CN110831624B - 涉及her抗原的用于肿瘤疫苗接种和免疫疗法的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

在某些实施例中，提供了用于产生针对肿瘤抗原的免疫应答的方法和组合物，所述肿瘤抗原是例如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位。在具体实施例中，可提供构建和生产基于重组腺病毒的载体疫苗的方法，所述载体疫苗包括编码肿瘤抗原的核酸序列，所述肿瘤抗原是例如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位，所述载体疫苗允许在对腺病毒已有免疫力的个体中进行疫苗接种。

Description

涉及HER抗原的用于肿瘤疫苗接种和免疫疗法的组合物及 方法
交叉引用
本申请要求2017年6月2日提交的美国临时专利申请号62/514,666的权益，其全部公开内容通过引用的方式并入本文。
政府权益声明
本发明是在政府支持下根据国家癌症研究所(NCI)授予的SBIR奖助号1R43CA139663-01、SBIR合同号HHSN261201100090C、SBIR合同号HHSN261201300066C，以及来自国防部的奖项W81XWH-12-1-0574、BC113107而进行。政府享有本发明的某些权益。
背景技术
疫苗通过训练免疫系统以识别并破坏有害物质和病变细胞来帮助人体对抗疾病。疫苗大致上能够分组为两类：预防疫苗和治疗疫苗。预防性疫苗提供给健康人群，以预防特定疾病的蔓延，而治疗性疫苗(也被称为免疫疗法)提供给被诊断患有疾病的人，以帮助阻止疾病的滋长及扩散，或作为预防性措施。
目前正在开发病毒疫苗，以帮助对抗传染病和癌症。这些病毒疫苗通过以下方法起作用：在宿主细胞内诱导与疾病相关的一小部分基因表达，这继而增强宿主的免疫系统进行识别并破坏病变细胞。因此，病毒疫苗的临床应答可基于疫苗获得高水平的免疫原性和具有持续的长期表达的能力而定。
通过提供编码肿瘤相关抗原(TAA)的病毒疫苗实现的癌症免疫疗法可具有存活优势；然而，这些策略存在局限性，并且需要免疫力更强的疫苗。因此，仍然需要发现用于增强对诸如癌症的复杂疾病的治疗应答的新颖的组合物和方法。
发明内容
在一些方面中，组合物包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码MUC1抗原的核酸序列；以及重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码Brachyury抗原的核酸序列。
在一些方面中，组合物包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括：所述重组腺病毒载体的E2b区域中的缺失；以及编码截短的HER3抗原的核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:87的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
在一些方面中，一种组合物，其包括：重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；以及重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码共刺激分子的核酸序列。
在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码全长HER3抗原的核酸序列；重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码MUC1抗原的核酸序列；重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码Brachyury抗原的核酸序列；或其任意组合。在一些实施例中，组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码共刺激分子的核酸序列。在一些实施例中，以下中的两个或更多个包括在相同的重组腺病毒载体内：(i)编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；(ii)编码MUC1抗原的核酸序列；以及(iii)编码Brachyury抗原的核酸序列。在一些实施例中，以下中的一个或多个包括在分开的重组腺病毒载体内：(i)编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；(ii)编码MUC1抗原的核酸序列；以及(iii)编码Brachyury抗原的核酸序列。在一些实施例中，以下中的两个或更多个包括在相同的重组腺病毒载体内：(i)编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；以及(ii)编码共刺激分子的核酸序列。在一些实施例中，以下中的一个或多个包括在分开的重组腺病毒载体内：(i)编码全长HER3抗原的核酸序列或编码截短的HER3抗原的核酸序列；以及(ii)编码共刺激分子的核酸序列。在一些实施例中，所述截短的HER3抗原与SEQ ID NO:87具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，所述截短的HER3抗原包括SEQ ID NO:87的至少氨基酸残基8至氨基酸残基162、至少氨基酸残基10至氨基酸残基100、至少氨基酸残基100至氨基酸残基300、至少氨基酸残基300至氨基酸残基500或至少氨基酸残基500至氨基酸残基650。在一些实施例中，全长HER3抗原与SEQ ID NO:86具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，所述MUC1抗原与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性，或所述编码MUC1抗原的核酸序列包括SEQ ID NO:89的位置1105-2532。在一些实施例中，所述Brachyury抗原与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性，或所述编码Brachyury抗原的核酸序列包括SEQ ID NO:90的位置1045-2277。在一些实施例中，所述截短的HER3抗原与SEQID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，所述组合物还包括编码免疫检查点抑制剂、免疫检查点调节剂或其组合的核酸序列。在一些实施例中，所述组合物还包括编码激活或增强免疫应答的抗体的核酸序列。在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码HER1抗原、HER2/neu抗原、HER4抗原或其任意组合的核酸序列。在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码HER2/neu的核酸序列。在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码HER1的核酸序列。在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码HER4的核酸序列。在一些实施例中，所述编码HER2/neu的核酸序列与SEQ IDNO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性或包括SEQ ID NO:3的位置1033-3107。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体包括编码HER2/neu的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。在一些实施例中，编码HER2/neu的核酸序列缺少天然HER2/neu蛋白的细胞内结构域。在一些实施例中，所述HER2/neu抗原与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。在一些实施例中，编码HER2/neu的核酸序列包括天然HER2/neu蛋白的跨膜结构域和细胞外结构域。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体中的任何一个包括复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体中的任何一种包括基于腺病毒亚型5(Ad5)的载体。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体中的任何一种包括E1区域、E3区域、E4区域或其任意组合中的缺失。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体中的任何一种包括E1区域和E3区域中的缺失。在一些实施例中，所述组合物由1x1010个至5x1012个病毒颗粒(VP)组成。在一些实施例中，所述组合物包括至少1x1010个病毒颗粒。在一些实施例中，所述组合物包括至少1x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，所述组合物包括至少5x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，所述组合物包括至少5x1012个病毒颗粒。在一些实施例中，所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其任意组合。在一些实施例中，所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些实施例中，所述组合物还包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括编码一个或多个其他靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些实施例中，所述编码一个或多个其他靶抗原或免疫表位的核酸序列与另一个编码一个或多个其他靶抗原或免疫表位的核酸序列位于相同的重组腺病毒载体内。在一些实施例中，所述编码一个或多个其他靶抗原或免疫表位的核酸序列与另一个编码一个或多个其他靶抗原或免疫表位的核酸序列位于不同的重组腺病毒载体内。在一些实施例中，所述一个或多个其他靶抗原是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、促分裂原或其任意组合。在一些实施例中，所述一个或多个其他靶抗原是HER1、HER2/neu、HER4、叶酸受体α、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7 T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CEA、CDK-4/m、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1、或修饰变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂或其任意组合。在一些实施例中，所述一个或多个其他靶抗原包括CEA、Brachyury和MUC1。在一些实施例中，所述一个或多个其他靶抗原包括CEA。在一些实施例中，CEA与SEQ ID NO:7、SEQID NO:9或包括SEQ ID NO:10的位置1057-3165具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，一种重组腺病毒载体，其包括所述编码CEA的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体中的任何一种还包括选择标志物。在一些实施例中，所述选择标志物是lacZ基因、胸苷激酶、gpt、GUS或牛痘K1L宿主范围基因、或其组合。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体还包括编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在一些方面中，药物组合物包括如前述实施例中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。
在一些方面中，宿主细胞包括如前述实施例中任一项所述的组合物。
在一些方面中，工程化的自然杀伤细胞包括如前述实施例中任一项所述的组合物。
在一些方面中，制备肿瘤疫苗的方法包括制备如前述实施例所述的药物组合物。
在一些方面中，增强有需要的受试者的免疫应答的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如前述实施例中任一项所述的组合物或如前述实施例所述的药物组合物。
在一些方面中，治疗有需要的受试者的癌症的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如前述实施例中任一项所述的组合物或如前述实施例所述的药物组合物。在一些实施例中，所述治疗有效量包括所述重组腺病毒载体的1x1010个至5x1012个病毒颗粒(VP)。在一些实施例中，所述治疗有效量包括至少1x1010个病毒颗粒。在一些实施例中，所述治疗有效量包括至少1x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，所述治疗有效量包括至少5x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，所述治疗有效量包括至少5x1012个病毒颗粒。在一些实施例中，所述方法还包括施用免疫检查点调节剂。在一些实施例中，所述方法还包括施用共刺激分子。在一些实施例中，所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。在一些实施例中，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂抑制PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA或CD244。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂抑制PD1、PDL1或CTLA-4。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是抗PD1抗体、抗PDL1抗体或抗CTLA-4抗体。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是抗PDL1抗体。在一些实施例中，所述施用包括选自静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、通过膀胱滴注或通过划痕的递送途径。在一些实施例中，在施用所述组合物后，免疫应答启动。在一些实施例中，所述免疫应答是细胞介导的应答或体液应答。在一些实施例中，所述免疫应答是对B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合的增强。
如权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是IL-2生产、IFN-γ生产或其组合的增强。在一些实施例中，所述免疫应答是增强抗原呈递细胞的增殖、功能或其组合。在一些实施例中，所述受试者先前已被施用腺病毒载体。在一些实施例中，所述受试者对腺病毒载体具有预先存在的免疫力。在一些实施例中，已确定所述受试者对腺病毒载体具有预先存在的免疫力。在一些实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用化疗、放疗、不同的免疫疗法或其组合。在一些实施例中，所述化疗以包括50mg环磷酰胺的剂量施用。在一些实施例中，每天两次施用所述剂量。在一些实施例中，每两周在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和第12天口服或皮下注射环磷酰胺，共8周。在一些实施例中，所述放疗包括立体定向身体放疗(SBRT)，并以包括8Gy的剂量向所述受试者施用。在一些实施例中，向所述受试者施用四剂SBRT。在一些实施例中，每两周施用SBRT。在一些实施例中，在第8天、第22天、第36天和第50天施用SBRT。在一些实施例中，所述受试者是人类或非人类动物。在一些实施例中，所述受试者先前已接受过癌症治疗。在一些实施例中，重复所述施用治疗有效量的组合物，总共进行三次施用。在一些实施例中，每一、二或三周重复所述施用治疗有效量的组合物。在一些实施例中，在所述施用治疗有效量的组合物后，进行包括相同组合物或药物组合物的一个或多个加强免疫。在一些实施例中，每一个、两个或三个月施用所述加强免疫。在一些实施例中，重复所述加强免疫三次或更多次。在一些实施例中，所述施用治疗有效量的组合物是每一、两或三周重复三次初次免疫、然后每一个、两个或三个月重复三次加强免疫。在一些实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用包括工程化的自然杀伤(NK)细胞群的药物组合物。在一些实施例中，所述工程化的NK细胞包括一个或多个已被修饰为基本上缺乏KIR(杀伤细胞抑制性受体)表达的NK细胞、一个或多个已被修饰为表达高亲和力CD16变体的NK细胞，以及一个或多个已被修饰为表达CAR(嵌合抗原受体)的NK细胞，或其任意组合。在一些实施例中，所述工程化的NK细胞群包括每次治疗至少2x109个激活的工程化的NK细胞的剂量。
如权利要求96所述的方法，其中在第-2、12、26、40天或其任意组合静脉输注所述至少2x109个激活的工程化的NK细胞的剂量。在一些实施例中，所述工程化的NK细胞包括一个或多个已被修饰为基本上缺乏所述KIR表达的NK细胞。在一些实施例中，所述工程化的NK细胞包括一个或多个已被修饰为表达高亲和力CD16变体的NK细胞。在一些实施例中，所述工程化的NK细胞包括一个或多个已被修饰为表达CAR的NK细胞。在一些实施例中，所述CAR是肿瘤新抗原、肿瘤新表位、HER1、HER2/neu、HER3、HER4、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、或其任何组合。在一些实施例中，前述实施例中任一项的组合物包括在细胞中。在一些实施例中，所述细胞是树突细胞(DC)。在一些实施例中，所述方法还包括施用包括治疗有效量的IL-15的药物组合物或包括编码IL-15的核酸序列的重组腺病毒载体。在一些实施例中，所述重组腺病毒载体还包括编码IL-15超激动剂复合物的核酸。在一些实施例中，在第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第7周、第8周皮下注射所述施用IL-15超激动剂复合物。在一些实施例中，所述方法还包括以每千克10微克的剂量施用所述IL-15超激动剂复合物。在一些实施例中，所述受试者患有表达HER1的癌症、表达HER2/neu的癌症、表达HER3的癌症、表达HER4的癌症或其任意组合。在一些实施例中，所述受试者患有表达HER1的乳腺癌、表达HER2/neu的乳腺癌、表达HER3的乳腺癌、表达HER4的乳腺癌或其任意组合。在一些实施例中，所述受试者患有表达HER1的骨癌、表达HER2/neu的骨癌、表达HER3的骨癌、表达HER4的骨癌或其任意组合。在一些实施例中，所述癌症是骨肉瘤。在一些实施例中，所述癌症是胃癌。在一些实施例中，所述受试者患有不可切除的、局部、晚期或转移性癌症。在一些实施例中，所述方法还包括向所述受试者施用其他癌症疗法。在一些实施例中，所述受试者患有乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、肝癌和食道癌。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在此呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1示出了乳腺癌基因表达数据分析结果。
图1A示出了HRG/NRG1的mRNA表达上调与ER+HER2/Neu-乳腺癌患者中较低的无复发存活率相关。
图1B示出了与非复发肿瘤相比，在诊断后早期复发(少于5年)或晚期复发(从5-10年)的患者的肿瘤中HRG/NRG1 mRNA升高。
图2示出了Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu载体pAdCMV/HER3/Δpp的限制性图谱的一个实施例。
图3示出了临床研究的研究设计和治疗方案的一个实施例。
图4示出了免疫原性测试和抗肿瘤功效测试的一个方案。
图5示出了接种Ad-HER3的小鼠血清中的抗HER3抗体水平。
图6示出了疫苗接种后，单个小鼠血清中4T1和4T1-HER3细胞染色的中值荧光强度。
图7示出了小鼠血清基于细胞的ELISA的结果。
图8示出了Ad-HER3疫苗诱导的抗HER3细胞应答。
图9示出了Ad5-[E1-,E2b-]-HER3fl疫苗对BALB/c小鼠中JC-HER3肿瘤生长的影响。
图10示出了Ad5-[E1-,E2b-]-HER3疫苗接种对BALB/c小鼠中JC-HER3肿瘤生长的影响。
图10A示出了接种Ad-hHER3FL的小鼠中肿瘤的生长。
图10B示出了接种Ad-GFP的小鼠中肿瘤的生长。
图11示出了HER3转基因小鼠中免疫原性测试的一个方案。
图12示出了免疫后从HER3转基因小鼠血清中进行基于细胞的ELISA分析的结果。
图13示出了疫苗接种诱导的抗HER3细胞应答。
图14示出了用Ad-HER3疫苗治疗的HER3+F1杂合小鼠中JC-HER3肿瘤的生长。
图15示出了根据IFN-γ生产而测定的Ad-HER3疫苗接种诱导的抗HER3细胞应答。
图16示出了在基于细胞的ELISA分析中，植入JC-hHER3肿瘤细胞的、用Ad-HER3疫苗接种的F1杂合小鼠(BALB/cx MMTV-neu/MMTV-hHER3)中的抗HER3抗体水平。
图17示出了植入JC-HER3肿瘤细胞的、用Ad-HER3疫苗接种的F1杂合小鼠(BALB/cxMMTV-neu/MMTV-HER3)中的JC-HER3肿瘤中的HER3表达。
图18示出了施用Ad5[E1-,E2b-]-huHER3全长疫苗或生理盐水对照的F1杂种雌性小鼠(BALB/cx MMTV-neu/MMTV-hHER3)中的JC-HER3处理的存活曲线。
图19示出了每个队列中的给药的一个方案。
具体实施方式
尽管下面详细讨论各种实施例的制造和使用，但是应当理解，本文提供的许多可应用的发明构思可以在各种各样的特定环境中体现。本文讨论的具体实施例仅是制造和使用本发明的特定方式的示例，并不限制本发明的范围。
为了更好地理解某些方面，下面将对一些术语进行定义。本文所定义的术语具有与本发明有关的领域的普通技术人员通常理解的含义。
诸如“一”、“一个”和“该(所述)”之类的术语并非旨在仅指单数实体，而是包括其特定示例可用于说明的通用类别。本文中的术语用于描述本发明的特定实施例，但是除了权利要求中概述的以外，它们的用法不限制本发明。
“个体”、“受试者”或“患者”是指需要治疗的任何单个受试者，这包括但不限于人、非人灵长类、啮齿动物、狗或猪。也打算包括在受试者中的是未显示任何疾病临床症状的任何参与临床研究试验的受试者，或是参与流行病学研究的受试者或用作对照的受试者。
如本文所用的术语“基因”是指功能性蛋白质、多肽或肽编码单元。如本领域技术人员将理解的是，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列或其片段或组合，以及基因产物(包括可能被人为改变的那些)。当鉴定出纯化的基因、核酸、蛋白质等并将其与至少一种通常与其相关的污染性核酸或蛋白质分离时，它们是指这些实体。术语“等位基因”或“等位基因形式”是指编码相同功能蛋白但相对于相同基因的另一个版本在核苷酸序列上具有差异的基因的替代版本。在某些方面中，术语“基因”是指基因及其所有当前已知的变体以及可以阐明的任何其他变体。
如本文所用的“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸(比如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸)、由聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及由连接、切割、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸的单体(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或两者的组合组成。修饰的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。例如，糖修饰包括用卤素、烷基、胺和叠氮基取代一个或多个羟基，或糖可被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被空间和电子相似的结构取代，比如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的示例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其他众所周知的杂环取代基。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类连接的类似物联接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代磷酸硫酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其中包含附接至聚酰胺主链的天然存在或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。
如本文所使用，除非另外指出，否则冠词“一”(“a”)是指一个或多个，除非另有明确规定。
如本文所用，除非另外指出，否则诸如“含”(“contain”)、“含有”(containing)、“包括”(include)、“包括有”(including)等词语的意思是“包含”(comprising)。
如本文所用，除非另外指出，否则词语“或”(or)可以是连接的或分离的。
如本文所使用的，除非另外指出，否则任何实施例可以与任何其他实施例进行组合。
除非另有说明，否则如本文所用的一些发明性实施例考虑数值范围。可以以范围格式的形式呈现各种方面。应当理解的是，在范围格式上的描述仅仅是为了方便和简洁目的，而不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围和该范围内的各个数值，如同已明确写出。例如，对诸如从1到6的范围描述应当被视为已明确公开的子范围，该子范围诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的广度怎么样，这都适用。当存在范围时，该范围包括范围端点。
术语“腺病毒”或“Ad”是指来自腺病毒科的一组非包膜DNA病毒。除了人类宿主，这些病毒还可在但不限于禽、牛、猪和犬种中发现。某些方面可考虑使用腺病毒科四个属中任何一个属中的腺病毒(例如，禽腺病毒(Aviadenovirus)、马斯特腺病毒属(Mastadenovirus)、腺胸腺病毒属(Atadenovirus)和唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus))作为E2b缺失的病毒载体或包含本文所述的其他缺失的载体的基础。另外，在每个物种中发现了几种血清型。Ad还涉及任何这些病毒血清型的遗传衍生物，其中包括但不限于同源或异源DNA序列的基因突变、缺失或转座。
“辅助腺病毒”或“辅助病毒”是指能够提供特定宿主细胞无法提供的病毒功能(宿主可以提供Ad基因产物，诸如E1蛋白)的Ad。该病毒用于反式提供第二病毒或辅助依赖性病毒(例如去病毒基因或病毒基因的病毒，或针对特定区域(例如E2b或其他如本文所述的区域)缺失的病毒)缺乏的功能(例如蛋白质)；据说第一无复制能力的病毒“有助于”第二辅助依赖性病毒，从而允许在细胞中产生第二病毒基因组。
本文所用的术语“腺病毒5无效(Ad5null)”是指不复制的Ad，其不包含用于表达的任何异源核酸序列。
本文所用的术语“第一代腺病毒”是指已经缺失早期区域1(E1)的Ad。在其他情况下，也可缺失不必要的早期区域3(E3)。
本文使用的术语“去病毒基因(Gutted)”或“无病毒基因(gutless)”是指已经在所有病毒编码区域中缺失的腺病毒载体。
本文所用的术语“转染”是指将外来核酸引入真核细胞。转染可通过各种本领域已知的方式来完成，这些方式包括磷酸钙与DNA的共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、多聚苯介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹药。
术语“稳定的转染”或“稳定地转染”是指将外来核酸、DNA或RNA引入并整合到转染细胞的基因组中。词语“稳定的转染”是指已经将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
术语“报告基因”表示编码报告分子(包括酶)的核苷酸序列。“报告分子”可通过各种检测系统中的任何一种来检测，这些系统包括但不限于基于酶的检测分析系统(例如ELISA，以及基于酶的组织化学分析)、荧光、放射性和发光系统。
“受试者”是指任何动物，其包括但不限于：人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、老鼠和禽类。
“免疫原性片段”是指被B细胞和/或T细胞表面抗原受体(其导致产生针对该片段的免疫应答)特异性识别(即特异性结合)的多肽的片段。
“靶抗原”或“靶蛋白”是指诸如蛋白质的分子，针对该分子进行定向免疫应答。
“E2b缺失”是指以阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的方式进行突变的DNA序列。因此，在某些实施例中，相对于从Ad基因组中缺失(去除)的特定DNA序列来使用“E2b缺失”。E2b缺失或“在E2b区域内包括缺失”是指Ad基因组的E2b区域内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施例中，缺失了一个以上的碱基对，并且在其他实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，缺失是Ad基因组的E2b区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。E2b缺失可以是阻止至少一种E2b基因产物表达和/或功能的缺失，并且因此涵盖了E2b特异性蛋白的编码部分的外显子内的缺失和启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E2b缺失是阻止E2b区域的DNA聚合酶和前末端蛋白之一或二者的表达和/或功能的缺失。在进一步的实施例中，“E2b缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一个或多个编码的蛋白质为不起作用的。此类突变包括用不同残基替换的残基，这引起导致不起作用蛋白的氨基酸序列的变化。
“E1缺失”是指DNA序列，其以阻止至少一种E1基因产物的表达和/或功能的方式进行突变。因此，在某些实施例中，相对于从Ad基因组中缺失(去除)的特定DNA序列来使用“E1缺失”。E1缺失或“在E1区域内包括缺失”是指Ad基因组的E1区域内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施例中，缺失了一个以上的碱基对，并且在其他实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，缺失是Ad基因组的E1区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。E1缺失可以是阻止至少一种E1基因产物表达和/或功能的缺失，因此，其涵盖E1特异性蛋白的编码部分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E1缺失是阻止E1区域的反式转录调节因子之一或两者的表达和/或功能的缺失。在另一个实施例中，“E1缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一个或多个编码的蛋白质是不起作用的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导致不起作用蛋白的氨基酸序列改变。
“产生免疫应答”或“诱导免疫应答”是指统计学上显著的变化(例如增加或减少)，该变化发生在一种或多种免疫细胞(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等)的数量或一种或多种这些免疫细胞的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌状况的变化等)中。
在一个实施例中，可提供大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(可从新泽西州皮斯卡特维的Pharmacia Biotech获得)、绿色荧光蛋白(GFP)(可从加利福尼亚州帕洛阿尔托的Clontech商购)、人胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因来作为报告基因；其他报告基因是本领域已知的并可使用。
如本文使用的术语“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”以及“编码……的DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。
本文使用的术语“异源核酸序列”是指与自然界中未与之连接或自然界中不同位置与之连接的核酸序列连接或被操作连接的核苷酸序列。异源核酸可包括在其引入的细胞中天然发现的核苷酸序列，或异源核酸可相对于天然存在的序列包含一些修饰。
术语“转基因”是指引入待测受试者的细胞或基因组中的任何编码天然或是异源核酸序列或是融合的同源或异源核酸序列区域的基因。在某些方面中，转基因携带在任何病毒载体上，这些病毒载体用来将该转基因引入受试者的细胞中。
本文使用的术语“第二代腺病毒”是指其中E1、E2、E3 DNA基因序列中所有或部分从病毒中缺失(移除)以及在某些实施例中E4 DNA基因序列从病毒中缺失的Ad。
如本文所用的应用于核酸序列、基因或多肽的术语“片段或片段”通常将是至少约5个连续的核酸碱基(对于核酸序列或基因)或氨基酸(对于多肽)、通常至少约10个连续的核酸碱基或氨基酸、更通常至少约20个连续核酸碱基或氨基酸、通常至少约30个连续核酸碱基或氨基酸、优选至少约40个连续核酸碱基或氨基酸、更优选至少约50个连续的核酸碱基或氨基酸、甚至更优选至少约60至80个或更多个连续的核酸碱基或氨基酸。如本文所用的“重叠片段”是指连续的核酸或肽片段，该连续的核酸或肽片段起始于核酸或蛋白质的氨基末端并且终止于核酸或蛋白质的羧基末端。每个核酸或肽片段与下一核酸或肽片段共同具有至少约一个连续的核酸或氨基酸位置，更优选共有至少约三个连续的核酸碱基或氨基酸位置，最优选至少约十个连续的核酸碱基共有的氨基酸位置。
核酸背景中的重要“片段”是至少约17个核苷酸的连续片段，通常至少20个核苷酸，更通常至少23个核苷酸，通常至少26个核苷酸，更通常至少29个核苷酸，经常至少32个核苷酸，更经常至少35个核苷酸，通常至少38个核苷酸，更通常至少41个核苷酸，通常至少44个核苷酸，更通常至少47个核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选至少53个核苷酸，且在特别优选的实施例中，将是至少56个或更多个核苷酸。
“载体”是可转导、转染、转化或感染细胞，从而使细胞表达不同于细胞天然的核酸和/或蛋白质的核酸和/或蛋白质或以细胞非天然的方式表达核酸和/或蛋白质。当核酸从细胞外环境转移到细胞中时，细胞被核酸“转导”。可使用将核酸转移到细胞中的任何方法；除非另外指出，否则该术语并不意味着将核酸递送至细胞中的任何特定方法。当将核酸转导进入细胞并进行稳定复制时，细胞被核酸“转化”。载体包括要由细胞表达的核酸(通常是RNA或DNA)。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞内的物质，比如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被等。“细胞转导载体”是对一旦核酸被转导到细胞中就能在细胞中稳定复制和表达的核酸进行编码的载体。
当在多核苷酸序列的背景中使用时，术语“变体”可涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。该定义还可包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态”变体。剪接变体可与参考分子具有显著的同一性，但是由于在mRNA加工过程中外显子的可变剪接，所以通常将具有更多或更少数量的多核苷酸。相应的多肽可具有其他功能结构域或不存在结构域。物种变体是从一个物种到另一个物种变化的多核苷酸序列。在本发明中特别有用的是野生型靶基因的变体。变体可由核酸序列中的至少一个突变产生，并可导致改变的mRNA或多肽，其结构或功能可改变或可不改变。任何给定的天然或重组基因都可没有、可有一个或可有多个等位基因形式。引起变体的常见突变变化通常归因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。这些类型的变化中的每一种都可单独发生，也可与其他类型组合按给定顺序来进行一次或多次。
如本文所用的多肽的“变体”是指被一个或多个氨基酸残基改变的氨基酸序列。变体可具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。而变体很少会出现“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变化也可包括氨基酸缺失或插入或包括两者。使用本领域众所周知的计算机程序(例如LASERGENE软件(DNASTAR))，可找到关于确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不丧失生物活性的指南。
所得的多肽通常相对于彼此具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态性变体还可包括“单核苷酸多态性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列相差一个碱基。
“抗原”是与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质。“抗原结合位点”是免疫球蛋白分子中特异性结合抗原的部分。另外，抗原结合位点包括任何抗原结合分子(包括但不限于MHC分子或T细胞受体)上的任何此类位点。“抗原加工”指：抗原降解成片段(例如，蛋白质降解成肽)以及这些片段中的一个或多个(例如，通过结合)与MHC分子缔合，以通过“抗原呈递细胞”呈递给特定的T细胞。
“树突细胞”(DC)是有效的抗原呈递细胞，其能够在体内触发强大的适应性免疫应答。已表明活化的成熟DC提供了T细胞活化和增殖所需的信号。这些信号可分类成两种类型。第一种类型赋予免疫应答特异性，其通过T细胞受体/CD3(“TCR/CD3”)复合物与由主要的组织相容性复合物(上文定义的“MHC”)I类或II类蛋白在APC表面上呈递的抗原肽之间的相互作用来介导。第二类型的信号称作共刺激信号，其既不是抗原特异性的也不是MHC限制性的，并在存在第一类型信号的情况下可使T细胞产生完全增殖应答和诱导产生T细胞效应子功能。因此，这种双重信号传导可导致强烈的免疫应答。如上所述，在大多数非禽类脊椎动物中，DC源自骨髓来源的前体。在外周血、脐带血和胸腺中均发现未成熟的DC。其他未成熟群体可能出现在其他地方。在脾脏、淋巴结、扁桃体和人肠中也发现了处于不同成熟期段的DC。禽类DC也可在法氏囊腔上囊中找到，法氏囊腔上囊是禽类独有的主要免疫器官。在一个具体实施例中，树突细胞是哺乳动物，优选人、小鼠或大鼠。
“共刺激分子”涵盖任何单个分子或分子组合，当其与由T细胞表面上的T细胞受体结合的肽MHC复合物一起作用时，提供了共刺激作用，从而实现了结合该肽的T细胞的活化。
“诊断性的”或“诊断的”是指识别病理状况的存在或性质。诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”是指测试为阳性的患病个体的百分比(“真实阳性”的百分比)。该测定法未检测到的患病个体为“假阴性”。未患病且在测定中呈阴性的受试者称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为没有疾病的患者测试为阳性的比例。尽管特定的诊断方法可能无法提供对疾病的明确诊断，但只要该方法提供有助于诊断的阳性指示即可。
在本申请全文中，术语“约”用于表示一个值包括该设备的误差的固有变化、用于确定该值的方法、或研究对象之间存在的变化。
如本说明书和权利要求中使用的词语“包括(comprising)”(以及任何形式的“包括”，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及任何形式的“具有”，如“have”和“has”)、“包含(including)”(以及任何形式的“包含”，如“includes”和“include”)或“含有(containing)”(以及任何形式的“含有”，如“contains”和“contain”)均是包含性的或开放性的，并不排除其他未引用的元素或方法步骤。本文使用的短语“基本上由……组成”将一项权利要求的范围限制到指定的材料或步骤、“以及本质上不影响所要求保护的本发明的一个或多个基本和新颖特征的那些”。本文所使用的短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，除了例如通常与该元素或限制相关的杂质。
如本文所用的术语“或其组合”是指该术语之前的所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少之一：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果顺序在特定情况下很重要，那么BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB也是重要的。继续该示例，其中明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文明显看出，否则通常对任何组合中的项或术语的数量没有限制。
如本文所用的近似词，例如但不限于“约”、“基本的”或“基本上”是指一种条件，在此条件时如此修饰的术语被理解为不一定是绝对的或完美的，但被认为与本领域普通技术人员足够接近以保证指定存在。说明书可变化的程度将取决于可进行多大的改变，且本领域普通技术人员仍然认识到该修改的特征仍然具有未修改的特征所要求的特性和能力。一般而言，但以前面的讨论为准，本文中用诸如“约”之类的近似词修饰的数值可与规定值相差至少±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、10％、12％或15％。
可结合上述各类实施例以提供进一步的实施例。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均整体通过引用并入本文，其程度与具体地且单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入的程度相同。
如果需要采用各种专利、申请和出版物的概念以提供其他实施例，则可修改实施例的各方面。
可根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求书中，不应将所使用的术语解释为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中公开的特定实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这些权利要求所享有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本披露的限制。
