CN1051110C - 筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒 - Google Patents

筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN1051110C
CN1051110C CN93117298A CN93117298A CN1051110C CN 1051110 C CN1051110 C CN 1051110C CN 93117298 A CN93117298 A CN 93117298A CN 93117298 A CN93117298 A CN 93117298A CN 1051110 C CN1051110 C CN 1051110C
Authority
CN
China
Prior art keywords
irf
cell
people
gene
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN93117298A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1098140A (zh
Inventor
谷口维绍
谢里尔·L·威利姆
玛丽亚·G·帕拉维西尼
原田久士
田中信之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN1098140A publication Critical patent/CN1098140A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1051110C publication Critical patent/CN1051110C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

一般来说，本发明涉及诊断致瘤的哺乳动物细胞或诊断哺乳动物细胞的致瘤倾向性的一种方法。另外，本发明涉及一种克隆的cDNA或基因组DNA，其可降低细胞致瘤的倾向性，或抑制细胞的致瘤表型；一种用于降低细胞致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤表型的方法；一种用于治疗患有肿瘤或易于以后发展成瘤的患者的方法，以及一种用于诊断人的致瘤组织或易于致瘤的组织的方法。

Description

筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒
背景技术
本申请是在此处用作参考的1992年11月24日序列号为07/950574的申请的部分继续申请。
发明领域
一般来说，本发明涉及对致瘤的哺乳动物细胞或对易于致瘤的哺乳动物细胞的测定方法。此外，本发明涉及用于降低细胞致瘤倾向性的或抑制细胞的致瘤表型的克隆cDNA或基因组DNA；涉及减少细胞的致瘤倾向性或抑制细胞的致瘤表型的方法；涉及治疗患癌症的病人或易于随后发展成癌病人的一种方法；以及诊断人的致瘤组织或易于致瘤的组织方法。
背景资料1、干扰素和干扰素调节因子1和2
干扰素(IFNs)属于一类多效细胞因子(cytokine)，最初是由于它们的抗病毒性质发现的。各种组织在病毒感染时产生I型干扰素即IFN-αs和IFN-β，并且通过诱导一批基因(IFN-诱导基因)以随后分泌的IFNs在靶细胞上发挥它们的抗病毒活性。最近，人们的许多关注都集中在IFNs在细胞生长和分化上的作用，而且业已证明IFNs对许多正常细胞和转化的细胞具有抗增殖作用(Weissmann和Weber的综述，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.33：251-300(1986)；Pestka等人，Annu.Rev.Biochem.56：727-777(1987)；De Maeyer和De Maeyer-Guignard，Interferons and other Regulatory Cytokines，New York，John Wiley and Sons(1988)；Taniguchi，Annu Rev.Immunol.6：439-464(1988)；Vilcek，“Interferons etc.”，Handbook of ExperimentalPharmacology，Sporn and Roberts，eds.，Berlin，Springer-Verlag，pp.3-38(1990)；Sen and Leng-yel，J.Biol.Chem.267：5017-5020(1992))。另外，许多研究也已证明IFNs和生长刺激因子呈相互拮抗性的方式；已经表明，IFNs能够防止生长因子刺激的细胞周期转换，同时表明某些生长因子可以逆转IFNs的抗增殖作用。而且，因为IFNs是由许多生长因子诱导的，暗示IFNs在调节细胞生长的反馈机制中的生理学上的作用。因此，这些研究有助于支持这种普遍流行的观点，即IFNs是“负生长因子”(综述于Clements和McNurlan，Biochem.J.226：345-360(1985)；Tamm等人，Interferon 9，I.Gresser，ed.，California，Academic Press，第14-74页(1987)；De Maeyer andDe Maeyer-Guignard，同上(1988)；Gresser，Acta Oncologica 28：347-353(1989)；Vilcek，出处同上(1990))。在这方面，感兴趣的是I型IFN基因在某些类型的恶性肿瘤中常常被排除(Diaz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5259-5263(1988)；Miyakoshi等人，Caner Res.50：278-283(1990))。但是，关于IFNs的这些抗增殖效应的机制方面知道的很少。
在对人IFN-β基因的调节机制的研究期间，发现了二种新的DNA结合因子，即干扰素调节因子-1(IRF-1)和2(IRF-2)(Fujita等人，EMBO J.7：3397-3405(1988)；Miyamoto等人，Cell 54：903-913(1988)；Harada等人，Cell58：729-739(1989))。因此在1989年8月24日申请的美国专利申请顺序号07/397,967中也公开了人和小鼠IRF-1和小鼠IRF-2的氨基酸顺序以及DNA顺序编码。这两种因子结构上有关系，特别是在赋予DNA结合专一性的N-端区域。事实上，在IFN-α，IFN-β和许多IFN-诱导基因的启动子内发现这两种因子结合到相同DNA顺序元件上(Harada等人，出处同上(1989))。
一系列基因转染研究已经证明，对IFN和IFN-诱导基因来说，IRF-1是一种关键的活化因子，而IRF-2抑制IRF-1的效应(Fujita等人，Nature337：270-272(1989)；Harada等人，Cell 63：303-312(1990)；Naf等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1369-1373(1991)；Au等人，Nucl.AcidsRes.20：2877-2884(1992)；Reis等人，EMBO J.11：185-193(1992)；Stark和Kerr，J.Interferon R.12：147-151(1992))。在这种IFN介导的细胞应答方面，感兴趣的是，IRF-1基因本身的表达是IFN可诱导的。在IFN-刺激细胞中IRF2基因也被诱导，但这种诱导作用只出现在继IRF-1基因诱导之后(Harada等人，出处同上(1989))。而且，先前的研究已表明，IRF-1和IRF-2在它们的稳定性方面不相同；在INF处理或病毒感染的细胞中前者有一短的半衰期(约30分钟)，而后者比较稳定(半衰期约8小时)。在生长的细胞中，IRF-2含量高于IFR-1，但IRF-1/IRF-2之比随着因IFNs或病毒的刺激而增加(Watanabe等人，Nucl.Acid Res.19：4421-4428(1991))。因此，IRF-1/IRF-2比的瞬间增加在用IFNs调节细胞生长中可以是一种关键性事件。和这种观点相一致的是发现了带有连接到人免疫球蛋白基因增强因子的人IRF-1基因的转移基因小鼠缺乏发育的B淋巴细胞(Yamada等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88；532-536(1991))。2.肿瘤阻遏物基因
人肿瘤发生是由于在调节细胞生长、分化和转移的多基因的位置上突变的渐进产生而引起的多步过程。在研究最多的人肿瘤模型中，在显性作用的原癌基因中的“功能获得”突变是与肿瘤抑制基因中的“丧失功能”突变一起被发现的。虽然多数原癌基因刚开始识别和表征，但最近的研究已经证明几种肿瘤阻遏物基因的突变或缺失，包括RB，p53，和WT1(Marshall，Cell64：313-326(1991))，以及APC(Groden等人，Cell 66：589-600(1991)；Kinzler等人，Science 253：661-664(1991))，和NF1(Xu等人，Cell 62：599-608(1990)；Marshall，出处同上，(1991)；Li等人，Cell 69：275-281(1992))；对于人肿瘤的发育是关键的。在其它基因位点的杂合性的丧失(Ponder，Nature335：400-402(1988)；Marshall，出处同上，(1991))和人肿瘤中的特定染色体区域的再发生缺失已经支持这种观点，即许多更可能的肿瘤阻遏物基因有待研究识别。
染色体5的长臂间质缺失(del(5q))，“5q-”细胞遗传异常性或全染色体5丧失(-5或单体性5)是人白血病和白血病前期的脊髓发育不良的综合征(脊髓发育不良；MDS)中最常再现的细胞遗传异常。发现Del(5q)或单体性5分别存在于30％患MDS的病人中，在50％患继发的或治疗诱导的急性脊髓性白血病(AML)的病人中，和在15％及2％重新患AML和重新得急性淋巴白血病(ALL)的病人中(Van den Berghe等人，Nature 251：437(1974)，CancerGenet.Cytogenet.17：189-255(1985)；Fourth International Workshop onChromosomes in Leukemia，(1982)；Le Beau等人，J.Clin.Oncol.4：325-345(1986)；Nimer和Golde，Blood 70：1705-1712(1987)；Kerim等人，Leukemia 4：12-15(1990)；Pederson-Biergaard等人，Blood 76：1083-1091(1990))。这种del(5q)最初被描述作为一种独特的脊髓发育不良综合征(“5q-综合症”)的标志，它主要出现于患有再生性障碍贫血，血小板增多和异常的巨核细胞的成年女性病人身上(Van den Berghe等人，出处同上(1974))。患这种综合征的女性通常有一种无痛的临床病程；被感染的骨髓干细胞克隆呈现出慢的扩展能力，仅偶然地产生另外的细胞遗传异常性，而且仅10-20％病例转化成AML(Van den Berghe等人，同上(1985)；Dewald等人，Blood 66：189-197(1985)；Nimer and Gold，同上(1987))。相反，重新患上或继发带del(5q)的AML病人通常会有另外的细胞遗传异常性和很差的预后(Rowly等人，Blood 58：759-767(1981)；Fourth International Workshop onChromosomes in Leukemia(1982)；Le Beau等人，同上(1986)；Samuels等人，Leukemia 2：79-83(1988))。在AML情况下，del(5q)/-5的出现常常与职业性的接触致癌物相关(Mitelman等人，Blood 52：1229-1273(1978)；Golomb等人，Blood 60：404-411(1982))或者与为了治疗各种恶性肿瘤而早先接触烷基化制剂的化学治疗或放射治疗相关(Le Beau等人，同上(1986))。
一系列的研究业已表明，del(5q)最小的一般缺失的片段，所谓的“关键”区存在于5q31带(Le Beau等人，Blood 73：647-650(1989)；Pederson和Jensen，Leukemia 5：566-573(1991))。少见的带有包括5q31移位的重新AML也已有描述(Fourth International Workshop on Chromosomes in Leukemia，1982)。这些发现暗示病原基因在5q31中，并且这种基因的缺失对白血病和MDS的发病机理是重要的。许多候选基因已被定位到5q31区域，包括血细胞生成生长因子和白细胞介素IL-3，IL-4，IL-5，IL-9，和GM-CSF，以及EGR-1转录因子(Huebner等人，Science 230，1282-1285(1985)；Le Beau等人，Science 231：984-987(1986)和同上(1989)；Suth-erland等人，Blood，71：1150-1152(1988)；Warrington等人，Genomics 13：803-808(1992))。但是，目前这些基因中没有一种表明能满足候选肿瘤阻遏物基因的所期望的要求。尽管不一致，常常有报道在白血病和带有del(5q)的MDS病人中缺失一种IL-3，IL-4，IL-5，和GM-CSF等位基因(Le Beau等人，同上(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5913-5917(1987)，同上(1989)；Nimer和Golde，同上(1987))。但并未发现在残留的等位基因中有纯合性的降低，结构重排，或突变(见Nimer and Golde，同上(1987))。最近在del(5q)病人中EGR-1的研究已经得到相似的阴性结果(G.Gilliland等人，Harvard University.私人通讯)。因此，在这领域中的候选肿瘤阻遏物基因还有待于研究阐明。
                    发明简述
本发明一般目的是提供一种诊断致瘤细胞或有致瘤细胞倾向性的方法。
本发明的具体目的，是提供一种诊断致瘤的哺乳动物细胞或有哺乳动物细胞的致瘤倾向性的方法。
本发明的具体目的，是提供一种克隆cDNA或基因组DNA以降低使细胞易于致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤表型。
本发明的又一目的，是提供一种降低细胞易于致瘤的倾向性或抑制细胞的致瘤表型的方法。
本发明的另一目的，是提供一种治疗患有或易于随后发展成癌症的病人的方法。
本发明的又一目的，是提供一种诊断人的致瘤组织或易于致瘤的组织的方法。
本发明的其它目的及其优点从下文所述将会更清楚。
