CN115003322A

CN115003322A - 癌症疫苗

Info

Publication number: CN115003322A
Application number: CN202080072796.5A
Authority: CN
Inventors: N·萨维莉娃; G·托马斯; C·奥滕斯梅尔; C·王; S·C·张; K·P·林
Original assignee: Malaysian Cancer Institute; University of Southampton
Current assignee: Malaysian Cancer Institute; University of Southampton
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2022-09-02
Also published as: US20220233666A1; GB201915163D0; IL292272A; JP2022553192A; WO2021074655A1; EP4045081A1; AU2020366599A1

Abstract

本发明涉及至少编码MAGED4B蛋白的核酸疫苗，其用于特别是癌症的治疗中。描述了与其他抗癌剂、特别是免疫检查点抑制剂的协同组合。癌症疫苗可以进一步包含用于增强免疫应答的免疫活性片段以及另外的癌症抗原，诸如FJX1。关注的特定组合疗法包括免疫疗法、放射疗法、靶向疗法和化学疗法。

Description

癌症疫苗

技术领域

本发明涉及基于核酸的癌症疫苗、其用途和治疗或预防癌症、特别是口腔癌的方法，以及相关组合疗法。本发明人已经证明了基于核酸的癌症疫苗用于若干种癌症类型的效用。关注的特定组合疗法包括免疫疗法、放射疗法、靶向疗法和化学疗法。

本发明涉及至少编码MAGED4B蛋白的核酸疫苗，其用于特别是癌症的治疗。描述了与其他抗癌剂、特别是免疫检查点抑制剂的协同组合。癌症疫苗可以进一步包含免疫活性片段以增强免疫应答，以及另外的癌症抗原，诸如FJX1。

背景技术

关注的一种特定癌症(但不是适于用本文所述的疫苗治疗的唯一癌症)是口腔癌和口咽癌。分组在一起的口腔癌和口咽癌(常常被称为头颈癌；HNSCC)是世界上的第六最常见癌症(口腔癌(OSCC)的每年估计发生率为275,000例并且口咽癌(OPSCC)的每年估计发生率为130,300例)。在英国，HNSCC的发病率自20世纪70年代后期以来大幅上升(+92％)至超过7500例/年；虽然上升的OPSCC英国发生率与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关，但OSCC发病率增加的原因尚不清楚，并且据估计，速率将继续显著上升。患者的管理常常是通过昂贵的多学科方法，其涉及手术和/或放射疗法，之后是重建和康复。治疗导致相当大的身体和心理发病率，并且可能并非为许多患者延长寿命。手术和放射疗法仍然是标准治疗，但是尽管有所改善，仍与显著的发病率和约50％-60％的相对停滞5年存活率相关联。在加强预先存在的抗肿瘤免疫应答时预测的针对CTLA4和PD1/PDL1的免疫检查点抑制剂已经跨癌症类型显示出功效，并且用α-PD1治疗HNSCC患者的近期KEYNOTE 012试验产生了18％的总应答率(J.Clin.Oncol.34,3838–3845(2016).British Journal of Cancer119,153–159(2018)。然而，大多数患者对检查点抑制剂疗法没有应答，这可能是由于缺乏足够强的预先存在的抗肿瘤免疫应答。若干家公司开发了靶向HPV抗原的用于治疗HPV驱动的HNSCC的实验方法。这些包括肽疫苗、mRNA和DNA疫苗。然而，大多数口腔癌和口咽癌是HPV阴性的；该患者组的存活率显著差于患有HPV阳性肿瘤的那些患者。全世界每年6,000,000名HPV阴性HNSCC患者需要治疗。到目前为止，对这种疾病探究了非常少量的疫苗接种方法。

虽然基于个体肿瘤突变组的患者特异性疫苗的开发存在激发兴趣的潜力，但这种方法的昂贵和技术难度意味着，即使成功，也不太可能使大多数患者受益。鉴定患者之间共有的常见肿瘤抗原以产生通用型癌症疫苗将提供用于OSCC的廉价且广泛可用的治疗。在不同类型的TAA中，癌症/睾丸(testis)(CT)抗原是高度有前途的治疗性靶标；在癌症患者中经常观察到对CT抗原的细胞和体液免疫应答，并且在CT抗原表达与肿瘤免疫浸润物的细胞溶解活性之间存在关联。CT抗原的免疫原性和癌症特异性使其变为癌症免疫疗法的优先靶标，并且它们的治疗性功能已经在多种临床环境中进行了测试。CT抗原疫苗通常耐受良好，并且目前存在大量的评估其治疗效果的进行中癌症疫苗接种试验。需要鉴定可以有效靶向治疗或预防癌症例如口腔癌和口咽癌的肿瘤抗原。

本发明人还鉴定了表达本文所述的癌症抗原、或者适于用本文所述的癌症疫苗治疗的其他癌症类型。此类癌症可以包括头颈癌、口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、皮肤黑素瘤、直肠癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、肾癌和胃腺癌。本领域技术人员可以基于疫苗的作用机理鉴别癌症疫苗可能有效的另外的癌症类型。癌症抗原在各种癌症类型中表达的证据包括在图29中。

本文首要关注的癌症抗原是MAGED4B抗原。该抗原可以表达于与癌症相关的一种或多种细胞(包括肿瘤细胞或癌症相关细胞)的表面上。本文关注的另一癌症抗原是FJX1抗原。这些抗原二者可以表达于相同癌症中，例如表达于癌症的一种或多种细胞或与癌症相关的细胞的表面上，或者表达于肿瘤的癌症微环境中。因此，疫苗可以包括一种或两种癌症抗原。

先前，已经确认MAGED4B和/或FJX1蛋白可以通过以下方式分裂成用于疫苗接种中的小肽(WO2018/169385)：切割蛋白质，使得蛋白质能够与MHC I类分子结合以在受试者中诱导抗癌免疫应答。这些肽限于可以与MHC I类分子结合的那些，这对大小施加限制，因为MHC I类分子的槽可以接受8至10个氨基酸或稍微更长的肽。

然而，据认为，此类肽未激活足够持续的免疫应答来帮助患者诱导持久的抗癌应答应。

由于MAGED4B和FJX1两者均是自身蛋白质，因此关于针对这些靶标中的任何一种或多种开发成功癌症疫苗的一个主要问题是，需要疫苗接种的患者已经对这些抗原产生自耐受。此外，已经发现仅MHC I类分子的靶向未产生足够的免疫应答来产生抗癌应答。这种疫苗方法未引发临床功效所需的强效、平衡且持久的CD4加CD8 T细胞扩增。尽管这些抗原被鉴定为癌症疫苗的良好靶标，但令人遗憾的是，迄今为止，现行技术尚未产生可用于临床环境中的疫苗。

此外，通过作为小肽提供疫苗，疫苗以非常特异的方式起作用，并且靶向特定类型的人白细胞抗原(HLA)，从而可以将疫苗的有用性限制于群体的特定部分。因此，来源于肽的疫苗不能提供泛群疫苗，这意味着需要测试患者以查看疫苗是否适于他们，从而缺失有需要的群体的一部分。

治疗性癌症疫苗通常必须克服三个主要障碍：低免疫原性；建立的疾病负担；和免疫抑制肿瘤微环境。异常表达的自身抗原(诸如MAGED4B和FJX1)面对这种障碍，通过中枢和外周耐受性机制消除了识别这些自身抗原的高亲和力T细胞。因此，肽疫苗迄今仍具有激活的足够低亲和力的T细胞。然而，刺激免疫应答所需的佐剂的高剂量对于患者将具有显著的副作用。因此，仍然存在长期尚未满足的能够帮助患有表达MAGED4B和/或FJX1的癌症的患者消除其肿瘤的需要。

这些问题使得存在这样的较大风险，即单独针对这些抗原的疫苗不太可能自身在治疗这些患者中有效。然而，本发明人令人惊讶地发现，可以开发一种疫苗，所述疫苗展示出良好的免疫应答，从而提供临床功效所需的CD4加CD8T细胞应答，并且此外提供了泛群效应，这意味着该疫苗可能是通用型的，而不是特定使用的。此外，他们已经在使用本发明的疫苗中注意到一些另外的有益效应，所述疫苗通过靶向与癌症相关并保护其免受其他抗癌剂的作用的细胞可以使癌症总体上对另外的化学治疗剂或免疫治疗剂更加敏感。这种令人兴奋的开发在治疗有需要的患者中极受关注。

此外，存在一些证据表明，本文所述的癌症疫苗可以与另外的抗癌剂以协同方式起作用，这在治疗这些癌症类型方面是令人兴奋的开发，因为临床上通常推荐组合方法以确保癌症的完全缓解。

为了提供成功的癌症疫苗，疫苗必须进入细胞并在体内表达，从而能够使抗原呈递在主要组织相容性分子(MHC)上和实现T细胞识别。T辅助细胞(具有表面标记物CD4)与细胞毒性T细胞(具有表面标记物CD8)的共诱导是至关重要的。CD4+和CD8+T细胞含有若干个子组。因此，DNA疫苗在其被视为良好临床候选者之前必须满足许多要求。

本发明人已经在相关模型中并且通过在此呈现的临床前数据显示，使用本发明的疫苗获得所需的免疫应答。特别地，本发明人已经显示出在疫苗接种后CD8+T细胞的有效肿瘤浸润，并且在人样品中存在具有被疫苗的施用刺激的潜力的循环T细胞，同时也引发新初免的T细胞的形成。数据显著证明了蛋白质从用核酸疫苗转染的细胞的良好表达和分泌，所述蛋白质适当地被加工以将其相关表位呈递至免疫监视。此外，在小鼠肿瘤模型中，在小鼠具有表达至少一种人抗原的可触及肿瘤的情况下，可以看到疫苗对肿瘤大小的减少的影响。由于已知与至少MAGED4B蛋白相关的肿瘤特别具有侵袭性，因此这种小鼠模型数据对本发明人具有巨大的鼓舞性。

因此本发明的疫苗已经展示出具有改变肿瘤周围的微环境，使其“可见”于免疫系统，从而允许T细胞浸润，以不仅引起针对肿瘤本身，还进一步引起针对完全出乎意料地显示出也表达MAGED4B蛋白的癌症相关成纤维细胞的免疫应答的能力。因此，根据本发明的疫苗具有改变肿瘤周围的起到保护此类癌细胞免受免疫系统和抗癌剂的影响的作用的细胞的能力。因此，本发明的疫苗对于调节癌症微环境、将肿瘤暴露于免疫系统、增强针对肿瘤的免疫应答以及由此大大辅助肿瘤细胞死亡具有深远的影响。

值得注意的是，本发明人已经发现本发明的疫苗非常不太可能对身体中的正常组织造成伤害，因为在其他组织中的表达模式是极少的。因此，这使得疫苗具有临床价值。

因此，本发明提供了治疗肿瘤生长和提供针对肿瘤生长的保护的疫苗。

本发明的目的是提供可以提供针对癌细胞、特别是口腔癌和口咽癌细胞的适当免疫应答的癌症疫苗。

发明内容

本发明涉及核酸疫苗的提供。根据其任何部分的疫苗可以被配制为疫苗组合物。所述核酸疫苗是癌症疫苗，用于治疗癌症。描述了各种替代性疫苗。如本文所用，任一种蛋白质可以描述为癌症抗原。

所述癌症疫苗可以包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸。该蛋白质可以是如SEQID No.3或SEQ ID No.31中所述的全长蛋白，但该蛋白质可以是截短型或经修饰的，使得通过所述核酸提供足够量的所述蛋白质，以能够使所述蛋白质在细胞内被加工并且呈递至免疫系统。合适的截短物描述于SEQ ID No.35至SEQ ID No.37中。因此，所述MAGED4B蛋白可以是如本文所述的全长蛋白的免疫原性片段。序列MADGED4B蛋白可以进一步是经修饰的，使得产生氨基酸取代。在本文中进一步讨论了此类变体、修饰物和截短物。

MAGED4B的已知同种型(变体)描述于No.41-43中。

可替代地定义，所述癌症疫苗可以包含编码MAGED4B蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26中所述，或者其变体和截短形式。变体和截短物如本文所定义。

任选地，所述组合物还可以包含编码FJX1蛋白或其变体的核酸。所述蛋白质可以是如SEQ ID No.4或SEQ ID No.33中所述的全长蛋白，或者可以是截短型或经修饰的。在本文中进一步讨论了此类变体、修饰物和截短物。

可替代地定义，所述癌症疫苗可以包含编码FJX1蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQID No.8、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中所述，或者其变体和截短形式。变体和截短物如本文所定义。

任选地，如果疫苗包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸和编码FJX1蛋白或其变体的核酸，则这些可以单独提供，即提供为单独的核酸；或者在相同或不同启动子的控制下提供在相同核酸上；或者作为两种蛋白质之间的融合体存在。

本发明涉及核酸疫苗的提供。所述核酸编码FJX1蛋白或其变体。所述蛋白质可以是如SEQ ID No.4或SEQ ID No.33中所述的全长蛋白，或者可以是截短型或经修饰的。在本文中进一步讨论了此类变体、修饰物和截短物。任选地，所述组合物还可以包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸。所述蛋白质可以是如SEQ ID No.3或SEQ ID No.31中所述的全长蛋白，或者可以是截短型(诸如SEQ ID No.35至SEQ ID No.37中所描述的)或经修饰的。此类术语如本文所讨论。

本发明涉及核酸疫苗组合物的提供。所述组合物可以包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸和编码FJX1蛋白或其变体的核酸。所述核酸可以将MADGED4B和FJX1蛋白两者编码为融合蛋白。所述组合物可以是各自编码MAGED4B蛋白或其变体或者FJX1蛋白或其变体的两种单独的核酸构建体，以用于作为疫苗单独、同时或顺序施用至有需要的患者。

可替代地定义，所述癌症疫苗可以包含编码MAGED4B蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26中所述，或者其变体和截短形式；以及编码FJX1蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中所述，或者其变体和截短形式。变体和截短物如本文所定义。所述核酸可以是单独的或存在于相同核酸构建体上。

融合蛋白是由至少两个结构域组成的蛋白质，所述至少两个结构域由已经接合的单独编码序列编码，使得它们作为单一单元转录和翻译，从而产生单一多肽。因此，可以将编码MAGED4B蛋白或其变体和FJX1蛋白或其变体的核酸融合，使得它们当施用时作为单一多肽产生。因此，在编码所述融合蛋白的核酸中，所述融合蛋白在一个启动子的控制下表达。所述融合体中基因顺序可以是在任一方向上，即FJX1蛋白或其变体之后是MAGED4B蛋白或其变体，亦可反之。可能优选的是，所述MAGED4B蛋白或其变体在所述FJX1蛋白或其变体之前。

可能优选的是，本文所述的任一种核酸疫苗组合物进一步包含辅助基序。辅助基序可以定义为直接刺激免疫应答的核酸序列(例如所述DNA序列本身能够刺激免疫应答)或编码免疫原性蛋白或其片段的基序。所述辅助基序起加强针对由所述核酸疫苗编码的所述蛋白质的免疫应答的作用。在本文中讨论了合适的辅助基序。一种辅助基序是破伤风毒素的免疫原性片段，称为DOM。

因此，所述癌症疫苗可以包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸以及辅助基序。所述辅助基序可以如在此所述的任何合适的辅助基序。所述辅助基序可以是DOM。示例性疫苗可以包含SEQ ID No.18或SEQ ID No.19中描述的序列，或者其变体或截短物。示例性疫苗可以编码SEQ ID No.32中所述的蛋白质序列或者其变体或截短物。

可替代地，所述癌症疫苗可以包含编码FJX-1蛋白或其变体的核酸以及辅助基序。所述辅助基序可以如在此所述的任何合适的辅助基序。所述辅助基序可以是DOM。示例性疫苗可以包含SEQ ID No.22或SEQ ID No.23中描述的核酸序列，或者其变体或截短物。示例性疫苗可以编码SEQ ID No.34中所述的蛋白质序列或者其变体或截短物。

此外，所述癌症疫苗可以包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸和编码FJX-1蛋白或其变体的核酸以及辅助基序。所述辅助基序可以如在此所述的任何合适的辅助基序。所述辅助基序可以是DOM。示例性疫苗可以包含SEQ ID No.18或SEQ ID No.19中描述的MAGED4B序列，或者其变体或截短物。示例性疫苗可以编码SEQ ID No.32中所述的MAGED4B蛋白序列或者其变体或截短物。示例性疫苗可以包含SEQ ID No.22或SEQ ID No.23中描述的核酸序列，或者其变体或截短物。示例性疫苗可以编码SEQ ID No.34中所述的蛋白质序列或者其变体或截短物。

在如在此所述的癌症疫苗包含融合蛋白的情况下，可以在编码序列之间使用接头。该融合可以是在癌症抗原MAGED4B与FJX1之间，或者可以是在癌症抗原与辅助基序之间。可以使用任何合适的接头序列。示例性接头序列在SEQ ID No.5、6、10和11中给出。

编码所述癌症抗原的核酸序列可以包含信号或前导序列。这样可以改善所述蛋白质从转染细胞的分泌。示例性前导序列在SEQ ID No.1和27中给出。

在此所述的癌症疫苗的所述核酸可以进一步包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且任选地，进一步包含在编码序列下游的聚腺苷酸化信号。在此描述了合适的启动子和聚腺苷酸化信号。合适的启动子包含SEQ ID No.9和SEQ ID No.15中所述的序列。

如在此所述的癌症疫苗可以是DNA疫苗或RNA疫苗。所述疫苗还可以是如在此所述的非天然核酸。

如在此所述的癌症疫苗可以作为任何适当的核酸构建体呈现，包括质粒、微环、单链环、闭合线性DNA或单链RNA。所述构建体可以包括任何其他组分、诸如增强子等以便促进编码序列的表达。

在下文进一步描述这些疫苗中的任一种：

如在此所述的癌症疫苗可以作为疫苗组合物提供。组合物可以包含任何合适的赋形剂或添加剂，可以提供所述赋形剂或添加剂以便稳定所述疫苗组合物，使其适于储存和运输，和/或通过包含缓冲溶液等以确保恰当的pH使其适于施用。

如在此所述的癌症疫苗可以用于治疗动物包括人中的癌症。任选地，所述癌症疫苗用于在人中治疗癌症。任选地，所述癌症疫苗用于在非人动物(诸如家畜或野生动物)中治疗癌症。合适的动物可以包括猫和狗、豚鼠、牛、马、绵羊、兔和非人灵长类动物。非人灵长类动物可以包括黑猩猩和猴。

还设想了在动物(包括人)中治疗癌症的方法，所述方法包括将在此所述的癌症疫苗施用至有需要的患者。合适的动物可以包括猫和狗、豚鼠、牛、马、绵羊、兔和非人灵长类动物。非人灵长类动物可以包括黑猩猩和猴。

在此所述的癌症疫苗可以用于在医学中使用，任选地用于在治疗或预防癌症中使用。

在此所述的癌症疫苗可以用于在将肿瘤显露于免疫系统中使用。

在此所述的癌症疫苗可以用于在使肿瘤对抗癌剂，任选地免疫疗法(诸如检查点抑制剂)敏感中使用。

在此所述的癌症疫苗可以用于与抗癌剂，任选地免疫疗法(诸如检查点抑制剂)或化学疗法组合使用。

在此所述的癌症疫苗可以用于使肿瘤对由CD8⁺T细胞的浸润敏感的方法，所述方法包括将所述癌症疫苗施用至人或动物受试者。

在此所述的治疗方法可以进一步包括使用抗癌剂，任选地免疫疗法(诸如检查点抑制剂)。

如本文所用，检查点抑制剂是能够阻断PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA-4的作用的药剂，任选地其中所述药剂是抗体或适体。

在此所述的癌症疫苗可以用于在有需要的患者中增加免疫检查点阻断的功效的方法中，所述方法包括将如在此所述的癌症疫苗施用至人或动物受试者。

本文所述的癌症疫苗可以用于共诱导CD4和CD8 T细胞。

在此所述的癌症疫苗、用途和治疗方法可以有效用于治疗多种癌症类型，所述多种癌症类型包括但不限于头颈癌、口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、皮肤黑素瘤、直肠癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、肾癌和胃腺癌。

根据本发明的第一方面，提供了癌症疫苗，其包含编码蛋白MAGED4B和/或FJX1或其变体，并且进一步编码破伤风毒素的免疫原性片段的核酸。

有利地，发现两种癌症睾丸抗原MAGED4B和FJX1经常在OSCC中表达。总体上，两者抗原在96％的OSCC病例下以RNA水平表达。此外，本研究确认了两种抗原在口腔发育异常和OSCC病例(10/10是阳性的；对于每种病症为5例)中在蛋白质水平下的表达，而在非恶性口腔粘膜中没有表达。对健康组织中蛋白质水平下的表达的检查证明了低表达。与这些表达数据平行的是使用HLA-A2四聚体(目前仅可用于MAGED4B)和针对每种抗原的整个氨基酸序列的重叠肽池(OPP)在患有HPV非依赖性HNSCC的患者中对针对抗原的预先存在免疫性的研究。在血液和肿瘤两者中使用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞测量这些表达。在5/7HLA-A2患者中观察到循环MAGED-4B四聚体阳性CD8+T细胞(总CD8+T细胞的0.04％-0.1％)，以及也具有以相似频率阳性的四聚体的2/2扩增的TIL。使用OPP在HLA-A2阴性HLA-A1阳性TIL样品中检测到较高水平的MAGED4B阳性CD8 T细胞(5-10倍)，这指示了超出HLA-A2限制的反应性。对于FJX1，已经使用OPP在扩增的TIL样品中评价CD8 T细胞反应性，并在同时存在有MAGED4BCD8 T细胞的HLA-A1患者中展示出CD8反应性。患者的数据表明了两种抗原的显著免疫原性，对于MAGED4B更是如此明显。已经开发了编码全长MAGED4B和FJX1抗原的DNA疫苗(例如本文所述的p.Dom-MAGED4BFL和p.Dom-FJX1FL)，并且临床前数据证明靶向MAGED4B/FJX1的DNA疫苗具有抑制表达这些抗原的肿瘤的生长的显著潜力。

进一步有利地，破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素的免疫原性片段的提供可以有助于诱导强的CD4+辅助T细胞应答，所述辅助T细胞应答为经由激活树突状细胞(所谓的关联T细胞机制)诱导肿瘤特异性CD4+和CD8+T细胞应答所需的。已知此类CD4和CD8表位能够结合一系列小鼠和人MHC II类分子。

具体实施方式

在此所述的癌症疫苗可以诱导抗原特异性T细胞应答，尤其是对于持久应答至关重要的CD4⁺和CD8⁺T细胞应答，从而引发针对表达抗原的肿瘤的免疫应答。本文所述的癌症疫苗可以另外或可替代地影响肿瘤微环境，增加肿瘤的免疫可见性并且促进CD8 T细胞浸润至肿瘤块中，从而使肿瘤细胞更易受抗癌剂(单独的或与所述抗癌剂组合)的攻击。有效地，疫苗改变肿瘤的微环境，使其对免疫攻击更敏感。

肿瘤内T细胞的缺乏是免疫检查点抑制剂和免疫疗法在患有癌症的患者中的功效的主要阻碍；这可能起因于差的肿瘤免疫原性(即T细胞的缺乏)或者因为T细胞不能浸润肿瘤(即T细胞在错误地方中)。本发明人已经清楚地证明，在此所述的癌症疫苗增加了肿瘤内T细胞(图10B和C)。因此，本发明延伸至用于在有需要的患者中增加免疫检查点阻断的功效的方法，其包括将在此所述的癌症疫苗施用至人或动物受试者。在此所述的癌症疫苗可以用于在使肿瘤对免疫系统或对抗癌剂敏感中使用。在此呈现的数据证明，当将在此所述的癌症疫苗与能够引起免疫检查点阻断的药剂一起使用时，发生具有重要意义的协同作用(图9B)。

如在此所述的疫苗可以产生诱导或引发的免疫应答，其可以是细胞免疫应答。诱导或引发的免疫应答可以包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或CD107a/b(其是细胞毒性T细胞的标记物)的诱导或分泌(图21和22)。

特别地，在癌症疫苗中的抗原是MAGED4B蛋白抗原的情况下，癌症疫苗可以诱导另外针对已经被本发明人证明也表达该抗原的癌症相关成纤维细胞(CAF)的抗原特异性应答(图27和28)。除了癌性细胞，人肿瘤还含有形成免疫微环境并且促进癌症进展的许多不同类型的细胞，包括癌症相关成纤维细胞(CAF)、内皮细胞、免疫细胞、脂肪细胞和周皮细胞。因此，靶向肿瘤微环境中的此类细胞的能力在治疗癌症中通常是特别有用的，并且可以不限于它们本身表达MAGED4B的癌症亚型。

所有类型的实体癌症(肿瘤)含有富含CAF的亚组；这从胰腺癌中的大于95％至头颈癌中的大约50％变动。肿瘤中CAF的比例是肿瘤的约25％-50％，并且在一些癌症诸如大多数肿瘤是富含CAF的胰腺癌中可能更高。值得注意的是，癌症中的CAF累积与差的临床结局相关；富含CAF的肿瘤在临床上是侵袭性的，对治疗的应答差并且与差的存活率相关。这是因为CAF促进许多‘恶性肿瘤的标志’，促进肿瘤生长、侵入、转移和血管生成。在多种癌症类型中的一致发现是CAF与CD8 T细胞之间的逆相关性，这表明CAF在肿瘤免疫逃避中的作用。最近研究(包括由本申请人进行的那些研究)已经显示CAF拒绝CD8 T细胞进入肿瘤中，并且从而促进对抗PD1/PDL1检查点免疫疗法(和基于疫苗的免疫疗法；Ford等人,CancerRes 80,1846-1860(2020))的抗性。多个临床研究已经在对抗PD1/PDL1没有应答的患者中鉴定出CAF基因特征(Mariathasan,S.等人Nature 554,544–548(2018))。CAF介导的CD8 T细胞拒绝现在被认可为检查点免疫疗法抗性的主要贡献者，并且CAF已经变为重要的免疫治疗靶标以改善检查点免疫疗法应答率(目前其跨癌症类型是约20％)。对于靶向CAF所提出的治疗可能性包括CAF消耗，从而抑制CAF功能或CAF正常化，但在临床上特异性靶向CAF的先前尝试一直是不成功的。

