CN1098140A - 在致瘤性诊断中的干扰素调节因子1和2 - Google Patents

Abstract

一般来说，本发明是关于诊断致瘤的哺乳动物细 胞或诊断哺乳动物细胞的致瘤倾向性的一种方法。 另外，本发明涉及一种克隆cDNA或基因DNA，用 于降低细胞致瘤的倾向性，或抑制细胞的致瘤表型； 一种用于降低细胞致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤 表型的方法；一种用于处置患有肿瘤或易于以后发展 成瘤的患者的方法，以及一种用于诊断人的致瘤组织 或易于致瘤组织的方法。

Description

一般来说，本发明涉及对致瘤的哺乳动物细胞或对易于致瘤的哺乳动物细胞的测定方法。此外，本发明涉及适于降低细胞致瘤倾向性的或抑制细胞的致瘤表型的克隆cDNA或基因DNA;涉及减少细胞的致瘤倾向性或抑制细胞的致瘤表型的方法;涉及治疗患癌症的病人或易于随后发展成癌病人的一种方法;以及论断人的致瘤组织或易于致瘤组织的方法。

1、干扰素和干扰素调节因子1和2

干扰素（IFNs）属于多效胞质（cytokine）的系，最初是依据它们的抗病毒性质来识别的。各种组织在病毒感染时产生干扰素Ⅰ型即IFN-αs和IFN-β，并且通过诱导一批基因（IFN-诱导基因）在随后分泌的IFNs在靶细胞上发挥它们的抗病毒活性。最近，许多研究集中在IFNs在细胞生长和分化上的作用，而且业已证明IFNs对许多正常细胞和转化的细胞具有抗增殖作用（Weissmann和Weber评述，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.33：251-300（1986）;Pestlka等人，Annu.Rev.Biochem.56：727-777（1987）;De Maeyer，De Maeyer-Guignard，Interferons and Other Regulatory Cytokines;New York，John Wiley and Sons（1988）;Taniguchi，Annu Rev.Immunol.6：439-464（1988）;Vilcek，“Interferons etc.”Handbook of Experimental Pharmacology，Sporn and Roberts，eds.，Berlin，Springer-Verlag，pp.3-38（1990）;Sen and Lengyel，J.Biol.Chem.267：5017-5020（1992）。另外，许多研究也已证明IFNs和生长刺激因子呈相互对抗性的方式;IFNs表明有阻止生长因子-刺激细胞周期转换，而某些生长因子表明有逆转IFNs的抗增殖作用。而且，对于由许多生长因子诱导的IFNs，提出了IFNs在调节细胞生长的反馈机制中的生理学上的作用。因此，这些研究有助于支持这种普遍流行的信念，即IFNs是“负生长因子”（综述于Clements and McNurlan，Biochem.J.226：345-360（1985）;Tamm等人，Interferon 9，I.Gresser，ed.，California，Academic，Press，pp.14-74（1987）;De Maeyer and De Maeyer-Guignard，同上（1988）;Gresser，Acta Oncologica 28：347-353（1989）;Vilcek，同上（1990））。在这方面，感兴趣的是IFN  1型基因在某些类型的恶性肿瘤中常常被排除（Diaz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5259-5263（1988）;Miyakoshi等人，Caner Res.50：278-283（1990））。但是，关于IFNs的这些抗-增殖效应的机制方面知道的很少。

在对人IFN-β基因的调节机制的研究期间，证实了二种新的DNA-结合因子，即干扰素调节因子-1（IRF-1）和2（IRF-2）（Fujita等人，EMBO J.7：3397-3405（1988）;Miyamoto等人，Cell54：903-913（1988）;Harada等人，Cell58：729-739（1989））。因此在1989年8月24日申请的美国专利申请顺序号07/397，967中也公开了人和小鼠IRF-1和小鼠IRF-2的氨基酸顺序以及DNA顺序编码。这两种因子结构上有关系，特别是在具有DNA结合专一性的N-端区域。事实上，在IFN-α，IFN-β和许多IFN-诱导基因的启动子内发现这两种因子结合到相同DNA顺序要素上（Harada等人，ibid.（1989））。一系列基因转染研究已经证明，对IFN和IFN-诱导基因来说，IRF-1功能是作为一种临界激活因子，而IRF-2压制IRF-1效应（Fujita等人，Nature337：270-272（1989）;Harada等人，Cell63：303-312（1990）;Naef等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1369-1373（1991）;Au等人，Nucl.Acids Res.20：2877-2884（1992）;Resis等人，EMBO J.11：185-193（1992）;Stark and Kerr，J.Interferon R.12：147-151（1992））。在这种IFN-中介细胞应答方面，感兴趣的是，IRF-1基因本身的表达是IFN-诱导。在IFN-刺激细胞中IRF2基因也被诱导，但这种诱导作用只出现在继IRF-1基因诱导之后（Harada等人，同上（1989）。但是，先前的研究已表明，IRF-1和IRF-2在它们的稳定性方面不相同;在INF-处理或病毒-感染的细胞中前者有一短的半衰期（约30分钟），而后者比较稳定（半衰期约8小时）。在生长的细胞中，IRF-2含量高于IFR-1，但IRF-1/IRF-2之比随着因IFNs或病毒的刺激而增加（Watanabe等人，Nucl.Acid Res.19：4421-4428（1991））。因此，IRF-1/IRF-2比的瞬间增加在用IFNs调节细胞生长中可以是一种关键状况。和这种观点相一致的是发现了带有连接到人免疫球蛋白基因强化因子的人IRF-1基因的转移基因小鼠缺乏发育的B淋巴细胞（Yamada等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：532-536（1991））。

2、肿瘤阻遏物基因

人肿瘤发生是由于在调节细胞生长、分化和转移的多基因的位置上突变的渐进产生而引起的多步过程。在最佳的研究人肿瘤模拟中，随着肿瘤抑制基因中的“丧失功能”突变，在显性作用的原始致癌基因中发现“增进功能”突变。虽然多数原致癌基因刚开始识别和表征，但最近的研究已经证明几种肿瘤阻遏物基因，包括RB，p53，和WT1（Marshall，Cell 64：313-326（1991）），以及APC（Groden等人，Cell 66：589-600（1991）;Kinzler等人，Science 253：661-664（1991）），和NF1（Xu等人，Cell 62：599-608（1990）;Marshall，同上，（1991）;Li等人，Cell 69：275-281（1992））;对于人肿瘤的发育，它们的突变或缺失是关键的。在另外的基因位点的杂合性的丧失（Ponder，Nature 335：400-402（1988）;Marshall，同上，（1991））和人肿瘤中的特定染色体区域的再发生缺失已经支持这种观点，即许多更候选的肿瘤阻遏物基因有待研究识别。

染色体5（del（5q），“5q-”细胞基因异常性）的长臂间质缺失或全染色体5（-5或单体性5）的丧失是处在人白血病和白血病前期的脊髓发育不良的综合征（脊髓发育不良;MDS）的最经常再现的细胞基因的异常之中。Del（5q）或单体性5发现存在于30%患MDS的病人中，在50%患二期的或治疗-诱导成急性脊髓性的白血病（AML）的病人中，和分别在15%及2%重新患AML和重新得急性淋巴白血病（ALL）的病人中（Van den Berghe等人，Nature 251：437（1974），Cancer Genet.Cytogenet.17：189-255（1985）;Fourth International Workshop on Chromosomes in Leukemia，（1982）;Le Beau等人，J.Clin.Oncol.4：325-345（1986）;Nimer and Golde，Blood 70：1705-1712（1987）;Kerim等人，Leukemia 4：12-15（1990）;Pederson-Biergaard等人，Blood 76：1083-1091（1990））。这种del（5q）最初被描述作为一种独特的脊髓发育不良综合病（“5q-综合症”）的标志，它主要出现于患有再生性障碍贫血，血小板增多和异常的巨核细胞的成年女性病人身上（Van den Berghe等人，同上（1974））。患这种综合病症的女性通常有一种无痛的临床过程;被感染的骨髓干细胞克隆呈现具有慢的膨胀能力，仅不经常地产生另外的细胞基因的异常性，和仅10-20%病例转化成AML（Van den Berghe等人，同上（1985）;Dewald等人，Blood 66：189-197（1985）;Nimer and Gold，同上（1987））。相反，重新患上或二期的带del（5q）的AML病人通常地在形式上有另外的细胞基因异常性和一种很差的预后（Rowly等人，Blood 58：759-767（1981）;Fourth International Workshop on Chromosomes in Leukemia（1982）;Le Beau等人，同上（1986）;Samuels等人，Leukemia 2：79-83（1988））。在AML情况下，del（5q）/-5的存在常常与职业性的接触致癌物相关（Mite-lman等人，Blood 52：1229-1273（1978）;Golomb等人，Blood 60：404-411（1982）或者与为了治疗各种恶性肿瘤而早先接触烷基化制剂化学治疗或放射治疗相关（Le Beau等人，同上（1986））。

一系列的研究业已表明，del（5q）最小的一般缺失的片段，所谓的“关键”区存在于5q31带（Le Beau等人，Blood 73：647-650（1989）;Pederson和Jensen，Leukemia 5：566-573（1991））。少见的带有包括5q31移位的重新AML也已有描述（Fourth International Workshop on Chromosomes in Leukemia，1982）。这些发现提出病原基因在5q31中，并且这种基因的缺失对白血病和MDS的发病机理是重要的。许多候选基因已被定位到5q31区域，包括造血的生长因子和间白细胞素IL-3，IL-4，IL-5，IL-9，和GM-CSF，以及EGR-1转录因子（Huebner等人，Science 230，1282-1285（1985）;Le Beau等人，Science 231：984-987（1986）和同上（1989）;Sutherland等人，Blood，71：1150-1152（1988）;Warrington等人，Genomics 13：803-808（1992））。但是，目前这些基因中没有一种表明能满足候选肿瘤阻遏物基因的所希望的要求。尽管不一致，常常有报道在白血病和带有del（5q）的MDS病人中缺失一种IL-3，IL-4，IL-5，和GM-CSF等位基因（Le Beau等人，同上（1986），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5913-5917（1987），同上（1989）;Nimer and Golde，同上（1987））。业已发现在残留的等位基因中同型接合性，结构重排，或突变都没有降低（见Nimer and Golde，同上（1987））。在del（5q）病人中EGR-1的最近研究已经得到相似的负结果（G.Gilliland等人，Harvard University.私人通讯）。因此，在这领域中的候选肿瘤阻遏物基因还有待于研究阐明。

本发明一般目的是提供一种论断致瘤细胞或有致瘤细胞倾向性的方法。

本发明的具体目的，是提供一种论断致瘤的哺乳动物细胞或有致瘤的哺乳动物细胞倾向性的方法。

本发明的具体目的，是提供一种克隆cDNA或基因DNA以降低使细胞易于致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤表型。

本发明的又一目的，是提供一种降低细胞易于致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤表型的方法。

本发明的另一目的，是提供一种治疗患有或易于患有其后发展成癌症的病人的方法。

本发明的又一目的，是提供一种论断人的致瘤组织或易于患肿瘤组织的方法。

本发明的其它目的及其优点从下文所述将会更清楚。

附图简述

图1A是由正常的用IRF-1基因克隆杂化的淋巴细胞得的经过普鲁比啶碘化物（propidium iodide）染色后的中期染色体。

图1B是用计算机辅助对得自经IRF-1探针和单基因探针互补序列5q22的杂化了的正常中期的染色体5的微量分析。

图2是得自正常对照样品和得自白血病和MDS样品的经Hind Ⅲ消化后自DNA进行的Southern印迹分析图。

图3A表示用IRF-1探针（箭头1）和5q22（箭头2）在细胞核分裂间期原位杂化的双色荧光的结果，其中A是带有2个5q22和2个IRF-1等位基因的正常淋巴细胞。

图3B是带有4个5q22和仅2个IRF-1区域的S型白血病细胞，指明1个IRF-1等位基因的缺失。

图3C是因del（5）（qllq33）引起的带有仅1个5q22和1个IRF-1区域的白血病细胞。

图4说明在一急性白血病情况下IRF-1基因的结构重排的特征。

图5表示用反PCR（SEQ ID NO：1-4）在IRF-1基因内的转效点的克隆和序列。

图6说明在细胞周期的期间IRF-1mRNA表达的波动。

图7说明IRF-2在NIH3T3细胞中的过度表达。

图8说明通过IRF-1 IRF-2诱导转化的逆转。

图9、图10分别为质粒pUCIRF-1、pHIRF4S-51

附图详述

在图1A中，普鲁比啶碘化物-染色来自正常淋巴细胞的中期染色体表明用IRF-1基因克隆杂化，IRF-1探针是特异地杂化到染色体5q的序列上（箭头1）。在分裂间期核中也能检测到两个IRF-1杂化区域（箭头2）。

