JP2022553192A - 癌ワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、特に、癌の治療に使用するための、少なくともＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質をコードする核酸ワクチンに関する。他の抗癌剤、特に免疫チェックポイント阻害薬との相乗的組み合わせについて記載される。癌ワクチンは、免疫応答を高めるための免疫学的に活性なフラグメント、およびＦＪＸ１などの追加の癌抗原をさらに含み得る。着目すべき特定の併用療法としては、免疫療法、放射線治療、標的療法および化学療法が挙げられる。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸ベース癌ワクチン、その使用、癌、特に口腔癌の治療または予防方法、および関連併用療法に関する。発明者らは、いくつかの癌型に対する核酸ベース癌ワクチンの有用性を実証した。着目すべき特定の併用療法としては、免疫療法、放射線治療、標的療法および化学療法が挙げられる。
本発明は、特に、癌の治療に使用するための、少なくともＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質をコードする核酸ワクチンに関する。他の抗癌剤、特に免疫チェックポイント阻害薬との相乗的組み合わせについて記載される。癌ワクチンは、免疫応答を高めるための免疫学的に活性なフラグメント、およびＦＪＸ１などの追加の癌抗原をさらに含み得る。
本明細書で記載のワクチンによる治療に好適な唯一の癌ではないが、着目すべき特定の癌の１種は、口腔癌および中咽頭癌である。口腔癌および中咽頭癌（一般的に、頭頸部癌；ＨＮＳＣＣと呼ばれる）は一緒のグループに分類される、世界中で６番目に多い癌である（年間の発生率は、口腔癌（ＯＳＣＣ）が２７５，０００症例、中咽頭癌（ＯＰＳＣＣ）が１３０，３００症例と推定されている）。ＵＫでは、ＨＮＳＣＣの発生率が１９７０年代の後期以来劇的に増加し（＋９２％）、７５００症例／年になった；ＵＫのＯＰＳＣＣの発生率の増加は、ヒトパピローマ（ＨＰＶ）感染症に関連しているが、ＯＳＣＣの発生率の増加の原因は明確でなく、発生率は、大きく上昇を続けると推定されている。患者の管理は、多くの場合、手術および／または放射線治療とこれに続く再建術およびリハビリテーションを伴う高価な学際的手法により行われる。治療は、顕著な身体的および精神的病的状態をもたらし、多くの患者にとって、寿命を延長するものになり得ない。手術および放射線治療は、標準的治療のまま残されているが、改善にもかかわらず、顕著な病的状態および比較的変動しない約５０～６０％の５年生存率を伴う。既存の抗腫瘍免疫応答の増強に基づく、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１／ＰＤＬ１に対する免疫チェックポイント阻害薬は、全ての癌型にわたって有効性を示し、ＨＮＳＣＣ患者をα－ＰＤ１で治療する最近のＫＥＹＮＯＴＥ ０１２試験は、１８％の奏効率をもたらした（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３４，３８３８－３８４５（２０１６）．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ１１９，１５３－１５９（２０１８））。しかし、ほとんどの患者は、おそらく、充分に強力な既存の抗腫瘍免疫応答がないために、チェックポイント阻害剤療法に応答しない。ＨＰＶ抗原を標的とするＨＰＶ促進ＨＮＳＣＣの治療に対する実験的手法がいくつかの会社により開発されている。これらには、ペプチドワクチン、ｍＲＮＡおよびＤＮＡワクチンが挙げられる。しかしながら、大部分の口腔癌および中咽頭癌は、ＨＰＶ陰性であり、この患者群における生存率は、ＨＰＶ陽性腫瘍の患者群よりもかなり低い。世界中で、年間、６，０００，０００人のＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ患者が治療を必要としている。この疾患では、従来、ワクチン接種手法が探求されてきたのは極めて少数に過ぎない。
それぞれの腫瘍ミュータノームに基づく患者特異的ワクチンの開発に対する興味深い将来性が存在するが、このような手法の高価であること、および技術的困難性は、たとえ成功しても、ほとんどの患者に利益をもたらす見込みはありそうにない。汎用癌ワクチンの製造のために患者間で共有される共通腫瘍抗原の特定は、安価で幅広く利用可能なＯＳＣＣの治療を提供することになろう。異なる型のＴＡＡの内で、癌／精巣（ＣＴ）抗原は、極めて有望な治療標的であり、ＣＴ抗原に対する細胞性および液性免疫応答は、癌患者で高頻度に観察され、ＣＴ抗原発現と腫瘍免疫浸潤物の細胞溶解活性との間には相関が存在する。ＣＴ抗原の免疫原性および癌特異性は、それらを癌免疫療法のための優先的標的にし、それらの治療作用を種々の臨床設定において試験した。ＣＴ抗原ワクチンは通常、耐容性良好であり、現在、それらの治療効力を評価する多数の癌ワクチン接種試験が進行中である。口腔癌および中咽頭癌などの癌の治療または予防のために効果的に標的化され得る腫瘍抗原を特定することが必要とされている。
本発明者らはまた、本明細書で記載の癌抗原を発現する、または本明細書で記載の癌ワクチンによる治療に好適する可能性のある他の癌型も特定した。このような癌には、頭頸部癌、口腔癌、中咽頭癌、上咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、胆管細胞癌腫、皮膚黒色腫、直腸癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、腎癌および胃腺癌が挙げられる。当業者は、ワクチンの作用機序に基づいて、癌ワクチンが効果的である癌型をさらに認識するであろう。癌抗原が種々の癌型で発現される証拠は、図２９に含まれる。
本明細書で主に関心のある癌抗原は、ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原である。これは、腫瘍細胞または癌関連細胞を含む１種または複数の癌に付随する細胞の表面上で発現し得る。本明細書で関心のある別の癌抗原は、ＦＪＸ１抗原である。これらは、両方とも、同じ癌で発現され、例えば、１種または複数の癌細胞もしくは癌に付随する細胞の表面上で、または腫瘍の癌微小環境中で発現される。従って、ワクチンは、片方または両方の癌抗原を含み得る。
以前に、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはワクチン接種のために、ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と結合して、抗癌免疫応答を誘導できるようにそのタンパク質を切断することにより、ＦＪＸ１タンパク質は小さいペプチドに分解できることが明らかにされた（ＷＯ２０１８／１６９３８５）。これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子の溝が８～１０アミノ酸またはそれより僅かに長いペプチドを許容し得るので、サイズに制限を課すＭＨＣクラスＩ分子に結合できるものに限定される。
しかし、このようなペプチドは、患者が長続きする抗癌応答を誘導するのを支援するのに充分に持続的な免疫応答を活性化しないと考えられている。
ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１は両方とも、自己タンパク質であるので、これらの標的のいずれか１種または複数に対し成功する癌ワクチンの開発に伴う主要な問題は、ワクチン接種を必要とする患者がこれらの抗原に対し既に自己免疫寛容化されていることである。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子のみの標的化は、抗癌応答をもたらすための十分な免疫応答を生じないことが明らかになった。このようなワクチン手法は、臨床的有効性に必要な、効力の高い、バランスのとれた、長続きするＣＤ４プラスＣＤ８ Ｔ細胞発現を誘発しない。これらの抗原が癌ワクチン用の良好な標的として特定されたにもかかわらず、残念なことに、この技術は、現在まで、臨床設定で使用され得るワクチンを産生しなかった。
さらに、小さいペプチドとしてワクチンを提供することにより、ワクチンは、極めて特殊な方式で機能し、集団の特定の部分にワクチンの有用性を限定できる、特定の型のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を標的化する。従って、ペプチド由来のワクチンは、それを必要とする集団の部分を欠いている汎集団ワクチンを提供できず、これは、患者は、それらに好適するかどうかを調べるために試験される必要があることを意味する。
治療癌ワクチンは一般的に、３つの大きなハードル：低免疫原性；既発疾病負荷；および免疫抑制腫瘍微小環境、を克服する必要がある。ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１などの異常発現自己抗原は、このハードルに直面し、これらの自己抗原を認識する高親和性Ｔ細胞は、中枢性および末梢性免疫寛容機序により除去される。従って、ペプチドワクチンは、今のところ、十分に低い親和性のＴ細胞を活性化している。しかし、免疫応答を刺激するために必要な高用量の補助剤は、患者に対し顕著な副作用を有すると思われる。従って、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１を発現している癌患者の腫瘍を除去するのを支援可能にする長期にわたり満たされていないニーズが未だに存在する。
これらの問題は、これらの抗原に対するワクチンは単独では、これらの患者の治療において、それ自体で、効果的でありそうにないという大きなリスクが存在したようなものである。しかし、本発明者らは、意外にも、良好な免疫応答を示し、臨床的有効性に必要なＣＤ４プラスＣＤ８ Ｔ細胞を生じ、さらに、特定の用途ではなく一般的な用途用であり得ることを意味する汎集団効果をもたらすワクチンを開発することが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、本発明のワクチンを使用する場合、癌に付随する細胞を標的化し、それを他の抗癌剤の効果から保護することにより、癌を追加の化学療法剤または免疫療法薬に対し、一般的に、より高い感受性にするいくつかの追加の有益な効果に気付いた。この刺激的な展開は、治療を必要としている患者の治療に大きな利益がある。
さらに、本明細書で記載の癌ワクチンは、追加の抗癌剤と相乗的に作用し得るといういくつかの証拠があり、これは、組み合わせの手法が癌の完全寛解を確実にするために臨床的に推奨されることが多いので、これらの癌型の治療における刺激的展開である。
成功裡に癌ワクチンを得るために、ワクチンは、細胞に入り、インビボで発現される必要があり、それにより主要組織適合性分子（ＭＨＣ）上での抗原提示およびＴ細胞認識を可能にする。細胞傷害性Ｔ細胞（表面マーカーＣＤ８を有する）のヘルパーＴ細胞（表面マーカーＣＤ４を有する）に対する共誘導は、重要である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、いくつかのサブセットを含む。従って、およびＤＮＡワクチンは、それを良好な臨床的候補であると考えることができる前に、多くの要件を満たさなければならい。
本発明者らは、関連モデルを用いて、ここで提示の前臨床データにより、所望の免疫応答が本発明のワクチンを用いて得られることを示した。特に、本発明者らは、ワクチン接種後のＣＤ８＋Ｔ細胞による効果的な腫瘍浸潤を示し、ワクチンの投与により刺激される可能性を有するが、一方で、新しく初回刺激を受けたＴ細胞の形成も誘発する、循環Ｔ細胞がヒト試料中に存在することを示した。データは、良好な発現および核酸ワクチンを遺伝子導入した細胞からのタンパク質の分泌を顕著に示し、これは、免疫監視機構に対し、その関連エピトープを提示するように適切にプロセッシングされる。さらに、マウスが、少なくとも１種のヒト抗原を発現している触知可能腫瘍を有するマウス腫瘍モデルでは、腫瘍サイズの減少に対するワクチンの影響を認めることができる。少なくともＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質に関連する腫瘍は、特に高悪性度であると知られているので、このようなマウスモデルデータは、本発明者らを大いに勇気づける。
従って、本発明のワクチンは、腫瘍周辺の微小環境を変える能力を有することが示され、それを免疫系に「認識可能」にし、Ｔ細胞浸潤を許容し、腫瘍それ自体に対する免疫応答するのみでなく、全く意外にも、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質を同様に発現することが示された癌関連線維芽細胞に対してもさらに免疫応答する。従って、本発明によるワクチンは、免疫系および抗癌剤からこのような癌細胞を保護するように作用する腫瘍周辺の細胞を変える能力を有する。従って、本発明のワクチンは、広範囲に及ぶ癌微小環境の調節のための潜在的重要性を有し、腫瘍を免疫系に曝露し、腫瘍に対する免疫応答を強化し、従って、腫瘍細胞死を大きく支援する。
特に、本発明者らは、本発明のワクチンは、他の組織での発現のパターンが最小限であるので、身体中の正常組織に害を及ぼす可能性は極めて少ないことを見出した。従って、これは、このワクチンを臨床的に意義のあるものにする。従って、本発明は、腫瘍増殖を治療し、それに対し保護を提供する。
本発明の目的は、癌細胞、特に、口腔癌細胞および中咽頭癌細胞に対し適切な免疫応答を提供できる癌ワクチンを提供することである。
本発明は、核酸ワクチンの提供に関する。本明細書のいずれかの部分によるワクチンは、ワクチン組成物として配合し得る。核酸ワクチンは、癌の治療に使用するための癌ワクチンである。種々の代替ワクチンが記載される。本明細書で使用される場合、いずれかのタンパク質は、癌抗原として記載され得る。
癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含み得る。これは、配列番号３または配列番号３１に記載のような完全長タンパク質であってもよいが、これは、短縮または改変でき、それにより、十分な量のタンパク質が核酸により提供され、細胞内でタンパク質がプロセッシングされ、免疫系に提示されることを可能にする。好適な短縮化物は、配列番号３５～配列番号３７に記載されている。従って、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、本明細書に記載の完全長タンパク質の免疫原性フラグメントであり得る。配列ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、さらに改変され、それにより、アミノ酸置換が作製される。このようなバリアント、改変および短縮化は、本明細書でさらに考察される。
既知のＭＡＧＥＤ４Ｂのアイソフォーム（バリアント）は、配列番号４１～配列番号４３に記載されている。
別の定義では、癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質、またはそのバリアントおよび短縮バージョンをコードする核酸を含んでもよく、該核酸配列は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に記載の通りである。バリアントおよび短縮化物は、本明細書で定義の通りである。
任意選択で、組成物はまた、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含み得る。タンパク質は、配列番号４もしくは配列番号３３で記載される完全長タンパク質であってもよく、または短縮化もしくは改変されていてもよい。このようなバリアント、改変および短縮化は、本明細書でさらに考察される。
別の定義では、癌ワクチンは、ＦＪＸ１タンパク質、またはそのバリアントおよび短縮バージョンをコードする核酸を含んでもよく、該核酸配列は、配列番号８、配列番号２０または配列番号２１に記載の通りである。バリアントおよび短縮化物は、本明細書で定義の通りである。
任意選択で、ワクチンが、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸、およびＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含む場合、これらは、別々に、すなわち、別々の核酸として提供されても、または同じ核酸上で同じまたは異なるプロモーターの制御下で提供されても、または２つのタンパク質の融合体として存在してもよい。
本発明は、核酸ワクチンの提供に関する。核酸は、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする。タンパク質は、配列番号４もしくは配列番号３３で記載される完全長タンパク質であってもよく、または短縮化もしくは改変されていてもよい。このようなバリアント、改変および短縮化は、本明細書でさらに考察される。任意選択で、組成物はまた、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸も含み得る。タンパク質は、配列番号３もしくは配列番号３１で記載される完全長タンパク質であってもよく、または短縮化（配列番号３５～配列番号３７に記載のものなど）もしくは改変されていてもよい。このような用語は、本明細書で考察される通りである。
本発明は、核酸ワクチン組成物の提供に関する。組成物は、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸、およびＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含み得る。核酸は、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１タンパク質の両方を融合タンパク質としてコードし得る。組成物は、それを必要としている患者への別々の、同時のまたは逐次の投与のための、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質もしくはそのバリアントまたはＦＪＸ１タンパク質もしくはそのバリアントをそれぞれコードする２つの別々の核酸構築物であってよい。
別の定義では、癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質、またはそのバリアントおよび短縮バージョンをコードする核酸であって、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に記載の通りである核酸、およびこれと一緒に、ＦＪＸ１タンパク質、またはそのバリアントおよび短縮バージョンをコードする核酸であって、配列番号８、配列番号２０または配列番号２１に記載の通りである核酸を含んでもよい。バリアントおよび短縮化物は、本明細書で定義の通りである。核酸は、別々であってもよく、または同じ核酸構築物上に存在してもよい。
融合タンパク質は、それらが単一ユニットとして転写および翻訳されるように連結され、単一のポリペプチドを産生する、別々のコード配列によりコードされる少なくとも２つのドメインからなるタンパク質である。従って、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸、およびＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸は、投与時に、それらは単一ポリペプチドとして産生されるように融合され得る。従って、融合タンパク質をコードする核酸では、融合タンパク質は、１つのプロモーターの制御下で発現される。融合体中の遺伝子の順番は、どちらかの方向、すなわち、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントと、それに続くＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアント、またはその逆であり得る。ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントが、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントに先行することが好ましい場合がある。
本明細書で記載のいずれかの核酸ワクチン組成物が、ヘルパーモチーフをさらに含むことが好ましい場合がある。ヘルパーモチーフは、免疫応答を直接的に刺激する（例えば、ＤＮＡ配列其れ自体で免疫応答を刺激できる）核酸配列、またはモチーフが免疫原性タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列として定義され得る。該ヘルパーモチーフは、核酸ワクチンによりコードされたタンパク質に対する免疫応答を高めるように作用する。好適なヘルパーモチーフは本明細書で考察される。１種のヘルパーモチーフは、ＤＯＭとして知られる破傷風毒素の免疫原性フラグメントである。
従って、癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸をヘルパーモチーフと共に含み得る。ヘルパーモチーフは、本明細書で記載のいずれか好適なヘルパーモチーフであり得る。ヘルパーモチーフは、ＤＯＭであってよい。例示的ワクチンは、配列番号１８または配列番号１９に記載の配列またはそのバリアントもしくは短縮化物を含み得る。例示的ワクチンは、配列番号３２に記載のタンパク質配列またはそのバリアントもしくは短縮化物をコードし得る。
あるいは、癌ワクチンは、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸をヘルパーモチーフと共に含み得る。ヘルパーモチーフは、本明細書で記載のいずれか好適なヘルパーモチーフであり得る。ヘルパーモチーフは、ＤＯＭであってよい。例示的ワクチンは、配列番号２２または配列番号２３に記載の配列またはそのバリアントもしくは短縮化物を含み得る。例示的ワクチンは、配列番号３４に記載のタンパク質配列またはそのバリアントもしくは短縮化物をコードし得る。
さらに、癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸およびＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸をヘルパーモチーフと共に含み得る。ヘルパーモチーフは、本明細書で記載のいずれか好適なヘルパーモチーフであり得る。ヘルパーモチーフは、ＤＯＭであってよい。例示的ワクチンは、配列番号１８または配列番号１９に記載のＭＡＧＥＤ４Ｂ配列またはそのバリアントもしくは短縮化物を含み得る。例示的ワクチンは、配列番号３２に記載のＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質配列またはそのバリアントもしくは短縮化物をコードし得る。例示的ワクチンは、配列番号２２または配列番号２３に記載の配列またはそのバリアントもしくは短縮化物を含み得る。例示的ワクチンは、配列番号３４に記載のタンパク質配列またはそのバリアントもしくは短縮化物をコードし得る。
本明細書で記載の癌ワクチンが融合タンパク質を含む場合、コード配列間にリンカーを使用し得る。この融合体は、癌抗原ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間にあってもよく、または癌抗原とヘルパーモチーフとの間にあってもよい。任意の好適なリンカー配列を使用し得る。例示的リンカー配列は、配列番号５、６、１０および１１で与えられる。
癌抗原をコードする核酸配列は、シグナルまたはリーダー配列を含み得る。このような配列は、遺伝子導入細胞からのタンパク質の分泌を改善し得る。例示的リーダー配列は、配列番号１および２７で与えられる。
本明細書で記載の癌ワクチンの核酸は、コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含み、および任意選択で、コード配列の下流にポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。好適なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは本明細書で記載される。好適なプロモーターは、配列番号９および配列番号１５で記載の配列を含む。
本明細書で記載の癌ワクチンは、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチンであり得る。ワクチンはまた、本明細書で記載の非天然核酸であり得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、プラスミド、ミニサークル、一本鎖サークル、閉鎖型直鎖状ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを含む、任意の適切な核酸構築物として提示され得る。構築物は、コード配列の発現を促進するために、エンハンサーなどの任意の他の構成成分を含み得る。
これらのワクチンのいずれかは、以下でさらに記載される：
本明細書で記載の癌ワクチンは、ワクチン組成物として提供され得る。組成物は、いずれかの適切な賦形剤、または添加物が含まれ、これらは、緩衝液などを含めて正確なｐＨを確保することにより、ワクチン組成物を安定化し、貯蔵および輸送に適するようにする、および／または投与に適するようにするために供給され得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、ヒトを含む動物の癌を治療するために使用され得る。任意選択で、癌ワクチンは、ヒトの癌の治療に使用するためのものである。任意選択で、癌ワクチンは、飼育動物、家畜または野生動物などの非ヒト動物の癌の治療に使用するためのものである。好適な動物には、ネコおよびイヌ、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、および非ヒト霊長類が挙げられ得る。非ヒト霊長類には、チンパンジーおよびサルが挙げられ得る。
また、想定されるのは、ヒトを含む動物の癌を治療する方法であり、該方法は、本明細書で記載の癌ワクチンをそれを必要としている患者に投与することを含む。好適な動物には、ネコおよびイヌ、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、および非ヒト霊長類が挙げられ得る。非ヒト霊長類には、チンパンジーおよびサルが挙げられ得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、医薬に使用するためのもの、任意選択で、癌の治療または予防に使用するためのものであり得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、免疫系に対する腫瘍の曝露に使用するためのものであり得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、抗癌剤、任意選択で、チェックポイント阻害剤などの免疫療法に対して感作させるのに使用するためのものであり得る
本明細書で記載の癌ワクチンは、抗癌剤、任意選択で、チェックポイント阻害剤などの免疫療法、または化学療法と組み合わせて使用するためのものであり得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞による浸潤に対し腫瘍に感作させる方法のためのものであり得、該方法は、ヒトまたは動物対象に対して癌ワクチンを投与することを含む。
本明細書で記載の治療方法は、抗癌剤、任意選択で、チェックポイント阻害剤などの免疫療法の使用をさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ－４の作用を遮断できる薬剤であり、任意選択で、該薬剤は抗体またはアプタマーである。
本明細書で記載の癌ワクチンは、チェックポイント阻害の有効性を高める方法において、それを必要としている患者に対し使用され得、該方法は、本明細書で記載の癌ワクチンをヒトまたは動物対象に投与することを含む。
本明細書で記載の癌ワクチンは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を共誘発するために使用され得る。
本明細書で記載の癌ワクチン、使用および治療方法は、限定されないが、頭頸部癌、口腔癌、中咽頭癌、上咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、胆管細胞癌腫、皮膚黒色腫、直腸癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、腎癌および胃腺癌を含む多数の癌型の治療での使用に効果的であり得る。
本発明の第１の態様では、タンパク質ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１、またはそのバリアントをコードし、および破傷風毒素の免疫原性フラグメントをさらにコードする核酸を含む癌ワクチンが提供される。
