FR2757524A1 - Polypeptides de la famille bhlh, sequences d'acides nucleiques correspondantes - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à des fins thérapeutiques.
Description
POLYPEPTIDE DE LA FAMILLE bHLH . SEQUENCE D'ACIDES NUCLEIQUES
CORRESPONDANTES.
CORRESPONDANTES.
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à des fins thérapeutiques.
Le tube neuronal embryonnaire est à l'origine composé d'un neuroépithélium non différencié sur toute sa longueur. Les cellules se diffférencient ensuite, selon leurs positions sur les axes antérieur/postérieur, dorsal/ventral et médium/latéral générant alors des structures neuronales différentes. Cette différenciation est en partie contrôlée par des facteurs génétiques qui sous-divisent le tube neuronal en plusieurs régions histogéniques. On sait aujourd'hui que de nombreux facteurs transcriptionnels et plus particulièrement des produits codés par des gènes dits bHLH " Basic Helix Loop
Helix" (Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061-67) sont impliqués dans ce phénomène de différenciation. Les protéines de cette famille présentent des motifs d'acides aminés très conservés et plus particulièrement un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice 2. Ces deux derniers motifs sont séparés par une boucle de taille variable. Chez les vertébrés, certains produits de ces gènes bHLH participent aux différentes étapes de neurogénèse au cours de la détermination et différenciation neuronales. A titre représentatif de ces protéines, on peut notamment citer les protéines Math-l (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279,8730-38) Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) et NeuroD (Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44). A l'évidence, d'autres protéines comportant ce domaine bHLH interviennent dans le développement neuronal au niveau d'autres sites et à des temps variables. L'identification de nouvelles protéines de type bHLH serait particulièrement précieuse pour améliorer notre compréhension de la neurogénèse et donc avantageuse sur le plan thérapeutique.
Helix" (Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061-67) sont impliqués dans ce phénomène de différenciation. Les protéines de cette famille présentent des motifs d'acides aminés très conservés et plus particulièrement un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice 2. Ces deux derniers motifs sont séparés par une boucle de taille variable. Chez les vertébrés, certains produits de ces gènes bHLH participent aux différentes étapes de neurogénèse au cours de la détermination et différenciation neuronales. A titre représentatif de ces protéines, on peut notamment citer les protéines Math-l (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279,8730-38) Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) et NeuroD (Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44). A l'évidence, d'autres protéines comportant ce domaine bHLH interviennent dans le développement neuronal au niveau d'autres sites et à des temps variables. L'identification de nouvelles protéines de type bHLH serait particulièrement précieuse pour améliorer notre compréhension de la neurogénèse et donc avantageuse sur le plan thérapeutique.
La présente invention a précisément pour objet l'isolément, le séquençage et la caractérisation d'un ADNc codant pour un polypeptide appartenant à une nouvelle famille de protéines de type bHLH. Elle décrit aussi des ADN recombinants incorporant cette séquence, des vecteurs la contenant et leur utilisation pour activer l'expression de protéines recombinantes.
La demanderesse a ainsi mis en évidence un polypeptide possédant une homologie importante avec les protéines bHLH déjà identifiées, homologie limitée au niveau du domaine bHLH. En effet, de manière inattendue, les régions bordant ce domaine bHLH ne partagent aucune identité de séquence avec celles des autres protéines de type bHLH.
En conséquence, la présente invention a pour premier objet un polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH.
Plus précisément la présente invention se rapporte à un polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N"1 ou l'un de ses dérivés.
Par dérivé, on entend au sens de la présente invention les produits comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles que des délétions d'un ou plusieurs résidus, des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des parties supplémentaires internes ou terminales, de nature peptidique ou non. Il peut s'agir notamment de parties actives, de marqueurs, d'acides aminés, tels qu'une méthionine en position -1. Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des modifications au niveau de la structure tertiaire (extrémité N-terminale, etc).
Ces dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Préférentiellement, les dérivés partagent au moins une homologie structurale avec la protéine revendiquée et plus préférentiellement au moins au niveau des régions bordant le domaine bHLH, et conservent sa propriété biologique d'activateur transcriptionnel. Les dérivés peuvent également apporter de nouvelles propriétés aux polypeptides revendiqués (marquage, ..), ou améliorer leurs propriétés (stabilité, activité biologique etc).
De préférence, il s'agit d'un polypeptide de type bHLH possédant la séquence représentée en SEQ ID N"1. Il s'agit plus préférentiellement d'une protéine comprenant en cadre de lecture ouvert, de 214 acides aminés dont l'expression de l'ARNm correspondant est détectée chez l'embryon de rat sous forme de bandes longitudinales. Cette protéine est désignée ci-après sous la dénommination Relax pour "Rat Embryonic Longitudinal Axis" et constitute un des objets revendiqués selon la présente invention.