在图1B中，表明用IRF-1探针（箭头1）杂化正常中期的染色体5和单一基因探针在5q22互补序列（箭头2）的计算机辅助的微量分析，IRF-1基因被定位到与短臂端粒（染色体）有关的5q31.1上。

在图2中，是由正常对照和由白血病及MDS来的样品（也见表1）的Hind Ⅲ-消化的DNA的Southen印迹分析。滤过物开始用IRF-2 cDNA探针杂化、检出6.0 kb片段，然后除去并用C9探针再杂化，检出3.0kb键作内标物。道线编号相当于如下样品（表1标出）：1（9）、2（1）、3（13）、4（3）、5（5）、6（6）、7（8）、8（10）、9（7）、10（正常人骨髓对照;5μg），11（正常人骨髓对照，2.5μg）。

图3表明用IRF-1探针（箭头1）和5q22（箭头2）在细胞核分裂间期进行原位杂化的双色荧光的结果，其中：

（A）带有2个5q22和2个IRF-1等位基因的正常淋巴细胞;

（B）带有4个5q22和仅2个IRF-2区域的S型白血病细胞（代表样品12，见表1），表明除去1个IRF-1等位基因;

（C）带有仅1个5q22和1个IRF-1区域（因del（5）（ql lq33）引起的）的白血病细胞（样品7，表1）。

图4记述在急性白血病病例中（表1，样品10）IRF-1基因的结构重排的特征，其中：

（A）是人IRF-1基因图和含有外显子1和2的HindⅢ区带的放大。上部表明人IRF-1基因的外显子图;外显子的位置用填满的方形指出。下部是放大的含外显子1和2的HindⅢ区带。用有斜线的方形指出外显子的位置，而Southern印迹分析中所用的探针是探针1和探针2。限制性内切酶位点：H，Hind Ⅲ;Ba，Bam HI;Bg，BalⅡ.（Ba）表示一种多形的Bam  HI位点。

（B）是由正常DNA（N）和病人样品10（P）的基因DNA的Southerm印迹分析。同样制备的滤过物用如下各探针进行杂化：IRF-1  cDNA（左边图;pHIRF31的2.0 kb XhoⅡ片段;见实验方法），探针1，（中间图;如图4A注明的1.0kb Hind Ⅲ-Bg Ⅲ片段）和探针2（右图;如图4A注明的1.0kb Bg1 Ⅲ-Hind Ⅲ片段）。箭头指出在白血病样品（P）中与正常（N）DNA比较出现缺失和新的带正常DNA意味由健康的无白血病的无关个体来的DNA。

图5记述用反PCR在IRF-1基因内的转效点的克隆和序列。

（A）是包含外显子1和2及内含子1的IRF-1基因的1.9kb Hind Ⅲ-Hind Ⅲ区带图。在白血病样品（样品10）中新的Hind Ⅲ位点和产生的400 bp Hind Ⅲ片段用图上（Hind Ⅲ）指出，也指出了反PCR所使用的引物和定位。

（B）是由白血病样品（P;样品10）和正常DNA（N）衍生的克隆PCR产物的序列，用星号＊表示在白血病和正常DNA中的相同序列。白血病样品序列表明在内含子1的引物后偏离10个核苷酸。

图6说明在细胞周期的期间IRF-1mRNA表达的波动。

（A）说明用血清刺激引起胸苷渗入的动力学。在时间过程（在20小时1.3×10⁵cpm/2×10⁴个细胞）达到³H-胸苷渗入的最高量作为100%。

（B）说明在血清-诱导生长期间IRF-1和IRF-2mRNA的表达。NIH3T3细胞起始用血清饥饿来抑制，然后用血清添加来诱导。上部表示S1绘图分析的结果。在指定的时间，分离出总的RNA并进行分析，箭头指出保护的IRF-1和IRF-2探针的位点。道线M相当于³²P标记的HaeⅢ-消化的pBR322DNA片段。下部表明用密度计分析来计算从上部得到IRF-1和IRF-2的mRNA复制数目。曲线是IRF-1（白圆点）和IRF-2（黑圆点）。

（C）说明在血清诱导生长期间IRF1蛋白质的表达·NIH  3T3细胞如（B）中所述的生长停滞和刺激。

图7说明NIH 3T3细胞中的IRF-2的过度表达。

（A）表明Northern印迹分析，其中接着是IRF-2mRNA的表达。

（B）说明转染NIH 3T3细胞的IRF-2活性的凝胶位移分析。箭头指出IRF-2-DNA复合物的位置，迁移较快的带可能代表结合到DNA探针的IRF-2的分解产物（也见图8B）。

（C）说明对照细胞系和过度表达的IRF-2细胞系的生长曲线。指出的生长曲线中白圆点为C-2，白方形是C-3，黑圆点是2-1，黑方形是2-5，和黑三角是2-7。

图8说明用IRF-1逆转IRF-2诱导转化。

（A）表示人IRF-1mRNA在抗潮霉素克隆中的表达。道1至7是用NDV（新城病病毒）假诱导，道8至12是诱导的。细胞系如下：道1和8，细胞系2-1-1;道2和9，2-1-2;道3和10，2-5-2;道4和11，2-7-1;道5和12，2-7-2;道6，C-3;道7，2-7。箭头表示被保护的人IRF-1探针的位置。

（B）表示用凝胶移位分析检测的IRF-1和IRF-2活性的结果。白三角和黑三角分别表示IRF-1和IRF-2的因子-DNA复合物的位置。内源性鼠IRF-1的活性（道3和6）只有延长照射后才能检测到。迁移较快的带可能代表结合DNA探针的IRF-1和/或IRF-2的分解产物。迁移较慢的带（道4、5、7、8、10和11）代表由二个IRF-2分子结合的DNA探针。

（C）表示分别用鼠IRF-2cDNA和人3-肌动蛋白拟基因作探针，5微克IRF-2  RNA的Northen印迹分析的结果。

（D）表示细胞系C-3、2-7、2-7-3和2-7-4的生长曲线。其中白方形是C-3，黑三角是2-7，白三角是2-7-3，和白圆点是2-7-4。

本发明是以这种发现为基础而预测的，即IRF-1是一种癌症阻遏物基因在各种癌症病人中其一个或二个等位基因被去除或突变，并且它被定位到5q31.1，在del（5q）的“临界去除区”;并且IRF-1对其结构上有关的转录阻遏物IRF-2之比有微小的改变，它对细胞生长含有深奥的影响。由此，当IRF-1具有抗致癌基因的性质时，相反地，IRF-2的过度表达会促进肿瘤发生。

根据本发明的一方面，提供一种论断致瘤的哺乳动物细胞或论断易于致瘤的哺乳动物细胞的方法，其中包括：

a）选择一个与所述能产生IRF-1的细胞有关系的参数;

b）规定这参数的值，该值相当于能使所述细胞产生癌症抑制量的IRF-1;

c）将由所述哺乳动物的所述细胞样品移出并将所述细胞进行分析以测定在所述样品中细胞的所说参数值。

d）从c）得的测定值与从b）得的规定值进行比较。

如下所述，优先的参数是细胞内IRF-1/IRF-2摩尔比，在染色体5上有或没有一个或多个编码IRF-1的基因，或在染色体5上在一个或多个编码IRF-1的基因中有一个或多个突变，或有没有染色体5。

优选的是所采取的IRF-1/IRF-2比与每个分别对IRF-1和IRF-2编码的细胞的mRNA分子之比有关。每个细胞的mRNA分子值可以通过S1核酸酶依据已知方法绘图而测定（例如，见Maniatis等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，Cold Spring Harbor Laboratory（1982）），该方法是用标记的DNAs作探针其中DNA至少分别地相当于IRF-1和IRF-2基因的片段。合适的探针最好具有基因的启动子的区域，如基因的约-100至+150，约-50至约+100（与主冠位点有关）更好，而在如下描述的实例中，当用人细胞试验情况下，人基因的-46至+97区带（与在+1上的主冠位点有关）较合适。作研究的细胞最好使用相同动物种的基因的探针DNA来进行分析。使用已知方法依据使用的特定标记可以进行mRNA分子计数。在如下所述的具体方案中探针是经放射标记的，用已知方法通过密度计分析可得到IRF-1和IRF-2的mRNA复制数目。用已知方法可测定细胞数。

另一种更好的方法包括免疫测定的免疫印迹分析法，使用分别能特异地识别IRF-2和IRF-1的标记抗体来分析细胞内IRF-1/IRF-2蛋白质含量。在这样一种方法中分离出总细胞的蛋白质含量，与分别标记的抗IRF-1和IRF-2的抗体相接触，并测定所产生的标记强度。这方法最好接着Western印迹分析方法，然后再用光密度计分析产生的染色点或标记。优选地抗体是放射标记的，或用虫荧光素酶标记，并按已知方法光密度计分析染色点或标记物而得到蛋白质含量。

一种对IRF-1/IRF-2比测定的其他途径，它可常规地用于检测和定量细胞表面和在完整正常的或赘生的造血细胞的细胞（以及任何谱系的细胞）中的胞内蛋白质这是流式免疫表型的血细胞计数（见the Chapter of Willman，C.L.，“Flow Cytometric Analysis of Hematologie Specimens”，Neoplastic Hematopathology，Knowles，D.M.，ed.，Williams and Wilkens，Baltimore，Mary-land（1992））。类似Western印迹分析法，这也是一种基于免疫学的技术，但与要在分离的蛋白质上完成的Western分析方法不同，免疫表型化方法是应用荧光-标记的抗体（单克隆抗体更好），向着指向在悬浮体中完整易渗透细胞的IRF-1和IRF-2蛋白。然后荧光标记的细胞可以按流式细胞光度术检测通过使用二种不同的结合在不同的IRF-1和IRF-2抗体的荧光色（荧光染料）（上述文献（Will-man，C.L.，ibid.（1992））同一章的177页和181-182页），在流式细胞光度术的多色荧光分析），IRF-1和IRF-2蛋白质含量能够被检测，测定并且在分析下的每个细胞中的关联。流式细胞光度术分析的一个优点是，它可以提供在分析下有关各个细胞和细胞群体在悬浮体中的信息，而Western分析只观察悬浮体中由总细胞分离出的总的蛋白质。流式细胞光度术的另外优点包含其快速（分析在不到24小时便完成），使IRF-1/IRF-2比与血红细胞中其它细胞表面蛋白质的表达相互关联的能力，和辨别分析前非赘生细胞中的赘生细胞的能力，以可以在悬浮体中的有残余正常细胞的赘生细胞中示差测定IRF-1/IRF-2比。能够使用的详细方法学上的途径在上述文献附录2中有叙述，其中用流式细胞光度术定量测定在造血细胞中细胞内的IgM蛋白质，按照适宜的类似方法在第6步骤中以抗IRF-1或抗IRF-2抗体代替鼠抗人IgM抗体。

当选择的参数是编码IRF-1的染色体5中的等位基因数目时，最好通过使用标记的IRF-1  DNA探针标记这种等位基因的方法而测定等位基因数目。一种优选方法是用已知荧光素就地杂化或用FISH方法。

依据论断的方法和病人情况，方法可以改变。

若一个个体具有易于发展为癌的IRF-1的固有种系缺失，则为了测定适宜于由外周血液分离的正常淋巴细胞中定量IRF-1等位基因的数目。可以检查分裂间期核;或者将细胞能用诱导素诱导成有丝分裂、从而由这些细胞得到中期染色体。为了测定分裂间期细胞中的IRF-1缺失，最好使用长度至少是8-10kb的基因IRF-1克隆;较短的探针在分裂间期核中不会给出足够的杂化信号。较长的克隆是优选的，用19kb的IRF-1基因克隆已得到一致的杂化信号。为了测定中期染色体中IRF-1缺失，可以使用较短的探针。在这种测定中，也可以使用IRF-1 cDNA克隆但发现用19kb  IRF-1基因克隆更好。

为了对可疑癌症的论断，要在组织活体或吸出物中定量测定IRF-1等位基因的数量;分裂间期的FISH研究可以完成。再者，如上所讨论，主要使用长度至少8-10kb的基因IRF-1探针。若这些细胞因赘生前或赘生态而自然成有丝分裂，就可从在活体或吸出物中的有丝分裂细胞中检测间期染色体。类似上述的讨论，为了间期的分析可应用合适的IRF-1探针。

