CN1252283C - 卵巢癌的检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测人染色体异常(尤其3q26.2异常)以进行癌症基因诊断和预后的方法，它包括步骤：在探针与靶序列会形成稳定杂交复合体的条件下，将待测对象的染色体样品与含有一种或多种核酸探针的组合物接触，其中所述的探针含有全长eIF-5A2或其片段的核苷酸序列；和检测所述的杂交复合体。本发明还提供了相应的检测试剂盒。

Description

卵巢癌的检测方法和试剂盒

本发明涉及细胞遗传学领域。更具体的，本发明涉及鉴别真核起始抑制5A2(eIF-5A2)的扩增，该扩增是多种癌症的良好诊断指示物。此外，本发明还提供了对eIF-5A2特异的探针和试剂盒。

卵巢癌是妇女泌尿生殖癌症中主要的导致死亡的病因，约1％美国妇女在其一生中受到卵巢癌的影响。如果没有被早期诊断的话，卵巢癌的预后很差，五年生存率不到10％。与其他一些实体瘤相比，人们至今对卵巢癌的分子发病机理及其发展过程了解甚少。

染色体异常通常与遗传疾病、退化性疾病和癌症相关。具体地，整个染色体或染色体片断拷贝的缺失或复制，以及基因组特定区域的更高等级的扩增，通常发生于癌症中。事实上，含有原癌基因和肿瘤抑制基因的DNA序列的扩增和缺失经常是肿瘤发生所特有的。很明显，对扩增和缺失区域的鉴定以及对相关基因的克隆，对于研究肿瘤发生和开发癌症诊断技术都是至关重要的。

检测扩增或缺失的染色体区域，通常通过细胞遗传学进行。因为DNA经复杂折叠形成染色体，因此细胞遗传技术的分辨率被局限于大于约10MB的区域；这几乎是Giemsa染色的染色体中条带的宽度。在复杂的具有多个转座和其他遗传变化的核型中传统细胞遗传分析方法的用途很有限，因为缺乏核型信息或难以被解释。此外常规细胞遗传学条带分析法是费时费力的，而且经常十分困难或不可能。

最近，克隆探针已用于通过Southern印迹法评估给定DNA序列在染色体中的数量。即使在基因组是高度重排，以致于消除有用的核型信息的情况下，该方法也是有效的。然而Southern印迹法仅仅给出了有关DNA序列拷贝数的大致估算并不能给出该序列在染色体中位置的任何信息。

比较染色体杂交法(CGH)是更新的一种鉴别扩增/缺失序列存在与否及其位置的方法。与Southern印迹法一样，CGH可揭示扩增和缺失，而不受基因组重排的影响。此外，CGH提供了比Southern印迹法更定量的对拷贝数的估计，而且还可以提供扩增或缺失序列在正常染色体中的位置信息。

最近，用比较基因组杂交技术(CGH)，在原发性卵巢癌中鉴别出了3q25-qter中的一个频繁扩增的区域。最小的重迭扩增区被定位于3q26。

鉴别出经常扩增的染色体区域以及所述区域中相应癌基因，对于了解肿瘤发生的分子机理是绝对必要的。最近，编码磷脂酰肌醇3-激酶的催化亚基的PIK3CA，已被暗示是3q26区的候选癌基因(Shayesteh，L.，et al.，Nat.Genet.，21：99-102，1999)。因为在一些病例中仅有低水平的PIK3CA扩增，并且卵巢癌细胞系UACC-1598在3q26区含有高水平的双微体形式的扩增(Brooks，D.J.，etal.，Br.J.Cancer，74：1518-1525，1996)，所以在该区域可能还有另一癌基因。

因此，本领域迫切需要寻找与卵巢癌有关的癌基因，尤其是在3q26区中的癌基因。然而，在本申请之前，还没有报道并证实过其他与卵巢癌有关的癌基因。

在本发明的第一方面，提供了一种检测人染色体异常的方法，它包括步骤：

在探针与靶序列会形成稳定杂交复合体的条件下，将待测对象的染色体样品与含有一种或多种核酸探针的组合物接触，其中所述的探针含有全长eIF-5A2或其片段的核苷酸序列；和

检测所述的杂交复合体。

较佳地，所述的检测杂交复合体的步骤包括检测靶序列的拷贝数。

在本发明的一个实例中，所述的检测杂交复合体是通过检测荧光标记物。

在本发明的一个实例中，所述的染色体异常是扩增。

5.如权利要求1所述的方法，所述的全长eIF-5A2及其片段包括：DNA、cDNA和反义DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种检测癌症的试剂盒，它包括：