La comparaison de la séquence d'acides aminés de Relax avec celles de protéines déjà disponibles a permis d'établir une corrélation de séquence essentiellement avec les protéines de type bHLH. Par ailleurs, cette homologie a été localisée uniquement au niveau du domaine bHLH. Le domaine bHLH de Relax partage ainsi respectivement 68%, 57% et 40% d'homologie avec les domaines bHLH des protéines NeuroD, Math-l et Mash-1.
Des tests d'activité réalisés avec la protéine Relax et plus précisément discutés dans les exemples ci-après, il ressort que cette protéine est capable de se lier spécifiquement à une séquence de boîte E et que dans des essais de cotransfection, elle se comporte comme un activateur transcriptionnel et que cette activité est strictement dépendante de la présence d'une boîte E intacte. L'ensemble de ces observations démontre l'appartenance de la protéine Relax revendiquée à une nouvelle famille de protéines bHLH.
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique susceptible d'exprimer un polypeptide de type bHLH tel que défini précédemment.
Plus précisément, la présente invention vise une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N"1, son brin complémentaire ou son dérivé.
Les acides nucléiques revendiqués peuvent être des fragments d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN génomique (ADNg). Il s'agit plus préférentiellement d' ADNc ou d'ADNg.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée.
Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de productioncelui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrémité, de type par exemple constructions hybrides consistant en un ADNc auquel serait associé un ou plusieurs introns.
De même au sens de l'invention, les acides nucléiques revendiqués peuvent comprendre des séquences promotrices, d'activation, de régulation, etc
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stringence conventionnelles (Maniatis et al., Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stringence élevées.
Plus préférentiellement il s'agit de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID N"1 ou de son brin complémentaire.
La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée, transcrite dans l'orientation inverse.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes. Ces activateurs transcriptionnels peuvent être tout particulièrement avantageux pour cibler l'expression d'une protéine au nveau du système nerveux central.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, incorporée ou non dans un ADN recombinant, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Préférentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur utile pour induire in vivo, ex vivo et/ou in vitro l'expression des polypeptides revendiqués. Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut dériver des adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés (AAV), du virus de l'herpès, du cytomégalovirus (CMV), du virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Alcli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224 ; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1(1990) 241; ; EP 185 573, Levrero et al., Gene 101(1991)195 ; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988 ; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson et al.,
Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al.,
New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088].
Neuron 5 (1990) 353 ; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739 ; Miyanohara et al.,
New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088].
La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant.
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus défectif.
Le terme "virus défectif" désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique rie l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
Il est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée à un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant défectif. Selon un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un adénovirus.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavi, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovinis d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, I'adénovirus comprend une délétion dans les régions El et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans la région El au niveau de laquelle sont insérés la région
E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus
Ad5. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région El.
E4 et la séquence codant. Dans les virus de l'invention, la délétion dans la région El s'étend préférentiellement des nucléotides 455 à 3329 sur la séquence de l'adénovirus
Ad5. Selon un autre mode de réalisation préféré, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la délétion dans la région El.
Les virus recombinants défectifs de l'invention peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un virus défectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucléotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195;
Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12%). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome du virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adénovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12%). A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants défectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460). Ensuite, les virus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucléotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention.
Elle se rapporte également à toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiqués pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux.
Enfin l'invention s'étend en outre à toute utilisation des polypeptides revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes.
Les exemples et figures présentés ci-après à titre illustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
FIGURES
Figure 1: Séquence nucléotidique de l'ADNc CIG235. Sur cette séquence sont indiqués les différents oligonucléotides utilisés pour isoler l'ADNc complet. Les flèches indiquent l'orientation 5' vers 3' de ces oligonucléotides.
Figure 1: Séquence nucléotidique de l'ADNc CIG235. Sur cette séquence sont indiqués les différents oligonucléotides utilisés pour isoler l'ADNc complet. Les flèches indiquent l'orientation 5' vers 3' de ces oligonucléotides.
Figure 2 : Comparaison des séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille. En noir sont notés les acides aminés homologues, en gris les acides aminés de structure proche.
EXEMPLE 1
Amplification directe par PCR des séquences comprises entre les domaines basique et l'Hélice II à l'aide d'oligonucleotides dégénérés.
Amplification directe par PCR des séquences comprises entre les domaines basique et l'Hélice II à l'aide d'oligonucleotides dégénérés.
L'isolement de l'ADNc codant de nouveaux facteurs de transcription de la famille bHLH est effectué à partir de GCS de rat ( Rat Superior Cervical Ganglia) . Les protéines de cette famille présentant des motifs d'acides aminés très conservés, en particulier un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice 2, il est choisi des oligonucléotides dégénérés codant ces diverses régions conservées. Ils ont donc été sélectionnés de manière à conserver les régions basiques domaines Hélice II du complexe Drosophilia achaete-scute et des gènes mammifères bHLH tels que Mash-1,
Mash-2 et M-Twist. De tels oligonucléotides ont été utilisés respectivement comme amorce sens et antisens d'une part, pour réaliser un criblage direct d'une banque de
GCS construite par PCR, et d'autre part pour effectuer des PCR sur des ADNc-sb de
GCS.
