WO1998027206A2 - Polypeptides de la famille 'basic helix-loop-helix' bhlh, sequences d'acides nucleiques correspondantes - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a new protein of the bHLH type and to the corresponding coding nucleic sequence. It also relates to expression vectors integrating said sequence and the use of this sequence or protein for therapeutic purposes.
  • the embryonic neural tube is originally composed of an undifferentiated neuroepithelium over its entire length.
  • the cells then differentiate according to their positions on the anterior / posterior, dorsal / ventral and medium / lateral axes generating
  • the proteins of this family have very conserved amino acid motifs and more particularly a basic domain followed by Helix 1 and Helix 2. These last two motifs are separated by a loop of variable size.
  • certain products of these bHLH genes participate in the various stages of neurogenesis during neuronal determination and differentiation.
  • the present invention specifically relates to the isolation, sequencing and characterization of a cDNA coding for a polypeptide belonging to a new family of proteins of the bHLH type. It also describes recombinant DNAs incorporating this sequence, vectors containing it and their use to activate expression of recombinant proteins
  • the present invention has for first object a bHLH type polypeptide endowed with a transcriptional activity characterized in that it shares a sequence homology with the bHLH type proteins only at the level of its bHLH domain.
  • the present invention relates to a polypeptide having a transc ⁇ ptional activity characterized in that it is represented in whole or in part by SEQ ID N ° 1 or one of its derivatives
  • drift is meant in the sense of the present invention products comprising for example modifications in the primary structure, such as deletions of one or more residues, substitutions of one or more residues, and / or modifications at the level of one or more residues
  • the number of residues affected by the modifications can be for example from 1 2 or from 3 to 10 20 or 30 residues
  • Le term de ⁇ ve also includes molecules comprising additional internal or terminal parts, of peptide or non-peptide nature II can be in particular active parts, markers, amino acids, such as a methionine in position -1
  • derivative includes also molecules with modifications in the tertiary structure (N-terminal end, etc.)
  • the derivatives share at least one structural homology with the claimed protein and more preferably at least at the level of the regions bordering the bHLH domain, and retain its biological property of transc ⁇ ptional activator
  • the derivatives can also bring new properties to the claimed polypeptides (labeling ,) or improve their properties (stability, biological activity, etc.)
  • it is a bHLH type polypeptide having the sequence represented in SEQ ID No. 1. It is more preferably a protein comprising an open reading frame, of 214 amino acids whose expression of the corresponding mRNA is detected in the rat embryo in the form of longitudinal bands.
  • This protein is designated below under the name Relax for "Rat Embryonic Longitudinal Axis" and constitutes one of the objects claimed according to the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence capable of expressing a bHLH type polypeptide as defined above.
  • the present invention relates to a nucleic acid sequence characterized in that it is represented in whole or in part by SEQ ID No. 1, its complementary strand or its derivative
  • the claimed nucleic acids may be fragments of complementary DNA (cDNA), genomic DNA (gDNA) or fragments of RNA. It is more preferably cDNA or gDNA.
  • cDNA complementary DNA
  • gDNA genomic DNA
  • RNA fragments of RNA. It is more preferably cDNA or gDNA.
  • the term de ⁇ ve designates any sequence different from the sequence considered due to a degeneration of the genetic code obtained by one or more modifications of a genetic and / or chemical nature as well as any sequence hybridizing with these sequences or fragments thereof and whose product has the activity indicated
  • modification of a genetic and / or chemical nature one can understand any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of improving its production levels which increase and / or modify its activity, or that of giving it new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • chimeric nucleic sequences comprising an additional heterologous part. linked to one end, of the type for example hybrid constructions consisting of a cDNA with which one or more introns would be associated
  • the claimed nucleic acids may comprise promoter, activation, regulation sequences, etc.
  • the term derivative also includes sequences homologous to the sequence considered, derived from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms, and having an activity of the same type or substantially similar type. Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments Hybridizations can be carried out from nucleic acid libraries, using as probe the native sequence or a fragment thereof, under conventional conditions of st ⁇ ngence (Maniatis et al, Cf general molecular biology techniques), or, preferably, under high conditions
  • the present invention also intends to cover the corresponding antisense sequences, the expression of which makes it possible to control the transcription of cellular mRNAs.