好都合にも、２種の癌精巣抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１は、ＯＳＣＣで高頻度に発現されることが明らかになった。全体として、２種の抗原は、ＯＳＣＣ症例の９６％においてＲＮＡレベルで発現されている。さらに、本研究は、口腔異形成およびＯＳＣＣ症例における両抗原のタンパク質レベルでの発現を確証し（１０／１０が陽性であった；各状態５症例）、非悪性口腔粘膜中では発現はなかった。健康な組織中のタンパク質レベルでの発現の試験は、低発現を示した。これらの発現データは、ＨＬＡ－Ａ２四量体（現時点でＭＡＧＥＤ４Ｂに対してのみ利用可能である）および各抗原の全アミノ酸配列に対するオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）を用いたＨＰＶ非関連ＨＮＳＣＣの患者における抗原に対する既存の免疫の調査と類似であった。これらは、増殖させた腫瘍浸潤リンパ球を用いて血液および腫瘍の両方で測定された。循環ＭＡＧＥＤ４Ｂ四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、同様に類似の頻度で四量体陽性である２／２増殖ＴＩＬを有する５／７ ＨＬＡ－Ａ２患者（総ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．０４～０．１％）で観察した。より高レベルのＭＡＧＥＤ４Ｂ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞（５～１０倍）をＨＬＡ－Ａ２陰性ＨＬＡ－Ａ１陽性ＴＩＬ試料中でＯＰＰを用いて検出し、ＨＬＡ－Ａ２制約を超える反応性を示した。ＦＪＸ１に対して、ＣＤ８ Ｔ細胞の反応性を増殖ＴＩＬ試料でＯＰＰを用いて評価し、ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＣＤ８ Ｔ細胞と共存するＨＬＡ－Ａ１患者中のＣＤ８の反応性を示した。患者のデータは、両抗原の強い免疫原性を示し、ＭＡＧＥＤ４Ｂの場合で極めて顕著であった。完全長ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１抗原をコードするＤＮＡワクチン（例えば、本明細書で記載のｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４ＢＦＬおよびｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１ＦＬ）が開発され、前臨床データは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１標的化ＤＮＡワクチンがこれらの抗原を発現している腫瘍の増殖を抑制する大きな潜在能力を有することを示している。
さらに好都合にも、破傷風菌の破傷風毒素の免疫原性フラグメントの提供は、樹状細胞の活性化を介して、腫瘍特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導に必要な強力なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答の誘導を支援できる（所謂、結合Ｔ細胞機序（ｌｉｎｋｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ））。このようなＣＤ４およびＣＤ８エピトープは、広範なマウスおよびヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることが知られている。
本明細書で記載の癌ワクチンは、抗原特異的Ｔ細胞応答、特に、永続的応答に重要なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導でき、それにより、抗原を発現している腫瘍に対する免疫応答を誘発する。本明細書で記載の癌ワクチンは、追加でまたは代わりに、腫瘍微小環境に影響を及ぼすことができ、腫瘍の免疫可視性を高め、ＣＤ８ Ｔ細胞の腫瘍塊中への浸潤を促進し、それにより、単独でまたは前述の抗癌剤と組み合わせて、抗癌剤に対し、腫瘍細胞をより攻撃を受けやすくする。ワクチンは、腫瘍の微小環境を効果的に変更し、腫瘍に免疫攻撃をより受けやすくする。
腫瘍内Ｔ細胞の欠乏は、免疫チェックポイント阻害薬および他の免疫療法の癌患者における有効性に対する大きな障壁であり；これは、不十分な腫瘍免疫原性（すなわち、Ｔ細胞の欠乏）に、またはＴ細胞が腫瘍に浸潤できない（すなわち、Ｔ細胞が間違った場所にある）ことに起因し得る。発明者らは、本明細書で記載の癌ワクチンは腫瘍内Ｔ細胞を増大させることを明確に示した（図１０ＢおよびＣ）。従って、本発明は、免疫チェックポイント阻害の有効性を高めることを必要としている患者において、それを実施する方法にまで及び、該方法は、本明細書で記載の癌ワクチンをヒトまたは動物対象に投与することを含む。本明細書で記載の癌ワクチンは、腫瘍を免疫系または抗癌剤に感作させるのに使用するためのものであり得る。ここで、本明細書で記載の癌ワクチンがチェックポイント阻害を生じさせることができる薬剤と共に使用される場合、極めて重要な相乗的効果が発生することを示すデータが提示される（図９Ｂ）。
本明細書で記載のワクチンは、誘導または誘発された免疫応答を生成し、これは、細胞性免疫応答であり得る。誘導または誘発された免疫応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、および／または細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ１０７ａ／ｂの誘導または分泌を含み得る（図２１および２２）。
特に、癌ワクチン中の抗原がＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質抗原である場合、癌ワクチンは、さらに、発明者らによりこの抗原を発現することが示された癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）に対する抗原特異的応答を誘導できる（図２７および２８）。ヒト腫瘍は、癌細胞は別にして、多くの異なる細胞型を含み、これには、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、内皮細胞、免疫細胞、脂肪細胞、および周皮細胞が含まれ、これらは、微小環境を形成し、癌進行を促進する。従って、腫瘍微小環境中のこのような細胞を標的化する能力は、一般的に癌の治療に特に有用であり、其れ自体でＭＡＧＥＤ４Ｂを発現する癌サブタイプに限定されない可能性がある。
全てのタイプの固形癌（腫瘍）は、ＣＡＦリッチサブグループを含み、これは、膵臓癌中の９５％から、頭頸部癌中の約５０％までの範囲である。腫瘍中のＣＡＦの比率は、腫瘍の約２５～５０％であり、ほとんどの腫瘍がＣＡＦリッチである膵臓癌などのいくつかの癌ではより高い場合がある。特に、癌中のＣＡＦ蓄積は、不十分な臨床転帰に関連し、ＣＡＦリッチ腫瘍は臨床的に高悪性度であり、治療に対し不十分に応答し、芳しくない生存率と関連している。これは、ＣＡＦが多くの「悪性腫瘍の特徴」を促進し、腫瘍増殖、浸潤、転移および血管新生を促進するためである。複数の癌型における一貫した知見は、ＣＡＦとＣＤ８ Ｔ細胞との間の逆相関であり、これは、腫瘍免疫回避におけるＣＡＦの果たす役割を示唆する。出願者らによるものを含む最近の研究は、ＣＡＦが腫瘍からＣＤ８ Ｔ細胞を排除し、それにより、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１チェックポイント免疫療法（およびワクチンベース免疫療法；Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８０，１８４６－１８６０（２０２０））に対する抵抗性を促進することを示した。いくつかの臨床試験は、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１に応答しない患者中でＣＡＦ遺伝子シグネチャーを特定した（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５４，５４４－５４８（２０１８））。ＣＡＦ媒介ＣＤ８ Ｔ細胞排除は、現在では、チェックポイント免疫療法抵抗性に対する主要な寄与因子として認識されており、ＣＡＦは、チェックポイント免疫療法応答率（現在、癌型全体で約２０％である）を改善するための重要な免疫療法標的になっている。ＣＡＦ標的化に対し示唆された治療の可能性には、ＣＡＦ枯渇、ＣＡＦ機能またはＣＡＦ正規化の阻害が含まれるが、しかし、ＣＡＦを特異的に標的化する以前の試みは、不成功であった。
発明者らがＣＡＦは一貫してＭＡＧＥＤ４Ｂを発現するように見えることを示したという事実は、非常に驚くべきことである。発現は、ＣＡＦ集団全体にわたり均一に高く、腫瘍間で一致しており、分析したＨＮＳＣＣの７０％がＭＡＧＥＤ４Ｂ陽性ＣＡＦを含んでいた。このＣＡＦのＭＡＧＥＤ４Ｂ発現は、ｓｃＲＮＡＳｅｑ ＨＮＳＣＣトランスクリプトームデータ（図２８）（Ｐｕｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１７；１７１（７）：１６１１－１６２４、これは、ＨＮＳＣＣ細胞によるＭＡＧＥＤ４Ｂ発現も確認した）を分析することにより確認された。
ＣＡＦを特異的に標的化する免疫応答の生成は、極めて魅力的な治療法であり、ワクチン接種、例えば、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）に対するワクチン接種によりＣＡＦを標的化する試みが以前に行われたことがある。しかし、ＦＡＰは、現在では、他の細胞型（多能性骨髄間質細胞など）により発現されることが既知であり、ＣＡＦ特異的ではない。ＣＡＦ特異的抗原はまだ特定されていないが、その１つを本発明の癌ワクチンが供給し得、この場合、癌ワクチンが供給する抗原は、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントである。
本発明は、他の抗癌剤、特に、標的療法、免疫療法および化学療法に対する応答性の回復、特に、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤などによるチェックポイント阻害、ａＣＤ４０、ａＣＤ２７、ＯＸ４０などのＴ細胞アゴニスト、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞およびワクチンを含むＴ細胞ベース免疫療法に対する応答性の回復に有用なワクチンおよび方法に関する。
Ｔ細胞媒介腫瘍の除去は、Ｔ細胞受容体からのシグナルおよび腫瘍－抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能を可能にする共刺激分子を必要とする。また、抗腫瘍免疫を抑制できる腫瘍微小環境内の多様な免疫抑制機序も存在する。この抑制を克服するためのモノクローナル抗体、特に、アゴニストＡｂと共に腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーの標的化共刺激メンバーの使用は、Ｔ細胞機能を高め、有望な治療結果に繋がった。ＴＮＦＲは、腫瘍特異的免疫応答を高めるための重要な標的であり得、特定のＴＮＦＲは、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、およびＣＤ４０を含む。
本明細書で記載の癌ワクチンは、単独でまたは化学療法、放射線治療、免疫療法、レーザー療法、標的療法および／または手術などの補助癌療法（これらの全ては、本明細書では抗癌剤として記載される）と組み合わせて、治療有効投与量で、投与できる。記載された癌ワクチンは、有益な効果、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍増殖の速度の遅延化、転移の抑制もしくは遅延化、免疫応答もしくは抗癌治療に対する腫瘍の感作化、あるいは、必ずしも腫瘍を根絶することなく、全体臨床的状態の改善をもたらし得る。
併用療法に対し、特に意図されるのは、腫瘍細胞を標的にする細胞増殖抑制性および細胞傷害薬、血管新生を標的にする薬剤（血管新生阻害剤レンバチニブおよびソラフェニブなど）、癌細胞が特異的に発現するマーカーを標的にする薬剤（すなわち、ＨＥＲ２陽性細胞を標的にするハーセプチン）、マクロファージを標的にする免疫療法剤、Ｔ細胞チェックポイントまたはアゴニスト経路を標的にする免疫療法剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を用いる養子免疫細胞療法（ＡＣＴ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはインビトロ増殖Ｔ細胞およびワクチンである。
本明細書で記載の組み合わせは、免疫チェックポイント阻害薬、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球結合タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１に対して活性な薬剤をさらに含み得る。理由は、これらが、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／または分化、およびサイトカイン、ケモカインまたは免疫細胞増殖および／または分化のためのシグナル伝達などの免疫系の要素の抑制を防ぎ得るためである。
従って、本明細書で記載の癌ワクチンは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対する抗体などのチェックポイント阻害剤と組み合わせて、細胞性および液性免疫応答の両方の刺激を高め得るが、任意の好適な阻害剤を使用し得る。
従って、本明細書で記載の癌ワクチンは、腫瘍細胞を標的にする細胞増殖抑制性および細胞傷害薬、血管新生を標的にする薬剤、マクロファージを標的にする免疫療法剤、Ｔ細胞チェックポイントまたはアゴニスト経路を標的にする免疫療法剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を用いる養子免疫細胞療法（ＡＣＴ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはインビトロ増殖Ｔ細胞、Ｔ細胞アゴニストおよびワクチンと組み合わせ得る。
ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原
ＭＡＧＥＤ４Ｂは、ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原コード遺伝子）と呼ばれるスーパーファミリーの一部である。ＭＡＧＥタンパク質は、ＭＡＧＥ相同ドメイン（ＭＨＤ）として知られる保存されたドメインを共有する。
癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含み得る。これは、配列番号３または配列番号３１に記載のような完全長タンパク質であってもよいが、これは、短縮または改変でき、それにより、十分な量のタンパク質が核酸により提供され、細胞内でタンパク質がプロセッシングされ、免疫系に提示されることを可能にする。好適な短縮化物は、配列番号３５～配列番号３７に記載されている。従って、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、本明細書に記載の完全長タンパク質の免疫原性フラグメントであり得る。配列ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、さらに改変され、それにより、アミノ酸置換が作製される。このようなバリアント、改変および短縮化物は、本明細書でさらに考察される。
別の定義では、癌ワクチンは、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質、またはそのバリアントおよび短縮バージョンをコードする核酸を含んでもよく、該核酸配列は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６に記載の通りである。バリアントおよび短縮化物は、本明細書で定義の通りである。
ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、完全長ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質配列を含むか、またはそれからなり得る。ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、配列番号３もしくは配列番号３１の配列、またはそのバリアントを含むか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５もしくは配列番号２６の配列またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる核酸によりコードされ得る。
好都合にも、完全長抗原設計は、より広範な集団のカバー率を達成でき、この場合、それは、例えば、ＨＬＡ－Ａ２アレルなどのそれぞれのＨＬＡアレルを標的化することに焦点を置いていない。
好都合にも、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質は短縮されていてもよい。短縮化は、ＭＡＧＥ相同ドメインの全てまたは一部または部分を除去する必要があり得る。２つの相同の潜在的領域がＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質で見出されており、それらは、ＭＡＧＥタンパク質全体にわたり共通であるので、両方が短縮化可能な領域である。２つの相同ドメインは、アイソフォーム１のアミノ酸４１２～５００およびアミノ酸５１０～６８２で特定され、これは配列番号３で表される。この配列は、７４１アミノ酸長さである。両方の相同ドメインが除去される場合、これは、ＭＡＧＥＤ４Ｂの長さを２６０アミノ酸だけ縮小するはずであるが、それでも、その機能性免疫学的フラグメントを提供する。従って、完全長タンパク質の最大４０％、任意選択で、最大５０％を除去でき、残りの配列は、その場合でも、充分に免疫原性があり、ワクチンとしての役割を果たし得る。可能な短縮化物は、図１６に示される。ＨＬＡ－２定義エピトープＲＬＳＬＬＬＶＬなどのＭＨＤ由来の既知のエピトープが保持されるのが好ましい場合がある。これは、２つのＭＨＤの間に位置する。示したように、ワクチン中のそれぞれのＭＨＤがうまく除去されたが、どの部分が除去されてもよい。従って、短縮化バージョンのＭＡＧＥＤ４Ｂは、ＭＨＤの一部または全部が除去された免疫学的フラグメントを含み得る。実際に、ＭＨＤの除去では、さらなる残基も短縮され得る。最小限でも、配列番号３で記載のＭＡＧＥＤ４Ｂ配列の４５０個のアミノ酸が含まれる。免疫原性フラグメントは、少なくとも４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０または７００アミノ酸長さまたはその間の任意の長さである。種々の短縮化物は、配列番号３５～配列番号３７に詳細に記載されている。他の短縮化物も可能である。発明者らは、ＭＨＤの除去は、免疫系がＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的エピトープをより明確に認識可能にし得ることを想定している。
ここでの研究は、ＭＡＧＥＤ４Ｂアイソフォーム１（配列番号３）をベースにしている。しかし、４種のアイソフォームが存在し、配列番号４１～４３に含まれる。これらの内で、アイソフォーム３（配列番号４２）は、極めて希な選択的スプライシングであり、位置３４９にフレームシフトを有し、位置４１４で末端になる。配列番号４２は、これらの選択的スプライシング、従って短縮化に起因して、配列番号３と８５％同一の配列を有する。従って、別の定義では、短縮化物は、配列番号３で示される配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し得る。
本明細書で記載の癌ワクチンは、配列番号４１～４３で記載のＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含み得る。これらは、配列番号３のバリアントである。
ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、ＭＡＧＥＤ４Ｂの改変および／または短縮化バリアントを含み得る。特に、当業者は、配列のいくつかの改変またはバリアントが、非改変配列（すなわち、本明細書で記載のＭＡＧＥＤ４Ｂ配列）と同じまたは実質的に類似の免疫原性機能をもたらす場合があることを理解するであろう。改変は、アミノ酸残基付加、置換、または欠失を含み得る。一実施形態では、改変は、２０個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１５個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１０個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、８個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、６個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、５個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、４個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、３個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、２個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。アミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、連続アミノ酸残基、複数のグループのアミノ酸残基、または非連続アミノ酸残基、またはこれらの組み合わせを含み得る。
ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３と少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
核酸変化／改変は、配列番号７によりコードされるものと同じＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質、またはその一部をコードするために、コドン冗長性を用いたヌクレオチドの保存的置換を含み得る。
また含まれるのは、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６で開示される核酸またはそのバリアントである。バリアントは、これらの配列のいずれかの１つで示される配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し得る。これらのバリアントは、従って、タンパク質の上記短縮化物をカバーする。
癌ワクチンの核酸は、配列番号１７に記載の配列などのように、コドン最適化され得る。コドン最適化配列は、同じペプチド配列をコードし得るが、ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドンによりコードされるという理由で、これが可能である。これは、核酸の合成を助けるために、またはホストゲノムとの完全な相同性を防ぐために、実施される。データで示されるように、コドン最適化ワクチンは、良好に機能した。コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化できる。
ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする核酸のバリアントは、配列番号７と少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
配列同一性は、少なくとも６００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を超え得る。あるいは、配列同一性は、少なくとも７００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を超え得る。あるいは、配列同一性は、全ＭＡＧＥＤ４Ｂ配列を超え得る。
配列同一性は、少なくとも４００個の連続アミノ酸、少なくとも４５０個の連続アミノ酸、少なくとも５００個の連続アミノ酸、または少なくとも５５０個の連続アミノ酸を超え得る。
別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４Ｂのバリアントは、配列番号３の短縮化配列を含み得るか、またはそれからなり得る。例えば、本明細書の配列番号３の配列は短縮化され得、それでも免疫原性を提供する。短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも２００個のアミノ酸を含み得る。短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも３００個のアミノ酸を含み得る。短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも４００個のアミノ酸を含み得る。短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも５００個のアミノ酸を含み得る。あるいは、短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも６００個のアミノ酸を含み得る。あるいは、短縮化配列は、配列番号３の配列の少なくとも７００個のアミノ酸を含み得る。好適な短縮化物は、図１６に示される。
ＦＪＸ１抗原
癌ワクチンは、ＦＪＸ１（４関節ボックスタンパク質１（Ｆｏｕｒ－ｊｏｉｎｔｅｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １））タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含み得るか、または追加で含み得る。タンパク質は、配列番号４もしくは配列番号３３で記載される完全長タンパク質であってもよく、または短縮化もしくは改変されていてもよい。このようなバリアント、改変および短縮化物は、本明細書でさらに考察される。
別の定義では、癌ワクチンは、ＦＪＸ１タンパク質をコードする核酸を含んでよく、または追加で含んでよく、該核酸配列は、配列番号８、配列番号２０または配列番号２１に記載の通りであるか、またはそのバリアントおよび短縮化バージョンである。バリアントおよび短縮化物は、本明細書で定義の通りである。
ＦＪＸ１タンパク質は、完全長ＦＪＸ１タンパク質配列を含むか、またはそれからなり得る。ＦＪＸ１タンパク質は、配列番号４の配列、またはそのバリアントを含むか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＦＪＸ１タンパク質は、配列番号８の配列、またはそのバリアントを含むか、またはそれからなる核酸によりコードされ得る。
前に考察したように、完全長抗原設計は、より広範な集団のカバー率を達成でき、この場合、それは、例えば、ＨＬＡ－Ａ２アレルなどのそれぞれのＨＬＡアレルを標的化することに焦点を置いていない。
ＦＪＸ１のバリアントは、ＦＪＸ１の改変および／または短縮化バリアントを含み得る。特に、当業者は、配列のいくつかの改変またはバリアントが、非改変配列（すなわち、本明細書で記載のＦＪＸ１配列）と同じまたは実質的に類似の免疫原性機能をもたらす場合があることを理解するであろう。改変は、アミノ酸残基付加、置換、または欠失を含み得る。一実施形態では、改変は、２０個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１５個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１０個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、８個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、６個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、５個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、４個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、３個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、２個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。別の実施形態では、改変は、１個以下のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含み得るか、またはそれらからなり得る。アミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、連続アミノ酸残基、複数のグループのアミノ酸残基、または非連続アミノ酸残基、またはこれらの組み合わせを含み得る。
ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４または配列番号３３と少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
核酸変化／改変は、配列番号８または配列番号２０または配列番号２１によりコードされるものと同じＦＪＸ１タンパク質、またはその一部をコードするために、コドン冗長性を用いたヌクレオチドの保存的置換を含み得る。
癌ワクチンの核酸は、配列番号２１に記載の配列などのように、コドン最適化され得る。コドン最適化配列は、同じペプチド配列をコードし得るが、ほとんどのアミノ酸が２つ以上のコドンによりコードされるという理由で、これが可能である。これは、核酸の合成を助けるために、またはホストゲノムとの完全な相同性を防ぐために、実施される。
ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。 あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも９８％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＦＪＸ１をコードする核酸のバリアントは、配列番号８と少なくとも９９．５％の同一性を有する配列を含み得るか、またはそれからなり得る。このパラグラフ中の配列番号８は、配列番号２０または配列番号２１で置換できる。
配列同一性は、少なくとも３００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を超え得る。あるいは、配列同一性は、少なくとも４００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を超え得る。あるいは、配列同一性は、全ＦＪＸ１配列を超え得る。
