JP2004529888A - インターフェロン調節因子−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質および癌を治療するためのその使用 - Google Patents
インターフェロン調節因子−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質および癌を治療するためのその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004529888A JP2004529888A JP2002568710A JP2002568710A JP2004529888A JP 2004529888 A JP2004529888 A JP 2004529888A JP 2002568710 A JP2002568710 A JP 2002568710A JP 2002568710 A JP2002568710 A JP 2002568710A JP 2004529888 A JP2004529888 A JP 2004529888A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- irf
- cells
- fusion protein
- tumor
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 106
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 title abstract description 20
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 title abstract description 20
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title abstract description 15
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 title abstract description 7
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 201
- 108090000890 Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 claims description 190
- 102000004289 Interferon regulatory factor 1 Human genes 0.000 claims description 186
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 42
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 40
- 108091054729 IRF family Proteins 0.000 claims description 29
- 102000043138 IRF family Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 13
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 7
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 abstract description 38
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 abstract description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 82
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 37
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 26
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 22
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 20
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 19
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 18
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 16
- 102220470475 L-seryl-tRNA(Sec) kinase_C57L_mutation Human genes 0.000 description 16
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 16
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 14
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 13
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 12
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 10
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 10
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 10
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 8
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 8
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 6
- 102100034170 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Human genes 0.000 description 6
- 101710089751 Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 6
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100029838 Interferon regulatory factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000908 Interferon regulatory factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 5
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 4
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 4
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 4
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 4
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 101150064107 fosB gene Proteins 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 3
- 101001136981 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-9 Proteins 0.000 description 3
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 3
- 102100035764 Proteasome subunit beta type-9 Human genes 0.000 description 3
- 108010003894 Protein-Lysine 6-Oxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004669 Protein-Lysine 6-Oxidase Human genes 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N (2r)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-(2-aminoethylamino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-naphthalen-2-yl-1-oxopropan-2-yl]-n'-hydroxy-2-(2-methylpropyl)butanediamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(=O)NO)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCCN)=CC=C21 AWNBSWDIOCXWJW-WTOYTKOKSA-N 0.000 description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 2
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 2
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 2
- 101001124792 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102000011202 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011786 NMRI nude mouse Methods 0.000 description 2
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 2
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 2
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 2
- 102100029081 Proteasome subunit beta type-10 Human genes 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003443 anti-oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 102000007445 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108010086241 2',5'-Oligoadenylate Synthetase Proteins 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 101710150820 Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108010085330 Estradiol Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 101000598002 Homo sapiens Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000585484 Homo sapiens Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 101000827787 Mus musculus Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101001054328 Mus musculus Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 101000926534 Mus musculus Interferon-induced, double-stranded RNA-activated protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100035174 SEC14-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000003592 T-IEL Anatomy 0.000 description 1
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000025309 Type 2 Angiotensin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010062475 Type 2 Angiotensin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N afimoxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=C(O)C=C1 TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000002022 anti-cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N benzbromarone Chemical compound CCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1 WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 1
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002566 clonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 108010037623 eIF-2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000010982 eIF-2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012148 non-surgical treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464436—Cytokines
- A61K39/464441—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
本発明は、β−エストラジオールにより可逆的に活性化可能であるインターフェロン調節因子−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質に、ならびに癌を治療するための、特に肝細胞癌を治療するためのその使用に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍を治療する方法の開発に関する。本方法は、IRF−1、特にβ−エストラジオールにより不可逆的に活性化可能であるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質の活性化に基づいている。
【0002】
本明細書中で用いられる略語:
AFP=αフェトプロテイン
c−Ha−ras=ras癌遺伝子
c−myc=myc癌遺伝子
CTL=細胞傷害性Tリンパ球
E2=β−エストラジオール
FCS=ウシ胎児血清
fosB=転写因子fosB
HCC=肝細胞癌細胞
HER1=EGF受容体
ICE=カスパーゼ
IL−15=インターロイキン−15
iNOS=誘導NOシンターゼ
ISG=インターフェロン刺激遺伝子
ISGF3=IRF−1関連サブユニット
ISRE=インターフェロン刺激応答要素
LMP2=タンパク質プロセシング因子
mAFP=ネズミαフェトプロテイン
MECL1=多触媒性エンドペプチダーゼ複合体1
MHC=主要組織適合性複合体
NK細胞=ナチュラルキラー細胞
OASE=2’,5’−オリゴ(A)シンテターゼ
PKR=プロテインキナーゼR
ras誘導=rasタンパク質の誘導
TAP−1=タンパク質プロセシング因子
TH1=1型Tヘルパー細胞
【0003】
詳細な書誌情報を有する引用参考文献の完全一覧を、本明細書の末尾に示す。
【0004】
肝細胞癌(HCC)は、世界中の全ての悪性疾患の中で第五位の発生頻度であって、1990年の新症例数は437,000と概算されている(1)。種々の非外科的治療法が開発され、外科技法は大いに改良されてきたが、これらの療法の中で、HCC患者の非常に不十分な予後を有意に改善したものはない。全体的な5年生存率は全世界で2%に過ぎず(2)、したがってHCCのための新規の遺伝子および免疫療法戦略が開発されつつある。当該発明者等は、腫瘍の治療のための腫瘍サプレッサーおよび免疫モジュレーターとしてのインターフェロン調節因子−1(IRF−1)の広範な役割を用いようと試みた(3)。本発明者等は、マウスにおける免疫応答性同系HCC腫瘍モデルおよび免疫不全マウスにおける試験のための別の腫瘍細胞系を用いた。
【0005】
IRF−1発現は多数のインターフェロン刺激遺伝子(ISG)の誘導をもたらし(4〜6)、それにより組織適合性抗原(7)および抗ウイルス状態(5、8)の誘導を含めた通常のIFN−機能を誘導する。IRF−1遺伝子はそれ自体、IFNにより誘導可能であるため、それはIFN媒介性細胞応答に関与され得ることが示唆された(5、9、10)。しかしながら機能的IRF−1遺伝子を欠くマウスおよび細胞では、典型的ISG(例えば9〜27、1〜8、PKR)のIFN誘導性誘導は影響を受けない(8、11〜13)。したがってIRF−1は、ISG−プロモーターをIRF−1関連サブユニットISGF3で結合するISGF−3によりISGのIFN特異的誘導を刺激すると思われる(14)。これらのマウスにおける特異的変更は、IFN−βに対する応答においてiNOS(誘導可能NOシンターゼ)誘導を欠くことである(15)。
【0006】
IRF−1は、DNA結合およびトランス活性化により抗増殖作用を発揮する(4)。成長抑制作用を発揮する複数の遺伝子を誘導することが既知である。それらの例としては、リシルオキシダーゼ(16)、PKR(17)、2’−5’OASE(18)、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(19)およびII型アンギオテンシン受容体(20)がある。繊維芽細胞および上皮起源の確立された細胞系では、IRF−1はアポトーシスの兆候を伴わずに細胞増殖停止をもたらす(21)。しかしながらras誘導性アポトーシスに必要とされる腫瘍サプレッサーp53の活性(22、23)と同様に、IRF−1は癌遺伝子依存性アポトーシスを発揮し得る。当該発明者等は、IRF−1により成長抑制される3T3細胞が条件付HER1癌遺伝子活性化後にアポトーシスを受けることを示した(24)。実際、ICEのようなある種のカスパーゼ遺伝子のプロモーター領域はISRE様配列を含有する(25)。これらの遺伝子は、IRF−1の標的であり得る(26)。
【0007】
IRF−1は、腫瘍サプレッサーとして確認された(4、17、24、27)。ヒトにおけるIRF−1遺伝子座の染色体欠失は、脊髄形成異常および))ある種の白血病に関連する(28)。IRF−遺伝子における突然変異を有さない一次胚繊維芽細胞は、単一癌遺伝子(c−Ha−ras)の発現による形質転換を受け易い。これらのIRF−1−/−細胞は、c−Ha−ras癌遺伝子発現および血清飢餓時にアポトーシスを受けないが、一方、IRF−1遺伝子を保有する野生型細胞はプログラムされた細胞死を受ける(21)。IRF−1発現はまた、c−mycおよびfosB癌遺伝子により発揮される腫瘍原性表現型を復帰させる(29)。c−Ha−rasおよびIRF−1を欠くマウスはより高率の腫瘍原性を示すことをさらなるデータは示した(30)。
【0008】
腫瘍サプレッサーとしてのIRF−1のin vivoでの作用は、複雑である。細胞の種類によって、IRF−1は成長阻害、アポトーシスを誘導し、細胞外マトリクスならびに免疫調節機能に影響を及ぼす。IRF−1は、多数の免疫調節作用、例えばMHCクラスI(31、32)、iNOS(15)、IFN−β(11)転写を誘導し、IL−15の適切な発現にも必要である(33)。IRF−1の一過性発現は、IFN−β遺伝子の活性化をもたらす(9、34、35)。IRF−1ノックアウト細胞を用いた試験は、IRF−1がNK細胞の分化および機能に関与し(33、36)、TH1型のTヘルパー細胞の生成、ならびにDNA損傷に関与することを実証する(26、37)。IRF−1はさらに、LMP2、TAP−1およびMECL1の転写的誘導(38、39)ならびにMHCクラスIIの誘導(7、40)による抗原提示の上向き調節に関与する。これらの事実は、IRF−1が抗原の提示のための補刺激因子として作用し得ることを示唆する。
【発明の開示】
【0009】
本発明の目的は、腫瘍に対する療法的アプローチに関するIRF−1の効能を実証することであった。本報告は、β−エストラジオール(E2)の存在下で活性になるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするプラスミドおよびネズミ細胞系の構築(4)、およびこれらの細胞系のin vitroでの表現型の詳細な特徴付けを詳述する。さらに本発明者等は、免疫応答性および非応答性マウスを用いたin vivoでの腫瘍増殖に対するこの活性化可能IRF−1系の防御的および治療的能力を記載し、腫瘍に対するT細胞応答を特徴付け、かつ、HCC特異的自己分化抗原マウスα−フェトプロテイン(AFP)に対する免疫学的耐性(41)がこのアプローチにより破壊され得ることを実証する。最後に、本発明者等の結果は、IRF−1が、直接的抗腫瘍成長作用および腫瘍の免疫細胞認識強化の両方によりその抗腫瘍作用を媒介することを実証する。
【0010】
本発明の問題は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの使用であり、それによりIRFファミリーのメンバーであるその遺伝子産物の活性が活性化されるようになり得る使用によって解決される。本発明の特徴的な実施形態は、上述した使用であって、遺伝子産物としてのIRFファミリーのメンバーは、野生型IRF−1,合成IRF−1、免疫学的活性IRF−1変異体、IRF−1以外のIRFファミリーの野生型メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーの合成メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体、およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される使用を含む。本発明は、哺乳類、特にヒトの治療のための上述した使用に関する。
【0011】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの1つとしてのメンバーおよび融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としてのIRFファミリーのメンバーをコードし、融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得、特に、遺伝子構築物は、IRF−1/hER融合タンパク質の発現をコードし、その活性がエストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る使用を含む。
【0012】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される使用を含む。
【0013】
本発明の特徴的な態様は、化学的または物理的活性化により、例えば、加熱または放射線照射により、スイッチを入れられ得る上述したタンパク質の発現より成る。さらなる特徴的な態様は、上記タンパク質の発現であって、発現は、調節可能プロモーターにより、例えば、外的刺激、特にテトラサイクリンにより、スイッチを切り替えられ得る発現により成る。
【0014】
本発明の有利な実施形態は、先行の請求項のうちの1つまたは複数に記載される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の1つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の抗原と一緒に含むワクチンから成る。本実施形態の利点は、腫瘍細胞の使用を避けることにから成る。ワクチン接種は、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを単に施すことによって実行することができ、抗原コード配列(単数または複数)は別個のベクターを用いて提供され、またワクチン接種は、すべての構成成分を提供するベクターを施すことにより、またはポリシストロン発現ユニットを施すことにより実行することができる。さらなる有利な実施形態は、上述したワクチンであって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび抗原コード配列(単数または複数)がウイルスまたは細菌担体として提供されるワクチンを含む。
【0015】
本発明の他の実施形態は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための調製物の製造のための上述した使用から成る。
【0016】
さらに、他の実施形態は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のためのIRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらから成る融合タンパク質であって、特に、IRF−1がその構成成分の1つであり、および/またはhERが融合タンパク質の他の構成成分である融合タンパク質に関する。
【0017】
本発明は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のためのIRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらからなる融合タンパク質からなるかまたは含む予防的および/または治療的組成物であって、特に、IRF−1が融合タンパク質の構成成分の1つであり、および/またはhERがその構成成分のその他の構成成分である、予防的および/または治療的組成物をさらに含む。
【0018】
さらに、本発明は、IRFファミリーのメンバーの発現のための上述した遺伝子構築物またはポリヌクレオチドがex vivoでチャージ(charge)されたヒト細胞、好ましくは、遺伝子移入、物理的形質導入、より好ましくは電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされたヒト細胞に関する。上述したヒト細胞は、自系または同種異系細胞であり得る。さらに、上述したヒト細胞は、腫瘍細胞、特に癌細胞、より好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍であり得る。付加的に、上述したヒト細胞は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種に適する。
【0019】
本発明の好ましい有益な実施形態は、予防接種の実施形態に記述された1つまたは複数の遺伝子を用いて、遺伝子移入、物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入を施されたヒト抗原提示細胞(APC)に関する。
【0020】
最後に本発明は、IRFファミリーのメンバーの活性レベルがインターフェロン−βにより誘導されるIRF−1のレベルより高い上記のようなヒト細胞の実施形態を含有する。
【0021】
本発明の目的、その種々の特徴ならびに本発明それ自体は、添付の図/図面を参照しながら読むと、以下の説明からさらに十分に理解され得る。
【0022】
以下において、実施例および図面を参照しながら本発明をより詳細に開示する。しかしながら記載される特定の形態または好ましい実施形態は、すべての点で、本発明を説明するためであって、本発明を制限するものではなく、本発明の範囲は以下の説明ではなく添付の特許請求の範囲により指示され、したがって特許請求の範囲と均等の意味および範囲内であるすべての変更がその中に包含されるよう意図される。
【0023】
材料および方法
ベクター構築:
pBTTAHis:ヒスチジジノール遺伝子を含有するBbrPI/NotI断片をpDAF2HISから単離し(Spitzer et al., 1998)、対応する制限プラスミドpRBTtTA中に挿入した(Unsinger et al., 2001)。その結果生じたプラスミドをpBTTAHisと呼ぶ。Hepa1〜6細胞の安定的トランスフェクションのために、発現構築物IRF−1−hER(4)(pMT7RF−1−hER)およびプロマイシン耐性付与プラスミド(42)を本発明者等は用いた。pHBTMRS:三シストロン発現カセットとしてc−myc、c−Ha−rasおよびSEAP遺伝子を含有するEcoRI/NotI断片を、pRBTからの二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターの3’末端上に挿入した(Unsinger et al., 2001)。ヒロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼをPCR増幅し、pRBTMRS中の二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターからのPmeI 5’を介して挿入し、pHBTMRSを生じた(Kroger, 1999)。
【0024】
pCMVIHEG:IRF−1hER融合タンパク質遺伝子およびポリオIRES配列を含有するSpeI/EcoRI断片をCMVプロモーターおよびeGFP遺伝子間に挿入して、二シストロンmRNA上のIRF−1hERおよびeGEPを発現するプラスミドを生じた。pCMVIH:ポリオIRESおよびeGFPをコードする配列を、PmaCI/HpaIを用いたpCMVIHEGの消化および再連結により排除した。pLTR−TBTIHEG:IRF−1−hERおよびeGFPに関する二シストロン発現カセットを含有するPmeI/NotI断片を、対応して制限されたLTR−THTG中に挿入し(Unsinger et al., 2002)、pLTR−TBTIHEGを生じた。