按已知方法，IRF-1基因的或cDNA探针可以从含有这些DNA片段的合适的质粒载体中分离出来。然后按已知方法，如用切口转译而荧光标记探针中的DNA。

杂化研究是适当地在由细胞提取的DNA上完成并变性，按类似于Kuo等（Am.J.Hum.Genet.，49：112-19）所述进行。

对探针DNAs适合的标记物是二硝基苯酚CDNP-11-dUTP或洋地黄毒苷-11dUTP，其中前者可例如用结合羊-抗鼠-IgG的荧光素异硫氰酸盐而展开，而后者可用若丹明标记的洋地黄毒苷抗体而展开。

细胞分为2、1或0杂化区域。正常细胞，有低的致瘤倾向，它有二个编码IRF-1的等位基因。用荧光素杂化方法易于测定怀疑有致瘤倾向的细胞有适合数目的等位基因或缺乏一个或两个等位基因。

参数也可以是等位基因或编码IRF-1的等位基因的结构重排。用Southern印迹或条状印迹（Slot blotting）有助于测定这种结构重排。在这些方法中从含有质粒例如pHIRF31的IRF-1  cDNA中分离出的全长IRF-1  cDNA可以用作一种适合的探针。

从在研究的细胞样品中分离到的适合的基因探针可用选自如Bg  Ⅲ，Bam HI，Eco RI，Hind Ⅲ，Kpn I，Pst I和Xba I的各种核酸酶进行消化。在合适的滤器上进行印迹后，消化液可以例如通过随机引物方法用标记的cDNA探针杂化。

对认为具有低的或没有成瘤倾向的相应的哺乳动物的相应细胞上;可以首先进行分析而提出一限定值标准，它相当于这种细胞的IRF-1含量，该细胞不经受重排并因而能产生一种抑制肿瘤量的IRF-1。

使用得自研究和对照细胞的基因DNA用类似方法通过条状印迹可以进行定量DNA分析。适当变性后印迹杂化到如上述的标记的IRF-1  cDNA探针上并用适合的方法如激光扫描光密度计进行定量。

最好在Southern和条状印迹中，随后将每个印迹洗出，并用一种DNA探针再杂化，该探针图距到不同于含IRF-1等位基因如5q22或最好是5p的染色体5的位点上，一种适合的DNA探针是用于补充成分9的cDNA探针。这样一种探针能用作对照探针以提供对定量测定IRF-1缺失的内标。IRF-1和相应的C9放射自显影信号能够定量而且对每个样品能够测定对照（如C9）的杂化率。

如下所述，上面所提的Southern印迹和条状印迹也可用于检测有没有不经重排的IRF-1等位基因，根据与对照比较在IRF-1中降低杂化信号，表明失掉一个或二个等位基因，因而增加细胞致瘤的倾向。

当选择的参数是一个或二个IRF-1等位基因的突变时，则可以通过将研究的基因IRF-1  DNA的适当片段序列分析并与对照样的或已发表的IRF1-1  DNA序列相比较就可测定这样的突变。这种分析最好在基因DNA上进行。适当完成后，用适合的引物和定位通过PCR可使所得的消化DNA进行放大：如使用琼脂糖凝胶电泳分离粒度大小后，所要求的DNA片段可以克隆进适合的载体如pBluescript，并在放大后用适当的消化作用可以除掉这种插入物并用已知方法作序列分析。在序列的DNA中的点突变和比较伸展的突变和比较伸展的突变可以表明在组织样品中失掉一个或多个IRF-1等位基因的功能。

如下所述，用于样品10的Hind Ⅲ方法是为在这种病人的重排片段的克隆而专门设计的。取决于定位对在种系中带有一个IRF-1缺失或突变的个体能够进行筛选，因而它们和它们的所有后代会在以后有得癌的危险（类似于p53肿瘤抑制基因;见Malkin等人，Science 250：1233-1238（1990））。在这定位中用于从外周血淋巴细胞分离出的DNA的特定IRF-1外显子能放大，个别外显子用PCR能够起动和放大，而且这些放大的产品通过下述技术则对突变筛选。或者，来自潜在赘生损伤的组织样品或吸出物，可对存在于种系的IRF-1突变进行筛选或者菌体地得到。在这种定位中，为检测肿瘤的缺失或突变可以使用由存在于吸出物或活体的细胞中分离出来的DNA。另外，可用对不同IRF-1外显子的引物以启动总DNA的特定外显子，并且这些外显子如通过下方法之一将对突变筛选：

1、使用Kinzler等人的方法（Science 253：661-664（1991）进行RNAse保护;

2、克隆放大的PCR片段并将克隆的片段进行序列分析，或者没有克隆而直接序列分析PCR-放大的产品;

3、SSCP：为了用单股构象多形态分析法将PCR片段筛选。这种筛选方法特别有用于检测在类似的p53基因中的突变（见Mashiyama等人，Oncogene  6：1313-1318（1991）and the original reference Orita等人，PNAS USA  86：2766-2770（1989））。

本发明又一方面是提供一种克隆的DNA用于减少哺乳动物细胞致瘤倾向或抑制这种细胞的致瘤表型，该细胞含有编码IRF-1的DNA序列。最好是，这种克隆DNA含有一个编码人IRF-1的DNA序列。

上述克隆DNA适用于通过使用编码IRF-1的克隆DNA并将克隆的IRF-1  DNA送到细胞而降低细胞致瘤倾向或抑制这种细胞的致瘤表型的方法中。或者降低细胞致瘤倾向或抑制细胞的致瘤表型的方法可以包括将IRF-1送入细胞。

将DNA送入细胞以改变其表型或有效治疗疾病的方法在许多刊物中都有描述，这些都简便地综述于Miller，Nature 357：455-460（1992年6月11日）中。在文献中描述的方法，包括如将脂质体/质粒DNA复合物直接注入肿瘤体，并利用反病毒载体和腺病毒载体，包括通过DNA与转铁蛋白复合而使DNA瞄准转铁蛋白受体的方法已表明通过随着使用腺病毒而有所改进（见，例如Cotten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6094-6098（1992）;Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103（1992）;Guriel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850-8854（1991））。

在裸体小鼠中将成视网膜细胞瘤细胞基因（RB）的野生型复制引入成视网膜细胞瘤细胞而抑制其致瘤性质（见PCT  Intt.Appl.9005180（1990年5月17日出版），它描述了一种方法，用构建一种含RB cDNA的反病毒以代替失活或缺损的RB基因并利用它来感染成视网膜细胞瘤细胞系）。

欧洲专利申请0475623（1992年3月18日出版），描述一种方法，利用从莫洛尼氏小鼠白血病病毒衍生的重组体反病毒代替失活或缺损的p53基因而在LTR启动子控制下将野生型p53引入例如软骨肉瘤细胞系Saos-2。

对实施基因治疗的详细合适方法，在其他刊物的实例中有：Roemer等人，Eur.J.Biochem.（FEBS）208：211-225（1992），他特别描述了病毒载体的构建;欧洲专利申请说明书386766描述了在完整哺乳动物细胞基因内通过微量注射将DNA引入细胞以改性基因;PCT专利申请WO 9200329，描述了用p53的DNA，渗入病人淋巴细胞而转染肿瘤并将这种细胞再导入病人;PCT专利申请WO 9107487，描述了使用微发射体，将编码生长激素基因转入脊椎动物细胞或组织;和PCT申请WO 9207573，描述了使用感染的重组体反病毒使基因序列嵌入内皮细胞。

将IRF-1基因嵌入选出的细胞内，或直接进入哺乳动物，或转染或感染从哺乳动物移出的细胞随后把这种感染细胞再引入哺乳动物，这样可以实施类似于上述刊物中所述的方法。

本发明也可以是一种治疗方法，根据细胞，最好是含IRF-1缺失或突变的造血干细胞能选择性地在体外从干细胞的总群体中除去正常的干细胞通过消耗带IRF-1缺失或突变的干细胞而选择性地增加，随后通过校正的髓质或外周血细胞的自身移植入病人。这样一种治疗方法包括从病人移出组织，筛选组织，使细胞没有IRF-1缺失或突变，扩大这种细胞群体并使用如注入或自体移植将它再导入病人。

本发明的另一方面还包括一种聚合酶链反应检测IRF-1基因的序列及突变所用的药合，它包括载体工具具有密闭在内的一个或几个容器例如小瓶、管子等。例如，首要的容器工具装有一套成对的单标准DNA引物，这套设备可以合成全部编码序列的IRF-1或其片段。一种合适的单股DNA引物对描述如下。这种药合的试用一般可依照下面所述实施例使用PCR的方法而进行。药合也可以含有其它可用于进行PCR反应的容器方式，如一种DNA聚合酶、缓冲液等。

本发明还包括测定细胞或组织中的IRF-1/IRF-2比例的药合，该药合包括分离抗IRF-1抗体和抗IRF-2抗体，使分离得到的抗体没有或基本没有与其他抗原的交叉反应活性而具有令人满意的单克隆性。此抗体可以标记或可以在使用时进行标记。此标记可以达到使用适当分析方法测量细胞内存在的抗原的量。

此药合可以适用于分离蛋白或免疫表型化的免疫分析，或单个细胞的蛋白质量分析用的流式细胞光度分析，以及与其他细胞表面，胞质蛋白（表型标记），或与DNA含量和S相分数之间的关联。

抗体可以用已知方法制备，例如，通过将与IRF-1或IRF-2或其选择的抗原决定基进行免疫反应的动物脾脏细胞，用骨髓瘤细胞进行融合，然后分出产生相应抗IRF抗体的杂化瘤（hybridoma）克隆。这种抗体可以分别中和IRF-1或IRF-2的活性，但没有交叉反应性。合适的制备这种抗体以及选择其高效抗原决定基的方法已公开于新西兰专利No.222006，欧洲专利申请No.90106568.0（相应的美国专利申请号No.801048，登记日1991年12月3日），和Hopp等的Mol.Immunol.20（4）;483-489（1983），和PCT申请WO 8003564。

本发明的另一方面还包括一种药合用于用荧光原地染色体杂化的方法测定哺乳动物组织中IRF-1等位基因数目。此杂化方法包括荧光标记DNA序列或DNA，这些DNA序列或DNA可荧光标记它可在中期染色体内或分裂间期核内与IRF-1基因杂化。这些DNA序列可以是一个cDNA克隆（用于杂化到中期染色体）或一个长度至少为8-10kb的基因克隆（杂化到完整的分裂间期核）。等位基因的数量可以用荧光显微术计数。这方法另外的内部控制包括由IRF-1和IRF-2同一染色体衍生的单个复制DNA探针并且距离感兴趣的部位有适当的距离（例如，对IRF-1为5q31，对于IRF-2则为4q）。使用这方法，在组织样品中的等位基因的数目就可以测定，因而不合适的等位基因数易于成恶性肿瘤。

本发明将更详述于下面非限制性的实施例中。

实施例1

人染色体5q上IRF-1基因的存在及准确地定位是通过原地荧光杂化技术（FISH）而进行的，以在由PHA激化的淋巴细胞产生的细胞分裂中期正常染色体上对IRF-1探针定位。如下面所述，一个包含IRF-1启动子和全部10个编码外显子的19kb  IRF-1基因克隆（Yamada等人，同上（1991）见图4A）用荧光标记并杂化到固定中期染色体上（见Pinkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9138-9142（1988）Sakamoto等，ⅡSystem.Performance（1992））。

检测位于5q22和5q31（IRF-1）序列的探针进行不同的修饰以便在分裂间期和中期可以双色目测杂化区域。位于5q22的19kb DNA探针（Cyn5.120）（由R.White提供University of Utah，Salt Lake City，UT）通过用二硝基苯酚（DNP）-11-dUTP（Novagen，Madison，WI）进行缺口转译（Pinkel等，同上（1988））。IRF-1基因DNA探针（19kb，Yamada等），同上（1991））用洋地黄毒苷-11-dUTP（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）进行化学修饰。通过使用SephadexG-50旋转柱回收探针，浓度约为20ng/μl。所有的标记反应均调节到产生单个单位长度为0.3～1.0kb的标记探针。

单色和双色杂化反应使用按Kuo等人，（同上（1991））所述的修饰后的方法进行。将玻片上Carnoy固定的细胞中的标的DNA通过在73℃浸入70%甲酰胺和2×SSC 3分钟。然后将玻片依次用乙醇溶液（70%，85%和100%）浸没而脱水。脱水后，玻片用蛋白酶K（2.5μg/ml）在38℃下处理3分钟。