別の実施形態では、ＦＪＸ１のバリアントは、配列番号４の短縮化配列を含み得るか、またはそれからなり得る。例えば、本明細書の配列番号４の配列は短縮化され得、それでも免疫原性を提供する。短縮化配列は、配列番号４の配列の少なくとも２００個のアミノ酸を含み得る。短縮化配列は、配列番号４の配列の少なくとも３００個のアミノ酸を含み得る。短縮化配列は、配列番号４の配列の少なくとも４００個のアミノ酸を含み得る。従って、本明細書で開示されるいずれかの配列によるＦＪＸ１の免疫原性フラグメントも包含される。
ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１の併用
一実施形態では、核酸は、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方、またはそれらのバリアントをコードする。一実施形態では、核酸は、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方、またはそれらのバリアント、およびそれらの間のリンカーをコードする。
ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１抗原は、単一融合タンパク質としてコードされ得る、または別々の発現のためにコードされ得る。ＭＡＧＥＤ４Ｂは、ＦＪＸ１に対しＮ末端にコードされ得る。
組み合わせは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ－２Ａペプチド－ＦＪＸ１などの単一転写単位にまで及び得る。２Ａ自己切断ペプチド、または２Ａペプチドは、１８～２２アミノ酸長さのペプチドの部類であり、これは、細胞中でタンパク質の翻訳の間にリボソームスキップを引き起こすことができる。これらのペプチドは、ＤｘＥｘＮＰＧＰのコア部配列モチーフを共有し、広範囲のウィルスファミリーで認められる。それらは、ペプチド結合形成で失敗させることにより、ポリタンパク質の生成を支援する。
ヘルパーモチーフ
本明細書で記載の癌ワクチンは、ヘルパーモチーフを提供する核酸を有し得る。本明細書で使用されるヘルパーモチーフは、癌ワクチンの免疫原性を高める、または改善するモチーフである。これは、アジュバント、ヘルパーエピトープ、免疫原性フラグメント、サイトカインとして定義され得る。
細胞質ゾル核酸認識時の炎症性シグナルは、主要炎症促進性の経路の活性化を介して、それ自体免疫原性を高め得るが、これは、核酸ワクチンがＣｐＧモチーフなどの配列モチーフであるヘルパーモチーフを含む場合、さらに刺激され得る。非メチル化ＣｐＧモチーフは、トール様受容体（ＴＬＲ）９経由の自然免疫系の刺激を介して其れ自体免疫刺激効果を有し得る。
従って、ヘルパーモチーフは、発現の必要なく免疫系を刺激することが既知の核酸モチーフであり得る。
ヘルパーモチーフは、タンパク質もしくはポリペプチド、または免疫系を刺激するその免疫原性フラグメントをコードし得る。従って、ヘルパーモチーフは、細胞中で発現される。ヘルパーモチーフは、癌ワクチン抗原と同じ構築物中に存在し得るか、または別々の構築物として提供され得る。好都合にも、両方は、同じ核酸構築物上に一緒に提供され得る。両方が一緒に提供される場合、それらは、同じまたは異なるプロモーターの制御下にあってよい。好都合にも、これらは、転写性または翻訳性融合体として提供され得る。転写性融合体は、コード配列が結合されるのを可能とするが、ハイブリッドまたは融合タンパク質を産生しない。翻訳性融合体も提供され得、この場合、発現の産物は、ハイブリッドタンパク質である。これは、ワクチン接種に好ましい可能性がある。本明細書で記載のリンカー分子は、癌抗原とヘルパーモチーフを遺伝子融合、およびポリペプチド融合により一緒に結合するために使用され得る。
例えば、サイトカインまたはケモカインをコードする核酸配列はまた、核酸ワクチンと共にその構築物または別々の構築物に直接送達できる。これは、サイトカインまたはケモカインが癌ワクチンと同時に、および同じ領域に出現することを可能にする。好適な核酸は、インターロイキン（ＩＬ）－１０、ＩＬ－１２、樹状細胞標的化ケモカインＭＩＰ３α、もしくはＩＦＮγ、または以降でさらに考察するもの、などのサイトカインまたはケモカインをコードする。従って、ヘルパーモチーフは、サイトカインをコードする核酸であってもよい。
さらに、核酸配列は、免疫系刺激剤をコードし得、これも、ワクチンと共に直接送達できる。これは、トラフィッキングシグナル（例えば、ＭＨＣクラスＩトラフィッキングシグナル（ＭＩＴＤ））などを含む配列を含み得る。
あるいは、ヘルパーモチーフは、粒子の形成によるなどの他の手段で免疫刺激を提供し得る。ＰＶＸＣＰは、ジャガイモウィルスＸコートタンパク質をコードし、これは、同様にＤＯＭに役立つ結合Ｔ細胞機序により免疫刺激を提供し、発現したポリペプチドの免疫原性を高める粒子の形成を可能にする。
さらなる例として、ヘルパーモチーフは、強力な免疫応答を誘導することが知られているタンパク質、ポリペプチド、またはその免疫原性フラグメントをコードし得る。本明細書で詳述のように、これは、破傷風毒素、特に、ＤＯＭの免疫原性フラグメントを含む。他の好適なヘルパーエピトープは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ熱不安定性毒素のＢサブユニット、破傷風毒素のフラグメントＣ、ジフテリア毒素Ｂサブユニット、Ｅ．ｃｏｌｉ不安定毒素フラグメント、コレラ毒素フラグメント、ＯＶＡペプチドおよび／またはカルレティキュリン、ＨＩＶタンパク質ＮＥＦ（負の調節因子）、ＨＢＶ表面抗原、プロミスキャスＣＤ４エピトープＰＡＤＲＥから誘導され得る。
ＣｐＧモチーフ、ＭＩＴＤ、ＰＶＸＣＰおよびＭＩＰ３αなどの種々のヘルパーモチーフが癌ワクチンと組み合わせて使用される例が本明細書で提示される。
好適なヘルパーモチーフは、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｆｌｔ３Ｌ－Ｆｃ融合体、ＣＤ８０、ＣＤ８０－Ｆｃ融合体、ＯＸ４０Ｌ、ＩＬ－１５、４－１ＢＢＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ２１ａ、ＩＬ－２３、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、ＣＣＬ３、ＬＡＧ３、ＩＬ－１５ＲＡ、ＣＸＣＬ１０、ＣｐＧ、Ｅ．ｃｏｌｉ不安定毒素フラグメント、コレラ毒素フラグメント、カルレティキュリン、ＨＩＶ ＮＥＦ、ＨＢＶ ｓＡｇ、ＰＡＤＲＥ、ＩＲＦ１、ＣＣＬ２５、ＩＬ－３３および／またはＩＬ－２８Ｂをコードする核酸配列を含む。
ヘルパーモチーフが本明細書に記載の破傷風毒素の免疫原性フラグメントである場合に、特定の結果が得られた。
破傷風毒素ＤＯＭの免疫原性フラグメント
破傷風毒素の免疫原性フラグメントは、完全長破傷風毒素の毒性機能を有し得ない。一実施形態では、破傷風毒素の免疫原性フラグメントは、ニューロン結合ドメインを含み得ない、または機能性結合ドメインを含み得ない。一実施形態では、破傷風毒素の免疫原性フラグメントは、破傷風毒素のｐ３０ ＭＨＣ ＩＩエピトープを含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、破傷風毒素の免疫原性フラグメントは、ＤＯＭを含むか、またはＤＯＭからなる。ＤＯＭは、配列番号２の配列、またはそのバリアントを含み得るか、またはそれからなり得る。
ＤＯＭは、破傷風菌（１）の破傷風毒素の免疫原性フラグメントであり、これは、痙性麻痺の原因であるニューロン結合ドメインを含まないので、ヒト使用では安全である。好都合にも、ＤＯＭは、「プロミスキャス」ｐ３０ ＭＨＣ ＩＩエピトープおよび場合によっては、他のＣＤ４ Ｔ細胞エピトープを含む。ｐ３０は、一連のマウスおよびヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に結合でき、樹状細胞の活性化を介して、腫瘍特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導に必要な強力なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘導できる（所謂、結合Ｔ細胞機序（ｌｉｎｋｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ））（２、３）。さらに好都合にも、ＤＯＭは、免疫優性のプロセスにより癌エピトープと競合できないいくつかの弱いＣＤ８エピトープを有し、これは、癌抗原に対する強力なＴ細胞応答の誘導のために意図される本発明によるＤＮＡワクチン中への包含のために、さらなる利点を提供する。
一実施形態では、本明細書でＤＯＭへの言及は、別の選択肢では、別の破傷風毒素の免疫原性フラグメントによる置き換えであってもよい。特に、本明細書でＤＯＭへの言及は、破傷風毒素のｐ３０またはｐ２エピトープ、または他の破傷風毒素ＣＤ４ヘルパーエピトープの単独もしくは組み合わせによる置き換えであってもよい。
ＤＯＭは、本明細書で記載のいずれかの癌ワクチンと共にヘルパーモチーフとして存在してもよい。それは、強力な免疫応答の誘導に役立ち得るエピトープを含むので、ヘルパーエピトープとして記載されてもよい。ここで示すデータは、これを裏付ける（図１１Ａ）。
ＤＮＡワクチンの種々のアセンブリを図７に示す。
ＤＯＭ、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の併用
一実施形態では、核酸は、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１、またはそれらのバリアントと共にＤＯＭをコードする。別の実施形態では、核酸は、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１、またはそれらのバリアントと共にＤＯＭをコードする。
一実施形態では、ＤＯＭ、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１は、単一融合タンパク質としてコードされる。別の実施形態では、ＤＯＭおよびＭＡＧＥＤ４ＢまたはＦＪＸ１の１つは、単一融合タンパク質としてコードされる。
ＤＯＭは、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１に対しＮ末端にコードされ得る。
ＤＮＡワクチンの種々のアセンブリを図７に示す。ＭＡＧＥＤ４Ｂ－２Ａペプチド－ＦＪＸ１などの単一転写単位を含む任意の好適なアセンブリが用いられ得る。
他の要素
次のセクションは、単一抗原または両方の抗原を含む、いずれの癌ワクチンが使用される場合であっても、該当する。
一実施形態では、リンカー残基は、ＤＯＭ、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の抗原の１種または複数、または全ての間に提供され得る。リンカー残基は、ランダムアミノ酸配列、または動物モデルでのエピトープ予測コンピュータープログラムまたは実験に基づいて、非免疫原性となるように選択されたアミノ酸を含み得る。例えば、リンカーは、それがエピトープであることが予測されない、またはエピトープであることが既知でない場合（すなわち、エピトープ、例えば、人工エピトープ、天然で認められないエピトープ、に対する免疫応答を回避するために）、検討されない場合がある。リンカーは柔軟であり得る。リンカーは、Ｋ、Ｇ、ＰまたはＳアミノ酸残基、またはこれらの組み合わせを含み得るか、またはこれらからなり得る。一実施形態では、リンカーは、Ｐおよび／またはＰアミノ酸残基を含み得るか、またはこれらからなり得る。リンカー残基は、１～１０アミノ酸長さであり得る。別の実施形態では、リンカー残基は、２～８アミノ酸長さであり得る。別の実施形態では、リンカー残基は、１～７アミノ酸長さであり得る。
ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１融合タンパク質は、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１配列との間にリンカーを含み得る。ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約１～約１０個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約１～約６個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約１～約５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約２～約６個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約２～約５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約３～約５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約４～約６個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、約５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。
ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＡから選択される３～５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、Ｇおよび／またはＳ残基を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、交互するＧおよび／またはＳ残基を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢとＦＪＸ１との間のリンカーは、ＧＳＧＳＧ（配列番号６／リンカー２）を含み得るか、またはそれからなり得る。別のリンカーは、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０）またはＳＳＳＳＳ（配列番号１１）を含み得るか、またはそれからなり得る。グリシンおよびセリンアミノ酸は、リンカー中に含まれる場合、柔軟性であり、それらは、効率的発現のために、タンパク質に柔軟性を与える。
このようなリンカーの利点は、それらが、顕著に免疫原性ではなく、疑似エピトープを最小化することである（われわれは、ＭＨＣ Ｉ予測アルゴリズムを使用して接合部ペプチドの非存在を予測した）。リンカーが柔軟性であることは、効率的翻訳およびＭＨＣによる提示のためにプロテアソームプロセッシングを可能にする抗原の構造に大きく影響を与えないであろう。
ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１融合タンパク質と共にＤＯＭをコードするある実施形態では、融合タンパク質は、ＤＯＭの配列と、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１の配列との間に、リンカーを含み得る。ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約１～約１０個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約１～約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約２～約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約４～約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約５～約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約６～約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約７個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約８個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約９個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１配列との間のリンカーは、約１０個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。
一実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１との間のリンカーは、ＡＡＡＧＰＧＰ（配列番号５／リンカー１）を含み得るか、またはそれからなり得る。ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１との間のリンカーは、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＡから選択される３～１０個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１との間のリンカーは、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＡから選択される３～５個のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１との間のリンカーは、交互するＧおよび／またはＳ残基を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、ＤＯＭと、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１との間のリンカーは、ＧＳＧＳＧ（配列番号６／リンカー２）を含み得るか、またはそれからなり得る。別のリンカーは、ＧＧＧＧＧ（配列番号１０）またはＳＳＳＳＳ（配列番号１１）を含み得るか、またはそれからなり得る。
好都合にも、リンカーＡＡＡＧＰＧＰ（配列番号５／リンカー１）は、疑似エピトープの発生を最小化し、制限酵素Ｎｏｔ Ｉ部位を挿入してクローニングを支援する。特に、ＭＨＣ Ｉ予測アルゴリズムは、接合部ペプチドの非存在を予測するために利用された。さらに、リンカーは、柔軟性であり、効率的翻訳およびＭＨＣによる提示のためにプロテアソームプロセッシングを可能にする抗原の構造に大きく影響を与えないであろう。
核酸は、分泌効力を高めるためのシグナルペプチドなどのリーダー配列をさらにコードし得る。リーダー配列は、ｍｕｓ ＩｇＨシグナルペプチド、またはその相同分子種などのＩｇＨシグナルペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。リーダー配列は、配列ＭＧＷＳＣＩＩＦＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号１）、またはその機能的バリアントを含み得るか、またはそれからなり得る。リーダー配列は、ＤＯＭ配列に対しＮ末端であり得、それと共に融合ペプチドの一部を形成する。
核酸は、１種または複数のプロモーターを含み得る。プロモーターは、真核生物プロモーターを含み得、核酸は任意選択で、Ｔ７などの原核生物プロモーターをさらに含み得る。一実施形態では、プロモーターは、二重真核生物／原核生物プロモーターである。プロモーターは、強力なプロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターは、ウィルスプロモーターである。プロモーターは、シミアンウィルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）サイトメガロウィルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、Ｔ７、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１Ａ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、およびＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーターを含む群のいずれかから選択され得る。一実施形態では、プロモーターはＣＭＶを含む。一実施形態では、プロモーターは、例えば、配列番号９に一致するＣＭＶ／Ｔ７デュアルプロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは、例えば、配列番号９、またはその機能性バリアントを含む、またはそれからなるＣＭＶ／Ｔ７デュアルプロモーターを含む。配列番号９のバリアントは、配列番号９と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有し得る。
プロモーターは、発現される抗原性のタンパク質（例えば、ＤＯＭ、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、および／またはＦＪＸ１）に対しＮ末端にコードされ得る。これは、プロモーターがコード配列の上流にあることを意味することは理解されよう。プロモーターは、単に、コード配列に動作可能に連結されることが必要なだけである。
ある実施形態では、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１は別々のポリペプチドとして発現され、核酸は、各ポリペプチドに対するプロモーターを含み得る。単一プロモーターは、発現される抗原の１種または複数、または全てに対し使用され得る。
核酸は、ポリＡ転写終結配列をコードし得る。一実施形態では、ポリＡ転写終結配列は、ポリアデニル化および終止の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡを含む哺乳動物ターミネーターである。哺乳動物ターミネーターは、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂのいずれか１種であり得る。一実施形態では、ポリＡ転写終結配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ転写終結配列である。ポリアデニル化シグナルは、癌抗原のコード配列の下流であり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。
一実施形態では、核酸は、下記をコードするＤＮＡである： ＤＯＭ抗原、完全長ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原、および完全長ＦＪＸ１抗原を含み、各抗原間にコード化リンカー残基を有する単一融合ポリペプチド；

Ｎ末端ＣＭＶ／Ｔ７プロモーター；および
Ｃ末端ポリＡ配列。
別の実施形態では、核酸は、下記をコードするＤＮＡである：
ＤＯＭ抗原、および完全長ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原または完全長ＦＪＸ１抗原の１つを含み、各抗原間にコード化リンカー残基を有する単一融合ペプチド；
Ｎ末端ＣＭＶ／Ｔ７プロモーター；および
Ｃ末端ポリＡ配列。
理想的には、ＣＭＶ／Ｔ７プロモーターは、ＣＭＶプロモーターで置換され得る。
核酸は、下記をコードするＤＮＡであり得る：
ヘルパーモチーフおよびＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原を含む単一融合ポリペプチド；
作動可能に連結されたプロモーター；および
ポリＡシグナル配列。
核酸は、下記をコードするＤＮＡであり得る：
ＤＯＭ抗原およびＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原を含む単一融合ポリペプチド；
作動可能に連結されたプロモーター；および
ポリＡシグナル配列。
核酸は、本明細書で記載の配列番号２～４をコードする配列、またはそのバリアントを含み得る。別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載の配列番号１～４をコードする配列、またはそのバリアントを含み得る。別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載の配列番号２～６をコードする配列、またはそのバリアントを含み得る。別の実施形態では、核酸は、本明細書で記載の配列番号１～６をコードする配列、またはそのバリアントを含み得る。
ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１をコードする核酸は、インビボでの送達および発現に適切なバックボーンベクターで提供され得る。一実施形態では、バックボーンベクターは、ｐｃＤＮＡ３．０ベクターを含む。
任意の好適な核酸構築物をワクチンに使用し得る。ＤＮＡワクチンの場合、ＤＮＡは、プラスミド、ミニサークル、一本鎖サークル、または閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形態であり得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、細菌性配列を含まない可能性があり、ＤＮＡワクチンなどに使用するために設計された最小限のベクターであるので、好ましい。
一実施形態では、核酸は、本明細書に記載のｐＤＯＭ ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１；ｐＤＯＭ ＭＡＧＥＤ４Ｂ、およびｐＤＯＭ ＦＪＸ１から選択されるベクターのいずれか１種を含み得る、またはそれからなり得る。
一実施形態では、核酸は、ＤＢ ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１；ＤＢ ＭＡＧＥＤ４Ｂ、およびＤＢ ＦＪＸ１から選択される構築物のいずれか１種を含み得る、またはそれからなり得る。これらは、ＤＯＭをさらに含み得る。これらの閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構造に関して、種々の構成が試験された；これらは図１８に示されている。
一実施形態では、核酸は、配列番号１２の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号１３の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号１４の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、核酸は、配列番号１６の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号１７の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号１８の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、核酸は、配列番号１９の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号２０の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号２１の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号２２の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、核酸は、配列番号２３の配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
核酸は、ＤＮＡを含み得るか、またはそれからなり得る。核酸は、ｍＲＮＡまたは自己複製するＲＮＡなどのＲＮＡを含み得るか、またはそれからなり得る。本明細書で考察したように、人工核酸もまた想定される。
核酸は、直鎖状または、例えば、プラスミド中で、環状であり得る。核酸は、ｐｃＤＮＡ３．０ベクターまたはその等価物などの哺乳動物発現ベクターの配列を含み得る。当業者は、いずれの適切な哺乳動物発現ベクターも、本明細書記載の発明による核酸を挿入するために使用し得ることを理解するであろう。ベクターは閉鎖型直鎖状ＤＮＡであるのが好ましい場合がある。
癌ワクチンは、組成物を含み得る。例えば、癌ワクチンは、薬学的に許容可能な核酸の形態で提供され得る。ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１抗原は、同じ組成物中で、ベクターなどの別々の核酸にコードされ得る。
追加の定義
本明細書で使用される場合、「コード配列」または「コード化」は、タンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中で発現を指示できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに動作可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質に対する「フラグメント」または「免疫学的フラグメント」は、本明細書で開示の抗原と交差反応する哺乳動物中で免疫応答を誘発できるタンパク質またはそのポリペプチド部分を意味し得る。フラグメントは、本明細書で記載の種々のアミノ酸配列の少なくとも１種から選択されるポリペプチドフラグメントであり得る。タンパク質のフラグメントは、タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％を含み得る。