  • sequences may consist of all or part of the nucleic sequence considered transcribed in the reverse orientation. They are Complementary or significantly complementary to the nucleic acid sequence in whole or in part
  • Another subject of the present invention is the use of the claimed polypeptides to control and / or participate in the expression of genes.
  • These transcriptional activators can be very particularly advantageous for targeting the expression of a protein at the level of the central nervous system.
  • polypeptides of the invention can be obtained by expression in a cellular host of a nucleotide sequence as described above, incorporated or not in a recombinant DNA, using techniques known to those skilled in the art, or by a combination of these techniques
  • the nucleic acid sequences according to the invention form part of a vector useful for inducing in vivo, ex vivo and / or in vitro the expression of the claimed polypeptides.
  • the vector used can be of various origins, since it is capable of transforming animal cells, preferably human nerve cells
  • a viral vector is used, which can be derived from adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus (AAV), virus herpes, cytomegalovirus (CMV), vaccinia virus, etc.
  • the recombinant virus according to the invention is a defective virus
  • the term "defective virus designates a virus incapable of replicating in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least sequences necessary for the rep cation of said virus in the infected cell These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the nucleic acid of the invention
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • nucleic acid sequences of the invention in the form incorporated into an adenovirus, an AAV or a defective recombinant retrovirus. According to a preferred embodiment, it is an adenovirus
  • adenovirus serotypes whose structure and properties vary somewhat.
  • human adenoviruses of type 2 or 5 Ad 2 or Ad 5
  • adenoviruses of animal origin see application WO94 / 26914.
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of murine bovine canine origin (example Mavl Beard et al, Virology 75 (1990) 81) avian or even simian porcine ovine (SAV example)
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferentially an adenovirus CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR- 800) for example]
  • adenovirus of human or canine or mixed origin Preferably used in part of the invention of adenovirus of human or canine or mixed origin
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total deletion, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered Other regions can also be modified, and in particular the region E3 (WO95 / 02697), E2
  • the adenovirus comprises a deletion in the El and E4 regions According to another preferred embodiment, it comprises a deletion in the El region at which the region is inserted
  • the deletion in the region E 1 preferably extends from nucleotides 455 to 3329 on the sequence of the adenovirus
  • the exogenous nucleic acid sequence is inserted at the level of the deletion in the El region
  • the recombinant defective viruses of the invention can be prepared by homologous recombination between a defective virus and a plasmid carrying, inter alia, the nucleotide sequence as defined above (Levrero et al, Gene 101 (1991) 195, Graham, EMBO J 3 (12) (1984) 2917) Homologous recombination occurs after co-transfection of said viruses and plasmid into an appropriate cell line.
  • the cell line used should preferably (î) be transformable by said elements, and (u), include the sequences capable of complementing the part of the defective virus genome, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination
  • a line usable for the preparation of defective recombinant adenoviruses mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham and al J Gen Virol 36 (1977) 59) which contains in particular integrated in its genome, the left part of the genome of an Ad 5 adenovirus (12%)
  • the CRIP line Danos and Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460 )
  • the viruses that have multiplied are recovered and purified according to conventional molecular biology techniques
  • the vector, the nucleic acid or the polypeptide of the invention can be in an isolated or purified form
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one nucleotide sequence, a vector or a polypeptide according to the invention
  • the invention also extends to any use of the claimed polypeptides to control and / or participate in the expression of genes
  • FIG. 1 CIG235 cDNA nucleotide sequence This sequence shows the different oligonucleotides used to isolate the complete cDNA The arrows indicate the 5 'to 3' orientation of these oligonucleotides
  • Figure 2 Comparison of amino acid sequences of the bHLH domain of Relax with other proteins in the family. In black are the homologous amino acids, in gray the amino acids of similar structure.
  • rat GCS Rat Superior Cervical Ganglia
  • the proteins of this family have very conserved acid motif motifs, in particular a basic domain followed by Helix 1 and Helix 2
  • degenerate oligonucleotides are chosen encoding these various conserved regions. They were therefore selected so as to conserve the basic regions and the Helix II domain of the Drosophilia achaete-scute complex and of the mammalian bHLH genes such as Mash-1, Mash-2 and M-Twist.