标记的核酸探针，该探针可特异性地结合于人eIF-5A2的核苷酸序列，且该核酸含有全长eIF-5A2及其片段的核苷酸序列。

较佳地，所述的试剂盒还含有对染色体3的端粒序列特异的参照探针。

在本发明的另一方面，提供了一种检测肿瘤或肿瘤易感性的方法，

将含有全长eIF-5A2或其片段的核苷酸序列的探针，与待测个体的DNA样品进行杂交；和

检测形成的杂合体数目是否高于正常对照，

其中形成的杂合体数目是否高于正常对照就表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。

较佳地，所述的肿瘤选自下组：卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和输卵管癌。

在本发明的又一方面，提供了一种检测肿瘤或肿瘤易感性的方法，它包括步骤：

在适合形成抗体复合物的条件下，将含有特异性抗eIF-5A2蛋白的抗体与待测个体的DNA样品进行接触；和

检测形成的抗体复合物数量是否高于正常对照，

其中形成的抗体复合物数量高于正常对照就表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。

图1：A，用CGH检测出的3q25-q26在两例原发性卵巢癌中的扩增情况。肿瘤DNA和正常参照DNA用绿色和红色标出。B，将显微解剖的3q26DNA与正常的中期染色体杂交(显示了部分中期)。C，G-条带化的部分中期，其中箭头指向3q26.2处的杂交。D，与图1C相同的部分中期，然后用含eIF-5A2的BAC克隆(红色)进行FISH，位于3q26.2。

图2：推导的人eIF-5A2氨基酸序列与人eIF-5A以及鸡eIF-5A的序列排列。相同的序列用黑色标出。8-羟-2，7，10-三氨基癸酸(hppusine)修饰所需的eIF-5A的最小区域用框线标出。星号表示在翻译后被修饰成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的赖氨酸残基。

图3：用Southern印迹法(图3A)和用外显子(204bp)内的引物进行PCR(图3B)证实了BAC克隆含有eIF-5A2基因。基因组DNA是从正常胎盘制备的，而BAC克隆用EcoRI消化并与eIF-5A2cDNA杂交。图3C，用RT-PCR检测eIF 5A2在6种正常组织中的表达。

图4：A，Southern印迹法显示eIF-5A2在5种原发性卵巢癌和卵巢癌细胞系UACC-1598中有扩增。15mg经EcoRI消化的DNA，在0.8％琼脂糖凝胶中分离并与1.2kb eIF-5A2cDNA探针杂交。针对β-肌动蛋白的探针被用作对照。

B，对4种原发性卵巢癌和UACC-1598的Northern印迹分析。在每个泳道中上样10mg总RNA，并与1.2kb eIF-5A2cDNA探针杂交。对于Northern印迹，将溴化乙锭染色的RNA分离凝胶作为对照。

图5：在两个卵巢癌细胞系中用FISH检测到的eIF-5A2扩增。A，将含eIF-5A2的BAC克隆与卵巢癌细胞系UACC-1598中的双微体进行杂交。B，在卵巢癌细胞系OVACA3中观察到6个拷贝的eIF-5A2。C，eIF-5A2被定位于3q26.2中的最小重迭扩增区。

在本发明人的CGH研究中，在15/30(50％)原发性卵巢癌中检测到3q扩增(gain)。在4个病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)中观察到3q26中最小重迭区中3q的高拷贝扩增。3q扩增还经常见于其他一些实体瘤，如鼻咽癌、前列腺癌和输卵管癌等。这些研究强烈表明，在3q26区可能含有与各种实体瘤(包括卵巢癌)的发病和发展有关的癌基因。

本发明人利用eIF-5A2的DNA序列从细菌人工染色体(BAC)库筛选出一个携带eIF-5A2的BAC克隆(PP11-115J24)，并应用荧光原位杂交技术将其定位在3号染色体长臂3q26带。通过用Southern印迹和Northern印迹技术检测，证明eIF-5A2在我们用CGH检测的3q26带扩增的卵巢癌中都有不同程度的DNA扩增及RNA过高表达。特别是在一种带有双微体(DM)的卵巢癌细胞株(UACC-1598)中，带有eIF-5A2的BAC克隆杂交到双微体上。双微体是一种染色体外的小片段DNA，被认为是肿瘤细胞中基因扩增在细胞学上的表现之一。UACC-1598已被证实来自3q26带。所以，eIF-5A2可被认为是该例卵巢癌最主要的致癌相关基因之一。

eIF-5A2基因用于恶性肿瘤的临床诊断和预后本发明人利用组织芯片技术对近200例原发性卵巢癌患者进行eIF-5A2扩增检测，结果发现eIF-5A2的扩增与卵巢癌的预后密切相关。被检出有eIF-5A2扩增的病人，其5年生存率明显低于无eIF-5A2扩增的病人。所以，eIF-5A2扩增与否可以作为判断卵巢癌病人预后的重要指标之一。此外，由于3q扩增常见于鼻咽癌、前列腺癌和食道癌等恶性肿瘤，所以，eIF-5A2扩增还可作为这些肿瘤预后的依据之一。

定义

如本文所用，“染色体样品”指制备的用于标准原位杂交的组织或细胞样品。在制备的该样品中各个染色体基本保持完好并且通常含有根据标准技术制备的分裂中期的扩展(spread)和间期核。

“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外说明该术语已包括能够与天然核苷酸类似方式发挥作用的天然核苷酸的类似物。