本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質／ポリペプチド配列との関連における「同一性」は、その配列が、指定された領域にわたり、指定されたパーセンテージの、基準配列と同じ残基を有することを意味する。パーセンテージは、２個の配列を最も適切なように整列させ、２個の配列を指定領域にわたり比較し、同一の残基が両方の配列中で発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を指定領域中の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算できる。任意選択で、本明細書で配列が参照される場合、好ましくは、少なくとも５０％の同一性、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％の配列同一性、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列も、包含される。
本明細書で使用される場合、核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の一部を含み得る。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、またはそのハイブリッドを含み得、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびに天然塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン）および非天然塩基（例えば、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニン）を含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、任意のヌクレオチドから構成され得る。これらのヌクレオチドは、天然、改変または人工であってもよい。ヌクレオチドは、重合してＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ハイブリッドおよびこれらの混合物ならびに任意の他の人工（ゼノ）核酸を形成するように重合されてもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはその改変バージョン（すなわち、主鎖、糖残基または核酸塩基中に改変を有する）であるのが好ましい場合がある。ＭｏｄＲＮＡは、ワクチンを形成するために適切な核酸であると考えられる。
核酸は、任意の適切なフォーマットであってよく、必要とされ得る任意の追加の配列または要素を含み得る。核酸は、プラスミド（二本鎖環状）、ミニサークル、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ、一本鎖環状ＤＮＡ、またはワクチンの細胞への送達に好適する任意の他の核酸構築物であり得る。核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、自己複製するＲＮＡ、またはインビトロで樹状細胞に遺伝子導入するのに好適するものなどの非複製性ｍＲＮＡであり得る。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、コード配列の発現が、空間的に連結されているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下のコード配列の５’（上流）または３’（下流）に配置できる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、細胞中のコード配列の発現を付与、活性化または強化できる合成または天然由来配列を意味する。プロモーターは、ウィルス、細菌性、真菌、植物、昆虫、および動物を含む由来限から誘導できる。プロモーターは、遺伝子構成要素の発現を、発現が起こる細胞、組織または臓器に対して、または誘発剤などの外部刺激に応答して、構成的にまたは差次的に調節できる。好適なプロモーターの例としては、ｌａｃオペレータープロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＳＶ４０プロモーター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＶＡＸ１、ｐＶＩＶＯ２、ｐＣＩ、ｐＣＭＶおよびｐＳＶ２）が挙げられる。
用語「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書では同じ意味で用いられ、本明細書で記載のタンパク質のＮ末端に結合できるアミノ酸配列を意味する。シグナルペプチド／リーダー配列は通常、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、産生された細胞からのタンパク質の分泌を促進する。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の、抗原の導入に応答した活性化を意味する。免疫応答は、細胞性もしくは体液性応答、または両方の形態であり得る。誘発される免疫応答は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答であるのが好ましい。
本明細書で使用される場合、「治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）、阻止（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）、または完全な除去（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）の手段による疾患からの動物（ヒトを含む）の保護を意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症の前に、本発明のワクチンを動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。疾患の抑制は、疾患の誘導後で、臨床的所見の前に、本発明のワクチンを動物（ヒト）に投与することを含む。疾患の阻止は、臨床症状の出現後に、本発明のワクチンを動物（ヒト）に投与することを含む。
癌は、限定されないが、頭頸部癌、口腔癌、中咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、上咽頭癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、胆管細胞癌腫、皮膚黒色腫、直腸癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、腎癌および胃腺癌を含む任意の癌であってよい。
癌ワクチンは、悪性細胞または癌細胞が発生するのを防ぐために使用され得る。いくつかの事例では、癌発生の前に細胞変化が検出でき、癌ワクチンは、癌の発生を防ぐために投与または使用される。従って、癌ワクチンは、前癌性細胞を治療するために使用され得る。さらに、細胞は、癌の表現型が獲得される前に、いくつかの表現型を経由して進行する場合がある。従って、癌の予防は、前癌性であるが侵襲的細胞型の治療を含み得る。例えば、口内の癌では、細胞は、限定されないが、口腔前癌病変（ＯＰＭＬ）：白斑症、紅板症、扁平苔癬、および口腔上皮異形成を含むいくつかの表現型を経由し得る。さらなる例としては、一部の肺癌は、限定されないが、扁平上皮異形成、異型腺腫様過形成、および／または扁平上皮内癌（ＣＩＳ）を含むいくつかの表現型を経由し得る。
癌ワクチンは、腫瘍増殖を防止できる。癌ワクチンは、腫瘍増殖を低減できる。ワクチンは、腫瘍細胞の転移を防止できる。癌ワクチンは、腫瘍細胞の免疫回避を低減できる。ワクチンの癌抗原は、その抗原を発現する癌または腫瘍に向けられた、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発する。誘導または誘発された細胞性免疫応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の誘導または分泌、および／またはパーフォリン／グランザイムを含む細胞溶解性顆粒の形成を含み得る。他の実施形態では、誘導または誘発された免疫応答は、その抗原を発現している腫瘍または癌の増殖を促進する１種または複数の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ－１０およびＴＦＧβなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、癌関連線維芽細胞、免疫サプレッサー細胞、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ－１、および免疫チェックポイント分子により産生される可溶性因子を上方制御する因子を低減または阻害できる。
ワクチンは、ワクチンを投与された対象の細胞性免疫応答を、ワクチンを投与されない対象の細胞性免疫応答に比較して、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍高め得る。
ワクチンは、ワクチンを投与された対象のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）レベルを、ワクチンを投与されない対象のＩＦＮγレベルに比較して、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍高め得る。
癌ワクチンは、ＤＮＡであり得る。ＤＮＡワクチンは、染色体中へのその組み込みを阻止する要素または試薬をさらに含み得る。
癌ワクチンは、１種または複数の癌抗原のＲＮＡであり得る。
本発明のワクチンは、ワクチンそれ自体が正常細胞に対し障害、疾病または死亡を生じないように安全であること；疾病に対し保護的であること；防御Ｔ細胞応答を誘導すること；ならびに投与の容易さ、少ない副作用、生物学的安定性、および特に閉鎖型直鎖状ＤＮＡが使用される場合、単回用量当たりの低価格を可能とすること、などの効果的なワクチンに必要な特徴を有し得る。
癌ワクチンは、１種または複数の免疫チェックポイント分子の１種または複数の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害薬または「チェックポイント阻害剤」）をさらに含み得る。免疫チェックポイント阻害薬は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／または分化、Ｂ細胞提示および／または分化、いずれかのサイトカイン、ケモカインまたは免疫細胞増殖および／または分化のためのシグナル伝達などの免疫系のいずれかの成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質である。癌ワクチンは抗体と共にＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１などのチェックポイント阻害剤にさらに組み合わされて、細胞応答および免疫応答の刺激を高める。抗ＰＤ－１または抗ＰＤＬ－１抗体の使用は、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１によるＴ細胞抑制および応答抑制を防ぐ。
併用療法
癌ワクチンは、別の治療的に、または予防的に活性な成分と組み合わせて、ワクチンとして使用し得る。癌ワクチンは、アジュバントと組み合わせて、ワクチンとして使用し得る。
治療的に、または予防的に活性な薬剤は、いずれかの抗癌剤であり得る。
好適な抗癌剤としては、限定されないが、アルキル化剤、マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、およびイホスファミド）、エチレンイミン、アルキルスルホネート、ヒドラジンおよびトリアジン、ニトロソウレア、金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンなど）、植物アルカロイド、ビンカアルカロイド、タキサン、ポドフィロトキシン、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）類似体、抗腫瘍抗生物質、アントラサイクリン、クロモマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、代謝拮抗薬、葉酸拮抗薬、ピリミジン拮抗薬、プリン拮抗薬、アデノシンデアミナーゼ阻害剤、およびトポイソメラーゼ（ＩおよびＩＩ）阻害剤を含む化学療法剤が挙げられる。
好適な抗癌剤としては、限定されないが、免疫チェックポイント阻害薬、Ｔ細胞導入療法剤、養子免疫細胞療法剤、または免疫細胞療法剤、抗体療法剤、ワクチン、または免疫系調節剤を含む免疫療法剤が挙げられる。さらに意図されるのは、Ｔ細胞チェックポイントまたはアゴニスト経路を標的にする免疫療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を用いる養子免疫細胞療法（ＡＣＴ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはインビトロ増殖Ｔ細胞である。
好適な抗癌剤としては、放射線治療または放射線類似作用物質、標的療法、手術またはレーザー療法が挙げられ得る。
好適な抗癌剤としては、標的療法が挙げられる。このような治療法は、治療される癌に依存し、何の遺伝子を癌細胞が発現しているかの分析を必要とし、またはどの遺伝子変異が変異誘発の根底にあるのかの再検討を必然的に伴い得る。いくつかの標的療法が本明細書で記載され、腫瘍細胞を標的にする細胞増殖抑制性および細胞傷害薬、血管新生を標的にする薬剤（血管新生阻害剤レンバチニブおよびソラフェニブなど）、癌細胞が特異的に発現するマーカーを標的にする薬剤（すなわち、ＨＥＲ２陽性細胞を標的にするハーセプチン）、マクロファージを標的にする療法剤、Ｔ細胞チェックポイントまたはアゴニスト経路を標的にする療法剤、などを含む。
追加でまたは代わりに、本発明による癌ワクチンは、単独で、またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて癌の予防または治療のために使用され得る。チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１結合分子を含み得る。この結合分子は、抗ＰＤ１抗体、またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４結合分子を含み得る。
好都合にも、前臨床データは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１を標的化し、これらの抗原を発現している腫瘍の増殖を抑制する大きな潜在能力を有するＤＮＡワクチンが、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４結合分子などのチェックポイント阻害剤と組み合わせることにより、さらに強化され得ることを本明細書で実証している。
抗ＰＤ１結合分子は、抗体フラグメント、または抗体模倣体などの抗体または抗体バリアントを含み得る。抗体またはそのバリアントは、モノクローナルであってもよい。一実施形態では、抗体またはそのバリアントは、ニボルマブ、またはニボルマブと結合を競合する抗体またはそのバリアントを含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、抗体またはそのバリアントは、ニボルマブの６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲを含み得る。代替的実施形態では、抗体またはそのバリアントは、ニボルマブの可変重鎖および軽鎖配列を含み得る。
抗ＣＴＬＡ４結合分子は、抗体フラグメント、または抗体模倣体などの抗体または抗体バリアントを含み得る。抗体またはそのバリアントは、モノクローナルであってもよい。一実施形態では、抗体またはそのバリアントは、イピリムマブ、またはイピリムマブと結合を競合する抗体またはそのバリアントを含み得るか、またはそれからなり得る。一実施形態では、抗体またはそのバリアントは、イピリムマブの６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲを含み得る。代替的実施形態では、抗体またはそのバリアントは、イピリムマブの可変重鎖および軽鎖配列を含み得る。
一実施形態では、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４結合分子などのチェックポイント阻害剤は、インビボ発現のためのチェックポイント阻害剤をコードする核酸の供給／投与により与えられ得る。チェックポイント阻害剤は、プラスミドでコードされ得る。チェックポイント阻害剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１９ Ｊａｎ １；１０（１）：１３－１６．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２６５３５）に記載される、ＤＮＡコードモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）を含み得る。
ＤＮＡコードモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）は、作製の困難さ、安定性、繰り返される問題である抗体投与のための頻繁な高投与量の要求および長時間の静脈内投与を克服するのに役立ち得る。人工的に設計されるＤＭＡｂは、ＭＡｂベース療法の設計および実施を簡略化できる。プラスミドＤＮＡ注入および電気穿孔を介して送達されたＤＭＡｂは、感染性疾患、癌ならびに心臓血管疾患の治療および予防のための前臨床モデルに使用された参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１９ Ｊａｎ １；１０（１）：１３－１６．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２６５３５）およびＤｕｐｅｒｒｅｔ ＥＫ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８；７８：６３６３－７０）は、免疫チェックポイント遮断薬が、インビボで最適化および送達でき、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の最適化、発現およびインビボ機能性特性評価により、さらにＤＭＡｂ技術を進展させることを報告した。
使用は、混合製剤の形態であり得る。別の実施形態では、使用は、同時または逐次投与（例えば、別々に処方されるが、一緒に投与される）であり得る。一実施形態では、本発明によるワクチンは、チェックポイント阻害剤の前に投与され得る。
本発明の別の態様では、本明細書で記載の癌ワクチンの核酸によりコードされる融合ペプチドが提供される。
本発明の別の態様では、本明細書による癌ワクチンを含む組成物が提供される。
組成物は、例えばヒトなどの哺乳動物中で免疫原性であり得る。組成物は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物であり得る。組成物は、癌の予防または治療での使用のためのものであり得る。
本発明の別の態様では、下記を含む、癌の治療または予防のためのキットが提供される：
－本明細書に記載の本発明による癌ワクチン；および
－抗ＰＤ１結合分子などのチェックポイント阻害剤。
本発明の別の態様では、下記を含む、癌の治療または予防のためのキットが提供される：
－本明細書に記載の本発明による第１の癌ワクチンであって、核酸がＭＡＧＥＤ４Ｂをコードするワクチン；
－本明細書に記載の本発明による第２の癌ワクチンであって、核酸がＦＪＸ１をコードするワクチン；および
－任意に抗ＰＤ１結合分子などのチェックポイント阻害剤。
従って、下記を含む、癌の治療または予防のためのキットが提供され得る：
－ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原またはそのバリアントをコードする配列を含む癌ワクチン；および
－抗ＰＤ１結合分子などのチェックポイント阻害剤。
従って、下記を含む、癌の治療または予防のためのキットが提供され得る：
－第１の癌ワクチンであって、核酸がＭＡＧＥＤ４Ｂまたはそのバリアントをコードするワクチン；および
－抗ＰＤ１結合分子などのチェックポイント阻害剤。
癌ワクチンは、１種または複数の免疫チェックポイント分子の１種または複数の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害薬）をさらに含み得る。免疫チェックポイント阻害薬は、ＭＨＣクラス提示、Ｔ細胞提示および／または分化、いずれかのサイトカイン、ケモカインまたは免疫細胞増殖および／または分化のためのシグナル伝達などの免疫系のいずれかの成分の抑制を阻止する任意の核酸またはタンパク質であり得る。
免疫チェックポイント阻害薬は、抗体、そのバリアント、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせをコードする１種または複数の核酸配列であり得る。他の実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬は、抗体、そのバリアント、そのフラグメント、またはこれらの組み合わせであり得る。
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはこれらの組み合わせであり得る。
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、そのフラグメント、そのバリアント、またはこれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現され、従って、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ－１は、Ｔ細胞制御因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に調節し、それにより、免疫応答を負に調節する。ＰＤ－１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に制御でき、従って、ＣＤ８媒介細胞傷害性を抑制し、腫瘍増殖を強化する。
ＰＤ－１は、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有し、これらは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ－ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、ならびにＴＣＲ受容体シグナル伝達時にＴ細胞上で発現上昇している。ＰＤ－Ｌ１は、いくつかの腫瘍細胞株により発現される。
抗免疫チェックポイント分子抗体
免疫チェックポイント阻害薬は、抗体であり得る。抗体は、免疫チェックポイント分子と結合または反応できる。従って、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体とみなし得る。抗体は、癌ワクチン中に含まれる核酸配列によりコードされ得るか、または抗体として供給され得る。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、または完全ヒト抗体である。
癌ワクチン構築物
癌ワクチンは、癌抗原をコードする核酸構築物を含み得る。核酸構築物は、１種または複数の異種核酸配列を組み込むまたは含むことができる。構築物は、機能する染色体外分子として細胞中に存在し得る。構築物は、好ましくは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子である。
閉鎖型直鎖状ＤＮＡは通常、各末端で、共有結合で閉じた二本鎖ＤＮＡと理解されている。ＤＮＡの二本鎖部分は、従って、相補的である。変性されると、閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、一本鎖サークルを形成し得る。ＤＮＡは、好みに応じて、十字型、ヘアピンまたはヘアピンループを含む、任意の好適な構造により各末端で閉じ得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡの末端は、非相補配列から構成される場合があり、従って、ＤＮＡを十字型、ヘアピンまたはヘアピンループの一本鎖配置にさせ得る。あるいは、配列は相補的であり得る。末端はプロテロメラーゼ酵素のための標的配列の一部により形成されるのが好ましい場合がある。プロテロメラーゼ標的配列は、ＤＮＡテンプレート中のその存在がプロテロメラーゼの酵素活性を可能にするいずれかのＤＮＡ配列である。プロテロメラーゼは、ＤＮＡの二本鎖部分を切断し、それらを再連結し、共有結合による閉止末端を残す。一般に、プロテロメラーゼ標的配列は、任意の完全な回文配列、すなわち、２回転対称、または完全な逆方向反復を有する任意の二本鎖ＤＮＡ配列を含む。閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、片方または両方の末端に、プロテロメラーゼ標的配列の部分を有し得る。この部分が、全二本鎖認識部位の一本鎖であることは効果的である。プロテロメラーゼ標的配列は、同じ同族のプロテロメラーゼを各末端に有し得るか、または各末端に対し異なるプロテロメラーゼを必要とし得る。種々のプロテロメラーゼ酵素の作用を介して構築された閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、ＷＯ２０１０／０８６６２６、ＷＯ２０１２／０１７２１０およびＷＯ２０１６／１３２１２９で以前に開示された。これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。インビトロＤＮＡ増幅とそれに続くプロテロメラーゼ酵素による切断を用いて構築された閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡがインビトロの無細胞環境で産生され、商業製品用にスケールアップできるという利点を有する。これらの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、ドギーボーンＤＮＡまたはｄｂＤＮＡ（商標）として知られる。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、出願者らの以前の方法を用いて、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を有するＤＮＡテンプレートのポリメラーゼベース増幅に基づいて、インビトロ、無細胞方式で作製し、さらに増幅したＤＮＡをプロテロメラーゼで処理して閉鎖型直鎖状ＤＮＡを産生することが好ましい。
閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、必要なプロテロメラーゼ標的配列を有するプラスミドの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターへの変換により構築できるが、これは、効率的な産生方法ではない。
他の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、ＰＣＲ産物のキャッピング、およびＭＩＤＧＥ（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクターを含む種々のインビトロ戦略により構築されてきた。ＭＩＤＧＥは、プラスミドの細菌細胞からの単離後の原核生物および真核生物両方のバックボーンの消化と、それに続く、末端再充填のための必要なＤＮＡ配列のヘアピン配列への結紮により生成される。
プロテロメラーゼの作用に基づいて、細胞培養物中で、インビボで産生されるＤＮＡ「ミニストリング（ｍｉｎｉｓｔｒｉｎｇ）」は、同様に、本発明中で使用するために好適するはずである閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターである。
好適であり得る他の形態の閉鎖型直鎖状ＤＮＡには、十字型構造を有する両端で閉じたものが含まれ、これも細胞培養物中で製造され得る。
閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、製品の純度を保証するという理由で、無細胞系で製造されるのが好ましい可能性があり、別の方法の場合には、規制当局により、細胞法で製造された閉鎖型直鎖状ＤＮＡの厳密な精製が要求されるであろう。
核酸構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含み得る。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
本明細書に記載の癌ワクチンは、動物の細胞中で、動物の免疫応答を誘発するのに効果的な量で癌抗原を発現することができる。癌ワクチンは、癌抗原をコードする核酸を、その抗原の発現が生じる細胞に遺伝子導入するために有用であり得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、ＤＮＡワクチンのための効果的な構築物であること示されている。
ワクチンの調製方法
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は、既知の装置および技術の組み合わせを用いて配合または製造できるが、それらは、ＷＯ２０１０／０８６６２６、ＷＯ２０１２／０１７２１０およびＷＯ２０１６／１３２１２９に記載の無細胞合成方法を用いて製造されるのが好ましい。
標準的組換え技術を用いて、ＤＮＡ構築物を調製できる。
他の態様
本発明の別の態様では、医薬として使用するための、本発明による癌ワクチンまたは組成物が本明細書で提供される。
本発明の別の態様では、対象の癌の治療または予防に使用するための、本発明による癌ワクチンまたは組成物が本明細書で提供される。
本発明の別の態様では、対象の癌の治療または予防方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の本発明による癌ワクチンまたは組成物の投与を含む。
治療または予防される癌は、口腔癌および／または中咽頭癌であり得る。口腔癌および／または中咽頭癌は、ＨＰＶ陰性または陽性口腔癌および／または中咽頭癌であり得る。一実施形態では、癌は口腔癌である。別の実施形態では、癌は中咽頭癌である。一実施形態では、癌は扁平上皮細胞癌である。別の実施形態では、治療される癌は肺癌または上咽頭癌であり得る。
