FR2797273A1 - Polynucleotides dirigeant l'activation de l'expression d'un gene dans le coeur et ses applications a la therapie genique - Google Patents
Polynucleotides dirigeant l'activation de l'expression d'un gene dans le coeur et ses applications a la therapie genique Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne notamment une nouvelle séquence polynucléotidique stimulatrice de la transcription dans les cellules du myocarde et son utilisation pour diriger l'activation de l'expression de gène et maintenir cette activation à un niveau élevé.
Description
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La présente invention concerne une nouvelle séquence polynucléotidique stimulatrice de la transcription dans les cellules du myocarde et son utilisation pour diriger l'activation de l'expression de gène et maintenir cette activation à un niveau élevé. L'invention concerne également l'utilisation d'une telle séquence en transgenèse et en thérapie génique.
La transgenèse animale, au niveau de la cellule ou d'un organisme entier, ainsi que la thérapie génique effectuée sur les cellules somatiques d'un individu affecté d'un défaut génétique pose de multiples problèmes méthodologiques. En effet, le gène greffé ou réparé doit être exprimé normalement de façon régulière, au bon moment et en quantité normale adaptée aux besoins ; dans le cadre de la thérapie génique, les exigences sont encore plus grandes car le gène à réparer doit être exprimé normalement au bon endroit, au bon moment, sans affecter l'expression des gènes environnants. Dans les deux cas, le contrôle de l'expression du transgène apparaît donc comme l'un des paramètres centraux à maîtriser lors des expériences de transgenèse ou au cours d'une thérapie génique.
Ces expériences utilisent en général des constructions nucléotidiques comportant un gène d'intérêt, muni de séquences annexes assurant un bon niveau d'expression, éventuellement des séquences assurant la sécrétion, auquel on adjoint éventuellement un gène auxilliaire conférant un avantage sélectif. Accessoirement, la constructions peut contenir une séquence génomique qui a les propriétés d'un Locus Control Région (LCR).
Les séquences annexes assurant un bon niveau d'expression sont : le promoteur et éventuellement une séquence activatrice ( enhancer ). Le promoteur est de préférence choisi parmi le groupe des promoteurs forts tels par exemple les promoteurs viraux ; le promoteur peut être également le promoteur endogène du gène d'intérêt à exprimer ; il peut être utilisé dans sa totalité ou sous une forme tronquée assurant une expression minimale. Les enhancers sont capables d'activer en CIS la
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transcription du gène d'intérêt, quelque soit son orientation, sa localisation en amont ou en aval du site d'initiation et dans certaines limites quelque soit la distance qui le sépare du promoteur.
Dans le cadre de la transgenèse des cellules cardiaques et de la thérapie génique du c#ur, il est d'un grand intérêt de disposer d'enhancers qui permettent de cibler et de stimuler l'expression d'un gène d'intérêt dans la majorité des cellules du myocarde spécifiquement.
La présente invention se propose donc de fournir une telle séquence activatrice de la transcription qui permet une large expression d'un gène d'intérêt dans les seules cellules du myocarde de l'individu adulte ; séquence activatrice de la transcription précède à l'état naturel la séquence promotrice minimale du gène de l'actine a-cardiaque et la séquence codante qui lui est associée.
Le gène de l'actine a-cardiaque est exprimé de façon précoce au cours de la différenciation des muscles cardiaque et squelettiques. Chez la souris, après la naissance, la transcription du gène de l'actine a-cardiaque cesse dans les muscles squelettiques mais persiste dans tout le coeur au cours du développement ainsi qu'à l'âge adulte où le taux de transcription est élevé. L'expression du gène de l'actine acardiaque à un haut niveau est nécessaire pour un bon fonctionnement du coeur En effet, tout évènement à l'origine d'une diminution de la production d'actine acardiaque (invalidation du gène ou duplication de la région promotrice, surexpression de l'actine squelettique chez la souris, mutations ponctuelles chez l'homme) se traduit au mieux par une modification des propriétés contractiles du coeur, au pire par une cardiomyopathie entraînant le décès.
Les connaissances actuelles concernant la régulation du gène de l'actine acardiaque restent somme toute assez sommaires. Un travail antérieur des inventeurs a permis de démontrer l'existence de deux sites hypersensibles à la DNAse 1 à-7,8/-7 kb, and-5,4/-3,5 kb) en amont du CAP site du gène (Biben et al, 1994) dans les cellules C2. Par transgénèse, il a été montré que le site distal présente les propriétés d'un enhancer du muscle squelettique embryonnaire, tandis qu'une région avec - 5,4 kb en amont du CAP site du gène agit comme un enhancer de type cardiaque, embryonnaire
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et adulte, et squelettique embryonnaire. L'expression d'un transgène (- 9 kb actine acardiaque nLacZ) réunissant ces deux enhancers (appelés squelettique et cardiaque ultérieurement) a démontré que celle-ci est régulée comme celle du gène endogène.
L'expression a lieu dans les muscles squelettiques embryonnaires, avec un haut niveau d'expression dans le coeur embryonnaire et dans le coeur adulte ; cependant l'expression est diminuée dans le ventricule droit. Dans les expériences de transgenèse le promoteur minimum est également spécifique du coeur, mais il est peu actif et exclusivement chez l'embryon.
Les muscles cardiaque et squelettique diffèrent de manière significative au niveau moléculaire en ce qui concerne leur composition en protéines régulatrices de la transcription. Dans le muscle squelettique, la famille de protéines possédant le motif hélice-tour-hélice MyoD régule la transcription de nombreux gènes spécifiques des muscles (Weintraub et al., 1991). Cette famille de facteurs de transcription n'est présente à aucun moment du développement dans le muscle cardiaque et dans le muscle lisse. Un certain nombre de facteur de transcription sont spécifiques du muscle cardiaque ; l'un de ces facteurs dénommé GATA-4, qui est présent de manière spécifique dans les cellules du myocarde et dans certaines cellules endothéliales (Arceci et al., 1993 ; Grépin et al., 1995), est nécessaire à la transcription d'un certain nombre de gènes cardiaques (Grépin et al., 1995). La protéine homéobox Nkx2-5 constitue un autre exemple de facteur de transcription spécifique du muscle cardiaque (Lints et al., 1993). Certains facteurs qui jouent un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes spécifiques des muscles sont communs à la fois aux muscles cardiaque et squelettique ; la famille de facteurs MEF2 en est un exemple (Martin et al., 1994 ; Edmondson et al., 1994).
Il apparaît comme extrêmement intéressant d'identifier les séquences régulatrices qui activent la transcription du gène de l'actine a-cardiaque dans le myocarde en cours de différenciation et celles qui assurent le maintien de la transcription chez l'animal adulte.
La présente invention concerne une molécule d'ADN purifiée activatrice de la transcription ( enhancer ) de la région 5' amont du locus du gène de l'actine a-
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cardiaque murine, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN est purifiée d'un fragment d'ADN situé dans une région comprise entre-5,3 kb et-0,7 kb en amont du CAP site du gène de l'actine a-cardiaque murine et caractérisé en ce que ladite molécule comprend au moins la séquence SEQ ID N 1. Plus particulièrement l'invention porte sur la molécule d'ADN purifiée de séquence SEQ ID N 1.