I.恶性肿瘤中的HER1、HER2、HER3和HER4
在某些方面中，可提供表达构建体或载体，该构建体或载体包括编码一种或多种目的靶蛋白或靶抗原(比如，本文所述的HER3抗原或表位)的核酸序列。人表皮生长因子受体(HER)家族是许多恶性肿瘤发展的重要受体家族，其中包括HER1(也称为EGFR)、HER2/neu、HER3和HER4(分别称为ErbB2、ErbB3和ErbB4)。
该HER1、HER3或HER4抗原可以是全长蛋白质或可以是其免疫原性片段(例如，表位)。在一些情况下，免疫表位(比如HER3表位)可以是8至10个氨基酸长度。在一些情况下，HER表位的长度为4至10个氨基酸，或超过10个氨基酸。免疫原性表位(比如HER1、HER3或HER4表位)的长度可以为或可至少为、可约为或最多可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸或从中得出的任何数字或范围。免疫原性表位(比如HER1、HER3或HER4表位)可以为任何氨基酸长度。
在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％、至少1％-99％、至少1％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％、至少90％-95％、至少95％-99％、至少20％-40％、至少40％-60％或至少60％-80％的长度。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQID NO:86中所示的全长HER3抗原)的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％、至少1％-99％、至少1％-10％、至少10％-20％、至少20％-30％、至少30％-40％、至少40％-50％、至少50％-60％、至少60％-70％、至少70％-80％、至少80％-90％、至少90％-95％、至少95％-99％、至少20％-40％、至少40％-60％或至少60％-80％的长度。
在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少8个氨基酸残基至662个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少10个氨基酸残基至40个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少40个氨基酸残基至70个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少70个氨基酸残基至100个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少100个氨基酸残基至130个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少130个氨基酸残基至160个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少160个氨基酸残基至190个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少190个氨基酸残基至220个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少220个氨基酸残基至250个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少250个氨基酸残基至280个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少280个氨基酸残基至310个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少310个氨基酸残基至340个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少340个氨基酸残基至370个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少370个氨基酸残基至400个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少400个氨基酸残基至430个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少430个氨基酸残基至460个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少460个氨基酸残基至490个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少490个氨基酸残基至520个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少520个氨基酸残基至550个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少550个氨基酸残基至580个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少580个氨基酸残基至610个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少610个氨基酸残基至640个氨基酸残基。在一些实施例中，任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段可包括截短的抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少640个氨基酸残基至662个氨基酸残基。在一些实施例中，截短部分可以是任何本文所述抗原(例如，HER1、HER2、HER3、HER4)的免疫原性片段，并可包括抗原(比如，如SEQ ID NO:87中所示的截短的HER3抗原)的至少10-100个氨基酸残基、100-300个氨基酸残基、300-500个氨基酸残基或500-650个氨基酸残基。
A.HER1
在一些实施例中，HER1(EGFR)还可在多种不同的癌症中过表达，这其中包括乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌和胰腺癌。在某些实施例中，HER1/EGFR可通过MAPK和Akt途径发出信号，并产生可刺激肿瘤进展的下游效应。HER1的配体可包括EGF或转化生长因子-α，并在结合其配体后，HER1可与另一个HER1受体同二聚化，或与HER家族的另一个成员形成异二聚化。在一些实施例中，靶向HER1的疫苗针对过表达HER1的细胞。在其他实施例中，HER1在癌细胞上的表达可用作跟踪HER1疫苗进展和应答的预后工具。
B.HER2
在某些方面中，可提供表达构建体或载体，该构建体或载体包括编码一种或多种目的靶蛋白或靶抗原(比如，本文所述的HER2/neu抗原或表位)的核酸序列。
HER2/neu(p185)是HER2/neu癌基因的蛋白质产物。在一些方面中，在多种癌症中，HER2/neu基因得到扩增，HER2/neu蛋白得到过表达，这些癌症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和骨癌。在一些方面中，HER2/neu与恶性转化有关。在一些方面中，在50％-60％的导管原位癌和20％-40％的所有乳腺癌以及在卵巢、前列腺癌、结肠癌和肺癌等大部分腺癌中都发现了它。在一些方面中，HER2/neu蛋白在包括骨肉瘤在内的骨癌中得到过表达。在一些方面中，在所有浸润性乳腺癌的四分之一中，HER2/neu不仅与恶性表型密切相关，而且还与恶性肿瘤攻击性密切相关。在一些方面中，HER2/neu过表达与乳腺癌和卵巢癌的不良预后相关。
在一些方面中，HER2/neu是一种跨膜蛋白，其相对分子质量为185kd，长度约为1255个氨基酸(aa)。其具有：与表皮生长因子受体(EGFR)具有40％的同源性的含约645个氨基酸的细胞外结合结构域(ECD)、高度疏水的跨膜结构域(TM)，以及与EGFR具有80％的同源性的含约580个氨基酸的细胞内结构域。
在其他方面中，可提供可含有核酸的表达构建体或载体，该核酸编码至少、最多或约一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种或500种或由此衍生的任何数量或范围的不同的目的靶抗原。表达构建体或载体可包含编码来自一种HER2/neu抗原的多个片段或表位的核酸序列，或可包含来自许多不同靶抗原的一个或多个片段或表位(包括本文所述的HER2/neu抗原或表位)。
该HER2/neu抗原可以是全长蛋白质或可以是其免疫原性片段(例如，表位)。可使用可用的技术来鉴定免疫原性片段，例如在Paul，Fundamental Immunology[]基础免疫学，第3版，243-247(Raven Press，1993)中总结的技术和其中引用的参考文献。鉴定免疫原性片段的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。特点靶多肽的免疫原性片段可以是与此类抗血清和/或T细胞反应的片段，该反应的水平基本上不低于全长靶多肽(例如，ELISA和/或T细胞反应性所测定)的反应性。换言之，免疫原性片段可以在此类测定法中以类似于或大于全长多肽的反应性的水平进行反应。通常可使用本领域普通技术人员可使用的方法来进行此类筛选，例如Harlow和Lane在1988年的冷泉港实验室的抗体：实验室手册中所述的那些方法。
在一些情况下，免疫表位(比如HER2/neu表位)可以是8至10个氨基酸长度。在一些情况下，Her表位的长度为4至10个氨基酸，或超过10个氨基酸。免疫原性表位(比如HER2/neu表位)的长度可以为或可至少为、可约为或最多可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸或从中得出的任何数字或范围。免疫原性表位(比如HER2/neu表位)可以为任何氨基酸长度。
在一些方面中，HER3可在乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌和黑素瘤中得到过表达。在一些实施例中，HER3的过表达可与预后不良有关。由于HER3的酪氨酸激酶功能可忽略不计，所以其可存在于与HER1或HER2/neu的异二聚体中，通过该异二聚体进行涉及细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和AKT(1)的下游信号传导。在一些实施例中，HER3的主要作用之一可以是将受体酪氨酸激酶激活与PI3K途径激活联系起来。在其他实施例中，HER3可充当有助于抵抗PI3K/AKT指导的治疗的反馈调节剂。
在一些实施例中，本发明提供了HER2/neu抗原的序列。例如，本发明的HER2/neu抗原可包括截短的HER2/neu抗原蛋白，该截短的HER2/neu抗原蛋白具有跨膜结构域和细胞外基质结构域，而缺乏细胞内结构域。该截短的HER2/neu蛋白可与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性，或包括SEQ ID NO:3的位置1033-3107。在一些实施例中，本发明的HER2/neu抗原具有如SEQ IDNO:1所示的序列或具有SEQ ID NO:3的位置1033-3107。在一些实施例中，本发明提供一种编码HER2/neu的序列，其中该HER2/neu蛋白序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，本发明提供了HER2/neu蛋白，该HER2/neu蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的序列。在一些实施例中，编码HER2/neu的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])可以具有与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的序列。在一些实施例中，编码HER2/neu的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-]具有如SEQ ID NO:3所示的序列。
C.HER3
在一些实施例中，HER3在乳腺癌中的作用可能与抗HER2/neu治疗药物的耐药性有关。在其他实施例中，HER3也可能是乳腺癌内分泌抵抗的原因。在先前接受他莫昔芬治疗的ER+乳腺癌患者中，HER3过表达可能与较短的无进展存活期有关。在一些实施例中，HER3表达可在ER阳性乳腺癌细胞(例如MCF-7、T47D)中体外诱导，该癌细胞可用氟维司群进行治疗。在一些实施例中，HER3的配体heregulin(HRG)的过表达在体外和体内也可能与针对抗雌激素的抵抗有关。因此，HER3及其配体可在治疗耐药性中发挥关键作用，靶向HER3可以是克服抗内分泌和抗HER2/neu治疗耐药性的有效策略。
在一些实施例中，“HER3”可称作“ErbB3”。在某些方面中，siRNA下调ErbB3可逆转由HER2/neu驱动的对他莫昔芬的耐药性，并可增强他莫昔芬抑制生长和增强细胞凋亡的能力。因此，在一些方面中，通过抑制ErbB3驱动的Akt激活可克服对他莫昔芬的耐药性。ErbB3介导的对靶向ErbB1和ErbB2/HER2/neu的酪氨酸激酶抑制剂的耐药性也可源于Akt的持续活化，该活化可与ErbB3表达相关，这表明ErbB3可以是广泛适用的耐药性机制。在一些实施例中，ErbB3受体可与α6β4整联蛋白相互作用，从而有助于维持乳腺癌肿瘤细胞的PI3K/Akt存活途径。在其他实施例中，通过Akt持续发出信号对于细胞持续生长可能很重要。
在一些实施例中，肿瘤细胞可过表达膜结合的HER3。在其他实施例中，HER3肽可通过MHC复合物呈递至细胞表面，以呈递给T细胞。在某些实施例中，对表达HER2/neu的癌症的治疗可能导致HER3的过表达。
在一些实施例中，HER3可用作本发明的腺病毒中的蛋白质抗原(例如，Ad5[E1-,E2-])。所得的Ad5[E1-,E2-]-HER3疫苗可用于在有需要的受试者中针对表达HER1、HER2/neu、HER3和/或HER4的癌症进行免疫。在某些实施例中，针对HER3进行疫苗接种可作为对抗耐药性的发展的方法。例如，在一些实施例中，HER3受体可成为抗内分泌治疗的乳腺癌的靶标。在某些实施例中，HER3疫苗在其他恶性肿瘤中在预防耐药性方面也起着类似的作用。HER3疫苗可与其他疗法(例如乳腺癌的内分泌疗法)联合使用，以预防由HER3过表达介导的治疗耐药性的发作。
在一些实施例中，本发明的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])包括编码全长(FL)蛋白(例如FL HER3)的序列。用编码FL HER3的腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])进行的疫苗接种可加强或增强荷瘤小鼠的免疫应答。在一些实施例中，腺病毒载体(例如，Ad5[E1-,E2b-])包括编码截短的蛋白(比如截短的HER3蛋白)的序列。截短的蛋白可以是其中相应全长蛋白的一个或多个核苷酸或氨基酸不存在的蛋白质。在一些实施例中，截短对应于缺少全长蛋白质的特定区域。例如，截短对应于缺少结构域的部分或全部。例如，HER3可包括三个结构域，即细胞内结构域、跨膜(TM)结构域和细胞外(ECD)结构域。截短的HER3蛋白可缺少细胞内结构域、TM结构域或ECD结构域中的任何一个，或可缺少细胞内结构域、TM结构域和ECD结构域的任意组合。在具体示例中，截短的HER3蛋白缺少细胞内结构域，因而包括TM和ECD结构域。用包括HER3的截短的序列(Ad5[E1-,E2b-]-人HER3 ECD-TM)的腺病毒载体进行的疫苗接种还可在临床前研究中诱导免疫应答，如图14所示。在一些情况下，与全长HER3蛋白相比，用截短的HER3蛋白进行的疫苗接种可诱导出更强的免疫应答。在一些情况下，与全长HER3蛋白相比，用截短的HER3抗原进行的接种疫苗的致癌性可能更低。
在一些实施例中，ErbB3(HER3)蛋白没有内在的信号传导能力，因为其缺少酶促活性的酪氨酸激酶结构域。因此，ErbB3蛋白可与另一个具有激活激酶结构域的生长因子受体(GFR)家族成员异二聚化。与其同源配体heregulin结合后，ErbB3蛋白可与GFR家族成员即ErbB2二聚形成ErbB2/ErbB3异二聚体复合物，从而导致ErbB2反式激活和有效的细胞内信号传导。在一些方面中，肿瘤细胞表达ErbB2/ErbB3复合物的活性形式，该复合物能够在细胞内发出稳定的信号。因此，活性的ErbB2/ErbB3复合物可能导致癌细胞的迁移、增殖和转化。
在一些实施例中，尽管ErbB3能够与其他GFR(例如ErbB1或ErbB4)异二聚化，但ErbB2仍可优先与ErbB3相互作用。维持ErbB2/ErbB3复合体内的细胞内信号转导所必需的结构特征可以是ErbB3的细胞内(ICD)结构域。在一些方面中，ErbB3的胞内(ICD)域内的残基的缺失或突变可导致ErbB2/ErbB3复合物中的ErbB2的磷酸化完全降低。因此，突变或缺失ICD的任何区域可导致致癌性降低，从而更安全地施用于受试者。在一些实施例中，可突变ICD的至少三个氨基酸残基来避免信号传导，并且导致致癌性降低，从而得到更安全的蛋白抗原。在一些实施例中，可去除整个ICD(例如仅留下跨膜和细胞外结构域)，以避免信号传导并降低致癌性，从而获得更安全的蛋白抗原。
在一些实施例中，本发明提供了一种截短的HER3抗原的序列。例如，本发明的截短的HER3抗原可具有跨膜结构域和细胞外基质结构域，而缺少细胞内结构域。本发明的截短的HER3抗原可与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，本发明的截短的HER3抗原具有如SEQID NO:6所示的序列。
在一些实施例中，本发明提供了一种截短的HER3抗原，该截短的HER3抗原可与SEQID NO:87具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，全长HER3抗原可与SEQ ID NO:86具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
D.HER4
在一些实施例中，靶向HER4的疫苗针对过表达HER4的细胞。在某些方面中，在乳腺癌中，HER2/neu表达可能比HER4表达更为明显。在一些方面中，HER4可在过表达雌激素受体的细胞中也得到过表达。HER4可结合神经调节蛋白并激活，从而导致出现下游过程，例如诱导细胞分化。HER4也可通过某些EGF配体的结合而得到激活。在其他实施例中，HER4在癌细胞上的表达可用作跟踪HER4疫苗进展和应答的预后工具。
II.组合HER疫苗
在一些实施例中，本发明的Ad5疫苗靶向HER1抗原或表位。在其他实施例中，本发明的Ad5疫苗靶向HER2/neu抗原或表位。在其他实施例中，本发明的Ad5疫苗靶向HER3抗原或表位。在一些实施例中，本发明的Ad5疫苗靶向HER4抗原或表位。在一些情况下，本发明的Ad5疫苗可靶向HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合。在某些实施例中，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合可用作预后标志物，以跟踪进展和对HER靶向疫苗的应答反应。
III.CEA抗原靶标
本文公开了包括复制缺陷型载体的组合物，该复制缺陷型载体包括在相同或单独的复制缺陷型载体中编码HER3抗原的一个或多个核酸序列、和/或编码粘蛋白家族抗原例如CEA的一个或多个核酸序列、和/或编码Brachyury的一个或多个核酸序列、和/或编码MUC1的一个或多个核酸序列、和/或编码HER1、HER2/neu、HER4或其任意组合的一个或多个核酸序列。
CEA表示有吸引力的免疫疗法靶抗原，因为它几乎在所有的结肠直肠癌和胰腺癌中过表达，也被一些肺癌和乳腺癌、甲状腺髓样癌等常见肿瘤所表达，但并没有在身体的其他细胞中表达，除了胃肠道上皮细胞中低表达。CEA包含可能被T细胞以MHC限制方式识别的表位。
研究发现，尽管出现早先存在或诱导的Ad5-中和抗体，用Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)(其编码肿瘤抗原CEA)进行多次同源免疫在小鼠中诱导具有抗肿瘤活性的CEA特异性细胞介导的免疫(CMI)应答。在目前的I/II期研究中，用逐步增加Ad5[E1-,E2b-]-CEA(6D)的剂量对晚期结肠直肠癌患者进行免疫。尽管大多数(61.3％)患者存在预先存在的Ad5免疫，但仍观察到CEA特异性CMI应答。重要的是，它的毒性很小，而且不管先前存在的Ad5中和抗体滴度如何，患者的总体存活率(12个月时为48％)是相似的。结果表明，在癌症患者中，新型Ad5[E1-,E2b-]基因递送平台在自然获得和免疫诱导的Ad5特异性免疫的情况下，对肿瘤抗原CEA产生显著的CMI应答。
例如,每106个人外周血单核细胞(PBMC)中，CEA抗原特异性CMI可以有大于10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000或更多IFN-γ点形成细胞(SFC)。在一些实施例中,用先前存在的人体Ad5中和抗体滴度大于50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000或更高在人类受试者中产生免疫应答。免疫应答可包括如本文所述的细胞介导免疫和/或体液免疫。免疫应答可通过一个或多个细胞内细胞因子染色(ICS)ELISpot、增殖测定、细胞毒性T细胞测定(其包括铬释放或等价测定)，和使用任意数量的聚合酶链反应(PCR)或基于RT-PCR的测定进行的基因表达分析(如本文所描述的并且其程度上使本领域技术人员可得)，以及本领域已知的用于测量免疫应答的任何其他合适的测定进行测量。
在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码与野生型多肽亚基的亚基至少具有75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的修饰序列。
该免疫原性多肽可能是突变的CEA或其片段。在一些实施例中，免疫原性多肽包括突变的CEA，其在位置610具有Asn->Asp替换。在某些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的序列。在一些实施例中，该编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:7的序列(CEA-CAP1(6D)的核酸序列)或SEQ ID NO:9(突变的CAP1(6D)表位的氨基酸序列)的序列。
在一些方面中，该CEA抗原与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码CEA抗原的核酸序列与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码CEA抗原的核酸序列与SEQ ID NO:10中的位置1057至3165具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
在一些实施例中,免疫原性多肽的序列编码包含有与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9至少70％75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％同一性的序列或通过替换密码子从SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9产生的序列。在一些实施例中，与野生型相比人类CEA序列相比，腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多的点突变，诸如单一的氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，该免疫原性多肽包括来自SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的序列，或包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的修饰的版本，例如包括多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个位点突变，比如单个氨基酸替代或缺失。
CEA基因家族成员根据序列相似性、发育表达模式及其生物学功能可分为三个亚组：包含十二个基因(CEACAM1、CEACAM3-CEACAM8、CEACAM16和CEACAM18-CEACAM21)的与CEA相关的细胞粘附分子(CEACAM)亚组、包含十一个紧密相关基因(PSG1-PSG11)的妊娠特异性糖蛋白(PSG)亚组，以及包含十一个假基因(CEACAMP1-CEACAMP11)的亚组。CEACAM亚组的多数成员有类似的结构,其由以下组成：细胞外类Ig结构域(其包含单个氨基端V-set结构域，与免疫球蛋白可变结构域具有结构同源性)，接着是不同数量的A或B亚型的C2-set结构域)、跨膜域和胞质结构域。CEACAM亚组的两个成员(CEACAM16和CEACAM20)在其结构的组织方面显示了一些例外。CEACAM16在其N和C末端包含两个Ig样V型结构域，CEACAM20则包含截短的Ig样V型1结构域。CEACAM分子可通过其跨膜结构域(CEACAM5到CEACAM8)锚定到细胞表面，或直接连接至糖磷脂酰肌醇(GPI)脂质部分(CEACAM5、CEACAM18到CEACAM21)。
CEA家族成员在不同的细胞类型中进行表达，具有广泛的生物学功能。CEACAM在大多数上皮细胞上显著存在，并存在于不同的白细胞上。在人类中，作为CEA家族的始祖成员，CEACAM1在上皮和内皮细胞的顶面以及淋巴和髓样细胞上表达。CEACAM1通过嗜血(CEACAM1至CEACAM1)和异宗配合(例如CEACAM1至CEACAM5)的相互作用来介导细胞间粘附。另外，很多其他生物进程中均涉及CEACAM1，比如血管生成、细胞迁移和免疫功能。CEACAM3和CEACAM4的表达在很大程度上局限于粒细胞，它们能够传递几种致病菌的摄取和破坏，包括奈瑟氏菌、莫拉氏菌和嗜血杆菌物种。
因此，在各种实施例中，组合物和方法涉及提高对抗CEA的免疫应答，所述CEA选自由CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9和PSG11组成的组。使用该方法和组合物可对抗细胞(诸如癌细胞)表达或过度表达一个或多个CEA而引起免疫应答。在一些实施例中，与非癌细胞相比，一个或多个CEA在这些癌细胞中的过表达超过5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多。
在某些实施例中，这里使用的CEA抗原是野生型CEA抗原或修饰的CEA抗原，其在CEA的CAP1表位YLSGANLNL(SEQ ID NO:8)中至少有一个突变。突变可以是保守的或非保守的、取代、添加或缺失。在某些实施例中，此处使用的CEA抗原具有YLSGADLNL(SEQ ID NO:9)中规定的氨基酸序列，即突变的CAP1表位。在其他实施例中，第一复制缺陷型载体或表达CEA的复制缺陷型载体具有与SEQ ID NO:10(表达修饰的CEA抗原的腺病毒载体的预测序列)中任何部分(比如，SEQ ID NO:10的位置1057至3165或全长SEQ ID NO:10)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。
IV.粘蛋白家族抗原靶标
本文公开了包括复制缺陷型载体的组合物，该复制缺陷型载体包括在相同或单独的复制缺陷型载体中编码HER3抗原的一个或多个核酸序列、和/或编码粘蛋白家族抗原例如MUC1的一个或多个核酸序列、和/或编码Brachyury的一个或多个核酸序列、和/或编码CEA的一个或多个核酸序列、和/或编码HER1、HER2/neu、HER4或其任意组合的一个或多个核酸序列。
人体粘蛋白家族(MUC1至MUC21)包括分泌的粘蛋白和跨膜粘蛋白，该分泌的粘蛋白和跨膜粘蛋白在人体上皮表面形成保护性的粘液屏障中发挥作用。这些蛋白的作用是保护呼吸道、胃肠道和重要器官(如乳腺、肝脏、胃、胰腺和肾脏)内的上皮细胞
MUC1(CD227)是在大多数人类癌症和一些血液恶性肿瘤中过表达的TAA。MUC1(GenBank:X80761.1、NCBI:NM_001204285.1)和激活许多重要的细胞途径已涉及人类疾病。MUC1是由两个亚基组成的异二聚体蛋白，通常在几种人类癌症中过表达。MUC1通过自身蛋白水解产生两个亚基MUC1n和MUC1c，进而形成稳定的非共价异二聚体。
MUC1 C末端亚基(MUC1c)可包括58个氨基酸的细胞外结构域(ED)、28个氨基酸的跨膜结构域(TM)和72个氨基酸的胞质结构域(CD)。MUC1c还能够包含“CQC”基序，其能够实现MUC1的二聚作用，它也能够对细胞赋予致癌作用。在某些情况下，MUC1能够经由MUC1c诱导细胞信号传导部分致癌作用。MUC1c可与EGFR、ErbB2等受体酪氨酸激酶进行相互作用，并且有助于激活PI3K→AKT和MEK→ERK的细胞途径。在细胞核中，MUC1c激活Wnt/β-连环素、STAT和NF-κB RelA细胞途径。在一些情况下，MUC1可通过经由MUC1n来诱导细胞信号传导以赋予致癌功能。MUC1 N末端亚基(MUC1n)能够包含可变数量的20个可糖基化氨基酸串联重复序列。MUC1通常在腺上皮细胞表面上进行表达，并且在癌症中过表达且糖基化异常。MUC1是能够用作肿瘤免疫疗法靶向的TAA。几项临床试验已经并且正在进行，以评估MUC1在免疫疗法疫苗中的使用。重要的是，这些试验表明MUC1靶向免疫疗法是安全的，并且可能提供存活的益处。
然而，临床试验也表明MUC1是相对较差的免疫原。为了克服这些，本发明鉴定了MUC1癌蛋白的C端区域中的T淋巴细胞免疫增强剂肽序列(MUC1-C或MUC1c)。与原生肽序列相比,修饰的MUC1-C中的激动剂：(a)在较低的肽浓度下结合HLA-A2；(b)对HLA-A2表现出较高的亲和力；(c)当与抗原呈递细胞一起使用时，比使用天然肽诱导T细胞产生更多的IFN-γ；和(d)能够从癌症患者更有效地产生MUC1特异性人类T细胞系。重要的是，使用激动剂表位生成的T细胞系比使用天然表位生成的T细胞系在裂解使用天然表位的靶细胞和裂解表达MUC1的HLA-A2人肿瘤细胞方面更有效。此外，本发明还鉴定了MUC1-C的其他CD8+细胞毒性T淋巴细胞免疫增强剂激动剂序列表位。
在某些方面中，提供了针对免疫增强剂能力修饰的有效的MUC1-C(mMUC1-C或MUC1-C或MUC1c)。本发明提供了针对免疫增强剂能力修饰的有效的MUC1-C，将其掺入到重组Ad5[E1-,E2b-]平台中，以产生新型且更有效的免疫疗法疫苗。例如，免疫疗法疫苗可以是Ad5[E1-,E2b-]-mMUC1-C，用于治疗表达MUC1的癌症或感染性疾病。
翻译后修饰在控制人体和人类疾病中的蛋白质功能中发挥着重要作用。例如，除了上文讨论的蛋白水解裂解外，MUC1还可以有一些译后修饰，诸如糖基化、唾液酸化、棕榈酰化，或其在特定氨基酸残基上的组合。本文提供了MUC1的靶向糖基化、唾液酸化、磷酸化或棕榈酰化修饰的免疫疗法。
MUC1能够被高度糖基化(在每个串联重复序列中在丝氨酸和苏氨酸残基上不同程度的N-和O-链碳水化合物和唾液酸，从单链糖基化到戊糖基化)。在乳腺癌中的具有3,4-连接的GlcNAc的不同的O-糖基化。N-糖基化包括高甘露糖、分泌型MUC1/SEC的酸性复合型和混合型糖基，以及跨膜型MUC1/TM.4的中性复合型。本发明提供了靶向不同的O-糖基化形式的MUC1的免疫疗法。
此外，可以对MUC1进行唾液酸化。从肾脏和乳腺癌细胞中分离出的膜糖蛋白优先唾液酸化核心1结构，而从相同组织中分泌的糖蛋白主要表现为核心2结构。在这两个组织中，O-糖基化的含量与末端的半乳糖、2-和3-连接的半乳糖、3-和3,6-连接的GalNAc-ol和4-连接的GlcNAc重叠。本发明提供了靶向各种唾液酸化形式的MUC1的免疫疗法。CQC基序中半胱氨酸残基上的双棕榈酰化是从核内体回收到质膜需要的。本发明提供了靶向各种棕榈酰化形式的MUC1的免疫疗法。
磷酸化可以影响MUC1诱导特定细胞信号应答的能力，这对人类健康很重要。本发明提供了靶向各种磷酸化形式的MUC1的免疫疗法。例如，MUC1可在C末端结构域的酪氨酸和丝氨酸残基上被磷酸化。C末端结构域中酪氨酸的磷酸化可以增加MUC1和β-连环蛋白的核定位。PKCδ磷酸化可以诱导MUC1与β-连环蛋白/CTNNB1结合并减少β-连环蛋白/E-钙粘蛋白复合物的形成。Src介导的MUC1磷酸化可抑制与GSK3B的相互作用。Tyr-1229上MUC1的Src和EGFR介导的磷酸化可以增加与β-连环蛋白/CTNNB1的结合。GSK3B介导的MUC1在Ser-1227上的磷酸化可以减少这种相互作用，但可以恢复β-钙粘蛋白/E-钙粘蛋白复合物的形成。MUC1的PDGFR介导的磷酸化可以增加MUC1CT和CTNNB1的核共定位。本发明提供了靶向已知调节其细胞信号传导能力的MUC1、MUC1c和MUC1n的不同磷酸化形式的免疫疗法。
本发明提供了调节MUC1c细胞质结构域及其在细胞中的功能的免疫疗法。本发明提供了包括调节MUC1c中的CQC基序的免疫疗法。本发明提供包括调节MUC1c的胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)、胞质结构域(CD)或其组合的免疫疗法。本发明提供了包括调节MUC1c诱导通过EGFR、ErbB2或其他受体酪氨酸激酶的细胞信号传导的能力的免疫疗法。本公开提供了包括调节MUC1c诱导PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-连环蛋白、STAT、NF-κB RelA细胞途径或其组合的能力的免疫疗法。
在一些实施例中，MUC1c免疫疗法还可在相同的复制缺陷型病毒载体或单独的复制缺陷型病毒载体中包括HER2/neu、CEA或Brachyury免疫疗法。
本发明还提供了调节MUC1n及其细胞功能的免疫疗法。本发明还提供了包括MUC1n串联重复序列、MUC1n串联重复序列上的糖基化位点或其组合的免疫疗法。在一些实施例中，MUC1n免疫疗法可在相同的复制缺陷型病毒载体或单独的复制缺陷型病毒载体中包括HER2/neu、CEA或Brachyury免疫疗法。
本发明还提供疫苗，该疫苗包括MUC1n、MUC1c、HER2/neu、HER1、HER3、HER4、brachyury、CEA或其组合。本发明还提供疫苗，该疫苗包括MUC1c和HER1、HER3、HER4、HER2/neu、brachyury、CEA或其组合。本发明还提供疫苗，该疫苗靶向MUC1n和HER1、HER3、HER4、HER2/neu、Brachyury、CEA或其组合。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的一个载体中。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的分开的载体中。
本发明涉及一种血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，该载体包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可以是MUC1的同工型或其亚基或片段。在某些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的序列。在一些实施例中，与野生型人类MUC1序列相比，本文所述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多点突变，诸如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本发明的MUC1-c抗原可以是修饰的MUC1，并可具有与SEQ IDNO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，本发明MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的MUC1-c抗原可以是修饰的MUC1，并可具有与SEQ IDNO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本发明MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些方面中，该MUC1抗原与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码MUC抗原的核酸序列与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码CEA抗原的核酸序列与SEQ ID NO:89中的位置1105至2532具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
V.Brachyury抗原靶标
本文公开了包括复制缺陷型载体的组合物，该复制缺陷型载体包括在相同或单独的复制缺陷型载体中编码HER2/neu抗原的一个或多个核酸序列、和/或编码粘蛋白家族抗原例如MUC1的一个或多个核酸序列、和/或编码Brachyury的一个或多个核酸序列、和/或编码CEA的一个或多个核酸序列、和/或编码HER1、HER3、HER4或任意组合的一个或多个核酸序列。
本发明提供包括一种或多种针对Brachyury的抗原的免疫疗法。Brachyury(在人类中也被称为“T”蛋白)是T-box转录因子家族中的一员，在早期发育过程中起着关键作用，主要是在正常中胚层的形成和分化过程中，其特征是被命名为T结构域的高度保守的DNA结合结构域。上皮细胞向间质转化(EMT)是原发肿瘤向转移状态发展的关键步骤，在此过程中Brachyury起着至关重要的作用。Brachyury在人癌细胞中的表达可引起EMT的改变，包括间质标志物上调、上皮标志物下调、细胞迁移和侵袭增加。与此相反，抑制Brachyury生长则会导致间质标志物的下调，细胞迁移和侵袭能力的丧失，从而降低了人类肿瘤细胞形成转移的能力。Brachyury可介导上皮-间质转化，促进细胞侵袭。
本公开还提供了调节Brachyury效应对细胞增殖疾病(如癌症)中上皮-间质转化功能的免疫疗法。本公开还提供了调节Brachyury促进细胞增殖疾病(诸如癌症)侵袭能力的免疫疗法。本公开还提供了调节Brachyury T-box结构域DNA结合功能的免疫疗法。在一些实施例中，该Brachyury免疫疗法还可包括一种或多种针对HER1、HER3、HER4、HER2/neu、CEA、MUC1、MUC1c、MUC1n或其任意组合的抗原。
Brachyury表达在大多数正常人体组织中几乎检测不到，在人类肿瘤中高度受限，常常过度表达，使其成为免疫疗法的一个有吸引力的靶抗原。在人类中，Brachyury由T基因(GenBank:AJ001699.1,NCBI:NM_003181.3)进行编码。在人类身上发现了通过选择性剪接产生的至少两种不同的同工型。每种同工型都有许多自然变体。
Brachyury具有免疫原性，Brachyury特异性的CD8+T细胞可裂解表达Brachyury淋巴细胞的肿瘤细胞。Brachyury的这些特征使其成为用于免疫疗法的具有吸引力的肿瘤相关抗原(TAA)。Brachyury蛋白是一种T-box转录因子。它可以结合到特定的DNA元件，该DNA元件为通过其N端的区域的近回文序列“TCACACCT”，将其称为T-box，以激活与该位点结合的基因转录。
本发明还提供疫苗，该疫苗包括Brachyury、HER1、HER3、HER4、HER2/neu、MUC1、CEA或其组合。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的一个载体中。在某些实施例中，抗原组合包含在本发明提供的分开的载体中。
在具体实施例中，本发明涉及一种血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，该载体包括编码免疫原性多肽的序列。该免疫原性多肽可以是Brachyury的同工型或亚基或片段。在某些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码与免疫原性多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％同一性的序列。在一些实施例中，与野生型人类Brachyury序列相比，本文所述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多点突变，诸如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本发明的Brachyury抗原可具有与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，本发明的Brachyury抗原可具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的Brachyury抗原与SEQ ID NO:85具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，本发明的Brachury抗原具有如SEQ ID NO:85所示的序列。
在一些方面中，该Brachury抗原与SEQ ID NO:85具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码Brachury抗原的核酸序列与SEQ ID NO:13具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。在一些方面中，编码CEA抗原的核酸序列与SEQ ID NO:90中的位置1045至2277具有至少80％、至少85％、至少87％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％的序列同一性。
VI.通用靶抗原
靶抗原的其他非限制性示例包括人表皮生长因子受体2(HER2/neu，在本文中也称为ErbB2)、HER3(在本文中也称为ErbB3)、HER4(在本文中也称为ErbB4)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤新抗原或肿瘤新表位、叶酸受体α、WT1、brachyury(TIVS7-2，多态性)、brachyury(IVS7T/C多态性)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、BAGE、DAM-6、DAM--10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、HER1(在本文中也称为EGFR)、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1-c、MUC1-n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1-或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸三糖异构酶、BAGE-1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、Gage 3、Gage4、Gage5、Gage6、Gage7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、粘蛋白、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、乳球蛋白A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、脂肪族蛋白、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、p53、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、存活素、端粒酶、VEGF或其任意组合。