癌は、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１を発現している、または過剰発現している癌細胞により特徴付け得る。
癌は、ＭＡＧＥＤ４Ｂを発現している、または過剰発現している腫瘍関連細胞により特徴付け得る。
癌抗原の発現は、関連抗体を用いた生検材料または試料検出、および／または細胞中に存在するＲＮＡ配列の検出などの定型的方法により測定できる。
癌は、追加でまたは代わりに、ＭＡＧＥＤ４Ｂ過剰発現ＣＡＦと関連付けることにより特徴付け得る。このような細胞は、免疫系および他の抗癌剤から癌細胞を保護し得る。
癌細胞および癌関連細胞上の癌抗原の発現は、同じ組織または臓器由来の正常細胞と比較して決定し得る。従って、発現または過剰発現は、正常細胞に対する発現の比較レベルであり得る。
一実施形態では、対象は、治療または予防の前に、それらの癌性の組織または細胞中のＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１抗原の存在について試験される。別の実施形態では、対象は、治療または予防の前に、それらの癌性の組織または細胞中のＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１抗原のレベルについて試験される。対象は、それらの癌性の組織または細胞中にＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１抗原を有するかどうか、または相当する非癌性の組織または細胞に比べて、その過剰発現を有するかどうかに関し、治療または予防のために選択され得る。腫瘍周辺の細胞はまた、癌抗原発現、特に、ＭＡＧＥＤ４Ｂ発現について試験され得る。
当業者は、ワクチン投与経路および投与量に精通しているであろう。例えば、投与は、皮下、筋肉内、または静脈内であり得る。典型的な投与量は、投与される患者／対象当り、約４～８ｍｇを、１回または複数の回であり得る。例えば、投与量は、治療効果が観察されるまで複数回投与され得る。一実施形態では、インビボ電気穿孔を用いて、細胞中への送達が、インビボまたはエクスビボで高められる。
対象は、哺乳動物であり得る。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象は、飼育動物または家畜である。
本発明の別の態様では、ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントまたは短縮化バージョンを含むポリペプチドが提供される。ポリペプチドは、ヘルパーモチーフとの融合体として提示され得る。ポリペプチドは、ＤＯＭとの融合体として提示され得る。例示的ポリペプチド配列は、配列番号３２、３５、３６および３７として本明細書で記載される。ＭＡＧＥＤ４Ｂ配列は、配列番号１２によりコードされるように（この例ではＤＯＭと融合）、ＦＪＸ１と融合され得る。
癌ワクチン組成物
ワクチンは、組成物、任意選択で、医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、約５ナノグラム～約１０ｍｇのワクチンを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、約２５ナノグラム～約５ｍｇのワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５０ナノグラム～約１ｍｇのワクチンのＤＮＡを含む。
組成物は、処方目的のための他の添加物をさらに含み得、これは、投与方法により変わり得る。組成物が注射可能である場合には、それらは、無菌、発熱性物質不含および粒子不含である。好適な製剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含み得る。いくつかの事例では、リン酸緩衝食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含み得る。
ワクチンは、許容可能な賦形剤をさらに含み得る。許容可能な賦形剤は、ビークル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能性分子であり得る。
ワクチン接種
本明細書で開示の癌ワクチンは、癌の治療または予防方法で使用するために提供される。本明細書で記載のワクチンは、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するための、投与またはワクチン接種方法で使用するためのものであり得る。ワクチン接種プロセスは、動物中で、１種または複数の癌抗原に対し免疫応答を生成できる。ワクチンの投与は、細胞中で発現され、その結果、細胞表面に送達されると、免疫系が認識し、免疫応答を誘導する核酸分子としての１種または複数の癌抗原の遺伝子導入であり得る。
ワクチンは、免疫応答を誘発するために、動物、好ましくは哺乳動物に投与され得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類（特に、チンパンジーおよびサル）、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ラマ、アルパカ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、マウス、ラット、および好ましくは、ヒト、イヌまたはネコであり得る。
ワクチン投与量は、１μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／時間であり得、および２０μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与できる。効果的治療のためのワクチン投与回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれを超える投与回数であり得る。
ワクチンは、「プライム・ブースト」法を用いて投与し得る。プライム・ブースト免疫法は、初回刺激とブースター投与の間の同じワクチンを用いた免疫のレジメンとして定義され得る。１回または複数回のブースター投与があり得る。実施例で使用される治療方法は、いくつかの事例で、プライム・ブースト法を使用した。
癌ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入経由、頬側投与経由、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節腔内またはこれらの組み合わせを含む種々の経路により投与できる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射器、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、またはタトゥー法（ｔａｔｔｏｏｉｎｇ）、電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、または超音波などの他の物理的方法により投与できる。
癌ワクチンは、核酸である。それは、細胞の遺伝子導入に使用される適切な核酸送達方法を用いて送達し得る。核酸が最小限の形態（ミニサークルまたは閉鎖型直鎖状ＤＮＡなど）である場合は特に、ネイキッド核酸を使用し得る。しかし、核酸はまた、投与のために、例えば、異なる材料を用いて、「パッケージ化」され得る。これら材料には、脂質、直鎖および分枝ポリマー、および天然または合成起源のペプチド／タンパク質が含まれる。脂質／核酸の複合体化産物は、代表的層状または六角形構造を有するリポプレックスをもたらす。ポリマーおよび核酸は、何らの規則的内部構造を持たないで一緒に絡み合ったポリマー鎖を有するポリプレックスに複合体化し得る。ペプチド／タンパク質は、核酸と相互作用し、ペプチド／タンパク質の一次構造に応じて、繊維状または球状の形態を有する、無秩序ポリプレックスまたは秩序化人工ウィルスを形成する。あるいは、核酸は、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）などのウィルスコート中にパッケージ化され得るか、または実際に、レンチウィルス、レトロウィルス、およびアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）アデノウィルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）または腫瘍溶解性マラバＭＧ１ラブドウィルスなどの任意の好適なウィルスベクター中にパッケージ化され得る。
癌ワクチンは、細胞に対しエクスビボで使用され得る。従って、好適な細胞を得ることができ、これは、自家または同種であり、インビトロで遺伝子導入され、その後、これらの細胞は、それを必要としている患者に供給できる。エクスビボ遺伝子導入のための好適な細胞には、ナチュラルキラー細胞または樹状細胞、自家または同種腫瘍細胞（通常、照射されている）などの任意の型の抗原提示細胞が挙げられる。自家細胞は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡフォーマットの癌ワクチンを一過性に遺伝子導入され得る。癌抗原は、コドン最適化され、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方に対し癌抗原ペプチドのＭＨＣ－ＩおよびＭＨＣ－ＩＩ提示をもたらすヘルパーモチーフを含み得る結果として、患者に再導入後に、強力な腫瘍特異的免疫応答が達成され得る。
従って、本出願は、患者の癌の治療または予防のためにこれらの細胞を使用する前に、インビトロまたはエクスビボで細胞に遺伝子導入するための癌ワクチンの使用まで拡張される。このような細胞は、投与されると、遺伝子導入は一過性でよいので、もはや癌ワクチンを含まない。
データは、癌ワクチンと免疫チェックポイント阻害薬の組み合わせが、癌抗原単独を含むワクチンよりも、免疫系をより効率的に誘導し、実際に、これらの２種が相乗的に作用することを示す。このより多くの効率的免疫応答は、癌の治療において高められた効力を提供する。
定義
チェックポイント阻害剤療法は、ある種の癌免疫療法である。チェックポイント阻害剤は、腫瘍が其れ自体を免疫系による攻撃から保護するために使用できる免疫系の作用を刺激または抑制する免疫系の重要な制御因子である免疫チェックポイントを標的にする。チェックポイント療法は、阻害性チェックポイントを遮断して、免疫系の機能を回復できる。
用語「免疫原性」は、本発明のタンパク質または組成物に適用される場合、ヒトまたは動物体で免疫応答を誘発できることを意味する。免疫応答は、保護的であり得る。
用語「保護的」は、癌の予防、癌感染、伝染および／または進行のリスクの低減、癌の重篤度の低減、癌の治癒、症状の緩和、または癌もしくは癌症状の重篤度の低減を意味する。
用語「治療」は、癌の治癒、症状の緩和、または癌もしくは癌症状の重篤度の低減を意味する。
口腔癌の場合における用語「予防」は、口腔異形成症から口腔癌への変換の防止を意味する。
「抗体」により、我々は、実質的に完全な抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（少なくとも１個のアミノ酸が天然起源ヒト抗体に対して変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモダイマーおよびヘテロダイマー、ならびに抗原結合フラグメントおよびその誘導体を含める。特に、本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、天然または部分的にもしくは完全に人工的に産生されたかどうかに関係なく、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはそれに相同である結合ドメインを有するいずれかのポリペプチドまたはタンパク質も包含する。これらは、天然源から誘導できるか、またはそれらは部分的にまたは完全に人工的に産生され得る。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含むフラグメント；およびディアボディである。抗体は、ポリクローナルであっても、またはモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体は、「ｍＡｂ」と呼ばれることもある。
モノクローナルおよび他の抗体を用いて、組換えＤＮＡ技術を使って、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域への導入を含み得る。例えば、ＥＰ－Ａ－１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ－Ａ－２３９４００を参照されたい。これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を、遺伝子変異または他の変化に供し得、これは、産生された抗体の結合特異性を変える場合も、または変えない場合もある。
抗体は、いくつかの方法で改変され得るので、用語の「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。従って、この用語は、天然または完全または部分的合成であるかどうかに関わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体、ヒト化抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物および同族体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメイン、または等価物を含むキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ－Ａ－０１２０６９４およびＥＰ－Ａ－０１２５０２３に記載されている。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体は、非ヒト、例えば、マウス抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であってもよい。ヒト化抗体の作製方法は、例えば、米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の抗体は、未処理でも、または遺伝子改変されていてもよい。例えば、抗体は、完全にまたは部分的にグリコシル化されても、および／または補体、マクロファージなどのＦｃＲ含有エフェクターなどのヒトエフェクターシステムへの結合を高めるもしくは減らす、または半減期を延長するまたは短縮するために選択されてもよい。これらの改変は、有効性を改善するために、および場合によっては、毒性副作用を減らすためにも行うことができる。
完全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を実施できることが示された。本発明で使用するための結合分子の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２個の結合Ｆａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが合体して抗原結合部位を形成可能とするペプチドリンカーにより結合される；（ｖｉｉｉ）二重特異的単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５、参照により本明細書に組み込まれる）；および（ｉｘ）「ディアボディ」、遺伝子融合により構築された多価または多重特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４、参照により本明細書に組み込まれる）である。
２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、当業者に既知の数学的アルゴリズムを用いて達成できる。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０ Ｍａｒ；８７（６）：２２６４－８）であり、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３ Ｊｕｎ １５；９０（１２）：５８７３－７）に記載のように修正されたものである。ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、このようなアルゴリズムを組み込み、標準パラメーターで使用され得る。
当業者は、本発明の一実施形態または態様の任意の特徴を、必要に応じ、他の本発明の実施形態または態様に適用可能であることを理解するであろう。
本明細書のいずれかの刊行物に対する参考文献は、米国特許権利化のみの目的のために、参照により組み込まれるとみなされるものとする。
本発明の実施形態が、添付の図面を参照しながら、例示の目的のみで、以降で記載される。
頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣ）および他の着目すべき有望な癌型における標的抗原の過剰発現ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１療法の転写物は、頭頸部腫瘍では、隣接する正常組織に比べて、顕著に高レベルで発現される。他の癌型に関しては、ＭＡＧＥＤ４Ｂ発現はまた、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、扁平上皮（ＬＵＳＣ）癌および胆管細胞癌腫（ＣＨＯＬ）中よりも有意に高く、一方、ＦＪＸ１は、それぞれの隣接する正常組織に比較して、多くの腫瘍型で有意により高い。転写性データは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）由来であり、Ｌｉら（２０１６）により処理され、オンラインで、ｃｉｓｔｒｏｍｅ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ｔｉｍｅｒから公的に入手可能である。このデータは、標的癌抗原は、複数の癌で発現されることを示し、本明細書で記載のワクチンの有用性を示している。 ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両抗原は、ＨＰＶ陰性扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、非悪性口腔癌異形成症および上咽頭癌中で強く発現する。ＭＡＧＥＤ４Ｂ（Ｎｏｖｕｓ－Ｂｉｏ：ＮＢＰ１－８９５９４）は、１：２００希釈で染色された。ＦＪＸ１（Ｎｏｖｕｓ－Ｂｉｏ：ＮＢＰ１－５９４７０）は、１：１００希釈で染色された。染色は、ＤＡＫＯ自動免疫染色装置で実施した。精巣は、強力な発現を有する陽性対照の役割をする。口腔線維上皮性ポリープ（ＦＥＰ）は、陰性対照の役割をし、非形成異常口腔組織中で低レベルの発現を示す。このデータは、標的癌抗原が、タンパク質として発現されることを確証する。 ＭＡＧＥＤ４Ｂ（Ｄ４Ｂ）は、ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ患者において免疫原性である。フローサイトメトリーにおいて、循環Ｄ４Ｂ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、５／７ ＨＬＡ－Ａ２＋ＨＮＳＣ患者で検出された（４例をここに示す）が、ＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナー（ＨＤ１）Ｄ４Ｂ５０１－５０９／ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ四量体染色では検出されなかった。染色は、Ｐｏｏｌ，ＵＫで手術を受けている患者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて実施した。１０６個のＰＢＭＣを抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ：ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＡＰＣ：ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＰＥ－Ｃｙ７：ＳＫ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＤＡＰＩ（生死染色）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＭＡＧＥＤ４Ｂ５０１－５０９四量体（ＰＥ）で染色した。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補償のために用いて、ＦＡＣＳＣａｎｔｏでフローサイトメトリーを実施した。分析は、ＦｌｏｗＪｏを用いて実施した；ゲーティングを生死リンパ球およびＣＤ８に設定し、その後四量体に設定した。四量体陽性ＣＤ８細胞がゲート中に示される。このデータは、確定されたＨＮＳＣＣの患者では、ワクチン接種による増幅に利用できるＴ細胞のプールが存在することを確証する。さらに、これは、このようなＴ細胞単独の存在は、これらの個体では何らの病態も引き起こさず、それらは十分に機能的ではないが、そうでなければ、個体はこのような細胞を用いてそれらの腫瘍を制御するはずであることを示唆する有望なデータである。 標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方に特異的なＣＤ８ Ｔ細胞。図４Ａ：Ｄ４Ｂ５０１－５０９／ＨＬＡ－Ａ２四量体染色およびフローサイトメトリーを用いて、Ｄ４Ｂ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＨＮＳＣＣ患者ＨＮ３３７の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：６０００ＩＵ／ｍｌの組換え型ヒトＩＬ－２で増殖）中で検出された。１０６個の増殖ＴＩＬを、抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ：ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＡＰＣ：ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＰＥ－Ｃｙ７）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＤＡＰＩ（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＭＡＧＥＤ４Ｂ５０１－５０９四量体（ＰＥ）で染色した。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補償のために用いて、ＦＡＣＳＣａｎｔｏでフローサイトメトリーを実施した。ＦｌｏｗＪｏを用いて分析を実施した。ゲーティングを生死リンパ球に設定し、その後ＣＤ８＋四量体に設定した。四量体陽性ＣＤ８細胞がゲート中に示される。図４Ｂ：ＨＬＡ－Ａ２陰性、ＨＬＡ－Ａ１陽性ＨＮ３３７腫瘍試料由来の増殖ＴＩＬ中のＩＦＮγ ＣＤ８ Ｔ細胞。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）と共に増殖したＴＩＬを、対照（ペプチドプールＭＡＧＥＤ４Ｂ ＨＬＡ－Ａ２ペプチド）、抗原の全配列に対し１１ａａの重複部分を有する１５マーペプチドからなるＭＡＧＥＤ４Ｂペプチドプール（１８３個のペプチドプール）、ＨＬＡ－Ａ１のみに結合するＦＪＸ１ペプチドプール（ＮｅｔＭＨＣ４．０、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇにより予測された）（ＦＪＸ１ ａａ配列由来の１５マーペプチドの３個：ＡＲＦＡＤＧＴＲＡＣＶＲＹＧＩ；ＤＬＶＱＷＴＤＬＩＬＦＤＹＬＴ；ＷＴＤＬＩＬＦＤＹＬＴＡＮＦＤ、太字はエピトープ）で８時間刺激し、細胞内ＩＦＮγ染色後に、フローサイトメトリーを実施した。フローのための抗体パネルは、抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ：ＯＫＴ３）、ＣＤ８（ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５：ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ＣＤ５６（ＰＥ：ＨＣＤ５６）、ＩＦＮγ（ＡＰＣ ４Ｓ．Ｂ３）（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから）およびＺｏｍｂｉ Ａｑｕａ（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、ＨｕＭａｎ ＴｒｕｅＳｔａｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてＦｃ受容体ブロッキング後に適用した。ゲートは、プロットの上端に示す試薬で再刺激後のＩＦＮγ ＣＤ８陽性Ｔ細胞の特異的集団を示す。これらの図のデータもまた、確定されたＨＮＳＣＣの患者では、ワクチン接種による増幅に利用できるＴ細胞のプールが存在し、これらの細胞は腫瘍中にも見つけることができることを示す。さらに、これは、このようなＴ細胞単独の存在は、これらの個体では何らの病態も引き起こさず、それらは十分に機能的ではないが、そうでなければ、個体はこのような細胞を用いてそれらの腫瘍を制御するはずであることを示唆する有望なデータである。 標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方に特異的であるＣＤ８ Ｔ細胞。図４Ａ：Ｄ４Ｂ５０１－５０９およびＦＪＸ１１５－２５ ＨＬＡ－Ａ２四量体染色およびフローサイトメトリーを用いて、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２＋マレーシアＯＳＣＣ患者０６－００２１－１８の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ：６０００ＩＵ／ｍｌの組換え型ヒトＩＬ－２で増殖）中で検出された。増殖ＴＩＬを、抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ；ＳＫ７）、ＣＤ４（ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５；ＳＫ３）、ＣＤ８（ＢＶ５１０；ＲＰＡ－Ｔ８）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＦＶＳ７８０（生存率染色）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＭＡＧＥＤ４Ｂ５０１－５０９四量体（ＰＥ）で染色した。ＢＤ ＣｏｍｐＢｅａｄを補償のために用いて、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリーを実施した。ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを用いて分析を実施した。ゲーティングを生死リンパ球に設定し、その後ＣＤ８＋四量体に設定した。四量体陽性ＣＤ８細胞がゲート中に示される。このデータは、抗原特異的Ｔ細胞が腫瘍中で特定されたことを示す。これは、ワクチンによる新たな活性化および増殖に加えて、増殖に利用可能な細胞のプールが存在することをさらに示唆する。 標的抗原ＭＡＧＥＤ４Ｂに特異的なＴ細胞はＨＮＳＣ患者でＰＤ１を発現し、従って、抗ＰＤ１を用いて標的化できる。特異的Ｔ細胞は、ＭＡＧＥＤ４Ｂ５０１－５０９四量体を用いて、ＰＢＭＣを使って循環中で検出された。四量体陽性集団の半分はまた、ＰＤ１＋でもあった。この亜集団は、ＨＬＡ＊Ａ２陰性ＨＮＳＣ患者中には存在しない（対照群）。パネルは、抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ；ＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＡＰＣ：ＯＫＴ４）、ＣＤ８（ＰＥ－Ｃｙ７：ＳＫ１）、ＰＤ－１（ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５：ＥＨ１２．２Ｈ７）、ＣＤ１９（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ：ＨＩＢ１９．１１）およびＣＤ１４（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ：ＨＣＤ１４）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＭＡＧＥＤ４Ｂ５０１－５０９四量体（ＰＥ）からなる。ＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補償のために用いて、ＦＡＣＳＣａｎｔｏでフローサイトメトリーを実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。このデータは、ＨＬＡ－２四量体の特異性を確認する。理由は、ＨＬＡ－２陰性患者（ＨＮ３６６）では、それが機能しないためである。ＨＬＡ－２陽性患者（ＨＮ３６４）では、このデータは、Ｔ細胞の抗原感受性を確証する。 頭頸部癌を標的にするためのＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１標的化ＤＮＡワクチンのアセンブリ。ｐＤＯＭ（対照）、単一抗原ｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４ＢおよびｐＤＯＭ－ＦＪＸ１を送達するワクチン、ならびに両抗原が同時に存在するｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１ワクチンのワクチン構築物の図である。