【0025】
アデノウイルスコスミドの調製:
Ad−IH、Ad−IHEG、Ad−IHEGinv、Ad−LTR−TBTIHEG、Ad−LTR−TBTIHEGinv:組換えアデノウイルスを、大腸菌(E. coli)中でのクローニングにより組換えアデノウイルスゲノムの直接アセンブリーを可能にするコスミドクローニング手順を用いて構築した。コスミドベクターpAdcos45(Unsinger et al., 2002)をE1領域の単一クローニング部位でXbaIを用いて消化し、充填した。以下のカセットをこの部位に挿入した:PmeI/SwaI断片としてのpCMVIHEGのCMVIHEGカセット、BsrBI/FspI断片としてのpLTR−TBTIHEGのLTR−TBTIHEGおよびPme/SwaI断片としてのpCMVIHからのCMVIHカセット。DNAを連結し、パッケージング抽出物を用いてin vitroでパッケージングした。大腸菌DH5α中への形質導入後に、アンピシリン耐性クローンを単離した。大腸菌中でのin vitroパッケージングおよび増殖後に、Ad−IH、Ad−IHEG、Ad−IHEGinv、Ad−LTR−TBTIHEG、Ad−LTR−TBTIHEGinvのためのコスミド調製物を得た。制限分析は、予測された構造を確証した。
【0026】
細胞培養および遺伝子形質導入:
ネズミ繊維芽細胞NIH3T3細胞(ATCC CRL−1658)をダルベッコの変法イーグル培地(DMEM)中に保持し、Hepa1〜6細胞(ネズミH−2b−制限HCC細胞系;92110305;動物細胞培養の欧州コレクション(European Collection of Animal Cell Cultures))をRPMI1640培地中で成長させ、293細胞(低継代でのヒト胚腎細胞;ミクロビックス(Microbix)PD−02−01)を最少必須培地(MEM)中で培養した。培地に、10%エストロゲン無含有熱不活性化ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミンペニシリン(10U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充した。トランスフェクトNIH3T3細胞を128U/mlのハイグロマイシンB、800μg/mlのヒスチジノールまたは800μg/mlのG418を用いて選択した。Hepa1〜6細胞の選択のためには、1μg/mlプロマイシンを用いた。
【0027】
pBTTAHis、pHBTMRS、pMT7IRH−1−hERおよびネオマイシン耐性付与プラスミドpAG60を用いて、NIH3T3細胞を安定的に同時トランスフェクトした(Colbere et al., 1981)。Hepa1〜6細胞は、IRF−1−hERをコードする発現構築物(4)およびプロマイシン耐性付与プラスミド(42)を用いて安定的に同時トランスフェクトした。トランスフェクタントを選択し、単一クローンを採取し展開させた。その後、ウエスタンブロットによりタンパク質発現に関してクローンをスクリーニングした。
【0028】
組換えアデノウイルスの産生
組換えアデノウイルスの産生のために、リン酸カルシウム共沈殿を用いて、環状アデノウイルスコスミドDNA20μgを293ヘルパー細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後10〜14日目に、この時点でアデノウイルスプラークの形成が明白になった。ウイルスを収集し、293細胞を再感染させた。細胞変性作用が観察された後、ウイルス粒子を収集し、293細胞の感染により力価を確定した。DNA(Graham et al., 1991)は、予期された構造を確認するものであった。すなわち、コスミドDNAからのウイルス配列の精確な切除を制限分析により制御した。アデノウイルス感染のために、細胞をMEM培地中に播種した。翌日、100(Hepa1〜6細胞)または2(293細胞)のMOIを用いて、細胞を感染させた。2%FCSを補充したPBS 1ml中で組換えアデノウイルスを希釈した。アデノウイルス感染の1時間後に、5%FCSを補充した培地中で細胞をさらに培養した。
【0029】
IRF−1−hER融合タンパク質中のIRF−1の活性化のために、最終濃度が1μMに達するまでE2(SERVA, Frankfurt, Germany)を細胞培地に添加した。
【0030】
ウエスタンブロッティング。 全細胞抽出物から得られるイムノブロットを、ヒトエストロゲン受容体(HC−30、Santa Crutz Biotechnology, USA)のホルモン結合ドメインに対して誘導される抗体を用いてプローブし、メーカーの使用説明書に従ってECL(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)により可視化した。
【0031】
IFN試験。 マウスL929細胞(43)を用いた抗ウイルスアッセイにより、細胞培養上清中のインターフェロン濃度を確定した。抗ウイルス活性の特異性を確証するために、試験細胞への添加前に、マウスIFN−βに対して向けられる中和モノクローナル抗体を上清に添加した。
【0032】
細胞成長の測定。 細胞増殖の確定のために、2×103細胞/ウェルをマイクロタイタープレート中に播種して、段階希釈(1:1)を実施し、数個の別々の測定点を可能にした。細胞を指示濃度のβ−エストラジオールで処置した。メーカーの指示に従ってWSTキット(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を用いて、細胞成長を測定した。10%未満の偏差を生じる三重反復試験の平均値をプロットした。
【0033】
足場非依存性成長に関するアッセイ。 軟寒天中に懸濁した細胞のコロニー形成効率を評価することにより、足場非依存性増殖能力を確定した。0.6%下張り寒天(underlay agar)50μlで被覆したマイクロタイタープレート中の0.3%上塗り寒天(overlay agar)50μl中に、1×103細胞を播種した。誘導培地を上部に添加した(50μl/ウェル)。平板培養後3週間目に、コロニーを計数した。
【0034】
マウス。 雄C57L/J(H−2b)マウスをフライブルク大学病院(University Hospital Freiburg)の動物施設で飼育して、10〜25週齢で使用した。
【0035】
ヌードマウス実験
雄6〜8週齢NMRIヌードマウス(Harlan Winkelmann, Borchen, Germany)を、ドイツバイオテクノロジー研究センター(German Research Centre for Biotechnology)の動物施設のSPFユニットで飼育した。マウスを各群5匹の2つの実験群に分けた。0.2mlのPBS NIH3T3TA/MR/IH細胞中の1×106細胞をマウスの側腹部に皮下注射した。群を以下のように処置した:群1:未処置(n=5);群2:1.5mgのE2を2日毎にi.p.(n=4)。腫瘍容積を、カリパスを用いて週3回測定し、記録した。データは腫瘍容積の平均値として示す。
【0036】
腫瘍モデル。 同系ホスト中で確実な成長を示すので、C57L/JマウスにおけるHepa1〜6腫瘍モデル(44)を選択した。Hepa1〜6細胞は、C57Lマウスに生じたBW7756マウス肝癌の派生物である。MHCクラスIおよびII発現は、C57LおよびC57L/Jマウス間で同一であり、Hepa1〜6HCCはAFP発現により特徴付けられる。マウスの右側腹部に100μlの血清無含有MEM培地中で注射される1×107または5×106個のHepa1〜6細胞を用いて、100%のマウスにおけるHepa1〜6ネズミHCC細胞の確実な腫瘍成長が達成されることが実証され得た。6日後、腫瘍が可視的になり、平均で18日後に約2000mm3のサイズに達した。この腫瘍サイズを本発明における終点として用いて、その後、マウスを屠殺した。腫瘍発生率および容積を、カリパスを用いて2日毎に評価した。データは、平均容積+/−SEとして示す。
【0037】
フローサイトメトリー。 抗マウスH−2Kb/H−2Dbおよび抗マウスCD80特異的抗体(それぞれクローン28−8−6および01940B)を、およびその後のFITC−標識抗マウス(クローン02014D)またはFITC−標識抗ラット(クローン10094D)抗体それぞれを用いたFACS分析により、Hepa1〜6およびHepaIRF−1hER細胞中でのMHCクラスIおよびCD80発現を調べた。さらに、PE−またはFITC−標識抗体(抗体はすべて、PharMingen, San Diego, CA, USAから得られた)により、CD54(クローン01544D)、I−A/I−E(クローン06355A)およびCD86(クローン09274)の発現を確定した。
【0038】
組換えワクシニアウイルスの生成。 CTL応答を試験するために、AFP発現およびpSc11(空ベクター陰性対照)組換えワクシニアウイルスを前に記載された(44)ように生成した。
【0039】
細胞傷害性アッセイ。 腫瘍攻撃または対照マウスから得られた脾臓細胞を懸濁し、24ウェルプレート中でのin vitro刺激の6日後に、細胞傷害活性に関して脾臓細胞を分析した。1×107の野生型Hepa1〜6細胞を用いて、または特異性に関する陰性対照として、同系ルイス肺癌細胞(3LL)を用いて(ともに8000radで照射)、4×107の腫瘍で初回抗原刺激した脾臓細胞をインキュベートすることにより、in vitro刺激を実施した。AFP特異的免疫応答を評価するために、未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞を用いて、腫瘍攻撃または対照マウス由来の脾臓細胞をin vitroで刺激した。未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞は、感染多重度(MOI)5で、UV−不活性化(300mJ)rVV−AFPにより、または特異性に関する陰性対照として、rVV−pSC11を感染させ、次に20Gy(2000rad)で照射して刺激細胞の増殖を防止した。その後、6時間51Cr放出アッセイを実施した。標的細胞として、AFP発現同系Hepa1〜6細胞およびAFP陰性同系ルイス肺癌細胞を用いた。結果は、次式により表した:溶解%=(実験的放出−自発性放出)/(最大放出−自発性放出)。実験的放出は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞により放出される平均数/分を表す。総放出は、5%トリトンX−100による標的細胞の全体的溶解後に放出された放射能を表す。自発性放出は、標的細胞のみに由来する培地中に存在する放射能を表す。Hepa1〜6腫瘍またはmAFP特異的溶解は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより示された。
【0040】
IFN−γおよびIL−4ELISPOTアッセイ。 多重スクリーン−HA96ウェルフィルタープレートを、4℃で一晩、4μg/mlのラット抗マウスIFN−γまたはラット抗マウスIL−4抗体(PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンR46A2または18191A)で被覆した。腫瘍攻撃または非攻撃マウス由来の脾臓細胞(1×105/ウェル)を、200μlの培地中の1×104照射刺激細胞(Hepa1〜6、3LLまたはrVV−AFP感染脾臓細胞)/ウェルを用いて20時間、三重反復試験で培養した。培養後、細胞を洗浄し、2μg/mlのビオチン化ラット抗マウスIFN−γまたはIL−4抗体(PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンXMG1.2または18042D)を添加し、プレートを室温で3時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼポリマー(Mabtech, Koln, Germany)の1:1000希釈液を用いて室温で30分間インキュベートし、次に、ALP接合基質溶液(BCIP/NBT, BioRad, Richmond, USA)で展開した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数と比較したスポット形成細胞の数として表される。特異性に関する対照として、腫瘍攻撃マウスの脾臓細胞および異なる照射刺激細胞を単独で培養した。
【0041】
in vivo腫瘍実験の実験計画
腫瘍防御試験。 C57L/Jマウスの右側腹部に1×107Hepa1〜6(群1および2)またはHepaIRF−1hER(群3および4)細胞を接種した。群5にはいかなる腫瘍も接種しなかった。それぞれの群を以下のように処置した:
【0042】
【表1】
【0043】
再攻撃に対する防御。 ナイーブC57L/JマウスまたはHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して防御されたことのあるE2処置動物を、E2処置停止後11日目(初期腫瘍接種後28日目)に、1×107個の野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER(n=3)腫瘍細胞を用いて再攻撃した。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。
【0044】
腫瘍療法。 C57L/Jマウスの右側腹部に1×107個のHepaIRF−1hER(群1および2)細胞を接種した。両群とも、いかなるE2処置も受けなかった。19日目に、腫瘍は両群において約2000mm3のサイズに達した。19日目に開始して、群2(n=6)には、2日毎に28日目まで、1.5mgのβ−エストラジオールをi.p.注射した。その後、E2処置を2匹のマウスにおいては再び中止したが、一方、残りの4匹はE2療法を維持した。群1(n=3)のマウスはE2処置を受けなかったが、その後、腫瘍が10,000mm3に達した場合に屠殺した。
【0045】
in vivoモノクローナル抗体除去。 精製ハイブリドーマ上清のi.p.注射により、CD4およびCD8 T細胞亜集団を枯渇させた。総量1mg/マウス/注射の抗CD8(クローンYTS169)または抗CD4(クローンYTS191.1)(45、46)を、HepaIRF−1hER腫瘍接種の5日前、3日前および1日前、ならびにその後5日毎に注射した。種々の群を以下のように処置した:
【0046】
【表2】
【0047】
統計学的分析。 データはすべて、ウィルコクソンの符号付順位検定により分析した。0.05未満の両面p値は、統計学的に有意であると考えられた。腫瘍出現および2500mm3への成長をカプラン−マイアー法により算定し、各群に関する平均の標準偏差として示して、免疫接種マウスと対照マウス間の差異をマンテル−ヘンツェル検定により算定した。
【0048】
結果
in vitro分析
IRF−1はHCC細胞系Hepa1〜6の細胞成長を阻害する
IRF−1の構成的発現は、いくつかの細胞系に強力な細胞増殖阻害を強いる(4、24、40)。これは、異種IRF−1の非常に低い、しばしば不安定な発現に関して選択される安定トランスフェクタントを生じる。HCC細胞系Hepa1〜6の成長阻害剤としてのIRF−1の活性を確定するために、本発明者等は、したがって、条件付活性IRF−1hER融合タンパク質を用いた。ホルモン刺激の非存在下で、構成的発現キメラタンパク質は不活性であるが、タンパク質のhER部分とのE2の結合時に、活性配座に変わり得ることが実証された。IRF−1−hERは、Hepa1〜6細胞中で安定的にトランスフェクトされた。異なるレベルのIRF−1hER発現がトランスフェクタントで観察され(図1A、上パネル)、アクチン発現(図1A、下パネル)に正規化された。異なる強度のIRF−1hER発現を有する3つの細胞クローンを選択した(c4、c9、c22)。これらのクローンの細胞成長を、IRF−1活性化後7日目に確定した。図1Bに示したように、3つの細胞クローン由来の細胞は、増殖阻害に関してIRF−1活性に感受性であった。増殖阻害の程度は、異なる細胞クローン間で40〜80%変化し、異なる発現量のIRF−1と相関した。IRF−1−hERを発現しない野生型Hepa1〜6細胞を、対照として用いた。非トランスフェクト細胞系は細胞成長の変更を伴ってβ−エストラジオールに対して応答しなかった。これは、3つの細胞クローンすべてが活性化可能IRF−1を発現し、IRF−1表現型の典型的成長阻害特性に応答したことを示す。しかしながらHepa1〜6細胞の増殖阻害は、他の細胞系と比較した場合、非常に強力であるというわけではない(24)ことに留意すべきである。細胞増殖の低減にもかかわらず、細胞はこの状態でかなりの時間培養され得た。さらにこれらの細胞は、β−エストラジオールによるIRF−1活性化時にアポトーシスのいかなる兆候も示さなかった。これは、亜二倍体DNA((47)、データは示されていない)およびアネキシン染色((48)、データは示されていない)の実験により確証された。
【0049】
活性化IRF−1はIFN分泌を誘導する
IFN−βの誘導は、IRF−1活性化後に観察される典型的特性である。分泌IFN−βの量は、IRF−1活性の測定値とみなされ得る(17)。IFNは免疫調節に関連があるため、抗ウイルスアッセイによりIFN−βの分泌を確定した(表1)。IRF−1は、3つの細胞クローンすべてにおいて、β−エストラジオールにより活性化されることが示された。最高IFN分泌は、クローン22により示されたが、これは、IRF−1発現の強度(図1A)および増殖阻害(図1B)と一致する。IFN−βに対して誘導される中和抗体を用いて、分泌抗ウイルス活性が専らIFN−βであることを本発明者等は確認するものであった。IFNは、細胞増殖を阻害することが既知である。しかしながらHepa1〜6細胞クローンにより分泌されるIFN−βの量は、匹敵する量の組換えネズミIFN−βによる対照細胞の処置により確定されるように細胞成長に及ぼす観察された作用を媒介するのに十分でない(データは示されていない)。
【0050】
IRF−1活性化中の足場非依存性成長の低減
腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞と区別する最も決定的なin vitro特徴は、足場非依存性成長である。IRF−1がin vitroでのこのHCC細胞系の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、不活性または活性IRF−1の存在下で足場非依存性コロニーを形成するその能力を、本発明者等は試験した(図2)。非トランスフェクト腫瘍細胞クローンは、軟寒天中で良好に増殖した。IRF−1hERを発現しない形質転換野生型Hepa1〜6細胞系のコロニー形成は、β−エストラジオールにより影響されなかった。対照的に、軟寒天成長の能力は、異なる細胞クローン中では、活性化IRF−1により有意に低減された。非トランスフェクト細胞と対照的に、IRF−1hER保有細胞はより少ないが、しかしやや大きいコロニーを形成した。E2の存在下では、クローン22は軟寒天中で最低量のコロニーを形成したが、これはIRF−1hER発現の強度と逆相関する。クローン9は、E2処置細胞を上回る最高比率の、非処置細胞からの軟寒天コロニー形成を示した。したがってクローンc9(以下で簡単にHepaIRF−1hERと示す)を、さらなるin vitro特性化のために、かつin vivo腫瘍モデルのために用いた。
【0051】
活性化IRF−1hERは免疫学的に関連がある細胞表面タンパク質発現を調整する
IRF−1発現は、MHC遺伝子の発現を増大することが既に示されている(7、31)。FACS分析により、−エストラジオールによるIRF−1活性化の前後の細胞表面におけるMHCクラスI、MHCクラスII、CD54、CD80、およびCD86発現のレベルを、本発明者等は調べた。野生型Hepa1〜6およびE2未処置HepaIRF−1hER細胞は、MHCクラスII、CD80、およびCD86発現の欠如により特性化された。MHCクラスI(H−2Kb/H−2Db)は低レベルで、CD54は高レベルで発現された。HepaIRF−1hER細胞のE2処置はH−2Kb/H−2Dbの強力な上向き調節を生じ、CD54発現は依然として変化せず、MHCクラスII発現は弱く上向き調節された(図3)。CD80およびCD86発現は、陰性のままであった(データは示されていない)。
【0052】
IRF−1のアデノウイルス媒介性発現はHCC細胞の強力なIFN−β分泌をもたらす
広範囲の細胞中にIRF−1を移入するために、かつin vivo形質導入のための送達系として、IRF−1−hER融合タンパク質のためのpAdcos45含有発現カセットに基づいたアデノウイルスベクターを構築した。IRF−1−hERのcDNAをアデノウイルスベクターpAdcos45中に導入し、ウイルスを調製した。
【0053】
Hepa1〜6細胞をpAd−1H、pAd−IHEG、pAd−LTR−TBTIHEGおよびpAd−LTR−TBTIHEGinvウイルスで感染させた(図4A)。感染の48時間後に、ウエスタンブロット分析によりIRF−1−hER発現を分析した。これらのアデノウイルスに感染した細胞中で、高レベルのIRF−1hER発現が見出された(図4B)。感染細胞のE2処置または偽処置後に、IFN分泌を測定した。E2処置後にIRF−1 hER遺伝子を含有するアデノウイルスで感染させた細胞の培養上清中にIFNを検出したが、これは、IRF−1活性化のみがIFN分泌を誘導するが、感染自体では誘導しないことを示す(表2)。アデノウイルス性形質導入細胞における分泌IFNの量は、IRF−1hER融合タンパク質を安定的に発現するトランスフェクタントより3.5〜6倍多かった。
【0054】
IRF−1は癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞中で作用する
癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞中のIRF−1の作用を調べた。癌遺伝子c−mycおよびc−Ha−rasを条件付で発現するNIH3T3細胞を用いた。両癌遺伝子は、テトラサイクリン調節可能プロモーターの制御下で二シストロン的に発現された(Kroger, Dissertation, Universitat Braunschweig, 1999)。細胞は、IRF−1−hER融合タンパク質コード構築物で安定的にトランスフェクトされた。この細胞系は、非形質転換NIH3T3細胞中(ドキシサイクリンの存在下)での、ならびに細胞の形質転換状態(ドキシサイクリンの非存在下)でのIRF−1作用の研究を可能にする。IRF−1のin vitroでの抗腫瘍活性を調べた:増殖に及ぼす影響、軟寒天成長、ならびにE2処置によるIRF−1hER活性化を伴うおよび伴わないIFN誘導を測定した。これは、非形質転換状態ならびに形質転換状態で行われた。E2およびドキシサイクリンを5日間添加した。E2の非存在下での形質転換細胞は細胞成長の強化を示すという事実にもかかわらず、活性化IRF−1−hERは、非形質転換細胞および形質転換細胞の両方で、細胞成長の顕著な低減を同程度にもたらした(表3)。
【0055】
IRF−1が細胞の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、軟寒天中のコロニーの形成をアッセイした。非形質転換状態の細胞は、軟寒天中で成長しなかった。対照的に、ドキシサイクリン(形質転換状態)の非存在下では、細胞は良好に成長し、軟寒天クローンを形成した。軟寒天増殖の能力は、E2贈与によるIRF−1の活性化により完全に撤廃された(表3)。抗ウイルスアッセイにより確定した場合のIFN分泌は、IRF−1活性の測定値とみなされた。E2処置によるIRF−1活性化は、非形質転換細胞および形質転換細胞において等価であると実証された(表3)。
【0056】
IRF−1活性化はヌードマウスにおける形質転換細胞の腫瘍成長を低減する
IRF−1は癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞においてin vitroで細胞形質転換を阻害したので、in vivoでの腫瘍原性に及ぼすその作用を評価した。IRF−1の考え得る抗腫瘍活性を立証するために、細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍形成をアッセイした。形質転換細胞の注射は4週間以内に腫瘍形成をもたらし、移植された動物の100%が6週間以内に腫瘍を発症した(図5)。マウスに形質転換細胞を接種し、E2で処置した場合、腫瘍成長の動態は劇的に変化した。1500mm3までの腫瘍サイズに達したのは未処置動物の場合より4週間遅く、E2処置マウスの40%が腫瘍を発症しなかった。これらの結果は、IRF−1hER融合タンパク質の活性化が、TおよびB細胞を欠く動物の形質転換細胞における腫瘍原性の動態を延長するのに十分であることを実証する。
【0057】
in vivo分析
IRF−1活性化はHCC成長を阻害する
C57L/Jマウスにおいて皮下で成長するネズミHepa1〜6HCCに対するIRF−1hER発現の抗腫瘍効力を確定するために、異なる処置群を無作為に計画した。同系C57L/Jマウスにおける腫瘍モデルのために用いられたHepa1〜6HCC細胞系は、中等度に速い腫瘍成長により特徴付けられ、移植された動物の100%が腫瘍を発症した。野生型Hepa1〜6およびHepaIRF−1hER細胞はともに、in vivo s.c.注射後にほぼ同一の腫瘍原性を示したが、これは、E2非処置HepaIRF−1hER細胞中の不活性IRF−1hER融合タンパク質の存在を示唆する(図6A、p>0.5)。17日以内に、大型腫瘍が発症し、平均サイズは1500mm3であった。野生型Hepa1〜6細胞を接種したマウスをE2で処置した場合、E2処置を伴わずにHepa1〜6またはHepaIRF−1hER細胞で攻撃されたマウスと比較して、腫瘍発症に及ぼす作用はまったく観察されなかった。これらの結果は、E2処置それ自体が腫瘍成長および動物の健康に及ぼす負の作用を有さないことを実証する。しかしながらHepaIRF−1hERを接種されたC57L/Jマウスが腫瘍接種の時点で開始するE2による2日毎のi.p.注射を受けた場合、腫瘍成長はかなり抑制された。8匹の動物のうちの6匹の動物が腫瘍成長に対して完全に防御され、2匹の動物が遅い増殖速度により特徴付けられる非常に小さい腫瘍のみを発症したことは重要な知見であった(図6A)。40日後、腫瘍サイズは450mm3に過ぎず、42日目にE2処置を中止しても、腫瘍の増殖速度が速まることはなかった。
【0058】
腫瘍細胞におけるIRF−1活性化は、T細胞記憶を誘導する
HepaIRF−1hERによる攻撃に対して防御されたE2処置マウスにおける腫瘍特異的記憶T細胞の存在を調べることに、本発明者等は興味を持った。したがって、腫瘍攻撃後28日目およびE2処置中止後11日目に、腫瘍無含有マウスに1×107個の野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER細胞(n=3)を接種した。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。図6Bに示したように、両群のマウスはすべて腫瘍成長に対して防御されたが、しかしCD8+T細胞in vivo枯渇後は防御されなかった(n=2、データは示されていない)。対照的に、E2処置を伴わないナイーブC57L/Jマウスは、迅速なHepa1〜6およびHepaIRF−1hER腫瘍成長により特徴付けられた。これらの結果は、活性IRF−1hERの発現による腫瘍特異的免疫性の初回抗原刺激後の腫瘍特異的T細胞記憶の存在を示唆する。
【0059】
IRF−1活性化腫瘍細胞によるCTL活性の誘導
実際、照射Hepa1〜6細胞を用いたin vitro刺激後のHepa1〜6標的細胞に対する強力なCTL活性は、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃され、かつE2で処置されたマウスにおいて観察された(図7A)。腫瘍攻撃されなかったマウスから、あるいはHepaIRF−1hER細胞で攻撃され、3LL細胞でin vitro刺激されたE2処置マウス由来の脾臓細胞がHepa1〜6標的に対する弱いバックグラウンド殺害活性のみを示したため、このCTL活性はHepa1〜6腫瘍細胞に対して特異的であった(図7A)。In vivoでサイトカイン産生細胞をモニタリングすることにより、一次T細胞応答を評価した。照射Hepa1〜6細胞による刺激時のIFN−γ(5,000のうち1)およびIL−4(10,000のうち1)を分泌する脾臓細胞の数の有意の増大(図7B)は、E2非処置/HepaIRF−1hER、E2非処置/Hepa1〜6、またはE2処置/Hepa1〜6攻撃マウスと比較して、HepaIRF−1hER腫瘍を接種されたE2処置マウスにおいて観察された(20,000IFN−γのうち1および40,000IL−4分泌T細胞のうち1、p=0.01)が、このことは、TH1およびTH2腫瘍免疫性の両方の有意の発症を示唆する。エリスポット(ELISPOT)分析により得られたin vivo結果とは対照的に、51Cr放出アッセイ(図7A)におけるCTL in vitro殺害活性の差は、異なる群間で統計学的に有意でなかった。これは、エリスポット(ELISPOT)技法と比較した場合の、腫瘍特異的T細胞のin vitro展開、ならびに51Cr放出アッセイのより低い感受性の結果であり得る。
【0060】
IRF−1活性化は腫瘍特異的自己抗原無視を打破する
より詳細にHCCに対する免疫応答を確定し、活性化IRF−1の発現が腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を初回抗原刺激し得たか否かを見出すために、標的としてHCC細胞中で高レベルでしばしば発現されるHCC特異的自己抗原AFPを本発明者等は選択する。高レベルでAFPを内因的に発現するHepa1〜6HCCに対する中間体CTL活性は、E2処置/HepaIRF−1hER攻撃マウスで観察された(図8A)。他の群(1,000,000のうち1)と比較した場合、これらのマウスにおいては、CTL活性は有意に強く(p=0.02)、AFP特異的IFN−γ(図8B)産生脾臓細胞(11,000のうち1)の数はより多かった(p=0.001)。腫瘍を伴わない対照動物においては、特異的CTL活性またはHepa1〜6または3LL標的細胞に対するバックグラウンド溶解強化は観察されなかった。さらに、これらの標的細胞の溶解の増大は、HepaIRF−1hER細胞で攻撃されたE2処置マウス由来のrVV−pSC11によるエフェクター細胞のin vitro刺激後に認められず、これは、AFPに対するCTL活性の特異性を示唆する(図8A)。エフェクターを伴わないrVV−AFP感染脾臓細胞単独を用いた、あるいはエフェクターのみを用いたエリスポットの実施はバックグラウンドスポット形成の増加を生じなかったが、これはさらに、AFP特異性を示唆する(データは示されていない)。これらのデータは、HCC腫瘍成長制御におそらくは関与するメカニズムである自己抗原AFPに対する耐性が活性化IRF−1の腫瘍内発現により破壊され得ることを実証する。