例示性的有用肿瘤蛋白包括但不限于以下中的一种或多种：CEA、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、MUC1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1。
在一些实施例中，病毒载体包含编码修饰的多肽的靶抗原序列，该多肽选自CEA、人表皮生长因子受体1(HER1)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人表皮生长因子受体3(HER3)、人表皮生长因子受体4(HER4)、MUC1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA(即PSM)、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多态性)、Brachyury(IVS7 T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、HPV E6、HPV E7、和TEL/AML1，其中多肽或其片段与相应的天然序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的同一性。
其他有用的例示性有用肿瘤蛋白包括但不限于α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖基转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARalpha融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1-或-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A9、MAGE-C2、mucink、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、亲脂素(adipophilin)、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Rα2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶和/或VEGF。
肿瘤相关抗原可以是来自与人类恶性肿瘤相关的传染原的抗原。与人类恶性肿瘤相关的传染原的实例包括Epstein-Barr病毒、幽门螺杆菌、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类疱疹病毒-8、人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒、人类T细胞白血病病毒、肝吸虫和血吸虫病。
在一些方面中，本文使用的肿瘤新表位是肿瘤特异性表位，比如EQVWGMAVR或CQGPEQVWGMAVREL(FLRT2的R346W突变)，GETVTMPCP或NVGETVTMPCPKVFS(VIPR2的V73M突变)，GLGAQCSEA或NNGLGAQCSEAVTLN(FCRL1的R286C突变)，RKLTTELTI、LGPERRKLTTELTII、或PERRKLTTE(FAT4的S1613L突变)，MDWVWMDTT、AVMDWVWMDTTLSLS、或VWMDTTLSL(PIEZO2的T2356M突变)，GKTLNPSQT、SWFREGKTLNPSQTS、或REGKTLNPS(SIGLEC14的A292T突变)，VRNATSYRC、LPNVTVRNATSYRCG、或NVTVRNATS(SIGLEC1的D1143N突变)，FAMAQIPSL、PFAMAQIPSLSLRAV、或AQIPSLSLR(SLC4A11的Q678P突变)。
肿瘤相关抗原可以是宿主通常不表达的抗原；它们可以是宿主正常表达的分子的突变、截短、错误折叠或以其他方式异常表现；它们可以与正常表达但异常高水平表达的分子相同；或者它们可以在异常的场景或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其他生物分子或其任何组合。
VII.与传染病相关的抗原靶标
靶抗原包括但不限于源自各种病原体(如寄生虫、细菌、病毒、朊病毒等)的抗原。病原体可以指任何能够感染宿主的生物。病原体包括例如细菌、任何种类的病毒，例如单链核糖核酸病毒、单链脱氧核糖核酸病毒、真菌、寄生虫以及原生生物。
可与组合物和方法一起使用的传染性疾病相关靶抗原的实例可从以下来源获得：放线杆菌属、放线菌属、腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、6型以及7型)、腺病毒(40型和41型)、气球菌属、嗜水气单胞菌、十二指肠钩虫、广州管圆线虫、蛔虫、蛔虫属、曲霉属、巴贝斯虫属、微小芽孢杆菌、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、拟杆菌属、结肠小袋纤毛虫、杆状巴尔通体、皮炎芽生菌、蓝舌病病毒、支气管败血病博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、莱姆病螺旋体，伯氏莱姆病螺旋体，加里尼莱姆病螺旋体、卡他布兰汉氏菌、布鲁氏菌属(流产布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪布鲁氏菌)、布鲁线虫属、伯克霍尔德氏菌、鼻疽杆菌、伯克霍尔德氏菌(假单胞菌属)、加利福尼亚血清群、胎儿弯曲杆菌亚种、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌空肠亚种、白色念珠菌、嗜囊细胞虫属、基孔肯雅病毒、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、柠檬酸杆菌、华支睾吸虫、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、梭菌属(以上所列物种除外)、粗球类芽生菌、科罗拉多蜱传热病毒、白喉棒状杆菌、贝氏柯克斯体、柯萨基病毒、克雅氏病剂、库鲁剂、克里米亚-刚果出血热病毒、新生隐球菌、微小隐孢子虫、巨细胞病毒、环孢菌、登革热病毒(1、2、3、4)、类白喉、东方(西方)马脑炎病毒、埃博拉病毒、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、埃可病毒、迟缓爱德华氏菌、溶组织内阿米巴、肠杆菌属、肠道病毒70型、絮状表皮癣菌、埃利希菌属、腺热埃里希体、小孢子菌属、毛癣菌属、EB病毒、大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒素大肠杆菌、肝片吸虫、土拉弗朗西斯菌、梭杆菌属、溶血孪生球菌、兰伯氏贾第虫、瓜纳里托病毒、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌(B组)、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、猴疱疹病毒、荚膜组织胞浆菌、人冠状病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人轮状病毒、人类T淋巴病毒、包括H5N1的流感病毒、胡宁病毒/马秋波病毒、克雷伯氏菌属、科萨努尔森林病病毒、乳杆菌属、拉沙病毒、嗜肺军团菌、利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、利什曼原虫属、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特菌、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马秋波病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、微球菌属、莫拉氏菌属、分枝杆菌(牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、麻风分枝杆菌除外)、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、人型支原体、口腔分枝杆菌、唾液分枝杆菌、发酵分枝杆菌、福氏纳格里阿米巴原虫、美洲钩虫、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟氏球菌属(淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌除外)、诺卡氏菌属、诺沃克病毒、鄂木斯克出血热病毒、盘尾丝虫、后睾吸虫属、细小病毒B19、巴氏杆菌属、消化球菌属、消化链球菌属、恶性疟原虫、间日疟原虫、疟原虫属、类志贺邻单胞菌、波瓦桑脑炎病毒、变形杆菌属、假单胞菌属(除鼻疽假单胞菌、伪鼻疽假单胞菌)、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、小蛛立克次氏体、普氏立克次氏体、加拿大立克次氏体、裂谷病毒、罗斯河病毒/奥绒绒病毒、风疹病毒、猪霍乱沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌属(以上所列物种除外)、血吸虫属、瘙痒剂、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申克孢子丝菌、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷脑炎病毒、金黄色葡萄球菌、念珠状链杆菌、无乳链球菌、粪链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、唾液链球菌、牛带绦虫、猪带绦虫、犬弓形虫、猫弓形虫、锥虫弓形虫、鼠弓形虫、梅毒螺旋体、旋毛虫属、阴道毛滴虫、鞭虫、布氏锥虫、克氏锥虫、解脲支原体、牛痘病毒、水痘带状疱疹病毒、东方马脑炎病毒(EEEV)、严重急性呼吸系统病毒(SARS)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、水泡性口炎病毒、霍乱弧菌、血清型01、副溶血弧菌、西尼罗病毒、班氏丝虫、黄热病病毒、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌以及鼠疫耶尔森菌。靶抗原可以包括由任何传染性生物产生的蛋白质或其变体或片段。
许多病毒与病毒性出血热有关，其包括丝状病毒(如埃博拉、马尔堡以及莱斯顿)、沙粒病毒(如拉沙、胡宁以及马秋波)以及布尼亚病毒。此外，白蛉热病毒(phleboviruses)，包括例如裂谷热病毒，其已被确定为病毒性出血热的病原体。出血热和相关炎症的病原体也可能包括副粘病毒，特别是呼吸道合胞病毒。此外，引起人类出血热的其他病毒已被鉴定为属于以下病毒组：披膜病毒(基孔肯雅病毒)、黄病毒(登革热、黄热病、夸赛纳森林病、鄂木斯克出血热)、内罗病毒(克里米亚-刚果出血热)以及汉坦病毒(肾综合征出血热、肾病性流行病)。此外，将辛诺柏病毒确定为1993年美国西南部汉坦病毒肺综合征爆发的病原体。
靶抗原可以包括病毒外壳蛋白，即流感神经氨酸酶和血凝素、HIV gp160或其衍生物、HIV Gag、HIV Nef、HIV Pol、SARS外壳蛋白、疱疹病毒粒子蛋白、WNV蛋白等。靶抗原还可以包括细菌表面蛋白，该细菌表面蛋白包括肺炎球菌PsaA、PspA、LytA、细菌病原体的表面或毒力相关蛋白，诸如尼氏乳链菌、外膜蛋白或表面蛋白酶。
VIII.个性化肿瘤相关抗原
在某些实施例中，与本文所述的组合物和方法共同使用的肿瘤相关抗原可以直接从患有增殖性疾病或癌症的个体中鉴定出来。在某些实施例中，癌症可以包括良性肿瘤、转移性肿瘤、癌或肉瘤等等。在一些实施例中，个性化的肿瘤抗原包括以患者为特征且整体、部分或作为变体而进一步用作靶抗原的HER3。
在这方面，能够使用各种已知技术进行筛选，以从个体中鉴定肿瘤靶抗原。例如，在一个实施例中，对患者进行肿瘤活检术，从肿瘤细胞中分离RNA，并使用基因芯片(例如，从加利福尼亚州圣克拉拉的Affymetrix公司)进行筛选，并鉴定出肿瘤抗原。一旦鉴定出肿瘤靶抗原，就可以使用本领域已知的技术对其进行克隆、表达以及纯化。
然后，该靶抗原能够连接到一个或多个表位，或者结合或连接到本文所述的盒或病毒载体，并施用于患者，以改变对从肿瘤分离的靶分子的免疫应答。用这种方式，在某些实施例中，考虑了“个性化”免疫疗法和疫苗。例如，当癌症是基因性的(即遗传性的)时，患者被鉴定具有BRAC1或BRAC2突变，则能够预防性地使用疫苗。当癌症为散发性的时，这种免疫疗法能够用于减小肿瘤的大小，提高总体存活率，并且减少受试者体内癌症的复发。
IX.载体
A.免疫疗法和疫苗的病毒载体
重组病毒载体可用于表达本文公开的任何抗原。本文中可用的病毒载体的实例包括慢病毒、原病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、自身互补腺相关病毒、巨细胞病毒、仙台病毒、HPV病毒或腺病毒。在一些实施例中，可使用诸如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)之类的逆转录病毒。在一些实施例中，可使用诸如HIV之类的慢病毒来编码本文所述的抗原。在一些实施例中，巨细胞病毒(CMV)载体或仙台病毒载体(SeV)可用于编码本文所述的抗原。
B.腺病毒载体
一般而言，腺病毒在临床上很有吸引力，因为它们能够具有广泛的嗜性，可以感染多种分裂和非分裂细胞类型，可以全身使用，也可以通过哺乳动物体内更具选择性的粘膜表面使用。另外，它们的相对热稳定性进一步促进了其临床使用。
某些方面包括将表达构建体转移到细胞中，所述表达构建体包含编码一种或多种靶抗原，例如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位的一种或多种核酸序列。在某些实施例中，表达构建体向细胞内的转移可使用病毒载体来完成。病毒载体可用于包括含有足以表达已克隆于其中的重组基因构建体的病毒序列的那些构建体。
在具体实施例中，该病毒载体是腺病毒载体。腺病毒是DNA病毒家族，其特征在于包含线性双链基因组的二十面体，无包膜衣壳。在人腺病毒中，没有与任何赘生性疾病有关，并且只会在具有免疫能力的个体中引起相对轻度的自我限制疾病。
腺病毒载体整合入基因组DNA的能力可能较低。腺病毒载体可导致高效的基因转移。腺病毒载体的其他优点包括它们可有效地将基因传递给非分裂和分裂细胞，并可进行大量生产。
与整合病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染可能不会导致染色体整合，这是因为腺病毒DNA可以游离方式进行复制而没有潜在的基因毒性。另外，腺病毒载体可能在结构上稳定，并在广泛扩增后未检测到基因组重排。由于其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、宽靶细胞范围和高感染性的特点，所以腺病毒特别适合用作基因转移载体。
病毒表达的第一个基因是E1基因，其作用是从野生型基因组中存在的其他Ad5基因启动子启动高水平的基因表达。病毒DNA复制和后代病毒粒子的组装发生在被感染细胞的核内，整个生命周期需要大约36小时，其中每个细胞输出大约104个病毒粒子。
野生型Ad5基因组约为36kb，其编码的基因分为早期和晚期病毒功能，这具体取决于它们是在DNA复制之前还是之后表达。早期/晚期的描述几乎是绝对的，因为已经证明，先前用Ad5感染的细胞进行超感染会导致超级感染病毒缺乏晚期基因表达，直到它复制了自己的基因组为止。在不受理论的束缚下，这很可能是由于Ad5主要晚期启动子(MLP)的复制依赖性顺式激活而引起的，这样阻止了晚期基因表达(主要是Ad5衣壳蛋白)，直到复制的基因组被封装为止。该组合物和方法可在开发新一代Ad载体/疫苗时可能会利用这些特征。
腺病毒载体可以是复制缺陷型的，或至少是条件型缺陷的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚组A-F中的任何一种，并可设想其他血清型或亚组。为了获得复制缺陷腺病毒载体，可在具体实施例中使用亚组C的5型腺病毒。这是因为5型腺病毒是已知大量生化和遗传信息的人腺病毒，且在过去已将其用于大多数以腺病毒为载体的结构中。
腺病毒的生长和操纵是本领域技术人员已知的，并在体外和体内表现出广泛的宿主范围。也可使用修饰的病毒，例如CAR结构域得到改变的腺病毒。还设想了增强递送或逃避免疫应答的方法，例如病毒的脂质体包封。
腺病毒载体可以在Ad基因组的E2b区域和任选的E1区域中包括缺失。在一些情况下，这种载体没有缺失Ad基因组的任何其他区域。腺病毒载体可以包括在Ad基因组的E2b区域中的缺失以及在E1和E3区域中的缺失。在一些情况下，此类载体没有其他区域被缺失。腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区域中的缺失和在E1、E3中的缺失以及E4区域的部分或完全去除。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可包括在Ad基因组的E2b区域中的缺失和在E1和/或E4区域中的缺失。在一些情况下，此类载体不包含其他缺失。腺病毒载体可以包括Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区域的缺失。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以具有E2b区域的E1和/或DNA聚合酶功能缺失。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可具有E1和/或E2b区域的末端蛋白功能缺失。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以使E1、DNA聚合酶和/或末端蛋白功能被缺失。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以具有E2b区域和/或E1区域的至少一部分。在一些情况下，此类载体不是去病毒基因的腺病毒载体。在这方面，载体可以缺失E2b区域的DNA聚合酶和末端蛋白功能。腺病毒载体可以在腺病毒基因组的E1、E2b和/或100K区域中具有缺失。腺病毒载体可包括E1、E2b和/或蛋白酶功能缺失的载体。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。腺病毒载体可以缺失E1和/或E2b区域，而纤维基因已经通过突变或其他改变(例如改变Ad嗜性)进行了修饰。从E3或E4区域去除基因可以被应用于所提到的任何腺病毒载体。在某些实施例中，腺病毒载体可以在E1区域、E2b区域、E3区域、E4区域或其任何组合中具有缺失。在某些实施例中，腺病毒载体可以是去病毒基因的腺病毒载体。
Ad基因组的其他区域可以被缺失。Ad基因组特定区域中的“缺失”是指以这种方式突变或去除的特定DNA序列，从而防止该区域编码的至少一种基因产物的表达和/或功能(例如，DNA聚合酶的E2b功能或末端蛋白功能)。缺失可以包括编码蛋白质部分的外显子内的缺失，以及启动子和前导序列内的缺失。在特定区域内的缺失是指在Ad基因组的该区域内的至少一个碱基对的缺失。可以缺失多个碱基对。例如，可以从特定区域缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。该缺失可以在Ad基因组的特定区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。这些缺失可以阻止该区域编码的基因产物的表达和/或功能。例如，Ad基因组的特定区域可以包括一个或多个点突变，使得一个或多个编码的蛋白质是不起作用的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导致不起作用蛋白的氨基酸序列改变。Ad基因组中的示例性缺失或突变包括E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4、L1、L2、L3、L4、L5、TP、POL、IV、和VA区中的一个或多个。缺失的腺病毒载体可以例如使用重组技术来制备。
该载体可包括腺病毒的基因工程化的形式，例如E2缺失的腺病毒载体，或更具体地，E2b缺失的腺病毒载体。本文使用的术语“E2b缺失”是指以防止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的方式突变的特定DNA序列。因此，在某些实施例中，“E2b缺失”是指从Ad基因组中缺失(移除)的特定DNA序列。E2b缺失或“在E2b区域内包括缺失”是指Ad基因组的E2b区域内的至少一个碱基对的缺失。在某些实施例中，缺失了超过一个碱基对，在其他实施例中，缺失了至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，缺失是Ad基因组的E2b区域内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对的缺失。E2b缺失可以是阻止至少一种E2b基因产物表达和/或功能的缺失，并且因此涵盖了E2b特异性蛋白的编码部分的外显子内的缺失和启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E2b缺失是阻止E2b区域的DNA聚合酶和前末端蛋白之一或二者的表达和/或功能的缺失。在另一个实施例中，“E2b缺失”是指Ad基因组的该区域的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一个或多个编码的蛋白质是不起作用的。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导致不起作用蛋白的氨基酸序列改变。
如本领域技术人员在阅读本发明后所了解的，可缺失Ad基因组的其他区域。因此，本文使用的Ad基因组特定区域中的“缺失”是指以这种方式突变或去除的特定DNA序列，从而阻止该区域编码的至少一种基因产物的表达和/或功能。在某些实施例中，在特定区域中“缺失”是指以某种方式从Ad基因组中缺失(去除)从而阻止该区域编码的表达和/或功能(例如，DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)的特定DNA序列。在特定区域中“缺失”或“包含缺失”是指Ad基因的该区域内至少一个碱基对的缺失。
因此，在某些实施例中，从特定的区域中缺失了超过一个碱基对，而在其他实施例中，则缺失了至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一个实施例中，Ad基因组的特定区域中缺失了超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。这些缺失使得该区域编码的基因产物的表达和/或功能得到阻止。因此，缺失包括编码蛋白质部分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在一个其他实施例中，Ad基因组的特定区域中“缺失”是指Ad基因组的此区域的DNA序列中使一种或多种编码的蛋白质无功能的一个或多个点突变。此类突变包括被不同残基替换的残基，引起导致不起作用蛋白的氨基酸序列改变。
在某些实施例中，预期使用的腺病毒载体包括E2b缺失的腺病毒载体，该载体在Ad基因组的E2b区域和任选的E1区域具有缺失。在一些情况下，这种载体没有缺失Ad基因组的任何其他区域。
在另一个实施例中，预期使用的腺病毒载体包括E2b缺失的腺病毒载体，该载体在Ad基因组的E2b区域和任选的E1和E3区域具有缺失。在一些情况下，此类载体没有其他区域被缺失。
在一个其他实施例中，预期使用的腺病毒载体包括腺病毒载体，该载体在Ad基因组的E2b区域和任选的E1、E3区域具有缺失以及还任选的E4区域部分或完整除去。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。
在另一个实施例中，预期使用的腺病毒载体包括腺病毒载体，该载体在Ad基因组的E2b区域和任选的E1和/或E4区域具有缺失。在一些情况下，此类载体不包含其他缺失。
在一个其他实施例中，考虑使用的腺病毒载体包括在Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区域具有缺失的腺病毒载体。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。
在一个实施例中，本文使用的腺病毒载体包括缺失E1和/或缺失E2b区域的DNA聚合酶功能的载体。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。
在一个其他实施例中，本文使用的腺病毒载体缺失E1和/或缺失E2b区域的前末端蛋白功能。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。
在另一个实施例中，本文使用的腺病毒载体缺失E1、缺失DNA聚合酶和/或前末端蛋白功能。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。在一个具体实施例中，本文预期使用的腺病毒载体缺失了E2b区域和/或E1区域的至少一部分。
在一些情况下，此类载体不是“去病毒基因”的腺病毒载体。在这方面，载体可以缺失E2b区域的DNA聚合酶和末端蛋白功能。在一个其他实施例中，使用的腺病毒载体包括在腺病毒基因组的E1、E2b和/或100K区域具有缺失的腺病毒载体。在某些实施例中，腺病毒载体可以是“去病毒基因”的腺病毒载体。
在一个实施例中，本文使用的腺病毒载体包括缺失E1、E2b和/或缺失聚合酶功能的载体。在一些情况下，这种载体没有其他缺失。
在一个其他实施例中，本文使用的腺病毒载体缺失E1和/或E2b区域，而纤维基因已通过突变或其他改变(例如，改变了Ad嗜性)进行了修饰。从E3或E4区域去除基因可以被应用于所提到的任何腺病毒载体。
可使用本领域已知的重组技术来产生缺失的腺病毒载体(参见，例如，Amalfitano等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1998；72:926-33；Hodges等人，J Gene Med[遗传医学杂志]，2000年；2:250-59)。如本领域技术人员所知，可使用适当的包装细胞系将某些方面中使用的腺病毒载体生长至高滴度，该适当的包装细胞系组成型地表达E2b基因产物和可能已缺失的任何必需基因产物。在某些实施例中，可使用不仅组成型表达E1和DNA聚合酶蛋白而且也表达Ad前末端蛋白的源自HEK-293的细胞。在一个实施例中，E.C7细胞用于成功培养高滴度的腺病毒载体(参见，例如，Amalfitano等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1998；72:926-33；Hodges等人，J Gene Med[遗传医学杂志]，2000年；2:250-59)。
为了从自我繁殖的腺病毒载体中缺失关键基因，可将由靶向的基因所编码的蛋白质与E1蛋白质一起在HEK-293细胞或类似物中共表达。因此，在进行组成型共表达时，仅可使用无毒性的那些蛋白质(或诱导表达的有毒蛋白质)。已证明E1和E4基因在HEK-293细胞中共表达(利用诱导性而非组成型启动子)(Yeh等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1996；70:559；Wang等人，Gene Therapy[基因疗法]，1995年；2:775；以及Gorziglia等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1996；70:4173)。已共表达了E1和蛋白质IX基因(病毒粒子结构蛋白)(Caravokyri等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1995；69:6627)，E1、E4和蛋白IX基因的共表达已得到说明(Krougliak等人，Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]1995；6:1575)。E1和100k基因已在转互补细胞系中成功表达，E1和蛋白酶基因也已成功表达(Oualikene等人，Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]，2000；11:1341-53；Hodges等人，J.Virol.[病毒学杂志]，2001；75:5913-20)。
用于生长高滴度的缺失E2b的Ad颗粒的共表达E1和E2b基因产物的细胞系如美国专利号6,063,622所述。E2b区域编码Ad基因组复制所绝对必需的病毒复制蛋白(Doerfler等人，染色体[Chromosoma]，1992；102:S39-S45)。有用的细胞系组成型地表达约140kDa的Ad-DNA聚合酶和/或约90kDa的前末端蛋白。具体地，期望具有E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的高水平组成型共表达且无毒的细胞系(例如，E.C7)用于扩增Ad以用在多种疫苗中。这些细胞系允许缺失E1、DNA聚合酶和末端蛋白质的腺病毒载体的繁殖。
某些实施例使用新型Ad5[E1-,E2b-]载体系统来满足开发针对各种癌症的治疗性疫苗的长期需求、克服其他Ad5系统发现的障碍并允许以前接触过Ad5的人们进行免疫。
对野生型Ad的先天免疫应答可能很复杂，并且看来腺病毒载体表达的Ad蛋白起着重要的作用。具体而言，E2b缺失的载体中的前末端蛋白质和DNA聚合酶的缺失似乎在注射后的最初24至72小时内缓解了炎症，而第一代腺病毒载体则在此期间刺激了炎症。另外，据报道，由E2b缺失产生的额外的复制阻滞也导致Ad晚期基因的表达降低了10,000倍，这远远超出了仅E1、E3缺失所提供的水平。
由于Ad特异性中和了抗体，第一代载体的功效可能降低。在不受理论的束缚的情况下，具有E1和E2b区域(Ad5[E1-,E2b-])的缺失的基于Ad5的载体(后者编码DNA聚合酶和前末端蛋白，例如，由于晚期病毒蛋白表达的减少)可以避免免疫清除，并诱导对抗Ad-免疫宿主中编码的肿瘤抗原转基因的更有效的免疫应答。
一些实施例涉及用于产生对抗靶抗原的免疫应答的方法和组合物(例如病毒载体)，特别是那些与传染病或增生性细胞疾病(诸如癌症)有关或相关的靶抗原。一些实施例涉及用于在个体中产生对抗靶抗原的免疫应答的方法和组合物，特别是那些与细胞增殖性疾病(诸如癌症)有关的靶抗原。在一些实施例中，本文所述的组合物和方法涉及在个体中产生对抗表达细胞的免疫应答和/或呈现包含至少一种靶抗原的靶抗原或靶抗原标记。
该组合物和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的靶抗原的免疫应答。例如，该组合物和方法可用来产生针对由细胞表达或呈递的HER2或HER3蛋白的免疫应答。例如，该组合物和方法能够用于对抗细胞表达或呈现的CEA(6D)而产生免疫应答。例如，该组合物和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的粘蛋白1(MUC1)的免疫应答。例如，该组合物和方法能够用于产生对抗细胞表达和/或呈递的MUC1c的免疫应答。例如，该组合物和方法能够用于产生对抗由细胞表达和/或呈递的Brachyury(T蛋白(T))的免疫应答。
该组合物和方法可用于产生对抗细胞表达和/或呈递的多种靶抗原的免疫应答。例如，该组合物和方法可用来产生针对HER3的免疫应答。
修饰形式的HER3可用于疫苗中，以引起针对HER3或针对表达和/或呈递HER2或HER3的细胞的免疫应答。特别地，一些实施例提供了改进的基于Ad的疫苗，使得可以实现对抗一个或多个抗原靶实体的多次疫苗接种。在一些实施例中，改良的基于Ad的疫苗包括携带靶抗原、其片段、变体或变体片段的复制缺陷型腺病毒，比如Ad5[E1-,E2b-]-HER3或Ad5[E1-,E2b-]-截短的HER3。靶抗原(比如HER3)的变体或片段可根据各种因素来选择，这包括免疫原性潜力。重要的是，在预先存在对Ad的免疫的情况下，能够进行疫苗接种，或者可以将疫苗接种给事先用本文所述的Ad载体或其他Ad载体多次免疫的受试者。可向受试者多次施用Ad载体，以诱导针对目的抗原(比如HER)的免疫应答，这包括但不限于产生针对一种或多种靶抗原的抗体和CMI应答。
可使用本领域已知的技术来扩增重组Ad。例如，在某些实施例中，在适当的MOI(例如5)下用腺病毒载体病毒储备物感染含有E.C7细胞的组织培养板，并在37.0℃下孵育40-96小时。收集感染的细胞，重悬于10mMTris-CI(pH 8.0)中并进行超声处理，并通过两轮氯化铯密度离心纯化病毒。在某些技术中，将含有病毒的条带在Sephadex CL-6B柱(Pharmacia Biotech公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)上脱盐，加入蔗糖或甘油，将等分试样保存在-80℃。在一些实施例中，将该病毒置于旨在增强其稳定性的溶液中，例如A195(Evans等人，J Pharm Sci[药学学报]，2004；93:2458-75)。测定原液的滴度(例如，通过测量SDS裂解后的病毒等分试样在260nm处的光密度)。在另一个实施例中，可将包含E2b缺失的整个重组腺病毒载体的线性或环状质粒DNA转染进E.C7或类似的细胞中，并在37.0℃下孵育，直到证实产生了病毒(例如，细胞病变作用)。然后，在纯化之前，可将这些细胞的调节后的培养基用于感染更多E.C7或类似细胞，以扩大产生的病毒量。可通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来完成纯化。在某些实施例中，可使用市售产品(例如，来自宾夕法尼亚州马尔文市Puresyn,Inc.公司的腺苷)或定制的色谱柱，以通过柱色谱法纯化病毒。
在某些实施例中，该重组腺病毒载体可包括足够的病毒，以确保待转染的细胞接收到一定数量的病毒。因此，可提供重组Ad的储备物，特别是无RCA的重组Ad的储备物。Ad储备物的制备和分析可使用本领域适用的任何方法。病毒储备物的滴度差异很大，这主要取决于病毒的基因型以及制备它们的方法和细胞系。病毒储备物的滴度至少约为106、107或108个病毒颗粒(VP)/ml，很多此类储备物的滴度更高，比如，至少约为109、1010、1011、或1012个VP/ml。
某些方面预期使用E2b缺失的腺病毒载体，比如美国专利申请号6,063,622和6,451,596；6,057,158；6,083,750；8,298,549所述的那些。在许多情况下，在E2b区域中缺失的载体削弱了病毒蛋白的表达和/或降低了产生复制能力的Ad(RCA)的频率。
这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖可以利用表达缺失的E2b基因产物的细胞系来完成。某些方面也提供了此类包装细胞系；例如，源自HEK-293细胞系的E.C7(以前称为C-7)。
在其他方面中，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可与E1基因产物一起在E.C7或类似细胞中组成型表达。将基因片段从Ad基因组转移到生产细胞系具有直接的益处：(1)增加的携带能力；和(2)产生RCA的潜力降低，通常需要两个或多个独立的重组事件才能产生RCA。本文使用的表达E1、Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白的细胞系可使携带能力接近13kb的腺病毒载体得到繁殖，而无需污染辅助病毒。此外，当缺失了对病毒生命周期至关重要的基因(例如E2b基因)时，进一步削弱Ad复制或表达其他病毒基因蛋白。这可降低病毒感染的细胞的免疫识别力，并使外来转基因表达的时长得到增加。
E1、DNA聚合酶和末端蛋白质缺失的载体通常无法表达E1和E2b区域的相应蛋白质。此外，它们可能显示出大多数病毒结构蛋白缺乏表达。例如，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责晚期结构蛋白L1至L5的转录。尽管MLP在Ad基因组复制之前的活性很小，但是只有在病毒基因组复制发生后，其高毒性的Ad晚期基因才会从MLP转录并翻译。晚期基因转录的这种顺式依赖性激活通常是DNA病毒的特征，例如多瘤病毒和SV-40的生长。DNA聚合酶和末端蛋白对于Ad复制非常重要(与E4或IX蛋白不同)。它们的缺失对腺病毒载体晚期基因表达危害极大，且产生细胞(比如，APCs.E1缺失的腺病毒载体)中该表达的毒效。
某些方面预期使用缺失E1的腺病毒载体。构建第一代或缺失E1的腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅替代基因的E1区域。一般而言，约90％的野生型Ad5基因组保留在载体中。Ad5[E1-]载体感染未表达Ad5 E1基因的细胞后，复制能力降低，无法产生传染性病毒。重组Ad5[E1-]载体人细胞(一般是293细胞)中得到扩增，实现了Ad5[E1-]载体的复制和包装。Ad5[E1-]载体具有许多积极属性；其中最重要的一项是它们相对易于扩展规模和生产cGMP。目前，超过220项人类临床试验使用了Ad5[E1-]载体，超过两千名受试者接受了sc、im或iv病毒。
此外，Ad5载体没有整合；它们的基因组保持游离状态。一般而言，对于没有整合到宿主基因组中的载体，插入诱变和/或种系传递的风险非常低。传统的Ad5[E1-]载体具有接近7kb的携带能力。
对人类和动物的研究表明，对抗Ad5的预先存在的免疫力可能是基于Ad的疫苗商业应用的抑制因素。人类主要具有抗Ad5的抗体，其为人类疫苗中使用最广泛的亚型，研究的三分之二的人对Ad5有淋巴增殖应答。这种预先存在的免疫力能够使用典型的Ad5疫苗抑制免疫或重新免疫，并且可以阻止以后使用Ad5载体对抗第二抗原的疫苗免疫。克服预先存在的抗载体免疫性的问题一直是深入研究的主题。使用其他人类(非基于Ad5的)Ad5亚型，甚至非人类形式的Ad5的调查均已进行了检查。即使这些方法在最初的免疫接种中成功了，由于对新Ad5亚型的免疫应答，后续的疫苗接种可能会出现问题。
为了避免Ad5免疫障碍，并提高第一代Ad5[E1-]载体的有限功效以诱导最佳免疫应答，某些实施例提供了基于下一代Ad5载体的疫苗平台。下一代Ad5平台在E2b区域具有其他缺失，这移除了DNA聚合酶和前末端蛋白质基因。Ad5[E1-,E2b-]平台具有足够的克隆能力，其足以允许包含许多可能的基因。与Ad5[E1-]载体的7kb容量相比，Ad5[E1-,E2b-]载体具有高达约12kb的基因携带容量，并在需要时为多个基因提供了空间。在一些实施例中，将超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11kb的插入片段引入Ad5载体，例如Ad5[E1-,E2b-]载体。
E2b区域的缺失可赋予Ad5载体有利的免疫特性，通常引起针对靶转基因抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的强力免疫应答，同时将对Ad病毒蛋白的免疫应答最小化。
在各个实施例中，Ad5[E1-,E2b-]载体可甚至在存在Ad免疫力的情况下诱导有效的CMI，以及针对载体表达的靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的抗体。
与Ad5[E1-]载体相比，Ad5[E1-,E2b-]载体还具有减少的不良反应，特别是肝毒性和组织损伤的出现的情况下。
Ad5载体的某些方面是Ad晚期基因的表达大大降低。例如，可在体内检测到用于Ad5[E1-]载体的衣壳纤维蛋白的产生，而从Ad5[E1-，E2b-]载体疫苗中去除了纤维表达。对野生型Ad的先天免疫应答是复杂的。从Ad5[E1-,E2b-]载体中缺失的蛋白质通常起重要作用。具体地，与Ad5[E1-]载体相比，在注射后的前24至72小时内，具有前末端蛋白或DNA聚合酶缺失的Ad5[E1-,E2b-]载体显示出减少的炎症。在各种实施例中，缺乏Ad5基因表达使得被感染的细胞对于抗Ad活性不可见，并允许被感染的细胞长时间表达转基因，从而增强对靶标的免疫力。
各种实施例考虑增加Ad5[E1-,E2b-]载体转导树突状细胞的能力，从而通过利用针对Ad5[E1-，E2b-]载体病毒蛋白的炎性反应的减少以及由此避免先前存在的Ad免疫来提高疫苗中的抗原特异性免疫应答。
在一些情况下，该免疫诱导过程需要数月。在诱导抗原特异性免疫应答方面，Ad5[E1-，E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，而且似乎优于Ad5[E1-]载体，这使其更适合用作平台来递送可导致临床应答的肿瘤疫苗。在其他情况下，免疫诱导可能需要几个月的时间。
在某些实施例中，提供了方法和组合物，该方法和组合物利用Ad5[E1-,E2b-]载体系统来开发治疗性肿瘤疫苗，该疫苗可克服其他Ad5系统发现的障碍，并可免疫以前接触过Ad5的人。
与第一代腺病毒载体的5到6kb容量相比，E2b缺失的载体可能具有高达13kb的基因携带容量，从而轻松为编码多种靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)中的任何一种的核酸序列提供空间。
与第一代腺病毒载体相比，E2b缺失的腺病毒载体的不良反应也得到减少。E2b缺失的载体减少了病毒基因的表达，该特点导致体内转基因的表达得到延长。
与第一代腺病毒载体相比，第二代E2b缺失的腺病毒载体的某些实施例包含在DNA聚合酶基因(pol)中附加的缺失以及在前末端蛋白质(pTP)中的缺失。与第一代腺病毒载体的5kb至6kb容量相比，E2b缺失的载体具有多达13kb的基因携带容量，从而容易为编码多种靶抗原中任何一种的核酸序列提供空间。与第一代腺病毒载体相比，E2b缺失的腺病毒载体的不良反应也得到减少。
看来由腺病毒载体表达的Ad蛋白起重要作用。具体而言，E2b缺失的载体中的前末端蛋白质和DNA聚合酶的缺失似乎在注射后的最初24至72小时内缓解了炎症，而第一代腺病毒载体则在此期间刺激了炎症。
另外，据报道，由E2b缺失产生的额外的复制阻滞也导致Ad晚期基因的表达降低10,000倍，这远远超出了E1、E3缺失所提供的水平。通过E2b缺失的腺病毒载体产生的Ad蛋白的降低水平有效地降低了对Ad抗原产生富有有竞争力的、不希望的免疫应答、防止在接受Ad免疫或接触的个体中重复使用平台的反应的可能性。第二代E2b缺失的载体对炎症应答的诱导减少，导致载体表达所需疫苗抗原的可能性增加。
第二代E2b缺失的载体对炎症应答的诱导的减少导致在抗原呈递细胞(即树突状细胞)感染期间载体表达所需疫苗抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的可能性增加，这样降低了抗原竞争的潜力，并且与使用第一代腺病毒载体进行相同的尝试相比，这样可导致疫苗针对所需抗原的更大免疫。
E2b缺失的腺病毒载体提供了一种改进的基于Ad的疫苗候选物，比起之前描述的使用第一代腺病毒载体的候选疫苗，该疫苗候选物比先前描述的疫苗候选物更安全、更有效、更通用。
因此，尽管有望用作疫苗的平台，但第一代基于E1缺失的腺病毒5型(Ad5)的载体的活性被天然存在的或诱导的Ad特异性中和抗体阻碍。
在不受理论约束的情况下，E1和E2b区域缺失(其中后者编码DNA聚合酶和前末端蛋白)的基于Ad5的载体(Ad5[E1-，E2b-])可例如通过减少晚期病毒蛋白的表达在Ad免疫宿主内避免免疫清除并诱导针对编码的抗原转基因(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的更有效的免疫应答。
Ad载体可包含能被检测或选择的产物，诸如报告基因，该报告基因的产物可被检测，诸如通过荧光、显色或荧光底物上的酶活性等，或通过生长条件选择。示例性的报告基因包括绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶、新霉素磷酸转移酶、分泌性碱性磷酸酶(SEAP)和人生长激素(HGH)。示例性的选择标志物包括耐药性，诸如新霉素(G418)、潮霉素等。