Mash-2 et M-Twist. De tels oligonucléotides ont été utilisés respectivement comme amorce sens et antisens d'une part, pour réaliser un criblage direct d'une banque de
GCS construite par PCR, et d'autre part pour effectuer des PCR sur des ADNc-sb de
GCS.
L'oligonucléotide sens a été choisi dans le domaine basique de ces protéines bHLH, il s'agit plus précisément de l'oligonucléotide suivant: 5'
AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ ID N"2)
L'oligonucléotide antisens a quant à lui été déterminé à partir du domaine Hélice II des mêmes protéines bHLH. Il s'agit de: 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ ID N"3)
L'ADNc monobrin (ss-ADNc). est préparé à partir de 500ng d'ARNpolyA' dénaturé issu du SGC de rats, agés de deux jours.
AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ ID N"2)
L'oligonucléotide antisens a quant à lui été déterminé à partir du domaine Hélice II des mêmes protéines bHLH. Il s'agit de: 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ ID N"3)
L'ADNc monobrin (ss-ADNc). est préparé à partir de 500ng d'ARNpolyA' dénaturé issu du SGC de rats, agés de deux jours.
L'amplification par PCR est effectuée sur un mélange comprenant outre le tampon PCR (lOmM Tris, pH 8,3, 50mM Kcl, 2,5mM MgC12), 200cl dNTP, 12,5pM de chaque oligonucléotide et environ 20ng de ss-ADNc. La PCR est effectué en réalisant successivement 3 minutes de dénaturation à 94"C; 2 cycles ( 94 C pendant 30 sec.; 50"C pendant 45 sec.; 72"c pendant 1,5 min.) suivis de 38 cycles ( 94C pendant 30 sec.; 62"C pendant 45 sec.; 72)C pendant 1,5 min.). Les produits de PCR sont clonés au site SmaI de pUCi9 et les 1500 clones ainsi obtenus, analysés par séquençage. Nous avons recherché la présence d'un motif Hélice I dans la séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique de ces différents ADNc. Une large proportion de ces ADNc (670) contiennent un tel motif, et parmi eux, un seul correspond à un nouveau membre possible de la famille bHLH. Les autres ADNc isolés correspondent à des protéines bHLH connues.
Le nouvel ADNc isolé, appelé CIG235 et représenté en figure 1, correspond à un fragment de 76 nucléotides (en excluant les séquences correspondant aux oligonucléotides introduits par la PCR). Les alignements de séquences en acides aminés ont été effectués en n'autorisant ni les insertions ni les délétions. Ces alignements montrent que ce fragment code un motif homologue au motif Hélice I des protéines bHLH . L'isolement de l'ADNc complet a ensuite été entrepris.
EXEMPLE 2
Isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235.
Isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235.
L'isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235 a été extrêmement difficile, car l'ARNm correspondant à CIG235 est très peu exprimé dans le GCS. Il semble même que son niveau d'expression soit proche de celui de la transcription illégitime. La technique retenue consiste d'une part à isoler ltextrémité 3' de l'ADNc correspondnat à CIG235 par PCR ancrée et d'autre part à isoler l'extrémité 5' de cet
ADNc à partir de moelle épinière d'embryons de rat au stade Ex2,5.
ADNc à partir de moelle épinière d'embryons de rat au stade Ex2,5.
1.Extension de I'ADNc CIG235 en 3'par PCR ancrée.
Pour cela, des ADNc-sb de GCS sont préparés avec l'amorce RA3' NV (amorce de transcription inverse aléatoire portant l'ancre 3' NV) selon la méthode Dumas Milne
Edwards et al ( 1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al., pp89-118, IRL Press
Oxford U.K.). Deux amorces emboitées spécifiques sont choisies dans le clone positif bHLH de 76 nucléotides:CIG5'~i : 5'-MCCUAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID N 4) et CIG5'-2 : 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID N 5).
Edwards et al ( 1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al., pp89-118, IRL Press
Oxford U.K.). Deux amorces emboitées spécifiques sont choisies dans le clone positif bHLH de 76 nucléotides:CIG5'~i : 5'-MCCUAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID N 4) et CIG5'-2 : 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID N 5).
Nous avons ensuite amplifié l'extrémité 3' de CIG235 par deux PCR emboîtées avec les couples d'oligonucléotides CIG5'1 et A3'~1 puis CIG5'2 et A3'~2. Le mélange
PCR identifié en exemple 1, est utilisé avec seulement 0,8pM de chacun des oligonucléotides et une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec. et une étape d'élongation à 72 C pendant 1,5 min..L'"annealing" est effectué pendant 45 sec. avec des variations de température. Lors des dix premiers cycles cette température est réduite de 1 C tous les deux cycles de 70 C à 65 C puis maintenue à 65 C au cours de 30 cycles. Les produits résultant sont clonés dans pUC19 et séquencés. Nous avons ainsi obtenu un ADNc de 717 nucléotides, appelé CIG3', dont la partie 5' correspond à l'extrémité 3' du clone CIG235. L'analyse des phases ouvertes de lectures montre que la totalité de la séquence codant l'extrémité carboxy-terminale de la protéine a été isolée avec 321 nucléotides de région 3' non codante.