【0061】
ホスト免疫応答ではない他の因子はIRF−1活性化腫瘍細胞の拒絶に関与する
ホスト抗腫瘍免疫応答が腫瘍拒絶に関与する唯一のパラメーターであるか否かを確定するために、in vivoでのT細胞枯渇実験をHepaIRF−1hER腫瘍を用いて攻撃されたE2処置マウスで実施した(図9A)。非枯渇マウスは、腫瘍成長に対して再び防御された。CD4およびCD8 T細胞枯渇はともに、すべてのマウスにおいて腫瘍成長を生じたが、しかしながらこれはE2処置を受けなかった非枯渇マウスと比較して、有意に遅延されていた。この知見は、ホスト免疫応答が腫瘍防御における重要な因子であるということを暗に意味するが、腫瘍成長の初期制御においては部分的なものに過ぎないと思われる。
【0062】
IRF−1活性化は活発に成長する腫瘍の増大を停止する
E2非処置C57L/Jマウスにおいて皮下で成長中のHepaIRF−1hER HCCに対するIRF−1hER活性化の治療的効力を評価するために、腫瘍攻撃後19日目にE2処置を開始した。この時点で、腫瘍は約2000mm3の平均サイズに達していた。図9Bに示したように、腫瘍成長はE2処置の開始後4日目という早期に恒久的に停止されたが、これは、HCCに対するIRF−1活性化の有意の治療的な可能性を実証する。対照的に、HepaIRF−1hER腫瘍はE2非処置マウスにおいて急速に増殖した。9日間のE2処置は、長期腫瘍成長制御を誘導するのに十分であった。これは、E2処置が28日目に再び中止された6匹のE2処置マウスのうちの2匹において容易に実証された。これらのマウスにおける腫瘍成長は、二日毎のE2注射を受け続けたマウスと比較して、異ならなかった。
【0063】
一側腹部における腫瘍のIRF−1活性化は両側腹部の腫瘍成長に影響を及ぼす
腫瘍に対する治療的ワクチンとしてのIRF−1活性化の効力を調べた。マウスの右側腹部にHepaIRF−1hER細胞を皮下注射し、野生型Hepa1〜6細胞を左側腹部に注射した。動物を1.5mgのE2で2日毎に処置するか、または非処置のままにした。IRF−1−hERの活性化は、マウスの右側腹部のHepaIRF−1hER細胞の腫瘍成長を撤廃した。さらに、左側腹部に野生型Hepa1〜6の腫瘍成長も、1日目に開始されたHepa1〜6腫瘍成長と比較して低減されたが、それが非処置動物において起きたようなさらなる展開は抑制された。
【0064】
考察
HCCは、予後は不十分で、治療的意見も少なく非常に悪性の腫瘍である。IRF−1の活性化を意図する新規の免疫療法的アプローチを検討した。β−エストラジオールの存在下で活性になるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするネズミHCC細胞系(HepaIRF−1hER)を構築した。in vitro表現型、細胞成長、in vitroでの足場非依存性成長、in vivoでの免疫原性、およびIRF−1の治療的な可能性をすべて調べた.安定的構成的IRF−1発現は、低発現クローンを選択するという欠点を有する。このような細胞系における実際的導入遺伝子発現は、内因性IRF−1発現の多くを無効にするというわけではない。さらに構成的発現は、長期に亘ってIRF−1応答性の損失に対する選択を誘導する(4、40)。対照的に、本発明に用いられる活性化可能IRF−1hER系は、IRF−1活性の厳密な調節を可能にし、腫瘍細胞中でかなり高レベルのIRF−1を発現させる。E2(E2=β−エストラジオール)活性化可能系は広範に研究されており、野生型IRF−1遺伝子のテトラサイクリン調節性転写活性化とも比較されてきた。差異は見出されなかった(Kirchhoff et al., 1995; Koster et al., 1995)。突然変異体エストラジオール受容体遺伝子(49)の使用のために、融合タンパク質は、低エストラジオール濃度に対して無反応性であり、したがって内因性エストロゲンレベルにより活性化されることなくマウスにおいて用いられ得る。しかしながらIRF−1hERのそれぞれのタモキシフェン特異的突然変異体(50)は、IRF−1活性の厳密な調節を示さなかった(A. Kroger、未発表)。したがってβ−エストラジオール誘導系を用いて、IRF−1の抗腫瘍作用をより詳細に本発明者等は取り扱い、かつその異なる抗腫瘍性エフェクターアームの活性化を分析し得た。
【0065】
Hepa1〜6細胞の成長および形質転換の阻害をin vitroで実証し、IRF−1の先天免疫活性に帰すべき特性を確証した。異所性IRF−1発現は、myc、fosB(29)、IRF−2(51、52)、EGFRおよびEla/b(24)のような異なる癌遺伝子により誘導される細胞形質転換特性をin vitroで抑制する。野生型細胞中のc−Ha−ras癌遺伝子の発現が成長制限条件下で細胞にアポトーシスを被らせるがIRF−1−/−細胞中ではそうではないIRF−1−/−マウスからの胚性繊維芽細胞を用いて早期に得られた結果(Tanaka et al., 1994)の通りに、NIH3T3細胞におけるEGFRおよびIRF−1の組合せ活性は、アポトーシスによる有意の細胞死を誘導することが示された(24)。しかしながらこの報告に提示されたデータは、in vitroでの癌遺伝子依存性腫瘍抑制がアポトーシスにより媒介される必要がないことを示す。したがって形質転換阻害のその他のメカニズムが働くことが予測される。IRF−1は、形質転換阻害に寄与し得る多数の遺伝子のDNA結合およびトランス活性化によりその作用を発揮する。それらの例としては、リシルオキシダーゼ(16)、PKR(17、53)、2’−5’OASE(18)、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(19)、およびII型アンギオテンシン受容体(20)がある。この状況でのIFN−β分泌の役割は明らかでないが、これらの遺伝子のフィードバックエンハンサーとして作用し得る。
【0066】
IRF−1は、いくつかのその他の関連するin vivo抗腫瘍活性を有する。これらは、IRF−1の免疫調節作用、例えばヘルパーTおよびNK細胞の刺激(54、55)、MHC遺伝子(4、31、56、57)の、ならびに抗原提示に関与する遺伝子(38、58)の転写の強化によるものである。したがってIRF−1の発現または活性を強化するほとんどの事象または薬剤が、形質転換細胞の特異的殺害を誘導することにより癌療法に有用であり得る。実際、マウスにおける実験が記載され、攻撃的非免疫原性肉腫細胞におけるIRF−1の発現が悪性表現型を抑制することが実証されている(40)。
【0067】
高腫瘍原性HCC細胞系のin vivoでの抑制および制御は、IRF−1の最も重要な活性であった。E2処置は、HepaIRF−1hER腫瘍を用いた攻撃に対して75%のマウスを防御し、腫瘍を発症するマウスは、E2非処置動物と比較して、腫瘍成長の有意の抑制および生存強化により特徴付けられた。同様の結果は、肉腫細胞系中でのIRF−1の構成的発現が部分的な腫瘍制御を生じた近年の研究において観察された(40)。T細胞枯渇実験により、CD4+およびCD8+T細胞が腫瘍成長の制御に重要な役割を果たすということが実証されたが、これは、TH1分化の誘導におけるIRF−1の既知の重要性を確証する(55)。さらに、腫瘍成長に対して相乗的に作用し得る腫瘍特異的TH2細胞の有意の活性化を、本発明者等は観察した(59、60)。CD4+およびCD8+の両方の枯渇実験の作用は、IRF−1媒介性腫瘍成長制御の全体的作用を説明することができない。IFN−βはNK細胞を活性化し得ることが示された。したがってNK細胞は腫瘍制御に寄与することができる。
【0068】
IRF−1の腫瘍内発現が、HCC特異的自己抗原AFPのような腫瘍関連抗原に対する有意のT細胞応答を誘導することがはじめて実証されたことはさらに重要であり、これは、AFPに対する耐性がこのアプローチにより破壊され得ることを示唆する。AFP特異的CTL活性は、高免疫原性ウイルス抗原、例えばHBVまたはHCV構造タンパク質と比較して、低かった(61、62)。これは、低CTL前駆体頻度および/または低親和性TCRの結果であり得る。しかしながら近年の研究は、DNAまたは樹状細胞ベースの免疫接種後のAFP特異的T細胞がAFP発現ネズミHCCに対してin vivoで機能的であることを実証した(44、63)が、これは、AFP特異的T細胞が、本発明に提示されたような抗腫瘍作用に寄与したことを示唆する。細胞性イムニティーのみは、in vivo枯渇実験により実証されるように腫瘍成長を完全に制御し得なかったが、腫瘍に対する有意のT細胞記憶が誘導され、これは、さらなるE2処置を用いずにHepaIRF−1hERを用いた再攻撃、野生型Hepa1〜6細胞を用いてさえの再攻撃に対してマウスを防御した。HCC診断後の臨床状態を反映するIRF−1発現の考え得る治療的効力が示されたことはさらに重要である。E2を用いた大型HepaIRF−1hER腫瘍を保有するマウスの処置は、4日以内に腫瘍の成長停止を生じた。9日間に亘るE2処置は、任意のさらなるE2処置を伴わずに長期間腫瘍成長を制御するのに十分であった。上記の腫瘍防御試験によれば、この長期腫瘍制御は主として免疫媒介され得る。
【0069】
IRF−1を発現するHCC腫瘍の免疫原性強化は、上記のようにMHCクラスIおよびII分子の上向き調節により媒介され得るが、MHCクラスII誘導はHCC細胞中では低かった。共刺激性分子CD80およびCD86は検出することができなかったが、このことは、抗腫瘍性免疫応答の初回抗原刺激が、プロ抗原提示細胞により排液リンパ節で起きたに違いないことを示唆する。IRF−1媒介性腫瘍成長制御に関与する付加的因子は、プロテアソームによる免疫系への提示のための次世代のMHCクラスI制限抗原性ペプチドであり得る(38、39、58)。
【0070】
Yim等(40)が予知したように、異所性IRF−1発現は有意の治療的抗腫瘍性免疫応答を誘導し、組織特異的自己腫瘍抗原、例えばAFPに対する免疫を初回抗原刺激することが初めて示された。したがって本発明者等の結果は、HCCの局所的およびAFPベースの免疫療法との関連を有し得る。
【0071】
要約すると、肝細胞癌(HCC)は、予後は不十分で、治療的意見も少ない非常に悪性の腫瘍である。
【0072】
HCCは、他の腫瘍存在物の一例とみなされる。IRF−1は他の腫瘍種において同一の全身性作用を有するという良好な証拠がある。以下の例は、この仮説を支持する:
1. Yim等(1997;40)は、肉腫細胞系は、IRF−1を発現する場合、拒絶および免疫性を部分的に誘導すると報告した。IRF−1は十分に発現されなかったため、作用は完全でなかった。
2. 癌遺伝子性形質転換3T3細胞を用いた例は、活性IRF−1が発現された場合、ヌードマウスにおいてさえ、腫瘍成長が有意に低減されるという見解を支持する。ヌードマウスにおける腫瘍成長の遅延は、in vitroデータから予測されたものより非常に高く、これは、この動物における免疫系の残りの部分が関与したことを示す。
3. 多数の異なる癌遺伝子性形質転換細胞系を用いたin vitroデータは、IRF−1が軟寒天成長を有意にまたは完全に抑制し、インターフェロン分泌を誘導し、MHC上向き調節を活性化することを示す(Kirchhoff et al., 1999およびKroger et al.、未発表データ)。
【0073】
マウスにおける腫瘍防衛の詳細な分子機能は既知でないが、提示されたデータは、免疫細胞(CTL、TH1およびTH2細胞)が関与することを示す。ヌードマウス実験は、NK細胞も関与することを示唆する。IFN−βはNK細胞活性の強力な活性剤であることが既知である。さらにIFN−βは、適応免疫系における多様な活性化機能に関しても既知である。最後に、IRF−1のアポトーシスならびに成長阻害作用は、IRF−1を過剰発現する細胞中で観察される腫瘍阻害作用に寄与し得る。免疫学的作用はMHC上向き調節およびインターフェロン分泌により媒介されると考えられるが、IRF−1により誘導されるその他の、今のところ未知の活性が抗腫瘍作用に寄与し得る。
【0074】
IRF−1活性化時に分泌されるインターフェロンは、全身的に、ならびに局所的に作用し得る。したがって、抗原提示細胞(例えばIRF−1を過剰発現するもの)の周囲におけるIFNの産生は、抗腫瘍活性の高度の刺激をもたらすと考えられる。
【0075】
本発明の研究において、IRF−1は抗腫瘍活性を誘導することが実証された。IRF−1と比較した場合、他のIRFが類似の結合特性を有することはよく知られている。例えばIRF−3は、IRF−1により活性化されるのと同一のまたは類似の組の遺伝子を活性化し得ると思われる。したがって構成的に活性である恒久的活性化IRF−3またはIRF−3変異体は、ここに示されたのと同一の抗腫瘍活性を有し得る。
【0076】
動物腫瘍モデルにおいて観察された作用はどのようにヒト療法に転換され得るであろうか。シナリオはすべて、IRF−1または関連転写因子の強力な活性に基づいている(上記参照)。
【0077】
1. 細胞療法:
ウイルス感染またはその他の遺伝子移入方法により、患者の腫瘍細胞または同一腫瘍実態を有する他の患者からの腫瘍細胞(同種異系細胞)に遺伝子をチャージすることができた。これらの遺伝子が一時的に発現されるかまたは長期間発現されるかは重要でない。あるいは、標的腫瘍に関連する腫瘍抗原を提示し得るかまたは提示させ得る非特異的細胞またはプロフェッショナル抗原提示細胞が、IRF構築物によりチャージされる。これらの細胞は、患者由来か、または同種異系であり得る。これらの細胞中でのIRF遺伝子の活性化は、患者への贈与の直前にin vitroで活性化され得る。あるいは、それらはそれぞれの活性剤(β−エストラジオールまたはテトラサイクリン)の贈与により患者内で活性化され得る。ヒトにおいては、細胞療法は、通常は他の細胞を不活性化することにより、UVまたはγ線照射のような方法により実行される。
【0078】
2. ウイルス移入法による遺伝子療法
例えば上記のようなIRFは、上記のアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターにより形質導入され得る。好ましくはこれは腫瘍中または腫瘍付近の組織中へのウイルスの感染により行われる。ある場合には、それは、全身的適用によっても行われ得る。これは典型的には、血流中へのアデノウイルスの適用による肝臓腫瘍の場合に行われる。アデノウイルスは主に肝臓で捕捉され、したがって遺伝子移入は極端に肝臓特異的であることがよく知られている。ウイルスベクターにより保有されるIRFの活性化または低減は、それぞれの作用物質により患者においてin vivoで活性化される。非腫瘍細胞中でのIRF−1活性化が可逆的増殖阻害を引き起こすが、阻止作用をもたらさないということを初期の研究は示したことに言及する必要がある。
【0079】
3. 非ウイルス法による遺伝子療法
遺伝子がヒト組織中に移入され得る多数の方法が既知である。それらの例としては、リポフェクション、遺伝子銃、電気穿孔等がある。IRFは、これらの方法によりそれぞれの腫瘍組織中にトランスフェクトされ得る。
【0080】
4. 患者の腫瘍中のまたは抗原提示細胞中の内因性IRF−1の活性化または誘導は、サイトカインおよびその他の生物学的応答修飾剤のような多数の化合物から活性化または誘導され得る。それらがIRF−1の転写および産生を活性化することは既知である。強力な誘導物質またはこのような組合せを用いて、IRF−1を誘導し、かつ観察された抗腫瘍作用を誘導し得る。内因性IRF−1を活性化する、ハイスループットスクリーニングにより典型的に見出されるその他の化合物も、同一方法で用い得る。
【0081】
【表3】
【0082】
【表4】
【0083】
【表5】
【0084】
【表6】
【0085】
参照文献
1. ボッシュ,X.,ライブス,J., アンド ボラス,J エピデマイオロジー・オブ・プライマリー・リバー・キャンサー、セミナー・リバー・Dis. 19: 271−285, 1999
2. オクダ,K. ヘパトセルラー カルシノマ、J.,ヘパノール, 32: 225−237, 2000
3. ハロッシュ,S.,レベル,M., アンド セバス,J. インダクション・バイ・インターロインキン−6・オブ・インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF1) ジーン エクスプレッション スルー ザ パラリンドロミック インターフェロン レスポンス エレメント pIRE アンド セル タイプ−ディペンデント コントロール オブ IRF−1 バインディング ツゥ DNA、Embo J. 13: 1942-9, 1994
【0086】
4. カーシュホフ,S., シャパー,F. アンド ハウザー,H. インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF−1) メディエーツ セル グロース インヒビション バイ トランスアクチベーション オブ ダウンストリーム ターゲット ジーンズ, ヌクレイック アシッズ Res., 21, 2881, 1993
5. パイン,R. コンスティチューティブ エクスプレッション オブ アン ISGF2/IRF1 トランスジーン リーズ ツゥ インターフェロン−インディペンデント アクチベーション オブ インターフェロン−インディゥシブル ジーンズ アンド レジスタンス ツゥ ビールス インフェクション, J Virol. 66, 4470-8, 1992
6. リース,L.F.,ハラダ,H.,ウォルコック,J.D.,タニグチ,T., アンド ビルセック,J. クリティカル ロール オブ ア コモン トランスクリプション ファクター,IRF−1, イン ザ レギュレーション オブ IFN−ベータ アンド IFN−インディゥシブル ジーンズ, Embo J. 11, 185-93, 1992
7. チャン,C.H.,ハマー,J.,ロー,J.E.,フォダー,W.L. アンド フラベル,R.A. ザ アクチベーション オブ メジャー ヒストコンパティビィリィティ コンプレックス クラス I ジーンズ バイ インターフェロン レギュラトリー ファクター−1 (IRF−1), インムノジェネティックス 35: 378-84, 1992
【0087】
8. キムラ,T.,ナカヤマ,K.,ペニンガー,J.,キタガワ,M.,ハラダ,H.,マツヤマ,T.,タナカ,N.,カミジョー,R.,ビルセック,J.,マック,T.W., アンド エト アル インボルブメント オブ ザ IRF−1 トランスクリプション ファクター イン アンチビーラル レスポンス ツゥ インターフェロンズ, サイエンス 264: 1921−4, 1994
9. フジタ,T.,キムラ,Y.,ミヤモト,M.,バーソーミアン,E.L., アンド タニグチ,T インダクション オブ エンドジーニアス IFN−アルファ アンド IFN−ベータ ジーンズ バイ ア レギュラトリー トランスクリプション ファクター, IRF−1, ネイチャー 337: 270−2, 1989
10. ハラダ,H.,フジタ,T.,ミヤモト,M.,キムラ,Y.,マルヤマ,M.,フリア,A.,ミヤタ,T., アンド タニグチ,T. ストラクチュアリー シミラー バット ファンクショナリー ディスティンクト ファクターズ, IRF−1 アンド IRF−2, バインド ツゥ ザ セイム レギュレイトリー エレメンツ オブ IFN アンド IFN−インディゥシブル ジーンズ, セル 58: 729−39, 1989
11. マツヤマ,T.,キムラ,T.,キタガワ,M.,プフェファー,K.,カワカミ,T.,ワタナベ,N.,クンディー,T.M.,アマカワ,R.,キシハラ,K.,ベァッケム,A., アンド エト アル ターゲッテッド ディスループション オブ IRF−1 オア IRF−2 リザルツ イン アブノーマル タイプ I IFN ジーン インダクション アンド エイベラント リンフォカイト デベロップメント, セル 75: 83−97, 1993
【0088】
12. ラフナー,H.,リース,L.F.,ナフ,D., アンド ヴァイスマン,C. インダクション オブ タイプ I インターフェロン ジーンズ アンド インターフェロン−インディゥシブル ジーンズ イン エンブリオナル ステム セルズ デヴォイド オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 1, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 11503−7, 1993
13. リース,L.F.,ラフナー,H.,スターク,G.,エイグエト,M., アンド ヴァイスマン,C. マイス デヴォイド オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF−1) ショウ ノーマル エクスプレッション オブ タイプ I インターフェロン ジーンズ, Embo J. 13: 4798−806, 1994
14. ペレグリニ,S. アンド シンドラー,C.アーリー イベンツ イン シグナリング バイ インターフェロンズ, トレンズ バイオケミ ソサイエティー 18: 338−42, 1993
【0089】
15. カミジョー,R.,ハラダ,H.,マツヤマ,T.,ボスランド,M.,ゲレチターノ,J.,シャピロー,D.,ル,J.,コー.,S.I.,キムラ,T.,グリーン,S.J., アンド エト アル リクイアメント フォー トランスクリプション ファクター IRF−1 イン NO シンザーゼ インダクション イン マクロファージズ, サイエンス 263: 1612−5, 1994
16. タン,R.S.,タニグチ,T.,およびハラダ,H(Tan, R. S., Taniguchi, T., and Harada, H.)、 アイデンティフィケーション・オブ・ザ・リシル・オキシダーゼ・ジーン・アズ・ターゲット・オブ・ジ・アンチオンコジェニック・トランスクリプション・ファクター、IRF−1、アンド・イッツ・ポッシブル・ロール・イン・テューマー・サプレッション, キャンサー・レス(Cancer Res.)、 56 : 2417-21,1996.
17. キルコッフ,S.,コロミラス,A.E.,シャペル,F.,グラショフ,M.,ソネンベルグ,N.,およびハウザー,H.(Kirchhoff, S., Koromilas, A. E., Schaper, F., Grashoff, M., Sonenberg, N., and Hauser, H.)、 IRF−1・インデュースド・セル・グロース・インヒビション・アンド・インターフェロン・インダクション・リクワイヤーズ・ジ・アクティビティ・オブ・ザ・プロテインキナーゼ・PKR、オンコジーン(Oncogene)、 11 : 439-45,1995.
【0090】
18. ベネチェ,P.,ビグネロン,M.,ペレツ,D.,レベル,M,およびチェバス,J.(Benech, P., Vigneron, M., Peretz, D., Revel, M., and Chebath, J)、インターフェロン−レスポンス・レギュラトリー・エレメンツ・イン・ザ・プロモーター・オブ・ザ・ヒューマン・2´,5´−オリゴ(A)・シンターゼ・ジーン、 モル・セル・バイオ(Mol Cell Biol.)、 7 : 4498-504,1987.
19. タキカワ,O.,クロイワ,T.,ヤマザキ,F.,およびキド,R.(Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., and Kido, R.)、メカニスム・オブ・インターフェロン−ガンマ・アクション。キャラクタライゼーション・オブ・インドレアミン2,3−ジオキシゲナーゼ・イン・カルチャード・ヒューマン・セルズ・インデュースド・バイ・インターフェロン−ガンマ・アンド・エバリューション・オブ・ジ・エンザイム−メディアイティッド・トリプトファン・デグラデーション・イン・イッツ・アンチセルラー・アクティビティ、ジェイ・バイオロ・ケム(J Biol Chem.)、 263: 2041-8,1988.
20. ホリグチ,M.,ヤマダ,T.,ハヤシバ,W.,およびダザウ,V.−J.(Horiuchi, M., Yamada, T., Hayashida, W., and Dzau, V.-J. )、インターフェロン・レギュレトリー・ファクター−1・アップ−レギュレイテス・アンジオテンシンII・タイプ2レセプター・アンド・インデューシズ・アポトーシス、ジェイ・バイオロ・ケム (J Biol Chem.)、 272: 11952-8,1997.
【0091】
21. タナカ,N.,イシカワ,M.,キタガワ,M.,ハラダ,H.,キムラ,T.,マツヤマ,T.,ランピアー,M.S.,アイザワ,S.,マック,T.W.,およびタニグチ,T.(Tanaka, N., Ishihara, M., Kitagawa, M., Harada, H., Kimura, T., Matsuyama, T., Lamphier, M. S., Aizawa, S., Mak, T. W., and Taniguchi, T.)、セルラー・コミットメント・トゥ・オンコジーン−インヂュースド・トランスフォーメーション・オア・アポトーシス・イズ・ディペンデント・オン・ザ・トランスクリプション・ファクター・IRF−1、セル(Cell)、 77: 829-39,1994.
22. ロウエ,S.W.およびルレイ,H.E.(Lowe, S. W. and Ruley, H. E.)スタビライゼーション・オブ・ザ・p53・テューマー・サプレッサー・イズ・インデュースド・バイ・アデノウイルス5 E1A・アンド・アコンパニス・アポトーシス、ジーン・デヴィ(Genes Dev.) 7: 535-45,1993.
23. アッタルディ, L. D., ロウエ, S. W.,ブルガロラス, J., アンド ジャックッス, T. トランスクリプショナル アクティベーション バイ p53, バット ノット インダクション オブ ザ p21 ジーン, イズ エッセンシャル フォー オンコジーン-メディケイティッド アポトシス, エンボ J. 15 : 3693-701,1996.
24. キルヒホッフ, S. アンド ハウザー, H. コーペラティブ アクティビティー ビトイーン ハー オンコジーン アンド ザ チュモア サプレッサー IRF-1 リザルト イン アポトシス, オンコジーン 18 : 3725-36,1999.
25. チン, Y. E., キタガワ, M., マカイダ, K., フラベル, R. A., アンド FU, X. Y. アクティベーション オブ ザ スタット シグナリング パスウェイ キャン コーズ エクスプレッション オブ キャスパス 1 アンド アポトシス, モル セル バイオル. 17: 5328-37,1997.
26. タムラ, T., イシハラ, M., ランフィア, M. S., タナカ, N., オオイシ, I., アイザワ, S., マツヤマ, T., マック, T. W., タキ, S., アンド タニグチ, T. DNA ダメージ-インデュースト アポトシス アンド アイス ジーン インダクション イン ミトジェニカリー アクティベイテッド T リムファシテス リクワイヤ IRF-1, ルーケミア. 11 SUPPL 3: 439-40,1997.
【0092】
27. ヤマダ, G., オガワ, M., アカギ, K., ミヤモト, H., ナカノ, N., イトウ, S., ミヤザキ, J., ニシカワ, S., ヤマムラ, K., アンド タニグチ, T. スペシィフィック ディプレッション オブ ザ B-セル ポピュレーション インデュースト バイ アベラント エクルプレッション オブ ヒューマン インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 ジーン イン トランスジェニック マイス, Proc Natl Acad Sci U S A.
88: 532-6,1991.
28. ウィリアム, C. L., シーバー, C. E., パラビシン, M. G., ハラダ, H., タナカ, N., スロバク, M. L., ヤマモト, H., ハラダ, K., ミーカー, T. C., リスト, A. F., アンド et al. デリーションof IRF-1, マッピング トゥー クロモソウム 5q31. 1, イン ヒューマン ルーキーミア アンド プレルーキック ミエロディスプラシア, サイエンス. 259 : 968-71,1993.
29. タナカ, N., イシハラ, M., アンド タニグチ, T. スプレッション オブ c-myc or FOSB-インデュースト セル トランスフォーメイション バイ ザ トランスクリプション ファクター IRF-1, キャンサー レット. 83: 191-6,1994.
30. ノザワ, H., オダ, E., ナカオ, K., イシハラ, M., ウエダ, S., ヨコチ T., オガサワラ, K., ナカツル, Y., シミズ, S., オオヒラ, Y., ヒオキ, K., アイザワ, S., イシカワ, T., カツキ M., ムトウ, T., タニグチ, T., アンド タナカ, N. ロス オブ トランスクリプション ファクター IRF-1 アフェクツ チューモア サスセプティビリティー イン マイス キャリング ザ Ha-ras トランスジーン オア ナリジゴスティー フォー P53, ジーンズ Dev. 13 : 1240-5,1999.
31. ホバート, M., ラマサール, V., ゴエス, N., アームソン, J., アンド ハロラン, P. F. ザ インダクション オブ クラスI アンド II メジャー ヒストコンパチビリチ コンプレックス アロゲニイック スチムレーション イズ デペンダント オン ザ トランスクリプション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター1(IRF-1): オブザベーション イン IRF-1 ノックアウト マイス, トランスプランテーション. 62 : 1895-901,1996.
【0093】
32. サルコウスキ, C. A., バーバー, S. A., デトーレ, G. R., アンド ボーゲル, S. N. ヂファレンチャル ヂィスレギュレーション オブ ニトリックオキシド プロダクション イン マクロファージス ウイズ ターゲッテド ヂィスラプションズ イン IFN レギュラトリ ファクタ-1 アンド-2 ジーン, J Immunol. 3107-10, 1996.
33. オガサワラ, K., ヒダ, S., アジミ N., タガヤ, Y., サトー, T., ヨコチ-フクダ, T., ワルドマン, T. A., タニグチ, T., アンド タキ, S. レクアイアメント フォア IRF-1 イン ザ マイクロエンビロンメント サポーテイング デベロップメント オフ ナチュラル キラー サイボウ, ネイチャー. 391 : 700-3,1998.