Ad载体也能够包含启动子或表达控制序列。启动子的选择将部分取决于靶细胞类型和所需控制的程度或类型。合适的启动子包括但不限于组成型、诱导型、组织特异性、细胞类型特异性、时间特异性或事件特异性。组成型或非特异性启动子的实例包括SV40早期启动子、SV40晚期启动子、CMV早期基因启动子、牛乳头瘤病毒启动子和腺病毒启动子。除病毒启动子外，细胞启动子在一些实施例中也是合适的和有用的。尤其是，所谓管家基因的细胞启动子是有用的(例如，β-肌动蛋白)。病毒启动子通常是比细胞启动子更强的启动子。也可以使用诱导型启动子。这些启动子包括地塞米松可诱导的MMTV LTR、重金属可诱导的金属硫蛋白、以及cAMP可诱导的具有cAMP应答元件的启动子、热休克启动子。通过使用诱导型启动子，可以将核酸递送至细胞并将保持静止直至添加诱导剂。这允许进一步控制目的蛋白质的产生时间。可以使用事件类型特异性启动子(例如，HIV LTR)，该启动子仅在事件发生时才有活性或上调，例如(诸如致瘤性或病毒感染)。除非存在tat基因产物，否则HIV LTR启动子是非活性的，tat基因产物是在病毒感染后发生的。一些事件类型的启动子也是组织特异性的。优选的事件类型特异性启动子包括在病毒感染后激活的启动子。
启动子的实例包括α-甲胎蛋白、α-肌动蛋白、myo D、癌胚抗原、VEGF-受体的启动子；FGF受体；TEK或tie 2；tie；尿激酶受体；E-和P-选择素；VCAM-1；内皮糖蛋白；内皮唾液酸蛋白；αV-β3整联蛋白；内皮素-1；ICAM-3；E9抗原；von Willebrand因子；CD44；CD40；血管内皮钙粘蛋白；notch 4，高分子量黑素瘤相关抗原；前列腺特异抗原-1、probasin、FGF受体、VEGF受体、erb B2；erb B3；erb B4；MUC-1；HSP-27；int-1；int-2、CEA、HBEGF受体；EGF受体；酪氨酸酶、MAGE、IL-2受体；前列腺酸性磷酸酶、前列腺素、前列腺特异性膜抗原、α-晶体蛋白、PDGF受体、整联蛋白受体、α-肌动蛋白、SM1和SM2肌球蛋白重链、钙蛋白-h1、SM22α-血管紧张素受体、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和CD4。
可以插入阻遏物序列、负调节子或组织特异性沉默子以减少多核苷酸的非特异性表达。多个阻遏元件可以插入启动子区域。转录的抑制与阻遏元件的方向或与启动子的距离无关。阻遏序列的一种类型是绝缘子序列。此类序列抑制转录并且可以使背景转录沉默。负调控元件可以位于许多不同基因的启动子区域。在没有诸如类固醇的因素的情况下，阻遏元件可以用作转录的阻遏物，卵清蛋白基因启动子区域的NSE也是如此。这些负调控元素可以结合输卵管的特定蛋白质复合物，而这些复合物都不对类固醇敏感。卵清蛋白基因的启动子中有三个不同的元件。在一些实施例中，对应于这些元件的部分的寡核苷酸可以抑制TK报道基因的病毒转录。例如，此类沉默子元件之一是TCTCTCCNA(SEQ ID NO:88)，该TCTCCTCCNA与存在于其他基因中的沉默子具有序列同一性。
可将增加所需靶抗原表达的元件掺入本文所述的Ad载体的核酸序列中。示例性元件包括内部核糖体结合位点(IRES)。IRES可以提高翻译效率。同样，其他序列可以增强表达。对于一些基因，尤其是5'端的序列可能会抑制转录和/或翻译。这些序列通常是可以形成发夹结构的回文。在一些情况下，待递送的核酸中的此类序列被缺失。可以测定转录产物或翻译产物的表达水平，以确认或确定哪些序列影响表达。转录物水平可以通过任何已知方法测定，包括Northern印迹杂交、RNase探针保护等。蛋白质水平可以通过任何已知的方法来测定，包括ELISA。
编码各类抗原的Ad5[E1-]载体可用于有效地将95％的离体暴露的DC转导为高滴度的载体。在某些实施例中，发现DC中外源基因表达水平的增加与载体感染的多重性(MOI)的增加相关。用Ad5[E1-]载体感染的DC可以编码多种抗原(包括肿瘤抗原MART-1、MAGE-A4、DF3/MUC1、p53、hugp100黑素瘤抗原、多瘤病毒中间-T抗原)，在混合淋巴细胞反应中，这些抗原可诱导抗原特异性CTL应答，具有增强的抗原呈递能力和/或具有增强的启动T细胞增殖的能力。当用表达各自抗原的肿瘤细胞攻击时，预先用编码肿瘤特异性抗原的Ad5载体转导的树突细胞(DC)对动物进行免疫可用于诱导对动物的显著保护水平。有趣的是，肿瘤内注射编码IL-7的Ad在诱导抗肿瘤免疫性方面不如用IL-7编码Ad5载体转导的DC有效。在某些实施例中，考虑了Ad5载体对DC的离体转导。离体DC转导策略可用于诱导受体宿主耐受。例如，Ad5介导的CTLA4Ig向DC的递送可以阻断DC CD80与存在于T细胞上的CD28分子的相互作用。
Ad5载体与DC的衣壳相互作用可触发几种有益的应答，这可能增强了DC呈递Ad5载体编码的抗原的倾向。例如，未成熟的DC尽管专门吸收抗原，但却是相对无效的T细胞活化效应物。DC成熟与DC驱动T细胞免疫的能力增强相一致。在一些情况下，这些组合物和方法利用了Ad5感染，这导致小鼠未成熟骨髓衍生DC的DC成熟Ad载体感染的直接诱导可以上调通常与DC成熟相关的细胞表面标志物(MHC I和II、CD40、CD80、CD86和ICAM-1)，以及下调CD11c，而CD11c是髓样DC成熟时下调的整合素。在一些情况下，Ad载体感染触发DC产生IL-12，这是DC成熟的标志物。不受理论的约束，这些事件可能是由于Ad5触发的NF-κB途径激活所致。成熟的DC可以通过Ad载体有效地转导，并且不会丧失其以较低的MOI刺激幼稚T细胞增殖的功能潜力，如成熟的CD83+人DC(来自外周血单核细胞)所证明的。但是，成熟的DC可能也比未成熟的DC更不易感染。衣壳蛋白的修饰可以用作优化Ad载体对DC感染以及增强功能成熟的策略，例如使用CD40L受体作为病毒载体受体，而不是使用正常的CAR受体感染机制。
X.异源核酸
在一些实施例中，载体(比如腺病毒载体)可包括异源核酸序列，该异源核酸序列编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4的抗原或表位，或其任何组合、其融合物或片段)，这些可调节免疫应答。在某些方面中，可提供第二代E2b缺失的腺病毒载体，该载体包括编码一种或多种肿瘤抗原的异源核酸序列，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位。
因此，可以提供编码来自本文进一步所述的来源的HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位的多核苷酸，、包括所述多核苷酸的载体或构建体以及用所述载体或表达构建体转化或转染的宿主细胞。
在本文中大体上可互换使用词语“核酸”和“多核苷酸”。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并可以是DNA(例如，基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。如本领域技术人员所知，本文使用的多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链，并可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包括HnRNA分子和mRNA分子，HnRNA分子包含内含子并以一对一方式对应于DNA分子，mRNA分子不包含内含子。其他的编码或非编码序列可以但不必存在于本文所公开的多核苷酸内，且多核苷酸可以但不必与其他分子和/或支持材料相连。如本文所用，分离的多核苷酸是指多核苷酸大体上远离其他编码序列。例如，本文所用的分离的DNA分子不包含大部分不相关的编码DNA，比如大的染色体片段或其他功能基因或多肽编码区域。当然，这是指最初分离的DNA分子，且不排除后来通过实验室重组添加到该片段的基因或编码区。
如本领域技术人员所理解的那样，多核苷酸能够包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小的工程化基因片段，它们表达或可以被调适以表达本文所述的靶抗原、抗原片段、肽等等。可以将这样的片段自然分离，也可以将其通过人工方式进行修饰。
多核苷酸可包括天然序列(即编码一种或多种肿瘤抗原如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合或其一部分的抗原或表位的内源序列)，或可包括编码该序列的变体或衍生物的序列。在某些实施例中，如本文所述的多核苷酸序列编码一种或多种突变的肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位)。在一些实施例中，多核苷酸代表了一种新型基因序列，该序列已被优化用于在特定细胞类型(即人细胞系)中进行表达，这可能与天然核苷酸序列或变体有很大不同，但编码相似的蛋白质抗原。
在其他相关实施例中，可提供与编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的天然序列具有实质同一性的多核苷酸变体，例如，那些与如SEQ ID NO:1所示的HER2/neu序列(HER2细胞外结构域(ECD)和跨膜结构域(TM))、HER1序列、如SEQ ID NO:6所示的HER3序列(HER3细胞外结构域和跨膜结构域)或HER4序列或其任意组合具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性(或其衍生范围或数值)、具体的具有至少75％以至99％或更高序列同一性的变体。在一些实施例中，提供了编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的多核苷酸序列，或提供了使用本文所述方法(例如，使用标准参数进行BLAST分析，如下所述)测定的与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性(或其衍生范围或数值)、具体地具有至少75％以至99％或更高序列同一性的氨基酸序列。本领域技术人员应了解，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框位置等，可适当地调节这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应身份。
一般而言，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地，使得通过变体多核苷酸编码的多肽表位具有免疫原性，或者使得相对于由天然多核苷酸序列编码的多肽的异源靶蛋白的免疫原性大体上不减少。在一些情况下，一种或多种取代、添加、缺失和/或插入可导致增加变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性。如本文其他地方所述，该多核苷酸变体可编码靶抗原的变体。如本文其他地方所述，多核苷酸变体优选编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的变体或其片段(例如，表位)，其中该变体多核苷酸或其片段(例如，表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向性相对于天然多肽基本上没有减少。多核苷酸变体可以编码靶抗原的变体或其片段，其中相对于天然多肽，变体多肽或其片段与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向显著增加。
词语“变体”也应理解为涵盖异种来源的同源基因。在特定的实施例中，靶抗原的变体或片段被修饰成使得它们具有一种或多种降低的生物学活性。例如，可以修饰致癌蛋白靶抗原以减少或消除该蛋白的致癌活性，或者可以修饰病毒蛋白以减少或消除一种或多种活性或病毒蛋白。修饰的HER3蛋白的一个实例是截短的HER3蛋白，该截短的HER3蛋白仅具有跨膜和细胞外结构域，从而产生一种免疫原性降低的变体蛋白。
在某些方面中，可提供多核苷酸，该多核苷酸包括至少约5个、最多1000个或更多个编码多肽的连续核苷酸(如本文所述，包括靶蛋白质抗原)，以及它们之间的所有中间长度或由其组成。应了解，在上下文中的“中间长度”意味着所示值中间的任何长度，比如，16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括从200至500的所有整数；500至1,000等等。本文所述的多核苷酸序列通过在编码本文所述的多肽(比如，表位或异源靶蛋白)的天然序列中未发现的其他核苷酸来在一个或两个末端进行延长。这个额外的序列在公开的序列的任一端或在公开的序列的两端可包含1到20个核苷酸或更多个。
无论编码序列的长度如何，多核苷酸或其片段均可与其他DNA序列(比如，启动子、表达控制序列、聚腺苷酸化信号、另外的限制性酶切位点、多个克隆位点、其他编码片段等)组合，使得它们的总体长度可大量地进行变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的核酸片段，该总长度优选地受制于预期的重组DNA方案中的制备和使用的容易性。例如，在某些方面中，考虑使用的示例性多核苷酸段的总长约为1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对(包括所有的中间长度)。
当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸的序列在为了最大对应而进行比对时相同的话，则此两个序列可以说是“等同”的，如下所述。两个序列之间的比较通过这样的方式进行：通常通过在比较窗口上比较序列以鉴定和比较局部序列区域相似性。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为30至约75、40至约50个，其中两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
用于比较的序列的优化比对可使用默认参数使用在Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.公司，麦迪逊市，威斯康星州)中的Megalign程序来进行。该程序体现了以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff MO(1978)，A model of evolutionarychange in proteins-Matrices fordetecting distant relationships[蛋白质进化变化的模型-用于检测远距离关系的矩阵]。Dayhoff MO(编)，Atlas of Protein Sequence andStructure[蛋白质序列和结构图谱]，国家生物医学研究基金会(National BiomedicalResearchFoundation)，华盛顿特区，第5卷第3增刊，第345-358页；Hein J，UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes[比对和系统发生学的统一方法],第626-645页，1990年)；Methods in Enzymology[酶学方法]，第183卷，加利福尼亚州圣地亚哥，学术出版社；Higgins等人，PM CABIOS[生物科学中的计算机应用]，1989年；5:151-53；Myers EW等人，CABIOS[生物科学中的计算机应用]，1988年；4:11-17；Robinson ED，Comb.Theor[组合理论学报]，1971年；11A 05；Saitou N等人，Mol.Biol.Evol.[分子生物学与进化]，1987；4:406-25；在PHA和Sokal RR Numerical Taxonomy-the Principles andPractice ofNumerical Taxonomy[数值分类法的基础上-数值分类法的原理和实践]，弗里曼出版社，加利福尼亚州旧金山(1973年)；Wilbur WJ等人，Proc.Natl.Acad.,Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1983 80:726-30)。
替代地，可以通过以下进行用于比较的序列的最佳比对：Smith等人的局部同一性算法，Add.APL.[应用数学增刊]1981；2:482；Needleman等人的同一性比对算法，Mol.Biol.[分子生物学]，1970 48:443；Pearson和Lipman的相似性寻找方法,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，1988；85:2444；这些算法的计算机化实现(威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，遗传学计算机小组(GCG),575位科学家,威斯康星州麦迪逊)，或通过检查。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，如Altschul等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，197725:3389-3402，和Altschul等人，J.MoI.Biol.[分子生物学]，1990 215:403-10中所述。可以使用BLAST和BLAST 2.0(例如其具有此处描述的参数)来确定多核苷酸的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)披露获得。在一个示例性实例中，对于核苷酸序列，可以使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵来作为默认值(参加Henikoff等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]1989；89:10915)，比对，(B)为50、期望(E)为10、M＝5、N＝-4，并比较两条链。
在某些实施例中，“序列同一性百分比”能够通过以下比较方式进行确定：比较窗口上的两个最佳对齐序列的至少20个位置，其中针对两个序列的最优比对，与参考序列(不包括添加或缺失)相比比较窗口中的多核苷酸序列部分可以包括通常为20％或更少，通常为5％到15％，或10％到12％的添加或缺失(即缺口)。该百分比通过以下方式来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置总数(即窗口大小)并将结果乘以100即可得出序列同一性的百分比。
本领域技术人员应了解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的特定目的抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，由于密码子用法的差异，特别考虑了变化的多核苷酸。
此外，也可考虑包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一种或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)被改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可以但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。
因此，在另一个实施例中，采用诱变方法(例如位点特异性诱变)来制备编码如本文所述的一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸序列的变体和/或衍生物或其片段。通过这种方法，可通过编码多肽序列的基础多核苷酸的诱变来对多肽序列进行特异性修饰。这些技术提供了一种直接的方法来制备和测试序列变体，例如，在结合了一个或多个上述考虑因素情况下，通过将一个或多个核苷酸序列改变引入多核苷酸。
位点特异性诱变允许通过以下产生突变体：使用编码所需突变的DNA序列以及足够数量的相邻核苷酸的特定寡核苷酸序列，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在被穿越的缺失连接的两侧形成稳定的双链体。可在选定的多核苷酸序列中使用突变，以改善、改变、减少、修饰或以其他方式改变多核苷酸本身的特性，和/或改变编码的多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
可容易地制备编码多肽的多核苷酸段或片段，例如，如通常使用自动化寡核苷酸合成仪所实践的那样来通过化学方法直接合成该片段。另外，片段可通过应用核酸复制技术(比如美国专利申请号4,683,202的PCRTM技术)通过将选择的序列引入重组载体以进行重组生产，以及通过分子生物学领域技术人员通常已知的其他重组DNA技术(参见，例如Current Protocolsin Molecular Biology[分子生物学实验手册]，约翰威立父子出版集团，纽约市，纽约州)来获得。
为了表达如本文所述的所需的肿瘤抗原(比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)、多肽或其片段或包括上述任何一种的融合蛋白，使用本领域已知的重组技术来将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的载体(如本文所述的复制缺陷腺病毒载体)中。适当的载体包含用于插入的编码序列和任何所需接头的转录和翻译的必需元件。
本领域技术人员可用的方法可用于构建这些含有编码一种或多种肿瘤抗原(比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的序列以及适当的转录和翻译控制元件的载体。这些方法包括体内重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组技术。例如，这些技术如下所述：Amalfitano等人，J.Virol.[病毒学杂志]，1998；72:926-33；Hodges等人，J GeneMed[遗传医学杂志]，2000年；2:250-259；Sambrook J等人，(1989年)，MolecularCloning,A Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册]，冷泉港出版社，纽约州普莱恩维尤，以及Ausubel FM等人(1989年)，Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验手册]，约翰威立父子出版集团，纽约，N.Y.。
可以利用多种载体/宿主系统来包含和产生多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，比如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌；用酵母载体转化的酵母；用病毒载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒载体(例如花椰菜花叶病毒、CaMV烟草花叶病毒TMV)或细菌载体(例如钛或pBR322质粒)；或动物细胞系统。
载体(如腺病毒载体)中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)，这些与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件在强度和特异性方面可能有所不同。根据所采用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件(其包括组成型和诱导型启动子)。例如，可将编码一种或多种肿瘤抗原(例如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的序列连接到由晚期启动子和三重前导序列组成的Ad转录/翻译复合物中。可在病毒基因组的非必要的E1或E3区域中进行插入操作来获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan J等人，Proc.Natl.Acad.Sci[美国国家科学院院刊]，1984；87:3655-59)。另外，转录增强子(诸如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子)可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
还可使用特定起始信号来实现编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位)的序列的更有效的翻译。这样的信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列的序列插入合适的表达载体中的情况下，可能不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其一部分的情况下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确的阅读框中，以确保翻译整个插入。外源翻译元件和起始密码子可能有多种来源(天然和合成的)。可通过包含适于所用特定细胞系统的增强子来增强表达效率，比如文献中所述的那些(Scharf D.等人，ResultsProbl.Cell Differ.[细胞分化的结果与问题]1994；20:125-62)。也可以掺入用于转录或翻译的特定终止序列，以实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
使用对产物特异性的多克隆或单克隆抗体来检测和测量多核苷酸编码产物(例如，一种或多种肿瘤抗原，如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)表达的多种方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。对于某些应用而言，利用对给定多肽上的两个非干扰性表位具有反应性的单克隆抗体的基于双位点、单克隆的免疫测定法可能是优选的，但也可以采用竞争性结合测定。这些测定法和其他测定法在下列文献中进行了描述：Hampton R等人(1990年，Serological Methods[血清学方法，实验室手册]，美国物理协会出版社(APSPress)，明尼苏达圣保罗以及Maddox DE等人，J.Exp.Med.[实验医学]，1983年；758:1211-16)。
在某些实施例中，增加所需肿瘤抗原(比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的表达的元件可整合入表达构建体或如本文所述的载体腺病毒载体的核酸序列中。这些元件包括内部核糖体结合位点(IRES；Wang等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol[微生物学和免疫学最新话题]，1995年；203:99；Ehrenfeld等人，Curr.Top.Microbiol.Immunol[微生物学和免疫学最新话题]，1995年；203:65；Rees等人，Biotechniques[生物科技]，1996年；20:102；Sugimoto等人，Biotechniques[生物科技]，1994年；2:694)。内部核糖体进入位点(IRES)可提高翻译效率。同样，其他序列可以增强表达。对于一些基因来说，尤其是在5’端的序列抑制了转录和/或翻译。这些序列通常是可以形成发夹结构的回文。通常缺失了待递送核酸中的任何此类序列。测定转录物或翻译产物的表达水平以确认或确定哪些序列影响表达。转录物水平可以通过任何已知方法测定，包括Northern印迹杂交、RNase探针保护等。蛋白质水平可以通过任何已知的方法来测定，包括ELISA。
如本领域技术人员所知，包括异源核酸序列的载体(如本文所述的腺病毒载体)可使用本领域已知的重组技术来产生，比如下列文献中所述的技术：Maione等人，Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊]，2001年；98:5986-91；Maione等人，Hum.Gene Ther.[人类基因疗法]，2000 1:859-68；Sandig等人，Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，2000年；97:1002-07；Harui等人，Gene Therapy[基因疗法]，2004年；11:1617-26；Parks等人，Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，1996年；93:13565-570；DelloRusso等人，Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，2002年；99:12979-984；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验手册]，约翰威立父子出版集团，纽约，NY)。
XI.药物组合物
在某些方面中，可提供药物组合物，该药物组合物包括编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸序列，针对该抗原可产生免疫应答。例如，肿瘤抗原可包括但不限于HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位，或与本文所述或本领域可用的一种或多种其他肿瘤抗原组合。
例如，本文所述的腺病毒载体储备物可与合适的缓冲液、药学上可接受的载体、赋形剂等组合。在某些实施例中，可在合适的缓冲液中施用适当数量的腺病毒载体颗粒，比如，在无菌PBS中。在某些实施例中，期望胃肠外、静脉内、肌内或甚至腹膜内递送本文公开的腺病毒载体组合物。
在某些实施例中，可在水中适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合来制备药物组合物的游离碱或药理学上可接受的盐的溶液。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在其他实施例中，E2b缺失的腺病毒载体可以丸剂形式来通过吞咽或通过栓剂进行递送。
适于注射用途的示例性药物形式包括用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉末(例如，参见美国专利申请号5,466,468)。在所有情况下，该剂型必须是无菌的，且必须是流动性的，以达到易于注射的程度。其必须在生产和储存条件下稳定，并必须进行防腐处理以防微生物(如细菌、霉菌和真菌)的污染。
该载体可以是溶剂或分散介质，其中包含有例如水、脂质、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，可通过使用涂层(例如，卵磷脂)、在分散的情况下保持所需的粒径和/或通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(比如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来促进对微生物作用的预防。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过使用一些成分延迟试剂的吸收，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长注射成分的吸收。
在一个实施例中，为了在水溶液中进行肠胃外施用，可根据需要适当地缓冲溶液，并首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类特定的水溶液特别适用于在静脉内、以及肌内、皮下腹膜内施用。有鉴于此，依据当前公开信息，本领域技术人员将了解该可使用的无菌水介质。例如，可将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，然后添加到1000ml皮下注射液中或在建议的输注部位进行注射(参见，例如，《雷明顿药物科学》第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。此外，对于人类施用，制剂当然优选满足FDA生物学办公室标准所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
该载体还可包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非有任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则可考虑将其用于治疗组合物中。补充性活性成分也可以被用入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不会产生过敏或相似的不良反应的分子实体和组合物。
本文所述的药物组合物施用的途径和频率以及剂量会根据个体、疾病的不同而不同，并可易于使用标准技术来建立起来。一般而言，药物组合物和疫苗可以通过注射(例如，皮内注射、肌内注射、静脉内注射或皮下注射)，鼻内(例如，通过抽吸)，以丸剂形式(例如吞咽，用于阴道或直肠递送的栓剂)来施用。在某些实施例中，可在6周的时间内可施用1至3个剂量，之后可定期进行进一步的加强免疫。
例如，合适的剂量是在如上所述施用腺病毒载体时如本文其他地方所述的腺病毒载体能够促进靶抗原免疫应答的量。在某些实施例中，免疫应答比基础水平(即，未治疗水平)高至少10％-50％。可通过测量患者体内针对靶抗原的抗体或通过疫苗依赖性产生能够在体外杀死表达靶抗原的细胞的溶细胞效应细胞，或通过其他本领域用于监测免疫应答的方法来监测此类应答。该靶抗原是如本文所述的HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位。
通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供预防益处的量提供了腺病毒载体。通常可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估保护性免疫应答，这些测定可使用免疫(疫苗接种)前后从患者那里获得的样品来执行。
在某些方面中，施用给患者或受试者的组合物的实际剂量可通过生理和生理性因素来确定，比如体重、病情严重程度、所治疗疾病的类型、既往或同时发生的治疗干预措施、患者的特发性疾病以及施用途径。无论如何，负责施用的医生将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和个体受试者的一个或多个合适剂量。
尽管本文所述的组合物和方法的一个优点是能够用相同的腺病毒载体进行多次疫苗接种的能力，特别是在对Ad具有预先免疫力的个体中，但本文所述的腺病毒载体还可作为初免和加强方案的一部分来施用。混合模式的引发和增强接种方案可能引起增强的免疫应答。因此，一个方面是一种通过至少一次施用质粒疫苗、允许经过预定长度的时间以及然后通过施用本文所述的腺病毒载体进行加强免疫来用质粒疫苗对受试者进行初免的方法，该质粒疫苗如包括编码一种或多种肿瘤抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸序列的质粒载体。
可以进行多次引发，例如1-3次，尽管可以使用更多。初免和加强免疫之间的时间长度通常可在约六个月到一年之间，但可使用其他时间框架。
在某些实施例中，例如，药物组合物可包括至少约0.1％的治疗剂，比如，本文用作疫苗的表达构建体或载体、相关脂质纳米囊泡或负载有治疗剂的外来体或纳米囊泡。在其他实施例中，该治疗剂可占单元重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，并可在包括其中衍生的任何范围。在其他非限制性示例中，每次施用的剂量还可包括约1微克/千克/体重、约5微克/千克/体重、大约10微克/千克/体重、约50微克/千克/体重、约100微克/千克/体重、约200微克/千克/体重、约350微克/千克/体重、约500微克/千克/体重、约1毫克/千克/体重、约5毫克/千克/体重、约10毫克/千克/体重、约50毫克/千克/体重、约100毫克/千克/体重、约200毫克/千克/体重、约350毫克/千克/体重、约500毫克/千克/体重、至约1000毫克/千克/体重或更高，并包括其中衍生的其他范围。在从本文列出的数字衍生的范围的非限制性示例中，可施用约5微克/千克/体重至大约100毫克/千克/体重、大约5微克/千克/体重至大约500毫克/千克/体重等的范围。
基于预期目标确定药物组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位均包含预定量的药物组合物，该组合物经计算可产生与其施用(即适当的途径和治疗方案)相关的上述讨论所需的应答。根据治疗次数和单位剂量的施用量取决于所需的保护措施或效果。
该药物组合物的精确量还取决于药师的判断，并且是每个个体所特有的。影响该剂量的因素包括患者的身体和临床状况、施用途径、预期的治疗目标(例如缓解症状与治愈)，以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。
在某些方面中，包括本文所述的疫苗方案的组合物可通过任何途径来单独施用或与药学上可接收的载体或赋形剂一起施用，且能够以单个或多个剂量进行此类施用。更具体地，该药物组合物可与各种形式的药学上可接受的惰性载体组合，这些形式包括片剂、胶囊剂、锭剂、糖锭、手工糖果、粉剂、喷雾剂、水悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆等形式。这样的载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水介质和各种无毒的有机溶剂等。此外，这种口服药物制剂可以通过常用的用于该目的的各种类型的试剂适当地进行甜化和/或调味。本文所述的组合物可制成药物并用于治疗有需要的诊断患有疾病(例如，癌症)的人或哺乳动物，或用于增强免疫应答。
在某些实施例中，本文所述的病毒载体或组合物可与一种或多种免疫刺激剂(例如佐剂)来组合施用。免疫刺激剂实质上是指能增强或强化对抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。有一类免疫刺激剂中包含佐剂。许多佐剂均包含旨在保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及刺激免疫应答的物质，诸如脂质A、百日咳博德特氏菌或结核分枝杆菌衍生的蛋白质。某些佐剂可从市场购得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室)；默克佐剂65(默克股份有限公司(Merckand Company,Inc.))AS-2(史克必成公司(SmithKline Beecham))；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(铝)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰脂质A和植物皂甙(quil A)。细胞因子(比如，GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和/或IL-32和其他类似生长因子的物质)也可用作佐剂。
在某些实施例中，佐剂组合物可以是主要诱导Th1型免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导细胞介导的针对所施用抗原的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)往往有利于诱导体液免疫应答。在应用本文提供的疫苗后，患者可能会产生包括Th1和/或th2型应答在内的免疫应答。在应答主要为Th1型的某些实施例中，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平有更大程度的提升。此类细胞因子的水平可以很容易地用标准测定法来评估。因此，各个实施例涉及使用与复制缺陷型病毒载体治疗同时提供的细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23和/或IL-32)来引起针对靶抗原(例如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的免疫应答的疗法在某些实施例中，将细胞因子或编码细胞因子的核酸与本文所述的复制缺陷型病毒一起施用。在某些实施例中，细胞因子在病毒载体施用之前或之后进行施用。在一些实施例中，能够产生针对靶抗原(例如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的免疫应答的复制缺陷型病毒载体还包括编码细胞因子的序列。
引起主要的Th1型应答的某些示例性佐剂包括了例如单磷酰基脂质A，诸如3-脱-O-酰化的单磷酰基脂质A与铝盐的组合。佐剂是可商购的(参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也主要诱导Th1应答。(参见，例如，WO 96/02555，WO 99/33488和美国专利号6,008,200以及5,856,462)。也可以使用免疫刺激性DNA序列。
在一些实施例中使用的另一种佐剂包括皂苷，例如植物皂甙或其衍生物，包括QS21和QS7(阿奎拉制药公司(Aquila BiopharmaceuticalsInc.))，七叶皂苷；洋地黄皂苷；或满天星或藜麦皂苷。其他制剂可以在佐剂组合中包括超过一种的皂苷，例如，以下组中至少两种的组合，所述组包括QS21，QS7，植物皂甙，β-七叶皂苷或洋地黄皂苷。
在某些实例中，所述组合物可通过鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他喷雾剂设备进行施用。也可采用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰甘油复合物进行施用(例如可参见，美国专利号5,725,871)。同样，还可采用聚四氟乙烯支持基质形式的示例性透粘膜进行施用(例如可参见，美国专利号5,780,045)。
脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡等可用于将本文所述的组合物引入合适的热细胞/生物中。本文所述的组合物可通过被配制用于包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等之内进行施用。另外，本文所述的组合物可以以共价键或非共价键结合到此类运载工具的表面。脂质体可有效地用于将基因、各种药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应子等引入各种培养的细胞系和动物中。此外，脂质体的使用似乎与全身免疫后的自身免疫应答或不可接受的毒性无关。在一些实施例中，脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发地形成多层同心双层囊泡(即多层囊泡(MLV))。
在一些实施例中，提供了本文所述的组合物或载体的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可通过稳定和可再现的方式截留药物组合物。为了避免因细胞外聚合物超载而引起的副作用，可使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸约为0.1μm)。
在某些方面中，可以与本文提供的一种或多种疗法(具体地一种或多种包括编码一种或多种靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸序列的腺病毒载体)组合来将包括IL-15的药物组合物来施用给有需要的个体。
白介素15(IL-15)是与IL-2结构相似的细胞因子。如同IL-2，IL-15结合并通过由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同的γ链(γ-C，CD132)组成的复合物来发出信号。一种或多种病毒感染后，IL-15由单核吞噬细胞(和其他一些细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；先天免疫系统的细胞的主要作用是杀死病毒感染的细胞。