破傷風毒素遺伝子のＤＯＭフラグメントおよび目的遺伝子（ＭＡＧＥＤ４ＢまたはＦＪＸ１）を７個のアミノ酸リンカー１（ＡＡＡＧＰＧＰ）を使って連結した。融合遺伝子をＣＭＶ／Ｔ７デュアルプロモーターとＢＧＨポリ（Ａ）部位との間に挿入した。ｍｕｓ ＩｇＨシグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＦＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードするリーダー配列を構築物のＮ末端に挿入し、分泌の効力を高めた。目的遺伝子が融合ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１抗原をコードしている場合は、５個のアミノ酸リンカー２個（ＧＳＧＳＧ）を適用してこれらの２個の遺伝子を連結した。ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を用いてＤＯＭ１をｐｃＤＮＡ３．０ベクターに挿入し、ｐＤＯＭベクターを生成した。ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＦＪＸ１またはそれらの目的融合体のための遺伝子をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限酵素部位でｐＤＯＭベクター中に挿入し、ＤＮＡワクチンを生成した。本明細書で使用される場合、ベクターの用語中のｐは、プラスミドベクターまたは構築物に関連する。 ３群の５～６匹の非担腫瘍ＨＨＤ（ヒトＨＬＡ－Ａ２アレルを遺伝子導入）マウスを５０マイクログラムのｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（Ａ）、ｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１（Ｂ）またはｐ．Ｄｏｍ（Ｃ）のそれぞれを１日目にワクチン接種し、続けて、２２日目に、同じＤＮＡワクチンの追加抗原注射を電気穿孔により接種した。それらの免疫原性をＩＦＮγ エリスポットにより評価した。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、各標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、各抗原（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）の全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる。Ｐ３０ペプチドをワクチン接種の標準として使用した。それぞれのペプチドを９０％純度で、ＪＰＴ、Ｇｅｒｍａｎｙで生成した。エリスポットＩＦＮγのために、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。このデータは、ＨＡＬ－Ａ２遺伝子導入マウス中の抗原の免疫原性を確認する。 ＤＮＡワクチンは、単独で、および抗ＰＤ１との組み合わせで治療薬として効果的である。図９Ａは、治療戦略を示す。図で示したように、各群のマウス（６～１０匹）を、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方を発現しているＢ１６腫瘍でチャレンジし、その後、混合ＤＮＡワクチン（ＤＶ；ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂおよびｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１；１００μｌの生理食塩水中の１００μｇ／マウスの５０μｇを各脚部の筋肉内に注射した）、抗ＰＤ１抗体（２００μｇ／注射、０．５ｍＬの腹腔内投与）またはＤＶおよび抗ＰＤ－１の組み合わせで治療した。対照群は、対照ＩｇＧ＋ｐＤＯＭ（ベクターバックボーン）を投与された。腫瘍サイズを２～３日毎に測定し、各群の腫瘍サイズを図９Ｂに示す。図９Ｃ（平均＋ｓ．ｅ．ｍ）：エリスポットアッセイは、ＤＶおよびＤＶ＋α－ＰＤ１群で、特異的にＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的免疫応答を示したが、α－ＰＤ１または対照群では示されなかった：ワクチン接種動物から単離した脾細胞は、全抗原配列オーバーラッピングＭＡＧＥＤ４Ｂペプチドライブラリー（一緒にプールした１８３個のペプチド１５マー１１ａａの重複部分）で再刺激時にＩＦＮγを分泌できる。図９Ｄは、図９Ｃと同様であるが、全抗原オーバーラッピングＦＪＸ１ペプチドライブラリーを使用した。このデータは、単剤療法（ワクチン単独）および併用療法（ワクチン＋抗ＰＤ１）の相乗的効果の腫瘍進行に対する明確な影響を示す。特に、図９Ｃおよび９Ｄは、ワクチン接種が担腫瘍マウスの抗原特異的Ｔ細胞を増殖する－これらのマウスは腫瘍上の抗原に曝露されたが良好な免疫応答を開始できなかったことを示す。これは、ワクチンが免疫応答を改善でき、免疫系に腫瘍を効果的に「曝露する」という主張を裏付ける。 ＤＮＡワクチンは腫瘍増殖の抑制に効果的である。図１０Ａは、治療戦略、腫瘍体積の減少および作用機序を示す。図で示したように、各群のマウス（８～１２匹）を、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両方を発現している腫瘍でチャレンジし、その後、ＤＮＡワクチン（ＤＶ；ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂおよびｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１；１００μｌの生理食塩水中の１００μｇ／マウスの５０μｇを各脚部の筋肉内に注射した）で治療した。対照群は、ｐＤＯＭベクターバックボーンを投与された。腫瘍サイズを２～３日毎に測定し、各群の腫瘍サイズを図１０Ａに示す（平均＋ｓ．ｅ．ｍ）。図１０（Ｂ）は、細胞の写真である。右側パネルの腫瘍の染色は、ＤＮＡワクチンでワクチン接種後のＴ細胞浸潤を示し、左側パネルは、不十分な浸潤のｐＤＯＭ対照腫瘍を示す（ヘマトキシリン＆エオシン染色、元の倍率：ｘ１０対物レンズ）。図１０Ｃは、フローサイトメトリー分析の結果を示し、ワクチン接種動物から改修した腫瘍中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫細胞の増加を対照動物と比較して示す。重要なことには、チェックポイントタンパク質ＰＤ１が、ワクチン接種動物から回収したＣＤ４＋およびＣＤ８＋免疫細胞中で顕著に上昇していることが明らかである。この試験は、高用量の腫瘍細胞を使用して、癌の進行を加速し、従って、特に、高悪性度の腫瘍モデルである。この場合も、ワクチン接種が担腫瘍マウスのＴ細胞を増殖し、それらに曝露されたにもかかわらず、腫瘍に対する良好な免疫応答を生じさせることができなかったことを示す。これは、ワクチンが免疫応答を改善でき、免疫系に腫瘍を効果的に「曝露する」という主張を裏付ける。 図１１Ａ-Ｂ。ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１標的化ＤＮＡワクチンの設計に不可欠な成分の実証両図では、治療戦略が示される。５匹の非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１、ｐＳＰ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１（ＤＯＭなし）、ｐＤｏｍ－ＦＪＸ１、ｐｎｏＳＰＤＯＭ－ＦＪＸ１（リーダー／ＳＰなし）のそれぞれ５０μｇで１日目にワクチン接種し、続けて、８日目に、同じＤＮＡワクチンの追加抗原注射により接種した。それらの免疫原性をＩＦＮγ エリスポットにより評価した。２２日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、各標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、各抗原（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）の全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる。ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドをワクチン接種の対照として使用した。図１１Ａは、ＤＯＭ有りおよび無しの場合のデータを示す。ＤＯＭ配列は、Ｔ細胞の誘導のために不可欠であることが示され、従って、ＭＡＧＥＤ４Ｂに対する応答を改善した。図１１Ｂは、リーダー配列の有りおよび無しの場合のデータを示す。分泌のために、コードされた構築物の小胞体への発現を指示するリーダー配列もＴ細胞免疫を誘導するために不可欠である。それぞれのペプチドを９０％純度で、ＪＰＴ、Ｇｅｒｍａｎｙで生成した。エリスポットＩＦＮγのために、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。このデータは、一般に、ＦＪＸ１応答がリーダー配列の含有により改善されることを示す。 融合抗原として直列形態の両抗原を標的化するＤＮＡワクチンは、単一抗原標的化ＤＮＡワクチンと同等のＴ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。３群の５匹の非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ｐＤＯＭ－ＦＪＸ１またはｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＦＪＸ１のそれぞれ５０μｇで１日目にワクチン接種し、続けて、８日目に、同じＤＮＡワクチンの追加抗原注射により接種した。それらの免疫原性をＩＦＮγ エリスポットにより評価した。２２日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、各標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、各抗原（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）の全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる。ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドをワクチン接種の対照として使用した。両抗原を標的化するＤＮＡワクチンは、類似の特異的Ｔ細胞応答を誘導する能力を示した。Ｐ値は、マン・ホイットニー分析により、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０を用いて計算した。エリスポットＩＦＮγのために、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。 癌を標的とする代替ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１標的化ＤＮＡワクチンのアセンブリｐＤＯＭ（対照）、ｐＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１、ｐＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１－ＭＩＴＤ、ｐＰＶＸＣＰ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１およびｐＭＩＰ３α－ＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１のワクチン構築物の図。代替融合パートナーは、ＭＩＴＤ、ＰＶＸＣＰ、およびＭＩＰ３αを含む。ＭＩＴＤ（１６５ｂｐ）は、ＭＨＣＩ（ＨＬＡ－Ａ２）トラフィッキングシグナルをコードする。ＰＶＸＣＰ（７３２ｂｐ）は、ジャガイモウィルスＸコートタンパク質をコードする。ＭＩＰ３α（２５２ｂｐ）は、マクロファージ炎症性タンパク質３アルファをコードする。ＭＩＴＤ、ＰＶＸＣＰおよびＭＩＰ３α遺伝子は、ヒトコドン使用頻度で最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に発注した。遺伝子（融合パートナーのある場合とない場合）をＣＭＶ／Ｔ７デュアルプロモーターとＢＧＨポリ（Ａ）部位との間に挿入した。マウスＩｇＨシグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＦＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードするリーダー配列を構築物のＮ末端に挿入し、分泌の効力を高めた。融合パートナーおよび目的遺伝子（ＭＡＧＥＤ４ＢまたはＦＪＸ１）を７個のアミノ酸リンカー１（ＡＡＡＧＰＧＰ）を使って連結した。ＭＩＴＤを除いて、全ての他の融合パートナーを目的の遺伝子の上流に融合した。ＭＩＴＤを目的の遺伝子の下流に加えた。ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＦＪＸ１またはそれらの目的融合体のための遺伝子をＮｏｔＩ、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位でｐｃＤＮＡ３ベクター中に挿入し、ＤＮＡワクチンを生成した。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対するＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的Ｔ細胞応答はＤＮＡワクチンにより誘導された。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、５０μｇのｐＳＰ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（５匹のマウス）、５０μｇのｐＳＰ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＭＩＴＤ（５匹のマウス）、５０μｇのｐＰＶＸＣＰ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（５匹のマウス）、および５０μｇのｐＭＩＰ３ａ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（５匹のマウス）で、１日目および８日目にワクチン接種した。２２日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＭＡＧＥＤ４Ｂのオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）は、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールした）。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、各群におけるＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰに対する応答をそれぞれ示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定した（Ｉｒｒ ＯＰＰ、赤色点線として示す）。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。（Ｉｒｒ＝無関係な）。このデータは、ＭＡＧＥＤ４Ｂの応答が、完全長タンパク質から生成でき、応答は、種々のヘルパーモチーフとの融合により改善できることを示す。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対するＦＪＸ１特異的Ｔ細胞応答はＤＮＡワクチンにより誘導された。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、５０μｇのｐＳＰ－ＦＪＸ１（５匹のマウス）および５０μｇのｐＳＰ－ＦＪＸ１－ＭＩＴＤ（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチン接種は、１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）投与された。１４日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、各群におけるＦＪＸ１ ＯＰＰに対する応答をそれぞれ示す。ｐＳＰ－ＦＪＸ１－ＭＩＴＤは、全ての群中で最強の応答を誘導した。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値（Ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ）および応答を示す。結果は、刺激のない場合のスポットの数を減算することにより正規化した。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定した（Ｉｒｒ ＯＰＰ、赤色点線として示す）。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。１つの実験のみ示したが、理由は、パンデミックによるラボのシャットダウンによりこれらの実験の反復が制限されたためである。 全ＭＡＧＥＤ４Ｂアミノ酸配列および３種の短縮化フラグメントのアミノ酸配列マップ。メラノーマ関連抗原科のメンバーとして、ＭＡＧＥＤ４Ｂは、ＭＡＧＥ共通相同ドメインＭＡＧＥＤ４Ｂ ４１２－６８２（配列番号３）を含む。確定ＨＬＡ－Ａ２エピトープＲＬＳＬＬＬＶＩＬ（ＭＡＧＥＤ４Ｂ ５０１－５０９）は、相同ドメインの内部に位置する。３個の短縮化ＭＡＧＥＤ４Ｂ配列は、次のように設計された：１）ＭＡＧＥＤ４Ｂ配列種類（ｖ）１は、相同ドメインを含まないがＲＬＳＬＬＬＶＩＬを含む；２）ＭＡＧＥＤ４Ｂ．ｓｖ２は、ＲＬＳＬＬＬＶＩＬを含む相同ドメインの後半（ＭＡＧＥＤ４Ｂ ５１０－６８２）を保持する；３）ＭＡＧＥＤ４Ｂ．ｓｖ３は、ＲＬＳＬＬＬＶＩＬを含む相同ドメインの前半（ＭＡＧＥＤ４Ｂ ４１２－５００）を保持する。従って、これらは全て、ＭＡＧＥＤ４Ｂの免疫原性フラグメントであり、本明細書で記載のワクチンでの使用に好適する。 図１６で詳述したＭＡＧＥＤ４Ｂのフラグメントは、免疫原性であることが示される。治療戦略が示される：４群の５匹の非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５０μｇのｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（完全長）、ｐ．ＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ１、ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ２、ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ３のそれぞれを１日目にワクチン接種し、続けて、２２日目に、同じＤＮＡワクチンの追加抗原注射により接種した。それらの免疫原性をＩＦＮγ エリスポットにより評価した。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＭＡＧＥＤ４Ｂのオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールした）。破傷風ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドをワクチン接種の対照として使用した。ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ３は、ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ（完全長）、ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ１、およびｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ２よりも有意に強力な特異的Ｔ細胞応答を誘導した。ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ１またはｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂｓｖ２のどちらもｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂより良好に機能しなかった。Ｐ値は、１元配置分散分析により、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０を用いて計算した。エリスポットＩＦＮγのために、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。従って、ＭＡＧＥ相同ドメインは、ワクチンの活性に影響を与えることなく、全体または一部を除去できる。 ワクチン接種実験に使用される閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））のベクターマップ。示されるのは、ｄｂＤＮＡの閉止端の配列である（プロテロメラーゼ標的配列ＴｅｌＲＬ由来のＴｅｌＲまたはＴｅｌＬ）－これらは、一緒に全体配列を形成する標的配列の一部である。４種の構築物構成は、以下の通り：ベーシック０（最小限の構築物構成－ＣＭＶプロモーター、ＤＯＭおよび抗原融合体、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列）他の全ての構築物がこれをベースにする。追加の他の構築物は次の通り：ベーシック１（プラスＴＥ：トリプルエンハンサー）；ＳＶ４０ ｅｎｈ（プラスＴＥおよびＳＶ４０エンハンサー配列）；ＣｐＧ（プラスＴＥおよびＣｐＧモチーフを有する配列の一部）。これらは、本明細書で記載のワクチン接種実験で使用される。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的Ｔ細胞応答は、ドギーボーン（ＤＢ）およびプラスミドＤＮＡワクチンにより誘導される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、２５μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ（５匹のマウス）および２５μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂプラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチン接種は、１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。電気穿孔（ＥＰ）は、Ｉｃｈｏｒ ＥＰ ｄｅｖｉｃｅによるＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ）を用いて、イソフルランで筋肉内麻酔したマウスに対し実施された。１４日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＭＡＧＥＤ４Ｂのオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。破傷風ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドを適正なワクチン接種の対照として使用した。この実験では、ＦＪＸ１ ＯＰＰは、Ｉｒｒペプチド対照としての役割を果たした。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、各群におけるｐ３０およびＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰに対する応答をそれぞれ示す。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値および応答を示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定した（Ｉｒｒ ＯＰＰ、赤色点線として示す）。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。 ＦＪＸ１特異的Ｔ細胞応答は、ドギーボーン（ＤＢ）およびプラスミドＤＮＡワクチンにより誘導された。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、２５μｇのＤＢ－ＤＯＭ－ＦＪＸ１－ＣＯ（５匹のマウス）および２５μｇのｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。１４日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）は、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。破傷風ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドを適正なワクチン接種の対照として使用した。この実験では、ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰは、Ｉｒｒペプチド対照としての役割を果たした。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、各群におけるｐ３０ペプチドおよびＦＪＸ１ ＯＰＰに対する応答をそれぞれ示す。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値および応答を示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定した（Ｉｒｒ ＯＰＰ、赤色点線として示す）。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。 ｄｂＤＮＡ ＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４ＢおよびｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＤＮＡワクチンは、特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ（５匹のマウス）、１０μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯベーシック１（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＳＶ４０（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＣｐＧ（５匹のマウス）、および１０μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂプラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目および２１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。１２日目に採取した５０μｌの血液試料のインビトロ刺激後にＦＡＣＳを実施した。最初に、採取血を赤血球可溶化バッファー（ＲＢＣ溶解バッファー、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理した白血球を１μＭのＭＡＧＥＤ４Ｂオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ；９６ウェルプレート中に、１μｌの抗ＣＤ１０７ａ－ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１０７ｂ－ＦＩＴＣ（両方ともＢｉｏＬｅｇｅｎｄより）を添加）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３－ＰＥ、抗ＣＤ４－ＰＥｃｙ７、抗ＣＤ８－ＡＰＣｃｙ７、抗ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－ＡＰＣ、抗ＰＤ１－ＰｅｒＣＰｃｙ５（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄより）、およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＯＰＰは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールした）。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーを実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。応答をＦＡＣＳを用いて評価した。ＣＤ１０７ａ／ｂ＋ＰＤ－１＋ダブルポジティブＴ細胞および４－１ＢＢ＋ＰＤ－１＋ダブルポジティブＴ細胞は、細胞傷害性およびＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰ特異的活性化集団をそれぞれ示す。ｐＤＯＭ、ＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ、ＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯベーシック１、ＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＳＶ４０、ＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＣｐＧおよびｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂプラスミドでそれぞれワクチン接種した群からのＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰに対する応答は、この棒グラフにまとめた。