On entend par SEQ ID N 1 la séquence de l'enhancer de 0,2 Kb situé environ entre - 1,6 Kb et-1,4 Kb en amont du CAP site. Elle désigne la séquence décrite ci-dessous qui est la séquence antisens, et également la séquence sens correspondante de polarité 5'-3' ou 3'-5'.
SEQ IDN 1 : Séquence de l'insert "GMD 133 antisens" TCTAGTGCTTGGACTTCTAATGCTGTGCTTTTCCTTCAGTTCACACCAGTTA AAAATAGAAAACTGGGCACCGGCATCTCTGTCTAGAGTGGGCTTGGATTGA TATGCTGAGCAGGACTGCTGATTAGATACTTCAGGGGCCGGGCAGTGCTGG GTCCTCCCCTCAGAGCTTCTCAACCATGTTTGGGATGGTCTAGGGATGAAAC TGCTGGACAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT Sont indiqués en gras - le site 3' de clonage Xbal/Spel perdus tous les deux - le site MEF2 - le site 5' de clonage pvu2/ Salirempli, perdus tous les deux
La molécule d'ADN purifiée selon l'invention peut également comprendre la séquence SEQ ID N 2. Plus particulièrement l'invention porte sur la molécule d'ADN purifiée de séquence SEQ ID N 2.
La molécule d'ADN purifiée selon l'invention peut également comprendre la séquence SEQ ID N 2. Plus particulièrement l'invention porte sur la molécule d'ADN purifiée de séquence SEQ ID N 2.
La séquence SEQ ID N 2 correspond à la séquence de l'enhancer de 0,9 Kb situé entre - 2,1Kb et-1,2 Kb en amont du CAP site du gène. Elle se trouve dans "insert GMD 134".
Dans le plasmide GMD 134, déposé le 25 mars 1999 à la CNCM (Institut Pasteur,
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France) sous le n 1-2177, cet insert a été cloné devant le promoteur de l'actine [alpha]- cardiaque. Cette séquence est représentée par la séquence SEQ ID N 2 suivante : SEQ ID N 2 : Séquence de l'insert GMD 134 (ML634) GGATCCATTCATCTTTAGAAACAATTAGGCCACCTACAGTCCCAGCGCTCA GGAGGTAGAAATTGGGATGTCAGGAGTTCAAGGTCATCTTCTGTTACCCATT TTGTAGGGGGGCTTATCCTGGCCTATATGAATATATCTCAATGATGCCAAAA AAAAAAATAAAACAAAAACTTAAATGATATTTCAAAAAAGGCTATCTGTGA AACTCCATTTAGATGCTTTCTGGCCCATTTCTAAATAACCCAGTGACACCAC CTCTCCCTTCCAAGGATGTTCCACGTCTCTGACTTCCACAATTACCACTGAG GATAAATCCTGTTGTGTGCTAGTTACCACTGAACTCTGCTTCATAATCAATA GAACATTGTTGAATGGAGGAATGAATGGTAGTGACCCAATTTTTCCAAACA GAAAGCTAATCCCACCTCTAAAAGTATCGAATGGTGACAGAGCAGGTTCAG TCTGTCTTGCGTCTGACTTACTTTGCTTGTCTCTTTGTGGGCCAGTCCTCAGT AACTCAATAGAACTGAGTTACTATGCCACTTTTCAGGGGGGTGAAAATGGG GTCTTGATGAGTTAACTGGCCTGCCCGAGACCAAACGTGCGGAACGTAGTT AAGTGTTAGAGGTAGGATTTGAAGCCTGTCGATCATTCTGATTCTCCTTTTC TCAACGTCTGCTTCCTGTCAATGGGCATCCTCACTGTCAAATGCTACAGCAG GGCTTGGTCTCAGCCAGGCAGGCCTCTCCCCAGTCTCCATGGCTCAGCTGTC CAGCAGTTTCATCCCTAGACCATCCCAAACATGGTTGAGAAGCTCTGAGGG GAGGACCCAGCACTGCCCGGCCCCTGAAGTATCTAATCAGCAGTCCTGCTC AGCATATCAATCCAAGCCCACTCTAGACAGAGATGCCGGTGCCCAGTTTTC TATTTTTAACTGGTGTGAACTGAAGGAAAAGCACAGCATTAGAAGTCCAAG CACTAGA Sont indiqués en gras - le site de clonage 5' BamHl - le site MEF 2 - le site de clonage 3' Spel/ Xbal perdus
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L'invention concerne également une molécule d'ADN purifiée caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule choisie parmi : a) une molécule d'ADN dont la séquence est complémentaire de la séquence de la molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, b) une molécule d'ADN dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec une molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, c) une molécule d'ADN hybridant dans des conditions de forte stringence avec une molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, d) un fragment d'au moins 20 nucléotides consécutifs, de préférence 100 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 210 nucléotides consécutifs d'une molécule d'ADN telle que définit ci-dessus, ledit fragment présentant une activité activatrice de la transcription.
La molécule d'ADN purifiée selon l'invention se caractérise en ce que ladite molécule d'ADN exerce son activité activatrice de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules myocardiques humaines. Dans la présente description, on entendra désigner par molécule d'ADN ou polynucléotide, une molécule d'ADN double brin ou simple brin purifié naturellement, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent être synthétisées par les techniques bien connues de l'homme de l'art décrites dans la littérature scientifique (voir Curruthers et al., 1982 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.. 47 :411-418 ; Adams et al., 1983 J. Am. Chem. Soc. 105 : 661). Les fragments d'ADN double brin peuvent être obtenus soit en synthétisant le brin complémentaire et en hybridant les brins ensemble dans des conditions appropriées ou en polymérisant le brin complémentaire en utilisant une ADN-polymérase avec une séquence amorce appropriée.
Par molécule d'ADN de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N 1ou N 2 ou d'une partie de la SEQ ID N 1 ou N 2 et dont l'orientation est inversée.
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Par pourcentage d'identité au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de bases identiques entre les molécules d'ADN, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux molécules d'ADN étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Selon l'invention, les molécules d'ADN de séquence nucléique homologue présentent un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de manière préférée 95 %, de manière encore préférée 97 %. Les comparaisons de séquences entre deux (ou plus) molécules d'ADN sont traditionnellement réalisées en comparant des séquences de deux séquences alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad.App.Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988)[ Proc Natl Acad Sci. USA 85: 2444] , au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)
II est dans l'étendue de l'invention d'introduire des mutations ou de sélectionner des mutants naturels des molécules d'ADN selon l'invention ; de telles molécules d'ADN de séquences nucléique homologue permettent ainsi de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber l'activité transcriptionnelle.
II est dans l'étendue de l'invention d'introduire des mutations ou de sélectionner des mutants naturels des molécules d'ADN selon l'invention ; de telles molécules d'ADN de séquences nucléique homologue permettent ainsi de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber l'activité transcriptionnelle.