有时老化的样品会显示低杂化效应，需消化较长时间（4-8分钟）。消化后，玻片按前所述进行脱水。杂化混合物（10μl总体积含50%甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖，1-5μl人胎盘DNA和20ng的各探针）在73℃变性5分钟后在38℃下培养20分钟。将混合物加到有细胞的玻片上用盖片密封。该玻片在37℃培养12小时。杂化后，玻片在更换三次的50%的甲酰胺溶液中在48℃洗10分钟，然后依次用同一温度的2×SSC和0.2×SSC洗涤。杂化区用50μl4×SSC，1%BAS处理5分钟。然后玻片用含有鼠抗DNP（0.5μ/ml，Boehringer Mannheim）和罗丹明标记的抗洋地黄毒苷（Novagen）的4×SSC混合物在室温下处理30分钟，接着在室温洗涤10分钟四次;依次用4×SSC，4×SSC+0.1%三硝基甲苯（triton）X-100，4×SSC和PN缓冲液（0.1M二代磷酸钠、0.1M一代磷酸钠、0.05NP-40，pH  8），然后用PNM（PN缓冲液，5%无脂干奶和0.02%叠氮化钠，离心除去不溶固体）处理后，加入结合羊抗鼠IgG的荧光素异硫氰酸盐（16.6μg/ml;CalTag，Burlingame，CA）30分钟，细胞用PN缓冲液洗10分钟，四次。在显微分析前，细胞用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在抗退色溶液中染色（Johnson，和de C.N.Araujo，J.Immunol.Methods 43：349-350（1981））。

按Pinkel等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：2934-2938（1986），同上（1988））所述用合适的滤色片进行荧光显微分析，在单色杂化中只用IRF探针，所有的细胞在显微镜场下记录有2、1或0个区。在双色杂化中，在细胞中计数的IRF-1区表明至少有一个绿-FITC-连接5q22的杂化区域。

在制剂中，＞25%的细胞不含有杂化区域或其中小于50的细胞可以分析和计数的都排除在数据分析之外。

如图1A所示，IRF-1探针只杂化到染色体5q上的序列中。用计算机辅助的荧光显微分析法分析杂化的中期染色体，IRF-1可以在染色体5q31中精确定位（Sakamota等，同上（1992））。如图1B所示，这种计算机定位方法可以自动获得全染色体DNA的多色成像，荧光标记的IRF-1探针，和用作对照的杂化到5q22的荧光标记探针（下面将详细讨论），通过分析15个杂化中期将IRF-1基因定位到5q31.1上，并较之染色体5的短臂端粒作为部分定位报导。

实施例2

为测定IRF-1在造血瘤中，用间隙缺失或包括染色体5q31的转移而进行缺失或结构上的重排。从11例急性白血病，带del（5q）的 MDS和两例有相互易位5q31的重新AML中选出冷藏细胞悬浮体，该悬浮体有足够分析用细胞。这些样品包括：4例前期白血病的脊髓发育不良（MDS），2典型例有再生障碍性贫血的5q-综合症（样品1-4）;2例有过量胚细胞的再生障碍性贫血（RAEB）并已转移到AML（称作“二期AML”）（样品5，6）;5例从新AML（样品7-9，12，13）;1例从新ALL（样品10）;以及1例在经结合化学初步治疗后复发的AML（样品11）。表1中列出了分析下每个样品的完全的核型，以及如适宜，在冷藏样品中白血病胚细胞的百分数（3栏和4栏）。类似地，将从正常人的骨髓和周血得到的冷藏细胞悬浮体用作对照（样品16和17）。两例具有含有非5q31区的染色体5q易位的造血瘤也选作对照（样品14，15），一例有5q33相互易位的慢性髓单核细胞白血病（CMMOL）亚型的MDS和一例有t（2;5）（q23;q35）的Ki-1+非何杰金淋巴瘤。

IRF-1的缺乏和结构重排是用全长IRF-1 cDNA（pHIRF31）作为探针在Southern印迹法和定量条状印迹中测定的（Maruyama等，Nucl.Acids.Res.17：3292（1989））。为提供内标以对内标定量IRF-1的缺失，接着将每个斑点洗脱并用cDNA探针重新杂化以补充组成9（C9：pHLC9.55）（DiScipoi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7298-7302（1984）），它定位到5q13（Abbott等，Genomics 4：606-609（1989））。这些操作如下进行：

高分子量的DNA从解冻的白血病的MDS和对照样品中分离，它们早先是在胎牛血清（90%，Hyclone）和DMSO（10%，Sigma）在-135℃冷藏的细胞悬浮体。白血病的胚细胞和髓样前体细胞在通过在Ficoll-Hypaque（Sigma）上离心而收集的初步样品期中进行富集;分离这些单核细胞，胚细胞数通过形态观察来确定;样品如前所述进行冷藏。进行Southern印迹分析时，病人样品和对照样品的基因DNA用Bgl Ⅱ，Bam HI，EcoRI，Hind Ⅲ，Kpn I，Pst Ⅰ，或XbaI消化，每样品中5mg DNA在0.8%琼脂糖凝胶中电泳后在硝基纤维素或Hybond-N+（Amersham）上进行印迹并用cDNA探针按随机引物进行杂化（Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，Cold Spring Harbor Laboratory（1989））。每个印迹均在严格的条件下洗涤。

对于DNA定量分析，从病人样品和对照样品的基因DNA用碱变性接着中和，然后按3个不同稀释度2μg、1μg和0.5μg点到硝基纤维素上，（Sambrook等，同上（1989）），杂化的条件与Southern印迹法所用相同。Southern印迹法和条状印迹法都是先杂化到由质粒pHIRF3切下的IRF-1cDNA探针（Maruyama等，同上（1989）），检出一个6.0kb Hind Ⅲ片段，然后洗脱并再杂化到由质粒pHLC9.55切下的补充C9 cDNA对照探针上检出一个3.0kb带。

IRF-1和相应的C9放射自显影术的信号用配有放射自显影术的激光扫描光密度测定法，使用计算机辅助的FOTO/ANALYST成像分析系统（Foto dyne，New York）进行定量，而且对各样品的IRF-1：C9的杂化比进行了测定。

结果列于表1和图2。

在图2中，各道对应于下列样品（见表1所标出的）：1（9），2（1），3（13），4（3），5（5），6（6），7（8），8（10），9（7），10（正常骨髓对照;2.5μg），11（正常骨髓对照;2.5μg）。

如图2所示，在每例MDS和带del（5q）的从新AML中可以观察到在IRF-1杂化信号中有明显的降低（表1，样品1-11），这表明与对照相比IRF-1：C9的杂化比降低（表1，样品14-17）。IRF-1：C9杂化比的降低紧密地相当于每个样品中的白血病胚细胞百分数和相当于有del（5q）细胞的细胞产生的频率（表1）。除了IRF-1杂化信号的明显降低之外，在样品10中还可以观察到IRF-1基因的结构重排并如下所述详细表征。

有趣的是，在每例有包含染色体5q31的相互移位的重新AML中也可以检测到IRF-1杂化信号的明显下降（表1，样品12，13，图2）。在IRF-1：C9杂化比的降低也相当于每例白血病胚细胞的百分比。在Southern印迹试验中，没有测到编码外显子的IRF-1的重排，并在这些样品中使用脉冲场凝胶电泳也没有看到IRF-1基因的197kb内发生重排。相对地，在有5q33相互易位的CMMoL的对照例和有5q33相互易位的淋巴瘤样品中，两者保持IRF-1的等位基因（表1，样品14，15）。

在13例MDS和有del（5q）或易位5q31的白血病的每一情况中IRF-1是缺失的，这一事实是很重要的，因为这些样品代表造血瘤的全谱，它曾报导有del（5q）（见Nimr和Gold，同上，（1987））。另外，最近在另外4例MDS和有del（5q）的急性白血病中检测到IRF-1缺失。

实施例3

人白血病和脊髓发育不良症中IRF-1的缺失：单色和双色分裂间期的细胞遗传学分析

分裂间期细胞遗传的研究依上述实施例1进行（Pinkel等，同上（1986），同上（1988））。单双色荧光就地染色体杂化（FISH）研究是在同样冷藏样品（用于测定IRF-1：C9杂化比）中进行。对单色FISH研究，19kb IRF-1基因DNA（Yamada等，同上（1991））进行化学修饰并杂化到包含固定细胞悬浮体的玻片中（表1，样品1-10，12，13，15-17）或杂化到从细胞遗传分析留下的残余固定细胞所制备的玻片中（表1，样品11，14），所有的细胞在显微场中均可记录到2，1或0个IRF-1杂化区（或等位基因）;大部分样品中可记录到总数为1000个细胞（表1，第六栏），在没有IRF-1缺失的对照样品中（表1，第7栏，样品14-17），IRF-1等位基因在84～90%的细胞中可以检测到。当然，平均来说，大约有10%的对照细胞中只含有1或2.4%的细胞没有可检测到的IRF-1杂化区。与新鲜淋巴细胞（它在92～95%细胞中可检测到2个IRF-1等位基因，在5～8%细胞中有1个或没有IRF杂化区）相比，在冷藏的对照中，FISH杂化效率的稍微下降来自于使用冷藏保存了2-5年的样品和使用了相当短（19kb）的单拷贝基因探针而不是用于FISH研究的可重复序列的探针（Pinkel等人，同上，（1986），同上，（1988））。但是，与这个背景相比较，在每个MDS和有del（5q）的白血病样品中的大量细胞（总细胞的24～88%范围内）中仅检测出1个IRF-1等位基因（表1，第7栏，样品1-11）。在两例有染色体5q31相互易位的重新AML中也确定了有1个单IRF-1等位基因损失（表1，样品12，13）。在这些FISH研究中所得的IRF-1单等位基因频率与通过形态学标准测得的白血病胚细胞百分数很好相应，大约1000或更多细胞可以记录。与对照相比，几种急性白血病的样品（表1，第7栏，样品7，8，10，12，13）也表现出有大量细胞（≥10%）没有IRF-1杂化区，认为在白血病的细胞的亚群中IRF-1的两种等位基因都可能已缺失。

为了更详细地研究IRF-1的缺失，在样品中进行双色FISH研究，其中使用了残留的固定细胞。将19kb IRF-1基因探针和杂化到在5q22单一序列的19kb单拷贝基因探针（cyn5.120;见图1B）进行不同标记以便如Pinkel等人（同上（1986），同上（1988））所述的在分裂间期双色目测杂化区。具有代表性的样品列于表3，只有那些在包含至少一个FITC-5q22杂化区的细胞中的IRF-1区才被计数。在制备中，如果小于50%的总细胞可以分析和计数以及不含5q22杂化信号的大于25%的细胞，由分析中排除（见表1）。

在两个对照样品上进行的双色FISH分析中（表1，第9栏，样品15，17），IRF-1和5q22等位基因的频率和分布极相似，大于80%的细胞含有预期的两个IRF-1和两个5q22杂化区。在这些对照中，含有1或2个IRF-1和5q332区的不同结合的细胞包括分析细胞总数的2.2-7.9%，只有2.0-4.3%的细胞含有两个5q22区而不含可测的IRF-1区。

通过双色FISH在所分析的6个有del（5q）或转移5q31的一例中确定了胚细胞群体一定不含有两个IRF-1杂化区，但保留1个或2个5q22杂化区，（表1，第9栏，样品6）。在样品10中可分析的4/16的残留细胞中两个IRF-1等位基因也均已缺失，但这一样品并不符合FISH数据所包含的标准。因为只有总共16个细胞可以分析（见表1）。两个有胚细胞亚群的样品，其两个IRF-1区（等位基因）缺失均来自患急性白血病人。一例是转移到AML的RAEB（样品6，22%细胞有0IRF-1区），另一例是刚描述的ALL（样品10，25%的细胞）。与此相反，前期白血病MDS的全部样品仅有一个IRF-1等位基因缺失。一个单IRF-1等位基因的缺失也再在两个有5q31相互移位的重新AML病人中确定（表1，第9栏，样品12）。单色FISH分析表明样品7、12和13可能含有一个缺失两个IRF-1等位基因的白血病细胞亚群（表1）。这种可能性没有被双色分析直接证实;我们观察到有几个细胞它有5q22而没有IRF-1。然而，有可能在样品7、12、13的细胞亚群中，大缺失（见下面和表1）已去除了5q22内控制和IRF-1基因两种，因为这些细胞在双色分析中没有计数。这后者的可能通过细胞相当高的频率事实表明各5q22区的IRF-1的基因已缺失一个等位基因。（样品7、8.03%，样品12、52.9%;样品13，55.9%）。