中央値＋四分位間値およびそれぞれのマウスの応答を示す。Ｐ値はクラスカル・ワリス検定により計算した。このデータは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原が異なる構成中に送達でき、その場合でも抗原経験ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導することを示している。ＣＯは、コドン最適化配列である。 ドギーボーンＤＯＭ－ＦＪＸ１およびｐＤＯＭ－ＦＪＸ１ ＤＮＡワクチンは、特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯベーシック１（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＳＶ４０（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＣｐＧ（５匹のマウス）、および１０μｇのｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目および２１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。１２日目に採取した５０μｌの採取血血液試料のインビトロ刺激後にＦＡＣＳを実施した。最初に、赤血球可溶化バッファー（ＲＢＣ溶解バッファー、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理した５０μｌの採取血を使用した。白血球を１μＭのＦＪＸ１オーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ；９６ウェルプレート中、同時に、１μｌの抗ＣＤ１０７ａ－ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１０７ｂ－ＦＩＴＣ（両方ともＢｉｏＬｅｇｅｎｄより）を添加）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３－ＰＥ、抗ＣＤ４－ＰＥｃｙ７、抗ＣＤ８－ＡＰＣｃｙ７、抗ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－ＡＰＣ、抗ＰＤ１－ＰｅｒＣＰｃｙ５（全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄより）、およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。オーバーラッピングペプチドプールは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩでフローサイトメトリーを実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。応答をＦＡＣＳを用いて評価した。ＣＤ１０７ａ／ｂ＋ＰＤ－１＋ダブルポジティブＴ細胞および４－１ＢＢ＋ＰＤ－１＋ダブルポジティブＴ細胞は、細胞傷害性およびＦＪＸ１ ＯＰＰ特異的活性化集団をそれぞれ示す。ｐＤＯＭ、ＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ、ＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯベーシック１、ＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＳＶ４０、ＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＣｐＧおよびｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミドでそれぞれワクチン接種した群からのＦＪＸ１ ＯＰＰに対する応答は、この棒グラフにまとめた。中央値＋四分位間値およびそれぞれのマウスの応答を示す。Ｐ値はクラスカル・ワリス検定により計算した。このデータは、ＦＪＸ１抗原が異なる構成中に送達でき、その場合でも抗原経験ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導することを示している。ＣＯは、コドン最適化配列である。 ドギーボーンＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４ＢおよびｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＤＮＡワクチンは、特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ（５匹のマウス）、１０μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯベーシック１（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＳＶ４０（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＣｐＧ（５匹のマウス）、および１０μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂプラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目および２１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＭＡＧＥＤ４Ｂのオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）を使用して、応答する特異的Ｔ細胞を刺激した。ＯＰＰは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールした）。破傷風ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドをＤＯＭヘルパー配列に対するＣＤ４応答の誘導を評価するために使用した。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、ｐ３０ペプチド、Ｉｒｒ ＯＰＰ（ＦＪＸ１ ＯＰＰ）、およびＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰに対する応答を示す。ＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯベーシック０は、全ての群中で最強の応答を誘導した。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値（Ｉｎｔｅｒｑｕａｒｔｉｌｅ）および応答を示す。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定し（Ｉｒｒ ＯＰＰ）、点線として示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。スポット数／１０６細胞を示す。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。このデータは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原が異なる構成中に送達でき、その場合でも抗原経験ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導することを示している。ＣＯは、コドン最適化配列である。 ｄｂＤＮＡ（ＤＢ）ＤＯＭ－ＦＪＸ１およびプラスミド（ｐ）ＤＯＭ－ＦＪＸ１ ＤＮＡワクチンは、特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯベーシック１（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＳＶ４０（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＣｐＧ（５匹のマウス）、および１０μｇのｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目および２１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）は、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。破傷風ＤＯＭ由来のＰ３０ペプチドおよびＭＨＣＩＩペプチドをＤＯＭヘルパー配列に対するＣＤ４応答の誘導を評価するために使用した。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフは、ｐ３０ペプチド、Ｉｒｒ ＯＰＰ（ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰ）、およびＦＪＸ１ ＯＰＰに対する応答を示す。全ての群が類似の結果であった。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値および応答を示す。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定し（Ｉｒｒ ＯＰＰ）、点線として示す。カットオフを２ｘバックグラウンドとして設定し（Ｉｒｒ ＯＰＰ）、点線として示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。スポット数／１０６細胞を示す。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。このデータは、ＦＪＸ１が複数の構成によりに送達でき、抗原特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を誘導できることを示している。 ｄｂＤＮＡ（ＤＢ）ＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂおよびプラスミド（ｐ）ＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＤＮＡワクチンは、特異的Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、２５μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ（６匹のマウス）、２５μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯベーシック１（６匹のマウス）、２５μｇのＤＢ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ－ＣＯ ＳＶ４０（６匹のマウス）、および２５μｇのｐＤＯＭ－ＭＡＧＥＤ４Ｂプラスミド（６匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目および２１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＭＡＧＥＤ４Ｂのオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）を使用して、応答する特異的Ｔ細胞を刺激した。ＯＰＰは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１８３個のそれぞれのペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールした）。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＯＰＰに対する応答を示す。中央値＋四分位間値およびそれぞれのマウスを示す。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。Ｐ値はマン・ホイットニー検定により計算した。 ｄｂＤＮＡ（ＤＢ）ＤＯＭ－ＦＪＸ１およびプラスミド（ｐ）ＤＯＭ－ＦＪＸ１ ＤＮＡワクチンは、特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導する。治療戦略が示される。１日目および２１日目に、非担腫瘍Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯベーシック１（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＳＶ４０（５匹のマウス）、１０μｇのＤＢ－ＦＪＸ１－ＣＯ ＣｐＧ（５匹のマウス）、および１０μｇのｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ＥＰは、筋肉内ＴｒｉＧｒｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＤＳ－ＩＭ；Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、イソフルランで麻酔したマウスに対し実施された。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種し、ＦＪＸ１のオーバーラッピングペプチドプールを使用して、応答する特異的Ｔ細胞を検出した。オーバーラッピングペプチドプールは、全体配列に対し、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなる（１０７個のそれぞれのペプチドをＦＪＸ１のためにプールした）。ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによるＩＦＮγエリスポットキットを、製造業者のプロトコルに従って使用した。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポットを、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。値は、応答から、刺激のない場合のスポットの数を減算した値とした。グラフは、ＦＪＸ１ ＯＰＰに対する応答を示す。それぞれのマウスの中央値＋四分位間値および応答を示す。 癌関連線維芽細胞 （ＣＡＦ）は、ＭＡＧＥＤ４Ｂを発現する。ＨＮＳＣＣ症例の免疫組織化学的分析であり、癌細胞および癌関連線維芽細胞中のＭＡＧＥＤ４Ｂ発現を示し、後者は、強力な発現を示す。抗ＭＡＧＥＤ４Ｂモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｇ１２；ｓｃ－３９３０５９）を１：５０希釈でＨＮＳＣＣ組織に対し使用した。染色は、ＤＡＫＯ自動免疫染色装置（Ｋ４０６５）で実施した。Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ総合病院（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）のＰａｔｈｏｌｏｇｙ ｌａｂで入手した６種の個別のＨＮＳＣＣ症例を提示する。 図２８Ａ-Ｂ。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、ＭＡＧＥＤ４Ｂを発現する。図２８Ａ：ＨＮＳＣＣ患者試料のＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ分析から生成した公的に入手可能な単細胞ＲＮＡ配列解析（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）データを用いて、異なる細胞型にわたるＭＡＧＥＤ４Ｂ発現を評価した。細胞系統は、Ｐｕｒａｍ ｅｔ ａｌＣｅｌｌ．２０１７ Ｄｅｃ １４；１７１（７）：１６１１－１６２４に記載のように特定した。図２８Ｂ：線維芽細胞亜集団を、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージ（ｖ３．２）に実装された、教師なし階層的クラスタリング（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）により特定した（Ｂｕｔｌｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｎ；３６（５）：４１１－４２０）。線維芽細胞亜集団マーカーＭＣＡＭ、ＡＣＴＡ２およびＰＯＳＴＩＮを、ウィルコクソン検定を用いて特定し、以前に肺癌線維芽細胞亜集団で特定し、異なる亜集団に注釈をつけたものと比較した（ＣＪ Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０６．０８．１３４２７０）。 ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の両抗原は、結腸、前立腺、直腸、乳、肺および上咽頭癌で強力に発現される。標的タンパク質の発現レベルは、抗ＭＡＧＥＤ４Ｂ（１：１００；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号＃ＨＰＡ００３５５４）抗ＦＪＸ１（１：２００；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号＃ＨＰＡ０５９２２０）抗体を用い、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ Ｌｉｎｋ Ｓｙｓｔｅｍ ＨＲＰ（ＤＡＢ＋）キット（ＤＡＫＯ、カタログ番号＃Ｋ４０６５）で以前に記載のように処理して、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により検出した。
配列
有望なＤＮＡワクチン構成成分の配列、またはコード配列を以下に記載する。本発明のＤＮＡワクチンは、以下に提供される核酸配列またはそのバリアントのいずれか１つを含み得る。代わりにまたは追加して、本発明のＤＮＡワクチンは、以下に提供されるアミノ酸配列またはそのバリアントのいずれか１つをコードする核酸を含み得る。
図７で示すようにアセンブルされたＤＮＡワクチン中の遺伝子のアミノ酸配列：

Figure 2022553192000002
Figure 2022553192000003
Figure 2022553192000004
Figure 2022553192000005
Figure 2022553192000006
Figure 2022553192000007
Figure 2022553192000008
Figure 2022553192000009
Figure 2022553192000010
Figure 2022553192000011
Figure 2022553192000012
Figure 2022553192000013
Figure 2022553192000014
Figure 2022553192000015
Figure 2022553192000016
Figure 2022553192000017
Figure 2022553192000018
Figure 2022553192000019
本発明は以下を定める：
Ａ．タンパク質ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１、またはそのバリアントをコードし、および破傷風毒素の免疫原性フラグメントをさらにコードする核酸を含む癌ワクチン。
Ｂ．ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質が、配列番号３の配列、またはそのバリアントを含むか、またはそれからなる、項目Ａに記載の癌ワクチン。
Ｃ．ＦＪＸ１タンパク質が、配列番号４の配列、またはそのバリアントを含むか、またはそれからなる、項目Ａまたは項目Ｂに記載の癌ワクチン。
Ｄ．破傷風毒素の免疫原性フラグメントが、破傷風毒素のｐ３０ ＭＨＣ ＩＩエピトープを含むか、またはそれからなる、項目Ａ～Ｃのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｅ．破傷風毒素の免疫原性フラグメントが、ＤＯＭを含むか、またはそれからなる、項目Ａ～Ｄのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｆ．ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１抗原が、単一融合タンパク質としてコードされる、項目Ａ～Ｅのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｇ．破傷風毒素の免疫原性フラグメント、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１が、単一融合タンパク質としてコードされる、項目Ａ～Ｆのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｈ．リンカー残基が、破傷風毒素の免疫原性フラグメント、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１の抗原の１種もしくは複数、または全ての間に提供される、項目Ａ～Ｇのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｉ．核酸が、分泌効力を高めるためのシグナルペプチドをさらにコードする、項目Ａ～Ｈのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｊ．核酸が、１種または複数のプロモーターをさらにコードする、項目Ａ～Ｉのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｋ．核酸が、ポリＡ転写終結配列をさらにコードする、項目Ａ～Ｊのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｌ．核酸が、配列番号２～４をコードする配列、またはそのバリアントを含む、項目Ａ～Ｋのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｍ．核酸が、配列番号１～６をコードする配列を含む、項目Ａ～Ｌのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｎ．核酸が、配列番号１２、１３または１４をコードする配列を含むか、またはそれからなる、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の癌ワクチン。
Ｏ．項目Ａ～Ｎのいずれか１項に記載の癌ワクチンを含む、組成物。
Ｐ．薬物として使用するための、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の癌ワクチン、または項目Ｏに記載の組成物。
Ｑ．対象の癌の治療または予防に使用するための、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の癌ワクチン、または項目Ｏに記載の組成物。
Ｒ．対象の癌の治療または予防方法であって、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の癌ワクチン、または項目Ｏに記載の組成物の対照への投与を含む、方法。
Ｓ．治療または予防される癌が、口腔癌および／または中咽頭癌である、項目Ｑに記載の使用のための癌ワクチンまたは組成物、または項目Ｒに記載の治療または予防方法。
Ｔ．癌ワクチンまたは組成物が、チェックポイント阻害剤の投与と組み合わせて対象に使用される、項目Ｐ、ＱまたはＳのいずれか１項に記載の使用のための癌ワクチンまたは組成物、または項目ＲもしくはＳに記載の治療または予防方法。
Ｕ．チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４結合分子、または抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４結合分子をコードする核酸を含む、項目Ｔに記載の使用のための癌ワクチンまたは組成物、または項目Ｔに記載の方法。
Ｖ．癌の治療または予防のためのキットであって、
－項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の癌ワクチン；および
－抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ４結合分子などのチェックポイント阻害剤、を含むキット。
Ｗ．癌の治療または予防のためのキットであって、
－核酸がＭＡＧＥＤ４Ｂをコードする、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の第１の癌ワクチン；
－核酸がＦＪＸ１をコードする、項目Ａ～Ｍのいずれか１項に記載の第２の癌ワクチン；および任意選択で、
－抗ＰＤ１結合分子などのチェックポイント阻害剤、を含むキット。
本発明は広範に示されてきたが、本明細書に含まれる図で得られ、示されたデータのための材料および方法は以下で提供され、治療戦略などの事項に関する特定の情報は、図および凡例に含まれている。ここで提供される方法およびデータは、本発明を裏付けるためのものであり、例示的にいくつかの代替物ワクチン構築物などを示す。
実施例
実施例１：ＨＰＶ－ｖｅ ＨＮＳＣＣ中のＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ抗原を標的にするＤＮＡワクチンの免疫原性の評価
ＨＰＶ非関連ＨＮＳＣＣ患者の標的抗原発現および既存のＴ細胞応答
それぞれの腫瘍ミュータノームに基づく患者特異的ワクチンの開発に対する興味深い将来性が存在するが、このような手法の高価であること、および技術的困難性は、たとえ成功しても、ほとんどの患者に利益をもたらす見込みはありそうにない。汎用癌ワクチンの製造のために患者間で共有される共通腫瘍抗原の特定は、安価で幅広く利用可能なＯＳＣＣの治療を提供することになろう。異なる型のＴＡＡの内で、癌／精巣（ＣＴ）抗原は、極めて有望な治療標的であり、ＣＴ抗原に対する細胞性および液性免疫応答は、癌患者で高頻度に観察され、ＣＴ抗原発現と腫瘍免疫浸潤物の細胞溶解活性との間には相関が存在する。ＣＴ抗原の免疫原性および癌特異性は、それらを癌免疫療法のための優先的標的にし、それらの治療作用を種々の臨床設定において試験した。ＣＴ抗原ワクチンは通常、耐容性良好であり、現在、それらの治療効力を評価する多数の癌ワクチン接種試験が進行中である。我々は、ＯＳＣＣで高頻度に発現されることが分かっている２種の癌精巣抗原ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１を選択した。その後、我々は、これらのデータを、ＣＧＡ（癌ゲノムアトラス）を用いて、データセットの分析にまで拡張し、その発現を確認した。全体として、２種の抗原は、ＯＳＣＣ症例の９６％においてＲＮＡレベルで発現されている。さらに、我々は、口腔異形成およびＯＳＣＣ症例における両抗原のタンパク質レベルでの発現を確証し（１０／１０が陽性であった；各状態５症例）、非悪性口腔粘膜中では発現はなかった（図２）。健康な組織のタンパク質レベルでの発現データは、ＨＬＡ－Ａ２四量体（現時点でＭＡＧＥＤ４Ｂに対してのみ利用可能である）および各抗原の全アミノ酸配列に対するオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）を用いたＨＰＶ非関連ＨＮＳＣＣの患者における抗原に対する既存の免疫の調査と類似であった。これらは、増殖させた腫瘍浸潤リンパ球を用いて血液および腫瘍の両方で測定された。循環ＭＡＧＥＤ４Ｂ四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、同様に類似の頻度で四量体陽性である２／２増殖ＴＩＬを有する４／６ ＨＬＡ－Ａ２患者（総ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．０４～０．１％）（図３）で観察した（図４Ａおよび図５）。より高レベルのＭＡＧＥＤ４Ｂ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞（５～１０倍）をＨＬＡ－Ａ２陰性ＨＬＡ－Ａ１陽性ＴＩＬ試料中でＯＰＰを用いて検出し、ＨＬＡ－Ａ２制約を超える反応性を示した（図４Ｂ）。従来、ＦＪＸ１に対して、ＣＤ８ Ｔ細胞の反応性を増殖ＴＩＬ試料でのみ、ＯＰＰを用いて評価し、ＭＡＧＥＤ４Ｂ ＣＤ８ Ｔ細胞と共存するＨＬＡ－Ａ１患者中のＣＤ８の反応性を示した（図４Ｂ）。患者のデータは、両抗原の強い免疫原性を示し、ＭＡＧＥＤ４Ｂの場合で極めて顕著であった。
実施例２：ＤＮＡワクチン効力／免疫原性に関する前臨床データ
ワクチン設計
ＨＰＶ＋癌では、免疫原性ウィルス抗原をコードするＤＮＡワクチンは、大きく進歩し、子宮頸部腫瘍のランダム化２ｂ相臨床試験の最近の結果は、疾患の病理組織学的退行を示す。ＤＮＡワクチン接種のための我々の手法は、破傷風毒素ドメイン（Ｄｏｍ）の免疫原性配列の存在下で、腫瘍特異的ペプチドまたは抗原を送達することであった。ワクチン設計は、癌患者において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最適誘導のための結合ＣＤ４ Ｔ細胞を提供することを目標としており、免疫寛容を破壊する効力の高い戦略である。第２相臨床データは、ＤＮＡワクチン接種が、ワクチン後に検出され、臨床的有用性を示す腫瘍抗原（癌胎児抗原；ＣＥＡ）に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答により、腫瘍組織の末梢性免疫寛容を克服できることを示唆している。従って、我々は、ＤＯＭベース設計を、完全長ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１抗原をコードするＤＮＡワクチン（ｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４ＢＦＬおよびｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１ＦＬ）を生成するために適用した。ここで、我々は、完全長抗原設計が、より広範な集団のカバー率を達成でき、それぞれのＨＬＡアレル（ＨＬＡ－Ａ２）を標的化することに焦点を置かないように最適化した。