“亚序列”指含有更长序列核酸中一部分核酸的核酸序列。

“探针”或“核酸探针”指一种或多种核酸片断的集合，可检测它们与靶目标的杂交。探针被如下所述的标记，使得可检测它与靶目标的结合。探针是用一种或多种特定部分的基因组制备的，例如一种或多种克隆分离的完整染色体或染色体片断或聚合酶链反应(PCR)产物。探针可以用某种方式进行加工，例如通过封闭或去除重复的核酸或富含独特的核酸。因此术语“探针”不仅指可检测的核酸，还指应用于靶目标的可检测核酸。

“杂交”指通过互补碱基的配对而使两个单链核酸结合在一起。

“基本结合于”或“特异结合”或“选择性结合”或“特异性杂交于”，指在寡核苷酸和靶序列之间的互补杂交反应，并可包括微小的错配，这些错配可通过降低杂交介质的严紧度来实现检测所需靶多核苷酸序列。该术语还指在严紧条件下，一分子结合、复合或杂交与特定核苷酸序列，当该序列存在于复合的混合物中(如总细胞NDA或RNA)时。术语“严紧条件”指探针杂交于靶定亚序列而不杂交于其他序列的条件。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。较长的序列可在更高的温度下特异性杂交。通常，选定的严紧条件是比在限定的离子强度和pH下推定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。该Tm是在达到平衡时，有约50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。通常，对于短探针而言，严紧条件是这样的条件，其中盐浓度至少约0.02Na离子浓度(或其他盐)，pH7.0-8.3，且温度至少约60℃。严紧条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。

本领域的技术人员会理解，此处所述的具体探针的确切序列可以被一定程度地修改(修饰)，以产生与所公开的探针“基本相同”但保留基本结合于靶序列能力的探针。这些修改被本文各探针所覆盖。术语多核苷酸的“基本相同”指，与参照序列相比，一个序列有至少90％，更佳地至少95％序列相同性。

两个核苷酸序列被认为“相同”，如果以最大对应性排列时，两个序列中的核苷酸序列是相同的。如本文所用，术语“互补”指互补序列与参照序列的全部或一部分是序列的。

两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较，通常是将两个序列的序列在“比较窗”范围内进行比较，以鉴别和比较局部区域的序列相同性。如本文所用，“比较窗”指至少约20个邻接位置，通常约50-200，更通常约为100-150个邻接位置，其中在两个序列被最佳排列后，将一个序列与具有相同数目邻接位点的参照序列进行比较。

“序列相同性百分比”的确定，是通过将两个最佳排列的序列在比较窗内进行比较而得出的。其中与参照序列(不含有插入或缺失)相比，为了获得两个序列的最佳排列，在比较窗中的多核苷酸序列可含有插入或缺失(即缺口)。百分比的计算如下：通过确定在两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基的数目，得到匹配位置的数目。然后将匹配位置数目除以比较窗中位置数目的总数，并将结果乘以100％，从而得到序列相同性百分比。

另一种表明核苷酸序列是基本相同的方法，是判断两个分子是否在严紧条件下杂交于同一序列。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。

本领域的技术人员会理解，使用本文所公开的序列信息和克隆，技术人员可以通过常规方法(如Southern或Northern印迹法)，从人基因组文库中分离相同或相似的探针。

探针的标记

标记核酸探针的方法是本领域技术人员熟知的。优选的探针是适用于原位杂交的探针。在杂交反应之前，核酸探针可以被可检测地标记。或者，使用结合于杂交产物的可检测标记物。这些可检测标记物是本领域熟知的，并且包括任何具有可检测的物理或化学性质的物质。

如本文所用，“标记物”是任何一种可通过光谱法、光电法、生物化学法、免疫化学法、或化学法检测的物质。可用于本发明的标记物包括：放射性标记物(如³²P，¹²⁵I，¹⁴C，³H，³⁵S)，荧光染料(如荧光素、罗丹明)，电子致密试剂(如)金，酶(如ELISA中常用的酶)，比色标记(如胶体金)，磁标记(如Dynabeads^TM)等。不直接检测但可通过使用直接检测标记物而被检测的标记物例子，包括生物素、地高辛、以及已有标记抗血清或单抗的半抗原和蛋白质。

使用具体的标记物对于本发明而言并不重要，只要它不干扰原位杂交的染色。然而，对于染色体杂交而言，用荧光标记物(如荧光素-12-dUTP等)进行直接染色是优选的。

如本文所用，直接标记的探针是附着有可检测标记物的探针。因为直接标记物已附着在探针上，因此随后不需要步骤将探针与可检测标记物关联起来。与之相反，间接标记的探针是携带随后(通常在探针与靶核酸杂交后)能结合可检测标记物的分子的探针。

此外，探针应能检测尽可能低的拷贝数，从而使分析的灵敏度最高，同时又能高于背景信号。最后，必需选择可提供高局部信号的探针，从而在将染色结果与染色体进行物理定位时可提供高空间分辨率，