IL-15可在临床前模型中增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫力。一项评估IL-15在转移性黑素瘤和肾细胞癌(肾癌)患者中的安全性、剂量和抗肿瘤功效的I期临床试验已开始在美国国立卫生研究院招募患者。
本文公开的IL-15还可包括经修饰以维持其天然形式的功能的IL-15突变体。
IL-15是14-15kDa糖蛋白，其在小鼠中由4号染色体的34kb区域4q31和由8号染色体的中央区域编码。人IL-15基因包括9个外显子(1-8和4A)和8个内含子，其中4个(外显子5至8)编码成熟蛋白。已报道了该基因中编码相同蛋白质的两个剪接的转录变体。最初鉴定的同工型(其具有48个氨基酸的长信号肽(IL-15LSP))由316bp 5'非翻译区(UTR)、486bp编码序列和C末端400bp 3'-UTR区组成。另一个同工型(IL-15SSP)具有由外显子4A和5编码的21个氨基酸的短信号肽。两种同工型在N端的信号序列之间共有11个氨基酸。尽管两种同工型均产生相同的成熟蛋白，但它们的细胞运输却不同。在高尔基体[GC]，早期内体和内质网(ER)中鉴定出IL-15LSP同工型。其以两种形式存在，分泌并具体地膜结合在树突状细胞上。另一方面，IL-15SSP同工型未被分泌，其似乎局限于细胞质和细胞核，其中其在细胞周期的调节中起着重要作用。
在小鼠中通过可变剪接产生了IL-15mRNA的两种同工型已得到证实。具有包含另一个3'剪接位点的替代性外显子5的同工型展现出很高的翻译效率，且产物在N端的信号序列中缺少疏水结构域。这表明衍生自该同工型的蛋白质位于细胞内。通过替代性外显子5的整体剪接产生的具有正常外显子5的其他同工型可在细胞外释放。
尽管IL-15mRNA可在包括肥大细胞、癌细胞或成纤维细胞在内的许多细胞和组织中找到，但是这种细胞因子主要是由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞产生的成熟蛋白。IL-15mRNA的广泛出现与有限的蛋白质产量之间的这种差异可能是由于人类中有十二个而小鼠中有五个上游密起始码子，并且它们可抑制IL-15mRNA的翻译。翻译性无活性的mRNA存储在细胞内，并可在特定信号下被诱导。IL-15的表达可由细胞因子(比如，GM-CSF、双链mRNA、未甲基化的CpG寡核苷酸、脂多糖(LPS))通过Toll样受体(TLR)、干扰素γ(IFN-γ)或在单核细胞疱疹病毒、结核分枝杆菌和白色念珠菌感染后来得到刺激。
XII.自然杀伤(NK)细胞
在某些实施例中，可提供天然或工程化的NK细胞来与本文所述的基于腺病毒载体的组合物或免疫疗法组合来施用给有需要的受试者。
免疫系统是由不同种类的免疫细胞组成的织锦，每一种免疫细胞在防止感染和疾病方面都有其独特的作用。在这些免疫细胞中，自然杀伤细胞(NK)是人体的第一道防线。在没有事先被其他支持分子接触或者激活的情况下，NK细胞具有快速寻找和破坏异常细胞(诸如癌症或病毒感染细胞)的先天能力。与适应性免疫细胞(诸如T细胞)相比，NK细胞已在第一阶段临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗方法，并已显示出对癌症的肿瘤杀伤能力。
1.aNK细胞
除了天然NK细胞之外，还可以提供NK细胞，用于对不表达杀伤细胞抑制性受体(KIR)的患者施用，其经常利用那些病变细胞来逃避NK细胞的杀伤功能。这种独特的激活的NK或aNK缺少这些抑制性受体，同时保留了能够选择性靶向和杀死病变细胞的大量激活的受体。aNK细胞还携带较大的颗粒酶和穿孔素颗粒。从而使它们能够将致命的酶有效载荷传递给多个靶向。
2.taNK细胞
嵌合抗原受体(CAR)技术是目前正在开发的最新型癌症治疗方法之一。CAR是使免疫效应细胞靶向展示特定表面抗原(靶向激活的自然杀伤细胞)的癌细胞的蛋白质，其作为一个平台，其中用一种或多种CAR来改造aNK细胞，以靶向癌症上发现的蛋白质，然后将其与各种CAR整合在一起。与使用患者或供体来源的效应细胞(诸如自体T细胞)的其他CAR方法相比，该策略具有多个优点，尤其是在可扩展性、质量控制和一致性方面。
大部分癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，其中效应免疫细胞附着到抗体上，其反过来结合到靶向癌细胞上，从而通过效应细胞促进杀伤癌症。NK细胞是体内针对ADCC的关键效应细胞，利用特殊的受体(CD16)结合到抗体。
3.haNK细胞
研究表明，可能只有20％的人会统一表达CD16(haNK细胞)的“高亲和力”变异体，与具有“低亲和力”CD16的患者相比，这与更有利的治疗结果密切相关。此外，由于化疗、疾病本身或其他因素，许多癌症患者的免疫系统严重衰弱。
在某些方面中，将NK细胞修饰成表达高亲和力CD16(haNK细胞)。正因如此，haNK细胞可能会增强对抗癌细胞的广谱抗体治疗效果。
XIII.组合疗法
可将包括基于腺病毒载体的疫苗接种的组合物配制成一种药物并用于治疗有需要或诊断患有疾病(例如，癌症)的人或哺乳动物，该基于腺病毒载体的疫苗接种包括编码肿瘤抗原(比如，全文所述的HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合)的核酸序列。可将这些药物与一种或多种其他疫苗或其他针对人类或哺乳动物的癌症疗法共同施用。
在其他实施例中，本发明提供了用于进一步组合疗法的组合物，其中包括Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗、IL-15超激动剂(例如ALT-803)以及以下一种或多种药剂：化疗剂、共刺激分子、检查点抑制剂、针对特定抗原(例如HER3)的抗体、工程化的NK细胞或其任意组合。例如，本发明提供了一种治疗有需要的个体中表达HER3的癌症的方法，该方法包括：向该个体施用第一药物组合物、向该个体施用IL-15超激动剂(比如ALT-803)以及向该个体施用抗HER3抗体和工程化的NK细胞，该第一药物组合物包括复制缺陷型载体，该复制缺陷型载体包括编码HER3抗原或其合适的抗原的核酸序列。在一些实施例中，该方法还可包括向个体施用VEGF抑制剂、化疗或其组合。在其他实施例中，该方法可以进一步包括对个体工程NK杀伤细胞和检查点抑制剂施用。化疗药物、共刺激分子、检查点抑制剂、针对特定抗原的抗体(例如HER3)或工程化的NK细胞的任意组合可与编码抗原(例如HER3)的Ad5[E1-，E2b-]疫苗和IL-15超激动剂或超激动剂复合物(例如ALT-803)一起包括在组合疗法内。
在某些实施例中，本文使用的化疗是卡培他滨、亚叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂、氟嘧啶、伊立替康、丝裂霉素、雷戈拉非尼、西妥昔纳、帕尼图马、阿西替诺芬或其组合。在特定实施例中，本文使用的化疗是FOLFOX(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)或卡培他滨。在某些实施例中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗。在某些实施例中，VEGF抑制剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。下文将进一步详细描述可与复制缺陷型载体和ALT-803一起用于联合治疗的试剂。
在某些方面中，如本文所述的药物可与一种或多种可用于乳腺癌的疗法组合，例如，常规的癌症疗法，比如手术、放疗或药物(激素阻断疗法、化疗或单克隆抗体)。在一些实施例中，本文所述的任何疫苗(例如，Ad5[E1-,E2b-]-HER3)都可与低剂量化疗或低剂量放疗联合使用。例如，在一些实施例中，本文所述的任何疫苗(例如，Ad5[E1-,E2b-]-HER3)可与化疗组合，使得化疗的施用剂量低于临床护理标准。在一些实施例中，该化疗可以是环磷酰胺。可以低于临床护理剂量的剂量来施用环磷酰胺。例如，可每两周在第1-5天和8-12天一天两次地(BID)以50mg施用化疗，共施用8周。在一些实施例中，本文所述的任何疫苗(例如，Ad5[E1-,E2b-]-HER3)可与放疗组合，使得放疗的施用剂量低于临床护理标准。例如，在一些实施例中，可在第8、22、36、50天(每2周施用4剂)同时进行8Gy的立体定向放疗(SBRT)。可使用SBRT对所有可行的肿瘤部位进行放疗。
在某些方面中，用于乳腺癌治疗的药物包括激素阻断剂、化疗和单克隆抗体。一些乳腺癌需要雌激素才能继续生长。可通过它们表面上存在的雌激素受体(ER+)和孕激素受体(PR+)(有时统称为激素受体)来鉴定它们。这些ER+癌症可用能阻断受体的药物(例如他莫昔芬)来治疗，也可替代地使用芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑或来曲唑)来阻断雌激素的产生。推荐使用他莫昔芬十年。芳香酶抑制剂对绝经后的女性有用；但是，在这一组中，它们显得优于他莫昔芬。这是因为绝经后的妇女中的活性芳香酶不同于绝经前的妇女中的普遍形式，因此这些药剂在抑制绝经前的妇女的主要芳香酶方面是无效的。
化疗主要用于2-4期的乳腺癌病例，对雌激素受体阴性(ER-)疾病特别有益。化疗药物进行组合施用，通常为3-6个月。最常见的治疗方案之一，称为“AC”，其将环磷酰胺与阿霉素联用。有时会添加紫杉烷类药物，例如多西紫杉醇(Taxotere)，所以这种治疗方案后来被称为“CAT”。另一种常见的治疗方法是环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶(或“CMF”)。大多数化疗通过破坏复制后的DNA损伤或其他机制破坏快速生长和/或快速复制的癌细胞来发挥作用。但是，药物也会损害快速生长的正常细胞，从而可能会导致严重的副作用。例如，对心肌的损害是阿霉素最危险的并发症。
HER2/neu是单克隆抗体曲妥珠单抗(作为赫赛汀销售)的靶标。曲妥珠单抗是一种针对HER2/neu的单克隆抗体(在某些乳腺癌细胞中特别活跃的细胞受体)，其已将1-3期HER2/neu阳性乳腺癌的5年无病存活率提高至约87％(总存活率95％)。对于所有同时接受化疗的HER2/neu阳性乳腺癌患者，建议一年的曲妥珠单抗治疗。
当受到某些生长因子刺激时，HER2/neu引起细胞生长和分裂；在没有生长因子刺激的情况下，该细胞通常会停止生长。25％至30％的乳腺癌过表达了HER2/neu基因或其蛋白产物，而HER2/neu在乳腺癌中的过表达与疾病复发和预后较差有关。当曲妥珠单抗与过表达HER2/neu的乳腺癌细胞中的该受体结合时，曲妥珠单抗会阻止生长因子结合并刺激受体，从而有效地阻断癌细胞的生长。曲妥珠单抗与HER2/neu结合的一个重要的下游作用是p27的增加，p27是一种阻止细胞增殖的蛋白质。因此，曲妥珠单抗可用于HER2/neu扩增/过表达的乳腺癌患者。
另一种抑制HER2/neu和HER3受体二聚化的单克隆抗体帕妥珠单抗(Pertuzumab)于2012年6月获FDA批准与曲妥珠单抗联合使用。
此外，NeuVax(Galena Biopharma)是一种基于肽的免疫疗法，其可指导“杀手”T细胞靶向并破坏表达HER2/neu的癌细胞。其已经进入了3期临床试验。
已发现到，与ER-/HER2/neu+乳腺癌相比，ER(雌激素受体阳性)/HER2/neu+的患者实际上可能会从抑制PI3K/AKT分子途径的药物中受益更多。
HER2/neu的过表达也可通过其他基因的扩增来抑制。当前正在进行研究以发现哪些基因可能具有这种期望的作用。
HER2/neu的表达受雌激素受体信号传导的调节。通常，通过雌激素受体起作用的雌二醇和他莫昔芬下调HER2/neu的表达。然而，当辅助激活剂AIB-3的比例超过辅抑制物PAX2的比例时，在存在他莫昔芬的情况下HER2/neu的表达得到上调，从而导致对他莫昔芬耐药的乳腺癌。
在某些方面中，本文所述的这些药物可与本文所述的一种或多种常规癌症疗法或替代性癌症疗法或免疫途径检查点调节剂组合。涉及基于腺病毒载体的药物的该组合疗法可用于治疗任何癌症，特别是乳腺癌或不可切除的、局部晚期或转移性癌症。
常规的癌症疗法包括选自以下组中的一种或多种：基于化学或放射的治疗和手术。例如，化疗包括顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴嗪、甲氧乙胺、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、通古霉素、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨、那韦尔滨、法呢基蛋白转移酶抑制剂、跨铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤，或前述的任何类似物或衍生物。
引起DNA损伤并已被广泛使用的放疗包括众所周知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也可考虑其他形式的DNA破坏因子，例如微波和紫外线辐射。所有这些因子最有可能对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护造成广泛的损害。X射线的剂量范围从50到200伦琴或10到500伦琴的日剂量持续一段时期(3-4周)直到2000到6000伦琴或1000到8000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围差异很大，且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型以及赘生性细胞的吸收程度。
当应用于细胞时，术语“接触的”和“暴露的”在本文中用于描述将治疗性构建体和化疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置的过程。为了实现杀伤或停滞细胞，两种药剂以有效杀死细胞或阻止其分裂的组合量而递送至细胞。
约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，这包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可与其他疗法(例如本文所述的疗法、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用的癌症疗法。
治愈性手术包括切除手术，在该手术中，全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除术是指至少切除部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。还考虑到本文描述的治疗方法可与浅表癌、癌前病变或偶然量的正常组织的去除结合使用。
切除所有癌细胞、组织或肿瘤的一部分后，体内可能会形成空腔。可通过对该区域用其他抗癌剂进行灌注、直接注射或局部来完成治疗。例如，可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、23或24月重复此类治疗。这些治疗在剂量上也有变化。
替代的癌症疗法包括除手术、化疗和放疗以外的任何癌症疗法，比如免疫疗法、基因疗法、激素疗法或其组合。使用本方法鉴定出预后不良的受试者可能对单独的一种或多种常规治疗没有良好的应答，并可对该受试者本身开处方或施用一种或多种替代性癌症疗法或与一种或多种常规疗法组合。
通常，免疫疗法依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。例如，免疫效应子可以是对肿瘤细胞表面上的某些标志物具有特异性的抗体。该抗体单独可充当疗法的效应子，或可募集其他细胞来实际实现细胞杀伤。该抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并仅用作靶向剂。可替代地，该效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子与肿瘤细胞靶标直接或间接相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
基因疗法是将多核苷酸(包括DNA或RNA)插入受试者的细胞和组织中以治疗疾病。反义疗法也是基因疗法的一种形式。可在第一次癌症治疗之前、之后或同时来施用治疗性多核苷酸。在一些实施例中提供了编码多种蛋白质的载体的递送。例如，外源性肿瘤抑制癌基因的细胞表达将发挥其抑制过度细胞增殖的功能，例如p53、p16和C-CAM。
用于改善治疗功效的其他药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接上调的试剂、细胞生长抑制和分化剂、细胞粘附抑制剂或增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的试剂。免疫调节剂包括：肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还考虑到，细胞表面受体或其配体(比如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)的上调将通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌作用来增强凋亡诱导能力。通过增加GAP连接数来增加细胞间信号传导将增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施例中，细胞抑制剂或分化剂可与本文所述的药物组合物组合使用，以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂可改善本文所述的药物组合物的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。还考虑到，可将增加过度增殖性细胞对凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)与本文所述的药物组合物组合使用，以改善治疗功效。
激素疗法也可与先前描述的任何其他癌症疗法结合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症(比如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌)，以降低某些激素的水平或阻断某些激素的作用，例如睾丸激素或雌激素。这种治疗通常与至少一种其他癌症疗法结合使用，以作为治疗的选择或降低转移的风险。
如本文所用的“化疗剂”或“化学治疗化合物”及其语法等同物可以是可用于治疗癌症的化学化合物。可与公开的T细胞组合使用的化疗癌症药剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱、长春地辛以及NaelbineTM(长春瑞滨，5’-去甲肾上腺素)。在有一些其他实施例中，化疗癌症药剂包括拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物。本文使用的“喜树碱化合物”包括CamptosarTM(伊立替康盐酸盐)、HycamtinTM(拓扑替康盐酸盐)和其他衍生自喜树碱及其类似物的化合物。可用于本文公开的方法和组合物中的另一类化疗癌症药剂是鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷、替尼泊苷和米托泊齐德。
在某些方面中，本文所述的方法和组合物还包括使用称为烷基化剂的其他化疗癌症药剂，其可将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥末、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁斯汀、尿嘧啶芥末、氯苯丙嗪和达卡巴嗪。本发明包括抗代谢物作为化疗剂。这些类型的药剂的实例包括阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和普卡巴嗪。
可用于本文公开的方法和组合物中的化疗癌症药剂的另一类包括抗生素。实例包括但不限于阿霉素、博来霉素、放线菌素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。对于这些化合物，有许多脂质体配制品可商购。在某些方面中，本文所述的方法或组合物还包括使用其他化疗癌症药剂，其包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、氨曲林、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。
本文公开的腺病毒疫苗可与其他抗赘生药剂来组合施用，这些药剂包括细胞毒性/抗赘生药剂和抗血管生成药剂。细胞毒性/抗赘生药剂可以定义为攻击和杀死癌细胞的药物。一些细胞毒性剂/抗肿瘤剂是使赘生性细胞中的遗传物质烷基化的烷化剂，该烷化剂例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基噻替派、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、洛莫司丁(belustine)、乌拉莫司汀(uracil mustard)、chlomaphazin和达卡嗪(dacabazine)。其他细胞毒性剂/抗瘤形成剂是针对赘生性细胞的抗代谢物，例如，胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤(mercaptopuirine)、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其他细胞毒性剂/抗赘生药剂是抗生素，例如多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、光神霉素、丝裂霉素、霉菌素C、和道诺霉素。对于这些化合物，有许多脂质体配制品可商购。还有其他细胞毒性剂/抗赘生药剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。杂类细胞毒性剂/抗赘生药剂包括紫杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪，氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌、和长春地辛。
可将其他包括CAR T细胞、T细胞受体工程化的T细胞、B细胞受体工程化的细胞的一个或多个群体的制剂在本文所述的药物组合物的施用之前或之后结合使用施用给受试者。当实施本文所述的方法时，可将治疗有效的过继转移细胞群施用给受试者。通常，施用的制剂包括约1x 104至约1x 1010个CAR T细胞、T细胞受体工程化的细胞或B细胞受体工程化的细胞。在一些情况下，该制剂包括约1x 105至约1x 109个工程化的细胞、约5x 105至约5x 108个工程化的细胞或约1x 106至约1x 107个工程化的细胞。然而，施用给受试者的工程化的细胞的数量将在很宽的范围内变化，这具体取决于癌症的位置、来源、身份、范围和严重程度、要治疗的受试者的年龄和状况等。医师最终将确定要使用的适当剂量。
也可采用抗血管生成剂。依据已公开的方法和组合物，可使用且合适的抗血管生成剂包括了抗VEGF抗体(其包括了人源化和嵌合抗体)，抗VEGF适体和反义寡核苷酸。其他血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。还可以使用小分子，包括拓扑异构酶如雷佐生(razoxane)，该雷佐生是具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
在一些情况下，例如，在治疗癌症的组合物、制剂和方法中，施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg或由此得出的任何中间值或范围。在一些情况下，施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100克或从中得出的任何中间值或范围。
XIV.免疫融合配偶体抗原靶标
本文所述的病毒载体或组合物还可包括编码蛋白质的核酸序列，或“免疫融合配偶体”，该免疫融合配偶体可增加靶抗原(比如，HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合)或本文公开的任何其他靶抗原的免疫原性。在这方面，在用含有该蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是包含所述目的靶抗原的融合蛋白，所述靶抗原融合到增加所述目的靶抗原的免疫原性的蛋白质上。此外，与编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的组合疗法可导致应答免疫增强，使得与编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4的Ad5[E1-,E2b-]或其组合的载体单独或免疫融合配偶体单独相比，两种治疗部分的组合具有协同增强免疫应答的作用。例如，与编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4的Ad5[E1-,E2b-]或其任何组合的载体以及免疫融合配偶体的组合疗法可导致协同增强抗原特异性效应CD4+和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤感染细胞的NK细胞应答的刺激、以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制来对针对杀伤感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答的刺激，或其任意组合。在向有此需要的受试者施用后，这种协同促进作用可大大改善存活结果。在某些实施例中，与对照相比，编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的联合疗法可在产生免疫应答，所述免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中产生约1.5至20倍或更多倍的靶抗原特异性CTL活性增加。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括在施用编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的受试者中靶特异性CTL活性提高约1.5至20倍，甚至更多倍。在一个其他实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括如通过ELISpot测定细胞因子(如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其他细胞因子)分泌的方法测得的靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加了1.5到20倍或更多倍。在一个其他实施例中，与适当的对照相比，产生免疫应答包括在施用编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以及如本文所述的免疫融合配偶体的受试者中使靶特异性抗体的产生增加1.5到5倍。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体的产生增加约1.5到20或更多倍。
作为一个其他实例，编码靶表位抗原的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的组合疗法可导致协同增强抗原特异性效应CD4+和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤感染细胞的NK细胞应答的刺激、以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制对针对杀伤感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答的刺激或其任意组合。在向有此需要的受试者施用后，这种协同促进作用可大大改善存活结果。在某些实施例中，与对照相比，编码靶表位抗原的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的联合疗法可在施用腺病毒载体的受试者中产生约1.5至20倍或更多倍的靶抗原特异性CTL活性增加的免疫应答。在另一个实施例中，与对照组相比，产生免疫应答包括在施用编码靶表位抗原的Ad5[E1-,E2b-]载体以及免疫融合配偶体的受试者中靶特异性CTL活性增加约1.5至20倍，甚至更多倍。在一个其他实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括如通过ELISpot测定细胞因子(如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其他细胞因子)分泌的方法测得的靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加了1.5到20倍或更多倍。在一个其他实施例中，与适当的对照相比，产生免疫应答包括在施用本文所述的腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体的产生增加约1.5到5倍。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中靶特异性抗体的产生增加约1.5到20或更多倍。
在一个实施例中，这种免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属，诸如结核分枝杆菌来源的Ra12片段。来源于分枝杆菌属的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:22中列出的任何序列。Ra12组合物及其用于增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的方法在美国专利第7,009,042号中有描述，该专利全文通过引入的方式并入本文。简言之，Ra12是指结核分枝杆菌MTB32A核酸的一个子序列的多核苷酸区域。MTB32A是一种32kDa的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌强毒株和无毒株中的基因编码。已经描述了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(参见，例如，美国专利号7,009,042；Skeiky等人,Infection andImmun.67:3998-4007(1999)，其在此通过引用的方式并入本文)。MTB32A编码序列的C末端片段可以高水平表达，并在整个纯化过程中保持为可溶性多肽。此外，Ra12可增强与之融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽能够包含与MTB32A的氨基酸残基192-323相对应的14kDa C末端片段。其他Ra12多核苷酸通常能够包含编码Ra12多肽一部分的至少约15、30、60、100、200、300或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可以包含天然序列(即编码Ra12多肽或其一部分的内源序列)，或者可以包含这种序列的变体。Ra12多核苷酸变体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物活性相对于包含天然Ra12多肽的融合多肽而言不会显著降低。变体可以与编码天然Ra12多肽或其一部分的多核苷酸序列具有至少约70％、80％或90％或更多的同一性。
在某些方面，免疫融合配偶体能够衍生自蛋白D，即革兰氏阴性杆菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白。由蛋白D衍生的免疫融合配偶体能够为SEQ ID NO:23中所示的序列。在某些情况下，蛋白质D衍生物包含蛋白质的大约前三分之一(例如，N末端前100-110个氨基酸)。蛋白质D衍生物可以脂质化。在某些实施例中，脂蛋白D融合配偶的前109个残基包含在N端，以向多肽提供额外的外源性T细胞表位，这可以增加在大肠杆菌中的表达水平，并且可以起到表达增强子的作用。脂质尾可以确保抗原向抗原呈递细胞的最佳呈递。其他融合配偶可以包括流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般而言，使用N-末端81个氨基酸，尽管可以使用包括T-辅助表位的不同片段。
在某些方面，免疫融合配偶体可以是被称为LYTA的蛋白质或其一部分(特别是C末端部分)。衍生自LYTA的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:24中列出的任何一个序列。LYTA来源于肺炎链球菌，肺炎链球菌合成一种被称为酰胺酶LYTA(由LytA基因编码)的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶。LYTA是一种自溶蛋白，其专门降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白的C末端结构域负责对胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和力。这一特性已探索用于表达大肠杆菌C-LYTA的质粒的开发，该质粒可用于融合蛋白的表达。可以使用在氨基末端含有C-LYTA片段的杂交蛋白的纯化。在另一个实施例中，LYTA的重复部分可以掺入融合多肽中。例如，可以在从残基178开始的C末端区域中发现重复部分。一个特定的重复部分包含残基188-305。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。靶抗原融合可产生与IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1,和MIF中的一种或多种基本相同的蛋白质。靶抗原融合可以编码核酸，该核酸编码与IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1,和MIF中的一种或多种基本相同的蛋白质。在一些实施例中，靶抗原融合进一步包含一种或多种免疫融合配偶体，在本文中也被称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。IFN-γ的序列可以是但不限于SEQ ID NO:25中规定的序列。TNFα的序列可以是但不限于SEQ ID NO:26中规定的序列。IL-2的序列可以是但不限于SEQ IDNO:27中规定的序列。IL-8的序列可以是但不限于SEQ ID NO:28中规定的序列。IL-12的序列可以是但不限于SEQ ID NO:29中规定的序列。IL-18的序列可以是但不限于SEQ ID NO:30中规定的序列。IL-7的序列可以是但不限于SEQ ID NO:31中规定的序列。IL-3的序列可以是但不限于SEQ ID NO:32中规定的序列。IL-4的序列可以是但不限于SEQ ID NO:33中规定的序列。IL-5的序列可以是但不限于SEQ ID NO:34中规定的序列。IL-6的序列可以是但不限于SEQ ID NO:35中规定的序列。IL-9的序列可以是但不限于SEQ ID NO:36中规定的序列。IL-10的序列可以是但不限于SEQ ID NO:37中规定的序列。IL-13的序列可以是但不限于SEQ ID NO:38中规定的序列。IL-15的序列可以是但不限于SEQ ID NO:39中规定的序列。IL-16的序列可以是但不限于SEQ ID NO:66列出的序列。IL-17的序列可以是但不限于SEQID NO:67中规定的序列。IL-23的序列可以是但不限于SEQ ID NO:68中规定的序列。IL-32的序列可以是但不限于SEQ ID NO:69列出的序列。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，在本文中也称为“免疫原性组分”，其包含选自IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF的细胞因子。在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体共表达，在本文中也称为“免疫原性组分”，包含选自IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体，Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、和MIF的细胞因子。
在一些实施例中，该靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，该免疫融合配偶体包括CpG ODN(非限制性示例序列在SEQ ID NO:40中显示)、霍乱毒素(SEQ ID NO:41中显示了非限制性实例)、来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亚基编码区(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:42)、来源于细菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亚基编码区(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:43)、Hp91(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:44)、CCL20(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:45)、CCL3(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:46)、GM-CSF(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:47)、G-CSF(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:48)、LPS肽模拟物(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:49-SEQ ID NO:60)、志贺毒素(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:61)、白喉毒素(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:62)或CRM197(非限制性示例序列示于SEQ ID NO:65)。
在一些实施例中，靶抗原与包括IL-15超激动剂的免疫融合配偶体融合或连接。白介素15(IL-15)是在病毒感染后，分泌出的一种天然存在的炎性细胞因子。分泌的IL-15可通过其在效应免疫细胞上的同源受体的信号传导来执行其功能，因此可导致效应免疫细胞活性的整体增强。
基于IL-15的刺激和维持细胞免疫应答的广泛能力，将其认为是一种具有潜力的免疫疗法药物，这种免疫疗法药物有望治愈某些癌症。然而，IL-15的临床研究的主要局限性能够包括在标准哺乳动物细胞表达系统的低产量和短血清半衰期。此外，IL-15:IL-15Rα复合物(其包括由同一细胞共同表达的蛋白质，而不是游离的IL-15细胞因子)能够负责刺激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
为了克服这些缺点，鉴定出一种新型的IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)，其具有增强的结合IL-15Rβγc的能力和增强的生物活性。将小鼠或人IL-15Rα和Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)添加到相等摩尔浓度的IL-15N72D可使IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物显示出支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，该浓度比游离IL-15细胞因子的浓度低10倍以上。
在一些实施例中，IL-15超激动剂可以是一种新的IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)。在某些实施例中，将小鼠或人IL-15Rα和Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)添加到相等摩尔浓度的IL-15N72D可使IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物显示出支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，该浓度可比游离IL-15细胞因子的浓度低10倍以上。
因此，在一些实施例中，本发明提供了具有针对支持IL-15依赖性细胞生长的EC50的IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，该EC50比游离的IL-15细胞因子低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
在一些实施例中，已经利用IL-15N72D、可溶性IL-15Rα和Fc融合蛋白的相互作用来产生生物活性蛋白复合物ALT-803。众所周知，在N末端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶性IL-15Rα片段携带大部分负责高亲和力细胞因子结合的结构元件。可溶性融合蛋白能够通过将人类IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的1-65个氨基酸)与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接而产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白具有经由IgG1结构域二硫键形成二聚体和易于使用标准蛋白A亲和层析方法纯化的优点。图1示出了ALT-803超激动剂的示意图。
ALT-803是一种可溶性复合物，该可溶性复合物由与二聚IL-15Rαsushi结构域/人IgG1 Fcfusion蛋白以高亲和力关联的人IL-15变体的2个蛋白质亚基(两个IL-15N72D)组成。IL-15变体是一种114氨基酸多肽，其包含成熟的人IL-15细胞因子序列，在螺旋C N72D的72位具有Asn-Asp取代。人类IL-15R sushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的sushi结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，其与含有Fc区域(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接。除了N72D取代，所有的蛋白质序列都是人类的。基于亚基的氨基酸序列，包含两个IL-15N72D多肽和二硫键连接的同二聚IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白的复合物的计算分子量为92.4 kDa。每个IL-15N720多肽的计算分子量约为12.8 kDa，IL-15RαSu/IgG 1 Fc融合蛋白的计算分子量约为33.4 kDa。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1 Fc蛋白都被糖基化，通过尺寸排阻色谱法得到表观分子量约为114 kDa的ALT-803。针对ALT-803进行测定的等电点(pI)可以在大约5.6到6.5的范围内。因此，融合蛋白在pH 7时可以带负电荷。计算出ALT-803在A280时的摩尔消光系数为116,540M，换言之，一个OD280相当于ALT-803溶液的0.79 mg/mL。
