. Après resuspension dans 1 ml d'H20 distillée, les ARNs sont de nouveau précipités à -20 C dans un volume d'alcool isopropylique et 0,2 M de Nazi. Après récupération par centrifugation et rinçage avec de l'éthanol à 70 %, les ARNs sont remis en suspension dans de l'eau et conservés à -800C. Les ARNs ainsi obtenus ont été utilisés par la suite dans la réaction de transcription inverse (RT) des ARNs, pour la synthèse des ADNs complémentaires correspondants. Les ADNc obtenus sont traités par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), en présence d'une polymérase thermostable, pour obtenir un fragment de l'ADNc HsKinl 7.
France). Les ARNs totaux sont récupérés dans la phase aqueuse et précipités par addition d'un volume d'alcool isopropylique à -200C et centrifugés. Après resuspension dans 1 ml d'H20 distillée, les ARNs sont de nouveau précipités à -20 C dans un volume d'alcool isopropylique et 0,2 M de Nazi. Après récupération par centrifugation et rinçage avec de l'éthanol à 70 %, les ARNs sont remis en suspension dans de l'eau et conservés à -800C. Les ARNs ainsi obtenus ont été utilisés par la suite dans la réaction de transcription inverse (RT) des ARNs, pour la synthèse des ADNs complémentaires correspondants. Les ADNc obtenus sont traités par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), en présence d'une polymérase thermostable, pour obtenir un fragment de l'ADNc HsKinl 7.
Obtention dan fragment de 1000 nucléotides de l'ADNc humain par RT-PCR.
Des oligonucléotides, dérivés de la séquence nucléotidique de l'ADNc kinl 7 de souris (couple d'oligonucléotides SEQ ID NO:27 =
TCAAAGACAACTGTTGCTGGC et SEQ ID NO:28 =
ATACCTTCAACTCTGCGTCCTT) ont été utilisés de la façon suivante: 1 g d'ARN totaux ont été mélangé à 5 mM de MgCl2, 1X tampon de PCR, I mM de dNTPs, 1 U/ml d'inhibiteur de RNase, 2,5 mM d'oligo d(T)16 et 2,5 U/ml de transcriptase inverse. Le mélange est incubé 20 min. à température ambiante pour permettre à la séquence d'oligo d(T)16 d'hybrider avec les extrémités polyA+ des ARNs et d'initier la transcriptase inverse. Le mélange est ensuite incubé 20 min. à 42 C puis 5 min. à 990C et 5 min à 50C. Ces différentes incubations permettent la transcription inverse des ARN messagers en ADN complémentaire. La PCR est réalisée en utilisant les oligonucléotides SEQ ID NO:27 et 28 précités. Après PCR, les produits de l'amplification ont été séparés dans un gel d'agarose à 1,5 %. La présence d'ADN est révélée par du bromure d'éthydium (figure 1). Les marqueurs de taille présents dans la colonne A de la figure 1, ont permis de déterminer la taille des produits d'amplification. Un fragment d'ADN de 1000 paires de bases est clairement détectable dans le cas d'une amplification réalisée sur l'ADNc obtenu (colonne C). Par contre, on constate que lorsque l'on omet de mettre l'enzyme qui permet l'étape de transcription inverse, ce fragment d'ADN est absent (colonne B). Ceci démontre bien la présence de l'ARN messager HsKin17 dans les cellules humaines ; le fragment de 1000 paires de bases obtenu (SEQ ID NO:4) n'est pas dû à une contamination d'ADN génomique.
TCAAAGACAACTGTTGCTGGC et SEQ ID NO:28 =
ATACCTTCAACTCTGCGTCCTT) ont été utilisés de la façon suivante: 1 g d'ARN totaux ont été mélangé à 5 mM de MgCl2, 1X tampon de PCR, I mM de dNTPs, 1 U/ml d'inhibiteur de RNase, 2,5 mM d'oligo d(T)16 et 2,5 U/ml de transcriptase inverse. Le mélange est incubé 20 min. à température ambiante pour permettre à la séquence d'oligo d(T)16 d'hybrider avec les extrémités polyA+ des ARNs et d'initier la transcriptase inverse. Le mélange est ensuite incubé 20 min. à 42 C puis 5 min. à 990C et 5 min à 50C. Ces différentes incubations permettent la transcription inverse des ARN messagers en ADN complémentaire. La PCR est réalisée en utilisant les oligonucléotides SEQ ID NO:27 et 28 précités. Après PCR, les produits de l'amplification ont été séparés dans un gel d'agarose à 1,5 %. La présence d'ADN est révélée par du bromure d'éthydium (figure 1). Les marqueurs de taille présents dans la colonne A de la figure 1, ont permis de déterminer la taille des produits d'amplification. Un fragment d'ADN de 1000 paires de bases est clairement détectable dans le cas d'une amplification réalisée sur l'ADNc obtenu (colonne C). Par contre, on constate que lorsque l'on omet de mettre l'enzyme qui permet l'étape de transcription inverse, ce fragment d'ADN est absent (colonne B). Ceci démontre bien la présence de l'ARN messager HsKin17 dans les cellules humaines ; le fragment de 1000 paires de bases obtenu (SEQ ID NO:4) n'est pas dû à une contamination d'ADN génomique.
La séquence du fragment de 1000 paires de bases est déterminée selon la technique de séquençage automatique décrite dans Tissier A. et al., 1996, précité. La séquence SEQ ID NO:4, correspondant à un fragment de l'ADNc HsKinl 7 est identique à 86 % à celle de souris MmKin17. Le polypeptide codé est identique à 92,4 %. C'est l'isolement de ce fragment de l'ADNc HsKinl7 qui a effectivement permis d'entreprendre le clonage de l'ADNc HsKinl 7 complet (Figure 2 : Comparaison des séquences des fragrnents d'ADNc HsKinl 7 avec l'ADNc Kinl 7 de souris).
EXEMPLE 2 : Criblage d'une banque d'ADNc humain : clonage et détermination de la séquence nucléotidique de I'ADN complémentaire du gène HsKinl 7.
Le fragment radiomarqué de 1000 paires de bases de l'ADNc du gène HsKinl 7 (appelée Sonde-1000; SEQ ID NO:4) a été utilisé comme sonde pour cribler une banque d'ADNc humains obtenus à partir d'ARNs messagers exprimés dans des testicules et insérés dans le vecteur Xgt 11. L'ADN des phages qui hybrident avec la sonde ont été purifiés et l'ADNc humain a été séquencé.
PROTOCOLE : La banque a été obtenue à partir d'ARN poly A+ purifiés à partir de testicules humains. Les ADN complémentaires ont été obtenus en utilisant comme amorce une séquence de poly d(T). Après transcription inverse et dégradation des ARNs qui ont servi de matrice, des séquences nucléotidiques correspondant au site de restriction de l'enzyme de digestion EcoRI ont été greff série des filtres est mise en contact pendant 2 min. avec les plages de lyses, à la surface de la boîte. Ils seront traités de la meme façon que la première empreinte. Les boîtes contenant les phages sont conservées à 40C dans l'obscurité. L'ADN fixé sur les filtres est alors hybridé avec la sonde-1000 radiomarquée (Maniatis et al., Molecular
Cloning, a Laboratory Manuel, 1989). La deuxième série des filtres avec des empreintes ont été hybridés avec une sonde radiomarquée correspondant à l'ADNc Kil 7 de souris (Angulo et al., N.A.R., 1991, précité).
b) Hybridation des ADNs recombinants et détection des phages qui s'hybrident avec la sonde.
Cloning, a Laboratory Manuel, 1989). La deuxième série des filtres avec des empreintes ont été hybridés avec une sonde radiomarquée correspondant à l'ADNc Kil 7 de souris (Angulo et al., N.A.R., 1991, précité).
b) Hybridation des ADNs recombinants et détection des phages qui s'hybrident avec la sonde.
Six filtres ont été placés chacun dans un tube et incubés pendant 3 heures à 65 C dans la solution d'hybridation (5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,5 % SDS), en présence de 50 g/ml final d'ADN de sperme de hareng soniqué (préalablement dénaturé à 100 C, pendant 10 min., puis placé dans la glace).
b-l)-Marquage radioactif des sondes: 30 ng d'ADN correspondant au fragment de 1000 pdb de l'ADNc HsKin17 (sonde-1000 de séquence SEQ ID NO:4) ou correspondant à l'ADNc Kinl7 de souris (sonde-1400) ont été chauffés 10 min. à 100 C et incubés en présence d'amorces (hexamères), d'un désoxyribonucléotide marqué au phosphore radioactif ([α-32P]-dCTP), des trois autres désoxyribonucléotides triphosphates non radioactifs et de la fraction Klenow de la polymérase
I d'E. coli. Le marquage est effectué à 370C pendant 30 min., puis la sonde est purifiée sur tamis moléculaire (SEPHADEX G50, Pharmacia). Le taux d'incorporation de la radioactivité est mesuré à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. L'activité spécifique des sonde-1000 et sonde-1400 étaient de 0,8-3x108 cpm/g (Random
Primed DNA Labeling Kit. Boehringer).
b-2)- Hybridanon: Les filtres sont incubés dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde-1000 (SEQ ID NO:4) ou la sonde-1400 radiomarquée (préalablement dénaturée à 100 C pendant 10 min.) a été ajoutée.
b-l)-Marquage radioactif des sondes: 30 ng d'ADN correspondant au fragment de 1000 pdb de l'ADNc HsKin17 (sonde-1000 de séquence SEQ ID NO:4) ou correspondant à l'ADNc Kinl7 de souris (sonde-1400) ont été chauffés 10 min. à 100 C et incubés en présence d'amorces (hexamères), d'un désoxyribonucléotide marqué au phosphore radioactif ([α-32P]-dCTP), des trois autres désoxyribonucléotides triphosphates non radioactifs et de la fraction Klenow de la polymérase
I d'E. coli. Le marquage est effectué à 370C pendant 30 min., puis la sonde est purifiée sur tamis moléculaire (SEPHADEX G50, Pharmacia). Le taux d'incorporation de la radioactivité est mesuré à l'aide d'un compteur à scintillation liquide. L'activité spécifique des sonde-1000 et sonde-1400 étaient de 0,8-3x108 cpm/g (Random
Primed DNA Labeling Kit. Boehringer).
b-2)- Hybridanon: Les filtres sont incubés dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde-1000 (SEQ ID NO:4) ou la sonde-1400 radiomarquée (préalablement dénaturée à 100 C pendant 10 min.) a été ajoutée.
L'incubation est réalisée pendant 16 heures à 65 C. Après hybridation, les filtres sont lavés de la façon suivante 3 lavages de 10 min. dans du tampon 2 X SSC, 0,1 % SDS à température arnbiante, 1 lavage de 45 min. dans du tampon 1 X SSC, 0,1 % SDS à 65 C.
Après élimination de l'excès de radioactivité, les filtres sont mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) qui sont placés à - 80"C pendant 16 heures.
c) Isolement des phages qui possèdent l > ADNc du gène ssKinl 7.
c) Isolement des phages qui possèdent l > ADNc du gène ssKinl 7.
Les plages de lyse qui ont donné un résultats positif par autoradiographie ont été repérées sur les boltes de Pétri et prélevées et remises en suspension dans 100-300 u1 de tampon SM (0,1 M NaCl, 10-3 M SO4, 0,02 M Tris-HCl pH 7,5, 0,01 % de gélatine) contenant 5 ul de chloroforme. Le meme protocole utilisé pour le criblage permet par la suite de purifier les phages positifs ainsi que leur ADN pour déterminer la taille des inserts et la séquence de l'ADNc.
Purification de l'ADN du phage kgtll et détermination de la séquence nucléotidique de l'ADN complémentaire du gène sbKinl 7.
On procède comme décrit dans le Brevet français n 2 706 487
EXEMPLE 3 : Méthodes de caractérisation de l'expression du gène Kinl7 par détection de l'ARN messager et de la protéine codée.
EXEMPLE 3 : Méthodes de caractérisation de l'expression du gène Kinl7 par détection de l'ARN messager et de la protéine codée.
Immunodéteciion de la protéine kin 17 (de souris et humaine) dans des cellules en culture
Les cellules cultivées sur lamelles sont lavées 3 fois avec du PBS, puis fixées à l'aide d'une solution de méthanol acétone (3v/7v) pendant 10 minutes à 20"C. L'immunodétection est ensuite réalisée à température ambiante en chambre humide. Après réhydratation des cellules pendant 10 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées 10 min. dans une solution de 3% de H202 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. avec du PBS, les lamelles sont incubées 30 min. dans 5 % de sérum de chèvre dans du PBS. Les lamelles sont ensuite rincées 3 fois 5 min. dans du PBS, puis incubées pendant 2 heures avec un anticorps dirigé contre la protéine kinl7, dénommé pAb2064 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité) ou un anticorps anti-RecA, dilué au 1/100 dans du PBS. Après 3 rinçages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de lapin biotinylé, produit chez la chèvre, dilué au 1/200 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont recouvertes pendant 30 min. avec le réactif ABC (Vectastain, Elite ABC
Kit, Vector Laboratories) qui contient de l'avidine et de la peroxydase de raifort biotinylée, puis de nouveau rincées 3 fois 5 min. dans du PBS. La peroxydase est révélée par la diaminobenzidine (Polysciences Inc.), utilisée à la concentration de 0,5 mg/ml en présence de 0,01% de H202 dans du tampon Tris pH 7,4. La réaction est arrêtée après quelques minutes, par immersion des lamelles dans l'eau. Les lamelles sont ensuite montées avec Aquamount amélioré (BDH, Gurr) et observées avec un microscope
AXIOPHOTE 2 de Carl ZEISS équipé pour l'immunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie (caméra CCD, Coolview, Photonic Science, UK) qui est contrôlée par un ordinateur.