可用本领域技术人员已知的各种方法，将标记物偶联于探针。在优选例子中，核酸探针是用缺口翻译或随机引物延伸法标记的。

本领域技术人员会理解，本发明的探针没有必要对eIF-5A2绝对特异。相反，探针是用于产生“染色反差”的。“反差”是由在基因组靶区域中探针浓度与基因组其他区域中探针浓度之比确定的。

如上所述，一检测到eIF-5A2的扩增是多种癌症存在与否以及预后的标志。这些癌症包括(但并不限于)：卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和输卵管癌。

在优选实施例中，通过将本发明的探针与靶核酸(如染色体样品)的杂交来检测eIF-5A2的扩增。合适的杂交方式是本领域技术人员已知的，包括(但并不限于)各种Southern印迹法、原位杂交和定量扩增方法(如定量PCR)。

在一优选例中，eIF-5A2扩增是通过原位杂交鉴别的。通常，原位杂交包括下列主要步骤：(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)对生物结构进行预杂交以增加靶DNA的可接近性(acessibility)，并减少非特异性结合；(3)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸进行杂交；(4)进行杂交后的洗涤以去除在杂交反应中未杂交的核酸；和(5)检测杂交的核酸片段。根据具体应用，用于每一步骤的试剂及使用条件可以变化。

用于检测染色体异常的FISH法，可用于纳克数量的有关核酸。可以使用石蜡包埋的肿瘤切片，以及新鲜或冷冻的样品。因为FISH可用于数量有限的材料，因此可使用从未培养的原发性肿瘤所制备接触式制品(touch preparation)。例如，可使用来自肿瘤的少量活检样品以制备接触式制品。还可以分析来自少量针吸活检样品或体液(如血液、尿液等)中的细胞。对于产前诊断，合适的样品包括羊水等。

在Southern印迹法中，基因组或cDNA(通常是片段化并用电泳凝胶分离)与对靶区域特异的探针杂交。将来自针对靶区域的探针的杂交信号强度，与针对多种(非扩增的)如着丝粒DNA的探针的信号强度进行比较，从而提供靶核酸的相对拷贝数的估测值。

eIF-5A2核酸、蛋白和抗体

基于本发明所揭示的eIF-5A2与卵巢癌的相关性以及eIF-5A2的序列信息，利用本领域的常规技术来产生eIF-5A2蛋白或片段，并用相应的eIF-5A2蛋白或片段来产生抗eIF-5A2的抗体。

本发明的人eIF-5A2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

另一方面，本发明还包括对人eIF-5A2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人eIF-5A2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人eIF-5A2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人eIF-5A2蛋白的分子，也包括那些并不影响人eIF-5A2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人eIF-5A2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人eIF-5A2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人eIF-5A2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人eIF-5A2功能的抗体以及不影响人eIF-5A2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人eIF-5A2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人eIF-5A2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

基于特异性的抗eIF-5A2抗体，本发明还提供了一种检测肿瘤或肿瘤易感性的方法，它包括步骤：

在适合形成抗体复合物的条件下，将含有特异性抗eIF-5A2蛋白的抗体与待测个体的DNA样品进行接触；和

检测形成的抗体复合物数量是否高于正常对照，

其中形成的抗体复合物数量高于正常对照就表示该个体患有肿瘤或肿瘤易感性高于正常人群。

试剂盒

本发明还提供了诊断eIF-5A2异常的诊断试剂盒。在优选例中，一种试剂盒包括一种或多种针对eIF-5A2的探针。该试剂盒还可含有封闭探针以及描述如何使用试剂盒来检测eIF-5A2的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种：用于协助检测探针的各种标记物或标记试剂；用于杂交的试剂(包括缓冲液、中期铺展剂(metaphase spread)，BSA和其他封闭试剂)；采样装置，包括细针头等；以及阳性和阴性杂交对照等。

与现行用于恶性肿瘤临床诊断和预后的其他方法比较，本发明的优越性主要表现在：鉴于eIF-5A2与卵巢癌的密切相关性，本发明方法在检出的灵敏度，准确性都显著优于现有的卵巢癌基因诊断方法，不仅填补了检测的盲区，而且操作简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料

肿瘤样品和细胞系

原发性卵巢癌样品是在手术时通过癌症研究所(中国，广州)获得。卵巢癌细胞系UACC-1588和UACC-2727是从University of Arizona Comprehensive CancerCenter的Tissue Culture Core Serivce处获得。

卵巢癌细胞系OVCAR3是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

方法

染色体显微解剖

染色体显微解剖和显微解剖的DNA的PCR扩增，按Guan，X.-Y.et al.，Hum.Mol.Genet.，2：1117-1121，1993中所述的方法进行。简而言之，从正常中期染色体的G-条带中解剖出5个拷贝的3q26条带。解剖的DNA片段用拓扑异构酶I处理，然后用UN1引物(5′-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′)进行PCR扩增。

cDNA合成和文库构建

根据制造商(RiboClone cDNA Synthesis System，Promega)的方案，在噬菌体lGEM4中构建随机引发的cDNA文库。对于杂交体(杂交复合体)选择，用SMARTPCR cDNA Library构建试剂盒(Clontech)，从OV-4mRNA制备随机引物合成的cDNA。