34. ハラダ, H., ウイリソン, K., サカキンバラ, J., ミヤモト, M., フジタ, T., アンド タニグチ, T. アブセンス オフ ザ タイプ I IFN システム イン EC セルス: トランスクリプショナル アクチベーター (IRF-1) アンド レプレッサー (IRF-2) ジーンス アー デベロップメンタリー レグレーテッド, セル. 63 : 303-12,1990.
35. キルヒホッフ, S., ヴィルヘルム, D., アンゲル, P., アンド ハーサー, H.
NFkappaB アクチベーション イズ レクアイアド フォア インターフェロン レギュラトリー ファクター-l-メヂィエートド インターフェロン ベータ インダクション, ユーロ J バイオケム. 261 : 546-54,1999.
【0094】
36. オーテキ, T ヨシダ, H., マツヤマ, T., ダンカン, G. S., マック, T. W., アンド オーハシ, P. S. ザ トランスクリプション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF-1) イズ インポータント ダーリング ザ マチャーション オフ ナチュラル キラー 1.1+ T セル レセプター- アルファ/ベータ+ (NK1+ T) セルズ, ナチュラル キラー セルス, アンド インテスチナル イントラエピセリアル T セル, J Exp Med. 187: 967-72, 1998.
37. タナカ, N., イシハラ, M., ランフィアル, M. S., ノザワH., マツヤマ, マック. W., アイザワ, トキノ,T オーレン, タニグチ, T コーポレーション オブ ザ ツマーア サプレッサーズ IRF-1 and p53 イン レスポンス ツー DNA ダメージ, ネイチャー. 382: 816-8,1996.
38. ホワイト, L. C., ライト, K. L., フェレックス, N. J., ルッフナー, H., レイスパイン, R., アンド チング, J. P. レギュレーション オブ LMP2 アンド TAP1 ジーンス バイ IRF-1 エクスプレインズ ザ パウシチー オブ CD8+ T セルズ イン IRF-1-/-マイス イミュニチィー. 5: 365-76,1996.
39. フォッス, G. S. アンド プライズド, H. インターヘロンレギュレタリー ファクターズ1 メヂィエート ザ インターフェロン−ガンマ インダクション オブ ザ ヒュマン イミュノプロテオゾーム サブユニット マルチカタリチィク エンドペプチダーゼ コンプレックス-ライク 1, J バイオル ケム. 274: 35196-202,1999.
40. イム, J. H., フー, S. J., カーシー, M. J., ノートン, J. A., アンド ドーハテイ, G. M. IFN レギュラトリー ファクター-1 ジーン トランスファー インツー アン アグレッシブ, ノンイミュノギェニック サルコーマ サプレッスズ ザ マリグナント フェノタイプ アンド エンハンスズ イミュノゲニシチィ イン シンゲネイック マイス, J イミュノル. 1581284-92,1997.
【0095】
41. ダイ ビィシェグリー, A. M., カリサーズ Jr., R. L., アンド ゴレス, G.
J. ヘパトセルラー カルシノーマ, ヘパトロジー. 28: 1161-1165,1998.
42. バラ, J. A., ポルテラ, A., オーチン, J., アンド ジメネズ, A.
エクスプレッシュンズ イン マンマリアンズ セルズ オブ ア ジーン フローム ステファロミセス アルボニガー コンファーニング ピューロマイシンレジスタンス, ヌクレイック アシズ レス. 14: 4617-24,1986.
【0096】
43. ジンター, H. アンド ハーサー, H. スーパーインダクション オブ ザ ヒューマン インターフェロン-ベータ プロモーター, エンボ J. 6: 599-604,1987.
44. グリム, C., オートマン, D. モール, L., ミカラック, S., クローネ, T. U., メッキェル, S., エイセレ, S., エンケ, J., ブルム, H. E., アンド ゲイスラー, M. トリートメント オブ ヘパトセルラー カルシノーマ バイ ブリ−キング イミュノロギカル イグノーランス トワード アルファ ユージング ゲネチック イミュニゼーション イン マイス, ガストロエンタロロギィ 119 : 1104-1112,2000.
【0097】
45. シルムベック, R., ワイルド, J., ブルーム, H. E., チサリ, F. V., ガイスラー, M., および ライマン, J. 「オンゴーング T1 オア T2 イムノ レスポンス トゥ ザ ヘパティティス B サーフェイス アンチゲン (HBsAg) アー エクスクルーデッド フロム ザ レバー オブ マイス イン フィッチ トランスジーン-エンコーデッド HBsAg イズ エクスプレスト」, J. Immunol. 164 : 4235-4243,2000.
46. ワイルド, J., グルスビー, M. J., シルムベック, R., および ライマン, J. 「プライミング MHC-I-レストリクテッド サイトトキシック T リンフォサイト レスポンシズ トゥ エクソジェニアウス ヘパティティス B サーフェイス アンチゲン イズ CD4+ T セル ディペンデント」, J. Immunol. 163 : 1880-1887,1999.
【0098】
47. ニコレッティ, I., ミグリオラチ, G., パグリアチ, M. C., グリニャーニ, F., および リカルディ, C. A 「ラピッド アンド シンプル メソッド フォー メジャリング チモサイト アポトーシス バイ プロピヂウム アイオダイド ステイニング アンド フロー サイトメトリー」, J Immunol Methods. [139 : 271-9,] 1991.
48. ファドック, V. A., フェルカー, D. R., カンベル, P. A., コーヘン, J. J., ブラットン, D. L., および ヘンソン, P. M. 「エクスポージャ オブ フォスファティジルセリン オン ザ サーフェイス オブ アポプトチック リンフォサイツ トリッガーズ スペシフィック レコグニッション アンド リムーバル バイ マクロファーゼ」, J Immunol. 148: 2207-16,1992.
49. トーラ, L., ムリック, A., メツガー, D., ポンリキトモンコール, M., パーク, I., および シャボン, P. 「ザ クローンド ヒューマン オエストロゲン レセプター コンテインズ ア ミューテーション フィッチ オルタース イッツ ホルモン バインディング プロパティーズ」, Embo J. 8: 1981-6,1989.
50. ダニエリアン, P. S., ホワイト, R., ホアレ, S. A., フェイウェル, S. E., および パーカー, M. G. 「アイデンティフィケーション オブ レシジュー イン ザ エストロゲン レセプター ザット カンファー ディファレンシャル センシティビティー トゥ エストロゲン アンド ヒドロキシタモキシフェン」, Mol Endocrinol. 7: 232-40, 1993.
51. ハラダ, H., キタガワ, M., タナカ, N., ヤマモト, H., ハラダ, K., イシハラ, M., および タニグチ, T. 「アンチ-オンコジェニック アンド オンコジェニック ポテンシャルズ オブ インテーフェロン レギュラトリー ファクター-1 アンド-2」, Science. 259 : 971-4,1993.
【0099】
52. フタキ, M., イノクチ, K., ハナワ, H., タノサキ, S., ダン, K., および ノムラ, T. 「パッシブル トランスフォーミング アクティビティ オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 2 イン チューモリジェニシティ アッセイ オブ NIH3T3 セル トランスフェクテッド ウィズ DNA フロム クロニック ミエロジェニィアス ロイケミア ペイシェンツ」, Leuk Res. 20: 601-5,1996.
53. タナカ, H. および サミュエル, C. E. 「メカニズム オブ インターフェロン アクション : ストラクチャー オブ ザ マウス PKR ジーン エンコーディング ザ インターフェロン-インデューシブル RNA-ディペンデント プロテイン キナーゼ」, Proc Natl Acad Sci U S A. 91 : 7995-9,1994.
54. ダンカン, G. S., ミッツルッカー, H. W., カギ, D., マツヤマ, T., および マク, T. W. 「ザ トランスクプリクション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター-1 イズ エッセンシャル フォー ナチュラル キラー セル ファンクション in vivo」, J Exp Med. 184: 2043-8,1996.
55. ロホッフ, M., フェリック, D., ミッツルッカー, H. W., ダンカン, G. S., ビショッフ, S., ローリンホッフ, M., および マク, T. W. 「インターフェロン レギュラトリー ファクター-1 イズ リクワイアド フォー ア T ヘルパー 1 イムノ レスポンス in vivo」, Immunity. 6 : 681-9,1997.
【0100】
56. ドリュー, P. D., フランゾーソ, G., ベッカー, K. G., バウアス, V., カールソン, L. M., シーベンリスト, U., および オウザト, K. 「NF カッパー B アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 フィジカリー インタラクト アンド シナージスティッカリー インデュース メジャー ヒストコンパチビリティ クラス I ジーン エキスプレッション」, J Interferon Cytokine Res. 15: 1037-45,1995.
57. マッサ, P. T. および ウー, H. 「インターフェロン レギュレイトリー ファクター エレメント アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 イン ザ インダクション オブ メジャー ヒストコンパーチビリティ コンプレックス クラス I ジーンズ イン ニューラル セルズ」, J Interferon Cytokine Res. 15: 799-810,1995.
58. チャタージー-キショワ, M., キショワ, R., ヒックリン, D. J., マリンコーラ, F. M., および フェロン, S. 「ディファレント リクワイアメンツ フォー シグナル トランジューサー アンド アクチベーター オブ トランスクリプション 1アルファ アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 イン ザ レギュレイション オブ ロウ モレキュラー マス ポリペプチド 2 アンド トランスポーター アソシエイテッド ウィズ アンチゲン プロセッシング 1 ジーン エクスプレッション」, J Biol Chem. 273: 16177-83,1998.
59. ハン, K., ハヤシ, R., ラフォンド-ウォーカー, A., ローレンシュタイン, C., パードール, D., アンド レビッスキイ, H. セントラル ロール オブ CD4 (+) Tセルズ イン ザ アンチチューマー イムノ レスポンス, J Exp Med. 188: 2357-68,1998.
60. ザジャック, A. J., ムライ-クリシュナ, K., ブラットマン, J. N., アンド アーメド, R. セラピューティック ヴァッシネイション アゲインスト クロニック ヴァイラル インフェクション: ザ インポータンス オブ コーポレーション ビトウィーン CD4+ アンド CD8+ T セルズ, Curr Opin Immunol. 10: 444-9,1998.
61. ゲイスラー, M., ゲイジェン, A., トクシゲ, K., アンド ウァンズ, J. R. エンハンスメント オブ セルラー アンド ヒューモラル イムノ レスポンシーズ トゥ ヘパティティス C ウィルス (HCV) コア プロテイン ユージング DNA ベースド ワクチン オーギュメンテッド ウィズ サイトカイン エクスプレッシング プラスミド, J Immunol. 158: 1231-1237,1997.
62. ゲイスラー, M., ブラス, V., ミチャラク, S., オートマン, D., ウァンズ, J. R., アンド ブルム, H. E. インターセルラー リテンション オブ ヘパティティス B ウィルス サーフェース プロテインズ リデューシーズ ザ イムノ レスポンス オーギュメンティング エッフェクツ オブ IL-2 アフター サイトカイン ジェネティック コイミュナイゼーションズ., J. Virol. 73: 4284-4292,1999.
【0101】
63. ヴォルマー, C. M., Jr., エイルバー, F. C., バターフィールド, L. H., ライバス, A., ディセッテ, V. B., コウ, A., モンテージョ, L. D., リー, M. C., アンドリューズ, K. J., マクブライド, W. H., グラスピー, J. A., アンド エコノモウ, J. S. アルファ-フェトプロテイン-スペシフィック ジェネティック イムノセラピー フォー ヘプタトセルラー カルシノーマ, Cancer Res. 59 : 3064-7,1999.
64. スバイツァー D., ハウザー H. アンド ワース D. テクニカル レポト.コンプリメント-プロテクテッド アンフォトロフィック レトロウィルス フロム ムリン パッケージング セル. Human Gene Therapy 10,1893-1902 (1999)
65. Unsinger, J., Kroger, A., ハウザー, H., アンド ワース, D.: レトロヴァイラル ベクターズ フォー トランスダクション オブ アン オートレギュレーテッド バイダイレクショナル エクスプレッション カセット. Molecular Therapy, 4,484- 489. (2001)
66. アンシンガー J., リンデンメイアー W., ハウザー H. アンド ワース D. LTR-フランクド オートレギュレーテッド エクスプレッション カセッツ フォー ホモゲノウス アンド, ストリクトリイ コントロールド エクスプレッション イン アデノヴァイラル ベクターズ. サブミッテッド 2002
【0102】
67. コルベア-ガーピン F., ホロドニセアヌ F., コーリルスキー P., アンド ガラピン A. C. ア ニュー ドミナント ハイブリッド セレクティブ アーカー フォー ハイヤー ユーカリオティック セルズ. J Mol. Biol. 150,1-13. (1981).
68. コースター, M., キリチホフ, S., シャーパー, F. アンド ハウザー, H.: プロライフレーション コントロール オブ マンマリアン セルズ バイ ザ チューマー サプレッサー IRF-1. Cytotechnology, 18,67-75 (1995)
69. キルシホフ, S., コースター, M., ワース, M., シェーパー, F., ゴッセン, M., ブジャード, H. アンド ハウザー, H.: アイデンフィケーション オブ マンマリアン セル クローンズ イクスヒビッティング ハイリー レギュレーテッド エクスプレッション フロム インデューシブル プロモーターズ. TIG, 11,219-220 (1995)
70. クロガー A. エヴァルエールング ダー チューマースプレッシヴェン エイゲンシャフテン ダス インターフェロン レギュレーター ファクター-ワン (IRF-1). Dissertation, Technische Universitat Braunschweig (1999)
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】IRF−1はHepa1〜6細胞における細胞成長阻害を媒介する。A:IRF−1hERでトランスフェクトされたHepa1〜6細胞におけるIRF−1hER融合タンパク質のウエスタンブロット分析。これらの細胞クローンから得られた溶解物(タンパク質50μg)をSDS−PAGEに付して、抗ER抗体を用いて分析した(上パネル)。膜を剥いで、抗アクチン抗体で再プローブして、試料のタンパク質チャージを制御した(下パネル)。B:細胞成長の確定のために、同一クローン由来の細胞をマイクロタイタープレートのウェル中に播種して、β−エストラジオール1μMを用いて(黒棒)または用いずに(白棒)成長させた。処置の7日後に、培養の代謝活性を測定した。個々のHepa1〜6細胞クローンの成長特性はわずかに異なるため、未処置細胞の代謝活性を100%と設定した。
【図2】IRF−1の活性化は、Hepa1〜6細胞の腫瘍原性表現型を復帰させる。A:軟寒天中のIRF−1トランスフェクト細胞クローンの足場非依存性成長。B:β−エストラジオール1μMを用いずに(黒棒)または用いて(白棒)3週間培養後、指示細胞クローンのコロニー数を測定した。
【図3】IRF−1の活性化は、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現の増大をもたらす。IRF−1−hERを発現するHepa1〜6細胞の表面タンパク質のFACS分析(クローン9)を、H2Kb/Db(A)、I−A/I−B(B)およびCD54(C)に対して誘導される抗体を用いて行った。エストロゲン無含有培地中でまたは1mMのβ−エストラジオールの1:1,000希釈物を含有する培地中で、HepaIRF−1hER細胞を3〜4日間培養した。その後、適切なFITC標識またはPE標識抗体を用いて細胞を染色した。特異性に関する対照として、FITC標識またはPE標識非特異的アイソタイプ対照で細胞を染色した。データは、3つの個々の実験から得られる。
【図4】IRF−1−HERのアデノウイルス形質導入はIRF−1媒介性表現型をもたらす A 材料と方法の節に記載されたような異なるアデノウイルスベクターの模式図。矢印:サイトメガロウイルスプロモーター(CMV);二方向矢印:二方向tTA−プロモーター(bitTA);黒丸:SV40ポリアデニル化シグナル;黒長方形:ポリオウイルス由来内部リボソーム進入部位(IRES);eGFP:強化グリーン蛍光タンパク質;LTR:レトロウイルス末端反復配列;tTA:トランス活性化因子。B 指示アデノウイルスに感染されたHepa1〜6細胞におけるIRF−1−hER融合タンパク質のウエスタンブロット分析。感染後48時間目の細胞由来の溶解物(タンパク質50μg)をSDS−PAGEに付して、ヒトエストロゲン受容体に対して誘導される抗体を用いて分析した。
【図5】IRF−1の活性化はヌードマウスにおける腫瘍成長を遅延し、部分的に阻害する。 NMRIヌードマウスの右側腹部に106細胞/マウスを皮下注射した。1.5mgのE2の2日毎のi.p.でマウスを処置するかまたは未処置のままにした。データは、5匹の動物の平均値を示す。A 腫瘍容積により腫瘍成長を測定した。B 腫瘍無含有ヌードマウス生存率を示すカプラン−マイアープロット。
【図6】同系免疫応答性C57L/JマウスにおけるE2処置および腫瘍再攻撃に対する防御に依存するHepaIRF−1hERおよびHepa1〜6細胞のin vivo特性。A:マウスの右側腹部に1×107Hepa1〜6またはHepaIRF−1hER細胞を接種し、2日毎の1.5mgβ−エストラジオールi.p.でマウスを処置するか、または未処置のままにした。8匹のE2処置動物のうちの6匹はHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して完全に防御され、2匹は、E2処置停止後でさえ非常に遅い成長速度を特徴とする小腫瘍を発症しただけであることに留意されたい。B:ナイーブC57L/JマウスまたはHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して防御されたE2処置動物を、E2処置停止後11日目(最初の腫瘍接種後28日目)に、1×107野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER(n=3)腫瘍細胞を用いて再攻撃させた。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。
【図7】Hepa1〜6腫瘍に対するCTL活性ならびにT細胞前駆体頻度。A:腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、放射線照射Hepa1〜6細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたE:T比で、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃されたE2処置マウスを3LL細胞でin vitro刺激して、その後、同系Hepa1〜6および3LL癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。Hepa1〜6腫瘍特異的溶解物は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより提示された。値は、3重反復試験確定値の平均を表す。B:腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、Hepa1〜6または3LL細胞を用いて20時間刺激した。その後、IFN−γおよびIL−4エリスポット(ELISPOT)アッセイを実施した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養の開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数に対するスポット形成細胞の数として表す。
【図8】AFP特異的CTL応答およびCTL−p頻度。A:腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、UV不活性化rVV−mAFPに感染させた放射線照射自系脾臓細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたE:T比で、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃されたE2処置マウスをrVV−pSC11に感染させた脾臓細胞でin vitro刺激して、その後、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。AFP特異的溶解物は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより示された。値は、3重反復試験測定の平均を表す。B:腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、UV不活性化rVV−AFPまたはrVV−pSC11感染同系放射線照射脾臓細胞を用いて20時間刺激した。その後、IFN−γエリスポット(ELISPOT)アッセイを実施した。
【図9】in vivoおよびIRF−1媒介性HCC療法における抗腫瘍免疫反応性の同定。A:抗腫瘍免疫は部分的に、CD4+およびCD8+T細胞の両方の関与を要した。材料と方法において記載されたような精製ハイブリドーマ上清のi.p.注射により、HepaIRF−hER細胞を接種されたE2処置または未処置マウスのCD4およびCD8 T細胞亜集団を枯渇させた。各群は、マウス2匹を含有した。B:C57L/Jマウスの右側腹部に1×107HepaIRF−1hER(群1および2)細胞を接種した。両群は、いかなるE2処置も受けなかった。19日目に、腫瘍は両群で約2000mm3のサイズに達した。19日目に開始して、28日目まで2日毎に、群2(n=6)に1.5mgのE2をi.p.注射した。その後、E2処置は2匹のマウスで再度中止されたが、一方、残りの4匹のマウスはE2療法を維持された。腫瘍成長における差異は観察されなかった。群1(n=3)のマウスにはE2処置を施さず、その後、腫瘍が10,000mm3に達した場合に屠殺した。
【0001】
本発明は、腫瘍を治療する方法の開発に関する。本方法は、IRF−1、特にβ−エストラジオールにより不可逆的に活性化可能であるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質の活性化に基づいている。
【0002】
本明細書中で用いられる略語:
AFP=αフェトプロテイン
c−Ha−ras=ras癌遺伝子
c−myc=myc癌遺伝子
CTL=細胞傷害性Tリンパ球
E2=β−エストラジオール
FCS=ウシ胎児血清
fosB=転写因子fosB
HCC=肝細胞癌細胞
HER1=EGF受容体
ICE=カスパーゼ
IL−15=インターロイキン−15
iNOS=誘導NOシンターゼ
ISG=インターフェロン刺激遺伝子
ISGF3=IRF−1関連サブユニット
ISRE=インターフェロン刺激応答要素
LMP2=タンパク質プロセシング因子
mAFP=ネズミαフェトプロテイン
MECL1=多触媒性エンドペプチダーゼ複合体1
MHC=主要組織適合性複合体
NK細胞=ナチュラルキラー細胞
OASE=2’,5’−オリゴ(A)シンテターゼ
PKR=プロテインキナーゼR
ras誘導=rasタンパク質の誘導
TAP−1=タンパク質プロセシング因子
TH1=1型Tヘルパー細胞
【0003】
詳細な書誌情報を有する引用参考文献の完全一覧を、本明細書の末尾に示す。
【0004】
肝細胞癌(HCC)は、世界中の全ての悪性疾患の中で第五位の発生頻度であって、1990年の新症例数は437,000と概算されている(1)。種々の非外科的治療法が開発され、外科技法は大いに改良されてきたが、これらの療法の中で、HCC患者の非常に不十分な予後を有意に改善したものはない。全体的な5年生存率は全世界で2%に過ぎず(2)、したがってHCCのための新規の遺伝子および免疫療法戦略が開発されつつある。当該発明者等は、腫瘍の治療のための腫瘍サプレッサーおよび免疫モジュレーターとしてのインターフェロン調節因子−1(IRF−1)の広範な役割を用いようと試みた(3)。本発明者等は、マウスにおける免疫応答性同系HCC腫瘍モデルおよび免疫不全マウスにおける試験のための別の腫瘍細胞系を用いた。
【0005】
IRF−1発現は多数のインターフェロン刺激遺伝子(ISG)の誘導をもたらし(4〜6)、それにより組織適合性抗原(7)および抗ウイルス状態(5、8)の誘導を含めた通常のIFN−機能を誘導する。IRF−1遺伝子はそれ自体、IFNにより誘導可能であるため、それはIFN媒介性細胞応答に関与され得ることが示唆された(5、9、10)。しかしながら機能的IRF−1遺伝子を欠くマウスおよび細胞では、典型的ISG(例えば9〜27、1〜8、PKR)のIFN誘導性誘導は影響を受けない(8、11〜13)。したがってIRF−1は、ISG−プロモーターをIRF−1関連サブユニットISGF3で結合するISGF−3によりISGのIFN特異的誘導を刺激すると思われる(14)。これらのマウスにおける特異的変更は、IFN−βに対する応答においてiNOS(誘導可能NOシンターゼ)誘導を欠くことである(15)。