本发明人已经证明CAF似乎始终表达MAGED4B的事实是非常出人意料的。表达在CAF群体中一律高，并且在肿瘤之间是一致的，70％的分析的HNSCC含有MAGED4B阳性CAF。该CAF MAGED4B表达通过分析scRNASeq HNSCC转录组数据确认(图28)(Puram等人,Cell.2017；171(7):1611-1624，其还确认了由HNSCC细胞的MAGED4B表达)。

产生特异性靶向CAF的免疫应答是非常有吸引力的疗法，并且已经存在通过疫苗接种，例如针对FAP(成纤维细胞激活蛋白)的疫苗接种来靶向CAF的先前尝试。然而，现在已知FAP由其他细胞类型(诸如多潜能骨髓基质细胞)表达并且不是CAF特异性的。本发明的癌症疫苗可以提供的CAF特异性抗原，其中癌症疫苗提供的抗原是MAGED4B蛋白或其变体，除此之外尚未鉴定出CAF特异性抗原。

本发明涉及可用于恢复针对其他抗癌剂、尤其是靶向疗法、免疫疗法和化学疗法的应答性，特别是用于恢复针对基于T细胞的免疫疗法的应答性的疫苗和方法，所述基于T细胞的免疫疗法包括诸如用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂、LAG 3抑制剂、TIGIT抑制剂等的免疫检查点阻断、T细胞激动剂(诸如aCD40、aCD27、OX40等)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞和疫苗。

T细胞介导的肿瘤消除需要来自T细胞受体和共刺激分子的信号以允许肿瘤抗原特异性T细胞的效应子功能。在肿瘤微环境内还存在一系列可以抑制抗肿瘤免疫的免疫抑制机制。使用单克隆抗体克服该抑制，特别是用激动剂Ab靶向肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的共刺激成员增强T细胞功能，从而导致了令人鼓舞的治疗结果。TNFR可以是用于增强肿瘤特异性免疫应答的主要靶标，并且特异性TNFR包括OX40、4-1BB和CD40。

本文所述的癌症疫苗可以以治疗有效剂量单独或与附加癌症疗法组合施用，所述附加癌症疗法诸如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激光疗法、靶向疗法和/或手术，所有所述疗法可以在本文中描述为抗癌剂。所述的癌症疫苗可以提供有益的作用，诸如降低肿瘤大小、减缓肿瘤生长速度、抑制或减缓转移、使肿瘤对免疫应答或抗癌治疗敏感或以其他方式改善整体临床病症，但不一定消除肿瘤。

具体地，对于组合疗法预期了靶向肿瘤细胞的细胞抑制剂和细胞毒性剂、靶向血管生成的药剂(诸如血管生成抑制剂乐伐替尼和索拉非尼)、靶向癌细胞特异性表达的标记物的药剂(即靶向HER2阳性细胞的赫赛汀)、靶向巨噬细胞的免疫疗法、靶向T细胞检查点或激动剂途径的免疫疗法、使用被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR T细胞)、T细胞受体(TCR)的T细胞或体外扩增的T细胞的过继细胞疗法(ACT)和疫苗。

在此所述的组合可以进一步包含免疫检查点抑制剂，例如对细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、PD-1和PDL-1具有活性的药剂，因为这些可以防止对免疫系统中的元件诸如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化以及用于免疫细胞增殖和/或分化的细胞因子、趋化因子或信号传导的抑制。

因此，可以将在此所述的癌症疫苗与检查点抑制剂诸如针对CTLA-4、PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体组合以增加细胞和体液免疫应答两者的刺激，但可以使用任何合适的抑制剂。

因此，可以将在此所述的癌症疫苗与靶向肿瘤细胞的细胞抑制剂和细胞毒性剂、靶向血管生成的药剂、靶向巨噬细胞的免疫疗法、靶向T细胞检查点或激动剂途径的免疫疗法、使用被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR T细胞)、T细胞受体(TCR)的T细胞或体外扩增的T细胞的过继细胞疗法(ACT)、T细胞激动剂和疫苗组合。

MAGED4B抗原

MAGED4B是称为MAGE(黑素瘤抗原编码基因)蛋白的超家族的一部分。MAGE蛋白共享称为MAGE同源结构域(MHD)的保守结构域。

MAGED4B蛋白可以包含全长MAGED4B蛋白序列或由其组成。MAGED4B蛋白可以包含SEQ ID NO:3或SEQ ID No.31的序列或其变体或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B蛋白可以由这样的核酸编码，所述核酸包含SEQ ID NO:7、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26的序列或其变体或者由其组成。

有利地，全长抗原设计可以实现更宽的群体覆盖，其中它不集中于例如靶向单独HLA等位基因，诸如HLA-A2等位基因。

有利地，MAGED4B蛋白可以是截短型的。截短可以涉及去除MAGE同源结构域的全部或一部分(part/portion)。在MAGED4B蛋白中发现两个潜在的同源区，并且两者代表可以允许截短的区域，因为它们是MAGE蛋白之间共有的。两个同源结构域已经在表示在SEQ IDNo.3中的同种型1中被鉴定出在氨基酸412-500和氨基酸510-682处。该序列的长度是741个氨基酸。如果去除两个同源结构域，这将MAGED4B的长度减少260个氨基酸并且仍提供其功能免疫片段。因此，可以去除全长蛋白的高达40％，任选地高达50％，并且剩余的序列仍可以具有足够免疫原性以充当疫苗。可能的截短物描绘于图16中。可能优选的是，保留MHD中的已知表位，诸如HLA-2定义表位RLSLLLVL。该表位位于两个MHD之间。如所描绘的，在疫苗中成功去除了每一个MHD，但可以去除其任何部分。因此，MAGED4B的截短形式可以包括其中去除MHD的一部分或全部的免疫片段。实际上，在去除MHD中进一步，还可以截短另外的残基。作为最低限度，包括如SEQ ID No.3中所述的MAGED4B序列的450个氨基酸。免疫原性片段的长度可以是400、450、500、550、600、650或700个氨基酸或其间的任何数目。各种截短物详述于SEQ ID No.35至SEQ ID No.37中。其他截短物是可能的。本发明人假定，去除MHD可以允许免疫系统更清楚地识别MAGED4B特异性表位。

在此的工作是基于MAGED4B同种型1(SEQ ID No.3)。然而，存在4种同种型，并且包括在SEQ ID No.41-43中。在这些之中，同种型3(SEQ ID No.42)是非常少见的可替代性剪接，其在位置349处具有移码，并且在位置414处终止。由于这些可替代性剪接和由此截短，SEQ ID No.42具有与SEQ ID No.3的85％同一性序列。因此，在替代性定义中，截短物可以具有SEQ ID No.3中所示序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。

在此所述的癌症疫苗可以包含编码SEQ ID No.41-43中所述的任一种MAGED4B蛋白的核酸。这些是SEQ ID No.3的变体。

MAGED4B的变体可以包括MAGED4B的经修饰的和/或经截短的变体。特别地，本领域技术人员应理解，序列的一些修饰物或变体可以提供与未经修饰的序列(即本文所述的MAGED4B序列)相同或基本上类似的免疫原性功能。修饰可以包括氨基酸残基添加、取代或缺失。在一个实施方案中，修饰可以包括不超过20个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过15个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过10个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过8个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过6个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过5个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过4个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过3个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过2个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过一个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。氨基酸残基添加、取代或缺失可以涉及连续氨基酸、多组氨基酸或非连续氨基酸残基或其组合。

MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少99％同一性的序列或由其组成。可替代地，MAGED4B的变体可以包含与SEQ ID NO:3具有至少99.5％同一性的序列或由其组成。

核酸变型/修饰可以包括使用密码子冗余对核苷酸的保守取代以编码相同MAGED4B蛋白或其部分，如由SEQ ID NO:7编码的。

还包括SEQ ID No.7、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26中公开的核酸或其变体。变体可以具有这些序列中的任一个中所示的序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性。这些变体因此涵盖以上在蛋白质中列出的截短物。

癌症疫苗的核酸可以是密码子优化的，诸如SEQ ID No.17中所述的序列。密码子优化的序列可以编码相同肽序列，但是可能的，因为大多数氨基酸由多于一个密码子编码。进行此举以有助于核酸的合成，或防止与宿主基因组的完全同源性。如数据中所示，密码子优化的疫苗表现良好。为了表达的稳定性和高水平，可以使编码序列优化。

编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ IDNO:7具有至少90％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少98％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少99％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码MAGED4B的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:7具有至少99.5％同一性的序列或者由其组成。

序列同一性可以跨越至少600个连续核苷酸或氨基酸残基。可替代地，序列同一性可以跨越至少700个连续核苷酸或氨基酸残基。可替代地，序列同一性可以跨越整个MAGED4B序列。

序列同一性可以跨越至少400个连续氨基酸、至少450个氨基酸、至少500个氨基酸或至少550个氨基酸。

在另一个实施方案中，MAGED4B的变体可以包含SEQ ID NO:3的截短型序列或者由其组成。例如，本文的SEQ ID NO:3的序列可以是截短型的并且仍提供免疫原性。截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少200个氨基酸。截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少300个氨基酸。截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少400个氨基酸。截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少500个氨基酸。可替代地，截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少600个氨基酸。可替代地，截短型序列可以包含SEQ ID NO:3的序列的至少700个氨基酸。合适的截短物描绘于图16中。

FJX1抗原

癌症疫苗可以包含或另外包含编码FJX1(四连接框蛋白1)蛋白或其变体的核酸。所述蛋白质可以是如SEQ ID No.4或SEQ ID No.33中所述的全长蛋白，或者可以是经截短的或经修饰的。在本文中进一步讨论了此类变体、修饰物和截短物。

可替代地定义，癌症疫苗可以包含或进一步包含编码FJX1蛋白的核酸，所述核酸序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中所述，或者其变体和截短形式。变体和截短物如本文所定义。

FJX1蛋白可以包含全长FJX1蛋白序列或由其组成。FJX1蛋白可以包含SEQ ID NO:4的序列或其变体或者由其组成。在另一个实施方案中，FJX1蛋白可以由这样的核酸编码，所述核酸包含SEQ ID NO:8的序列或其变体或者由其组成。

如先前讨论的，全长抗原设计可以实现更宽的群体覆盖，其中它不集中于例如靶向单独HLA等位基因，诸如HLA-A2。

FJX1的变体可以包括FJX1的经修饰的和/或经截短的变体。特别地，本领域技术人员应理解，序列的一些修饰物或变体可以提供与未经修饰的序列(即本文所述的FJX1序列)相同或基本上类似的免疫原性功能。修饰可以包括氨基酸残基添加、取代或缺失。在一个实施方案中，修饰可以包括不超过20个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过15个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过10个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过8个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过6个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过5个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过4个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过3个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过2个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。在另一个实施方案中，修饰可以包括不超过一个氨基酸残基的添加、取代或缺失或者由其组成。氨基酸残基添加、取代或缺失可以涉及连续氨基酸、多组氨基酸或非连续氨基酸残基或其组合。FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:33具有至少80％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:33具有至少85％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33具有至少95％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33具有至少98％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:33具有至少99％同一性的序列或由其组成。可替代地，FJX1的变体可以包含与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:33具有至少99.5％同一性的序列或由其组成。

核酸变型/修饰可以包括使用密码子冗余对核苷酸的保守取代以编码相同FJX1蛋白或其部分，如由SEQ ID NO:8或SEQ ID No.20或SEQ ID No.21编码的。

癌症疫苗的核酸可以是密码子优化的，诸如SEQ ID No.21中所描述的序列。密码子优化的序列可以编码相同肽序列，但是可能的，因为大多数氨基酸由多于一个密码子编码。进行此举以有助于核酸的合成，或防止与宿主基因组的完全同源性。

编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ IDNO:8具有至少95％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少98％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少99％同一性的序列或者由其组成。可替代地，编码FJX1的核酸的变体可以包含与SEQ ID NO:8具有至少99.5％同一性的序列或者由其组成。该段落中的SED ID No.8可以用SEQ ID No.20或SEQ ID No.21取代。

序列同一性可以跨越至少300个连续核苷酸或氨基酸残基上。可替代地，序列同一性可以跨越至少400个连续核苷酸或氨基酸残基。可替代地，序列同一性可以跨越整个FJX1序列。

在另一个实施方案中，FJX1的变体可以包含SEQ ID NO:4的截短型序列或者由其组成。例如，本文的SEQ ID NO:4的序列可以是截短型的并且仍提供免疫原性。截短型序列可以包含SEQ ID NO:4的序列的至少200个氨基酸。截短型序列可以包含SEQ ID NO:4的序列的至少300个氨基酸。截短型序列可以包含SEQ ID NO:4的序列的至少400个氨基酸。因此，还涵盖了根据本文公开的任何序列的FJX1的免疫原性片段。

组合的MAGED4B和FJX1

在一个实施方案中，核酸编码MAGED4B和FJX1两者或其变体。在一个实施方案中，核酸编码MAGED4B和FJX1两者或其变体，在两者之间具有接头。

MAGED4B和FJX1抗原可以编码为单一融合蛋白，或编码用于单独表达。MAGED4B可以被编码在FJX1的N末端。

组合可以扩展为单一转录单元，诸如MAGED4B-2A肽-FJX1。2A自切割肽或2A肽是一类18-22aa长的肽，其可以在蛋白质在细胞中翻译期间诱导核糖体跳跃。这些肽共享DxExNPGP的核心序列基序，并且可见于广泛范围的病毒家族。它们通过致使核糖体在形成肽键方面失败而有助于产生多蛋白。

辅助基序

在此所述的癌症疫苗可以提供有提供辅助基序的核酸。如本文所用，辅助基序是增强或改善癌症疫苗的免疫原性的基序。这种可以定义为佐剂、辅助表位、免疫原性片段、细胞因子。

胞质核酸识别时的炎症性信号本身可以经由主要促炎途径的激活增强免疫原性，但如果核酸疫苗包含作为序列基序诸如CpG基序的辅助基序，则可以进一步引发该作用。未甲基化CpG基序可以经由刺激通过Toll样受体(TLR)9的先天性免疫系统而独自具有免疫刺激作用。

因此，辅助基序可以是已知刺激免疫系统而不需要表达的核酸基序。

辅助基序可以编码刺激免疫系统的蛋白质或多肽或者其免疫原性片段。因此，辅助基序在细胞中表达。辅助基序可以与癌症疫苗抗原存在相同的构建体上，或者可以提供在单独构建体上。有利地，可以将两者一起提供在相同核酸构建体上。如果两者提供在一起，则它们可以在相同或不同启动子的控制下。有利地，这些可以作为转录或翻译融合体提供。转录融合体允许将要组合的编码序列，但不导致杂交或融合蛋白的产生。还可以提供翻译融合体，其中表达的产物是杂交蛋白。这种可以对于疫苗接种是优选的。如在此所述的接头分子可以用于将癌症抗原和辅助基序以基因融合体和多肽融合体方式连接在一起。

例如，也可以将编码细胞因子或趋化因子的核酸序列直接与核酸疫苗在构建体上或在单独构建体上一起递送。这使得能够与癌症疫苗抗原同时且在相同区域中显现细胞因子或趋化因子。合适的核酸编码细胞因子或趋化因子，诸如白介素(IL)-10、IL-12、树突状细胞靶向趋化因子MIP3α或IFN-γ或下文进一步讨论的那些。因此，辅助基序可以是编码细胞因子的核酸。

此外，核酸序列可以编码免疫系统刺激物，其也可以直接与疫苗一起递送。这种可以包括包含运输信号(诸如MHC I类运输信号(MITD))等的序列。

可替代地，辅助基序可以通过其他手段，诸如通过颗粒的形成来提供免疫刺激。PVXCP编码马铃薯病毒X外壳蛋白，其与DOM类似地通过关联T细胞辅助的机制提供免疫刺激并且允许增强表达多肽的免疫原性的颗粒的形成。

作为进一步实例，辅助基序可以编码已知诱导强烈免疫应答的蛋白质、多肽或其免疫原性片段。如本文详述的，这种包括破伤风毒素免疫原性片段，特别是DOM。其他合适的辅助表位可以来源于大肠杆菌热不稳定毒素的B亚基、破伤风毒素的片段C、白喉毒素B亚基、大肠杆菌热不稳定毒素片段、霍乱毒素片段、OVA肽和/或钙网蛋白、HIV蛋白NEF(负调控因子)、HBV表面抗原、混杂CD4表位PADRE。

本文呈现了实例，其中将各种辅助基序诸如CpG基序、MITD、PVXCP和MIP3α与癌症疫苗组合使用。

合适的辅助基序包括编码以下的核酸序列：Flt3L、Flt3L-Fc融合、CD80、CD80-Fc融合、OX40L、IL-15、4-1BBL、GM-CSF、CCL21a、IL-23、CCL27、CXCL10、CCL5、CCL3、LAG3、IL-15RA、CXCL10、CpG、大肠杆菌热不稳定片段、霍乱毒素片段、钙网蛋白、HIV NEF、HBV sAg、PADRE、IRF1、CCL25、IL-33和/或IL-28B。

当辅助基序是如本文所述的破伤风毒素的免疫原性片段时，已经获得特定结果。

破伤风毒素的免疫原性片段DOM

破伤风毒素的免疫原性片段可以不具有全长破伤风毒素的毒性功能性。在一个实施方案中，破伤风毒素的免疫原性片段可以不包含神经元结合结构域，或可以不包含功能性结合结构域。在一个实施方案中，破伤风毒素的免疫原性片段可以包含破伤风毒素的p30MHC II表位或者由其组成。在一个实施方案中，破伤风毒素的免疫原性片段包含DOM或者由其组成。DOM可以包含SEQ ID NO:2的序列或其变体或者由其组成。

DOM是破伤风梭菌的破伤风毒素的免疫原性片段(1)，其对于人使用是安全的，因为它不含有造成痉挛性麻痹的神经元结合结构域。有利地，DOM含有‘混杂’p30 MHC II表位和潜在的其他CD4 T细胞表位。已知P30能够与一系列小鼠和人MHC II类分子结合并且诱导强的CD4+辅助T细胞应答，所述辅助T细胞应答为经由激活树突状细胞(所谓的关联T细胞机制)诱导肿瘤特异性CD4和CD8 T细胞应答所需的(2,3)。进一步有利地，DOM具有不能通过免疫显性的过程与癌症表位竞争的多个弱CD8表位，这进一步提供了用于包含至根据本发明的DNA疫苗中的益处，所述DNA疫苗旨在诱导针对癌症抗原的强效T细胞应答。

在一个实施方案中，本文中对DOM的提及可以可替代地被破伤风毒素的另一免疫原性片段替换。特别地，本文中对DOM的提及可以被破伤风毒素的p30或p2表位、或其他破伤风毒素CD4辅助表位单独或组合地取代。

DOM可以作为辅助基序与本文所述的任何癌症疫苗一起存在。它可以被描述为辅助表位，因为它包含可以有助于诱导强免疫应答的表位。在此所示的数据支持这一点(图11A)。

DNA疫苗的各种组装示出于图7中。

组合的DOM、MAGED4B和FJX1

在一个实施方案中，核酸编码DOM与MAGED4B和/或FJX1或其变体。在另一个实施方案中，核酸编码DOM与MAGED4B和FJX1或其变体。

在一个实施方案中，DOM、MAGED4B和FJX1被编码为单一融合蛋白。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和FJX1之一编码为单一融合蛋白。

DOM可以被编码在MAGED4B和/或FJX1的N末端。

DNA疫苗的各种组装在图7中示出。可以使用任何合适的组装，包括单一转录单元诸如MAGED4B-2A肽-FJX1。

其他元件

应当理解，以下章节适用于有用的任一种癌症疫苗，包括单一抗原或两种抗原。

在一个实施方案中，可以在DOM、MAGED4B和FJX1的抗原中的一者或多者或者全部之间提供接头残基。接头残基可以包含随机氨基酸序列，或基于表位预测计算机程序或动物模型中的实验选择为非免疫原性的氨基酸。例如，如果预测或已知其为表位(即为了避免针对自然界中未发现的表位(例如人工表位)的免疫应答)，则不将其视为接头。接头可以是柔性的。接头可以包含K、G、P或S氨基酸残基或其组合或者由其组成。在一个实施方案中，接头可以包含G和/或P氨基酸残基或者由其组成。接头残基的长度可以在1与10个氨基酸之间。在另一个实施方案中，接头残基的长度可以在2与8个残基之间。在另一个实施方案中，接头残基的长度可以在1与7个残基之间。

MAGED4B和FJX1融合蛋白可以包含MAGED4B与FJX1序列之间的接头。MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约1至约10个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约1至约6个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约1至约5个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约2至约6个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约2至约5个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约3至约5个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约4至约6个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含约5个氨基酸或者由其组成。

MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含选自G、S、T和A的3-5个氨基酸或者由其组成。MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含G和/或S残基或者由其组成。在一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含交替性G和/或S残基或者由其组成。在一个实施方案中，MAGED4B与FJX1之间的接头可以包含GSGSG(SEQ ID NO:6/接头2)或者由其组成。替代性接头可以包含GGGGG(SEQ ID NO:10)或SSSSS(SEQ ID NO:11)或者由其组成。甘氨酸和丝氨酸氨基酸是柔性的，当包含在接头中时，它们允许用于高效表达的蛋白质柔性。

这种接头的优点是它们不具有显著免疫原性，这将使假表位最小化(我们已使用MHC I预测算法来预测连接肽(junctional peptides)的不存在)。接头是柔性的，不会显著影响抗原的结构，以允许高效的翻译和蛋白酶体加工以便于由MHC呈递。

在编码DOM与MAGED4B和/或FJX1融合蛋白的实施方案中，融合蛋白可以包含在DOM的序列与MAGED4B和/或FJX1的序列之间的接头。DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约1至约10个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约1至约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约2至约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约4至约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约5至约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约6至约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约7个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约8个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约9个氨基酸或者由其组成。在另一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1序列之间的接头可以包含约10个氨基酸或者由其组成。

在一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1之间的接头可以包含AAAGPGP(SEQID NO:5/接头1)或者由其组成。DOM与MAGED4B和/或FJX1之间的接头可以包含选自G、S、T和A的3-10个氨基酸或者由其组成。可替代地，DOM与MAGED4B和/或FJX1之间的接头可以包含选自G、S、T和A的3-5个氨基酸或者由其组成。在一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1之间的接头可以包含交替性G和/或S残基或者由其组成。在一个实施方案中，DOM与MAGED4B和/或FJX1之间的接头可以包含GSGSG(SEQ ID NO:6/接头2)或者由其组成。替代性接头可以包含GGGGG(SEQ ID NO:10)或SSSSS(SEQ ID NO:11)或者由其组成。

有利地，接头AAAGPGP(SEQ ID NO:5/接头1)使假表位的发生最小化并且插入限制性酶Not I位点以有助于克隆。特别地，已经利用MHC I预测算法来预测连接肽的不存在。此外，接头是柔性的并且不会显著影响抗原的结构，以允许高效的翻译和蛋白酶体加工以便于由MHC呈递。

核酸可以进一步编码前导序列，诸如用于增强分泌的功效的信号肽。前导序列可以包含IgH信号肽(诸如mus IgH信号肽)或其直系同源物或者由其组成。前导序列可以包含序列MGWSCIIFFLVATATGVHS(SEQ ID NO:1)或其功能性变体或者由其组成。前导序列可以在DOM序列的N末端，并且与其形成融合肽的一部分。

核酸可以包含一个或多个启动子。启动子可以包括真核细胞启动子，并且核酸可以任选地进一步包含原核细胞启动子，诸如T7。在一个实施方案中，启动子是双重真核细胞/原核细胞启动子。启动子可以是强启动子。在一个实施方案中，启动子是病毒启动子。启动子可以选自包括以下的组中的任一种：猿猴病毒40早期启动子(SV40)、巨细胞病毒即刻-早期启动子(CMV)、T7、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1A)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)和与CMV早期增强子(CAGG)偶联的鸡β-肌动蛋白启动子。在一个实施方案中，启动子包括CMV。在一个实施方案中，启动子包括例如根据SEQ ID NO:9的CMV/T7双重启动子。在一个实施方案中，启动子包括包含SEQ ID NO:9或其功能性变体或者由其组成的CMV/T7双重启动子。SEQ ID NO:9的变体可以与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。

启动子可以被编码在待表达的抗原性蛋白(例如DOM、MAGED4B和/或FJX1)的N末端。应当理解，这意指启动子在编码序列的上游。启动子仅需要可操作地连接至编码序列。

在其中MAGED4B和FJX1表达为单独多肽的实施方案中，核酸可以包含针对每种多肽的启动子。可以对于待表达的抗原中的一种或多种或者全部使用单一启动子。

核酸可以编码polyA转录终止序列。在一个实施方案中，polyA转录终止序列是包含序列基序AAUAAA的哺乳动物终止子，其促进聚腺苷酸化和终止两者。哺乳动物终止子可以是SV40、hGH、BGH和rbGlob中的任一种。在一个实施方案中，polyA转录终止序列是牛生长激素(BGH)polyA转录终止序列。聚腺苷酸化信号可以在癌症抗原的编码序列的下游。聚腺苷酸化信号可以是LTR聚腺苷酸化信号、聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的聚腺苷酸化信号。