                    附图简述
图1A是由正常的用IRF-1基因组克隆杂交的来自淋巴细胞的经过碘化丙锭染色后的中期染色体。
图1B是用计算机辅助对经IRF-1探针和与5q22的序列互补的单一基因组探针杂交的正常中期的染色体5的微量分析。
图2是得自正常对照样品和得自白血病和MDS样品的经Hind III消化后的DNA进行的Southern印迹分析图。
图3A表示用IRF-1探针(箭头1)和5q22(箭头2)在细胞核分裂间期原位杂交的双色荧光结果，其中A是带有2个5q22和2个IRF-1等位基因的正常淋巴细胞。
图3B是带有4个5q22和仅2个IRF-1区域的S型白血病细胞，表明1个IRF-1等位基因的缺失。
图3C是因del(5)(q11q33)引起的带有仅1个5q22和1个IRF-1区域的白血病细胞。
图4说明在一急性白血病情况下IRF-1基因的结构重排的特征。
图5表示用反向PCR在IRF-1基因内进行的折点的克隆和测序(SEQ IDNO：1-4)。
图6说明在细胞周期中IRF-1mRNA表达的波动。
图7说明IRF-2在NIH3T3细胞中的过度表达。
图8说明由IRF-1引起的IRF-2诱导转化的逆转。
图9、图10分别为质粒pUCIRF-1、pHIRF4S-51。
                    附图详述
在图1A表明碘化丙锭染色的用IRF-1基因克隆杂交的来自正常淋巴细胞的中期染色体。IRF-1探针特异地与染色体5q的序列杂交(箭头1)。在分裂间期核中也能检测到两个IRF-1杂交区域(箭头2)。
在图1B中，其表明用IRF-1探针(箭头1)和与5q22的序列互补的单一基因组探针杂交的正常中期的染色体5的计算机辅助的微量分析，IRF-1基因被定位到与短臂端粒(染色体)相关的5q31.1上。
在图2中，是由正常对照和由白血病及MDS来的样品(也见表1)的HindIII消化的DNA的Southen印迹分析。滤膜开始用检出6.0kb片段的IRF-2cDNA探针杂交，然后除去并用检测作为内标的3.0kb的带的C9探针再杂交。泳道对应于如下样品(表1标出)：1(9)、2(1)、3(13)、4(3)、5(5)、6(6)、7(8)、8(10)、9(7)、10(正常骨髓对照；5μg)，11(正常骨髓对照，2.5μg)。
图3表明用IRF-1探针(箭头1)和5q22(箭头2)在细胞核分裂间期进行原位杂交的双色荧光的结果，其中：
(A)带有2个5q22和2个IRF-1等位基因的正常淋巴细胞；
(B)带有4个5q22和仅2个IRF-2区域的S型白血病细胞(代表样品12，见表1)，表明有1个IRF-1等位基因的缺失；
(C)因del(5)q11、q33引起的带有仅1个5q22和1个IRF-1区域的白血病细胞(样品7，表1)。
图4描述在急性白血病病例中(表1，样品10)IRF-1基因的结构重排的特征，其中：
(A)是人IRF-1基因图和含有外显子1和2的HindIII区带的放大。上部表明人IRF-1基因的外显子图；外显子的位置用填满的方块指出。下部是放大的含外显子1和2的HindIII区带。用有斜线的方块指出外显子的位置，而Southern印迹分析中所用的探针是探针1和探针2。限制性内切酶位点：H，HindIII；Ba，BamHI；Bg，BglII.(Ba)表示一个多态性的BamHI位点。
(B)是正常DNA(N)和病人样品10(P)的基因组DNA的Southern印迹分析。用相同方法制备的滤膜用如下各探针进行杂交：IRF-1cDNA(左边图；pHIRF31的2.0kb XhoII片段；见实验方法)，探针1，(中间图；如图4A注明的1.0kb HindIII-BgIII片段)和探针2(右图；如图4A注明的1.0kb BglIII-HindIII片段)。箭头指出与正常(N)DNA比较在白血病样品(P)中的缺失和出现新的带正常DNA指由健康的无白血病的无关个体来的DNA。
图5记述用反向PCR在IRF-1基因内的折点的克隆和测序。
(A)是包含外显子1和2及内含子1的IRF-1基因的1.9kb HindIII-HindIII区的图谱。在白血病样品(样品10)中新的HindIII位点和产生的400bpHindIII片段用图上(HindIII)指出，也指出了反向PCR所使用的引物和方向。
(B)是由白血病样品(P；样品10)和正常DNA(N)衍生的所克隆的PCR产物的序列，用星号*表示在白血病和正常DNA中的相同序列。白血病样品序列表明在内含子1的引物1后偏离10个核苷酸。
图6说明在细胞周期中IRF-1mRNA表达的波动。
(A)说明用血清刺激引起胸苷吸收的动力学。取该时间段中(在20小时1.3×105cpm/2×104个细胞)3H-胸苷吸收达到的最高量为100％。
(B)说明在血清-诱导生长期间IRF-1和IRF-2mRNA的表达。NIH3T3细胞起始用血清饥锇来抑制，随后添加血清来诱导。上部表示S1绘图分析的结果。在指定的时间，分离出总的RNA并进行分析，箭头指出受保护的IRF-1和IRF-2探针的位点。泳道M相当于32P标记的HaeIII-消化的pBR322DNA片段。下部表明用光密度分析计算所得的从上面泳道得到IRF-1和IRF-2的mRNA的拷贝数目。曲线是IRF-1(白圆点)和IRF-2(黑圆点)。
(C)说明在血清诱导生长期间IRF-1蛋白质的表达。NIH3T3细胞的生长停滞和刺激如(B)中所述。
图7说明NIH3T3细胞中的IRF-2的过度表达。
(A)表明Northern印迹分析，其中接着是IRF-2mRNA的表达。
(B)说明IRF-2活性转染NIH3T3细胞的凝胶位移分析。箭头指出IRF-2-DNA复合物的位置，迁移较快的带可能代表结合到DNA探针的IRF-2的断裂产物(也见图8B)。
(C)说明对照细胞系和过度表达IRF-2的细胞系的生长曲线。指出的生长曲线中空心圆圈为C-2，空心方块是C-3，黑圆实心圆圈是2-1，实心方块是2-5，和实心三角是2-7。
图8说明用IRF-1逆转的IRF-2的诱导转化。
(A)表示人IRF-1mRNA在抗潮霉素克隆中的表达。道1至7为模拟诱导，道8至12用NDV(新城病病毒)诱导。细胞系如下：道1和8，细胞系2-1-1；道2和9，2-1-2；道3和10，2-5-2；道4和11，2-7-1；道5和12，2-7-2；道6，C-3；道7，2-7。箭头表示被保护的人IRF-1探针的位置。
(B)表示用凝胶移位分析检测的IRF-1和IRF-2活性的结果。空心三角形和实心三角分别表示IRF-1和IRF-2的因子-DNA复合物的位置。第3道和第6道内源性鼠IRF-1的活性只有在延长曝光后才能检测到。迁移较快的带可能代表结合DNA探针的IRF-1和/或IRF-2的断裂产物。迁移较慢的带(道4、5、7、8、10和11)代表由二个IRF-2分子结合的DNA探针。
(C)表示分别用鼠IRF-2cDNA和人3-肌动蛋白拟基因作探针时5微克IRF-2RNA的Northen印迹分析结果。
(D)表示细胞系C-3、2-7、2-7-3和2-7-4的生长曲线。其中空心方块是C-3，实心三角形是2-7，空心三角形是2-7-3，和空心圆是2-7-4。
                        发明详述
本发明是以这种发现为基础而预测的，即IRF-1是一种肿瘤抑制基因，在各种癌症病人中其一个或二个等位基因发生缺失或突变，并且它被定位到5q31.1，即del(5q)的关键缺失区”；并且IRF-1与和其结构相关的转录阻遏物IRF-2比有微小的改变就会对细胞生长含有深刻的影响，其中，当IRF-1表现出抗致癌的特性，相反地，IRF-2的过度表达会促进肿瘤发生。
根据本发明的一方面，提供一种诊断致瘤的哺乳动物细胞或诊断易于致瘤的哺乳动物细胞的方法，其包括：
a)选择一个与所述细胞产生IRF-1的能力有关的参数；
b)规定这参数的值，该值相当于所述细胞产生癌症抑制量的IRF-1的能力；
c)除去所述哺乳动物的所述细胞样品并将所述细胞进行分析以测定在所述样品中细胞的所说参数值。
d)将从c)得的测定值与从b)得的规定值进行比较。
如下所述，优选的参数是细胞内IRF-1/IRF-2摩尔比，在染色体5上有或没有一个或多个编码IRF-1的基因，或在染色体5上在一个或多个编码IRF-1的基因中有一个或多个突变，或有没有染色体5。
优选的是所采取的IRF-1/IRF-2比与每个细胞中编码IRF-1和IRF-2的mRNA分子之比相关。每个细胞的mRNA分子值可以通过S1核酸酶作图依据已知方法测定(例如，见Maniatis等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，New York，Cold Spring HarborLaboratory(1982))，该方法是用标记的DNAs作探针，其中DNA至少分别地相当于IRF-1和IRF-2基因的一个片段。合适的探针最好包括基因的启动子的区域，如基因的约-100至+150，约-50至约+100相对主要加帽位点更好，而在如下描述的实例中，当用人细胞试验情况下，人基因的-46至+97区(相对于主要加帽位点的+1而言)较合适。优选使用与所研究细胞相同动物种的基因的探针DNA来进行分析。使用已知方法依据使用的特定标记可以进行mRNA分子计数。在如下所述的实施方案中探针是经放射标记的，用已知方法通过光密度计分析可得到IRF-1和IRF-2的mRNA拷贝数目。用已知方法可测定细胞数。
另一种优选的方法包括免疫测定的免疫印迹分析法，使用分别能特异地识别IRF-2和IRF-1的标记抗体来分析细胞内IRF-1/IRF-2蛋白质含量。在这样一种方法中分离出总细胞的蛋白质含量，与分别标记的抗IRF-1和IRF-2的抗体相接触，并测定所产生的标记强度。这方法优选在Western印迹分析方法后进行，然后再用光密度计分析所产生的染色剂或标记。优选地抗体是放射标记的，或用荧光素酶标记，并按已知方法用光密度计分析染色剂或标记物而得出蛋白质含量。
一种用于检测IRF-1/IRF-2比率的可替代途径是常规地用于检测和定量细胞表面和在完整正常的或新生造血细胞(以及任何谱系的细胞)中的胞内蛋白质的流式细胞计数(flow cytometric immunophenotyping)的免疫表型(见Willmar，C.L.的章节，“Flow Cytometric Analysis of HematologieSpecimens”，Neoplastic Hematopathology，Knowles，D.M.，ed.，Williams andWilkens，Baltimore，Maryland(1992))。类似Western印迹分析法，这也是一种基于免疫学的技术，但与要在分离的蛋白质上完成的Western分析方法不同，免疫表型化方法直接将荧光-标记的抗体(优选单克隆抗体)，应用于悬浮液中完整透性细胞的IRF-1和IRF-2蛋白。然后可在流式细胞计数仪中检测到荧光标记的细胞。通过用两种不同的荧光染料(荧光染料)结合到IRF-1和IRF-2的不同抗体上(见上述流式细胞计数的多色荧光分析参考文献(William C.L.，出处同上(1992)中该章第177页和181-182页)，就可以对与所分析的每个细胞的IRF-1和IRF-2的蛋白质水平进行检测、测定和关联。流式细胞光度术分析的一个优点是，它可以提供所分析的悬浮液中有关各个细胞和细胞群体的信息，而Western分析只观察悬浮液中由全部细胞分离出的总的蛋白质。流式细胞光度术的其它优点包含其快速(分析在不到24小时便完成)，使IRF-1/IRF-2比与造血细胞中其它细胞表面蛋白质的表达相互关联的能力，和在进行分析前辨别非新生细胞和/新生细胞的能力，以便使得在悬浮液中可以进行新生细胞和残余正常细胞的IRF-1/IRF-2的比率的示差测定。能够使用的详细方法学上的途径在上述文献附录2中有叙述，其中用流式细胞光度术定量测定在造血细胞中细胞内的IgM蛋白质，按照适当的类似方法在第6步骤中以抗IRF-1或抗IRF-2抗体代替鼠抗人IgM抗体。
当选择的参数是编码IRF-1的染色体5中的等位基因数目时，优选通过使用标记的IRF-1 DNA探针标记这种等位基因的方法而测定等位基因数目。一种优选方法是用已知荧光素原位杂交或用FISH方法。
依据诊断的方法和病人的情况，可用不同方法。
为了确定某一个体是否具有组成型的确实要发展成癌症的IRF-1缺失，在从外周血中分离到的正常淋巴细胞中计数IRF-1等位基因的数是适当的。可以检查分裂间期核；或者将细胞能用分裂素诱导至有丝分裂期从而由这些细胞得到中期染色体。为了测定分裂间期细胞中的IRF-1缺失，最好使用长度至少为8-10kb的基因组IRF-1克隆；较短的探针在分裂间期核中不会给出足够的杂交信号。较长的克隆是优选的，用19kb的IRF-1基因克隆已得到一致的杂交信号。为了测定中期染色体中IRF-1缺失，可以使用较短的探针。在这种测定中，也可以使用IRF-1cDNA克隆，但发现用19kbIRF-1基因克隆是优选的。
为了在组织活体或抽提物中定量测定IRF-1等位基因的数量以诊断可疑癌症，可以进行分裂间期的FISH研究。再者，如上所讨论，使用长度至少8-10kb的基因IRF-1探针是重要的。若这些细胞因新生前或新生的状态而自然处于有丝分裂期，就可从在活体或抽提物中的有丝分裂细胞中检测间期染色体。类似上述的讨论，为了间期的分析可应用合适的IRF-1探针。
按已知方法，IRF-1基因的或cDNA探针可以从含有这些DNA片段的合适的质粒载体中分离出来。然后按已知方法，如用切口平移法来标记(例如荧光化)来自探针的DNA。
杂交研究可适当地在由细胞提取的DNA上完成并变性，方法类似于Kuo
等(Am.J.Hum.Genet.，49：112-19)所述。
对探针DNA适合的标记物是二硝基苯酚CDNP-11-dUTP或异羟基洋地黄毒苷(digoxagenin)-11dUTP，其中前者可例如用异硫氰酸荧光素酯结合的羊抗鼠IgG显影，而后者可用罗丹明标记的抗异羟基洋地黄毒苷抗体显影。
细胞分为2、1或0杂交区域。正常细胞有低的致瘤倾向，它有二个编码IRF-1的等位基因。用荧光素杂交方法可方便地确定被怀疑有致瘤倾向的细胞是否有适当数目的等位基因或缺乏一个或两个等位基因。
参数也可以是等位基因或编码IRF-1的等位基因的结构重排。用Southern印迹或狭线印迹有助于测定这种结构重排。在这些方法中可将从含有IRF-1cDNA的质粒例如pHIRF31中分离出的全长IRF-1cDNA用作适合的探针。
从所研究的细胞样品中分离到的适合的基因探针可用选自如BglII，BamHI，EcoRI，HindIII，KpnI，PstI和XbaI的各种核酸酶进行消化。在合适的滤膜上进行印迹后，消化物可与例如通过随机引物方法标记的cDNA探针杂交。
可对认为具有低的或没有成瘤倾向的相应的哺乳动物的相应细胞上首先进行分析而提出一限定值标准，它相当于这种细胞的IRF-1含量，该细胞不经受重排并因而能产生肿瘤抑制量的IRF-1。
使用得自所研究的细胞和对照细胞的基因组DNA用类似方法通过狭线印迹可以进行定量DNA分析。适当变性后印迹杂交到如上述的标记的IRF-1cDNA探针上并用适当的方法如激光扫描光密度法进行定量。
