【発明の詳細な説明】
腫瘍形成の診断におけるインターフェロン調節因子１および２
発明の背景
本発明は1992年9 月24日登録された出願番号No.07/950,574の関連出願である1
992年12月22日登録された出願番号No.07/995,594の関連出願であり、ここに挙げ
た各出願の内容は本明細書に含まれるものとする。
発明の分野
一般に、本発明は腫瘍形成哺乳類細胞または哺乳類細胞の腫瘍化傾向の診断法
に関する。さらに、本発明は細胞が腫瘍化傾向を軽減すること、または細胞の腫
瘍表現型を抑制することを目的としてクローン化cDNAまたはゲノム性DNA、細胞
が腫瘍化傾向を軽減する方法または細胞の腫瘍表現型を抑制する方法、癌の生成
した患者または癌が生成する可能性のある患者の治療法、および人の腫瘍形成組
織または腫瘍化傾向を有する組織の診断方法に関する。
関連技術
１．インターフェロンおよびインターフェロン調節因子１および２
インターフェロン（IFN）は本来抗ウイルス性に基づいて同定された多面的サ
イトカインである。ウイルス感染によって種々の組織でタイプＩのIFN 、即ちIF
N-αおよびIFN-βが生成され、分泌されたIFNは一連の遺伝子、IFN誘導可能遺伝
子を誘導することにより標的細胞に対して抗ウイルス活性を提供する。細菌細胞
増殖および分化におけるIFNの役割が注目されており、IFNが多くの正常または形
質転換細胞において抗増殖効果を示すことが報告されている（ワイズマン（Weis
smann）およびウェバー（Weber）、Prog.Nucleic Aced Res.Mol.Biol.33:251-30
0(1986)；ペストカ（Pestka）等、Annu.Rev.Biochem.56:727-777(1987);デ・メ
イヤー（De Maeyer）およびデ・メイヤー・ガイナード（De Maeyer-Guegnard）
，Interferons and Other Regulatory Cytokines，ニューヨーク、ジョン・ウイ
リー・アンド・サンズ版（1988）; タニグチ（Taniguchi）,Annu.Rev.Immunol.6
:439-
464(1988);ヴィルチェク（Vilcek）,”Interferons etc.”Handbook of Experim
ental Pharmacology,スポーン・アンド・ロバーツ編、ベルリン、スプリンガー
・バーラグ版、3-38(1988);セン（Sen）およびレンギール（Lengyel）， J. Bio
l.Chem.267:5017-5020(1992)）。さらに、一連の研究でIFNおよび成長刺激因子
が相互に抑制的に作用し合うことが示された。即ち、IFNが成長因子で刺激され
た細胞サイクルの転移を阻止することが示され、一方ある成長因子はIFNの抗増
殖効果を阻害することが示された。さらに、IFNは多くの成長因子によって誘導
されるが、このことは細胞増殖を調節するフィードバック機構におけるIFNに対
する生理的役割を暗示している。また、これらの観測はIFNが「負の成長因子」
であるという議論（クレメンツ（Clements）およびマクラーナン（McNurlan），
Biochem.J.226:345-360(1985);タン（Tamm）等、Interferon ９，Ｉ.グレサー（
Gresser）編、カリフォルニア、アカデミック・ブレス版、14-74(1987);デ・メ
イヤー（De Maeyer）およびデ・メイヤー・ガイナード（De Maeyer-Guegnard）,
ibid(1988);グレサー（Gresser），Acta Oncologica 28:347-353(1989);ビルチ
ェク（Vilcek）,ibid(1990)）を支持している。この意味でタイプＩのIFNがある
種の腫瘍には欠如しているのは興味深い（ディアス（Diaz）等、Prec.Natl.Acad
.Sci.USA 85:5259-5263(1988); ミヤコシ（Miyakoshi）等、Cancer Res 50:278-
283(1990)）。しかし、これらのIFNの抗増殖効果に関するメカニズムについては
全く分かっていない。
ヒトのIFN-β遺伝子の調節メカニズムの研究から、二つの新しいDNA結合因子
インターフェロン調節因子１（IRF-1）および２（IRF-2）が同定された（フジタ
（Fujita）等、EMBO J．7;3397-3405(1988);ミヤモト（Miyamoto）等、Cell 54:
903-913(1988);ハラダ（Harada）等、Cell 58:729-739(1989)）。ヒトおよびマ
ウスのIRF-1、およびマウスのIRF-2のアミノ酸配列並びにDNA配列は1989年8月24
日に登録された米国特許出願番号No.07/397,967に報告されている。これら二つ
の因子は構造的に特にDNA結合特異性を提供するＮ末端領域に関係している。事
実、両因子はIFN-α、IFN-βおよび多くのIFN誘導可能遺伝子のプロモーター内
に存在する同じDNA配列要素に結合する（ハラダ（Harada）等、ibid.(1989)）。
一連の遺伝子トランスフェクション実験でIRF-1がIFNおよびIFN誘導可能遺伝子
に
対する重要な活性化因子として機能する一方、IRF-2がIRF-1の効果を抑制する事
を示している（フジタ（Fujita）等、Nature 337:270-272(1989);ハラダ（Harad
a）等、Cell 63:303-312(1990);ナフ（Naf）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:13
69-1373(1991);オウ（Au）等、Nucl.Acids Res.20:2877-2884(1992);レイス（Re
is）等、EMBO J.11:185-193(1992);スターク（Stark）およびカー（Kerr），J.I
nterferonR．12:147-151(1992)）。IFN関連細胞応答の見地からIRF-1遺伝子自体
がIFN誘導可能であることは興味深い。IRF-2遺伝子もIFN活性化細胞で誘導され
ているが、この誘導はIRF-1遺伝子の誘導後にだけ発生する（ハラダ（Harada）
等、ibid(1989)）。さらに、先の研究でIRF-1およびIRF-2は安定性の上で差があ
ることが分かっている。即ち、IFN処理した細胞またはウイルス感染した細胞内
での前者の寿命は短いが（約30分間）後者は比較的安定である（寿命約８時間）
。増殖する細胞におけるIRF-2の濃度はIRF-1より高いが、IFNまたはウイルスの
刺激によりIRF-2/IRF-1の比は増加する（ワタナベ（Watanabe）等、Nucl.Acids
Res.１9:4421-4428(1991)）。従って、一時的なIRF-1/IRF-2比の増加がIFNによ
る細胞増殖における重要な事象なのかもしれない。これを支持するものとしてヒ
トの免疫グロブリン遺伝子のエンハンサーに結合したヒトのIRF-2遺伝子はＢリ
ンパ球を発生できないという知見がある（ヤマダ（Yamada）等、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 88:532-536(1991)）。
２．腫瘍抑制遺伝子
ヒトの腫瘍発生は細胞増殖、分化および転移を調節する多くの遺伝子座におけ
る突然変異の漸進的獲得に基づく多段階過程である。最も良く研究されたヒトの
腫瘍モデルにおいては、支配的に作用するプロトオンコジーン中に発見されてい
る「機能獲得」突然変異は腫瘍抑制遺伝子における「機能損失」突然変異を伴っ
ている。最初に多くのプロトオンコジーンが同定され、特徴付けられたにもかか
わらず、最近の研究ではその突然変異および欠失がRB、p53およびWT1（マーシャ
ル（Marshall），Cell 64:313-326(1991)）並びにAPC（グロデン（Groden）等、
Cell66:589-600(1991);キンズラー（Kinzler）等、Science 253:661-664(1991)
）およびNF1（ズ(Xu)等、Cell 62:599-608(1990);マーシャル（Marshall）,ibid
(1991);
リ（Li）等、Cell69:275-281(1992)）を含むヒトの腫瘍の発生に重要だと考えら
れるいくつかの腫瘍抑制遺伝子が同定された。 ヒトの腫瘍における別の遺伝子
座の異質接合性の欠如（ポンダー（Ponder）,Nature 335:400-402(1988);マーシ
ャル（Marshall）,ibid.(1991)）および特異的染色体領域の欠失の再発は未だ同
定されていない多くの腫瘍抑制遺伝子が存在することを支持している。
染色体５のロング・アームの部分的欠失（del(5q);”5q-”細胞形成異常）ま
たは全染色体５の損失（-５またはモノソミー５）はヒトの白血病および前白血
病骨髄形成異常症（骨髄形成異常：MDS ）においてもっとも頻繁に起こる細胞形
成異常性に関係している。del(5q)またはモノソミー５は、MDS患者の30%、二次
または治療で誘導された急性骨髄性白血病（AML）患者の50%、ド・ノボAMLおよ
びド・ノボ急性リンパ性白血病（ALL）患者の各々15%および2%に見られる（バン
・デン・ベルゲ（Van den Berghe）等、Nature 251:437(1974),Bancer Genet.Cy
togenet.17:189-255(1985);第４回白血病における染色体に関する国際ワークシ
ョップ（1982）；レ・ビュウ（Le Beau）等、J.Clin.Oncol.4:325-345(1986);ナ
イマー（Nimer）およびゴールド（Golde），Blood 70:1705-1712(1987);ケリン
（Kerim）等、Leukemia 4:12-15(1990);ペダーソン・バーガード（Pederson-Bj
ergaard）等、Bod 76:1083-1091(1990)）。最初に難病の貧血性、血小板増多症
および異常巨核芽球の特徴を有する主に初老の女性に起こる独特な骨髄形成症（
「5q-症」）のホールマークとして示された（バン・デン・ベルゲ（Van den Ber
ghe）等、ibid(1974)）。通常、これらの病気を有する女性は不活発な臨床経過
を有している。影響を受けた骨髄幹細胞は膨張に対して緩慢であり、しばしば別
の細胞形成異常を獲得し、さらに僅か10-20%であるがAMLに転移する（バン・デ
ン・ベルゲ（Van den Berghe）等、ibid.(1985)；デワルド（Dewald）等、Blood
66:189-197(1985);マイマー（Nimer）およびゴールド（Gold）、ibid.(1985)）
。対照的にド・ノボまたはdel(5q)を伴う二次AMLの患者は提示されるか、または
非常に貧弱な予後を示す別の細胞形成異常を有する（ローリー（Rowly）等、Blo
od 58:759-767(1981);第４回白血病における染色体に関する国際ワークショップ
(1982)；レ・ビュウ（Le Beau）等、ibid.(1986)；サミュエルス（Samuels）等
、Luekemia 2:79-83(1988)）。また、AMLにおいて、del(5q)/-5の存在は発癌性
物質への職業的接
触（マイテルマン（Mitelman）等、Blood 52:1229-1273(1978)；ゴロン（Golomb
）等、Blood 60:404-411(1982)）または種々の腫瘍の治療におけるアルキル化試
薬による化学療法または放射線療法に関連している（レ・ビュウ（Le Beau）等
、ibid.(1986)）。
一連の研究で共通する最も小さいdel(5q)欠失断片、いわゆる「重要」領域は
バンド5q31に存在することが分かった（レ・ビュウ（Le Beau）等、Blood 73:64
7-650(1989);ペダーソン（Pederson）およびジェンセン（Jensen）,Leukemia 5:
566-573(1991)）。5q31を含む転移を伴うド・ノボAMLも報告されている（第４回
白血病における染色体に関する国際ワークショップ、1982）。これらの知見は原
因となる遺伝子が5q31に存在し、この遺伝子の欠失が白血病およびMDSの発生に
中心的な役割を果たしていることを示している。造血成長因子およびインターロ
イキン類IL-3、ILー4、IL-5、IL-9およびGM-CSFおよびEGR-1転写因子を含む多く
の遺伝子候補が5q31領域にマッピングされた（ヒューブナー（Huebner）等、Sci
ence230:1282-1285(1992);レ・ビュウ（Le Beau）等、Science 231:984-987(198
6)およびibid.(1989);サザーランド（Sutherland）等、Blood，71:1150-1152(19
88);ワーリントン（Warrington）等、Genomics 13:803-808(1992)）。しかし、
どの遺伝しも腫瘍抑制遺伝子候補に期待される条件を満たすものではない。一貫
性は無いもののIL-3、IL-4、IL-5およびGM-CSF遺伝子の内の１つの欠失がdel(5q
)を伴う白血病およびMDS患者に報告されている（レ・ビュウ（Le Beau）等、ibi
d.(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5913-5917(1987)，ibid.(1987)）。しか
し、ホモ接合性の減少、構造再配列または別の遺伝子における突然変異等は発見
されなかった（ナイマー（Nimer）およびゴールド（Golde），ibid.(1987)）。d
el(5q)患者におけるEGR-1の最近の研究から同様の否定的知見が得られた（Ｇ．
ギリランド（Gilliland）等、ハーバード大学、パーソナル・コミュニケーショ
ン）。上述のように、この領域の腫瘍抑制遺伝子は未だ同定されていない。
発明の概要
本発明の目的は細胞の腫瘍化又は細胞の腫瘍化傾向を診断する方法を提供する
事である。
また、本発明の目的は腫瘍性哺乳類細胞又は哺乳類細胞の腫瘍化傾向を診断す
る方法を提供する事である。
また、本発明の目的は細胞の腫瘍化傾向を軽減する方法または細胞の腫瘍表現
型を抑制する方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は細胞の腫瘍化傾向を軽減する方法または細胞の腫瘍表
現型を抑制する方法を提供する事である。
また、本発明の目的はガン患者またはガンを発生する恐れのある患者を治療す
る方法を提供することである。
さらに、本発明の目的はヒトの腫瘍組織または腫瘍を発生する可能性のある組
織を診断する方法を提供することである。
その他の本発明の目的および利点は以下の説明から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
図1AはIRF-1ゲノムクローンとハイブリダイズした正常なリンパ球由来のプロ
ピジウム・ヨイウダイド染色した中期染色体を示している。
図IBはIRF-1および5q22への単一のゲノムプローブ相補配列とハイブリダイズ
した正常な中期染色体のコンピュータ・マイクロ解析の結果である。
図２は正常なコントロールおよび白血病並びにMDS試料由来のHindIII消化DNA
のサザンブロットである。
図3AはIRF-1プローブ（矢印１）および5q22（矢印２）を用いた間期核のデュ
アル・カラー蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーションの結果を示しており