在一个实施方案中，核酸是编码以下的DNA：

包含DOM抗原、全长MAGED4B抗原和全长FJX1抗原，并且具有被编码于每种抗原之间的接头残基的单一融合多肽；

N末端CMV/T7启动子；以及

C末端PolyA序列。

在另一个实施方案中，核酸是编码以下的DNA：

包含DOM抗原与全长MAGED4B抗原或全长FJX1抗原之一，并且具有被编码于每种抗原之间的接头残基的单一融合肽；

N末端CMV/T7启动子；以及

C末端PolyA序列。

理想地，CMV/T7启动子可以被CMV启动子替换。

核酸可以是编码以下的DNA：

包含辅助基序和MAGED4B抗原的单一融合多肽；

可操作连接的启动子；以及

PolyA信号序列。

核酸可以是编码以下的DNA：

包含DOM抗原和MAGED4B抗原的单一融合多肽；

可操作连接的启动子；以及

PolyA信号序列。

核酸可以包含编码本文所述的SEQ ID NO:2-4或其变体的序列。在另一个实施方案中，核酸可以包含编码本文所述的SEQ ID NO:1-4或其变体的序列。在另一个实施方案中，核酸可以包含编码本文所述的SEQ ID NO:2-6或其变体的序列。在另一个实施方案中，核酸可以包含编码本文所述的SEQ ID NO:1-6或其变体的序列。

编码MAGED4B和/或FJX1的核酸可以提供在适当的骨架载体中以进行递送和体内表达。在一个实施方案中，骨架载体包括pcDNA3.0载体。

任何合适的核酸构建体可以用于疫苗。对于DNA疫苗，DNA可以呈质粒、微环、单链环或闭合线性DNA。闭合线性DNA可以是优选的，因为可以不包含细菌序列并且它是被设计用于诸如DNA疫苗的用途的最小载体。

在一个实施方案中，核酸可以包含选自如本文所述的pDOM MAGED4B-FJX1、pDOMMAGED4B和pDOM FJX1中的任一种载体或者由其组成。

在一个实施方案中，核酸可以包含选自DB MAGED4B-FJX1、DBMAGED4B和DB FJX1中的任一种构建体或者由其组成。这些可以进一步包含DOM。已经关于这些闭合线性DNA结构测试了各种架构；这些描绘于图18中。

在一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:12的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:13的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:14的序列或者由其组成。

在一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:16的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:17的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:18的序列或者由其组成。在一个实施方案中，核酸可以包含SEQ IDNO:19的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:20的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:21的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:22的序列或者由其组成。在另一个实施方案中，核酸可以包含SEQ ID NO:23的序列或者由其组成。

核酸可以包含DNA或者由其组成。核酸可以包含RNA、诸如mRNA或自复制RNA或者由其组成。还设想了人工核酸，如本文讨论的。

核酸可以是线性的或呈环状形式，例如在质粒中。核酸可以包含哺乳动物表达载体(诸如pcDNA3.0载体)的序列或其等同物。本领域技术人员将认识到，任何适当的哺乳动物表达载体可以用于插入根据本发明的核酸。可能优选的是，载体是闭合线性DNA。

癌症疫苗可以包括组合物。例如，癌症疫苗可以核酸在药学上可接受的载体中的形式提供。MAGED4B和/或FJX1抗原可以编码在相同组合物中的单独核酸，诸如载体上。

另外的定义

如本文所用，“编码序列或“编码”可以意指包含编码蛋白质或其片段的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包含与调控元件可操作连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。

如本文所用，关于蛋白质的“片段”或“免疫片段”可以意指能够在哺乳动物中引发免疫应答、与本文公开的抗原发生交叉反应的蛋白质或其多肽部分。片段可以是选自本文所述的各种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。蛋白质的片段可以包含蛋白质的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

如本文所用，在核酸或蛋白质/多肽序列的背景下的“同一性”意指其序列与参考序列跨越指定区域具有指定百分比的相同残基。可以通过以下方式来计算百分比：使两个序列最佳对齐、跨越指定区域来比较两个序列、确定在两个序列中出现相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。任选地，在本文中提及序列之处，还涵盖优选地具有至少50％同一性，55％、60％、65％、70％、75％、80％序列同一性，85％、90％、93％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

如本文所用，核酸可以是单链的或者双链的，或者可以含有双链或者单链序列两者的节段。核酸可以是DNA(包括cDNA)、RNA或其杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括天然碱基(尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉)和非天然碱基(诸如肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的碱基的组合。核酸可以由任何核苷酸构成。这些核苷酸可以是天然的、经修饰的或人工的。可以将核苷酸聚合以形成RNA、DNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、其杂交体和混合物以及任何其他人工(异种)核酸。可能优选的是，多核苷酸是DNA或其修饰形式(即在骨架、糖残基或核碱基中具有修饰)。ModRNA被视为用于形成疫苗的适当核酸。

核酸可以呈任何适当的形式并且包括可能需要的任何另外序列或元件。核酸可以是质粒(双链环状)、微环、闭合线性DNA、单链环状DNA或适于将疫苗递送至细胞的任何其他核酸构建体。核酸可以是RNA，诸如mRNA(信使RNA)、自复制RNA或非复制mRNA，诸如适于体外转染树突状细胞的非复制mRNA。

如本文所用，“可操作连接”可以意指编码序列的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下。启动子可以被定位于在其控制下的编码序列的5'(上游)或者3'(下游)。

如本文所用，“启动子”意指合成的或天然来源的序列，其能够赋予、激活或增强细胞中的编码序列的表达。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或响应于外部刺激(诸如诱导剂)而组成型地或差异性地调控基因组分的表达。合适的启动子的实例包括lac操纵子-启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV启动子或SV40启动子(例如pcDNA3.1、pVAX1、pVIVO2、pCI、pCMV和pSV2)。

术语“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的蛋白质的N末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。

如本文所用，“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的激活。免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或两者的形式。优选的是，引发的免疫应答是CD4+和CD8+T细胞应答。

如本文所用，“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏(repressing)的手段保护动物(包括人)免受疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物(诸如人)施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在临床出现之前向动物(人)施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在临床症状出现之后向动物(人)施用本发明的疫苗。

癌症可以是任何癌症，包括但不限于头颈癌、口腔癌、口咽癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、皮肤黑素瘤、直肠癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、肾癌和胃腺癌。

癌症疫苗可以用于预防恶性或癌细胞发展。在一些情况下，可以检测到癌症发展之前的细胞变化，并且施用或使用癌症疫苗以预防癌症的发展。因此，癌症疫苗可以用于治疗恶性前细胞。此外，细胞在获得癌症表型之前可能进展通过若干种表型。因此，癌症的预防涉及癌性前但侵入性细胞类型的治疗。例如，在口腔癌症中，细胞可能通过若干种表型，包括但不限于口腔恶性前病变(OPML)：黏膜白斑病、黏膜红斑病、扁平苔癣和口腔上皮发育异常。进一步示例性地，一些肺癌可以通过若干种表型，包括但不限于鳞状上皮化生、非典型腺瘤样增生和/或原位鳞状癌(CIS)。

癌症疫苗可以预防肿瘤生长。癌症疫苗可以减少肿瘤生长。疫苗可以预防肿瘤细胞的转移。癌症疫苗可以降低肿瘤细胞的免疫逃避。癌症疫苗可以靶向治疗，疫苗的癌症抗原诱导或引发针对癌症或肿瘤表达抗原或针对癌症或肿瘤表达抗原反应性的免疫应答。诱导或引发的细胞免疫应答可以包括干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌和/或含有穿孔素/颗粒酶的细胞溶解颗粒的形成。在其他实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以减少或抑制促进表达抗原的肿瘤或癌症生长的一种或多种免疫抑制因子，例如但不限于：下调MHC呈递的因子，上调抗原特异性调控性T细胞(Treg)、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞的因子，由免疫抑制细胞、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子产生的可溶性因子。

疫苗可以使施用疫苗的受试者中的细胞免疫应答与未施用疫苗的受试者中的细胞免疫应答相比增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。

疫苗可使施用疫苗的受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平与未施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平相比增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。

癌症疫苗可以是DNA。DNA疫苗可以进一步包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。

癌症疫苗可以是一种或多种癌症抗原的RNA。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，诸如为安全的，使得疫苗本身不会对正常细胞有害、引起疾病或死亡；保护免受疾病；诱导保护性T细胞应答；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性和每剂量的低成本，特别是在使用闭合线性DNA的情况下。

癌症疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂或“检查点抑制剂”)。免疫检查点抑制剂是防止对免疫系统中任何组分的抑制的任何核酸或蛋白质，所述任何组分诸如MHC类别呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化以及用于免疫细胞增殖和/或分化的细胞因子、趋化因子或信号传导。可以将癌症疫苗进一步与针对检查点抑制剂诸如CTLA-4、PD-1和PDL-1的抗体组合以增加细胞和免疫应答的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体防止PD-1或PDL-1抑制T细胞和应答。

组合疗法

可以将癌症疫苗与另一种治疗或预防活性成分组合用作疫苗。癌症疫苗可以与佐剂组合用作疫苗。

治疗或预防活性剂可以是任何抗癌剂。

合适的抗癌剂包括化学治疗剂，包括但不限于烷基化剂、芥子气衍生物(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑和异环磷酰胺)、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、肼和三嗪、亚硝基脲(nitrosureas)、金属盐(诸如卡铂、顺铂和奥沙利铂)、植物生物碱、长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素、喜树碱类似物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、色霉素、丝裂霉素、博来霉素、抗代谢物、叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂、腺苷脱氨酶抑制剂和拓扑异构酶(I和II)抑制剂。

合适的抗癌剂包括免疫治疗剂，包括但不限于免疫检查点抑制剂、T细胞转移疗法、过继细胞疗法、过继免疫疗法或免疫细胞疗法、抗体疗法、疫苗或免疫系统调节剂。进一步预期了靶向T细胞检查点或激动剂途径的免疫疗法、使用被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR T细胞)、T细胞受体(TCR)的T细胞或体外扩增T细胞的过继细胞疗法(ACT)。

合适的抗癌剂可以包括放射疗法或类辐射作用物质、靶向疗法、手术或激光疗法。

合适的抗癌剂包括靶向疗法。此类疗法取决于被治疗的癌症，并且可能涉及分析癌细胞正在表达哪种基因或需要审查构成诱变基础的是哪种基因突变。本文描述了若干种靶向疗法，并且包括靶向肿瘤细胞的细胞抑制剂和细胞毒性剂、靶向血管生成的药剂(诸如血管生成抑制剂乐伐替尼和索拉非尼)、靶向癌细胞特异性表达的标记物的药剂(即靶向HER2阳性细胞的赫赛汀)、靶向巨噬细胞的疗法、靶向T细胞检查点或激动剂途径的疗法等。

另外或可替代地，可以将根据本发明的癌症疫苗单独或与检查点抑制剂组合用于预防或治疗癌症。检查点抑制剂可以包括抗PD1结合分子。结合分子包括抗PD1抗体或其片段。在另一个实施方案中，检查点抑制剂可以包括抗CTLA4结合分子。

有利地，本文的临床前数据证明，靶向MAGED4B/FJX1并且具有抑制表达这些抗原的肿瘤生长的显著潜力的DNA疫苗可以通过与检查点抑制剂、诸如抗PD1或抗CTLA4结合分子组合而进一步增强。

抗PD1结合分子可以包括抗体或抗体变体，诸如抗体片段或抗体模拟物。抗体或其变体可以是单克隆的。在一个实施方案中，抗体或其变体可以包含纳武单抗(Nivolumab)或与纳武单抗竞争结合的抗体或其变体或者由其组成。在一个实施方案中，抗体或其变体可以包含纳武单抗的六个重链和轻链CDR。在替代性实施方案中，抗体或其变体可以包含纳武单抗的可变重链和轻链序列。

抗CTLA4结合分子可以包括抗体或抗体变体，诸如抗体片段或抗体模拟物。抗体或其变体可以是单克隆的。在一个实施方案中，抗体或其变体可以包含伊匹单抗(Ipilimumab)或与伊匹单抗竞争结合的抗体或其变体或者由其组成。在一个实施方案中，抗体或其变体可以包含伊匹单抗的六个重链和轻链CDR。在替代性实施方案中，抗体或其变体可以包含伊匹单抗的可变重链和轻链序列。

在一个实施方案中，检查点抑制剂(诸如抗PD1或抗CTLA4结合分子)可以通过提供/施用用于体内表达的编码检查点抑制剂的核酸来提供。检查点抑制剂可以被编码在质粒上。检查点抑制剂可以包括DNA编码的单克隆抗体(DMAb)，例如如Perales-Puchalt等人(Oncotarget.2019年1月1日；10(1):13-16.doi:10.18632/oncotarget.26535)中所述的，该文献通过引用并入本文。

DNA编码的单克隆抗体(DMAb)可以有助于克服为反复出现的问题的在生产、稳定性、对于抗体施用和长期静脉内施用的频繁高剂量需要方面的困难。合成设计的DMAb可以简化基于MAb的疗法的设计和实现。通过质粒DNA注射和电穿孔递送的DMAb已经在临床前模型中用于治疗或预防感染性疾病、癌症和心血管疾病。Perales-Puchalt等人(Oncotarget.2019年1月1日；10(1):13-16.doi:10.18632/oncotarget.26535)和DuperretEK等人(Cancer Res.2018；78:6363-70)(将两者通过引用并入本文)报道，免疫检查点阻断剂可以被优化并在体内递送，从而通过抗CTLA4和抗PD1抗体的优化、表达和体内功能性表征进一步推进DMAb技术。

所述使用可以是以组合配制品的形式。在另一个实施方案中，所述使用可以是并发或依序施用(例如单独配制，但一起施用)。在一个实施方案中，根据本发明的疫苗可以在检查点抑制剂之前施用。

根据本发明的另一方面，提供了由本文所述的癌症疫苗的核酸编码的融合多肽。

根据本发明的另一方面，提供了组合物，其包含根据本发明的癌症疫苗。

组合物例如在哺乳动物诸如人中可以是免疫原性的。组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。组合物可以是包含药学上可接受的载体的药物组合物。组合物可以用于在预防或治疗癌症中使用。

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗或预防癌症的试剂盒，所述试剂盒包含

-根据本发明的癌症疫苗；以及

-检查点抑制剂，诸如抗PD1结合分子。

-根据本发明的第一癌症疫苗，其中核酸编码MAGED4B；

-根据本发明的第二癌症疫苗，其中核酸编码FJX1；以及任选地，

-检查点抑制剂，诸如抗PD1结合分子。

因此，可以提供用于治疗或预防癌症的试剂盒，所述试剂盒包含

-癌症疫苗，其包含编码MAGED4B抗原或其变体的序列；以及

-检查点抑制剂，诸如抗PD1结合分子。

-第一癌症疫苗，其中核酸编码MAGED4B或其变体，以及

-检查点抑制剂，诸如抗PD1结合分子。

癌症疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点抑制剂可以是防止对免疫系统中任何组分的抑制的任何核酸或蛋白质，所述任何组分诸如MHC类别呈递、T细胞呈递和/或分化、以及用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号传导。

免疫检查点抑制剂可以是编码抗体、其变体、其片段或其组合的一种或多种核酸序列。在其他实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变体、其片段或其组合。

免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。

PD-1和PD-L1

免疫检查点分子可以是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白。PD-1是免疫球蛋白超级族的成员并且表达于T细胞和原代B细胞上，并且因此促成这些细胞的归宿和/或分化。特别地，PD-1是T细胞调控剂的CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白并且负调控T细胞受体(TCR)信号，从而负调控免疫应答。PD-1可以负调控CD8+T细胞应答，并且由此抑制CD8介导的细胞毒性并增强肿瘤生长。

PD-1具有两种配体PD-L1和PD-L2，所述配体是B7家族的成员。PD-L1在响应于LPS和GM-CSF治疗的巨噬细胞和树突状细胞(DC)上被上调以及在TCR受体信号传导时在T细胞上被上调。PD-L1由若干种肿瘤细胞系表达。

抗免疫检查点分子抗体

免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体可以结合免疫检查点分子或与之反应。因此，抗体可以被视为抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可以由包含在癌症疫苗中的核酸序列编码，或可以作为抗体提供。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。

癌症疫苗构建体

癌症疫苗可以包含编码癌症抗原的核酸构建体。核酸构建体可以包括或含有一种或多种异源核酸序列。构建体可作为功能性染色体外分子存在于细胞中。构建体优选地是闭合线性DNA分子。

闭合线性DNA通常被理解为在每端共价闭合的双链DNA。DNA的双链节段因此是互补的。当变性时，闭合线性DNA可以形成单链环。DNA可以通过任何适合的结构在每端闭合，所述结构包括十字形、发夹或发夹环，这取决于偏好。闭合线性DNA的末端可以由非互补序列构成，从而迫使DNA在十字形、发夹或发夹环处成为单链构型。可替代地，序列可以是互补的。可能优选的是，末端通过针对原端粒酶(protelomerase)的靶序列的一部分形成。原端粒酶靶序列是任何DNA序列，其在DNA模板中的存在允许原端粒酶的酶活性，所述酶活性切割DNA的双链节段并且重新连接它们，从而留下共价闭合端。一般来讲，原端粒酶靶序列包含任何完美回文序列，即具有两重旋转对称性的任何双链DNA序列，或完美反向重复序列。闭合线性DNA可以在一端或两端具有原端粒酶靶序列的一部分。该部分有效地是整个双链识别位点的单链。原端粒酶靶序列在每端可以具有相同同源原端粒酶，或者对于每端要求不同的原端粒酶。经由各种原端粒酶的作用构建的闭合线性DNA先前已经公开于WO2010/086626、WO2012/017210和WO2016/132129中(所有这些文献通过引用并入本文中)。使用体外DNA扩增之后用原端粒酶切割构建的闭合线性DNA具有在体外无细胞环境中产生闭合线性DNA并且可以放大用于商业生产的优点。这些闭合线性DNA载体已知为Doggybone DNA或dbDNA^TM。优选的是，闭合线性DNA载体使用本申请人的先前方法，以体外无细胞方式制备，所述先前方法是基于对具有至少一种原端粒酶靶序列的DNA模板进行基于聚合酶的扩增，并且用原端粒酶加工扩增的DNA以产生闭合线性DNA。

闭合线性DNA可以通过将具有必需原端粒酶靶序列的质粒转化为闭合线性DNA载体来构建，但这不是高效的生产方法。

已经通过各种体外策略构建了其他闭合线性DNA载体，所述策略包括对PCR产物的加帽和“简约免疫原性定义基因表达(MIDGE)”载体。MIDGE通过以下方式产生：在从细菌细胞分离质粒之后消化原核和真核骨架两者，之后将所需DNA序列连接到发夹序列中以进行末端再填充。

基于原端粒酶的作用在细胞培养中以体内方式产生的DNA“微线(ministring)”也是将适于在本发明中使用的闭合线性DNA载体。

可能合适的闭合线性DNA的其他形式包括在末端以十字形结构闭合的那些，其同样可以在细胞培养中制备。

可能优选的是，在无细胞系统中生产闭合线性DNA，因为这确保了产物的纯度，在替代性方案中，监管机构将要求通过细胞方法对闭合线性DNA进行严格纯化。

核酸构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。

如本文所述的癌症疫苗可以能够以有效在动物中引发免疫应答的量在动物的细胞中表达癌症抗原。癌症疫苗可用于用编码癌症抗原的核酸转染细胞，其中发生上述抗原的表达。闭合线性DNA显示为用于DNA疫苗的有效构建体。

制备疫苗的方法

可以使用已知设备和技术的组合配制或生产闭合线性DNA分子，但优选地，它们使用如WO2010/086626、WO2012/017210和WO2016/132129中所述的无细胞合成方法生产。

可以使用标准重组技术来制备DNA构建体。

其他方面

根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的癌症疫苗或组合物，用于作为药物使用。

根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的癌症疫苗或组合物，用于在受试者中治疗或预防癌症的用途。

根据本发明的另一方面，提供了在受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用根据本发明的癌症疫苗或组合物。

待治疗或预防的癌症可以是口腔癌和/或口咽癌。口腔癌和/或口咽癌可以是HPV阴性或阳性口腔癌和/或口咽癌。在一个实施方案中，癌症是口腔癌。在另一个实施方案中，癌症是口咽癌。在一个实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，待治疗的癌症可以是肺癌或鼻咽癌。

癌症的特征可以为表达或过表达MAGED4B和/或FJX1的癌细胞。

癌症的特征可以为表达或过表达MAGED4B的肿瘤相关细胞。

癌症抗原的表达可以通过常规方法确定，所述常规方法诸如用相关抗体查询活检或样品，和/或探测细胞中存在的RNA序列。

癌症的特征另外或可替代地可以为与过表达MAGED4B的CAF相关。此类细胞可以保护癌细胞免受免疫系统和其他抗癌剂的影响。

癌症抗原在癌症和癌症相关细胞上的表达可以与来自相同组织或器官的正常细胞比较地确定。表达或过表达因此可以是相对于正常细胞的比较性表达水平。

在一个实施方案中，在治疗或预防之前对受试者针对MAGED4B和/或FJX1抗原在其癌性组织中的存在进行测试。在另一个实施方案中，在治疗或预防之前对受试者针对MAGED4B和/或FJX1抗原在其癌性组织中的水平进行测试。如果受试者在其癌性组织或细胞中具有MAGED4B和/或FJX1抗原，或相对于等同的非癌性组织或细胞具有其过表达，则可以选择所述受试者用于治疗或预防。可以针对癌症抗原表达、尤其是MAGED4B表达测试肿瘤周围的细胞。

本领域技术人员将熟悉疫苗施用途径和剂量。例如，施用可以是皮下、肌肉内或静脉内的。典型的剂量可以是约4-8mg/患者/受试者，施用一次或多次。例如，可以施用多次剂量，直到观察到治疗效果。在一个实施方案中，使用体内电穿孔以增强向体内或离体细胞中的递送。

受试者可以是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者可以是家畜或牲畜。

根据本发明的另一方面，提供了多肽，其包括MAGED4B蛋白或其变体或截短形式。多肽可以作为与辅助基序的融合体呈现。多肽可以作为与DOM的融合体呈现。示例性多肽序列在此描述为SEQ ID No.32、35、36和37。可以将MAGED4B序列与如由SEQ ID No.12编码的FJX1(在该情况下与DOM)融合。

癌症疫苗组合物

疫苗可以呈组合物、任选地药物组合物的形式。药物组合物可以包含约5纳克至约10mg的疫苗。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的疫苗DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mg的疫苗DNA。

组合物可以进一步包含用于配制目的的其他添加剂，其可以根据施用方式而变化。在组合物是可注射的情况下，它们是无菌、无热原以及无颗粒的。合适的配制品可以包含氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液诸如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂可以包括明胶和白蛋白。

疫苗可以进一步包含可接受的赋形剂。可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能性分子。

疫苗接种

本文公开的癌症疫苗提供用于在用于治疗或预防癌症的方法中使用。本文所述的疫苗可以用于在施用或疫苗接种的方法中使用，以诱导治疗性和/或预防性免疫应答。疫苗接种过程可以在哺乳动物中产生针对癌症抗原中的一种或多种的免疫应答。疫苗的施用可以是作为核酸分子的一种或多种癌症抗原的转染，所述核酸分子在细胞中被表达且因此被递送至细胞的表面，在细胞表面上免疫系统识别并诱导细胞应答。

可以将疫苗施用至动物，优选地哺乳动物，以便引发免疫应答。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物(尤其是黑猩猩和猴)、母牛、猪、绵羊、山羊、鹿、美洲驼、羊驼、狗、猫、豚鼠、兔、小鼠、大鼠，并且优选地是人、狗或猫。

疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。

可以使用“初免加强”策略施用疫苗。初免加强免疫策略可以定义为在初免和加强剂量期间用相同疫苗施用的方案。可以存在一个或多个加强剂量。在一些情况下在实施例中使用的治疗策略使用初免加强策略。

癌症疫苗可以通过不同途径来施用，所述不同途径包括口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊面施用、胸腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。疫苗可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectile bombardment gone gun)”或其他物理方法诸如纹身、电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。

癌症疫苗是核酸。它可以使用用于转染细胞的任何适当的核酸递送方法递送。可以使用裸核酸，特别是在核酸呈最小形式(诸如微环或闭合线性DNA)的情况下。然而，也可以例如使用不同材料将核酸“包装”用于施用。这些材料包括具有天然或合成来源的脂质、直链和支链聚合物以及肽/蛋白质。脂质/核酸的复合产物导致具有代表性层状或六边形结构的脂质复合物。聚合物和核酸可以复合为聚合复合物，其中聚合物链缠结在一起而没有任何有序内部结构。肽/蛋白质与核酸相互作用以形成具有丝状或球形形态的无序聚合复合物或有序人工病毒，这取决于肽/蛋白质的初级结构。可替代地，可以将核酸可以包装在病毒外壳诸如病毒样颗粒(VLP)中或实际上包装至任何合适的病毒载体诸如慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)腺病毒、改良安卡拉痘苗(MVA)或溶瘤性马拉巴(Maraba)MG1弹状病毒(rhadovirus)中。