在Southern和狭线印迹中，优选随后将每个印迹洗脱，并用一种DNA探针再杂交，该探针图距为不同于含IRF-1等位基因如5q22或最好是5q的染色体5的一个位点上，一种适合的DNA探针是用于补体组分9的cDNA探针。这样一种探针能用作对照探针以作为定量测定IRF-1缺失的内标。IRF-1和相应的C9放射自显影信号能够被定量而且对每个样品能够测定IRF-1；对照(如C9)的杂交率。
如下所述，上面所提的Southern印迹和狭线印迹也可用于检测不经重排的IRF-1等位基因的有无，根据与对照比较在IRF-1中杂交信号的降低，表明缺失了一个或二个等位基因，因而增加了细胞致瘤的倾向。
当选择的参数是一个或二个IRF-1等位基因的突变时，则可以通过将所研究的基因IRF-1DNA的适当片段进行序列分析并与对照样的或已发表的IRF1-1DNA序列相比较就可确定这样的突变。这种分析最好在基因组DNA上进行。适当加工后，用适合的引物和定向通过PCR可使所得的消化DNA进行扩增：如使用琼脂糖凝胶电泳进行大小分离后，所需的DNA片段可以克隆到合适的载体如pBluescript中，并在扩增后用适当的消化作用除掉这种插入物并用已知方法作序列分析。在序列的DNA中的点突变和范围更大的突变可表明在组织样品中一个或多个IRF-1等位基因的功能丧失。
如下所述，用于样品10的HindIII方法是为这种病人的重排片段的克隆而专门设计的。根据设定可对在种系中带有一个IRF-1缺失或突变的个体能够进行筛选，这些个体和它们的所有后代因这种缺失或突变从而随后有患癌症的危险(类似于p53肿瘤抑制基因；见Malkin等人，Science 250：1233-1238(1990))。在这种设定中可对从外周血淋巴细胞分离出的DNA的特定IRF-1外显子进行扩增，单个的外显子可用PCR起动和扩增，而且这些扩增的样品通过下述技术则对突变进行筛选。另外，可对来自于潜在瘤损害的组织样品或吸出物筛选其种系中存在或由体细胞获得的IRF-1突变。在这种设定中，为检测肿瘤的缺失或突变可以使用由存在于吸出物或活体的细胞中分离出来的DNA。另外，可用对不同IRF-1外显子的引物以启动总DNA的特定外显子，并且这些外显子如通过下方法之一筛选突变：
1、使用Kinzler等人的方法(Science 253：661-664(1991)进行RNAse保护；
2、克隆扩增的PCR片段并将克隆的片段进行序列分析，或者不克隆而直接对PCR-扩增产物进行序列分析；
3、SSCP：用单链构象多态性分析法筛选PCR片段的突变。这种筛选方法在检测类似p53基因中的突变时特别有用(见Mashiyama等人，Oncogene 6：1313-1318(1991)及原始文献Orita等人，PNAS USA 86：2766-2770(1989))。
本发明又一方面是提供一种克隆的DNA，其用于减少哺乳动物细胞致瘤倾向或抑制这种细胞的致瘤表型，该细胞含有编码IRF-1的DNA序列。优选这种克隆DNA含有一个编码人IRF-1的DNA序列。
上述克隆DNA适用于通过使用编码IRF-1的克隆DNA并将克隆的IRF-1DNA送到细胞而降低细胞致瘤倾向或抑制这种细胞的致瘤表型的方法中。另外降低细胞致瘤倾向或抑制细胞致瘤表型的方法可以包括将IRF-1送入细胞。
将DNA送入细胞以改变其表型或有效治疗疾病的方法在许多刊物中都有描述，这些都简便地综述于Miller，Nature 357：455-460(1992年6月11日)中。在文献中描述的方法，包括如将脂质体/质粒DNA复合物直接注入肿瘤体，并利用逆转录病毒载体和腺病毒载体，包括通过DNA与转铁蛋白复合而使DNA定位转铁蛋白受体的方法已证明可通过同时使用腺病毒而有所改进(见，例如Cotten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6094-6098(1992)；Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103(1992)；Curiel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850-8854(1991))。
在裸鼠中将成视网膜细胞瘤细胞基因(RB)的野生型拷贝导入成视网膜细胞瘤细胞可抑制其致瘤性质(见PCT Intl.Appl.9005180)(1990年5月17日出版)，它描述了一种方法，其中构建一种含RBcDNA的逆转录病毒以代替失活或缺损的RB基因并利用它来感染成视网膜细胞瘤细胞系)。
欧洲专利申请公开号0475623(1992年3月18日出版)描述了一种方法，其中利用从莫洛尼氏小鼠白血病病毒衍生的重组体逆转录病毒代替失活或缺损的p53基因而将在LTR启动子控制下的野生型p53引入例如软骨肉瘤细胞系Saos-2中。
对进行基因治疗的策略有具体描述的其它出版物的例子包括Roemer等，Eur.J.Biochem.(FEBS)208：211-225(1992)，其特别描述了病毒载体的构建；欧洲专利申请公开号386766，其描述了在完整的哺乳动物细胞基因组内通过微注射向细胞中导入DNA的方法来修饰基因；PCT专利申请号WO9200329，其描述了用p53的DNA转染患者的浸润肿瘤淋巴细胞并将该细胞重新导入患者中；PCT专利申请号910 7487，其描述了用微粒将编码生长激素的基因转入脊椎动物细胞或组织中，以及PCT申请WO 9207573，其描述了用感染性重组逆转录病毒将遗传序列插入到内皮细胞中。
将IRF-1基因插入选出的细胞内，或直接进入哺乳动物，或转染或感染取自哺乳动物的细胞随后把这种感染细胞再引入哺乳动物，所用的试验方法类似于上述刊物所述。
本发明也可以是一种治疗方法，其中细胞，优选为含IRF-1缺失或突变的造血干细胞能选择性地在体外从干细胞的总群体中除去，正常的干细胞通过除去带IRF-1缺失或突变的干细胞而得以选择性地扩展，随后将校正的髓质或外周血细胞的自身移植入病人。这样一种治疗方法包括从病人取得组织，筛选组织中没有IRF-1缺失或突变的细胞，扩大这种细胞群体并使用如注入或自体移植将它再导入病人。
本发明的另一方面还包括一种聚合酶链式反应检测IRF-1基因的序列及突变所用的试剂盒，它包括载体即密闭在其内的一个或几个容器例如小瓶、管子等。例如，首要的容器可装有一套成对的单标准DNA引物，这套设备可以合成全部编码序列的IRF-1或其片段。一种合适的单链DNA引物对描述如下。这种试剂盒的使用一般可依照下面所述实施例使用PCR的方法而进行。试剂盒也可以含有其它可用于进行PCR反应的成品剂，如一种DNA聚合酶、缓冲液等。
本发明还包括测定细胞或组织中的IRF-1/IRF-2比例的试剂盒，该试剂盒包括单独的抗IRF-1抗体和抗IRF-2抗体，所说的抗体没有或基本没有与其他抗原的交叉反应活性并优选是单克隆的。此抗体可以是标记好的或可以在使用时进行标记。此标记使得在使用适当分析方法时可以测定细胞内存在的抗原的量。
此试剂盒可以适用于分离蛋白或免疫表型化的免疫分析，或单个细胞的蛋白质量分析用的流式细胞计数分析，以及与其它细胞表面，胞质蛋白(表型标记)，或与DNA含量和S相分数之间的关联。
抗体可以用已知方法制备，例如，通过将与IRF-1或IRF-2或其选择的抗原决定基进行免疫反应的动物脾脏细胞，用骨髓瘤细胞进行融合，然后分出产生相应抗IRF抗体的杂交瘤(hybridoma)克隆。这种抗体可以分别中和IRF-1或IRF-2的活性，但没有交叉反应性。合适的制备这种抗体以及选择其潜在抗原表位的方法已公开于新西兰专利No.222006，欧洲专利申请No.90106568.0(相应的美国专利申请号No.801048，登记日1991年12月3日)，和Hopp等的Mol.Immunol.20(4)；483-489(1983)，和PCT申请WO8003564。
本发明的另一方面还包括一种用于用荧光原位染色体杂交的方法测定哺乳动物组织中IRF-1等位基因数目的试剂盒，其包括荧光标记好的DNA序列或可用荧光标记的DNA，这些DNA序列或DNA可在中期染色体内或分裂间期核内与IRF-1基因杂交。这些DNA序列可以是一个cDNA克隆(用于杂交到中期染色体)或一个长度至少为8-10kb的基因克隆(杂交到完整的分裂间期核)。等位基因的数量可以用荧光显微术计数。方法中其它的内标物包括由IRF-1和IRF-2所在的同一染色体衍生的单拷贝DNA探针但与所研究区域有适当的距离(例如，对IRF-1为5q31，对于IRF-2则为4q)。使用这方法，在组织样品中的等位基因的数目就可以被测定，因而不合适的等位基因数就预示有恶性肿瘤。
本发明将进一步详述于下面非限制性的实施例中。
实施例1
人染色体5q上IRF-1基因的存在及准确地定位是通过原位荧光杂交技术(FISH)而进行的，该技术用于在由PHA刺激的淋巴细胞产生的细胞分裂中期正常染色体或间期核上对IRF-1探针进行定位。如下面所述，一个包含IRF-1启动子和全部10个编码外显子的19kb IRF-1基因克隆(Yamada等人，同上(1991)见图4A)用荧光标记并杂交到固定后的中期染色体上(见Pinkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9138-9142(1988)Sakamoto等，IISystem.Performance(1992))。
将检测位于5q22和5q31(IRF-1)序列的探针进行不同的修饰以便在分裂间期和中期可以双色显示杂交区域。位于5q22的19kb DNA探针(Cyn5.120)(由R.White提供，University of Utah，Salt Lake City，UT)通过用二硝基苯酚(DNP)-11-dUTP(Novagen，Madison，WI)以切口平移(Pinkel等，同上(1988))进行修饰。IRF-1基因组DNA探针(19kb，Yamada等，同上(1991))用异羟基洋地黄毒苷-11-dUTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)进行化学修饰。通过使用SephadexG-50旋转柱回收探针，浓度约为20ng/μl。所有的标记反应均进行调节以使得产生单个单位长度为0.3～1.0kb的标记探针。
单色和双色杂交反应使用按Kuo等人，(同上(1991))所述的改良后的方法进行。将玻片上Carnoy固定的细胞中的靶DNA通过在73℃下浸入70％甲酰胺和2×SSC3分钟变性。然后将玻片依次用乙醇溶液(70％，85％和100％)浸没而脱水。脱水后，玻片用蛋白酶K(2.5μg/ml)在38℃下处理3分钟。
有时老化的样品会显示低的杂交效率，需消化较长时间(4-8分钟)。消化后，玻片按前所述进行脱水。杂交混合物(10μl总体积，含50％甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖，1-5μg)人胎盘DNA和20ng的各探针)在73℃变性5分钟后在38℃下培养20分钟。将混合物加到有细胞的玻片上用盖片密封。该玻片在37℃培养约12小时。杂交后，玻片在更换三次的50％的甲酰胺溶液中在48℃洗10分钟，然后依次用同一温度的2×SSC和0.2×SSC洗涤。杂交区用50μl4×SSC，1％BAS处理5分钟。然后玻片用含有鼠抗DNP(0.5μ/ml，Boehringer Mannheim)和罗丹明标记的抗异羟基洋地黄毒苷(Novagen)的4×SSC混合物在室温下处理30分钟，接着在室温洗涤四次10分钟：依次用4×SSC，4×SSC+0.1％三硝基甲苯(triton)X-100，4×SSC和PN缓冲液(0.1M二代磷酸钠、0.1M一代磷酸钠、0.05NP-40，pH8)，然后用PNM(PN缓冲液，5％无脂干奶和0.02％叠氮化钠，离心除去不溶固体)处理后，加入荧光素异硫氰酸盐结合的羊抗鼠IgG(16.6μg/ml；CalTag，Burlingame，CA)30分钟，细胞用PN缓冲液洗10分钟，四次。在显微分析前，细胞用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在抗退色溶液中染色(Johnson，和de C.Nogueira Araujo，J.Immunol.Methods 43：349-350(1981))。
按Pinkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83：2934-2938(1986)，同上(1988))所述用合适的滤色片进行荧光显微分析，在单色杂交中只用IRF探针，所有的细胞在显微镜视野下记录有2、1或0个区。在双色杂交中，在细胞中计数的IRF-1区表明至少有一个绿-FITC-相联的5q22的杂交区域。
＞25％的细胞不含有杂交区域或其中只有少于50个的细胞可以分析和计数的制剂都排除在数据分析之外。
如图1A所示，IRF-1探针只杂交到染色体5q上的序列中。用计算机辅助的荧光显微分析法分析杂交的中期染色体，IRF-1被精确定位到染色体5q31上(Sakamota等，同上(1992))。如图1B所示，这种计算机定位方法可以自动获得全染色体DNA，荧光标记的IRF-1探针，和用作对照的杂交到5q22的荧光标记探针的多色图(下面将详细讨论)，通过分析15个杂交中期后将IRF-1基因定位到5q31.1上，并说明相对于染色体5的短臂端粒，其为一个分部位点(fractional location)。
实施例2
为了确定IRF-1在具涉及染色体5q31的间质缺失或转位的造血细胞瘤中是否发生了缺失或结构重排，从具用于分析的足够细胞的11个急性白血病和有del(5q)的MDS病例中和两个具有5q31相互易位的重新AML的病例中选出了低温保藏的细胞悬浮液。这些样品包括：4例前期白血病的脊髓发育不良(MDS)，2个有顽固性贫血的5q-综合症(样品1-4)典型病例；2例原始细胞过多性顽固性贫血(RAEB)并已转移到AML的病例(称作“继发性AML”)(样品5，6)；5例重新AML(样品7-9，12，13)；1例重新ALL(样品10)；以及1例在经结合化学初步治疗后复发的AML(样品11)。表1中列出了分析下每个样品的完全的核型，以及如适宜，在冷藏样品中白血病胚细胞的百分数(3栏和4栏)。类似地，将从正常人的骨髓和外周血得到的冷藏细胞悬浮液用作对照(样品16和17)。两例具有含有非5q31区的染色体5q易位的造血细胞瘤也选作对照(样品14，15)，一例有5q33相互易位的慢性骨髓单核细胞性白血病(CMMOL)亚型的MDS和一例有t(2；5)(q23；q35)的Ki-1+非何杰金淋巴瘤。
IRF-1的缺失和结构重排是用全长IRF-1 cDNA(pHIRF31)作探针通过Southern印迹法和定量狭线印迹中测定的(Maruyama等，Nucl.Acids.Res.17：3292(1989))。为提供定量IRF-1缺失的内标，接着将每个斑点洗脱并用定位到5q13(Abbott等，Genomics 4：606-609(1989)上的补体组分9的cDNA探针进行再次杂交)(C9：pHLC9.55)(DiScipoi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7298-7302(1984))。这些操作如下进行：