此外，已经证明，与IL-15Rα的细胞内复合物形成防止在内质网中的IL-15降解，并促进其分泌。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中采用共表达方法，可高水平产生IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG1 Fc蛋白，形成可溶性、稳定的复合物。在用IL-15依赖性细胞系进行体外效价测定中，CHO产生的ALT-803复合物的生物活性可与体外组装的IL-15N72D:IL-15RαSu/IgG1Fc复合物相当。因此，本文提供的方法代表了一种产生活性的、完全表征的cGMP级IL-15:IL-15Rα复合物的更好方法，该方法优于单独产生的和在某些情况下重折叠的蛋白质的体外组装目前采用的策略。
最近的研究表明，ALT-803(1)促进先天表型的高效效应NK细胞和CD8+T细胞应答者的发育，(2)能够增强NK细胞的功能，(3)能够在减少肿瘤转移和最终存活方面发挥重要作用，特别是与检查点抑制剂联用时，下面将进一步介绍。
在一些实施例中，IL-15超激动剂或IL-15超激动剂复合物ALT-803可以肠胃外、皮下、肌内、静脉输注、植入、腹膜内或膀胱内施用。在一些实施例中，可以单剂量施用0.1μg-5μg IL-15超激动剂。在一些实施例中，0.1μg-0.2μg、0.2μg-0.3μg、0.3μg-0.4μg、0.4μg-0.5μg、0.5μg-0.6μg、0.6μg-0.7μg、0.7μg-0.8μg、0.8μg-0.9μg、0.9μg-1μg、1μg-1.5μg、1.5μg-2μg、2μg-2.5μg、2.5μg-3μg、3μg-3.5μg、3.5μg-4μg、4μg-4.5μg、或4.5μg-5μg的IL-15超激动剂可单剂量施用。在某些实施例中，1μg ALT-803可以单剂量施用。在一些实施例中，ALT-803可以以约0.1μg/kg至约100mg/kg体重的有效剂量施用，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800或900μg/kg体重或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或者100mg/kg体重。在一些实施例中，IL-15超激动剂可与Ad5[E1-,E2b-]-HER3(例如，截短的或全长HER3)疫苗一起施用。在一些实施例中，IL-15超激动剂可与Ad5[E1-,E2b-]-HER3(例如，截短的或全长HER3)疫苗一起作为混合物来施用。在其他实施例中，IL-15超激动剂可在Ad5[E1-,E2b-]-HER3之前或之后立即以单独的剂量来施用。在其他实施例中，在施用Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗的1天内、2天内、3天内、4天内、5天内或6天内来施用ALT-803。在一些实施例中，在Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗之后的3天施用ALT-803。在一些实施例中，每天连续或数次给予ALT-803，例如，每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每次9小时、每10小时、每11小时或每12小时。ALT-803的日有效剂量包括0.1μg/kg与100μg/kg体重之间，例如0.1、0.3、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或99μg/kg体重。在一些实施例中，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、或每周七次施用ALT-803。ALT-803的有效每周剂量包括0.0001mg/kg与4mg/kg体重之间，例如0.001、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、或4mg/kg体重。ALT-803的剂量可从约0.1μg/kg体重到约5000μg/kg体重；或从约1μg/kg体重到约4000μg/kg体重或从约10μg/kg体重到约3000μg/kg体重。在其他实施例中，ALT-803可以约0.1，0.3、0.5、1、3、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，ALT-803可以约0.5μg化合物/kg体重到约20μg化合物/kg体重的剂量施用。在其他实施例中，剂量可以是大约0.5、1、3、6、10或20mg/kg体重。在一些实施例中，或肠胃外施用的实例中，ALT-803可以以约0.5μg/kg-约15μg/kg(例如，0.5、1、3、5、10或15μg/kg)的剂量施用。
在一些实施例中，在21天的时间段内向接受Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗和ALT-803的组合疗法的有需要的受试者施用一个或多个剂量的Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗和ALT-803。例如，如图2A所示，可在第7、14和21天向有需要的受试者施用Ad-HER3疫苗。此外，有此需要的受试者可以在第10天和第17天施用IL-15超激动剂(ALT-803)。在一些实施例中，在8周的时间段内向接受Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗和ALT-803的组合疗法的有需要的受试者施用一个或多个剂量的Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗和ALT-803。在一些实施例中，可在第3周和第6周向有需要的受试者施用Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗，并可在第1、2、4、5、7和8周向该受试者施用IL-15超激动剂(ALT-803)。因此，在一些实施例中，在完整的给药方案中给予受试者一剂以上的ALT-803。在一些实施例中，可以给予受试者至少1剂、至少2剂、至少3剂、至少4剂或至少5剂IL-15超激动剂。在某些实施例中，可向受试者施用一个低于Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗的剂量的ALT-803。
在一些实施例中，可将IL-15超激动剂(例如ALT-803)编码为与HER3抗原的免疫融合。例如，在一些实施例中，Ad5[E1-，E2b-]疫苗可编码HER3和ALT-803(Ad5[E1-，E2b-]-HER3/ALT-803)。在这些实施例中，在向有需要的受试者进行施用后，编码HER3和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体诱导HER3和ALT-803的表达为具有治疗活性的免疫学融合物。
编码HER3和ALT-803的Ad5[E1-，E2b-]载体的组合疗法可导致免疫应答增强，使得与单独的任一种疗法相比，这两种治疗部分的组合起到协同作用以增强免疫应答。例如，编码HER3的Ad5[E1-,E2b-]载体以及ALT-803的组合疗法可导致协同增强抗原特异性效应CD4+和CD8+T细胞的刺激、针对杀死感染细胞的NK细胞应答的刺激、以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制来对针对杀死感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答的刺激。编码HER3的Ad5[E1-,E2b-]载体和ALT-803的组合疗法可协同地增强以上应答中的任何一种或上述应答的组合，以在向有需要的受试者施用后来大大改善存活结果。
在一些实施例中，IL-15超激动剂是具有两个IL-15N72D分子和可溶性IL-15Rα/Fc融合蛋白二聚体(也称为ALT-803)的生物活性蛋白复合物。在美国专利申请公开2015/0374790中描述了ALT-803的组合物以及生产和使用ALT-803的方法，该专利申请以引入的方式并入本文。众所周知，在N末端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶性IL-15Rα片段可携带大部分负责高亲和力细胞因子结合的结构元件。可溶性融合蛋白能够通过将人类IL-15RαSu结构域(成熟人IL-15Rα蛋白的1-65个氨基酸)与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接而产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白具有通过IgG1区域二硫键合形成二聚体和易于使用标准蛋白A亲和层析方法纯化的优点。
在一些实施例中，ALT-803能够具有由与二聚体IL-15Rαsushi结构域/人类IgG1Fc融合蛋白高亲和力相关联的人类IL-15变体的2个蛋白质亚基组成的可溶性复合物。IL-15变体是一种114氨基酸多肽，其包含成熟的人IL-15细胞因子序列，在螺旋C N72D的72位具有Asn-Asp取代。人类IL-15Rsushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的sushi结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，其与含有Fc区域(232个氨基酸)的人类IgG1 CH2-CH3区域连接。除了N72D取代，所有的蛋白质序列都是人类的。根据亚基的氨基酸序列，包括两个IL-15N72D多肽(示例性IL-15N72D序列如SEQ ID NO:63所示)和二硫键连接的同二聚IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白(示例性IL-15RαSu/Fc结构域如SEQ ID NO:64所示)的复合物的计算分子量为92.4kDa。在一些实施例中，编码靶抗原和ALT-803的重组载体可具有本文所述的任何序列以编码该靶抗原，并可具有任何顺序的SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:64以编码ALT-803。在其他实施例中，可在用编码靶抗原的重组载体进行免疫之前或之后施用作为单独的药物组合物的IL-15超激动剂(例如ALT-803)。在其他实施例中，可将IL-15超激动剂(比如ALT-803)作为蛋白质复合物或编码该蛋白质复合物的重组载体来以单独的药物组合物形式进行施用。
每个IL-15N720多肽的计算分子量约为12.8kDa，IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白的计算分子量约为33.4kDa。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1的Fc蛋白能够被糖基化，从而通过大小排阻色谱法得到约114kDa的表观分子量的ALT 803。针对ALT-803进行测定的等电点(pI)可以在大约5.6到6.5的范围内。因此，融合蛋白在pH 7时可以带负电荷。
编码HER3、HER2/neu、HER1、HER4或其任意组合的Ad5[E1-，E2b-]载体和ALT-803的组合疗法可导致免疫应答增强，使得与单独的任一种疗法相比，这两种治疗部分的组合起到协同作用以增强免疫应答。例如，编码HER3、HER2/neu、HER1或HER4抗原或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以及ALT-803的组合疗法可导致协同增强抗原特异性效应CD4+和CD8+T细胞的刺激、针对杀死感染细胞的NK细胞应答的刺激、以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制对针对杀死感染细胞的中性粒细胞或单核细胞应答的刺激。编码HER3、HER2/neu、HER1或HER4抗原或其任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体和ALT-803的组合疗法可协同地增强以上应答中的任何一种或上述应答的组合，以在向有需要的受试者施用后来大大改善存活结果。
使用本文所述的任何重组载体，通过在同一重组载体中表达免疫原性增强剂和靶抗原，可以将本文所述的任何免疫原性增强剂融合或连接至靶抗原。
编码此类免疫原性增强剂的核酸序列可以是SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:69中的任何一种序列，并在表1中进行了汇总。
表1：免疫原性增强剂的序列
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在一些实施例中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列不被任何核酸分开。在其他实施例中，可将编码接头的核酸序列插入编码本文所述的任何靶抗原的核酸序列和编码本文所述的任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施例中，在用含有靶抗原、接头和免疫融合配偶体的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，其包含目的靶抗原，随后是接头并以免疫融合配偶体结束，从而将靶抗原连接至免疫融合配偶体，该免疫融合配偶体通过接头增加了目的靶抗原的免疫原性。在一些实施例中，接头核酸的序列的长度可以为约1至约150个核酸长、约5至约100个核酸长，或为约10至约50个核酸长。在一些实施例中，核酸序列可以编码一个或多个氨基酸残基。在一些实施例中，接头氨基酸序列的长度可以是约1至约50，或约5至约25个氨基酸残基。在一些实施例中，接头的序列包含少于10个氨基酸。在一些实施例中，接头可以是聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头或具有丙氨酸和甘氨酸两者的接头。
编码此类接头的核酸序列可以是SEQ ID NO:60-SEQ ID NO:84中的任何一个，并在表2中进行了概述。
表2：接头的序列
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XV.共刺激分子
除了使用包含靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的基于重组腺病毒的载体，还可将共刺激分子并入所述疫苗中以增加免疫原性。免疫应答的启动需要至少两种用于通过APC激活幼稚T细胞的信号(Damle等人，J Immunol[免疫学杂志]，148:1985-92(1992)；Guinan等人，Blood[血液]，84:3261-82(1994)；Hellstrom等人，Cancer Chemother Pharmacol[癌症化学药物]，38:S40-44(1996)；Hodge等人，CancerRes[癌症研究]，39:5800-07(1999))。抗原特异性第一信号通过肽/主要组织相容性复合物(MHC)通过T细胞受体(TCR)传递，并使T细胞进入细胞循环。可以传递第二个或共刺激信号用于细胞因子的产生和增殖。
据报道，通常在专门的抗原呈递细胞(APC)表面发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化至关重要的第二信号:B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人CD58)(Damle等人，J Immunol[免疫学杂志]，148:1985-92(1992)；；Guinan等人Blood[血液]84:3261-82(1994)；Wingren等人Crit Rev Immunol[免疫学关键综述]15:235-53(1995)；Parra等人Scand.J Immunol[斯坎地免疫杂志]38:508-14(1993)；Hellstrom等人Ann NY Acad Sci[纽约学术科学年刊]690:225-30(1993)；Parra等人J Immunol[免疫学杂志]158:637-42(1997)；Sperling等人J Immunol[免疫学杂志]157:3909-17(1996)；Dubey等人J Immunol[免疫学杂志]155:45-57(1995)；Cavallo等人Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]25:1154-62(1995))。
这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1β2整联蛋白)复合物相互作用，而LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在一个优选实施例中，期望具有分别包含B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当其与包含一种或多种编码靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸的基于重组像病毒的载体疫苗组合时，将会进一步增加/增强针对特定靶抗原的抗肿瘤免疫应答。
FOLFOX(5-氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂)
一项随机试验(其比较了伊立替康和大剂量氟尿嘧啶加亚叶酸(IFL，对照组合)、奥沙利铂和输注氟尿嘧啶加亚叶酸(FOLFOX)或伊立替康和奥沙利铂(IROX))建立了FOLFOX组合，共施用6个月，作为转移性结肠直肠癌(mCRC)患者一线治疗的护理标准。虽然已经验证了多个FOLFOX的输注时间表，通常命名为“修饰的FOLFOX”，但在该方案的组成细胞毒性剂中没有本质的变化。其中，mFOLFOX6是使用最广泛的一种。
然而，由于渐进性神经毒性，奥沙利铂对患者来说接受6个月以上(12个周期)是非常困难的。尽管6个月的联合治疗仍然是mCRC的护理标准，但临床判断可能会影响到在治疗结束时限制含奥沙利铂周期数的决定。其他试验，包括CAIRO3研究，已经证明在3个月的“诱导”期后停用奥沙利铂的可行性和益处，同时继续使用5-FU和亚叶酸作为“维持”治疗。
贝伐单抗
在一线含5-FU和奥沙利铂的治疗方案中加入贝伐单抗证明可以增加mCRC患者的进展时间，且副作用易于控制，毒性不重叠。后来的试验表明，通过KRAS突变状态，比伐单抗在首次进展后继续使用(与随后的化疗相结合)提高了未选择的一组患者的总体存活率，这导致了其在维持治疗中得到批准使用。
卡培他滨
该药剂是一种前药，口服后通过3步酶法转化为5-氟尿嘧啶。作为口服活性氟嘧啶，卡培他滨已批准用于佐剂环境。在晚期结肠癌的情况下，它已与5-氟尿嘧啶同样有效，尽管手足口综合征的发病率更高。这种药物提供了口服途径的便利性，其优点是减少了患者在维持环境中的输注量，同时在肿瘤内达到高浓度，因为与正常组织相比，肿瘤中胸苷磷酸化酶的浓度更高。
XVI.免疫途径检查点调节剂
在某些实施例中，免疫途径检查点抑制剂与包括本文公开的腺病毒载体的组合物组合。在某些实施例中，患者接受了与本文所述的疫苗或药物组合物的免疫途径检查点抑制剂。在其他实施例中，与一种或多种免疫途径检查点调节剂一起施用组合物。激活和抑制信号之间的平衡调节T淋巴细胞和疾病细胞之间的相互作用，其中T细胞应答通过T细胞受体(TCR)抗原识别启动。该抑制性途径和信号称作免疫途径检查点。在正常情况下，免疫途径检查点在控制和预防自身免疫中发挥关键作用，也应答于病原感染而保护组织免受损伤。
某些实施例提供了组合免疫疗法，该疗法包括基于病毒载体的疫苗和用于调节免疫途径检查点抑制性途径的组合物，以预防和/或治疗癌症和传染病。在一些实施例中，调节增加了基因或蛋白质的表达或活性。在另一些实施例中，调节降低了基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施例中，调节影响了基因或蛋白质家族。
一般情况下，免疫抑制途径由配体-受体相互作用触发。现在，已经很清楚的是，疾病可将免疫检查点途径作为诱导受试者免疫对抗的机制。
给定疾病在受试者中引起的免疫抵抗或免疫抑制途径的诱导可被分子组合物阻断，比如已知可调节一种或多种免疫抑制途径的siRNA、反义、小分子、模拟物、配体、受体或蛋白质或抗体(可以是Ig融合蛋白)的重组形式。例如，免疫检查点蛋白(比如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1))阻滞剂的初步临床发现表明有望增强抗肿瘤免疫力。
由于患病细胞可表达多种抑制性配体，而浸润疾病的淋巴细胞则表达多种抑制性受体，所以免疫途径检查点蛋白的双重或三重阻断可增强抗疾病免疫力。本文提供的组合免疫疗法可包括一种或多种组合物，该一种或多种组合物包括靶向以下一种或多种免疫检查点蛋白的免疫途径检查点调节剂：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(也称为CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(也称为CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(也称为HAVcr2)、GAL9、A2aR和腺苷。
在一些方面，免疫途径检查点调节剂包含siRNA、抗转录疗法、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在进一步的方面，免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单抗。在一些方面，免疫应答增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。
在一些方面，免疫途径检查点调节剂靶向PD1蛋白。在一些方面，免疫途径检查点调节剂包含siRNA、抗转录疗法、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体的重组形式、抗体或其组合。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些方面，免疫途径检查点抑制剂是阿维鲁单抗。在进一步的方面，阿维鲁单抗每周至少一次、至少两次或至少三次施用于所述受试者。在一些方面，在第1周的第1天、第2周的第1天、第4周的第1天、第8周的第1天、第12周的第1天和第16周的第1天施用阿维鲁单抗。在进一步的方面，在施用包含编码抗原的核酸序列的重组腺病毒载体后施用阿维鲁单抗。在进一步的方面，将阿维鲁单抗以包括1mg/kg至20mg/kg的剂量施用于受试者。在又一方面，剂量包括10mg/kg。
在一些实施例中，该分子组合物包括siRNA。在一些实施例中，该分子组合物包括小分子。在一些实施例中，该分子组合物包括配体的重组形式。在一些实施例中，该分子组合物包括受体的重组形式。在一些实施例中，该分子组合物包括抗体。在一些实施例中，所述组合疗法包括一个以上的分子组合物和/或一种以上的分子组合物。如本领域技术人员所知，本公开还包括免疫检查点抑制途径的未来发现的蛋白质。
在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节CTLA4的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节PD1的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节PDL1的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节LAG3的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节B7-H3的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节B7-H4的分子组合物。在一些实施例中，联合免疫疗法包括用于调节TIM3的分子组合物。在一些实施例中，调节是表达的增加或增强。在其他实施例中，调节是表达的缺失或减少。
两个非限制性示例性免疫途径检查点抑制剂包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)。CTLA-4仅在T细胞上表达，其中它调节T细胞活化的早期阶段。CTLA-4与共刺激T细胞受体CD28进行相互作用，这能够产生抑制T细胞活性的信号。一旦出现TCR抗原识别，则CD28信号传导可增强TCR信号传导，这样在某些情况下会导致T细胞活化，而CTLA-4则会抑制CD28的信号传导活性。本发明提供了本文提供的与抗CTLA-4单克隆抗体组合的免疫疗法，用于预防和/或治疗癌症和传染病。本发明提供了本文提供的与CTLA-4分子组合物组合的疫苗或免疫疗法，用于预防和/或治疗癌症和传染病。
程序性死亡细胞蛋白配体-1(PDL1)是B7家族的成员之一，并且其分布在各种组织和细胞类型中。PDL1能够与PD1进行相互作用，进而抑制T细胞活化和CTL介导的裂解。在各类人肿瘤上已显示出PDL1显著的表达，且PDL1表达是肿瘤逃避宿主抗肿瘤免疫应答的关键机制之一。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)作为免疫途径检查点相互作用。这种相互作用可能是导致抗肿瘤免疫应答减弱和随后肿瘤进展的主要耐受机制。Pd1存在于激活的T细胞上，PD1的主要配体PDL1通常在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及包括B细胞在内的其他细胞上表达。PDL1与PD1在T细胞上进行相互作用，进而抑制T细胞活化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解。本发明提供了本文提供的与抗PD1或抗PDL1单克隆抗体组合的免疫疗法，用于预防和/或治疗癌症和传染病。
某些实施例可提供本文提供的与抗PD1或抗PDL1分子组合物组合的免疫疗法，用于预防和/或治疗癌症和传染病。某些实施例可提供本文提供的与抗CTLA-4或抗PD1单克隆抗体组合的免疫疗法，用于预防和/或治疗癌症和传染病。某些实施例可提供本文提供的与抗CTLA-4和PDL1单克隆抗体的组合的免疫疗法。某些实施例可提供本文提供的与抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1单克隆抗体或其组合一起组合的疫苗或免疫疗法，用于治疗癌症和传染病。
免疫途径检查点分子可由T细胞来表达。免疫途径检查点分子可有效地作为充当“制动器”，从而下调或抑制免疫应答。免疫途径检查点分子包括但不限于直接抑制免疫细胞的程序性死亡1(PD1或PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，GenBank登录号：JX049979.1)、B和T淋巴细胞相关(BTLA)(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，GenBank登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为IVSTM3，登录号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305，GenBank登录号：CR542051.1)、SIGLECIO(GenBank登录号：AY358337.1)、自然杀伤细胞受体2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFl、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3。例如，PD1可与基于腺病毒载体的组合物组合，以治疗有需要的受试者。
可靶向的其他免疫途径检查点可以是腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含V-set结构域的T细胞活化抑制剂1(VTCN1)、吲哚胺2,3-二加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个结构域、长胞质尾1(KIR3DL1)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、细胞因子诱导性含SH2的蛋白(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)或其任意组合。
表3非穷举性地显示了示例性的免疫途径检查点基因，所述基因可被灭活以提高如本文所述的基于腺病毒载体的组合物的效率。免疫途径检查点基因可选自表3中列出的此类基因，以及涉及共同抑制受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精氨酸色氨酸饥饿、TCR信号传导、诱导的T-reg抑制，控制耗竭或无能的转录因子以及缺氧介导的耐受性的其他基因。
表3：免疫途径检查点基因的实例
与单独使用任何一种药剂相比，基于腺病毒的载体和免疫途径检查点调节剂的组合可降低治疗患者的疾病的感染、进展或症状。在另一个实施例中，与单独使用任何一种药剂相比，基于腺病毒的载体和免疫途径检查点调节剂的组合可改善治疗患者的整体存活率。在一些情况下，与单独使用任何一种药剂相比，基于腺病毒的载体和免疫途径检查点调节剂的组合可增加已治疗患者疾病特异性T细胞应答的频率或强度。
某些实施例还可提供使用免疫途径检查点抑制来改善基于腺病毒载体的组合物的药效。某些免疫途径检查点抑制剂可在基于腺病毒载体的组合物时施用。某些免疫途径检查点抑制剂还可在施用基于腺病毒载体的组合物之后施用。免疫途径检查点抑制可与施用腺病毒疫苗同时出现。免疫途径检查点抑制可出现在疫苗接种后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或60分钟。免疫途径检查点抑制还可出现在施用基于腺病毒载体的组合物后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在某些情况下，免疫抑制可出现在接种疫苗后1、2、3、4、5、6或7天。免疫途径检查点抑制可在施用基于腺病毒载体的组合物之前或之后的任意时间点出现。
在另一个方面中，提供了涉及疫苗和免疫途径检查点调节剂的方法，该疫苗包括一种或多种编码抗原的核酸。例如，提供了一种用于治疗患有病症的受试者的方法，该病症将从免疫途径检查点蛋白(例如PD1或PDL1)及其在受试者细胞上的一种或多种天然结合配偶体的下调中受益。
免疫途径检查点调节剂可与基于腺病毒载体的组合物组合，该组合物包括一种或多种编码任何抗原的核酸。例如，抗原可以是肿瘤抗原，例如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位，或本文所述的任何抗原。
免疫途径检查点调节剂可在与基于腺病毒载体的组合物(比如疫苗)组合时产生协同作用。免疫途径检查点调节剂还可在与基于腺病毒载体的组合物组合时产生有益作用。
XVII.癌症
在一些实施例中，本发明的方法和组合物用于治疗有需要的受试者的癌症。在具体方面中，这些癌症过表达HER2/neu靶抗原。HER2/neu在多种不同的癌症中过表达，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和骨癌。HER2/neu过表达可用作癌症治疗的预后标志物。在一些实施例中，HER1、HER2/neu、HER3、HER4中的任何一种或其组合可用作癌症治疗中的预后标志物。
具体可考虑到，包括本文所述的腺病毒载体的组合物可用于评估或治疗疾病期段，例如增生、发育不良、赘生物形成、癌前病变、癌症、原发性肿瘤或转移性肿瘤。在具体实施例中，该受试者患有以下、处于以下的风险中或被诊断为患有以下：乳腺癌，更特别地转移性乳腺癌或对其他癌症疗法(例如标准乳腺癌疗法)无应答、无法切除或局部晚期的乳腺癌。
如本文所用的术语“赘生性细胞”和“赘生物形成”可互换使用，并指的是细胞，其表现出相对自主生长，使得它们表现出特征在于细胞增殖控制的明显丧失的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或良性的。在具体方面中，赘生物形成既包括发育异常又包括癌症。肿瘤可能是良性、恶性前(原位癌或发育不良)或恶性(癌)。赘生性细胞可形成或不形成肿块(即，肿瘤)。
当细胞异常仅限于起源组织时，比如在早期原位赘生物的情况下，可使用术语“发育异常”。发育异常可能预示着早期的赘生物形成过程。术语“癌症”可指恶性赘生物，其中包括与细胞生长失调有关的多种疾病。
转移或转移性疾病可以是指癌症从一个器官或部分扩散到另一个非相邻器官或部分。由此产生的新的疾病发生可称为转移。
可通过所公开的方法和组合物评估或治疗的癌症包括癌细胞，尤其是乳腺癌细胞，但还可包括来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、胃、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、舌头或子宫的细胞和癌细胞。
另外，该癌症具体可以是以下组织学类型，但不仅限于此：恶性肿瘤；癌；未分类的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉病；实体癌；恶性类癌；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；发色癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；膀胱腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；具有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；滋养细胞癌；恶性间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺旁神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的马里格黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间皮肉瘤；恶性布氏肿瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；免疫缺陷；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢间质；绒毛膜癌；恶性肾上腺皮质瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波济肉瘤；恶性血管内皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；牙釉质成牙本质肉瘤；恶性成釉细胞瘤；釉质成纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金淋巴瘤；肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；以及毛细胞白血病。
乳腺癌
在某些方面中，包括复制缺陷型载体的方法和组合物用于治疗患有以下，处于以下的风险中或被诊断患有以下的受试者：乳腺癌、特别是患有不可切除、局部晚期或转移性乳腺癌，该复制缺陷型载体包括HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位。
在某些方面中，乳腺癌是通过对乳房病变区域进行样品或活检的显微镜分析来诊断的。另外，有些类型的乳腺癌需要专门的实验室检查。
两种最常用的筛查方法是由医护人员对乳房进行身体检查和乳房X线照相术，这样可提供肿块为癌症的近似可能性，并还可检测其他一些病变，例如单纯性囊肿。当这些检查尚无定论时，医护人员可取出肿块中的液体样本进行显微镜分析(该程序称为细针抽吸或细针抽吸和细胞学检查FNAC)，以帮助建立诊断。发现透明液体则使肿块极不可能是癌性的，但是血性液体可能会被送去在显微镜下检查癌细胞。对乳房进行的身体检查、乳腺X线摄影和FNAC可结合在一起用于诊断乳腺癌，具有很高的准确性。
活检的其他选择包括核心活检或真空辅助的乳房活检，这些是去除一部分乳房肿块的程序；或切除活检，其中将整个肿块去除。通常，由医疗服务提供者进行的体格检查、乳房X线照相以及在特殊情况下可能进行的其他检查(例如，通过超声或MRI成像)的结果足以确保切除活检作为确定的诊断和首要治疗方法。
乳腺癌可分类成不同的模式。这些方面均会影响治疗应答和预后。乳腺癌的描述最好包括所有这些分类方面以及其他发现，例如体格检查发现的体征。完整的分类包括组织病理学类型、等级、期段(TNM)、受体状态以及通过DNA测试确定的基因存在与否：
组织病理学。绝大部分乳腺癌都来自导管或小叶衬里的上皮，被归类为乳腺导管癌。原位癌是癌细胞在上皮组织内增殖而不会侵袭周围组织。相反，浸润性癌侵袭周围组织。通常将神经周围和/或淋巴管间隙浸润视为乳腺癌组织学描述的一部分，如果这些存在，则其可能与更具侵略性的疾病相关。
等级。与正常乳腺组织的外观相比，分级集中在乳腺癌细胞的外观上。像乳房这样的器官中的正常细胞会分化，这意味着它们呈特定的形状和形式，从而可反映其作为该器官一部分的功能。癌细胞失去了这种分化特征。在癌症中，通常会有序排列以组成乳腺导管的细胞变得无组织。细胞分裂变得不受控制。细胞核变得不太均匀。根据其中逐渐失去了正常乳腺细胞所见的特征，病理学家将细胞描述为分化良好的细胞(低级)、分化中等的细胞(中级)和分化差的细胞(高级)。分化差的癌症的预后较差。
期段。乳腺癌分期段的TNM分类基于其最初起源于体内的癌症的大小以及行进到的位置。这些癌症特征描述为肿瘤的大小(T)、肿瘤是否扩散到腋下、颈部和胸部内部的淋巴结(N)以及肿瘤是否已转移(M)(即传播到身体的更远的部分)。较大的尺寸、淋巴结扩散和转移具有更大的期段数和更差的预后。
主要期段为0期、1期、2期、3期和4期。
0期是乳头的原位疾病或佩吉特病。0期是癌前或标志物状态，即原位导管癌(DCIS)或原位小叶癌(LCIS)。
1-3期在乳腺或局部淋巴结内。
4期是转移性癌症。转移性乳腺癌的预后较差。
受体状态。细胞在其表面以及细胞质和细胞核中具有受体。化学信使(例如激素)与受体结合，这会导致细胞发生变化。乳腺癌细胞可能有也可能没有许多不同类型的受体，在本分类中最重要的三个是：雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2/neu。有或没有这些受体的细胞称为ER阳性(ER+)、ER阴性(ER-)、PR阳性(PR+)、PR阴性(PR-)、HER2/neu阳性(HER2/neu+)和HER2/neu阴性(HER2/neu-)。没有任何这些受体的细胞称为基底样或三阴性。
骨肉瘤
在一些实施例中，包括复制缺陷型载体的方法和组合物用于治疗患有骨癌特别是骨肉瘤、有罹患骨癌特别是骨肉瘤风险或被诊断患有骨癌特别是骨肉瘤的受试者，该复制缺陷型载体包括HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位。在某些实施例中，骨肉瘤可以是高级骨肉瘤、中级骨肉瘤或低级骨肉瘤。骨肉瘤是一种骨骼癌，最常见于青年受试者。这些癌症最常见于新骨生长区域。在某些实施例中，可施用本公开的方法和组合物以治疗具有任何等级或类型的骨肉瘤的受试者。
胃癌
在一些实施例中，包括复制缺陷型载体的方法和组合物用于治疗患有胃癌、有罹患胃癌风险或被诊断患有胃癌的受试者，该复制缺陷型载体包括HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位。胃癌是起源于胃的癌症，其中近90-95％是腺癌。在某些实施例中，胃癌可以是腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤或类癌。胃癌也可能源自幽门螺杆菌感染。在某些实施例中，可施用本公开的方法和组合物以治疗具有任何等级或类型的骨肉瘤的受试者。
XVIII.治疗方法
如本文所述的包括靶抗原(比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的复制缺陷腺病毒载体可用于多种疫苗设置中，以产生针对一种或多种靶抗原的免疫应答。在一些实施例中，提供了用于产生针对任何靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位)的免疫应答的方法。
腺病毒载体之所以特别重要，是因为出乎意料的发现，它们可用于在对Ad已有免疫力的受试者中产生免疫应答，并且可以用于包括使用腺病毒载体进行多轮免疫的疫苗接种方案(使用上一代腺病毒载体不可能进行的方案)。
一般而言，产生免疫应答包括体液应答和/或细胞介导的应答的诱导。可期望增加针对目的靶抗原的免疫应答。
产生免疫应答可以涉及免疫系统的某些细胞的活性和/或数量的减少或某些细胞因子或其他效应分子的水平和/或活性的降低。在一些方面中，有多种方法可检测免疫应答的变化(例如，细胞数量、细胞因子表达、细胞活性)并且这些方法是有用的。在这种情况下，有用的示例性方法包括细胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖测定，包括铬释放或等效测定的细胞毒性T细胞测定，以及使用任何数量的基于聚合酶链反应(PCR)或RT-PCR的分析进行基因表达测定。
与对照组相比，产生免疫应答可包括在施用本文所述的腺病毒载体的受试者中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到5倍。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括约施用腺病毒载体的受试者中2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍的靶特异性CTL活性的增加。
与适当的对照组相比，产生免疫应答可包括在施用本文所述的腺病毒载体的受试者中使靶抗原特异性HTL活性(比如辅助T细胞的增殖)增加约1.5到5倍，该腺病毒载体包括编码靶抗原的核酸。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍的靶特异性HTL活性的增加。在此背景下，HTL活性可包括特定细胞因子(比如，干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他细胞因子)的产生的如上所述增加或减少。在这方面而言，产生免疫应答可以包括从Th2型应答向Th1型应答的转变，或者在某些实施例中，包括从Th1型应答向Th2型应答的转变。在其他实施例中，产生免疫应答可以包括激活主要Th1或Th2型应答。
与适当的对照组相比，产生免疫应答可包括在施用本文所述的腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体的产生增加约1.5到5倍。在另一个实施例中，与对照相比，产生免疫应答包括在施用腺病毒载体的受试者中约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、11.5倍、12倍、12.5倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更高的靶特异性抗体的产生的增加。
因此，在某些实施例中，提供了用于产生针对目的靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位)的免疫应答的方法，该方法包括向个体施用腺病毒载体，该腺病毒载体包括：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中该腺病毒载体在E2b区域具有缺失，以及b)编码靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的核酸；和至少一次将腺病毒载体重新施用给个体；从而产生对抗靶抗原的免疫应答。在某些实施例中，提供了其中所施用的载体不是去病毒基因的载体的方法。在特定的实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，该靶抗原包括肿瘤抗原，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段。