PCR identifié en exemple 1, est utilisé avec seulement 0,8pM de chacun des oligonucléotides et une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec. et une étape d'élongation à 72 C pendant 1,5 min..L'"annealing" est effectué pendant 45 sec. avec des variations de température. Lors des dix premiers cycles cette température est réduite de 1 C tous les deux cycles de 70 C à 65 C puis maintenue à 65 C au cours de 30 cycles. Les produits résultant sont clonés dans pUC19 et séquencés. Nous avons ainsi obtenu un ADNc de 717 nucléotides, appelé CIG3', dont la partie 5' correspond à l'extrémité 3' du clone CIG235. L'analyse des phases ouvertes de lectures montre que la totalité de la séquence codant l'extrémité carboxy-terminale de la protéine a été isolée avec 321 nucléotides de région 3' non codante.
2.Isolement de l'extrémité 5' correspondant à ClG3' à partir de telle épinière d'embryons de rat au stade E12.5.
Nous avons recherché par hybridation i" situ le patron d'expression de l'ARNm correspondant à CIG3'. Son expression est estimée à différents stades du développement embryonnaire. La méthode choisie est celle de l'hybridation in situ sur coupes épaisses d'embryons de rat avec une sonde marquée à la digoxygénine. Cette méthode est en fait une adaptation de celle décrite pour l'hybridation in toto (1994, A
Pratical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75-83, IRL Press Oxford U.K.), et permet de cribler rapidement des embryons entiers à de nombreux stades différents.
Pratical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75-83, IRL Press Oxford U.K.), et permet de cribler rapidement des embryons entiers à de nombreux stades différents.
Une forte expression de cet ARNm a été détectée dans la moelle épinière, au jour embryonnaire 12.5 (E12.5). Nous avons donc préparé des ARNm à partir de moelle épinière à ce stade de développement, et effectué l'isolement de l'extrémité 5' par la méthode SLIC. Un produit de PCR de 893 nucléotides est isolé et appelé CIG5'.
L'ADNc CIG3' et CIG5' se recouvrent sur une région de 120 nucléotides et forment un ADNc total dont la taille est de 1491 nucléotides.
Cependant, CIG3' et CIG5' n'ayant pas été isolés à partir du même tissu, il était nécessaire de montrer que le contigue généré par l'alignement de ces deux clones correspondait bien à un ARNm existant et non pas à une chimère générée par PCR.
Nous avons donc vérifié par PCR, après transcription inverse, que l'ARNm total est présent dans la moelle épinière à-E12.5. Dans ce tissu, une seule amplification par PCR permet de visualiser cet ARNm dans son intégralité. De plus, l'analyse des ARNm par
Northern blot montre que les sondes CIG3', CIG5' et l'ADNc total permettent toutes trois de détecter un seul ARNm de 3.1 kb. Enfin, en hybridation in situ, le patron d'expression spatio-temporel obtenu avec CIG3' ou avec l'ADNc total est absolument identique. Ces trois résultats nous permettent d'affirmer que CIG3' et CIG5' correspondent bien à deux fragments d'un même ARNm.
Northern blot montre que les sondes CIG3', CIG5' et l'ADNc total permettent toutes trois de détecter un seul ARNm de 3.1 kb. Enfin, en hybridation in situ, le patron d'expression spatio-temporel obtenu avec CIG3' ou avec l'ADNc total est absolument identique. Ces trois résultats nous permettent d'affirmer que CIG3' et CIG5' correspondent bien à deux fragments d'un même ARNm.
Afin de s'affranchir des mutations ponctuelles introduites par la Taq polymérase, nous avons effectué, sur des ADNc-sb de moelle à E12.5, quatre amplifications indépendantes de la totalité de l'ADNc. Nous avons ainsi pu déterminer de manière fiable la séquence de cet ADNc qui est représenté en SEQ ID N01.
L'analyse de la séquence de l'ADNc montre que nous avons isolé la totalité de la région codante, la région 5' non codante ainsi qu'une partie de la région 3' non traduite.
De plus, l'expression de l'ARNm correspondant est détectée, chez l'embryon, sous forme de bandes longitudinales. Cette caractéristique a conduit à désigner cet ADNc
Relax, pour Rat embryons longitudinal axis.
Relax, pour Rat embryons longitudinal axis.
EXEMPLE 3
Comparaison de séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec
d'autres protéines de la famille BHLH.
Comparaison de séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec
d'autres protéines de la famille BHLH.