  • Such oligonucleotides have been used respectively as sense and antisense primer on the one hand, to carry out a direct screening of a GCS library constructed by PCR, and on the other hand to carry out PCR on cDNA-ss of GCS.
  • the sense oligonucleotide was chosen from the basic domain of these bHLH proteins, more precisely it is the oligonucleotide corresponding to the following polypeptide fragment: 5'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3 '(SEQ ID No. 2)
  • the antisense oligonucleotide was determined from the Helix II domain of the same bHLH proteins. It is the oligonucleotide corresponding to the following polypeptide fragment: 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3 '(SEQ ID N ° 3)
  • the single-strand cDNA is prepared from 500 ng of denatured RNApolyA + from the GCS of rats, two days old
  • the PCR amplification is carried out on a mixture comprising, in addition to the PCR buffer (10 mM Tris, pH 8.3, 50 mM Kcl, 2.5 mM MgCl 2), 200 ⁇ M dNTP, 12.5 ⁇ M of each oligonucleotide and approximately 20 ng of ss-cDNA
  • La PCR is carried out by successively performing 3 minutes of denaturation at 94 ° C, 2 cycles (94 ° C for 30 sec, 50 ° C for 45 sec, 72 ° c for 1.5 min) followed by 38 cycles (94C for 30 sec , 62 ° C for 45 sec, 72) C for 1.5 min)
  • the PCR products are cloned at the SmaI site of pUC19 and the 1500 clones thus obtained, analyzed by sequencing We looked for the presence of a Helix I motif in the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of these different cDNAs A large proportion of these cDNAs (670) contain such
  • the new isolated cDNA corresponds to a fragment of 76 nucleotides (excluding the sequences corresponding to the oligonucleotides introduced by the PCR).
  • the amino acid sequence alignments were carried out while not allowing either insertions or deletions. These alignments show that this fragment codes for a motif homologous to the Helix I motif of the bHLH proteins.
  • the isolation of the complete cDNA was then undertaken.
  • the isolation of the complete cDNA corresponding to CIG235 was extremely difficult, because the mRNA corresponding to CIG235 is very little expressed in the GCS II even seems that its level of expression is close to that of illegitimate transcription
  • the technique adopted consists on the one hand in isolating the 3 'end of the cDNA corresponding to CIG235 by anchored PCR and on the other hand in isolating the 5' end of this cDNA from spinal cord of rat embryos at the El stage 2, 5
  • GCS ss-cDNAs are prepared with the primer RA3 'NV (random reverse transcription primer carrying the anchor 3' NV) according to the Dumas method Milne Edwards et al (1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al , pp89-1-18, IRL Piess Oxford UK)
  • Two specific nested primers are selected from the 76 nucleotide bHLH positive clone CIG5 5'-AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and CIG5'-2 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC- 3 '(SEQ ID N ° 5)
  • CIG3 'and CIG5' cDNA overlap over a region of 120 nucleotides and form a total cDNA whose size is 1491 nucleotides
  • the proteins of the bHLH family form homo or heterodimeres and bind specifically to DNA (Murre et al, 1989, Cell, 558, 537-44)
  • C ANNTG consensus hexanucleotide sequence
  • box E box E
  • the purified recombinant Relax protein is capable of specifically binding to a sequence containing an E box
  • the DNA coding for the Relax protein is inserted between the NdeI and Kpnl sites in a pFLAG-CTC vector.
  • the Relax-Flag fusion protein is purified on a column. affinity then used in a binding reaction in the presence of an oligonucleotide containing an E box 2
  • the transcriptional activity of the Relax protein was tested by cotransfection experiments in the PC 12 cell line, derived from rat pheochromocytomas
  • luciferase reporter gene placed under the control, on the one hand, of a promoter containing an E box (5kb of the TH promoter) and, on the other hand, of the same promoter containing a mutated E box
  • the cDNA coding for the Relax protein (from position 389 to 1235) is inserted between the EcoRI and Xhol sites in the expression vector pcDNA3 downstream of the CMV promoter.