双色FISH分析也揭示了在六例有del（5q）的三例中在近似折点的位置中有一意料之外的不均匀性。在传统的分解的细胞遗传学量中报导了样品2、6和7含有一个del（5q）（q13q33）;用这些折点，克隆群体将期望有1个IRF-1和1个5q22区，因为留下的IRF-1和5q22区二者已由染色体5q中去除。但是，除了一个群体含有一个IRF-1/1个5q22等位基因外，显著量的细胞群体也确定，在每个样品中含有2个5q22和1个IRF-1区（表1，第9栏，样品2、6）。这些发现表明在这些病人样品中存在明显的胚细胞群体，它有不同的近似折点（保持或也缺失5q22区），但有均匀的一个IRF-1等位基因的缺失。折点的不均性在两个有转移5q31的重新AML的样品中也已观察到（表1，第9栏，样品12、13）。如果如在移位情况过程中（如FISH试验所表明）一个IRF-1等位基因被缺失，则在大部分细胞中预期的双色等位基因频率是2个5q22/1个IRF-1。然而，除了这群体外两个AML例具有的大部分细胞有1个5q22和1个IRF-1等位基因（表1，第9栏）。由于没有一个AML例除了转移5q31外有单体5，这些结果表明DNA在染色体5上由转换折点区去除比以前在分解的细胞遗传学量上去除的多得多。

实施例4

白血病和脊髓发育不良病例筛选IRF-1突变

为测定，在其它情况下保留的IRF-1异位基因持续任何较小的缺失/插入或在上述分析中不可检出的点突变，使用聚合酶链反应（PCR）以启动由分离的DNA得的残留IRF-1外显子，DNA是由除样品5外的全部白血病和MDS样品中分离的，以及然后将PCR产品按Kingler等人（Science251，1366-1370（1991））如下面所描述的，用RNase保护分析法进行筛选突变。

在4个样品中，注意到在外显子7中有一单碱基变化（表1，样品4、6、8、10），这种碱基变化发生在密码子的第三次变性核苷酸内，但是并不重要。

实施例5

IRF-1基因内的折点特性

Southern印迹法分析发现了在从新ALL的一例，样品10（表1）中的IRF-1基因的结构重排。在最初的用全长-IRF-1 cDNA探针（图4B，右幅）研究中，观察到了有几个IRF-1限制片段的缺失和新的重排带的出现。在Bg Ⅲ-消化的DNA中，有一个13kb的片段缺失（含有IRF-1外显子，它由基因DNA的上段Bgl Ⅱ位点和内含子Ⅰ的BglⅡ位点的消化而产生的，见图4A）和出现一个新的1.8kb片段。相类似地，用Hind Ⅲ，降低了2.0kb片段（含有外显子1和2;图4A）的强度以及在2.4kb出现一个新带。5.0kb Bam HI片段（含有外显子1-3;图4A）实际上已消失并在3.9kb检测到一个新片段。在病人样品中的另一个2.8kb  Bam HI片段（图4B;左幅）得自自然产生的Bam HI多态现象（见图4A），对此，病人是杂合的。这些数据全部与样品中的大多数细胞中存在包括IRF-1基因的5′端缺失相一致。使用IRF-1 cDNA探针检测到几个新带，这表明在这样品中白血病细胞的亚群中也可以有另外的更复杂的IRF-1重排。

为了更精确地测定样品10中主要IRF-1折点的位置，按图4A中所示，使用由基因IRF-1克隆所衍生的亚克隆进行另外的Southern印迹分析。探针1是含有外显子1的Hind Ⅲ-Bgl Ⅱ片段而探针2是含有外显子2的BalⅡ-Hind Ⅲ片段。用探针1杂化揭示了有各酶的IRF-1的结构重排（图4B，中间）。在病人样品的Bgl Ⅱ-消化的DNA中再次观察到确实消失的13kb带和出现新的0.5kb带。用Hind Ⅲ、2.0 kb带明显降低强度而用Bam HI时一个新的1.4 kb很明显，5.0 kb带明显降低强度并检测到一个新的3.9kb带。使用探针2（图4B，右幅），在Bgl Ⅱ消化液中没有缺失或重排，这说明折点必须将5′放到内含子1的Bgl Ⅱ限制位点中。用探针2观察到同样的缺失和重排，如用探针1在Hind Ⅲ和Bam HI-消化的DNA上见到的（图4B，右幅）。

这些研究表明，病人样品10（表1）的IRF-1基因中的主要折点大约位于内含子1的Bgl Ⅱ的400 bp5′位点（图4A）。为了更好地理解这种重排的性质，使用了修饰的聚合酶链反应逆转PCR（见Silver，PCR，A Practical Approacl，McPherson等人，eds，Oxford IRL Press，pp 137-146（1991））以对正常人和白血病DNA两者中含有外显子1和内含子1区的IRF-1基因进行放大和序列分析（图5）。

用Hind Ⅲ消化由样品得的基因DNA和正常DNA（1μg）。消化后，样品用苯酚/氯仿萃取，而DNA用乙醇沉淀。沉淀的DNA在连接酶缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl₂;1mM ATP，1mM DTT）中稀释至1μg/ml，并与2.8Weiss Units的T4DNA连接酶在14℃培养20小时。连接作用后，样品用苯酚/氯仿再一次萃取并用乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA再悬浮在30μl蒸馏水中，然后通过在95℃加热10分钟而引入缺口。包括IRF-1外显子1和内含子1的区使用图5的引物和定位而在PCR反应（DNA热循环，Perkin-Elmer Cetus）中放大。反应是在50μl有1mM MgCl₂、0.0.1%明胶和1.25Cl Taq DNA聚合酶（Perkin-Elmer Cetus）中进行（95℃30秒，60℃1分钟，70℃2分钟，40循环）。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳校核，将合适的带（如图5所示）从凝胶上洗脱。将得到的DNA片段克隆入pBluescript;序列分析6个单独分离的克隆。

这步骤可对其它IRF-中的外显子和内含子进行重复。

图5B表明由白血病样品（P，样品10）和正常DNA（N）中得到的克隆PCR产品的序列。可以看到白血病样品的序列在内含子1的引物后偏离10个核苷酸。

在正常DNA中检测到所希望的1.1kb带而在白血病人样品中注意到有一另外的较小的约500bp的带。如图5所示，在白血病样品的内含子BglⅡ位点的DNA序列上段在引物1DNA序列后偏离正常IRF-1序列10个核苷酸。在相当于外显子2的引物2序列的下段，在正常的和白血病细胞DNA之间的序列中没有观察到偏离。这些结果证实了白血病样品中IRF-1基因的重排，导致失去外显子1和IRF-1启动子区域。

这些结果表明，IRF-1基因的一个等位基因在样品10的大多数白血病细胞中由于启动子区和部分外显子的缺失而失活。Southern印迹分析（图4B）、双色FISH研究以及del（5）（q13  q33）的细胞遗传检测都说明了，在这些白血病细胞的主要群体中残留的IRF-1等位基因都已缺失。因此，在这白血病人的大量细胞中两种IRF-1等位基因都已失活，其中一个是通过一个包括一染色体5q的间质缺失而另一个是通过在破坏IRF-1启动子区和外显子1的第二IRF-1等位基因中的失活重排。

实施例6

对在鼠N1H3T3细胞的细胞周期期间的IRF-1和IRF-2的mRNA表达量进行了测量。N1H3T3细胞最初保持在含有10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco的改性Eagle培养基（DMEM）中。将细胞生长到汇合并通过在无血清的DMEM中血清饥饿24小时而初始停滞（G1停滞），然后通过加入添加有10%FCS的DMEM而诱导以转换细胞周期并在刺激后在适当时间进行收获。按Mudryj等（EMBO J.9，2179-2184（1990））所述，在血清激活后的规定时间（见图6A）通过用5μCi³-胸苷（2.0Ci/mmol）脉冲标记细胞（2×10⁴）1小时而测量掺入DNA的³H-胸苷。

如图6A所示，³H-胸苷摄取量测定法揭示了DNA合成是始于血清激活后8-12小时。流式细胞计数分析细胞周期也揭示了事实上在这期间细胞进入S相。将全部RNA周期性地分离而将10μg进行IRF-1和IRF-2mRNAs的S1图示分析（如Fujita等人，Cell 49：357-367（1987）中所述）。鼠IRF探针（图6B）与Harada等人（同上（1990））所述相同（比活度3.1×10⁶cpm/pmol的IRF-1，30×10⁶cpm/pmol的IRF-2）。人的IRF-1探针DNA是一个143核苷酸探针，它含有人IRF-1基因（比活度，4.7×10⁶cpm/pmol）的核苷酸残基-46-+97（相当于主冠位点在+1）。

如图6B所示，IRF-1mRNA表达在其生长-停滞细胞的最高量（仅约5拷贝/细胞）时观察到并在血清激活后迅速下降。事实上，发现IRF-1 mRNA达到的量约五倍低于激活后2小时的生长停滞细胞，并然后在DNA合成启动前开始慢慢增加（图6B）。相反，留下的IRF-2 mRNA的表达量在整个细胞周期基本上恒定。mRNA和拷贝数由描述于Harado等人，（Cell，同上，（1989））t Fujita等人（Cell，同上（1987））中的方法进行测定。

细胞提取液通过抗-IRF-1抗体的Western印迹分析也揭示了在细胞周期期间IRF-1量的波动。

Western印迹分析在下面所规定的时间进行：

全部细胞提取液是在图6C指出的时间，通过将5×10⁵细胞用溶胞缓冲液（50 mM Hepes-NaOH（pH7.0）、0.1% Nonidet P-40、250mM NaCl、100mM NaF、200μM Na₃VO₄、10μg/ml各种抑肽酶、PMSF、和亮肽酶）按2.5×10⁶细胞/50μl在4℃溶解20分钟。接着在4℃离心20分钟，提取液进行12.5%SDS-PAGE分析。然后将蛋白通过电泳转到PVDF膜滤器并用Ponceau S非-专一染料染色（Harlow和Lane（1988））。免疫检测按Hatakeyama等人（Science 252：1523-1528（1991））所述进行，使用抗鼠IRF-1单克隆抗体TK-1和TK-3的鸡尾（cook tail）（在TBST乳各10μg/ml）进行。

在生长停滞阶段发现IRF-1的表达达到最大值而在血清恢复后3小时下降约6倍，然后接着再增加（图6C）。这些结果表明在细胞周期期间IRF-1/IRF-2比值的波动。在与造血细胞系BAF-DO3有关的间白细胞素3（IL3）中也进行了相似的观察。

实施例7

通过产生NIH3T3细胞克隆测定了在细胞生长中扰动IRF-1/IRF-2比的效应，其中IRF-2是过表达的。质粒pAct-2（Harada等，同上（1990））（其中鼠IRF-2 cDNA 是由鸡D-肌动蛋白启动子表达的）用新抗性基因，pSTneoB（Kato等人，Mol.Cell.Biol.10（2）486-491（1990））通过磷酸钙方法（Fujita等人，Cell 41;489-496（1985））共转染为N1H3T3细胞。然后将转染的细胞在转染后一天保持在含700μg/ml G418 的选择培养基中，在2-3周后分离抗G418-菌落。由N1H3T3细胞用亲代载体，pAct-C（Harada等人，同上（1990））转染中得到对照细胞系。

在选择新抗性后，得到几种克隆，它们表达高量的IRF-2 mRNA。任意选择三种细胞克隆，1-2、2-5和2-7以进一步分析，其中5μg RNA 进行Northern印迹分析，分别使用鼠IRF-2 cDNA和人β-肌动蛋白的类基因作为探针。在这些克隆中IRF-2 mRNA 的表达量比在pAc-C转染的对照细胞克隆（C-2、C-3）（图7A）所观察到的基本表达量高约40倍。但是当用凝胶位移分析（所用方法描述于Harada等人，同上（1990）），发现在克隆2-1、2-5和2-7中的IRF-2蛋白量分别仅比在对照细胞所观察到的高9、4和7倍（图7B），这说明IRF-2表达可以在转录后下调。