L'analyse de la séquence en acides aminés déduite de l'ADNc Relax indique clairement que cette protéine fait partie de la famille des bHLH. Le domaine bHLH de
Relax partage une identité de 68% avec le motif bHLH de la protéine NeuroD (Lee et coll., 1995). De plus, il apparaît que Relax partage plus d'identités de séquences avec les protéines homologues de ato (Math-l, Akazawa et coll., 1995) qu'avec celles homologues d' AS-C (Mash-l, Johnson et coll., 1990) (Figure 2). Cependant, l'absence totale d'identité de séquence, en dehors du domaine bHLH, avec les autres membres de la famille révèle que Relax n'est pas le paralogue d'une protéine déjà identifiée. Pour cette raison, Relax correspond vraisemblablement au premier membre d'une nouvelle sous-famille de protéines bHLH.
Relax partage une identité de 68% avec le motif bHLH de la protéine NeuroD (Lee et coll., 1995). De plus, il apparaît que Relax partage plus d'identités de séquences avec les protéines homologues de ato (Math-l, Akazawa et coll., 1995) qu'avec celles homologues d' AS-C (Mash-l, Johnson et coll., 1990) (Figure 2). Cependant, l'absence totale d'identité de séquence, en dehors du domaine bHLH, avec les autres membres de la famille révèle que Relax n'est pas le paralogue d'une protéine déjà identifiée. Pour cette raison, Relax correspond vraisemblablement au premier membre d'une nouvelle sous-famille de protéines bHLH.
EXEMPLE 4
Caractérisation de l'activité transcriptionnelle de la protéine Relax
Les analyses de séquences en acides aminés indiquent que Relax partage une communauté de structure avec les protéines de la famille des bHLH. Ces protéines sont des facteurs de transcription. Il est donc important de démontrer que l'ADNc
Relax code une protéine dont les caractéristiques sont celles d'un facteur de transcription, c'est à dire que Relax est capable de se fixer à l'ADN sur les sites cibles de facteurs bHLH, et qu'il peut réguler la transcription.
Caractérisation de l'activité transcriptionnelle de la protéine Relax
Les analyses de séquences en acides aminés indiquent que Relax partage une communauté de structure avec les protéines de la famille des bHLH. Ces protéines sont des facteurs de transcription. Il est donc important de démontrer que l'ADNc
Relax code une protéine dont les caractéristiques sont celles d'un facteur de transcription, c'est à dire que Relax est capable de se fixer à l'ADN sur les sites cibles de facteurs bHLH, et qu'il peut réguler la transcription.
1. Les protéines de la famille bHLH forment des homo ou hétérodimères et se fixent spécifiquement à l'ADN (Murre et coll., 1989, Cell, 558, 537-44). La caractérisation in vitro des sites de liaison à l'ADN a permis l'identification d'une séquence hexanucléotidique consensus, CANNTG dénommée boîte E (Murre et coll., 1989). Nous avons montré, par des expériences de retard de migration sur gel, que la protéine Relax recombinante purifiée est capable de se lier spécifiquement à une séquence contenant une boîte E. Pour se faire, l'ADN codant pour la protéine Relax est inséré entre les sites NdeI et KpnI dans un vecteur pFLAG-CTC. Après expression de la protéine dans E;coli, la protéine de fusion Relax-Flag est purifiée sur colonne d'affinité puis utilisée dans une réaction de binding en présence d'un oligonucléotide contenant une boîte E.
2. L'activité transcriptionnelle de la protéine Relax a pour sa part été testée par des expériences de cotransfection dans la lignée cellulaire PC12, dérivée de phéochromocytomes de rat.
Pour cela, nous avons utilisé un gène rapporteur luciférase placé sous le contrôle, d'une part, d'un promoteur contenant une boîte E (5kb du promoteur de la
TH) et, d'autre part, d'un même promoteur contenant une boîte E mutée.
TH) et, d'autre part, d'un même promoteur contenant une boîte E mutée.
Parallèlement nous avons préparé un vecteur d'expression de la protéine Relax comme suit:
L'ADNc codant pour la protéine Relax ( de la position 389 à 1235) est inséré entre les sites EcoRI et XhoI dans le vecteur d'expression pcDNA3 en aval du promoteur CMV. Le promoteur TH du rat portant une boîte E CAGGTG (SEQ ID N" 6) enposition 197 sur un fragment de Skbp est inséré into the blunt ended site HindIII dans le plasmide pKSLuc qui deveint 5kbTH-Luc. Le site est muté en TCCGTG( SEQ
ID N"7) et le plasmide résultant désigné 5kbTH(Delta E)-Luc.
L'ADNc codant pour la protéine Relax ( de la position 389 à 1235) est inséré entre les sites EcoRI et XhoI dans le vecteur d'expression pcDNA3 en aval du promoteur CMV. Le promoteur TH du rat portant une boîte E CAGGTG (SEQ ID N" 6) enposition 197 sur un fragment de Skbp est inséré into the blunt ended site HindIII dans le plasmide pKSLuc qui deveint 5kbTH-Luc. Le site est muté en TCCGTG( SEQ
ID N"7) et le plasmide résultant désigné 5kbTH(Delta E)-Luc.