【0006】
IRF−1は、DNA結合およびトランス活性化により抗増殖作用を発揮する(4)。成長抑制作用を発揮する複数の遺伝子を誘導することが既知である。それらの例としては、リシルオキシダーゼ(16)、PKR(17)、2’−5’OASE(18)、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(19)およびII型アンギオテンシン受容体(20)がある。繊維芽細胞および上皮起源の確立された細胞系では、IRF−1はアポトーシスの兆候を伴わずに細胞増殖停止をもたらす(21)。しかしながらras誘導性アポトーシスに必要とされる腫瘍サプレッサーp53の活性(22、23)と同様に、IRF−1は癌遺伝子依存性アポトーシスを発揮し得る。当該発明者等は、IRF−1により成長抑制される3T3細胞が条件付HER1癌遺伝子活性化後にアポトーシスを受けることを示した(24)。実際、ICEのようなある種のカスパーゼ遺伝子のプロモーター領域はISRE様配列を含有する(25)。これらの遺伝子は、IRF−1の標的であり得る(26)。
【0007】
IRF−1は、腫瘍サプレッサーとして確認された(4、17、24、27)。ヒトにおけるIRF−1遺伝子座の染色体欠失は、脊髄形成異常および))ある種の白血病に関連する(28)。IRF−遺伝子における突然変異を有さない一次胚繊維芽細胞は、単一癌遺伝子(c−Ha−ras)の発現による形質転換を受け易い。これらのIRF−1−/−細胞は、c−Ha−ras癌遺伝子発現および血清飢餓時にアポトーシスを受けないが、一方、IRF−1遺伝子を保有する野生型細胞はプログラムされた細胞死を受ける(21)。IRF−1発現はまた、c−mycおよびfosB癌遺伝子により発揮される腫瘍原性表現型を復帰させる(29)。c−Ha−rasおよびIRF−1を欠くマウスはより高率の腫瘍原性を示すことをさらなるデータは示した(30)。
【0008】
腫瘍サプレッサーとしてのIRF−1のin vivoでの作用は、複雑である。細胞の種類によって、IRF−1は成長阻害、アポトーシスを誘導し、細胞外マトリクスならびに免疫調節機能に影響を及ぼす。IRF−1は、多数の免疫調節作用、例えばMHCクラスI(31、32)、iNOS(15)、IFN−β(11)転写を誘導し、IL−15の適切な発現にも必要である(33)。IRF−1の一過性発現は、IFN−β遺伝子の活性化をもたらす(9、34、35)。IRF−1ノックアウト細胞を用いた試験は、IRF−1がNK細胞の分化および機能に関与し(33、36)、TH1型のTヘルパー細胞の生成、ならびにDNA損傷に関与することを実証する(26、37)。IRF−1はさらに、LMP2、TAP−1およびMECL1の転写的誘導(38、39)ならびにMHCクラスIIの誘導(7、40)による抗原提示の上向き調節に関与する。これらの事実は、IRF−1が抗原の提示のための補刺激因子として作用し得ることを示唆する。
【発明の開示】
【0009】
本発明の目的は、腫瘍に対する療法的アプローチに関するIRF−1の効能を実証することであった。本報告は、β−エストラジオール(E2)の存在下で活性になるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするプラスミドおよびネズミ細胞系の構築(4)、およびこれらの細胞系のin vitroでの表現型の詳細な特徴付けを詳述する。さらに本発明者等は、免疫応答性および非応答性マウスを用いたin vivoでの腫瘍増殖に対するこの活性化可能IRF−1系の防御的および治療的能力を記載し、腫瘍に対するT細胞応答を特徴付け、かつ、HCC特異的自己分化抗原マウスα−フェトプロテイン(AFP)に対する免疫学的耐性(41)がこのアプローチにより破壊され得ることを実証する。最後に、本発明者等の結果は、IRF−1が、直接的抗腫瘍成長作用および腫瘍の免疫細胞認識強化の両方によりその抗腫瘍作用を媒介することを実証する。
【0010】
本発明の問題は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの使用であり、それによりIRFファミリーのメンバーであるその遺伝子産物の活性が活性化されるようになり得る使用によって解決される。本発明の特徴的な実施形態は、上述した使用であって、遺伝子産物としてのIRFファミリーのメンバーは、野生型IRF−1,合成IRF−1、免疫学的活性IRF−1変異体、IRF−1以外のIRFファミリーの野生型メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーの合成メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体、およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される使用を含む。本発明は、哺乳類、特にヒトの治療のための上述した使用に関する。
【0011】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの1つとしてのメンバーおよび融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としてのIRFファミリーのメンバーをコードし、融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得、特に、遺伝子構築物は、IRF−1/hER融合タンパク質の発現をコードし、その活性がエストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る使用を含む。
【0012】
さらなる実施形態は、上述した使用であって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される使用を含む。
【0013】
本発明の特徴的な態様は、化学的または物理的活性化により、例えば、加熱または放射線照射により、スイッチを入れられ得る上述したタンパク質の発現より成る。さらなる特徴的な態様は、上記タンパク質の発現であって、発現は、調節可能プロモーターにより、例えば、外的刺激、特にテトラサイクリンにより、スイッチを切り替えられ得る発現により成る。
【0014】
本発明の有利な実施形態は、先行の請求項のうちの1つまたは複数に記載される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の1つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の抗原と一緒に含むワクチンから成る。本実施形態の利点は、腫瘍細胞の使用を避けることにから成る。ワクチン接種は、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを単に施すことによって実行することができ、抗原コード配列(単数または複数)は別個のベクターを用いて提供され、またワクチン接種は、すべての構成成分を提供するベクターを施すことにより、またはポリシストロン発現ユニットを施すことにより実行することができる。さらなる有利な実施形態は、上述したワクチンであって、遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび抗原コード配列(単数または複数)がウイルスまたは細菌担体として提供されるワクチンを含む。
【0015】
本発明の他の実施形態は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための調製物の製造のための上述した使用から成る。
【0016】
さらに、他の実施形態は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のためのIRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらから成る融合タンパク質であって、特に、IRF−1がその構成成分の1つであり、および/またはhERが融合タンパク質の他の構成成分である融合タンパク質に関する。
【0017】
本発明は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のためのIRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての上記メンバーおよび融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらからなる融合タンパク質からなるかまたは含む予防的および/または治療的組成物であって、特に、IRF−1が融合タンパク質の構成成分の1つであり、および/またはhERがその構成成分のその他の構成成分である、予防的および/または治療的組成物をさらに含む。
【0018】
さらに、本発明は、IRFファミリーのメンバーの発現のための上述した遺伝子構築物またはポリヌクレオチドがex vivoでチャージ(charge)されたヒト細胞、好ましくは、遺伝子移入、物理的形質導入、より好ましくは電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされたヒト細胞に関する。上述したヒト細胞は、自系または同種異系細胞であり得る。さらに、上述したヒト細胞は、腫瘍細胞、特に癌細胞、より好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍であり得る。付加的に、上述したヒト細胞は、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種に適する。
【0019】
本発明の好ましい有益な実施形態は、予防接種の実施形態に記述された1つまたは複数の遺伝子を用いて、遺伝子移入、物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入を施されたヒト抗原提示細胞(APC)に関する。
【0020】
最後に本発明は、IRFファミリーのメンバーの活性レベルがインターフェロン−βにより誘導されるIRF−1のレベルより高い上記のようなヒト細胞の実施形態を含有する。
【0021】
本発明の目的、その種々の特徴ならびに本発明それ自体は、添付の図/図面を参照しながら読むと、以下の説明からさらに十分に理解され得る。
【0022】
以下において、実施例および図面を参照しながら本発明をより詳細に開示する。しかしながら記載される特定の形態または好ましい実施形態は、すべての点で、本発明を説明するためであって、本発明を制限するものではなく、本発明の範囲は以下の説明ではなく添付の特許請求の範囲により指示され、したがって特許請求の範囲と均等の意味および範囲内であるすべての変更がその中に包含されるよう意図される。
【0023】
材料および方法
ベクター構築:
pBTTAHis:ヒスチジジノール遺伝子を含有するBbrPI/NotI断片をpDAF2HISから単離し(Spitzer et al., 1998)、対応する制限プラスミドpRBTtTA中に挿入した(Unsinger et al., 2001)。その結果生じたプラスミドをpBTTAHisと呼ぶ。Hepa1〜6細胞の安定的トランスフェクションのために、発現構築物IRF−1−hER(4)(pMT7RF−1−hER)およびプロマイシン耐性付与プラスミド(42)を本発明者等は用いた。pHBTMRS:三シストロン発現カセットとしてc−myc、c−Ha−rasおよびSEAP遺伝子を含有するEcoRI/NotI断片を、pRBTからの二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターの3’末端上に挿入した(Unsinger et al., 2001)。ヒロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼをPCR増幅し、pRBTMRS中の二方向性テトラサイクリン応答可能プロモーターからのPmeI 5’を介して挿入し、pHBTMRSを生じた(Kroger, 1999)。
【0024】
pCMVIHEG:IRF−1hER融合タンパク質遺伝子およびポリオIRES配列を含有するSpeI/EcoRI断片をCMVプロモーターおよびeGFP遺伝子間に挿入して、二シストロンmRNA上のIRF−1hERおよびeGEPを発現するプラスミドを生じた。pCMVIH:ポリオIRESおよびeGFPをコードする配列を、PmaCI/HpaIを用いたpCMVIHEGの消化および再連結により排除した。pLTR−TBTIHEG:IRF−1−hERおよびeGFPに関する二シストロン発現カセットを含有するPmeI/NotI断片を、対応して制限されたLTR−THTG中に挿入し(Unsinger et al., 2002)、pLTR−TBTIHEGを生じた。
【0025】
アデノウイルスコスミドの調製:
Ad−IH、Ad−IHEG、Ad−IHEGinv、Ad−LTR−TBTIHEG、Ad−LTR−TBTIHEGinv:組換えアデノウイルスを、大腸菌(E. coli)中でのクローニングにより組換えアデノウイルスゲノムの直接アセンブリーを可能にするコスミドクローニング手順を用いて構築した。コスミドベクターpAdcos45(Unsinger et al., 2002)をE1領域の単一クローニング部位でXbaIを用いて消化し、充填した。以下のカセットをこの部位に挿入した:PmeI/SwaI断片としてのpCMVIHEGのCMVIHEGカセット、BsrBI/FspI断片としてのpLTR−TBTIHEGのLTR−TBTIHEGおよびPme/SwaI断片としてのpCMVIHからのCMVIHカセット。DNAを連結し、パッケージング抽出物を用いてin vitroでパッケージングした。大腸菌DH5α中への形質導入後に、アンピシリン耐性クローンを単離した。大腸菌中でのin vitroパッケージングおよび増殖後に、Ad−IH、Ad−IHEG、Ad−IHEGinv、Ad−LTR−TBTIHEG、Ad−LTR−TBTIHEGinvのためのコスミド調製物を得た。制限分析は、予測された構造を確証した。
【0026】
細胞培養および遺伝子形質導入:
ネズミ繊維芽細胞NIH3T3細胞(ATCC CRL−1658)をダルベッコの変法イーグル培地(DMEM)中に保持し、Hepa1〜6細胞(ネズミH−2b−制限HCC細胞系;92110305;動物細胞培養の欧州コレクション(European Collection of Animal Cell Cultures))をRPMI1640培地中で成長させ、293細胞(低継代でのヒト胚腎細胞;ミクロビックス(Microbix)PD−02−01)を最少必須培地(MEM)中で培養した。培地に、10%エストロゲン無含有熱不活性化ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミンペニシリン(10U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充した。トランスフェクトNIH3T3細胞を128U/mlのハイグロマイシンB、800μg/mlのヒスチジノールまたは800μg/mlのG418を用いて選択した。Hepa1〜6細胞の選択のためには、1μg/mlプロマイシンを用いた。
【0027】
pBTTAHis、pHBTMRS、pMT7IRH−1−hERおよびネオマイシン耐性付与プラスミドpAG60を用いて、NIH3T3細胞を安定的に同時トランスフェクトした(Colbere et al., 1981)。Hepa1〜6細胞は、IRF−1−hERをコードする発現構築物(4)およびプロマイシン耐性付与プラスミド(42)を用いて安定的に同時トランスフェクトした。トランスフェクタントを選択し、単一クローンを採取し展開させた。その後、ウエスタンブロットによりタンパク質発現に関してクローンをスクリーニングした。
【0028】
組換えアデノウイルスの産生
組換えアデノウイルスの産生のために、リン酸カルシウム共沈殿を用いて、環状アデノウイルスコスミドDNA20μgを293ヘルパー細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後10〜14日目に、この時点でアデノウイルスプラークの形成が明白になった。ウイルスを収集し、293細胞を再感染させた。細胞変性作用が観察された後、ウイルス粒子を収集し、293細胞の感染により力価を確定した。DNA(Graham et al., 1991)は、予期された構造を確認するものであった。すなわち、コスミドDNAからのウイルス配列の精確な切除を制限分析により制御した。アデノウイルス感染のために、細胞をMEM培地中に播種した。翌日、100(Hepa1〜6細胞)または2(293細胞)のMOIを用いて、細胞を感染させた。2%FCSを補充したPBS 1ml中で組換えアデノウイルスを希釈した。アデノウイルス感染の1時間後に、5%FCSを補充した培地中で細胞をさらに培養した。
【0029】
IRF−1−hER融合タンパク質中のIRF−1の活性化のために、最終濃度が1μMに達するまでE2(SERVA, Frankfurt, Germany)を細胞培地に添加した。
【0030】
ウエスタンブロッティング。 全細胞抽出物から得られるイムノブロットを、ヒトエストロゲン受容体(HC−30、Santa Crutz Biotechnology, USA)のホルモン結合ドメインに対して誘導される抗体を用いてプローブし、メーカーの使用説明書に従ってECL(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)により可視化した。
【0031】
IFN試験。 マウスL929細胞(43)を用いた抗ウイルスアッセイにより、細胞培養上清中のインターフェロン濃度を確定した。抗ウイルス活性の特異性を確証するために、試験細胞への添加前に、マウスIFN−βに対して向けられる中和モノクローナル抗体を上清に添加した。
【0032】
細胞成長の測定。 細胞増殖の確定のために、2×103細胞/ウェルをマイクロタイタープレート中に播種して、段階希釈(1:1)を実施し、数個の別々の測定点を可能にした。細胞を指示濃度のβ−エストラジオールで処置した。メーカーの指示に従ってWSTキット(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を用いて、細胞成長を測定した。10%未満の偏差を生じる三重反復試験の平均値をプロットした。
【0033】
足場非依存性成長に関するアッセイ。 軟寒天中に懸濁した細胞のコロニー形成効率を評価することにより、足場非依存性増殖能力を確定した。0.6%下張り寒天(underlay agar)50μlで被覆したマイクロタイタープレート中の0.3%上塗り寒天(overlay agar)50μl中に、1×103細胞を播種した。誘導培地を上部に添加した(50μl/ウェル)。平板培養後3週間目に、コロニーを計数した。
【0034】
マウス。 雄C57L/J(H−2b)マウスをフライブルク大学病院(University Hospital Freiburg)の動物施設で飼育して、10〜25週齢で使用した。
【0035】
ヌードマウス実験
雄6〜8週齢NMRIヌードマウス(Harlan Winkelmann, Borchen, Germany)を、ドイツバイオテクノロジー研究センター(German Research Centre for Biotechnology)の動物施設のSPFユニットで飼育した。マウスを各群5匹の2つの実験群に分けた。0.2mlのPBS NIH3T3TA/MR/IH細胞中の1×106細胞をマウスの側腹部に皮下注射した。群を以下のように処置した:群1:未処置(n=5);群2:1.5mgのE2を2日毎にi.p.(n=4)。腫瘍容積を、カリパスを用いて週3回測定し、記録した。データは腫瘍容積の平均値として示す。
【0036】
腫瘍モデル。 同系ホスト中で確実な成長を示すので、C57L/JマウスにおけるHepa1〜6腫瘍モデル(44)を選択した。Hepa1〜6細胞は、C57Lマウスに生じたBW7756マウス肝癌の派生物である。MHCクラスIおよびII発現は、C57LおよびC57L/Jマウス間で同一であり、Hepa1〜6HCCはAFP発現により特徴付けられる。マウスの右側腹部に100μlの血清無含有MEM培地中で注射される1×107または5×106個のHepa1〜6細胞を用いて、100%のマウスにおけるHepa1〜6ネズミHCC細胞の確実な腫瘍成長が達成されることが実証され得た。6日後、腫瘍が可視的になり、平均で18日後に約2000mm3のサイズに達した。この腫瘍サイズを本発明における終点として用いて、その後、マウスを屠殺した。腫瘍発生率および容積を、カリパスを用いて2日毎に評価した。データは、平均容積+/−SEとして示す。
【0037】
フローサイトメトリー。 抗マウスH−2Kb/H−2Dbおよび抗マウスCD80特異的抗体(それぞれクローン28−8−6および01940B)を、およびその後のFITC−標識抗マウス(クローン02014D)またはFITC−標識抗ラット(クローン10094D)抗体それぞれを用いたFACS分析により、Hepa1〜6およびHepaIRF−1hER細胞中でのMHCクラスIおよびCD80発現を調べた。さらに、PE−またはFITC−標識抗体(抗体はすべて、PharMingen, San Diego, CA, USAから得られた)により、CD54(クローン01544D)、I−A/I−E(クローン06355A)およびCD86(クローン09274)の発現を確定した。
【0038】
組換えワクシニアウイルスの生成。 CTL応答を試験するために、AFP発現およびpSc11(空ベクター陰性対照)組換えワクシニアウイルスを前に記載された(44)ように生成した。
【0039】
細胞傷害性アッセイ。 腫瘍攻撃または対照マウスから得られた脾臓細胞を懸濁し、24ウェルプレート中でのin vitro刺激の6日後に、細胞傷害活性に関して脾臓細胞を分析した。1×107の野生型Hepa1〜6細胞を用いて、または特異性に関する陰性対照として、同系ルイス肺癌細胞(3LL)を用いて(ともに8000radで照射)、4×107の腫瘍で初回抗原刺激した脾臓細胞をインキュベートすることにより、in vitro刺激を実施した。AFP特異的免疫応答を評価するために、未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞を用いて、腫瘍攻撃または対照マウス由来の脾臓細胞をin vitroで刺激した。未処置同系ドナーマウスの脾臓細胞は、感染多重度(MOI)5で、UV−不活性化(300mJ)rVV−AFPにより、または特異性に関する陰性対照として、rVV−pSC11を感染させ、次に20Gy(2000rad)で照射して刺激細胞の増殖を防止した。その後、6時間51Cr放出アッセイを実施した。標的細胞として、AFP発現同系Hepa1〜6細胞およびAFP陰性同系ルイス肺癌細胞を用いた。結果は、次式により表した:溶解%=(実験的放出−自発性放出)/(最大放出−自発性放出)。実験的放出は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞により放出される平均数/分を表す。総放出は、5%トリトンX−100による標的細胞の全体的溶解後に放出された放射能を表す。自発性放出は、標的細胞のみに由来する培地中に存在する放射能を表す。Hepa1〜6腫瘍またはmAFP特異的溶解は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより示された。
【0040】
IFN−γおよびIL−4ELISPOTアッセイ。 多重スクリーン−HA96ウェルフィルタープレートを、4℃で一晩、4μg/mlのラット抗マウスIFN−γまたはラット抗マウスIL−4抗体(PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンR46A2または18191A)で被覆した。腫瘍攻撃または非攻撃マウス由来の脾臓細胞(1×105/ウェル)を、200μlの培地中の1×104照射刺激細胞(Hepa1〜6、3LLまたはrVV−AFP感染脾臓細胞)/ウェルを用いて20時間、三重反復試験で培養した。培養後、細胞を洗浄し、2μg/mlのビオチン化ラット抗マウスIFN−γまたはIL−4抗体(PharMingen, San Diego, CA, USA。それぞれクローンXMG1.2または18042D)を添加し、プレートを室温で3時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼポリマー(Mabtech, Koln, Germany)の1:1000希釈液を用いて室温で30分間インキュベートし、次に、ALP接合基質溶液(BCIP/NBT, BioRad, Richmond, USA)で展開した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数と比較したスポット形成細胞の数として表される。特異性に関する対照として、腫瘍攻撃マウスの脾臓細胞および異なる照射刺激細胞を単独で培養した。
【0041】
in vivo腫瘍実験の実験計画
腫瘍防御試験。 C57L/Jマウスの右側腹部に1×107Hepa1〜6(群1および2)またはHepaIRF−1hER(群3および4)細胞を接種した。群5にはいかなる腫瘍も接種しなかった。それぞれの群を以下のように処置した:
【0042】
【表1】
【0043】
再攻撃に対する防御。 ナイーブC57L/JマウスまたはHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して防御されたことのあるE2処置動物を、E2処置停止後11日目(初期腫瘍接種後28日目)に、1×107個の野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER(n=3)腫瘍細胞を用いて再攻撃した。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。
【0044】
腫瘍療法。 C57L/Jマウスの右側腹部に1×107個のHepaIRF−1hER(群1および2)細胞を接種した。両群とも、いかなるE2処置も受けなかった。19日目に、腫瘍は両群において約2000mm3のサイズに達した。19日目に開始して、群2(n=6)には、2日毎に28日目まで、1.5mgのβ−エストラジオールをi.p.注射した。その後、E2処置を2匹のマウスにおいては再び中止したが、一方、残りの4匹はE2療法を維持した。群1(n=3)のマウスはE2処置を受けなかったが、その後、腫瘍が10,000mm3に達した場合に屠殺した。
【0045】
in vivoモノクローナル抗体除去。 精製ハイブリドーマ上清のi.p.注射により、CD4およびCD8 T細胞亜集団を枯渇させた。総量1mg/マウス/注射の抗CD8(クローンYTS169)または抗CD4(クローンYTS191.1)(45、46)を、HepaIRF−1hER腫瘍接種の5日前、3日前および1日前、ならびにその後5日毎に注射した。種々の群を以下のように処置した:
【0046】
【表2】
【0047】
統計学的分析。 データはすべて、ウィルコクソンの符号付順位検定により分析した。0.05未満の両面p値は、統計学的に有意であると考えられた。腫瘍出現および2500mm3への成長をカプラン−マイアー法により算定し、各群に関する平均の標準偏差として示して、免疫接種マウスと対照マウス間の差異をマンテル−ヘンツェル検定により算定した。
【0048】
結果
in vitro分析
IRF−1はHCC細胞系Hepa1〜6の細胞成長を阻害する