Les hommes de l'art sont à même d'apprécier les différents degrés de stringence employés au cours des réactions d'hybridation ou lors des lavages consécutifs à l'hybridation. Lorsque les conditions d'hybridation deviennent plus stringentes, il existe un plus grand degré de complémentarité entre la sonde et la cible pour que la formation d'un duplexe se réalise. Le degré de stringence peut être contrôlé par la température, par la force ionique, le pH et la présence de solvant partiellement dénaturé tel la formamide Par exemple, la stringence de l'hybridation est modifiée à façon en changeant la concentration de la formamide dans le milieu réactionnel d'hybridation dans une gamme allant de 0 à 50 % de formamide. A titre illustratif, des conditions de forte
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;tringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : L'hybridation ADN-ADN est réalisée en deux étapes : préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5 % de dextran sulfate et 100 Dg/ml d'ADN de sperme ie saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température iépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage le 20 minutes à 20 C en 0,1x SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Les technologies de l'ADN recombinant utilisées dans la présente invention Font appel à des protocoles et à des techniques bien connus et employés couramment par l'homme de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, 'isolement d'ADN, l'amplification et la purification. En général, les réactions ;nzymatiques utilisent l'ADN-ligase, l'ADN-polymérase, les endonucléases de estrictions, les kinases, les phosphatases, et les autres enzymes en accord avec les nstructions du fabricant. Ces protocoles et ces techniques sont généralement réalisées ielon Sambrook et al. (1989).
La molécule d'ADN exerce son activité stimulatrice de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules nyocardiques humaines.
)e préférence, cette molécule est fusionnée à un gène d'intérêt. e gène d'intérêt peut comprendre un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt.. Par exemple, on peut mettre le gène d'intérêt sous le contrôle du
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promoteur minimal POX de l'actine a-cardiaque de la séquence SEQ ID N 3 suivante ou d'un segment de cette séquence.
SEQ ID N 3 : Séquence de l'insert GMD 132 TCTAGATGAGCATAGTCCCAGCTCAGGCTAAAGGAGACCAGAAGATGCACT ACCCAGGTGCCCCTTTTGCATCCAGGTACTCAAATATCCTGTCAAGCTGCTC TTTGTGCCTATGACTCTGCTCCTCTGTCTCCCAGTACTGGAAGATGAGAAGC TGCTGTCTGTCCCCTGCAGCCCCAGCCCAGCTGTCAGGACCCTTCTCCAAGG GCAGGGCGCCAAGTCTTCCGGCATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGACTCATTGTCCCTTAGTTTGGAAGGGCTGAAG AGCAATAAGCCCACTCCACAACTAGGGAGCTCCCCCACCCAAGGGGCGCAT TGGCATCACATAGCCTTTCCCCGTCCCCCACCCCTTGCTGGCCTGCCCCTCCC TAGCTCCCTATATGGCCATTGCTCTGACTGCCCCCTCCCCTTCCTTACATGGT CTGGGAGCCCCCTGGCTGATTCAGCGGTCCTAGATGGTGCTAAGGCGACCA AATAAGGCAAGGTGGCAGATCAGGGGCCCCCCACCCCTGCCCCCGGCTGCT CCAACTGACCCCGTCCATCAGAGAGCTATAAAGCTGCGCTCCAGGCGACTG ACACCC +1 AGTGCCTGCCACCAGCGCCAGCCCAGCTGAATCCAGCCGCCCCTAGCACGGTGAGT CCCAGCCTTGCTCCCTGCAGGACCTTGTCAGCACTGTGCTTTTGTGCTCTTGGATCC Sont indiqués en caractères gras : - le site 5' de clonage Xbal - la boite TATA soulignée - le nucléotide d'initiation de la transcription - le site 3' de clonage BamHl Avantageusement, la molécule d'ADN purifiée se caractérise en ce que ledit gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène,
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l'antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
La présente invention concerne également une cassette d'expression comprenant un gène d'intérêt, un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt et qui médie l'expression dudit gène et une molécule d'ADN telle que décrite précédemment capable de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber la transcription en CIS dudit gène dans les cellules du myocarde. Selon un mode préféré de réalisation, la molécule d'ADN selon l'invention augmente la transcription en CIS dudit gène. Selon un autre mode préféré de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur de gène exprimé dans les cellules du myocarde. Selon un autre mode préféré de réalisation, la cassette d'expression selon l'invention est caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine a-cardiaque de la séquence SEQ ID N 3 ou d'un segment de cette séquence. Bien entendu, l'utilisation de promoteur de l'actine acardiaque remplissant une fonction équivalente à celle de la SEQ ID N 3 est visée par l' invention.
lié de manière opérationnelle se réfère au lien fonctionnel entre un promoteur et une seconde séquence d'ADN, qui se caractérise en ce que ledit promoteur initie et contrôle la transcription de la dite séquence d'ADN. Généralement, lié de manière opérationnelle signifie que les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës, et lorsqu'il s'agit de joindre deux régions codant pour des protéines, les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës et dans la même phase de lecture.
Le gène d'intérêt présent dans la cassette d'expression code en général pour une protéine hétérologue. On entend désigner par hétérologue , des acides nucléiques ou des polypeptides qui ont pour origine une espèce étrangère, ou si il proviennent de la même espèce, sont modifiés substantiellement par rapport à leur forme originale. Par exemple, un promoteur lié de manière opérationnelle à un gène hétérologue provient d'une espèce différente de l'espèce dont dérive le gène hétérologue, ou si il provient de la même espèce, il est modifié substantiellement par rapport à sa forme originale.
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Le gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l'antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
L'invention concerne un vecteur recombinant de clonage d'une molécule d'ADN selon l'invention et/ou d'expression d'un polypeptide caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide tel que précédemment décrit. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Selon un mode préféré de réalisation, l'invention concerne un vecteur recombinant caractérisé en ce que ledit vecteur est contenu dans une bactérie désignée GMD 132, GMD 133, GMD 134, GMD 137 ou GMD 138 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cedex 15 (France) le 25 mars 1999 respectivement sous les numéros : 1-2175. Le plasmide GMD 132 (ML616) contient la région promotrice (-0,65 kb + 0,12 kb) du gène de la souris codant pour l'actine a cardique, clonée dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de pucl8 modifié, conférant la résistance à l'ampicilline. Ce plasmide est utilisé comme référence pour tester en culture de cardiocytes primaires l'activité enhancer de différentes régions 5' du gène de l'actine a cardiaque de souris.
1-2176. Le plasmide GMD 133 (ML643) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine a cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de pucl8 modifié, conférant la résistance à l'ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb)
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. la séquence enhancer (0,21 kb) située à environ - 1,4 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice.
Cette séquence augmente la transcription (x 10 à 20) spécifiquement dans les cultures de cardiocytes primaires embryonnaires de rats, pas dans les cultures de cellules myogéniques squelettiques ou de fibroblastes.
1-2177. Le plasmide GMD 134 (ML634) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine a cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de pucl8 modifié, conférant la résistance à l'ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb) . la séquence enhancer (0,98 kb) située entre - 1 kb et - 2 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice.