癌症疫苗可以用于离体细胞上。因此，可以获得体外转染的作为自体或同种异体的合适细胞，并且然后可以将这些细胞提供至有需要的患者。用于离体转染的合适细胞包括任何类型的抗原呈递细胞，包括天然杀伤细胞或树突状细胞、自体或同种异体的肿瘤细胞(通常为经辐照的)。可以将自体细胞用呈mRNA或DNA形式的癌症疫苗瞬时转染。癌症抗原可以是密码子优化的并且含有辅助基序，所述辅助基序导致在患者中癌症抗原肽的MHC-I和MHC-II呈递至CD8+和CD4+T细胞两者。因此，在重新引入至患者中之后可以实现强的肿瘤特异性免疫应答。

因此，本申请扩展至使用癌症疫苗转染体外或离体细胞，然后使用这些细胞治疗或预防患者中的癌症。因为转染可以是瞬时的，所以此类细胞可以不再在施用时包括癌症疫苗。

数据显示，癌症疫苗和免疫检查点抑制剂的组合比包含单独癌症抗原的疫苗更高效地诱导免疫系统，并且实际上这两者协同工作。该更高效的免疫应答提供了在治疗癌症方面的增加功效。

定义

检查点抑制剂疗法是癌症免疫疗法的形式。检查点抑制剂靶向免疫检查点，所述免疫检查点是免疫系统中刺激或抑制其作用的关键调控子，其肿瘤可以用于保护它们自身免受免疫系统的攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，从而恢复免疫系统功能。

当应用于本发明的蛋白质或组合物时，术语“免疫原性”意指能够在人或动物体内引发免疫应答。免疫应答可以是保护性的。

术语“保护性”意指预防癌症，降低癌症感染、传播和/或进展的风险，降低癌症的严重程度，治愈癌症，缓解症状或降低癌症或癌症症状的严重程度。

术语“治疗”意指治愈癌症、缓解症状或降低癌症或癌症症状的严重程度。

在口腔癌的背景下，术语“预防”意指预防从口腔发育异常转变为口腔癌。

“抗体”包括基本上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人抗体、人源化抗体(其中相对于天然存在的人抗体使至少一个氨基酸突变)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体以及所述抗体的抗原结合片段和衍生物。特别地，如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，无论天然产生还是部分或完全合成产生均可。所述术语也涵盖具有为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质。这些可以来源于天然来源，或者它们可以部分或完全合成产生。抗体的实例是免疫球蛋白同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；以及双抗体。抗体可以是多克隆的或单克隆的。单克隆抗体可以提及为“mAb”。

可以采用单克隆和其他抗体并且使用重组DNA技术产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可以涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入至不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，将所述文献通过引用并入本文。可以对杂交瘤或其他产生抗体的细胞进行基因突变或其他改变，这可以改变或可以不改变产生的抗体的结合特异性。

因为抗体可以以多种方式修饰，所以“抗体”应理解为涵盖包含具有所需特异性的结合结构域的任何特定结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段、抗体的衍生物、功能等同物和同源物、人源化抗体，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论天然合成还是整体或部分合成均可。因此包括了嵌合分子，其包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023中，该文献通过引用并入本文。人源化抗体可以是具有非人(例如鼠类)抗体的可变区和人抗体的恒定区的经修饰的抗体。用于制备人源化抗体的方法描述于例如美国专利号5225539中，该文献通过引用并入本文。

本公开的抗体可以是原始的或工程化的。例如，抗体可以完全或部分糖基化的和/或经选择以增加或减弱与人效应系统(诸如补体、带有FcR的效应子诸如巨噬细胞)的结合或以延长或减小半衰期。可以进行这些修饰以改善有效性并且还潜在降低毒性副作用。

已经显示出完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。用于在本发明中使用的结合分子的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点的肽接头连接；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965，其通过引用并入本文)和(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804，其通过引用并入本文)。

两个序列之间的百分比一致性的确定可以使用本领域技术人员已知的数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的实例是Karlin和Altschul(Proc Natl Acad SciUSA.1990年3月；87(6):2264-8)的算法，该算法如在Karlin和Altschul(Proc Natl AcadSci USA.1993年6月15日；90(12):5873-7)中修改。Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序并入了这种算法，并且可以在标准参数下使用。

本领域技术人员应当理解，本发明的一个实施方案或方面的任选特征在合适时可以适用于本发明的其他实施方案或方面。

对本文任何出版物的提及应被视为仅出于美国专利申请过程的目的而通过引用并入。

现在将仅通过举例的方式、参考以下附图更详细地描述本发明的实施方案。

图1.靶抗原在头颈鳞状癌(HNSC)和潜在关注的其他类型癌症中的过表达。两种MAGED4B和FJX1转录物在头颈肿瘤中比在相邻正常组织中以显著更高的水平表达。关于其他癌症类型，MAGED4B表达在肺腺癌(LUAD)、鳞状癌(LUSC)和胆管癌(CHOL)中的也显著较高，同时与各自的相邻正常组织相比，FJX1在许多肿瘤类型中显著更高。转录数据来自癌症基因组图谱(TCGA)，其由Li等人(2016)处理并在cistrome.shinyapps.io/timer上可在线公开获得。该数据证明，靶标癌症抗原表达于多种癌症中，描绘了如在此所述的疫苗的效用。

图2.MAGED4B和FJX1抗原两者均在HPV阴性鳞状细胞癌(SCC)、非恶性口腔发育异常和鼻咽癌(NPC)中强表达。将MAGED4B(Novus-Bio：NBP1-89594)以1:200稀释度染色。将FJX1(Novus-Bio：NBP1-59470)以1:100稀释度染色。染色在DAKO自动染色仪上进行。睾丸充当具有强表达的阳性对照。口腔纤维上皮息肉(FEP)充当阴性对照，其指示非发育异常口腔组织中的低水平表达。该数据确认靶标癌症抗原被表达为蛋白质。

图3.MAGED4B(D4B)在HPV阴性HNSCC患者中具有免疫原性。在5/7HLA-A2+患者HNSC患者(在此示出了4例)中检测到循环D4B特异性CD8 T细胞，但在HLA-A2+健康供体(HD1)中未检测到在流式细胞术中的D4B^501-509/HLA-A2-PE四聚体染色。使用来自在Pool,UK经历手术的患者的外周血单核细胞(PBMC)进行染色。将10⁶个PBMC用抗CD3(FITC:OKT3)、CD4(APC:OKT4)、CD8(PE-Cy7:SK1)(BioLegend)、DAPI(活/死(live/dead)染色)(Miltenyi)和MAGED4B^501-509四聚体(PE)进行染色。使用UltraComp eBeads(Invitrogen)用于补偿，在FACSCanto上进行流式细胞术。使用FlowJo进行分析；在活/死淋巴细胞和CD8以及然后四聚体上进行门控(gating)。四聚体阳性CD8细胞在门中指示出。该数据确认，在患有确认HNSCC的患者中，存在可用于通过疫苗接种进行扩增的T细胞池。此外，这是令人鼓舞的数据，所述数据表明单独的此类T细胞的存在不在这些个体中引起任何病状，但它们不是完全功能性的，否则个体将使用此类细胞控制其肿瘤。

图4(A和B).对靶抗原MAGED4B和FJX1两者具有特异性的CD8 T细胞。图4A.使用D4B^501-509/HLA-A2四聚体染色和流式细胞术，在HLA-A2+HNSCC患者HN337中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL；用6000IU/ml重组人IL-2扩增)中检测到D4B特异性CD8 T细胞。将10⁶个扩增TIL用抗CD3(FITC:OKT3)、CD4(APC:OKT4)、CD8(APC-Cy7)(BioLegend)、DAPI(活/死染色)(Miltenyi)和MAGED4B^501-509四聚体(PE)进行染色。使用UltraComp eBeads(Invitrogen)用于补偿，在FACSCanto上进行流式细胞术。使用FlowJo进行分析。对活/死淋巴细胞，然后对CD8加四聚体进行门控。四聚体阳性CD8细胞在门中指示出。图4B.来自HLA-A2阴性、HLA-A1阳性HN337肿瘤样品的扩增TIL中的IFNγCD8 T细胞。将用抗CD3(克隆OKT3)扩增的TIL用以下刺激8h：对照(肽池MAGED4B HLA-A2肽)、由对抗原的整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成的MAGED4B肽池(合并183种肽)、仅结合HLA-A1的FJX1肽池(由NetMHC 4.0预测，www.iedb.org)(来源于如下FJX1 aa序列的3种15聚体肽：

表位用粗体表示)，并且进行细胞内IFNγ染色，之后是流式细胞术。用于流的抗体面板是抗CD3(FITC:OKT3)、CD8(PerCp-Cy5.5:RPA-T8)、抗CD56(PE:HCD56)、IFNγ(APC 4S.B3)(全部来自BioLegend)，并且在使用HuMan TrueStain(Biolegend)阻断Fc受体之后施加ZombiAqua(活/死染色)(Miltenyi)。门示出了在用图顶部处所指示的试剂再刺激之后IFNγCD8阳性T细胞的特异性群体。这些图中的数据再次证明，在患有确认HNSCC的患者中，存在可用于通过疫苗接种进行扩增的T细胞池并且这些细胞也可以见于肿瘤中。此外，这是令人鼓舞的数据，所述数据表明单独的此类T细胞的存在不在这些个体中引起任何病状，但它们不是完全功能性的，否则个体将使用此类细胞控制其肿瘤。

图5.对靶抗原MAGED4B和FJX1两者具有特异性的CD8 T细胞。使用MAGED4B^501-509/FJX1^15-25 HLA-A2四聚体染色和流式细胞术，在HLA-A2+Malaysian OSCC患者06-0021-18中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL；用6000IU/ml重组人IL-2扩增)中检测到MAGED4B和FJX1特异性CD8 T细胞。将扩增TIL用抗CD3(FITC；SK7)、CD4(PerCP-Cy5.5；SK3)、CD8(BV510；RPA-T8)(BD Biosciences)、FVS780(活力染色)(BD Biosciences)和MAGED4B^501-509四聚体(PE)染色。使用BD CompBead用于补偿，在BD LSRFortessa上进行流式细胞术。使用FACS DIVA软件进行分析。对活/死淋巴细胞，然后对CD8加四聚体进行门控。四聚体阳性CD8细胞在门中指示出。该数据证明已经在肿瘤中鉴定出抗原特异性T细胞。这进一步表明，除了从疫苗从头激活和扩增之外，存在可用于扩增的细胞池。

图6.对靶抗原MAGED4B具有特异性的T细胞在HNSC患者中表达PD1且因此可以用抗PD1靶向。在使用PBMC的循环中使用MAGED4B^501-509四聚体检测到特异性T细胞。一半的四聚体阳性群体也是PD1+。此亚群不存在于HLA*A2阴性HNSC患者(对照组)的PBMC中。面板由CD3(FITC:OKT3)、CD4(APC:OKT4)、CD8(PE-Cy7:SK1)、PD-1(PerCP-Cy5.5:EH12.2H7)、CD19(Pacific Blue:HIB19.11)和CD14(Pacific Blue:HCD14)(BioLegend)、活/死紫罗兰(Pacific Blue)(Invitrogen)和MAGED4B^501-509四聚体(PE)组成。使用UltraComp eBeads(Invitrogen)用于补偿，在FACSCanto上进行流式细胞术。使用FlowJo软件进行分析。该数据确认了HLA-2四聚体的特异性，因为在HLA-2阴性患者(HN366)中它不起作用。在HLA-2阳性患者(HN364)中，该数据确认了T细胞的抗原敏感性。

图7.用于靶向头颈癌症的MAGED4B和FJX1靶向DNA疫苗的组装。pDOM(对照)、递送单一抗原pDOM-MAGED4B和pDOM-FJX1的疫苗和同时两种抗原的pDOM-MAGED4B-FJX1疫苗的疫苗构建体的图。使用七氨基酸接头1(AAAGPGP)连接破伤风毒素基因的DOM片段和关注的基因(MAGED4B或FJX1)。将融合基因插入在CMV/T7双重启动子与BGH Poly(A)位点之间。将编码mus IgH信号肽(MGWSCIIFFLVATATGVHS)的前导序列插入在构建体的N末端处以增强分泌的功效。如果关注的基因编码融合的MAGED4B和FJX1抗原，则应用五氨基酸接头2(GSGSG)以连接这两个基因。使用NotI和HindIII限制性位点将DOM1插入至pcDNA3.0载体中以产生pDOM载体。将针对关注的MAGED4-B、FJX1或其融合体的基因在NotI和XhoI限制性酶位点处插入至pDOM载体中以产生DNA疫苗。如本文所用，关于载体的p涉及质粒载体或构建体。

图8.在第1天，将三组5-6只非荷瘤HHD(针对人HLA-A2等位基因转基因的)小鼠用50微克p.Dom-MAGED4B(A)、p.Dom-FJX1(B)或p.Dom(C)单独地进行疫苗接种，之后在第22天通过电穿孔进行相同DNA疫苗的加强注射。通过IFNγELISpot评价其免疫原性。在第35天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对每种靶抗原MAGED4B和FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于每种抗原的整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽并且对于FJX1合并107种肽)。将P30肽用作疫苗接种的标准品。单独肽由JPT(Germany)产生至90％纯度。对于ELISpot，根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassberg,Germany)计算。该数据确认了HAL-A2转基因小鼠中抗原的免疫原性。

图9(A-D).DNA疫苗作为单独治疗和与抗PD1的组合是有效的。图9A描绘了治疗策略。将单独组的小鼠(6-10)用表达MAGED4B和FJX1两者的B16肿瘤激发，并且然后用组合的DNA疫苗(DV；p.Dom-MAGED4B和p.Dom FJX1；100μg/小鼠，在100μl盐水中，向每只腿中肌肉内注射50μg)、抗PD-1抗体(200μg/注射，以0.5mL i.p.给予)或组合的DV和抗PD1治疗，如图中所指示的。向对照组给予对照IgG+pDOM(载体骨架)。每2-3天测量肿瘤大小并且将每个组的肿瘤大小描绘于图9B(平均值+s.e.m)图9C中。ELISpot测定在DV和DV+a-PD1组中展示出特异性方式的MAGED4B特异性免疫应答，但在a-PD1或对照组中未展示出：从疫苗接种动物分离的脾细胞在用与整个抗原序列重叠的MAGED4B肽文库(183种肽(15聚体11aa重叠)合并在一起)再刺激时能够分泌IFN-γ。图9D如图9C中，但使用了与整个抗原重叠的FJX1肽文库。该数据示出了单一疗法(单独疫苗)对肿瘤进展的明显影响和组合疗法(疫苗加抗PD1)的协同作用。特别地，图9C和9D显示，疫苗接种在荷瘤小鼠中扩增抗原特异性T细胞-这些小鼠已经暴露于肿瘤上的抗原，但尚未能发起良好免疫应答。这支持了疫苗可以改善免疫应答并且将肿瘤有效地“暴露”于免疫系统的断定。

图10(A-C).DNA疫苗在抑制肿瘤生长方面是有效的。图10A描绘了治疗策略、肿瘤体积减小和作用机制。将单独组的小鼠(8-12)用表达MAGED4B和FJX1两者的肿瘤激发，并且然后用DNA疫苗(DV；p.Dom-MAGED4B和p.Dom-FJX1；100μg/小鼠，在100μl盐水中，向每只腿中肌肉内注射50μg)治疗，如图中所指示的。向对照组给予pDOM载体骨架。每2-3天测量肿瘤大小并且将每个组的肿瘤大小描绘于图10A(平均值+s.e.m)中。图10(B)是细胞照片。右侧面板中肿瘤的染色展示出在用DNA疫苗疫苗接种后的T细胞浸润，右侧面板示出了较差浸润的pDOM对照肿瘤(苏木精和伊红染色，原始放大倍数：x10物镜)。图10C描绘了流式细胞术分析的结果，其展示出与对照动物相比，在从疫苗接种动物收获的肿瘤中CD4+和CD8+免疫细胞的增加。显著地，发现检查点蛋白PD1在从疫苗接种动物收获的CD4+和CD8+免疫细胞中明显升高。该研究使用较高剂量的肿瘤细胞来加速癌症的进展，因此是特别具有侵袭性的肿瘤模型。这再次显示，疫苗接种在荷瘤小鼠中扩增T细胞，其中小鼠尽管暴露于它们但尚未引起针对肿瘤的良好免疫应答。这支持了疫苗可以改善免疫应答并且将肿瘤有效地“暴露”于免疫系统的断定。

图11(A和B).用于设计MAGED4B和FJX1靶向DNA疫苗的关键组分的展示。对于两个图，描绘了治疗策略。在第1天，将四组5只非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg p.Dom-MAGED4B-FJX1、pSP-MAGED4B-FJX1(无DOM)、pDom-FJX1、pnoSPDOM-FJX1(无前导/SP)单独地进行疫苗接种，之后在第8天进行相同DNA疫苗的加强注射。通过IFNγELISpot评价其免疫原性。在第22天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对每种靶抗原MAGED4B和FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于每种抗原的整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽并且对于FJX1合并107种肽)。将来自DOM的MHCII肽P30肽用作疫苗接种的对照。图11A示出了在具有和不具有DOM的情况下的数据。显示Dom序列对于诱导T细胞且因此改善对MAGED4B的应答是至关重要的。图11B示出了在具有和不具有前导序列的情况下的数据。编码构建体表达至内质网以进行分泌的前导序列对于T细胞免疫的诱导也是必要的。单独肽由JPT(Germany)产生至90％纯度。对于ELISpot，根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AIDAutoimmun Diagnostika GmbH,Strassberg,Germany)计算。该数据显示，通常FJX1应答通过包含前导序列得以改善。

图12.靶向串联为融合抗原的两种抗原的DNA疫苗诱导与靶向单一抗原的DNA疫苗可比的T细胞应答。描绘了治疗策略。在第1天，将三组5只非荷瘤C57BL/6小鼠用50μgp.Dom-MAGED4B、pDom-FJX1或p.Dom-MAGED4B-FJX1单独地进行疫苗接种，之后在第8天进行相同DNA疫苗的加强注射。通过IFNγELISpot评价其免疫原性。在第22天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对每种靶抗原MAGED4B和FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于每种抗原的整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽并且对于FJX1合并107种肽)。将来自DOM的MHCII肽P30肽用作疫苗接种的对照。靶向两种抗原的DNA疫苗显示出类似的诱导特异性T细胞应答的能力。通过Graphpad prism 8.0用Mann-Whitney分析计算P值。对于ELISpot，根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。

图13.用于靶向癌症的替代性MAGED4-B和FJX1靶向DNA疫苗的组装。pDOM(对照)、pMAGED4B/FJX1、pMAGED4B/FJX1-MITD、pPVXCP-MAGED4B/FJX1和pMIP3α-MAGED4B/FJX1的疫苗构建体的图示。替代性基因融合配偶体包括MITD、PVXCP和MIP3α。MITD(165bp)编码MHC I(HLA-A2)运输信号。PVXCP(732bp)编码马铃薯病毒X外壳蛋白。MIP3α(252bp)编码巨噬细胞炎症性蛋白3α。将MITD、PVXCP和MIP3α基因用人密码子使用进行优化并且从GeneArt(Invitrogen)订购。将基因(具有或不具有融合配偶体)插入在CMV/T7双重启动子与BGHPoly(A)位点之间。将编码小鼠IgH信号肽(MGWSCIIFFLVATATGVHS)的前导序列插入在构建体的N末端处以增强分泌的功效。使用七氨基酸接头1(AAAGPGP)连接融合配偶体和关注的基因(MAGED4B或FJX1)。除了MITD之外，将所有其他融合配偶体融合在关注基因的上游。将MITD添加在关注基因的下游。将针对关注的MAGED4-B、FJX1或其融合体的基因在NotI、XhoI和XbaI限制性酶位点处插入至pcDNA3载体中以产生DNA疫苗。

图14对C57BL/6小鼠通过DNA疫苗诱导MAGED4B特异性T细胞应答。描绘了治疗策略。在第1天和第8天将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、50μg pSP-MAGED4B(5只小鼠)、50μg pSP-MAGED4B-MITD(5只小鼠)、50μg pPVXCP-MAGED4B(5只小鼠)和50μg pMIP3a-MAGED4B(5只小鼠)进行疫苗接种。在第22天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对MAGED4B的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池(OPP)由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽)。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID AutoimmunDiagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。图分别示出了每个组中对MAGED4B OPP的应答。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。截止值设定为2x背景(Irr OPP，示出为红色虚线)。通过Mann-Whitney检验计算P值。(Irr＝不相关)。该数据显示MAGED4B应答可以由全长蛋白产生，并且应答可以通过与各种辅助基序的融合改善。

图15对C57BL/6小鼠通过DNA疫苗诱导FJX1特异性T细胞应答。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、50μg pSP-FJX1(5只小鼠)和50μg pSP-FJX1-MITD(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天i.m(肌肉内)施用疫苗接种。在第14天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于FJX1合并107种单独肽)。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AIDAutoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。图分别示出了每个组中对FJX1OPP的应答。在所有组中，pSP-FJX1-MITD诱导最强的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。通过减去在没有刺激物的情况下的斑点数而对结果进行归一化。截止值设定为2x背景(Irr OPP，示出为红色虚线)。通过Mann-Whitney检验计算P值。仅描述出一种实验，因为在大流行病期间的实验室关闭限制了重复这些实验。

图16.整个MAGED4B氨基酸序列和三种截短型片段的氨基酸序列图谱。作为黑素瘤相关抗原家族的成员，MAGED4B含有MAGE共同同源结构域MAGED4B 412-682(SEQ ID No.3)。所定义的HLA-A2表位RLSLLLVIL(MAGED4B501-509)位于同源结构域内部。三种截短型MAGED4B序列设计如下：1)MAGED4B序列形式(v)1不含有同源结构域但含有RLSLLLVIL；2)MAGED4B.sv2保留同源结构域的第二半部(MAGED4B 510-682)，包括RLSLLLVIL；3)MAGED4B.sv3保留同源结构域的第一半部(MAGED4B412-500)，包括RLSLLLVIL。因此，这些全部是适用于在此所述的疫苗的MAGED4B免疫原性片段。

图17.如图16中详述的MAGED4B的片段显示出具有免疫原性。示出了治疗策略：在第1天，将四组5只非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg p.Dom-MAGED4B(全长)、p.Dom-MAGED4Bsv1、p.Dom-MAGED4Bsv2、p.Dom-MAGED4Bsv3单独地进行疫苗接种，之后在第22天进行相同DNA疫苗的加强注射。通过IFNγELISpot评价其免疫原性。在第35天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对MAGED4B的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽)。将来自破伤风DOM的MHCII肽P30肽用作疫苗接种的对照。与p.Dom-MAGED4B(全长)、p.Dom-MAGED4Bsv1和p.Dom-MAGED4Bsv2相比，p.Dom-MAGED4Bsv3诱导显著更强的特异性T细胞应答。p.Dom-MAGED4Bsv1或p.Dom-MAGED4Bsv2均不比p.Dom-MAGED4B表现更佳。通过Graphpadprism 8.0用单因素方差分析计算P值。对于ELISpot，根据制造商的方案使用来自BDBioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。因此，可以全部或部分去除MAGE同源结构域而不影响疫苗的活性。

图18.用于疫苗接种实验中的闭合线性DNA(dbDNA^TM)的载体图谱。示出了在dbDNA的闭合端处的序列(来自原端粒酶靶序列TelRL的TelR或TelL)-这些是一起形成整个序列的靶序列部分。示出了四种构建体架构：所有其他构建体所基于的Basic 0(最小构建体架构-CMV启动子、Dom和抗原融合体、SV40 poly A信号序列)。向其他构建体中添加：Basic 1(加上TE-三重增强子)；SV40 enh(加上TE和SV40增强子序列)；CpG(加上TE和具有CpG基序的序列的节段)。将这些用于本文所述的实验性疫苗接种工作中。

图19.在C57BL/6小鼠中通过狗骨(doggy bone，DB)和质粒DNA疫苗诱导MAGED4B特异性T细胞应答。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、25μg DB-MAGED4B-CO(5只小鼠)和25μg pDOM-MAGED4B质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天用EP i.m施用疫苗接种。使用来自Ichor EP装置的肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行电穿孔(EP)。在第14天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对MAGED4B的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽，对于FJX1合并107种单独肽)。将来自破伤风DOM的MHCII肽P30肽用作有效疫苗接种的对照。FJX1 OPP充当该实验中的Irr肽对照。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。图分别示出了每个组中对p30肽和MAGED4B OPP的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。截止值设定为2x背景(Irr OPP，示出为红色虚线)。通过Mann-Whitney检验计算P值。

图20.通过狗骨(DB)和质粒DNA疫苗诱导FJX1特异性T细胞应答。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、25μg DB-DOM-FJX1 CO(5只小鼠)和25μg pDom-FJX1质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM Ichor Medical System)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在第14天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池(OPP)由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽，对于FJX1合并107种单独肽)。将来自破伤风DOM的MHCII肽P30肽用作有效疫苗接种的对照。MAGED4B OPP充当该实验中的Irr肽对照。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。图分别示出了每个组中对p30肽和FJX1OPP的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。截止值设定为2x背景(Irr OPP，示出为红色虚线)。通过Mann-Whitney检验计算P值。