高分子量的DNA从解冻的白血病的MDS和对照样品中分离出来，其为预先在胎牛血清(90％，Hyclone)和DMSO(10％，Sigma)在-135℃冷藏的细胞悬浮液。白血病的胚细胞和髓样前体细胞在通过Ficoll-Hypaque(Sigma)离心而收集初步样品时进行富集；分离这些单核细胞，胚细胞数通过形态观察来确定；样品如前所述进行冷藏。进行Southern印迹分析时，病人样品和对照样品的基因组DNA用BglII，Bam HI，EcoRI，HindIII，KpnI，PstI，或XbaI消化。每样品的5mg DNA在0.8％琼脂糖凝胶中电泳后在硝基纤维素或Hybond-N+(Amersham)上进行印迹并用cDNA探针按随机引物法进行杂交(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))。每个印迹均在严紧条件下洗涤。
对于DNA定量分析，将从病人样品和对照样品来的基因组DNA用碱变性接着中和，然后按3个不同稀释度2μg、1μg和0.5μg点到硝基纤维素上(Sambrook等，同上(1989))，杂交的条件与Southern印迹法所用相同。Southern印迹法和狭线印迹法都是先杂交到检出一个6.0kb HindIII片段的由质粒pHIRF3切下的IRF-1cDNA探针上(Maruyama等，同上(1989))然后洗脱并再杂交到检出一个3.0kb带的由质粒pHLC9.55(DiScipio等，同上(1984))切下的补充C9cDNA对照探针上。
IRF-1和相应的C9放射自显影的信号用配有放射自显影的激光扫描光密度测定法，使用计算机辅助的FOTO/ANALYST成像分析系统(Fotodyne，New York)进行定量，而且对各样品的IRF-1∶C9的杂交比进行了测定。
结果列于表1和图2。
在图2中，各泳道对应于下列样品(见表1所标出的)：1(9)，2(1)，3(13)，4(3)，5(5)，6(6)，7(8)，8(10)，9(7)，10(正常骨髓对照；5μg)，11(正常骨髓对照；2.5μg)。
如图2所示，在每例MDS和带del(5q)的重新AML中可以观察到IRF-1杂交信号有明显的降低(表1，样品1-11)，这表明与对照相比，IRF-1∶C9的杂交比降低(表1，样品14-17)。IRF-1∶C9杂交比的降低与每个样品中的白血病胚细胞百分数和有del(5q)细胞的细胞产生的频率紧密对应(表1)。除了IRF-1杂交信号的明显降低之外，在样品10中还可以观察到IRF-1基因的结构重排并如下所述对其详细表征。
有趣的是，在每例有包含染色体5q31的相互移位的重新AML中也可以检测到IRF-1杂交信号的明显下降(表1，样品12，13，图2)。在IRF-1∶C9中杂交率的降低也相当于每例白血病胚细胞的百分比。在Southern印迹试验中，没有测到编码外显子的IRF-1的重排，而且在这些样品中使用脉冲场凝胶电泳也没有看到IRF-1基因的197kb内发生重排。与其形成对照的是，在有5q33相互易位的CMMoL的对照例和有5q33相互易位的淋巴瘤样品中，两者都保留了IRF-1的等位基因(表1，样品14，15)。
在13例MDS和有del(5q)或易位5q31的白血病的每一情况中IRF-1是缺失的，这一事实是很重要的，因为这些样品代表造血瘤的全谱，曾报导造血瘤有del(5q)(见Nimer和Gold，同上，(1987))。另外，最近在另外4例MDS和有del(5q)的急性白血病中检测到IRF-1缺失。
实施例3
人白血病和脊髓发育不良症中IRF-1的缺失：单色和双色分裂间期的细胞遗传学分析
分裂间期细胞遗传的研究依上述实施例1进行(Pinkel等，同上(1986)，同上(1988))。单双色荧光原位染色体杂交(FISH)研究在同样冷藏样品(用于测定IRF-1∶C9杂交率)中进行。对单色FISH研究，将19kb IRF-1基因DNA(Yamada等，同上(1991))进行化学修饰并杂交到包含固定细胞悬浮体的玻片中(表1，样品1-10，12，13，15-17)或杂交到从细胞遗传分析留下的残余固定细胞所制备的玻片上(表1，样品11，14)，所有的细胞在显微场中均可记录到2，1或0个IRF-1杂交区(或等位基因)；在大部分样品中测定了总数为1000个的细胞(表1，第六栏)，在没有IRF-1缺失的对照样品中(表1，第7栏，样品14-17)，IRF-1等位基因在84-90％的细胞中可以检测到。然而，平均来说，大约有10％的对照细胞中只含有1或2.4％的细胞没有可检测到的IRF-1杂交区。与新鲜淋巴细胞(它在92～95％细胞中可检测到2个IRF-1等位基因，在5～8％细胞中有1个或没有IRF杂交区)相比，在冷藏的对照中，FISH杂交效率的轻微下降来自于使用冷藏保存了2-5年的样品和使用了相当短(19kb)的单拷贝基因探针而不是用于FISH研究的可重复序列的探针(Pinkel等人，同上，(1986)，同上，(1988))。但是，与这个背景相比较，在每个MDS和有del(5q)的白血病样品中的大部分细胞(总细胞的24～88％范围内)中仅检测出1个IRF-1等位基因(表1，第7栏，样品1-11)。在两例有染色体5q31相互易位的重新AML中也确定了有1个单IRF-1等位基因损失(表1，样品12，13)。在这些FISH研究中所得的IRF-1单等位基因频率与通过形态学标准测得的白血病胚细胞百分数具相当好的相关性，大约1000或更多细胞可以记录。与对照相比，几种急性白血病的样品(表1，第7栏，样品7，8，10，12，13)也表现出有大量细胞(≥10％)没有IRF-1杂交区，提示在白血病的细胞的亚群中IRF-1的两个等位基因都可能已缺失。
为了更详细地研究IRF-1的缺失，在具有残留的固定细胞的样品中进行双色FISH研究。将19kb IRF-1基因探针和与5q22单一序列杂交的19kb单拷贝基因探针(cyn5.120；见图1B)进行不同标记以便如Pinkel等人(同上(1986)，同上(1988))所述的在分裂间期双色显色杂交区。具有代表性的样品列于表3，只有那些在包含至少一个FITC-5q22杂交区的细胞中的IRF-1区才被计数。在制备中，如果只有少于50个的总细胞可以分析和计数以及不多于25％的细胞没有含5q22杂交信号的产物，它们将由分析中排除(见表1)。
在两个对照样品上进行的双色SIFH分析中(表1，第9栏，样品15，17)，IRF-1和5q22等位基因的频率和分布极相似，大于80％的细胞含有预期的两个IRF-1和两个5q22杂交区。在这些对照中，含有1或2个IRF-1和5q332区的不同组合的细胞构成了分析细胞总数的2.2-7.9％，只有2.0-4.3％的细胞含有两个5q22区而不含可测的IRF-1区。
通过双色FISH在所分析的6个有del(5q)或转移5q31的一例中确定了确定不含有两个IRF-1杂交区，但保留1个或个2个5q22杂交区的胚细胞群体(表1，第9栏，样品6)。在样品10中可分析的4/16的残留细胞中两个IRF-1等位基因也均已缺失，但这一样品并不符合FISH数据所包含的标准。因为只有总共16个细胞可以分析(见表1)。有胚细胞亚群并同时缺失了两个IRF-1区(等位基因)缺失的两个样品均来自患急性白血病人；刚描述了一例转移到AML的RAEB(样品6，22％细胞有0 IRF-1区)和另一例ALL(样品10，25％的细胞)。与此相反，前期白血病MDS的全部样品仅有一个IRF-1等位基因缺失。在两个有5q31相互移位的重新AML病人中再一次确定了一个单IRF-1等位基因的缺失(表1，第9栏，样品12)。单色FISH分析表明样品7、12和13可能含有一个同时缺失两个IRF-1等位基因的白血病细胞亚群(表1)。这种可能性没有被双色分析直接证实；我们观察到有几个细胞，其具有5q22而没有IRF-1。然而，有可能在样品7、12、13的细胞亚群中，大的缺失(见下面和表1)已同时去除了5q22内标和IRF-1基因，因为这些细胞在双色分析中没有记录。后一种可能性实际上已被缺失了分别一个5q22区域和一个IRF-1基因的等位基因的细胞的相对高的频率所证实。(样品7，8.03％，样品12，52.9％；样品13，55.9％)。
双色FISH分析也揭示了在六例有del(5q)的三例中在近臂端折点的位置中有一意料之外的异质性。在传统的分解的细胞遗传学分辨水平上，报导了样品2、6和7含有一个del(5q)(q13q33)；根据这些折点，可以推定克隆群体将有1个IRF-1和1个5q22区，因为留下的IRF-1和5q22区二者已由染色体5q中去除。但是，除了含有一个IRF-1/1个5q22等位基因的一个群体外，也发现了在每个样品中含有2个5q22和1个IRF-1区(表1，第9栏，样品2、6)的相当大量的细胞。这些发现暗示在这些病人样品中存在截然不同的胚细胞群体，其具有不同的近臂端折点(保留或也缺失了5q22区)，但有一致的一个IRF-1等位基因的缺失。折点的异质性在两个有5q31易位的重新AML的样品中也已观察到(表1，第9栏，样品12、13)。如果如在易位情况过程中(如FISH试验所证明的)一个IRF-1等位基因被缺失，则在大部分细胞中预期的双色等位基因频率是2个5q22/1个IRF-1。然而，除了这群体外，两个AML例具有的大部分细胞有1个5q22个IRF-1等位基因(表1，第9栏)。由于两例中没有一个AML例除了5q31易位外有单体5，这些结果表明DNA在染色体5上由易位折点区缺失的DNA比以前在细胞遗传学水平分析结果所检测到的要多得多。
实施例4
从白血病和脊髓发育不良病例中筛选IRF-1突变
为测定在其它情况下保留的IRF-1等位基因是否经受了任何较小的缺失/插入或在上述分析中不可检出的点突变，使用聚合酶链反应(PCR)以启动由分离的DNA所得的残留IRF-1外显子，DNA是由除样品5外的全部白血病和MDS样品中分离的，以及然后将PCR产品按Kingler等人(Science 251，1366-1370(1991))如下面所描述的，用RNase保护分析法进行突变的筛选。
在4个样品中，注意到在外显子7中有一单碱基变化(表1，样品4、6、8、10)，这种碱基变化发生在密码子的第三个简并性核苷酸内，但是并不重要。
实施例5
IRF-1基因内的折点特性
Southern印迹法分析发现了在一例重新ALL的样品10(表1)中的IRF-1基因的结构重排。在最初的使用全长-IRF-1cDNA探针(图4B，左幅)的研究中，观察到了有几个IRF-1限制片段的缺失和新的重排带的出现。在BglII-消化的DNA中，有一个13kb的片段缺失(含有IRF-1外显子，它由基因DNA的上游BglII位点和内含子I的BglII位点的消化而产生的，见图4A)和出现一个新的1.8kb片段。相类似地，用HindIII，降低了2.0kb片段(含有外显子1和2；图4A)的强度以及在2.4kb出现一个新带。5.0kbBamHI片段(含有外显子1-3；图4A)实际上已消失并在3.9kb检测到一个新片段。在病人样品中的另一个2.8kb BamHI片段(图4B；左幅)来自于自然产生的BamHI多态现象(见图4A)，因为对此病人是杂合的。这些数据全部与样品中的大多数细胞中存在包括IRF-1基因的5′端缺失相一致。使用IRF-1cDNA探针检测到几个新带，这表明在这样品中白血病细胞的亚群中也可以有另外的更复杂的IRF-1重排。
为了更精确地测定样品10中主要IRF-1折点的位置，按图4A中所示，使用由基因IRF-1克隆所衍生的亚克隆进行另外的Southern印迹分析。探针1是含有外显子1的HindIII-BglII片段而探针2是含有外显子2的BalII-HindIII片段。用探针1杂交揭示了有各种酶的IRE-1的结构重排(图4B，中间幅)。在病人样品的BglII-消化的DNA中再次观察到确实消失的13kb带和出现新的0.5kb带。用HindIII、2.0kb带明显降低强度并且明显有一条1.4kb的带，而用BamHI时，5.0kb带明显降低强度并检测到一个新的3.9kb带。使用探针2(图4B，右幅)，在BglII消化液中没有缺失或重排，这暗示折点一定位于内含子1的BglII限制位点的5′。用探针2观察到与用探针1在HindIII和BamHI-消化的DNA上见到的同样的缺失和重排(图4B，右幅)。
这些研究表明，病人样品10(表1)的IRF-1基因中的绝大部分折点大约位于内含子1的BglII 5′的400bp位点(图4A)。为了更好地理解这种重排的性质，使用了修饰的聚合酶链反应逆转PCR(见Silver in PCR，A PracticalApproach，McPherson等人，eds，Oxford IRL Press，pp 137-146(1991))以对正常人和白血病DNA两者中含有外显子1和内含子1区的IRF-1基因进行扩增和序列分析(图5)。
用HindIII消化由样品得的基因DNA和正常DNA(1μg)。消化后，样品用苯酚/氯仿萃取，而DNA用乙醇沉淀。沉淀的DNA在连接酶缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.6，10mM MgCl2；1mM ATP，1mM DTT)中稀释至1μg/ml，并与2.8Weiss Units的T4 DNA连接酶在14℃培养20小时。连接作用后，样品用苯酚/氯仿再一次萃取并用乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA再悬浮在30μl蒸馏水中，然后通过在95℃加热10分钟而引入缺口。包括IRF-1外显子1和内含子1的区使用图5的引物和方向而在PCR反应(DNA热循环仪，Perkin-Elmer Cetus)中扩增。反应是在50μl有1mM MgCl2、0.01％明胶和1.25UTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)中进行(95℃30秒，60℃1分钟，70℃2分钟，40循环)。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，将合适的带(如图5所示)从凝胶上洗脱。将回收得到的DNA片段克隆λpBluescript；序列分析6个单独分离的克隆。
这步骤可对其它IRF-1中的外显子和内含子进行重复。
图5B表明由白血病样品(P，样品10)和正常DNA(N)中得到的克隆PCR产品的序列。可以看到白血病样品的序列在内含子1的引物1后偏离10个核苷酸。
在正常DNA中检测到所希望的1.1kb带而在白血病人样品中注意到有一另外的较小的约500bp的带。如图5所示，在白血病样品的内含子BglII位点上游的DNA序列在引物1DNA序列后偏离正常IRF-1序列10个核苷酸。在对应于外显子2的引物2序列的下游，在正常的和白血病细胞DNA之间的序列中没有观察到偏离。这些结果证实了白血病样品中IRF-1基因的重排，导致了外显子1和IRF-1启动子区域的缺失。