Les cellules cultivées sur lamelles sont lavées 3 fois avec du PBS, puis fixées à l'aide d'une solution de méthanol acétone (3v/7v) pendant 10 minutes à 20"C. L'immunodétection est ensuite réalisée à température ambiante en chambre humide. Après réhydratation des cellules pendant 10 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées 10 min. dans une solution de 3% de H202 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. avec du PBS, les lamelles sont incubées 30 min. dans 5 % de sérum de chèvre dans du PBS. Les lamelles sont ensuite rincées 3 fois 5 min. dans du PBS, puis incubées pendant 2 heures avec un anticorps dirigé contre la protéine kinl7, dénommé pAb2064 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité) ou un anticorps anti-RecA, dilué au 1/100 dans du PBS. Après 3 rinçages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont incubées avec un anticorps anti-immunoglobulines de lapin biotinylé, produit chez la chèvre, dilué au 1/200 dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min. dans du PBS, les lamelles sont recouvertes pendant 30 min. avec le réactif ABC (Vectastain, Elite ABC
Kit, Vector Laboratories) qui contient de l'avidine et de la peroxydase de raifort biotinylée, puis de nouveau rincées 3 fois 5 min. dans du PBS. La peroxydase est révélée par la diaminobenzidine (Polysciences Inc.), utilisée à la concentration de 0,5 mg/ml en présence de 0,01% de H202 dans du tampon Tris pH 7,4. La réaction est arrêtée après quelques minutes, par immersion des lamelles dans l'eau. Les lamelles sont ensuite montées avec Aquamount amélioré (BDH, Gurr) et observées avec un microscope
AXIOPHOTE 2 de Carl ZEISS équipé pour l'immunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie (caméra CCD, Coolview, Photonic Science, UK) qui est contrôlée par un ordinateur.
Détection de l'ARN messager du gène ,Kin1 7 par hybridation in situ dans les lymphocytes T.
Les lymphocytes humains, déposés sur les lames par cytocentrifriga- tion, ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min., rincés au PBS puis déshydratés par passages successifs dans des solutions à 70 %, 90 % et 100 % d'alcool, avant d'être conservés à -800C. Après hydratation dans du PBS, toutes les étapes de la détection ont été réalisées dans une chambre humide. Les lames sont incubées pendant 10 min. avec une solution de H202 à 3% dans du PBS, puis rincées 3 fois 5 min. dans du PBS. Les lames sont successivement traitées pendant 10 min. par des solutions de glycine 0,1 M dans du PBS et de Triton X-100, 0,3 % également dans du
PBS avant d'être incubées pendant 2 heures à 37 C dans le tampon de préhybridation (50 % de formamide désionisé, SSC 4x, solution de Denhardt lx, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0, 125 mg/ml d'ARN de transfert et 0,8 % de sarcosyle).
PBS avant d'être incubées pendant 2 heures à 37 C dans le tampon de préhybridation (50 % de formamide désionisé, SSC 4x, solution de Denhardt lx, 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon, 0, 125 mg/ml d'ARN de transfert et 0,8 % de sarcosyle).
Marquage de l'oligonucléotide à la dioxygénine.
On utilise 100 pm d'un oligonucléotide synthétique de 40 nucléotides (SEQ ID NO:16 ou 17) et marqués par la Dig-11-dUTP à l'extrémité 3', à l'aide de la trousse Boehringer Mannheim (Dig Oligonucléotides Tailing Kit. Réf. 1417231). Le marquage des sondes est contrôlé à l'aide d'un anticorps anti-digoxygénine, couplé à la phosphatase alcaline (révélation par une solution de NBT-BCIP).
Conditions d'hybridation et révélation des hybrides.
Sur chaque lame comprenant des lymphocytes fixés, ont été déposés 100 ul de solution d'hybridation composée de 4 pmoles de sonde marquée pour 96 u1 de tampon de préhybridation. L'hybridation est réalisée à 37 C pendant 16 heures.
La révélation a été réalisée à l'aide de la trousse TSAaM Direct (kit
NEN Réf. NEL 731). Après hybridation, les lames sont lavées successivement 3 fois pendant 10 min. dans du tampon SSC2X, SSC1X, SSC0, 5X à température ambiante, puis 3 fois pendant 5 min. dans du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCI 0,15 M,
Tween-20 0,05 % (TNT). Les cellules sont ensuite incubées avec un tampon de blocage composé de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0, 15 M et 0,5 % de réactif bloquant pendant 30 min. Après blocage, l'immunodétection est réalisée pendant 90 min. avec un anticorps anti-digoxygénine couplé à la peroxydase (Boerhinger Mannheim, Ref 1207733 ). L'anticorps est utilisé à une dilution au 1/100 dans le tampon de blocage de la trousse d'hybridation (TSATM Direct). L'incubation est suivie de 3 rinçages de 5 min. dans le tampon TNT puis la peroxydase est détectée par action de la tyramide couplée à la fluorescéine pendant 5 nun. comme décrit par le fournisseur (TSA1M Direct, NEN).
NEN Réf. NEL 731). Après hybridation, les lames sont lavées successivement 3 fois pendant 10 min. dans du tampon SSC2X, SSC1X, SSC0, 5X à température ambiante, puis 3 fois pendant 5 min. dans du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCI 0,15 M,
Tween-20 0,05 % (TNT). Les cellules sont ensuite incubées avec un tampon de blocage composé de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0, 15 M et 0,5 % de réactif bloquant pendant 30 min. Après blocage, l'immunodétection est réalisée pendant 90 min. avec un anticorps anti-digoxygénine couplé à la peroxydase (Boerhinger Mannheim, Ref 1207733 ). L'anticorps est utilisé à une dilution au 1/100 dans le tampon de blocage de la trousse d'hybridation (TSATM Direct). L'incubation est suivie de 3 rinçages de 5 min. dans le tampon TNT puis la peroxydase est détectée par action de la tyramide couplée à la fluorescéine pendant 5 nun. comme décrit par le fournisseur (TSA1M Direct, NEN).
Après 3 lavages de 5 min. dans le TNT, les cellules sont colorées avec une solution de 10-3 Rg/ml de 4',6-diamidino-2 phénylindole (DAPI) pendant 10 min. Les lames sont ensuite rincées dans le tampon TNT avant d'être montées à l'aide du Vectasheilds, un produit de montage protecteur de la fluorescence (Vector Laboratories, ref: H-1000).
La fluorescéine est observée à 525 nm et le DAPI à 425 nm avec un microscope
AXIOPHOTE 2 de Carl ZEISS équipé pour l'immunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus.
AXIOPHOTE 2 de Carl ZEISS équipé pour l'immunofluorescence indirecte et avec une caméra refroidie, comme précisé ci-dessus.
Détection de l'ARN messager du gène MmKin1 7 par hybridation in situ dans les testicules de souris.
Les testicules sont prélevés et inclus immédiatement à -200C dans le milieu d'inclusion OCT (OCT compound, Tissue-Tek, Miles. Réf. 4583). Des coupes de 10 um d'épaisseur sont réalisées au cryostat à -200C. Elles ont été utilisées immédiatement ou congelées et gardées à -800C jusqu'à utilisation. La première étape est la fixation au paraformaldéhyde 4 %, puis le protocole est identique a celui décrit cidessus, pour la détection du gène humain dans les lymphocytes T. Les sondes utilisées pour la souris sont les oligonucléotides synthétiques: sonde anti-sens = 5'-CCA GGC
CTC TTC TCA CCT GCT CCT CAATGA ACT TGG CAG T-3' (SEQ ID NO:17) et sonde sens 5'-ACT GCC AAG TTC ATT GAG GAG CAG GTG AGA AGA GGC
CTG G-3' (SEQ ID NO: 16). On observe une hybridation spécifique au niveau des spermatocytes zygotènes (Figure 4).
CTC TTC TCA CCT GCT CCT CAATGA ACT TGG CAG T-3' (SEQ ID NO:17) et sonde sens 5'-ACT GCC AAG TTC ATT GAG GAG CAG GTG AGA AGA GGC
CTG G-3' (SEQ ID NO: 16). On observe une hybridation spécifique au niveau des spermatocytes zygotènes (Figure 4).
Détection de l'ARN messager du gène NsKinl 7 par hybridation des
ARN immobilisés sur membrane avec une sonde d'ADN radiomarquée.
ARN immobilisés sur membrane avec une sonde d'ADN radiomarquée.
La quantité de transcrit Kinl7 présent dans différents tissus est déterminée par la méthode de Northern (électrophorèse, transfert et hybridation des
ARNs). On utilise des membranes de Nylon sur lesquelles 2 ug d'ARN poly A+ de différents tissus humains sont transférés (coeur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas, rate, thymus, prostate, testicule, ovaire, petit intestin, colon et lymphocyte du sang périphérique, MTN, Clontech). La préhybridation et l'hybridation sont effectuées dans un four (hybridization oven/shaker d'Amersham). La membrane est placée dans des tubes et incubée à 42 C pendant 5 heures avec 15 ml de solution d'hybridation (50 % formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,5 %
SDS) en présence de 50 ugimi final d'ADN de sperme de hareng soniqué (préalablement dénaturé à 100 C pendant 10 min. puis placé dans la glace). La membrane est ensuite incubée dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde1000 radiomarquée (SEQ ID NO:4) (préalablement dénaturée à 100 C pendant 10 min) a été ajoutée. L'incubation est réalisée pendant 16 heures à 42"C. Pour éliminer l'excès de sonde, la membrane est lavée deux fois 20 min., à température ambiante dans du 2 X SSC, 0,1 % SDS, deux fois 15 min., à 42 C dans du 0,5 X SSC, 0,1 %
SDS puis une fois 15 min., à 60 C dans du 0,1X SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont ensuite mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) ou Hyperfilm-MP (Amersham) à -80"C pendant 60-100 heures. Le panneau A de la Figure 3 montre l'autoradiographie obtenue après hybridation des ARN totaux extraits de différents tissus humains avec la Sonde-1000. fl existe une expression préférentielle du gène EiKinl7 dans certains tissus comme le testicule, l'ovaire, le coeur, le muscle squelettique ou le petit intestin alors qu'il est pratiquement indécelable dans d'autre tissus comme le rein, le poumon ou le cerveau.
ARNs). On utilise des membranes de Nylon sur lesquelles 2 ug d'ARN poly A+ de différents tissus humains sont transférés (coeur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas, rate, thymus, prostate, testicule, ovaire, petit intestin, colon et lymphocyte du sang périphérique, MTN, Clontech). La préhybridation et l'hybridation sont effectuées dans un four (hybridization oven/shaker d'Amersham). La membrane est placée dans des tubes et incubée à 42 C pendant 5 heures avec 15 ml de solution d'hybridation (50 % formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,5 %
SDS) en présence de 50 ugimi final d'ADN de sperme de hareng soniqué (préalablement dénaturé à 100 C pendant 10 min. puis placé dans la glace). La membrane est ensuite incubée dans la solution d'hybridation dans laquelle la sonde1000 radiomarquée (SEQ ID NO:4) (préalablement dénaturée à 100 C pendant 10 min) a été ajoutée. L'incubation est réalisée pendant 16 heures à 42"C. Pour éliminer l'excès de sonde, la membrane est lavée deux fois 20 min., à température ambiante dans du 2 X SSC, 0,1 % SDS, deux fois 15 min., à 42 C dans du 0,5 X SSC, 0,1 %
SDS puis une fois 15 min., à 60 C dans du 0,1X SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont ensuite mis en contact avec des films X-OMAT AR (Kodak) ou Hyperfilm-MP (Amersham) à -80"C pendant 60-100 heures. Le panneau A de la Figure 3 montre l'autoradiographie obtenue après hybridation des ARN totaux extraits de différents tissus humains avec la Sonde-1000. fl existe une expression préférentielle du gène EiKinl7 dans certains tissus comme le testicule, l'ovaire, le coeur, le muscle squelettique ou le petit intestin alors qu'il est pratiquement indécelable dans d'autre tissus comme le rein, le poumon ou le cerveau.
EXEMPLE 4 : Détection de l'ARN itiÇini 7 dans des lignées tumorales humaines.