用5fmol³²P标记的C13寡聚物作探针（比活度5000 cpm/fmol）而进行凝胶色层位移分析，全部细胞的提取物来自2×10⁴个细胞。虽然过表达IRF-2的细胞并没有任何明显的形态变化，但它们在其他的生长性质上表现出明显的区别。在35mm的平板上植入2×10⁴个细胞，在用加有10% FCS 和700μg/ml G 418的DMEM中生长，并在指出的天数用犁头（coulter）计数器计算。如图7C所示，2-1、2-5和2-7细胞克隆的生长速度和对照相同但有更高的细胞密度（约三倍）。此外这些全部克隆表现出非固定地生长。菌落形成的分析基本上按Miyashita和Kanunago（Cell 5：131-138（1975）所描述的方法进行。该方法中用溶介在培养基中的1.3%甲基纤维素凝胶悬浮10⁵个细胞，并把细胞铺在由53%琼脂糖和培养基组成的琼脂糖床上，在植入三周后记录培养基菌落。在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率是6-15%，而用对照克隆则没有发现菌落形成（表2）。众所周知，这些性质通常与恶性肿瘤转化有关[Freedman和Shin，Cell，3：355-359（1974）;Keath等人，Cell 39：339-348（1984）]。

实施例8

研究了过表达的IRF-2细胞的致瘤性。将从再悬浮在不含FCS[Shin，Meth.Enzymol.58：370-379（1979）]的200μl DMEM 的三种克隆2-1、2-5和2-7中得到的细胞（2×10⁶个）皮下注射到4-6周令的裸鼠（Balb/c nu/nu;Clea Japan，Inc）的双侧腹部。如果在注射的位置上出现一个可见的小瘤并且以后继续长大，则细胞被认为是致瘤的。在相当短的潜伏期中（2-3周，表2）肿瘤发展，虽然它们没有转移的信号，但继续无限制地生长。对没有生长肿瘤的小鼠观察6周。在同一期间用对照克隆C-2和C-3的细胞注射的裸鼠没有生长肿瘤。IRF-2 cDNA转染的整个过程和分析重复了三次，结果都是可重复的。在每个实验中过表达IRF-2的克隆都表现出改变的生长性质和致瘤的潜力（总共12个克隆）。此外，从裸鼠产生的肿瘤回收的细胞中，观察到基本同样的IRF-2 mRNA表达和同样的生长性质。集中起来，这些结果明显表明2-1、2-5和2-7细胞的改变生长性质和致瘤性是由于转录阻遏物IRF-2的提高表达而引起的。

实施例9

由IRF-1诱导转化的IRF-2的逆转

上述实施例说明IRF-2的致肿瘤倾向，以及在细胞生长保持正常的限制中保持在IRF-1和IRF-2的表达之间的平衡是十分重要的。当这个平衡受到IRF-1的过表达干扰，细胞的增殖可以抑制[Yamada等人，同上（1991）]，因而，如上所示，IRF-2的过表达可促使细胞不受限制地增长。这个实施例表明通过NIH3T3细胞呈现转化的表型通过增加IRF-1的表达量过表达的IRF-2可以转回到原来的表型，因而使IRF-1/IRF-2的比值回到一个“正常”范围。为此将含有全部10个外显子以及人IRF-1基因的促进子区[从主冠位点起455bp，见Yamada等人，同上（1991）]的一个1 kb DNA片段引入IRF-2转化细胞中。由于上面提出的结果，指出在细胞周期期间调节IRF-1基因表达的重要性（图6）。在该实验中使用基因组IRF-1克隆以保证异位IRF-1基因的表达与内生基因同时产生。

为了得到表达IRF-1高水平的细胞克隆，将15毫克质粒，PUCHIRFIB（19 kb人的IRF-1基因亚克隆进pUC 19的EcoRI位点）和pMiwhgh（0.3μg）通过磷酸钙方法共转染入2-1、2-5或2-7细胞（5×10⁵细胞/10cm盘）。制好试验板并在转染第二天在含有100μg/ml潮霉素的选择培养基中保存，2-3周后分离出抗潮霉素菌落。

选出2-1、2-5和2-7细胞系，（它们已与IRF-1基因共转染）和抗潮霉素（hgr）基因pMIwhgH[Kato等人，Mol.Cell.Biol.10（2）：486-491）]以及抗-潮霉素克隆，接着筛选人IRF-1基因的稳定整合，转染体2-1-1、2-1-2、2-5-1、2-7-3和2-7-4分别由亲代克隆2-1、2-5和2-7衍生。人的IRF-1 mRNA的表达通过上述S1图分析法测定。如综述于表3，在这些克隆中的稳态IRF-1 mRNA 表达量从高到低按如下顺序变化：2-5-2、2-7-3、2-7-4、2-1-1和2-1-2。

如前所述[Fujita et al，（1985）]抗潮霉素克隆通过NDV（新城病病毒）进行假诱导或诱导。转染的IRF-1基因在所有克隆中是病毒-诱发的。并且在另一个实验中表明在克隆基因内的启动子序列也是IFN-可诱导的[Itoh，Genomics 10：1092-1099（1990）]。诱导或假诱导9小时后，分离出全部RNA，用上述方法把5μgRNA进行S1图谱分析。结果示于图8A。图中确定的道条如下：道1-7，假诱导;道8-12NDV-诱导;道1和8，细胞系2-1-1;道2和9，2-1-2;道3和10，2-5-2;道4和11，2-7-3;道5和12，2-7-4;道6，C3;道7，2-7。箭头指出被护的人IRF-1探针的位置。

IRF-1和IRF-2的活性是按照Harada等（同上，（1990））的在克隆2-7-3和2-7-4中通过凝胶位移分析而证明的。

方法是用5fmol的³²P标记的Cl寡聚体作为探针（比活度5000cpm/fmol）而进行的并且全部细胞提取物是从5×10⁴细胞中得到的。Cl寡聚体由四个重复序列AAGTGA组成，并含有两个IRF结合位点。这个寡聚体用于代替C13寡聚物，因它易于除去IRF-1的活性[Watanabe等人，Nucl.Acids Res.19：4421-4428（1991）]。结果示于图8B，其中，道1、4、7和10在反应混合物中含有2μl非免疫的兔血清，道2、5、8和11含有2μl兔抗-鼠IRF-1抗血清，道3、6、9和12含有2μl兔抗鼠IRF-1抗血清，道13没有提取物。白的和黑的三角形分别表明IRF-1和IRF-2的因子-DNA复合物的位置。只有在延长接触后，内生的鼠IRF-1的活性才可检测到。较快迁移的带可能代表结合到DNA探针的IRF-1和/或IRF-2的转折产物。在道4、5、7、8、10和11的较慢迁移的带代表由2个IRF-2分子结合的DNA探针。

通过5μg RNA进行Northern印迹分析而测定IRF-2mRNA的表达。RNA按上述分离。通过随机引物法（Amersham）标记探针DNA。对鼠IRF-2是由pAct-2得的一个1.4kb Xbal cDNA片段（Harada等人，同上（1990）），而对人的β-肌动蛋白（人的β-肌动蛋白假基因）是一个入Ha-204的2.0kb Bam HI-Pvu Ⅱ的片段[Myamoto等人，同上（1988）]。

如图8C所示在全部克隆中发现IRF-2 mRNA的表达和在其亲代细胞中相同。有意义的是，图8B所示的凝胶移位分析数据表明在这些克隆中IRF-2的DNA结合活性稍有下降，这是由于异位的IRF-1表达引起的。这增加了IRF-1可以影响转录后IRF-2的活性的可能性。用克隆2-5-2进行了同样的观察。

这些细胞的致瘤性大大地被抑制。事实上，致瘤性被抑制的效率和异位的IRF-1 mRNA的表达量有关;克隆2-5-2和2-7-3它们两个都在较多量上表达人的IRF-1 mRNA，表示有很强的抑制作用，克隆2-7-4和2-1-1中，其中mRNA表达量相对低些，表明有较弱的抑制作用，而克隆2-1-2表明没有抑制作用（表3）。随着转化的表型的缺失或降低，2-7-3和2-7-4细胞克隆分别具有与转化相关的其它特性的缺失和降低，如增加的细胞的饱和密度（图8D）和不固定性的生长（表3）。因此，IRF-2诱导的HIH3T3细胞的转化通过引入或增加IRF-1基因的表达而可以逆转的。

在生长控制和肿瘤发生中的IRF-IFN体系

如本文所示，在转录激活子IRF-1和结构上相关的转录阻遏物IRF-2之间的比值的微小的变化对细胞生长产生很大的影响。IRF-1具有抗-致瘤的性质，相反IRF-2的过表达促进致瘤作用。在最近研究中，表明在髓样白血病细胞系内，IRF-1反义寡聚体阻断这种区别[Abdollahi等人，Cell Growth Differ.2：401-407（1991）]，而我们初步观察，在NIH3T3细胞中IRF-1反义mRNA的表达产生了一个和IRF-2过表达相似的表型，这和IRF-1是一个肿瘤抑制基因的观点相一致的。IRF-1的IRF-2首次是作为类型Ⅰ IFN基因的转录调节基因而发现的[Miyamoto等人，同上（1988）;Fujita等人，同上（1989）;Harada等人，同上（1989）]，接着表明调节IFN-可诱导基因的表达[Harada等人，同上（1990）;Reis等人，同上（1992）]，实际上，IRF-1是IFN-可诱导的。在正常细胞和转化细胞中类型ⅠIFNs抑制了细胞的增殖[Einat等人，Nature 313：597-600（1985）;Lin等人，Science 233：356-359（1986）]，并且在造血细胞中诱导IFN表达以自发（autocrine）方式抑制了细胞的增殖[Moore等人，Science 233：171-181（1984）;Resnitzky等人，Cell 46：31-40（1956）]。此外，在缺失染色体9q22的急性白血病患者中，半合子的和纯合的缺失IFN-β基因或IFN-α基因丛都已有报导[Diaz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5259-5263（1988），N.Engl.J.Med.332：77-82（1990）]，提出了IFNs的缺少可能破坏正常生长控制机理并促进白血病的生成[Grander等人，Blood 79：2076-2083（1992）]。本发明使用了我们的发现，IRF-1是IFNs的关键靶之一，包括靶基因级联式地表达，这对抑制细胞生长中是至关重要的。并且IRF-1/IRF-2比值的微小变化可以干扰细胞的生长并促进白血病的形成。

染色体5q31区和del（5q）

最近对5q31的物理绘图研究表明，IRF-1位于IL-4/IL-5和IL-3/GM-CSF基因簇之间而IL-4和IRF-1两者都存在于450kb YAC，IL-9和EGR-1是到这区端点的1-2Mb。[Warrington等人，Genomics 13：803-808（1992）]。然而，如上所讨论的，以前绘到这个区域的那些基因中，没有一个基因能满足作为候选的肿瘤阻遏基因的要求[参见Nimer和Golde，同上（1987）]，因为对每个这些基因，都提不出对肿瘤抑制基因作用的功能性证明。5q31的一个同源的CDC25（CDC25C）[M.P.T.Meeker，UCSE，Sartor等人，Genomics 13：991-913（1992）最近才绘出，并且IRF-1和CDC25C是共存于175kb脉冲场凝胶片段中。

此外，在含有IRF-1缺失的全部del5（q）病例中CDC25C并不缺失而在病例10中（表1）CDC25C不缺失，该例中仅包含外显子1和启动子区的IRF-1缺失。这些研究进一步表明在这些综合症中IRF-1是关键的缺失的肿瘤阻遏基因。

在个体病人的del（5q）中在近端（5q 13-15）和远端（5q 31-33）的折点观察到变化并出现变种如del（5）（q31 q35），提出了在del（5q）中折点的正确定位并不关键，最多5q31区缺失。CSFIR（EMS）绘制到5q31·1，并且在有包含5q33-q35的远端折点的del（5q）的病例中CSFIR也可能是半合子缺失的。[Nienhuis等人，Cell 42：421-428（1985）;Le Beau等人，同上（1986）];虽然最近已经报导了在某些MDS患者中CSFIR的纯合子缺失[Boultwood等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6176-6180（1991）]，这些发现还未被证实。本文双色FISH结果表明del（5q）折点的明确的定位在MDS的致病原理中并不是重要的。甚至在一个MDS患者中可鉴定出明显的细胞的克隆群体，它们在5q上含有不同的近端折点;然而，全部这些克隆已经缺失了5q31区和IRF-1等位基因。我们的FISH研究也指出了在不同的AML病人中在位于易位的5q31的折点上都存在重要的和不均匀的DNA的丧失，其中包括IRF-1等位基因。这些发现和以前的细胞遗传研究相反，指出了包括5q31的易位有可能平衡相互易位[Fourth Interantional workshop on Chromosomes in Leukemia，1982]。