Dans des cultures primaires de cardiocytes embryonnaires de rats, cette région augmente spécifiquement la transcription (x 10 à 20). Il n'y a pas d'augmentation de la transcription dans des cultures de cellules myogéniques squelettiques ou de fibroblastes.
1-2178. Le plasmide GMD 137 (ML648) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine a cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de pucl8 modifié, conférant la résistance à l'ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb) . la séquence enhancer (0,98 kb) située entre - 1 kb et - 2 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice, dans laquelle le site MEF2 a été muté et remplacé par un site Smal.
Dans des cultures primaires de cardiocytes embryonnaires de rats, cette séquence avec le site MEF2 muté ne stimule pas la transcription. La séquence partielle antisens avec l'amorce "-20" de la mutation du site MEF2 (caractères gras) présente dans GMD 137 et GMD 138 est représentée par la séquence SEQ ID N 4 suivante .
SEQ ID N 4
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A/CTAGTGCTTGGACTTCTAATGCTGTGCTTTTCCTTCAGTTCACACCAGTcc cgggTAGAAAACTGGGCACCGGCATCTCTGTCTAGAGTGGGCTTGGATTGAT ATGCTGAGCAGGACTGCTGATTAGATACTTCAGGGGCCGGGCAGTGCTGG GTCCTCCCCTCAGAGCTTCTCAACCATGTTTGGGATGGTCTACGGATGAAA CTGCTGGACAGCTGAGCCATGGA 1-2179. Le plasmide GMD 138 (ML679) contient deux régions du gène de la souris codant pour l'actine a cardiaque, clonées dans un plasmide pBLCAT6 dérivé de pucl8 modifié, conférant la résistance à l'ampicilline : . la région promotrice du gène (- 0,65 kb + 0,12 kb) . la séquence enhancer (0,21 kb) située à environ - 1,4 kb du site d'initiation de la transcription, clonée en amont de la région promotrice, dans laquelle le site MEF2 a été muté et remplacé par un site Smal.
Dans des cultures primaires de cardiocytes embryonnaires de rats, cette séquence avec le site MEF2 muté ne stimule pas la transcription
Le vecteur de clonage selon l'invention est utile pour transformer des cellules hôtes afin de cloner les séquences nucléotidiques de l'invention.
Le vecteur de clonage selon l'invention est utile pour transformer des cellules hôtes afin de cloner les séquences nucléotidiques de l'invention.
Le vecteur recombinant d'expression selon l'invention est caractérisé en ce qu'il contient un cassette d'expression selon l'invention. Le vecteur selon l'invention comporte en outre les éléments permettant la sécrétion du produit d'expression codé par ledit gène d'intérêt hors de la cellule hôte. Par vecteur d'expression , on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à l'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus, les virus dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpes pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu
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selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préféré les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne la cellule hôte telle que déposée à la CNCM sous les numéros 1-2175, 12176, 1-2177, 1-2178 et 1-2179.
De préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères. Selon un mode préféré, la cellule hôte est une cellule du myocarde. De préférence, la cellule hôte est une cellule myocardique de souris, et de manière plus préférée une cellule myocardique humaine.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
L'invention s'applique également aux cellules qui doivent être modifiées à des fins de thérapie génique ou aux cellules embryonnaires souches (cellules ES) modifiées pour créer un animal transgénique ou un animal dont l'une de ces cellules a subi un événement de recombinaison homologue. Il est donc dans l'étendue de l'invention de fournir un animal, comprenant au moins une cellule selon l'invention. De tels animaux transgéniques peuvent être obtenus, par exemple, en injectant une molécule d'ADN, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention dans un #uf fertilisé que l'on laisse se développer jusqu'à l'âge adulte tel que décrit par Brinster et al. (1985) [PNAS,
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USA 82 :4438-4442). De préférence, l'animal selon l'invention est mammifère, choisi parmi le groupe composé de souris, rat, hamster, cochon, bovin, ovin, caprin.
L'invention concerne également l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques et/ou en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
La molécule d'ADN selon l'invention est utilisée en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques ; l'invention porte également sur l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques. Selon l'invention, les fragments de molécule d'ADN pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la molécule d'ADN selon l'invention est ou non marquée, directement ou indirectement, par un composé radioactif ou un composé non radioactif. En général, la molécule d'ADN est marquée pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications connues de l'homme de l'art. Le marquage des amorces, des sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives ; parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 32P, le 35S, le 3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
La molécule d'ADN selon l'invention peut ainsi être utilisée comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide,
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ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription inverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. en 1989, la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al. en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. en 1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée
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notamment par Chu et al. en 1986 et Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. (1996) ainsi que par Stone et al. (1996).
L'invention porte sur l'utilisation d'une molécule d'ADN selon l'invention en tant que séquence stimulatrice ( enhancer ) de la transcription ; cette utilisation se fait de préférence dans les cellules du myocarde. L'invention concerne également l'utilisation de molécule d'ADN homologue dans lesquelles existent de manière naturelle ou non des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus nucléotidiques. Les molécules d'ADN homologues selon l'invention peuvent ainsi avoir une activité stimulatrice ( enhancer ) de la transcription mais elle peuvent avoir une activité qui module, diminue ou inhibe la transcription.
L'invention concerne également un procédé de criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription de la molécule d'ADN selon l'invention, ledit procédé comportant les étapes de (i) mise en contact de la cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention et dudit ligand en présence de réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription, puis (ii) de détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle.
L'invention concerne également un nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN et/ou une cassette d'expression et/ou un vecteur et/ou une cellule selon l'invention, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription.
L'invention concerne également le ligand obtenu par le procédé ou avec le nécessaire précédemment décrit. Par ligand, on entend définir tous les composés susceptibles d'interagir avec la molécule d'ADN selon l'invention pour former un complexe susceptible d'affecter l'activité transcriptionnelle, c'est-à-dire d'augmenter, de diminuer, de moduler ou d'inhiber la transcription d'un gène. Le ligand selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à une séquence d'ADN et en ce qu'il est comporte au moins un des motifs protéiques connus susceptibles d'interagir avec l'ADN, par exemple la structure en doigt de gant à laquelle est associée un atome
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de zinc ( zinc-finger ), la structure hélice-tour-hélice, la structure hélice-boucle-hélice et la fermeture éclair à leucines ( leucine-zipper ).
Le ligand peut exercer son action sous la forme d'un monomère ou en s'assoçiant à d'autres monomères ou polypeptides par des interactions protéine-protéine. Ainsi, le ligand selon l'invention peut se dimériser pour former des homodimères ou des hétérodimères, ou s'associer sous la forme d'homomultimères ou d'hétéromultimères. Le polypeptide selon l'invention peut également interagir avec un autre polypeptide pour exercer son action ; ainsi, le polypeptide selon l'invention peut posséder, en plus de son domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'action sur la transcription qui exerce son action via des interactions protéine-protéine avec d'autres composants protéique de la machinerie transcriptionnelle. On entend désigner par composant protéique de la machinerie transcriptionnelle tous les facteurs de transcription nécessaires à la réalisation et à la régulation de la réaction de transcription.