杂交体选择

按Guan，X.-Y.et al.，Cancer Res.，56：3446-3450，1996中所述的方法进行杂交体选择。该方法是使用随机引物从含3q26扩增的卵巢癌OV-4合成的cDNA，从而从显微解剖的3q26DNA片段中选出编码区序列。简而言之，将5mg随机引物延伸的cDNA固定在直径7mm的尼龙膜上，并与从3q26区显微解剖DNA片段扩增出的PCR产物，在200毫升杂交溶液(5XSSC，5X Denhardt′s溶液，0.1％SDS，100mg/ml鲑精DNA，和100mg/ml人Cot-1DNA)中，于65℃和轻微晃动下杂交过夜。在严紧洗涤后，对杂交的显微解剖DNA进行洗脱，并用PCR回收。

cDNA文库筛选

将PCR回收的、选定的DNA片段(100ng)，通过随机引物法(Gibco BRL)用³²P进行标记，然后在Sephadex G50上纯化。将探针与100mg人Cot-1DNA在65℃预杂交1小时，然后用标准方法与cDNA文库噬斑进行杂交。

染色体定位

将通过BLAST数据库检索而选出的BAC克隆，用光谱橙-dUTP(Spectrum-orange-dUTP)(Gibco BRL)，通过缺口翻译法进行标记。然后按Guan，X.-Y.et al.，Cancer Res.，56：3446-3450，1996中所述，用FISH法将标记的探针与预条带化(prebanded)的正常淋巴细胞中期染色体杂交。

Southern和Northern印迹分析

将来自人胎盘、原发性卵巢癌样品、和卵巢癌细胞系的基因组DNA，用SDS/酚/氯仿法进行分离。用EcoRI消化DNA，然后在1％琼脂糖凝胶上分级，再转移至尼龙膜(Zeta-probe，Bio-Rad)，与³²P标记的针对eIF-5A2和PIK3CA基因的探针，在42℃杂交过夜。用Trizol/氯仿法制备总细胞RNA，在1％琼脂糖/2.2M甲醛凝胶上进行大小分级，再转移至尼龙膜上，与³²P标记的针对eIF-5A2和PIK3CA基因的探针进行杂交。

FISH探针的制备和FISH实验方法

1.随机引物标记法(BioPrime DNA Labeling System)

此方法使用随机引物来标记DNA分子，通过标记反应可以产生数倍于初始DNA量的标记探针。因此，此标记法特别适用于仅有少量DNA的标记，如BAC和PAC的DNA标记。另外，如DNA的纯度不高(如含太多RNA)，则容易产生较多的非特异信号，故此标记法对DNA的纯度要求较高。一般可以使用LifeTechnologies公司的随机引物标记试剂盒。

(1)将100mg DNA溶入24μl水中，置于冰上，加入20μl随机引物溶液(2.5X)。将混合后的DNA煮沸变性5分钟，立即置于冰上。

(2)加入5μl 10XdNTP溶液，轻轻地将离心管内试剂彻底混匀，再加入1μl的酶溶液。

(3)混匀后，将反应物在37℃中培养1小时，取2μl做凝胶电泳检查。如果被标记的DNA探针片段在200-2000bp之间，标记效果最佳。

(4)终止反应可通过加热到75℃，10分钟，或加5μl反应终止缓冲液。

2.杂交前处理及原位杂交

(1)、染色体玻片前期处理

杂交前，将载有上期染色体的玻片进行RNA酶处理。在玻片上加200微升RNA酶溶液(100μg/ml，溶解在2XSSC中)，盖一载玻片，置37℃孵箱内消化30-60分钟，然后在2XSSC溶液中洗10分钟，经70％、85％、100％梯度酒精脱水，置空气中干燥。

(2)、染色体变性

将已制备好载有分裂中期染色体的玻片放入变性液中(70％Formanide，2XSSC)75℃变性2分钟，经70％、85％、100％梯度酒精脱水，空气中干燥。

(3)、探针变性及杂交

加入50-200mg的探针于杂交缓冲液中(共10μl杂交液)：7μl杂交缓冲液(70％甲酰氨2X SSC，10％硫酸葡聚糖)，2μl探针，1μl阻断DNA(Cot-1DNA)。将混匀后的杂交液放入75℃变性5分钟，然后转入37℃。预杂交20-30分钟。将探针滴在玻片上，加盖玻片，立即用橡胶粘固剂封好四周，放入湿盒内，置于37℃恒温箱内杂交过夜。

3.杂交后处理及显微观察

(1)、洗片

先除去封片的橡胶粘固剂和盖玻片，将玻片放在45℃的FISH洗液I(50％甲酰氨，2XSSC)中洗三次，每次5-10分钟。然后将玻片放入FISH洗液II(4XSSC，0.05％吐温20)中。洗三次，每次2分钟。最后放入FISH洗液III(4XSSC)中洗2分钟。后二步洗片均在室温中进行。