这些结果表明，IRF-1基因的一个等位基因在样品10的大多数白血病细胞中由于启动子区和部分外显子1的缺失而失活。Southern印迹分析(图4B)、双色FISH研究以及del(5)(q13 q33)的细胞遗传检测都说明了，在这些白血病细胞的主要群体中残留的IRF-1等位基因都已缺失。因此，在这白血病人的大量细胞中两种IRF-1等位基因都已失活，其中一个是通过一个包括一染色体5q的间质缺失而另一个是通过在破坏IRF启动子区和外显子1的第二IRF-1等位基因中的失活重排。
实施例6
对在鼠N1H3T3细胞的细胞周期期间的IRF-1和IRF-2的mRNA表达水平进行了测定。N1H3T3细胞先保存在含有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中。将细胞生长到汇合并通过在无血清的DMEM中血清饥饿24小时而初始抑制(G1抑制)，然后通过加入补充有10％FCS的DMEM而诱导以通过细胞周期并在刺激后在适当时间进行收获。按Mudryj等(EMBO J.9，2179-2184(1990))所述，在血清激活后的规定时间(见图6A)通过用5μCi3-胸苷(2.0Ci/mmol)脉冲标记细胞(2×104)1小时而测量掺入DNA的3H-胸苷。
如图6A所示，3H-胸苷摄取实验揭示了DNA合成是始于血清激活后8-12小时。细胞周期的流式细胞计数分析也揭示了事实上在这期间细胞进入了S期。将总RNA周期性地分离而将10μg进行IRF-1和IRF-2mRNAs的S1图谱分析(如Fujita等人，Cell 49：357-367(1987)中所述)。鼠IRF探针(图6B)与Harada等人(同上(1990))所述相同(比活度3.1×106cpm/pmol的IRF-1，30×106cpm/pmol的IRF-2)。人的IRF-1探针DNA是一个143核苷酸探针，它含有人IRF-1基因(比活度，4.7×106cpm/pmol)的核苷酸残基-46至+97(相当于主加帽位点在+1)。
如图6B所示，IRF-1mRNA表达在其生长-抑制细胞的最高量(仅约5拷贝/细胞)时观察到并在血清激活后迅速下降。事实上，发现其IRF-1mRNA达到的量约五倍低于激活后2小时的生长停滞细胞所达到的量，然后在DNA合成启动前开始慢慢增加(图6B)。相反，IRF-2mRNA的表达量在整个细胞周期中基本上保持恒定。mRNA和拷贝数由描述于Harado等人，(Cell，同上，(1989)和Fujita等人(Cell，同上(1987)))中的方法进行测定。
细胞提取物通过抗IRF-1抗体的Western印迹分析也揭示了在细胞周期期间IRF-1量的波动。
Western印迹分析在下面所规定的时间进行：
全部细胞提取液是在图6C指出的时间，通过将5×105细胞用溶胞缓冲液[50mM Hepes-NaOH(pH 7.0)、0.1％Nonidet P-40、250mM NaCl、100mM NaF、200μM Na3VO4、10μg/ml各种抑肽酶、PMSF、和亮抑蛋白酶肽]按2.5×106细胞/50μl的体积在4℃溶解20分钟。接着在4℃离心20分钟，然后将提取液进行12.5％SDS-PAGE分析。然后将蛋白通过电泳转到PVDF膜滤纸上并用Ponceau S非特异性染料染色(Harlow和Lane(1988))。免疫检测按Hatakeyama等人(Science 252：1523-1528(1991))所述进行，使用抗鼠IRF-1单克隆抗体TK-1和TK-3的混合物(cock tail)(在TBST乳中各10μg/ml)进行。
在生长停滞阶段发现IRF-1的表达达到最大值而在血清恢复(Serumrestoration)后3小时下降约6倍，然后接着再增加(图6C)。这些结果表明在细胞周期期间IRF-1/IRF-2比值的波动。在与造血细胞系BAF-D03有关的白细胞介素3(IL3)中也进行了相似的观察。
实施例7
通过产生NIH3T3细胞克隆测定了IRF-1/IRF-2比的扰动对细胞生长的效应，其中IRF-2是过表达的。质粒pAct-2(Harada等，同上(1990))(其中鼠IRF-2cDNA是由鸡D-肌动蛋白启动子表达的)与新抗性基因，pSTneoB(Kato等人，Mol.Cell.Biol.10(2)486-491(1990))通过磷酸钙方法(Fujita等人，Cell 41；489-496(1985))共转染到N1H3T3细胞中。然后将转染的细胞在转染后一天保持在含700μg/ml G418的选择培养基中，在2-3周后分离抗G418的菌落。由N1H3T3细胞用亲代载体，pAct-C(Harada等人，同上(1990))转染中得到对照细胞系。
在选择新抗性后，得到几种克隆，它们高水平地表达IRF-2mRNA。任意选择三种细胞克隆，1-2、2-5和2-7以进一步分析，其中5μg RNA进行Northern印迹分析，分别使用鼠IRF-2cDNA和人β-肌动蛋白的假基因作为探针。在这些克隆中IRF-2 mRNA的表达量比在pAct-C转染的对照细胞克隆(C-2、C-3)(图7A)中所观察到的基本表达量高约40倍。但是当用凝胶迁移分析(所用方法描述于Harada等人，同上(1990))，发现在克隆2-1、2-5和2-7中的IRF-2蛋白量分别仅比在对照细胞所观察到的高9、4和7倍(图7B)，这暗示IRF-2表达可以在转录后下调。用5fmol32p标记的C13寡聚物作探针(比活度5000cpm/fmol)而进行凝胶迁移分析，全部细胞的提取物来自2×104个细胞。虽然过表达IRF-2的细胞并没有任何明显的形态变化，但它们在其他的生长特性上表现出了明显的区别。在每35mm的平板上植入2×104个细胞，在用加有10％FCS和700μg/ml G418的DMEM中生长，并在标明的天数用库尔特(coulter)计数器计数。如图7C所示，2-1、2-5和2-7细胞克隆的生长速率和对照相同但有更高的细胞密度(约三倍)。此外这些全部克隆表现出非固定地生长。菌落形成分析基本上按Miyashita和Kanuago(Cell 5：131-138(1975))所描述的方法进行。该方法中在培养物培养基中的1.3％甲基纤维素凝胶里悬浮105个细胞，并把细胞铺在由53％琼脂糖和培养基组成的琼脂糖层上，在植入三周后记录培养基菌落。在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率是6-15％，而用对照克隆则没有发现菌落形成(表2)。众所周知，这些性质通常与恶性肿瘤转化有关[Freedman和Shin，Cell，3：355-359(1974)；Keath等人，Cell 39：339-348(1984)]。
实施例8
研究了过表达IRF-2的细胞的致瘤性。将从再悬浮在不含FCS[Shin，Meth.Enzymol.58：370-379(1979)]的200μl DMEM的三种克隆2-1、2-5和2-7中得到的细胞(2×106个)皮下注射到4-6周龄的裸鼠(Balb/c nu/nu；CleaJapan，Inc)的双侧腹部。如果在注射的位置上出现一个可见的小瘤并且以后继续长大，则细胞被认为是致瘤的。在相当短的潜伏期中(2-3周，表2)肿瘤发展，虽然它们没有转移的迹象，但继续无限制地生长。对没有生长肿瘤的小鼠观察6周。在同一期间用对照克隆C-2和C-3的细胞注射的裸鼠没有生长肿瘤。将IRF-2 cDNA转染的整个过程和分析重复了三次，结果都是可重复的。在每个实验中过表达IRF-2的克隆都表现出改变的生长特性和致瘤的潜力(总共12个克隆)。此外，从裸鼠产生的肿瘤回收的细胞中，观察到基本相同的IRF-2 mRNA表达和生长特性。总而言之，这些结果清楚地表明2-1、2-5和2-7细胞的改变生长特性和致瘤性是由于转录阻遏物IRF-2的表达增加而引起的。
实施例9
通过IRF-1的IRF-2诱导的转化的逆转
上述实施例说明IRF-2的致瘤倾向，以及保持在IRF-1和IRF-2的表达之间的平衡对细胞生长保持正常的限制是十分重要的。如上所示，当这个平衡受到IRF-1的过表达干扰，细胞的增殖可以抑制[Yamada等人，同上(1991)]，IRF-2的过表达可促使细胞不受限制地增长。这个实施例表明通过过表达IRF-2的NIH3T3细胞呈现转化的表型可通过增加IRF-1的表达量因而使IRF-1/IRF-2的比值回到一个“正常”范围而转回到原来的表型。为此将含有全部10个外显子以及人IRF-1基因的启动子区[从主加帽位点起455bp，见Yamada等人，同上(1991)]的一个1kb DNA片段引入IRF-2转化细胞中。从上面提出的结果看来，该结果指出在细胞周期期间调节IRF-1基因表达的重要性(图6)，在该实验中使用基因组IRF-1克隆以保证异位IRF-1基因的表达与内源基因的表达是同步的。
为了得到IRF-1表达水平增高的细胞克隆，将15毫克质粒，“pUCHIRF1B(亚克隆进pUC 19的EcoRI位点的19kb人的IRF-1基因)与pMiwhgh(0.3μg)通过磷酸钙方法共转染入2-1、2-5或2-7细胞(5×105细胞/10cm盘)中。制好试验板并在转染第二天在含有100μg/ml潮霉素的选择培养基中保存，2-3周后分离出抗潮霉素菌落。
选出已用IRF-1基因和抗潮霉素(hgr)基因pMIwhgH[Kato等人，Mol.Cell.Biol.10(2)：486-491]共转染的2-1、2-5和2-7细胞系，以及抗潮霉素克隆，接着筛选人IRF-1基因的稳定整合。转染体2-1-1、2-1-2、2-5-1、2-7-3和2-7-4分别由亲代克隆2-1、2-5和2-7衍生而来。人的IRF-1 mRNA的表达通过上述S1图谱分析法测定。如综述于表3，在这些克隆中的稳态IRF-1 mRNA表达量从高到低按如下顺序变化：2-5-2、2-7-3、2-7-4、2-1-1和2-1-2。
如前所述[Fujita等人，(1985)]抗潮霉素克隆通过NDV(新城病病毒)进行假诱导或诱导。转染的IRF-1基因在所有克隆中都是病毒诱导的。并且在另一个实验中表明在克隆基因内的启动子序列也是IFN-可诱导的[Itoh，Genomics 10：1092-1099(1990)]。诱导或假诱导9小时后，分离出全部RNA，用上述方法把5μg RNA进行S1图谱分析。结果示于图8A。图中确定的泳道如下：道1-7，假诱导；道8-12NDV-诱导；道1和8，细胞系2-1-1；道2和9，2-1-2；道3和10，2-5-2；道4和11，2-7-3；道5和12，2-7-4；道6，C3；道7，2-7。箭头指出被保护的人IRF-1探针的位置。
IRF-1和IRF-2的活性是按照Harada等(同上，(1990))的在克隆2-7-3和2-7-4中通过凝胶迁移分析而证明的。
该方法是用5fmol的32P标记的C1寡聚体作为探针(比活度5000cpm/fmol)而进行的，并且全部细胞提取物是从5×104细胞中得到的。C1寡聚体由四个重复序列AAGTGA组成，并含有两个IRF结合位点。使用这个寡聚体而不是C13寡聚物，其原因是由于它易于除去IRF-1的活性[Watanabe等人，Nucl.Acids Res.19：4421-4428(1991)]。结果示于图8B，其中，道1、4、7和10在反应混合物中含有2μl非免疫的兔血清，道2、5、8和11含有2μl兔抗-鼠IRF-1抗血清，道3、6、9和12含有2μl兔抗鼠IRF-1抗血清，道13没有提取物。白的和黑的三角形分别表明IRF-1和IRF-2的因子-DNA复合物的位置。对泳道3和6，只有在延长接触后，内源的鼠IRF-1的活性才可检测到。较快迁移的带可能代表结合到DNA探针的IRF-1和/或IRF-2的断裂产物。在道4、5、7、8、10和11的较慢迁移的带代表由2个IRF-2分子结合的DNA探针。
通过5μg RNA进行Northern印迹分析而测定IRF-2mRNA的表达。RNA按上述分离。通过随机引物法(Amersham)标记探针DNA。对鼠IRF-2是由pAct-2得的一个1.4kb Xbal cDNA片段(Harada等人，同上(1990))，而对人的β-肌动蛋白(人的β-肌动蛋白假基因)是一个λHa-204的2.0kb BamHI-PvuII的片段[Myamoto等人，同上(1988)]。
如图8C所示在全部克隆中发现IRF-2 mRNA的表达和在其亲代细胞中相同。有意思的是，图8B所示的凝胶迁移分析数据表明在这些克隆中IRF-2的DNA结合活性稍有下降，这是由于异位的IRF-1表达引起的，这增加了IRF-1可以影响转录后IRF-2的活性的可能性。用克隆2-5-2进行了同样的观察。
这些细胞的致瘤性大大地被抑制。事实上，致瘤性被抑制的效率和异位的IRF-1 mRNA的表达量有关；克隆2-5-2-和2-7-3(它们两个都以较高水平表达人的IRF-1 mRNA)表现出了很强的抑制作用；克隆2-7-4和2-1-1中，其mRNA表达量相对低些，表现出了较弱的抑制作用，而克隆2-1-2表明没有抑制作用(表3)。随着转化的表型的缺失或降低，2-7-3和2-7-4细胞克隆分别具有与转化相关的其它特性的缺失和降低，如增加的细胞的饱和密度(图8D)和非锚定点依赖性生长(表3)。因此，IRF-2诱导的HIH3T3细胞的转化是可以通过引入或增加IRF-1基因的表达而得以逆转的。
在生长控制和肿瘤发生中的IRF-IFN系统
如本文所示，在转录激活子IRF-1和结构上相关的转录阻遏物IRF-2之间的比值的微小的变化对细胞生长可产生很大的影响。IRF-1具有抗致瘤的物质，相反，IRF-2的过表达促进致瘤作用。在最近研究中，表明在髓样白血病细胞系内，IRF-1反义寡聚体阻断其分化[Abdollahi等人，Cell GrowthDiffer.2：401-407(1991)]，而我们初步观察，在NIH3T3细胞中IRF-1反义mRNA的表述产生了一个和IRF-2过表达相似的表型，这和IRF-1是一个肿瘤抑制基因的观点相一致的。IRF-1和IRF-2首次是作为I型IFN基因的转录调节基因而发现的[Miyamoto等人，同上(1988)；Fujita等人，同上(1989)；Harada等人，同上(1989)]，接着表明调节IFN-可诱导基因的表达[Harada等人，同上(1990)；Reis等人，同上(1992)]，实际上，IRF-1是IFN-可诱导的。在正常细胞和转化细胞中I型IFNs抑制了细胞的增殖[Einat等人，Nature313：597-600(1985)；Lin等人，Science 233：356-359(1986)]，并且在造血细胞中诱导IFN表达以自发(autocrine)方式抑制了细胞的增殖[Moore等人，Science 233：171-181(1984)；Resnitzky等人，Cell 46：31-40(1956)]。此外，在缺失染色体9q22的急性白血病患者中，半合子的和纯合的缺失IFN-β基因或IFN-α基因簇都已有报导[Diaz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5259-5263(1988)，N.Engl.J.Med.332：77-82(1990)]，暗示IFNs的缺少可能破坏正常生长控制机制并促进白血病的生成[Grander等人，Blood 79：2076-2083(1992)]。本发明利用了我们的发现，即IRF-1是IFNs的关键靶之一，包括靶基因级联式地表达，这对抑制细胞生长是至关重要的。并且IRF-1/IRF-2比值的微小变化可以干扰细胞的生长并促进白血病的形成。