  • the TH promoter of the rat carrying an E box CAGGTG (SEQ ID N ° 6) at position 197 on a 5kbp fragment is inserted at the HindIII site made blunt-ended in the plasmid pKSLuc which becomes 5kbTH-Luc
  • the site is mutated into TCCGTG (SEQ ID No. 7) and the resulting plasmid designated 5kbTH (Delta E) -Luc
  • the plasmid pcDN A3 -Relax is cotransfected in different amounts varying from 0 to 5pmole, and brought back to 5pmole with empty pcDNA3 vector, in PC 12 cells (10 6 cells / plate) mixed with lpmole of plamide 5kbTH-Luc, 5kb -TH (deltaE) - Luc or pKSLuc
  • 0.2pmol of an expression vector of the gene coding for the CAT protein (chloramphenicol acetyltransferase) under the control of the RSV promoter are also cotransfected
  • This mRNA is only present in the embryo, between days 1 1 5 and 18 5 of development Its expression is restricted to the central nervous system In fact, no expression was detected, neither in the peripheral nervous system, nor outside the nervous system Inside the CNS, Relax mRNA is expressed only in the spinal cord, the posterior brain and the anterior brain
  • Relax mRNA is expressed in longitudinal compartments in the spinal cord and the posterior brain
  • NAME RHONE-POULENC RORER S.A.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à des fins thérapeutiques.

Description

POLYPEPΗDES DE LA FAMILLE "BASIC HELIX-LOOP-HELIX" BHLH, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES CORRESPONDANTES
La présente invention se rapporte à une nouvelle protéine de type bHLH et à la séquence nucléique codante correspondante. Elle vise également des vecteurs 5 d'expression intégrant ladite séquence et l'utilisation de cette séquence ou protéine à des fins thérapeutiques.
Le tube neuronal embryonnaire est à l'origine composé d'un neuroépithélium non différencié sur toute sa longueur. Les cellules se diffférencient ensuite, selon leurs positions sur les axes antérieur/postérieur, dorsal/ventral et médium/latéral générant
10 alors des structures neuronales différentes. Cette différenciation est en partie contrôlée par des facteurs génétiques qui sous-divisent le tube neuronal en plusieurs régions histogéniques. On sait aujourd'hui que de nombreux facteurs transcriptionnels et plus particulièrement des produits codés par des gènes dits bHLH " Basic Hélix Loop Hélix" (Caudy et al., 1988, Cell, 55, 1061 -67) sont impliqués dans ce phénomène de
15 différenciation. Les protéines de cette famille présentent des motifs d'acides aminés très conservés et plus particulièrement un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice 2. Ces deux derniers motifs sont séparés par une boucle de taille variable. Chez les vertébrés, certains produits de ces gènes bHLH participent aux différentes étapes de neurogénèse au cours de la détermination et différenciation neuronales. A titre
20 représentatif de ces protéines, on peut notamment citer les protéines Math-1 (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., 279,8730-38) Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) et NeuroD (Lee et al., 1995, Sciences, 268, 836-44). A l'évidence, d'autres protéines comportant ce domaine bHLH interviennent dans le développement neuronal au niveau d'autres sites et à des temps variables. L'identification de nouvelles protéines de type bHLH serait particulièrement précieuse pour améliorer notre compréhension de la neurogenese et donc avantageuse sur le plan thérapeutique
La présente invention a précisément pour objet l'isolement, le sequençage et la caracteπsation d'un ADNc codant pour un polypeptide appartenant a une nouvelle famille de protéines de type bHLH Elle décrit aussi des ADN recombinants incorporant cette séquence, des vecteurs la contenant et leur utilisation pour activer l'expression de protéines recombinantes
La demanderesse a ainsi mis en évidence un polypeptide possédant une homologie importante avec les protéines bHLH déjà identifiées, homologie limitée au niveau du domaine bHLH En effet, de manière inattendue, les régions bordant ce domaine bHLH ne partagent aucune identité de séquence avec celles des autres protéines de type bHLH
En conséquence, la présente invention a pour premiei objet un polypeptide de type bHLH dote d'une activité transcπptionnelle caractérise en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH
Plus précisément la présente invention se rapporte a un polypeptide possédant une activité transcπptionnelle caractérise en ce qu'il est représente en tout ou partie par la SEQ ID N° 1 ou l'un de ses dérives
Par dérive, on entend au sens de la présente invention les produits comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles que des deletions d'un ou plusieurs résidus, des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus Le nombre de résidus affectes par les modifcations peut être par exemple de 1 2 ou de 3 a 10 20 ou 30 résidus Le terme deπve comprend également les molécules comportant des parties supplémentaires internes ou terminales, de nature peptidique ou non II peut s'agir notamment de parties actives, de marqueurs, d'acides aminés, tels qu'une methionine en position -1 Le terme dérive comprend également les molécules comportant des modifications au niveau de la structure tertiaire (extrémité N-terminale, etc)
Ces dérives peuvent être génères dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinetiques et/ou biologiques