Le taux d'ARN messager FssKinl Z dans différentes cellules dérivées des tumeurs humaines (leucémie promyélocytaire (HL60), adénocarcinome de la glande cervicale (HeLa S3), leucémie myéloïde chronique (K-562), leucémie lymphoblastique (MOLT-4), lymphome de Burkitt Raji, adénocarcinome colorectal (SW480), carcinome du poumon (A549, mélanome (G361)) a été déterminé. Le protocole de détection du transcrit HsKinl7 utilisé est le même que celui décrit pour la détection de l'ARN Kil 7 dans les tissus humains (voir exemple 3). On utilise une membrane sur
laquelle 2 g d'ARN poly A+ de différentes cellules tumorales ont été immobilisés (MTN, Clontech). Le panneau B de la Figure 3 représente l'autoradiographie obtenue après hybridation de la sonde-1000 avec les ARN totaux extraits de différents cellules tumorales humaines, Après quantification des signaux obtenus pour l'ARN HsKin1 7 par rapport à ceux calculé pour l'ARN d'actine, on constate que l'expression du gène
HsKinl 7 est très variable suivant la lignée : on observe une expression très faible dans les cellules HL60, alors qu'on observe une différence d'un facteur 15 dans les cellules
K-562 ou d'un facteur 10 dans les cellules dérivées de l'adénocarcinome colorectale.
laquelle 2 g d'ARN poly A+ de différentes cellules tumorales ont été immobilisés (MTN, Clontech). Le panneau B de la Figure 3 représente l'autoradiographie obtenue après hybridation de la sonde-1000 avec les ARN totaux extraits de différents cellules tumorales humaines, Après quantification des signaux obtenus pour l'ARN HsKin1 7 par rapport à ceux calculé pour l'ARN d'actine, on constate que l'expression du gène
HsKinl 7 est très variable suivant la lignée : on observe une expression très faible dans les cellules HL60, alors qu'on observe une différence d'un facteur 15 dans les cellules
K-562 ou d'un facteur 10 dans les cellules dérivées de l'adénocarcinome colorectale.
Les cellules tumorales semblent donc réguler différemment l'expression du gène ',sKifll 7.
EXEMPLE 5 : Etude de la surexpression transitoire de la protéine kinl7 de souris (Mmkin17) et de ses formes tronquées dans des cellules humaines.
On a observé que les fibroblastes BALB/c 3T3 lorsqu'ils sont stimulés à proliférer présentent une accumulation intranucléaire de la protéine Mllkinl7 dans les cellules en phase S (réplication de l'ADN). Pour mieux cerner le rôle de la protéine kinl7 sur la prolifération cellulaire, on a testé l'effet d'une surexpression de la protéine
Mmkin17 sur la prolifération cellulaire. Un système de transfection transitoire, qui permet de surexprimer la protéine Mmkin17 dans les cellules de mammifères en culture, a été utilisé. Les vecteurs obtenus expriment bien la protéine Mmkin17 (vérification par des techniques d'immunofluorescence indirecte à l'aide des anticorps polyclonaux pAb2064 dirigés contre la protéine Mmkin17 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité et Brevet français n 2 706 487).
Mmkin17 sur la prolifération cellulaire. Un système de transfection transitoire, qui permet de surexprimer la protéine Mmkin17 dans les cellules de mammifères en culture, a été utilisé. Les vecteurs obtenus expriment bien la protéine Mmkin17 (vérification par des techniques d'immunofluorescence indirecte à l'aide des anticorps polyclonaux pAb2064 dirigés contre la protéine Mmkin17 (Biard et al., Arch. Dermatol., 1997, précité et Brevet français n 2 706 487).
On observe l'effet de la surexpression transitoire de différentes formes tronquées de la protéine kinl7 sur la prolifération cellulaire.
Construction des vecteurs d'expression eucaryotes.
Tous les plasmides utilisés pour cette étude ont été construits à partir du vecteur pCMVDT21 qui permet une expression élevée du transgène (Bourdon et al., 1997). La phase ouverte de lecture de l'ADNc Kinl7 de souris (Angulo et al., 1991, N.A.R., précité) est insérée dans le vecteur pCMVDT21 digéré par l'enzyme de restriction XhoI pour obtenir le plasmide pCMVKinl7. On utilise aussi l'ADNc appelé Jinl 7ACT. Il correspond à une délétion du fragment compris entre le nucléotide 854 et le nucléotide 1034 de l'ADNc MrflKinI7, et a déjà été décrit (Mazin et al., 1994, précité). Cet ADNc code pour une protéine tronquée dans sa région C-terminale, nommée protéine kinl7ACT (délétée dans la région C-terminale), qui a un poids moléculaire de 32407 Daltons. Cet ADNc KinI 7ACT est inséré dans le vecteur pCMVDT21 , on obtient ainsi le plasmide pCMVKinl7ACT. Un deuxième mutant est obtenu en délétant l'ANDc MmKin17 du nucléotide 412 au nucléotide 705. Un tel acide nucléique code pour une protéine tronquée (absence de 99 amino-acides entre les résidus 129 et 228), au niveau d'une région contenant la séquence homologue à la protéine
RecA. Cette protéine mutée a été nommée Mkinl7A (délétée dans la Région
Homologue). L'ADNc sKinl 7ARH est généré de la façon suivante:
a) Amplification par PCR de la région 5' de l'ADNc h~Kinl 7 (entre les nucléotides 1 à 411) à partir du vecteur pcD2Kinl7 (Angulo et al., 1991) en utilisant le couple d'oligonucléotides: 5'-AAGCTGCTGCAGCAGCTTATCGGG-3' (SEQ ID NO:29) et 5'-GGTACCTTTACACAAGCCCTCTCGCC-3' (SEQ ID NO:30).
b) Amplification par PCR de la région 3' de l'ADNc MmKin17 (entre les nucléotides 706-1352) en utilisant les amorces 5'-GGTACCAGTGCACTGAAGCTGCTGGGG-3' (SEQ ID NO:31) et 5'-ATTTACCCAACTATTCACTA -3' (SEQ ID NO:32).
RecA. Cette protéine mutée a été nommée Mkinl7A (délétée dans la Région
Homologue). L'ADNc sKinl 7ARH est généré de la façon suivante:
a) Amplification par PCR de la région 5' de l'ADNc h~Kinl 7 (entre les nucléotides 1 à 411) à partir du vecteur pcD2Kinl7 (Angulo et al., 1991) en utilisant le couple d'oligonucléotides: 5'-AAGCTGCTGCAGCAGCTTATCGGG-3' (SEQ ID NO:29) et 5'-GGTACCTTTACACAAGCCCTCTCGCC-3' (SEQ ID NO:30).
b) Amplification par PCR de la région 3' de l'ADNc MmKin17 (entre les nucléotides 706-1352) en utilisant les amorces 5'-GGTACCAGTGCACTGAAGCTGCTGGGG-3' (SEQ ID NO:31) et 5'-ATTTACCCAACTATTCACTA -3' (SEQ ID NO:32).
Les deux produits d'amplification sont ensuite ligués entre eux au site
KpnI (séquence soulignée). Le séquençage de la jonction des deux fragments a montré que le cadre de lecture de la protéine kinl7 est intacte. L'ADN ainsi obtenu est inséré dans le vecteur pCMVDT21 pour donner le plasmide pCMVKin17#RH.
KpnI (séquence soulignée). Le séquençage de la jonction des deux fragments a montré que le cadre de lecture de la protéine kinl7 est intacte. L'ADN ainsi obtenu est inséré dans le vecteur pCMVDT21 pour donner le plasmide pCMVKin17#RH.
La Figure 5 montre la représentation schématique des différentes protéines exprimées. La séquence des acides aminés est représentée de façon linéaire.
Le nom des protéines est indiqué à gauche de chaque protéine et la taille est mentionnée à droite. La Région Homologue à la protéine RecA (RH, aa 163 à 201) et le Signal de Localisation Nucléaire (SLN, aa 235 à 285) sont présentés dans des rectangles hachurés. Les résidus délétés sont numérotés en fonction de leur position respective dans la séquence de la protéine kinl7 et sont indiqués comme des discontinuités.
Transfection transitoire de vecteurs d'expression dans les cellules humaines.
Les différentes constructions ont été transfectées dans des cellules
HeLa, qui sont des cellules humaines issues d'un adénocarcinome de la glande cervicale (référence ATCC CCL-2). On obtient 10 % de cellules transfectées. La transfection s'effectue de la façon suivante : les cellules HeLa sont ensemencées dans des boîtes de 35 mm de diamètre dans lesquelles une lamelle de verre a préalablement été déposée. Les cellules sont incubées dans un milieu DMEM contenant 4,5 g/l de glucose, 10 % de sérum de veau foetal et 1 % de pénicilline-streptomycine à une densité de 2x105 cellules par boîte. 24 heures plus tard, les cellules sont incubées avec le mélange suivant : pour chaque transfection, on mélange 3 ug d'ADN à 10 AI de CaC12 2,5 M dans un volume final de 100 ul. Le précipité est homogénéisé et additionné goutte à goutte à 100 AI de tampon de transfection (274 mM NaCl , 1 mM KCl; 1,5 mM Na2HPO4, 12 H20 ; 11 mM D(+) Glucose ; 25 mM HEPES ; ajusté à pH 7,15 et stérilisé par filtration). Le mélange est incubé pendant 20 minutes à température ambiante puis déposé goutte à goutte sur les cellules. L'incubation dure 16 heures à 37"C. Les cellules sont ensuite rincées 3 fois avec du PBS, puis remises dans du milieu DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine pendant 24 heures à 37"C. Les cellules humaines transfectées sont fixées avec une solution de méthanol/acétone (3v/7v) à -200c pendant 10 min., puis séchées à température ambiante pendant 10 min., afin d'analyser par immunofluorescence indirecte la localisation de la protéine skinl7 surproduite.
HeLa, qui sont des cellules humaines issues d'un adénocarcinome de la glande cervicale (référence ATCC CCL-2). On obtient 10 % de cellules transfectées. La transfection s'effectue de la façon suivante : les cellules HeLa sont ensemencées dans des boîtes de 35 mm de diamètre dans lesquelles une lamelle de verre a préalablement été déposée. Les cellules sont incubées dans un milieu DMEM contenant 4,5 g/l de glucose, 10 % de sérum de veau foetal et 1 % de pénicilline-streptomycine à une densité de 2x105 cellules par boîte. 24 heures plus tard, les cellules sont incubées avec le mélange suivant : pour chaque transfection, on mélange 3 ug d'ADN à 10 AI de CaC12 2,5 M dans un volume final de 100 ul. Le précipité est homogénéisé et additionné goutte à goutte à 100 AI de tampon de transfection (274 mM NaCl , 1 mM KCl; 1,5 mM Na2HPO4, 12 H20 ; 11 mM D(+) Glucose ; 25 mM HEPES ; ajusté à pH 7,15 et stérilisé par filtration). Le mélange est incubé pendant 20 minutes à température ambiante puis déposé goutte à goutte sur les cellules. L'incubation dure 16 heures à 37"C. Les cellules sont ensuite rincées 3 fois avec du PBS, puis remises dans du milieu DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % de pénicilline-streptomycine pendant 24 heures à 37"C. Les cellules humaines transfectées sont fixées avec une solution de méthanol/acétone (3v/7v) à -200c pendant 10 min., puis séchées à température ambiante pendant 10 min., afin d'analyser par immunofluorescence indirecte la localisation de la protéine skinl7 surproduite.
Détection de la protéine kinl7 par immunofluorescence indirecte.
Les cellules fixées sont réhydratées 10 min. dans du PBS, puis incubées en chambre humide lh30 à 37"C avec l'anticorps pAb2064 dilué au 1/100 dans du
PBS en présence de 3 % BSA. Après 3 lavages de 5 minutes dans du PBS à température ambiante et sous agitation, les cellules sont incubées avec le deuxième anticorps anti-immunoglobulines de lapin produit chez la chèvre, couplé au fluorochrome Cy 2 (Jackson Immuno Research Laboratories), dilué au 1/500, pendant 45 minutes à 370C et dans l'obscurité. Les lamelles sont ensuite lavées 3 fois 10 minutes dans du PBS et incubées dans une solution de 10-3 ug/ml de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Les lamelles sont ensuite rincées à l'eau avant d'être collées sur une lame avec un produit de montage (Glycergel, Dako).
PBS en présence de 3 % BSA. Après 3 lavages de 5 minutes dans du PBS à température ambiante et sous agitation, les cellules sont incubées avec le deuxième anticorps anti-immunoglobulines de lapin produit chez la chèvre, couplé au fluorochrome Cy 2 (Jackson Immuno Research Laboratories), dilué au 1/500, pendant 45 minutes à 370C et dans l'obscurité. Les lamelles sont ensuite lavées 3 fois 10 minutes dans du PBS et incubées dans une solution de 10-3 ug/ml de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Les lamelles sont ensuite rincées à l'eau avant d'être collées sur une lame avec un produit de montage (Glycergel, Dako).
La Figure 6 correspond à une photographie des cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7 contenant l'ADNc MmKifll7 sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus. Le marquage de l'ADN par le DAPI permet de distinguer, colorés en bleu, les noyaux des cellules. La coloration intranucléaire verte correspond au marquage indirect de la protéine Mmkin17 surproduite dans les cellules transfectées.
La protéine M"kinl7 est localisée essentiellement dans des foyers intranucléaires discrets.