、Ａは２個の5q22および２個のIRF-1対立遺伝子を有する正常なリンパ球である
。
図3Bは、４個の5q22および２個のIRF-1ドメインを有する白血病細胞であり、
１個のIRF-1対立遺伝子の欠失を示している。
図3Cはdel(5)(ql1q33)により１個の5q22および１個のIRF-1ドメインしかない
白血病細胞である。
図４は急性白血病の場合のIRF-1遺伝子の構造的転位の特徴を示している。
図５はインバースPCR（SEQ.ID No.1-4）を用いたIRF-1遺伝子内の切断点の
クローニングおよびシーケンシングを示している。
図６は細胞サイクル中のIRF-1 mRNA発現の振動を示している。
図７はNIH3T3細胞におけるIRF-2の過剰発現を示している。
図８はIRF-2誘導型トランスホーメーションのIRF-1による抑制を示している。
図９はpUCIRF-1の制限地図を示している。
図10はpHIRF4S-51の制限地図を示している。
図面の詳細な説明
図1Aにおいては、IRF-1ゲノムクローンでハイブリダイズした正常なリンパ球
由来のプロピジウム・ヨウダイド染色した中期染色体が示されている。IRF-1プ
ローブは染色体5q上の配列（矢印１）に特異的にハイブリダイズする。間期の核
では２つのIRF-1ハイブリダイゼーション・ドメイン（矢印２）が検出された。
図1BにおいてはIRF-1プローブ（矢印１）および5q22における単一のゲノムプ
ローブ相補配列（矢印２）とハイブリダイズした正常な間期由来の染色体５のコ
ンピュータ・マイクロ解析を示されており、IRF-1遺伝子はショート・アーム・
テロメアに対して5q31.1に位置している。
図２では正常コントロールおよび白血病並びにMDS試料（表１参照）由来のHin
dIII消化DNAのサザンブロットが示されており、最初フィルターは6.0kbの断片を
検出するIRF-1 cDNAプローブでハイブリダイズされ、ついで、洗浄後内部コント
ロールとしての3.0kbのバンドを検出するためのC9プローブと再ハイブリダイズ
された。各レーンは以下の試料（表１に示されている）に対応する:1(9),2(1),3
(13),4(3),5(5),6(6),7(8),8(10),9(7),10（正常骨髄コントロール；５μg），1
1（正常骨髄コントロール；2.5μg）。
図３ではIRF-1プローブ（矢印１）および5q22（矢印２）を用いた間期核にお
けるデュアル・カラー蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーションの結果が示
されており、
（Ａ）２個の5q22および２個のIRF-1対立遺伝子を有する正常なリンパ球、
（Ｂ）４個の5q22および２個のIRF-1ドメインしか持たず、１個のIRF-1対立遺
伝子の欠失を示すＳ期の白血病細胞（表１の試料12に代表される）、
（Ｃ）del(5)(q1lq33)のために１個の5q2および１個のIRF-1ドメインしか持た
ない泊血病細胞（表１の試料７に代表される）、
以上（Ａ）乃至（Ｃ）が検出された。
図４は急性白血病の場合のIRF-1遺伝子の構造的転位の特性を示しており（表
１、試料10）、
（Ａ）はヒトのIRF-1遺伝子の地図およびエクソン１および２を含むHindIII領域
の拡大図である。上図はヒトのIRF-1遺伝子のエクソン地図を示している。エク
ソンの位置は黒ボックスで示してある。下図はエクソン１および２を含むHindII
I領域を拡大してある。エクソンの位置は斜線ボックスで示されており、サザン
ブロットに使用したプローブはプローブ１およびプローブ２と記されている。制
限酵素部位：H，HindIII；Ba，BamHI；Bg，BgIII。(Ba)は多型的BamHI部位を示
している。
（Ｂ）は正常DNA(N)および患者試料10(P)由来のゲノムDNAのサザンブロット分
析である。同様に調製したフィルターに以下に示す各プローブをハイブリダイズ
させた：IRF-1 cDNA（左図；pHIRF31由来の2.0 kb XhoIIフラグメント；実験操
作参照）、プローブ１（中央図；図４Ａに示されている1.0kb HindIII-BgIIIフ
ラグメント）およびプローブ２（右図；図４Ａに示されている1.0kbBgIII-HindI
IIフラグメント）。矢印は正常(N)DNAに対して白血病試料(P)に見られる欠失ま
たは新しいバンドを示している。
図５はインバースPCRを用いたIRF-1遺伝子内のブレークポイントのクローニン
グおよびシーケンシングを示しており、
（Ａ）はエクソン１および２およびイントロン１を含むIRF-1遺伝子の1.9kbHind
III-HindIII領域の地図である。白血病試料（試料10）中の新しいHindIII部位お
よびその結果生成する400bpのHindIIIフラグメントは地図では（HindIII）によ
って示してある。プライマーおよびインバースPCRに使用した方向も示してある
。
（Ｂ）は白血病（Ｐ；試料10）および正常DNA(N)由来のクローニングされたPCR
産物の配列である。白血病および正常DNA間で同一の配列はａ*で示してある。
白血病試料の配列はイントロン１中のプライマー１の後10ヌクレオチド分岐する
ように示されている。
図６は細胞サイクルにおけるIRF-1mRNA発現の振動を示している。
（Ａ）は血清刺激によるチミジン取り込みの速度を示している。時間経過と共
に達成された最高レベルの3Ｈ−チミジン取り込み（20時間目で2×104個細胞当
たり1.3×105cpm）を100％とした。
（Ｂ）は血清で誘導された増殖間のIRF-1およびIRF-2mRNAの発現を示している
。最初NIH3T3細胞を血清飢餓状態で休止させておき、血清添加により誘導を開始
した。上図はS1マッピング分析の結果を示している。指示されている時間に全RN
Aを単離し、分析した。矢印は保護されているIRF-1およびIRF-2プローブの位置
を示している。レーンＭは32ＰラベルしたHaeIII消化pBR322DNAフラグメントに
対応している。下図は上図からデンシトメータ分析で計算されたIRF-1およびIRF
-2のmRNAのコピー数を示している。その輪郭がIRF-1（白丸）およびIRF-2（黒丸
）について示されている。
（Ｃ）は血清誘導増殖間のIRF-1の発現を示している。NIH3T3細胞を(B)と同様
に休止させ、活性化した。
図７はNIH3T3細胞におけるIRF-2の過剰生産を示している。
（Ａ）はノーザンブロット分析でIRF-2のmRNAの発現を追跡している。
（Ｂ）はIRF-2活性をトランスフェクトしたNIH3T3細胞のゲルシフト分析を示
している。矢印はIRF-2-DNA複合体の位置を示している。より速く移動するバン
ドはおそらくDNAプローブに結合したIRF-2の分解産物を示している（図８Ｂ参照
）。
（Ｃ）はコントロール細胞系列およびIRF-2を過剰生産する細胞系列の増殖曲
線を示している。増殖曲線はC-2（白丸）、C-3（白四角）、2-1（黒丸）、2-5（
黒四角）、および2-7（黒三角）について示されている。
図８はIRF-1によるIRF-2誘導性トランスホーメーションの抑制を示している。
（Ａ）は疑似誘導（レーン1-7）またはNDV（ニューキャッスル病ウイルス）（
レーン8-12）により誘導されたハイグロマイシン耐性クローンにおけるヒトIRF-
1 mRNAの発現を示している。細胞系列を以下に示す；レーン１および８、細胞系
列2-1-1；レーン２および９、2-1-2；レーン３および10、2-5-2；レーン
４および11、2-7-1；レーン５および12、2-7-2；レーン６、C-3；レーン７、2-7
。矢印は保護されたヒトIRF-1プローブの位置を示している。
（Ｂ）はゲルシフト分析によるIRF-1およびIRF-2活性の検出を示している。
白および黒三角は各々IRF-1およびIRF-2の因子−DNA複合体の位置を示している
。内在性マウスIRF-1活性は長時間露光後のみレーン３および６で検出された。
速く移動するバンドは恐らくDNAプローブに結合したIRF-1および／またはIRF-2
の分解産物を示している。ゆっくり移動するレーン4,5,7,8,10および11のバンド
は２つのIRF-2分子に結合したDNAプローブを示している。
（Ｃ）はプローブとして各々マウスIRF-2 cDNAおよびヒト3−アクチンシュー
ドジーンを用いた５μgのIRF-2 RNAのノーザンブロット分析の結果を示している
。
（Ｄ）はC-3，2-7，2-7-3および2-7-4細胞系列の増殖曲線を示している。増殖
曲線はC-3は白四角、2-7は黒三角、2-7-3は白三角、および2-7-4は白丸で示され
ている。
発明の詳細な説明
本発明はIRF-1が種々のガン患者においてその対立遺伝子の１つまたは両方が
欠失または変異している腫瘍抑制遺伝子であるという知見およびそれがdel(5q)
中の「重要な欠失領域」である5q31.1に位置するという知見、および構造的に関
連している転写抑制因子IRF-2に対するIRF-2の比の変化は、IRF-1が抗オンコジ
ーン性を示す細胞増殖に顕著な効果を起こす一方、IRF-2の過剰発現が腫瘍発生
を促進するという知見に基づいている。
本発明の特徴として腫瘍化哺乳類細胞または哺乳類細胞の腫瘍化傾向を診断する
方法であって、
ａ）該細胞のIRF-1を生産する能力に関連するパラメータを選択する；
ｂ）該細胞が腫瘍抑制両のIRF-1を生産する能力に相当するパラメータ値を定義
する；
ｃ）該哺乳類が細胞を摘出し試料中の細胞の該パラメータ値を測定する分析を行
う。；
ｄ）ｃ）の測定値をｂ）の定義値と比較する。
以上ａ）乃至ｄ）のステップを含む方法を提供している。
以下に説明するように、好ましいパラメータは細胞内IRF-1／IRF-2モル比、染
色体５上のIRF-1をコードする遺伝子の存否、または染色体５上のIRF-1をコード
する遺伝子中の突然変異の存否または染色体５の存否である。
好ましくは、IRF-1／IRF-2比は各々IRF-1およびIRF-2をコードするmRNA分子の
細胞当たりの比と相関関係がある。細胞当たりのmRNA分子の値は、例えば各々IR
F-1およびIRF-2遺伝子の少なくともフラグメントに対応する標識したDNAをプロ
ーブとして用いて従来法に従ったS1ヌクレアーゼ・マッピング法で測定しうる（
例えば、マニアチス（Maniatis）等、Molecular Cloning，A Laboratory Mannua
l，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、コールド・スプリング
・ハーバー、NY(1982)）。適当なプローブは、該遺伝子のプロモーター領域、例
えば該遺伝子の約-100から+150、望ましくは約-50から約+100（主要キャップ部
位に対して）を含んでおり、また、以下に述べる実施例のヒト細胞を用いた場合
はヒト遺伝子の-46から+97を含んでいる。また、分析は目的の細胞と同じ動物種
の遺伝子由来のプローブDNAを用いて行うことが望ましい。mRNA分子の計数は使
用した特定の標識にしたがった従来法で行いうる。以下に述べる態様において該
プローブは放射能標識されており、IRF-1およびIRF-2のmRNAコピー数はデンシト
メータ分析による従来法で測定しうる。細胞数は従来法で測定した。
別の好ましい方法には各々特異的にIRF-1およびIRF-2を認識する標識された抗
体を用いる細胞内IRF-1／IRF-2タンパク質の免疫学的イムノブロット分析が含ま
れる。その１つの方法では全細胞タンパク質を単離し、各々標識した抗IRF-1お
よびIRF-2抗体と接触させ、生じた標識強度を測定する。この方法はウエスタン
ブロット分析の操作と、これに続く染色物または標識のデンシトメータ分析で行
うことが望ましい。抗体は放射能標識またはルシフェラーゼ標識されていること
が望ましく、染色物または標識物のデンシトメータ分析でタンパク質含量が与え
られる。
IRF-1／IRF-2比を検出する別の方法であって、ルーチンに本来の正常細胞また
は悪性の造血細胞（並びにあらゆる細胞系列由来の細胞）における細胞表面およ
び細胞内タンパク質の検出および定量に使用される方法はフローサイトメトリ
ーによるイムノフェノタイピングである（ウイリアム（William），C.L.，”Flo
wCytometric Analysis of Hematologie Specimens”「悪性血液病理学」、ノー
レス（Knowles）、D.M.編、ウィリアムス・アンド・ウィルケンス版、バルチモ
ア、メリーランド（1992））。ウエスタン・ブロットと同様、これも免疫学的な
技術であるが単離したタンパク質を用いるウエスタン・ブロットと異なりイムノ
フェノタイピングは懸濁液中の透過処理細胞に対してIRF-1およびIRF-2タンパク
質を指向する蛍光標識した抗体（望ましくはモノクローナル抗体）を直接使用す
る。この蛍光標識された細胞をフローサイトメータで分析する。各々IRF-1およ
びIRF-2に対する抗体に２つの異なる蛍光色素を結合することにより（上記参考
文献（ウィリアム（William），C.L.ibid.(1992)）のフローサイトメトリーにお
けるマルチカラー蛍光分析の章、pp.177およびpp181-182参照）、IRF-1およびIR
F-2タンパク質濃度が測定され、各細胞における相関をとることができた。この
ことはサイトフローメトリー分析の利点であり、分析している懸濁液における個
々の細胞および細胞集団に関する情報が得られる一方、ウエスタンブロット分析
では懸濁液中の全ての細胞から単離された全タンパク質に関する情報しか得られ
ない。フローサイトメトリーのもう一つの利点にはその速度（分析は長くとも24
時間で完了する）、IRF-1/IRF-2比と造血細胞中の他の細胞表面タンパク質の発
現を関連しうる事、および分析前に悪性と非悪性細胞を区別し、懸濁液中の悪性
および正常細胞におけるIRF-1/IRF-2比の測定を可能にすること等が挙げられる
。使用しうる詳細な方法は付録２（上述の章）に提供されており、そこでは造血
細胞中の細胞内IgMタンパク質がフローサイトメトリーで定量されている。適当
な同様の操作ではステップ６のマウスの抗ヒトIgM抗体の代わりに抗IRF-1または
抗IRF-2抗体が使用される。
選択されたパラメータがIRF-1をコードする染色体５中の対立遺伝子の数であ
る場合、対立遺伝子の数は標識されたIRF-1 DNAプローブを用いて該対立遺伝子
を標識する操作を行うことが望ましい。望ましい方法は従来の蛍光インサイチュ
ウ・ハイブリダイゼーションまたはFISH法である。
診断操作または患者に依存して方法は変化する。
患者が構成的なガンを発生する傾向を有するIRF-1の生殖系列欠失を有するか
どうかを決定するためには、末梢血液から単離した正常リンパ球中のIRF-1対立
遺伝子数を定量するのが適当である。間期の核を調べることもできる。別に細胞
をマイトジェンで有糸分裂させ、これらの細胞から中期染色体を入手することも
できる。間期細胞におけるIRF-1欠失を調べるためには、少なくとも長さ8-10kb
のゲノムIRF-1クローンを使用することが望ましい。より短いプローブだと間期
核においては適当なハイブリダイゼーション・シグナルを与えることは出来ない
。より長いクローンが望ましく、一貫したハイブリダイゼーション・シグナルが
19kbのIRF-1ゲノムクローンで提供されている。中期染色体におけるIRF-1欠失を