(2)、卵白素(Avidin)处理

处理前，先用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性抗体结合点，从而减少非特异性杂交信号。加100微升1％BSA在载玻片上，37℃中封闭30分钟，然后在洗液III中洗2分钟。使用前临时配制卵白素及抗卵白素抗体溶液，将卵白素及抗卵白素抗体分别溶解于PNM缓冲液(5μg/ml)。闭光保存。PNM缓冲液配制如下(100ml)：将95ml 0.1M磷酸缓冲液，pH7，0.1ml NP40，20mg叠氮钠和5g脱脂奶粉，混均后置37℃水浴箱中孵育2小时，待奶粉完全溶解后，分装至1.5ml小管中，储存于-20℃中，每次使用前将PNM缓冲液溶解，14,000转/分钟离心5分钟，取出上清液备用。加40μl卵白素(5μg/ml)于玻片上，加盖玻片，37℃，孵育20分钟。然后，将玻片放入洗液II中洗3次，洗液III中洗1次，每次2分钟。随后再加40μl抗卵白素抗体(5μg/ml)于玻片上，加盖玻片，37℃，孵育20分钟。然后，将玻片放入洗液II中洗3次，洗液III中洗1次，每次2分钟。最后再进行一次卵白素处理，过程同上。

(3).封片

用含有DAP1(0.5-1mg/ml)的抗褪色液封片。

实施例1

染色体显微解剖

在该实施例中，为了确定在3q26扩增区中的候选癌基因，对正常的中期染色体进行3q26染色体显微解剖。在原位杂交中，用于作为FISH探针的是整个BAC克隆。该BAC克隆的名称是：RP11-110-0-7。(其中，RP11是该克隆所在的文库名，-110是盘名，-O是该克隆所在的横坐标，-7是该克隆所在的纵坐标。)该BAC克隆含有eIF-5A2基因序列。荧光显示显微解剖的DNA序列与3q26有特异性杂交(图1B)，杂交的位置在染色体3q26.2。

实施例2

杂交体选择

通过杂交体选择，从显微解剖的DNA中选出3q26区特异表达的序列。通过筛选5×10⁴个噬斑，31个阳性cDNA克隆被分离出并被测序。

测序结果显示，4/31cDNA克隆(大小为0.5-2.1kb)代表了一个新的基因，其开放阅读框编码153个氨基酸(图2)。数据库检索显示，该cDNA与真核起始因子5A(eIF-5A)有显著的序列特异性(82％(126/153)氨基酸相同性)(图2)。序列相同性包括了进行8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰的结构域和lys-50残基，其中8-羟-2，7，10-三氨基癸酸是通过翻译后修饰而形成的(Kyrpides，N.C.etal.，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：224-228，1998)。eIF-5A是唯一已知含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸(一种非常见氨基酸)残基的细胞蛋白，而8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基是通过对lys-50残基的翻译后修饰而形成(Park，M.H.et al.，Trends Biochem.Sci.，18：475-479，1993)。已表明，eIF-5A的8-羟-2，7，10-三氨基癸酸化对于某些肿瘤发生细胞系的生长是关键的。

本发明的新基因被命名为真核起始因子5A2(eIF-5A2)。eIF-5A2的Genbank登录号为AF262027。eIF-5A2的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。

实施例3

eIF-5A2的表达谱

为了确定eIF-5A2在正常组织中的表达谱，使用基于eIF-5A2序列的引物，对正常卵巢组织以及肝、胎盘、乳房、皮肤、脑和大肠组织进行RT-PCR。结果表明，eIF-5A2在所有这些组织中都表达(图3C)。

通过BLAST法对EST数据库进行检索，揭示eIF-5A2在人的睾丸、子宫、淋巴细胞和肺组织中也表达。

实施例4

eIF-5A2定位于3q26.2

为了证实染色体定位定位，用BLAST法分离出含eIF-5A2序列的BAC克隆。用全长eIF-5A2cDNA作为探针进行Southern印迹法(图3A)。此外，使用位于外显子(204bp)中的引物进行PCR扩增((图3B)。两者都证实了该BAC克隆含有eIF-5A2。

然后，用FISH法，将该BAC克隆定位与3q26.2(图1C和1D)。

实施例5

eIF-5A2在卵巢癌中存在扩增

用Southern印迹法，对30例原发性卵巢癌中eIF-5A2的DNA序列扩增情况进行了研究。在15/30病例中检测到了eIF-5A2扩增，并且在4个病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)中观察到高拷贝扩增(图4A，探针是1.2kb的eIF-5A2基因的全长cDNA)。在卵巢癌细胞系UACC-1598中也检测到eIF-5A2的高拷贝扩增，在卵巢癌细胞系UACC-1598中含有双微体形式的3q26扩增(图4A)。

在4个原发性卵巢癌病例(OV-4，OV-7，OV-13和OV27)和卵巢癌细胞系UACC-1598中eIF-5A2的表达水平，还用Northern印迹法进行分析，并都观察到了eIF-5A2超表达(图4B)。