On a détecté des cellules qui expriment un taux faible de protéine Ns, kinl7. La localisation est clairement nucléaire et on observe une concentration de la protéine Mmkin17 dans des foyers intranucléaires d'un diamètre d'environ 0,5 m (Figure 7 A). Lorsque la protéine kinl7 est exprimée en grande quantité, elle forme des foyers intranucléaires plus gros, avec des dimensions similaires, voire plus grandes que les nucléoles (Figure 7B). Ce résultat montre que la protéine kinl7 produite par le vecteur pCMVKinl7 s'exprime, que les anticorps pAb2064 reconnaissent sa forme native et qu'elle présente une localisation nucléaire. Ces résultats confirment qu'in vivo, le signal de localisation nucléaire est bien fonctionnel. La localisation de la protéine
Mmkin17 dans des foyers intranucléaires discrets semble refléter la compartimentalisation fonctionnelle des processus biologiques qui ont lieu dans le noyau. En effet, des profils similaires ont déjà été observés pour d'autres protéines impliquées, soit dans le complexe multiprotéique de réplication, soit dans le complexe de transcription ou encore pour des protéines intervenant dans l'épissage alternatif des ARNm.
Mmkin17 dans des foyers intranucléaires discrets semble refléter la compartimentalisation fonctionnelle des processus biologiques qui ont lieu dans le noyau. En effet, des profils similaires ont déjà été observés pour d'autres protéines impliquées, soit dans le complexe multiprotéique de réplication, soit dans le complexe de transcription ou encore pour des protéines intervenant dans l'épissage alternatif des ARNm.
La surexpression de la protéine kinI7ARH conduit à la formation d'aggrégats intranucléaires.
Le vecteur pCMVKinl7ARH est transfecté dans les cellules humaines dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. La détection de la protéine Mmkin17#RH par la méthode d'immunofluorescence indirecte est réalisée soit en utilisant l'anticorps anti-kinl7 (pAb2064) ou l'anticorps anti-RecA (Brevet français n 2 706 487, Angulo et al., Biochimie, 1991, précité). On observe que l'anticorps pAbanti-RecA est incapable de détecter la protéine Mmkin17#RH (Figure 8, panneaux A: cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKin17#RH et traitées pour l'immunodétection avec l'anticorps pAbanti-RecA). Ceci démontre que la région homologue à la protéine RecA est effectivement responsable de la réactivité croisée entre la protéine kil 7 et les anticorps pAbanti-RecA. En revanche, la protéine kinl7ARH est facilement détectée en utilisant l'anticorps pAb2064 (Figure 8, panneaux
B : cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7ARH et traitées pour l'îmmunodétection avec l'anticorps pAb2064). On observe une coloration verte nucléaire correspondant au marquage indirect de la protéine kinl7SH surproduite dans les cellules transfectées. Les noyaux des cellules sont colorés avec le DAPI. La distribution de la protéine Mmkin17#RH est différente de celle de la protéine Mmkin17.
B : cellules HeLa transfectées par le plasmide pCMVKinl7ARH et traitées pour l'îmmunodétection avec l'anticorps pAb2064). On observe une coloration verte nucléaire correspondant au marquage indirect de la protéine kinl7SH surproduite dans les cellules transfectées. Les noyaux des cellules sont colorés avec le DAPI. La distribution de la protéine Mmkin17#RH est différente de celle de la protéine Mmkin17.
En effet, la protéine Mmkin17#RH forme de larges aggrégats intranucléaires dans toutes les cellules transfectées indépendamment de la quantité de protéine surproduite. Ceci pourrait indiquer que la délétion des amino-acides entre 129 et 228 augmente la liaison de la protéine Mmkin17#RH à un autre composant nucléaire comme l'ADN ou la chro- matine. D'autres approches biochimiques ont montré que la solubilité de la protéine Mmkin17#RH est différente de celle de la protéine kinl 7.
La présence de la protéine Mmkin17#RH produit des déformations de la morphologie nucléaire (DMN) des cellules HeLa.
On transfecte des cellules HeLa avec le plasmide pCMVKinl7ARH, puis on détecte par immunofluorescence indirecte les cellules exprimant la protéine skinl7ARH. L'analyse par microscopie en contraste de phase montre que 100 % des cellules transfectées présentent des altérations de la morphologie nucléaire (Figure 8, contraste de phase). Lorsque les cellules surproduisent la protéine Mmkin17#CT il est impossible de détecter ce type de DMN (Figure 9). Dans le cas de la production des faibles quantités de protéine Mmkin17, on observe la formation de foyers intranucléaires et les cellules présentent une morphologie nucléaire normale sans altérations (comme décrit plus haut). Par contre, la surexpression d'une quantité importante de protéine M"kinl7 mène à la formation de très gros foyers intranucléaires qui ressemblent à la distribution de la protéine Mmkin17#RH et dans ce cas, les cellules présentent systéma tiquement des DMN (Figure 7). Le fait que 100 % des cellules qui expriment la protéine Mmkin17#RH ont des altérations de la morphologie nucléaire indique le phéno- type dominant de ce mutant.
Les DMN sont corrélées à une inhibition de la réplication de l'ADN.
On démontre que l'expression des protéines Mmkin17 et Mmkin17#RH produisent des DMN et affectent des processus biologiques nucléaires comme la réplication. Un résumé des résultats est présenté à la figure 10. L'ADNc MmKin17#RH est introduit dans des cellules humaines HeLa. Après expression du plasmide, la protéine kinl7 est détectée par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un anticorps marqué à la rhodamine (coloration rouge). En parallèle, dans les mêmes cellules, on détecte le taux de réplication de l'ADN par l'incorporation de BrdU (coloration verte) , l'ADN génomique contenu dans les noyaux est visualisé par le DAPI (coloration bleue) (figure 10). La surexpression de la protéine M"kinl7ARH inhibe complètement l'incorporation du BrdU (figure 10).
Test de clonogénéicité des cellules surexprimant la protéine kinl7 ou ses formes mutées.
Les plasmides pCMVDT21, pCMVKinl7, pCMVKinl7ARH ou pCMVKinl7ACT ont été cotransfectés avec le plasmide pEGFP-Nl (Clontech) dans des cellules HeLa, qui sont ensuite incubées pendant 20 jours dans un milieu contenant un marqueur de sélection (généticine). Les colonies formées sont comptées. Le nombre de colonies formées par les cellules transfectées avec le plasmide pCMVDT21 est considéré comme 100 %.
La protéine kinl7 permet la formation de 10 % de colonies. La protéine kini7ARH permet la formation de 20 % de colonies.
La protéine <R
EXEMPLE 6 : Obtention des cellules humaines qui ont une expression stable de la protéine Mmkin17. Effet surla prolifération cellulaire.
Pour confirmer les effets produits par l'expression transitoire de la protéine Mmkkin17, on a cherché à isoler des cellules qui expriment en continu la protéine Mmkkin17 et à déterminer l'effet de cette expression ectopique sur la survie cellulaire, la prolifération et la morphologie des cellules. On a utilisé l'ADN complémentaire a"2cinl7 de souris porté par des vecteurs navettes "EBV" afin de transfecter des cellules humaines en culture, appelées HFK293. Les cellules HEK 293 ("Transformed human embryo kidney cells "HEK- Ad5), établies à partir de reins embryonnaires transformés par des fragments de l'Adénovirus 5 (Graham F.L. et al., J. Gen. Virol., 1977, 36, 59-72). On cherche à sélectionner des cellules capables d'exprimer la protéine M*"kinl7. On a supposé que la surproduction de la protéine kinl7 de souris dans les cellules humaines a un effet biologique très proche de la protéine humaine étant donné la conservation des séquences observée entre l'homme et la souris (figure 2A et 2B).
Les vecteurs d'expression EBVportant l'ADNc MinKini 7.
L'ADNc MmKin17 est introduit dans des vecteurs d'expression dérivés du virus d'Epstein Barr (vecteurs EBV) sous le contrôle d'un promoteur viral très puissant ("human cytomegalovirus immediate-early promoter" ou "lE HCMV") ou d'un promoteur inductible par les métaux lourds (promoteur de souris mMT-I du gène de la métallothionéine I). Ces plasmides sont dérivés de ceux déjà publiés (Biard et al.,
Biochim. BioPhys. Acta, 1992, 1130, 68-74 , Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, 200, 263-271). Ces vecteurs ont les avantages suivants : 1) se maintiennent de façon épisomale (extrachromosomique) stable dans les cellules humaines; 2) persistent en nombre faible de copies par cellule (1 à 20 dans les lignées établies) , 3) se répliquent une fois par cycle cellulaire, 4) se ségrêgent entre les cellules filles comme les chromosomes, 5) présentent un bruit de fond de mutagenèse spontanée extrêmement faible 6) ne perturbent pas l'intégrité fonctionnelle des cellules transfectées, 7) permettent la sélection des cellules qui les portent par le fait de conférer la résistance à l'hygromycine ou à la généticine (G418).
Biochim. BioPhys. Acta, 1992, 1130, 68-74 , Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, 200, 263-271). Ces vecteurs ont les avantages suivants : 1) se maintiennent de façon épisomale (extrachromosomique) stable dans les cellules humaines; 2) persistent en nombre faible de copies par cellule (1 à 20 dans les lignées établies) , 3) se répliquent une fois par cycle cellulaire, 4) se ségrêgent entre les cellules filles comme les chromosomes, 5) présentent un bruit de fond de mutagenèse spontanée extrêmement faible 6) ne perturbent pas l'intégrité fonctionnelle des cellules transfectées, 7) permettent la sélection des cellules qui les portent par le fait de conférer la résistance à l'hygromycine ou à la généticine (G418).
Les étapes de clonage dans les vecteurs EBV et d'analyse de ces vecteurs ont déjà été décrites (Biard et al,. Biochim. BioPhys. Acta, 1992 ; Biard et al,
Exp. Cell Res., 1992, précités). Parmi les plasmides construits, 4 d'entre eux ont plus particulièrement été étudiés : le vecteur pEBVMTMmKinl7 (ou pB223) (figure 11), le vecteur pEBVMT# (ou pB220) (figure 11), le vecteur pEBVCMVMmKin17 (ou pB291) et le vecteur pEBVCMVASMmKin17 (ou pB291AS dans lequel l'ADNc
MmKin17 a été inséré en position "anti-sens"). Après le clonage, les vecteurs sont amplifiés dans la bactérie DH5a et purifiés sur des colonnes "Qiagen" selon les recommandations du fournisseur. Cet ADN est alors utilisé pour transfecter les cellules humaines.
Exp. Cell Res., 1992, précités). Parmi les plasmides construits, 4 d'entre eux ont plus particulièrement été étudiés : le vecteur pEBVMTMmKinl7 (ou pB223) (figure 11), le vecteur pEBVMT# (ou pB220) (figure 11), le vecteur pEBVCMVMmKin17 (ou pB291) et le vecteur pEBVCMVASMmKin17 (ou pB291AS dans lequel l'ADNc
MmKin17 a été inséré en position "anti-sens"). Après le clonage, les vecteurs sont amplifiés dans la bactérie DH5a et purifiés sur des colonnes "Qiagen" selon les recommandations du fournisseur. Cet ADN est alors utilisé pour transfecter les cellules humaines.
Ln transfection des cellules humaines.
Les cellules d'eucaryotes ont été cultivées dans des boites 6-puits contenant 2 ml de milieu par puits. Par la suite, 1 à 2 Ag d'ADN par puits sont transfectés (selon le type cellulaire) par précipitation avec du chlorure de calcium (Biard et al,. Biochim. BioPhys. Acta, 1992 ; Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, précités). Les cellules sont incubées à 37 C toute la nuit et le milieu est remplacé par du milieu frais sans antibiotique. 48 heures après la transfection, les protéines cellulaires sont analysées par la technique de "Western blot" ou d'immunohistochimie comme décrit précédemment (Biard et al, Rad. Res., 1997; Biard et al, Arch. Dermatol. Res., 1997). La purification des plasmides par la technique de "Hirt" permet leur caractérisation par hybridation ADN-ADN ou par transformation des bactéries DH5a et amplification (Biard et al, Exp. Cell Res., 1992, précité). Les cultures cellulaires sont poursuivies en présence de 250 Ag/ml d'hygromycine dans le milieu pendant 4 jours, puis avec 125 ug/ml d'hygromycine ou de généticine (750 ug/ml pendant 4 jours, puis 250 Rg/ml), afin de déterminer la croissance clonogénique et d'établir des lignées continues.
Effet de la surexpression de la protéine Mmkin17 dans des cellules tumorales H1299.
Les cellules H1299 (ATCC CRL-5803) sont des cellules épithéliales humaines du poumon qui ont été établies après prélèvement d'un patient atteint d'un carcinome pulmonaire NSCLC ("non small cell lung cancer"). Ces cellules tumorales présentent une inactivation du gène p53. L'expression de l'ANDc MmKin17 sous le contrôle du promoteur puissant IE HCMV entraîne une diminution très importante du nombre de colonies formées 14 jours après la transfection et cela en présence du marqueur de sélection (hygromycine ou généticine). Dans les mêmes conditions, l'expression de l'ADNc MmKin17 anti-sens permet l'établissement de très nombreux clones. De ce fait, il ressort qu'une expression ectopique de la protéine Mmkinl7 dans les cellules tumorales H1299 entraîne un désavantage sélectif important. Il est donc très difficile, voire impossible d'établir des lignées dérivées des cellules H1299 exprimant en continu la protéine Mmkin17.