調べるためには、より短いプローブを使用しうる。この場合にはIRF-1 cDNAクロ
ーンも使用しうるが、19kbのIRF-1ゲノムクローンが望ましいことが分かった。
ガン診断のための組織生検またはアスピレートにおけるIRF-1対立遺伝子数の
定量は間期FISH法で行いうる。また、ここでも上述の長さが少なくとも8-10kbの
ゲノムIRF-1プローブを使用することが重要である。もし、これらの細胞が前悪
性または悪性状態により自然に有糸分裂を行っているのなら、アスピレートまた
は生検中に存在する有糸分裂細胞由来の中期染色体を検査する事ができる。上述
したものと同様の注意が中期分析の適当なIRF-1プローブの使用に適用すること
ができる。
IRF-1ゲノムまたはcDNAプローブはこれらのDNAフラグメントを含む適当なプラ
スミドベクターから従来法にしたがって単離しうる。
プローブからのDNAは、例えばニック・トランスレーション法などの従来法に
より、例えば蛍光で標識しうる。
ハイブリダイゼーション実験は、クオ（Kuo）等、Am.J.Hum.Genet.，49:112-1
9に報告されている方法と同様に細胞から抽出し、変性したDNAで行うことができ
る。
プローブDNAに対する適当な標識にはジニトロフェノールCDNP-11-dUTPまたは
ジゴキサゲニン-11-dUTPがあるが前者は例えばフルオレセイン・イソチオシアネ
ート結合ヤギ抗ラットIgGで、後者は例えばローダミン標識抗ジゴキサゲニン抗
体を用いて発色しうる。
細胞は２、１または０個のハイブリダイズしたドメインを有するというように
スコアを付けられる。腫瘍性の低い正常な細胞はIRF-1をコードする２つの対立
遺伝子を有している。蛍光ハイブリダイゼーション法により腫瘍性を判定する細
胞が至適数の対立遺伝子を有しているか、又はその１つまたは２つを欠いている
かを容易に測定するしうる。
また、パラメータにはIRF-1をコードする対立遺伝子の構造的転位がある。こ
のような構造的転位はサザン・ブロットまたはスロット・ブロッティングを用い
て検出しうる。これらの操作ではpHIRF31等のIRF-1 cDNA含有プラスミドから単
離された全長IRF-1 cDNAを適当なプローブとして使用しうる。
測定に使用する細胞試料から単離した適当なゲノムプローブを例えば、BgIII
、BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstIおよびXbaIから選択される種々のヌクレ
アーゼで消化する。適当なフィルターにブロッティング後、その消化物を例えば
ランダム・プライマー法により標識したcDNAプローブとハイブリダイズしうる。
この分析は、先ず、腫瘍性の低いと考えられる哺乳類由来の細胞で行ない転位
を受けておらず、かつ腫瘍抑制量のIRF-1を生産しうる細胞のIRF-1含量に相当す
る標準値を得る。
スロット・ブロッティングによる定量的DNA分析は試料細胞およびコントロー
ル細胞由来のゲノムDNAを用いて同様の操作で行いうる。適当な変性後、例えば
上述したようにブロットに標識したIRF-1 cDNAプローブをハイブリダイズさせ、
例えばレーザー・スキャンニング・デンシトメトリー等の適当な方法で定量する
。
サザン・ブロットおよびスロット・ブロッディングでは各ブロットをさらに洗
浄し、IRF-1を含む位置とは異なる染色体５上の位置、例えば5q22または望まし
くは5pを示すDNAプローブと再ハイブリダイズさせる。適当なDNAプローブには補
体成分９に対するcDNAプローブがある。このようなプローブはコントロール・プ
ローブとして働きIRF-1欠失を定量するための内部標準となる。IRF-1および対応
するC9のオートラジオグラフ・シグナルを測定し、IRF-1：コントロール（例え
ばC9）のハイブリダイゼーションの比率を各試料について計算する。
以下に示すように、上述のサザン・ブロッティングおよびスロット・ブロッテ
ィングを用いて、コントロールとの比較からIRF-1ハイブリダイゼーション・シ
グナルの減少により転位を受けていないIRF-1対立遺伝子の存否を検出し、１つ
または両対立遺伝子の欠失、即ち細胞の腫瘍発生傾向の増大を示すことができる
。
選択したパラメータが１つまたは両IRF-1対立遺伝子の突然変異である場合、
このような突然変異は検討しているゲノムIRF-1 DNAの適当なフラグメントをシ
ーケンシングし、コントロールまたは公表されているIRF-1 DNA配列由来のフラ
グメントと比較することにより決定しうる。この分析はゲノムDNAで行うことが
望ましい。適当な処理後、DNAを適当なプライマーを用いたPCRで増幅し、例えば
アガロース・ゲル電気泳動でサイズ分離した後、望ましいDNAフラグメントを例
えばpBluescriptなどの適当なベクターにクローン化し、増幅後その挿入物を適
当に消化してから従来法でシーケンシングしうる。シーケンシングしたDNA中の
点突然変異およびより拡張した突然変異は組織試料中の１つ以上のIRF-1対立遺
伝子の機能の損失を示している。
以下に述べる試料10に使用したHindIII法はこの患者の転位フラグメントのク
ローニングのために特別に設計した。設定に依存してスクリーニングは生殖細胞
中のIRF-1欠失または変異を有する患者であって、本人およびその子孫全員がガ
ン発生を危惧されるヒトに対して行った（p53腫瘍抑制遺伝子の場合と同様に；
マルキン（Malkin）等、Science 250:1233-1238(1990)）。この場合、末梢血液
のリンパ球から単離したDNAに対して特異的IRF-1エクソンを増幅する。各エクソ
ンをPCRで増幅し、増幅した産物について以下に述べる方法で突然変異によるス
クリーニングを行った。また、潜在的に悪性障害を有する部分からの組織試料ま
たはアスピレートについて生殖細胞中に存在するか、または体細胞中に獲得され
たIRF-1突然変異に関するスクリーニングを行った。この場合、腫瘍中の欠失ま
たは変異を検出するために、アスピレートまたは生検中に存在する細胞から単離
したDNAを使用する。さらに、種々のIRF-1エクソンに対するプライマーを使用し
て全DNAから特異的エクソンを立ち上げ、各エクソンを例えば以下に示す方法の
１つを用いて変異体のスクリーニングを行った：
１．キンズラー（Kinzler）等、Science 253:661-664(1991)の方法を使用した
RNaseプロテクション；
２．増幅したPCRフラグメントのクローニングおよびクローニング・フラグメ
ン
トのシーケンシングまたはクローニングを使用しないPCR増幅産物のダイレクト
・シーケンシング；
３．SSCP：PCRフラグメントを一本鎖コンホメーション多型分析による突然変
異のスクリーニング。このスクリーニング操作は相同的p53遺伝子における突然
変異の検出に特に有効である（マシヤマ（Mashiyama）等、Oncogene 6:1313-131
8(1991)およびオリタ（Orita）等、PNAS USA 86:2766-2770(1989)）。
さらに、本発明の特徴として哺乳類細胞が腫瘍を発生させる傾向を軽減するか
、またはIRF-1をコードするDNA配列を含む細胞の腫瘍化を抑制するためのクロー
ン化したDNAが提供される。このようなクローン化したDNAにはヒトのIRF-1をコ
ードするDNA配列が含まれることが望ましい。
上記のクローン化したDNAはIRF-1をコードするクローン化したDNAを用い、か
つ該クローン化したIRF-1 DNAを細胞に供給する事により細胞の腫瘍化する傾向
を軽減する方法または細胞の腫瘍化を抑制する方法に使用するのに適している。
また、細胞が腫瘍化する傾向を軽減する方法または細胞の腫瘍化を抑制する方法
には細胞にIRF-1を供給する事が含まれる。
表現型の変化、もしくは病気の治療を目的として細胞にDNAを供給する方法は
多くの刊行物に報告されているが、概説はミラー（Miller），Nature 357:455-4
60（1992,6,11）に見ることができる。この文献に見られる方法には、例えば腫
瘍へのリポソーム／プラスミドDNA複合体の直接的注入およびレトロウイルス・
ベクターおよびアデノウイルス・ベクターの使用が含まれている。DNAとトラン
スフェリンを複合体化することによりトランスフェリン・レセプターにDNAを指
向させる方法がアデノウイルスを同時に使用するように改良されて示されている
（例えば、コッテン（Cotten）等、Ｐroc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6094-6098(199
2)；ワグナー（Wagner）等、Proc.Natl.acad.Sci.USA 89:6099-6103(1992)；ク
リール（Curiel）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8850-8854(1991)）。
レチノブラストーマ細胞へのレチノブラストーマ遺伝子(RB)の野生型コピーの
導入はヌードマウスにおける腫瘍化を抑制した（1990,5,17発行のPCT Intl．App
l.9005180参照、RBcDNAを含むレトロウイルスを構築し、レチノブラストーマ細
胞系列に感染させることにより不活性または欠損RB遺伝子を置換する方法が述
べられている）。
1992年3月18日発行のヨーロッパ特許出願No.0475623は、モロニー・マウス白
血病ウイルスから誘導した組み換えレトロウイルスを用いて例えばオステオザル
コーマ細胞系列Saos-2にLTRプロモーターコントロール化の野生型p53を導入する
ことにより不活性または欠損p53遺伝子を置換する方法を示している。
遺伝子治療を行う適当な方法について詳述している他の刊行物の例には、とり
わけウイルスベクターの構築について説明しているローマー（Roemer）等、Eur.
J.Biochem.(FBBS)208:211-225(1992)；マイクロインジェクションによる細胞へ
のDNAの導入を行い哺乳類細胞のゲノム中の遺伝子を変化させたヨーロッパ特許
出願No.386766；患者の腫瘍浸透リンパ球をp53 DNAでトランスフェクトし、その
細胞を再び患者に導入するPCT特許出願卸9200329；脊椎動物の細胞または組織に
マイクロプロジェクタイルを用いてソマトトロピンをコードする遺伝子を転移さ
せるPCT特許出願WO 9107487および感染性組み換えレトロウイルスを用いて内皮
細胞に遺伝子配列を挿入するPCT出願WO 9207573がある。
直接的または哺乳類由来の細胞のトランスフェクションまたは感染および該細
胞の哺乳類への再導入による選択された細胞へのIRF-1遺伝子の挿入は上述の文
献の操作と同様に行いうる。
また、本発明は細胞、望ましくはIRF-1欠失または変異を含む造血幹細胞を全
幹細胞集団から生体外へ選択的に取り出し、IRF-1欠失または変異を有する幹細
胞を犠牲にして正常な幹細胞を選択的に増殖し、さらに正しい骨髄または末梢血
液細胞を患者に移植する治療方法にも適用しうる。このような治療法は患者から
の組織の摘出、IRF-1欠失または変異を含まない細胞組織の選択、該細胞集団の
増殖および注入または移植等による患者への再導入を含む。
また、本発明の特徴にはポリメレース・チェーン・リアクションによるIRF-1
遺伝子の配列またはその突然変異を検出するためのキットであって、バイアル、
チューブなど１つ以上の容器をきっちりと納めるキャリヤーを含むキットが含ま
れる。例えば、第１の容器にはIRF-1コード配列またはそのフラグメントを合成
する単一の標準DNAプライマーのペアセットが含まれる。このキットの使用は一
般に以下に示す実施例で説明するPCRの操作に準じている。また、このキットに
はDNAポリメラーゼ、バッファなどのPCR反応を行うのに使用するための別の容器
も含みうる。
さらに、本発明には細胞または組織のIRF-1/IRF-2比の測定用のキットであっ
て、他の抗体と交差反応を起こさないか、または実質的に起こさない、望ましく
はモノクローナル抗体である抗IRF-1抗体および抗IRF-2抗体を別々に含む容器を
納めたキットも含まれる。この抗体は標識されたものでも、または使用時に標識
するものでも良い。標識により適当な分析に際して抗原量の測定が可能になる。
このようなキットは単離したタンパク質のイムノブロット分析または各細胞中
のタンパク質レベルの分析、他の細胞表面タンパク質または細胞質タンパク質（
表現型マーカー）との相関関係またはDNA含量およびＳ期分画との相関関係を解
析するためのニムノフェノタイピング/フローサイトメトリー分析などに使用す
るのに適している。
抗体はIRF-1またはIRF-2または選択されたそのエピトープで免疫化した動物由
来の脾細胞をミエローマ細胞と融合し各抗IRF抗体を生産するハイブリドーマク
ローンを単離するような従来の方法で調製しうる。これらの抗体はIRF-1またはI
RF-2活性を各々中和するが交差反応は示さない。このような抗体の調製および潜
在的抗原エピトープの選択に関する適当な操作はニュージーランド特許No.22200
6、ヨーロッパ特許出願No.90106568.0（1991年12月3日登録のUS特許出願No.8010
48に該当する）およびホップ（Hopp）等、Mol.Immunol.20(4):483-489(1983)お
よびPCT 出願WO 8003564に開示されている。
さらに本発明の特徴には蛍光インサイチュー染色体ハイブリダイゼーションに
使用する哺乳類組織におけるIRF-1対立遺伝子数を測定するためのキットであっ
て、間期染色体または中期核中のIRF-1ゲノムにハイブリダイズしうる蛍光標識
したDNA配列または蛍光標識しうるDNAを含むキットが含まれる。該DNA配列には
例えばcDNAクローン（間期染色体へのハイブリダイゼーションに使用する）また
は少なくとも約8-10kbのゲノムクローン（中期核にハイブリダイゼーションする
）である。対立遺伝子の数は蛍光顕微鏡で計数する。さらに、この操作の内部標
準としてIRF-1およびIRF-2と同じ染色体に由来するが目的の領域からは適当
な距離をおいて存在する単一コピーのDNAプローブ（例えばIRF-1には5q3l、IRF-
2には4q）が含まれる。これにより組織試料中の対立遺伝子数が決定し、さらに
腫瘍になる傾向を有する不適当な対立遺伝子の数が分かる。
本発明を以下に示す実施例でより詳細に説明するがこれらは本発明を制限する
ものではない。
実施例１
ヒトの染色体5q上のIRF-1遺伝子の存在およびその詳細な位置がPHA感作リンパ
球由来の正常間期染色体上のIRF-1プローブの位置を測定する蛍光インサイチュ
ーハイブリダイゼーション（FISH）法を用いて決定された。以下に詳述するよう
にIRF-1プロモーターおよび10個全てのエクソンを含む19kbのIRF-1ゲノムクロー
ン（ヤマダ（Yamada）等、ibid.(1991)；図４Ａ参照）を蛍光標識し固定した間
期染色体にハイブリダイズした（ピンケル（Pinkel）等、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 85:9138-9142(1988)，サカモト（Sakamoto）等、IISystem Performance(1992
)）。
5q22および5q3l（IRF-1）に存在する配列を検出するプローブに異なる標識を
施し中期および間期のハイブリダイズ・ドメインの二色観察を可能にした。Ｒ.