マウスモデル
免疫原性のために、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入マウスＨＨＤを腫瘍チャレンジなしで使用した。Ｂ１６／Ｆ１０に、ヒトＨＬＡ－Ａ２、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび、ＦＪＸ１構築物を遺伝子導入し、ＨＮＳＣＣにおけるこれらの抗原の発現を模倣し、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入ヒト化マウスモデル（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ）で使用される。腫瘍を皮下に投与した。
各ワクチンの免疫原性を確認し、続けて、単一用量のワクチンを電気穿孔により非担腫瘍マウスに投与した（図７）。各抗原の全体配列をカバーするオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）（ＭＡＧＥＤ４Ｂ １８３ペプチド；ＦＪＸ１ １０７ペプチド）を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答を測定した。
腫瘍チャレンジ実験では、腫瘍が３日目に触知できる（サイズ）場合に、マウスにワクチン接種した。ＤＮＡワクチンは、抗ＰＤ１（インビボＭａｂ抗マウスＰＤ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌからのＲＭＰ１－１４、ＢＥＯ１４６）抗ＰＤ１は対照薬の役割を果たす）と共にまたはそれなしに、３週間隔で２回、混合物として投与した。実験は、ＯＰＰを上記のように用いて免疫原性測定と並行実施した。ＤＮＡワクチンは、対照ＤＮＡワクチン（ｐ．Ｄｏｍバックボーン）に対する抗ＰＤ１と類似のレベルで腫瘍増殖を低減／抑制でき、一緒に組み合わせると、顕著な相乗作用を生ずる（図９Ｂ）。データは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的Ｔ細胞の誘導および抗ＰＤ１と組み合わせ時のＭＡＧＥＤ４Ｂ特異的Ｔ細胞の増加の実証に対応した（図９Ｃ）まとめると、前臨床データは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ／ＦＪＸ１を標的化したＤＮＡワクチンが、これらの抗原を発現している腫瘍の増殖を抑制する大きな潜在能力を有し、これは、抗ＰＤ１と組み合わせることにより、さらに強化できることを実証している。
実施例３：代替遺伝子融合パートナー－ヘルパーモチーフ－ＭＩＴＤ、ＰＶＸＣＰ、ＭＩＰ３α
標的抗原のＣ末端に結合させたＭＨＣクラスＩトラフィッキングシグナル（ＭＩＴＤ）は、ＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩエピトープの両方の提示を促進し、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のポリエピトープ増殖に繋がることが示された（Ｋｒｅｉｔｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０（１）：３０９－１８）。
ＰＶＸＣＰ（ジャガイモウィルスＸコートタンパク質）は、ヘルパー配列であり、ＤＯＭヘルパー配列に類似の結合Ｔ細胞ヘルプの機序を介して融合癌抗原に対するＴ細胞応答の誘導を高めることが示された（Ｓａｖｅｌｙｅｖａ Ｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００１；１９（８）：７６０－４，ａｎｄ Ｓｔｅｇａｎｔｓｅｖａ ＭＶ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ：ＣＩＩ．２０２０）。
ケモカインＭＩＰ３αに融合された抗原は、ケモカイン受容体ＣＣＲ６を介して未成熟ＤＣに向かうことが示された（Ｂｉｒａｇｙｎ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７（１１）：６６４４－５３）。受容体媒介取り込み後に、融合抗原は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩの両方により提示され、顕著なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化する（Ｂｉｒａｇｙｎ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０４（７）：１９６１－９，Ｂｉｒａｇｙｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９（２）：１３８１－８）。
これらの融合体は、図１３に示され、この図表の説明はさらなる情報を提供する。
融合構築物とヘルパーモチーフのアセンブリ
ＭＩＴＤ（１６５ｂｐ）は、ＨＬＡ－Ａ２トラフィッキングシグナルをコードする。ＰＶＸＣＰ（７３２ｂｐ）は、ジャガイモウィルスＸコートタンパク質をコードする。ＭＩＰ３α（２５２ｂｐ）は、マクロファージ炎症性タンパク質３アルファをコードする。ＭＩＴＤ、ＰＶＸＣＰおよびＭＩＰ３α遺伝子は、コドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成した。マウス（ｍｕｓ）ＩｇＨシグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＦＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードするリーダー配列を各構築物のＮ末端に挿入し、其れ自体のシグナルペプチドを有するＭＩＰ３α融合構築物を別として、分泌の効力を高めた。融合パートナーおよび目的遺伝子（ＭＡＧＥＤ４ＢまたはＦＪＸ１）を７個のアミノ酸リンカー（ＡＡＡＧＰＧＰ）と連結した。ＭＩＴＤ以外を、他の全ての融合パートナーを標的癌抗原癌抗原の上流に融合した（図１３）。ＭＩＴＤ配列を抗原配列の下流に添加した。ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＦＪＸ１またはそれらの目的融合体のための遺伝子をＮｏｔＩ、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位でｐｃＤＮＡ３ベクター中に挿入し、ＤＮＡワクチン構築物を生成した。
ＤＯＭおよび異なる融合ヘルパーモチーフパートナーを含む融合構築物の免疫原性の評価：
ＤＮＡワクチン単独または電気穿孔との組み合わせの免疫原性の評価用汎用ワクチン接種プロトコルは、プライム／ブーストであった（図１７；２１～２６）（特異的ワクチン構築物は、各図表の説明中に示される）：
３群の５～６匹の非担腫瘍ＨＨＤ（ヒトＨＬＡ－Ａ２アレルを遺伝子導入）マウスを５０μｇのｐ．Ｄｏｍ－ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ｐ．Ｄｏｍ－ＦＪＸ１またはｐ．Ｄｏｍのそれぞれを1日目にワクチン接種し、続けて、２２日目に、同じＤＮＡワクチンの追加抗原注射を電気穿孔により接種した。それらの免疫原性をＩＦＮγ エリスポットにより評価した。３５日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種した（図８）。図２１～２６の実験では、ｄｂＤＮＡワクチンの可変投与量は、図表の説明に示した。
図１１、１２、１４の実験では、ワクチン接種は、１日目および８日目に投与され、エリスポット用の脾臓を２２日目に採取した（特異的ワクチン構築物は、各図表の説明中に示される）。
図１５、１９、２０では、汎用（特異的ワクチン構築物は各図表の説明中に示される）プロトコルによる刺激のみの後で評価された：非担腫瘍Ｃ５７Ｂ／６マウスは、５０μｇのｐＤＯＭプラスミドワクチン（３匹のマウス、陰性対照として）、２５μｇのＤＢ－ＤＯＭ－ＦＪＸ１－ＣＯ（５匹のマウス）および２５μｇのｐＤＯＭ－ＦＪＸ１プラスミド（５匹のマウス）でワクチン接種した。ワクチンは、１日目に、ｉ．ｍ（筋肉内）にＥＰで投与された。図１５の実験では、マウスは５０μｇのＤＮＡワクチンを投与された。１４日目にマウス脾臓から単離したリンパ球をエリスポット培養皿に播種した。
本明細書で使用される汎用エリスポットプロトコル：
製造業者のプロトコル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってＩＦＮγ エリスポットを行った。手短に説明すると、リンパ球をワクチン接種マウスの脾臓からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）を用いて単離し、２．５ｘ１０５個の細胞／ウェルで、エリスポット培養皿に播種した。各標的抗原ＭＡＧＥＤ４ＢまたはＦＪＸ１のためのオーバーラッピングペプチドプール（ＯＰＰ）を最終濃度の１μＭまで加え、３７℃、１０％ＦＣＳ、２０ｍＭのＬ－グルタミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中の５％で４０時間インキュベートした。各抗原の全体配列のためのオーバーラッピングペプチドプールは、１１ａａの重複部分を有する１５マーのペプチドからなり；１８３個のペプチドをＭＡＧＥＤ４Ｂのためにプールし、１０７個のペプチドをＦＪＸ１のためにプールした（ＪＰＴ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＦＪＸ１ ＯＰＰは、ＭＡＧＥＤ４Ｂ標的化ワクチンのための陰性対照として機能し、逆もまた同じである。それぞれの応答Ｔ細胞に対応するスポット形成単位（ＳＦＵ）を、ＡＩＤ エリスポットプレートリーダーシステムＥＬＲ０４およびソフトウェア（ＡＩＤ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像化し、計数した。グラフはＰＲＩＳＭ ｇｒａｐｈＰａｄパッケージを用いて作成した。
実施例４：ＣＡＦ上のＭＡＧＥＤ４Ｂ抗原の特定
ＨＮＳＣＣ症例の免疫組織化学的分析であり、癌関連線維芽細胞ならびに癌細胞中の強力なＭＡＧＥＤ４Ｂ発現を示す。高ｐＨ（トリスＥＤＴＡ（ｐＨ（９）））バッファーを用いて抗原回収後、抗ＭＡＧＥＤ４Ｂモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｇ１２；ｓｃ－３９３０５９）を１：５０希釈でＨＮＳＣＣ組織に対し使用した。脱パラフィン、再水和、抗原回収、およびＩＨＣ染色を、Ｄａｋｏ ＰＴ Ｌｉｎｋ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを用いて実施した（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｈｉｇｈ ｐＨ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄａｋｏ）およびＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ ＮＨＳ ＴｒｕｓｔのＤＡＫＯ Ａｕｔｏ－ｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ４８を使用して）。ＤＡＫＯ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｍｏｕｓｅリンカーを切片に１５分間適用した；ＤＡＫＯ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ ＨＲＰ（２０分）およびＤＡＫＯ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０分）を適用し、その後、ＤＡＫＯ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸヘマトキシリンで５分間、対比染色した。画像を、ＷＩＳＨ ＬａｂでＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏスキャナーを用いて取得した。
６種の個別のＨＮＳＣＣ症例が提示される（図２７）。
ＨＮＳＣＣの１０症例の分析により、９／１０症例で、ＭＡＧＥＤ４Ｂの腫瘍細胞発現が確認された。腫瘍細胞発現のレベルをＨ Ｓｃｏｒｅ（染色強度（スコア０～３）と、陽性細胞のパーセンテージ（スコア０～１００）の積）を用いて評価した；可能な最大のスコアは、３００、すなわち、強力な染色を示す１００％の腫瘍細胞となる。特に、（および意外にも）、ＭＡＧＥＤ４の高い発現はまた、ＣＡＦ中（７／１０症例）でも観察され、下表中でＣＡＦ＋として示される。ＣＡＦ染色は、陽性または陰性として評価した。我々は、ｓｃＲＮＡＳｅｑ ＨＮＳＣＣトランスクリプトームデータ（これは、ＨＮＳＣＣ細胞によるＭＡＧＥＤ４Ｂ発現も確認した）を分析することによりＣＡＦ ＭＡＧＥＤ４Ｂ発現を確認した（図２８Ａ）。単細胞ＲＮＡｓｅｑ（ｓｃＲＮＡＳｅｑ）は、個々の細胞のトランスクリプトームを定量化するための強力な方法として登場し、適切なプロトコルは、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｔ ａｎｄ Ｈｅｍｂｅｒｇ，Ｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌｕｍｅ ５９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ １１４－１２２に概説されている。
Figure 2022553192000020
この表は、腫瘍細胞の染色の強度を示す。ＣＡＦ＋は、ＣＡＦ中のＭＡＧＥＤ４Ｂに対する強力な染色を示す。
実施例５：腫瘍および正常組織中のＭＡＧＥＤ４Ｂ発現の特定
これらの試験は、腫瘍および正常の両組織試料中でＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１発現を評価するように設計された。ＯＳＣＣ患者由来の腫瘍生検試料および正常組織マイクロアレイ試料を取得し、免疫組織化学的検査分析に供した。両抗原の強力な発現がＯＳＣＣ患者由来の全試料で明らかであった。ＨＰＶ－ＨＮＳＣＣを用いた５／５試料および各抗原に対する口腔形成異常組織中の５／５（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫコホート）。２８個の試料の抗原発現を評価し、２８／２８試料がＭＡＧＥＤ４Ｂ陽性で、２７／２８試料がＦＪＸ１陽性であった（マレーシアコホート）。
加えて、肺癌の患者由来の５個の試料（ＬＵＡＤの３個、ＬＵＳＣの２個の試料）は、ＭＡＧＥＤ４Ｂの強力な発現を示した。
これらの２種の抗原のいずれかを標的化する適合性が、健康な組織中で無発現／無視できる程度の発現を示した分析で示唆され、ＴＭＡ試料における低染色により確認された（データは示さず）。従って、ワクチンが正常組織に対して免疫応答を誘導することは予測されない。
この研究は、マレーシアおよびＵＫの患者由来の複数のＨＰＶ－ｖｅ ＨＮＳＣＣ試料中の両抗原の発現を確定し、非形成異常口腔組織を含む大部分の臓器の組織マイクロアレイパネルにおける好ましい組織発現パターンを確認した。
Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ ＯＳＣＣ患者試料では：試料は、製造業者の説明書に従い、自動化Ｄａｋｏ自動免疫染色装置を用いて染色した。
Figure 2022553192000021
ＯＳＣＣ患者のマレーシアコホートでは、ＦＦＰＥブロックが特定され、４μｍの切片を正に帯電したスライドガラス上に作成した。手短に説明すると、切片からのワックスを６５℃で１０分間融解し、続いて、キシレン代用品で５分間の洗浄を２回行うことにより脱パラフィンした。その後、切片を段階的エタノール（１００％エタノールｘ２、９５％エタノールｘ２、７０％エタノールｘ１）中で再水和し、蒸留水中で少なくとも３０秒間洗浄した。続けて、それを熱誘導抗原回収（ＭＡＧＥＤ４Ｂに対しクエン酸緩衝液ｐＨ６；ＦＪＸ１に対しトリスＥＤＴＡバッファーｐＨ９）を９９℃で２０分間行った。Ｄａｋｏ ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ Ｌｉｎｋ Ｓｙｓｔｅｍ ＨＲＰ（ＤＡＢ＋）キットからのＤｕａｌ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ中で切片を室温下１０分間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックした。その後、切片を抗ＭＡＧＥＤ４Ｂ（１：１００希釈）および抗ＦＪＸ１抗体（１：２００希釈）と共に４℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、切片を洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ポリマー（ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギに結合）と共に室温で３０分間インキュベートした。ヘマトキシリンにより比染色し、段階的エタノールで脱水後に、それぞれの抗体に対する陽性結合が、ＤＡＢ＋発色基質を有し、カバーガラスを取り付けた顕微鏡下で明らかになった。
Figure 2022553192000022
この研究は以下を確認した：
ＵＫおよびマレーシアかたのＨＮＳＣＣ／ＯＳＣＣ患者試料中の両抗原の強力な発現。
肺癌試料もまた、ＭＡＧＥＤ４Ｂ（ＦＪＸ１は分析せず）の強力な発現を示し、ＴＣＧＡデータベースを用いて生成した過剰発現データを確認した（ＴＧＬ－１００＿００１－Ｒ ＴＣＧＡで詳細に記載）。
これらのデータは、好ましい組織発現パターン；腫瘍における強力な発現および健康な組織中の低／無発現を示す利用可能なＲＮＡｓｅｑデータと広範囲に対応する。
実施例６：Ｂ１６マウスモデルでの前臨床研究
本明細書で記載のワクチンを用いた治療的ワクチン接種の腫瘍進行に対する影響を示すために、抗原を発現するＢ１６モデルを採用して、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入ＡＡＤマウスの皮下にチャレンジした。５日目のデュアルワクチンによるワクチン接種の前の５日間で腫瘍を確立し、投与の約１０日目に測定可能になると、腫瘍体積評価を開始することが可能であった。ワクチン治療と抗ＰＤ－１の効果の組み合わせも評価した。
ワクチン単剤療法は、対象と比較して、腫瘍増殖を遅らせ、この効果は、抗ＰＤ－１との組み合わせ時にさらに顕著に高められた。免疫組織化学的検査による腫瘍の評価により、デュアルワクチンでワクチン接種したマウスでは、ｐＤＯＭ対照ワクチン接種マウスに比べて、増大したＴ細胞浸潤物が明らかであることが示された。フローサイトメトリーは、これらの浸潤物が、ｐＤＯＭ対照に比べて、増大した数の活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでいたことをさらに示した。Ｔ細胞疲弊マーカーＰＤ－１の発現の増大は、ＰＤ－１阻害とワクチン接種との組み合わせが有益であり得ることを示した。
この研究は、ＰＤ－１阻害と組み合わせた新規抗原ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１を標的とするワクチン接種がＴ細胞媒介腫瘍攻撃を効果的に誘導できるという我々が提案した作用機序を支持する。
筋肉内（ｉ．ｍ）注射による２回分のワクチンの効力を、ＡＡＤマウス（ＨＬＡ－Ａ２＋／Ｋｂ＋）を用いて、ＢＡＭモデル（ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＨＬＡ－Ａ２を発現するように遺伝子改変されたＢ１６メラノーマ腫瘍）またはＢＡＦモデル（ｈｕＦＪＸ１およびＨＬＡ－Ａ２を発現するように遺伝子改変されたＢ１６メラノーマ腫瘍）で試験した。ＢＡＭ細胞は、ＭＡＧＥＤ４ＢおよびヒトＦＪＸ１に対し９５％の相同性を有するマウスＦＪＸ１の発現を確証した。ＢＡＦ細胞は、ｈｕＦＪＸ１の発現を確証した。
ヒトＨＬＡ－Ａ２遺伝子を発現しているＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞株は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｅｒｉｃ Ｔａｒｔｏｕｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｐａｒｉｓ Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ，Ｐａｒｉｓ）から譲り受けた。この細胞株は、１０％加熱不活性化した胎児ウシ血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）および１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養された。Ｂ１６Ｆ１０／ＨＬＡ－Ａ２は、マウスＦＪＸ１を内因性に発現することが検証され、ヒトＭＡＧＥＤ４Ｂ（Ｂ１６Ｆ１０／ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＤ４Ｂ、「ＢＡＭ」）を発現するように改変された。同時に、Ｂ１６Ｆ１０／ＨＬＡ－Ａ２は、ヒトＦＪＸ１（Ｂ１６Ｆ１０／ＨＬＡ－Ａ２／ＦＪＸ１、「ＢＡＦ」）を発現するように改変された。これらの細胞株中でのＨＬＡ－Ａ２の発現は、ヒトＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ（クローンＢＢ７．２）－結合抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認された。ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１発現レベルは、注文製作抗ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび抗ＦＪＸ１抗体をそれぞれ用いて、ウェスタンブロッティングにより確認された。
ＤＮＡワクチンの免疫原性および有効性は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡから購入した、キメラＨＬＡ－Ａ２．１／Ｈ２－Ｄｄ ＭＨＣクラスＩ分子を発現している遺伝子導入マウスＢ６．Ｃｇ－Ｉｍｍｐ２ｌＴｇ（ＨＬＡ－Ａ／Ｈ２－Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ）（ＡＡＤマウスとしても知られる）で試験された。ＡＡＤマウスは、その後の実験での使用のために、動物実験室で飼育された。
マウスは、ＢＡＭ細胞株（１０６細胞）で０日目にチャレンジされ、その後、無菌生理食塩水中のワクチン（５０μｇの各ワクチン）または５０μｇのｐＤＯＭ ＤＮＡワクチン対照（筋肉内）で５日目に触知できる腫瘍を観察後（平均で２５ｍｍ２の測定値）、ワクチン接種された。ｐＤＯＭ対照は、破傷風毒素ＤＯＭヘルパー配列のみを発現した。追加抗原注射を１２日目に投与した。マウスを屠殺するまで腫瘍増殖を監視し、免疫組織化学的検査およびフローサイトメトリーにより腫瘍のＴ細胞浸潤を評価した。腫瘍容量は、次式を用いて評価した：体積＝１／２（長さｘ幅２）。プラスミドベースワクチンの結果を図９および１０に示す。

Claims (28)

  1. ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含む癌ワクチン。
  2. 前記ＭＡＧＥＤ４Ｂタンパク質が、配列番号３、３１、４１、４２または４３のいずれか１つで示される配列、または免疫学的に活性なその短縮化バージョン、任意選択で、配列番号３５～配列番号３７のいずれか１つで示される配列、と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の癌ワクチン。
  3. 前記短縮化バージョンが、一方または両方のＭＡＧＥ相同ドメインの少なくとも一部の除去を含む、請求項１または請求項２に記載の癌ワクチン。
  4. 前記核酸配列が、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６のいずれか１つで示される配列、と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれかに記載の癌ワクチン。
  5. ヘルパーモチーフをさらに含み、任意選択で、前記ヘルパーモチーフが免疫応答を刺激するタンパク質をコードする、請求項１～４のいずれかに記載の癌ワクチン。
  6. 前記ヘルパーモチーフが、タンパク質の免疫学的フラグメント、任意選択で、ヘルパーエピトープをコードする、請求項５に記載の癌ワクチン。
  7. 前記ヘルパーモチーフが、破傷風毒素の免疫原性フラグメント、任意選択で、破傷風毒素のｐ３０ ＭＨＣＩＩエピトープである、請求項５または請求項６に記載の癌ワクチン。
  8. 前記ヘルパーモチーフがＤＯＭである、請求項７に記載の癌ワクチン。
  9. 前記癌ワクチンが、ＦＪＸ１タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の癌ワクチン。
  10. 前記ＦＪＸ１タンパク質が、配列番号４または配列番号３３で示される配列、またはその短縮化バージョンと少なくとも８５％の同一性を有し、および任意選択で、配列番号８、配列番号２０または配列番号２１に記載の核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する核酸によりコードされる、請求項９に記載の癌ワクチン。
  11. 前記ＭＡＧＥＤ４ＢおよびＦＪＸ１が、同じ核酸により融合タンパク質としてコードされ、任意選択で、前記融合タンパク質がタンパク質の免疫学的フラグメントをさらに含む、請求項９または請求項１０に記載の癌ワクチン。
  12. 前記融合タンパク質が、ＭＡＧＥＤ４Ｂおよび／またはＦＪＸ１および／または前記タンパク質の免疫学的なフラグメントの間に、１種または複数のリンカータンパク質を含む、請求項１１に記載の癌ワクチン。
  13. 少なくとも１種の核酸が、シグナルペプチドをコードする、請求項１～１２のいずれかに記載の癌ワクチン。
  14. 前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１～１３のいずれかに記載の癌ワクチン。
  15. 前記ＤＮＡが、プラスミド、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡまたは一本鎖環状ＤＮＡである、請求項１４に記載の癌ワクチン。
  16. 前記核酸が、コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択で、前記コード配列の下流にポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１４または請求項１５に記載の癌ワクチン。
  17. 前記核酸が、ＲＮＡ、任意選択で、メッセンジャーＲＮＡまたは自己増幅型ＲＮＡである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
  18. 医薬に使用するための、任意選択で、癌の治療または予防に使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
  19. 前記免疫系への腫瘍の曝露に使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
  20. 抗癌剤、任意選択で、免疫チェックポイント阻害薬に対し腫瘍を感作させるのに使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の癌ワクチン。
  21. 前記ワクチンが、抗癌剤、任意選択で、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて使用するためのものである、請求項１８、１９または２０で請求される使用するための癌ワクチン。
  22. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の癌ワクチンを投与することを含む、それを必要としている患者を治療する方法。
  23. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のワクチンをヒトまたは動物対象に投与することを含む、ＣＤ８＋Ｔ細胞による浸潤に腫瘍を感作させる方法。
  24. 前記方法が、抗癌剤、任意選択で、免疫チェックポイント阻害薬の使用をさらに含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ－４の作用を遮断できる薬剤であり、任意選択で、前記薬剤が抗体またはアプタマーである、請求項２０もしくは２１に記載の使用または請求項２４に記載の方法。
  26. 前記癌が、頭頸部癌、口腔癌、中咽頭癌、上咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、胆管細胞癌腫、皮膚黒色腫、直腸癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、腎癌および胃腺癌のいずれか１種または複数である、請求項１～２５のいずれかに記載の癌ワクチン、使用または方法。
  27. 本発明のワクチンによる治療のために癌を選択する方法であって、癌に、ＭＡＧＥＤ４Ｂ単独の、またはＦＪＸ１と組み合わせての発現が付随しているかどうかを判定することを含む、方法。
  28. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の癌ワクチンをヒトまたは動物対象に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害の効力を高めることを必要としている患者で、それを実施する方法。

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