Obtention des cellules HEK 293 immortelles qui surenspriment la protéine > "kin1 7.
Ces cellules HEK 293 présentent les caractéristiques suivantes: 1) sur 4 à 5 fragments du génome viral, intégrés dans leur génome (12 % de l'extrémité gauche et une copie de 9 % de l'extrémité droite) (Aiello L. et al., Virology, 1979, 94, 460-469), seuls les transcrits de l'extrémité gauche sont détectés; 2) caractère transformé et perte de l'inhibition de contact; 3) sécrètent leurs propres facteurs de croissance et donc poussent en milieu faible en sérum, 4) tumorigénicité modérée (15 % des souris rudes présentant des tumeurs) ; 5) efficacité de transfection supérieure à 30 %. (observée 48 h après la transfection d'un vecteur pEBVCMVlacZ ou d'un vecteur pEBVCMVEGFP).
On observe que 48h après la transfection du vecteur pEBVCMVMmKin17, un grand nombre de cellules expriment la protéine Mmkin17 à un niveau très élevé. Après sélection à l'hygromycine (250 ug/ml), on observe dans tous les cas un nombre très important de clones, ce nombre étant toujours plus important que celui observé après transfection du vecteur contrôle pEBVCMVASNsKinl7. Ainsi,
14 jours après la sélection, la viabilité des cellules est compatible avec l'expression de la protéine Mmkkin17. Après semaines, on constate une perte progressive du nombre de cellules exprimant la protéine Mmkin17. Ceci se reproduit dans de nombreuses expérience de transfection. Cela indique que l'expression ectopique de la protéine Mmkin17 entraîne un désavantage sélectif des cellules HEK 293, qui entraîne leur disparition. En revanche, les cellules HEK 293 transfectées par d'autres vecteurs
EBV, comme les vecteurs pEBVCMVlacZ, pEBVMTlacZ, ou pEBVCMVlacI maintiennent une expression stable du gène d'intérêt (ici les gènes bactériens lacZ ou lacl) pendant de nombreux mois, voire de nombreuses années (Biard et al., Cancer
Res., 1992, précité).
14 jours après la sélection, la viabilité des cellules est compatible avec l'expression de la protéine Mmkkin17. Après semaines, on constate une perte progressive du nombre de cellules exprimant la protéine Mmkin17. Ceci se reproduit dans de nombreuses expérience de transfection. Cela indique que l'expression ectopique de la protéine Mmkin17 entraîne un désavantage sélectif des cellules HEK 293, qui entraîne leur disparition. En revanche, les cellules HEK 293 transfectées par d'autres vecteurs
EBV, comme les vecteurs pEBVCMVlacZ, pEBVMTlacZ, ou pEBVCMVlacI maintiennent une expression stable du gène d'intérêt (ici les gènes bactériens lacZ ou lacl) pendant de nombreux mois, voire de nombreuses années (Biard et al., Cancer
Res., 1992, précité).
On transfecte des cellules HEK 293 avec le vecteur pEBVMTMmKin17. Dans ce vecteur, l'expression de l'ADNc M~, Kinl 7 est controlée par le promoteur mMT-I. De ce fait, I'expression basale de l'ADNc MmKinl 7 est considérablement plus faible que celle obtenue avec le promoteur IE HCMV. De plus, l'expression peut être augmentée par l'utilisation de métaux lourds dans le milieu de culture. On a isolé et analysé plusieurs clones stables qui expriment un taux très faible de protéine M"kinl7. L'avantage de ce système est que l'introduction de 100 M de Zn et 1 uM de Cd dans le milieu de culture active le promoteur mMT-I et augmente l'expression de l'ADNc MmKin17 (figure 12).
Un clone, dénommé cellules B223. 1 (figure 12), puisqu'il porte le vecteur pEBVMTnh, Kinl7 (ou pB223), présente une expression basale assez élevée de la protéine Mmkin17, alors que le clone dénommé pB223.2 présente une expression basale basse de la protéine Mmkin17. La caractérisation de ce clone pendant plus de 8 mois en culture continue a montré que le taux de la protéine Mmkin17 est corrélé avec une diminution très importante de la prolifération cellulaire.
La protéine M"kinl7 est détectée dans les cellules transfectées par coloration immunocytochimique, alors que l'on n'observe aucun signal avec les cellules B220 (figure 12C et D), un signal intense est détecté dans toutes les cellules
B223. 1, 24 heures après un traitement aux métaux lourds avec un anticorps anti-recA (figure 12A et 12B).
B223. 1, 24 heures après un traitement aux métaux lourds avec un anticorps anti-recA (figure 12A et 12B).
On observe également des différences d'expression dans la population de cellules B223. 1.
En utilisant la microscopie conventionnelle avec un filtre étroit pour analyser l'émission du fluorochrome Cy21M, on observe moins de 1% de cellules
B223.1 surexprimant la protéine Mmkin17, en l'absence de stimulation avec les métaux lourds (figure 13A), après stimulation aux métaux lourds, on détecte un fort signal spécifique, localisé dans les noyaux des cellules B223. l (figure 13B).
B223.1 surexprimant la protéine Mmkin17, en l'absence de stimulation avec les métaux lourds (figure 13A), après stimulation aux métaux lourds, on détecte un fort signal spécifique, localisé dans les noyaux des cellules B223. l (figure 13B).
Dans ces conditions expérimentales, la protéine endogène HSkin17 n'est pas détectable (figure 12C et 13C).
On observe également une diminution de la croissance clonogénique des cellules B223. 1, une incapacité à pousser à faible densité, et une mauvaise adhérence au support de culture (figure 13B). Les cellules B223. 1 sont souvent géantes et polynucléées (figure 14). On observe plus de cellules polynucléées dans la population de cellules B223. 1 que dans les deux autres lignées cellulaires (B220 et B223.2) (figure
15). Elles présentent des structures nucléaires multilobées ainsi que des micronoyaux.
15). Elles présentent des structures nucléaires multilobées ainsi que des micronoyaux.
Ces résultats indiquent que la viabilité des cellules humaines HEK 293 est compatible avec une expression constitutive faible de la protéine M"kinl7. En revanche, un taux d'expression élevé affecte négativement la prolifération cellulaire. Ces résultats indiquent que la surexpression de la protéine Mmkin17 compromet la viabilité cellulaire.
Tous ces résultats renforcent l'hypothèse selon laquelle la protéine > "kin17 devrait intervenir dans le contrôle (négatif) de la prolifération cellulaire (figure 16).
Lorsque les cellules B223. 1 sont ensemencées à une densité de i 103 cellules/cm2, on observe qu'en l'absence de métaux lourds, ces cellules sont incapables de croître après 7 jours en culture; elles restent rondes et ne s'étalent pas (figure 12 et 17A). Alors que les cellules B223. 1 commencent à croître après 7 jours en culture, les deux autres lignées cellulaires arrivent presque à confluence (figure 17A). Lorsque ces différentes lignées cellulaires sont mises en croissance à différentes densités pour tenir compte de leur efficacité à former des plaques, on observe un taux de prolifération réduit des cellules B223. 1, en comparaison avec les deux autres lignées (figure 17B).
Dans la mesure où l'on n'observe aucune différence en présence ou en l'absence d'hygromycine, B, on doit considérer que ces résultats ne sont pas dus à une différence de sensibilité au milieu de sélection (figure 1 7B).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, I'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
(B) RUE: 31-33 RUE DE LA FEDERATION
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES CODANT POUR UNE PROTEINE KIN17 ET
LEURS APPLICATIONS.
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE
(B) RUE: 31-33 RUE DE LA FEDERATION
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES CODANT POUR UNE PROTEINE KIN17 ET
LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 9
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D EXPLOITATION: PC-DOS/MG-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1296 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7
humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TGATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCGAT TAGAAAGTGA TCGCTGCCGT GGTCGCCATG 60
GGGAAGTCGG ATTTTCTTAC TCCCAAGGCT ATCGCCAACA GGATCAAGTC CAAGGGGCTG 120
CAGAAGCTAC GCTGGTATTG CCAGATGTGC CAGAAGCAGT GCCGGGACGA GAATGGCTTT 180
AAGTGTCATT GTATGTCCGA ATCTCATCAG AGACAACTAT TGCTGGCTTC AGAAAATCCT 240
CAGCAGTTTA TGGATTATTT TTCAGAGGAA TTCCGAAATG ACTTTCTAGA ACTTCTCAGG 300
AGACGCTTTG GCACTAAAAG GGTCCACAAC AACATTGTCT ACAACGAATA CATCAGCCAC 360
CGAGAGCACA TCCACATGAA TGCCACTCAG TGGGAAACTC TGACTGATTT TACTAAGTGG 420
CTGGGCAGAG AAGGCTTGTG CAAAGTGGAC GAGACACCAA AAGGCTGGTA TATTCAGTAC 480
ATAGACAGGG ACCCAGAAAC TATCCGCCGG CAACTGGAAC TGGAGAAAAA GAAAAAGCAG 540
GACCTTGATG ATGAAGAAAA AACTGCCAAA TTTATTGAAG AGCAAGTGAG AAGAGGCCTG 600
GAAGGGAAGG AACAGGAGGT CCCTACTTTT ACGGAATTAA GCAGAGAAAA TGATGAAGAG 660 AAAGTCACGT TTAATTTGAG TAAAGGAGCA TGTAGCTCAT CCGGAGCAAC ATCTTCCAAG 720
TCAAGTACTC TGGGACCGAG TGCACTGAAG ACGATAGGAA GTTCAGCATC AGTGAAACGA 780
AAAGAATCTT CCCAGAGCTC AACTCAGTCT AAAGAAAAGA AGAAAAAGAA ATCTGCACTG 840
GATGAAATCA TGGAGATTGA AGAGGAAAAG AAAAGAACTG CCCGAACAGA CTACTGGCTA 900
CAGCCTGAAA TTATTGTGAA AATTATAACC AAGAAACTGG GAGAGAAATA TCATAAGAAA 960
AAGGCTATTG TTAAGGAAGT AATTGACAAA TATACAGCTG TTGTGAAGAT GATTGATTCT 1020
GGAGACAAGC TGAAACTTGA CCAGACTCAT TTAGAGACAG TAATTCCAGC ACCAGGAAAA 1080
AGAATTCTAG TTTTAAATGG AGGCTACAGA GGAAATGAAG GTACCCTAGA ATCCATCAAT 1140
GAGAAGACTT TTTCAGCTAC TATCGTCATT GAAACTGGCC CTTTAAAAGG ACGCAGAGTT 1200
GAAGGAATTC AATATGAAGA CATTTCTAAA CTTGCCTGAG TTTGAAAATT TGTTAACAAT 1260
ACCTTTAAAA TCTTAAAGCA TCAAATTGGT GTTCGC 1296
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1102 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7ARR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGGGCAAGT CGGATTTTCT GAGCCCCAAG GCCATCGCCA ATAGAATTAA GTCCAAAGGG 60
CTCCAGAAGC TTCGCTGGTA CTGCCAGATG TGCCAAAAGC AATGCCGCGA CGAGAATGGC 120
TTTAAGTGTC ACTGTATGTC TGAATCTCAT CAAAGACAAC TGTTGCTGGC TTCAGAAAAC 180
CCTCAGCAGT TTATGGATTA TTTTTCAGAG GAATTCCGAA ATGACTTTCT GGAACTTCTG 240
AGGCGACGCT TTGGCACTAA AAGGGTCCAC AACAACATTG TCTACAATGA ATACATCAGC 300
CACCGAGAGC ACATCCACAT GAACGCTACC CAGTGGGAGA CACTGACCGA CTTTACCAAG 360
TGGCTGGGCA GAGAGGGCTT GTGTAAAGGT ACCAGTGCAC TGAAGCTGCT GGGGAGCGCA 420
GCATCCGGGA AACGGAAAGA GTCTTCACAG AGCTCCGCCC AGCCTGCGAA GAAGAAGAAG 480
TCGGCCCTGG ATGAGATCAT GGAGCTCGAA GAGGAAAAGA AAAGGACCGC ACGGACAGAC 540
GCCTGGTTAC AGCCGGGGAT CGTTGTGAAA ATTATAACGA AGAAGCTTGG GGAGAAATAT 600
CACAAGAAGA AAGGGGTCGT TAAGGAAGTG ATTGACAGGT ACACAGCTGT GGTAAAGATG 660
ACTGACTCTG GAGACAGGCT GAAACTGGAC CAGACTCATT TAGAGACAGT CATTCCGGCC 720