ホワイト（White）（UT、ソルトレイク市、ユタ大学）により提供された5q22に
位置する19kb DNAプローブ（Cyn5.120）をジニトロフェノール(DNP)-11-dUTP（W
I，マジソン、ノバゲン）を用いたニック・トランスレーション（ピンケル（Pin
kel）等、ibid.(1988)）で修飾した。IRF-1ゲノムDNAプローブ（19kb；ヤマダ（
Yamada）等、ibid.(1991)）はジゴキシゲニン-11-dUTP（IN，インディアナポリ
ス、ベーリンガー・マンハイム）で化学的に修飾した。プローブはセファデック
スG-50スピンカラムで約20ng/μlの濃度で回収した。全ての標識反応は個々の要
素が0.3-1.0kbの長さの標識プローブを作るように調整した。
単色および二色ハイブリダイゼーションはクー（Kuo）等、ibid.(1991)の方法
を修正して行った。スライドガラス上のカルノイ固定細胞中の標的DNAを70%ホル
ムアミドおよび２×SSCに37℃で３分間浸漬することにより変性した。このスラ
イドを連続するエタノール溶液（70%、85%および100%）に浸漬して脱水し
た。脱水後、スライドをプロテイナーセK（2.5μl/ml）で38℃、３分間処理した
。
たまたま古くなった試料はハイブリダイゼーション効率が低く、長時間消化し
た（4-8分）。消化後、スライドを先と同様に脱水した。ハイブリダイゼーショ
ン混合物（50%ホルムアミド、２×SSC、10%硫酸デキストラン、1-5μgヒト胎盤D
NAおよび20ng 各プローブを含む10μl混合物）を73℃で５分間変性し、38℃で2
0分間インキュベーションした。この混合物を細胞を含むスライドに乗せ、カバ
ースリップで封じた。このスライドを37℃で約12時間インキュベートした。ハイ
ブリダイズ後、スライドを48℃で10分間50%ホルムアミドで３回洗浄し、さらに
、同温度で続けて２×SSCおよび0.2×SSCで洗浄した。ハイブリダイズした領域
を４×SSC、１%BSA溶液50μlで５分間処理した。ついで、このスライドをラット
抗DNP（0.5μ/ml；ベーリンガー・マンハイム）およびローダミン標識した抗ジ
ゴキシゲニン（ノバゲン）を含む50μlの４×SSCを用い室温で30分間処理した後
、続けて４回、４×SSC、４×SSC+0.1% Triton X-100、４×SSCおよびPNバッフ
ァ（0.1M リン酸２ナトリウム、0.1M リン酸１ナトリウム、0.05NP-40、pH8）
で室温、10分間の洗浄を行った。PNM（PNバッファ、５%ノンファットミルクおよ
び0.02%アジ化ナトリウム；遠心で固形分除去）による処理後、フルオレセイン
・イソチオシアネート結合ヤギ抗ラットIgG（16.6μg／ml；CalTag、バーリンガ
ム、CA）で30分間処理し、PNバッファによる10分間の細胞の洗浄を４回行った。
顕微鏡観察の前に細胞を4,6,-ジアミジノ-2-フェニルインレドール（DAPI）のア
ンチフェード溶液（ジョンソン（Johnson）およびデ（de）Ｃ．ノグエラ・アラ
ジョ（Nogueira Araujo）、J．Immunol.Methods 43:349-350(1981)）で染色した
。
適当なフィルターをもちいた蛍光顕微鏡観察はピンケル（Pinkel）等、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 83:2934-2938(1986)，ibid.(1988)に述べられているように行
った。IRF-プローブのみを使用した単色ハイブリダイゼーションでは顕微鏡の視
野にいる全ての細胞に２、１または０の点数をつけた。二色ハイブリダイゼーシ
ョンではIRF-1ドメインは少なくとも１つのグリーンFITC結合5q22ハイブリダイ
ゼーション・ドメインを示す細胞で計数した。
細胞の25%以上がハイブリダイゼーション・ドメインを含んでいないか、また
は50以下の細胞しか分析および計数していない調製物はデータ解析から除外した
。
図1Aに示したようにIRF-1プローブは染色体5q上の配列にのみハイブリダイズ
した。IRF-1はハイブリダイズした中期染色体のコンピュータ蛍光顕微鏡解析に
より染色体5q31に正確に位置づけられた（サカモト（Sakamoto）等、ibid.(1992
)）。図1Bに示されているように、このコンピュータ・マッピング法では自動的
に全染色体DNA、蛍光標識IRF-1プローブおよびコントロールとして使用した5q22
にハイブリダイズする蛍光標識プローブ（以下に詳しく議論する）の多色イメー
ジが得られる。15個の中期染色体を分析することによりIRF-1遺伝子は5q31.1に
正確に位置づけられ、染色体５のショート・アーム・テロメアに対して中間的位
置に存在することが報告されている。
実施例２
IRF-1が5q31を含む中間欠失または転移を有する造血腫瘍において欠失または
構造的に転位しているかどうかを調べるにために冷凍保存した細胞懸濁液をdel
（5q）を含む急性白血病およMDSの11個の代表検体および分析に十分な細胞を有
する5q31の相互転座を含むド・ノボAMLの２個の検体から選択した。これらの試
料には２個の古典的なレフラクトリー・アネミアを伴う5q症候群を含む４個の前
白血病骨髄形成障害（試料1-4）；２個のAMLに形質転換された過剰のブラストを
伴うレフラクトリー・アネミア（RAEB）（いわゆる「二次AML」）（試料５、６
）；５個のド・ノボAML（試料7-9、12、13）、１個のド・ノボALL（試料10）お
よび組み合わせ化学療法後にぶり返したAMLの試料１個（試料11）が含まれる。
完全な核および望ましくは分析する冷凍保存試料中の白血病腫瘍細胞が表１の各
試料に含まれている（カラム３および４）。同様に正常な骨髄および血液由来の
同様の凍結保存細胞懸濁液もコントロールとして使用した（試料16、17）。5q31
以外の領域を含む染色体5qの転位を含む造血腫瘍、すなわち、5q33を含む相互転
位を含む慢性骨髄単球白血病（CMMoL）サブタイプのMDSの場合およびｔ(2;5)(q2
3;q35)を伴うKi-1+非ホドキンリンパ腫の場合もコントロールとして選択した（
試料14、15）。
IRF-1欠失および構造的転位はプローブとして全長IRF-1 cDNA（pHIRF31）を用
いたサザン・ブロットおよび定量スロット・ブロットで検定した（マルヤマ（Ma
ruyama）等、Nucl.Acids Res.17:3292(1989)）。IRF-1欠失を定量するための内
部標準を提供するため、各ブロットを洗浄後、補体９（C9;pHLC9.55）に対するc
DNAプローブで再ハイブリダイズし（ジシピオ(DiScipio)等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81;7298-7302(1989)）5q13の位置を決定した（アボット(Abbott)等、Geno
mics4;606-609(1989)）。これらの操作は以下のように行った。
ウシ胎児血清（90% ；ハイクローン）およびDMSO（10% ；シグマ）中の細胞懸
濁液として予め-135℃で冷凍保存しておいた白血病性MDSおよびコントロール試
料から高分子量DNAを単離した。白血病腫瘍細胞およびミエロイド前駆体細胞は
当初にフィコール・ハイパーク（シグマ）遠心で濃縮した。単核細胞を単離し、
形態的に腫瘍細胞を計数して上述のように冷凍保存した。サザン・ブロット分析
のために患者試料およびコントロールからのゲノムDNAをBgIII、BamHI、EcoRI、
HindIII、KpnI、PstIまたはXbaIで消化した。試料当たり５μgのDNAを0.8%のア
ガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースまたはハイボンド-N+（アマーシ
ャム）にブロッティングした後、ランダム・プライマー法で標識したcDNAプロー
ブをハイブリダイズした（サンブルーク(Sambrook)等、MolecularCloning、A La
boratory Manual，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプ
リングハーバー・ラボラトリー(1989)）。各ブロットを高ストリンジェンシー条
件で洗浄した。
定量DNA分析には患者試料およびコントロール由来のゲノムDNAわアルカリ変性
し、中和後３段階希釈物２μg、１μgおよび0.5μgをニトロセルロースにブロッ
トした（サンブルーク(Sambrook)等、ibid.(1989)）。ハイブリダイゼーション
の条件はサザン・ブロットに使用したものと同様である。サザン・ブロットおよ
びスロット・ブロットの両方とも先ずプラスミドpHIRF3から切りだしたIRF-1cDN
Aプローブをハイブリダイズさせ（マルヤマ(Maruyama)等、ibid.(1989)）、6.0k
bのHindIIIフラグメントを検出後、洗浄してからプラスミドpHLC9.55（ジシピオ
（DiScipio）等、ibid.(1984)）から切りだした補体C9cDNAコントロールプロー
ブをハイブリダイズして3.0kbのバンドを検出した。
IRF-1および対応するC9オートラジオグラフ・シグナルをコンピュータ制御FOT
O/ANALYST画像解析システム（フォトダイン、ニューヨーク）を用いたオートラ
ジオグラフのレーザー・スキャンニング・デンシトメトリーで定量し、IRF-1：C
9ハイブリダイゼーション速度を各試料について測定した。
その結果を表１および表２に示す。
図２において、各レーンは以下の試料（表１に示されている）に対応する：1(
9),2(1),3(13),4(3),5(5),6(6),7(8),8(10),9(7),10（正常骨髄コントロール；
５μg），11（正常骨髄コントロール；2.5μg）。
図２に示されているように、IRF-1ハイブリダイゼーション・シグナルの有意
な減少はdel(5q)を伴うMDSおよびド・ノボAMSに観測されており（表１、試料1-1
1）、コントロールと比較してIRF-1：C9ハイブリダイゼーション比が減少してい
ることで示されている（表１、試料14-17）。IRF-1：C9ハイブリダイゼーション
比の減少は各試料中の白血病腫瘍細胞の割合およびdel(5q)を伴う細胞の発生頻
度と密接に関連している（表１）。IRF-1ハイブリダイゼーション比の減少に加
えて、IRF-1遺伝子の構造的転位も試料10で観測されており、以下に示すように
詳細に特徴付けられた。
興味深いことに、IRF-1ハイブリダイゼーション比の有意な減少は染色体5q31
を含む相互転位を伴うド・ノボAMLの場合にも検出されている（表１、試料12，1
3；図２）。即ち、ここでもIRF-1：C9ハイブリダイゼーション比の減少が各場合
での白血病腫瘍細胞の比率に対応している。サザン・ブロットではIRF-1コード
エクソンの転位は検出されず、これらの試料におけるパルス・フィールド・ゲル
電気泳動を用いた197kbのIRF-1遺伝子内での転位は無かった。対照的に、IRF-1
両対立遺伝子は5q33の相互転座を含むCMMoLおよび5q35を含む相互転座を持つリ
ンパ腫試料では維持されいる（表１、試料14，15）。
IRF-1がdel(5q)または5q31の転位を含むMDSおよび白血病の13例において欠失
しているという事実は、これらの試料がdel(5q)を伴うと報告されてきた造血腫
瘍の全スペルトルの代表であることから非常に有意であるといえる（ナイマー（
Nimer）およびゴールド（Gold）,ibid.(1987)）。さらに、最近IRF-1の欠失がde
l(5q)を伴うMDSおよび急性白血病の別の４例で検出された。
実施例３
ヒト白血病および骨髄腫におけるIRF-1の欠失：単色および二色間期細胞発生
的分析
間期細胞発生的研究が実施例１で述べたように行われてきた（ピンケル(Pinke
l)等、ibid.(1988)）。単色および二色蛍光インサイチユー染色体ハイブリダイ
ゼーション（FISH）実験をIRF-1：C9ハイブリダイゼーション比の測定に使用し
たの同様の冷凍保存試料について行った。単色FISHでは、19kbのIRF-1ゲノムDNA
（ヤマダ(Yamada)等、ibid.(1991)）を化学的に修飾し、固定化した細胞懸濁液
を含むスライド（表１、試料1-10，12，12，15-17世または細胞発生分析後に残
存する固定化細胞で調製したスライド（表１、試料11，14）に対してハイブリダ
イズさせた。顕微鏡の視野にいる全ての細胞についてIRF-1ハイブリダイゼーシ
ョン・ドメイン（対立遺伝子）を２、１または０個有すると言うようにスコアを
付けた。すなわち、試料の大部分である総計1000個の細胞にスコアを付けた（表
１、カラム６）。IRF-1欠失を欠くコントロール試料（表１、カラム７、試料14-
17）では、IRF-1対立遺伝子が細胞の84-90%で検出された。しかし、平均してこ
れらのコントロール細胞の10%だけが１であり、細胞の2.4%にはIRF-1ハイブリダ
イゼーション・ドメインは検出されなかった。細胞の92-95%が検出可能な２個の
IRF-1対立遺伝子を有し、IRF-1ハイブリダイゼーション・ドメイン１個もしくは
０個の細胞が5-8%である新鮮なリンパ球に比べて、凍結保存コントロールのFISH
ハイブリダイゼーション効率がこのように僅かに減少するこりは2-5年保存して
おいた凍結保存試料の使用およびFISH実験に反復配列プローブではなく比較的短
い（19kb）単一コピーゲノムプローブの使用が原因である（ピンケル(Pinkel)等
、ibid.(1986)，ibid，(1988)）。しかし、この確立されたバックグランドと比
較して、たった１個のIRF-1対立遺伝子が全細胞の24-88%の範囲でdel(5q)を含む
各MDSまたは白血病試料において有意な割合で検出された（表１、カラム７、試
料1-11）。単一のIRF-1対立遺伝子の損失も染色体5q31の相互転座を有する２つ
のド・ノボAMLの場合に確認された（表１、試料12，13）。FISH実験で得られたI
RF-1単一対立遺伝子の頻度は1000個以上の細胞を調べたところ形態学的
基準で決定した白血病腫瘍細胞の割合と良く相関していた。コントロールと比較
して、いくつかの急性白血病試料（表１、カラム７、試料7,8,10,12,13）は、有
意な割合で（〉10%）IRF-1ハイブリダイゼーション・ドメインを持たないと考え
られ、このことは白血病細胞では両IRF-1対立遺伝子が欠失していることを示し
ている。
IRF-1欠失のより詳細な研究を行うため、残存する固定化細胞を使用しうる試