图21.dbDNA DOM-MAGED4B和pDOM-MAGED4B DNA疫苗诱导特异性CD4和CD8 T细胞应答。描绘了治疗策略。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO basic 1(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO SV40(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO CpG(5只小鼠)和10μg pDOM-MAGED4B质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天和第21天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；Ichor Medical System)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在体外刺激后进行FACS，在第12天获取50μl血液样品，首先使用红色血液裂解缓冲液(RBC裂解缓冲液，Biolegend)处理血液。将白细胞用1μM MAGED4B重叠肽池(OPP；在96孔板中，添加1μl抗CD107a-FITC和抗CD107b-FITC(两者均来自Biolegend)刺激，并且在37℃ 5％CO2下孵育过夜。第二天，将细胞洗涤并且用抗CD3-PE、抗CD4-PEcy7、抗CD8-APCcy7、抗CD137(4-1BB)-APC、抗PD1-PerCPcy5(全部来自Biolegend)和活/死-紫罗兰(Invitrogen)染色。OPP由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽)。在FACSCanto II上进行流式细胞术。使用FlowJo软件进行分析。使用FACS评价应答。CD107a/b+PD-1+双重阳性T细胞和4-1BB+PD-1+双重阳性T细胞分别指示对MAGED4B OPP具有特异性的细胞毒性和激活的群体。在该柱形图中汇总了分别来自用pDOM、DB-MAGED4B-CO、DB-MAGED4B-CO basic1、DB-MAGED4B-CO SV40、DB-MAGED4B-CO CpG和pDOM-MAGED4B质粒进行疫苗接种的组的针对MAGED4B OPP的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠应答。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。该数据显示了MAGED4B抗原可以在不同的架构中递送并且仍诱导抗原经历CD4和CD8 T细胞。CO是密码子优化的序列。

图22.狗骨DOM-FJX1和pDOM-FJX1 DNA疫苗诱导特异性CD4和CD8 T细胞应答。描绘了治疗策略。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、10μgDB-FJX1-CO(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO basic 1(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO SV40(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO CpG(5只小鼠)和10μg pDOM-FJX1质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天和第21天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；IchorMedical System)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在体外刺激后进行FACS，在第12天获取50μl出血血液样品(使用50μl出血，首先将其使用红色血液裂解缓冲液(RBC裂解缓冲液，Biolegend)处理)。将白细胞用1μM FJX1重叠肽池(OPP；在96孔板中，同时添加1μl抗CD107a-FITC和抗CD107b-FITC(两者均来自Biolegend)刺激，并且在37℃ 5％CO2下孵育过夜。第二天，将细胞洗涤并且用抗CD3-PE、抗CD4-PEcy7、抗CD8-APCcy7、抗CD137(4-1BB)-APC、抗PD1-PerCPcy5(全部来自Biolegend)和活/死-紫罗兰(Invitrogen)染色。重叠肽池由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于FJX1合并107种单独肽)。在FACSCantoII上进行流式细胞术。使用FlowJo软件进行分析。使用FACS评价应答。CD107a/b+PD-1+双重阳性T细胞和4-1BB+PD-1+双重阳性T细胞分别指示对FJX 1OPP具有特异性的细胞毒性和激活的群体。在该柱形图中汇总了分别来自用pDOM、DB-FJX1-CO、DB-FJX1-CO basic 1、DB-FJX1-CO SV40、DB-FJX1-CO CpG和pDOM-FJX1质粒进行疫苗接种的组的针对FJX1OPP的T细胞应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠应答。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。该数据显示了FJX1抗原可以在不同的架构中递送并且仍诱导抗原经历CD4和CD8 T细胞。CO是密码子优化的序列。

图23.狗骨DOM-MAGED4B和pDOM-MAGED4B DNA疫苗诱导特异性CD4和CD8 T细胞应答。描绘了治疗策略。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO basic 1(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO SV40(5只小鼠)、10μg DB-MAGED4B-CO CpG(5只小鼠)和10μg pDOM-MAGED4B质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天和第21天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；Ichor Medical System)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在第35天，将淋巴细胞从小鼠脾脏分离并且铺板至ELISpot板，并且使用MAGED4B的重叠肽池(OPP)来刺激应答性特异性T细胞。OPP由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽)。使用来自破伤风DOM序列的MHCII肽P30肽来评估针对Dom辅助序列的CD4应答的诱导。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AIDAutoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。图示出了针对p30肽、Irr OPP(FJX1 OPP)和MAGED4B OPP的应答。D在所有组中，B-MAGED4B-CO basic 0诱导最强的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。截止值设定为示出为虚线的2x背景(IrrOPP)。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。示出了斑点数/10⁶个细胞。通过Mann-Whitney检验计算P值。该数据显示了MAGED4B抗原可以在不同的架构中递送并且仍诱导抗原经历CD4和CD8 T细胞。CO是密码子优化的序列。

图24.dbDNA(DB)DOM-FJX1和质粒(p)DOM-FJX1 DNA疫苗诱导特异性CD4和CD8 T细胞应答。描绘了治疗策略。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO basic 1(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO SV40(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO CpG(5只小鼠)和10μg pDOM-FJX1质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天和第21天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；Ichor Medical System)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在第35天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池(OPP)由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于FJX1合并107种单独肽)。使用来自破伤风DOM序列的MHCII肽P30肽来评估针对Dom辅助序列的CD4应答的诱导。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun DiagnostikaGmbH,Strassburg,Germany)计算。图示出了针对p30肽、Irr OPP(MAGED4B OPP)和FJX1 OPP的应答。所有组类似地进行。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。截止值设定为以虚线示出的2x背景(Irr OPP)。截止值设定为以虚线示出的2x背景(Irr OPP)。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。示出了斑点数/10⁶个细胞。通过Mann-Whitney检验计算P值。该数据显示，FJX1可以由多种架构递送，可以诱导抗原特异性CD4和CD8 T细胞。

图25.dbDNA(DB)DOM-MAGED4B和质粒(p)DOM-MAGED4B DNA疫苗诱导特异性T细胞应答。描绘了治疗策略。将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、25μg DB-MAGED4B-CO(6只小鼠)、25μg DB-MAGED4B-CO basic 1(6只小鼠)、25μg DB-MAGED4B-CO SV40(6只小鼠)和25μg pDOM-MAGED4B质粒(6只小鼠)进行疫苗接种。在第1天和第21天用EP i.m施用疫苗。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；Ichor MedicalSystem)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在第35天，将淋巴细胞从小鼠脾脏分离并且铺板至ELISpot板，并且使用MAGED4B的重叠肽池(OPP)来刺激应答性特异性T细胞。OPP由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于MAGED4B合并183种单独肽)。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。示出了对MAGED4B OPP的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。通过Mann-Whitney检验计算P值。

图26.dbDNA(DB)DOM-FJX1和质粒(p)DOM-FJX1 DNA疫苗诱导特异性CD4和CD8 T细胞应答。描绘了治疗策略。在第1天和第21天将非荷瘤C57BL/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO basic 1(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO sv40(5只小鼠)、10μg DB-FJX1-CO CpG(5只小鼠)和10μg pDOM-FJX1质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。使用肌肉内TriGrid递送系统(TDS-IM；Ichor MedicalSystem)，对通过异氟烷麻醉的小鼠进行EP。在第35天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISpot板，并且使用针对FJX1的重叠肽池检测应答性特异性T细胞。重叠肽池由对于整个序列具有11aa重叠的15聚体肽组成(对于FJX1合并107种单独肽)。根据制造商的方案使用来自BD Bioscience的IFNγELISpot试剂盒。对对应于单独应答性T细胞的斑点进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。数值是减去在没有刺激物的情况下的斑点数的应答。图示出了对FJX1 OPP的应答。示出了中位值+四分位数和单独小鼠中的应答。

图27.癌症相关成纤维细胞(CAF)表达MAGED4B。对HNSCC病例的免疫组织化学分析展示出癌细胞和癌症相关成纤维细胞中的MAGED4B表达，后者展示出强表达。将抗MAGED4B单克隆抗体(Santa Cruz，G12；sc-393059)以1:50稀释度用于HNSCC组织上。在DAKO自动染色仪(K4065)上进行染色。呈现了在南安普顿综合医院(Southampton General hospital)(南安普顿，英国)的病理学实验室中可获得的六例单独HNSCC病例。

图28(A和B)癌症相关成纤维细胞(CAF)表达MAGED4B。图28A：使用由HNSCC患者样品的Smart-Seq分析产生的可公开获得的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据评估跨不同细胞类型的MAGED4B表达。如由Puram等人,Cell.2017年12月14日；171(7):1611-1624所述那样鉴定细胞谱系。图28B：通过无监督分层聚类鉴定成纤维细胞亚群，如Seurat R package(v3.2)(Butler A等人,Nat Biotechnol.2018年6月；36(5):411-420)中所实施的。使用Wilcox检验鉴定出纤维细胞亚群标记物MCAM、ACTA2和POSTIN并且将其与先前对于肺癌成纤维细胞亚群鉴定的那些进行比较以注释不同亚群(CJ Hanley等人,bioRxiv2020.06.08.134270)。

图29MAGED4B和FJX1抗原两者均在结肠癌、前列腺癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌和鼻咽癌中强表达。通过使用抗MAGED4B(1:100；Sigma Aldrich，目录号HPA003554)和抗FJX1(1:200；Sigma Aldrich，目录号HPA059220)抗体，并且如先前所述地使用DakocytomationEnvision+Dual(DAB+)试剂盒(Dako，目录号K4065)处理进行的免疫组织化学(IHC)来检测目标蛋白质的表达水平。

序列

下面描述潜在DNA疫苗组分的序列或编码序列。本发明的DNA疫苗可以包含下面提供的任一种核酸序列或其变体。可替代地或另外地，本发明的DNA疫苗可以包含编码下面提供的任一种氨基酸序列或其变体的核酸。

如图7中组装的DNA疫苗中基因的氨基酸序列：

前导序列(SEQ ID NO:1)

MGWSCIIFFLVATATGVHS

DOM(SEQ ID NO:2)

KNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGN

MAGED4B(SEQ ID NO:3)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTLLQERANKLVKYLMIKDYKKIPIKRADMLKDVIREYDEHFPEIIERATYTLEKKFGIHLKEIDKEEHLYILVCTRDSSARLLGKTKDTPRLSLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPFLGDLRKLITDDFVKQKYLEYKKIPNSNPPEYEFLWGLRARHETSKMRVLRFIAQNQNRDPREWKAHFLEAVDDAFKTMDVDMAEEHARAQMRAQMNIGDEALIGRWSWDDIQVELLTWDEDGDFGDAWARIPFAFWARYHQYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

FJX1(SEQ ID NO:4)

MGRRMRGAAATAGLWLLALGSLLALWGGLLPPRTELPASRPPEDRLPRRPARSGGPAPAPRFPLPPPLAWDARGGSLKTFRALLTLAAGADGPPRQSRSEPRWHVSARQPRPEESAAVHGGVFWSRGLEEQVPPGFSEAQAAAWLEAARGARMVALERGGCGRSSNRLARFADGTRACVRYGINPEQIQGEALSYYLARLLGLQRHVPPLALARVEARGAQWAQVQEELRAAHWTEGSVVSLTRWLPNLTDVVVPAPWRSEDGRLRPLRDAGGELANLSQAELVDLVQWTDLILFDYLTANFDRLVSNLFSLQWDPRVMQRATSNLHRGPGGALVFLDNEAGLVHGYRVAGMWDKYNEPLLQSVCVFRERTARRVLELHRGQDAAARLLRLYRRHEPRFPELAALADPHAQLLQRRLDFLAKHILHCKAKYGRRSGT

接头1(SEQ ID NO:5)

AAAGPGP

接头2(SEQ ID NO:6)

GSGSG

MAGED4B核苷酸序列(SEQ ID NO:7)：

>NG_029896.1:5001-12446智人MAGE家族成员D4B(MAGED4B)，染色体X上的RefSeqGene

GCATGCGCAGGCTACCCAGCCGCGGGGGGTGCACGGAGAAAAGGGGCGGGGTGGTCCGGGCTGCTGTGCT

GGCAGCAGTAGGCGAGGGCGCGGCTGCGGGGTTCCTGGTGCTGAGGACGGACGCCATTGGAGTTCCCGAG

AAGGTAAGGATCCAGCCCCAGACAGGACCGGGAGAGGGCGAGTGGAACCCGACACGCTGCGCCCTCCCTC

CGCCTCCGGATCTGAACAAAGCCCAAGCACTCAGAACCGGAACCCCATTAGACCCAAGGTCTAGATAGGA

GCCCCCATCACCATCAGACCCAGGCGCCCCGATCTGAGCCCTACTGAAACCGGAGCCCAGGATCCTCACC

CCTTTAGCAGACCCGTGTGCTCCGAGCTGAGCTCCCTTGGACCTGAGGCCCCACCCCCACCCCAACCACT

CCTAGATTACTCGAACCGAGCTGACCGCTTGCCCCCTTCCTGGAGTGCCCAGTCCTCGCGTTTGAGATCT

GCAGCGCTCCGATTGGAGCCTCACCTAGGTCTGAGGCCCCCACTCCATCCGCCTCTAGTGCTCGAGTCTG

AGCCCCACCTAGGCCCCCCGCCCGGACCTAGCCAAAGGTCCCTGGGGTTCTGTTTCGCAGAGCTTGCGGC

TTGCCACTGTCCCTGTTGTCTGAGCTCTCCCATCTGCTCCCCCTTCATCCCGGTCCCCTTCTCTGGCCCG

TAAATCCAAACCCTTTGTTTCTCTCTTCCCCAATGCATTCCCTTTGGGACTCTTCGGACCCCAGCCCTCC

AGAACACCCCCTCGTCAAATCTAGCCGCTGGGATGGCGAGCCTGCCCATCCTAAACTCCGCTTTCAGTGC

GGCGCCTCCTGCGACCTCCTCTGTCCCTTTCCTTGGGCTCTGTCCCTGACCAGGTCTACCCCATCAGAAA

GCCAAACCGTCTCCCCCCCGCTCCTCCTCCCCCCCCCCGCCCCCTACTGCCTAATATTGCCTAGTAACCT

GATGATTGTCGCCCCTCACCTCCCGGGAGATCCCGCCTCCCATTGGATCCCGCCCCCTCCCCCTGCAGCT

GCTTCACCCTCCCTCTCAGGCTGAGCTCTCATCTCCCTGGGACCCGCAGCATGGCTGAGGGAAGCTTCAG

CGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATG

GTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCC

ATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGGTGAGGCCCCTTCCTGGACA

CCTGCTGGCCTGGGCCTTTCCCCTGTGAATGGGGGAGGGAGGAGGGGGGAGCCAGGAGGGTTGTGTGGGA

AAGGACTGCCCAGCTTCCCAAGCCTTCCCTCCCCTGCTCGGAAGAAGAAGATTTGGGAAGGTCTTGGGGT

GTTCAGGGCTGACTGCTGGGAAGAGGCTGGCCAGCACAGGGAAGCTAACACAAGTATGTCGTCGAGTGGC

CTGCCTTCCCCAACCCCTCTCTCTGGCCTTGCAGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCC

CAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCA

ACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAG

TCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTAC

GCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCA

CCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGA

GGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCC

AACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTG

GCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGC

CTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGG

AAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGA

TGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGC

CAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGGTGAGATCCCCCTGCCCCCTGCCACCTCCACACCCCCTTGCT

CCTGTCCTTTCCTTCTCCTCCCTTTCCTGCTCCTCTCCTCCCTCTCCTCTCCCCCTTCTTCCTCTCTTCT

CCTCTTTCCCCTCCTTCTCTCCTCACCTCCCCTCTCCTCCCCTCCTCTCCTCTCAGCTAGTCCATGTTTC

TCCAACACAAGTTTGCTGAGCATGTTTTCACTCCACGTAGTCCCTACCCTCAGGACTGGTGGGAGAAGAG

GCTGGCTCAGTGCCTGGCACTTAGTAAGCACGCAGCACATGCCAGCCGCTGCTGGTACTGCTCTCATTTC

CAAGAGCCTGCTACGGGTGAGGTGCGTGCCGGGTGCTTTGGCACGGGGAGCCTGGTAGCCCTGGGTCTCT

CCTCTCTCAAATGATACAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACT

CCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGC

CCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCCT

TCTGCAGGAGAGGGTAAGAAGCCCACCCTCCCCCATCTCCTTCCTCTCCTCCCTTGTGGGCCACGTCTCT

GCTGTCACCCATGCCTTGACCTCCCCGCATGTTCCTCCTTCTCCAGGCAAATAAGTTGGTGAAATACCTG

ATGATTAAGGACTACAAGAAGATCCCCATCAAGCGCGCAGGTAGGCAGCCTGTGCCCCCTTCACCATCCC

CTAGTCTGTGGGCATCCCTTTGCTTGCGTGCCACGGCTGGTCCCTCCATAGCCACAGGACGGGGTCCTGG

CTGCGTCACCCTCGGCAGAGCTGACCAAGGGGCTACAGCTCTATGACCCCTGCTCAGCCCAGGTGCTTTC

TCCAACTCTTCCCCCTCCTGCAGACATGCTGAAGGATGTCATCAGAGAATATGATGAACATTTCCCTGAG

ATCATTGAACGAGCAACGTACACCCTGGAAAAGGTGGGTGCAGGATGGGAGCAGCTCTGTGGGGGAAGAG

CGGGCATGGGGGTGCGGTGACCCTGCAGCCCCTCAAGGCCCAGTCTCTGGAGCCATCTCTCACCTCTCCG

ACTCTGAGCTTCCACTGCACTGGCAGTTTGACTCGTGCTTCCTGCCCTCGGCTTCTCTCTCTCATGCTCT

CTGAGTGTCTCGCCGTCTGGCCAGGTGGGTCTCATCGCCTCTGCCAGCGTCAGCTCCCACAGCGAAGGTC

TTCCGTGTGCTGTCTTCTTCTGCCCTCGCTCACGAGTTTGGATTCCTTGCTGAGGAGCAGTTCTAACCCG

GAATCACTGTCTGCCGGCAGGATGCCCAGCATGGGGTTTGGATCTCACACTCTGTTTTCTCCCCCACGTA

GAAGTTTGGGATCCACCTGAAGGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTATATTCTTGTCTGCACACGGGAC

TCCTCAGCTCGCCTCCTTGGAAAGTAAGAAAGGGAAAGCGGGTCGTGGCCTTCCTCGGTGGTGTCCCTTC

CCTGCCCACACCCCTTCAGTGAAGCAGGAAGACGGGGCTTGAGTGCGGCGCACCGCTCCCACACACAGCG

AGGGCTGCCTGGTGACTGCTGGATGAAAGGAATGATAGCCTGGGGTGAGGCCTTGCTGCCATCAGTTCTC

CCCAAGCTGCTGCCGGGCTTTATCCCCAAAGCTTCGGAGGAAAGTGCCTCTTCCTCCTGCCTGCCTGGCC

TGGGCCTGGCAGAGCTGGCCTAGGGGAGAGCTGCCTCTTCAGTGTAGGTGCTGATGTGGAAGGGGCAGGA

AAGGTCTGGAGCCATCTCTGGGCACACGTTTGCCATTTGCAGAGCTTCGGCTCCCTGCCTCGCCCTGTCC

TCTGCAGAACCCTGTCAGGGAAGTGTTAGTACCCATGTTTTATAGAGGAGGCGATTAAGTCTCAGGCGGA

GGTGCGAATGGTCTGTCAGCAGCTAGTGAACTGTGCCTGTCCTGGGAAGAGTTCCCCTCAAGCTGGGAAA

CCTGAGAGAGGCTAGTTGGGAGAGCCTGGTGGTGTCTCTCAGGCAAATAGCTGCTAAACAGGATTTCTCT

TTCCACACCTTTAGAACCAAGGACACTCCCAGGCTGAGTCTCCTCTTGGTGATTCTGGGCGTCATCTTCA

TGAATGGCAACCGTGCCAGCGAGGGTGAGTGGCTGGACCTGCAACTGGGGGGCTGCCCATAGTCTCATCT

TCTGGGTGCCAAACTCTCGTACCTCCTCTCCCCTCGCAGCTGTCCTCTGGGAGGCACTACGCAAGATGGG

ACTGCGCCCTGGGTATGATTGGCCTCTCCAGCTCCTCCCCTCGGTGCTATCCTCTGGCCAAAGAGGTCCT

GGGATTGCAATAGCCTGGTGGTCTGGCGCAAGGGCGTGGGGTGCCCTGGGCTCGGTAGAGAGCAAAGGAT

CTCACCAGGGCGGATGGGGAAGCGGTGCTGGACGCTGCTCAGCCCTCTCTCTGCTCTGTGGCCCCAGATG

ACATCTAAGAGAGACAGTCAGAGTCAGGGATTCCATCAAATCCCTACCTGGGGCGTCCCTGACCAACAGT

CCTCTGGCCTCTGCTGCATGCCCAGGCCTCCACAGCGACTCCCCGGGGGCTGGGAAGTCATAGTCATGCT

AGGGAGGGCCCCTGCCACCGTCTCTGCTCATGGATTCCTTTCCTTGCCCTCAGGGTGAGGCACCCATTCC

TCGGCGATCTGAGGAAGCTCATCACAGATGACTTTGTGAAGCAGAAGTAAGTATCACCTGAGCTAACTGC

GGCTCTCACTCGAGCATCCTTTGTGTGCTGGTCTGGCTGAGAAAGCAGTTCCCTATCCCAAATCTTCAAC

TGGAGGGATGGGTGCCTCTGACCTGGGAGTGAGTGGCAGTGGGGGGTATGCGAGTGTGTGGGGAGCCGAA

GGCCAGGGCGGTCTTGGGAAAAGGGAGCTCACGTCACCTGAGAACACGGTGTGGGGTGTGAAAACGGCCG

CCATCACCTTGAGCACCTGCCCTGTAGACTGACACAAGAGTTCCCCCTGGTTTACACCTAAGGAACCCGG

AGCTCAGAGAGGAGACGCCTCTGAGCATGGCTCCCAGCTGGTAAGGGCCTCAGCCCAACTCTCCTGATTT

TCAGGCCAGGGGCCACCCTCTCCCCGTCCCTGGAGGACTTGCCAACGCACAGGCGCGCATGCACACCAAC

AAAGGGTCAGGACTTGAGGAGGATGCCTGGAGCACGCTTCTCCTGGCTGACTGTTTCTTCCTCTCCAGTC

GTTTCCTCTGGTGGGCCTCTCCAGGGCTCCGCCGGGGTGTGGCCAAGACCCTCGAGGTGGGGTGTGCTCA

GAGCAGGGGGCCTGAAGAATGGCTCCTCTGTTTACAACACACCCAACAGGAAGCTGGGGTCATCGTGATG

AGGGGCACAAACTTGTGGCCTCCCTACAGACAAATGCCCTACATGTGGACCCCCTGCACCTCCGCATGGC

TTCCGGGGAGGACCAATGGCAAAAGGCTTTGAAGGCCTCACTTTTGCAGGCAGAAGTCCTGGGAGTGGGT

TTGGGAATGAGTGAAGGGCTGGAGGGGCAGGACAGTCCTCTTCCAGGAGCTGAGCTGCGGCATCGGGTTG

AGGAGGGGCCCCCTGGAACCCATCCGTTCAGCAACAGGTCTGCTTGGCTAGCAGCAAAGTTTACTTTCCT

CTCATGCCAAGGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCCAACAGCAACCCACCTGAGTATGAATTCCTCTGGG

GCCTGCGAGCCCGCCATGAGACCAGCAAGATGAGGGTCCTGAGATTCATCGCCCAGGTAAGGGAGCGCCT

CTGTTGGGTGCCCGGCACCGGGGGTGGTGCTCTCCACACCTTGCTTGTTTCTTGGTCGAGGCCTCCTTCC

CATTACCCCGTATTCCAGTGAGGGTACCAAACACTCACAGAGGCACCTGAGCACCCTACACAAGGTCACA

GATGGGGCAAAATCCCAGGTCTGGCACAGGAGAGTAGGAGCCCCCAATCCCTGTGGTCCTGATTTTTGCC

ATCATTGCACAAAGCACACGGGAGGGGGTGAGGCGGGCCGCGGGTGCTCAGCCAGTGTGGGGTAGCTCTG

TGTCTATGCCTGCCCTTTTCCTCCTCAGAATCAGAACCGAGACCCCCGGGAATGGAAGGCTCATTTCTTG

GAGGCTGTGGATGATGCTTTCAAGACAATGGATGTGGATATGGCCGAGGAACATGCCAGGGCCCAGATGA

GGGCCCAGATGAATATCGGGGATGAAGCGCTGATTGGACGGTGGAGCTGGGATGACATACAAGTCGAGCT

CCTGACCTGGGATGAGGACGGAGATTTTGGCGATGCCTGGGCCAGGATCCCCTTTGCTTTCTGGGCCAGA

TACCATCAGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTG

GCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAA

TGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGTAAGAGTTTCGGTAGAGAAATGAGACTCTG