CCGGGGAAAA GGGTTCTAGT TTTAAATGGA GGCTACAGAG GAAATGAAGG CACTCTCGAA 780
TCCATCAATG AGAAGGCTTT TTCAGCCACG ATAGTCATTG AAACTGGACC TTTGAAAGGA 840
CGCAGAGTTG AAGGTATTCA ATATGAAGAC ATATCTAAAC TTGCTTGAGT TTGAAAATTT 900
GATAACAACA CATTGAAACT GTGAAGCATC AAATTGGTGT TAGCCAAGGC ACTGTGTAAC 960
TCTACTGTGT TAGGGGATTT GTTTTGTATT AAAAAAAAAA AAATCATCTA TTTAAATACT 1020
AGTGAATAGT TGGGTAAATT TATAATAAAA TCTATGTTTT TTTTAAGTGT AAAAAAAAAA 1080 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA AA 1102
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1002 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine RSkin17RH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3
TGATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCGAT TAGAAAGTGA TCGCTGCCGT GGTCGCCATG 60
GGGAAGTCGG ATTTTCTTAC TCCCAAGGCT ATCGCCAACA GGATCAAGTC CAAGGGGCTG 120
CAGAAGCTAC GCTGGTATTG CCAGATGTGC CAGAAGCAGT GCCGGGACGA GAATGGCTTT 180
AAGTGTCATT GTATGTCCGA ATCTCATCAG AGACAACTAT TGCTGGCTTC AGAAAATCCT 240
CAGCAGTTTA TGGATTATTT TTCAGAGGAA TTCCGAAATG ACTTTCTAGA ACTTCTCAGG 300
AGACGCTTTG GCACTAAAAG GGTCCACAAC AACATTGTCT ACAACGAATA CATCAGCCAC 360
CGAGAGCACA TCCACATGAA TGCCACTCAG TGGGAAACTC TGACTGATTT TACTAAGTGG 420
CTGGGCAGAG AAGGCTTGTG CAAAAGTGCA CTGAAGACGA TAGGAAGTTC AGCATCAGTG 480
AAACGAAAAG AATCTTCCCA GAGCTCAACT CAGTCTAAAG AAAAGAAGAA AAAGAAATCT 540
GCACTGGATG AAATCATGGA GATTGAAGAG GAAAAGAAAA GAACTGCCCG AACAGACTAC 600
TGGCTACAGC CTGAAATTAT TGTGAAAATT ATAACCAAGA AACTGGGAGA GAAATATCAT 660
AAGAAAAAGG CTATTGTTAA GGAAGTAATT GACAAATATA CAGCTGTTGT GAAGATGATT 720
GATTCTGGAG ACAAGCTGAA ACTTGACCAG ACTCATTTAG AGACAGTAAT TCCAGCACCA 780
GGAAAAAGAA TTCTAGTTTT AAATGGAGGC TACAGAGGAA ATGAAGGTAC CCTAGAATCC 840
ATCAATGAGA AGACTTTTTC AGCTACTATC GTCATTGAAA CTGGCCCTTT AAAAGGACGC 900
AGAGTTGAAG GAATTCAATA TGAAGACATT TCTAAACTTG CCTGAGTTTG AAAATTTGTT 960
AACAATACCT TTAAAATCTT AAAGCATCAA ATTGGTGTTC GC 1002
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1002 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: SONDE 1000
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4
TCAGAGACAA CTATTGCTGG CTTCAGAAAA TCCTCAGCAG TTTATGGATT ATTTTTCAGA 60
GGAATTCCGA AATGACTTTC TAGAACTTCT CAGGAGACGC TTTGGCACTA AAAGGGTCCA 120
CAACAACATT GTCTACAACG AATACATCAG CCACCGAGAG CACATCCACA TGAATGCCAC 180
TCAGTGGGAA ACTCTGACTG ATTTTACTAA GTGGCTGGGC AGAGAAGGCT TGTGCAAAGT 240
GGACGAGACA CCAAAAGGCT GGTATATTCA GTACATAGAC AGGGACCCAG AAACTATCCG 300
CCGGCAACTG GAACTGGAGA AAAAGAAAAA GCAGGACCTT GATGATGAAG AAAAAACTGC 360
CAAATTTATT GAAGAGCAAG TGAGAAGAGG CCTGGAAGGG AAGGAACAGG AGGTCCCTAC 420
TTTTACGGAA TTAAGCAGAG AAAATGATGA AGAGAAAGTC ACGTTTAATT TGAGTAAAGG 480
AGCATGTAGC TCATCCGGAG CAACATCTTC CAAGTCAAGT ACTCTGGGAC CGAGTGCACT 540
GAAGACGATA GGAAGTTCAG CATCAGTGAA ACGAAAAGAA TCTTCCCAGA GCTCAACTCA 600
GTCTAAAGAA AAGAAGAAAA AGAAATCTGC ACTGGATGAA ATCATGGAGA TTGAAGAGGA 660
AAAGAAAAGA ACTGCCCGAA CAGACTACTG GCTACAGCCT GAAATTATTG TGAAAATTAT 720
AACCAAGAAA CTGGGAGAGA AATATCATAA GAAAAAGGCT ATTGTTAAGG AAGTAATTGA 780 CAAATATACA GCTGTTGTGA AGATGATTGA TTCTGGAGAC AAGCTGAAAC TTGACCAGAC 840
TCATTTAGAG ACAGTAATTC CAGCACCAGG AAAAAGAATT CTAGTTTTAA ATGGAGGCTA 900
CAGAGGAAAT GAAGGTACCC TAGAATCCAT CAATGAGAAG ACTTTTTCAG CTACTATCGT 960 CATTGAAACT GGCCCTTTAA AAGGACGCAG AGTTGAAGGA AT 1002 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 291 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine hkinl7ARH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Ser Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ser Gly Lys Arg Lys Glu Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Ser Ala Gln Pro Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ala Leu Asp
145 150 155 160
Glu Ile Met Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr Ala Arg Thr Asp
165 170 175
Ala Trp Leu Gln Pro Gly Ile Val Val Lys Ile Ile Thr Lys Lys Leu
180 185 190
Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Gly Val Val Lys Glu Val Ile Asp
195 200 205
Arg Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Thr Asp Ser Gly Asp Arg Leu Lys
210 215 220
Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala Pro Gly Lys Arg
225 230 235 240
Val Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu Gly Thr Leu Glu
245 250 255
Ser Ile Asn Glu Lys Ala Phe Ser Ala Thr Ile Val Ile Glu Thr Gly
260 265 270
Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr Glu Asp Ile Ser
275 280 285
Lys Leu Ala
290 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 293 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine Rskinl7ARH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Thr Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Ala Leu Lys Thr Ile Gly Ser Ser Ala Ser Val Lys Arg Lys Glu Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Ser Thr Gln Ser Lys Glu Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ala
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ile Met Glu Ile Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr Ala Arg
165 170 175
Thr Asp Tyr Trp Leu Gln Pro Glu Ile Ile Val Lys Ile Ile Thr Lys
180 185 190
Lys Leu Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Ala Ile Val Lys Glu Val
195 200 205
Ile Asp Lys Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Ile Asp Ser Gly Asp Lys
210 215 220
Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala Pro Gly
225 230 235 240
Lys Arg Ile Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu Gly Thr
245 250 255
Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Thr Phe Ser Ala Thr Ile Val Ile Glu
260 265 270
Thr Gly Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr Glu Asp
275 280 285
Ile Ser Lys Leu Ala
290
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1390 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7 de souris
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
ATGGGCAAGT CGGATTTTCT GAGCCCCAAG GCCATCGCCA ATAGAATTAA GTCCAAAGGG 60
CTCCAGAAGC TTCGCTGGTA CTGCCAGATG TGCCAAAAGC AATGCCGCGA CGAGAATGGC 120
TTTAAGTGTC ACTGTATGTC TGAATCTCAT CAAAGACAAC TGTTGCTGGC TTCAGAAAAC 180
CCTCAGCAGT TTATGGATTA TTTTTCAGAG GAATTCCGAA ATGACTTTCT GGAACTTCTG 240
AGGCGACGCT TTGGCACTAA AAGGGTCCAC AACAACATTG TCTACAATGA ATACATCAGC 300
CACCGAGAGC ACATCCACAT GAACGCTACC CAGTGGGAGA CACTGACCGA CTTTACCAAG 360
TGGCTGGGCA GAGAGGGCTT GTGTAAAGTG GATGAGACAC CGAAAGGCTG GTACATTCAG 420
TACATAGACA GAGACCCAGA AACCATCCGT CGGCAACTGG AATTAGAAAA AAAGAAGAAG 480
CAAGATCTGG ACGATGAAGA AAAAACTGCC AAGTTCATTG AGGAGCAGGT GAGAAGAGGC 540
CTGGAAGGGA AAGAGCAGGA GACACCTGTT TTTACAGAAC TTAGCCGAGA AAATGAGGAA 600
GAAAAAGTTA CGTTCAATCT GAATAAAGGA GCGGGTGGCT CAGCGGGAGC TACAACATCC 660
AAGTCAAGCT CTTTGGGACC AAGTGCACTG AAGCTGCTGG GGAGCGCAGC ATCCGGGAAA 720
CGGAAAGAGT CTTCACAGAG CTCCGCCCAG CCTGCGAAGA AGAAGAAGTC GGCCCTGGAT 780
GAGATCATGG AGCTCGAAGA GGAAAAGAAA AGGACCGCAC GGACAGACGC CTGGTTACAG 840
CCGGGGATCG TTGTGAAAAT TATAACGAAG AAGCTTGGGG AGAAATATCA CAAGAAGAAA 900
GGGGTCGTTA AGGAAGTGAT TGACAGGTAC ACAGCTGTGG TAAAGATGAC TGACTCTGGA 960
GACAGGCTGA AACTGGACCA GACTCATTTA GAGACAGTCA TTCCGGCCCC GGGGAAAAGG 1020
GTTCTAGTTT TAAATGGAGG CTACAGAGGA AATGAAGGCA CTCTCGAATC CATCAATGAG 1080
AAGGCTTTTT CAGCCACGAT AGTCATTGAA ACTGGACCTT TGAAAGGACG CAGAGTTGAA 1140
GGTATTCAAT ATGAAGACAT ATCTAAACTT GCTTGAGTTT GAAAATTTGA TAACAACACA 1200 TTGAAACTGT GAAGCATCAA ATTGGTGTTA GCCAAGGCAC TGTGTAACTC TACTGTGTTA 1260
GGGGATTTGT TTTGTATTAA AAAAAAAAAA ATCATCTATT TAAATACTAG TGAATAGTTG 1320
GGTAAATTTA TAATAAAATC TATGTTTTTT TTAAGTGTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1380 AAAAAAAAAA 1390
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 391 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
titi) TYPE DE MOLéCULE: protéine skinl7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Ser Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Giy Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Lys Val Asp Glu Thr Pro Lys Gly Trp Tyr Ile Gln Tyr Ile Asp Arg
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Ile Arg Arg Gln Leu Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys
145 150 155 160
Gln Asp Leu Asp Asp Glu Glu Lys Thr Ala Lys Phe Ile Glu Glu Gln
165 170 175
Val Arg Arg Gly Leu Glu Gly Lys Glu Gln Glu Thr Pro Val Phe Thr
180 185 190
Glu Leu Ser Arg Glu Asn Glu Glu Glu Lys Val Thr Phe Asn Leu Asn
195 200 205
Lys Gly Ala Gly Gly Ser Ala Gly Ala Thr Thr Ser Lys Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Pro Ser Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ser Gly Lys
225 230 235 240
Arg Lys Glu Ser Ser Gln Ser Ser Ala Gln Pro Ala Lys Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Ala Leu Asp Glu Ile Met Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr
260 265 270
Ala Arg Thr Asp Ala Trp Leu Gln Pro Gly Ile Val Val Lys Ile Ile
275 280 285
Thr Lys Lys Leu Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Gly Val Val Lys
290 295 300
Glu Val Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Thr Asp Ser Gly
305 310 315 320
Asp Arg Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala
325 330 335
Pro Gly Lys Arg Val Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu
340 345 350
Gly Thr Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Ala Phe Ser Ala Thr Ile Val
355 360 365
Ile Glu Thr Gly Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr
370 375 380
Glu Asp Ile Ser Lys Leu Ala
385 390 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 393 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine HSkinl7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Thr Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Lys Val Asp Glu Thr Pro Lys Gly Trp Tyr Ile Gln Tyr Ile Asp Arg
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Ile Arg Arg Gln Leu Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys 145 150 155 160
Gln Asp Leu Asp Asp Glu Glu Lys Thr Ala Lys Phe Ile Glu Glu Gln
165 170 175
Val Arg Arg Gly Leu Glu Gly Lys Glu Gln Glu Val Pro Thr Phe Thr
180 185 190
Glu Leu Ser Arg Glu Asn Asp Glu Glu Lys Val Thr Phe Asn Leu Ser
195 200 205
Lys Gly Ala Cys Ser Ser Ser Gly Ala Thr Ser Ser Lys Ser Ser Thr
210 215 220
Leu Gly Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ile Gly Ser Ser Ala Ser Val Lys 225 230 235 240
Arg Lys Glu Ser Ser Gln Ser Ser Thr Gln Ser Lys Glu Lys Lys Lys
245 250 255
Lys Lys Ser Ala Leu Asp Glu Ile Met Glu Ile Glu Glu Glu Lys Lys
260 265 270
Arg Thr Ala Arg Thr Asp Tyr Trp Leu Gln Pro Glu Ile Ile Val Lys
275 280 285
Ile Ile Thr Lys Lys Leu Giy Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Ala Ile
290 295 300
Val Lys Glu Val Ile Asp Lys Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Ile Asp 305 310 315 320