料について二色FISH実験を行った。19kbIRF-1ゲノムプローブおよび5q22の特定
の配列（Cyn5.120；図1B参照）にハイブリダイズする19kb単一コピーゲノムプロ
ーブを各々標識しピンケル（Pinkel）等（ibid(1986)，ibid(1986)）と同様に間
期のハイブリダイズしたドメインの二色観察を行った。代表的試料を図３に示す
。少なくとも１個のFITC-5q22ハイブリダイゼーション・ドメインを含む細胞の
みにIRF-1ドメインのスコアが付けられた。50個以下の細胞しか分析、評価しな
かった調製物および25%以上の細胞が5q22ハイブリダイゼーションシグナルを欠
いている調製物は解析から除外した（表１参照）。
２つのコントロール試料で行った二色FISH検定において（表１、カラム９、試
料15,17）、IRF-1および5q22対立遺伝子の頻度および分布は全く同様であった。
80%以上の細胞が予想される２個のIRF-1および２個の5q22ハイブリダイゼーショ
ン・ドメインを有していた。これらのコントロールにおいて、１または２個のIR
F-1および5q22ドメインを種々の組み合わせで含む細胞は分析した細胞の2.2-7.9
%の範囲に含まれており、細胞の僅か2.0-4.3%は２個の5q22ドメインを含むがIRF
-1ドメインは含んでいなかった。
両方のIRF-1ハイブリダイゼーション・ドメインを欠き、１個または２個の5q2
2ハイブリダイゼーション・ドメインを保持する腫瘍細胞が二色FISHで分析したd
el(5q)または5q31転座を有する６個の試料のうちの１個で同定された（表１、カ
ラム９、試料６）。試料10で分析した残りの16個の内の４個で両法のIRF-1対立
遺伝子が欠失していたが、この試料は僅か16個しか分析していないためFISHデー
タの基準に合致しなかった（表１）。両IRF-1ドメイン（対立遺伝子）を欠損す
る腫瘍細胞を含む両試料は急性白血病の患者、すなわちAMLに転換するRAEBの場
合（試料６、細胞の22%がIRF-1ドメインを含まない）およびALLの場合（試
料10、細胞の25%）に由来するものであった。対照的に前白血病MDS全ての試料が
１個のIRF-1対立遺伝子の欠失しか無かった。単一のIRF-1対立遺伝子の欠失も5q
31の相互転座を有する両ド・ノボAML患者で確認された（表１、カラム９、試料1
2）。単色FISH分析で試料7，12および13は、両IRF-1対立遺伝子の欠失を有する
白血病細胞を含むことを示唆した（表１）。この可能性は二色分析では直接確認
されていない。我々は5q22は含むがIRF-1は含まないいくつかの細胞を観測して
いる。しかし、これらの細胞が二色分析で評価されていないことから、大きな欠
失が試料7，12および13の細胞において5q22内部標準およびIRF-1遺伝子の両方を
除去している可能性が残されている。この後者の可能性は5q22領域およびIRF-1
遺伝子各々の１個の対立遺伝子をすでに欠いている細胞が比較的高頻度に出現し
ている事で示唆される（試料7、80.3%、試料12、52.9%、試料13、55.9%）また、
二色FISH分析でdel(5q)を伴う６個の場合の３個が近接ブレークポイントの位置
に予期できない不均一性があることが分かった。伝統的細胞遺伝学的レベルで試
料2,6および７はdel(5q)（ql3q33）を含むと報告されている。これらのブレーク
ポイントを有するクローン群は残りのIRF-1および5q22ドメインが両方とも染色
体5qから欠失している筈なので１個のIRF-1および１個の5q22ドメインを有する
と予想される。しかし、１個のIRF-1/1個の5q22対立遺伝子を含む細胞群に加え
て、各試料に２個の5q22および１個のIRF-1ドメインを含む有意な細胞群が同定
された（表１、カラム９、試料2,6）。これらの知見は種々の近接ブレークポイ
ントを持つがIRF-1対立遺伝子の均一な欠失を有する種々の腫瘍細胞群（5q22は
保持または欠失している）がこれらの患者試料に存在した。また、ブレークポイ
ントの不均一性は5q31の転座を含むド・ノボAMLの両方の場合にも観察された（
表１、カラム９、試料12,13）。もし、１個のIRF-1対立遺伝子が転座の際に欠失
するなら（FISH検定で示されている）、大多数の細胞で予想される二色対立遺伝
子頻度は２個の5q22/１個のIRF-１となるであろう。しかし、この細胞群に加え
て、両方のAMLの場合で１個の5q22および１個のIRF-1対立遺伝子を有する細胞が
有意な割合で存在していた（表１、カラム９）。いずれのAMLの場合も転座5q31
に加えてモノソミー５を有しているので、これらの結果は以前細胞遺伝学的レベ
ルで検出されていた以上のDNAが染色体５の転座ブレークプイン
ト領域から欠失していることを示している。
実施例４
IRF-1突然変異による白血病および骨髄形成障害
残りのケースにおける保持されているIRF-1対立遺伝子が上記の分析では検出
できなかったより小さな欠失/挿入または点突然変異を有しているかどうかを調
べるために、ポリメレース・チェーン・リアクション（PCR）を用いて試料５以
外の全ての白血病およびMDS試料から単離したDNAから残存するIRF-1エクソンを
増幅し、そのPCR産物を以下に述べるキンズラー（Kinzler）等、Science 251：1
366-1370(1991)に則ったRNaseプロテクション分析により突然変異のスクリーニ
ングを行った。
４個の試料でエクソン７に単一の塩基変化が見つかったが（表１、試料4,6,8,
10）、この塩基変化はコドンの第３縮退ヌクレオチドで起こっており重要な物で
はなかった。
実施例５
IRF-1遺伝子内のブレークポイントの特性
サザン・ブロット分析はド・ノボALLである試料10（表１）のIRF-1遺伝子の構
造的転位を明らかにした。全長IRF-1 cDNA（図４Ｂ、左図）を用いた最初の実験
で、いくつかのIRF-1制限断片の欠失および新しい転位バンドが観測された。Bgl
II消化DNAでは13kbのフラグメント（IRF-1エクソンを含む；ゲノムDNA中の上流B
g1II部位およびイントロン中のBglII部位の消化から生じるもの、図４Ａ参照）
）の欠失および新しい1.8kbフラグメントの出現があった。同様に、HindIIIでは
2.0kbフラグメント（エクソン１および２を含む；図４Ａ）の強度の減少および2
.4kbの新たなバンドの出現があった。事実、5.0kbのBamHIフラグメント（エクソ
ン1-3を含む；図４Ａ）が消失し、3.9kbの新たなバンドが出現した。さらに、患
者がヘテロ接合体である試料の2.8kbBamHIフラグメント（図４Ｂ；左図）は天然
のBamHI多型に由来する（図４Ａ参照）。これらのデータは試料中の大部分の細
胞におけるIRF-1遺伝子の５’末端に含まれる欠失の存在と一致
している。IRF-1 cDNAプローブを用いた幾つかのフラグメント新たなバンドの検
出は、この試料中の白血病細胞群でより複雑なIRF-1転位が起こっていることを
示している。
試料10中の主要なIRF-1ブレークポイントの位置をより詳細に決定するために
、図4Aに示したゲノムIRF-1 クローンに由来するサブクローンを用いた別のサザ
ン・ブロットを行った。プローブ１はエクソン１を含むHindIII - Bg1IIフラグ
メントであり、プローブ２はエクソン２を含むBglII - HindIIIフラグメントで
ある。プローブ１を用いたハイブリダイゼーションは各酵素によりIRF-1の構造
的転位を明らかにした（図4B、中央図）。患者試料中のBglII消化DNAにおいて、
13kbバンドの消失および新たな0.5kbバンドの出現が観察された。HindIIIを用い
ると2.0kbのバンドの強度が著しく減少し1.4kbバンドが明確になる一方、BamHI
では5.0kbバンドの強度が著しく減少し、新たに3.9kbバンドが検出された。プロ
ーブ２を使用した場合（図4B、右図）、BglII消化では欠失または転位は明確に
はならなかったが、このことはブレークポイントがイントロン１のBglII部位の
５’側に存在しなければならないことを意味している。HindIIIおよびBamHI消化
DNAに関するプローブ１の場合と同様の欠失および転位がプローブ２でも観測さ
れた（図4B、右図）。
これらの実験は患者試料10におけるIRF-1遺伝子中の主要なブレークポイント
（表１）がイントロン１のBglII部位の５’側400bpの付近に存在することを示し
ている（図4A）。さらに、この転位を洞察するために、ポリメレース・チェーン
・リアクションを換えてインバースPCR（シルバー(Silver)、PCR ;A Practical
Approach， マクファーソン(McPherson)等編、オックスフォードIRL版、pp.137-
146(1991)）を使用し、正常および白血病DNA中のエクソン１およびイントロン１
間の領域にあるIRF-1遺伝子を増幅しシーケンシングした（図５）。
試料および正常DNA由来のゲノムDNA（１μｇ）をHindIIIで消化した。消化後
、試料をフェノール／クロロホルムで抽出しDNAをエタノールで沈殿させた。沈
殿DNAをリガーゼ・バッファ（50mM トリス-HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、１mM A
TP、１mM DTT）に１μｇ/mlとなるように希釈し、14℃で20時間、2.8ワイスユ
ニットのT4DNAリガーゼとインキュベートした。ライゲーション後、試
料をフェノール/クロロホルムで１回抽出し、DNAをエタノールで沈殿させた。沈
澱化したDNAを30μlの蒸留水に溶かし、95℃で10分間加熱することによりニック
を導入した。IRF-1エクソン１およびイントロン１の間の領域を図５に示したプ
ライマーおよび方向でPCR増幅した（DNAサーマル・サイクラー、パーキン・エル
マー・シータス）。反応は１mM MgCl2、0.01%ゼラチン、および1.25ユニットTa
q DNAポリメラーゼを含む50μlの溶液で行った（95℃、30秒、60℃、１分、70℃
、２分、40サイクル）。PCR産物をアガロース・ゲル電気泳動でチェックし、適
当なバンド（図５に示す）をゲルから溶出した。回収したDNAをpBluescriptにク
ローニングした。６個の独立したクローンをシーケンシングした。
この操作をIRF-1遺伝子の別のエクソンおよびイントロンでも繰り返した。
図5Bは白血病試料（P、試料10）および正常DNA (N)由来のクローン化したPCR
産物の配列を示している。白血病試料の配列はイントロン１中のプライマー１の
後の10ヌクレオチドが変化していることが見てとれる。
正常DNAでは予想される1.1kbのバンドが検出され、一方、白血病試料では約50
0bpの新しい小さいバンドが見られた。図５に示されるように、白血病試料のイ
ントロン１中のBglII部位の上流のDNA配列は、プライマー１DNA配列後の10個の
ヌクレオチドが正常のIRF-1と異なっていた。エクソン２に対応するプライマー
２の配列の下流には正常DNAと白血病細胞DNAとの間に変化は観察されなかった。
この結果はエクソン１およびIRF-1プロモーター領域の損失を生じる白血病試料
中のIRF-1の転位を確認するものである。
これらの結果は、IRF-1の１つの対立遺伝子はプロモーター領域およびエクソ
ン１の一部の欠失により試料10中の白血病細胞の大部分で不活性化している事を
示している。サザン・ブロット分析（図4B）、二色FISH実験およびdel(5q)(q13q
33)の細胞遺伝学的検出の全てが残存するIRF-1対立遺伝子が白血病細胞の有意な
集団で欠失していることを示している。従って、両IRF-1対立遺伝子がこの白血
病患者の有意な数の細胞で、１つ１つの染色体5qを含む大きな中間欠失、１つは
IRF-1プロモーター領域およびエクソン１を破壊する第２のIRF-1対立遺伝子中の
不活性化転位により不活性化している。
実施例６
マウスNIH3T3細胞の細胞サイクルにおけるIRF-1およびIRF-2のmRNA発現レベル
を調べた。NIH3T3細胞を先ず10%ウシ胎児血清（FCS）を含むダルベッコ修正イー
グル培地（DMEM）中で維持した。この細胞を集密化し、まず無血清DMEM中で血清
飢餓状態に24時間さらした後（G1アレスト）、10%FCSを補填したDMEMを添加して
細胞サイクルを転移させ、活性化後適当な時間に細胞を収穫した。DNAへの3H-チ
ミジンの取り込みをムドリ(Mudryj)等、EMBO J.9:2179-2184(1990)の方法に従っ
て血清活性化後指示されている時間に１時間に渡り５μCi 3H-チミジン(2.0Ci/m
mol)を用いて細胞（２×104）をパルスラベルして測定した。
図6Aに示したように、3H-チミジンの取り込み検定はDNA合成が血清活性化後8-
12時間で始まっている事を示している。また、細胞サイクルのフロー・サイトメ
トリー分析は、この時間帯に細胞が実際にＳ期に入ったことを示している。周期
的に全RNAを単離し、その10μgをIRF-1およびIRF-2 mRNAのS1マッピング分析に
使用した（フジタ(Fujita)等、Cell 49:357-367(1987)）。マウスのIRF-プロー
ブ（図6B）はハラダ(Harada)等（ibid.(1990)）のものと同様である（比活性IRF
-1は3.1×106cpm/pmol、IRF-2は3.0×106cpm/pmol）。ヒトのIRF-1プローブDNA
はヒトIRF-1遺伝子のヌクレオチド残基-46から+97（主要キャップ部位を+1とし
て）までの146ヌクレオチドである（比活性4.7×106cpm/pmol）。
図6Bに示されているように、IRF-1 mRNA発現は成長制限細胞中最も高いレベル
で観測され（約５コピー/細胞）、血清活性化後急激に減衰した。事実、IRF-１m
RNAは活性化後２時間後、成長制限細胞の５倍も低いレベルに到達し、その後DNA
合成の開始前から始まり徐々に増加した（図6B）。反対に、IRF-2 mRNAの発現レ
ベルは細胞サイクルを通じて基本的に一定のままであった。mRNAのコピー数はハ
ラダ(Harada)等、Cell,ibid.(1989)およびフジタ(Fujita)等、Cell,ibid.(1987)
の方法で測定した。
抗IRF-1抗体による細胞抽出物のウエスタン・ブロッティング分析も細胞サイ
クルにおけるIRF-1の振動を明らかにした。
ウエスタン・ブロット分析は以下に示すように指示された時間に行った。