Les protéines MEF-2 ainsi que ces co-activateurs constituent des ligands selon l'invention. De même, les facteurs de transcription qui se lient au niveau de séquences ou boites régulatrices de la transcription constituent des ligands selon l'invention. Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui permettent aisément d'identifier les séquences ou boites régulatrices promotrices nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique et au niveau desquelles se lient les ligands ou facteurs de transcription selon l'invention ; les facteurs MEF2 en sont des exemples.
Les ligands et plus particulièrement les facteurs de transcription se liant à la séquence activatrice constituent donc des cibles moléculaires pour contrôler le taux d'expression de l'actine a-cardiaque ou d'un gène hétérologue sous le contrôle d'une séquence promotrice comportant au moins la séquence activatrice selon l'invention, tel que une séquence promotrice du gène de l'actine a-cardiaque. En intervenant sur ces facteurs, il est possible d'envisager de contrôler l'expression du gène dans le coeur.
L'invention concerne donc un composé à titre de médicament caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe composé d'une molécule d'ADN, d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une cellule hôte et d'un ligand selon l'invention Plus particulièrement, le composé selon l'invention est utilisé à titre de médicament destiné
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au traitement et/ou à la prévention des maladies cardiaques. Le composé selon l'invention est utilisé pour la préparation d'un médicament destiné à médier, à moduler, à augmenter, à diminuer ou à inhiber l'expression d'un gène d'intérêt, notamment dans une cellule du myocarde.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.
Légendes Figure 1 : Profil d'expression des différentes constructions dérivées du gène de l'actine a-cardiaque.
Les flèches vers le bas représentent les sites d'hypersensibilité à la DNAse.
Figure 2 : de l'activité enhancer spécifique du tissu cardiaque.
Des fragments du génôme de la souris situés en amont du promoteur de l'actine acardiaque sont matérialisés dans la figure par des lignes noires devant le promoteur Ce sont les plasmides GMD 134 (enhancer de 0,9 Kb, fragment se situant environ de-2,1 Kb à-1,2 Kb) et GMD 133 (enhancer de 0,2 Kb, (220nt)).
Ces fragments mutés ont été également clonés dans le plasmide GMD 132 et la mutation est indiquée par une croix sur le fragment d'ADN dans la figure. Ce sont les plasmides GMD 137 et GMD 138 (qui sont les formes mutées respectives de GMD 134 et GMD 133).
Les activités CAT corrigées sont exprimées par rapport l'activité CAT de la construction portant le promoteur seul ramenée à 1 pour chaque tissu. L'activité CAT est représentée en noir pour les cardiocytes, en gris pour les fibroblastes et avec des rayures noires pour les cellules C2.
Figure 3 : Spécificité tissulaire du site MEF2 de l'actine a-cardiaque.
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Trois constructions correspondant respectivement au plasmide tkCAT, au plasmide (mef2)4-tkCAT, et au plasmide (mef2) 3-tkCAT ont été transfectées dans des cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats, dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier in vitro, et dans des cultures de cellules non musculaires. Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la construction contenant le seul promoteur. Sur le schéma, les activités CAT corrigées sont exprimées par rapport l'activité CAT de la construction tkCAT seul ramenée à 1 pour chaque tissu. L'activité CAT est représentée en noir pour les cardiocytes, en gris pour les fibroblastes et avec des rayures noires pour les cellules C2.
Figure 4 : Expériences de gel retard avec des extraits nucléaires de cellules ou de muscle squelettique ou cardiaque.
EXEMPLES Exemple 1 : Construction des plasmides et localisation de l'activité enhancer spécifique du tissu cardiaque.
Le promoteur de l'actine a-cardiaque de souris a été cloné dans un plasmide appelé pBLCAT6 contenant le gène CAT codant pour la chloramphenicol acetyl transférase bactérienne : cette construction est GMD 132.
Des fragments du génôme de la souris situés en amont du promoteur de l'actine a-cardiaque ont alors été clonés dans ce plasmide GMD 132. Les clonages ont été faits en profitant de sites de restriction naturels et les techniques utilisées sont référencées dans le livre de protocoles de Sambrook et al. auquel il est fait référence par ailleurs). Ces fragments sont matérialisés dans la figure par des lignes noires devant le promoteur Ce sont les plasmides GMD 134 (enhancer de 0,9 Kb, fragment se situant environ de-2,1 Kb à-1,2 Kb) et GMD 133 (enhancer de 0,2 Kb).
Ces fragments contenant des séquences d'ADN susceptibles de fixer des protéines nucléaires, ces séquences ont été mutées grâce à des kits commerciaux (gene
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editod, Promega)et les fragments ainsi modifiés ont été également clonés dans le plasmide GMD 132 et la mutation est indiquée par une croix sur le fragment d'ADN dans la figure. Ce sont les plasmides GMD 137 et GMD 138 (qui sont les formes mutées respectives de GMD 134 et GMD 133).
Le gène CAT a été mis sous le contrôle du promoteur minimum de l'actine a- cardiaque (construction POX) et des séquences variables situées entre-5,3 Kb et-0.7 Kb ont été testées pour leur capacités d'enhancer par rapport à la construction POX témoin.
Des cultures de cardiocytes primaires de coeur de ratons embryonnaires ont été mises au point dans le laboratoire, pour rechercher les régions actives dans le c#ur. Les constructions indiquées ci-dessus ont été transfectées dans les cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats, dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier in vitro, et dans des cultures de cellules non musculaires par le procédé au phosphate de Calcium. Un plasmide contenant le gène rapporteur Luciferase sous le contrôle du promoteur RSV a été ajouté dans chaque réaction pour servir d'indicateur d'efficacité de transfection. Après incubation, les cellules sont rincées, récoltées et les extraits cellulaires ont été obtenus après lyse cellulaire par trois cycles de congélation-décongélation brutale et centrifugation.
Les activités enzymatiques sont alors dosées dans les extraits : l'activité luciférase est dosée par luminescence et l'activité CAT est dosée après incubation d'une aliquote de l'extrait cellulaire en présence de chloramphenicol radiomarqué, extraction et dosage de la radioactivité incorporée). Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la construction contenant le seul promoteur. Les résultats de la figure 2 illustrent une forte activité CAT dans les cardiocytes pour l'enhancer 0. 2 Kb (région minimum) et 0,9 Kb. Les résultats obtenus en culture de
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cellules C2 ont montré que les régions activatrices ainsi délimitées étaient constituées d'éléments composites dont aucun n'est déterminant à lui seul.
Exemple 2 : ex vivo par transfection de cellules non myogéniques, myogéniques et cardiaques
Une séquence de 0,9 kb (-2,1,-1,2 kb) en amont du promoteur a une action d'enhancer exclusivement cardiaque sur le promoteur POX (x 21 dans les cardiocytes, pas d'augmentation dans les fibroblastes ou cellules C2).