实施例6

在双微体中存在eIF-5A2

为了证实双微体是否含有eIF-5A2，将中期UACC-1598与含eIF-5A2的BAC克隆用FISH法进行杂交。结果显示，BAC克隆与所有的双微体杂交(图5A)。用FISH法，还在另一卵巢癌细胞系(OVCAR3)中观察到eIF-5A2的扩增(图5B)。根据本发明人的CGH结果，界定了位于3q26.1-3q26.2处的一个最小重迭扩增子，而eIF-5A2正好被定位于该区域(图5C)。

实施例7

用组织芯片技术检测eIF-5A2的扩增情况

在该实施例中，用组织芯片(tissue Microarray)技术对近200例卵巢癌标本进行了检测，结果发现约40％病例(76/192)有eIF-5A2扩增。此外，有eIF-5A2基因扩增的病人的预后都较差。

讨论

在本发明中，从卵巢癌的频繁扩增区域中分离出了eIF-5A家族的一个新成员eIF-5A2。eIF-5A2与eIF-5A的氨基酸序列相同性为82％，其中包括了进行8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰的结构域和lys-50残基，其中8-羟-2，7，10-三氨基癸酸是通过翻译后修饰而形成的。这表明eIF-5A2是eIF-5A2家族的一个成员，并且可能具有类似的功能。

已表明，eIF-5A在翻译起始中起作用，然而在缺失eIF-5A的酵母细胞中蛋白质合成的缺失并没有受到显著影响。尽管eIF-5A的确切功能还不清楚，但是含8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的eIF-5A对细胞增殖的必要性已被充分研究。已表明，由具有缺失而导致的完全胞内缺失eIF-5A，会造成细胞生长受抑制。其他研究表明，抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合成酶(deoxyhypusinesynthase，DHS)(一种在eIF-5A的8-羟-2，7，10-三氨基癸酸化中涉及的酶)，可抑制CHO细胞增殖，并遏制HeLa细胞和v-src转化的NIH3T3细胞的生长(Shi，X.-P.et al.，Biochim.Biophys.Acta.，1310：119-126，1996)。Hanauske-Abel等人暗示含8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的eIF-5A可能在真核细胞中直接影响在细胞周期的G1至S转变中所涉及的一组选择性基因的表达，因为通过抑制eIF-5A 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰可使细胞周期停滞在G1-S边界期(Hanauske-Abel et al.Biochim.Biophys.Acta.，1221：15-124)。

最近，Tome等人报道，过量的腐胺的积累以及用二氨基庚烷处理细胞而抑制eIF-5A 8-羟-2，7，10-三氨基癸酸修饰，也是一种诱导细胞发生凋亡的机制(Tome，M.E.et al.，Biochem.J.，328：847-854，1997)。

最近的研究表明，8-羟-2，7，10-三氨基癸酸形成活性是血清反应性的，并且在Ras癌基因转化的HIH3T3细胞中显著增加了30倍(Chen.，Z.P.et al.，Cancer Lett.，115：235-241，1997)。所有这些研究强烈暗示eIF-5A与癌症发生的相关性。

在本发明中，在15/30原发性卵巢癌和数种卵巢癌细胞系(包括UACC-1598)中检测到eIF-5A2扩增。并且在所有4种测试的具有3q26扩增的原发性卵巢癌中观察到eIF-5A2超表达。此外，含eIF-5A2的BAC克隆与卵巢癌细胞系UACC-1598中的双微体杂交。因此，基于染色体定位、在卵巢癌中的扩增情况、以及可能的与增殖有关的功能，eIF-5A2被认为是位于卵巢癌3q26.2的最小重迭扩增子中的推定的癌基因。

3q26扩增区域可能含有一种以上重要基因(包括PIK3CA和eIF-5A2)，它们是卵巢癌扩增事件中的生物靶目标。eIF-5A2位于PIK3CA的端粒一侧，并且在其之间的基因组距离是约7cM。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表

<110>关，新元

     岑，信棠

<120>卵巢癌的检测方法和试剂盒

<130>012374

<160>2

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>2246

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(38)..(499)