Ser Gly Asp Lys Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile
325 330 335
Pro Ala Pro Gly Lys Arg Ile Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly
340 345 350
Asn Glu Gly Thr Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Thr Phe Ser Ala Thr
355 360 365
Ile Val Ile Glu Thr Giy Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile
370 375 380
Gln Tyr Glu Asp Ile Ser Lys Leu Ala 385 390
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D EXPLOITATION: PC-DOS/MG-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1296 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7
humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TGATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCGAT TAGAAAGTGA TCGCTGCCGT GGTCGCCATG 60
GGGAAGTCGG ATTTTCTTAC TCCCAAGGCT ATCGCCAACA GGATCAAGTC CAAGGGGCTG 120
CAGAAGCTAC GCTGGTATTG CCAGATGTGC CAGAAGCAGT GCCGGGACGA GAATGGCTTT 180
AAGTGTCATT GTATGTCCGA ATCTCATCAG AGACAACTAT TGCTGGCTTC AGAAAATCCT 240
CAGCAGTTTA TGGATTATTT TTCAGAGGAA TTCCGAAATG ACTTTCTAGA ACTTCTCAGG 300
AGACGCTTTG GCACTAAAAG GGTCCACAAC AACATTGTCT ACAACGAATA CATCAGCCAC 360
CGAGAGCACA TCCACATGAA TGCCACTCAG TGGGAAACTC TGACTGATTT TACTAAGTGG 420
CTGGGCAGAG AAGGCTTGTG CAAAGTGGAC GAGACACCAA AAGGCTGGTA TATTCAGTAC 480
ATAGACAGGG ACCCAGAAAC TATCCGCCGG CAACTGGAAC TGGAGAAAAA GAAAAAGCAG 540
GACCTTGATG ATGAAGAAAA AACTGCCAAA TTTATTGAAG AGCAAGTGAG AAGAGGCCTG 600
GAAGGGAAGG AACAGGAGGT CCCTACTTTT ACGGAATTAA GCAGAGAAAA TGATGAAGAG 660 AAAGTCACGT TTAATTTGAG TAAAGGAGCA TGTAGCTCAT CCGGAGCAAC ATCTTCCAAG 720
TCAAGTACTC TGGGACCGAG TGCACTGAAG ACGATAGGAA GTTCAGCATC AGTGAAACGA 780
AAAGAATCTT CCCAGAGCTC AACTCAGTCT AAAGAAAAGA AGAAAAAGAA ATCTGCACTG 840
GATGAAATCA TGGAGATTGA AGAGGAAAAG AAAAGAACTG CCCGAACAGA CTACTGGCTA 900
CAGCCTGAAA TTATTGTGAA AATTATAACC AAGAAACTGG GAGAGAAATA TCATAAGAAA 960
AAGGCTATTG TTAAGGAAGT AATTGACAAA TATACAGCTG TTGTGAAGAT GATTGATTCT 1020
GGAGACAAGC TGAAACTTGA CCAGACTCAT TTAGAGACAG TAATTCCAGC ACCAGGAAAA 1080
AGAATTCTAG TTTTAAATGG AGGCTACAGA GGAAATGAAG GTACCCTAGA ATCCATCAAT 1140
GAGAAGACTT TTTCAGCTAC TATCGTCATT GAAACTGGCC CTTTAAAAGG ACGCAGAGTT 1200
GAAGGAATTC AATATGAAGA CATTTCTAAA CTTGCCTGAG TTTGAAAATT TGTTAACAAT 1260
ACCTTTAAAA TCTTAAAGCA TCAAATTGGT GTTCGC 1296
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1102 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7ARR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATGGGCAAGT CGGATTTTCT GAGCCCCAAG GCCATCGCCA ATAGAATTAA GTCCAAAGGG 60
CTCCAGAAGC TTCGCTGGTA CTGCCAGATG TGCCAAAAGC AATGCCGCGA CGAGAATGGC 120
TTTAAGTGTC ACTGTATGTC TGAATCTCAT CAAAGACAAC TGTTGCTGGC TTCAGAAAAC 180
CCTCAGCAGT TTATGGATTA TTTTTCAGAG GAATTCCGAA ATGACTTTCT GGAACTTCTG 240
AGGCGACGCT TTGGCACTAA AAGGGTCCAC AACAACATTG TCTACAATGA ATACATCAGC 300
CACCGAGAGC ACATCCACAT GAACGCTACC CAGTGGGAGA CACTGACCGA CTTTACCAAG 360
TGGCTGGGCA GAGAGGGCTT GTGTAAAGGT ACCAGTGCAC TGAAGCTGCT GGGGAGCGCA 420
GCATCCGGGA AACGGAAAGA GTCTTCACAG AGCTCCGCCC AGCCTGCGAA GAAGAAGAAG 480
TCGGCCCTGG ATGAGATCAT GGAGCTCGAA GAGGAAAAGA AAAGGACCGC ACGGACAGAC 540
GCCTGGTTAC AGCCGGGGAT CGTTGTGAAA ATTATAACGA AGAAGCTTGG GGAGAAATAT 600
CACAAGAAGA AAGGGGTCGT TAAGGAAGTG ATTGACAGGT ACACAGCTGT GGTAAAGATG 660
ACTGACTCTG GAGACAGGCT GAAACTGGAC CAGACTCATT TAGAGACAGT CATTCCGGCC 720
CCGGGGAAAA GGGTTCTAGT TTTAAATGGA GGCTACAGAG GAAATGAAGG CACTCTCGAA 780
TCCATCAATG AGAAGGCTTT TTCAGCCACG ATAGTCATTG AAACTGGACC TTTGAAAGGA 840
CGCAGAGTTG AAGGTATTCA ATATGAAGAC ATATCTAAAC TTGCTTGAGT TTGAAAATTT 900
GATAACAACA CATTGAAACT GTGAAGCATC AAATTGGTGT TAGCCAAGGC ACTGTGTAAC 960
TCTACTGTGT TAGGGGATTT GTTTTGTATT AAAAAAAAAA AAATCATCTA TTTAAATACT 1020
AGTGAATAGT TGGGTAAATT TATAATAAAA TCTATGTTTT TTTTAAGTGT AAAAAAAAAA 1080 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA AA 1102
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1002 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine RSkin17RH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3
TGATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCGAT TAGAAAGTGA TCGCTGCCGT GGTCGCCATG 60
GGGAAGTCGG ATTTTCTTAC TCCCAAGGCT ATCGCCAACA GGATCAAGTC CAAGGGGCTG 120
CAGAAGCTAC GCTGGTATTG CCAGATGTGC CAGAAGCAGT GCCGGGACGA GAATGGCTTT 180
AAGTGTCATT GTATGTCCGA ATCTCATCAG AGACAACTAT TGCTGGCTTC AGAAAATCCT 240
CAGCAGTTTA TGGATTATTT TTCAGAGGAA TTCCGAAATG ACTTTCTAGA ACTTCTCAGG 300
AGACGCTTTG GCACTAAAAG GGTCCACAAC AACATTGTCT ACAACGAATA CATCAGCCAC 360
CGAGAGCACA TCCACATGAA TGCCACTCAG TGGGAAACTC TGACTGATTT TACTAAGTGG 420
CTGGGCAGAG AAGGCTTGTG CAAAAGTGCA CTGAAGACGA TAGGAAGTTC AGCATCAGTG 480
AAACGAAAAG AATCTTCCCA GAGCTCAACT CAGTCTAAAG AAAAGAAGAA AAAGAAATCT 540
GCACTGGATG AAATCATGGA GATTGAAGAG GAAAAGAAAA GAACTGCCCG AACAGACTAC 600
TGGCTACAGC CTGAAATTAT TGTGAAAATT ATAACCAAGA AACTGGGAGA GAAATATCAT 660
AAGAAAAAGG CTATTGTTAA GGAAGTAATT GACAAATATA CAGCTGTTGT GAAGATGATT 720
GATTCTGGAG ACAAGCTGAA ACTTGACCAG ACTCATTTAG AGACAGTAAT TCCAGCACCA 780
GGAAAAAGAA TTCTAGTTTT AAATGGAGGC TACAGAGGAA ATGAAGGTAC CCTAGAATCC 840
ATCAATGAGA AGACTTTTTC AGCTACTATC GTCATTGAAA CTGGCCCTTT AAAAGGACGC 900
AGAGTTGAAG GAATTCAATA TGAAGACATT TCTAAACTTG CCTGAGTTTG AAAATTTGTT 960
AACAATACCT TTAAAATCTT AAAGCATCAA ATTGGTGTTC GC 1002
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1002 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: SONDE 1000
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4
TCAGAGACAA CTATTGCTGG CTTCAGAAAA TCCTCAGCAG TTTATGGATT ATTTTTCAGA 60
GGAATTCCGA AATGACTTTC TAGAACTTCT CAGGAGACGC TTTGGCACTA AAAGGGTCCA 120
CAACAACATT GTCTACAACG AATACATCAG CCACCGAGAG CACATCCACA TGAATGCCAC 180
TCAGTGGGAA ACTCTGACTG ATTTTACTAA GTGGCTGGGC AGAGAAGGCT TGTGCAAAGT 240
GGACGAGACA CCAAAAGGCT GGTATATTCA GTACATAGAC AGGGACCCAG AAACTATCCG 300
CCGGCAACTG GAACTGGAGA AAAAGAAAAA GCAGGACCTT GATGATGAAG AAAAAACTGC 360
CAAATTTATT GAAGAGCAAG TGAGAAGAGG CCTGGAAGGG AAGGAACAGG AGGTCCCTAC 420
TTTTACGGAA TTAAGCAGAG AAAATGATGA AGAGAAAGTC ACGTTTAATT TGAGTAAAGG 480
AGCATGTAGC TCATCCGGAG CAACATCTTC CAAGTCAAGT ACTCTGGGAC CGAGTGCACT 540
GAAGACGATA GGAAGTTCAG CATCAGTGAA ACGAAAAGAA TCTTCCCAGA GCTCAACTCA 600
GTCTAAAGAA AAGAAGAAAA AGAAATCTGC ACTGGATGAA ATCATGGAGA TTGAAGAGGA 660
AAAGAAAAGA ACTGCCCGAA CAGACTACTG GCTACAGCCT GAAATTATTG TGAAAATTAT 720
AACCAAGAAA CTGGGAGAGA AATATCATAA GAAAAAGGCT ATTGTTAAGG AAGTAATTGA 780 CAAATATACA GCTGTTGTGA AGATGATTGA TTCTGGAGAC AAGCTGAAAC TTGACCAGAC 840
TCATTTAGAG ACAGTAATTC CAGCACCAGG AAAAAGAATT CTAGTTTTAA ATGGAGGCTA 900
CAGAGGAAAT GAAGGTACCC TAGAATCCAT CAATGAGAAG ACTTTTTCAG CTACTATCGT 960 CATTGAAACT GGCCCTTTAA AAGGACGCAG AGTTGAAGGA AT 1002 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 291 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine hkinl7ARH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Ser Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ser Gly Lys Arg Lys Glu Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Ser Ala Gln Pro Ala Lys Lys Lys Lys Ser Ala Leu Asp
145 150 155 160
Glu Ile Met Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr Ala Arg Thr Asp
165 170 175
Ala Trp Leu Gln Pro Gly Ile Val Val Lys Ile Ile Thr Lys Lys Leu
180 185 190
Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Gly Val Val Lys Glu Val Ile Asp
195 200 205
Arg Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Thr Asp Ser Gly Asp Arg Leu Lys
210 215 220
Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala Pro Gly Lys Arg
225 230 235 240
Val Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu Gly Thr Leu Glu
245 250 255
Ser Ile Asn Glu Lys Ala Phe Ser Ala Thr Ile Val Ile Glu Thr Gly
260 265 270
Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr Glu Asp Ile Ser
275 280 285
Lys Leu Ala
290 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 293 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine Rskinl7ARH
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Thr Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Ala Leu Lys Thr Ile Gly Ser Ser Ala Ser Val Lys Arg Lys Glu Ser
130 135 140
Ser Gln Ser Ser Thr Gln Ser Lys Glu Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ala
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ile Met Glu Ile Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr Ala Arg
165 170 175
Thr Asp Tyr Trp Leu Gln Pro Glu Ile Ile Val Lys Ile Ile Thr Lys
180 185 190
Lys Leu Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Ala Ile Val Lys Glu Val
195 200 205
Ile Asp Lys Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Ile Asp Ser Gly Asp Lys
210 215 220
Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala Pro Gly
225 230 235 240
Lys Arg Ile Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu Gly Thr
245 250 255
Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Thr Phe Ser Ala Thr Ile Val Ile Glu
260 265 270
Thr Gly Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr Glu Asp
275 280 285
Ile Ser Lys Leu Ala
290
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1390 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc du gène codant pour la protéine kinl7 de souris
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
ATGGGCAAGT CGGATTTTCT GAGCCCCAAG GCCATCGCCA ATAGAATTAA GTCCAAAGGG 60
CTCCAGAAGC TTCGCTGGTA CTGCCAGATG TGCCAAAAGC AATGCCGCGA CGAGAATGGC 120
TTTAAGTGTC ACTGTATGTC TGAATCTCAT CAAAGACAAC TGTTGCTGGC TTCAGAAAAC 180
CCTCAGCAGT TTATGGATTA TTTTTCAGAG GAATTCCGAA ATGACTTTCT GGAACTTCTG 240
AGGCGACGCT TTGGCACTAA AAGGGTCCAC AACAACATTG TCTACAATGA ATACATCAGC 300
CACCGAGAGC ACATCCACAT GAACGCTACC CAGTGGGAGA CACTGACCGA CTTTACCAAG 360
TGGCTGGGCA GAGAGGGCTT GTGTAAAGTG GATGAGACAC CGAAAGGCTG GTACATTCAG 420
TACATAGACA GAGACCCAGA AACCATCCGT CGGCAACTGG AATTAGAAAA AAAGAAGAAG 480
CAAGATCTGG ACGATGAAGA AAAAACTGCC AAGTTCATTG AGGAGCAGGT GAGAAGAGGC 540
CTGGAAGGGA AAGAGCAGGA GACACCTGTT TTTACAGAAC TTAGCCGAGA AAATGAGGAA 600
GAAAAAGTTA CGTTCAATCT GAATAAAGGA GCGGGTGGCT CAGCGGGAGC TACAACATCC 660
AAGTCAAGCT CTTTGGGACC AAGTGCACTG AAGCTGCTGG GGAGCGCAGC ATCCGGGAAA 720
CGGAAAGAGT CTTCACAGAG CTCCGCCCAG CCTGCGAAGA AGAAGAAGTC GGCCCTGGAT 780
GAGATCATGG AGCTCGAAGA GGAAAAGAAA AGGACCGCAC GGACAGACGC CTGGTTACAG 840
CCGGGGATCG TTGTGAAAAT TATAACGAAG AAGCTTGGGG AGAAATATCA CAAGAAGAAA 900
GGGGTCGTTA AGGAAGTGAT TGACAGGTAC ACAGCTGTGG TAAAGATGAC TGACTCTGGA 960
GACAGGCTGA AACTGGACCA GACTCATTTA GAGACAGTCA TTCCGGCCCC GGGGAAAAGG 1020
GTTCTAGTTT TAAATGGAGG CTACAGAGGA AATGAAGGCA CTCTCGAATC CATCAATGAG 1080
AAGGCTTTTT CAGCCACGAT AGTCATTGAA ACTGGACCTT TGAAAGGACG CAGAGTTGAA 1140
GGTATTCAAT ATGAAGACAT ATCTAAACTT GCTTGAGTTT GAAAATTTGA TAACAACACA 1200 TTGAAACTGT GAAGCATCAA ATTGGTGTTA GCCAAGGCAC TGTGTAACTC TACTGTGTTA 1260