Une séquence de 0,9 kb (-2,1,-1,2 kb) en amont du promoteur a une action d'enhancer exclusivement cardiaque sur le promoteur POX (x 21 dans les cardiocytes, pas d'augmentation dans les fibroblastes ou cellules C2).
Cette région peut être réduite à 200nt devant le promoteur POX (200-POX) et retient une grande partie de l'activité du fragment de 2 kb.
Cette séquence contient deux sites qui sont susceptibles de fixer des facteurs de transcription présents dans le coeur : un site MEF2 et un site GATA. La mutation du site GATA a peu d'effet sur l'activité enhancer. Au contraire, le site de fixation des protéines MEF2 est responsable de l'activité puisque sa mutation entraîne l'inactivation de l'enhancer. Ces résultats sont rassemblés dans la figure 2. Ces plasmides ont été séquences et déposés dans la collection Pasteur.
Une construction dans laquelle ce site MEF2 multimérisé se trouve devant POX (mef2x4-POX) présente également une spécificité cardiaque (figure 3) .
Des expériences de transactivation de la construction multimérisée (mef2x4POX) et de la construction (200nt-POX) par différentes isoformes de MEF2 ont été faites dans des fibroblastes pour déterminer si l'expression forcée des protéines MEF2 dans des cellules naïves serait capable d'activer la transcription de ces deux constructions. Aucune transactivation n'a été observée : ceci pouvait être lié à l'absence d'un ou de plusieurs cofacteurs agissant en synergie avec les protéines MEF2.
Nous avons donc réalisé des expériences de transactivation dans les cellules musculaires C2 avec la construction (mef2 x4-POX), les protéines MEF2 étant également impliquées dans l'activation des gènes au cours de la myogénèse squelettique. Il n'a pas été possible d'observer de transactivation : suggère qu'il puisse exister un cofacteur spécifique cardiaque nécessaire à l'activité de MEF2 .Des
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expériences de transactivation dans les cellules cardiaques sont en cours pour répondre à cette question.
Exemple 3 : Spécificitétissulaire du site MEF2 de l'actine a-cardiaque.
Deux oligonucléotides complémentaires ont été synthétisés. La partie centrale reproduit le site MEF 2 de la région enhancer dont l'importance de l'intégrité a été montrée dans la figure 2. Par ailleurs, des séquences permettant le clonage directionnel de l'oligonucléotide double brin dans un site Sfilont été rajoutées en 3' de chaque oligo Séquences des oligonucléotides natifs Sens 5' cagttttctatttttaactggtgtgggg (SEQ ID N 5) Antisens 5' cacaccagttaaaaatagaaaactgccc (SEQ ID N 6) Le site MEF2 est indiqué en caractères gras Les nucléotides permettant le clonage sont en italiques Deux oligonucléotides équivalents dans lesquels le site MEF 2 a subi une mutation identique à celle utilisée au cours des transfections ont également été synthétisés avec des extrémités permettant leur clonage Séquences des oligonucléotides mutés Sens 5' cagttttctacccgggactggtgtgggg (SEQ ID N 7) Antisens 5' cacaccagtcccgggtagaaaactgccc (SEQ ID N 8) La mutation est indiquée en caractères gras Les nucléotides permettant le clonage sont en italiques
Après annellation, ces oligonucléotides ont été clonés au site Sfilintroduit par Frédéric Relaix dans le linker situé en amont du promoteur tk dans le plasmide tkCAT. (Dans le plasmide tkCAT, le promoteur du gène de la thymidine kinase du
Après annellation, ces oligonucléotides ont été clonés au site Sfilintroduit par Frédéric Relaix dans le linker situé en amont du promoteur tk dans le plasmide tkCAT. (Dans le plasmide tkCAT, le promoteur du gène de la thymidine kinase du
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virus de l'herpès dirige la transcription du gène CAT mentionné plus haut). La séquence des plasmides recombinants a été vérifiée et nous avons gardé les plasmide (mef2)4-tkCAT et (mef2muté)3-tkCAT dans lesquels 4 motifs natifs mef2 et 3 motifs mutés ont été clonés en tandem dans tkCAT.
Trois constructions correspondant respectivement au plasmide tkCAT, au plasmide (mef2)4-tkCAT, et au plasmide (mef2) 3-tkCAT ont été transfectées dans des cultures primaires de cardiocytes d'embryons de rats, dans des cultures de myoblastes squelettiques que l'on a fait se différencier in vitro, et dans des cultures de cellules non musculaires par le procédé au phosphate de Calcium. Un plasmide contenant le gène rapporteur Luciferase sous le contrôle du promoteur RSV a été ajouté dans chaque réaction pour servir d'indicateur d'efficacité de transfection.
Après incubation, les cellules sont rincées, récoltées et les extraits cellulaires ont été obtenus après lyse cellulaire par trois cycles de congélation-décongélation brutale et centrifugation.
Les activités enzymatiques sont alors dosées dans les extraits : l'activité luciférase est dosée par luminescence et l'activité CAT est dosée après incubation d'une aliquote de l'extrait cellulaire en présence de chloramphenicol radiomarqué, extraction et dosage de la radioactivité incorporée). Toutes les activité CAT mesurées sont corrigées en fonction de l'activité Luc générée dans le même extrait. L'activité des enhancers est alors évaluée en comparant l'activité CAT corrigée qu'ils génèrent à l'activité corrigée mesurée pour la construction contenant le seul promoteur. Les résultats sont présentés à la figure 3 et montrent une forte activité CAT pour MEF2 (non muté).
Exemple 4 : Expériences in vitro de retard sur gel avec des extraits nucléaires de cellules ou de muscle squelettique ou cardiaque.
Un oligonucléotide contenant le site liant les protéines MEF2 forme un complexe avec les extraits nucléaires de coeur adulte que ne forme pas l'oligo dont la séquence est mutée. Ce complexe est aboli par compétition avec un oligonucléotide contenant la séquence consensus MEF2. La séquence de l'actine a-cardiaque semble
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avoir plus d'affinité lors de la formation du complexe que l'oligonucléotide consensus MEF2 lui-même (figure 4).
Exemple 5 : Expériences in vivo par transgénèse
Dans les coeurs des animaux d'une des deux lignées analysées exprimant le transgène, le fragment de 2 kb a le même patron d'expression que le transgène -9 kb a-cardiaque actine nLacZ de C. Biben : expression dans le coeur embryonnaire et dans le coeur adulte, avec un marquage très intense dans le ventricule gauche, faible et punctiforme dans le ventricule droit, de même que dans les lignées de C. Biben. Les différences observées concernent l'absence d'expression dans certains muscles squelettiques. L'absence de l'enhancer squelettique distal et de la partie "squelettique" de l'enhancer cardiaque dans notre construction est vraisemblablement à l'origine de ces différences.
Dans les coeurs des animaux d'une des deux lignées analysées exprimant le transgène, le fragment de 2 kb a le même patron d'expression que le transgène -9 kb a-cardiaque actine nLacZ de C. Biben : expression dans le coeur embryonnaire et dans le coeur adulte, avec un marquage très intense dans le ventricule gauche, faible et punctiforme dans le ventricule droit, de même que dans les lignées de C. Biben. Les différences observées concernent l'absence d'expression dans certains muscles squelettiques. L'absence de l'enhancer squelettique distal et de la partie "squelettique" de l'enhancer cardiaque dans notre construction est vraisemblablement à l'origine de ces différences.