在一个其他实施例中，提供了通过向个体施用腺病毒载体来用于在个体中产生针对靶抗原的免疫应答的方法，其中该个体对Ad具有预先存在的免疫力，该腺病毒载体包括：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；和至少一次将腺病毒载体重新施用给个体；从而产生对抗靶抗原的免疫应答。在特定的实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，该靶抗原包括比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段。
关于对Ad具有预先存在的免疫力，这可通过使用本领域已知的方法来确定，比如基于抗体的检测以测试Ad抗体的存在。此外，在某些实施例中，本文所述的方法包括首先确定个体对Ad具有预先存在的免疫力，然后按照本文所述施用E2b缺失的腺病毒载体。
一种实施例提供了一种在个体内针对一种或多种靶抗原产生免疫应答的方法，该方法包括向个体施用第一腺病毒载体，第一腺病毒载体包括出复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，并具有编码至少一种靶抗原的核酸；向个体施用第二种腺病毒载体，第二种腺病毒载体包含复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区域具有缺失，和具有编码至少一种靶抗原的核酸，其中第二腺病毒载体的至少一个靶抗原与第一腺病毒载体的至少一个靶抗原相同或不同。在特定的实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，该靶抗原包括肿瘤抗原，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段。
因此，某些实施例考虑用相同的E2b缺失的腺病毒载体来进行多次免疫或用不同的E2b缺失的腺病毒载体进行多次免疫。在每种情况下，腺病毒载体可包含编码一种或多种靶抗原的核酸序列，如本文其他地方所述。在某些实施例中，该方法包括用编码一种靶抗原的缺失E2b的腺病毒进行多次免疫，并多次再次施用相同的腺病毒载体，从而诱导对抗靶抗原的免疫应答。在一些实施例中，该靶抗原包括肿瘤抗原，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段。
在另一个实施例中，该方法包括用编码一种或多种靶抗原的第一腺病毒载体免疫，然后与编码一种或多种靶抗原的第二种腺病毒载体一起施用，该抗原与第一腺病毒载体编码的那些抗原可以相同或不同。在这方面而言，一个编码的靶抗原可以不同，或者所有编码的抗原可以不同，或者某些可以相同，而有些可以不同。此外，在一些实施例中，该方法包括多次施用第一腺病毒载体和多次施用第二腺病毒。就这方面而言，该方法包括施用第一腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次，以及施用第二腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。施用顺序可以包括连续一次或多次施用第一腺病毒，然后连续一次或多次施用第二腺病毒载体。在某些实施例中，该方法包括将第一腺病毒载体和第二腺病毒载体交替施用为每次一次施用，每次两次施用，每次三次施用，等等。在某些实施例中，同时施用第一腺病毒载体和第二腺病毒载体。在其他实施例中，第一腺病毒载体和第二腺病毒载体是按顺序的方式施用。在一些实施例中，该靶抗原包括肿瘤抗原，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任何组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段。
如本领域技术人员所知，可在本文所述的方法中使用超过两种腺病毒载体。可在本文所述的方法中使用3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的腺病毒载体。在某些实施例中，该方法包括一次施用一种以上的E2b缺失的腺病毒载体。关于这方面，可以通过同时施用多种不同的腺病毒载体来产生对抗多种目的靶抗原的免疫应答，每种应答包含编码一种或多种靶抗原的核酸序列。
能够使用腺病毒载体，以产生对抗癌症的免疫应答，诸如癌瘤或肉瘤(例如实瘤、淋巴瘤和白血病)。该腺病毒载体可用于产生针对癌症的免疫应答，比如神经系统癌症、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或其他癌症。
还提供了用于治疗或改善本文所述的任何传染性疾病或癌症的症状的方法。治疗方法包括将腺病毒载体一次或多次施用给患有本文所述的传染病或癌症或有患传染病或癌症的风险的个体。因此，某些实施例提供了用于在有患疾病的风险的个体中针对传染病或癌症而进行免疫的方法。风险中的个体可以是可能在某些时候接触到传染原或先前已接触但尚未出现感染症状的个体，或者是具有遗传易感性癌症或特别容易感染传染原的个体。可确定患有本文所述传染病或癌症的个体表达和/或呈现靶抗原，可用于指导本文的治疗方法。例如，可以发现表达和/或呈现靶抗原的示例，并且随后可以施用编码靶抗原、其变体、片段或变体片段的腺病毒载体。
某些实施例考虑使用腺病毒载体在体内递送编码靶抗原或其片段、变体或变体片段的核酸。一旦注射到受试者体内，核酸序列被表达，从而导致对该序列编码的抗原的免疫应答。可施用“有效量”的腺病毒载体疫苗，即在选定的一种或多种施用途径中可有效引发如本文其他地方所述的免疫应答的一定量的腺病毒载体。有效量可诱导免疫应答有效地促进宿主对目标感染因子或癌症的保护或治疗。每个疫苗剂量中载体的量被选择为诱导免疫、免疫保护或其他免疫疗法反应而没有通常与典型疫苗相关的显著副作用的量。一接种疫苗后，可以对受试者进行监测，以确定疫苗治疗的效果。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来监测疫苗接种的效果。在一些实施例中，以分析血液或液体样品以检测抗体水平。在其他实施例中，可以进行ELISpot试验来检测来自循环血液细胞或淋巴组织细胞的细胞介导的免疫应答。
在某些实施例中，可在52周的时间内施用1至10个剂量。在某些实施例中，每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、18、20、22、23或24个月或由此得出的任何范围或价值来施用6个剂量，并在理论上可每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、18、20、22、23或24个月或由此得出的任何范围或价值来进一步给予加强性疫苗接种。替代方案可能适合个别患者。因此，可在1年的时间或更短或更长的时间内(35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100周的时间内)施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个剂量。剂量可以每隔1、2、3、4、5或6周或更长的时间间隔施用。在一些方面中，初次免疫后可进行包括相同组合物或药物组合物的一个或多个加强免疫。在一些实施例中，每一、二、三四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个月或更长时间进行一次加强免疫。在一些实施例中，重复加强免疫三四、五、六、七、八、九、十、十一或十二次或多次。在一些实施例中，该施用治疗有效量是每一、二或三周重复初次免疫三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多次、然后每一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多月重复加强免疫三次或更多次。
疫苗可以在少于约4小时的时间内输注，更优选地，在少于约3小时的时间内输注。例如，可将最初的25-50mg在30分钟内(最好是15分钟)输注，其余的在接下来的2-3小时内输注。更通常，所施用的疫苗构建体的剂量可以每2或3周施用一个剂量，总共重复至少3个剂量。或者，该构建体可以每周施用两次，持续4-6周。剂量时间表可以选择性地以其他时间间隔重复，并且可以通过各种肠胃外途径施用，同时适当调整剂量和时间表。本文所述的组合物可与任何数量的相关治疗模式(例如，在之前、同时或在之后)结合来施用给患者。
合适的剂量是腺病毒载体的量，当如上所述施用时，其能够促进如本文别处所述的靶抗原免疫应答。在某些实施例中，免疫应答比基础水平(即，未治疗水平)高至少10％-50％。在某些实施例中，该免疫应答比基础水平高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500或更多。这种应答可以通过测量患者体内的靶抗原抗体或通过能够在体外杀死患者肿瘤或受感染细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生，或本领域已知的用于监测免疫应答的其他方法来监测。与未接种疫苗的患者相比，这种疫苗还应该能够引起免疫应答，从而改善接种疫苗的患者的相关疾病的临床结果。在一些实施例中，改善的临床结果包括治疗疾病、减轻疾病症状、改变疾病恶化或延长寿命。
可以给个体施用本文提供的任何组合物。“个体”可以与“受试者”或“患者”互换使用。个体可以是哺乳动物，例如人或动物，诸如非人灵长类动物、啮齿动物、兔子、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、牛、猪或羊。在实施例中，个体为人。在实施例中，该个体是胎儿、胚胎或孩童。在一些情况下，可将本文提供的组合物体外施用给细胞。在某些情况下，本文提供的组合物作为治疗疾病或病症的方法而施用于个体。在一些实施例中，个体患有遗传病。在某些情况下，个体有患病的风险，例如本文所述的任何疾病。在一些实施例中，个体患有由蛋白质量不足或蛋白质活性不足引起的疾病或病症的风险增加。如果个体患有疾病或病症的“风险增加”，则该方法涉及预防性或预防性治疗。例如，由于家族病史，个体患有这种疾病或病症的风险会增加。一般而言，患有这种疾病或病症风险增加的个体受益于预防性治疗(例如，通过预防或延迟疾病或病症的发作或进展)。
在某些情况下，受试者没有疾病。在一些情况下，在疾病发作之前施用本文所述的治疗方法。受试者可能患有未被发现的疾病。受试者可能疾病负担较轻。受试者也可能疾病负担较重。在某些情况下，可以根据分级标准给受试者施用如本文所述的治疗。分级标准可以为格里森分类法。格里森分类法反映了肿瘤组织与正常前列腺组织的不同。其评分范围为从1至5。医师根据癌细胞的模式和生长情况给癌症评出一个数字。数字越小，癌细胞看起来越不正常，等级越高。在某些情况下，可以对格里森分数低的患者进行治疗。优选地，格里森评分为3或以下的患者可接受本文所述的治疗。
各种实施例涉及在选定的患者群体中产生针对一种或多种特定靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的免疫应答的组合物和方法。因此，本文所述的方法和组合物可靶患有癌症的患者，该癌症包括但不限于癌或肉瘤，比如神经系统癌症、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或可靶向其他癌症来进行治疗。在一些情况下，靶向的患者群可限于患有以下疾病的个体：结肠直肠腺癌、转移性结肠直肠癌、表达MUC1、MUC1c、MUC1n、T或CEA的晚期结肠直肠癌、头颈癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌或胰腺癌。可以使用组织学确诊选定的癌症，例如结肠直肠腺癌。可选择特定的疾病阶段或进展，例如，可选择患有转移性、复发性、III期或IV期癌症中的一种或多种的患者来用本文所述的方法和组合物进行治疗。在一些实施例中，患者可能需要接受其他治疗，并且任选地通过其他治疗进行，其包括但不限于含氟嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼图单抗的治疗。在一些情况下，个体拒绝接受此类疗法可使将患者纳入具有本文所述的方法和组合物的治疗合格库中。在一些实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的个体需要其预期寿命至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、21或24个月。接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的患者库可能受到年龄限制。例如，年龄大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、60或更大的个体有资格接受使用本文所述的方法和组合物的疗法。再例如，年龄小于75、70、65、60、55、50、40、35、30、25、20或更小的个体有资格接受使用本文所述的方法和组合物的疗法。
在一些实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的患者仅限于具有足够血液学功能的个体，例如，每微升WBC计数至少为1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多、血红蛋白水平至少为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更高的g/dL、血小板计数至少为50,000；60,000；70,000；75,000；90,000；100,000；110,000；120,000；130,000；140,000；150,000或更多；其中，PT-INR值小于或等于0.8、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0或更高，PTT值小于或等于ULN的1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0倍或更高倍。在各类实施例中，对于不同性别和年龄组的个体，例如0-5、5-10、10-15、15-18、18-21、21-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80岁以上的个体，血液功能指标限值的选择是不同的。
在一些实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的患者仅限具有足够肾脏和/或肝功能的个体，例如以下中的一项或多项：血清肌酐水平小于或等于0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更高，胆红素水平为.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更高，同时该个体还对吉尔伯特综合征具有更高的限制，例如小于或等于1.5、1.6、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4mg/dL，ALT和AST值小于或等于1.5、2.0、2.5、3.0x正常上限(ULN)或更高。在各类实施例中，对于不同性别和年龄组的个体，例如0-5、5-10、10-15、15-18、18-21、21-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80岁以上的个体，肾或肝功能指标限值的选择是不同的。
在一些实施例中，可以确定使用本文所述方法和组合物进行治疗的候选个体的K-ras突变状态。具有预选K-ras突变状态的个体可以被包括在合格的患者池中，用于使用本文所述的方法和组合物进行治疗。
在各类实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的患者仅限于未同时进行细胞毒性化疗或放疗、脑转移病史或当前转移、自身免疫病史的个体，例如但不限于炎症性肠病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化症、甲状腺疾病和白癜风、严重的并发慢性或急性疾病(例如心脏病(NYHA III或IV级)或肝病)，可能不遵守方案的医学或心理障碍、非-黑素瘤皮肤癌以外的并发(或最近5年内)的第二次恶性肿瘤、子宫颈原位癌、控制性浅表膀胱癌或其他已治疗的原位癌、活动性急性或慢性感染，包括：泌尿道感染、HIV(如，通过ELISA确定并通过Western Blot确认)、慢性肝炎或同时进行类固醇治疗(或其他免疫抑制剂，如硫唑嘌呤或环孢菌素A)。在某些情况下，停止任何类固醇治疗至少3、4、5、6、7、8、9或10周的患者(用作化疗或对比增强研究的术前用药除外)可被包括在使用本文所述方法和组合物进行治疗的合格个体的池中。在一些实施例中，接受使用本文所述的方法和组合物的疗法的患者包括患有甲状腺疾病和白癜风的个体。
在各种实施例中，可以收集来自个体或候选个体的样品，例如血清或尿液样品，用于使用本文所述方法和组合物的治疗。可在治疗之前、期间和/或之后收集样品，例如开始治疗前2、4、6、8、10周内；治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内；开始治疗前2、4、6、8、10周内；治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内；治疗期间间隔1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周；治疗后间隔1月、3月、6月、1年、2年；治疗后1月、3月、6月、1年、2年或更长时间内；持续6月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长。可以对样品进行本文所述的任何血液、肾功能或肝功能指标的测试，以及本领域已知的合适的其他指标的测试，例如用于有生育潜力的妇女的β-HCG。在这方面，某些方面中考虑了血液和生化检查(包括细胞血细胞计数与差异、PT、INR和PTT、检测Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的检测)。在一些实施例中，在来自用于使用本文所述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体的样品中确定HIV抗体、BsAg肝炎或丙型肝炎抗体的存在或数量。
在来自用于使用本文所述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体的样品(例如血清)中测试生物标志物，例如针对靶抗原的抗体或针对Ad5载体的中和抗体。在一些情况下，在来自用于使用本文所述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体的样品中收集和存档一种或多种样品(例如血液样品)。收集的样品可用于免疫评估。可在影像学研究(例如使用胸部、腹部或骨盆的CT扫描或MRI)中评估用于使用本文所述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体。可在使用本文所述的方法和组合物的疗法之前、期间和/或之后执行影像学研究，例如开始治疗前2、4、6、8、10周内；治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内；开始治疗前2、4、6、8、10周内；治疗开始后的1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内；治疗期间间隔1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周；治疗后间隔1月、3月、6月、1年、2年；治疗后1月、3月、6月、1年、2年或更长时间内；持续6月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长。
本文所述的组合物和方法在治疗期间考虑各种剂量和施用方案。患者可接受一种或多种复制缺陷型腺病毒载体或腺病毒载体，例如包括靶抗原的Ad5[E1-,E2B-]载体，该载体能够在个体中产生针对本文所述的靶抗原的免疫应答。
在各种实施例中，复制缺陷型腺病毒以适于实现这种免疫应答的剂量施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x108个病毒颗粒到约5x1013个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x109个病毒颗粒到约5x1012个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x108个病毒颗粒到约5x108个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约5x108个病毒颗粒到约1x109个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x109个病毒颗粒到约5x109个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约5x109个病毒颗粒到约1x1010个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1010个病毒颗粒到约5x1010个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约5x1010个病毒颗粒到约1x1011个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1011个病毒颗粒到约5x1011个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约5x1011个病毒颗粒到约1x1012个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1012个病毒颗粒到约5x1012个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约5x1012个病毒颗粒到约1x1013个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1013个病毒颗粒到约5x1013个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x108个病毒颗粒到约5x1010个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1010个病毒颗粒到约5x1012个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1011个病毒颗粒到约5x1013个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x108个病毒颗粒到约1x1010个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1010个病毒颗粒到约1x1012个病毒颗粒的剂量来施用。在一些实施例中，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫约1x1011个病毒颗粒到约5x1013个病毒颗粒的剂量来施用。在一些情况下，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫大于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多个病毒颗粒(VP)的剂量施用。在一些情况下，该复制缺陷型腺病毒以每次免疫小于或等于1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012或更多个病毒颗粒的剂量施用。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒以每次免疫1x109-5 x1012个病毒颗粒的剂量施用。在一些实施例中，组合物包括至少1.0x1011、2.0x1011、3.0x1011、3.5x1011、4.0x1011、4.5x1011、4.8x1011、4.9x1011、4.95x1011或4.99x1011个病毒颗粒，所述病毒颗粒包括重组核酸载体。在一些实施例中，组合物包括至多7.0x1011、6.5x1011、6.0x1011、5.5x1011、5.2x1011、5.1x1011、5.05x1011或5.01x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括1.0x1011-7.0x1011或1.0-5.5x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.5x1011-5.5x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.8x1011-5.2x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.9x1011-5.1x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.95x1011-5.05x1011个病毒颗粒。在一些实施例中，组合物包括4.99x1011-5.01x 1011个病毒颗粒。
在各种实施例中，本文所述的所需剂量在合适体积制剂缓冲液中施用，例如约0.1-10mL、0.2-8mL、0.3-7mL、0.4-6mL、0.5-5mL、0.6-4mL、0.7-3mL、0.8-2mL、0.9-1.5mL、0.95-1.2mL、或1.0-1.1mL的体积。本领域技术人员可以理解，体积可以落在由这些值中的任何一个限定的任何范围内(例如，大约0.5mL到大约1.1mL)。可以通过多种合适的施用途径施用病毒颗粒，例如可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如抽吸)、丸剂形式(例如吞咽、阴道或直肠施用栓剂)施用。在一些实施例中，皮下递送可能是优选的，并且可以提供对树突细胞的更大接触。
可以重复给个体施用病毒颗粒。病毒颗粒的重复递送可以按照时间表进行，或者可以根据需要进行。例如，可对个体针对靶抗原(例如，肿瘤抗原，比如HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位、其片段、变体或变体片段)的免疫力进行测试，并在必要时补充另外的递送。在一些实施例中，递送时间表包括定期施用病毒颗粒。联合施用方案可以设计为包括一个或多个在施用前评估的具有时间表的时期和/或基于需要的施用时期。例如，治疗方案可以包括施用，例如每三周皮下施用一次，然后每三个月进行另一次免疫疗法，直到由于包括死亡在内的任何原因而退出治疗。另一个实施例方案包括每三周三次施用，然后每三个月另一组三次免疫疗法。
另一个实施例方案包括具有第一频率的第一施用次数的第一时段、具有第二频率的第二施用次数的第二时段、具有第三频率的第三施用次数的第三时段等，以及根据需要任选地一个或多个施用次数不确定的时期。每个时间段施用的次数可进行独立选择，例如，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。每个时间段施用的频率可进行独立选择，例如可以是约每天、每隔一天、每隔三天、一周两次、每周一次、隔周一次、每三周、每月、每六周、每隔一个月、每隔三个月、每隔四个月、每五个月、每六个月、每年一次等。治疗可持续的时间段可高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36个月或更长。
免疫接种之间的预定间隔可以修改，使得免疫接种之间的间隔修改高达间隔的五分之一、四分之一、三分之一或一半。例如，对于3周的间隔时间表，免疫接种可以在20到28天(3周-1天到3周+7天)之间重复。对于前3次免疫接种，如果第二次和/或第三次免疫接种延迟，则随后的免疫接种可以改变，从而在两次免疫接种之间允许最小量的缓冲。例如，对于三周间隔时间表，如果免疫接种延迟，则后续免疫接种可安排为不早于前一次免疫接种后的17、18、19或20天进行。
本文所述组合物可以多种状态来施用，例如，在室温下、在冰上或冷冻下。组合物可以在合适尺寸的容器(例如2mL小瓶)中提供。在一个实施例中，一个具有1.0mL可提取疫苗的2ml小瓶总共含有5x1011个病毒颗粒/mL。包含温度和湿度的储存条件可能会有所不同。例如，用于治疗的组合物可以储存在室温、4℃、-20℃或更低的温度下。
在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物，对接受治疗的个体进行一般评估。可根据需要或按计划执行任何一项或多项测试，例如在第0、3、6周等。相对于没有免疫的时间点，可在免疫同时进行一个不同组的测试。
一般评估可包括以下中的一项或多项：病史、ECOG表现评分、Karnofsky表现状态和主治医生的完整的体重体检。可以记录患者自上次就诊以来正在接受或已经接受的任何其他治疗、药物、生物制品或血液制品。在接受疫苗以监测任何不良反应后，可以在诊所对患者进行适当的随访，例如大约30分钟。
在某些实施例中，可每天评估每剂疫苗后的局部和全身反应原性，持续选定的时间，例如3天(在免疫当天及之后的2天)。日记卡可以用来报告症状，尺子可以用来测量局部反应性。可以评估免疫注射部位。可以对胸部、腹部和骨盆进行CT扫描或MRI。
在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物，对接受治疗的个体进行血液学和生物化学评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。血液学和生化评估可包括一项或多项血液化学和血液学检查、全血细胞分类计数(CBCwith differential)、Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT、葡萄糖和ANA。
在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行生物标志物评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。
生物标志物评估可包括一种或多种测量来自足够量的血清样品的针对本文所述靶抗原或病毒载体的抗体，例如如果确定并可得到，则可以检查约5ml生物标志物。
在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行免疫评估。可以按照需要或在预定的基础上执行任何一个或多个测试，例如在第0、3、6周等。相对于在没有免疫情况下的时间点，可以在免疫接种的同时进行不同的一组测试。
可在每次免疫之前以及在至少某些免疫之后的时间抽取外周血(例如约90mL)，以确定研究期间和/或特定数量的免疫接种后的特定时间点是否对免疫应答有影响。免疫评估可包括一种或多种使用ELISpot、增殖测定、多参数流式细胞仪分析和细胞毒性测定来对外周血单核细胞(PBMC)对靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的T细胞应答的测定。每次采血的血清可以存档、发送和测定。
在各种实施例中，根据本文所述的方法和组合物对接受治疗的个体进行肿瘤评估。可根据需要或按计划执行任何一项或多项测试，例如治疗前、第0、3、6周等。相对于没有免疫的时间点，可在免疫同时进行一个不同组的测试。肿瘤评估可以包括在治疗前、在至少一些免疫接种后以及在完成选定数量的第一次治疗(例如2、3或4次)后的大约每三个月，然后对胸部、腹部或骨盆进行一次或多次CT或MRI扫描，例如直到从治疗中移除为止。
可使用一种或多种合适的免疫应答测试(比如ELISpot、细胞因子流式细胞仪或抗体应答)来从样品(比如个人的外周血样品)中评估针对靶抗原(比如，HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合的抗原或表位)的免疫应答。阳性免疫应答可以通过测量T细胞反应来确定。如果六个有抗原的孔中根据背景调节的斑点的平均数量比六个对照孔中的斑点数量多10个，并且使用学生的T检验，六个有抗原的孔和六个对照孔的单个值之间的差异在p≤0.05的水平上具有统计学意义，则可以认为是阳性的。在每次免疫前和治疗期间的预定时间点可以进行免疫原性分析。例如，即使此时没有计划的免疫接种，也可安排在治疗的约第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36或48周左右进行免疫原性测定的时间点。在某些情况下，如果个体接受了至少最低数量的免疫接种，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次免疫接种，则可以认为该个体的免疫应答是可评估的。
在一些实施例中，在患有可测量/可评估疾病的患者中，根据RECIST 1.1标准进行疾病恶化或临床反应确定。在一些实施例中，使用本文所述的方法和成分的治疗影响接受治疗的个体的完全应答(CR；靶向病变的所有靶向病变消失或所有非靶向病变消失以及非靶向病变的肿瘤标志物水平的正常化)。在一些实施例中，使用本文所述的方法和组合物的疗法会影响接受治疗的个体的局部应答(PR；靶病变的LD的总和至少降低30％，以靶病变的基线LD的总和为参考)。
在一些实施例中，使用本文所述的方法和组合物的疗法会影响接受治疗的个体的稳定疾病(SD；以靶病变开始治疗以来的最小LD总和作为参考，既没有足够的收缩来符合PR，也没有足够的增加来符合PD)。在一些实施例中，使用本文所述的方法和组合物的疗法影响不完全应答/稳定疾病(SD；接受该疗法的个体持续存在一种或多种非靶病变或/和维持肿瘤标志物水平高于非靶病变的正常限度)。在一些实施例中，使用本文所述方法和组合物的疗法影响渐近性疾病(PD；在接受治疗的个体中，靶病变的总LD至少增加20％，以自治疗开始以来记录的最小LD总和或出现一个或多个靶病变的新病变或一个或多个非靶病变的持续或/和肿瘤标志物水平维持在非靶病变的正常极限之上为参考)。
XIX.试剂盒
本文所述的组合物、免疫疗法或疫苗可以试剂盒的形式来提供。本发明的试剂盒还可包括有关剂量和/或施用的说明，其中包括治疗方案信息。
在一些实施例中，试剂盒包括用于提供所述免疫疗法或疫苗的组合物和方法。在一些实施例中，试剂盒还可以包括用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备组分的说明。在一些实施例中，试剂盒还可以包括用于在治疗前后通过适当的实验室测试对患者进行监测，或者与医务人员交流结果和患者数据的软件。
组成试剂盒的组分可以是干的或液体的形式。如果它们是干的形式，试剂盒可以包括溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可以包括液体或干的形式的转移因子。如果转移因子为干的形式，试剂盒将包括溶解转移因子的溶液。所述试剂盒还可以包括用于混合和制备所述组分的容器。所述试剂盒还可以包括用于辅助施用的仪器，例如针头、导管、敷贴器、吸入器、注射器、移液管、镊子、测量勺、滴管或任何此类经医学批准的载体。本文所述的试剂盒或药物递送系统通常将包括含有用于严格限制本公开内容的组合物用于商业销售和分配的装置。
实例
包括以下实例以示出本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可认为构成其实践的优选方式。然而，根据本发明，本领域技术人员应当理解，可在所公开的特定实施例中进行许多改变，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得相似或相似的结果。
实例1
Heregulin/神经调节蛋白的基因表达分析
该示例描述了heregulin/神经调节蛋白HRG/NRG1的基因表达分析。收集了自NCBI基因表达综合(GEO)上收集的23个数据集的乳腺肿瘤基因表达数据(n＝4010)。来自这些数据集的mRNA表达证明HRG/NRG1的mRNA表达上调与ER+HER2/neu-乳腺癌患者较低的无复发存活相关。另外，早期复发(少于5年)或晚期复发(5-10年)患者的肿瘤中的HRG/NRG1mRNA升高。
图1示出了乳腺癌基因表达数据分析结果。图1A示出了HRG/NRG1的mRNA表达上调与ER+HER2/neu-乳腺癌患者中较低的无复发存活率相关。图1B示出了与非复发肿瘤相比，在诊断后早期复发(少于5年)或晚期复发(从5-10年)的患者的肿瘤中HRG/NRG1 mRNA升高。
实例2
Ad5[E1-,E2b-]载体的构建
该示例说明了Ad5[E1-,E2b-]载体的构建。先前已说明了Ad5[E1-,E2b-]载体主链的构建。将pBHG11的大约20kb的Xba-BamHI亚片段亚克隆到pBluescriptKSII+(Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州)中，得到pAXB。用BspEI消化质粒pAXB，在末端填充T4 DNA聚合酶，并消化BamHI，以及分离出大约9.0kb的片段。还用BspHI消化质粒pAXB，在末端填充T4DNA聚合酶，并消化BamHI，以及将约13.7kb的片段连接至先前分离的9.0kb的片段，从而产生pAXB-Δpol。
该亚克隆策略在聚合酶基因的氨基末端缺失了608bp(Δpol；Ad5核苷酸7274至7881)。该缺失也有效地去除了在Ad基因组的该区域中向右阅读链上存在的开放阅读框9.4。将pAXB-Δpol的Xba-BamHI亚片段重新引入Xba-BamHI消化的pBHG11中，以产生pBHG11-Δpol。
实例3
Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗的构建
该实例说明了Ad5[E1-,E2b-]-HER3/neu疫苗的构建。将带有最小的巨细胞病毒启动子/增强子和SV40衍生的聚腺苷酸化信号的截短的HER3转基因亚克隆到穿梭pShuttleCMV中，以产生穿梭质粒pShuttle CMV/HER3。将穿梭质粒用PmeI线性化，并与质粒pAdΔpp同源重组(在大肠杆菌中)以产生pAdCMV/HER3/Δpp(图2)。
将用PacI线性化的10微克pAdCMV/HER3/Δpp CaPO4共转染到表达Ad E1、聚合酶(E2b)和pTP的E.C7细胞中。转染后十六小时，收获细胞并将细胞混合物分配到九个24孔组织培养簇板中，并在37℃下孵育5至9天。收集表现出病毒细胞病作用的单个孔，并通过重复感染大量E.C7细胞来扩增分离的病毒。随后通过(1)载体基因组的DNA限制性酶切作图、(2)HER3表达的确认和(3)多功能研究来证实Ad5[E1-,E2b-]-HER3重组载体的分离。
实例4
对BALB/c小鼠中的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的临床前免疫原性评估
该实例说明了对BALB/c小鼠中的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的临床前免疫原性测试。在初步研究中，在BALB/c小鼠中确定了Ad5[E1-,E2b-]-HER3fl(全长基因插入片段)的免疫原性。以两周间隔给雌性小鼠(每组10只小鼠)接种两次，并在4天后将表达人HER3的鼠乳腺癌细胞系(JC-HER3，1M细胞/小鼠)注射入小鼠腹侧。在植入肿瘤细胞之前从每组中处死3只小鼠以收集血液和脾脏用于免疫监测。监测其余小鼠的肿瘤体积，直到达到人类终点。
图4示出了免疫原性测试和抗肿瘤功效测试的一个方案。在第-18天和第-4天，给小鼠接种Ad载体(2.6x 1010个vp/小鼠)，并在第0天处死每组的三只小鼠进行免疫分析。收获脾细胞用于ELISPOT测定。收集血液以测试抗体的产生。对于每组中的其他七只小鼠，将JC-HER3细胞皮下注射到BALB/c小鼠的腹侧面，并测量肿瘤大小。
体液免疫应答
通过流式分析法在小鼠中分析了针对HER3的体液免疫应答。将4T1(HER3阴性)或4T1-HER3(HER3转染子)细胞与小鼠血清(用盐水(1:100稀释)稀释)孵育，再与PE偶联的二抗(抗小鼠IgG)孵育。接种Ad5[E1-,E2b-]-GFP(绿色荧光蛋白)小鼠的血清用作阴性对照，使用市售抗HER3 mAb作为阳性对照，并使用接种Ad5[E1-]-huHER3的小鼠血清作为比较。
图5示出了接种Ad-HER3的小鼠血清中的抗HER3抗体水平。处死每组三只小鼠，并收集血清。将4T1(HER3阴性)和4T1-HER3(转染子)用血清(1:100稀释)标记，然后用PE偶联的抗小鼠IgG Ab标记。空心直方图(黑线)显示小鼠血清的染色，而灰色直方图显示无血清的染色(仅2o Ab)。在Ad-HER3疫苗接种的小鼠血清中，未转染的细胞(4T1细胞)不表达HER3，也不结合抗HER3抗体。因此，空心直方图和灰色直方图完全重叠。空心直方图向右移动表示该血清含有抗HER3抗体，其中该抗体与4T1细胞表达的HER3结合。Ad-HER3(全长HER3)转染的4T1细胞在Ad-HER疫苗接种的小鼠血清中显示出与抗HER3抗体的结合。左下方的直方图显示了HER3单克隆抗体(抗HER3 mAb)与表达HER3的4T1细胞的结合。观察到的空心直方图向灰色直方图右侧的移动表面非特异性背景结合。
图6示出了单个小鼠血清中4T1和4T1-HER3细胞染色的中值荧光强度。用编码全长HER3(HER3-FL)的Ad5载体来免疫小鼠。将编码GFP的Ad5载体和盐水用作阴性对照组。Ad5[E2b-]-HER3诱导了强烈的抗HER3抗体产生，这可通过与来自这些小鼠血清孵育的4T1-HER3表达细胞中定量的高平均荧光强度(MFI)来进行证实。
通过基于细胞的ELISA来分析每种血清中的抗HER3抗体水平。在该测定中使用了4T1鼠类乳腺癌细胞系(HER3阴性)和人HER3转染子(4T1-HER3)。将来自单个小鼠的血清从1:50滴定至1:6400。图7示出了小鼠血清的基于细胞的ELISA的结果。将4T1和4T1-HER3细胞接种到96孔板中。进行过夜孵育后，将细胞用缓冲液洗涤，并添加具有系列稀释度的小鼠血清(1:50至1:6400)，并在冰上孵育1小时。用4％甲醛固定细胞，并添加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:1000)。孵育1小时后，将细胞用PBS洗涤3次，并添加TMB 5分钟。通过添加H2SO4来停止显色。显示了OD450值的差异(＝[4T1-HER3的值]-[4T1的值])。因此，y轴显示表达HER3的4T1细胞在450nm处的吸收率超过表达阴性对照的不表达HER3的4T1细胞。基于细胞的ELISA结果表明，在所有小鼠中均证实了Ad5[E1-,E2b-]-HER3fl疫苗接种的小鼠中产生了HER3抗体，且ELISA结果表明，对应于结合的吸收率与所测得的相互滴度有关。此外，来自接种了阴性对照(Ad-GFP或盐水)的小鼠的小鼠血清未显示出超过阴性对照细胞的吸收率，这表明该血清中不存在抗HER3抗体。
抗原特异性细胞免疫应答
抗原特异性细胞免疫应答通过小鼠脾细胞的IFN-γELISPOT分析进行了分析。将每只小鼠的脾细胞与HER3肽库细胞外结构域(ECD)或细胞内结构域(ICD)、作为阴性对照的HIV肽混合物以及作为阳性对照的PMA+碘霉素进行孵育。如所预期的，T细胞对HER3的细胞内结构域作出应答。T细胞对HER3细胞内结构域的肽混合物的应答是可变的。
图8示出了Ad-HER3疫苗接种诱导的抗HER3细胞应答。用Ad5[E1-,E2b-]-HER3、对照Ad-GFP(2.6x 1010个vp/疫苗)或单独的生理盐水对小鼠进行疫苗接种。两周后，用相同的Ad载体重复疫苗接种，四天后，收集脾脏以评估抗HER3细胞应答。将ELISPOT板用抗IFNγmAb包被过夜。将500K脾细胞放入带有HER3-ECD肽库、HER3-ICD肽库、HIV肽库(阴性对照)和PMA+伊诺霉素(阳性对照)的每个孔中。将细胞孵育过夜，并形成斑点。显示每组平均3只小鼠。ELISPOT结果表明，Ad-HER3免疫诱导了细胞应答，这通过暴露于HER3(细胞内，“ICD”)肽混合物或HER3(细胞外结构域和跨膜结构域，“ECDTM”)肽混合物的脾细胞中较多的斑点数量来证实。
抗肿瘤应答
每周两次测量肿瘤生长，直到肿瘤细胞植入后34天。一旦肿瘤体积达到2,000mm3或出现溃疡，就对小鼠实施安乐死。直到第20天，所有小鼠均存活，并计算每组的平均肿瘤体积。统计分析的初步结果如图9所示。
图9示出了Ad5-[E1-,E2b-]-HER3fl疫苗对BALB/c小鼠中JC-HER3的肿瘤生长的影响。BALB/c小鼠在肿瘤细胞植入之前(第-18天、第-4天)接种了两次疫苗，并在肿瘤细胞植入后(第14天)接种了一次疫苗，所述接种是通过足垫注射用Ad5[E1-,E2b-]-HER3fl、Ad-GFP(2.6x 1010个颗粒/小鼠)或盐水接种。在第0天，每只小鼠植入表达人HER3的JC-HER3小鼠乳腺肿瘤细胞(1x 106个细胞/小鼠)。每三天测量一次肿瘤体积。误差线显示标准误差。