Le plasmide pcDNA3-Relax est cotransfecté à différentes quantités variant de 0 à Spmole, et ramené à Spmole avec du vecteur pcDNA3 vide, dans des cellules PC12 (106 cellules/plaque) en mélange à immole de plamide 5kbTH-Luc, Skb-TH(deltaE)
Luc ou pKSLuc.. Pour évaluer l'efficacité de transfection, 0,2pmol d'un vecteur d'expression du gène codant pour la proténce CAT (acétyltransférase chloramphénicol) sous contrôle du promoteur RSV sont également cotransfectés.
Luc ou pKSLuc.. Pour évaluer l'efficacité de transfection, 0,2pmol d'un vecteur d'expression du gène codant pour la proténce CAT (acétyltransférase chloramphénicol) sous contrôle du promoteur RSV sont également cotransfectés.
La mesure de l'activité luciférase, après cotransfection de ces vecteurs avec des quantités croissantes d'un vecteur d'expression de la protéine Relax, démontre que
Relax active la transcription du gène rapporteur d'une manière dépendante de la quantité de vecteur d'expression utilisée et que cette activation nécessite strictement la présence d'une boîte E intacte.
Relax active la transcription du gène rapporteur d'une manière dépendante de la quantité de vecteur d'expression utilisée et que cette activation nécessite strictement la présence d'une boîte E intacte.
EXEMPLE 5
Caractérisation des sites d'expression de l'ARNm Relax au cours du dévelo de 250clam. Les ribosondes sont préparées en présence de 1pg de plamide linéarisé et en présence de 3,5 nmol. de Digoxygenin UTP en utilisant le kit Ribosonde de
Promega. ette analyse détaillée montre que l'expression de l'ARNm Relax est transitoire et spatialement restreinte.
Caractérisation des sites d'expression de l'ARNm Relax au cours du dévelo de 250clam. Les ribosondes sont préparées en présence de 1pg de plamide linéarisé et en présence de 3,5 nmol. de Digoxygenin UTP en utilisant le kit Ribosonde de
Promega. ette analyse détaillée montre que l'expression de l'ARNm Relax est transitoire et spatialement restreinte.
Cet ARNm n'est présent que chez l'embryon, entre les jours 11.5 et 18.5 de développement. Son expression est restreinte au système nerveux central. En effet, aucune expression n'a été détectée, ni dans le système nerveux périphérique, ni en dehors du système nerveux. A l'intérieur du SNC, l'ARNm Relax est exprimé uniquement dans la moelle épinière, le cerveau postérieur et le cerveau antérieur.
Plus précisément, l'ARNm Relax est exprimé dans des compartiments longitudinaux dans la moelle épinière et le cerveau postérieur.
Sa distribution dans la moelle épinière y est restreinte à deux bandes continues de symétrie bilatérale, organisées longitudinalement et restreintes, sur l'axe D/V, à la lame basale, l'une à son extrémité ventrale, l'autre à son extrémité dorsale.
Dans le cerveau antérieur, les ARNm Relax sont localisés dans deux groupes de cellules situées de part et d'autre du recessus optique, dans la région ventrale de l'hypothalamus et dans l'aire préoptique. Le groupe majoritaire des cellules exprimant
Relax est situé dans la partie basale. Seules les quelques cellules de l'aire préoptique sont situées dans la région alaire. La situation dans le cerveau antérieur est semblable à celle dans la moelle épinière et le cerveau postérieur. En effet, les cellules exprimant
Relax sont, dans tous les cas, strictement localisées dans la zone ventriculaire.
Relax est situé dans la partie basale. Seules les quelques cellules de l'aire préoptique sont situées dans la région alaire. La situation dans le cerveau antérieur est semblable à celle dans la moelle épinière et le cerveau postérieur. En effet, les cellules exprimant
Relax sont, dans tous les cas, strictement localisées dans la zone ventriculaire.
EXEMPLE 6
Caractérisation des moments d'expression de I'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire
Tous les sites d'expression de Relax apparaissent simultanément à E11.5. Ils disparaissent progressivement dans la moelle épinière entre E16.5 et E18.5, suivant un gradient ventro-dorsal qui suit la réduction progressive de la zone ventriculaire. Dans le cerveau postérieur, l'expression de Relax s'éteint, en même temps que celle de la bande médiane dans la moelle épinière. Enfin, dans le cerveau antérieur, l'expression de
Relax disparaît après Eu 8.5. Il est important de souligner que l'expression de Relax est confinée à la zone ventriculaire et que la fenêtre temporelle d'expression coïncide avec celle de la production des neurones dans ces différentes structures.