Cette lignée pourrait être utile pour cartographier les modules activant l'actine cardiaque dans différents types de muscles.
Dans l'enhancer cardiaque, situé à environ 1Kb du CAP site du gène de l'actine a-cardiaque, que nous avons caractérisé, un site MEF2 joue un rôle important. Ceci est en accord avec l'observation chez les souris MEF2C-/- d'une diminution sévère de l'expression de l'actine cardiaque, (Olson et al. ).
En ce qui concerne les éléments qui assurent l'expression de l'a-actine cardiaque au cours du développement, l'ensemble des résultats obtenus en culture de cellules et en transgénèse suggèrent que quatre régions sont impliquées dans l'expression du gène au cours du développement : - le promoteur proximal qui à lui seul peut assurer l'activation du gène dans les muscles squelettiques et le coeur, mais pas le maintien de l'expression dans le coeur adulte, ce promoteur est peu efficace in vivo : seulement deux lignées sur sept expriment le transgène ; - la molécule d'ADN selon l'invention, qui peut assurer le maintien de l'expression dans le coeur chez l'embryon et l'adulte, à un niveau élevé, et dont l'utilisation en thérapie génique pourrait être envisagée ;
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- un élément distal qui est actif dans des cultures de cellules myogéniques squelettiques, et qui participe à l'expression du gène de l'actine a-cardiaque dans les muscles squelettiques embryonnaires et dans certaines fibres des muscles squelettiques de l'adulte, cet élément aurait des propriétés de LCR et isole les séquences génomiques qu'il délimite des séquences environnantes.
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LISTAGE DE SEQUENCES <110> Institut Pasteur <120> POLYNUCLEOTIDES DIRIGEANT L'ACTIVATION DE L'EXPRESSION
D'UN GENE DANS LE COEUR ET SES APPLICATIONS A LA
THERAPIE GENIQUE <130> D18278 <160> 8 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 239 <212> ADN <213> Souris <400> 1 tctagtgctt ggacttctaa tgctgtgctt ttccttcagt tcacaccagt taaaaataga 60 aaactgggca ccggcatctc tgtctagagt gggcttggat tgatatgctg agcaggactg 120 ctgattagat acttcagggg ccgggcagtg ctgggtcctc ccctcagagc ttctcaacca 180 tgtttgggat ggtctaggga tgaaactgct ggacagtcga cctgcaggca tgcaagctt 239 <210> 2 <211> 986 <212> ADN <213> Souris <400> 2 ggatccattc atctttagaa acaattaggc cacctacagt cccagcgctc aggaggtaga 60 aattgggatg tcaggagttc aaggtcatct tctgttaccc attttgtagg ggggcttatc 120 ctggcctata tgaatatatc tcaatgatgc caaaaaaaaa aataaaacaa aaacttaaat 180 gatatttcaa aaaaggctat ctgtgaaact ccatttagat gctttctggc ccatttctaa 240 ataacccagt gacaccacct ctcccttcca aggatgttcc acgtctctga cttccacaat 300 taccactgag gataaatcct gttgtgtgct agttaccact gaactctgct tcataatcaa 360 tagaacattg ttgaatggag gaatgaatgg tagtgaccca atttttccaa acagaaagct 420 aatcccacct ctaaaagtat cgaatggtga cagagcaggt tcagtctgtc ttgcgtctga 480 cttactttgc ttgtctcttt gtgggccagt cctcagtaac tcaatagaac tgagttacta 540 tgccactttt caggggggtg aaaatggggt cttgatgagt taactggcct gcccgagacc 600 aaacgtgcgg aacgtagtta agtgttagag gtaggatttg aagcctgtcg atcattctga 660 ttctcctttt ctcaacgtct gcttcctgtc aatgggcatc ctcactgtca aatgctacag 720 cagggcttgg tctcagccag gcaggcctct ccccagtctc catggctcag ctgtccagca 780 gtttcatccc tagaccatcc caaacatggt tgagaagctc tgaggggagg acccagcact 840 gcccggcccc tgaagtatct aatcagcagt cctgctcagc atatcaatcc aagcccactc 900 tagacagaga tgccggtgcc cagttttcta tttttaactg gtgtgaactg aaggaaaagc 960 acagcattag aagtccaagc actaga 986 <210> 3 <211> 740 <212> ADN <213> Souris <400> 3 tctagatgag catagtccca gctcaggcta aaggagacca gaagatgcac tacccaggtg 60 ccccttttgc atccaggtac tcaaatatcc tgtcaagctg ctctttgtgc ctatgactct 120 gctcctctgt ctcccagtac tggaagatga gaagctgctg tctgtcccct gcagccccag 180
D'UN GENE DANS LE COEUR ET SES APPLICATIONS A LA
THERAPIE GENIQUE <130> D18278 <160> 8 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 239 <212> ADN <213> Souris <400> 1 tctagtgctt ggacttctaa tgctgtgctt ttccttcagt tcacaccagt taaaaataga 60 aaactgggca ccggcatctc tgtctagagt gggcttggat tgatatgctg agcaggactg 120 ctgattagat acttcagggg ccgggcagtg ctgggtcctc ccctcagagc ttctcaacca 180 tgtttgggat ggtctaggga tgaaactgct ggacagtcga cctgcaggca tgcaagctt 239 <210> 2 <211> 986 <212> ADN <213> Souris <400> 2 ggatccattc atctttagaa acaattaggc cacctacagt cccagcgctc aggaggtaga 60 aattgggatg tcaggagttc aaggtcatct tctgttaccc attttgtagg ggggcttatc 120 ctggcctata tgaatatatc tcaatgatgc caaaaaaaaa aataaaacaa aaacttaaat 180 gatatttcaa aaaaggctat ctgtgaaact ccatttagat gctttctggc ccatttctaa 240 ataacccagt gacaccacct ctcccttcca aggatgttcc acgtctctga cttccacaat 300 taccactgag gataaatcct gttgtgtgct agttaccact gaactctgct tcataatcaa 360 tagaacattg ttgaatggag gaatgaatgg tagtgaccca atttttccaa acagaaagct 420 aatcccacct ctaaaagtat cgaatggtga cagagcaggt tcagtctgtc ttgcgtctga 480 cttactttgc ttgtctcttt gtgggccagt cctcagtaac tcaatagaac tgagttacta 540 tgccactttt caggggggtg aaaatggggt cttgatgagt taactggcct gcccgagacc 600 aaacgtgcgg aacgtagtta agtgttagag gtaggatttg aagcctgtcg atcattctga 660 ttctcctttt ctcaacgtct gcttcctgtc aatgggcatc ctcactgtca aatgctacag 720 cagggcttgg tctcagccag gcaggcctct ccccagtctc catggctcag ctgtccagca 780 gtttcatccc tagaccatcc caaacatggt tgagaagctc tgaggggagg acccagcact 840 gcccggcccc tgaagtatct aatcagcagt cctgctcagc atatcaatcc aagcccactc 900 tagacagaga tgccggtgcc cagttttcta tttttaactg gtgtgaactg aaggaaaagc 960 acagcattag aagtccaagc actaga 986 <210> 3 <211> 740 <212> ADN <213> Souris <400> 3 tctagatgag catagtccca gctcaggcta aaggagacca gaagatgcac tacccaggtg 60 ccccttttgc atccaggtac tcaaatatcc tgtcaagctg ctctttgtgc ctatgactct 120 gctcctctgt ctcccagtac tggaagatga gaagctgctg tctgtcccct gcagccccag 180
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<400> 4 ntagtgcttg gacttctaat gctgtgcttt tccttcagtt cacaccagtc ccgggtagaa 60 aactgggcac cggcatctct gtctagagtg ggcttggatt gatatgctga gcaggactgc 120 tgattagata cttcaggggc cgggcagtgc tgggtcctcc cctcagagct tctcaaccat 180 gtttgggatg gtctacggat gaaactgctg gacagctgag ccatgga 227 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Souris <400> 5 cagttttcta tttttaactg gtgtgggg 28 <210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Souris <400> 6 cacaccagtt aaaaatagaa aactgccc 28 <210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Souris <400> 7 cagttttcta cccgggactg gtgtgggg 28 <210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Souris <400> 8 cacaccagtc ccgggtagaa aactgccc 28
Claims (32)
- SEQ ID N 1.5' amont du locus du gène de l'actine a-cardiaque murine, caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN est purifiée d'un fragment d'ADN situé dans une région comprise entre-5,3 kb et-0,7 kb en amont du CAP site du gène de l'actine a- cardiaque murine et caractérisé en ce que ladite molécule comprend la séquenceREVENDICATIONS 1. Molécule d'ADN purifiée activatrice de la transcription ( enhancer ) de la région
- 2. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 1 de séquence SEQ ID N 1.