Preferentiellement, les dérives partagent au moins une homologie structurale avec la protéine revendiquée et plus preferentiellement au moins au niveau des régions bordant le domaine bHLH, et conservent sa propriété biologique d'activateur transcπptionnel Les dérives peuvent également apporter de nouvelles propriétés aux polypeptides revendiques (marquage, ) ou améliorer leurs propriétés (stabilité, activité biologique etc)
De préférence, il s'agit d'un polypeptide de type bHLH possédant la séquence représentée en SEQ ID N°l II s'agit plus preferentiellement d'une protéine comprenant un cadre de lecture ouvert, de 214 acides aminés dont l'expression de l'ARNm correspondant est détectée chez l'embryon de rat sous forme de bandes longitudinales Cette protéine est désignée ci-apres sous la denommination Relax pour "Rat Embryonic Longitudinal Axis" et constitute un des objets revendiques selon la présente invention
La comparaison de la séquence d'acides aminés de Relax avec celles de protéines déjà disponibles a permis d'établir une corrélation de séquence essentiellement avec les protéines de type bHLH Par ailleurs, cette homologie a ete localisée uniquement au niveau du domaine bHLH Le domaine bHLH de Relax partage ainsi respectivement 68%, 57% et 40% d'homologie avec les domaines bHLH des protéines NeuroD, Math-1 et Mash-1
Des tests d'activité réalises avec la protéine Relax et plus précisément discutes dans les exemples ci-apres, il ressort que cette protéine est capable de se lier spécifiquement a une séquence de boîte E et que dans des essais de cotransfection, elle se comporte comme un activateur transcπptionnel et que cette activité est strictement dépendante de la présence d'une boîte E intacte L'ensemble de ces observations démontre l'appartenance de la protéine Relax revendiquée a une nouvelle famille de protéines bHLH
La présente invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique susceptible d'exprimer un polypeptide de type bHLH tel que défini précédemment
Plus précisément, la présente invention vise une séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N°l , son brin complémentaire ou son dérive
Les acides nucléiques revendiques peuvent être des fragments d'ADN complémentaire (ADNc), d'ADN genomique (ADNg) ou des fragments d'ARN II s'agit plus preferentiellement d' ADNc ou d'ADNg Au sens de la présente invention, le terme deπve désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison d'une dégénérescence du code génétique obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique ainsi que toute séquence hybπdant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et dont le produit possède l'activité indiquée Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, deletion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus De tels dérives peuvent être génères dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de productioncelui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinetiques et/ou biologiques Parmi les dérives résultant d'une addition, on peut citer par exemple les séquences nucléiques chimères comportant une partie heterologue supplémentaire liée a une extrémité, de type par exemple constructions hybrides consistant en un ADNc auquel serait associe un ou plusieurs introns
De même au sens de l'invention, les acides nucléiques revendiques peuvent comprendre des séquences promotrices, d'activation, de régulation etc
Le terme dérive comprend également les séquences homologues a la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type ou de type substanciellement similaire De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation Les hybridations peuvent être réalisées a partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions de stπngence conventionnelles (Maniatis et al , Cf techniques générales de biologie moléculaire), ou, de préférence, dans des conditions de stπngence élevées
Plus preferentiellement il s'agit de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID N°l ou de son brin complémentaire
La présente invention entend également couvrir les séquences antisens correspondantes dont l'expression permet de contrôler la transcription d'ARNm cellulaires De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie de la séquence nucléique considérée transcrite dans l'orientation inverse Elles sont complémentaires ou significativement complémentaires à la séquence d'acide nucléique en tout ou partie
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides revendiqués pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes Ces activateurs transcriptionnels peuvent être tout particulièrement avantageux pour cibler l'expression d'une protéine au niveau du système nerveux central
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, incorporée ou non dans un ADN recombinant, en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques
Preferentiellement, les séquences nucléiques selon l'invention font partie d'un vecteur utile pour induire in vivo, ex vivo et/ou in vitro l'expression des polypeptides revendiqués Le vecteur utilisé peut être d'origines diverses, dès lors qu'il est capable de transformer les cellules animales, de préférence les cellules nerveuses humaines Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on utilise un vecteur viral, qui peut dériver des adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés (AAV), du virus de l'herpès, du cytomégalovirus (CMV), du virus de la vaccine, etc. Des vecteurs dérivés des adénovirus, des rétrovirus, ou des AAV incorporant des séquences d'acides nucléiques hétérologues ont été décrits dans la littérature [Akli et al , Nature Genetics 3 ( 1993) 224 , Stratford-Perricaudet et al , Human Gène Therapy 1 ( 1990) 241 , EP 185 573. Levrero et al , Gène 101 (1991 ) 195 , Le Gai la Salle et al , Science 259 ( 1993 ) 988 . Roemer et Friedmann, Eur J Biochem 208 ( 1992) 21 1 , Dobson et al , Neuron 5 ( 1990) 353 . Chiocca et al , New Biol 2 ( 1990) 739 . Miyanohara et al , ew Biol 4 (1992) 238 . WO91/18088] La présente invention concerne donc également tout virus recombinant comprenant, insérée dans son génome, une séquence nucléique telle que définie avant
Avantageusement, le virus recombinant selon l'invention est un virus defectif Le terme "virus defectif désigne un virus incapable de se répliquer dans la cellule cible Généralement, le génome des virus defectifs utilises dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires a la rep cation dudit virus dans la cellule infectée Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par l'acide nucléique de l'invention Preferentiellement, le virus defectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires a l'encapsidation des particules virales
Il est particulièrement avantageux d'utiliser les séquences nucléiques de l'invention sous forme incorporée a un adénovirus, un AAV ou un rétrovirus recombinant defectif Selon un mode de réalisation préfère il s'agit d'un adénovirus
II existe différents serotypes d'adenovirus dont la structure et les propriétés varient quelque peu Parmi ces serotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914) Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine bovine murine, (exemple Mavl Beard et al , Virology 75 ( 1990) 81 ) ovine porcine aviaire ou encore simienne (exemple SAV) De préférence l'adenovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus preferentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR- 800) par exemple] De préférence on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte Preferentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région El au moins est non fonctionnelle Le gène viral considère peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, deletion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considères D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO95/02697), E2
(WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) et L5
(WO95/02697) Selon un mode préfère de mise en oeuvre, l'adenovirus comprend une deletion dans les régions El et E4 Selon un autre mode de réalisation préfère, il comprend une deletion dans la région El au niveau de laquelle sont insères la région
E4 et la séquence codant Dans les virus de l'invention, la deletion dans la région E 1 s'étend preferentiellement des nucleotides 455 a 3329 sur la séquence de l'adenovirus
Ad Selon un autre mode de réalisation préfère, la séquence d'acide nucléique exogène est insérée au niveau de la deletion dans la région El
Les virus recombinants defectifs de l'invention peuvent être prépares par recombinaison homologue entre un virus defectif et un plasmide portant entre autre la séquence nucleotidique telle que définie ci-avant (Levrero et al , Gène 101 ( 1991) 195, Graham, EMBO J 3(12) (1984) 2917) La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits virus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (î) être transformable par lesdits éléments, et (u), comporter les séquences capables de complementer la partie du génome du virus defectif de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation d'adenovirus recombinants defectifs on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire uumain 293 (Graham et al J Gen Virol 36 ( 1977) 59) qui contient notamment intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad 5 (12 %) A titre d'exemple de lignée utilisable pour la préparation de rétrovirus recombinants defectifs, on peut mentionner la lignée CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460) Ensuite, les virus qui se sont multiplies sont récupères et purifies selon les techniques classiques de biologie moléculaire
Le vecteur, l'acide nucléique ou le polypeptide de l'invention peut être sous une forme isolée ou purifiée
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence nucleotidique, un vecteur ou un polypeptide selon l'invention
Elle se rapporte également a toute utilisation d'une séquence ou d'un vecteur tels que revendiques pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies affectant le système nerveux
Enfin l'invention s'étend en outre a toute utilisation des polypeptides revendiques pour contrôler et/ou participer a l'expression de gènes
Les exemples et figures présentes ci-apres a titre îllustratif et non limitatif mettent en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention
FIGURES
Figure 1 : Séquence nucleotidique de l'ADNc CIG235 Sur cette séquence sont indiques les différents oligonucleotides utilises pour isoler l'ADNc complet Les flèches indiquent l'orientation 5' vers 3' de ces oligonucleotides Figure 2 : Comparaison des séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille. En noir sont notés les acides aminés homologues, en gris les acides aminés de structure proche.