全細胞抽出物は図6Cに示す時間に、５×105個の細胞を2.5×106細胞/50μlの
密度で分解バッファ（50mM HEPES - NaOH（pH7.0）、0.1%NonidetP-40、250mM
NaCl、100mM NaF、200μM NacVO4、10μg/mlのアプロチニン、PMSFおよびリ
ューペプチン）で４℃、20分間処理することにより調製した。４℃、20分間の遠
心後、抽出物を12.5%SDS-PAGEで分析した。その後、タンパク質を電気泳動的にP
VDFメンブレン・フィルターに転写し、Ponceau S非特異的色素（ハロー(Harlow)
およびレーン(Lane)(1988)）で染色した。免疫学的検出は抗マウスIRF-1モノク
ローナル抗体TK-1およびTK-3のカクテル（TBSTミルク中各々10μg/ml）を用いハ
タケヤマ（Hatakeyama）等、Science 252:1523-1528(1991)の方法で行った。
IRF-1発現は増殖抑制段階で最高点に達し、血清添加から３時間後に約６分の
１に下降し、その後再び増加する事が分かった（図6C）。これらの結果は細胞サ
イクルにおけるIRF-1 /IRF-2比の振動を示すものである。同様の観察がインター
ロイキン３（IL3）依存造血細胞系列BAF-DO3でなされた。
実施例７
細胞増殖に関するIRF-1 /IRF-2比の揺らぎ効果をIRF-2が過剰発現するNIH3T3
細胞クローンを生成することで調べた。マウスIRF-2 cDNAがチキンD-アクチン・
プローブから発現されるプラスミドpAct-2（ハラダ(Harada)等、ibid.(1990)）
をリン酸カルシウム方（フジタ(Fujita)等、Cell 41:489-496(1985)）によりNIH
3T3細胞（10cmシャーレ当たり５×105細胞）にneo耐性遺伝子pSTneoB（カトウ(K
ato)等、Mol.Cell.Biol.10(2):486-491(1990)）と共にコトランスホームした。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションから１日、700μg/mlのG418
を含む選択培地で維持した。G-418耐性コロニーを2-3週間後に単離した。コント
ロール細胞系列は親ベクターpAct-C（ハラダ(Harada)等、ibid.(1990)）でNIH3T
3をトランスフェクションしたものである。
neo耐性による選択後、高いレベルでIRF-2 mRNAを発現する幾つかのクローン
が得られた。さらに分析するために任意に３個の細胞クローン1-2、2-5および2-
7を選択し、そのRNAをプローブとしてマウスIRF-2 cDNAおよびヒトβ−アク
チン・シュードジーンを用いたノーザンブロットで分析した。これらのクローン
でのIRF-2 mRNAの発現レベルはpAct-Cトランスフェクション・コントロール細胞
クローン（C-2、C-3）で観測される基本的発現レベルの約40倍であった（図7A）
。しかし、ゲル・シフト分析により検定では（ハラダ(Harada)等、ibid.(1990)
）の方法を用いた）、クローン2-1、2-5および2-7におけるIRF-2タンパク質のレ
ベルはコントロール細胞で観察されたものの各々９、４および７倍であり（図7B
）、このことはIRF-2発現が転写後にダウン・レギュレートされていることを示
している。プローブとして５fmolの32P標識化Cl3オリゴマー（比活性5000cpm /f
mol）および２×104細胞由来の総細胞抽出物を用いて、ゲル・シフト分析を行っ
た。IRF-2を過剰発現する細胞は明らかな形態的変化を示さなかったが、その増
殖特性は著しい変化を見せた。35mmプレート当たり２×104個の細胞を植種し、1
0%FCSおよび700μg/mlのG4l8を補填したDMEM中で成育し、指示されている日にコ
ールターカウンターで計数した。図7Cに示されているように、2-1、2-5および2-
7細胞クローンはコントロールと同様の速度で増殖したがより高い細胞密度にな
ることはなかった（約３倍）。さらに、全てのクローンはアンカリッジ非依存的
増殖を示した。コロニー形成検定を基本的にミヤシタ（Miyashita）およびカヌ
ナゴ(Kanunago)Cell 5:131-138(1975)の方法で行った。この操作では、105個の
細胞を培養培地に溶かした1.3%のメチルセルロースに懸濁し、53%アガロースお
よび培養培地を含むアガロース・ベッドに重層して、植種後３週間目に計数する
。メチルセルロースゲルでのコロニー形成効率は6-15%であったが、コントロー
ルクローンでのコロニー形成は見られなかった（表２）。これらの性質は腫瘍転
換と相関することが多いと考えられている（フリードマン（Freedman）およびシ
ン(Shin)、Cell 3:355-359(1974); キース(Keath)等、Cell 39:339-348(1984)）
。
実施例８
IRF-2を過剰生産する細胞の腫瘍化傾向を調べた。FCSを含まない200μlに懸濁
したクローン2-1,2-5および2-7の３個のクローンの細胞（２×106）を4-６週令
のヌードマウス（Balb/c nu/nu; クリー ・ジャパン社）の両脇腹に皮下
注射した。細胞は注射部位に目視できる瘤が出現し、それが増加するかどうかで
腫瘍発生の目安とした。腫瘍は比較的短期間に（2-3週、表２）発生し、無制限
に増殖しつづけたが、転移の兆候は示さなかった。腫瘍を発生しなかったマウス
が６週間も見られた。同期間コントロール・クローンC-2およびC-3由来の細胞に
注射したヌードマウスには腫瘍は発生しなかった。IRF-2 cDNAトランスフェクシ
ョンおよび検定のサイクルを３回繰り返したが、結果は再現した。すなわち、各
実験において、IRF-2を過剰生産するクローンは増殖および腫瘍発生能に関して
変化を見せた（全部で12クローン）。さらに、ヌードマウスに発生した腫瘍から
回収した細胞では基本的に同レベルのIRF-2 mRNA発現および同様の増殖能が観察
された。これらの結果を総合すると、2-1、2-5および2-7細胞の増殖能の変化お
よび腫瘍発生は転写リプレッサーIRF-2の発現の増加によって引き起こされてい
ることを示している。
実施例９
IRF-2誘導性トランスホーメーションのIRF-1による逆転
上記の実施例はIRF-2のオンコジーン的傾向およびIRF-1およびIRF-2間のバラ
ンスの維持が細胞増殖の正常性の維持に重要であることを示している。このバラ
ンスがIRF-1の過剰発現により揺らぐと細胞増殖が阻害され（ヤマダ(Yamada)等
、ibid.(1991)）、一方IRF-2の過剰発現は上述したように無制限の増殖を推進す
る。本実施例はIRF-2を過剰発現するNIH3T3細胞によって示されるトランスホー
メーションされた発現型がIRF-1の発現レベルの増加によって元の発現型に逆戻
りし、IRF-1 ／IRF-2比を正常な範囲に保持することを示している。最後に、全
部で10個のエクソンを含む１kbDNA断片ならびにヒトIRF-1遺伝子のプロモーター
領域（主要キャップ部位から455 bp、ヤマダ(Yamada)等、ibid.(1991)）をIRF-2
トランスホーム細胞に導入した。細胞サイクルにおいて調節されたIRF-1遺伝子
発現の重要性を示した先の結果の見地から（図６）、内在性遺伝子の発現と異所
性IRF-1遺伝子を同調させることを保証するためゲノム性IRF-1クローンをこの実
験に使用した。
高いレベルのIRF-1を発現する細胞クローンを得るために、15μgのプラスミ
ドpUCHIRF1B（pUC19のEcoRI部位に19kbのヒトIRF-1遺伝子をサブクローニングし
た）をリン酸カルシウム法によりpMiwhgh（0.3μg）と共に2-1、2-5または2-7細
胞（10cmプレート当たり５×105細胞）にコトランスホームした。プレートは100
μg / mlのハイグロマイシンを含む選択培地のものでトランスフェクションから
１日維持した。2-3週間後、ハイグロマイシン耐性コロニーを単離した。
IRF-1遺伝子およびハイグロマイシン（hgr）耐性遺伝子、pMIwhgH（カトウ(Ka
to)等、Mol.Cell.Biol.10(2):486-491(1990)）をコトランスホーメーションした
2-1,2-5および2-7細胞系列およびハイグロマイシン耐性クローンを選択し、ヒト
IRF-1遺伝子の安定な組み込みに関してスクリーニングした。トランスフェクタ
ント2-1-1、2-1-2、2-5-1、2-7-3および2-7-4は各々親クローン2-1、2-5および2
-7に由来するものである。ヒトのIRF-1 mRNA発現は上述したS1マッピング分析で
検討した。表３にまとめたように、これらのクローンにおける定常的IRF-1 mRNA
発現レベルは高いものから低いもので以下に示す順番であった；2-5-2、2-7-3、
2-7-4、2-1-1および2-1-2。
ハイグロマイシン耐性クローンを疑似誘導または先に示されたように（フジタ
(Fujita)等、(1985)）NDV(ニューキャッスル病ウイルス)で誘導した。トランス
フェクトしたIRF-1遺伝子は全てのクローンにおいてウイルス誘導可能であり（
表３）、別の実験ではクローンされた遺伝子内のプロモーター配列もIFN誘導可
能であった（イトー(Itoh),Genomics 10:1092-1099(1990)）。誘導または疑似誘
導９時間後、全RNAを単離し、その５μgを先に述べた操作を用いたS1マッピング
で分析した。その結果を図8Aに示すが、各レーンは以下に示すとおりである；レ
ーン1-7、疑似誘導；レーン8-12、NDV誘導；レーン１および８、細胞系列2-1-1
；レーン２および９、2-1-2 ；レーン３および10、2-5-2 ；レーン４および11、
2-7-3 ；レーン５および12、2-7-4 ；レーン６、C3; レーン７、2-7。矢印は保
護されたヒトIRF-1 プロモーターの位置を示している。
IRF-1およびIRF-2活性はハラダ(Harada)等、ibid.(1990)の操作に従って行っ
たクローン2-7-3および2-7-4におけるゲル・シフト分析で示した。
この操作はプローブとして32P標識したC1オリゴマー5fmol（比活性5000cpm/fm
ol）および５×104個の細胞を用いて行った。C1オリゴマーは配列AAGTGAの
４回の繰り返しからなり、２つのIRF-結合部位を有する。このオリゴマーはIRF-
1活性を欠失させることが容易なことからC13オリゴマーの代わりとして使用した
（ワタナベ(Watanabe)等、Nucl.Acids Res.19:4421-4428(1991)）。その結果を
図8Bに示すが、各レーンは以下に示す通りである；レーン1,4,7および10は反応
混合物中に２μlの非免疫化ウサギ血清を含む；レーン2,5,8および11はウサギ抗
マウスIRF-1抗血清２μlを含む；レーン3,6,9および12は２μlのウサギ抗マウス
IRF-1抗血清を含む；レーン13は抽出物を含まない。白および黒三角は各々IRF-1
およびIRF-2の因子- DNA複合体の位置を示している。内在性マウスIRF-1勝つせ
いは長時間処理後だけレーン３および６で検出されている。速い移動を示すバン
ドはDNAプロモーターに結合したIRF-1および／またはIRF-2の分解産物を示して
いる。レーン4,5,7,8,10および11のゆっくり動くバンドは２つのIRF-2分子が結
合したDNAプロモーターを示している。
IRF-2 mRNAの発現は５μgのRNAをノーザンブロット分析して測定した。先に述
べたようにRNAを単離した。プローブDNAはランダム・プライマー法で標識したも
ので（アマーシャム）、マウスIRF-2に対してはpAct-2由来の1.4kbXbaIcDNAフラ
グメントであり（ハラダ(Harada)等、ibid.(1990)）、ヒトβ−アクチン（ヒト
β−アクチンシュードジーン）に対しては2.0kbのλHa-204のBamHI - PvuIIフラ
グメント（ミヤモト(Myamoto)等、ibid.(1988)）である。
全てのクローンにおけるIRF-2 mRNA発現レベルは図8Cに見られるように親クロ
ーンと同様であることが分かった。興味深いことに、図8Bに示したゲル・シフト
検定データはこれらのクローンにおけるIRF-2のDNA結合活性が異所性IRF-1発現
の結果減少していることを示しており、IRF-1が転写後IRF-2活性に影響している
可能性を示唆している。同様の観測が2-5-2でも得られた。
これらの細胞の腫瘍発生能は強く抑制されていた。事実、腫瘍発生が抑制され
る効率は異所性IRF-1 mRNA発現レベルと相関しており、高いレベルでヒトIRF-1
mRNAを発現する両クローン2-5-2および2-7-3は非常に強い抑制を示し、mRNA発現
レベルが比較的低いクローン2-7-4および2-1-1は幾分低い抑制を示す一方、クロ
ーン2-1-2は抑制を示さなかった（表３）。トランスホーメーションされた表現
型の損失または減少と一致して、2-7-3-および2-7-4細胞クローンは細胞飽
和密度の増加（図8D）およびアンカーリッジ非依存的増殖（表３）等トランスホ
ーメーション関連特性の各々損失または減少を示した。このようにNIH3T3細胞の
IRF-2誘導型トランスホーメーションはIRF-1遺伝子の導入および発現の増加によ
り逆転しうる。
増殖コントロールおよび腫瘍発生におけるIRF-IFNシステム
本明細書に示されているように、転写活性因子IRF-1およびその構造的関連転
写抑制因子IRF-2の比の変化は細胞増殖において顕著な影響を与える。IRF-1は抗
オンコジーン性を示す一方、IRF-2の過剰発現は腫瘍発生を促進する。IRF-1アン
チセンス・オリゴマーがミエロイド白血病細胞系列における分化を抑制すること
が示され（アブドラヒ(Abdollahi)等、Cell Growth Differ.2:401-407(1991)）
、NIH3T3細胞におけるIRF-1アンチセンスmRNAの発現がIRF-2過剰発現にときに見
られる表現型と同様の表現型を示すという我々の観測は、IRF-1が腫瘍抑制遺伝
子であるという考え方と一致している。IRF-1およびIRF-2は最初にタイプＩのIF
N遺伝子の転写調節因子として発見され（ミヤモト(Miyamoto)等、ibid.(1988)；
フジタ(Fujita)等、ibid.(1989)；ハラダ(Harada)等、ibid.(1989)）、つづいて
IFN誘導可能遺伝子の発現を調節することが示された（ハラダ(Harada)等、ibid.