CAGGAGGGCTGCGGAGGGGGGTGAGATGTCAGAGGGAGGGCCAGGGTGGGGGCGCTGGGGGCAACGGCAA

CAGCATGGACGGACACTTATTTTGTTACGTACACCCCTCCCTGGTTCGCGTGTGTCCACGGATGTTGTCA

CTTTGGTTTCTTGTGCTTTTATAGGCACCGTTGACGAACTGCAGCGATCTTACTGGCCAAGCCAGAGCGC

CTCCTCTCAGATTCCTTCTCGACACAGCACCCTAGGCGGCTTCTTCCTGTCAGTCGGAGGTGGCATGCAA

GATGAAGCTCTCTTTGCTCTTCCTGCTTTCATTTTGTGCTTTTCCTTGTGTTTTCATGTTTTGGGTATCA

GTGTTACATTAAAGTTGCAAAATTAA

FJX1核苷酸序列(SEQ ID NO:8)：

>NC_000011.10:35618460-35620865智人染色体11，GRCh38.p13初级组装

AGTTCCCAGCGCCGGGCGGAGCGCCGGACAGAGCCCCGCAGCGCCCCGCGGCCGCGATGGGGCCGAAGCG

CCCGAAGCCCCGGAGCCCACAAACTGCCGGGCCCGCCTCGCCGCCGGGACCCGGGTGCCTGGGCTCGGCT

TGAAGCGGCGGCGGCGCACCGGCACAGCCGCGGGAGCATGGGCAGGAGGATGCGGGGCGCCGCCGCCACC

GCGGGGCTCTGGCTGCTGGCGCTGGGCTCGCTGCTGGCGCTGTGGGGAGGGCTCCTGCCGCCGCGGACCG

AGCTGCCCGCCTCCCGGCCGCCCGAAGACCGACTCCCACGGCGCCCGGCCCGGAGCGGCGGCCCCGCGCC

CGCGCCTCGCTTCCCTCTGCCCCCGCCCCTGGCGTGGGACGCCCGCGGCGGCTCCCTGAAAACTTTCCGG

GCGCTGCTCACCCTGGCGGCCGGCGCGGACGGCCCGCCCCGGCAGTCCCGGAGCGAGCCCAGGTGGCACG

TGTCAGCCAGGCAGCCCCGGCCGGAGGAGAGCGCCGCGGTGCACGGGGGCGTCTTCTGGAGCCGCGGCCT

GGAGGAGCAGGTGCCCCCGGGCTTTTCGGAGGCCCAGGCGGCGGCGTGGCTGGAGGCGGCTCGCGGCGCC

CGGATGGTGGCCCTGGAGCGCGGGGGTTGCGGGCGCAGCTCCAACCGACTGGCCCGTTTTGCCGACGGCA

CCCGCGCCTGCGTGCGCTACGGCATCAACCCGGAGCAGATTCAGGGCGAGGCCCTGTCTTACTATCTGGC

GCGCCTGCTGGGCCTCCAGCGCCACGTGCCGCCGCTGGCACTGGCTCGGGTGGAGGCTCGGGGCGCGCAG

TGGGCGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCGCGCTGCGCACTGGACCGAGGGCAGCGTGGTGAGCCTGACACGCT

GGCTGCCCAACCTCACGGACGTGGTGGTGCCCGCGCCCTGGCGCTCGGAGGACGGCCGTCTGCGCCCCCT

CCGGGATGCCGGGGGTGAGCTGGCCAACCTCAGCCAGGCGGAGCTGGTGGACCTAGTACAATGGACCGAC

TTAATCCTTTTCGACTACCTGACGGCCAACTTCGACCGGCTCGTAAGCAACCTCTTCAGCCTGCAGTGGG

ACCCGCGCGTCATGCAGCGTGCCACCAGCAACCTGCACCGCGGTCCGGGCGGGGCGCTGGTCTTTCTGGA

CAATGAGGCGGGCTTGGTGCACGGCTACCGGGTAGCAGGCATGTGGGACAAGTATAACGAGCCGCTGTTG

CAGTCAGTGTGCGTGTTCCGCGAGCGGACCGCGCGGCGCGTCCTGGAGCTGCACCGCGGACAGGACGCCG

CGGCCCGGCTGCTGCGCCTCTACCGGCGCCACGAGCCTCGCTTCCCCGAGCTGGCCGCCCTTGCAGACCC

CCACGCTCAGCTGCTACAGCGCCGCCTCGACTTCCTCGCCAAGCACATTTTGCACTGTAAGGCCAAGTAC

GGCCGCCGGTCTGGGACTTAGTGTCACCGGGAGGAAAAGAGAGAGATCTGGGGCTGGGGTATGGATGATG

GGGGGAAGGGCGGTCGCCTCTGCCACTGTCAGGGACCAGCCGGCCAACGCCCACCCGCAAAGGTGTCTAA

AAACTTCAGCTTTTCACCCACCTGCCCCTTTCTTTCAATCCCACGCTGTTTCCTTTCAAAGTTCTGGGAG

GACGAACTCACCGAGGCGAGAAGTGTAACATTCTCTCCACCCAGCTTATAAAAGGATTCTTTACTGTGCC

AGCACGGGGATTGGATCCGAAGAAACTGGCTACTGGGGTTTGGCCCCCGAGTGGCCGTCCCTGTGGGAGA

TGCACCCCATTCTTGGGCCCCCCCTCATTCCCTTTCCGAAAAAGGAAAACTTGCGTTTGAGCCGTTGAGC

TAATTCTGCAATTTTCTACCAAACAGAGCGCTGGTGGCCCCGGAGCAGGGCTGTGACATTGGCTGGTGGA

GCCCCCTTCCTGTGTTCTCCCTTTGTTCCAGCGCCGCGATGGTGAGATCACTGTTCCAAGCAGGGGGACG

GCTCGCGATAGGACAAAGAGAGCAGGACCTCCAGACTCTGGGGAGCCCTGCAGACCTTGACAATTTGCCT

GACTCATTCCTGACCTCTTGTCATTTTGGCCTGAAGGCTACAAATTCAGGGTCAGCTGTATGCACTAAGT

CAAATAATGAATTTCTTCCTCCCTCTCGCAACCGACCAAAATTTTGACAACGATGATGTTCACCAGAAGG

AAAAAAAAAAATCAGTTTTATGCACTTTATTTTGTTTTGATTTTCATTTTTTATTAAGAAAAAATTTTAT

TTTACAGAATTTACCTTCTCTGTATATATGTGCATAAAGTGTGGTGTAAATATACTAAACAAACTTATAT

TTCAATAAAAGGGAGTTTAAAATTTA

CMV/T7双重启动子序列(SEQ ID NO:9)：

ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG

SEQ ID NO:10

GGGGG

SEQ ID NO:11

SSSSS

pDOM.MAGED4B-FJX1(SEQ ID NO:12)

DOM1＝加下划线

pDOM.MAGED4B(SEQ ID NO:13)

DOM1＝加下划线；

pDOM.FJX1(SEQ ID NO:14)

DOM1＝加下划线；

CMV启动子(SEQ ID NO:15)

TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG

MAGED4B DNA野生型(SEQ ID NO:16)

ATGGCTGAGGGAAGCTTCAGCGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATGGTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCCATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCCCAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCAACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAGTCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTACGCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCACCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGAGGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCCAACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTGGCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGCCTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGGAAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGATGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGCCAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACTCCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGCCCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCCTTCTGCAGGAGAGGGCAAATAAGTTGGTGAAATACCTGATGATTAAGGACTACAAGAAGATCCCCATCAAGCGCGCAGACATGCTGAAGGATGTCATCAGAGAATATGATGAACATTTCCCTGAGATCATTGAACGAGCAACGTACACCCTGGAAAAGAAGTTTGGGATCCACCTGAAGGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTATATTCTTGTCTGCACACGGGACTCCTCAGCTCGCCTCCTTGGAAAAACCAAGGACACTCCCAGGCTGAGTCTCCTCTTGGTGATTCTGGGCGTCATCTTCATGAATGGCAACCGTGCCAGCGAGGCTGTCCTCTGGGAGGCACTACGCAAGATGGGACTGCGCCCTGGGGTGAGGCACCCATTCCTCGGCGATCTGAGGAAGCTCATCACAGATGACTTTGTGAAGCAGAAGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCCAACAGCAACCCACCTGAGTATGAATTCCTCTGGGGCCTGCGAGCCCGCCATGAGACCAGCAAGATGAGGGTCCTGAGATTCATCGCCCAGAATCAGAACCGAGACCCCCGGGAATGGAAGGCTCATTTCTTGGAGGCTGTGGATGATGCTTTCAAGACAATGGATGTGGATATGGCCGAGGAACATGCCAGGGCCCAGATGAGGGCCCAGATGAATATCGGGGATGAAGCGCTGATTGGACGGTGGAGCTGGGATGACATACAAGTCGAGCTCCTGACCTGGGATGAGGACGGAGATTTTGGCGATGCCTGGGCCAGGATCCCCTTTGCTTTCTGGGCCAGATACCATCAGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTGGCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAATGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGCACCGTTGA

MAGED4B DNA密码子优化的(SEQ ID NO:17)

ATGGCCGAGGGATCTTTTTCTGTGCAGAGCGAAAGCTACAGCGTCGAGGACATGGACGAGGGTTCTGATGAAGTTGGCGAAGAAGAAATGGTGGAAGGAAATGACTACGAGGAGTTCGGCGCCTTCGGCGGCTACGGCACCCTGACATCCTTCGACATCCACATCCTAAGAGCCTTCGGCTCTCTGGGCCCTGGTCTTCGGATCCTGTCTAATGAGCCTTGGGAGCTGGAAAACCCCGTGCTGGCTCAAACCCTGGTGGAAGCACTCCAGCTGGATCCTGAAACCCTGGCCAACGAGACAGCTGCGCGTGCTGCCAATGTGGCCAGAGCTGCTGCAAGCAACAGAGCTGCTCGCGCCGCCGCTGCTGCCGCCCGGACAGCCTTTAGCCAGGTGGTGGCCAGCCACAGAGTGGCCACTCCTCAGGTTAGCGGCGAGGATACACAGCCTACCACCTACGCCGCCGAAGCCCAGGGCCCCACCCCTGAACCCCCTCTGGCCTCCCCTCAGACCTCCCAGATGCTGGTGACAAGCAAAATGGCCGCACCTGAGGCCCCTGCCACATCAGCCCAAAGCCAGACAGGCAGCCCTGCTCAGGAGGCCGCTACTGAGGGCCCTAGCTCAGCTTGTGCCTTCAGCCAGGCCCCGTGCGCCAGAGAGGTGGACGCCAACAGACCTAGCACCGCCTTCCTGGGCCAGAACGACGTCTTTGATTTCACCCAGCCAGCCGGAGTGTCCGGCATGGCCTTTCCTAGACCCAAGAGACCTGCCCCTGCCCAGGAGGCCGCCACCGAGGGCCCTAGCGCCGCCAGCGGAGTTCCACAGACCGGCCCCGGCAGAGAAGTGGCCGCCACGAGACCTAAGACCACAAAGAGCGGCAAAGCCCTGGCTAAGACAAGATGGGTCGAACCGCAAAACGTGGTGGCCGCCGCTGCCGCCAAGGCCAAAATGGCTACAAGTATCCCTGAGCCTGAGGGCGCTGCCGCGGCCACCGCCCAGCACAGCGCCGAGCCCTGGGCCCGGATGGGCGGAAAGAGAACCAAAAAAAGCAAGCACCTCGATGATGAGTACGAGAGCTCTGAGGAAGAGCGGGAAACACCTGCCGTGCCCCCCACCTGGAGAGCCAGCCAGCCTAGCCTGACCGTGCGGGCCCAGCTGGCCCCTCGCCCACCTATGGCCCCTAGAAGCCAGATCCCTAGCAGACACGTGCTGTGCCTGCCTCCCCGGAACGTGACCCTGCTGCAGGAGAGAGCCAACAAGCTGGTGAAGTACCTGATGATCAAGGACTATAAGAAGATCCCCATCAAGCGGGCCGACATGCTGAAGGATGTGATTAGAGAGTACGACGAGCACTTCCCCGAGATCATCGAGCGGGCCACGTACACCCTGGAAAAGAAATTCGGCATCCACCTGAAAGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTACATCCTGGTGTGCACCAGAGACAGCAGCGCTCGGCTGCTGGGAAAAACCAAGGACACCCCTCGGCTGAGCCTGCTGCTCGTGATCCTGGGCGTGATTTTCATGAACGGCAACAGAGCTTCTGAGGCAGTGCTGTGGGAAGCCCTCAGAAAGATGGGCCTGAGACCCGGAGTCAGACATCCTTTCCTGGGCGACCTGAGAAAGCTGATCACCGACGACTTCGTGAAGCAGAAGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCTAATAGCAATCCTCCAGAGTACGAGTTCCTGTGGGGCCTGCGGGCCCGCCACGAGACATCCAAGATGAGAGTGCTGAGGTTCATCGCCCAGAACCAGAACCGCGACCCCAGAGAGTGGAAGGCCCACTTCCTGGAAGCCGTGGATGACGCTTTTAAGACAATGGATGTGGACATGGCCGAGGAACACGCCCGAGCTCAGATGCGGGCCCAAATGAACATCGGCGACGAGGCCCTGATCGGCAGATGGTCCTGGGACGATATCCAGGTGGAACTGCTGACCTGGGATGAGGACGGCGATTTCGGCGACGCCTGGGCCCGAATCCCATTCGCCTTCTGGGCTAGATACCACCAGTACATCCTGAACAGCAACAGAGCTAACCGTAGAGCCACCTGGCGGGCCGGCGTGTCCAGCGGCACAAACGGCGGCGCCTCTACAAGCGTGCTGGACGGCCCAAGCACAAGCAGCACCATCAGAACCAGAAACGCCGCTAGAGCCGGCGCCAGCTTCTTCAGCTGGATCCAGCATAGATGA

DOM-MAGED4B DNA序列(SEQ ID NO:18)

ATGGGTTGGAGCTGTATCATCTTCTTTCTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTGCACTCCAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCCTCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCACCTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAACGACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCCCACCTGGAACAGTACGGCACTAACGAGTACTCCATCATCAGCTCTATGAAGAAACACTCCCTGTCCATCGGCTCTGGTTGGTCTGTTTCCCTGAAGGGTAACAACCTGATCTGGACTCTGAAAGACTCCGCGGGCGAAGTTCGTCAGATCACTTTCCGCGACCTGCCGGACAAGTTCAACGCGTACCTGGCTAACAAATGGGTTTTCATCACTATCACTAACGATCGTCTGTCTTCTGCTAACCTGTACATCAACGGCGTTCTGATGGGCTCCGCTGAAATCACTGGTCTGGGCGCTATCCGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTATCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTGTATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACGCGGCCGCTGGACCCGGACCTATGGCTGAGGGAAGCTTCAGCGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATGGTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCCATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCCCAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCAACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAGTCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTACGCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCACCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGAGGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCCAACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTGGCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGCCTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGGAAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGATGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGCCAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACTCCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGCCCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCCTTCTGCAGGAGAGGGCAAATAAGTTGGTGAAATACCTGATGATTAAGGACTACAAGAAGATCCCCATCAAGCGCGCAGACATGCTGAAGGATGTCATCAGAGAATATGATGAACATTTCCCTGAGATCATTGAACGAGCAACGTACACCCTGGAAAAGAAGTTTGGGATCCACCTGAAGGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTATATTCTTGTCTGCACACGGGACTCCTCAGCTCGCCTCCTTGGAAAAACCAAGGACACTCCCAGGCTGAGTCTCCTCTTGGTGATTCTGGGCGTCATCTTCATGAATGGCAACCGTGCCAGCGAGGCTGTCCTCTGGGAGGCACTACGCAAGATGGGACTGCGCCCTGGGGTGAGGCACCCATTCCTCGGCGATCTGAGGAAGCTCATCACAGATGACTTTGTGAAGCAGAAGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCCAACAGCAACCCACCTGAGTATGAATTCCTCTGGGGCCTGCGAGCCCGCCATGAGACCAGCAAGATGAGGGTCCTGAGATTCATCGCCCAGAATCAGAACCGAGACCCCCGGGAATGGAAGGCTCATTTCTTGGAGGCTGTGGATGATGCTTTCAAGACAATGGATGTGGATATGGCCGAGGAACATGCCAGGGCCCAGATGAGGGCCCAGATGAATATCGGGGATGAAGCGCTGATTGGACGGTGGAGCTGGGATGACATACAAGTCGAGCTCCTGACCTGGGATGAGGACGGAGATTTTGGCGATGCCTGGGCCAGGATCCCCTTTGCTTTCTGGGCCAGATACCATCAGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTGGCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAATGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGCACCGTTGA

DOM-MAGED4B密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO:19)

ATGGGTTGGAGCTGTATCATCTTCTTTCTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTGCACTCCAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCCTCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCACCTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAACGACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCCCACCTGGAACAGTACGGCACTAACGAGTACTCCATCATCAGCTCTATGAAGAAACACTCCCTGTCCATCGGCTCTGGTTGGTCTGTTTCCCTGAAGGGTAACAACCTGATCTGGACTCTGAAAGACTCCGCGGGCGAAGTTCGTCAGATCACTTTCCGCGACCTGCCGGACAAGTTCAACGCGTACCTGGCTAACAAATGGGTTTTCATCACTATCACTAACGATCGTCTGTCTTCTGCTAACCTGTACATCAACGGCGTTCTGATGGGCTCCGCTGAAATCACTGGTCTGGGCGCTATCCGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTATCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTGTATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACGCGGCCGCTGGACCCGGACCTATGGCCGAGGGATCTTTTTCTGTGCAGAGCGAAAGCTACAGCGTCGAGGACATGGACGAGGGTTCTGATGAAGTTGGCGAAGAAGAAATGGTGGAAGGAAATGACTACGAGGAGTTCGGCGCCTTCGGCGGCTACGGCACCCTGACATCCTTCGACATCCACATCCTAAGAGCCTTCGGCTCTCTGGGCCCTGGTCTTCGGATCCTGTCTAATGAGCCTTGGGAGCTGGAAAACCCCGTGCTGGCTCAAACCCTGGTGGAAGCACTCCAGCTGGATCCTGAAACCCTGGCCAACGAGACAGCTGCGCGTGCTGCCAATGTGGCCAGAGCTGCTGCAAGCAACAGAGCTGCTCGCGCCGCCGCTGCTGCCGCCCGGACAGCCTTTAGCCAGGTGGTGGCCAGCCACAGAGTGGCCACTCCTCAGGTTAGCGGCGAGGATACACAGCCTACCACCTACGCCGCCGAAGCCCAGGGCCCCACCCCTGAACCCCCTCTGGCCTCCCCTCAGACCTCCCAGATGCTGGTGACAAGCAAAATGGCCGCACCTGAGGCCCCTGCCACATCAGCCCAAAGCCAGACAGGCAGCCCTGCTCAGGAGGCCGCTACTGAGGGCCCTAGCTCAGCTTGTGCCTTCAGCCAGGCCCCGTGCGCCAGAGAGGTGGACGCCAACAGACCTAGCACCGCCTTCCTGGGCCAGAACGACGTCTTTGATTTCACCCAGCCAGCCGGAGTGTCCGGCATGGCCTTTCCTAGACCCAAGAGACCTGCCCCTGCCCAGGAGGCCGCCACCGAGGGCCCTAGCGCCGCCAGCGGAGTTCCACAGACCGGCCCCGGCAGAGAAGTGGCCGCCACGAGACCTAAGACCACAAAGAGCGGCAAAGCCCTGGCTAAGACAAGATGGGTCGAACCGCAAAACGTGGTGGCCGCCGCTGCCGCCAAGGCCAAAATGGCTACAAGTATCCCTGAGCCTGAGGGCGCTGCCGCGGCCACCGCCCAGCACAGCGCCGAGCCCTGGGCCCGGATGGGCGGAAAGAGAACCAAAAAAAGCAAGCACCTCGATGATGAGTACGAGAGCTCTGAGGAAGAGCGGGAAACACCTGCCGTGCCCCCCACCTGGAGAGCCAGCCAGCCTAGCCTGACCGTGCGGGCCCAGCTGGCCCCTCGCCCACCTATGGCCCCTAGAAGCCAGATCCCTAGCAGACACGTGCTGTGCCTGCCTCCCCGGAACGTGACCCTGCTGCAGGAGAGAGCCAACAAGCTGGTGAAGTACCTGATGATCAAGGACTATAAGAAGATCCCCATCAAGCGGGCCGACATGCTGAAGGATGTGATTAGAGAGTACGACGAGCACTTCCCCGAGATCATCGAGCGGGCCACGTACACCCTGGAAAAGAAATTCGGCATCCACCTGAAAGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTACATCCTGGTGTGCACCAGAGACAGCAGCGCTCGGCTGCTGGGAAAAACCAAGGACACCCCTCGGCTGAGCCTGCTGCTCGTGATCCTGGGCGTGATTTTCATGAACGGCAACAGAGCTTCTGAGGCAGTGCTGTGGGAAGCCCTCAGAAAGATGGGCCTGAGACCCGGAGTCAGACATCCTTTCCTGGGCGACCTGAGAAAGCTGATCACCGACGACTTCGTGAAGCAGAAGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCTAATAGCAATCCTCCAGAGTACGAGTTCCTGTGGGGCCTGCGGGCCCGCCACGAGACATCCAAGATGAGAGTGCTGAGGTTCATCGCCCAGAACCAGAACCGCGACCCCAGAGAGTGGAAGGCCCACTTCCTGGAAGCCGTGGATGACGCTTTTAAGACAATGGATGTGGACATGGCCGAGGAACACGCCCGAGCTCAGATGCGGGCCCAAATGAACATCGGCGACGAGGCCCTGATCGGCAGATGGTCCTGGGACGATATCCAGGTGGAACTGCTGACCTGGGATGAGGACGGCGATTTCGGCGACGCCTGGGCCCGAATCCCATTCGCCTTCTGGGCTAGATACCACCAGTACATCCTGAACAGCAACAGAGCTAACCGTAGAGCCACCTGGCGGGCCGGCGTGTCCAGCGGCACAAACGGCGGCGCCTCTACAAGCGTGCTGGACGGCCCAAGCACAAGCAGCACCATCAGAACCAGAAACGCCGCTAGAGCCGGCGCCAGCTTCTTCAGCTGGATCCAGCATAGATGA

FJX1野生型DNA序列(SEQ ID NO:20)

ATGGGCAGGAGGATGCGGGGCGCCGCCGCCACCGCGGGGCTCTGGCTGCTGGCGCTGGGCTCGCTGCTGGCGCTGTGGGGAGGGCTCCTGCCGCCGCGGACCGAGCTGCCCGCCTCCCGGCCGCCCGAAGACCGACTCCCACGGCGCCCGGCCCGGAGCGGCGGCCCCGCGCCCGCGCCTCGCTTCCCTCTGCCCCCGCCCCTGGCGTGGGACGCCCGCGGCGGCTCCCTGAAAACTTTCCGGGCGCTGCTCACCCTGGCGGCCGGCGCGGACGGCCCGCCCCGGCAGTCCCGGAGCGAGCCCAGGTGGCACGTGTCAGCCAGGCAGCCCCGGCCGGAGGAGAGCGCCGCGGTGCACGGGGGCGTCTTCTGGAGCCGCGGCCTGGAGGAGCAGGTGCCCCCGGGCTTTTCGGAGGCCCAGGCGGCGGCGTGGCTGGAGGCGGCTCGCGGCGCCCGGATGGTGGCCCTGGAGCGCGGGGGTTGCGGGCGCAGCTCCAACCGACTGGCCCGTTTTGCCGACGGCACCCGCGCCTGCGTGCGCTACGGCATCAACCCGGAGCAGATTCAGGGCGAGGCCCTGTCTTACTATCTGGCGCGCCTGCTGGGCCTCCAGCGCCACGTGCCGCCGCTGGCACTGGCTCGGGTGGAGGCTCGGGGCGCGCAGTGGGCGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCGCGCTGCGCACTGGACCGAGGGCAGCGTGGTGAGCCTGACACGCTGGCTGCCCAACCTCACGGACGTGGTGGTGCCCGCGCCCTGGCGCTCGGAGGACGGCCGTCTGCGCCCCCTCCGGGATGCCGGGGGTGAGCTGGCCAACCTCAGCCAGGCGGAGCTGGTGGACCTAGTACAATGGACCGACTTAATCCTTTTCGACTACCTGACGGCCAACTTCGACCGGCTCGTAAGCAACCTCTTCAGCCTGCAGTGGGACCCGCGCGTCATGCAGCGTGCCACCAGCAACCTGCACCGCGGTCCGGGCGGGGCGCTGGTCTTTCTGGACAATGAGGCGGGCTTGGTGCACGGCTACCGGGTAGCAGGCATGTGGGACAAGTATAACGAGCCGCTGTTGCAGTCAGTGTGCGTGTTCCGCGAGCGGACCGCGCGGCGCGTCCTGGAGCTGCACCGCGGACAGGACGCCGCGGCCCGGCTGCTGCGCCTCTACCGGCGCCACGAGCCTCGCTTCCCCGAGCTGGCCGCCCTTGCAGACCCCCACGCTCAGCTGCTACAGCGCCGCCTCGACTTCCTCGCCAAGCACATTTTGCACTGTAAGGCCAAGTACGGCCGCCGGTCTGGGACTTAG

FJX1密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO:21)