EXEMPLE 1
Amplification directe par PCR des séquences comprises entre les domaines basique et l'Hélice II à l'aide d'oligonucléotides dégénérés.
L'isolement de l'ADNc codant de nouveaux facteurs de transcription de la famille bHLH est effectué à partir de GCS de rat ( Rat Superior Cervical Ganglia) . Les protéines de cette famille présentant des motifs d'acides amenés très conservés, en particulier un domaine basique suivi des Hélice 1 et Hélice 2, il est choisi des oligonucleotides dégénérés codant ces diverses régions conservées. Ils ont donc été sélectionnés de manière à conserver les régions basiques et le domaine Hélice II du complexe Drosophilia achaete-scute et des gènes mammifères bHLH tels que Mash-1, Mash-2 et M-Twist. De tels oligonucleotides ont été utilisés respectivement comme amorce sens et antisens d'une part, pour réaliser un criblage direct d'une banque de GCS construite par PCR, et d'autre part pour effectuer des PCR sur des ADNc-sb de GCS.
L'oligonucléotide sens a été choisi dans le domaine basique de ces protéines bHLH, il s'agit plus précisément de l'oligonucléotide correspondant au fragment polypeptidique suivant: 5'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (SEQ ID N°2)
L'oligonucléotide antisens a quant à lui été déterminé à partir du domaine Hélice II des mêmes protéines bHLH. Il s'agit de l'oligonucléotide correspondant au fragment polypeptidique suivant : 5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (SEQ ID N°3) L'ADNc monobrin (ss-ADNc) est préparé à partir de 500ng d'ARNpolyA+ dénaturé issu du GCS de rats, âgés de deux jours
L'amplification par PCR est effectuée sur un mélange comprenant outre le tampon PCR (lOmM Tris, pH 8,3, 50mM Kcl, 2,5mM MgC12), 200μM dNTP, 12,5μM de chaque oligonucléotide et environ 20ng de ss-ADNc La PCR est effectué en réalisant successivement 3 minutes de dénaturation à 94°C, 2 cycles ( 94°C pendant 30 sec , 50°C pendant 45 sec , 72°c pendant 1,5 min ) suivis de 38 cycles ( 94C pendant 30 sec , 62°C pendant 45 sec , 72)C pendant 1,5 min ) Les produits de PCR sont clones au site Smal de pUC19 et les 1500 clones ainsi obtenus, analysés par séquençage Nous avons recherché la présence d'un motif Hélice I dans la séquence en acides aminés déduite de la séquence nucleotidique de ces différents ADNc Une large proportion de ces ADNc (670) contiennent un tel motif, et parmi eux, un seul correspond à un nouveau membre possible de la famille bHLH Les autres ADNc isolés correspondent à des protéines bHLH connues
Le nouvel ADNc isolé, appelé C1G235 et représente en figure 1, correspond à un fragment de 76 nucleotides (en excluant les séquences correspondant aux oligonucleotides introduits par la PCR). Les alignements de séquences en acides aminés ont été effectués en n'autorisant ni les insertions ni les délétions Ces alignements montrent que ce fragment code un motif homologue au motif Hélice I des protéines bHLH L'isolement de l'ADNc complet a ensuite été entrepris EXEMPLE 2
Isolement de l'ADNc complet correspondant à CIG235.