IRF-1半合子缺失的意义

原型肿瘤中由研究成视网膜细胞瘤（RB）中发展起来的阻遏物基因，由于肿瘤阻遏物基因的两个等位基因的功能丧失而形成肿瘤[综述于Marshall，同上（1991）]。一个单一等位基因的丧失或失活虽然是有易于生成肿瘤的条件但不认为有重要的生物影响。然而，在其他人的肿瘤模型的新近的研究表明，丧失肿瘤阻遏物基因的一个等位基因可能会有很重要的生物作用，而在一些例子中是足以促进肿瘤生成。虽然在位于11p13的WTI的纯合的缺失是产生于维尔姆斯（Wilms）肿瘤中，发现一个例子，其中候选WTI基因已经遭受到小的内部缺失[Habert等人，Cell 61：1257-1269（1990）]，在这例中残留的WTI等位基因是正常的，提出了在11p13的单个突变等位基因可能促使维尔姆斯肿瘤生成，特别是如果在其他位置，例如11pl持续突变[Haber等人，同上（1990）]。相似地，在神经纤维瘤发生中，一个NFI等位基因的丧失或失活，可足以诱发良性神经纤维瘤[Li等人，同上（1992）]，并且一个APC等位基因的缺失或失活可以促使结肠直肠腺瘤的发展。[Vogelstein等人，N.Engl.J.Med.319，525-532（1988））;Groden等人，同上（1991）]。在这两种模型中肿瘤的进展是与在其他原-致癌基因和肿瘤阻遏物基因位置上获得突变相关的，[综述于Marshall，同上（1991）]。最近研究p53也已证明，由于鼠杂合性缺p53等位基因而生长肿瘤，虽然是很少的，而鼠纯合性缺少p53等位基因，则在早龄期就生长了不同种类的肿瘤[Donehower等人，Nature356：215-221（1992）]。综合而言，这些研究表明失去了某些肿瘤阻遏物基因中的一个单个的等位基因可以促使变更细胞的克隆的扩展，从而给进一步的遗传突变产生一个靶群体。

本文已表明失去一个单个的IRF-1等位基因在生物上也是重要的。一个单个IRF-1等位基因的丧失或失活可以降低IRF-1的表达，足以减小IRF-1/IRF-2的比值，从而扰乱细胞的生长。在本文中，在白血病和MDS样品中已检测了IRF-2基因，并通过Southern印迹分析在任何样品中都没有检测到IRF-2的放大、缺失或结构上的重排。因此，单个的IRF-1等位基因的缺失在白血病和有del（5q）的MDS中可在IRF-1/IRF-2的比值中导致失常。

一种仅失去一个单IRF-1等位基因的细胞的克隆将期望具有低的扩展能力，并易于进一步基因突变。有意义的是，这些更惰性的生物特征已在患有5q-综合症的大多数病人中可观察到[Van den Berghe等人，同上（1974，同上（1985）;Dreald等人，同上（1985）]。患再生性障碍贫血和del（5）（q13 q33）的女性，最常见的间质缺失型，具有顽固性的医疗过程，产生进一步的细胞遗传的异常的可能性低，并对AML的转化速度，低[Dewald等人，同上（1985）;Van den Berghe等人，同上（1985）;Nimer和Gold，同上（1987）]。相反，在患病过程中论断和探测时，还存在其他的细胞遗传的异常，而且男性病人常伴有更高的白血病转化频率。[Nimer and Gold，同上，（1987）]。这些发现表明，虽然一个IRF-1等位基因丧失可以促进肿瘤发生，但是，在胚细胞亚群另一个等位基因的丧失和/或在其他遗传位置上的突变产生对全白血病的转化是必要的。这一点在本文所述的白血病和MDS患者中的细胞遗传和分子研究得到证实。所有的带有白血病前期的骨髓发育不良综合症的全部del（5q）病人，都有IRF-1半合子缺失。在每一例有del（5q）的重新（de novo）AML也都见到有一个IRF-1等位基因缺失，虽然每一例在疾病呈现时期已在另外位点产生强的细胞遗传异常。有意义的是在胚细胞亚群中检测到IRF-1的纯合缺失的两个病倒都是急性白血病：一例是由先前MDS引起的AML而另一例是ALL。在本文报导的病人中在残留的IRF-1等位基因中没有检测到变更IRF-1结构的突变。

总之，对上述病人的论断表明，失去一个IRF-1等位基因是白血病前期克隆扩展的必要条件，通过失去第二个IRF-1等位基因或通过在其他位置持续另外的遗传突变，则白血病前期克隆可发展为白血病。

在细胞生长中IFN基因的调节

以前曾认为，IRF-1基因的表达是由病毒、IFNs和一些其他的细胞素（cytokin）瞬间诱导的[Fujita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9936-9940（1989）;Harada等人，同上（1989）;Pine等人，Cell.Biol.10：2448-2457（1990）;Yu-Lee等人，Mol.Cell.Biol.10：3087-3094（1990）]。上述实例表明，在正常生长的细胞中这种基因在细胞周期也受到调节。在细胞中，例如在NIH3T3，当细胞处于生长停滞态时IRF-1基因表达最高，当血清刺激后恢复生长时IRF-1基因表达大大下降，然后再逐渐增加至到细胞进入S相。假定，在本文描述的NIH3T3细胞系中，IRF-2的过表达抑制了IRF-1细胞生长-停滞功能，然而这种抑制作用仅在细胞周期的某些阶段时变更细胞是重要的。IRF-2的过表达没有改变这些细胞的血清依赖性，它们在血清饥饿时仍然成为生长停滞的。因而IRF-2抑制IRF-1功能的“关键”期，可能发生在细胞进入细胞周期后。

在IFN体系和细胞生长控制之间的连接

以前表明，IRF-1是一个转录激活子，在Ⅰ型IFN和IFN可诱导基因的表达中起关键的作用。而IR-2通过结合到同-DNA顺-单元上的竞争而抑制IRF-1的作用[Fujita等人，同上（1989）;Harada等人，同上（1990）;Naf等人，同上（1991）;Au等人，同上（1992）;Reis等人，同上（1992）;Stark和Kerr，同上（1992）]。在病毒感染的细胞中，IRF-1必须经受一些类型的修饰以有效地激活IFN基因[Watanabe等人，同上（1991）]。本文所述结果表明，在调节IFN体系和细胞生长这两者中IFN基因的困难。在正常生长的细胞中，由IFNs突发性诱导IRF-1基因对由IFNs引起的细胞周期的扰搅是主要的，至少是部分的[Sokawa等，Nature 268：236-238（1977）;Balkwill和Taylor-Papdimtriou，Nature 274：798-800（1978）]。

IRF-1的效应可能因IRF-2表达水平而影响，可望IRF-2在不同类型的细胞中进行变化。

IRF-1诱导的细胞生长调节的可能机理

由本文的上述结果可以认为IRF-1激活一系列基因，它们的产物对细胞生长的负调节是必要的。这种基因的表达对于细胞生长的正常调节是重要的，因为假定IRF-2通过抑制IRF-1的功能而诱导细胞的转化。这种假设为如下的观察支持：IRF-1的表达使由IRF-2诱导的转化表型反转。以前曾证明，虽然不是全部，但是有很多IFN-诱导基因在其促进子区内含有序列，它们结合IRFs[综述于Vilcek，同上（1990），Stark和Kerr，同上（1992）]。关于这一点已经提供了证据表明，在抑制细胞的增殖中涉及2′，5′-寡聚腺嘌呤核苷酸合成酶（它的基因是IFN诱导的），虽然在这一点上还存在一些有争论的报导[综述于Revel和Chebath，Trends Biol.Sci.11：166-170（1986），De Maeyer和De Maeyer-Guignard，同上（1988）]。有意思的是，这种酶的活性看来随细胞周期而波动[Jacobsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4954-4958（1983）;Wells和Mallucci，Exp.Cell Res.159：27-36（1985）]，并且其表达是由IRF-1调节的[Au等人，（1992）;Reis等人，（1992）]。另一方面，可能是IRF-1通过一个以上的机理调节其作用，对于生长调节关键的特定机理可能在很大程度上依赖于细胞类型和细胞的条件。IRF-2的过表达通过某种不是抑制IRF-1的功能的机理而引起肿瘤的变化的观点似乎是不可能的，特别是根据结果表明，相似于由IRF-2过表达而诱导的一种表型也可以通过在NIH3T3细胞中表达IRF-1反义RNA而诱导。

因此，IRF-1和IRF-2通常对细胞生长起关键调节子的作用，而细胞质在这两因素间的平衡中瞬间诱导而改变。在病毒感染的细胞中，这些因素是用于有效地启动IFN-α和-β基因，它对于宿主防御病毒的侵袭是重要的。

IRF-1和其他作为肿瘤阻遏物的核因素

所提出的结果表明IRF-1是肿瘤阻遏物的一种新出现的成员[综述于Marshall，同上（1991）;Weiberg，Science 254：1138-1146（1991）]。至今，在有关肿瘤抑制方面已有广泛研究的三个核因素;P105-RB（pRB）（综述于Weiberg，同上（1991））;Hamel等人，Trends Genet.8：180-185（1992）]，p53（综述于Hollstein等人，Science 253：49-52（1991）;Levine等人，Nature 351：453-456（1991）]和WTI基因产物（综述于Haber和Housman，cancer Res.59：41-68（1992）;Van Heyningen和Hastie，Trends Genet.8：16-21（1992）]。认为，后两个因素直接调节转录活性，或以正的形式（p53）[Farmer等人，Nature 358：83-85（1992）;Kern等人，Science 256：827-830（1992）]，或以负的形式（WTI）[Madden等人，Science 253：1550-1553（1991）]。

IRF-1似乎是相似于很好表征的肿瘤阻遏物p53，其中它们两个都起作这转录的激活子的功能，两个都调节细胞生长。有趣的是，在生长停滞期，p53量仍然上升[Kastan等人，cancer Res.51：6304-6311（1991）]，并在整个细胞周期内进行调节[Reich和Levine，Nature 308：199-201（1984）]，正如在IRF-1的情况中所观察到的。有意义的是，p53的突变致癌形式抵消了野生型p53的功能[Kern等人，同上（1992）]，和IRF-2对IRF-1的影响相似。在这一点上，有趣的可能性是p53象IRF-2一样也具有天然的对抗因子，而在实际上，最近已报导了这样的一种候选者、[Momand等人，Cell69：1237-1245（1992）;Oliner等人，Nature 358：80-83（1992）]。在同一文章中，另一肿瘤阻遇物基因WTI，编码一个有DNA结合能力的蛋白质，最近的论据提出，WTI蛋白可以通过一个结构上相关的激活子EGR-1和/或其蛋白质族而抑制调节的转录（Madden等人，同上（1991）Van Heyningen and Hastie，同上（1992））。

在人类肿瘤中IRF-1的作用

正如本文所述，人的IRF-1基因定位在染色体5q31，而且在所观测的11个患急性白血病和有染色体5q的间质缺失的MDS病例中的每一例以及在两个有染色体5q31相互易位的急性白血病的病例中的每一例中都有一个IRF-1等位基因缺失。在急性白血病的一个病例中，也观察到在一个IRF-1等位基因中的重排，它引起了近似启动子区域和第一个外显子的缺失。而且，在这病例中在大多数的白血细胞中发现剩余的IRF-1等位基因是缺失的。从结果表明在IR-1/IRF-2比值中的微小变化能引起细胞不受限制地生长，失去一个或2个IRF-1的等位基因都可认为表明一种易于生长肿瘤的关键步骤。特别是白血病和有5q31异常的MDS。因此，经常出现在人的白血病和MDS的5q-综合症和del（5q）中，其中IRF-1是一个关键缺失的基因。

正如本文所述，缺少IRF-1等位基因或含有突变的或易位的等位基因的细胞以及因而它们不能应答负的生长因素，这些细胞更易于产生癌的表型。

因此，IRF-1和IRF-2是两个结构上有关的DNA结合因子和独特实例，它以一种相互对抗的方式起作用，表明了抗致癌和致癌因素的平衡的重要性，这种平衡的改变是细胞转化的关键的一步。

在患者中，对于因染色体5[del（5q）或易位5q31]长臂的缺失或突变或易位而形成肿瘤如MDS的患肿瘤的病人，IRF-1是“关键的缺失”的肿瘤阻遏物基因。本发明提供了新的可能性，以论断和治疗肿瘤，特别是MDS和AML。检测IRF-1种系（组成的）和体细胞的缺失及突变就可使下述成为可能：