IRF−1の構成的発現は、いくつかの細胞系に強力な細胞増殖阻害を強いる(4、24、40)。これは、異種IRF−1の非常に低い、しばしば不安定な発現に関して選択される安定トランスフェクタントを生じる。HCC細胞系Hepa1〜6の成長阻害剤としてのIRF−1の活性を確定するために、本発明者等は、したがって、条件付活性IRF−1hER融合タンパク質を用いた。ホルモン刺激の非存在下で、構成的発現キメラタンパク質は不活性であるが、タンパク質のhER部分とのE2の結合時に、活性配座に変わり得ることが実証された。IRF−1−hERは、Hepa1〜6細胞中で安定的にトランスフェクトされた。異なるレベルのIRF−1hER発現がトランスフェクタントで観察され(図1A、上パネル)、アクチン発現(図1A、下パネル)に正規化された。異なる強度のIRF−1hER発現を有する3つの細胞クローンを選択した(c4、c9、c22)。これらのクローンの細胞成長を、IRF−1活性化後7日目に確定した。図1Bに示したように、3つの細胞クローン由来の細胞は、増殖阻害に関してIRF−1活性に感受性であった。増殖阻害の程度は、異なる細胞クローン間で40〜80%変化し、異なる発現量のIRF−1と相関した。IRF−1−hERを発現しない野生型Hepa1〜6細胞を、対照として用いた。非トランスフェクト細胞系は細胞成長の変更を伴ってβ−エストラジオールに対して応答しなかった。これは、3つの細胞クローンすべてが活性化可能IRF−1を発現し、IRF−1表現型の典型的成長阻害特性に応答したことを示す。しかしながらHepa1〜6細胞の増殖阻害は、他の細胞系と比較した場合、非常に強力であるというわけではない(24)ことに留意すべきである。細胞増殖の低減にもかかわらず、細胞はこの状態でかなりの時間培養され得た。さらにこれらの細胞は、β−エストラジオールによるIRF−1活性化時にアポトーシスのいかなる兆候も示さなかった。これは、亜二倍体DNA((47)、データは示されていない)およびアネキシン染色((48)、データは示されていない)の実験により確証された。
【0049】
活性化IRF−1はIFN分泌を誘導する
IFN−βの誘導は、IRF−1活性化後に観察される典型的特性である。分泌IFN−βの量は、IRF−1活性の測定値とみなされ得る(17)。IFNは免疫調節に関連があるため、抗ウイルスアッセイによりIFN−βの分泌を確定した(表1)。IRF−1は、3つの細胞クローンすべてにおいて、β−エストラジオールにより活性化されることが示された。最高IFN分泌は、クローン22により示されたが、これは、IRF−1発現の強度(図1A)および増殖阻害(図1B)と一致する。IFN−βに対して誘導される中和抗体を用いて、分泌抗ウイルス活性が専らIFN−βであることを本発明者等は確認するものであった。IFNは、細胞増殖を阻害することが既知である。しかしながらHepa1〜6細胞クローンにより分泌されるIFN−βの量は、匹敵する量の組換えネズミIFN−βによる対照細胞の処置により確定されるように細胞成長に及ぼす観察された作用を媒介するのに十分でない(データは示されていない)。
【0050】
IRF−1活性化中の足場非依存性成長の低減
腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞と区別する最も決定的なin vitro特徴は、足場非依存性成長である。IRF−1がin vitroでのこのHCC細胞系の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、不活性または活性IRF−1の存在下で足場非依存性コロニーを形成するその能力を、本発明者等は試験した(図2)。非トランスフェクト腫瘍細胞クローンは、軟寒天中で良好に増殖した。IRF−1hERを発現しない形質転換野生型Hepa1〜6細胞系のコロニー形成は、β−エストラジオールにより影響されなかった。対照的に、軟寒天成長の能力は、異なる細胞クローン中では、活性化IRF−1により有意に低減された。非トランスフェクト細胞と対照的に、IRF−1hER保有細胞はより少ないが、しかしやや大きいコロニーを形成した。E2の存在下では、クローン22は軟寒天中で最低量のコロニーを形成したが、これはIRF−1hER発現の強度と逆相関する。クローン9は、E2処置細胞を上回る最高比率の、非処置細胞からの軟寒天コロニー形成を示した。したがってクローンc9(以下で簡単にHepaIRF−1hERと示す)を、さらなるin vitro特性化のために、かつin vivo腫瘍モデルのために用いた。
【0051】
活性化IRF−1hERは免疫学的に関連がある細胞表面タンパク質発現を調整する
IRF−1発現は、MHC遺伝子の発現を増大することが既に示されている(7、31)。FACS分析により、−エストラジオールによるIRF−1活性化の前後の細胞表面におけるMHCクラスI、MHCクラスII、CD54、CD80、およびCD86発現のレベルを、本発明者等は調べた。野生型Hepa1〜6およびE2未処置HepaIRF−1hER細胞は、MHCクラスII、CD80、およびCD86発現の欠如により特性化された。MHCクラスI(H−2Kb/H−2Db)は低レベルで、CD54は高レベルで発現された。HepaIRF−1hER細胞のE2処置はH−2Kb/H−2Dbの強力な上向き調節を生じ、CD54発現は依然として変化せず、MHCクラスII発現は弱く上向き調節された(図3)。CD80およびCD86発現は、陰性のままであった(データは示されていない)。
【0052】
IRF−1のアデノウイルス媒介性発現はHCC細胞の強力なIFN−β分泌をもたらす
広範囲の細胞中にIRF−1を移入するために、かつin vivo形質導入のための送達系として、IRF−1−hER融合タンパク質のためのpAdcos45含有発現カセットに基づいたアデノウイルスベクターを構築した。IRF−1−hERのcDNAをアデノウイルスベクターpAdcos45中に導入し、ウイルスを調製した。
【0053】
Hepa1〜6細胞をpAd−1H、pAd−IHEG、pAd−LTR−TBTIHEGおよびpAd−LTR−TBTIHEGinvウイルスで感染させた(図4A)。感染の48時間後に、ウエスタンブロット分析によりIRF−1−hER発現を分析した。これらのアデノウイルスに感染した細胞中で、高レベルのIRF−1hER発現が見出された(図4B)。感染細胞のE2処置または偽処置後に、IFN分泌を測定した。E2処置後にIRF−1 hER遺伝子を含有するアデノウイルスで感染させた細胞の培養上清中にIFNを検出したが、これは、IRF−1活性化のみがIFN分泌を誘導するが、感染自体では誘導しないことを示す(表2)。アデノウイルス性形質導入細胞における分泌IFNの量は、IRF−1hER融合タンパク質を安定的に発現するトランスフェクタントより3.5〜6倍多かった。
【0054】
IRF−1は癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞中で作用する
癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞中のIRF−1の作用を調べた。癌遺伝子c−mycおよびc−Ha−rasを条件付で発現するNIH3T3細胞を用いた。両癌遺伝子は、テトラサイクリン調節可能プロモーターの制御下で二シストロン的に発現された(Kroger, Dissertation, Universitat Braunschweig, 1999)。細胞は、IRF−1−hER融合タンパク質コード構築物で安定的にトランスフェクトされた。この細胞系は、非形質転換NIH3T3細胞中(ドキシサイクリンの存在下)での、ならびに細胞の形質転換状態(ドキシサイクリンの非存在下)でのIRF−1作用の研究を可能にする。IRF−1のin vitroでの抗腫瘍活性を調べた:増殖に及ぼす影響、軟寒天成長、ならびにE2処置によるIRF−1hER活性化を伴うおよび伴わないIFN誘導を測定した。これは、非形質転換状態ならびに形質転換状態で行われた。E2およびドキシサイクリンを5日間添加した。E2の非存在下での形質転換細胞は細胞成長の強化を示すという事実にもかかわらず、活性化IRF−1−hERは、非形質転換細胞および形質転換細胞の両方で、細胞成長の顕著な低減を同程度にもたらした(表3)。
【0055】
IRF−1が細胞の形質転換表現型を逆転するか否かを確定するために、軟寒天中のコロニーの形成をアッセイした。非形質転換状態の細胞は、軟寒天中で成長しなかった。対照的に、ドキシサイクリン(形質転換状態)の非存在下では、細胞は良好に成長し、軟寒天クローンを形成した。軟寒天増殖の能力は、E2贈与によるIRF−1の活性化により完全に撤廃された(表3)。抗ウイルスアッセイにより確定した場合のIFN分泌は、IRF−1活性の測定値とみなされた。E2処置によるIRF−1活性化は、非形質転換細胞および形質転換細胞において等価であると実証された(表3)。
【0056】
IRF−1活性化はヌードマウスにおける形質転換細胞の腫瘍成長を低減する
IRF−1は癌遺伝子性形質転換NIH3T3細胞においてin vitroで細胞形質転換を阻害したので、in vivoでの腫瘍原性に及ぼすその作用を評価した。IRF−1の考え得る抗腫瘍活性を立証するために、細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍形成をアッセイした。形質転換細胞の注射は4週間以内に腫瘍形成をもたらし、移植された動物の100%が6週間以内に腫瘍を発症した(図5)。マウスに形質転換細胞を接種し、E2で処置した場合、腫瘍成長の動態は劇的に変化した。1500mm3までの腫瘍サイズに達したのは未処置動物の場合より4週間遅く、E2処置マウスの40%が腫瘍を発症しなかった。これらの結果は、IRF−1hER融合タンパク質の活性化が、TおよびB細胞を欠く動物の形質転換細胞における腫瘍原性の動態を延長するのに十分であることを実証する。
【0057】
in vivo分析
IRF−1活性化はHCC成長を阻害する
C57L/Jマウスにおいて皮下で成長するネズミHepa1〜6HCCに対するIRF−1hER発現の抗腫瘍効力を確定するために、異なる処置群を無作為に計画した。同系C57L/Jマウスにおける腫瘍モデルのために用いられたHepa1〜6HCC細胞系は、中等度に速い腫瘍成長により特徴付けられ、移植された動物の100%が腫瘍を発症した。野生型Hepa1〜6およびHepaIRF−1hER細胞はともに、in vivo s.c.注射後にほぼ同一の腫瘍原性を示したが、これは、E2非処置HepaIRF−1hER細胞中の不活性IRF−1hER融合タンパク質の存在を示唆する(図6A、p>0.5)。17日以内に、大型腫瘍が発症し、平均サイズは1500mm3であった。野生型Hepa1〜6細胞を接種したマウスをE2で処置した場合、E2処置を伴わずにHepa1〜6またはHepaIRF−1hER細胞で攻撃されたマウスと比較して、腫瘍発症に及ぼす作用はまったく観察されなかった。これらの結果は、E2処置それ自体が腫瘍成長および動物の健康に及ぼす負の作用を有さないことを実証する。しかしながらHepaIRF−1hERを接種されたC57L/Jマウスが腫瘍接種の時点で開始するE2による2日毎のi.p.注射を受けた場合、腫瘍成長はかなり抑制された。8匹の動物のうちの6匹の動物が腫瘍成長に対して完全に防御され、2匹の動物が遅い増殖速度により特徴付けられる非常に小さい腫瘍のみを発症したことは重要な知見であった(図6A)。40日後、腫瘍サイズは450mm3に過ぎず、42日目にE2処置を中止しても、腫瘍の増殖速度が速まることはなかった。
【0058】
腫瘍細胞におけるIRF−1活性化は、T細胞記憶を誘導する
HepaIRF−1hERによる攻撃に対して防御されたE2処置マウスにおける腫瘍特異的記憶T細胞の存在を調べることに、本発明者等は興味を持った。したがって、腫瘍攻撃後28日目およびE2処置中止後11日目に、腫瘍無含有マウスに1×107個の野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER細胞(n=3)を接種した。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。図6Bに示したように、両群のマウスはすべて腫瘍成長に対して防御されたが、しかしCD8+T細胞in vivo枯渇後は防御されなかった(n=2、データは示されていない)。対照的に、E2処置を伴わないナイーブC57L/Jマウスは、迅速なHepa1〜6およびHepaIRF−1hER腫瘍成長により特徴付けられた。これらの結果は、活性IRF−1hERの発現による腫瘍特異的免疫性の初回抗原刺激後の腫瘍特異的T細胞記憶の存在を示唆する。
【0059】
IRF−1活性化腫瘍細胞によるCTL活性の誘導
実際、照射Hepa1〜6細胞を用いたin vitro刺激後のHepa1〜6標的細胞に対する強力なCTL活性は、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃され、かつE2で処置されたマウスにおいて観察された(図7A)。腫瘍攻撃されなかったマウスから、あるいはHepaIRF−1hER細胞で攻撃され、3LL細胞でin vitro刺激されたE2処置マウス由来の脾臓細胞がHepa1〜6標的に対する弱いバックグラウンド殺害活性のみを示したため、このCTL活性はHepa1〜6腫瘍細胞に対して特異的であった(図7A)。In vivoでサイトカイン産生細胞をモニタリングすることにより、一次T細胞応答を評価した。照射Hepa1〜6細胞による刺激時のIFN−γ(5,000のうち1)およびIL−4(10,000のうち1)を分泌する脾臓細胞の数の有意の増大(図7B)は、E2非処置/HepaIRF−1hER、E2非処置/Hepa1〜6、またはE2処置/Hepa1〜6攻撃マウスと比較して、HepaIRF−1hER腫瘍を接種されたE2処置マウスにおいて観察された(20,000IFN−γのうち1および40,000IL−4分泌T細胞のうち1、p=0.01)が、このことは、TH1およびTH2腫瘍免疫性の両方の有意の発症を示唆する。エリスポット(ELISPOT)分析により得られたin vivo結果とは対照的に、51Cr放出アッセイ(図7A)におけるCTL in vitro殺害活性の差は、異なる群間で統計学的に有意でなかった。これは、エリスポット(ELISPOT)技法と比較した場合の、腫瘍特異的T細胞のin vitro展開、ならびに51Cr放出アッセイのより低い感受性の結果であり得る。
【0060】
IRF−1活性化は腫瘍特異的自己抗原無視を打破する
より詳細にHCCに対する免疫応答を確定し、活性化IRF−1の発現が腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を初回抗原刺激し得たか否かを見出すために、標的としてHCC細胞中で高レベルでしばしば発現されるHCC特異的自己抗原AFPを本発明者等は選択する。高レベルでAFPを内因的に発現するHepa1〜6HCCに対する中間体CTL活性は、E2処置/HepaIRF−1hER攻撃マウスで観察された(図8A)。他の群(1,000,000のうち1)と比較した場合、これらのマウスにおいては、CTL活性は有意に強く(p=0.02)、AFP特異的IFN−γ(図8B)産生脾臓細胞(11,000のうち1)の数はより多かった(p=0.001)。腫瘍を伴わない対照動物においては、特異的CTL活性またはHepa1〜6または3LL標的細胞に対するバックグラウンド溶解強化は観察されなかった。さらに、これらの標的細胞の溶解の増大は、HepaIRF−1hER細胞で攻撃されたE2処置マウス由来のrVV−pSC11によるエフェクター細胞のin vitro刺激後に認められず、これは、AFPに対するCTL活性の特異性を示唆する(図8A)。エフェクターを伴わないrVV−AFP感染脾臓細胞単独を用いた、あるいはエフェクターのみを用いたエリスポットの実施はバックグラウンドスポット形成の増加を生じなかったが、これはさらに、AFP特異性を示唆する(データは示されていない)。これらのデータは、HCC腫瘍成長制御におそらくは関与するメカニズムである自己抗原AFPに対する耐性が活性化IRF−1の腫瘍内発現により破壊され得ることを実証する。
【0061】
ホスト免疫応答ではない他の因子はIRF−1活性化腫瘍細胞の拒絶に関与する
ホスト抗腫瘍免疫応答が腫瘍拒絶に関与する唯一のパラメーターであるか否かを確定するために、in vivoでのT細胞枯渇実験をHepaIRF−1hER腫瘍を用いて攻撃されたE2処置マウスで実施した(図9A)。非枯渇マウスは、腫瘍成長に対して再び防御された。CD4およびCD8 T細胞枯渇はともに、すべてのマウスにおいて腫瘍成長を生じたが、しかしながらこれはE2処置を受けなかった非枯渇マウスと比較して、有意に遅延されていた。この知見は、ホスト免疫応答が腫瘍防御における重要な因子であるということを暗に意味するが、腫瘍成長の初期制御においては部分的なものに過ぎないと思われる。
【0062】
IRF−1活性化は活発に成長する腫瘍の増大を停止する
E2非処置C57L/Jマウスにおいて皮下で成長中のHepaIRF−1hER HCCに対するIRF−1hER活性化の治療的効力を評価するために、腫瘍攻撃後19日目にE2処置を開始した。この時点で、腫瘍は約2000mm3の平均サイズに達していた。図9Bに示したように、腫瘍成長はE2処置の開始後4日目という早期に恒久的に停止されたが、これは、HCCに対するIRF−1活性化の有意の治療的な可能性を実証する。対照的に、HepaIRF−1hER腫瘍はE2非処置マウスにおいて急速に増殖した。9日間のE2処置は、長期腫瘍成長制御を誘導するのに十分であった。これは、E2処置が28日目に再び中止された6匹のE2処置マウスのうちの2匹において容易に実証された。これらのマウスにおける腫瘍成長は、二日毎のE2注射を受け続けたマウスと比較して、異ならなかった。
【0063】
一側腹部における腫瘍のIRF−1活性化は両側腹部の腫瘍成長に影響を及ぼす
腫瘍に対する治療的ワクチンとしてのIRF−1活性化の効力を調べた。マウスの右側腹部にHepaIRF−1hER細胞を皮下注射し、野生型Hepa1〜6細胞を左側腹部に注射した。動物を1.5mgのE2で2日毎に処置するか、または非処置のままにした。IRF−1−hERの活性化は、マウスの右側腹部のHepaIRF−1hER細胞の腫瘍成長を撤廃した。さらに、左側腹部に野生型Hepa1〜6の腫瘍成長も、1日目に開始されたHepa1〜6腫瘍成長と比較して低減されたが、それが非処置動物において起きたようなさらなる展開は抑制された。
【0064】
考察
HCCは、予後は不十分で、治療的意見も少なく非常に悪性の腫瘍である。IRF−1の活性化を意図する新規の免疫療法的アプローチを検討した。β−エストラジオールの存在下で活性になるIRF−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質をコードするネズミHCC細胞系(HepaIRF−1hER)を構築した。in vitro表現型、細胞成長、in vitroでの足場非依存性成長、in vivoでの免疫原性、およびIRF−1の治療的な可能性をすべて調べた.安定的構成的IRF−1発現は、低発現クローンを選択するという欠点を有する。このような細胞系における実際的導入遺伝子発現は、内因性IRF−1発現の多くを無効にするというわけではない。さらに構成的発現は、長期に亘ってIRF−1応答性の損失に対する選択を誘導する(4、40)。対照的に、本発明に用いられる活性化可能IRF−1hER系は、IRF−1活性の厳密な調節を可能にし、腫瘍細胞中でかなり高レベルのIRF−1を発現させる。E2(E2=β−エストラジオール)活性化可能系は広範に研究されており、野生型IRF−1遺伝子のテトラサイクリン調節性転写活性化とも比較されてきた。差異は見出されなかった(Kirchhoff et al., 1995; Koster et al., 1995)。突然変異体エストラジオール受容体遺伝子(49)の使用のために、融合タンパク質は、低エストラジオール濃度に対して無反応性であり、したがって内因性エストロゲンレベルにより活性化されることなくマウスにおいて用いられ得る。しかしながらIRF−1hERのそれぞれのタモキシフェン特異的突然変異体(50)は、IRF−1活性の厳密な調節を示さなかった(A. Kroger、未発表)。したがってβ−エストラジオール誘導系を用いて、IRF−1の抗腫瘍作用をより詳細に本発明者等は取り扱い、かつその異なる抗腫瘍性エフェクターアームの活性化を分析し得た。
【0065】
Hepa1〜6細胞の成長および形質転換の阻害をin vitroで実証し、IRF−1の先天免疫活性に帰すべき特性を確証した。異所性IRF−1発現は、myc、fosB(29)、IRF−2(51、52)、EGFRおよびEla/b(24)のような異なる癌遺伝子により誘導される細胞形質転換特性をin vitroで抑制する。野生型細胞中のc−Ha−ras癌遺伝子の発現が成長制限条件下で細胞にアポトーシスを被らせるがIRF−1−/−細胞中ではそうではないIRF−1−/−マウスからの胚性繊維芽細胞を用いて早期に得られた結果(Tanaka et al., 1994)の通りに、NIH3T3細胞におけるEGFRおよびIRF−1の組合せ活性は、アポトーシスによる有意の細胞死を誘導することが示された(24)。しかしながらこの報告に提示されたデータは、in vitroでの癌遺伝子依存性腫瘍抑制がアポトーシスにより媒介される必要がないことを示す。したがって形質転換阻害のその他のメカニズムが働くことが予測される。IRF−1は、形質転換阻害に寄与し得る多数の遺伝子のDNA結合およびトランス活性化によりその作用を発揮する。それらの例としては、リシルオキシダーゼ(16)、PKR(17、53)、2’−5’OASE(18)、インドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(19)、およびII型アンギオテンシン受容体(20)がある。この状況でのIFN−β分泌の役割は明らかでないが、これらの遺伝子のフィードバックエンハンサーとして作用し得る。
【0066】
IRF−1は、いくつかのその他の関連するin vivo抗腫瘍活性を有する。これらは、IRF−1の免疫調節作用、例えばヘルパーTおよびNK細胞の刺激(54、55)、MHC遺伝子(4、31、56、57)の、ならびに抗原提示に関与する遺伝子(38、58)の転写の強化によるものである。したがってIRF−1の発現または活性を強化するほとんどの事象または薬剤が、形質転換細胞の特異的殺害を誘導することにより癌療法に有用であり得る。実際、マウスにおける実験が記載され、攻撃的非免疫原性肉腫細胞におけるIRF−1の発現が悪性表現型を抑制することが実証されている(40)。
【0067】
高腫瘍原性HCC細胞系のin vivoでの抑制および制御は、IRF−1の最も重要な活性であった。E2処置は、HepaIRF−1hER腫瘍を用いた攻撃に対して75%のマウスを防御し、腫瘍を発症するマウスは、E2非処置動物と比較して、腫瘍成長の有意の抑制および生存強化により特徴付けられた。同様の結果は、肉腫細胞系中でのIRF−1の構成的発現が部分的な腫瘍制御を生じた近年の研究において観察された(40)。T細胞枯渇実験により、CD4+およびCD8+T細胞が腫瘍成長の制御に重要な役割を果たすということが実証されたが、これは、TH1分化の誘導におけるIRF−1の既知の重要性を確証する(55)。さらに、腫瘍成長に対して相乗的に作用し得る腫瘍特異的TH2細胞の有意の活性化を、本発明者等は観察した(59、60)。CD4+およびCD8+の両方の枯渇実験の作用は、IRF−1媒介性腫瘍成長制御の全体的作用を説明することができない。IFN−βはNK細胞を活性化し得ることが示された。したがってNK細胞は腫瘍制御に寄与することができる。
【0068】
IRF−1の腫瘍内発現が、HCC特異的自己抗原AFPのような腫瘍関連抗原に対する有意のT細胞応答を誘導することがはじめて実証されたことはさらに重要であり、これは、AFPに対する耐性がこのアプローチにより破壊され得ることを示唆する。AFP特異的CTL活性は、高免疫原性ウイルス抗原、例えばHBVまたはHCV構造タンパク質と比較して、低かった(61、62)。これは、低CTL前駆体頻度および/または低親和性TCRの結果であり得る。しかしながら近年の研究は、DNAまたは樹状細胞ベースの免疫接種後のAFP特異的T細胞がAFP発現ネズミHCCに対してin vivoで機能的であることを実証した(44、63)が、これは、AFP特異的T細胞が、本発明に提示されたような抗腫瘍作用に寄与したことを示唆する。細胞性イムニティーのみは、in vivo枯渇実験により実証されるように腫瘍成長を完全に制御し得なかったが、腫瘍に対する有意のT細胞記憶が誘導され、これは、さらなるE2処置を用いずにHepaIRF−1hERを用いた再攻撃、野生型Hepa1〜6細胞を用いてさえの再攻撃に対してマウスを防御した。HCC診断後の臨床状態を反映するIRF−1発現の考え得る治療的効力が示されたことはさらに重要である。E2を用いた大型HepaIRF−1hER腫瘍を保有するマウスの処置は、4日以内に腫瘍の成長停止を生じた。9日間に亘るE2処置は、任意のさらなるE2処置を伴わずに長期間腫瘍成長を制御するのに十分であった。上記の腫瘍防御試験によれば、この長期腫瘍制御は主として免疫媒介され得る。
【0069】
IRF−1を発現するHCC腫瘍の免疫原性強化は、上記のようにMHCクラスIおよびII分子の上向き調節により媒介され得るが、MHCクラスII誘導はHCC細胞中では低かった。共刺激性分子CD80およびCD86は検出することができなかったが、このことは、抗腫瘍性免疫応答の初回抗原刺激が、プロ抗原提示細胞により排液リンパ節で起きたに違いないことを示唆する。IRF−1媒介性腫瘍成長制御に関与する付加的因子は、プロテアソームによる免疫系への提示のための次世代のMHCクラスI制限抗原性ペプチドであり得る(38、39、58)。
【0070】
Yim等(40)が予知したように、異所性IRF−1発現は有意の治療的抗腫瘍性免疫応答を誘導し、組織特異的自己腫瘍抗原、例えばAFPに対する免疫を初回抗原刺激することが初めて示された。したがって本発明者等の結果は、HCCの局所的およびAFPベースの免疫療法との関連を有し得る。
【0071】
要約すると、肝細胞癌(HCC)は、予後は不十分で、治療的意見も少ない非常に悪性の腫瘍である。
【0072】
HCCは、他の腫瘍存在物の一例とみなされる。IRF−1は他の腫瘍種において同一の全身性作用を有するという良好な証拠がある。以下の例は、この仮説を支持する:
1. Yim等(1997;40)は、肉腫細胞系は、IRF−1を発現する場合、拒絶および免疫性を部分的に誘導すると報告した。IRF−1は十分に発現されなかったため、作用は完全でなかった。
2. 癌遺伝子性形質転換3T3細胞を用いた例は、活性IRF−1が発現された場合、ヌードマウスにおいてさえ、腫瘍成長が有意に低減されるという見解を支持する。ヌードマウスにおける腫瘍成長の遅延は、in vitroデータから予測されたものより非常に高く、これは、この動物における免疫系の残りの部分が関与したことを示す。
3. 多数の異なる癌遺伝子性形質転換細胞系を用いたin vitroデータは、IRF−1が軟寒天成長を有意にまたは完全に抑制し、インターフェロン分泌を誘導し、MHC上向き調節を活性化することを示す(Kirchhoff et al., 1999およびKroger et al.、未発表データ)。
【0073】
マウスにおける腫瘍防衛の詳細な分子機能は既知でないが、提示されたデータは、免疫細胞(CTL、TH1およびTH2細胞)が関与することを示す。ヌードマウス実験は、NK細胞も関与することを示唆する。IFN−βはNK細胞活性の強力な活性剤であることが既知である。さらにIFN−βは、適応免疫系における多様な活性化機能に関しても既知である。最後に、IRF−1のアポトーシスならびに成長阻害作用は、IRF−1を過剰発現する細胞中で観察される腫瘍阻害作用に寄与し得る。免疫学的作用はMHC上向き調節およびインターフェロン分泌により媒介されると考えられるが、IRF−1により誘導されるその他の、今のところ未知の活性が抗腫瘍作用に寄与し得る。
【0074】
IRF−1活性化時に分泌されるインターフェロンは、全身的に、ならびに局所的に作用し得る。したがって、抗原提示細胞(例えばIRF−1を過剰発現するもの)の周囲におけるIFNの産生は、抗腫瘍活性の高度の刺激をもたらすと考えられる。
【0075】
本発明の研究において、IRF−1は抗腫瘍活性を誘導することが実証された。IRF−1と比較した場合、他のIRFが類似の結合特性を有することはよく知られている。例えばIRF−3は、IRF−1により活性化されるのと同一のまたは類似の組の遺伝子を活性化し得ると思われる。したがって構成的に活性である恒久的活性化IRF−3またはIRF−3変異体は、ここに示されたのと同一の抗腫瘍活性を有し得る。
【0076】
動物腫瘍モデルにおいて観察された作用はどのようにヒト療法に転換され得るであろうか。シナリオはすべて、IRF−1または関連転写因子の強力な活性に基づいている(上記参照)。
【0077】
1. 細胞療法:
ウイルス感染またはその他の遺伝子移入方法により、患者の腫瘍細胞または同一腫瘍実態を有する他の患者からの腫瘍細胞(同種異系細胞)に遺伝子をチャージすることができた。これらの遺伝子が一時的に発現されるかまたは長期間発現されるかは重要でない。あるいは、標的腫瘍に関連する腫瘍抗原を提示し得るかまたは提示させ得る非特異的細胞またはプロフェッショナル抗原提示細胞が、IRF構築物によりチャージされる。これらの細胞は、患者由来か、または同種異系であり得る。これらの細胞中でのIRF遺伝子の活性化は、患者への贈与の直前にin vitroで活性化され得る。あるいは、それらはそれぞれの活性剤(β−エストラジオールまたはテトラサイクリン)の贈与により患者内で活性化され得る。ヒトにおいては、細胞療法は、通常は他の細胞を不活性化することにより、UVまたはγ線照射のような方法により実行される。
【0078】
2. ウイルス移入法による遺伝子療法
例えば上記のようなIRFは、上記のアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターにより形質導入され得る。好ましくはこれは腫瘍中または腫瘍付近の組織中へのウイルスの感染により行われる。ある場合には、それは、全身的適用によっても行われ得る。これは典型的には、血流中へのアデノウイルスの適用による肝臓腫瘍の場合に行われる。アデノウイルスは主に肝臓で捕捉され、したがって遺伝子移入は極端に肝臓特異的であることがよく知られている。ウイルスベクターにより保有されるIRFの活性化または低減は、それぞれの作用物質により患者においてin vivoで活性化される。非腫瘍細胞中でのIRF−1活性化が可逆的増殖阻害を引き起こすが、阻止作用をもたらさないということを初期の研究は示したことに言及する必要がある。
【0079】
3. 非ウイルス法による遺伝子療法
遺伝子がヒト組織中に移入され得る多数の方法が既知である。それらの例としては、リポフェクション、遺伝子銃、電気穿孔等がある。IRFは、これらの方法によりそれぞれの腫瘍組織中にトランスフェクトされ得る。
【0080】
4. 患者の腫瘍中のまたは抗原提示細胞中の内因性IRF−1の活性化または誘導は、サイトカインおよびその他の生物学的応答修飾剤のような多数の化合物から活性化または誘導され得る。それらがIRF−1の転写および産生を活性化することは既知である。強力な誘導物質またはこのような組合せを用いて、IRF−1を誘導し、かつ観察された抗腫瘍作用を誘導し得る。内因性IRF−1を活性化する、ハイスループットスクリーニングにより典型的に見出されるその他の化合物も、同一方法で用い得る。
【0081】
【表3】
【0082】
【表4】
【0083】
【表5】
【0084】
【表6】
【0085】
参照文献
1. ボッシュ,X.,ライブス,J., アンド ボラス,J エピデマイオロジー・オブ・プライマリー・リバー・キャンサー、セミナー・リバー・Dis. 19: 271−285, 1999
2. オクダ,K. ヘパトセルラー カルシノマ、J.,ヘパノール, 32: 225−237, 2000
3. ハロッシュ,S.,レベル,M., アンド セバス,J. インダクション・バイ・インターロインキン−6・オブ・インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF1) ジーン エクスプレッション スルー ザ パラリンドロミック インターフェロン レスポンス エレメント pIRE アンド セル タイプ−ディペンデント コントロール オブ IRF−1 バインディング ツゥ DNA、Embo J. 13: 1942-9, 1994
【0086】
4. カーシュホフ,S., シャパー,F. アンド ハウザー,H. インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF−1) メディエーツ セル グロース インヒビション バイ トランスアクチベーション オブ ダウンストリーム ターゲット ジーンズ, ヌクレイック アシッズ Res., 21, 2881, 1993
5. パイン,R. コンスティチューティブ エクスプレッション オブ アン ISGF2/IRF1 トランスジーン リーズ ツゥ インターフェロン−インディペンデント アクチベーション オブ インターフェロン−インディゥシブル ジーンズ アンド レジスタンス ツゥ ビールス インフェクション, J Virol. 66, 4470-8, 1992
6. リース,L.F.,ハラダ,H.,ウォルコック,J.D.,タニグチ,T., アンド ビルセック,J. クリティカル ロール オブ ア コモン トランスクリプション ファクター,IRF−1, イン ザ レギュレーション オブ IFN−ベータ アンド IFN−インディゥシブル ジーンズ, Embo J. 11, 185-93, 1992
7. チャン,C.H.,ハマー,J.,ロー,J.E.,フォダー,W.L. アンド フラベル,R.A. ザ アクチベーション オブ メジャー ヒストコンパティビィリィティ コンプレックス クラス I ジーンズ バイ インターフェロン レギュラトリー ファクター−1 (IRF−1), インムノジェネティックス 35: 378-84, 1992
【0087】
8. キムラ,T.,ナカヤマ,K.,ペニンガー,J.,キタガワ,M.,ハラダ,H.,マツヤマ,T.,タナカ,N.,カミジョー,R.,ビルセック,J.,マック,T.W., アンド エト アル インボルブメント オブ ザ IRF−1 トランスクリプション ファクター イン アンチビーラル レスポンス ツゥ インターフェロンズ, サイエンス 264: 1921−4, 1994
9. フジタ,T.,キムラ,Y.,ミヤモト,M.,バーソーミアン,E.L., アンド タニグチ,T インダクション オブ エンドジーニアス IFN−アルファ アンド IFN−ベータ ジーンズ バイ ア レギュラトリー トランスクリプション ファクター, IRF−1, ネイチャー 337: 270−2, 1989
10. ハラダ,H.,フジタ,T.,ミヤモト,M.,キムラ,Y.,マルヤマ,M.,フリア,A.,ミヤタ,T., アンド タニグチ,T. ストラクチュアリー シミラー バット ファンクショナリー ディスティンクト ファクターズ, IRF−1 アンド IRF−2, バインド ツゥ ザ セイム レギュレイトリー エレメンツ オブ IFN アンド IFN−インディゥシブル ジーンズ, セル 58: 729−39, 1989
11. マツヤマ,T.,キムラ,T.,キタガワ,M.,プフェファー,K.,カワカミ,T.,ワタナベ,N.,クンディー,T.M.,アマカワ,R.,キシハラ,K.,ベァッケム,A., アンド エト アル ターゲッテッド ディスループション オブ IRF−1 オア IRF−2 リザルツ イン アブノーマル タイプ I IFN ジーン インダクション アンド エイベラント リンフォカイト デベロップメント, セル 75: 83−97, 1993
【0088】
12. ラフナー,H.,リース,L.F.,ナフ,D., アンド ヴァイスマン,C. インダクション オブ タイプ I インターフェロン ジーンズ アンド インターフェロン−インディゥシブル ジーンズ イン エンブリオナル ステム セルズ デヴォイド オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 1, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 11503−7, 1993
13. リース,L.F.,ラフナー,H.,スターク,G.,エイグエト,M., アンド ヴァイスマン,C. マイス デヴォイド オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF−1) ショウ ノーマル エクスプレッション オブ タイプ I インターフェロン ジーンズ, Embo J. 13: 4798−806, 1994
14. ペレグリニ,S. アンド シンドラー,C.アーリー イベンツ イン シグナリング バイ インターフェロンズ, トレンズ バイオケミ ソサイエティー 18: 338−42, 1993
【0089】
15. カミジョー,R.,ハラダ,H.,マツヤマ,T.,ボスランド,M.,ゲレチターノ,J.,シャピロー,D.,ル,J.,コー.,S.I.,キムラ,T.,グリーン,S.J., アンド エト アル リクイアメント フォー トランスクリプション ファクター IRF−1 イン NO シンザーゼ インダクション イン マクロファージズ, サイエンス 263: 1612−5, 1994
16. タン,R.S.,タニグチ,T.,およびハラダ,H(Tan, R. S., Taniguchi, T., and Harada, H.)、 アイデンティフィケーション・オブ・ザ・リシル・オキシダーゼ・ジーン・アズ・ターゲット・オブ・ジ・アンチオンコジェニック・トランスクリプション・ファクター、IRF−1、アンド・イッツ・ポッシブル・ロール・イン・テューマー・サプレッション, キャンサー・レス(Cancer Res.)、 56 : 2417-21,1996.
17. キルコッフ,S.,コロミラス,A.E.,シャペル,F.,グラショフ,M.,ソネンベルグ,N.,およびハウザー,H.(Kirchhoff, S., Koromilas, A. E., Schaper, F., Grashoff, M., Sonenberg, N., and Hauser, H.)、 IRF−1・インデュースド・セル・グロース・インヒビション・アンド・インターフェロン・インダクション・リクワイヤーズ・ジ・アクティビティ・オブ・ザ・プロテインキナーゼ・PKR、オンコジーン(Oncogene)、 11 : 439-45,1995.
【0090】
18. ベネチェ,P.,ビグネロン,M.,ペレツ,D.,レベル,M,およびチェバス,J.(Benech, P., Vigneron, M., Peretz, D., Revel, M., and Chebath, J)、インターフェロン−レスポンス・レギュラトリー・エレメンツ・イン・ザ・プロモーター・オブ・ザ・ヒューマン・2´,5´−オリゴ(A)・シンターゼ・ジーン、 モル・セル・バイオ(Mol Cell Biol.)、 7 : 4498-504,1987.
19. タキカワ,O.,クロイワ,T.,ヤマザキ,F.,およびキド,R.(Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., and Kido, R.)、メカニスム・オブ・インターフェロン−ガンマ・アクション。キャラクタライゼーション・オブ・インドレアミン2,3−ジオキシゲナーゼ・イン・カルチャード・ヒューマン・セルズ・インデュースド・バイ・インターフェロン−ガンマ・アンド・エバリューション・オブ・ジ・エンザイム−メディアイティッド・トリプトファン・デグラデーション・イン・イッツ・アンチセルラー・アクティビティ、ジェイ・バイオロ・ケム(J Biol Chem.)、 263: 2041-8,1988.
20. ホリグチ,M.,ヤマダ,T.,ハヤシバ,W.,およびダザウ,V.−J.(Horiuchi, M., Yamada, T., Hayashida, W., and Dzau, V.-J. )、インターフェロン・レギュレトリー・ファクター−1・アップ−レギュレイテス・アンジオテンシンII・タイプ2レセプター・アンド・インデューシズ・アポトーシス、ジェイ・バイオロ・ケム (J Biol Chem.)、 272: 11952-8,1997.
【0091】
21. タナカ,N.,イシカワ,M.,キタガワ,M.,ハラダ,H.,キムラ,T.,マツヤマ,T.,ランピアー,M.S.,アイザワ,S.,マック,T.W.,およびタニグチ,T.(Tanaka, N., Ishihara, M., Kitagawa, M., Harada, H., Kimura, T., Matsuyama, T., Lamphier, M. S., Aizawa, S., Mak, T. W., and Taniguchi, T.)、セルラー・コミットメント・トゥ・オンコジーン−インヂュースド・トランスフォーメーション・オア・アポトーシス・イズ・ディペンデント・オン・ザ・トランスクリプション・ファクター・IRF−1、セル(Cell)、 77: 829-39,1994.
22. ロウエ,S.W.およびルレイ,H.E.(Lowe, S. W. and Ruley, H. E.)スタビライゼーション・オブ・ザ・p53・テューマー・サプレッサー・イズ・インデュースド・バイ・アデノウイルス5 E1A・アンド・アコンパニス・アポトーシス、ジーン・デヴィ(Genes Dev.) 7: 535-45,1993.
23. アッタルディ, L. D., ロウエ, S. W.,ブルガロラス, J., アンド ジャックッス, T. トランスクリプショナル アクティベーション バイ p53, バット ノット インダクション オブ ザ p21 ジーン, イズ エッセンシャル フォー オンコジーン-メディケイティッド アポトシス, エンボ J. 15 : 3693-701,1996.
24. キルヒホッフ, S. アンド ハウザー, H. コーペラティブ アクティビティー ビトイーン ハー オンコジーン アンド ザ チュモア サプレッサー IRF-1 リザルト イン アポトシス, オンコジーン 18 : 3725-36,1999.
25. チン, Y. E., キタガワ, M., マカイダ, K., フラベル, R. A., アンド FU, X. Y. アクティベーション オブ ザ スタット シグナリング パスウェイ キャン コーズ エクスプレッション オブ キャスパス 1 アンド アポトシス, モル セル バイオル. 17: 5328-37,1997.
26. タムラ, T., イシハラ, M., ランフィア, M. S., タナカ, N., オオイシ, I., アイザワ, S., マツヤマ, T., マック, T. W., タキ, S., アンド タニグチ, T. DNA ダメージ-インデュースト アポトシス アンド アイス ジーン インダクション イン ミトジェニカリー アクティベイテッド T リムファシテス リクワイヤ IRF-1, ルーケミア. 11 SUPPL 3: 439-40,1997.
【0092】
27. ヤマダ, G., オガワ, M., アカギ, K., ミヤモト, H., ナカノ, N., イトウ, S., ミヤザキ, J., ニシカワ, S., ヤマムラ, K., アンド タニグチ, T. スペシィフィック ディプレッション オブ ザ B-セル ポピュレーション インデュースト バイ アベラント エクルプレッション オブ ヒューマン インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 ジーン イン トランスジェニック マイス, Proc Natl Acad Sci U S A.
88: 532-6,1991.
28. ウィリアム, C. L., シーバー, C. E., パラビシン, M. G., ハラダ, H., タナカ, N., スロバク, M. L., ヤマモト, H., ハラダ, K., ミーカー, T. C., リスト, A. F., アンド et al. デリーションof IRF-1, マッピング トゥー クロモソウム 5q31. 1, イン ヒューマン ルーキーミア アンド プレルーキック ミエロディスプラシア, サイエンス. 259 : 968-71,1993.
29. タナカ, N., イシハラ, M., アンド タニグチ, T. スプレッション オブ c-myc or FOSB-インデュースト セル トランスフォーメイション バイ ザ トランスクリプション ファクター IRF-1, キャンサー レット. 83: 191-6,1994.
30. ノザワ, H., オダ, E., ナカオ, K., イシハラ, M., ウエダ, S., ヨコチ T., オガサワラ, K., ナカツル, Y., シミズ, S., オオヒラ, Y., ヒオキ, K., アイザワ, S., イシカワ, T., カツキ M., ムトウ, T., タニグチ, T., アンド タナカ, N. ロス オブ トランスクリプション ファクター IRF-1 アフェクツ チューモア サスセプティビリティー イン マイス キャリング ザ Ha-ras トランスジーン オア ナリジゴスティー フォー P53, ジーンズ Dev. 13 : 1240-5,1999.
31. ホバート, M., ラマサール, V., ゴエス, N., アームソン, J., アンド ハロラン, P. F. ザ インダクション オブ クラスI アンド II メジャー ヒストコンパチビリチ コンプレックス アロゲニイック スチムレーション イズ デペンダント オン ザ トランスクリプション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター1(IRF-1): オブザベーション イン IRF-1 ノックアウト マイス, トランスプランテーション. 62 : 1895-901,1996.
【0093】
32. サルコウスキ, C. A., バーバー, S. A., デトーレ, G. R., アンド ボーゲル, S. N. ヂファレンチャル ヂィスレギュレーション オブ ニトリックオキシド プロダクション イン マクロファージス ウイズ ターゲッテド ヂィスラプションズ イン IFN レギュラトリ ファクタ-1 アンド-2 ジーン, J Immunol. 3107-10, 1996.
33. オガサワラ, K., ヒダ, S., アジミ N., タガヤ, Y., サトー, T., ヨコチ-フクダ, T., ワルドマン, T. A., タニグチ, T., アンド タキ, S. レクアイアメント フォア IRF-1 イン ザ マイクロエンビロンメント サポーテイング デベロップメント オフ ナチュラル キラー サイボウ, ネイチャー. 391 : 700-3,1998.
34. ハラダ, H., ウイリソン, K., サカキンバラ, J., ミヤモト, M., フジタ, T., アンド タニグチ, T. アブセンス オフ ザ タイプ I IFN システム イン EC セルス: トランスクリプショナル アクチベーター (IRF-1) アンド レプレッサー (IRF-2) ジーンス アー デベロップメンタリー レグレーテッド, セル. 63 : 303-12,1990.
35. キルヒホッフ, S., ヴィルヘルム, D., アンゲル, P., アンド ハーサー, H.
NFkappaB アクチベーション イズ レクアイアド フォア インターフェロン レギュラトリー ファクター-l-メヂィエートド インターフェロン ベータ インダクション, ユーロ J バイオケム. 261 : 546-54,1999.
【0094】
36. オーテキ, T ヨシダ, H., マツヤマ, T., ダンカン, G. S., マック, T. W., アンド オーハシ, P. S. ザ トランスクリプション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター 1 (IRF-1) イズ インポータント ダーリング ザ マチャーション オフ ナチュラル キラー 1.1+ T セル レセプター- アルファ/ベータ+ (NK1+ T) セルズ, ナチュラル キラー セルス, アンド インテスチナル イントラエピセリアル T セル, J Exp Med. 187: 967-72, 1998.
37. タナカ, N., イシハラ, M., ランフィアル, M. S., ノザワH., マツヤマ, マック. W., アイザワ, トキノ,T オーレン, タニグチ, T コーポレーション オブ ザ ツマーア サプレッサーズ IRF-1 and p53 イン レスポンス ツー DNA ダメージ, ネイチャー. 382: 816-8,1996.
38. ホワイト, L. C., ライト, K. L., フェレックス, N. J., ルッフナー, H., レイスパイン, R., アンド チング, J. P. レギュレーション オブ LMP2 アンド TAP1 ジーンス バイ IRF-1 エクスプレインズ ザ パウシチー オブ CD8+ T セルズ イン IRF-1-/-マイス イミュニチィー. 5: 365-76,1996.
39. フォッス, G. S. アンド プライズド, H. インターヘロンレギュレタリー ファクターズ1 メヂィエート ザ インターフェロン−ガンマ インダクション オブ ザ ヒュマン イミュノプロテオゾーム サブユニット マルチカタリチィク エンドペプチダーゼ コンプレックス-ライク 1, J バイオル ケム. 274: 35196-202,1999.
40. イム, J. H., フー, S. J., カーシー, M. J., ノートン, J. A., アンド ドーハテイ, G. M. IFN レギュラトリー ファクター-1 ジーン トランスファー インツー アン アグレッシブ, ノンイミュノギェニック サルコーマ サプレッスズ ザ マリグナント フェノタイプ アンド エンハンスズ イミュノゲニシチィ イン シンゲネイック マイス, J イミュノル. 1581284-92,1997.
【0095】
41. ダイ ビィシェグリー, A. M., カリサーズ Jr., R. L., アンド ゴレス, G.
J. ヘパトセルラー カルシノーマ, ヘパトロジー. 28: 1161-1165,1998.
42. バラ, J. A., ポルテラ, A., オーチン, J., アンド ジメネズ, A.
エクスプレッシュンズ イン マンマリアンズ セルズ オブ ア ジーン フローム ステファロミセス アルボニガー コンファーニング ピューロマイシンレジスタンス, ヌクレイック アシズ レス. 14: 4617-24,1986.
【0096】
43. ジンター, H. アンド ハーサー, H. スーパーインダクション オブ ザ ヒューマン インターフェロン-ベータ プロモーター, エンボ J. 6: 599-604,1987.
44. グリム, C., オートマン, D. モール, L., ミカラック, S., クローネ, T. U., メッキェル, S., エイセレ, S., エンケ, J., ブルム, H. E., アンド ゲイスラー, M. トリートメント オブ ヘパトセルラー カルシノーマ バイ ブリ−キング イミュノロギカル イグノーランス トワード アルファ ユージング ゲネチック イミュニゼーション イン マイス, ガストロエンタロロギィ 119 : 1104-1112,2000.
【0097】
45. シルムベック, R., ワイルド, J., ブルーム, H. E., チサリ, F. V., ガイスラー, M., および ライマン, J. 「オンゴーング T1 オア T2 イムノ レスポンス トゥ ザ ヘパティティス B サーフェイス アンチゲン (HBsAg) アー エクスクルーデッド フロム ザ レバー オブ マイス イン フィッチ トランスジーン-エンコーデッド HBsAg イズ エクスプレスト」, J. Immunol. 164 : 4235-4243,2000.
46. ワイルド, J., グルスビー, M. J., シルムベック, R., および ライマン, J. 「プライミング MHC-I-レストリクテッド サイトトキシック T リンフォサイト レスポンシズ トゥ エクソジェニアウス ヘパティティス B サーフェイス アンチゲン イズ CD4+ T セル ディペンデント」, J. Immunol. 163 : 1880-1887,1999.
【0098】
47. ニコレッティ, I., ミグリオラチ, G., パグリアチ, M. C., グリニャーニ, F., および リカルディ, C. A 「ラピッド アンド シンプル メソッド フォー メジャリング チモサイト アポトーシス バイ プロピヂウム アイオダイド ステイニング アンド フロー サイトメトリー」, J Immunol Methods. [139 : 271-9,] 1991.
48. ファドック, V. A., フェルカー, D. R., カンベル, P. A., コーヘン, J. J., ブラットン, D. L., および ヘンソン, P. M. 「エクスポージャ オブ フォスファティジルセリン オン ザ サーフェイス オブ アポプトチック リンフォサイツ トリッガーズ スペシフィック レコグニッション アンド リムーバル バイ マクロファーゼ」, J Immunol. 148: 2207-16,1992.
49. トーラ, L., ムリック, A., メツガー, D., ポンリキトモンコール, M., パーク, I., および シャボン, P. 「ザ クローンド ヒューマン オエストロゲン レセプター コンテインズ ア ミューテーション フィッチ オルタース イッツ ホルモン バインディング プロパティーズ」, Embo J. 8: 1981-6,1989.
50. ダニエリアン, P. S., ホワイト, R., ホアレ, S. A., フェイウェル, S. E., および パーカー, M. G. 「アイデンティフィケーション オブ レシジュー イン ザ エストロゲン レセプター ザット カンファー ディファレンシャル センシティビティー トゥ エストロゲン アンド ヒドロキシタモキシフェン」, Mol Endocrinol. 7: 232-40, 1993.
51. ハラダ, H., キタガワ, M., タナカ, N., ヤマモト, H., ハラダ, K., イシハラ, M., および タニグチ, T. 「アンチ-オンコジェニック アンド オンコジェニック ポテンシャルズ オブ インテーフェロン レギュラトリー ファクター-1 アンド-2」, Science. 259 : 971-4,1993.
【0099】
52. フタキ, M., イノクチ, K., ハナワ, H., タノサキ, S., ダン, K., および ノムラ, T. 「パッシブル トランスフォーミング アクティビティ オブ インターフェロン レギュラトリー ファクター 2 イン チューモリジェニシティ アッセイ オブ NIH3T3 セル トランスフェクテッド ウィズ DNA フロム クロニック ミエロジェニィアス ロイケミア ペイシェンツ」, Leuk Res. 20: 601-5,1996.
53. タナカ, H. および サミュエル, C. E. 「メカニズム オブ インターフェロン アクション : ストラクチャー オブ ザ マウス PKR ジーン エンコーディング ザ インターフェロン-インデューシブル RNA-ディペンデント プロテイン キナーゼ」, Proc Natl Acad Sci U S A. 91 : 7995-9,1994.
54. ダンカン, G. S., ミッツルッカー, H. W., カギ, D., マツヤマ, T., および マク, T. W. 「ザ トランスクプリクション ファクター インターフェロン レギュラトリー ファクター-1 イズ エッセンシャル フォー ナチュラル キラー セル ファンクション in vivo」, J Exp Med. 184: 2043-8,1996.
55. ロホッフ, M., フェリック, D., ミッツルッカー, H. W., ダンカン, G. S., ビショッフ, S., ローリンホッフ, M., および マク, T. W. 「インターフェロン レギュラトリー ファクター-1 イズ リクワイアド フォー ア T ヘルパー 1 イムノ レスポンス in vivo」, Immunity. 6 : 681-9,1997.
【0100】
56. ドリュー, P. D., フランゾーソ, G., ベッカー, K. G., バウアス, V., カールソン, L. M., シーベンリスト, U., および オウザト, K. 「NF カッパー B アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 フィジカリー インタラクト アンド シナージスティッカリー インデュース メジャー ヒストコンパチビリティ クラス I ジーン エキスプレッション」, J Interferon Cytokine Res. 15: 1037-45,1995.
57. マッサ, P. T. および ウー, H. 「インターフェロン レギュレイトリー ファクター エレメント アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 イン ザ インダクション オブ メジャー ヒストコンパーチビリティ コンプレックス クラス I ジーンズ イン ニューラル セルズ」, J Interferon Cytokine Res. 15: 799-810,1995.
58. チャタージー-キショワ, M., キショワ, R., ヒックリン, D. J., マリンコーラ, F. M., および フェロン, S. 「ディファレント リクワイアメンツ フォー シグナル トランジューサー アンド アクチベーター オブ トランスクリプション 1アルファ アンド インターフェロン レギュレイトリー ファクター 1 イン ザ レギュレイション オブ ロウ モレキュラー マス ポリペプチド 2 アンド トランスポーター アソシエイテッド ウィズ アンチゲン プロセッシング 1 ジーン エクスプレッション」, J Biol Chem. 273: 16177-83,1998.
59. ハン, K., ハヤシ, R., ラフォンド-ウォーカー, A., ローレンシュタイン, C., パードール, D., アンド レビッスキイ, H. セントラル ロール オブ CD4 (+) Tセルズ イン ザ アンチチューマー イムノ レスポンス, J Exp Med. 188: 2357-68,1998.
60. ザジャック, A. J., ムライ-クリシュナ, K., ブラットマン, J. N., アンド アーメド, R. セラピューティック ヴァッシネイション アゲインスト クロニック ヴァイラル インフェクション: ザ インポータンス オブ コーポレーション ビトウィーン CD4+ アンド CD8+ T セルズ, Curr Opin Immunol. 10: 444-9,1998.
61. ゲイスラー, M., ゲイジェン, A., トクシゲ, K., アンド ウァンズ, J. R. エンハンスメント オブ セルラー アンド ヒューモラル イムノ レスポンシーズ トゥ ヘパティティス C ウィルス (HCV) コア プロテイン ユージング DNA ベースド ワクチン オーギュメンテッド ウィズ サイトカイン エクスプレッシング プラスミド, J Immunol. 158: 1231-1237,1997.
62. ゲイスラー, M., ブラス, V., ミチャラク, S., オートマン, D., ウァンズ, J. R., アンド ブルム, H. E. インターセルラー リテンション オブ ヘパティティス B ウィルス サーフェース プロテインズ リデューシーズ ザ イムノ レスポンス オーギュメンティング エッフェクツ オブ IL-2 アフター サイトカイン ジェネティック コイミュナイゼーションズ., J. Virol. 73: 4284-4292,1999.
【0101】
63. ヴォルマー, C. M., Jr., エイルバー, F. C., バターフィールド, L. H., ライバス, A., ディセッテ, V. B., コウ, A., モンテージョ, L. D., リー, M. C., アンドリューズ, K. J., マクブライド, W. H., グラスピー, J. A., アンド エコノモウ, J. S. アルファ-フェトプロテイン-スペシフィック ジェネティック イムノセラピー フォー ヘプタトセルラー カルシノーマ, Cancer Res. 59 : 3064-7,1999.
64. スバイツァー D., ハウザー H. アンド ワース D. テクニカル レポト.コンプリメント-プロテクテッド アンフォトロフィック レトロウィルス フロム ムリン パッケージング セル. Human Gene Therapy 10,1893-1902 (1999)
65. Unsinger, J., Kroger, A., ハウザー, H., アンド ワース, D.: レトロヴァイラル ベクターズ フォー トランスダクション オブ アン オートレギュレーテッド バイダイレクショナル エクスプレッション カセット. Molecular Therapy, 4,484- 489. (2001)
66. アンシンガー J., リンデンメイアー W., ハウザー H. アンド ワース D. LTR-フランクド オートレギュレーテッド エクスプレッション カセッツ フォー ホモゲノウス アンド, ストリクトリイ コントロールド エクスプレッション イン アデノヴァイラル ベクターズ. サブミッテッド 2002
【0102】
67. コルベア-ガーピン F., ホロドニセアヌ F., コーリルスキー P., アンド ガラピン A. C. ア ニュー ドミナント ハイブリッド セレクティブ アーカー フォー ハイヤー ユーカリオティック セルズ. J Mol. Biol. 150,1-13. (1981).
68. コースター, M., キリチホフ, S., シャーパー, F. アンド ハウザー, H.: プロライフレーション コントロール オブ マンマリアン セルズ バイ ザ チューマー サプレッサー IRF-1. Cytotechnology, 18,67-75 (1995)
69. キルシホフ, S., コースター, M., ワース, M., シェーパー, F., ゴッセン, M., ブジャード, H. アンド ハウザー, H.: アイデンフィケーション オブ マンマリアン セル クローンズ イクスヒビッティング ハイリー レギュレーテッド エクスプレッション フロム インデューシブル プロモーターズ. TIG, 11,219-220 (1995)
70. クロガー A. エヴァルエールング ダー チューマースプレッシヴェン エイゲンシャフテン ダス インターフェロン レギュレーター ファクター-ワン (IRF-1). Dissertation, Technische Universitat Braunschweig (1999)
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】IRF−1はHepa1〜6細胞における細胞成長阻害を媒介する。A:IRF−1hERでトランスフェクトされたHepa1〜6細胞におけるIRF−1hER融合タンパク質のウエスタンブロット分析。これらの細胞クローンから得られた溶解物(タンパク質50μg)をSDS−PAGEに付して、抗ER抗体を用いて分析した(上パネル)。膜を剥いで、抗アクチン抗体で再プローブして、試料のタンパク質チャージを制御した(下パネル)。B:細胞成長の確定のために、同一クローン由来の細胞をマイクロタイタープレートのウェル中に播種して、β−エストラジオール1μMを用いて(黒棒)または用いずに(白棒)成長させた。処置の7日後に、培養の代謝活性を測定した。個々のHepa1〜6細胞クローンの成長特性はわずかに異なるため、未処置細胞の代謝活性を100%と設定した。
【図2】IRF−1の活性化は、Hepa1〜6細胞の腫瘍原性表現型を復帰させる。A:軟寒天中のIRF−1トランスフェクト細胞クローンの足場非依存性成長。B:β−エストラジオール1μMを用いずに(黒棒)または用いて(白棒)3週間培養後、指示細胞クローンのコロニー数を測定した。
【図3】IRF−1の活性化は、MHCクラスIおよびMHCクラスII発現の増大をもたらす。IRF−1−hERを発現するHepa1〜6細胞の表面タンパク質のFACS分析(クローン9)を、H2Kb/Db(A)、I−A/I−B(B)およびCD54(C)に対して誘導される抗体を用いて行った。エストロゲン無含有培地中でまたは1mMのβ−エストラジオールの1:1,000希釈物を含有する培地中で、HepaIRF−1hER細胞を3〜4日間培養した。その後、適切なFITC標識またはPE標識抗体を用いて細胞を染色した。特異性に関する対照として、FITC標識またはPE標識非特異的アイソタイプ対照で細胞を染色した。データは、3つの個々の実験から得られる。
【図4】IRF−1−HERのアデノウイルス形質導入はIRF−1媒介性表現型をもたらす A 材料と方法の節に記載されたような異なるアデノウイルスベクターの模式図。矢印:サイトメガロウイルスプロモーター(CMV);二方向矢印:二方向tTA−プロモーター(bitTA);黒丸:SV40ポリアデニル化シグナル;黒長方形:ポリオウイルス由来内部リボソーム進入部位(IRES);eGFP:強化グリーン蛍光タンパク質;LTR:レトロウイルス末端反復配列;tTA:トランス活性化因子。B 指示アデノウイルスに感染されたHepa1〜6細胞におけるIRF−1−hER融合タンパク質のウエスタンブロット分析。感染後48時間目の細胞由来の溶解物(タンパク質50μg)をSDS−PAGEに付して、ヒトエストロゲン受容体に対して誘導される抗体を用いて分析した。
【図5】IRF−1の活性化はヌードマウスにおける腫瘍成長を遅延し、部分的に阻害する。 NMRIヌードマウスの右側腹部に106細胞/マウスを皮下注射した。1.5mgのE2の2日毎のi.p.でマウスを処置するかまたは未処置のままにした。データは、5匹の動物の平均値を示す。A 腫瘍容積により腫瘍成長を測定した。B 腫瘍無含有ヌードマウス生存率を示すカプラン−マイアープロット。
【図6】同系免疫応答性C57L/JマウスにおけるE2処置および腫瘍再攻撃に対する防御に依存するHepaIRF−1hERおよびHepa1〜6細胞のin vivo特性。A:マウスの右側腹部に1×107Hepa1〜6またはHepaIRF−1hER細胞を接種し、2日毎の1.5mgβ−エストラジオールi.p.でマウスを処置するか、または未処置のままにした。8匹のE2処置動物のうちの6匹はHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して完全に防御され、2匹は、E2処置停止後でさえ非常に遅い成長速度を特徴とする小腫瘍を発症しただけであることに留意されたい。B:ナイーブC57L/JマウスまたはHepaIRF−1hER腫瘍成長に対して防御されたE2処置動物を、E2処置停止後11日目(最初の腫瘍接種後28日目)に、1×107野生型Hepa1〜6(n=3)またはHepaIRF−1hER(n=3)腫瘍細胞を用いて再攻撃させた。これらのマウスが任意のさらなるE2処置を受けなかったことは重要である。
【図7】Hepa1〜6腫瘍に対するCTL活性ならびにT細胞前駆体頻度。A:腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、放射線照射Hepa1〜6細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたE:T比で、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃されたE2処置マウスを3LL細胞でin vitro刺激して、その後、同系Hepa1〜6および3LL癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。Hepa1〜6腫瘍特異的溶解物は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより提示された。値は、3重反復試験確定値の平均を表す。B:腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、Hepa1〜6または3LL細胞を用いて20時間刺激した。その後、IFN−γおよびIL−4エリスポット(ELISPOT)アッセイを実施した。各ウェル中のスポットを顕微鏡下で計数し、その値を、培養の開始時に各ウェルに添加された脾臓細胞数に対するスポット形成細胞の数として表す。
【図8】AFP特異的CTL応答およびCTL−p頻度。A:腫瘍攻撃処置または対照マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、UV不活性化rVV−mAFPに感染させた放射線照射自系脾臓細胞を用いて再刺激し、その後、指示されたE:T比で、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。特異性の対照のために、HepaIRF−1hER細胞を用いて攻撃されたE2処置マウスをrVV−pSC11に感染させた脾臓細胞でin vitro刺激して、その後、同系Hepa1〜6およびルイス肺癌細胞に対する細胞傷害性活性に関して分析した。AFP特異的溶解物は、Hepa1〜6標的に対する溶解値から3LLに対する溶解値を差し引くことにより示された。値は、3重反復試験測定の平均を表す。B:腫瘍攻撃または非攻撃処置マウス(各群n=5)由来の脾臓細胞を、UV不活性化rVV−AFPまたはrVV−pSC11感染同系放射線照射脾臓細胞を用いて20時間刺激した。その後、IFN−γエリスポット(ELISPOT)アッセイを実施した。
【図9】in vivoおよびIRF−1媒介性HCC療法における抗腫瘍免疫反応性の同定。A:抗腫瘍免疫は部分的に、CD4+およびCD8+T細胞の両方の関与を要した。材料と方法において記載されたような精製ハイブリドーマ上清のi.p.注射により、HepaIRF−hER細胞を接種されたE2処置または未処置マウスのCD4およびCD8 T細胞亜集団を枯渇させた。各群は、マウス2匹を含有した。B:C57L/Jマウスの右側腹部に1×107HepaIRF−1hER(群1および2)細胞を接種した。両群は、いかなるE2処置も受けなかった。19日目に、腫瘍は両群で約2000mm3のサイズに達した。19日目に開始して、28日目まで2日毎に、群2(n=6)に1.5mgのE2をi.p.注射した。その後、E2処置は2匹のマウスで再度中止されたが、一方、残りの4匹のマウスはE2療法を維持された。腫瘍成長における差異は観察されなかった。群1(n=3)のマウスにはE2処置を施さず、その後、腫瘍が10,000mm3に達した場合に屠殺した。
Claims (25)
- 遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの使用であって、それによりIRFファミリーのメンバーである該遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの遺伝子産物の活性が、腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のために活性化される使用。
- 遺伝子産物としてのIRFファミリーの前記メンバーは、野生型IRF−1,合成IRF−1、免疫学的活性IRF−1変異体、IRF−1以外のIRFファミリーの野生型メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーの合成メンバー、IRF−1以外のIRFファミリーのメンバーの免疫学的活性変異体、およびそれらの融合タンパク質から成る群から選択される請求項1記載の使用。
- 哺乳類、特にヒトの治療のための請求項1および/または2記載の使用。
- 前記遺伝子構築物は、融合タンパク質のドメインの1つとしての前記IRFファミリーのメンバーおよび該融合タンパク質の別のドメインとしての外来タンパク質を含む融合タンパク質としての前記IRFファミリーのメンバーをコードし、前記融合タンパク質の活性は、化学的または物理的手段によりスイッチを切り換えられ得る1つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
- 前記遺伝子構築物は、IRF−1/hER融合タンパク質の前記発現をコードし、該融合タンパク質の活性は、エストロゲンまたは抗エストロゲン活性を有する化合物により制御され得る1つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
- 前記遺伝子構築物または前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞中への移入のための生成物として、特にウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターとして提供される1つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
- 前記発現は、化学的または物理的活性化によりスイッチを入れられ得る1つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
- 前記発現は、加熱によりまたは放射線照射によりスイッチを入れられ得る請求項7記載の使用。
- 前記発現は、調節可能プロモーターによりスイッチを入れられ得る請求項7および/または8記載の使用。
- 前記発現は、外的刺激により、特にテトラサイクリンによりスイッチを切り換えられ得る請求項9記載の使用。
- 1つまたは複数の先行の請求項で特定された遺伝子構築物またはポリヌクレオチドを、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物起源、あるいは腫瘍細胞由来の1つまたは複数の抗原コード遺伝子からなる群から選択される1つまたは複数の抗原と一緒に含むワクチン。
- 前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、複数の別個のベクター、すべての構成成分を提供するベクター、またはポリシストロン発現ユニットを用いて提供される請求項11記載のワクチン。
- 前記遺伝子構築物またはポリヌクレオチドおよび前記抗原コード配列(単数または複数)は、ウイルスまたは細菌担体として提供される請求項11および/または12記載のワクチン。
- 腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための調製物の製造のための1つまたは複数の先行の請求項で特定された使用。
- 腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための、IRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての前記メンバーおよび該融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらから成る融合タンパク質。
- IRF−1が前記融合タンパク質の構成成分の1つであり、および/またはhERが前記融合タンパク質の他の構成成分である請求項15記載の融合タンパク質。
- 腫瘍性、感染性および/または免疫疾患の治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための、IRFファミリーのメンバーあるいは融合タンパク質の構成成分の1つとしての前記メンバーおよび該融合タンパク質の別の構成成分としての治療的に許容可能なタンパク質を有するかまたはそれらからなる融合タンパク質からなるかあるいは含む予防的および/または治療的組成物。
- IRF−1が融合タンパク質の構成成分の1つであり、および/またはhERが前記構成成分の他の構成成分である請求項17記載の組成物。
- 前記IRFファミリーのメンバーの発現のための請求項1ないし10のうちの1つまたは複数に規定される遺伝子構築物またはポリヌクレオチドがex vivoでチャージされたヒト細胞。
- 遺伝子移入、物理的形質導入、特に電気穿孔、化学的形質導入またはウイルス形質導入によりチャージされた請求項19記載のヒト細胞。
- 自系または同種異系細胞である請求項19および/または20記載のヒト細胞。
- 腫瘍細胞、特に癌細胞、好ましくは肝細胞癌細胞、肉腫細胞または造血系由来の腫瘍である請求項19ないし21のうちの1つまたは複数に記載のヒト細胞。
- 腫瘍性、感染性および/または免疫疾患に対する治療、予防、防御的治療および/または予防免疫接種のための請求項19ないし22のうちの1つまたは複数に記載のヒト細胞。
- 請求項11ないし13のうちの1つまたは複数に記載の遺伝子を用いて請求項20記載の遺伝子移入を施されたヒト抗原提示細胞(APC)。
- IRFファミリーの前記メンバーの活性レベルは、インターフェロン−βにより誘起されるIRF−1のレベルより高い請求項19ないし24のうちの1つまたは複数に記載のヒト細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP01104423 | 2001-02-26 | ||
PCT/EP2002/002036 WO2002068614A2 (en) | 2001-02-26 | 2002-02-26 | Interferon regulatory factor-1/human estrogen receptor fusion protein and its use for treating carcinomas |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004529888A true JP2004529888A (ja) | 2004-09-30 |
Family
ID=8176577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002568710A Pending JP2004529888A (ja) | 2001-02-26 | 2002-02-26 | インターフェロン調節因子−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質および癌を治療するためのその使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040116369A1 (ja) |
EP (1) | EP1363943A2 (ja) |
JP (1) | JP2004529888A (ja) |
KR (1) | KR20030092003A (ja) |
AU (1) | AU2002308216A1 (ja) |
CA (1) | CA2439335A1 (ja) |
WO (1) | WO2002068614A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002343481A1 (en) * | 2001-10-05 | 2003-04-22 | Mount Sinais School Of Medecine Of New York University | A hybrid fusion protein transcription regulator to induce interferon target gene expression |
EP1777523A1 (en) * | 2005-10-19 | 2007-04-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | An in vitro method for the prognosis of progression of a cancer and of the outcome in a patient and means for performing said method |
EP2390356A1 (en) * | 2006-06-02 | 2011-11-30 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Method for identifying whether a patient will be responder or not to immunotherapy based on the differential expression of the FASLG gene |
JP2021507924A (ja) * | 2017-12-22 | 2021-02-25 | ディストリビューテッド バイオ, インコーポレイテッド | 主要組織適合複合体(mhc)組成物およびその使用方法 |
CN115243714A (zh) * | 2020-03-06 | 2022-10-25 | 匹兹堡大学联邦系统高等教育 | 用于治疗癌症的表达irf调节剂的溶瘤病毒 |
GB202020063D0 (en) * | 2020-12-17 | 2021-02-03 | Imperial College Innovations Ltd | RNA construct |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX9305855A (es) * | 1992-09-24 | 1995-01-31 | Tadatsugu Taniguchi | Factores 1 y 2 reguladores del interferon en el diagnostico de latumorigenicidad. |
US6348586B1 (en) * | 1996-07-25 | 2002-02-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Unique associated Kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof |
EP1046710A1 (en) * | 1999-04-23 | 2000-10-25 | Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) | Promoter-transactivator system for inducible high-level mammalian gene expression with the option of cell growth control |
-
2002
- 2002-02-26 JP JP2002568710A patent/JP2004529888A/ja active Pending
- 2002-02-26 CA CA002439335A patent/CA2439335A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-26 KR KR10-2003-7011233A patent/KR20030092003A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-02-26 EP EP02744902A patent/EP1363943A2/en not_active Withdrawn
- 2002-02-26 AU AU2002308216A patent/AU2002308216A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-26 WO PCT/EP2002/002036 patent/WO2002068614A2/en not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-08-26 US US10/648,454 patent/US20040116369A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20040116369A1 (en) | 2004-06-17 |
KR20030092003A (ko) | 2003-12-03 |
AU2002308216A1 (en) | 2002-09-12 |
EP1363943A2 (en) | 2003-11-26 |
WO2002068614A2 (en) | 2002-09-06 |
CA2439335A1 (en) | 2002-09-06 |
WO2002068614A3 (en) | 2002-11-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bateman et al. | Fusogenic membrane glycoproteins as a novel class of genes for the local and immune-mediated control of tumor growth | |
Tuting et al. | Autologous human monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and IFN-α | |
Narvaiza et al. | Intratumoral coinjection of two adenoviruses, one encoding the chemokine IFN-γ-inducible protein-10 and another encoding IL-12, results in marked antitumoral synergy | |
Kaplan et al. | Induction of antitumor immunity with dendritic cells transduced with adenovirus vector-encoding endogenous tumor-associated antigens | |
Daniel et al. | Costimulatory signals through B7. 1/CD28 prevent T cell apoptosis during target cell lysis. | |
US20070135373A1 (en) | Method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia | |
Hiroishi et al. | IFN-α-expressing tumor cells enhance generation and promote survival of tumor-specific CTLs | |
Kröger et al. | Growth suppression of the hepatocellular carcinoma cell line Hepa1-6 by an activatable interferon regulatory factor-1 in mice | |
Warnier et al. | Induction of a cytolytic T‐cell response in mice with a recombinant adenovirus coding for tumor antigen P815A | |
Schultz et al. | Long-lasting anti-metastatic efficiency of interleukin 12-encoding plasmid DNA | |
Spender et al. | Direct and indirect regulation of cytokine and cell cycle proteins by EBNA-2 during Epstein-Barr virus infection | |
US20160317631A1 (en) | Increased t-cell tumor infiltration and eradication of metastases by mutant light | |
Chen et al. | Enhanced HER-2/neu-specific antitumor immunity by cotransduction of mouse dendritic cells with two genes encoding HER-2/neu and alpha tumor necrosis factor | |
Liu et al. | Adenovirus-mediated CD40 ligand gene-engineered dendritic cells elicit enhanced CD8+ cytotoxic T-cell activation and antitumor immunity | |
Yim et al. | IFN regulatory factor-1 gene transfer into an aggressive, nonimmunogenic sarcoma suppresses the malignant phenotype and enhances immunogenicity in syngeneic mice. | |
Tsuchiyama et al. | Prolonged, NK cell-mediated antitumor effects of suicide gene therapy combined with monocyte chemoattractant protein-1 against hepatocellular carcinoma | |
Lu et al. | Modulating oncolytic adenovirus immunotherapy by driving two axes of the immune system by expressing 4-1bbl and cd40l | |
JP2004529888A (ja) | インターフェロン調節因子−1/ヒトエストロゲン受容体融合タンパク質および癌を治療するためのその使用 | |
CA2466530A1 (en) | Allogenic vaccine that contains a costimulatory polypeptide-expressing tumor cell | |
Ali et al. | Tumor regression induced by intratumor therapy with a disabled infectious single cycle (DISC) herpes simplex virus (HSV) vector, DISC/HSV/murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, correlates with antigen-specific adaptive immunity | |
JP2001010973A (ja) | がんワクチン | |
Yang et al. | Co-transfection of dendritic cells with AFP and IL-2 genes enhances the induction of tumor antigen-specific antitumor immunity | |
Tenbusch et al. | Coexpression of GM-CSF and antigen in DNA prime-adenoviral vector boost immunization enhances polyfunctional CD8+ T cell responses, whereas expression of GM-CSF antigen fusion protein induces autoimmunity | |
Liu et al. | Dendritic cells engineered to express the Flt3 ligand stimulate type I immune response, and induce enhanced cytoxic T and natural killer cell cytotoxicities and antitumor immunity | |
Qiu et al. | Induction of tumor immunity and cytotoxic t lymphocyte responses using dendritic cells transduced by adenoviral vectors encoding HBsAg: comparison to protein immunization |