(1990)；レイス(Reis)等、ibid.(1992)）。事実、IRF-1はIFN誘導可能である。
タイプＩIFNは正常細胞およびトランスホーム細胞における細胞増殖を阻害し（
アイナット(Einat)等、Nature 313:597-600(1985); リン（Lin）等、Science 23
3:356-359(1986)）、また、造血細胞におけるIFN発現の誘導はオートクライン様
に細胞増殖を阻害する（モア(Moore)等、Science 233:171-181(1984):レシニツ
キー(Resnitzky)等、Cell 46:31-40(1956)）。さらに、IFN-βまたはIFN-α遺伝
子クラスターのいずれかのヘミ接合体およびヘテロ接合体は急性リンパ腫性白血
病患者において染色体9q22が欠失しており（ディアス(Diaz)等、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 85:5259-5263(1988)、N.Eengl.J.Med.332:77-82(1990)）、IFNの損失
は正常な増殖コントロール機構を破壊し、白血病の発生を促進する（グランダー
(Grander)等、Bloode 79:2076-2083(1992)）。本発明はIRF-1が細胞増殖の阻害
に重要である一連の標的遺伝子の発現を含むIFNの重要な標的の1
つであり、かつIRF-1/IRF-2比の僅かな変化が細胞増殖を乱し、白血病を促進し
うるという発見を利用している。
染色体5q31領域およびdel(5q)
5q31の最近の物理マッピングは、IRF-1がIL-4/IL-5およびIL-3/GM-CSF遺伝子
クラスターの間に存在し、またIL-4およびIRF-1の両方が450 kb YACに存在する
ことを示している。すなわち、IL-9およびEGR-1はこの領域の末端の1-2Mbに存在
している（ワーリントン(Warrington)等、Genomics 13:803-808(1992)）。しか
し、上述したように先にこの領域にマッピングされた遺伝子はいずれも腫瘍抑制
因子遺伝子候補に予期される条件を満たしておらず（ナイマー(Nimer)およびゴ
ールド(Golde)、ibid.(1987)）、また、これらの各遺伝子について腫瘍抑制因子
遺伝子の役割に関する機能的確証が得られていない。5q31.1に相同的なCDC25(CD
C25C)（M.P.T.ミーカー(Meeker)、UCSE、サーター(sartor)編、Genomics 13:991
-913(1992)）が最近マッピングされて、IRF-1およびCDC25Cが175 kbパルス・フ
ィールド・ゲルフラグメントに共存していることが分かった。
さらに、CDC25はIRF-1欠失を含む全てのdel(5q)の場合において欠失しておら
ず、また、CDC25Cはエクソン１およびプロモーター領域間のIRF-1の欠失を有す
る10個の場合において欠失していない（表1）。
個々の患者におけるdel(5q)中の近接(5q13-15)および遠隔(5q31-33)のブレー
クポイントに観測される変化およびdel(5q)(q31q35)などのバリアントの出現は
、del(5q)中のブレークポイントの詳細な位置は5q31が欠失しているかぎり大し
て重要ではないことを示している。CSF1R(EMS)は5q33.1にマッピングされており
、5q33-q35を含む遠隔ブレークポイントを含むdel(5q)の場合にはヘミ接合的に
欠失している（ニエンハイス(Nienhuis)等、Cell 42:421-428(1985)；レ・ビュ
ー(Le Beau)等、ibid.(1986)）。最近、CSF1Rのホモ接合欠失が何人かのMDS患者
で報告されているが（ボールトウッド(Boultwood)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
88:6176-6180(1991)）、これらの発見は確認されていない。本明細書において二
色FISHの結果がdel(5q)ブレークポイントの詳細な位置はMDSの病因に重要ではな
いことを示している。個々のMDS患者の中でさえ、種々の5qに関する近接
ブレークポイントを含む細胞クローン集団が同定された。しかし、これらの全て
のクローンは5q31領域およびIRF-1対立遺伝子を欠いていた。また、このFISH実
験は種々のAML患者において転座5q31中のブレークポイントの部分でIRF-1対立遺
伝子を含むDNAの有意で不均一な損失があることを示している。これらの知見は5
q31を含む転座はバランスのとれた相互転座であるようであるという以前の細胞
遺伝学的研究と相反している（第４回白血病の染色体に関する国際ワークショッ
プ、1982）。
IRF-1のヘミ接合欠失の意味
レチノブラストーマ(RB)の研究から発展した腫瘍抑制因子遺伝子モデルでは、
腫瘍の発生は腫瘍抑制因子遺伝子の両方の対立遺伝子の機能の損失に由来する（
マーシャル(Marshall)、ibid.(1991)）。腫瘍発生のための予想される条件でも
単一の対立遺伝子の損失または不活性化が重要な生物学的結果であるとは考えら
れなかった。しかし、他のヒト腫瘍モデルにおける最近の研究は、腫瘍抑制因子
遺伝子の単一の対立遺伝子の損失が有意な生物学的効果を有しており、幾つかの
例で腫瘍を促進するのに十分であることを示した。ウィルムス腫瘍では11p13のW
T1遺伝子座のホモ接合欠失が起こるが、WT1遺伝子が小さな内部欠失を起こして
いる1つの例が発見された（ヘイバー(Haber)等、Cell 61:1257-1269(1990)）。
この場合残存するWT1対立遺伝子は正常であり、このことは特に変異が11p15など
他の遺伝子座に存在する場合、11p13における単一の変異対立遺伝子がウィルム
ス腫瘍発生を促進しうることを示している（ヘイバー(Haber)等、ibid.(1992)）
。同様に、神経繊維芽腫症における1つのNF1対立遺伝子の損失または不活性化は
軽い神経繊維芽腫を誘導するのに十分であり（リ(Li)等、ibid.(1992)）、また
、1つのAPC対立遺伝子の欠失または不活性化は結腸直腸アデノーマの発生を促進
する（ボゲルスタイン(Vogelstein)等、N.Engl.J.Med.319:525-532(1988)；グロ
ーデン(Groden)等、ibid.(1991)）。これら両モデルにおける腫瘍の発生は他の
プロト・オンコジーンおよび腫瘍抑制因子遺伝子の遺伝子座における変異の獲得
と関連している（マーシャル(Marshall)、ibid.(1991)）。また、p53の最近の研
究は僅かではあるがヌルp53対立遺伝子のマウスヘテロ接合体が
腫瘍を発生する一方、ヌルp53対立遺伝子のマウスホモ接合体は早い段階で種々
の腫瘍を発生することを示している（ドネハウア(Donehower)等、Nature 356：2
15-221(1992)）。集約すると、これらの研究は特定の腫瘍抑制因子遺伝子の単一
の対立遺伝子の損失が修正された細胞クローンの増殖を促進し、それによりさら
に遺伝的変異を起こした細胞集団を創製していく。
本明細書では単一のIRF-1対立遺伝子の損失が如何に生物学的に重要であるか
を示している。単一のIRF-1対立遺伝子の損失または不活性化はIRF-1／IRF-2比
を減少させるほどIRF-1の発現を減少し、細胞増殖を乱す。この意味で白血病お
よびMDS試料におけるIRF-2遺伝子を調べたが、サザン・ブロットではIRF-2の増
幅、欠失または構造的転位は検出されなかった。従って、単一のIRF-1対立遺伝
子の損失はdel(5q)を伴う白血病およびMDSにおけるIRF-1/IRF-2比の異常を起こ
しうる。
単一のIRF-1対立遺伝子を失った細胞のクローンはゆっくりとした拡大能を有
すると考えられ、さらに遺伝的変異を起こすことが予想される。興味深いことに
、5q症候群の患者の大部分により不活発な生物学的特性が見られる（ヴァン・デ
ン・ベルゲ（Van den Berghe）等、ibid.(1974),ibid.(1985);デワルド(Dewald)
等、ibid.(1985)）。最も頻度が高いタイプの内部欠失を含む、レフラクトリー
・アネミアおよびdel(5q)(q13q33)を有する女性は不活発な臨床経過、細胞遺伝
学的異常を獲得する確率の低さ、およびAMLへの転換速度の低さなどの特徴を有
する（デワルド(Dewald)等、ibid.(1985);ヴァン・デン・ベルゲ(Van den Bergh
e)等、ibid.(1985);ナイマー(Nimer)およびゴールド(Gold)、ibid.(1987)）。一
方、病気の経過とともに診断時の付加的細胞遺伝学的異常の存在またはそれらの
獲得および男性は白血病転換への高い頻度を有する（ナイマー(Nimer)およびゴ
ールド(Gold)，ibid.(1987)）。これらの知見は１つのIRF-1対立遺伝子の損失が
腫瘍発生を促進するが、本明細書で示されている白血病およびMDS患者における
細胞遺伝学的および分子的知見によって示されるように完全な白血病への転換に
必要なものは腫瘍集団における付加的IRF-1対立遺伝子の損失または他の遺伝子
座での突然変異の獲得であることを示している。前白血病骨髄腫を有する全ての
del(5q)患者は、IRF-1のヘミ接合性欠失を有する。また、各場合の患者が症状提
示
時に他の遺伝子座に強い細胞遺伝学的異常を獲得しているにもかかわらず、１つ
のIRF-1対立遺伝子の損失はdel(5q)を有するド・ノボAMLの各試料にも見られる
。興味深いことに、腫瘍集団に検出されるIRF-1のホモ接合的欠失を有する患者
は急性白血病であった。即ち、先行するMDSから生じたAMLの場合およびALLの場
合である。IRF-1構造を修正する突然変異はここで報告する患者の残りのIRF-1対
立遺伝子には検出されなかった。
まとめると、上述の患者に関して行った診断は1つのIRF-1対立遺伝子の損失が
第２のIRF-1対立遺伝子の損失または他の遺伝子座での別の遺伝的突然変異の獲
得により白血病へと進行する前白血病クローンの拡大に関する前段階の事象であ
ることを示している。
細胞増殖におけるIRF-遺伝子の調節
先にIRF-1遺伝子の発現はウイルス、IFNおよび幾つかの別のサイトカインによ
って一時的に導入されることが示された（フジタ(Fujita)等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86:9936-9940(1989);ハラダ(Harada)等、ibid.(1989);パイン(Pine)等、
Cell Biol.10:2448-2457(1990);ユ・リー(Yu-Lee)等、Mol.Cell.Biol.10:3087-3
094(1990)）。先の実施例は正常な増殖細胞において、この遺伝子も細胞サイク
ルによって調節されていることを示している。例えば、NIH3T3等の細胞において
、細胞が増殖抑制状態にあるとき最もIRF-1遺伝子発現が高く、血清刺激後増殖
の回復とともに急激に下降し、細胞がS期に入るまで徐々に増加する。本明細書
で示されているようにNIH3T3細胞系列におけるIRF-2の過剰発現はIRF-1の細胞増
殖抑制機能を抑制する。しかし、この様な抑制は細胞サイクルの特定の段階に細
胞増殖を修正するのに重要であるかもしれない。IRF-2の過剰発現は細胞の血清
依存の特性を変化させることはなく、また、これらは血清枯渇により増殖が抑制
される。このようにIRF-1の機能をIRF-2が抑制する「重要な」段階は、細胞が細
胞サイクルに入った後に起こることもあり得る。
IRF-システムおよび細胞増殖調節間の連結
以前、IRF-1が転写活性化因子であってタイプＩIFNおよびIFN誘導可能遺伝
子の発現に重要な役割を果たしており、また、IRF-2が同様のDNAシス・エレメン
トへの結合を競争することによりIRF-1の作用を抑制することが示された（フジ
タ(Fujita)等、ibid.(1989);ハラダ(Harada)等、ibid.(1990);ナフ(Naf)等、ibi
d.(1991);オウ(Au)等、ibid.(1992);レイス(Reis)等、ibid.(1992);スターク(Sta
rk)およびカー(Kerr)、ibid.(1992)）。ウイルス感染した細胞において、IRF-1
はIFN遺伝子の効率的な活性化に対して幾つかのタイプの修飾を受けなければな
らない（ワタナベ(Watanabe)等、ibid.(1991)）。本明細書に記載されている結
果はIRFシステムおよび細胞増殖の両方におけるIRF遺伝子の関与を示している。
通常の細胞におけるIFNによるIRF-1の急激な誘導は少なくとも一部はIFNによっ
て引き起こされる細胞サイクルの乱れに寄因する（ソカワ(Sokawa)等、Nature 2
68:236-238(1977);バークウィル(Balkwill)およびテーラー・パプジミトリウ(Ta
ylor-Papdimitriou)、Nature 274:798-800(1978)）。
IRF-1の効果はIRF-2の発現レベルに影響され、また後者の発現はは細胞型によ
り様々であると予想される。
IRF-1誘導細胞増殖調節の予想されるメカニズム
本明細書に記載されている結果から、IRF-1が細胞増殖のネガティブ調節に必
要とされる産物の遺伝子群を活性化すると言うことができる。このような遺伝子
の発現はIRF-2がIRF-1の機能を抑制する事により細胞の転換を誘導すると考えら
れることから、細胞増殖の正常な調節に重要である。この仮定はIRF-1の発現がI
RF-2によって誘導されるトランスホームされた表現型を抑えるという観測によっ
て支持される。先に、全部ではないが、多くのIFN誘導可能な遺伝子がプロモー
ター領域内にIRFを結合する配列を含んでいることが示された（ヴィルセク(Vilc
ek),ibid.(1990);スターク(Stark)およびカー(Kerr),ibid.(1992)）。これに関
して、IFN誘導可能な2'-5'-オリゴアデニレート・シンセターゼが細胞増殖の阻
害に関連していることを示す証拠が提供されたが、この点に関する反対の報告も
ある（レベル(Revel)およびチェバス(Chebath),Trends Biol.Sci.11:166-170(19
86);デ・メーヤー・ギナード(De Maeyer-Guignard.ibid.(1988)の概説参照）。
興味深いことに、この酵素の活性は細胞サイクルを乱すと考えられ
（ヤコブセン(Jabobsen)等、Proc.Natl.Acad.Sce.USA 80:4954-4958(1983);ウェ
ルス(Wells)およびマルシ(Mallucci),Exp.Cell Res.159:27-36(1985)）、また、
その発現はIRF-1によって調節される（オウ(Au)等、(1992)；レイス(Reis)等、(