GGGGATTTGT TTTGTATTAA AAAAAAAAAA ATCATCTATT TAAATACTAG TGAATAGTTG 1320
GGTAAATTTA TAATAAAATC TATGTTTTTT TTAAGTGTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1380 AAAAAAAAAA 1390
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 391 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
titi) TYPE DE MOLéCULE: protéine skinl7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Ser Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Giy Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Lys Val Asp Glu Thr Pro Lys Gly Trp Tyr Ile Gln Tyr Ile Asp Arg
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Ile Arg Arg Gln Leu Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys
145 150 155 160
Gln Asp Leu Asp Asp Glu Glu Lys Thr Ala Lys Phe Ile Glu Glu Gln
165 170 175
Val Arg Arg Gly Leu Glu Gly Lys Glu Gln Glu Thr Pro Val Phe Thr
180 185 190
Glu Leu Ser Arg Glu Asn Glu Glu Glu Lys Val Thr Phe Asn Leu Asn
195 200 205
Lys Gly Ala Gly Gly Ser Ala Gly Ala Thr Thr Ser Lys Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Pro Ser Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ser Gly Lys
225 230 235 240
Arg Lys Glu Ser Ser Gln Ser Ser Ala Gln Pro Ala Lys Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Ala Leu Asp Glu Ile Met Glu Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Thr
260 265 270
Ala Arg Thr Asp Ala Trp Leu Gln Pro Gly Ile Val Val Lys Ile Ile
275 280 285
Thr Lys Lys Leu Gly Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Gly Val Val Lys
290 295 300
Glu Val Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Thr Asp Ser Gly
305 310 315 320
Asp Arg Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile Pro Ala
325 330 335
Pro Gly Lys Arg Val Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly Asn Glu
340 345 350
Gly Thr Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Ala Phe Ser Ala Thr Ile Val
355 360 365
Ile Glu Thr Gly Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile Gln Tyr
370 375 380
Glu Asp Ile Ser Lys Leu Ala
385 390 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 393 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine HSkinl7
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
Met Gly Lys Ser Asp Phe Leu Thr Pro Lys Ala Ile Ala Asn Arg Ile
1 5 10 15
Lys Ser Lys Gly Leu Gln Lys Leu Arg Trp Tyr Cys Gln Met Cys Gln
20 25 30
Lys Gln Cys Arg Asp Glu Asn Gly Phe Lys Cys His Cys Met Ser Glu
35 40 45
Ser His Gln Arg Gln Leu Leu Leu Ala Ser Glu Asn Pro Gln Gln Phe
50 55 60
Met Asp Tyr Phe Ser Glu Glu Phe Arg Asn Asp Phe Leu Glu Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Phe Gly Thr Lys Arg Val His Asn Asn Ile Val Tyr Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Ser His Arg Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Gln Trp
100 105 110
Glu Thr Leu Thr Asp Phe Thr Lys Trp Leu Gly Arg Glu Gly Leu Cys
115 120 125
Lys Val Asp Glu Thr Pro Lys Gly Trp Tyr Ile Gln Tyr Ile Asp Arg
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Ile Arg Arg Gln Leu Glu Leu Glu Lys Lys Lys Lys 145 150 155 160
Gln Asp Leu Asp Asp Glu Glu Lys Thr Ala Lys Phe Ile Glu Glu Gln
165 170 175
Val Arg Arg Gly Leu Glu Gly Lys Glu Gln Glu Val Pro Thr Phe Thr
180 185 190
Glu Leu Ser Arg Glu Asn Asp Glu Glu Lys Val Thr Phe Asn Leu Ser
195 200 205
Lys Gly Ala Cys Ser Ser Ser Gly Ala Thr Ser Ser Lys Ser Ser Thr
210 215 220
Leu Gly Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ile Gly Ser Ser Ala Ser Val Lys 225 230 235 240
Arg Lys Glu Ser Ser Gln Ser Ser Thr Gln Ser Lys Glu Lys Lys Lys
245 250 255
Lys Lys Ser Ala Leu Asp Glu Ile Met Glu Ile Glu Glu Glu Lys Lys
260 265 270
Arg Thr Ala Arg Thr Asp Tyr Trp Leu Gln Pro Glu Ile Ile Val Lys
275 280 285
Ile Ile Thr Lys Lys Leu Giy Glu Lys Tyr His Lys Lys Lys Ala Ile
290 295 300
Val Lys Glu Val Ile Asp Lys Tyr Thr Ala Val Val Lys Met Ile Asp 305 310 315 320
Ser Gly Asp Lys Leu Lys Leu Asp Gln Thr His Leu Glu Thr Val Ile
325 330 335
Pro Ala Pro Gly Lys Arg Ile Leu Val Leu Asn Gly Gly Tyr Arg Gly
340 345 350
Asn Glu Gly Thr Leu Glu Ser Ile Asn Glu Lys Thr Phe Ser Ala Thr
355 360 365
Ile Val Ile Glu Thr Giy Pro Leu Lys Gly Arg Arg Val Glu Gly Ile
370 375 380
Gln Tyr Glu Asp Ile Ser Lys Leu Ala 385 390
Claims (5)
100) Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que ladite sonde est constituée par une séquence SEQ ID NO:4.
11 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il peut comprendre, préalablement à l'étape (1):
une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, et
au moins un cycle d'amplification génique réalisé à l'aide d'une paire d'amorces sélectionnée parrni les séquences SEQ ID NO:5-21, de préférence à l'aide de la paire d'amorces SEQ ID Nô: 16 et SEQ ID NO:17.
120) Protéine kinl7, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl7 tronquée au niveau d'une région homologue de la protéine recA.
13 ) Protéine kinl7 selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle correspond à une protéine kinl7 dans laquelle au moins le fragment compris entre les aminoacides 162 et 201 et au plus le fragment compris entre les aminoacides 55-235 est délété.
14 ) Protéine kinl7 selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite protéine kinl7 tronquée correspond à la protéine kinl7 de souris dans laquelle le fragment compris entre les aminoacides 129-228 est délété et présente la séquence
SEQ ID NO:22 (séquence dénommée Mmkin17#RH).
15 ) Protéine kinl7 selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite protéine kinl7 tronquée correspond à une protéine kinl7 humaine dans laquelle le fragment 129-228 est délété et présente la séquence SEQ ID NO:23 (séquence dénommée HSkin17#RH).
16 ) Utilisation d'une protéine kinl7 de mammifère, pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire.
17 ) Utilisation selon la revendication 16, pour la préparation d'un médicament inhibant la prolifération cellulaire, notamment destiné au traitement des maladies dans lesquelles on observe une hyperprolifération cellulaire.
180) Utilisation d'une protéine kinl7 de mammifère, pour la préparation d'un médicament contrôlant la fertilité.
19 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que ladite séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 et SEQ ID NO:26.
20 ) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une séquence codant pour une protéine kinl7 de mammifère sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID Nô:1, 2, 3.
21 ) Utilisation d'un vecteur d'expression incluant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1, 2, 3 et 24, pour la préparation d'un médicament contrôlant la prolifération cellulaire.
22 ) Utilisation du fragment compris entre les aminoacides 55-235, de préférence le fragment compris entre les aminoacides 129 et 228 d'une protéine kinl7 de mammifère pour la régulation de l'interaction protéine-ADN courbe.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9715536A FR2772046B1 (fr) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | Sequences codant pour une proteine kin17 et leurs applications |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| FR9715536A FR2772046B1 (fr) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | Sequences codant pour une proteine kin17 et leurs applications |
Publications (2)
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|---|---|
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| FR2772046B1 FR2772046B1 (fr) | 2001-10-26 |
Family
ID=9514343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9715536A Expired - Fee Related FR2772046B1 (fr) | 1997-12-09 | 1997-12-09 | Sequences codant pour une proteine kin17 et leurs applications |
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Families Citing this family (1)
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| FR2706487A1 (fr) * | 1993-06-15 | 1994-12-23 | Commissariat Energie Atomique | Préparation purifiée de protéine kin17 et ses applications, notamment au dépistage de remaniements chromosomiques. |
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1997
- 1997-12-09 FR FR9715536A patent/FR2772046B1/fr not_active Expired - Fee Related
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- 1998-12-09 EP EP98958989A patent/EP1036172A1/fr not_active Withdrawn
- 1998-12-09 WO PCT/FR1998/002667 patent/WO1999029845A1/fr active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2706487A1 (fr) * | 1993-06-15 | 1994-12-23 | Commissariat Energie Atomique | Préparation purifiée de protéine kin17 et ses applications, notamment au dépistage de remaniements chromosomiques. |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| A. MAZIN ET AL: "kin17, a mouse nuclear zinc finger protein that binds preferentially to curved DNA", NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 22, no. 20, 1994, OXFORD GB, pages 4335 - 4341, XP002076396 * |
| D.S.F. BIARD ET AL: "Differential expression of the hsKin17 protein during differentiation of in vitro reconstructed human skin", ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 289, no. 8, July 1997 (1997-07-01), pages 448 - 456, XP002076395 * |
| D.S.F. BIARD ET AL: "Enhanced expression of the Kin17 protein immediately after low doses of ionizing radiation", RADIATION RESEARCH, vol. 147, no. 4, April 1997 (1997-04-01), pages 442 - 450, XP002076398 * |
| J.F. ANGULO ET AL: "Identification and expression of the cDNA of KIN17, a zinc-finger gene located on mouse chromosome 2 , encoding a new DNA-binding protein", NUCLEIC ACIDS RESEARCH., vol. 19, no. 19, 1991, OXFORD GB, pages 5117 - 5123, XP002076397 * |
| J.F. ANGULO ET AL: "Identification of a mouse cDNA fragment whose expressed polypeptide reacts with anti-Reca antibodies", BIOCHIMIE, vol. 73, no. 2-3, March 1991 (1991-03-01), pages 251 - 256, XP002076423 * |
| P. KANNOUCHE ET AL: "Overexpression of KIn17 protein forms intranuclear foci in mammalian cells", BIOCHIMIE, vol. 79, no. 9-10, October 1997 (1997-10-01), pages 599 - 606, XP002076394 * |
| P. KANNOUCHE ET AL: "The nuclear concentration of Kin17, a mouse protein that binds to curved DNA, increases during cell proliferation and after UV irradiation", CARCINOGENESIS, vol. 19, no. 5, May 1998 (1998-05-01), pages 781 - 789, XP002076399 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999029845A1 (fr) | 1999-06-17 |
| FR2772046B1 (fr) | 2001-10-26 |
| EP1036172A1 (fr) | 2000-09-20 |
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