<400>1

agttcccacg gaaaaactac catctcccct gcccacc atg gca gac gaa att gat    55

                                         Met Ala Asp Glu Ile Asp

                                         1               5

ttc act act gga gat gcc ggg gct tcc agc act tac cct atg cag tgc    103

Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser Thr Tyr Pro Met Gln Cys

            10                  15                  20

tcg gcc ttg cgc aaa aac ggc ttc gtg gtg ctc aaa gga cga cca tgc    151

Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys

        25                  30                  35

aaa ata gtg gag atg tca act tcc aaa act gga aag cat ggt cat gcc    199

Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala

    40                  45                  50

aag gtt cac ctt gtt gga att gat att ttc acg ggc aaa aaa tat gaa    247

Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu

55                  60                  65                  70

gat att tgt cct tct act cac aac atg gat gtt cca aat att aag aga    295

Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg

                75                  80                  85

aat gat tat caa ctg ata tgc att caa gat ggt tac ctt tcc ctg ctg    343

Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu

            90                  95                  100

aca gaa act ggt gaa gtt cgt gag gat ctt aaa ctg cca gaa ggt gaa    391

Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Lys Leu Pro Glu Gly Glu

        105                 110                 115

cta ggc aaa gaa ata gag gga aaa tac aat gca ggt gaa gat gta cag 439

Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn Ala Gly Glu Asp Val Gin

   120                  125                 130

gtg tct gtc atg tgt gca atg agt gaa gaa tat gct gta gcc ata aaa       487

Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu Tyr Ala Val Ala Ile Lys

135                 140                 145                 150

ccc tgc aaa taa acggaaacat caggcatgaa cactgtttat gtctgaatca           539

Pro Cys Lys

actgcaaaaa taatttggtt ctaagttgtc accaaagcta tagccttcat aagcaacctc     599

atttcttttt ttaattgttt tcagattgtg ctgggttagt tttgcaagca attgataatt     659

tttaaaaaat tatcaatatg tataattttt tttgaatttt gtagatatgt ttcctataat     719

attcctgtgg ttttcagtat gtcagtccaa gaaacaaaca agatagcttc agcagatgtg     779

atttgtctga gcaaatcatt cctgtgtttt agttagatga taaaccaggg ttttaaatca     839

aacaatgtag cataaagtgg tattgaagta ccatatttaa gttgaactgc tctgcattaa     899

ttacagattt aatataaaat gaactgatta tatattggaa ttgttgcact ttcagcctgt     959

gtagggcaaa cacaaatcct taaacaaaaa tcatgttatc aaaaactgtc agttattttg    1019

gtggccacat gcaaccatgt gattactttg gtcatactat ttaccaaatt gttggcaaac    1079

ttgatgtaac cttatatggt ggttttagtc ccttcttatg gttggcagaa gggcactgaa    1139

ctgttgggtg aaagttagtt agcaagtaag attataagga agacacaaaa gacagtggca    1199

aagagggttg attaaatcta taagttttta tgtgaggact ttgtaagtca gcataaaaat    1259

gaaaagttgt ttctcagttg tttttgcttt taactttgcc cccaacgttt aaagggagtg    1319

atctgcttta catgatacta tgcaatgctt gttttccaac tatgttgaat aaatagtaat    1379

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tcaggagaat aaaatgagaa ttcatatata cgttcatctt tcaagtcaga gcaatgagtt    1619

gggaaaagag gtggcatttc tgatcggata atggaatact ctcatttatt ttatgacatt    1679

ctctgtctac tcagatcata gtgaaaactg gaaacaaaaa aaaaaacagc ctcttcttgg    1739

aaagtgacag cagaaggtgg catggagctt gtgtccttgg acaacaaatc tggatatact    1799

aggattaatt atcagaagac agctcaggcc aagttttgat cgttccatac agtaccttgt    1859

ttatctgctt cttaaagaat cagccgagac accataaaag aaataggctt tttgtgcctt    1919

ttgctgttaa tgtttaattt acaaactgtt ttggtaaatc tcttaatgta agtagctatt    1979

tgactttgga attttgcatt cgaggtatac tgtcatttct tgaaatcttt ttctcgttta    2039

gttgctctgt gggaaatgtg aggaagccta agtttgtatt tgtaaatttc ttatgccatc    2099

ctctagtcaa attttttttc attgtttaaa aatacggaag tgttccaata taattttttc    2159

ctgtactgga tggctaggat tctagagaat tgattataaa atattttcaa tacatcccaa    2219

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                                        2246

<210>2

<211>153

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser

1               5                   10                  15

Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

            20                  25                  30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

        35                  40                  45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

    50                  55                  60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

65                  70                  75                  80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp

                85                  90                  95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

            100                 105                 110

Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn

        115                 120                 125

Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu

    130                 135                 140

Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys

145                 150

Claims (9)

1.一种检测人染色体异常的方法，其特征在于，它包括步骤：

在探针与靶序列会形成稳定杂交复合体的条件下，将待测对象的染色体样品与含有一种或多种核酸探针的组合物接触，其中所述的探针含有全长eIF-5A2的核苷酸序列；和

检测所述的杂交复合体，其中待检测对象的染色体样品所形成的杂交复合体数量高于正常对照就表示染色体异常。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测杂交复合体的步骤包括检测靶序列的拷贝数。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测杂交复合体是通过检测荧光标记物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的染色体异常是扩增。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的全长eIF-5A2包括：DNA、cDNA和反义DNA。

6.一种检测癌症的试剂盒，其特征在于，它包括：

标记的核酸探针，该探针可特异性地结合于人eIF-5A2的核苷酸序列，且该核酸含有全长eIF-5A2的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还含有对染色体3的端粒序列特异的参照探针。

8.一种全长eIF-5A2的核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制备检测肿瘤或肿瘤易感性的试剂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌和输卵管癌。

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