1992)）。一方、IRF-1は１つ以上のメカニズムを経てその作用を起こすことも考
えられるし、また、細胞増殖の調節に重要な特定のメカニズムが細胞型または細
胞の状態に応じて変化するのかもしれない。特にNIH3T3細胞においてIRF-2の過
剰発現により誘導される表現型と同様の表現型がIRF-1アンチセンスRNAの発現に
より誘導されることを示す結果を見ると、IRF-2の過剰発現がIRF-1の機能の抑制
以外のメカニズムでオンコジーン性トランスホーメーションを起こすとは考えに
くい。
従って、通常、IRF-1およびIRF-2は細胞増殖の重要な調節因子として機能し、
また、サイトカインは一時的に両因子のバランスの修正を誘導する。ウイルス感
染した細胞において、これらの因子はウイルス侵入に対する宿主の防衛に重要な
事象であるIFN-αおよびIFN-β遺伝子の効率的な引き金として利用されている。
腫瘍抑制因子としてのIRF-1およびその他の核因子
これまで提示されてきた結果は、IRF-1が腫瘍抑制因子群の新しいメンバーで
あることを示している（マーシャル(Marshall)、ibid(1991)；ウェインバーグ(W
einberg),Science 254:1138-1146(1991)）。これまで腫瘍抑制に関して３個の核
因子；p105-RB(pRB)（ウェインバーグ(Weinberg),ibid.(1991)；ハメル(Hamel)
等、Trends Genet.8:180-185(1992)）、p53（ホルスタイン(Hollstein)等、Scie
nce；レビン(Levine)等、Nature 351:453-456(1991)およびWT1因子産物（ヘイバ
ー(Haber)およびハウスマン(Housman)、Cancer Res.59:41-68(1992)；バン・へ
イニンゲン(van Heyningen)およびハステイ(Hastie),Trends Genet.8:16-21(199
2)）。後者の２つの因子はポジティブに(p53)（ファーマー(Farmer)等、Nature
358:83-85(1992)；カーン(Kern)等、Science 256:827-830(1992)）またはネガテ
ィブに(WT1)（マデン(Madden)等、Science 253:1550-1553(1991)）転写活性を直
接調節すると考えられている。
IRF-1は転写活性化因子として機能し、細胞増殖を調節する点で良く研究され
ている腫瘍抑制因子p53に類似していると考えられる。p53の濃度もIRF-1と同様
に増殖抑制期に上昇し、（カスタン(Kastan)等、Cancer Res.51:6304-6311(1991
)）、かつ、細胞サイクルを通して調節されていることは興味深い（レイチ(Reic
h)およびレビン(Levine),Nature 308:199-201(1984)）。また、IRF-1に関するIR
F-2の効果と同様に変異したオンコジーン型p53は野生型p53の機能を阻害するの
も興味深い（カーン(Kern)等、ibid.(1992)）。このことに関して、p53もIRF-2
同様天然のアンタゴニスト的因子を有する可能性もあり、事実、最近そのような
報告もなされている（モマンド(Momand)等、Cell69:1237-1245(1992)；オライナ
ー(Oliner)等、Nature 358:80-83(1992)）。同様にもう一つの腫瘍抑制因子遺伝
子WT1はDNA結合能を有するタンパク質をコードしており、最近の証拠はWT1タン
パク質が構造的に関連する活性化因子EGR-1および／またはそのタンパク質群に
よって仲介される転写を抑制することが示されている（マデン(Madden)等、ibid
.(1991);バン・ヘイニンゲン(van Heyningen)およびハスティー(Hastie),ibid.(
1992)）。
ヒトのガンにおけるIRF-1の役割
本明細書で示しているようにヒトIRF-1遺伝子は染色体5q31に位置しており、
１つのIRF-1対立遺伝子は染色体5qの中間欠失を含む急性白血病およびMDSの11例
および染色体5q31の相互転座を含む急性白血病の２つの場合の各々で欠失してい
る。ある急性白血病の場合１つのIRF-1対立遺伝子が転位して隣接プロモーター
領域および最初のエクソンの欠失が起きているのが観察された。さらに、残存す
るIRF-1対立遺伝子はこの場合の白血病細胞の大部分で欠失していることが分か
った。IRF-1/IRF-2比の僅かな変化が無制御に細胞増殖させうることを示す結果
を考慮して、１つまたは両方のIRF-1対立遺伝子の損失は特に5q31異常を有する
白血病およびMDSなど腫瘍を発生する重要な段階の傾向を示していると考えるこ
とができる。したがって、IRF-1はしばしばヒトの白血病およびMDSに起こる5q症
候群およびdel(5q)における重要な欠失遺伝子の１つである。
本明細書に示されているように、IRF-1対立遺伝子を欠いている、または突然
変異または転座した該対立遺伝子を含む細胞であって、本ネガティブ増殖因子に
応答できない細胞はより確実に腫瘍表現型を獲得する。
このように、IRF-1およびIRF-2は相互にアンタゴニスト様に作用する２つの構
造的に関連するDNA結合因子のユニークな例であり、その変化が細胞の転換に重
要なステップとなる抗オンコジーンおよびオンコジーン因子のバランスの重要性
を示している。
例えばMDS等の染色体５のロング・アームの欠失または突然変異または転座に
（del(5q)または転座5q31）より起こる腫瘍患者において、IRF-1は「重要な欠失
」腫瘍抑制遺伝子であるので、本発明は腫瘍、特にMDSおよびAMLの診断および治
療の新たな可能性を提供する。IRF-1ジャームライン（構成的）の欠失および体
細胞欠失および突然変異は、
１．例えば、MDSおよびAMS等の腫瘍の発生の傾向を持つヒトのより詳細な診断
および同定、
２．その病気が部分的にIRF-1突然変異で開始する、例えばMDSおよびML患者等
の腫瘍患者のより詳細な診断および同定でき、それにより新たな生物学的治療の
恩恵を被るMDSおよびAML患者のグループを限定する、
３．IRF-1突然変異および欠失、付加的核型（細胞遺伝学的）異常およびその
他の臨床特性に基づくMDSおよびAML患者の新たな前兆分類法の開発、
４．正常な真核細胞におけるIRF-1およびIRNα/β細胞増殖阻害経路の生理学
的理解に基づくIRF-1欠失および突然変異を有するMDSおよびAML患者の新たな生
物学的治療法の合理的設計であって、
ａ）IRF-1欠失および突然変異を含む造血細胞を選択的に除外するためにサイ
トカインまたは他の生物学的因子を使用する、またはIRF-1の機能の損失からお
こる生理学的欠陥を修正するためにサイトカインを使用する治療法の設計、
ｂ）全ヒト造血幹細胞(HSC)群からIRF-1欠失および突然変異を含むHSCの選択
的体外排除を可能にする、またはIRF-1欠失および突然変異を有するHSCを犠牲に
して正常なHSCを選択的に増殖し、そのような欠陥を有する幹細胞を骨髄または
末梢血液HSCから一掃して綺麗な骨髄または末梢血液HSCをMDSおよびAML患者に移
植しうる治療法の設計、
Ｃ）IRF-1欠失および突然変異を有するヒト細胞にIRF-1遺伝子を配給し、それ
によりIRF-1機能の損失の結果生じた遺伝的および生化学的欠陥を修正する遺伝
子治療法の設計、
以上、ａ）乃至ｃ）の事項が含まれる新しい治療法の開発、
以上１乃至４の事項を可能とする。
実施例10
IRF-1またはIRF-2の遺伝子を含むレトロウイルスによる細胞のトランスフェクシ
ョン
マウスIRF-2 cDNAの発現を行う組み換えレトロウイルス・ベクターpGDIRF2を
構築した。組み換えレトロウイルスｐGDIRF2はpGDベクターにマウスIRF-2 cDNA
を挿入する事により構築した（デイリー(Daley),G.Q.等、Science 247:824(1990
)）。このDNA構築物を¢2細胞にトランスフェクションし（マン(Mann),R.等、Ce
ll 33:153(1983)）、NIH3T3細胞にneo耐性を付与する能力で検定して高活性値（
約106cfu/ml）の上清を調製した。NIH3T3細胞にpGDIRF2レトロウイルスを高感染
多重度（m.o.i.）で感染させ、細胞を直接メチル・セルロース・ゲル上でコロニ
ー形成検定した。表４にまとめた様に、コントロールpGDウイルスとは異なり、I
RF-2発現ウイルスで感染した細胞は高い効率でコロニーを形成した。全ての細胞
がウイルスに感染したとすると、コロニー形成効率は上述の３個の選択したクロ
ーンと同様である（表１参照）。組み換えレトロウイルスpGDIRF1はpGDベクター
にマウスIRF-1 cDNAを挿入することにより構築し、¢2細胞にトランスフェクシ
ョンすることによりウイルスpGDIRF2と同様に高ウイルス活性値の上清を調製し
た。NIH3T3細胞（クローンR2-7）にこのウイルスを感染させると、この細胞のIR
F-2誘導トランスホーメーションがIRF-1遺伝子の導入および発現の増加によって
逆転しうることが分かった。この観察はpGDIRF1レトロウイルスで感染したR2-7
細胞のメチルセルロース・ゲルで形成されるコロニーの著しい減少と一致してい
る（表５）。これらの結果を考え合わせると、IRF-2はオンコジーン性を有し、
かつ、IRF-1およびIRF-2発現のバランスの維持が抑制された細胞増殖に重要であ
ることを示している。このバランスがIRF-1の過剰発現で乱された時、細胞増殖
は阻害され（ヤマダ(Yamada)等、ibid；アブドラヒ(Abdollahi)等、Cell Growth
and Differ.2:401(1991)；クチホフ(Kuchhoff),S.等、Interferon Res.12(S);1
02(1992)）、一方、IRF-2の過剰発現は無抑制の増殖を促進する。
登録
ブダペスト協定に基づく以下の登録は、305日本国茨城県筑波郡矢田部町通産
省国立バイオサイエンス・アンド・ヒューマン・テクノロジー研究所（以前はFE
RMとして知られていたMIBHT）で行った。
受理番号 説明
pUCIRF-1 制限部位SalI（XhoI）およびSmaI（Hi
ncII）の間にヒトIRF-1 をコードする
cDNA挿入物を含む。pUCIRF-1の制限地
図は図９に示した。
pHIRF4S-51 制限部位XhoI間にヒトIRF-2 をコード
するcDNA挿入物を含む。pHIRF4S-51の
制限地図は図10に示した。
pUCHIRF1B 19kbのヒトゲノムIRF-1 挿入物を含む
実施例9 参照。
ハイブリドーマTK3 IRF-1 特異的なモノクローナル抗体TK
-3を生産する。実施例6 参照。
本明細書に記載されている全ての刊行物は参考として引用している。
これまで本発明の明瞭かつ十分な理解を目的として詳細に記載してきたが、当
業者が本開示を読むことで本発明および本発明の請求の範囲を逸脱する事なしに
形式および詳細において種々の変化を行いうることは明白である。
配列表
(1)一般的情報
(i)出願者：タニグチ(Taniguchi),タダツグ(Tadatsugu)
ウィルマン(Willman)・チェリル(Cheryl)L.
パラビチニ(Pallavicini),マリア(Maria)G.
ハラダ(Harada),ヒサシ(Hisashi)
タナカ(Tanaka),ノブユキ(Nobuyuki)
(ii)発明の名称：腫瘍発生の診断におけるインターフェロン調節因子1および2
(iii)配列数：4
(iv)住所
(A)宛て名：スターン(Sterne)、ケスラー(Kessler)、コールドスタイン(G
oldstein)およびフォックス(Fox)
(B)番地：ニューヨーク・アベニュー1100
(C)市：ワシントン
(D)州：D.C.
(E)国：U.S.A.
(F)郵便番号：20005
(v)コンピュータ・リーダブル・フォーム
(A)メディア型式：フロッピーディスク
(B)コンピュータ：IBM PCコンパチ
(C)オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン・リリース＃1.0,バージョン＃1.25
(vi)現行出願データ：
(A)出願数：US（認定予定）
(B)登録期日：（本明細書と共に）
(C)分類
(viii)代理人情報：
(A)氏名：エスモンド(Esmond),ロバート(Robert)W.
(B)登録番号：32,893
(C)参照／協議番号：0652.112PC02
(ix)通信情報：
(A)電話：(202)371-2600
(B)ファクス： (202)371-2540
(C)テレックス：248636 SSK
(2)SEQ.ID No.1の情報
(i)配列特性：
(A)長さ：51塩基対
(B)分子型：核酸
(C)鎖型：二本鎖
(D)形状・線状
(ii)SEQ.ID No.1の配列
(2)SEQ.ID No.2の情報
(i)配列特性：
(A)長さ：51塩基対
(B)分子型：核酸
(C)鎖型：二本鎖
(D)形状：線状
(ii)SEQ.ID No.2の配列
(2)SEQ.ID No.3の情報
(i)配列特性：
(A)長さ：82塩基対
(B)分子型：核酸
(C)鎖型：二本鎖
(D)形状：線状
(ii)SEQ.ID No.3の配列
(2)SEQ.ID No.4の情報
(i)配列特性：
(A)長さ：82塩基対
(B)分子型：核酸
(C)鎖型：二本鎖
(D)形状：線状
(ii)SEQ.ID No.4の配列
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ 8615−4Ｃ
Ｂ 8615−4Ｃ
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｇ０１Ｎ 33/68 8310−2Ｊ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ
Ｒ，ＮＺ
(71)出願人 ザ ユニバーシティ オブ ニュー メキ
シコ
アメリカ合衆国 ニューメキシコ州
87131 アルバカーキ ノースイースト
カミノ デ サルード 900
(72)発明者 谷口 維紹
大阪府茨木市美穂ケ丘19―Ａ―207
(72)発明者 ウィルマン シェリル エル
アメリカ合衆国 ニューメキシコ州
87107 アルバカーキ ノースウェスト
エル アルハンブラ サークル 819
(72)発明者 バラヴィシーニ マリア ジー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94550 リヴァーモア ウォーカー プレ
イス 2571
(72)発明者 原田 久士
大阪府吹田市千里山西６―60―９―502
(72)発明者 田中 信之
大阪府吹田市山田東４―12―22―301