染色体5q31区和del(5q)
最近对5q31的物理图谱研究表明，IRF-1位于IL-4/IL-5和IL-3/GM-CSF基因簇之间而IL-4和IRF-1两者都存在于450kb YAC中，IL-9和EGR-1是到这区的1-2Mb的端粒序列。[Warrington等人，Genomics 13：803-808(1992)]。然而，如上所讨论的，以前绘到这个区域的那些基因中，没有一个基因能满足作为候选的肿瘤阻遏基因的要求[参见Nimer和Golde，同上(1987)]，因为对每个这些基因，都提不出对肿瘤抑制基因作用的功能性证明。5q31的一个同源的CDC25(CDC25C)[M.P.T.Meeker，UCSE，Sartor等人，Genomics 13：991-913(1992)]最近才绘出，并且IRF-1和CDC252C共存于175kb脉冲场凝胶片段中。
此外，在含有IRF-1缺失的全部del5(q)病例中CDC25C并不缺失而在病例10中(表1)CDC25C不缺失，该例中仅含有外显子1和启动子区的IRF-1缺失。这些研究进一步表明在这些综合征中IRF-1是关键缺失的肿瘤阻遏基因。
在单个病人的del(5q)中在近端(5q13-15)和远端(5q31-33)的折点观察到的变化并出现变种如del(5)(q31 q35)暗示在del(5q)中折点的精确定位并不关键，只要5q31区缺失就可以了。CSF1R(EMS)绘制到5q31·1，并且在涉及5q33-q35的远端折点的del(5q)的病例中CSF1R也可能是半合子缺失的[Nienhuis等人，Cell 42：421-428(1985)；Le Beau等人，同上(1986)]；虽然最近已经报导了在某些MDS患者中CSF1R的纯合子缺失[Boultwood等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6176-6180(1991)]，这些发现还未被证实。本文双色FISH结果表明del(5q)折点的精确位置在MDS的发病机理中并不是关键的。甚至在单个MDS患者中可鉴定出各不相同的细胞的克隆群体，它们在5q上含有不同的近端折点；然而，所有这些克隆都已经缺失了5q31区和IRF-1等位基因。我们的FISH研究也指出了在不同的AML病人中在位于易位的5q31的折点上都存在明显的和异质的DNA的丧失，其中包括IRF-1等位基因。这些发现和以前的细胞遗传研究相反，以前的细胞遗传研究指出了涉及5q31的易位有可能平衡相互易位[Fourth International workshop onChromosomes in Leukemia，1982]。
IRF-1半合子缺失的意义
在开发用于视网膜细胞瘤(RB)研究的原发肿瘤阻遏物基因模型中，由于肿瘤阻遏物基因的两个等位基因的功能丧失而形成肿瘤[综述于Marshall，同上(1991)]。一个单一等位基因的丧失或失活虽然是有易于生成肿瘤的条件但不认为有明显的生物影响。然而，在其他人肿瘤模型的新近的研究表明，丧失肿瘤阻遏物基因的一个等位基因可能会有很重要的生物作用，并且在一些例子中足以促进肿瘤生成。虽然在11p13的WT1的纯合缺失可发现于维尔姆斯(Wilms)肿瘤中，但发现有一个例子，其中候选WT1基因已经历了小的内部缺失[Haber等人，Cell 61：1257-1269(1990)]。在这例中残留的WT1等位基因是正常的，暗示在11p13的单个突变等位基因可能促使维尔姆斯肿瘤生成，特别是如果在其他位置，例如11p1还有突变[Haber等人，同上(1990)]的话。相似地，在神经纤维瘤发生中，一个NFI等位基因的丧失或失活，可足以诱发良性神经纤维瘤[Li等人，同上(1992)]，并且一个APC等位基因的缺失或失活可以促使结肠直肠腺瘤的发展。[Vogelstein等人，N.Engl.J.Med.319-525-532(19988))；Groden等人，同上(1991)]。在这两种模型中肿瘤的进展是与在其他原-致癌基因和肿瘤阻遏物基因座位上突变的获得相关[综述于Marshall，同上(1991)]。最近研究p53也已证明杂合性缺失p53等位基因的鼠生长肿瘤，然而很少，而鼠纯合性缺失p53等位基因，则在早龄期就生长了不同种类的肿瘤[Danehower等人，Nature 356：215-221(1992)]。总而言之，这些研究暗示失去了某种肿瘤阻遏物基因中的一个单个的等位基因可以促使突变细胞的克隆的扩展，从而给进一步的遗传突变产生一个靶群体。
本文已表明失去一个单个的IRF-1等位基因如何在生物上也是重要的。一个单个IRF-1等位基因的丧失或失活可以降低IRF-1的表达，足以减小IRF-1/IRF-2的比值，从而扰乱细胞的生长。在本文中，在白血病和MDS样品中已检测了IRF-2基因，并通过Southern印迹分析在任何样品中都没有检测到IRF-2的扩增、缺失或结构重排。因此，单个的IRF-1等位基因的缺失在白血病和有del(5q)的MDS中可在IRF-1/IRF-2的比值中导致失常。
一种仅失去一个单个的IRF-1等位基因的细胞的克隆将期望具有低的扩展能力，并易于进一步发生基因突变。有意思的是，这些更惰性的生物特征已在患有5q综合征的大多数病人中可观察到[Van den Berghe等人，同上(1974)，同上(1985)；Dewald等人，同上(1985)]。患再生性障碍贫血和del(5)(q13q33)的女性，最常见的间质缺失型，具有生长缓慢的医疗过程，其产生进一步的细胞遗传异常的可能性低，并对AML的转化速度也低[Dewald等人，同上(1985)；Van den Berghe等人，同上(1985)；Nimer和Gold，同上(1987)]。相反，诊断时其它细胞遗传学异常的出现或疾病病程中这种异常的获得，以及雄性的性别是与更高的白血病转化频率相关的。[Nimer andGold，同上，(1987)]。这些发现表明，虽然一个IRF-1等位基因丧失可以促进肿瘤发生，但是，在胚细胞亚群另一个等位基因的丧失和/或在其他遗传位置上的突变产生对完全的白血病的转化是必要的，这一点在本文所述的白血病和MDS患者中的细胞遗传和分子研究得到证实。带有白血病前期的骨髓发育不良综合症的全部del(5q)病人，部有IRF-1半合子缺失。在每一例有del(5q)的重新(de novo)AML也都见到有一个IRF-1等位基因缺失，虽然每一例在疾病呈现时期已在另外位点产生强的细胞遗传异常。有意思的是在胚细胞亚群中检测到IRF-1的纯合缺失的两个病例都是急性白血病：一例是由先前MDS引起的AML而另一例是ALL。在本文报导的病人中在残留的IRF-1等位基因中没有检测到可变更IRF-1的结构的突变。
总之，对上述病人的诊断表明，失去一个IRF-1等位基因是白血病前期克隆扩展的必要条件，通过失去第二个IRF-1等位基因或通过在其他位置发生另外的遗传突变，则白血病前期的克隆可发展为白血病。
在细胞生长中IFN基因的调节
以前曾认为，IRF-1基因的表达是由病毒、IFNs和一些其他的细胞因子(cytokin)瞬间诱导的[Fujita等人，Proc.Natol.Acad.Sci.USA 86：9936-9940(1989)；Harada等人，同上(1989)；Pine等人，Cell.Biol.10：2448-2457(1990)；Yu-Lee等人，Mol.Cell.Biol.10：3087-3094(1990)]。上述实例表明，在正常生长的细胞中这种基因在细胞周期中也受到调节。在例如NIH3T3细胞中，当细胞处于生长停滞态时IRF-1基因表述最高，当血清刺激后恢复生长时IRF-F-1基因表达大大下降，然后再逐渐增加至到细胞进入S相。假定，在本文描述的NIH3T3细胞系中，IRF-2的过表达抑制了IRF-1细胞生长限滞功能。然而这种抑制作用仅在细胞周期的某些阶段时对变更细胞生长是重要的。IRF-2的过表达没有改变这些细胞的血清依赖性，它们在血清饥饿时仍然是生长停滞的。因而IRF-2抑制IRF-1功能的“关键”期，可能发生在细胞进入细胞周期后。
在IFN体系和细胞生长控制之间的联系
以前表明，IRF-1是一个转录激活子，在I型IFN和IFN可诱导基因的表达中起关键的作用。而IRF-2通过结合到同一DNA顺式元件上的竞争而抑制IRF-1的作用[Fujita等人，同上(1989)；Harada等人，同上(1990)；Naf等人，同上(1991)；Au等人，同上(1992)； Reis等人，同上(1992)；Stark和Kerr，同上(1992)]。在病毒感染的细胞中，IRF-1必须经受一些类型的修饰以有效地激活IFN基因[Watanabe等人，同上(1991)]。本文所述结果表明，在IFN系统和细胞生长的调控中都涉及到了IRF基因。在正常生长的细胞中，由IFNs对IRF-1基因的突发性诱导至少部分是由IFNs引起的细胞周期的扰动的原因[Sokawa等，Nature 268：236-238(1977)；Balkwill和Taylor-Papdimtriou，Nature 274：798-800(1978)]。
IRF-1的效应可能受IRF-2表达水平的影响，期望IRF-2在不同类型的细胞中是互不相同的。
IRF-1诱导的细胞生长调节的可能机理
由本文的上述结果可以认为IRF-1激活一系列基因，它们的产物对细胞生长的负调节是必需的。这种基因的表达对于细胞生长的正常调节是重要的，因为据信IRF-2通过抑制IRF-1的功能而诱导细胞的转化。这种假设为如下的现象支持：IRF-1的表达使由IRF-2诱导的转化表型反转。以前曾证明，虽然不是全部，但是有很多IRF-诱导基因在其启动子区内含有结合IRFs的序列[综述于Vilcek，同上(1990)，Stark和Kerr，同上(1992)]。关于这一点已经提供了证据表明，在抑制细胞的增殖中涉及2′，5′-寡聚腺嘌呤核苷酸合成酶(它的基因是IFN诱导的)，虽然在这一点上还存在一些有争论的报导[综述于Revel和Chebath，Trends Biol.Sci.11：166-170(1986)，De Maeyer和DeMaeyer-Guignard，同上(1988)]。有意思的是，这种酶的活性看来随细胞周期而波动[Jacobsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4954-4958(1983)；Wells和Mallucci，Exp.Cell Res.159：27-36(1985)]，并且其表达是由IRF-1调节的[Au等人，(1992)；Reis等人，(1992)]。另一方面，可能是IRF-1通过一个以上的机理调节其作用，对于生长调节关键的特定机理可能在很大程度上依赖于细胞类型和细胞的条件。IRF-2的过表达通过某种不是抑制IRF-1的功能的机理而引起致瘤转化的观点似乎是不可能的，特别是根据结果表明，相似于由IRF-2过表达而诱导的一种表型也可以通过在NIH3T3细胞中表达IRF-1反义RNA而诱导。
因此，IRF-1和IRF-2通常对细胞生长起到关键调节因子的作用，而细胞因子瞬时诱导这两个因子之间的平衡的改变。在病毒感染的细胞中，这些因素是用于有效地启动IFN-α和-β基因，此过程对于宿主防御病毒的侵袭是重要的。
IRF-1和其他作为肿瘤阻遏物的核因子
所得的结果表明IRF-1是肿瘤阻遏物的一种新出现的成员[综述于Marshall，同上(1991)；Weiberg，Science 254：1138-1146(1991)]。至今，在有关肿瘤抑制方面已有广泛研究的三个核因子；P105-RB(pRB)(综述于Weinberg，同上(1991))；Hamel等人，Trends Genet.8：180-185(1992)]，p53(综述于Hollstein等人， Science 253：49-52(1991)；Levine等人，Nature351：453-456(1991)]和WT1基因产物(综述于Haber和Housman，CancerRes.59：41-68(1992)；van Heyningen和Hastie，Trends Genet.8：16-21(1992)]。似乎后两个因子直接调节转录活性，或以正的形式(p53)[Farmer等人，Nature 358：83-85(1992)；Kern等人，Science 256：827-830(1992)]，或以负的形式(WT1)[Madden等人，Science 253；1550-1553(1991)]。
IRF-1似乎是相似于表征得很充分的肿瘤阻遏物p53，其中它们两个都起到了转录激活子的功能，且二者都调节细胞生长。有趣的是，在生长停滞期，p53量仍然上升[Kastan等人，Cancer Res.51：6304-6311(1911)]，并在整个细胞周期内都受到调节[Reich和Levine，Nature 308：199-201(1984)]，正如在IRF-1的情况中所观察到的。同样有意思的是，p53的突变致癌形式抵消了野生型p53的功能[Kern等人，同上(1992)]，和IRF-2对IRF-1的影响相似。在这一点上，有趣的可能性是p53象IRF-2一样也具有天然的对抗因子，而在实际上，最近已报导了这样的一种候选物[Momand等人，Cell69：1237-1245(1992)；Oliner等人，Nature 358：80-83(1992)]。在同一文章中，另一肿瘤阻遏物基因WT1编码一个有DNA结合能力的蛋白质，最近的证据提出，WT1蛋白可以通过调节一个结构上相关的激活子EGR-1和/或其蛋白质家族而抑制转录(Madden等人，同上(1991)Van Heyningen and Hastie，同上(1992))。
在人癌中IRF-1的作用
正如本文所述，人的IRF-1基因定位在染色体5q31，而且在所观测的11个患急性白血病和有染色体5q的间质缺失的MDS病例中的每一例以及在两个有染色体5q31相互易位的急性白血病的病例中的每一例中都有一个IRF-1等位基因缺失。在急性白血病的一个病例中，也观察到在一个IRF-1等位基因中的重排，它引起了近端启动子区域和第一个外显子的缺失。而且，在这病例中在大多数的白血细胞中发现剩余的IRF-1等位基因是缺失的。从该结果表明在IRF-1/IRF-2比值中的微小变化能引起细胞不受限制地生长，失去一个或2个IRF-1的等位基因都可认为表明一种易于生长肿瘤的关键步骤，特别是白血病和有5q31异常的MDS。因此，经常出现在人的白血病和MDS的5q-综合症和del(5q)中，其中IRF-1是一个关键缺失的基因。
正如本文所述，缺少IRF-1等位基因或含有突变的或易位的等位基因因而它们不能应答这种负的生长因子的细胞更易于产生癌的表型。
因此，IRF-1和IRF-2是两个结构上有关的DNA结合因子的独特实例，它们以一种相互对抗的方式起作用，这种方式表明了抗致癌和致癌因素的平衡的重要性，这种平衡的改变是细胞转化的关键的一步。