Caractérisation des moments d'expression de I'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire
Tous les sites d'expression de Relax apparaissent simultanément à E11.5. Ils disparaissent progressivement dans la moelle épinière entre E16.5 et E18.5, suivant un gradient ventro-dorsal qui suit la réduction progressive de la zone ventriculaire. Dans le cerveau postérieur, l'expression de Relax s'éteint, en même temps que celle de la bande médiane dans la moelle épinière. Enfin, dans le cerveau antérieur, l'expression de
Relax disparaît après Eu 8.5. Il est important de souligner que l'expression de Relax est confinée à la zone ventriculaire et que la fenêtre temporelle d'expression coïncide avec celle de la production des neurones dans ces différentes structures.
LISTE DE SEOUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rat
(x1) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
gcaggtagcgagaggagcagtccctgggcccccgttgctgattggcccgtggcacaggcagcagcccggcag 72
gcacgctcctggtccgggcagagcagataaagcgtgccaggggacacacgattagcagctcagaagtccctc 144
tgggtctcaccactgcacagaggccgaggaccccctccgagcttctttgctgcctccagacgcaatttactc 216
caggcgagggcgcctgcagctcagcaaaacttcgaagcgagcagaggggttcagctatccaccgctgcttga 288
ctctgaccacccgcagctctctgttcttttgagcccggagtaactaggtaacatttaggaacctccaaaggg 360
tagaagaggggagtgggtgggcgtactctagtcccgcgtggagtgacctctaagtcagagactgtcacaccc 432
M R P H P L D R P T I 11
ccttccattttttcccaacccagg RTG GCG CCT CRT CCC TTG GRT GCG CCC RCC RTC 491 Q V S Q I T Q Q F @ P G A S D H @ V 29
CRR GTG TCC CRR GAG RCC CRG CRR CCC TTT CCC GOR GCC TCG GRC CRC GAA GTG 545
L S S N S T P P S P T L V P R D C S 47
CTC RGT TCC RRT TCC RCC CCR CCT ROC CCC RCT CTC GTR CCG AGG GAC TGC TCC 599
r R r R G 1 C R G T S R K t R R R R 65
GRR GCR GRR GCR GGT GRC TGC CGR GGG RCR TCG RGG RRG CTC CGT GCG CGG CGC 653
G G R N R P K S E L R L S K Q R R S 83
GGA GGG CGC AAC AGG CCC AAG AGC GAG TTG GCA CTG AGC AAG CAG CGA CGA AGC 707
R R K K R N 1 R r R H R M K H t H S 101
CGG CGC RRG RRG GCC RRC GRC COO GRG CGC RRC CGC ATG CRC AAC CTT RRC TCC 761
A L D A L R G V L P T @ P D D A K L 119
GCG CTG GAT GCG CTG CGC GGT GTC CTG CCC ACC TTC CCG GAT GAC GCC AAA CTT 815
T K I @ T L R @ A H N Y I W A L T Q 137
RCR RRG RTC GRG RCC CTG CGC TTC GCC CRC RRC TRC RTT TGG GCA CTG RCT CRG 869
T L R I A D H S @ Y G P @ P P V P C 155
RCG CTG CGC RTR GCG ORC CRC ROC TTC TRC GGC CCC GAG CCC CCT GTG CCC TGT 923
G @ L G S P G G G S S G D @ G S I Y 173
GGG GAG CTG GGA AGC CCG GGA GGG GGC TCC AGC GGC GAC TGG GGC TCT ATC TAC 977
S P V S Q A G S L S P T A S L @ @ @ 191
TCC CCR GTT TCC CRR GCT GGT ROC CTG ROC CCC RCR GCC TCR TTG GRG GAG TTC 1031
P G L Q V P S S P S C L L P G T L V 209
CCT GGC CTG CRG GTG CCC RGC TCC CCR TCC TGT CTG CTC CCG GGC RCC CTG GTG 1085
F S D F L 214
TTC TCA GAC TTC TTG tgaagggcccaaacaggccctgggcggtgggcgctggcagaaagggaggga 1151
gtcagagctgtctgaaatggaaggtagtggaggcactcgagcatctcgccccttctggctttcattagtcag 1223
gtccctgatttaaccaggattcgcacagttccttgctgctgtgcgtgcacaaaggacattgcaggctgatct 1295
cctcttaaccctcctcagtgtggccacctcaaactcccgctccaagcagaggagagccgtagcactaaatag 1367
ttgggagactcccatacttcctggtgactccgccctctttcaaatctgcgggcctccaaccaccgctttctc 1439
cagagtgacctaatccagtgttgcgtcttacctcactggctcttgttccata 1491 (3) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AATKHGMGIG AGCGCIDKCG CRYG 24 (4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGCSRDTYTC AGGGTSYBGA YCTT 24 (5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AACCTTAACT CCGCGCTGGA TGCGC 25
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:18 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CGCGGTGTCC TGCCCACC 18 (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAGGTG 6 (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TCCGTG 6
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(ii) TITRE DE L' INVENTION: (iii) NOMBRE DE SEQUENCES:
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rat
(x1) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
gcaggtagcgagaggagcagtccctgggcccccgttgctgattggcccgtggcacaggcagcagcccggcag 72
gcacgctcctggtccgggcagagcagataaagcgtgccaggggacacacgattagcagctcagaagtccctc 144
tgggtctcaccactgcacagaggccgaggaccccctccgagcttctttgctgcctccagacgcaatttactc 216