与对照组(盐水注射)相比，Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗接种对BALB/c小鼠的肿瘤生长表现出强大的抑制作用。使用混合模型来分析数据。将肿瘤体积进行平方根转化，以使体积与时间关系呈线性并标准化数据。模型结果清楚地表明，盐水组的肿瘤体积随时间(天)增加。疫苗Ad5[E1-,E2b-]-HER3组的肿瘤体积生长速度明显慢于生理盐水组，而生理盐水和Ad-GFP的肿瘤生长差异不显著。
图10示出了Ad5-[E1-,E2b-]-HER3疫苗接种对BALB/c小鼠中JC-HER3的肿瘤生长的影响。图10A示出了接种Ad-hHER3FL的小鼠体内肿瘤的生长。图10B示出了接种Ad-GFP的小鼠体内肿瘤的生长。当肿瘤体积达到2000mm3或出现溃疡时，对小鼠实施安乐死。Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗组中没有小鼠死亡。
实例5
对HER3转基因小鼠模型中的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的临床前免疫原性的评估
该实例说明了对HER3转基因小鼠模型中的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的临床前免疫原性的评估。在BALB/c背景下(F1杂合小鼠；BALB/cx MMTV-neu/MMTV-hHER3)开发了HER3转基因小鼠模型，以测试Ad-HER3载体在表达人HER3的小鼠中的HER3特异性免疫原性和抗肿瘤作用。
使用HER3转基因小鼠模型在免疫原性、预防和治疗分析中比较了以下人类HER3(E1、E2b-、E3-)腺病毒载体：(1)Ad5[E1-,E2b-]-HER3-FL；表达人HER3全长，(2)Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM(截短的)；表达人HER3细胞外结构域(ECD)和跨膜结构域(TM)，(3)Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECD；表达人HER3 ECD，以及(4)Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDC1C2；表达人HER3 ECD和C1C2结构域。
用Ad-HER3载体进行免疫原性测试。两周后重复一次疫苗接种，加强免疫一周后处死小鼠进行免疫测定。
图11示出了HER3转基因小鼠中免疫原性测试的免疫学时间表。在第-18天和第-4天，给小鼠接种Ad载体(2.6x 1010个病毒颗粒/小鼠)，并在第0天处死每组的四只小鼠进行免疫分析。收获脾脏用于ELISPOT测定，并收集血液以测试抗体产生。
使用基于细胞的ELISA来分析抗HER3血清抗体水平。在该测定中使用了4T1鼠类乳腺癌细胞系(HER3阴性)和人HER3转染子(4T1-HER3)。将来自每只小鼠的血清从1:50滴定至1:6400。图12示出了从HER3转基因小鼠血清中进行基于细胞的ELISA分析的结果。用Ad5[E1-,E2b-]-huHER3载体、Ad-GFP对照或生理盐水对HER3转基因小鼠进行疫苗接种两次。最后一次疫苗接种后7天，对小鼠实施安乐死并收集血清。将4T1和4T1-HER3细胞接种到96孔板中。进行过夜孵育后，将细胞用缓冲液洗涤，并添加具有系列稀释度的小鼠血清(1:50至1:6400)，并在冰上孵育1小时。固定细胞，并添加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:2000)。孵育1小时后，将细胞用PBS洗涤3次，并添加TMB 5分钟。通过添加H2SO4来停止显色。显示了单个小鼠中OD450值的差异(＝[4T1-HER3的值]-[4T1的值])。基于细胞的ELISA分析结果证实，在所有Ad5-HER3疫苗接种的小鼠中均产生抗HER3抗体。在该模型中，5种腺病毒载体中的每种在诱导体液免疫方面均显示出相当的功效，但Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-FL和Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECDTM诱导产生更高水平的抗HER3抗体。阴性对照Ad-GFP和盐水未诱导体液免疫。
抗原特异性细胞应答
通过IFN-γELISPOT分析法分析了HER3转基因小鼠中的抗原特异性细胞免疫应答。仅编码全长HER3的腺病毒载体诱导了针对HER3抗原的细胞内结构域的T细胞应答。T细胞对HER3细胞内结构域的肽混合物的应答是可变的。Ad5[E1-,E2b--]-huHER3-FL、Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECDTM和Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECD-TM诱导了类似水平的针对HER3胞外域的强细胞应答。但是，编码全长HER3的Ad5[E1-]-huHER3病毒仅诱导针对细胞外结构域的弱细胞应答，这可能是由于初免疫苗诱导的抗Ad抗体所中和。
图13示出了疫苗接种诱导的抗HER3细胞应答。用Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-全长(FL)、Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECD、Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECD-TM、Ad5[E1-,E2b-]-huHER3-ECD-mC1C2或对照Ad-GFP、Ad5[E1-]-HER3(2.6x 1010个病毒颗粒/疫苗接种)对小鼠进行疫苗接种。两周后，用相同的Ad载体重复疫苗接种，四天后，收集脾脏以评估抗HER3细胞应答。将ELISPOT板用抗IFNγmAb包被过夜。将500K脾细胞放入带有HER3-ECD肽库、HER3-ICD肽库、HIV肽库(阴性对照)和PMA+伊诺霉素(阳性对照)的每个孔中。将细胞孵育过夜，并形成斑点。显示每组平均3只小鼠。
为了测试Ad-HER3疫苗在HER3转基因小鼠中的功效，进行了肿瘤治疗实验。给小鼠接种Ad5[E1-E2b-]-HER3载体(Ad5[E1-,E2b]-HER3-FL、Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECD、Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM和Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECD-C1C2)。详细情况如表4所示。
表4：治疗和测定方案
图14示出了用Ad-HER3疫苗治疗的HER3+F1杂合小鼠中JC-HER3肿瘤的生长。第0天，F1杂合小鼠(BALB/c xMMTV-neu/MMTV-HER3)接收JC-HER3肿瘤细胞注射(5x 105个细胞/小鼠，在50％Matrigel中)，并在第3和10天用Ad5[E1-,E2b-]-HER3(全长、ECD、ECDTM、ECD-C1C2)、Ad5[E1-]-HER3(2.6x 1010个vp/注射)或生理盐水进行治疗。每周测量肿瘤大小两次。显示了单个肿瘤的生长，误差线表示标准误差。
图15示出了Ad-HER3疫苗诱导的抗HER3细胞应答。第0天，F1杂合小鼠(BALB/c xMMTV-neu/MMTV-HER3)接收JC-HER3肿瘤细胞注射(5x 105个细胞/小鼠，在50％Matrigel中)，并在第3和10天用Ad[E1-,E2b-]-huHER3(全长、ECD、ECDTM、ECD-C1C2)、Ad5[E1-]-huHER3(2.6x 10E10个vp/注射)或生理盐水进行治疗。当肿瘤体积达到人道终点时，处死小鼠。将ELISPOT板用抗IFNγmAb包被过夜。将500K脾细胞放入带有HER3-ECD肽库、HER3-ICD肽库、HIV肽库(阴性对照)和PMA+伊诺霉素(阳性对照)的每个孔中。将细胞孵育过夜，并形成斑点。显示每组平均4只小鼠。
图16示出了在基于细胞的ELISA测定中，在Ad-HER3疫苗接种的F1杂合小鼠中的抗HER3抗体水平。第0天，用JC-hHER3细胞(5x 105个细胞/小鼠)植入雌性F1杂合小鼠(BALB/cx MMTV-neu/MMTV-hHER3)，然后在第3和10天用Ad5[E1-,E2b-]-huHER3(全长、ECD、ECD-TM、ECD-C1C2)或Ad[E1-]-HER3全长(2.6x 1010个vp/小鼠)来进行疫苗接种两次。一旦肿瘤体积达到人道终点，就处死小鼠，并从每只小鼠收集血液。血清用于基于细胞的ELISA分析(4T1-HER3和4T1细胞作为铺板细胞)。将HRP共轭的山羊抗小鼠IgG用作二抗，并用TMB底物显色，以及用H2SO4终止反应。显示了单个OD 450nm值(4T1-HER3细胞的OD值减去4T1细胞的OD值)。
还评估了Ad-huHER3疫苗接种后的小鼠肿瘤中HER3的表达。与生理盐水对照组相比，在用Ad-huHER3疫苗接种的小鼠中，HER3表达在肿瘤中降低，这表明Ad-huHER3载体诱导的抗HER3应答不仅降低了肿瘤的生长，而且降低了HER3在肿瘤上的表达。
图17示出了在施用Ad-HER3疫苗的小鼠的JC-HER3肿瘤中的HER3表达。第0天，F1杂合小鼠(BALB/c x MMTV-neu/MMTV-HER3)接收JC-HER3肿瘤细胞注射(5x 105个细胞/小鼠，在50％Matrigel中)，并在第3和10天用Ad5[E1-,E2b-]-huHER3(全长、ECD、ECD-TM、ECD-mC1C2)、Ad5[E1-]-huHER3(2.6x 1010个病毒颗粒/注射)或生理盐水进行治疗。当肿瘤体积达到人道终点时，处死小鼠。用抗hHER3抗体，然后用生物素偶联的抗小鼠IgG和抗生蛋白链菌素-HRP进行蛋白质印迹。
图18示出了比较Ad5[E1-,E2b-]-huHER3全长和生理盐水对照的JC-HER3治疗的存活曲线。结果表明，Ad5[E1-,E2b-]-HER3全长疫苗的存活时间显著增加。第0天，用JC-hHER3细胞(5x 105个细胞/小鼠)注射HER3转基因F1杂合雌性小鼠(BALB/c x MMTV-neu/MMTV-hHER3)，并在第3和10天用Ad5[E1-E2b-]-huHER3(全长，2.6x10E10个vp/注射)或生理盐水进行治疗。每周测量肿瘤大小两次。当肿瘤体积达到人道终点时，认为小鼠已经死亡。每组的存活曲线由具有相同治疗时间表的两个独立实验的存活数据制成。使用Kaplan-Meier方法估计总体存活率，并使用双侧对数秩检验来比较各组。
实例6
关于用Ad5[E1-,E2b-]-HER3截短的疫苗对晚期或转移性恶性肿瘤患者进行主动免疫疗法的I期研究
该实例说明了关于用Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗对晚期或转移性恶性肿瘤患者进行主动免疫疗法的I期研究。这项研究的主要目标包括：(1)评估截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的安全性和耐受性。这项研究的次级目标包括：(1)评估HER3特异性抗体和T细胞对疫苗的应答，以及(2)在抗雌激素疗法难治的ER+和/或PR+/HER2/neu乳腺癌患者中评估肿瘤组织中的HER3信号传导激活的标志物。此项研究的探索性目标包括：(1)评估免疫接种前后免疫细胞浸润进入肿瘤组织的情况；(2)扩大肿瘤组织，以进一步分析与治疗耐药性相关的途径和突变，以及(3)给出关于临床活动的初步证明的报告。
尽管可中和抗体，但第二代Ad5[E1-,E2b-]-载体比第一代Ad5[E1-]载更能诱导有效的免疫应答。与对照组相比，Ad5[E1-,E2b-]-HER3免疫接种导致更长的存活期和更大的肿瘤生长控制。临床前数据证明了使用Ad5[E1-E2b-]huHER3-ECDTM疫苗可在HER3转基因小鼠模型中实现抗肿瘤HER3定向的免疫应答活性，根据该数据，选择表达HER3的截短的形式的Ad5[E1-E2b-]-huHER3(以下称为截短的Ad5[E1-E2b-]-HER3)来作为疫苗用于本I期临床试验。另外，可能还有一个额外的安全因素，即Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM不含有可能潜在地致癌活性的激酶区域。
患者人群的基本原理。征募了患有预期会表达HER3的晚期恶性肿瘤的患者，这些患者在经过标准疗法后进展良好，已知可延长其存活期。对于这些患者，临床试验被认为是管理其疾病的适当建议。HER3在乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、头颈癌、肝癌和食道癌中过表达。
终点选择的原理。在该研究的I期，目标是在可行剂量水平范围内来确定疫苗的安全剂量。由于疫苗的预期作用机制是诱导T细胞和抗体应答，所以还检查了来自外周血的HER3特异性T细胞和抗体应答。用于测量此免疫应答的标准测定方法包括ELISPOT(可枚举HER3应答的T细胞的比例)和细胞因子流式细胞术(可鉴定CD4+和CD8+T细胞对免疫应答的贡献)。HER3特异性抗体水平由ELISA来确定。
患者选择-入选标准
I期临床试验的受试者资格由入选标准和排除标准定义。入选标准包括如下：具有已通过延长存活期的标准疗法后进展的经组织学确认的晚期实体瘤、可安全地进行核心或穿孔活检的经组织学确认的转移性或不能手术的乳腺癌和肿瘤组织。另外，受试者必须接受至少一种标准疗法的治疗。对于以下常见癌症，所需的先前疗法的定义如下。
对于结肠直肠癌，受试者必须已经接受通过至少一种由以下方案中的一种方案组成的疗法并进展：(1)5-氟尿嘧啶(或卡培他滨)和奥沙利铂，(2)-5-氟尿嘧啶(或卡培他滨)和伊立替康，(3)包括贝伐单抗或阿柏西普或雷莫昔单抗的化疗方案，或(4)包括西妥昔单抗或帕尼单抗的化疗方案。
对于乳腺癌，受试者必须已经接受通过至少一种由以下方案中的一种方案组成的疗法并进展：(1)细胞毒性化疗(蒽环类、卡培他滨或紫杉烷类)，(2)患有过表达HER2/neu(IHC 3+或FISH扩增)的肿瘤的患者必须已经接受通过在有或没有化疗的情况下包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或拉帕替尼的至少一种疗法并进展。在剂量扩展队列中，当前接受抗HER2/neu靶向疗法(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼)的乳腺癌患者符合条件，并可在研究治疗的同时继续使用这些疗法(如果已经使用这些疗法至少3个月)，或(3)如果肿瘤是ER+和/或PR+(包括芳香酶抑制剂、他莫昔芬、氟维西汀、GnRH激动剂)，则继续进行内分泌疗法。当前正在接受内分泌疗法的乳腺癌患者可继续进行这些疗法，同时可接受研究治疗(如果已接受这些疗法至少3个月)。
对于肺癌，在参与研究之前不需要抗PD1抗体疗法，然而受试者必须已经接受通过至少一种由以下方案中的一种方案组成的疗法并进展：(1)铂基(顺铂或卡铂)化疗，(2)紫杉烷类(多西他赛或紫杉醇)或长春瑞滨化疗，或(3)单药厄洛替尼、吉非替尼或克唑替尼。
对于胰腺癌，受试者必须已经接受通过至少一种由以下方案中的一种方案组成的疗法并进展：(1)吉西他滨单独使用或与其他药物合用，(2)氟尿嘧啶与奥沙利铂和/或伊立替康组合使用。
对于其他恶性肿瘤，如果存在一线疗法，则应该施用给受试者，并应该具有进展性疾病。
其他入选标准是：从先前的细胞毒性化疗或放疗到研究治疗开始的时间至少有3周、ECOG评分为0或1、预计寿命>3个月、年龄≥18岁，具有足够的血液学功能、ANC>1500/μL、血红蛋白≥9g/dL、血小板≥75000/μL，足够的肾和肝功能、血清肌酐<1.5mg/dL、胆红素<1.5mg/dL(将允许胆红素≤2.0mg/dL的吉尔伯特综合症除外)、ALT和AST≤2.5x ULN或肝脏转移≤5x ULN。ECOG评分汇总在下表5中。
表5：ECOG体力状态量表
在开始研究治疗之前至少3个月必须停止先前的免疫疗法。女性患者必须具有非生育能力或使用有效的避孕方法，例如将口服避孕药与其他屏障方法一起使用(因为研究药物可能会削弱口服避孕药的有效性)、双重避孕方法(使用杀虫剂凝胶做成的隔膜或使用避孕泡沫的避孕套)、Depo-Provera、伴侣输精管结扎术、完全禁欲，并愿意在最后一剂研究治疗药物后30天继续使用有效的避孕方法。
如果在研究治疗开始后的4周内进行了实验室检查，则在签署同意书之前将其作为护理标准进行以符合资格要求。受试者必须具有理解并提供签署的知情同意书的能力，并有能力按照本协议的要求返回研究地点进行充分的随访。仅对于有生育能力的女性，在研究治疗开始前7天内必须进行阴性血清妊娠试验。
患者选择-排除标准
I期临床试验的受试者资格由入选标准和排除标准定义。排除标准包括如下：任何先前的细胞毒性化疗和/或放疗与开始研究治疗之间的时间少于3周并且患者必须从先前的治疗中恢复到1级毒性(2级脱发或疲劳除外)、已知的中枢神经系统(CNS)/脑转移瘤(在开始研究治疗前至少4周，如果患者无症状且未使用所有类固醇，则允许已治疗的转移)-这项研究的一部分将不需要脑成像、有过诸如但不限于炎症性肠病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病或多发性硬化症等自身免疫病史(不排除自身免疫性甲状腺炎或白癜风的既往史)。
其他排除标准是患有严重的慢性或急性疾病，这些疾病对以下构成不必要的高风险：对可能遵守该协议的研究治疗、医学或心理障碍，非黑素瘤皮肤癌以外的并发或先前的第二次恶性肿瘤(过去5年内)，膀胱和子宫颈原位癌，在开始研究治疗之前48小时内存在活动性感染或全身性使用抗菌药物。由于潜在的免疫抑制作用，排除了进行连续类固醇治疗至少72小时(或使用其他连续免疫抑制剂，如硫唑嘌呤或环孢霉素A)的患者。在开始研究治疗之前，患者必须停止任何类固醇的连续治疗4周(至少持续72小时)(允许用于过敏性反应的类固醇或全身化疗的止吐药除外)。排除标准还包括存在已知的包括HIV或病毒性肝炎(乙型和丙型肝炎)的活动性急性或慢性感染，以及孕妇或哺乳妇女。
受试者每3周接受研究治疗，共进行3次疫苗接种，并第三次疫苗接种3周后返回，然后长期随访，每3个月进行一次，长达1年。第0天/第0周是第一次疫苗接种的时间。第二次疫苗接种是在第21天/第3周，第三次疫苗接种是在第42天/第6周。完成第三次疫苗接种后的三周是第63天/第9周。长期随访是随访1/第3月、随访2/第6月、随访3/第9月以及随访4/第12月。
治疗计划
给药。受试者每3周在同一条大腿上皮下(SQ)接受截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的1mL中1x 1010个病毒颗粒(VP)(用于递减治疗)、1x 1011个VP或5x 1011个VP的剂量，3次接种疫苗。基于对Ad5[E1-,E2b-]-HER3载体无剂量极限毒性的先前经验，试验中第一位患者的剂量是1x 1011个VP。DLT将按照以下定义进行评估。
剂量极限毒性定义。基于NCI CTCAE 4.03，剂量极限毒性(DLT)定义为在第一剂量的研究治疗的3周内发生的以下任何与研究治疗相关的不良事件：2、3或4级即时超敏反应、可能与疫苗接种有关的3级或4级发烧、除白癜风或发烧少于2天且低于<101.5°F外的≥2级自身免疫事件、≥2级过敏反应，或≥3级非血液学毒性。
研究治疗。研究就诊期间，在第0、3和6周进行疫苗施用。没有给予任何处方药。将每剂(Ad-HER3)皮下注射到大腿中。每次疫苗接种均使用相同的大腿。每次疫苗接种后，患者在诊所停留1小时，并在接种后15分钟、30分钟和1小时检查生命体征。
队列1。3例患者每3周在同一条大腿上皮下(SQ)接受Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM的0.2mL中1x1011个VP的剂量，进行3次免疫。免疫间隔为5厘米。在该队列中的所有患者接受第一剂量的疫苗后至少3周进行研究就诊后，评估DLT的剂量递增情况。如果没有DLT(定义如下)，则患者可开始加入队列2。如果存在≤1的DLT，则随后将其他3例患者加入该剂量水平中。在该3位额外的患者接受第一剂量的疫苗后至少3周进行研究就诊后，评估DLT的剂量递增情况。如果后面3例患者中无人具有DLT，则随后患者可开始加入队列2中。如果2例患者在此最低剂量水平下具有DLT，则将剂量递减为5x1011个VP，并建立了新的队列。
队列2。3例患者每3周在同一条大腿上的皮下(SQ)以1.0mL中5x1011个VP的剂量接受Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM，进行3次免疫。免疫部位间隔为5厘米。在该队列中的所有患者接受第一剂量的疫苗后至少3周进行研究就诊后，针对剂量水平2评估DLT。如果没有DLT，则随后加入3个其他患者。如果存在≤1的6DLT，则该剂量将是MTD。在该3个额外的患者接受第一剂量的疫苗后至少3周进行研究就诊后，评估DLT的剂量递增情况。如果该剂量水平下有2个患者具有DLT，则认为队列1中的剂量水平为MTD。在进入II期之前，对2个剂量水平之间的免疫应答进行评估。
1x 1010个病毒颗粒剂量递减治疗。制备1x1010个VP剂量用于递减治疗。抽取1mL稀释的Ad5[E1-,E2b-]-HER3_ECD_TM(细胞外结构域和跨膜结构域)，用酒精准备注射部位，并通过在大腿内皮下注射将疫苗施用给受试者。3个患者每3周在同一条大腿上皮下(SQ)以1.0mL中1x1010个病毒颗粒的剂量接受Ad5[E1-,E2b-]-HER3-ECDTM，进行3次免疫。免疫部位间隔为5厘米。在该队列中的所有患者接受第一剂量的疫苗后至少3周进行研究就诊后，评估DLT的剂量递减情况。图19示出了每个队列中的给药的一个示意图。
剂量与施用
患者每3周以1mL缓冲盐溶液中1x1010、1x1011或5x1011个病毒颗粒(VP)皮下(SQ)接受截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3，共接种3次。
截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3将以冷冻状态在2ml小瓶中提供，填充量为1ml可提取的疫苗，总共含有5x1011个VP。按照以下说明通过在0.9％盐水中稀释来产生较低的剂量。产品在≤-65℃下储存直至使用。
剂量制备说明
递减治疗。如下制备通过皮下注射的1x1010个VP的递减剂量。使用结核菌素注射器(1号注射器)从10ml的无菌生理盐水小瓶中无菌抽取0.2ml进行注射。使用第二个1.0mL结核菌素注射器(2号注射器)从截短的Ad5[E1-,E2b-]-huHER3疫苗瓶中无菌抽取0.2mL液体(5x1011VP/mL)。将抽入2号注射器的病毒颗粒注入盐水瓶中并充分混合。新溶液的浓度为1x1010个VP/mL。使用另一支注射器来抽取10mL盐水溶液中包含的1mL稀释病毒颗粒。将一支新的1mL无菌注射器标上“截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3，1x 1010个VP”。制备的疫苗(截短的Ad5[E1,E2b-]-HER3，1x 1010个vp)可在施用前于4℃保持4小时。
皮下(SQ)注射1x1011个VP。使用结核菌素注射器(1号注射器)从截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗的小瓶中无菌抽取0.2ml。可在施用前将制备的疫苗(截短的Ad5[E1,E2b-]-HER3，1x 1011个vp)于4℃下保持4小时。
皮下(SQ)注射5x1011个VP。将一支1mL无菌注射器标上“截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3，5x 1011个VP”。将1mL的截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗从其小瓶中抽入标记过的注射器中。可在施用前将制备的疫苗(截短的Ad5[E1,E2b-]-HER3，5x 1011个vp)于4℃下保持4小时。
研究评估
完整的研究方案汇总于表6中。
治疗前评估患者将在开始研究治疗之前的4周内完成以下治疗前评估。总体评估包括评估病史、ECOG表现状态以及对生命体征、体重和身高的完整身体检查。记录了患者自上个月正在接受或已接受的任何其他治疗、药物、生物制品或血液制品的情况。完成血液化学和血液学检查，这包括全血细胞分类计数、对钠、钾、氯、碳酸氢盐、血尿素氮(BUN)、肌酐、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的检查。对于有生育能力的妇女，在第一次接种疫苗前7天内完成血清妊娠检验。在治疗前或筛选就诊时收集外周血(约90毫升)以检查血清、血浆和外周血单核细胞(PBMC)，从而评估抗体和T细胞应答以及其他免疫标志物。在该研究的剂量递增治疗部分中，在第一次疫苗接种之前，需要(但不是必须)对肿瘤组织进行核心或穿孔活检。在该扩展的队列中，在第一次疫苗接种之前，需要对肿瘤组织进行核心或穿孔活检。分析肿瘤组织的HER3信号传导、T细胞浸润和其他免疫应答(包括PD-L1表达)的标志物。
治疗过程中评估。在疫苗接种日(即第0周、第3周和第6周)对受试者进行评估。在疫苗接种日，在疫苗施用前抽血。当在指定疫苗接种时间表完成之前停止研究治疗时(即退治疗)，也会进行评估。总体评估包括评估病史、ECOG表现状态以及对生命体征和体重的完整身体检查。记录了患者自最后一次就诊正在接受或已接受的任何其他治疗、药物、生物制品或血液制品的情况。接种疫苗后，患者在诊所停留约1小时，以监测是否有不良反应，并在接种疫苗后15分钟、30分钟和1小时检查生命体征。在停止研究治疗(如果指定的疫苗时间表未完成)的第0、3、6周并按照临床指示来完成血液化学和血液学检查，这包括全血细胞分类计数、对钠、钾、氯、碳酸氢盐、血尿素氮(BUN)、肌酐、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的检查。在每次疫苗接种(第0、3和6周)之前，针对PBMC、血浆和血清收集外周血(约90mL)，以评估抗体和T细胞应答以及其他免疫标志物。如果筛选抽血是在第0周抽血的3周内抽出的，则在第2次免疫之前(第3周就诊)将不获得抽血。
治疗后评估。在第三次疫苗接种(即第9周)后三周(第+/-14天)完成了患者评估。总体评估包括评估病史、ECOG表现状态以及对生命体征和体重的完整身体检查。记录了患者自最后一次就诊正在接受或已接受的任何其他治疗、药物、生物制品或血液制品的情况。完成血液化学和血液学检查，这包括全血细胞分类计数、对钠、钾、氯、碳酸氢盐、血尿素氮(BUN)、肌酐、钙、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的检查。针对血清、血浆和PBMC收集外周血(约90mL)，以评估抗体和T细胞应答以及其他免疫标志物。在该研究的剂量递增治疗部分中，在第三次疫苗接种之后，需要(但不是必须)对肿瘤组织进行核心或穿孔活检。在该扩展的队列中，在第三次疫苗接种之后，需要对肿瘤组织进行核心或穿孔活检。分析肿瘤组织的HER3信号传导、T细胞浸润和其他免疫应答(比如PD-L1表达)的标志物。
长期随访。完成第9周治疗但疾病未出现进展(由主治医师确定)的患者，则在第9周就诊后进行长期随访，每3个月(第+/-28天)返回，长达1年。在每次长期随访中，完成总评估和免疫学评估均。为了进行免疫学评估，根据主要研究人员或指定人员确定的免疫应答证据来收集外周血(约40-90mL)。长期随访并不适于在第9周完成之前疾病出现进展或未完成指定疫苗接种时间表的患者。然而，所有接受研究治疗的患者在首次研究疫苗后都将针对存活情况被跟踪长达3年。存活状态通过个人询问或对医疗或公共记录的审查来评估。
统计方面考虑
安全性。该剂量找寻试验的安全性目的是确定截短的Ad5[E1-,E2b-]-HER3的最大耐受剂量(MTD)。定期评估每位患者的安全性。在以先前剂量水平进行治疗的患者接受首次注射后的至少3周，对是否升级至下一剂量水平来进行总体评估。在剂量递增治疗中的每个剂量水平下，对每位患者的安全性进行评估。如果使用至少一种免疫进行治疗，则认为可评估患者的安全性。在9周内观察DLT，以适应所有3个产品剂量的安全性评估。
免疫应答率。在接受了至少3次免疫的以最大耐受剂量(MTD)治疗的所有患者中评估免疫应答。从以下测定从患者外周血评估针对HER3和其他抗原的免疫应答：ELISPOT、细胞因子流式细胞仪和抗体应答。免疫原性测定在每次免疫治疗之前和第12周进行。如果在MTD下接受治疗的12名患者中至少有6名(50％)表现出如上定义的免疫应答，则认为该疗法具有进一步的意义。观察到的0.50的比率将具有0.28-0.71的80％确切置信区间。如果真实的免疫应答率为0.30，则观察到至少0.50的应答率的概率为0.12。如果真实免疫应答率为0.60，则观察到至少0.50的应答率为的概率0.84。
HER3信号传导的评估。通过RT-PCR来评估免疫接种前后所获得的肿瘤组织的heregulin mRNA和/或通过qIHC来评估HER3。高heregulin mRNA的高表达定义为评分>-5。qIHC评估的低HER3定义为Log10 HER3<5.1(76)。通过患者是否具有HER3生物标志物来分析临床应答。将回顾免疫治疗前后的可用影像学研究。RECIST 1.1和irRR标准将用于报告临床活动。
实例7
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗治疗晚期或转移性恶性肿瘤
该实例说明了用Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗治疗晚期或转移性恶性肿瘤。将Ad5[E1-,E2b-]-HER3疫苗施用给有需要的受试者。疫苗的施用通过大腿皮下注射进行。每个疫苗剂量范围为1x1019-5x1012个病毒颗粒。剂量总共施用3次，间隔为1至3周。每隔一、二或三周给予加强免疫。
受试者患有恶性肿瘤，该肿瘤的特征在于HER3过表达的病症。该病症是乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌或黑素瘤。将HER3表达用作预后工具，以追踪已接种疫苗的受试者的应答和疾病进展。
实例8
用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗治疗晚期或转移性恶性肿瘤
该实例说明了用Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗治疗晚期或转移性恶性肿瘤。该Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗包括Ad5[E1-,E2b-]-HER1、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu、Ad5[E1-,E2b-]-HER3、Ad5[E1-,E2b-]-HER4或其任意组合。将组合式疫苗施用给有需要的受试者。疫苗的施用通过大腿皮下注射进行。每个疫苗剂量范围为1x109-5x1012个病毒颗粒。剂量总共施用3次，间隔为1至3周。每隔一、二或三周给予加强免疫。
受试者患有恶性肿瘤，该肿瘤的特征在于HER1、HER2/neu、HER3、HER4或其任意组合过表达的病症。该病症是乳腺癌、肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌或黑素瘤。将HER1、HER2/neu、HER3、HER4表达或其任意组合用作预后工具，以追踪已接种疫苗的受试者的应答和疾病进展。
实例9
晚期或转移性恶性肿瘤患者中用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗进行主动免疫疗法的I期研究
该实例说明了在晚期或转移性恶性肿瘤患者中用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗进行主动免疫疗法的I期研究。I期研究的进行情况如示例6所述。进行测试的疫苗包括Ad5[E1-,E2b-]-HER1、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu、Ad5[E1-,E2b-]-HER3、Ad5[E1-,E2b-]-HER4或其任意组合。
实例10
用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗治疗癌症
该实例说明了用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗治疗有需要的受试者的癌症。有需要的受试者是患有晚期或转移性恶性肿瘤的患者。将Ad5[E1-,E2b-]-HER1、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu、Ad5[E1-,E2b-]-HER3、Ad5[E1-,E2b-]-HER4或其任意组合的药物组合物在大腿进行皮下注射。递送的总疫苗剂量为1x109-5x1011个病毒颗粒。每三周施用免疫治疗，总共进行三次免疫治疗。每隔一、二或三周给予加强免疫。
实例11
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和共刺激分子组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合共刺激分子来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。该共刺激分子是B7-1、ICAM-1或LFA-3。该受试者是任何动物，例如哺乳动物，比如小鼠、人类或非人类灵长类动物。在施用该疫苗和共刺激分子后，针对表达HER的癌症的细胞和体液应答启动，并消除了该癌症。
实例12
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和检查点抑制剂组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合检查点抑制剂来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。该免疫检查点抑制剂是抗PDL1抗体，比如阿维鲁单抗。按照包装说明书上的标签，以10mg/kg的剂量给药和施用阿维鲁单抗。该受试者是任何动物，例如哺乳动物，比如小鼠、人类或非人类灵长类动物。在施用该疫苗和检查点抑制剂后，针对表达HER的癌症的细胞和体液应答启动，并消除了该癌症。
实例13
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和工程化的NK细胞组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合共刺激分子来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。另外，将工程化的NK细胞，具体地将活化的NK细胞(aNK细胞)施用给受试者。在第-2、12、26和40天以每次治疗2x109个细胞的剂量来输注aNK细胞。有需要的受试者具有表达HER的癌细胞，且癌症被消除。受试者为任何哺乳动物，例如人类或非人类的灵长类动物。
实例14
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和ALT-803组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合共刺激分子来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。还分别在第1、2、4、5、7和8周以10μg/kg的剂量将超激动剂/超激动剂复合物(比如ALT-803)皮下(SC)注射给受试者。有需要的受试者具有表达HER的癌症，且癌症被消除。受试者为任何哺乳动物，诸如人类或非人类动物。
实例15
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和低剂量化疗组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合共刺激分子来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。
还向受试者施用低剂量化疗。化疗为环磷酰胺。可使用低于临床护理剂量的剂量来施用化疗。例如，化疗在第1至5天和第8至12天以50mg一天两次(BID)施用，每两周一次，共8周。该环磷酰胺进行口服或静脉内施用。有需要的受试者具有表达HER的癌症，且癌症被消除。受试者为任何哺乳动物，诸如人类或非人类动物。
实例16
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3和低剂量放疗组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了治疗有需要的受试者中的表达HER的癌症细胞。将编码HER3或HER3与HER1、HER2/neu和/或HER4的任意组合的Ad5[E1-,E2b-]载体以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合共刺激分子来施用给有需要的受试者。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。然后，每两个月进行一次加强注射。
还向受试者施用低剂量放疗。低剂量放疗的剂量低于护理剂量的临床标准。在第8天、22天、36天、50天(每2周施用4剂)以8Gy同步进行立体定向体放疗(SBRT)。使用SBRT对所有可行的肿瘤部位施用放疗。有需要的受试者具有表达HER的癌症，且癌症被消除。受试者为任何哺乳动物，诸如人类或非人类动物。
实例17
用Ad5[E1-,E2b-]-HER3、Ad5[E1-,E2b-]-HER2、Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-MUC1疫苗和检查点抑制剂组合治疗表达HER的癌症
该实例说明了用组合式Ad5[E1-,E2b-]-HER疫苗治疗有需要的受试者中表达HER的癌症细胞。将Ad5[E1-,E2b-]-HER3(全长HER3或截短的HER3)、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu(全长HER2或截短的HER2)、Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-,E2b-]-MUC1或其任意组合的药物组合物以1x109-5x1011个病毒颗粒(VP)的剂量组合检查点抑制剂来皮下注射给有需要的受试者。然后，每两个月进行一次加强注射。该免疫检查点抑制剂是抗PDL1抗体，比如阿维鲁单抗。按照包装说明书上的标签，以10mg/kg的剂量给药和施用阿维鲁单抗。在适用的情况下，受试者以10mg/kg的剂量接受经1小时(-10分钟/+20分钟，即50至80分钟)的阿维鲁单抗静脉内输注。总共施用3次疫苗，每次疫苗接种间隔3周。在第一次注射疫苗后3周，从第二次疫苗治疗开始使用阿维鲁单抗进行治疗。替代地，使用阿维鲁单抗的治疗与首次疫苗治疗同时开始，并每2周进行一次给药。该受试者是任何动物，例如哺乳动物，比如小鼠、人类或非人类灵长类动物。在施用该疫苗和检查点抑制剂后，针对表达HER的癌症的细胞和体液应答启动，并消除了该癌症。
鉴于本发明，可在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但本领域技术人员应了解，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可将各种变型应用于本文所述的方法和步骤中或步骤的顺序中。更具体地，应了解，在化学和生理学上均相关的某些试剂可代替本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代物和修改都被认为落入所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
序列
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Claims (9)

1.一种组合物，所述组合物包括重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体包括：
所述重组腺病毒载体的E1基因区域中的缺失、E2b区域中的缺失和E3区域中的缺失；和
编码截短的HER3抗原的核酸序列，所述截短的HER3抗原与SEQ ID NO:87具有100％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的组合物，其进一步包括：
(a)重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码全长HER3抗原的核酸序列；
重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码MUC1抗原的核酸序列；
重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码Brachyury抗原的核酸序列，
或其任意组合；和/或
(b)共刺激分子。
3.如权利要求2所述的组合物，其中：
(a)全长HER3抗原由SEQ ID NO:86组成；和/或
(b)所述MUC1抗原由SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:11组成；和/或
(c)所述Brachyury抗原由SEQ ID NO:13组成。
4.如权利要求1所述的组合物：
(a)进一步包括抗PDL1抗体；和/或
(b)进一步包括重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码HER1抗原、HER2/neu抗原、HER4抗原或其任意组合的核酸序列，其中所述编码HER2/neu的核酸序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的位置1033-3107组成；和/或
(c)进一步包括重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码HER2/neu的核酸序列，其中所述编码HER2/neu的核酸序列由SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的位置1033-3107组成；和/或
(d)进一步包括重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码HER1的核酸序列；和/或
(e)进一步包括重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体，所述重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体包括编码HER4的核酸序列；和/或
(f)包括所述编码HER2/neu的核酸序列的重组Ad5[E1-,E2b-]腺病毒载体与SEQ IDNO:3具有100％的序列同一性。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述HER2/neu抗原由SEQ ID NO:2组成。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其任意组合。
7.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1所述的组合物及药学上可接受的载体。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如权利要求1所述的组合物。
9.一种制备肿瘤疫苗的方法，所述方法包括制备如权利要求7所述的药物组合物。
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