ATGGGCAGAAGAATGAGAGGCGCCGCTGCCACCGCCGGACTCTGGCTACTGGCTCTGGGCAGCCTGCTGGCTCTGTGGGGCGGCCTGCTGCCTCCACGAACAGAGCTGCCCGCTAGCAGACCTCCAGAAGATAGACTGCCTCGGCGGCCTGCCAGAAGCGGCGGACCTGCACCAGCCCCTAGATTCCCCCTGCCTCCTCCTCTTGCCTGGGATGCCAGAGGCGGAAGCCTGAAGACCTTCAGAGCCCTGCTCACCCTGGCAGCTGGAGCCGACGGCCCTCCTAGACAGAGCAGATCAGAGCCTCGGTGGCACGTGTCCGCCCGGCAGCCTCGGCCCGAGGAAAGCGCCGCCGTGCACGGCGGCGTGTTCTGGTCCAGAGGCCTGGAAGAACAGGTGCCTCCCGGCTTCTCAGAGGCCCAGGCCGCTGCCTGGCTGGAAGCTGCTAGAGGCGCCAGAATGGTGGCCCTCGAGCGGGGCGGTTGTGGCAGAAGCAGCAATAGACTGGCTCGGTTCGCCGATGGCACCAGAGCCTGCGTGCGGTACGGCATCAACCCCGAGCAGATCCAGGGCGAGGCCCTCAGCTACTACCTGGCCAGACTGCTGGGACTGCAAAGACACGTGCCACCTCTGGCCCTCGCCAGGGTGGAAGCCAGAGGGGCCCAGTGGGCCCAAGTGCAGGAGGAACTGAGAGCCGCCCACTGGACCGAGGGCAGCGTGGTCAGCCTGACCAGATGGCTGCCCAACCTGACCGACGTGGTGGTTCCTGCCCCTTGGCGGTCTGAAGATGGAAGACTGAGACCCCTGCGCGATGCCGGCGGCGAGCTGGCCAATCTGAGCCAGGCCGAGCTGGTCGACCTGGTGCAGTGGACAGACCTGATCCTGTTTGATTACCTGACCGCCAACTTCGACCGGCTGGTGTCCAACCTGTTCAGCCTGCAGTGGGACCCTAGAGTGATGCAGCGGGCCACAAGCAACCTCCACCGGGGTCCTGGCGGCGCCCTCGTGTTTCTGGACAACGAGGCCGGACTGGTTCATGGCTACAGAGTGGCCGGCATGTGGGACAAGTACAACGAGCCCCTGCTTCAAAGCGTGTGCGTGTTCCGCGAGAGAACCGCCAGAAGAGTGCTGGAACTGCACAGAGGACAGGACGCCGCCGCCAGACTGCTGCGGCTGTACCGGCGGCACGAGCCTAGATTCCCTGAACTGGCCGCTCTGGCCGACCCCCACGCCCAGCTGCTGCAGAGAAGGCTCGACTTCCTGGCTAAGCACATCCTGCACTGCAAGGCCAAGTACGGCAGACGGAGCGGAACATGA

DOM-FJX1 DNA序列(SEQ ID NO:22)

ATGGGTTGGAGCTGTATCATCTTCTTTCTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTGCACTCCAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCCTCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCACCTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAACGACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCCCACCTGGAACAGTACGGCACTAACGAGTACTCCATCATCAGCTCTATGAAGAAACACTCCCTGTCCATCGGCTCTGGTTGGTCTGTTTCCCTGAAGGGTAACAACCTGATCTGGACTCTGAAAGACTCCGCGGGCGAAGTTCGTCAGATCACTTTCCGCGACCTGCCGGACAAGTTCAACGCGTACCTGGCTAACAAATGGGTTTTCATCACTATCACTAACGATCGTCTGTCTTCTGCTAACCTGTACATCAACGGCGTTCTGATGGGCTCCGCTGAAATCACTGGTCTGGGCGCTATCCGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTATCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTGTATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACGCGGCCGCTGGACCCGGACCTATGGGCAGGAGGATGCGGGGCGCCGCCGCCACCGCGGGGCTCTGGCTGCTGGCGCTGGGCTCGCTGCTGGCGCTGTGGGGAGGGCTCCTGCCGCCGCGGACCGAGCTGCCCGCCTCCCGGCCGCCCGAAGACCGACTCCCACGGCGCCCGGCCCGGAGCGGCGGCCCCGCGCCCGCGCCTCGCTTCCCTCTGCCCCCGCCCCTGGCGTGGGACGCCCGCGGCGGCTCCCTGAAAACTTTCCGGGCGCTGCTCACCCTGGCGGCCGGCGCGGACGGCCCGCCCCGGCAGTCCCGGAGCGAGCCCAGGTGGCACGTGTCAGCCAGGCAGCCCCGGCCGGAGGAGAGCGCCGCGGTGCACGGGGGCGTCTTCTGGAGCCGCGGCCTGGAGGAGCAGGTGCCCCCGGGCTTTTCGGAGGCCCAGGCGGCGGCGTGGCTGGAGGCGGCTCGCGGCGCCCGGATGGTGGCCCTGGAGCGCGGGGGTTGCGGGCGCAGCTCCAACCGACTGGCCCGTTTTGCCGACGGCACCCGCGCCTGCGTGCGCTACGGCATCAACCCGGAGCAGATTCAGGGCGAGGCCCTGTCTTACTATCTGGCGCGCCTGCTGGGCCTCCAGCGCCACGTGCCGCCGCTGGCACTGGCTCGGGTGGAGGCTCGGGGCGCGCAGTGGGCGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCGCGCTGCGCACTGGACCGAGGGCAGCGTGGTGAGCCTGACACGCTGGCTGCCCAACCTCACGGACGTGGTGGTGCCCGCGCCCTGGCGCTCGGAGGACGGCCGTCTGCGCCCCCTCCGGGATGCCGGGGGTGAGCTGGCCAACCTCAGCCAGGCGGAGCTGGTGGACCTAGTACAATGGACCGACTTAATCCTTTTCGACTACCTGACGGCCAACTTCGACCGGCTCGTAAGCAACCTCTTCAGCCTGCAGTGGGACCCGCGCGTCATGCAGCGTGCCACCAGCAACCTGCACCGCGGTCCGGGCGGGGCGCTGGTCTTTCTGGACAATGAGGCGGGCTTGGTGCACGGCTACCGGGTAGCAGGCATGTGGGACAAGTATAACGAGCCGCTGTTGCAGTCAGTGTGCGTGTTCCGCGAGCGGACCGCGCGGCGCGTCCTGGAGCTGCACCGCGGACAGGACGCCGCGGCCCGGCTGCTGCGCCTCTACCGGCGCCACGAGCCTCGCTTCCCCGAGCTGGCCGCCCTTGCAGACCCCCACGCTCAGCTGCTACAGCGCCGCCTCGACTTCCTCGCCAAGCACATTTTGCACTGTAAGGCCAAGTACGGCCGCCGGTCTGGGACTTAG

DOM-FJX1密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO:23)

ATGGGTTGGAGCTGTATCATCTTCTTTCTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTGCACTCCAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCCTCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCACCTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAACGACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCCCACCTGGAACAGTACGGCACTAACGAGTACTCCATCATCAGCTCTATGAAGAAACACTCCCTGTCCATCGGCTCTGGTTGGTCTGTTTCCCTGAAGGGTAACAACCTGATCTGGACTCTGAAAGACTCCGCGGGCGAAGTTCGTCAGATCACTTTCCGCGACCTGCCGGACAAGTTCAACGCGTACCTGGCTAACAAATGGGTTTTCATCACTATCACTAACGATCGTCTGTCTTCTGCTAACCTGTACATCAACGGCGTTCTGATGGGCTCCGCTGAAATCACTGGTCTGGGCGCTATCCGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTATCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTGTATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACGCGGCCGCTGGACCCGGACCTATGGGCAGAAGAATGAGAGGCGCCGCTGCCACCGCCGGACTCTGGCTACTGGCTCTGGGCAGCCTGCTGGCTCTGTGGGGCGGCCTGCTGCCTCCACGAACAGAGCTGCCCGCTAGCAGACCTCCAGAAGATAGACTGCCTCGGCGGCCTGCCAGAAGCGGCGGACCTGCACCAGCCCCTAGATTCCCCCTGCCTCCTCCTCTTGCCTGGGATGCCAGAGGCGGAAGCCTGAAGACCTTCAGAGCCCTGCTCACCCTGGCAGCTGGAGCCGACGGCCCTCCTAGACAGAGCAGATCAGAGCCTCGGTGGCACGTGTCCGCCCGGCAGCCTCGGCCCGAGGAAAGCGCCGCCGTGCACGGCGGCGTGTTCTGGTCCAGAGGCCTGGAAGAACAGGTGCCTCCCGGCTTCTCAGAGGCCCAGGCCGCTGCCTGGCTGGAAGCTGCTAGAGGCGCCAGAATGGTGGCCCTCGAGCGGGGCGGTTGTGGCAGAAGCAGCAATAGACTGGCTCGGTTCGCCGATGGCACCAGAGCCTGCGTGCGGTACGGCATCAACCCCGAGCAGATCCAGGGCGAGGCCCTCAGCTACTACCTGGCCAGACTGCTGGGACTGCAAAGACACGTGCCACCTCTGGCCCTCGCCAGGGTGGAAGCCAGAGGGGCCCAGTGGGCCCAAGTGCAGGAGGAACTGAGAGCCGCCCACTGGACCGAGGGCAGCGTGGTCAGCCTGACCAGATGGCTGCCCAACCTGACCGACGTGGTGGTTCCTGCCCCTTGGCGGTCTGAAGATGGAAGACTGAGACCCCTGCGCGATGCCGGCGGCGAGCTGGCCAATCTGAGCCAGGCCGAGCTGGTCGACCTGGTGCAGTGGACAGACCTGATCCTGTTTGATTACCTGACCGCCAACTTCGACCGGCTGGTGTCCAACCTGTTCAGCCTGCAGTGGGACCCTAGAGTGATGCAGCGGGCCACAAGCAACCTCCACCGGGGTCCTGGCGGCGCCCTCGTGTTTCTGGACAACGAGGCCGGACTGGTTCATGGCTACAGAGTGGCCGGCATGTGGGACAAGTACAACGAGCCCCTGCTTCAAAGCGTGTGCGTGTTCCGCGAGAGAACCGCCAGAAGAGTGCTGGAACTGCACAGAGGACAGGACGCCGCCGCCAGACTGCTGCGGCTGTACCGGCGGCACGAGCCTAGATTCCCTGAACTGGCCGCTCTGGCCGACCCCCACGCCCAGCTGCTGCAGAGAAGGCTCGACTTCCTGGCTAAGCACATCCTGCACTGCAAGGCCAAGTACGGCAGACGGAGCGGAACATGA

MAGED4B截短物

MAGED4B sv1(SEQ ID NO:24)

ATGGCTGAGGGAAGCTTCAGCGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATGGTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCCATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCCCAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCAACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAGTCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTACGCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCACCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGAGGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCCAACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTGGCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGCCTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGGAAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGATGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGCCAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACTCCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGCCCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCAGACTGTCTCTGCTGCTGGTCATCCTGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTGGCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAATGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGCACCGT

MAGED4B sv2(SEQ ID NO:25)

ATGGCTGAGGGAAGCTTCAGCGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATGGTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCCATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCCCAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCAACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAGTCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTACGCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCACCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGAGGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCCAACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTGGCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGCCTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGGAAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGATGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGCCAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACTCCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGCCCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCAGGCTGAGTCTCCTCTTGGTGATTCTGGGCGTCATCTTCATGAATGGCAACCGTGCCAGCGAGGCTGTCCTCTGGGAGGCACTACGCAAGATGGGACTGCGCCCTGGGGTGAGGCACCCATTCCTCGGCGATCTGAGGAAGCTCATCACAGATGACTTTGTGAAGCAGAAGTACCTGGAATACAAGAAGATCCCCAACAGCAACCCACCTGAGTATGAATTCCTCTGGGGCCTGCGAGCCCGCCATGAGACCAGCAAGATGAGGGTCCTGAGATTCATCGCCCAGAATCAGAACCGAGACCCCCGGGAATGGAAGGCTCATTTCTTGGAGGCTGTGGATGATGCTTTCAAGACAATGGATGTGGATATGGCCGAGGAACATGCCAGGGCCCAGATGAGGGCCCAGATGAATATCGGGGATGAAGCGCTGATTGGACGGTGGAGCTGGGATGACATACAAGTCGAGCTCCTGACCTGGGATGAGGACGGAGATTTTGGCGATGCCTGGGCCAGGATCCCCTTTGCTTTCTGGGCCAGATACCATCAGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTGGCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAATGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGCACCGT

MAGED4B sv3(SEQ ID NO:26)

ATGGCTGAGGGAAGCTTCAGCGTGCAATCGGAAAGCTACAGTGTTGAAGACATGGATGAGGGTAGCGACGAAGTCGGGGAGGAAGAGATGGTTGAAGGCAACGACTATGAAGAATTCGGTGCGTTTGGTGGCTATGGCACCCTCACCAGCTTTGACATCCATATCCTCAGAGCCTTCGGAAGCTTGGGTCCAGGCCTTCGCATCTTATCGAATGAGCCCTGGGAACTGGAAAACCCTGTGCTGGCCCAGACCCTGGTGGAGGCATTGCAGCTGGATCCGGAAACACTTGCCAATGAGACGGCCGCCCGTGCTGCCAACGTAGCCCGCGCCGCCGCCTCCAACCGTGCGGCTCGGGCCGCTGCCGCCGCTGCCCGTACCGCCTTCAGTCAGGTGGTCGCTAGCCACCGGGTGGCCACGCCGCAGGTCTCAGGAGAGGATACCCAGCCCACGACCTACGCCGCCGAGGCTCAGGGGCCCACCCCTGAGCCACCCCTTGCTTCTCCGCAGACCTCCCAGATGTTAGTCACCAGTAAGATGGCTGCCCCCGAGGCTCCGGCAACCTCCGCACAGTCCCAGACAGGCTCCCCGGCCCAGGAGGCTGCTACTGAGGGCCCTAGTAGCGCCTGTGCTTTCTCTCAGGCTCCGTGTGCCAGGGAGGTGGACGCCAACCGGCCCAGCACAGCCTTCCTGGGCCAGAATGATGTCTTCGATTTCACTCAGCCGGCAGGTGTCAGTGGCATGGCCTTCCCGCGCCCCAAGAGACCTGCCCCAGCCCAAGAGGCTGCCACAGAGGGCCCCAGTGCTGCCTCTGGTGTGCCCCAGACGGGACCTGGCAGGGAGGTGGCAGCCACCCGGCCCAAGACCACCAAGTCGGGGAAGGCGCTGGCCAAGACTCGGTGGGTGGAGCCTCAGAATGTTGTGGCAGCAGCTGCTGCCAAGGCCAAGATGGCCACGAGCATCCCTGAGCCGGAGGGTGCAGCTGCTGCCACTGCTCAGCACAGTGCTGAGCCCTGGGCCAGGATGGGAGGCAAGAGGACCAAGAAGTCCAAGCACCTGGATGATGAGTATGAGAGCAGCGAGGAGGAGAGAGAGACTCCCGCGGTCCCACCCACCTGGAGAGCATCACAGCCCTCATTGACGGTGCGGGCTCAGTTGGCCCCTCGGCCCCCGATGGCCCCGAGGTCCCAGATACCCTCAAGGCACGTACTGTGCCTGCCCCCCCGCAACGTGACCCTTCTGCAGGAGAGGGCAAATAAGTTGGTGAAATACCTGATGATTAAGGACTACAAGAAGATCCCCATCAAGCGCGCAGACATGCTGAAGGATGTCATCAGAGAATATGATGAACATTTCCCTGAGATCATTGAACGAGCAACGTACACCCTGGAAAAGAAGTTTGGGATCCACCTGAAGGAGATCGACAAGGAAGAACACCTGTATATTCTTGTCTGCACACGGGACTCCTCAGCTCGCCTCCTTGGAAAAACCAAGGACACTCCCAGGCTGAGTCTCCTCTTGGTGATTCTGTACATTCTGAATAGCAACCGTGCCAACAGGAGGGCCACGTGGAGAGCTGGCGTCAGCAGTGGCACCAATGGAGGGGCCAGCACCAGCGTCCTAGATGGCCCCAGCACCAGCTCCACCATCCGGACCAGAAATGCTGCCAGAGCTGGCGCCAGCTTCTTCTCCTGGATCCAGCACCGT

前导/信号肽

mIGH SP(SEQ ID NO:27)

ATGGGTTGGAGCTGTATCATCTTCTTTCTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTGCACTCC

替代性融合体-辅助基序

PVXCP(SEQ ID NO:28)

ATGAGCGCCCCTGCCTCTACAACACAGCCTATCGGCAGCACCACCTCCACCACCACAAAAACAGCTGGCGCTACCCCTGCCACAGCCTCTGGCCTGTTTACAATCCCTGACGGCGACTTCTTCAGCACCGCCAGAGCTATCGTGGCCTCTAACGCCGTGGCCACAAACGAGGACCTGAGCAAGATCGAGGCCATCTGGAAGGACATGAAGGTGCCCACCGACACAATGGCCCAGGCTGCTTGGGATCTCGTCAGACACTGTGCCGATGTGGGCAGCTCTGCCCAGACAGAGATGATCGACACAGGCCCCTACAGCAACGGCATCAGCAGAGCTAGACTGGCCGCTGCCATCAAAGAAGTGTGCACCCTGAGACAGTTCTGCATGAAGTACGCCCCTGTCGTGTGGAACTGGATGCTGACCAACAACAGCCCTCCTGCCAACTGGCAGGCTCAGGGCTTTAAGCCAGAGCACAAGTTCGCCGCCTTCGATTTCTTCAACGGCGTGACAAACCCTGCCGCCATCATGCCTAAAGAGGGCCTGATCAGACCTCCTAGCGAGGCCGAGATGAACGCCGCTCAGACTGCTGCCTTCGTGAAGATCACCAAGGCCAGGGCTCAGAGCAACGACTTCGCCTCTCTTGATGCCGCCGTGACCAGAGGCAGAATCACCGGAACCACAACAGCCGAGGCTGTCGTGACATTGCCTCCTCCA

MIP3a(SEQ ID NO:29)

ATGTGCTGTACCAAGTCTCTGCTGCTGGCCGCTCTGATGTCTGTGCTGCTGCTGCATCTGTGTGGCGAGTCTGAGGCCGCCAGCAACTTCGACTGTTGTCTGGGCTACACCGACAGAATCCTGCATCCTAAGTTCATCGTGGGCTTCACCAGACAGCTGGCCAACGAGGGCTGTGACATCAACGCCATCATCTTCCACACCAAGAAGAAGCTGAGCGTCTGCGCTAACCCCAAGCAGACCTGGGTCAAGTACATCGTGCGGCTGCTGAGCAAGAAAGTGAAGAACATG

MITD：HLA-A2 MITD(SEQ ID NO:30)

ATCGTGGGAATTGTGGCTGGACTGGCCCTGTTTGGCGCCGTGATTACAGGTGCTGTGGTGGCCGCTGTTATGTGGCGGAGAAAGAGCAGCGACAGAAAAGGCGGCAGCTACTCTCAGGCCGCCAGCTCTGATTCTGCCCAGGGCTCTGATGTGTCCCTGACAGCT

MAGED4B蛋白(SEQ ID NO:31)

DOM-MAGED4B蛋白(SEQ ID NO:32)

MGWSCIIFFLVATATGVHSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNAAAGPGPMAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTLLQERANKLVKYLMIKDYKKIPIKRADMLKDVIREYDEHFPEIIERATYTLEKKFGIHLKEIDKEEHLYILVCTRDSSARLLGKTKDTPRLSLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPFLGDLRKLITDDFVKQKYLEYKKIPNSNPPEYEFLWGLRARHETSKMRVLRFIAQNQNRDPREWKAHFLEAVDDAFKTMDVDMAEEHARAQMRAQMNIGDEALIGRWSWDDIQVELLTWDEDGDFGDAWARIPFAFWARYHQYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

FJX1蛋白序列(SEQ ID NO:33)

DOM-FJX1蛋白序列(SEQ ID NO:34)

MGWSCIIFFLVATATGVHSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNAAAGPGPMGRRMRGAAATAGLWLLALGSLLALWGGLLPPRTELPASRPPEDRLPRRPARSGGPAPAPRFPLPPPLAWDARGGSLKTFRALLTLAAGADGPPRQSRSEPRWHVSARQPRPEESAAVHGGVFWSRGLEEQVPPGFSEAQAAAWLEAARGARMVALERGGCGRSSNRLARFADGTRACVRYGINPEQIQGEALSYYLARLLGLQRHVPPLALARVEARGAQWAQVQEELRAAHWTEGSVVSLTRWLPNLTDVVVPAPWRSEDGRLRPLRDAGGELANLSQAELVDLVQWTDLILFDYLTANFDRLVSNLFSLQWDPRVMQRATSNLHRGPGGALVFLDNEAGLVHGYRVAGMWDKYNEPLLQSVCVFRERTARRVLELHRGQDAAARLLRLYRRHEPRFPELAALADPHAQLLQRRLDFLAKHILHCKAKYGRRSGT

前导序列加下划线。

MAGED4B截短物

MAGED4B sv1(SEQ ID NO:35)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTRLSLLLVILYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

MAGED4B sv2(SEQ ID NO:36)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTRLSLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPFLGDLRKLITDDFVKQKYLEYKKIPNSNPPEYEFLWGLRARHETSKMRVLRFIAQNQNRDPREWKAHFLEAVDDAFKTMDVDMAEEHARAQMRAQMNIGDEALIGRWSWDDIQVELLTWDEDGDFGDAWARIPFAFWARYHQYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

MAGED4B sv3(SEQ ID NO:37)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTLLQERANKLVKYLMIKDYKKIPIKRADMLKDVIREYDEHFPEIIERATYTLEKKFGIHLKEIDKEEHLYILVCTRDSSARLLGKTKDTPRLSLLLVILYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

替代性融合体-辅助基序：

PVXCP(SEQ ID NO:38)

MSAPASTTQPIGSTTSTTTKTAGATPATASGLFTIPDGDFFSTARAIVASNAVATNEDLSKIEAIWKDMKVPTDTMAQAAWDLVRHCADVGSSAQTEMIDTGPYSNGISRARLAAAIKEVCTLRQFCMKYAPVVWNWMLTNNSPPANWQAQGFKPEHKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKEGLIRPPSEAEMNAAQTAAFVKITKARAQSNDFASLDAAVTRGRITGTTTAEAVVTLPPP

MIP3a(SEQ ID NO:39)

MCCTKSLLLAALMSVLLLHLCGESEAASNFDCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLANEGCDINAIIFHTKKKLSVCANPKQTWVKYIVRLLSKKVKNM

MITD(SEQ ID NO:40)

IVGIVAGLALFGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA

MAGED4B人同种型2(SEQ ID NO:41)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTLLQERANKLVKYLMIKDYKKIPIKRADMLKDVIREYDEHFPEIIERATYTLEKKFGIHLKEIDKEEHLYILVCTRDSSARLLGKTKDTPRLSLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPFLGDLRKLITDDFVKQKYLEYKKIPNSNPPEYEFLWGLRARHETSKMRVLRFIAQNQNRDPREWKAHFLEAVDDAFKTMDVDMAEEHARAQMRAQMNIGDEALIGRWSWDDIQVELLTWDEDGDFGDAWARIPFAFWARYHQYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQ

MAGED4B人同种型3(SEQ ID NO:42)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKVRSPCPLPPPHPLAPVLSFSSLSCSSPPSPLPLLPLFSSFPSFSPHLPSPPLLSSQLVHVSPTQVC

MAGED4B人同种型4(SEQ ID NO:43)

MAEGSFSVQSESYSVEDMDEGSDEVGEEEMVEGNDYEEFGAFGGYGTLTSFDIHILRAFGSLGPGLRILSNEPWELENPVLAQTLVEALQLDPETLANETAARAANVARAAASNRAARAAAAAARTAFSQVVASHRVATPQVSGEDTQPTTYAAEAQGPTPEPPLASPQTSQMLVTSKMAAPEAPATSAQSQTGSPAQEAATEGPSSACAFSQAPCAREVDANRPSTAFLGQNDVFDFTQPAGVSGMAFPRPKRPAPAQEAATEGPSAASGVPQTGPGREVAATRPKTTKSGKALAKTRWVEPQNVVAAAAAKAKMATSIPEPEGAAAATAQHSAEPWARMGGKRTKKSKHLDDEYESSEEERETPAVPPTWRASQPSLTVRAQLAPRPPMAPRSQIPSRHVLCLPPRNVTLLQERANKLVKYLMIKDYKKIPIKRADMLKDVIREYDEHFPEIIERATYTLEKKFGIHLKEIDKEEHLYILVCTRDSSARLLGKTKDTPRLSLLLVILGVIFMNGNRASEAVLWEALRKMGLRPGVRHPFLGDLRKLITDDFVKQKNPELREETPLSMAPSWYLEYKKIPNSNPPEYEFLWGLRARHETSKMRVLRFIAQNQNRDPREWKAHFLEAVDDAFKTMDVDMAEEHARAQMRAQMNIGDEALIGRWSWDDIQVELLTWDEDGDFGDAWARIPFAFWARYHQYILNSNRANRRATWRAGVSSGTNGGASTSVLDGPSTSSTIRTRNAARAGASFFSWIQHR

本发明定义了：

A.一种癌症疫苗，其包含编码蛋白MAGED4B和/或FJX1或其变体，并且进一步编码破伤风毒素的免疫原性片段的核酸。

B.根据段落A所述的癌症疫苗，其中所述MAGED4B蛋白包含SEQ ID NO:3的序列或其变体或者由其组成。

C.根据段落A或段落B所述的癌症疫苗，其中所述FJX1蛋白包含SEQ ID NO:4的序列或其变体或者由其组成。

D.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述破伤风毒素的免疫原性片段包含破伤风毒素的p30 MHC II表位或者由其组成。

E.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述破伤风毒素的免疫原性片段包含DOM或者由其组成。

F.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述MAGED4B和FJX1抗原编码为单一融合蛋白。

G.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述破伤风毒素的免疫原性片段、MAGED4B和FJX1编码为单一融合蛋白。

H.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中在所述破伤风毒素的免疫原性片段、MAGED4B和FJX1的抗原中的一者或多者或者全部之间提供有接头残基。