caggcgagggcgcctgcagctcagcaaaacttcgaagcgagcagaggggttcagctatccaccgctgcttga 288
ctctgaccacccgcagctctctgttcttttgagcccggagtaactaggtaacatttaggaacctccaaaggg 360
tagaagaggggagtgggtgggcgtactctagtcccgcgtggagtgacctctaagtcagagactgtcacaccc 432
M R P H P L D R P T I 11
ccttccattttttcccaacccagg RTG GCG CCT CRT CCC TTG GRT GCG CCC RCC RTC 491 Q V S Q I T Q Q F @ P G A S D H @ V 29
CRR GTG TCC CRR GAG RCC CRG CRR CCC TTT CCC GOR GCC TCG GRC CRC GAA GTG 545
L S S N S T P P S P T L V P R D C S 47
CTC RGT TCC RRT TCC RCC CCR CCT ROC CCC RCT CTC GTR CCG AGG GAC TGC TCC 599
r R r R G 1 C R G T S R K t R R R R 65
GRR GCR GRR GCR GGT GRC TGC CGR GGG RCR TCG RGG RRG CTC CGT GCG CGG CGC 653
G G R N R P K S E L R L S K Q R R S 83
GGA GGG CGC AAC AGG CCC AAG AGC GAG TTG GCA CTG AGC AAG CAG CGA CGA AGC 707
R R K K R N 1 R r R H R M K H t H S 101
CGG CGC RRG RRG GCC RRC GRC COO GRG CGC RRC CGC ATG CRC AAC CTT RRC TCC 761
A L D A L R G V L P T @ P D D A K L 119
GCG CTG GAT GCG CTG CGC GGT GTC CTG CCC ACC TTC CCG GAT GAC GCC AAA CTT 815
T K I @ T L R @ A H N Y I W A L T Q 137
RCR RRG RTC GRG RCC CTG CGC TTC GCC CRC RRC TRC RTT TGG GCA CTG RCT CRG 869
T L R I A D H S @ Y G P @ P P V P C 155
RCG CTG CGC RTR GCG ORC CRC ROC TTC TRC GGC CCC GAG CCC CCT GTG CCC TGT 923
G @ L G S P G G G S S G D @ G S I Y 173
GGG GAG CTG GGA AGC CCG GGA GGG GGC TCC AGC GGC GAC TGG GGC TCT ATC TAC 977
S P V S Q A G S L S P T A S L @ @ @ 191
TCC CCR GTT TCC CRR GCT GGT ROC CTG ROC CCC RCR GCC TCR TTG GRG GAG TTC 1031
P G L Q V P S S P S C L L P G T L V 209
CCT GGC CTG CRG GTG CCC RGC TCC CCR TCC TGT CTG CTC CCG GGC RCC CTG GTG 1085
F S D F L 214
TTC TCA GAC TTC TTG tgaagggcccaaacaggccctgggcggtgggcgctggcagaaagggaggga 1151
gtcagagctgtctgaaatggaaggtagtggaggcactcgagcatctcgccccttctggctttcattagtcag 1223
gtccctgatttaaccaggattcgcacagttccttgctgctgtgcgtgcacaaaggacattgcaggctgatct 1295
cctcttaaccctcctcagtgtggccacctcaaactcccgctccaagcagaggagagccgtagcactaaatag 1367
ttgggagactcccatacttcctggtgactccgccctctttcaaatctgcgggcctccaaccaccgctttctc 1439
cagagtgacctaatccagtgttgcgtcttacctcactggctcttgttccata 1491 (3) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
AATKHGMGIG AGCGCIDKCG CRYG 24 (4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GGCSRDTYTC AGGGTSYBGA YCTT 24 (5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AACCTTAACT CCGCGCTGGA TGCGC 25
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:18 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CGCGGTGTCC TGCCCACC 18 (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAGGTG 6 (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TCCGTG 6
Claims (15)
1. Polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH.
2. Polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N"1 ou l'un de ses dérivés.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il posséde la séquence représentée en SEQ ID N"1.
4. Polypeptide selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine Relax.
5. Séquence d'acides nucléiques susceptible d'exprimer un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N l, son brin complémentaire ou son dérivé.
7. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est représentée par la SEQ ID N"1 ou son brin complémentaire.
8. Vecteur comprenant une séquence nucléique selon l'une des revendications 5 à 7.
9. Vecteur selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
10. Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine.
11. Vecteur selon les revendications 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus défectif pour la réplication.
12. Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 4 pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes.
13. Composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 5 à 7 un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 8 à 11.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un polypeptide selon la revendication 1 à 4.
15. Utilisation d'une séquence selon l'une des revendications 5 à 7 ou d'un vecteur contenant ladite séquence pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de pathologies affectant le système nerveux.
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