1、更精确地论断和确定有发展肿瘤如MDS和AML倾向的个体。

2、更精确地论断和确定那些肿瘤患者，例如MDS和AML病人，其疾病的引发是通过或部分由于IRF-1突变，从而确定一个独特的MDS和AML病人组，这些病人可得益于创新的生物治疗（见上述）。

3、根据有或没有IRF-1突变或缺失，有或没有其他核型（细胞遗传）异常和其他临床特征而对MDS和AML患者开展一种新的预后分层和分类方案。

4、根据我们目前理解的IRF-1的生理学和在正常的真核细胞中IRNα/β细胞生长抑制途径，给IRF-1缺失和突变的MDS和AML病人以新的生物治疗法的合理方案。这些新的和创新的治疗方法将包括：

a）设计治疗方案，使用细胞质或其他生物因素以选择性地消除带IRF-1缺失和突变的造血细胞或使用细胞质以校正丧失IRF-1功能而引起的生理缺陷。

b）设计治疗方案，使得能够从人的造血干细胞（HSC）总群体中选择地体外消除含IRF-1缺失和突变的HSC，在去除有IRF-1缺失和突变的HSC下，可以选择性地扩大HSC，从而消除这种有缺陷的干细胞的骨髓或同血液HSC，以使得校正的骨髓或同血液HSC自体移植到MDS和AML病人。

c）设计基因治疗方案，它将IRF-1基因输送到有IRF-1缺失和突变的人的细胞中，从而较正因IRF-1功能丧失而导致的遗传和生化的缺陷。

表2  细胞系过度表达IRF-2和对照的生长性质

细胞系  在甲基纤维素凝胶中的生长  致瘤性

效率(%)  肿瘤/注入  潜伏期(周)

C-2  0,0  0/7  -

C-3  0,0  0/5  -

2-1  7,12  6/6  2-3

2-5  6,6  6/6  2-3

2-7  10,19  6/6  2-3

在甲基纤维素凝胶中生长给出的值来自二次测定值

对致瘤性的试验细节描述于实验方法中

实施例10

带有IRF-1或IRF-2基因的反病毒细胞的转染

构建了一种重组体反病毒载体pGDIRF2，它控制小鼠IRF-2 cDNA的表达。用小鼠IRF-2 cDNA嵌入pGD载体而构建重组体反病毒pGDIRF2（Daley，G.Q.等人，Science 247：824（1990））。DNA构建在ψ2细胞中进行转染（Mann，R.等人，Cell 33：153（1983）），得到具有高滴定度（～10⁶cfu/ml）病毒上清液的世代，高滴定度是根据对NIH3T3细胞具有新抗力的能力来测定。NIH3T3细胞用pGDIRF2反病毒在传染的高多重性下进行感染并将这些细胞在甲基纤维素凝胶上直接进行菌落形成试验。如表4所概括的，用IRF-2表达的病毒而不是用对照的pGD病毒感染细胞其菌落形成的效率高，假设全部细胞被病毒感染，其菌落形成的效率与上面提到三种选择的克隆的相类似（见表1）。用小鼠IRF-1 cDNA嵌入pGD载体而构建重组体组体反病毒pGDIRF1并转染进ψ2细胞以产生一种具有上述对病毒pGDIRF-2的高病毒滴定度的上清液。NIH3T3细胞（克隆R2-7）用病毒感染而发现经引入和增加IRF-1基因的表达这些细胞的IRF-2诱导转化是可逆转的。与这种观察相一致的是在用pGDIRF1反病毒感染的R2-7细胞的甲基纤维素凝胶中所生成的菌落明显降低（表5）。这些结果一起表明IRF-2有致瘤的可能性，在IRF-1和IRF-2表达之间保持平衡对抑制细胞生长是很重要的。当这种平衡受IRF-1的过表达扰乱时，细胞增殖可被抑制（Yamada等人，同上;Abdollahi等人，Cell Growth和Differ.2：401（1991）;Kuchhoff，S.等人，Inteferon Res.12（S）：102（1992）），而IRF-2的过度表达可以促进不受抑制的生长。

表4  IRF-2基因的反病毒引入后在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率

在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率(%)

pGD  pGDIRF2

实验1  <1,<1  17,15

实验2  <1,<1  12,16

表5  IRF-1基因的反病毒引入后在R27细胞的菌落形成

在甲基纤维素凝胶中按5000细胞的菌落数目

m.o.i.  pGD  pGDIRF1

实验1  0.3  417,389  308,287

实验2  1  423,408  187,225

实验3  10  415,432  196,124

在上文中所提及的全部文献都引入本文作为参考。

为了清楚和了解，上面的发明已有详述，专业人员可以理解，阅读本发明后，在不离开本发明的实际范围和所附权利要求可以在形式上和细节上作不同的改变。

序列明细表

序列数：4个

序列ID  No1：

（1）序列特性：

（A）长度：51个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股纹状态：双的

（D）拓扑学：线性的

（2）分子类型：DNA

（3）列序叙述：序列TD No1：

TTGTGGTAGT ACCGGTGGGG GCCCGGCAGG TTTCGCAGAT CTGCGTGCGC G

序列ID  No2：

（1）序列特性：

（A）长度：51个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股纹状态：双的

（D）拓扑学：线性的

（2）分子类型：DNA

（3）列序叙述：序列TD No2：

ACCGGACGAG GCTGCCGGGG GCCCGGCAGG TTTCGCAGAT CTGCGTGCGC G

序列ID  No3：

（1）序列特性：

（A）长度：82个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股纹状态：双的

（D）拓扑学：线性的

（2）分子类型：DNA

（3）列序叙述：序列TD No3：

TTCCAACCAA ATCCCGGGGC TCATCTGGAT TAATAAAGTG AGTGTAACTC TTTGGGTTTT CCTGCCACTG TTTTAACCCA TG

序列ID  No4：

（1）序列特性：

（A）长度：82个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股纹状态：双的

（D）拓扑学：线性的

（2）分子类型：DNA

（3）列序叙述：序列TD No4：

TTCCCAACCAA ATCCCGGGGC TCATCTGGAT TAATAAAGTG AGTGAACTC TTTGGGTTTT CCTGCCACTG TTTTAACCCA TG

质粒明细表

PUCIRF-1 含有在限制位点SalⅠ（Xho Ⅰ）和Sma Ⅰ（Hinc Ⅱ）之间编码人IRF-1的cDNA插入物（图9）。

pHIRF4S-51  含有在限制位点Xhol，编码人IRF-2的cDNA插入物（图10）。

pUCHIRFIB  说明书中已详述，并含有19kb基因人IRF-插入物。

Hybridoma TK3 这是产生对IRF-1专一的抗体TK3并在文中涉及的。

Claims (33)

1、一种对致瘤的哺乳动物细胞或有致瘤哺乳动物细胞的倾向性的测定方法，它包括：

(a)选择一个与所述细胞产生IRF-1的能力有关的参数，

(b)确定参数的值，这个参数相当于所述细胞能产生IRF-1的肿瘤抑制量，

(c)从所述哺乳动物的所述细胞中取出一个样品，并将所述细胞进行分析以测定在所述样品中一个细胞的所述参数值，

(d)将(c)中测定值与(b)中确定的值相比较。

2、一种根据权利要求1的方法，其中，所选择的参数是IRF-1/IR-2之比。

3、一种根据权利要求1的方法，其中，参数是在编码IRF-1染色体5的等位基因数目。

4、一种根据权利要求1的方法，其中，参数是在染色体5中编码突变体IRF-1的等位基因数目。

5、一种根据权利要求1的方法，其中参数是在染色体5中已易位的编码IRF-1基因或其片段的数值。

6、一种根据权利要求1的方法，其中参数是存在或缺少染色体5。

7、一种根据权利要求2的方法，其中将来自哺乳动物的细胞或来自可能有低的或没有致瘤倾向的哺乳动物群体的细胞进行分析。测定在这些细胞中IRF-1/IRF-2之比的确定值，再分析来自可能有致瘤危险的哺乳动物的细胞，以测定其中IRF-1/IRF-2的比值，并将这两个值进行比较。

8、一种根据权利要求2和6的方法，其中，通过每个细胞的mRNA分子计数来确定IRF-1/IRF-2的比值，mRNAs的比值视作各蛋白质的比值。

9、一种根据权利要求8的方法，其中每个细胞mRNA分子数是通过由一个细胞群体中提取全部细胞的RNA，用标记的相应的哺乳动物的IRF-1和IRF-2  DNA片段作为探针将提取物进行S1绘图分析，以及测定各个IRF-1和IRF-2印迹的标记强度而得到的。

10、一种根据权利要求8的方法，其中，每个细胞的mRNA分子数是通过从一个细胞群体中提取全部细胞的RNA，用标记的相应的哺乳动物的IRF-1和IRF-2 DNA片段作为探针而对提取物进行RNA印迹分析，并测定各个IRF-1和IRF-2印迹标记强度而得到的。

11、一种根据权利要求2或6的方法，其中，IRF-1/IRF-2比值是通过使用对IRF-1和IRF-2分别具有特异亲合性的标记的单克隆抗体而进行免疫检测而测定的。

12、一种根据权利要求2的方法，其中，在编码IRF-1的染色体5中的等位基因数是通过使用标记的IRF-1 DNA探针而进行测定的。

13、一种根据权利要求10的方法，其中DNA探针是IRF-1 cDNA探针。

14、一种根据权利要求12的方法，其中，探针是至少8kb的IRF-1基因的探针，优选的约10-19kb。

15、一种根据权利要求4的方法，其中，突变是一个点的突变，或缺失一个或更多的氨基酸。

16、一种根据权利要求4或15的方法，其中，突变是通过IRF-1基因或其片段的克隆和序列分析而测定的。

17、一种根据权利要求4或15的方法，其中，IRF-1基因或片段由PCR放大，克隆进入合适的载体，增殖，分离克隆并作序列分析。

18、一种根据权利要求15的方法，其中，IRF-1片段是通过PCR放大并直接作序列分析。

19、一种根据权利要求15的方法，其中IRF-1片段是通过PCR放大，并通过变性梯度凝胶而对突变进行筛分。

20、一种根据权利要求15的方法，其中IRF-1片段是用PCR放大，并通过单股构象多态分析法对突变进行筛分。

21、一种克隆cDNA或基因DNA，它用于降低细胞致瘤的倾向性或抑制细胞致瘤的表型，包括编码IRF-1的DNA序列。

22、根据权利要求15的一种克隆cDNA或基因DNA，它包括编码人IRF-1的DNA序列。

23、一种降低细胞致瘤倾向或抑制细胞致瘤表型的方法，它包括使用一种编码IRF-1的克隆cDNA或基因克隆并将所述克隆IRF-1cDNA或基因克隆送至细胞。

24、一种降低细胞致瘤倾向或抑制细胞致瘤表型的方法，它包括将IRF-1送到细胞。

25、一种用于处置患有癌症或易于以后发展成癌的病人的方法，它包括从所述病人中取出组织，将由所述组织筛选细胞，以使细胞没有IRF-1缺失或突变，分离和扩大这些细胞的群体，并把细胞的扩大群体重新引入患者体内。

26、一种药合用于测定细胞或组织的IRF-1/IRF-2的比例，它包括在分开的容器中的抗IRF-1抗体和抗IRF-2抗体，所述抗体没有或基本没有交叉活性。

27、一种诊断人的致瘤组织或有致瘤倾向性的组织的方法，它包括，

（a）由人体中取出怀疑致瘤或有致瘤倾向的组织。

（b）由所述组织检测一个或多个编码功能性IRF-1的基因或它们编码的活性IRF-1蛋白的缺失，所述缺失表明组织有致瘤或易于致瘤。

28、一种根据权利要求27的方法，其中所述IRF-1基因缺失的检测，包括对点突变的筛选。

29、一种根据权利要求27的方法，其中检测所述IRF-1基因的缺失包括对缺失突变的筛选。

30、一种根据权利要求27的方法，其中检测所述IRF-1基因的缺失包括在染色体5中对基因位移的筛选。

31、一种根据权利要求27的方法，其中检测所述IRF-1基因的缺失包括使用聚合酶链反应而序列分析全部或部分IRF-1基因。

32、一种根据权利要求27的方法，其中，检测所述IRF-1基因的缺失包括使用标记的IRF-1  DNA探针进行在原位荧光杂化。

33、论断人的致瘤组织或易于致瘤的组织的方法，包括：

（a）由人体中分出可疑致瘤的或易于致瘤的组织。

（b）在所述组织中测定IRF-1/IRF-2的比值，并将所述比值与正常体的细胞比值进行比较。

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