在患者中，对于因染色体5[del(5q)或易位5q31]长臂的缺失或突变或易位而形成肿瘤如MDS的患肿瘤的病人，IRF-1是“关键的缺失”的肿瘤阻遏物基因，本发明提供了新的可能性以诊断和治疗肿瘤，特别是MDS和AML。检测IRF-1种系(组成的)和体细胞的缺失及突变就可使下述成为可能：
1、更精确地诊断和确定有发展肿瘤如MDS和AML倾向的个体。
2、更精确地诊断和确定那些肿瘤患者，例如MDS和AML病人，其疾病的引发是通过或部分由于IRF-1突变，从而确定一个独特的MDS和AML病人组，这些病人可得益于新的生物治疗(见上述)。
3、根据有或没有IRF-1突变或缺失，有或没有其他核型(细胞遗传)异常和其他临床特征而对MDS和AML患者开发一种新的预后分层和分类方案。
4、根据我们目前理解的IRF-1的生理学和在正常的真核细胞中IRN α/β细胞生长抑制途径，给IRF-1缺失和突变的MDS和AML病人以新的生物治疗法的合理方案。这些新的和创新的治疗方法将包括：
a)设计治疗方案，使用细胞因子或其他生物因子以选择性地除去带IRF-1缺失和突变的造血细胞或使用细胞因子以校正丧失IRF-1功能而引起的生理缺陷。
b)设计治疗方案，使得能够从人的造血干细胞(HSC)总群体中选择地体外消除含IRF-1缺失和突变的HSC，在去除有IRF-1缺失和突变的HSC下，可以选择性地扩大正常HSC，从而消除这种有缺陷的干细胞的骨髓或外周血液HSC，以使得校正的骨髓或外周血液HSC自体移植给MDS和AML病人。
c)设计基因治疗方案，它将IRF-1基因输送到有IRF-1缺失和突变的人的细胞中，从而较正因IRF-1功能丧失而导致的遗传和生化的缺陷。
表1  血细胞计数、FISH和分子分析造血瘤中的IRF-1缺失1
                       原位荧光染色体杂交
      IRF-1单色     IRF-1(5q31.1)/5q22双色
    病例     染色体组型2 白血病3胚细胞％ IRF-1∶C9杂交比率 #细胞计数 IRF-1等位基因频率(％) #细胞计数     IRF-1/5q22等位基因频率(％)
1、染色体5q的间质的缺失
脊髓发育不良1、再生障碍性贫血2、MDS/贫血3、再生障碍性贫血4 MDS 46，XX，del(5)(q13q33)[10]/46，XX[2]46，XY，del(5)(q13q33)[3]/46，XY[22]45，XX，del(5)(q13q35)，-6，+1(6p)，del(7)(q22q22)，-10，-12，+der(12)t(12；7)(p13；7)[4]/46，XX[14]52，X，-Y，+1，del(5)(q13q33)，+8，+9，+11，i(14q)，+18，+19，+22[15] 0.36∶10.62∶10.68∶10.56∶1 101411121001N.D. 2-66.71-23.90-9.42-71.91-23.60-4.52-46.01-48.30-5.7N.D. 73 不考虑425q22/2 IRF-1-37.025q22/1 IRF-1-20.515q22/1 IRF-1-31.615q22/2 IRF-1-8.225q22/0 IRF-1-2.7N.D.N.D.
继发性白血病5 RAEB→AML6 RAEB→AML 40-46，XX，del(5)(q13q33)-11，+13，+16，-18，-22[20]46，XX，del(5)(q15q33)[25] 59％60％ 0.58∶10.58∶1 10181261 2-8.21-84.50-7.32-14.51-78.10-7.4 72 不考虑25q22/2 IRF-1-8.325q22/1 IRF-1-23.615q22/1 IRF-1-43.115q22/2 IRF-1-2.725q22/0 IRF-1-13.915q22/0 IFR-1-8.4
De Novo急性白血病7 Del Novo AML8 Del Novo AML 44，XX，del(5)(q11，2q33)，del(7)(q11.2)，-8，-10，+der(10)t(10；11)(q22；q13)，-11，+der(11)，t(11；7)，(q13；7)，-13，+der(13)t(13；7)(q372；7)，-14[17]/44，idem，del(6)(q715；q723)[3]45，X，-X，der(4)t(4；7)(p16；7)，del(5)(q13q33)，del(8)(q21.3q24.2)，del(9)(q12q32)，del(17)(p11.2)，dmins 80％80％ 0.35∶10.36∶1 10001000 2-2.71-86.30-112-1.21-84.70-14.1 76 25q22/2 IRF-1-4.025q22/1 IRF-1-11.715q22/1 IRF-1-80.315q22/2 IRF-1-4.025q22/0 IRF-1-0.0不考虑
表1  血细胞计数、FISH和分子分析造血瘤中的IRF-1缺失1
                    原位荧光染色体杂交
    IRF-1单色     IRF-1(5q31.1/5q22双色
    病例     染色体组型2 白血病3胚细胞％ IRF-1∶C9杂交比率 #细胞计数 IRF-1等位基因频率(％) #细胞计数   IRF-1/5q22等位基因频率
De Novo急性白血病9 De Novo AML10 De Novo AML11 de Novo AML复发 46，XY，del(3)(q275q277)，del(5)(q272q31)，del(7)(q11.2)，12，+der(12)t(12；7)/45，idem，-746，XX，t(4；11)(q21；q23)，del(5)(q15q373)，[(7q)，(3)/46，XX[18]46，XY，t(2；6)(p23；q25)，del(5)(q31q35)，t(8；21)(q22；q22)[13]/46，idem，t(13；18)(q14；q23)[3] 90％75％40％ 0.45∶10.55∶10.81∶1 未测179231 未测2-55.91-25.70-18.42-67.81-25.70-6.5 61 未测不考虑425q22/2 IRF-1-44.325q22/1 IRF-1-36.115q22/1 IRF-1-9.815q22/2 IRF-1-4.925q22/0 IRF-1-4.9
II.染色体5q 31的易位
12 De Novo AML13 De Novo AML 46，XY，t(5；13)(q31；q14)，-7del(15)(q21q26)，+21[18]/46，XY[2]46，XX，t(5；6)(q31；q21) 95 ％70％ 0.46∶10.72∶1 10261000 2-2.51-87.70-9.82-2.51-77.30-20.2 10486 25q22/2 IRF-1-14.425q22/1 IRF-1-29.815q22/1 IRF-1-52.915q22/2 IRF-1-2.025q22/0 IRF-1-0.925q22/2 IRF-1-6.925q22/1 IRF-1-3.515q22/1 IRF-1-55.915q22/2 IRF-1-31.425q22/0 IRF-1-2.3
III.选择对照
具有5q异常的造血瘤5q31除外14 MDS/CMMOL15淋巴瘤 46，XY，t(5；12)(q33；p13)，del(7)(q22q32)[20]46，XX，t(2；5)(q23；q35) 1.02∶11.06∶1 581021 2-84.61-15.00-0.42-88.21-9.00-2.8 139 不考虑25q22/2 IRF-1-81325q22/1 IRF-1-7.915q22/1 IRF-1-2.215q22/2 IRF-1-4.325q22/0 IRF-1-4.3
           表1血细胞计数、FISH和分子分析造血瘤中的IRF-1缺失1
    原位荧光染色体杂交
    IRF-1   单色     IRF-1(5q31.1)/5q22双色
    病例  染色体组型2   白血病3胚细胞％  IRF-1∶C9杂交比率    #细胞计数 IRF-1等位基因频率(％) #细胞计数 IRF-1/5q22等位基因频率(％)
正常组织16血单核细胞(低温贮藏)17骨髓(低温贮藏) 46，XY46，XX 1.03∶10.92∶1 10471045 2-89.71-8.10-2.22-88.01-8.00-4.0 317 未测25q22/2 IRF-1-80.425q22/1 IRF-1-6.315q22/1 IRF-1-4.715q22/2 IRF-1-6.625q22/0 IRF-1-2.0
1缩写词：MDS，脊髓发育不良；RAEB→AML，有过量胚细胞的再生性障碍贫血转化成急性脊髓白血病；AML，急性脊髓白血病；ALL，急性淋巴样白血病；CMMOL，慢性髓单核细胞白血病；ND，未测定2按照ISCH标准准则，(ISCH，1991)代表性的中期染色体扩散是：染色体组型检出有每个克隆异常的细胞数在括号内给出。3血癌胚细胞％，同形态学准则确定，对那些MDS转染成AML的情况和AML/ALL的各情况都有列出。4不考虑的标准：在用于分析和计数的＞25％细胞和/或＜50％杂交细胞中没有5q22杂交信号的。
表2过度表达IRF-2的细胞系和对照的生长性质细胞系   在甲基纤维素凝胶中的生长      致瘤性
          效率(％)        肿瘤/注射    潜伏期(周)C-2             0，0             0/7           -C-3             0，0             0/5           -2-1             7，12            6/6           2-32-5             6，6             6/6           2-32-7             10，19           6/6           2-3在甲基纤维素凝胶中生长给出的值为重复实验所得对致瘤性的试验细节描述于实验方法中表3表达人IRF-1的细胞系的生长性质细胞系    人IRF-1    mRNA表达(拷贝/细胞)   在甲基纤维素中的生长           致瘤性
     (NDV)-             +                 效率(％)          肿瘤/注射    潜伏期(周)C-3        ＜1             N.D.                  0                 0/5           -2-7        ＜1             N.D.                  15                6/6           2-2.52-1-1      1               6                     N.D.              2/6           22-1-2      ＜1             7                     N.D.              6/6           2-32-5-2      24              463                   N.D.              0/5           --2-7-3      16              542                   0                 0/6           --2-7-4      3               65                    5                 3/6           3-3.5mRNA拷贝数是按以前所报道(Fujita et al(1987)用S1图谱分析法并用光密度分析法来计算而测定的。在甲基纤维素凝胶中生长给出值是重复试验的平均值，致瘤性测定描述于实验方法部分。N.D.指未测。
实施例10
带有IRF-1或IRF-2基因的反转录病毒细胞的转染
构建了一种重组体反转录病毒载体pGDIRF2，它控制小鼠IRF-2 cDNA的表达。用小鼠IRF-2 cDNA嵌入pGD载体而构建重组体逆转录病毒pGDIRF2(Daley，G.Q.等人，Science 247：824(1990))。DNA构建体在ψ2细胞中进行转染(Mann，R.等人，Cell 33：153(1983))，得到具有高滴度(～106cfu/ml)的病毒上清液，高滴度是根据对NIH3T3细胞具有新抗性的能力来测定的。NIH3T3细胞用pGDIRF2逆转录病毒在高感染复数下进行感染并将这些细胞在甲基纤维素凝胶上直接进行菌落形成试验。如表4所概括的，用IRF-2表达的病毒而不是用对照的pGD病毒感染细胞其菌落形成的效率高，全部细胞被病毒感染，其菌落形成的效率与上面提到三种选择的克隆的相类似(见表1)。用小鼠IRF-1 cDNA嵌入pGD载体而构建重组体逆转录病毒pGDIRF1并转染进ψ2细胞以产生一种具有上述对病毒pGDIRF-2的高病毒滴度的上清液。NIH3T3细胞(克隆R2-7)用病毒感染并发现这些细胞经IRF-2诱导的转化是可以通过诱导和增加IRF-1基因的表达而逆转的。与这种观察相一致的是在用pGDIRF1逆转录病毒感染的R2-7细胞的甲基纤维素凝胶中所生成的菌落明显降低(表5)。这些结果一起表明IRF-2有致瘤的可能性，在IRF-1和IRF-2表达之间保持平衡对有限制的细胞生长是很重要的。当这种平衡受IRF-1的过表达扰乱时，细胞增殖可被抑制(Yamada等人，同上；Abdollahi等人，Cell Growth和Differ.2：401(1991)；Kuchhoff，S.等人，Inteferon Res.12(S)：102(1992))，而IRF-2的过度表达可以促进不受抑制的生长。表4IRF-2基因的逆转录病毒引入后在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率在甲基纤维素凝胶中菌落形成的效率(％)
       pGD       pGDIRF2实验1    ＜1，＜1    17，15实验2    ＜1，＜1    12，16表5IRF-1基因的逆转录病毒引入后在R27细胞的菌落形成在甲基纤维素凝胶中每5000个细胞的菌落数目
      m.o.i.    pGD      pGDIRF1实验1     0.3     417，389   308，287实验2     1       423，408   187，225实验3     10      415，432   196，124
在上文中所提及的全部文献都引入本文作为参考。为了清楚和了解起见，上面的发明已有详述，专业人员可以理解，阅读本发明后，在不偏离本发明的实际范围和所附权利要求的前提下可以在形式上和细节上作各种改变。
                         序列表(1)基本信息：(i)申请人：Taniguchi，Tadatsugu
         Willman，Cheryl L.