I.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸进一步编码信号肽以增强分泌的功效。

J.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸进一步编码一个或多个启动子。

K.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸进一步编码polyA转录终止序列。

L.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸包含编码SEQ ID NO:2-4或其变体的序列。

M.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸包含编码SEQ ID NO:1-6的序列。

N.根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸包含SEQ ID NO:12、13或14的序列或者由其组成。

O.一种组合物，其包含根据前述段落中任一项所述的癌症疫苗。

P.根据段落A-M中任一项所述的癌症疫苗或根据段落O所述的组合物，用于作为药物。

Q.根据段落A-M中任一项所述的癌症疫苗或根据段落O所述的组合物，用于在受试者中治疗或预防癌症的用途中。

R.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将根据段落A-M中任一项所述的癌症疫苗或根据段落O所述的组合物施用至所述受试者。

S.用于根据段落Q所述的用途的癌症疫苗或组合物或根据段落R所述的治疗或预防的方法，其中所述待治疗或预防的癌症是口腔癌和/或口咽癌。

T.用于根据段落P、Q或S中任一项所述的用途的癌症疫苗或组合物或根据段落R或S所述的治疗或预防的方法，其中将所述癌症疫苗或组合物与检查点抑制剂的施用组合用于所述受试者。

U.用于根据段落T所述的用途的癌症疫苗或组合物或根据段落T所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括抗PD1或抗CTLA4结合分子或编码抗PD1或抗CTLA4结合分子的核酸。

V.一种用于治疗或预防癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：

-根据段落A-M中任一项所述的癌症疫苗；以及

-检查点抑制剂，诸如抗PD1或抗CTLA4结合分子。

W.一种用于治疗或预防癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：

-根据段落A-M中任一项所述的第一癌症疫苗，其中所述核酸编码MAGED4B；

-根据段落A-M中任一项所述的第二癌症疫苗，其中所述核酸编码FJX1；以及任选地，

-检查点抑制剂，诸如抗PD1结合分子。

本发明已经充分展示并且在下文呈现了用于所获得的并且呈现于本文包括的图中的数据的材料和方法，其中关于诸如治疗策略的事项的具体信息包括在附图和附图说明中。在此呈现的方法和数据是为了支持本发明并且是示例性的，其描绘了一些可替代的疫苗构建体等。

实施例

实施例1

在HPV-ve HNSCC中对靶向MAGED4B/FJX抗原的DNA疫苗的免疫原性的评价

在患有HPV非依赖性HNSCC的患者中的靶抗原表达和预先存在的T细胞应答

虽然基于个体肿瘤突变组的患者特异性疫苗的开发存在激发兴趣的潜力，但这种方法的昂贵和技术难度意味着，即使成功，也不太可能使大多数患者受益。鉴定患者之间共有的常见肿瘤抗原以产生通用型癌症疫苗将提供用于OSCC的廉价且广泛可用的治疗。在不同类型的TAA中，癌症/睾丸(CT)抗原是高度有前途的治疗性靶标；在癌症患者中经常观察到对CT抗原的细胞和体液免疫应答，并且在CT抗原表达与肿瘤免疫浸润物的细胞溶解活性之间存在关联。CT抗原的免疫原性和癌症特异性使其变为癌症免疫疗法的优先靶标，并且它们的治疗性功能已经在多种临床环境中进行了测试。CT抗原疫苗通常耐受良好，并且目前存在大量的评估其治疗效果的进行中癌症疫苗接种试验。我们选择两种癌症睾丸抗原MAGED4B和FJX1，它们被鉴定为经常表达于OSCC中。然后我们将这些数据扩展至使用CGA(癌症基因组图谱)数据集的分析，并且确认该表达。总体上，两者抗原在96％的OSCC病例下以RNA水平表达。此外，我们确认了两种抗原在口腔发育异常和OSCC病例(10/10是阳性的；对于每种病症为5例)中以蛋白质水平的表达，而在非恶性口腔粘膜中没有表达(图2)。与健康组织中的蛋白质水平下的表达数据平行的是使用HLA-A2四聚体(目前仅可用于MAGED4B)和针对每种抗原的整个氨基酸序列的重叠肽池(OPP)在患有HPV非依赖性HNSCC的患者中对针对抗原的预先存在免疫性的研究。在血液和肿瘤两者中使用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞测量这些表达。在4/6HLA-A2患者中观察到循环MAGED4B四聚体阳性CD8+T细胞(总CD8+T细胞的0.04％-0.1％)(图3)，以及也具有以相似频率阳性的四聚体的2/2扩增的TIL(图4A和图5)。使用OPP在HLA-A2阴性、HLA-A1阳性TIL样品中检测到较高水平的MAGED4B阳性CD8 T细胞(5-10倍)，这指示了超出HLA-A2限制的反应性(图4B)。对于FJX1，迄今为止仅已经使用OPP在扩增的TIL样品中评价CD8 T细胞反应性，并在同时存在有MAGED4B CD8 T细胞的HLA-A1患者中展示出CD8反应性(图4B)。患者的数据表明了两种抗原的显著免疫原性，对于MAGED4B更是如此明显。

实施例2

关于DNA疫苗功效/免疫原性的临床前数据

疫苗设计

在HPV+癌症中，编码免疫原性病毒抗原的DNA疫苗有了显著进步，其中在子宫颈瘤形成中的随机化2b期临床试验的最近结果展示出疾病的组织病理学消退。我们的DNA疫苗接种的方法已经用于在破伤风毒素结构域(Dom)的免疫原性序列的背景下递送肿瘤特异性肽或抗原。疫苗设计旨在提供关联的CD4 T细胞辅助以便在患有癌症的患者中最佳诱导CD8+T细胞，这是一种打破耐受性的强效策略。II期临床数据表明，DNA疫苗接种能够克服肿瘤组织中的外周耐受性，其中在疫苗后检测到针对肿瘤抗原(癌胚抗原；CEA)的CD8 T细胞应答并且指示了临床益处。因此，我们应用基于Dom的设计以产生编码全长MAGED4B和FJX1抗原(p.Dom-MAGED4BFL和p.Dom-FJX1FL)的DNA疫苗。在此，我们选择全长抗原设计来实现更宽的群体覆盖而不集中于靶向单独HLA等位基因(HLA-A2)。

小鼠模型

对于免疫原性，在没有肿瘤激发的情况下使用HLA-A2转基因小鼠HHD。将B16/F10用人HLA-A2、MAGED4B和FJX1构建体转染以模拟这些抗原在HLA-A2转基因的人源化小鼠模型(B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J)中使用的HNSCC中的表达。皮下给予肿瘤。

在非荷瘤小鼠中通过电穿孔给予单剂量的疫苗后，已经确认每种疫苗的免疫原性(图7)。使用覆盖每种抗原的整个序列(MAGED4B 183肽；FJX1 107肽)的重叠肽池(OPP)来测量抗原特异性T细胞应答。

在肿瘤激发实验中，当在第3天肿瘤可觉察时(大小)对实验小鼠进行疫苗接种。在具有或不具有抗PD1(体内Mab抗小鼠PD1(来自BioXcell的RMP1-14、BEO146)的情况下，将DNA疫苗作为混合物间隔3周给予两次，其中抗PD1充当比较物。与实验平行的是使用如上的OPP的免疫原性测量。DNA疫苗能够相对于对照DNA疫苗(p.Dom骨架)以与抗PD1的类似水平减少/抑制肿瘤生长，其中当组合在一起时具有显著的协同作用(图9B)。与所述数据平行的是展示MAGED4B特异性T细胞的诱导和在与抗PD1组合时MAGED4B特异性T细胞的增加(图9C)。共同地，临床前数据证明，靶向MAGED4-B/FJX1的DNA疫苗具有抑制表达这些抗原的肿瘤生长的显著潜力，并且该显著潜力可以通过与抗PD1组合进一步增强。

实施例3

替代性基因融合配偶体-辅助基序-MITD、PVXCP、MIP3α

已经显示附接至靶抗原的C末端的MHC I类运输信号(MITD)促进MHCI和MHCII表位两者的呈递，从而导致CD4和CD8 T细胞的多表位扩增(Kreiter S等人J Immunol.2008；180(1):309-18)。

PVXCP(马铃薯病毒X外壳蛋白)是辅助序列，已经显示其与来自破伤风毒素的DOM辅助序列类似地通过相关联T细胞辅助的机制来增强T细胞对融合癌症抗原应答的诱导(Savelyeva N等人Nature biotechnology.2001；19(8):760-4，和Stegantseva MV等人,Cancer immunology,immunotherapy:CII.2020)。

已经显示与趋化因子MIP3α融合的抗原经由趋化因子受体CCR6指导未成熟DC(Biragyn A等人J Immunol.2001；167(11):6644-53)。在受体介导的摄取后，融合抗原由MHC I和II类两者呈递，从而激活显著应答CD4+和CD8+T细胞应答(Biragyn A等人Blood.2004；104(7):1961-9,Biragyn A等人J Immunol.2007；179(2):1381-8)。

这些融合体描绘于图13中并且附图说明提供进一步信息。

具有辅助基序的融合构建体的组装

MITD(165bp)编码HLA-A2运输信号。PVXCP(732bp)编码马铃薯病毒X外壳蛋白。MIP3α(252bp)编码巨噬细胞炎症性蛋白3α。MITD PVXCP和MIP3α基因是密码子优化的并且通过GeneArt(Invitrogen)合成。将前导序列编码小鼠(mus)IgH信号肽(MGWSCIIFFLVATATGVHS)插入在每个构建体的N末端处以增强分泌，除了MIP3α融合构建体(其具有自己的信号肽)之外。用七氨基酸接头(AAAGPGP)连接融合配偶体和关注的基因(MAGED4B或FJX1)。除了MITD之外，将所有其他融合配偶体融合在靶标癌症抗原的上游(图13)。将MITD序列添加在抗原性序列的下游。将针对关注的MAGED4B、FJX1或其融合体的基因在NotI、XhoI和XbaI限制性酶位点处插入至pcDNA3载体中以产生DNA疫苗构建体。

对含有DOM和不同融合辅助基序配偶体的融合构建体的免疫原性的评价：

用于评价单独的或与电穿孔组合的DNA疫苗的免疫原性的一般疫苗接种方案是初免/加强(图17；21-26)(在每个附图说明中指示出特异性疫苗构建体)：

在第1天，将三组5-6只非荷瘤HHD(人HLA-A2等位基因转基因的)小鼠用50μgp.Dom-MAGED4B、p.Dom-FJX1或p.Dom单独地进行疫苗接种，之后在第22天通过电穿孔进行相同DNA疫苗的加强注射。通过IFN-γELISPOT评价其免疫原性。在第35天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISPOT板(图8)。在图21-26中的实验中，在附图说明中指示出dbDNA疫苗的不同剂量。

在图11、12、14中的实验中，在第1和8天给予疫苗接种，并且在第22天获取用于ELISPOT的脾脏(在每个附图说明中指示出特异性疫苗构建体)。

在图15、19和20中，在仅根据以下一般(在每个附图说明中指示出特异性疫苗构建体)方案初免之后评价应答：将非荷瘤C57B/6小鼠用50μg pDOM质粒疫苗(作为阴性对照，3只小鼠)、25μg DB-DOM-FJX1 CO(5只小鼠)和25μg pDom-FJX1质粒(5只小鼠)进行疫苗接种。在第1天用EP i.m施用疫苗。在图15的实验中，小鼠接受50μg DNA疫苗。在第14天将从小鼠脾脏分离的淋巴细胞铺板至ELISPOT板。

如本文所用的一般ELISpot方案：

根据制造商的方案(BD Biosciences)进行IFNγELISpot。简而言之，使用Lymphoprep^TM从疫苗接种小鼠的脾脏分离淋巴细胞并且将其以2.5x10⁵个细胞/孔铺板至ELISpot板。将针对每种靶抗原MAGED4B或FJX1的重叠肽池(OPP)添加至最终浓度为1μM，并且在37℃下以5％在补充有10％FCS、20mM L-谷氨酰胺、10U/ml青霉素/链霉素的RPMI中孵育40小时。针对每种抗原的整个序列的重叠肽池由具有11aa重叠的15聚体肽组成；对于MAGED4B合并183种肽，并且对于FJX1合并107种肽(JPT,Germany)。FJX1 OPP充当靶向MAGED4B的疫苗的阴性对照并且以此类推。对对应于单独应答性T细胞的斑点形成单位(SFU)进行成像，并且用AID ELISpot读板仪系统ELR04和软件(AID AutoimmunDiagnostika GmbH,Strassburg,Germany)计算。使用PRISM graphpad包生成图。

实施例4

CAF上MAGED4B抗原的鉴定

HNSCC病例的免疫组织化学分析展示出癌症相关成纤维细胞以及癌细胞中的强MageD4B表达。在使用高pH(Tris-EDTA(pH(9))缓冲液抗原修复后，将抗MAGED4B单克隆抗体(Santa Cruz,G12；sc-393059)以1:50稀释度用于HNSCC组织。在南安普顿NHS信托大学医院的细胞病理学部门中进行去石蜡化、再水合、抗原修复并且使用Dako PT Link自动染色仪(使用EnVision FLEX靶标修复溶液，高pH(Agilent Dako)和DAKO自动染色仪Link48进行IHC染色。将DAKO Envision FLEX小鼠接头应用至切片15分钟；DAKO Envision FLEX HRP(20分钟)和DAKO底物工作溶液(10分钟)，并且然后用DAKO Envision FLEX HRP苏木精复染5分钟。在WISH实验室中使用ZEISS Axio扫描器捕获图像。

呈现六例单独HNSCC病例(图27)。

对HNSCC的10例病例的分析在9/10病例中确认了MAGED4B的肿瘤细胞表达。使用H评分(染色强度(评分为0-3)和阳性细胞的百分比(评分为0-100)的乘积；从而产生300的最大可能评分，即100％的肿瘤细胞显示出强染色)评估肿瘤细胞表达的水平。值得注意的是，(并且意料不到地)，还在CAF(7/10病例)中观察到MAGED4的高表达，如下表中以CAF+指示的。CAF染色评估为阳性或阴性的。我们通过分析scRNASeq HNSCC转录物组数据确认了CAFMageD4B表达(其还确认了HNSCC细胞的MAGED4B表达)(图28A)。单细胞RNASeq(scRNASeq)已成为用于定量单独细胞的转录物组的有效方法，并且在Andrews,T和Hemberg,M,MolecularAspects of Medicine Volume 59,2018年2月,第114-122页中概述了适当的方案。

表中示出了肿瘤细胞的染色强度。CAF+指示CAF中对于MAGED4B的强染色。

实施例5

肿瘤和正常组织中MAGED4B表达的鉴定

设计这些研究以评价肿瘤和正常组织样品两者中的MAGED4B和FJX1表达。获得来自OSCC患者和正常组织微阵列样品的肿瘤活检样品，并且对其进行免疫组织化学分析。两种抗原的强表达在来自患有OSCC的患者的所有样品中是明显的。针对每种抗原，使用HPV-HNSCC的样品5/5且在口腔发育异常组织中5/5(南安普顿，英国群组)。针对抗原表达，评价28个样品，其中28/28样品是MAGED4B阳性的并且27/28样品是FJX1阳性的(马来西亚群组)。

此外，来自患有肺癌患者的5个样品(3LUAD，2LUSC)表现出MAGED4B的强表达。

在健康组织中未展示出的表达/展示出可忽略的表达的分析中表明了靶向这两种抗原中的任一种的适合性，并且通过TMA样品中的低染色确认(数据未示出)。因此，预期疫苗不诱导针对正常组织的免疫应答。

该工作确立了两种抗原在来自马来西亚和英国的患者的多个HPV-ve HNSCC样品中的表达，并且确认了主要器官(包括非发育异常口腔组织)的组织微阵列面板的有利组织表达模式。

对于南安普敦OSCC患者样品：根据制造商的说明书使用自动化DAKO自动染色仪对样品进行染色。

表1：方法汇总(UK)：

对于OSCC患者的马来西亚群组，鉴定出FFPE块并且以4μm切片于带正电玻璃片上。简而言之，将来自切片的蜡在65℃下熔融10分钟，之后通过二甲苯取代物的2次洗涤(各自5分钟)进行去石蜡化。然后将切片在分等级的乙醇(100％乙醇X 2，95％乙醇X 2，70％乙醇X1)中再水合，并且在蒸馏水中至少洗涤30秒。之后在99℃下进行热诱导的抗原修复(对于MAGED4B为柠檬酸缓冲液pH 6；对于FJX1为Tris-EDTA缓冲液pH 9)持续20分钟。通过在室温下将切片在来自Dako cytomation Envision+Dual Link系统HRP(DAB+)试剂盒的双重内源性酶中孵育10分钟来阻断试剂的非特异性结合。然后在4℃中将切片与抗MAGED4B(1:100稀释度)和抗FJX1抗体(1:200稀释度)一起孵育16小时。在孵育后，将切片洗涤并且在室温下与过氧化物酶标记的聚合物(与山羊抗小鼠和山羊抗兔缀合)一起孵育30分钟。用DAB+色原体使与对应抗体的阳性结合在显微镜下显色，并且在通过苏木精复染并且在分等级的乙醇中脱水之后用盖玻片封固。

表2：方法、替代性抗体(Malaysia)的汇总：

该工作确认了：

两种抗原在来自英国和马来西亚的HNSCC/OSCC患者样品中的强表达。

肺癌样品还显示出MAGED4B的强表达(未分析FJX1)，确认了使用TCGA数据库(详述于TGL-100_001-R TCGA中)产生的过表达数据。

这些数据大体上与可用的RNAseq数据对应，所述RNAseq数据显示出有利的组织表达模式；在肿瘤中强表达而在健康组织中低表达/无表达。

实施例6

B16小鼠模型中的临床前工作

为了展示用在此所述的疫苗的治疗性疫苗接种对肿瘤进展的影响，采用表达抗原的B16模型来皮下激发HLA-A2转基因AAD小鼠。使肿瘤建立五天，在第5天用双重疫苗进行接种，一旦在施用后大约第10天可测量就开始进行肿瘤体积评价。还评价了疫苗治疗的作用与抗PD-1的组合。

与对照相比，疫苗单一疗法延迟肿瘤生长，在与抗PD-1组合时具有进一步明显增强的效应。免疫组织化学对肿瘤的评价显示，在用双重疫苗进行疫苗接种的小鼠的肿瘤中，与pDOM对照疫苗接种的小鼠相比，增加的T细胞浸润物是明显的。流式细胞术进一步证明，相对于pDOM对照，这些浸润物含有增加数量的激活的CD4+和CD8+T细胞。T细胞耗竭标记物PD-1的增加表达表明将PD-1抑制与疫苗接种相结合可以是有益的。

该工作支持了我们提出的作用机制，即靶向新颖抗原MAGED4B和/或FJX1的疫苗接种与PD-1抑制的组合可以有效地诱导T细胞诱导的肿瘤攻击。

使用AAD小鼠(HLA-A2+/Kb+)在BAM模型(经基因修饰以表达MAGED4B和HLA-A2的B16黑素瘤肿瘤)或BAF模型(经基因修饰以表达huFJX1和HLA-A2的B16黑素瘤肿瘤)中测试肌肉内(i.m)注射的两个剂量的疫苗的功效。BAM细胞确认了MAGED4B和小鼠FJX1(其与人FJX1具有95％同源性)的表达。BAF细胞确认了huFJX1的表达。

表达人HLA-A2基因的B16F10黑素瘤细胞系由Professor Eric Tartour(巴黎第五大学(UniversitéParis Descartes)，巴黎)友好给予。将该细胞系在补充有10％热灭活胎牛血清、青霉素/链霉素(100U/ml)和1mg/ml G418的RPMI 1640中培养。B16F10/HLA-A2被验证为内源性表达小鼠FJX1并且被修饰以表达人MAGED4B(B16F10/HLA-A2/MAGED4B，“BAM”)。平行地，B16F10/HLA-A2被修饰以表达人FJX1(B16F10/HLA-A2/FJX1，“BAF”)。使用人HLA-A2–PE(克隆BB7.2)缀合的抗体通过流式细胞术确认这些细胞系中HLA-A2的表达。分别使用定制的抗MAGED4B和抗FJX1抗体通过蛋白质印迹确认MAGED4B和FJX1表达水平。

对购买自美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory,USA)的表达嵌合HLA-A2.1/H2-Dd MHC I类分子的转基因小鼠B6.Cg-Immp2lTg(HLA-A/H2-D)2Enge/J(也称为AAD小鼠)测试DNA疫苗的免疫原性和功效。将AAD小鼠在动物实验室中育种以便在后续实验中使用。

在第0天将小鼠用BAM细胞系(10⁶个细胞)激发并且在观察到可觉察肿瘤(测量平均25mm²)之后第5天用在无菌盐水中的疫苗(50μg每种疫苗)或50μg pDOM DNA疫苗对照(肌肉内)进行疫苗接种。pDOM对照仅表达破伤风毒素DOM辅助序列。在第12天给予加强注射。监测肿瘤生长，直到小鼠被拣选来通过免疫组织化学和流式细胞术评估肿瘤的T细胞浸润。使用以下公式评价肿瘤体积：体积＝1/2(长度×宽度²)。

基于质粒的疫苗的结果在图9和图10上给出。

Claims

1.一种癌症疫苗，其包含编码MAGED4B蛋白或其变体的核酸。

2.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其中所述MAGED4B蛋白与如SEQ ID No.3、31、41、42和43中的任一个中列出的序列具有至少85％序列同一性或者是其免疫活性截短形式，任选地如SEQ ID No.35至SEQ ID No.37中的任一个中列出的。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的癌症疫苗，其中所述截短形式涉及去除一个或两个MAGE同源结构域的至少一部分。

4.根据任一项前述权利要求所述的癌症疫苗，其中所述核酸序列与SEQ ID No.7、SEQID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26中的任一个中列出的序列具有至少85％序列同一性。

5.根据任一项前述权利要求所述的癌症疫苗，其进一步包含辅助基序，任选地其中所述辅助基序编码刺激免疫应答的蛋白质。

6.如权利要求5所述的癌症疫苗，其中所述辅助基序编码蛋白质的免疫片段，任选地辅助表位。

7.如权利要求5或权利要求6所述的癌症疫苗，其中所述辅助基序是破伤风毒素的免疫原性片段，任选地是破伤风毒素的p30 MHCII表位。

8.如权利要求7所述的癌症疫苗，其中所述辅助基序是DOM。

9.根据任一项前述权利要求所述的癌症疫苗，其中所述疫苗进一步包含编码FJX1蛋白或其变体的核酸。

10.根据权利要求9所述的癌症疫苗，其中所述FJX1蛋白与如SEQ ID No.4或SEQ IDNo.33中列出的序列具有至少85％同一性或具有其截短形式，并且任选地由与如SEQ IDNo.8、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中描述的核酸序列具有至少85％同一性的核酸编码。

11.如权利要求9或权利要求10所述的癌症疫苗，其中所述MAGED4B和FJX1由相同的核酸编码为融合蛋白，任选地其中所述融合蛋白进一步包含蛋白质的免疫片段。

12.如权利要求11所述的癌症疫苗，其中所述融合蛋白包含MAGED4B和/或FJX1和/或蛋白质的免疫片段之间的一个或多个接头蛋白。

13.如任一项前述权利要求所述的癌症疫苗，其中至少一种核酸编码信号肽。

14.如任一项前述权利要求所述的癌症疫苗，其中所述核酸是DNA。

15.如权利要求14所述的癌症疫苗，其中所述DNA是质粒、闭合线性DNA、微环DNA或单链环状DNA。

16.如权利要求14或15所述的癌症疫苗，其中所述核酸进一步包含可操作地连接至所述编码序列的启动子，任选地进一步包含在所述编码序列下游的聚腺苷酸化信号。

17.如权利要求1至13中任一项所述的癌症疫苗，其中所述核酸是RNA，任选地是信使RNA或自我扩增RNA。

18.如权利要求1至17中任一项所述的癌症疫苗，用于医学用途中，任选地用于治疗或预防癌症的用途中。

19.如权利要求1至17中任一项所述的癌症疫苗，用于将肿瘤显露于免疫系统的用途中。

20.如权利要求1至17中任一项所述的癌症疫苗，用于使肿瘤对抗癌剂，任选地免疫检查点抑制剂敏感的用途中。

21.如权利要求18、19或20所述的用于所述用途的癌症疫苗，其中所述疫苗用于与抗癌剂，任选地免疫检查点抑制剂组合使用。

22.一种治疗有需要的患者的方法，其包括将如权利要求1至17中任一项所述的癌症疫苗施用至人或动物受试者。

23.一种使肿瘤对CD8⁺T细胞的浸润敏感的方法，其包括将如权利要求1至17中任一项所述的疫苗施用至人或动物受试者。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述方法进一步包括使用抗癌剂，任选地免疫检查点抑制剂。

25.如权利要求20或21所述的用途或如权利要求24所述的方法，其中所述检查点抑制剂是能够阻断PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA-4的作用的药剂，任选地其中所述药剂是抗体或适体。

26.根据任一项前述权利要求所述的癌症疫苗、用途或方法，其中所述癌症是以下中的任何一种或多种：头颈癌、口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、胆管癌、皮肤黑素瘤、直肠癌、甲状腺癌、膀胱尿路上皮癌、肾癌和胃腺癌。

27.一种选择用于用本发明的疫苗治疗的癌症的方法，所述方法包括确定癌症是否与单独的MAGED4B表达或与FJX1组合的MAGED4B表达相关。

28.一种在有需要的患者中增加免疫检查点阻断功效的方法，其包括将如权利要求1至17中任一项所述的癌症疫苗施用至人或动物受试者。