SK81899A3

SK81899A3 - Polypeptides of the "basic-helix-loop-helix" bhlh family, corresponding nucleic acid sequences

Info

Publication number: SK81899A3
Application number: SK818-99A
Authority: SK
Inventors: Christine Icard-Liepkalns; Jacques Mallet; Philippe Ravassard
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2000-05-16
Also published as: AU5667398A; WO1998027206A3; IL130302A0; US6998474B1; ZA9711401B; HUP0001184A3; NO993029D0; WO1998027206A2; JP2001510464A; EP0946724A2; HUP0001184A2; CZ219499A3; HU224305B1; FR2757524B1; FR2757524A1; BR9713968A; NO993029L; KR20000057698A; AU732438B2; CA2275454A1

Description

Predkladaný vynález sa týka nového proteinu typu bHLH a x zodpovedajúcej kódujúcej nukleovej kyseliny. Týka sa tiež expresných vektorov obsahujúcich uvedenú sekvenciu a použitia tejto sekvencie alebo proteinu na liečebné účely.

Doterajší stav techniky

Embryonálna nervová trubica je spočiatku tvorená po celej svojej dĺžke z nediferencovaného neuroepitelu. Neskôr sa bunky diferencujú a v závislosti od ich polohy k osiam prednej/zadnej, dorzálnej/ventrálnej a mediálnej/laterálnej vytvárajú rôzne nervové štruktúry. Táto diferenciácia je do určitej miery riadená genetickými faktormi, ktoré rozdeľujú nervovú trubicu do niekoľkých histogénnych oblastí. Dnes je známe, že sa na tomto diferenciačnom procese podieľajú mnohé transkripčné faktory a najmä produkty kódované takzvanými génmi bHLH („Basic Helix Loop Helix) (Caudy a kol., 1988. Celí 55, 1061-67). Proteíny tejto rodiny majú vysoko konzervatívne úseky aminokyselín, najmä bázickú doménu nasledovanú Helixom (závitnicou) 1 a Helixom 2. Dve závitnicové jednotky sú oddelené slučkou premenlivej dĺžky. U stavovcov sa určité produkty týchto bHLH génov podieľajú na rôznych štádiách neurogenézy v priebehu neuronálnej determinácie a diferenciáce. Ako príklad reprezentatívnych proteínov tohto typu možno uviesť najmä proteíny Math-1 (Akazawa a kol., 1995, J. Biol. Chem. 279, 8730-38), Mash-1 (Johnson a kol., 1990, 346, 858-61) a NeuroD (Lee a kol., 1995, Sciences, 268, 836-44). Neuronálneho vývoja sa zjavne zúčastňujú aj iné proteíny obsahujúce doménu bHLH na úrovni ďalších miest a v rôznych časoch. Identifikácia nových proteínov typu bHLH by bola obzvlášť cenná na zlepšenie nášho porozumenia neurogenéze a preto by bola výhodná tiež z liečebného hľadiska.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je izolácia, sekvenovanie a charakterizácia cDNA kódujúcej polypeptid, ktorý patri do novej rodiny proteínov bHLH. Vynález ďalej opisuje rekombinantné DNA a vektory obsahujúce túto sekvenciu a tiež ich použitie na aktiváciu expresie rekombinantných proteínov.

Pôvodca identifikoval polypeptid, ktorý má vysokú mieru homológie s dosial identifikovanými proteinmi bHLH, pričom homológia je obmedzená na doménu bHLH. A skutočne, čo je prekvapivé, úseky obklopujúce túto doménu bHLH nemajú žiadnu sekvenčnú identitu s úsekmi iných proteínov typu bHLH.

Teda prvým predmetom predkladaného vynálezu je polypeptid typu bHLH s transkripčnou aktivitou, ktorý má sekvenčnú homológiu s proteinmi typu bHLH na úrovni svojej domény bHLH.

Presnejšie povedané, predkladaný vynález sa týka polypeptidu, ktorý má transkripčnú aktivitu, a ktorý je tvorený úplne alebo čiastočne sekvenciou SEQ. ID. NO. 1, alebo niektorým z jej derivátov.

Pod pojmom „derivát sa v teejto prihláške rozumie produkt, obsahujúci napríklad modifikácie na úrovni primárnej štruktúry, ako sú napríklad delécia jedného alebo niekoľkých zvyškov, substitúcia jedného alebo niekoľkých zvyškov a/alebo modifikácia na úrovni jedného alebo niekoľkých zvyškov. Počet zvyškov zasiahnutých modifikáciami môže byť napríklad 1, 2 alebo 3 až 10, 20 alebo 30. Termín derivát označuje tiež molekuly, ktoré obsahujú dodatočné vnútorné alebo koncové časti, či už peptidovej, alebo inej povahy. Môžu to byť najmä aktívne časti, markery alebo aminokyseliny, ako je napríklad metionín v polohe -1. Termín derivát tiež zahrnuje molekuly obsahujúce modifikácie na úrovni terciárnej štruktúry (N-koncová časť a podobne).

Tieto deriváty sa môžu pripravovať na napríklad najmä s cieľom zvýšiť afinitu peptidu rôzne účely, k miestu jeho interakcie, zvýšiť produkčnú hladinu peptidu alebo udeliť peptidu nové farmakokinetické a/alebo biologické vlastnosti.

Deriváty majú výhodne aspoň jednu štruktúrnu homológiu s proteínom podľa predkladaného vynálezu, výhodnejšie aspoň na úrovni úsekov obklopujúcich doménu bHLH, a uchovávajú si aktivitu transkripčného aktivátora. Deriváty môžu mať tiež novú vlastnosť v porovnaní s polypeptidmi podľa predkladaného vynálezu (môžu niesť značku a pod.), alebo môžu mať zlepšené vlastnosti (stabilita, biologickú účinnosť a pod.).

Výhodne sa jedná o polypeptid typu bHLH, ktorý má sekvenciu uvedenú ako sekvencia SEQ. ID. NO. 1. Výhodnejšie sa jedná o proteín, ktorý obsahuje otvorený čítací rámec 214 aminokyselín, pre ktorý je expresia príslušnej mRNA detegovaná v pozdĺžnych pásoch v krysom embryu. Tento proteín sa preto nazval Relax, čo je skratka z „Rat Embryonic Longitudinal Axis (pozdĺžna os krysieho embrya), a predstavuje jeden z predmetov predkladaného vynálezu.

Porovnanie aminokyselinovej sekvencie proteínu Relax s dosiaľ známymi proteínmi umožnilo stanoviť sekvenčnú koreláciu medzi proteínmi typu bHLH. Okrem toho, táto homológia bola lokalizovaná len na úrovni domény bHLH. doména proteínu Relax má teda 68 %, 57 % a 40 % homológiu s bHLH doménami proteínov NeuroD, Math-1 a Mash-1 (v uvedenom poradí)

Na základe testov účinnosti, ktoré sa uskutočnili s proteínom Relax, a ktoré sú podrobnejšie uvedené v príkladoch, je zrejmé, že tento proteín je schopný sa špecificky viazať k sekvencii E boxu, transkripčný aktivátor a prítomnosti intaktného E boxu, na to, že proteín Relax podľa rodiny proteínov bHLH.

v kotransfekčných pokusoch sa chová ako jeho aktivita je

Všetky takéto predkladaného prísne závislá od pozorovania ukazujú vynálezu je členom

Predmetom predkladaného nukleovej kyseliny definovaný vyššie.

vynálezu je tiež schopná exprimovať polypeptid sekvencia typu bHLH

Presnejšie povedané, predkladaný vynález sa týka sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá je sekvenciou SEQ. ID. NO. 1, jej jej derivátmi.

tvorená čiastočne alebo úplne komplementárnym reťazcom alebo i vynálezu môžu byť fragmentmi genómovej DNA (gDNA) alebo RNA.

Nukleové kyseliny podľa komplementárnej DNA (cDNA), i Najmä sú to cDNA alebo gDNA.

Derivát v zmysle tohto vynálezu znamená akúkoľvek sekvenciu líšiacu sa od danej sekvencie v dôsledku degenerácie genetického kódu, sekvenciu získanú jednou alebo niekoľkými modifikáciami genetickej a/alebo chemickej povahy, a tiež akúkoľvek sekvenciu hybridizujúcu s týmito sekvenciami alebo ich fragmentmi, pričom ich produkty si zachovajú vyššie uvedené vlastnosti.

Modifikáciami genetickej a/alebo povahy sa rozumie akákoľvek mutácia, substitúcia, delécia a/alebo modifikácia jedného alebo niekoľkých zvyškov. Takéto deriváty sa môžu pripravovať na rôzne účely, napríklad najmä s cieľom zvýšiť produkčnú hladinu peptidu alebo modifikovať/zvýšiť jeho aktivitu alebo udeliť peptidu nové farmakokinetické vlastnosti. chimérické

K derivátom sekvencie a/alebo patria ktoré dodatočnú heterológnu vzniknutým adíciou nukleovej kyseliny, časť pripojenú k jednému biologické napríklad obsahujú z koncov, napríklad sa môže jednať o hybridný konštrukt obsahujúci cDNA, s ktorou môže byť spojený jeden alebo niekoľko intrónov.

Podobne v predkladanom vynáleze nukleové kyseliny podlá predkladaného vynálezu obsahujú promótor, aktivačné alebo regulačné sekvencie a podobne.

Termín derivát zahrnuje tiež sekvencie homologické s uvažovanou sekvenciou, ktoré sú získané z iných bunkových zdrojov, najmä z buniek Iudského pôvodu, alebo z iných organizmov, a pritom majú aktivitu rovnakého typu alebo v podstate podobného typu. Takéto homologické sekvencie je možné získať hybridizačnými pokusmi. Hybridizácie sa môžu uskutočňovať s knižnicami nukleových kyselín pomocou sondy, natívnej sekvencie alebo jej fragmentu, za obvyklých stringentných podmienok (Maniatis a kol., pozri tiež všeobecné techniky molekulárnej biológie) alebo výhodne za vysoko stringentných podmienok.

Výhodne sa jedná o sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú tu ako sekvencia SEQ. ID. NO. 1, alebo jej komplementárny reťazec.

Predkladaný vynález sa tiež týka zodpovedajúcich anti-sense sekvencií, ktorých expresia umožňuje kontrolovať transkripciu bunkových mRNA. Takéto sekvencie môžu obsahovať celú alebo časť uvedenej sekvencie nukleovej kyseliny, transkribovanú v opačnej orientácii. Sú komplementárne alebo významne komplementárne so sekvenciou nukleovej kyseliny, celé alebo čiastočne.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež použitie polypeptidu podlá vynálezu na riadenia a/alebo na účasť v génovej expresii. Takéto transkripčné aktivátory môžu byť výhodné najmä na zacielenie expresie proteínu do centrálneho nervového systému.

Polypeptidy podlá predkladaného vynálezu sa môžu získať v bunkovom hostitelovi expresiou už opísanej nukleotidovej sekvencie vloženej do rekombinantnej DNA pomocou techník odborníkovi známych alebo kombináciou týchto spôsobov.

Výhodne nukleová kyselina podlá vynálezu tvorí časť vektora vhodného na indukciu expresie polypeptidu podľa vynálezu in vivo, ex vivo a/alebo in vitro. použitý vektor môže byť rôzneho pôvodu, za predpokladu, že je schopný transformovať živočíšnu bunku, výhodne ľudskú nervovú bunku. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa použil vírusový vektor, ktorý možno odvodiť od adenovírusov, retrovirusov, adeno-asociovanýčh vírusov (AAV), herpetického vírusu, cytomegalovírusu (CMV), vírusu vakcínie a podobne, vektory odvodené od adenovírusov, retrovirusov alebo AAV obsahujúce heterológne sekvencie nukleovej kyseliny boli opísané v odbornej literatúre (Akli a kol., Náture Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573; Levero a kol., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Šalie a kol., Science 259 (1993) 988; Roemer a Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dobson a kol., Neurón 5 (1990) 353; Chiocca a kol., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara a kol., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/10888).

Predkladaný vynález sa preto tiež týka akéhokoľvek rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje už definovanú nukleovú kyselinu, vloženú do svojho genómu.

Rekombinantný vektor podľa predkladaného vynálezu je výhodne defektný vírus, termín „defektný vírus označuje vírus, ktorý nie je schopný replikácie v cieľovej bunke. Všeobecne povedané, genóm takéhoto defektného vírusu použitého podľa predkladaného vynálezu postráda prinajmenšom sekvencie nevyhnutné na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto úseky sa môžu buďto odstrániť (úplne alebo čiasnočne), alebo sa môžu zmeniť na nefunkčné, alebo sa môžu nahradiť inými sekvenciami, najmä nukleovou kyselinou podľa vynálezu.

Zvlášť výhodné je použiť sekvencie nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu vo forme vloženej do adenovirusu, AAV alebo rekombinantného retrovírusu, ktoré sú defektné. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa jedná o adenovirusu.

Existujú adenovírusy rôznych sérot.ypov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa do určitej miery odlišujú. Podlá predkladaného vynálezu je výhodné použitie ľudských adenovírusov typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusov živočíšneho pôvodu (pozri patentová prihláška WO 94/26914). K adenovírusom, ktoré sa môžu použiť podlá predkladaného vynálezu, patria napríklad adenovírusy psieho, hovädzieho alebo myšieho pôvodu (napríklad Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo opičieho pôvodu (napríklad SAV). Výhodne je adenovírus živočíšneho pôvodu psí adenovírus, výhodnejšie adenovírus CAV2 (napríklad kmeň „Manhattan alebo A26/61), ATCC VR-800) . Výhodne sa podľa predkladaného vynálezu použije adenovírus ľudského, psieho alebo zmiešaného pôvodu. Výhodne je v genóme adenovírusu podľa predkladaného vynálezu nefunkčný aspoň úsek El. Funkcie tohto vírusového génu sa môže vyradiť akýmkoľvek spôsobom známym odborníkovi, najmä úplnou supresiou, substitúciou alebo čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo niekoľkých báz v uvedenom géne (génoch) . Môžu sa modifikovať aj iné úseky, najmä úseky E3 (WO95/0267), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649) , WO95/02697) a L5 (WO98/02697).

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje adenovírus deléciu v úsekoch El a E4.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje deléciu v úseku El na úrovni miesta vloženia úseku E4 a kódujúcej sekvencie. Vo vírusoch podľa predkladaného vynálezu delécia výhodne obsahuje nukleotidy 455 až 3329 v sekvencii adenovírusu Ad5. Podľa iného výhodného uskutočnenia je exogénna nukleová kyselina vložená na úrovni delécie v úseku El.

Defektné rekombinantné vírusy podľa predkladaného vynálezu sa môžu pripraviť homologickou rekombináciou medzi defektným vírusom a plazmidom nesúcim okrem iného nukleotidovú sekvenciu definovanú vyššie (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, Graham, EMBO J: 3(12) )1984) 917). K homologickej rekombinácii dochádza po kontransfekcii uvedeného vírusu a plazmidu do vhodnej bunkovej línie. Vhodná bunková línia má výhodne I) byť tansformaovatelná uvedenými prvkami a II) obsahovať sekvencie schopné komplementácie defektných časti vírusového genómu, výhodne v integrovanej forme, aby sa zabránilo riziku rekombinácie. Ako príklad línie, ktorá sa môže použiť na prípravu defektných rekombinantných adenovírusov, je možné uviesť líniu 293 ľudských embryonálnych obličiek (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá zvlášť obsahuje ľavú časť genómu adenovirusu Ad5 (12 %) integrovanú do bunkového genómu. Ako príklad línie, ktorá sa môže použiť na prípravu defektného rekombinantného retrovírusu možno uviesť líniu CRIP (Danos a Mulligan, PNAs 85 (1988) 6460). A ďalej sa vírusy, ktoré sa namnožili, izolujú a purifikujú technikami známymi v odbore molekulárnej biológie.

Vektor, nukleová kyselina alebo polypeptid podľa predkladaného vynálezu môžu byť v izolovanej alebo purifikovanej forme.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež farmaceutický prípravok obsahujúci aspoň jednu nukleotidovú sekvenciu, vektor alebo polypeptid podľa vynálezu.

Predkladaný vynález sa týka tiež akéhokoľvek použitia sekvencie alebo vektora podľa vynálezu na prípravu farmaceutického prípravku na liečenie patologických stavov ovplyvňujúcich nervovú sústavu.

Okrem toho vynález zahrnuje aj akékoľvek použitie polypeptidov podľa vynálezu na riadenia a/alebo na účasť v génovej expresii.

Nasledujúce príklady a obrázky slúžia na ilustráciu vynálezu a ďalej charakterizujú a demonštrujú výhody vynálezu, bez toho, že by ho akokoľvek obmedzovali.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1

Nukleotidová sekvencia cDNA CIG235. V tejto sekvencii sú zobrazené rôzne oligonukleotidy použité na izoláciu úplnej cDNA. Šípky ukazujú orientáciu týchto oligonukleotidov v smere od 5' ku 3 '.

Obrázok 2

Porovnanie aminokyselinových sekvencii domény bHLH proteínu Relax s ostatnými proteinmi z rodiny. Homologické aminokyseliny sú označené čiernou a aminokyseliny s podobnou štruktúrou sú označené šedou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Priama PCR amplifikácia sekvencii medzi bázickými doménami a Helixom II pomocou degenerovaných oligonukleotidov

Izolácia cDNA kódujúcej nové transkripčné faktory rodiny bHLH sa uskutočnila z SCG laboratórnych potkanov („Rat Superior Cervical Ganglia), horná krčná nervová uzlina potkana). Keďže proteíny tejto rodiny majú vysoko konzervatívne jednotky aminokyselinových sekvencii, najmä bázickú doménu nasledujúcu za Helixom I a Helixom II, boli vybrané degenerované oligonukleotidy kódujúce tieto rôzne konzervatívne úseky. Boli vybrané tak, aby konzervovali bázické úseky a doménu Helixu II komplexu achaete-scute drozofily a bHLH cicavčích génov ako sú Mash-1, Mash-2 a M-Twist. Tieto oligonukleotidy boli použité ako „sense a „antisense (priame a spätné) priméry na jednak na uskutočnenie priameho screeningu knižnice SCG skonštruovanej pomocou PCR a tiež na PCR na ss-cDNA z SCG.

Priamy (sense) oligonukleotid sa vybral z bázciekj domény proteinov bHLH, konkrétne je to oligonukleotid zodpovedajúci nasledujúcemu polypeptidovému fragmentu:

5'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ. ID. NO. 2)

Spätný (anti-sense) oligonukleotid sa určil z Helixu II rovnakých proteinov bHLH. Je to oligonukleotid zodpovedajúci nasledujúcemu polypeptidovému fragmentu:

5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ. ID. NO. 3).

Jednoreťazcová cDNA (ss-cDNA) sa pripravila z 500 ng denaturovanej polyA*RNA získanej z SCG dva dni starých potkanov.

PCR amplifikácia sa uskutočnila v reakčnej zmesi obsahujúcej okrem PCR pufra (10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KC1, 2,5 mM MgC12) , 200 μΜ dNTP, 12,5 μΜ každého z oligonukleotidov a 20 ng ss-cDNA. PCR sa uskutočnila tak, že sa postupne uskutočnila

3-minútová denaturácia pri 94 °C, potom 2 cykly (94 °C po 30 s; 50 °C po 45 s; 72 °C po 1,5 min) a nakoniec 38 cyklov (94 °C po 30 s; 62 °C po 45 s; 72 °C po 1,5 min). Produkty PCR sa klonovali do miesta Smal plazmidu pUC19 a takto získaných 1500 klonov sa analyzovalo sekvenovaním. Hladala sa prítomnosť jednotky Helixu I v aminokyselinovéj sekvencii dedukovanej z nukleotidovej sekvencie týchto rôznych cDNA. Veľká časť týchto cDNA (670) obsahoval takúto jednotku a z nich len jedna zodpovedala prípadnému novému členovi rodiny bHLH. Ostatné izolované cDNA zodpovedali známym proteínom bHLH.

Novo izolovaná cDNA nazvaná CIG235 a uvedená tu na obrázku 1 zodpovedá fragmentu 76 nukleotidov (okrem sekvencií zodpovedajúcich oligonukleotidom vneseným pri PCR). Porovnávacie priradenie aminokyselinových sekvencii sa uskutočnilo s tým, že nebola povolená ani inzercia ani delécia. Tieto porovnania ukázali, že uvedený fragment kóduje jednotku homologickú s jednotkou Helixu I proteínov bHLH. Potom sa uskutočnila izolácia úplnej cDNA.

Príklad 2

Izolácia úplnej cDNA zodpovedajúcej CIG235

Izolácia úplnej cDNA zodpovedajúcej CIG235 bola extrémne náročná, lebo mRNA zodpovedajúca CIG235 sa v SCG exprimuje veľmi slabo. Zdá sa, že úroveň jej expresie je blízka úrovni nelegitímnej transkripcie. Zvolený spôsob spočíval v tom, že na jednej strane sa izoloval 3' koniec cDNA zodpovedajúci CIG235 pomocou PCR a na druhej stane 5' koniec tejto cDNA sa izoloval z miechy embryí potkana v štádiu E12.5.

1. 3' Extenzia cDNA CIG235 pomocou zakotvenej („anchored) PCR

Na tento účel sa pripravila SCG ss-cDNA pomocou RA3'NV priméru (náhodný primér na reverznú transkripciu nesúci kotvu 3'NV) metódou podľa Dumas Milne Edwards a kol. (1995, A Practical Approach Ed McPherson a kol., 89-118, IRL Press Oxford U.K.). Vybrali sa dva špecifické hniezdové priméry v bHLH pozitívnom klone 76 nukleotidov:

CIG5'-1: 5'- AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID NO. 4) a

CIG5'-2: 5'- CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID NO. 5).

3' koniec CIG235 sa potom amplifikoval v dvoch hniezdových PCR s pármi oligonukleotidov CIG5'-1 a A3'-l a potom CIG5'-2 a A3'-2. Použila sa rovnaká PCR reakčná zmes ako je opísaná v príklade 1, len s 0,8 μΜ každého oligonukleotidu s denaturačným krokom 94 ^eC, 30 s a s predlžovacím krokom 72 ^ec,

1,5 min. Nasadnutie primérov („annealing) sa uskutočnilo pri rôznych teplotách počas 45 s. Počas prvých desiatich cyklov sa po každých dvoch cykloch teplota znížila o 1°C zo 70 ’C na 65 ’C a potom sa udržiavala na 65 °C počas 30 cyklov. Výsledné produkty sa klonovali do pUC19 a sekvenovali. Získala sa tak cDNA dĺžky 717 nukleotidov, nazvaná CIG3', ktorej 5' časť zodpovedala 3' konci klonu CIG235. Analýza otvorených čítacích rámcov ukázala, že bola izolovaná celá sekvencia kódujúca karboxylový koniec proteínu s nekódujúcim 3' koncovým úsekom 321 nukleotidov.

2. Izolácia 5' konca zodpovedajúceho CIG3' z miechy embrya potkana v štádiu E12.5

Expresný vzorec mRNA zodpovedajúcej CIG3' sa stanovil pomocou hybridizácie in situ. Expresia sa stanovila v rôznych štádiách embryonálneho vývoja. Vybrala sa taká metóda, že sa uskutočnila hybridizácia in situ na hrubých rezoch embryí potkaňou so sondou značenou digoxygenínom. Táto metóda je v podstate adaptáciou metódy hybridizácie in toto (1994, A Practical Approach, Ed Wilkonson a kol., 75-83, IRL Press Oxford U.K.) a umožňuje rýchly screening celých embryí v mnohých rôznych štádiách).

Silná expresia sa detegovala v mieche v deň 12,5 embryonálneho vývoja (E12.5). Pripravila sa preto mRNA z miechy v tomto vývojovom štádiu a potom sa izoloval 5' koniec metódou SLIC. Produkt PCR veľkosti 893 bp sa nakoniec izoloval a nazval sa CIG5'.

cDNA CIG3' a CIG5' sa pripravia v úseku 120 nukleotidov a vytvárajú celkovú cDNA, ktorej veľkosť je 1491 nukleotidov.

Avšak vzhladom k tomu, že uvedené CIG3' a CIG5' neboli izolované z rovnakého tkaniva, bolo treba ukázať, že celok vytvorený priradením existujúcej mRNA a že klonov zodpovedá skutočne sa nejedná len o chiméru vytvorenú PCR.

týchto

Pomocou PCR po reverznej transkripcii sme preto overili, že celá mRNA je prítomná v mieche v štádiu E12.5. V tomto tkanive jediná amplifikácia PCR umožnila vizualizovať celú túto mRNA. Navyše analýza mRNA pomocou northernového prenosu ukázala, že všetky tri sondy, t. j. CIG3' a CIG5' a celková cDNA detegovali jedinú cDNA veľkosti 3,1 kb. A nakoniec časopriestorové vzorce expresie získané hybridizáciou in situ s CIG3' alebo celkovou cDNA sú úplne zhodné. Tieto výsledky sú presvedčivým dôkazom toho, ž e » CIG3' a CIG5' skutočne zodpovedajú fragmentom jednej a tej istej mRNA.

«

Aby sme eliminovali vplyv bodových mutácii vnesených pri PCR polymerázou Taq, uskutočnili sa štyri nezávislé amplifikácie celej cDNA z ss-cDNA z miechy E12.5. Boli sme tak schopní presne stanoviť sekvenciu cDNA, ktorá je tu uvedená ako SEQ ID NO 1.

Analýza sekvencie cDNA ukázala, že sa izoloval celý kódujúci úsek, nekódujúci úsek 5' konca a tiež časť netranslatovaného 3' úseku. Okrem toho sa expresia zodpovedajúcich mRNA detegovala v embryu vo forme pozdĺžnych pásov. Táto charakteristika bola dôvodom, že táto cDNA sa nazvala Relax (z „Rat embryonic longitudinal axis).

. Príklad 3 , Porovnanie aminokyselinových sekvencií domény bHLH proteínu

Relax s inými proteínmi rodiny bHLH

Analýza aminokyselinovej sekvencie dedukovanej z cDNA Relax jasne ukazuje, že tento proteín patrí do rodiny bHLH proteinov. Doména bHLH proteínu Relax má 68 % identitu s bHLH jednotkou proteínu NeuroD (Lee a kol., 1995). Okrem toho je zjavné, že Relax zdieľa stále viac sekvenčných identít s proteínmi homologickými s ato (Math-1, Akazawa a kol., 1995) ako s proteínmi homologickými s AS-C (Mash-1, Johnson a kol., 1990), pozri obrázok 2. Avšak úplná neprítomnosť sekvenčnej identity s ostatnými členmi rodiny mimo domény bHLH ukazuje na to, že Relax nie je paralógom už existujúceho proteínu. Z tohto dôvodu je Relax pravdepodobne prvým členom novej podrodiny proteinov bHLH.

Príklad 4

Charakteristika transkripčnej aktivity proteínu Relax

Analýzy aminokyselinových sekvencií ukázali, že Relax zdieľa spoločnú štruktúru s proteínmi rodiny bHLH. Tieto proteíny sú transkripčné faktory. Bolo preto dôležité dokázať, že Relax cDNA kóduje proteín, ktorý má vlastnosti transkripčného faktora, čiže, že Relax je schopný regulovať transkripciu.

1. Proteíny rodiny bHLH vytvárajú homo- a heterodiméry a viažu sa špecificky na DNA (Murre a kol., 1989, Celí, 558, 53744) . Charakterizácia väzbových miest in vitro umožnila identifikovať konvenčnú (konsenzuálnu) hexanukleotidovú sekvenciu CANNTG, nazývanú E box (Murre a kol., 1989). V pokusoch s retardovanou migráciou v géle sme preukázali, že purifikovaný rekombinantný proteín Relax je schopný viazať sa špecificky na sekvenciu obsahujúcu E box. Na tento dôkaz sa DNA kódujúca proteín Relax vložila do miest Ndel a KpnI vektora pFLAG-CTC. Po expresii proteínu v E. coli. sa na afinitnej kolóne purifikoval fúzny proteín Relax-Flag a potom sa použil vo väzbovej reakcii za prítomnosti oligonukleotidu obsahujúceho E box.

2. Transkripčná aktivita proteínu Relax alebo jeho časti sa testovala pomocou kotransfekčných pokusov s bunkovou líniou PC12 z feochromocytov potkana.

V týchto pokusoch sa použil luciferázový reportérový gén umiestnený pod kontrolu promótora obsahujúceho E box ( kb TH promótora) alebo rovnakého promótora obsahujúceho mutovaný E box.

Paralelne sa pripravil vektor na expresiu proteínu Relax nasledujúcim spôsobom:

cDNA kódujúca protein Relax (od polohy 389 do 1235) sa vložila do miest EcoRI a Xhol expresného vektora pcDNA3 „downstream (po smere transkripcie) od promótora CMV. Promótor TH potkana nesúci E box CAGGTC (sekvencia SEQ ID NO. 6) v polohe 197 na 5 kb fragmente sa vložil do zatupeného miesta HindlII plazmidu pKSLuc, čim vznikol plazmid 5kbTH-Luc. Miesto sa mutovalo na TCCGTG (sekvencia SEQ ID NO. 7) a výsledný plazmid sa nazval 5kbTH (Delta E)-Luc.

Plazmid pcDNA3-Relax sa kotransfekoval v rôznych množstvách od 0 do 5 pmol, po doplnení do 5 pmol prázdnym vektorom pcDNA3, do buniek PC12 (10⁶ buniek na misku) v zmesi s 1 pmol plazmidu 5kbTH-Luc, 5kbTH (Delta E)-Luc alebo pKSLuc. Kvôli vyhodnoteniu transfekčnej účinnosti sa použilo na kotransfekciu tiež 0,2 pmol vektora exprimujúceho gén kódujúci CAT (Chloramfenikolacetyltransferázu) pod kontrolu promótora RSV.

Meranie luciferázovej aktivity po kotransfekcii týchto vektorov s rastúcim množstvom vektora na expresiu proteínu Relax, ukázala, že Relax aktivuje transkripciu reportérového génu v závislosti od množstva použitého expresného vektora, a že táto aktivácia striktne vyžaduje prítomnosť intaktného E boxu.

Príklad 5

Charakterizácia miest expresie Relax mRNA počas embryonálneho vývoja

Pomocou hybridizácie in situ sme systematicky charakterizovali distribúciu Relax mRNA v priebehu embryonálneho vývoja u potkanov. S týmto cieľom sa hybridizácia in situ uskutočňovala metódou podía Wilkinsona s anti-sense ribosondami, a to buď in toto alebo na rezoch s hrúbkou 250 μιη. ribosondy sa pripravili v prítomnosti 1 gg linearizovaného plazmidu a v prítomnosti 3,5 nmol dioxygenín-ll-UTP pomocou súpravy pre ribosondy firmy Promega. Tieto podrobné analýzy ukázali, že expresia Relax mRNA je prechodná a priestorovo obmedzená.

Táto mRNA je prítomná len v embryu, a to medzi vývojovými dňami 11,5 a 18,5. Expresia je obmedzená na centrálny nervový systém. Skutočne, žiadna expresia sa nedetegovala ani v periférnom nervovom systéme, ani mimo nervový systém. V rámci CNS sa Relax mRNA exprimuje len v mieche a v prednom a zadnom laloku.

Podrobnejšie možno povedať, že Relax mRNA sa exprimuje v pozdĺžnych kompartmentoch miechy a zadného mozgu. Distribúcia v mieche je obmedzená na dva súvislé pásy s bilaterálnou symetriou pozdĺžne organizované a obmedzená, v osi D/V, na bazálnu vrstvu, a to jeden na brušnej a druhý na chrbtovej strane.

V prednom mozgu je Relax mRNA lokalizovaná v dvoch skupinách buniek na každej strane optického výbežku, na ventrálnej strane hypotalamu a v preoptickej oblasti. Hlavná skupina buniek exprimujúcich Relax je situovaná v bazálnej časti. Len niekoľko buniek v preoptickej oblasti je situovaných v krídlovej oblasti. Situácia v prednom mozgu je veľmi podobná situácii v mieche a zadnom mozgu. Bunky exprimujúce Relax sú skutočne obmedzená len na ventrikulárnu oblasť.

Príklad 6

Charakterizácia doby embryonálneho vývoja expresie Relax mRNA v priebehu

Všetky miesta expresie súčasne patria do obdobia Ell,5.

Progresívne miznú z miechy medzi E16,5 a 18,5, podlá ventrodorzálneho gradientu, ktorý sleduje progresívnu redukciu ventrikulárnej zóny. V zdanom mozgu expresia Relax mRNA ustáva v rovnakej chvíli ako v strednom páse miechy. A nakoniec, v prednom mozgu expresia Relax mRNA mizne po E18,5. Je dôležité zdôrazniť, že expresia Relax je viazaná na ventrikulárnu zónu a že časové obdobia prechodnej expresie súhlasia s vytváraním neurónov v týchto rôznych štruktúrach.

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1491 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: potkan (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 1:

216

288

360

432

M A t K P L

491

D A T T I GAT GCG CCC ACC ATC ccctrtcaatttvttcccnacctcagg ATG GCG CCT CAT CCC TTG

Q

v

3

Q

Σ

T

Q

P

r

P

G

A

S

3

K

Σ

7

29

CAA

GTG

TCC

CAA

GAG

ACC

CAG

CAA

CCC

TCT i

CCC

GGA

GCC ¹

TCG i

GAC

CAC

GAA GTG

545

L

S

3

H

S

T

P

s

P

T

L

7

P

R

9

C

S

47

CTC

AGT

TCC

AAT

TCC

ACC

CCA

CCT

AGC

CCC

ACT

CTC

GTA

CCG

AGG

GAC

TCC ¹

TCC

599

Σ

A

Σ

A

G

9

C

R

G

T

3

R

K

I>

R

A

R

65

GAA

GCA

GAA

GCA

GGT

GAC

TGC

CGA

GGG

ACA

TCG

RGG

AAG

CTC

CGT

GCG

CGG

CGC

653

G

R

H

R

P

K

S

Σ

L

A

L

3

K

Q

R

S

83

GGA

GGG

CGC

AAC

AGG

CCC

AAG

AGC

GAG

TCG

GCA

CTC

AGC

AAG

CAG

CGA

AGC

707

R

K

A

H

9

R

Σ

R

H

R

M

K

H

L

H

S

101

CGG

CGC

ARG

AAG

GCC

AAC

GAC

CGG

GAG

CGC

RAC

CGC

ATG

CAC

RAC

CTC

AAC

TCC

761

A

L

9

A

L

R

G

7

L

P

T

I

P

9

R

K

L

119

GCG

CTG

GAT

GCG

CTG

CGC

GGT

GTC

CTG

CCC

ACC

TTC

CCG

GAT

GAC

GCC

ARA

CTC!

815

T

K

I

Σ

T

L

R

Γ

R

K

N

T

I

W

A

L

T

Q

137

ACA

AAG

ATC

GAG

ACC

CTG

CGC

TTC

GCC

CAC

RAC

TAC

ATC

TGG

GCA

CTG

ACT

CAG

869

T

L

R

I

A

9

K

3

Γ

r

G

P

Σ

P

7

P

C

155

ACG

CTG

CGC

ATA

GCG

GAC

CAC

AGC

TTC

TAC

GGC

CCC

GAG

CCC

CTT

GTG

CCC

TCT

923

G

Σ

L

G

S

P

G

3

S

G

9

w

G

3

I

Y

173

GGG

GAG

CTG

GGA

AGC

CCG

GGA

GGG

GGC

TCC

AGC

GGC

GAC

TGG

GGC

TCT ATC

TAC

977

3

P

7

3

Q

A

G

3

L

s

P

T

R

S

L

Σ

r

191

TCC

CCA

GTC

TCC

CAA

GCT

¹ GGT

¹ AGC

CTG

AGC

CCC

ACA

i GCC

TCA

TTG

i GAG GAG

TTC

1031

P

G

L

Q

7

P

3

P

3

C

L

P

G

T

L

7

209

CCT GGC

CTG

CAG

GTG

CCC

: AGC

: TCC

CCA

TCC

TGT CTG CTC

CCG

i GGC ACC CTG

i GTC

1085

(2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 2:

AATKHGMGIG AGCGCIDKCG CRYG (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NÓ. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 3:

GGCSRDTYTC AGGGTSYBGA YCTT (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 25 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 4:

AACCTTAACT CCGCGCTGGA TGCGC 25 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 5:

CGCGGTGTCC TGCCCACC

INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 bázových párov (B) . TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 6:

CAGGTG (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII SEQ ID NO. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 6 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA SEQ ID NO. 7:

TCCGTG

1. Polypeptid typu bHLH prejavujúci transkripčnú aktivitu, vyznačujúci sa tým, že zdieľa sekvenčnú homológiu s proteínmi typu bHLH len na úrovni domény bHLH.

Claims

2. Polypeptid majúci transkripčnú aktivitu, vyznačuj úci sa tým, že je úplne alebo čiastočne predstavovaný sekvenciou SEQ ID NO. 1 alebo ktorýmkoľvek jej derivátom.
3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje sekvenciu SEQ ID NO. 1.
4. Polypeptid podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyznačujúci sa t ý m, že je to protein Relax.
5. Sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4.
6. Sekvencia nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že je úplne alebo čiastočne predstavovaná sekvenciou SEQ ID NO. 1, jej komplementárnym reťazcom alebo jej derivátom.
7. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 6, vyznačujúca sa t ý m, že je predstavovaná sekvenciou SEQ ID NO. 1 alebo jej komplementárnym reťazcom.
8. Vektor obsahujúci nukleotidovú sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.
9. Vektor podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že je to vírusový vektor.
10. Vektor podía nároku 9,vyznačujúci sa tým, že je odvodený od adenovirusov, retrovirusov, vírusov AAV, HSV alebo CMV, alebo vírusu vakcínie.
11. Vektor podľa ktoréhokolvek z nárokov. 9 a 10, vyznačujúci sa t ý m, že je to replikačne defektný vírus.
12. Použitie polypeptidov podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 4 na riadenie expresie génov a/alebo na účasť na expresii génov.
13. Farmaceutický prípravok vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jednu sekvenciu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokolvek z nárokov 5 až 7, alebo jeden či niekoľko vektorov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 11.
14. Farmaceutický prípravok vyzná.čujúci sa tým, že obsahuje aspoň jeden polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4.
15. Použitie sekvencie podľa ktoréhokolvek z nárokov 5 až 7 alebo vektora obsahujúceho uvedenú sekvenciu na prípravu farmaceutického prípravku na liečenie patologických stavov zasahujúcich nervový systém.