         Pallavicini，Maria G.
         Harada，Hisashi
         Tanaka，Nobuyuki
 (ii)发明名称：在致瘤性诊断中的干扰素调节因子1和2
(iii)序列数：4
(iv)通信地址：
  (A)收信人：Sterne，Kessler，Goldstein and Fox
  (B)街道：1225 Connecticut Avenue
  (C)城市：Washington
  (D)州：D.C.
  (E)国家：U.S.A.
  (F)邮编：20036
(v)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release # 1.0，版本 # 1.25
(vi)当前申请数据
  (A)申请号：US(待定)
  (B)申请日：(与此相同)
  (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
  (A)姓名：Esmond，Robert W.
  (B)登记号：32，893
(ix)电讯资料：
  (A)电话：(202)833-7533
  (B)传真：(202)833-8716(2)序列1信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：51碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TTGTGGTAGT    ACCGGTGGGG    GCCCGGCAGG    TTTCGCAGATCTGCGTGCGC G(2)序列2信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：51碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：ACCGGACGAG   GCTGCCGGGG   GCCCGGCAGG   TTTCGCAGATCTGCGTGCGC G(2)序列3信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：82碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TTCCAACCAA    ATCCCGGGGC   TCATCTGGAT   TAATAAAGTGAGTGTAACTC TTTGGGTTTT CCTGCCACTG TTTTAACCCA TG(2)序列4信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：82碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TTCCAACCAA    ATCCCGGGGC    TCATCTGGAT    TAAIAAAGTGAGTGTAACTC TTTGGGTTTT CCTGCCACTG TTTTAACCCA TG
                     质粒表PUCIRF-1    含有在限制位点Sal I(XhoI)和Sma I(Hinc II)之间编码人
        IRF-1的cDNA插入物(图9)。pHIRF4S-51  含有在限制位点Xhol，编码人IRF-2的cDNA插入物(图
        10)。pUCHIRFIB   说明书中已详述，并含有19kb基因人IRF-插入物。Hybridoma TK3这是产生对IRF-1专一的抗体TK3并在文中涉及的。

Claims (16)

1、一种筛查人的白血病组织的方法，包括：
(a)分离怀疑为白血病的人组织；
(b)用核酸分析测定该组织中的干扰素调节因子-1/干扰素调节因子-2(IRF-1/IRF-2)比率，并将该比率与正常人的组织中的进行比较；
其中IRF-2的值高于IRF-1并且怀疑为白血病的所说组织中的该比率不同于正常组织中的该比率是存在白血病组织的指征。
2、一种筛查人的白血病组织的方法，包括：
(a)分离怀疑为白血病的人组织；
(b)检测该组织中一个或多个功能性IRF-1基因的缺失，该缺失是存在白血病组织的指征。
3、权利要求2的方法，其中所说的IRF-1基因的缺失的检测包括筛查染色体5中的该基因的易位。
4、权利要求2的方法，其中所说的IRF-1基因的缺失的检测包括用标记的IRF-1DNA探针在原位杂交中进行荧光检测。
5、一种筛查人的白血病的方法，包括
(a)定义对照标本中的参数，IRF-1/IRF-2比率的值；
(b)从所说人中取标本并进行所说细胞的核酸分析以测定该标本中的细胞的该参数值；和
(c)比较(b)中测定的值和(a)中定义的值，其中在该标本中的IRF-2值高于IRF-1的指示白血病组织的存在。
6、权利要求5的方法，其中的参数的IRF-1的值为编码IRF-1的染色体5中的等位基因的数目。
7、权利要求6的方法，其中的编码IRF-1的染色体5中的等位基因的数目通过用标记的IRF-1DNA探针的荧光原位杂交(FISH)而测定。
8、权利要求7的方法，其中的DNA探针是IRF-1cDNA探针。
9、权利要求7的方法，其中的DNA探针是至少8Kb的IRF-1基因组探针。
10、权利要求5的方法，其中的参数的IRF-的值是染色体5中编码突变体IRF-1的等位基因的数目。
11、权利要求5的方法，其中的参数的IRF-1的值是已在染色体5中易位的编码IRF-1的基因的数目。
12、权利要求5的方法，其中的参数的IRF-1的值是染色体5的存在与否。
13、权利要求5的方法，其中的参数通过计算每细胞中的IRF-1和IRF-2mRNA分子数目。
14、权利要求13的方法，其中的每细胞中的IRF-1和IRF-2的mRNA分子的数目是通过从细胞群中抽取总细胞RNA，用标记的IRF-1和IRF-2DNA片段作为探针进行该提取物的S1图谱分析和测定每个IRF-1和IRF-2印迹的标记强度而得到的。
15、权利要求13的方法，其中的每细胞中的IRF-1和IRF-2的mRNA分子的数目是通过从细胞群中抽取总细胞RNA，用标记的IRF-1和IRF-2DNA片段作为探针进行该提取物的RNA印迹分析并测定每个IRF-1和IRF-2印迹的标记强度而得到的。
16、一种用于测定细胞或组织的IRF-1/IRF-2的比率的试剂盒，它包括在分开的容器中的抗IRF-1抗体和抗IRF-2抗体，所述抗体没有或基本没有交叉活性。
CN93117298A 1992-09-24 1993-09-24 筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒 Expired - Fee Related CN1051110C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US950,574 1986-12-11
US95057492A 1992-09-24 1992-09-24
US99559492A 1992-12-22 1992-12-22
US995,594 1992-12-22
US07/995,594 1992-12-22
US07/950,574 1992-12-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1098140A CN1098140A (zh) 1995-02-01
CN1051110C true CN1051110C (zh) 2000-04-05

Family

ID=27130304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN93117298A Expired - Fee Related CN1051110C (zh) 1992-09-24 1993-09-24 筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒

Country Status (10)

Country Link
US (2) US5652095A (zh)
EP (1) EP0662976A4 (zh)
JP (1) JPH08501691A (zh)
CN (1) CN1051110C (zh)
AU (1) AU682321B2 (zh)
CA (1) CA2145412A1 (zh)
HU (1) HU217688B (zh)
MX (1) MX9305855A (zh)
NZ (1) NZ256623A (zh)
WO (1) WO1994006818A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6605712B1 (en) * 1990-12-20 2003-08-12 Arch Development Corporation Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
PH31414A (en) * 1994-02-24 1998-10-29 Boehringer Ingelheim Int Method of diagnosing cancer precancerous state, orsusceptibility to other forms of diseases by anal ysis of irf-1 specific rna in biopsy samples.
WO1998049321A2 (en) * 1997-04-28 1998-11-05 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
WO2001013940A1 (fr) 1999-08-23 2001-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Potentialisateurs d'expression de l'antigene hm1.24
JP4522431B2 (ja) * 2001-02-07 2010-08-11 中外製薬株式会社 造血器腫瘍の治療剤
EP1364657B1 (en) * 2001-02-07 2016-12-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedies for myelocytic leukemia
JP2004529888A (ja) * 2001-02-26 2004-09-30 ゲゼルシャフト フュア ビオテヒノロジッシェ フォルシュング エムベーハー （ゲーベーエフ） インターフェロン調節因子−１／ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質および癌を治療するためのその使用
EP1390075B1 (en) * 2001-04-06 2012-01-18 The University of Chicago Chemotherapeutic induction of egr-1 promoter activity in gene therapy
US20040242523A1 (en) * 2003-03-06 2004-12-02 Ana-Farber Cancer Institue And The Univiersity Of Chicago Chemo-inducible cancer gene therapy
US8034791B2 (en) 2001-04-06 2011-10-11 The University Of Chicago Activation of Egr-1 promoter by DNA damaging chemotherapeutics
CN108221058A (zh) * 2017-12-29 2018-06-29 苏州金唯智生物科技有限公司 一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用
CN108205614A (zh) * 2017-12-29 2018-06-26 苏州金唯智生物科技有限公司 一种全基因组sgRNA文库的构建系统及其应用
CN115243714A (zh) * 2020-03-06 2022-10-25 匹兹堡大学联邦系统高等教育 用于治疗癌症的表达irf调节剂的溶瘤病毒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
EP0359998B1 (en) * 1988-08-24 1994-05-18 Taniguchi, Tadatsugu, Prof. Dr. Factor regulating gene expression
CA2104964A1 (en) * 1991-02-28 1992-08-29 Ruth Sager Cancer diagnosis and therapy with tumor suppressor genes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBO VOL7 1988. 1. 1 FUJITA ET AL EVICLENCE FOR ELEMENTS *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0662976A4 (en) 1997-04-23
AU5141793A (en) 1994-04-12
HU217688B (hu) 2000-03-28
CN1098140A (zh) 1995-02-01
US5807836A (en) 1998-09-15
WO1994006818A1 (en) 1994-03-31
NZ256623A (en) 1997-04-24
AU682321B2 (en) 1997-10-02
MX9305855A (es) 1995-01-31
HUT71768A (en) 1996-01-29
EP0662976A1 (en) 1995-07-19
HU9500841D0 (en) 1995-05-29
US5652095A (en) 1997-07-29
CA2145412A1 (en) 1994-03-31
JPH08501691A (ja) 1996-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1051110C (zh) 筛查白血病及其组织的方法以及有关试剂盒
Ruddle Linkage analysis in man by somatic cell genetics
Ellis et al. Somatic intragenic recombination within the mutated locus BLM can correct the high sister-chromatid exchange phenotype of Bloom syndrome cells.
CN1197966C (zh) 肿瘤坏死因子受体相关因子的调节剂、及其制备和用途
CN1167795C (zh) 肽、dna及抗体
CN1207771A (zh) 诊断和治疗肿瘤的方法及组合物
CN1131240C (zh) 染色体21基因标记,组合物及其使用方法
Maraschio et al. An analysis of Xq deletions
CN1680441A (zh) 新型化合物
Puck et al. Somatic cell genetics and its application to medicine
CN1270637A (zh) 新的衰老因子基因p23的分离
CN1807623A (zh) 一个细胞周期正向调控基因及其编码蛋白与应用
Martinelli et al. Alu and translisin recognition site sequences flanking translocation sites in a novel type of chimeric bcr-abl transcript suggest a possible general mechanism for bcr-abl breakpoints
Hino et al. Molecular genetic basis of renal carcinogenesis in the Eker rat model of tuberous sclerosis (Tsc2)
CN1254377A (zh) 哺乳动物chk1效应物细胞周期关卡蛋白激酶材料与方法
CN1203633A (zh) 对癌症的易感性诊断及其治疗
Gaidano et al. Molecular pathogenesis of non-Hodgkin lymphoma: a clinical perspective
CN1171133A (zh) 细胞凋亡相关基因
CN1865440A (zh) 肥厚型心肌病致病基因的新突变及其用途
CN1088260A (zh) 用于检测染色体易位的寡核苷酸探针和引物
CN1142274C (zh) 具有细胞凋亡促进活性的多肽
CN1252283C (zh) 卵巢癌的检测方法和试剂盒
CN1231496C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1364172A (zh) 转录激活抑制蛋白
CN1169956C (zh) 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee