KR20030092003A - 인터페론 조절 인자-1／인간 에스트로겐 수용체 융합단백질 및 암을 치료하기 위한 그의 용도 - Google Patents
인터페론 조절 인자-1／인간 에스트로겐 수용체 융합단백질 및 암을 치료하기 위한 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 베타-에스트라디올(β-estradiol)에 의하여 가역적으로 활성화가능한 IRF-1／인간 에스트로겐 수용체 융합단백질 및 항암제로서의 그의 용도, 특히 간상피암의 치료에 관한 것이다.
Description
본 명세서에 사용된 약어
AFP= 알파 페토단백질(alpha fetoprotein)
c-Ha-ras= ras 종양 유전자(ras oncogene)
c-myc= myc 종양 유전자(myc oncogene)
CTL= 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)
E2= β-에스트라디올(β-estradiol)
FCS= 송아지 태아 혈청(fetal calf serum)
fosB= 전사 인자 fosB(transcription factor fosB)
HCC= 간상피암 세포(hepatocellular carcinoma cell)
HER1=EGF 수용체(EGF receptor)
ICE= 카스파제(caspase)
IL-15= 인터루킨-15(interleucin-15)
iNOS= 유도 가능한 NO 합성효소(inducible NO synthase)
ISG= 인터페론 자극 유전자(interferon stimulated gene)
ISGF3= IRF-1 연관 서브유닛(IRF-1 related subunit)
ISRE= 인터페론 자극 반응 요소(interferon stimulated response element)
LMP2= 단백질 조작 인자(protein processing factor)
mAFP= 마우스 알파 페토단백질(murine alpha-fetoprotein)
MECL1= 다중 촉매 엔도펩티다제 복합체 1(muticatalytic endopeptidase complex 1)
MHC= 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)
NK Cell= 자연 살해 세포(natural killer cell)
OASE= 2′, 5′-올리고(A) 합성효소(2′, 5′-Oligo(A) Synthase)
PKR= 단백질 키나아제 R(protein kinase)
ras induction= ras 단백질의 유도(induction of ras protein)
TAP-1= 단백질 조작 인자(protein processing factor)
TH1= T 헬퍼 세포 1형(T helper cell type 1)
본 발명에 인용된 참고문헌 목록은 본 명세서의 말단에 기재되어 있다.
간상피암(hepatocellular carcinoma, HCC)은 1990년에 437,000의 새로운 케이스가 발생한 것으로 추정되며 세계의 모든 악성종양 중 다섯 번째를 차지한다(1). 다양한 비외과적 치료양상이 개발되어 왔으며 외과적 기술도 많이 향상되었음에도 불구하고, 이들 치료방법 중 어떤 것도 HCC를 가지는 환자의 극단적으로 나쁜 예후를 획기적으로 개선하지는 못했다. 전세계적으로 5년 생존률(5-yr survival rate)은 2%에 불과하며(2), 따라서 HCC를 위한 새로운 유전자 및 면역 치료적 전략이 개발되고 있다. 본 발명자들은 종양의 치료를 위하여 종양 억제자 및 면역 조절자로서의 인터페론 조절인자-1(IRF-1)의 광범위한 역할의 도입을 시도하였다(3). 본 발명자들은 마우스에서 면역반응 능력이 있는(immunocompetent) 동계의(syngeneic) HCC 종양 모델 및 면역결핍 마우스에서의 시험을 위한 종양 세포주를 사용하였다.
IRF-1 발현은 많은 인터페론 자극 유전자(interferon stimulated genes, ISGs) 유도를 야기하며(4-6), 따라서 조직적합성(histocompatibility) 항원의 유도 및 항 바이러스성 상태를 포함한 특정 IFN 기능을 유도한다(5, 8). se 당 IRF-1 유전자는 IFN에 의하여 유도가능하기 때문에 IFN 매개 세포반응에 포함될 것이라 알려져 왔다(5, 9, 10). 그러나, 기능적 IRF-1 유전자가 결핍된 세포 및 마우스에서 특정 ISGs의 IFN에 의한 유도는 일어나지 않는다(예, 9-27, 1-8, PKR). 따라서, IRF-1은 IRF-3에 대한 ISG의 IFN-특이적 유도를 촉진하는 것처럼 보이며, ISGF-3은 IRF-1과 연관된 서브유닛 ISGF3과 함께 ISG-프로모터에 결합한다(14). 이러한 마우스들에서 특이적인 변화는 IFN-β에 반응한 iNOS(inducible NO synthase)의 유도가 일어나지 않는다는 것이다(15).
IRF-1은 DNA 결합과 원격활성(transactivation)에 의하여 항증식성(antiproliferative) 효과를 나타낸다(4). 이는 성장 억제(inhibitory) 효과를 나타내는 많은 유전자들을 유도한다고 알려져 있다. 이들 중에는 라이실 산화효소(Lysyl oxidase)(16), PKR(17), 2′-5′OASE(18), 인돌아민 2,3 디옥시게나제(Indoleamine 2,3-dioxigenase)(19), 안지오텐신 Ⅱ형 수용체(Angiotensin type Ⅱ receptor)(20)가 있다. 섬유아세포(fibroblast) 및 표피(epithelial) 세포로부터 확립된 세포주에서, IRF-1은 세포사멸(apoptosis) 신호 없이 세포 성장 정지(cell growth arrest)를 야기한다(21). 그러나, ras 유도 세포사멸에 필요한 종양 억제자 p53의 활성과 유사하게, IRF-1은 종양유전자(oncogene) 의존 세포사멸을 야기할 수 있다(22, 23). 본 발명자들은 IRF-1에 의하여 성장이 억제되는 3T3 세포가 HER1 종양유전자 조건부 활성화 후에 세포사멸을 일으킨다는 보고를 한 바 있다(24). 실제로, ICE같은 카스파제(caspase) 유전자의 프로모터 부위는 ISRE-유사 염기서열을 포함한다(25). 이러한 유전자들은 IRF-1의 표적이 될 수 있다(26).
IRF-1은 종양 억제자로 알려져 왔다(4, 17, 24, 27). 인간에서 IRF-1 영역의 염색체 결실(deletion)은 골수이형성(myelodysplasia) 및 백혈병(leukemia)과 연관된다(28). null 돌연변이를 가지는 1차 배아 섬유아세포(primary embryonic fibroblast)는 단일 종양유전자(c-Ha-ras)의 발현에 의하여 형질전환될 수 있다. IRF-1을 포함하는 야생형 세포는 c-Ha-ras 종양유전자의 발현 및 혈청 결핍(starvation)에 의하여 세포 예정사(programmed cell death)를 일으키는 반면(21), 이러한 IRF-1-／-세포는 세포사멸을 일으키지 않는다. IRF-1 발현은 또한 c-myc 및 fosB 종양유전자에 의하여 나타내어지는 종양성 표현형을 복귀시킨다(29). 더 나아가, c-Ha-ras 및 IRF-1이 결핍된 마우스는 더 높은 종양형성률을 나타낸다는 실험 결과도 있다(30).
종양 억제자로서의 IRF-1의 생체내(in vivo) 기능은 복합적이다. 세포 종류에 따라, IRF-1은 성장 억제, 세포사멸을 유발하며, 면역 조절 기능뿐만 아니라 세포외 기질(extracellular matrix)에도 영향을 미친다. IRF-1은 MHC class 1(31,32), iNOS(15), IFN-(11)의 전사와 같은 다수의 면역 조절 효과를 유도하며, IL-15(33)의 적절한 발현에도 필요하다. IRF-1의 일시적 발현은 IFN-β유전자의 활성화를 야기한다(9, 34, 35). IRF-1 넉-아웃(knock-out) 세포를 사용한 연구에서 IRF-1은 NK 세포의 분화 및 기능(33, 36), T 헬퍼 세포 TH1 형의 생성, 및 DNA 손상(26, 37)에 포함된다고 보고되고 있다. IRF-1은 더나아가 MHC class Ⅱ의 유도(7, 40)를 비롯한 LMP2, TAP-1 및 MECL1(38, 39)의 전사 유도에 의한 항원 표지를 높이는 데에도 포함된다. 이러한 사실로 IRF-1은 항원 표지에 대한 조자극제(costimulator)로서 기능할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 종양을 치료하는 방법의 개발에 관한 것이다. 상기 방법은 IRF-1, 특히 베타-에스트라디올(β-estradiol)에 의하여 가역적으로 활성화 가능한 IRF-1／인간 에스트로겐 수용체 융합단백질에 기초하고 있다.
도 1.IRF-1은 Hepa 1-6 세포에서 세포 성장 억제를 매개한다.A:IRF-1／hER로 형질감염된 Hepa 1-6 세포에서 IRF-1／hER 융합단백질의웨스턴블랏(Western blot) 분석. 이러한 세포 클론들로부터 유래된 융해물(단백질 50 ㎍)을 SDS-PAGE에 적용하고 항-ER 항체로 분석하였다(위 패널). 상기 멤브레인의 항체를 벗겨내고 샘플을 단백질 로딩 대조군으로 항-액틴 항체를 사용하여 재검출하였다(아래 패널).B:세포 성장을 조사하기 위하여, 동일 클론으로부터 유래한 세포를 마이크로타이터 플레이트의 웰에 접종하고, 1 μM β-에스트라디올과 함께(검은 막대) 또는 없이(흰 막대) 배양하였다. 상기 배양의 대사적 활성을 처리 7일 후에 측정하였다. 개별 Hepa1-6 세포 클론의 성장 특성은 조금씩 다르기때문에, 비처리 세포의 대사적 활성을 100%로 설정하였다.
도 2.IRF-1의 활성은 Hepa1-6 세포의 종양적 표현형을 복귀시킨다.A:소프트 아가(agar)에서 IRF-1 형질감염된 세포 클론의 부착 비의존성(anchorage independent) 성장.B:지시된 세포 클론의 콜로니 갯수를 1 μM β-에스트라디올 없이(검은 막대) 또는 함께(흰 막대) 배양한 후, 3주 후에 조사하였다.
도 3.IRF-1의 활성화는 MHC class Ⅰ및 MHC class Ⅱ 발현의 증가를 야기한다. IRF-1-hER을 발현하는 Hepa1-6 세포의 표면 단백질의 FACS 분석을 H2Kb／Db (A), I-A／I-B(B), 및 CD54(C)에 대한 항체를 이용하여 실시하였다. HepaIRF-1hER 세포를 에스트로겐이 없는 배지 또는 1 mM β-에스트라디올을 1:1000으로 희석한 것을 포함하는 배지에서 배양하였다. 이어서, 세포를 적절한 FITC- 또는 PE 표지된 항체로 염색하였다. 특이성(specificity)을 위한 대조군으로 세포를 FITC- 또는 PE 표지된 비특이적 이성질체(isotype) 대조군으로 염색하였다. 실험결과는 3개의 독립적인 실험으로 나타난다.
도 4.IRF-1-hER의 아데노바이러스 형질도입은 IRF-1 매개 표현형을 야기한다.A:실험 재료 및 방법 섹션에서 기재되는 서로다른 아데노바이러스 벡터의 모식도. 화살표: 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 프로모터(CMV); 양쪽 화살표: 양쪽 tPA-프로모터 (bitTA); 검은 동그라미: SV40 폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 신호; 검은 사각형: 폴리오(polio) 바이러스 유래 내부 리보소말 시작 부위(internal ribosomal entry site, IRES); eGFP: enhanced 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein); LTR; Retorviral long terminal repeat; tTA: transactivatior.B:상기 아데노바이러스로 형질감염된 Hepa1-6 세포에서 IRF-1-hER 융합단백질의 Westen blot 분석. 감염 후 48시간된 세포로부터 유래된 융해물(단백질 50 ㎍)을 SDS-PAGE에 적용하고 인간 에스트로겐 수용체에 대한 항체로 분석하였다.
도 5.IRF-1의 활성화는 누드 마우스(nude mice)에서 종양 성장을 늦추거나 부분적으로 억제한다. 마우스당 1×106개의 세포를 NMRI 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하접종하였다. 마우스는 또한 1,5 mg E2를 2일마다 i.p 또는 처리하지 않은 왼쪽에 처리하였다. 데이타는 5 개체의 평균 값을 나타낸다.A:종양 성장을 종양 부피로 측정하였다.B:종양이 없는 누드 마우스의 생존 백분율을 보여주는 카플란-마이에르 플랏(Kaplan-Meier plot).
도 6.동계의 면역반응력이있는(syngeneic immunocompetent) C57L／J 마우스에서 E2 처리에 따른 HepaIRF-1hER 및 Hepa1-6 세포의 생체내 특성 및 종양 재접종(rechallenge)에 대한 보호.A:마우스의 오른쪽 옆구리에 1× 107의 Hepa1-6 또는 HepaIRF-1hER 세포를 접종하고 1.5 mg의 β-에스트라디올을 i.p 또는 처리하지 않은 왼쪽 옆구리에 2일마다 처리하였다. E2 처리 8 개체 중 6 개체가 HepaIRF-1hER 종양 성장으로부터 완전히 보호되었으며 나머지 2개체는 E2 중단 이후에 매우 느린 종양 성장률을 보이는 작은 종양만이 발생하였다.B:미처리 C57L／J 마우스 또는 HepaIRF-1hER 종양 성장에 대하여 보호된 E2 처리 개체에 1×107의 Hepa1-6(n=3) 또는 HepaIRF-1hER 종양 세포(n=3)를 E2 처리 중단 후 11일에 재접종하였다(초기 종양 접종 후 28일). 중요하게, 이 마우스들은 더이상의 E2 처리를 받지 않았다.
도 7.Hepa1-6 종양에 대한 CTL 활성 및 T 세포 선구체(precursor) 빈도(frequency).A:종양 접종한 마우스 또는 대조군 마우스로부터 유래한 비장(spleen) 세포(각각의 그룹에서 n=5)를 방사선 조사한 Hepa1-6 세포로 재접종시키고, 이어 제시한 E:T 비율로 동계의 Hepa1-6 및 루이스(Lewis) 폐암 세포에 대한 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 분석하였다. 특이성을 확인하기 위한 대조군으로, HepaIRF-1hER 세포를 접종한 E2 처리 마우스를 3LL 세포로 시험관내(in vitro) 자극시키고, 이어 동계의 Hepa1-6 세포및 3LL 암 세포에 대한 세포 독성 활성을 분석하였다. Hepa1-6 종양 특이적 융해는 Hepa1-6 표적에 대한 융해 값에서 3LL에 대한 융해값을 빼서 나타내었다. 상기 값들은 3회 측정한 값의평균을 나타낸다.B:종양을 접종한 마우스 또는 접종하지 않은 마우스(각 그룹별 n=5)로부터의 비장 세포를 Hepa1-6 세포 또는 3LL 세포로 20시간동안 자극하였다. 이어, IFN-γ및 IL-4 ELISPOT 분석을 실시하였다. 각 웰의 스팟(spot)들은 현미경 하에서 계수하였고, 그 값은 배양 초기에 각각의 웰에 첨가하여준 비장 세포의 수에 대한 스팟-형성 세포의 수로 나타내었다.
도 8.AFP 특이적 CTL 반응 및 CTL-p 빈도.A:종양 접종한 마우스 또는 대조군 마우스(각 그룹별 n=5)로부터의 비장 세포를 UV로 불활성화된 rVV-mAFP로 감염시킨 방사선 조사한 자가 비장 세포를 이용하여 재자극하고 이어 제시한 E:T 비율로 동계의 Hepa1-6 및 루이스(Lewis) 폐암 세포에 대한 세포 독성 활성(cytotoxic activity)을 분석하였다. 특이성을 확인하기 위한 대조군으로, HepaIRF-1hER 세포를 접종한 E2 처리 마우스를 rVV-pSC11으로 감염시킨 비장 세포로 시험관내 방법으로 (in vitro) 자극시키고, 이어 동계의 Hepa1-6 세포및 루이스 폐 암 세포에 대한 세포 독성 활성을 분석하였다. AFP 특이적 융해는 Hepa1-6 표적에 대한 융해 값에서 3LL에 대한 융해값을 빼서 나타내었다. 상기 값들은 3회 측정한 값의 평균을 나타낸다.B:종양을 접종한 마우스 또는 접종하지 않은 마우스(각 그룹별 n=5)로부터의 비장 세포를 UV로 불활성화된 rVV-mAFP 또는 rVV-pSC11로 감염시킨 방사선 조사한 동계의 비장 세포로 20시간동안 자극하였다. 이어, IFN-γELISPOT 분석을 실시하였다.
도 9.생체낸에서의 항종양성 면역 반응 및 IRF-1 매개 HCC 치료의 확인.A:항종양성 면역은 부분적으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 참여가 필요하다. 실험 재료 및 방법에 기재된 바에 따라 정제된 하이브리도마(hybridoma) 상층액을 복강 내(i.p.) 주입으로 HepaIRF-1hER 세포를 접종한 E2 처리 마우스 또는 비처리 마우스의 CD4 및 CD8 세포 아군(subpopulation)을 제거하였다.B:C57L／J 마우스의 오른쪽 옆구리에 1×107의 HepaIRF-1hER(그룹 1과 2) 세포를 접종한다. 두 그룹 모두 E2 처리는 받지 않는다. 19일째에 양쪽 그룹모두에서 종양의 크기가 2000 mm3에 도달하였다. 19일째부터 28일까지 그룹2(n=6)에 1.5mg E2를 2일마다 오른쪽 옆구리에 i.p. 주입하였다. 이어, 4개체에서는 E2 처리를 지속하는 반면, 2개체에서는 다시 E2 처리를 중단하였다. 종양 성장에 상이한 점은 관찰되지 않았다. 그룹 1의 마우스들은(n=3) E2 처리를 받지 않았고 이어 종양이 10,000 mm3에 도달하면 부검하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 종양에 대한 치료적 접근을 위한 IRF-1의 가능성을 제시하는 것이다. 본 명세서에서는 β-에스트라디올(E2)의 존재 하에서 활성화되는 IRF-1／인간 에스트로겐 수용체 융합단백질을 코딩하는 플라스미드와 마우스 세포주의 제조를 상세히 설명하고(4), 상기 제조한 세포주의 시험관내 표현형의 상세한 특징을 밝힌다. 또한, 본 발명자들은 면역반응 가능한 마우스와 면역반응 불가능한 마우스를 이용하여 생체내에서 종양의 성장에 대한 상기 활성화가능한 IRF-1 시스템의 보호적 및 치료적 능력을 기술하고, 종양에 대한 T 세포 반응을 특징화하며, HCC 특이적 자가 분화 항원인 마우스 α-페토프로테인(α- fetoprotein)(AFP)에 대한 면역적 내성은 이러한 접근에 의하여 깨어질 수 있음을 밝힌다(41). 마지막으로, 본 발명자들의 결과는 IRF-1이 직접적 항종양 성장 효과 및 종양세포에 대한 면역세포의 증가된 인식을 통하여 그의 항종양 효과를 매개하는 것을 보여준다.
본 발명의 문제점은 IRF 패밀리의 일원인 그의 유전자 생성물의 활성이 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적 차원의 면역을 위하여 활성화될 수 있는 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 의해 해결될 수 있다. 본 발명의 한 특정 실시예는 상기 용도를 포함하며,상기 유전자 생성물로서의 IRF 패밀리의 일원은 야생형 IRF-1, 합성 IRF-1, 면역적으로 활성이 있는 IRF-1 변형들, IRF-1이외의 IRF 패밀리의 야생형 일원, IRF-1이외의 IRF 패밀리의 합성형 일원, 면역적으로 활성이 있는 IRF-1이외의 IRF 패밀리의 야생형 일원의 변형들, 및 그들의 융합 단백질들로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명은 포유류, 특히 인간에 대한 치료를 위한 상기에서 기술된 용도에 관한 것이다.
상기 용도를 포함하는 다른 실시예에서, 상기 유전자 구조물은 융합 단백질의 하나의 도메인으로서의 상기 일원과 융합 단백질의 다른 도메인으로서의 외래 단백질을 포함하는 융합단백질로서 IRF 패밀리의 일원을 코딩하며, 상기 융합단백질의 활성은 화학적 또는 물리적 방법에 의하여 켜지거나 꺼질수 있고, 특히 상기 유전자 생성물은 IRF-1／hER 융합 단백질의 발현을 코딩하며, 융합 단백질의 활성은 에스트로겐 또는 항 에스트로겐 활성을 가지는 화합물에 의하여 조절될 수 있다.
상기 용도를 포함하는 다른 실시예에서, 상기 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에 도입기위한 생성물로서, 특히 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 제공된다.
본 발명의 특징적인 면은 화학적 또는 물리적 활성, 예를 들면 열 또는 방사선 조사에 의하여 켜질 수 있는(switched on) 상기 단백질의 발현으로 구성된다. 본 발명의 다른 특징적인 면은, 예를 들면 외부 자극, 특히 테트라사이클린(tetracycline)에 의하여 조절가능한 프로모터를 이용하여 켜지거나 꺼질 수 있는 상기 단백질의 발현으로 구성된다.
본 발명의 유용한 실시예는 바이러스, 세균, 곰팡이, 및 기생충 기원 또는 종양 세포 유래의 유전자를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 항원으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 항원들과 하나 또는 그 이상의 선행하는 항에서 정의되는 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신으로 이루어 진다. 이 실시예의 장점은 종양세포의 이용을 피한다는 것이다. 백신접종은 단순히 분리된 벡터들, 모든 구성요소를 제공하는 벡터 또는 다중시스트로닉 발현 단위들로서 제공되는 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드 및 항원 코딩 서열들을 적용함으로써 수행될 수 있다. 다른 유용한 실시예의 백신에서 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드 및 항원 코딩 서열들은 바이러스 또는 세균 담체(carrier)로 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예는 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한 제조물의 생성을 위한 상기 용도로 구성된다.
더 나아가, 또 다른 실시예는 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한, 융합 단백질의 한 구성요소로서의 상기 일원과 다른 구성요소로서의 치료적으로 수용가능한 단백질을 포함하거나 또른 이로 구성되는 IRF 패밀리의 일원 또는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한, 융합 단백질의 한 구성요소로서의 상기 일원과 다른 구성요소로서의 치료적으로 수용가능한 단백질을 포함하거나 또른 이로 구성되는 IRF 패밀리의 일원 또는 융합 단백질로 구성되는 예방적 및／또는 치료적 조성물, 특히 IRF-1이 융합단백질의 구성요소의 하나이고 및／또는 hER이 다른 구성요소의 다른 하나인 것을 특징으로 하는 조성물을 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 IRF 패밀리의 일원의 발현을 위하여 상기 기술한 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드로 생체 외적인 방법으로, 바람직하게는 유전자 전이, 물리적 형질도입으로, 더욱 바람직하게는 엘렉트로포래이션, 화학적 형질도입 또는 바이러스 형질도입으로 장전된 인간 세포에 관한 것이다.
상기 인간 세포는 자가조직(autologous) 또는 동종이계(allogenic) 세포일 수 있다. 더 나아가, 상기 인간 세포는 종양 세포, 바람직하게는 암 세포, 더욱 바람직하게는 간상피암 세포, 육종(sarcoma) 세포 또는 조혈(hematopoietic) 시스템으로부터 유래된 종양일 수 있다. 부가적으로, 상기 인간 세포는 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적 차원의 면역을 위하여 적합하다.
본 발명의 바람직한 유용한 실시예는 인간 항원 표지 세포(antigen presenting cell, APC)에 관한 것이며, 상기 세포는 백신접종의 실시예에서 언급된 하나 또는 그이상의 유전자들로 유전자 전이, 물리적 형질도입, 특히 엘렉트로포래이션, 화학적 형질도입 또는 바이러스 형질도입된다.
마지막으로, 본 발명은 상기 IRF 패밀리의 일원의 활성화 수준이 인터페론-베타에 의하여 유도되는 IRF-1의 활성화 수준보다 더 높은 것을 특징으로하는 인간 세포에 관한 실시예를 포함한다.
본 발명 자체 뿐 아니라 그의 여러가지 면에서, 본 발명의 목적은 하기에 기재되는 그림／모식도들과 함께 읽을 때, 하기의 설명으로부터 보다 완전하게 이해될 수 있다.
실험 재료 및 방법
벡터의 제조:
pBTTAHis:히스디디놀(hisdidinol)을 포함하는 BbrPI／NotⅠ 절편을pDAF2HIS로부터 분리하여(Spitzer et al., 1998) 동일한 방법으로 절단한 pRBTtTA(Unsinger et al., 2001)에 삽입하였다. 상기 수득한 플라스미드를 pBTTAHis라 명명하였다. Hepa1-6 세포의 영구적(stably) 형질감염을 위하여 본 발명자들은 IRF-1-hER의 발현 구조물(pMT7RF-1-hER) (4) 및 퓨로마이신(puromycin) 내성을 나타내는 플라스미드를 사용하였다(42).pHBTMRS:트리시스트로닉(tricistronic) 발현 카세트로서 c-myc, c-Ha-ras 및 SEAP 유전자를 포함하는 EcoRⅠ／NOT Ⅰ절편을 pRBT의 양쪽방향성(bidirectional) 테트라사이클린 담당 프로모터의 3′말단에 삽입하였다(Unsinger et al., 2001). 히로마이신-B-인산전이효소(Hyromycin-B-phosphotransferase)를 PCR 증폭하여 pRBTMRS의 양쪽방향성(bidirectional) 테트라사이클린 담당 프로모터의 5′에 PmeⅠ을 통하여 삽입하여 pHBTMRS(Kroger, 1999)를 얻었다.pCMVIHEG:IRF-1hER 융합 단백질 유전자 및 폴리오(polio) IRES 서열을 포함하는 SpeⅠ／EcoRⅠ절편을 CMV 프로모터와 eGFP 유전자 사이에 삽입하여 바이시스트로닉(bicistronic) mRNA 상에서 IRF-1hER 및 eGFP를 발현하는 플라스미드를 얻었다.pCMVIH:pCMVIHEG를 PmaCI／HpaⅠ으로 절단하여 폴리오 IRES 및 eGFP를 코딩하는 서열을 제거하고 다시 재접합시켰다.pLTR-TBTIHEG:IRF-1hER 및 eGFP에 대한 바이시스트로닉 발현 카세트를 포함하는 PmeⅠ／NotⅠ절편을 동일한 방법으로 절단한 LTR-THTF(Unsinger et al., 2002)에 삽입하여 pLTR-TBTIHEG를 얻었다.
아데노바이러스 코스미드(cosmid)의 제조:
Ad-IH, Ad-IHEG, Ad-IHEGinv, Ad-LTR-TBTIHEG, Ad-LTR-TBTIHEGinv: 대장균에서의 클로닝에 의하여 재조합 아데노바이러스 유전체의 직접 결합을 허용하는 코스미드 클로닝 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. 코스미드 벡터 pAdcos45(Unsinger et al., 2002)를 E1 부위의 단일 클로닝 사이트에서 XbaⅠ으로 절단하고 하기의 카세트를 삽입하여 이 사이트를 채웠다; PmeⅠ／SwaⅠ절편으로서 pCMVIHEG의 CMVIHEG 카세트, BsrBⅠ／FspⅠ절편으로서 pLTR-TBTIHEG의 LTR-TBTIHEG 및 PmeⅠ／SwaⅠ절편으로서 pCMVIH로부터의 CMVIH 카세트. 패키징(packaging) 추출물(extract)를 이용하여 DNA를 접합하고 포장하였다. 대장균 DH5α에 형질도입 후, 암피실린 내성 클론을 선별하였다. 대장균에서의 시험관내 포장 및 증식 후에 Ad-IH, Ad-IHEG, Ad-IHEGinv, Ad-LTR-TBTIHEG, Ad-LTR-TBTIHEGinv 코스미드 제조물을 수득하였다.
세포 배양 및 유전자 형질도입:
마우스 섬유아세포 NIH3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 DMEM(Dulbescco's modified Eagle's medium)에서 배양하고, Hepa1-6 세포(마우스 H-2b-한정 HCC 세포 주: 92110305; European Collection of Animal Cell Culture)는 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 293 세포(낮은 계대의 인간 배아 신장 세포; Microbix PD-02-01)는 MEM(minimum essential medium)에서 배양하였다. 배지는 에스트로겐이 제거되고, 열 불활성화 시킨 10% 송아지 태아 혈청(fetal calf serum), 2 mM L-글루타민 페니실린(10 U／ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍／ml)을 포함한다. 형질감염된NIH3T3 세포를 128 U／ml 하이그로마이신 B, 800 ㎍／ml 히스티디놀 또는 800 ㎍／ml G418로 선별하였다. Hepa1-6 세포의 선별을 위하여 1 ㎍／ml의 퓨로마이신을 사용하였다.
NIH3T3 세포를 pBTTAHis, pHBTMRS, pMT7IRH-1-hER 및 네오마이신 저항성을 나타내는 플라스미드 pAG60(Colbere et al., 1981)로 영구 형질감염 시켰다. Hepa1-6 세포는 IRF-1-hER을 코딩하는 발현 구조물 및 퓨로마이신 저항성을 나타내는 플라스미드를 사용하여 영구 형질감염시켰다. 형질감염체를 선별하고 단일 클론은 분리하여 증폭하였다. 이러한 클론들은 Western blotting을 통하여 단백질 발현으로 탐색하였다.
재조합 아데노바이러스의 생성
재조합 아데노 바이러스를 생성하기 위하여 20 ㎍의 원형 아데노 바이러스 코스미드 DNA를 칼슘 포스페이트 침전을 사용하여 293 도우미(helper) 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 10-14일 경에 아데노바이러스 플라크의 형성을 확인하였다. 바이러스를 수득하고 293 세포를 재감염시켰다. 세포변성을 관찰한 후에, 바이러스를 수득하고 293 세포의 감염을 통하여 역가를 측정하였다. 코스미드 DNA로 부터 바이러스 서열이 제대로 잘려지는 것으로 의도된 구조를 확인한 DNA를 제한효소 분석으로 조절하였다. 아데노바이러스 감염을 위하여 세포를 MEM 배지에 접종하였다. 다음날 세포를 100 MOI (Hepa1-6 세포) 또는 2 MOI(293 세포)를 사용하여감염시켰다. 재조합 아데노바이러스를 2% FCS를 포함하는 1 ml PBS에 희석하였다. 아데노바이러스 감염 후 1시간동안 세포를 5% FCS를 포함하는 배지에서 더 배양하였다.
IRF-1-hER 융합 단백질의 IRF-1 활성화를 위하여, E2(SERVA, Frankfurt, Germany)를 세포 배양 배지에 첨가하여 최종 농도가 1 μM이 되도록 하였다.
웨스턴 블랏
전체 세포 추출물로부터의 면역 블랏을 인간 에스트로겐 수용체의 호르몬 결합 부위에 직접적으로 반응하는 항체(HC-30, Santa Crutz Biotechnology)로 검출하고 ECL(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)에 의하여 제조사의 방침에 따라 가시화하였다.
IFN-시험
마우스 L929 세포를 사용하는 항바이러스 분석을 통하여 세포 배양 상층액의 인터페론 농도를 측정하였다. 상기 항바이러스 활성의 특이성을 확인하기 위하여 마우스 IFN-β에 직접적으로 반응하는 중성화(neutralizing) 단클론 항체를 시험 세포에 첨가하기 전에 상층액에 첨가하였다.
세포 성장의 측정
세포성장을 측정하기위하여, 2×103세포／웰을 마이크로타이터 플레이트에 접종하고 몇 개의 독립적인 측정 포인트를 가지도록 연쇄 희석(serial dilution)(1:1)을 실시하였다. 세포에 제시한 농도의 β-에스트라디올을 처리하였다. WST 키트(Roche Diagnostics, Manheim, Germany)를 사용하여 제조사의 방침에 따라 세포 성장을 측정하였다. 10% 미만의 편차를 보이는 3회 실험의 평균 값을 도시하였다.
접촉 비의존성 성장(anchorage independent growth)의 분석
소프트 아가에 현탁한 세포의 콜로니 형성 효율을 측정함으로써 접촉 비의존성 성장 능력을 측정하였다. 50 ㎕의 0.6% 아래층(underlay) 아가(agar)로 코팅된 마이크로타이터 플래이트의 50 ㎕ 0.3% 위층(overlay) 아가(agar)에 1×103세포를 접종하였다. 유도 배지를 그 위에 첨가하였다(50 ㎕／웰). 도포 후 3주 후에 콜로니를 계수하였다.
마우스
수컷 C57L／J(H-2b) 마우스를 Freiburg 대학 병원의 동물 설비에서 유지하고 10에서 25주 령에 사용하였다.
누드 마우스 실험
6-8주 령의 수컷 NMRI 누드 마우스(Harlan Winkelmann, Borchen, Germany)를 생명공학 독일 연구 센터(German Research Center for Biotechnology)의 동물 설비 SPF 단위에서 유지하였다. 마우스들을 2 개의 실험 그룹으로 나누었으며, 각 그룹당 5마리의 마우스에 0.2 ml PBS NIH3T3A／MR／IH 세포 내의 1×106개의 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사 하였다. 각 그룹을 하기의 방법에 따라 처리하였다; 그룹 1: 비처리(n=5); 그룹 2: 1.5 mg의 E2를 2일마다 i.p.(n=4) 접종. 칼리퍼(calipers)를 이용하여 1 주일에 3 회 종양의 부피를 측정하고 기록하였다.
종양 모델
동계의 숙주에서 믿을만한 성장을 보이기 때문에 C57L／J 마우스에서 Hepa1-6 종양 모델을 선택하였다. Hepa1-6 세포는 C57L 마우스에서 발생하는 BW7756 마우스 간암 세포의 유도체이다. C57L 및 C57L／J 마우스 사이의 MHC class Ⅰ및 Ⅱ 발현은 동일하며 Hepa1-6 세포는 AFP 발현으로 특징지어질 수 있다. 이는 100 ㎕의 혈청이 제거된 MEM 배지에 포함된 1×107또는 5×106Hepa1-6세포를 마우스의 오른쪽 옆구리에 주사함으로써 100% 의 마우스에서 Hepa1-6 마우스 HCC 세포의 종양이 발생한다는 것으로 알 수 있었다. 6일 후, 종양이 식별가능하였으며 평균적으로 18일 후에는 크기가 2000 mm3에 도달하였다. 이 종양의 크리는 실험의 종료 시점(end point)로서 사용되었으며, 이어 마우스를 부검하였다. 종양 발생 및 부피는 칼리퍼를 사용하여 2일마다 측정하였다. 실험결과는 평균 부피 +／- SE로서 나타내었다.
유세포 분석(flow cytometry)
Hepa1-6 세포 와 HepaIRF-1hER 세포의 MHC class Ⅰ및 CD80의 발현을 항-마우스 H-2kb ／ H-2Db 항체 및 항-마우스 CD80 특이 항체(각각 클론 28-8-6 및 01940B)에 이어 FITC 표지된 항-마우스 (clone 02014D) 또는 FITC 표지된 항-래트 (클론 10094D) 항체를 사용하여 유세포 분석으로 조사하였다. 더 나아가, CD54(클론 01544D), I-A／I-E(클론 06355A), 및 CD86(클론 09274)의 발현을 PE- 또는 FITC-표지된 항체를 사용하여 측정하였다(모든 항체는 Pharmingen, San Diego, CA, USA로 부터 구입).
재조합 백시니아 바이러스의 제조
CTL 반응을 조사하기위하여 AFP를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 pSc11(음성 대조군으로서의 공 벡터) 재조합 백시니아 바이러스를 상기에서 기술한 바 대로 제조하였다.
세포독성(cytotoxicity) 분석
종양이 접종된 마우스 또는 대조군 마우스로부터의 비장세포를 현탁하고 24 웰 플래이트에서 시험관 내 자극 6일 후에 상기 비장세포의 세포독성 활성을 분석하였다. 상기 시험관 내 자극은 4×107개의 종양 노출된 비장세포와 1×107개의
야생형 Hepa1-6 세포 또는 특이성 확인을 위한 대조군으로서, 동계의 루이스 폐암 세포(상기 두 세포 모두 8000 라드(rad)로 방사선 조사한 세포)를 함께 배양하는 방법으로 수행하였다. AFP 특이적 면역 반응을 측정하기 위하여 종양이 접종된 마우스 또는 대조군 마우스로부터의 비장 세포를 UV로 불활성화된(300 mJ) rVV-AFP 또는, 특이성 확인을 위한 대조군으로서, MOI(multiplicity of infection) 5의 rVV-pSC11으로 감염시킨 동계의 미처리 공여 마우스의 비장 세포로 시험관내 자극시키고, 다음 상기 자극 세포들이 증식하는 것을 막기위하여 20 Gy(2000 rad)로 방사선 조사하였다. 이어 6 시간 크롬 유출 분석(chrome release assay)를 실시하였다. 표적세포로서 AFP를 발현하는 동계의 Hepa1-6 세포 및 AFP 음성 동계의 루이스 폐암 세포를 사용하였다. 상기 실험의 결과를 하기 식에따라 나타내었다; % 융해 = (실험 유출-자발적 유출) ／ (최대 유출 - 자발적 유출). 실험 유출은 상기 작동자(effector) 세포의 존재 하에서 표적 세포에 의하여 유출되는 분당 평균 계수값을 나타낸다. 최대 유출은 5% 트리톤 X-100으로 표적 세포를 모두 융해한 후 방출되는 방사성활성을 나타낸다. 자발적 유출은 표적 세포만으로부터 유래되는 배지의 방사성활성을 나타낸다. Hepa1-6 종양 또는 mAFP 특이적 융해는 Hepa1-6 표적에 대한 융해 값에서 3LL에대한 융해값을 뺀 값으로 나타낸다.
IFN-γ및 IL-4 ELISPOT 분석
멀티스크린-HA 96-웰 필터 플래이트를 4 ㎍／ml의 래트 항-마우스 IFN-γ또는 래트 항-마우스 IL-4 항체(PharMingen, San Diego, CA, USA, 클론 R46A2 또는 18191A)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 종양 접종된 마우스 또는 대조군 마우스로부터의 비장 세포(웰당 1×105개)를 1×104개의 방사선 조사한 작동자 세포(Hepa1-6, 3LL, 또는 rVV-AFP로 감염된 비장 세포)로 웰 당 200 ㎕ 배지에서 20 시간동안 3 중복실험으로 배양하였다. 배양 후에, 세포를 세척하고 2 ㎍／ml의 바이오틴 표지된 래트-항-마우스 IFN-γ또는 래트 항-마우스 IL-4 항체(PharMingen, San Diego, CA, USA, 클론 XMG1.2 또는 18042D)를 첨가하였으며 상기 플래이트를 실온에서 3 시간동안 방치하였다. 상기 플래이트를 다시 세척하고 1:1000으로 희석한 스트렙트아비딘-알칼라인 포스파타아제(Strepavidin-Alkaline Phosphatase) 중합체 (Mabtech, koln, Germany)로 30분동안 실온에서 반응시킨 후 ALP 융합 기질 용액(BCIP／NBT, BioRad, Richmond, USA)으로 현상하였다. 각 웰의 스팟들을 현미경 하에서 계수하고 그 값을 배양 초기에 각 웰에 첨가한 비장 세포의 수에 대한 스팟 형성 세포의 수로 표현하였다. 특이성 확인을 위한 대조군으로서 종양 접종된 마우스의 비장세포와 서로 다르게 방사선 조사된 작동자 세포를 단독으로 배양하였다.
생체내 종양 실험을 위한 실험 디자인
종양 보호 연구(tumor protection study)
C57L／J 마우스의 오른쪽 옆구리에 1×107개의 Hepa1-6 (그룹 1 및 2) 또는 HepaIRF-1hER(그룹 3 및 4) 세포를 접종하였다. 그룹 5에는 종양을 접종하지 않았다. 상기의 서로 다른 그룹들은 하기와 같이 처리되었다;
그룹 1: 비처리(n=3);
그룹 2: 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p.(n=3);
그룹 3: 비처리(n=8);
그룹 4: 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p.(n=8);
그룹 5: 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p.(n=2).
재접종에 대한 보호(Protection against rechallenge)
비처리(naive) C57L／J 마우스 또는 HepaIRF-1hER 종양 성장에 대하여 보호되었던 E2 처리 개체에 1×107개의 Hepa1-6 (n=3) 또는 HepaIRF-1hER(n=3) 세포를 재접종하였다(초기 종양 접종 후 28일). 중요하게는, 이 마우스들은 더이상 E2 처리를 받지 않는다.
종양 치료(Tumor theraphy)
C57L／J 마우스 오른쪽 옆구리에 1×107개의 HepaIRF-1hER 세포를(그룹 1 및 2) 접종하였다. 두 그룹 모두 E2 처리를 받지 않는다. 19일째에 두 그룹 모두에서 종양크기가 약 2000 mm3에 도달하였다. 19 일째부터 그룹 2에는 1.5 mg의 β-에스트라디올을 매 2일마다 i.p.(n=6)로 28일까지 주사하였다. 이어서, 나머지 4 개체에는 E2 처리를 지속하는 반면, 2 개체에는 E2 처리를 중단하였다. 그룹 1의 마우스들은(n=3) E2 처리를 받지 않았으며 종양이 10,000 mm3에 도달하면 부검하였다.
생체내 단클론 항체 제거
정제된 하이브리도마 상층액을 복강내 주사하여 CD4 및 CD8 T 세포 아군(subpopulation)을 제거하였다. 마우스 당 1 mg의 항-CD8(클론 YTS 169) 및 항-CD4 항체(클론 YTS 191.1)를 HepaIRF-1hER 종양 접종 5, 3, 1일 전에 그리고 그 이후 매 5일마다 주사하였다. 각각의 그룹은 하기와 같이 처리되었다;
1. 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p., 비제거(n=2);
2. 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p., CD8 제거(n=2);
3. 1.5 mg β-에스트라디올 매 2일 i.p., CD4 제거(n=2);
4. 비처리, 비제거(n=2).
통계적 분석
모든 결과는 윌콕슨 사인 랭크 테스트(Wilcoxon's signed rank test)로 분석하였다. 0.05이하의 양면성의 p 값은 통계적으로 중요하다고 간주된다. 종양 발생 및 2500 mm3까지의 성장은 카플란-마이에르 방법으로 계산하여 각각의 그룹 평균의 표준 편차로 나타내었고, 면역된 마우스와 대조군 마우스 사이의 차이는 만텔-하엔젤(Mantel-Haenszel) 시험으로 계산하였다.
결과
시험관내 분석
IRF-1은 HCC 종양 세포주 Hepa 1-6의 세포 성장을 억제한다.
IRF-1의 지속적 발현은 몇몇 세포주에서 강력한 세포 성장 억제를 나타낸다(4, 24, 40). 이는 영구 형질감염체가 매우 드물게 선별되며, 혼성 IRF-1의 비영구적 발현이 자주 일어난다는 결과를 가져온다. 따라서 본 발명자들은 HCC 세포주 Hepa1-6의 성장 억제제로서의 IRF-1의 활성을 조사하기 위하여 조건적으로 활성이 있는 IRF-1hER 융합단백질을 사용하였다. 지속적으로 발현되는 잡종(chimeric) 단백질은 호르몬 자극이 없는 상태에서는 활성을 가지지 않지만 상기 단백질의 hER 부위에 E2가 결합하면 활성이 있는 구조로 변화된다(4, 17, 24). IRF-1-hER을 Hepa1-6 세포에 영구적 형질감염 시켰다. 상기 형질감염체의 서로다른 IRF-1-hER 발현 수준을 관찰하고(도 1의 A, 위) 이를 액틴 발현에 대하여 평준화하였다(도 1의 A, 아래). 서로 다른 강도의 IRF-1-hER 발현을 보이는 3개의 세포 클론을 선별하였다(c4, c9, c22). IRF-1 활성화 7일 후에 이 클론들의 세포 성장을 측정하였다. 도 1의 B에서 보는 바와 같이, 상기 3 클론들로부터 유래된 세포들은 세포 성장 억제면에서 IRF-1 활성에 민감한 것으로 나타났다. 세포 성장억제 정도는 서로 다른 클론에 따라 40에서 80%까지 다양하고 이는 서로 다른 IRF-1의 발현량과 연관이 있다. IRF-1-hER을 발현하지 않는 야생형 Hepa1-6 세포를 대조군으로 사용하였다. 상기 형질감염시키지 않은 세포는 β-에스트라디올에 반응하지 않아 세포성장에 변화를 보이지 않았다. 이는 3개의 세포 클론 모두 활성화가능한 IRF-1을 발현하며 IRF-1의 표현형의 독특한 성장 억제 능력을 나타낸다는 것을 가리킨다. 그러나, 다른 세포주에 비하여 Hepa1-6 세포의 성장 억제는 강력하지 않다는 것을 주목해야 한다(24). 세포 증식이 감소함에도 불구하고 상기 세포는 이러한 상태에서 상당한 기간 동안 배양될 수 있다. 더 나아가, 이 세포들은 β-에스트라디올에의한 IRF-1 활성화에 의하여 어떤 세포사멸 신호도 나타내지 않는다. 이는 아배수(subdiploid) DNA 시험((47) 및 결과 제시 안함) 및 아넥신(Annexin) 염색((48) 및 결과 제시 안함)으로 확인하였다.
활성화된 IRF-1은 IFN 분비를 유도한다.
IFN-β의 유도는 IRF-1 활성화 후 관찰된 특징적인 면이다. 분비된 IFN-β을 IRF-1 활성화 척도로 간주할 수 있다. IFN들이 면역 조절능력을 가지기 때문에, IFN-β의 분비를 항바이러스 분석으로 측정하였다(표 1). 3개의 모든 클론에서 IRF-1은 β-에스트라디올에 의하여 활성화되는 것으로 나타났다. 클론 22에서 가장 높은 IFN 분비를 보이며, 이는 IRF-1 발현의 강도(도 1의 A) 및 증식 억제(도 1의 B)와도 일치한다. 본 발명자들은 IFN-β에 직접 반응하는 중성화 항체를 사용하여 상기 항 바이러스 활성이 전적으로 IFN-β에 의한 것임을 확인하였다. IFN들은 세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 Hepa1-6 세포 클론으로부터 분비되는 IFN-β의 양은 그에 상당하는 양의 재조합 마우스 IFN-β를 대조군 세포에 처리하여 나타난 상기 관찰된 세포 성장에 대한 효과를 매개하기에 충분하지 않다(결과 제시하지 않음).
IRF-1 활성화 동안 감소된 부착 비의존적 성장
종양 세포를 비종양세포와 구분하는 가장 대표적인 시험관내 특징은 부착 비의존적 성장이다. IRF-1 활성화가 이 HCC 세포 주의 형질전환된 표현형을 회복시킬 수 있는지 시험관내에서 확인하기 위하여, 본 발명자들은 불활성회된 또는 활성화된 IRF-1의 존재하에서 부착 비의존적 콜로니를 형성하는 능력을 조사하였다(도 2). 형질감염시키지 않은 종양 세포 클론은 소프트 아가에서 잘 자랐다. IRF-1hER을 발현하지 않는 형질전환된 야생형 Hepa1-6 세포 주의 콜로니 형성 능력은 β-에스트라디올에 의하여 영향 받지 않았다. 형질감염시키지 않은 세포와는 반대로, IRF-1hER을 포함하는 세포는 수는 적으나 더 큰 콜로니를 형성하였다. E2 존재하에서, 클론 22는 IRF-1hER의 발현 능력과 반비례하는 연관성을 보이며 소프트 아가에서 가장 적은 수의 콜로니를 형성하였다. 클론 9는 비처리 세포와 E2 처리 세포간의 가장 큰 소프트 아가 콜로니 형성 비율을 보였다. 따라서, 하기의 간단하게 설계된 HepaIRF-1hER에서, 시험관내 특성 관찰 및 생체내 종양 모델로 클론 c9을 사용하였다.
활성화된 IRF-1hER은 면역적으로 반응가능한 세포 표면 단백질 발현을 조절한다.
IRF-1 발현이 MHC 유전자의 발현을 증가시킨다는 것이 이미 알려져 있다(7, 31). 본 발명자들은 유세포 분석으로 β-에스트라디올에 의한 IRF-1의 활성화 전, 후에 MHC class Ⅰ, MHC class Ⅱ, CD54, CD80, 및 CD86의 세포 표면 발현 수준을 조사하였다. 야생형 Hepa1-6 및 E2 비처리 HepaIRF-1hER 세포는 MHC class Ⅱ, CD80, 및 CD86 발현이 되지 않는 것으로 나타났다. MHC class Ⅰ(H-2Kb／H-2Db)은 낮은 수준으로 CD54는 높은 수준으로 발현되었다. HepaIRF-1hER 세포에 E2 처리하면 H-2Kb／H-2Db의 강력한 발현 증가를 나타내고, CD54 발현은 변화되지 않은 채로 남아있으며, MHC class Ⅱ 발현은 약하게 증가하였다(도 3). CD80 및 CD86 발현은 음성으로 남아있었다(결과 제시 안함).
아데노바이러스 매개 IRF-1의 발현은 HCC 세포의 IFN-β의 강력한 분비를 야기한다.
광범위하게 다양한 세포에서 IRF-1의 전달 및 생체낸 형질도입을 위한 운반 시스템으로서 IRF-1-hER 융합 단백질의 발현 카세트를 포함하는 pAdcos45에 기초한 아데노바이러스 벡터들을 제조하였다. IRF-1-hER의 cDNA를 아데노바이러스 벡터 pAdcos45에 도입하고 바이러스를 제조하였다.
Hepa1-6 세포를 pAd-IH, pAd-IHEG, pAd-LTR-TBTIHEG 및 pAd-LTR-TBTIHEGinv바이러스로 감염시켰다(도 4의 A). 감염 48시간 후에 IRF-1-hER 발현을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 상기 아데노바이러스로 감염시킨 세포에서 높은 수준의 IRF-1-hER 발현이 관찰되었다(도 4의 B). 감염된 세포를 E2 처리 또는 모크(mock) 처리한 후 IFN의 분비를 측정하였다. E2 처리 후의 IRF-1 hER 유전자를 포함하는 아데노 바이러스로 감염된 세포의 배양 상층액에서 IFN이 검출되었고, 이는 상기 감염에 의해서가 아닌 IRF-1의 활성화에 의하여 IFN의 분비가 유도된다는 것을 나타낸다(표 2). 아데노바이러스로 형질도입된 세포에서 분비된 IFN의 양은 IRF-1hER 융합 단백질을 영구적으로 발현하는 형질감염체에서 분비된 양보다 3,5-6배 정도 높았다.
종양적으로 형질전환된 형질전환된 NIH3T3 세포에서의 IRF-1 영향
종양적으로 형질전환된 형질전환된 NIH3T3 세포에서의 IRF-1 영향을 조사하였다. c-myc과 c-Ha-ras 종양유전자를 조건적으로 발현하는 NIH3T3 세포를 사용하였다. 상기 두 종양유전자 모두 테트라사이클린 조절 프로모터에 의하여 발현된다(Kroger, Dissertation, Universitat braunschweig, 1999). 상기 세포에 IRF-1-hER 융합단백질을 코딩하는 구조물을 영구적으로 형질감염시켰다. 이 세포주는 형질전환되지 않은 NIH3T3 세포에서(독시사이클린(Doxycycline) 존재 시) 및 형질전환된 상태에서(독시사이클린 부재 시)의 IRF-1의 영향 조사가 가능하다. 하기의 IRF-1의 시험관내 항종양성 활성을 조사하였다; 세포증식에 대한 영향, 소프트 아가에서의 성장 및 E2 처리에 의한 IRF-1-hER의 활성화 유무에 따른 IFN 유도를 측정하였다. 이는 세포가 형질전환된 상태에서 뿐아니라 형질되지 않은 상태에 대해서도 수행되었다. E2 및 독시사이클린을 5일동안 첨가하였다. E2 처리가 없을 때 형질전환된 세포는 세포성장의 증가를 보인다는 사실에도 불구하고, IRF-1-hER의 활성화로 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환된 세포에서 모두 뚜렷한 세포 성장 감소가 나타났다(표 3).
IRF-1이 소프트 아가에서 콜로니를 형성할 수 있는 세포의 형질전환된 표현형을 되돌릴 수 있는지 여부에 대하여 조사하였다. 형질전환되지 않은 상태에서의 상기 세포는 소프트 아가에서 성장하지 못했다. 반대로, 독시사이클린 부재 시(형질전환된 상태에서) 세포는 소프트 아가에서 잘 자라며 콜로니를 형성하였다. 상기 소프트 아가에서의 성장 능력은 E2 처리를 하여 IRF-1을 활성화시켰을 때 완전히 제거되었다(표 3). IRF-1 활성화 측정으로 항바이러스 분석에 의하여 측정되는 IFN 분비를 사용하였다. E2 처리에 의한 IRF-1 활성화는 형질전환되지 않은 세포 및 형질전환된 세포에서 동일한 것으로 나타났다(표 3).
IRF-1 활성화는 누드 마우스에서 형질전환된 세포의 종양 성장을 감소시킨다.
IRF-1이 시험관 내에서 종양적으로 형질전환된 NIH3T3 세포의 세포 형질전환을 억제하기 때문에, 생체내에서의 종양성에 대한 그의 영향을 조사하였다. IRF-1의 가질수 있는 항-종양 활성을 검증하기 위하여, 상기 세포를 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 주사하였다. 종양 형성을 조사하였다. 상기 형질전환된 세포의 주입은 4주 이내에 종양 형성을 야기하였고 이식받은 개체의 100%가 6주 이내에 종양이 발생하였다(도 5). 형질전환된 세포로 접종된 마우스에 E2 처리를 하면, 종양 성장 역학은 획기적으로 변화되었다. 처리하지 않은 개체에서는 4주 후에 종양의 크기가 1500 mm3에 도달하였고 E2 처리한 개체의 40%에서는 종양이 발생하지 않았다. 이러한 결과는 IRF-1hER 융합 단백질의 활성화가 T- 및 B-세포로 짜여지는 개체에서의 형질전환된 세포의 발암 역학을 연기시키기에 충분하다는 것을 나타낸다.
생체내 분석
IRF-1 활성화는 HCC 성장을 억제한다.
C57L／J 마우스에서 피하에서 자라는 마우스 Hepa1-6 HCC에 대한 IRF-1hER 발현의 항종양적 효능을 조사하기 위하여, 서로 다른 처리그룹을 무작위적으로 설계하였다. 동계의 C57L／J 마우스에서 종양 모델로 사용되는 Hepa1-6 HCC 세포는 약간 빠른 종양 성장 및 이식받은 개체의 100%에서 종양을 발생을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 야생형 Hepa1-6 및 HepaIRF-1hER 세포는 모두 피하 주사 후에 거의 동일한 발암성을 보였고, 이는 E2 처리하지 않은 HepaIRF-1hER 세포에서 비활성 IRF-1hER 융합 단백질이 존재한다는 것을 나타낸다(도 6의 A, p＞0.5). 17일 후에, 평균 1500 mm3크기의 거대한 종양이 발생하였다. 야생형 Hepa1-6 세포로 접종된 마우스에 E2 처리한 경우에 Hepa1-6 또는 HepaIRF-1hER 세포로 접종된 마우스에 E2 처리하지 않은 경우와 비교하여 볼 때 종양 발생에 대한 어떠한 영향도 관찰되지않았다. 이러한 결과는 E2 처리 단독으로는 종양 성장이나 개체의 건강에 어떠한 음성적 영향을 미치지않음을 알 수있다. HepaIRF-1hER 세포로 접종되었으나 종양 접종 시점부터 2일마다 E2로 i.p 접종한 C57L／J 마우스의 경우에, 종양 성장이 유의적으로 억제되었다. 8 개체 중 6개체에서 종양 성장에 대하여 완전히 보호되었고 나머지 2개체는 느린 세포 성장률을 보이는 매우 작은 종양만이 발생하였다는 것(도 6)은 매우 중요한 발견이다. 40일 후에 종양의 크기는 단지 450 mm3이었으며, 42일째 E2 처리를 멈추어도 더 빠른 종양 성장률이 나타나지 않았다.
종양 세포에서의 IRF-1 활성화는 T-세포 기억(memory)을 유도한다.
본 발명자들은 HepaIRF-1hER 접종에 대하여 완벽하게 보호되었던 E2 처리 마우스에서의 종양 특이적 기억(memory) T-세포가 존재하는지를 조사하는데 관심을 가지게 되었다. 따라서, 종양접종 후 28일 째 및 E2 처리 중단 후 11일 째의 종양이 없는 마우스에 1×107의 야생형 Hepa1-6(n=3) 또는 HepaIRF-1hER(n=3)을 접종하였다. 중요하게는, 이 마우스들은 더이상의 E2 처리를 받지않았다. 도 6의 B에서 보는 바와 같이, 두 그룹의 모든 마우스들에서 종양 성장에 대하여 보호되었지만 CD8+ T 세포 제거 후에는 그렇지 않았다(n=2, 실험결과 제시하지 않음). 반대로, 종양접종한 경험이 없는 E2 처리하지 않은 C57L／J 마우스에서는 Hepa1-6 및 HepaIRF-1hER의 빠른 종양 성장이 나타났다. 이러한 결과는 활성 IRF-1hER의 발현에 의한 종양특이적 면역의 1차 준비 이후 종양 특이적 T 세포 기억이 존재함을 나타낸다.
IRF-1 활성화된 종양 세포를 통한 CTL 활성의 유도.
실제로, HepaIRF-1hER 세포로 접종하고 E2로 처리한 마우스에서 방사선 조사한 Hepa1-6 세포를 이용한 시험관내 자극 후 Hepa1-6 표적 세포에 대한 강력한 CTL 활성이 관찰되었다(도 7의 A). 종양 접종되지않은 마우스 또는 종양접종되고 E2 처리된 마우스로부터 유래되고 3LL 세포로 시험관내 자극된 비장세포는 Hepa1-6 표적에 대한 약한 배경 살해 능력만을 보이기 때문에, 이러한 CTL 활성은 Hepa1-6 종양 세포에 대하여 특이적이다(도 7). 생체내 사이토카인 생성 세포를 측정함으로써 1차 T 세포 반응을 검증하였다. E2 비처리／HepaIRF-1hER, E2 비처리／Hepa1-6, 또는 E2 처리／Hepa1-6 접종된 마우스의 경우(20,000 중 1 IFN-γ분비 T 세포 및 40,000 중 1 IL-4 분비 T 세포, p=0.01)와 비교하면, HepaIRF-1hER 접종되고 E2 처리한 마우스에서 방사선 조사한 Hepa1-6 세포로 자극하였을 때 IFN-γ(5,000 중 1) 및 IL-4(10,000 중 1)를 분비하는 비장세포의 수가 현격하게 증가되었으며(도 7의 B), 이는 TH1 및 TH2 종양 면역 모두 유의적으로 발생하였음을 의미한다. ELISPOT 분석에의하여 수득된 생체내 결과와는 반대로, 서로 다른 두 그룹사이의51Cr-유출 검사에서의 시험관내 살해 활성에서의 CTL의 차이(도 7의 A)는 통계적 유의성을 나타내지 않았다. 이는 종양 특이적 T 세포의 시험관내 확장 및 ELISPOT 기술과 비교하여51Cr-유출 검사의 낮은 민감도 때문일 수 있다.
IRF-1 활성화는 종양 특이적 자가 항원에 대한 무시를 깨뜨린다.
HCC에 대한 면역반응을 좀더 상세히 밝히고 활성화된 IRF-1의 발현이 종양 특이적 항원에 대한 면역반응을 일으킬 수 있는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 표적으로 HCC 세포에서 높은 수준으로 빈번하게 발현되는 HCC 특이적 자가 항원 AFP를 선택하였다. HepaIRF-1hER 접종되고 E2 처리한 마우스에서 내인성으로 높은 수준의 AFP를 발현하는 Hepa1-6 HCC에 대한 중간 수준의 CTL 활성이 관찰되었다(도 8의 A). 다른 그룹(1,000,000 중 1)과 비교할 때 CTL 활성이 유의적으로 강했고(p=0.02), AFP 특이적 IFN-γ 생성 비장세포의 수(11,000 중 1)도 높았다(p=0.001). 종양이 없는 대조군 개체에서는 특이적 CTL 활성 또는 Hepa1-6 또는 3LL 표적 세포에 대한 증가된 배경 세포융해가 관찰되지 않았다. 덧붙여, HepaIRF-1hER 접종되고 E2 처리한 마우스로부터의 rVV-pSC11으로 작동자 세포를 자극한후에는 표적세포의 세포융해 증가를 볼 수 없었으며 이로부터 AFP에 대한 CTL 활성을 알 수 있었다(도 8의 A). 작동자 세포 없이 rVV-AFP 감염된 비장세포만을 이용한 또는 작동자 세포만을 이용한 ELISPOT 검사에서 증가된 스팟 형성이 나타나지 않은 것도 부가적으로 AFP 특이성을 나타낸다(실험결과 제시하지 않음).
이러한 시험결과는 자가 항원 AFP에 대한 내성이 HCC 종양 성장 조절에 관여할 것으로 예상되는 메카니즘인 활성화된 IRF-1의 종양내적 발현에 의하여 깨어질 수 있다는 것을 나타낸다.
숙주 면역 반응 이외의 요인들이 IRF-1 활성화된 종양 세포의 거부에 참여한다.
숙주의 항종양성 면역 반응이 종양 거부를 담당하는 유일한 조절인자인지를 조사하기 위하여, HepaIRF-1hER 접종되고 E2 처리한 마우스에서 생체내 T 세포 제거 실험을 실시하였다. CD4 및 CD8 T 세포 모두를 제거한 경우 모든 마우스에서 종양 성장이 일어났으나, E2 처리하지 않은 마우스에서 제거하지 않은 경우와 비교하면 유의적으로 지연되었다. 이 발견으로 숙주 면역 반응이 종양 보호의 중요한 요인이지만 종양 성장의 초기조절에서 일부분만을 담당하는 것으로 보인다는 것을 내포한다.
IRF-1 활성화는 활발하게 성장하는 종양의 증가를 정지시킨다.
E2 처리되지 않은 C57L／J 마우스의 피하에서 성장하는 HepaIRF-1hER HCC에 대한 IRF-1hER 활성화의 치료적 효능을 조사하기 위하여, 종양접종 후 19일 째부터 E2 처리를 시작하였다. 이 시점에서 종양은 평균 크기 2,000 mm3에 도달하여 있었다. 도 9의 B에서 나타난 바와 같이, E2 처리를 시작한지 4일 만에 종양성장이 영구적으로 정지되었으며, 이는 HCC에대한 IRF-1 활성화의 중요한 치료적 잠재성을 나타낸다. 반대로 E2 처리하지 않은 마우스에서 HepaIRF-1hER 종양이 빠르게 성장했다. 9일동안의 E2 처리는 장기적 종양 성장 조절에 충분했다. 이는 E2 처리한 6개체 중 개체에서 28일째 다시 E2 처리를 중단한 것으로 쉽게 알 수 있다. 이 마우스들에서의 종양성장은 2일마다 E2 처리를 지속한 마우스들과 비교하여 다르지않았다.
한쪽 옆구리의 종양에서의 IRF-1 활성화는 양쪽 옆구리의 종양성장에 영향을 미친다.
종양에 대한 치료적 백신으로서의 IRF-1 활성화의 효능을 조사하였다. 마우스의 오른쪽 옆구리에는 HepaIRF-1hER 세포를 피하주사하고 왼쪽 옆구리에는 야생형 Heap1-6 세포를 주사하였다. 개체들은 매 2일마다 1.5 mg의 E2를 처리하거나 처리하지 않은 채로 놔두었다. IRF-1-hER의 활성화는 마우스의 오른쪽 옆구리에서의 HepaIRF-1hER의 종양 성장을 폐지시켰다. 덧붙여, 왼쪽 옆구리에서의 야생형 Hepa1-6 세포의 종양 성장 또한 첫째날에 시작된 Hepa1-6 종양 성장과 비교하여 감소하였음에도 불구하고 처리하지 않은 개체에서 일어난 것과 같은 더이상의 확장은 억제되었다.
토 의
HCC는 나쁜 예후를 보이며 치료 가능성이 거의 없는 매우 악성의 종양이다. IRF-1의 활성화에 목적을 둔 새로운 면역치료학적 접근을 조사하였다. β-에스트라디올의 존재 하에서 활성화되는 IRF-1／인간 에스트로겐 수용체 융합 단백질을 코딩하는 마우스 HCC 세포주(HepaIRF-1hER)을 제조하였다. 시험관내 표현형, 세포성장, 시험관내 부착 의존성 성장, 생체내 면역유발성 및 IRF-1의 치료학적 잠재성에 대한 모든 것을 조사하였다. 영구적으로 계속 발현되는 IRF-1은 그 발현 클론이 매우 적게 나타나기 때문에 선택하기에 부적합하다. 이러한 세포주에서의 실제적인 외부유전자 발현은 내인성 IRF-1 발현에 미치지 못한다. 게다가 지속적인 발현은 시간이 지남에 따라 IRF-1 반응성이 손실되는 것을 유발한다. 반대로, 본 발명에서 사용된 활성화 가능한 IRF-1hER 시스템은 IRF-1 활성화가 잘 조절되도록 하며 종양세포에서 보다 높은 수준으로 IRF-1이 발현되도록 한다. E2(E2= β-에스트라디올)로 활성화 가능한 시스템이 많이 연구되어 왔으며 야생형 IRF-1 유전자의 테트라사이클린 조절 전사 활성화와도 비교되었다. 차이점은 발견되지 않았다(Kirchhoff et al., 1995; Koster et al., 1995). 돌연변이 에스트라디올 수용체 유전자를 사용하기때문에 상기 융합 단백질은 낮은 농도의 에스트라디올에 민감하지 않으며 따라서 내인성 에스트로겐 수준에 의하여 활성화 되지않고 마우스에서 사용될 수 있다. 그러나, IRF-1hER*의 상대적 타목시펜(Tamoxifen) 특이적 돌연변이(50)는 IRF-1 활성의 밀착된 조절을 보이지 않았다(A. Kroger, 미발표). β-에스트라디올 유도가능한 시스템을 사용하여 본 발명자들은, 따라서 IRF-1의 항종양성 효과를 확인할 수 있었으며 그의 서로다른 항종양성 작동자 분지의 활성화를 분석하였다.
Hepa1-6 세포의 성장 및 형질전환의 억제로 IRF-1의 태생적 면역 활성에 기인하는 가능성을 시험관내에서 확인할 수 있다. 비정상적인 IRF-1 발현은 myc, forB(29), IRF-2(51, 52), EGFR 및 E1a／b(24)와 같은 서로 다른 종양인자에 의하여 시험관내 유도되는 세포 형질전환 가능성을 억제한다. 야생형 세포에서는 c-Ha-ras 종양유전자를 발현하지만 IRF-／-세포에서는 발현하지 않는 IRF-／-마우스로부터의 배아 섬유아세포(embryomic fibroblast)는 성장 제한된 조건에서의 세포사멸을 일으킨다는 이전의 연구 결과와 맞추어(Tanaka et al., 1994), NIH3T3 세포에서의 EGFR과 IRF-1의 연합된 활성은 세포사멸에 의한 주요한 세포 죽음을 유도하는 것으로 나타났다(24). 그러나, 이 보고에서의 실험결과는 시험관내 종양유전자 의존적 종양 억제는 세포사멸을 매개하는데 필수적이지 않다는 것을 나타낸다. 따라서, 형질전환억제의 또다른 메카니즘이 활성화될 것으로 기대된다. IRF-1은 DNA에 결합하여 형질전환 억제에 관여할 수 있는 여러 유전자를 원격활성화(transactivation)시킴으로써 효력을 나타낸다. 이들 중에는 라이실 산화효소(Lysyl oxidase)(16), PKR(17, 53), 2’-5’OASE(18), 인돌아민-2,3-디옥시게나제(indoleamine-2,3-dioxigenase)(19), 및 안지오텐신(angiotensin) 2형 수용체(20) 등이 있다. 이 목록에서 IFN-β분비의 역할은 명확하지 않지만 이러한 유전자의 피드-백 강화제로 기능할 수 있다.
IRF-1은 몇몇 다른 상당한 생체내 항종양 활성을 가진다. 이들은 헬퍼 T 및 NK 세포의 자극(54, 55), MHC 유전자(4, 31, 56, 57) 및 항원 표지에 포함되는 유전자(38, 58)의 전사 증가와 같은 IRF-1의 면역조절 효과를 담당한다. 따라서, IRF-1의 발현 또는 활성을 강화시키는 대부분의 기작 또는 제제는 형질전환된 세포의 특이적 살해를 유도함으로써 암 치료에 유용할 수 있다. 실제로 마우스 실험에서 공격적인 비면역유발성 육종(sarcoma) 세포에서의 IRF-1의 발현이 악성의 표현형을 억제한다고 보고된 바 있다(40).
생체낸에서의 고도의 종양유발성 HCC 세포주의 억제 및 조절은 IRF-1의 가장 중요한 활성이다. E2를 처리하여 HepaIRF-1hER 종양의 접종으로부터 75%의 마우스를 보호하였으며, 종양이 발생한 마우스는 E2 처리하지않은 개체와 비교하여 종양 성장의 현저한 억제와 생존 증가를 보였다. 이와 유사한 결과가 육종 세포주에서의 지속적인 발현이 부분적인 종양 조절을 가져온다는 최근 연구에서도 관찰되었다. T 세포 제거 실험에 의하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 종양 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며, 알려진 TH1 분화 유도에서의 IRF-1의 중요성을 확인하였다(55). 덧붙여, 본 발명자들은 종양성장에 대하여 상승작용으로 기능하는 종양 특이적 TH2 세포(59, 60)의 유의한 활성화를 관찰하였다. CD4+ 및 CD8+ 모두 제거한 실험의 효과는 IRF-1 매개 종양 성장 조절 효과 전체를 설명하지는 못한다. IFN-β는 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, NK 세포도 종양 조절에 참여할 수 있다.
보다 중요하게, IRF-1의 종양내적 발현이 HCC 특이적 자가 항원인 AFP와 같은 종양 연관 항원에 대한 유의한 T 세포 반응을 유도한다는 것을 처음으로 밝혔으며, 이는 이러한 접근에 의하여 AFP에 대한 내성이 깨어졌다는 것을 의미한다. AFP 특이적 CTL 활성은 HBV 및 HCV 구조 단백질과 같은 고도의 면역유발성 바이러스 항원과 비교할 때 낮은 편이다(61, 62). 이는 낮은 CTL 선구체 빈도 및／또는 낮은 TCRs 친화도의 결과때문일 수 있다. 그러나 최근의 연구에서, DNA- 또는 수지상(dendritic) 세포에 기초한 면역유발 후의 AFP 특이적 T 세포는 AFP를 발현하는 마우스 HCC에 대하여 생체내 기능할 수 있음이 밝혀졌으며(44, 63), 이는 본 발명에서 기재한 바와 같이 AFP 특이적 T 세포가 항종양적 효과에 기여한다는 것을 의미한다. 생체낸 제거 실험에서 밝혀진 바와 같이 세포 면역 단독으로 종양 성장을 완벽하게 조절할 수는 없음에도 불구하고, HepaIRF-1hER의 재접종 및 더이상 E2 처리를 하지않는 야생형 Hepa1-6 세포에 대하여도 마우스를 보호하는 종양에 대한 유의한 T 세포 기억이 유발되었다. 더욱 중요하게는, HCC 진단 후의 의학적 상황을 반영하는 IRF-1 발현의 잠재적 치료 효과를 보여주었다. 커다란 HepaIRF-1hER 종양을 포함하는 마우스에 E2 처리를 하면 4일내에 종양의 성장 정지를 일으킨다. 9일 정도의 E2처리는 더이상의 E2 처리없이 장기 종양 성장을 조절하기에 충분하다. 상기에서 기술된 종양 보호 연구에 따르면, 이러한 장기 종양 조절은 1차적으로는 면역 매개일 수 있다.
IRF-1을 발현하는 HCC 종양의 증가된 면역 유발성은 HCC 세포에서 MHC 클래스 Ⅱ 유도가 낮긴 하지만 이전에 기술된 대로 MHC 클래스 Ⅰ및 Ⅱ 분자의 증가에 의하여 매개될 수 있다. CD80 및 CD86 보조자극 분자는 검출되지 않았으며 이는 항종양성 면역 반응의 초기화가 전문 항원 표지 세포에 의하여 림프 노드를 따라 일어났음을 의미한다. IRF-1 매개 종양 조절에 포함되는 부가적인 요소들은 프로테아좀에의하여 면역 시스템에 표지되기 위한 MHC 클래스 Ⅰ 제한적 항원 펩티드 생산의 증가일 수 있다(38, 39, 58).
임 등(Yim et al)에 의해 예견된 바대로, 비정상적인 IRF-1 발현이 유의한 치료학적 항종양성 면역반응을 유도하며, 예를들어 AFP와 같은 조직 특이적 자가 종양 항원에 대한 면역화를 일으킨다는 것이 처음 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 결과는 국지적 및 AFP 기초 HCC 면역치료를 포함한다.
요약하면, 간상피암(HCC)는 나쁜 예후를 가지며 치료 가능성의 거의 없는 매우 악성의 종양이다.
HCC는 다른 종양에의 도입을 위한 예로서 간주되고 있다. IRF-1이 다른 종양 종에서도 동일한 시스템 효과를 가질 것이라는 좋은 증거가 있다. 하기의 예들은 이러한 가정을 뒷받침한다:
1. 임 등(1997; 40)은 IRF-1을 발현할 때 육종 세포주가 부분적으로 거부 및 면역화를 유발한다는 것을 보고하였다. 상기 효과는 IRF-1이 충분히 발현되지 않기 때문에 완전하지 않다.
2. 종양적으로 형질전환된 NIH3T3 세포의 예는 누드 마우스에서도 활성 IRF-1이 발현될 때 종양의 성장이 유의적으로 감소한다는 것을 뒷받침한다. 누드 마우스에서의 종양 성장의 지연은 시험관내 결과에서 기대되었던 것보다 훨씬 높았으며, 이는 이러한 개체에서 면역 시스템의 나머지 부분이 포함되었다는 것을 의미 한다.
3. 수많은 서로다른 종양적으로 형질전환된 세포주를 이용한 시험관내 실험결과는 IRF-1이 유의적으로 또는 완벽하게 소프트 아가 성장을 억제할 수 있으며, 인터페론 분비의 유도, 및 MHC 증가를 활성화시킬 수 있음을 보여준다(Kirchhoff et al., 1999; Kroger et al., 발표되지 않은 결과).
마우스에서 종양 방어의 상세한 분자적 기능이 알려지지 않았음에도 불구하고, 제시된 데이타는 면역 세포들(CTL, TH1 및 TH2 세포)이 포함되는 것을 나타낸다. 상기 누드 마우스 실험은 NK 세포 또한 포함된다는 것을 제시한다. IFN-β는 NK 세포 활성의 강력한 활성자로 알려져 있다. 더나아가 IFN-β는 또한 수용성 면역 시스템에서 다양한 활성화 기능으로 알려져 있다. 마지막으로, IRF-1의 성장 억제 효과 뿐 아니라 세포 사멸이 IRF-1을 과발현하는 세포에서 보이는 종양 억제 효과에 기여할 수 있다. 면역학적 효과가 MHC 증가 및 인터페론 분비에 의하여 매개되는 것으로 생각되어지는 반면, IRF-1에 의하여 유도되는 아직 알려지지 않은 활성이 항종양성에 기여할 수도 있다.
IRF-1 활성화에 의하여 분비되는 인터페론은 국지적으로뿐아니라 전체적으로 기능할 수 있다. 따라서 항원 표지 세포(IRF-1을 과발현하는 것들)를 둘러싸는 IFN의 생성이 항종양 활성의 고도의 자극을 유발할 가능성이 있다.
본 발명에서 IRF-1은 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어IRF-3가 IRF-1에 의하여 활성화되는 유전자와 동일한 또는 유사한 유전자들을 활성화시킬 수 있다는 것에서 보여지듯이, 다른 IRF들도 IRF-1과 비교하여 유사한 결합 능력을 가진다는 것이 잘 알려져있다. 따라서, 지속적으로 활성이 있는 영구적으로 활성화된 IRF-3 또는 IRF-3 변이체들은 상기에서 밝혀진 바와 같이 동일한 항종양성 활성을 가질 수 있다.
상기 동물 종양 모델에서 관찰된 효과들이 어떻게 인간 치료에 적용될 수 있을까? 모든 시나리오는 IRF-1 또는 관련 전사 요소들의 강력한 활성에 기초한다(상기 참조).
1. 세포 치료
환자의 종양 세포 또는 동일한 종양 존재를 가지는 환자로부터의 종양 세포(동종 이계의 세포)에 바이러스 감염 또는 다른 유전자 전달 방법에 의하여 유전자를 장전할 수 있다. 상기 유전자들이 일시적으로 또는 장기적으로 발현되는 지는 중요하지 않다. 다르게는, 표적 종양에 상당하는 종양 항원을 표지시킬 수 있는 비특이적 세포 또는 전문 항원 표지 세포에 IRF 구조물을 장전할 수 있다. 상기 세포들은 환자 자신으로부터 유래되거나 또는 동종이계일 수 있다. 그러한 세포에서의 IRF 유전자의 활성화는 환자에게 주어지기 전에 즉시 시험관내에서 활성화될 수 있다. 다르게는, 적합한 활성자(β-에스트라디올 또는 테트라사이클린)를 주므로써 상기 환자 내에서 활성화 될 수 있다. 인간에서 세포 치료는 보통 UV 또는감마 방사선 조사와 같은 방법에 의하여 불활성화시킨 다른 세포를 이용하여 수행된다.
2. 바이러스 전달 방법에 의한 유전자 치료
상기에서 기재된 바와 같은 IRF들은 상기 기재된 아데노바이러스 같은 바이러스 벡터에 의하여 형질도입될 수 있다. 바람직하게는, 이는 상기 바이러스를 종양에 또는 종양에 가까운 조직에 감염시킴으로써 수행된다. 이러한 경우에, 이는 전체적인 적용에 의하여 실시될 수 있다. 특히 간 종양의 경우에 아데노바이러스를 혈류에 적용하는 것으로 실시할 수 있다. 아데노 바이러스들은 간에서 주로 포집되어 유전자 전달이 간 특이적으로 일어난다는 것이 잘 알려져 있다. 바이러스 벡터에 의하여 부여된 IRF의 활성화 또는 감소는 각각의 제제에 의하여 환자 내에서 생체내 활성화된다. 이전의 연구들에서 비종양 세포에서의 IRF-1 활성화가 가역적인 증식 억제를 야기하지만 다른 저지 효과는 일으키지 않는다는 것이 밝혀진 바 있다는 것을 언급해야 한다.
3. 비-바이러스 방법에의한 유전자 치료
유전자를 인간 조직으로 전달할 수 있는 수많은 방법들이 알려져있다. 이들중에는 리포펙타민, 유전자 총(gene gun), 전기천공 및 다른 것들이 있다. IRF들은 이러한 방법들에의하여 각각의 종양조직으로 형질감염될 수있다.
4. 내인성인 활성화 또는 유도
환자의 종양 내 또는 항원 표지 세포 내의 IRF-1은 활성화되거나 유도될 수 있다. 사이토카인 및 다른 생물학적 반응 조절제들과 같은 수많은 화합물들로부터 IRF-1의 전사 및 생성을 활성화시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 강력한 유도자 또는 그러한 것들의 조합이 IRF-1을 유도하고 상기 관찰된 항종양성 효과를 유도하는데 이용될 수 있다. 내인성 IRF-1을 활성화시키는 고속 스크리닝(High throughput screening)에 의하여 다른 화합물들도 동일한 방법으로 이용될 수 있다.
| 클론 | IFN 분비(IU／ml) | ||
| -E2 | +E2a | +E2a+ 항-IFN Abb | |
| wt | n.d | n.d | n.d |
| c4 | n.d | 125 | n.d |
| c9 | n.d | 125 | n.d |
| c22 | n.d | 180 | n.d |
n.d: 검출 안됨
a: 1 μM β-에스트라디올
b: 항-IFN-β중성화 500IU
c: Hepa1-6 세포 및 HepaIRF-1hER 세포 클론을 1 μM β-에스트라디올로 5일동안 처리하였다. 축적된 IFN을 재료 및 방법에 기재된 바대로 상층액에서 측정하고 106세포로 평준화 하였다.
| t형질도입된 아데노바이러스 구조물 | IFN 분비(IU／ml) | |
| -E2 | +E2b | |
| mock | ndc | nd |
| Ad-CMVIH | nd | 5000 |
| Ad-CMVIHEG | nd | 5000 |
| Ad-LTR-TBTIHEG | nd | 5000 |
| Ad-LTR-TBTIHEGinv | nd | 2500 |
a: 아데노 바이러스 감염 후 24시간 후의 Hepa1-6세포에 1 μM E2를 24시간동안 처리하였다. 축적된 IFN을 상층액에서 측정하고 106세포로 평준화 하였다.
b: 1 μM β-에스트라디올
c: 검출 안됨
| +Doxa | -Dox | |||
| -E2 | +E2b | -E2 | +E2b | |
| 증식(%) | 100 | 60 | 130 | 65 |
| 소프트 아가 성장d(클론 수) | 0 | 0 | 130 | 0 |
| IFN 분비e(IU／ml) | ndf | 750 | nd | 750 |
a: 2 ㎍／ml 독시사이클린
b: 1 μM β-에스트라디올
c: 세포 성장 측정으로서의 대사 활성은 처리 7일 후에 측정되었다.
d: 소프트 아가에서의 세포의 부착 비의존적 성장. 콜로니 수는 처리 2주 후에 측정하였다.
e: 축적된 IFN을 처리 5일 후에 상층액에서 측정하고 106세포로 평준화 하였다.
f: 검출 안됨.
| 주입된 세포 형a | 종양 부피(mm3) (mean ±SD) | |
| -E2 | +E2b | |
| Hepa1-6(wt) | 1630 ±596 | 1630 ±596 |
| HepaIH | 1317 ±380 | 22.4 ±179 |
| Hepa1-6 (left)+HepaIH(right)c | 1630 ±596 | 179 ±288 |
| 1630 ±596 | ndd |
a: 5×106Hepa1-6 또는 HepaIRF-1hER 세포를 마우스의 옆구리에 피하 주사 하였다.
b: 마우스에 2일마다 1.5 mg의 E2를 복강내 처리하였다.
c: 마우스의 오른쪽 옆구리에 5×106HepaIRF-1hER 세포를 주사하고 왼쪽 옆구리에 5×106의 세포를 주사하였다.
d: 검출 안됨
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상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 융합단백질은 암, 특히 간상피암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (25)
- IRF 패밀리의 일원인 그의 유전자 생성물의 활성이 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위하여 활성화될 수 있는 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드의 용도.
- 제 1항에 있어서, 유전자 생성물로서의 IRF 패밀리의 일원은 야생형 IRF-1, 합성 IRF-1, 면역적으로 활성이 있는 IRF-1 변형들, IRF-1 이외의 IRF 패밀리의 야생형 일원, IRF-1 이외의 IRF 패밀리의 합성형 일원, 면역적으로 활성이 있는 IRF-1 이외의 IRF 패밀리의 야생형 일원의 변형들, 및 그들의 융합 단백질들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도
- 제 1항 및／또는 제 2항에 있어서, 포유류 특히 인간에 대한 치료를 위한 용도.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 구조물은 융합 단백질의 하나의 도메인으로서의 상기 일원 단백질과 융합 단백질의 다른 도메인으로서의외래 단백질을 포함하는 융합단백질로서 IRF 패밀리의 일원을 코딩하며, 상기 융합단백질의 활성은 화학적 또는 물리적 방법에 의하여 켜지거나 꺼질수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 생성물은 IRF-1／hER 융합 단백질의 발현을 코딩하며, 융합 단백질의 활성은 에스트로겐 또는 항 에스트로겐 활성을 가지는 화합물에 의하여 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에 도입되기 위한 생성물로서, 특히 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 제공되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현은 화학적 또는 물리적 방법에 의하여 켜질 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7항에 있어서, 상기 발현은 열 또는 방사선 조사에 의하여 켜질 수 있는것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7항 및／또는 8항에 있어서, 상기 발현은 조절가능한 프로모터를 이용하여 켜질 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 9항에 있어서, 상기 발현은 외부 자극, 특히 테트라사이클린(tetracycline)에 의하여 켜지거나 꺼질 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
- 바이러스, 세균, 곰팡이, 및 기생충 기원 또는 종양 세포 유래의 유전자를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 항원으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 항원과 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항 또는 그 이상의 항에서 정의되는 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신.
- 제 11항에 있어서, 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드 및 항원 코딩 서열들은 분리된 벡터들, 모든 구성요소를 제공하는 벡터 또는 다중시스트로닉 발현 단위로서 제공되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 11항 및／또는 12항에 있어서, 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드 및 항원 코딩 서열들은 바이러스 또는 세균 담체(carrier)로 제공되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한 제조물의 생산을 위한 선행하는 한항 또는 그 이상의 항에 따른 용도.
- 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한, 융합 단백질의 한 구성요소로서의 상기 일원과 다른 구성요소로서의 치료적으로 수용가능한 단백질을 포함하거나 또른 이로 구성되는 IRF 패밀리의 일원 또는 융합 단백질.
- 제 15항에 있어서, IRF-1이 상기 융합단백질의 구성요소의 하나이고 및／또는 hER이 다른 구성요소인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
- 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한, 융합 단백질의 한 구성요소로서의 상기 일원과 다른 구성요소로서의 치료적으로 수용가능한 단백질을 포함하거나 또른 이로 구성되는 IRF 패밀리의 일원 또는 융합 단백질로 구성되거나 또는 포함하는 예방적 및／또는 치료적 조성물.
- 제 17항에 있어서, IRF-1이 융합단백질의 구성요소의 하나이고 및／또는 hER이 구성요소의 다른 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
- IRF 패밀리의 일원의 발현을 위하여 제 1항 내지 10항의 하나 또는 그 이상에서 정의된 유전자 구조물 또는 폴리뉴클레오티드로 생체 외적인 방법으로 장전된(charged) 인간 세포.
- 제 19항에 있어서, 상기 세포는 유전자 전이, 물리적 형질도입, 특히 엘렉트로포래이션, 화학적 형질도입 또는 바이러스 형질도입에 의하여 장전되는 것을 특징으로 하는 인간 세포.
- 제 19 및／또는 제 20항에 있어서, 상기 세포는 자가조직(autologous) 또는 동종이계(allogenic) 세포인 것을 특징으로 하는 인간 세포.
- 제 19 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포, 특히 암 세포, 바람직하게는 간상피암 세포, 육종 세포 또는 조혈(hematopoietic) 시스템으로부터 유래된 종양인 것을 특징으로 하는 인간 세포.
- 제 19 내지 21항의 하나 또는 그 이상에서, 종양, 감염 및／또는 면역 질환에 대한 치료, 억제, 보호적 치료 및／또는 예방적차원의 면역을 위한 인간 세포
- 제 11 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전이된 세포인 것을 특징으로 하는 인간 항원 표지 세포(antigen presenting cell, APC).
- 제 19 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, IRF 패밀리의 일원의 활성화 수준이 인터페론-베타에 의하여 유도되는 IRF-1의 그것보다 더 높은 것을 특징으로 하는 인간 세포.
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