- 3. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 1 comprenant la séquence SEQ IDN 2.
- 4. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 3 de séquence SEQ ID N 2.
- 5 Molécule d'ADN purifiée caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule choisie parmi : a) une molécule d'ADN dont la séquence est complémentaire de la séquence de la molécule d'ADN selon les revendications 1 à 4, b) une molécule d'ADN dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec une molécule d'ADN définie en a) ou selon les revendications 1 à 4, c) une molécule d'ADN hybridant dans des conditions de forte stringence avec une molécule d'ADN définie en a), b) ou selon les revendications 1 à 4, d) un fragment d'au moins 20 nucléotides consécutifs, de préférence 100 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 210 nucléotides consécutifs d'une molécule d'ADN défini en a), b), c) ou selon les revendications 1 à 4, ledit fragment présentant une activité stimulatrice de la transcription.<Desc/Clms Page number 32>
- 6. Molécule d'ADN purifiée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ladite molécule d'ADN exerce son activité stimulatrice de la transcription dans des cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines, de manière préférée des cellules myocardiques humaines.
- 7. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 1 à 6 fusionnée à un gène d'intérêt.
- 8. Molécule d'ADN purifiée selon la revendication 7 caractérisée en ce que le gène d'intérêt comprend un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt.
- 9. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 7 à 8 ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine a-cardiaque de la séquence SEQ ID N 3.
- 10. Molécule d'ADN purifiée selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l'antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
- 11. Cassette d'expression comprenant : - un gène d'intérêt ; - un promoteur lié de manière opérationnelle audit gène d'intérêt et qui médie l'expression dudit gène ; - une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 capable de moduler, d'augmenter ou de diminuer la transcription dudit gène en CIS dans les cellules du myocarde.<Desc/Clms Page number 33>
- 12 Cassette d'expression selon la revendication 11 caractérisée en ce que le promoteur est un promoteur de gène exprimé dans les cellules du myocarde.
- 13. Cassette d'expression selon la revendication 12 caractérisée en ce que ledit promoteur est le promoteur minimal POX de l'actine a-cardiaque de la séquenceSEQ ID N 3.
- 14. Cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 13 caractérisée en ce que ledit gène d'intérêt code pour un produit d'expression sélectionné parmi les facteurs de croissance, les facteurs de coagulation sanguine, l'activateur tissulaire du plasminogène, l'antithrombine III, les cytokines, les anticoagulants, les enzymes ou leurs inhibiteurs, les hormones ou leur récepteur, les protéines structurales, les marqueurs de sélection.
- 15. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
- 16. Vecteur recombinant selon la revendication 15 caractérisé en ce que ledit vecteur est contenu dans une bactérie désignée GMD 132, GMD 133, GMD 134, GMD 137 ouGMD 138 telle que déposée à la CNCM respectivement sous les numéros 1-2175, 12176,1-2177,1-2178 et 1-2179.
- 17. Vecteur recombinant d'expression caractérisé en ce qu'il contient un cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 11à 14.
- 18. Vecteur selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il comporte en outre les éléments permettant la sécrétion du produit d'expression codé par ledit gène d'intérêt hors de la cellule hôte.<Desc/Clms Page number 34>
- 19. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 14 ou un vecteur selon l'une des revendications 15 à 18.
- 20. Cellule hôte telle que déposée à la CNCM sous les numéros 1-2175, 12176, 1-2177,1-2178 et 1-2179.
- 21. Animal comprenant au moins une cellule selon l'une des revendications 19 ou 20.
- 22. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 5 en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
- 23. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 5 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
- 24. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en tant que séquence stimulatrice ( enhancer ) de la transcription.
- 25. Utilisation selon la revendication 24 dans les cellules du myocarde.
- 26. Procédé de criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription de la molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ledit procédé comportant les étapes suivantes : a) mise en contact de la cassette d'expression selon l'une des revendications 11à 14 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 15à 18 et dudit ligand en présence de réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription; b) détection et/ou mesure de l'activité transcriptionnelle.
- 27. Nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription selon la revendication 26 caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : une molécule d'ADN selon l'une des revendications 1 à 6 et/ou une cassette d'expression selon l'une des revendications 11 à 14 et/ou un<Desc/Clms Page number 35>vecteur selon l'une des revendications 15 à 18 et/ou une cellule selon l'une des revendications 19 et 20, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en #uvre d'une réaction de transcription.
- 28. Ligand obtenu par le procédé selon la revendication 26 ou avec le nécessaire de la revendication 27.
- 29. Composé à titre de médicament caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe composé de : - une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; - une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 11à 14 ; - un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 ; - une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 19 et 20 ; - un ligand selon la revendication 28.
- 30. Composé selon la revendication 29 à titre de médicament destiné au traitement et/ou la prévention des maladies cardiaques.
- 31. Utilisation d'un composé selon la revendication 29 pour la préparation d'un médicament destiné à médier, à moduler, à augmenter ou à diminuer l'expression d'un gène d'intérêt.
- 32. Utilisation d'un composé selon la revendication 29 dans une cellule du myocarde.
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