L'isolement de l'ADNc complet correspondant a CIG235 a ete extrêmement difficile, car l'ARNm correspondant a CIG235 est très peu exprime dans le GCS II semble même que son niveau d'expression soit proche de celui de la transcription illégitime La technique retenue consiste d'une part a isoler l'extrémité 3' de l'ADNc correspondant a CIG235 par PCR ancrée et d'autre part a isoler l'extrémité 5' de cet ADNc a partir de moelle epmiere d'embryons de rat au stade El 2, 5
/ Extension de l'ADNc CIG235 en 3' pat PCR ancrée
Pour cela, des ADNc-sb de GCS sont prépares avec l'amorce RA3' NV (amorce de transcription inverse aléatoire portant l'ancre 3' NV) selon la méthode Dumas Milne Edwards et al ( 1995, A Pratical Approach Ed McPherson et al , pp89- l 18, IRL Piess Oxford U K ) Deux amorces emboîtées spécifiques sont choisies dans le clone positif bHLH de 76 nucleotides CIG5 5'-AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (SEQ ID N°4) et CIG5'-2 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (SEQ ID N°5)
Nous avons ensuite amplifie l'extrémité 3' de CIG235 par deux PCR emboîtées avec les couples d'oligonucleotides CIG5'1 et A3'_l puis CIG5'2 et A3'_2 Le mélange PCR identifie en exemple 1, est utilise avec seulement 0,8μM de chacun des oligonucleotides et une étape de dénaturation a 94°C pendant 30 sec suivi d'une étape d'elongation a 72°C pendant 1,5 min L'"anneahng" est effectue pendant 45 sec avec des variations de température Lors des dix premiers cycles cette température est réduite de 1 °C tous les deux cycles de 70°C a 65°C puis maintenue a 65°C au cours de 30 cycles Les produits résultant sont clones dans pUC19 et séquences Nous avons ainsi obtenu un ADNc de 717 nucleotides appelé CIG3' dont la partie 5' correspond a 1 extrémité 3 du clone CIG235 L analyse des phases ouvertes de lectures montre que la totalité de la séquence codant l'extrémité carboxy-terminale de la protéine a été isolée avec 321 nucleotides de région 3' non codante
2. Isolement de l'extrémité 5' correspondant à CIG3' à partir de moelle épimère d'embryo de rat au stade El 2.5.
Nous avons recherché par hybridation in situ le patron d'expression de l'ARNm correspondant à CIG3' Son expression est estimée à différents stades du développement embryonnaire La méthode choisie est celle de l'hybridation /// situ sur coupes épaisses d'embryons de rat avec une sonde marquée a la digoxygenine Cette méthode est en fait une adaptation de celle décrite pour l'hybridation m tolo (1994, A Pratical Approach, Ed Wilkinson et al , pp75-83, IRL Press Oxford U K ), et permet de cribler rapidement des embryons entiers à de nombreux stades différents
Une forte expression de cet ARNm a été détectée dans la moelle épiniere, au jour embryonnaire 12 5 (E12 5) Nous avons donc préparé des ARNm à partir de moelle épiniere à ce stade de développement, et effectué l'isolement de l'extrémité 5' par la méthode SLIC Un produit de PCR de 893 nucleotides est isolé et appelé CIG5'
L'ADNc CIG3' et CIG5' se recouvrent sur une région de 120 nucleotides et forment un ADNc total dont la taille est de 1491 nucleotides
Cependant, CIG3' et CIG5' n'ayant pas été isolés a partir du même tissu, il était nécessaire de montrer que le contigue génère par l'alignement de ces deux clones correspondait bien a un ARNm existant et non pas a une chimère générée par PCR Nous avons donc vérifie par PCR, après transcription inverse, que l'ARNm total est présent dans la moelle épiniere à E12 5 Dans ce tissu, une seule amplification par PCR permet de visualiser cet ARNm dans son intégralité De plus, l'analyse des ARNm par Northern blot montre que les sondes CIG3', CIG5' et l'ADNc total permettent toutes trois de détecter un seul ARNm de 3 1 kb Enfin, en hybridation situ, le patron d'expression spatio-temporel obtenu avec CIG3' ou avec l'ADNc total est absolument identique Ces trois résultats nous permettent d'affirmer que CIG3' et CIG5' correspondent bien à deux fragments d'un même ARNm
Afin de s'affranchir des mutations ponctuelles introduites par la Taq polymérase, nous avons effectué, sur des ADNc-sb de moelle à E12 5, quatre amplifications indépendantes de la totalité de l'ADNc Nous avons ainsi pu déterminer de manière fiable la séquence de cet ADNc qui est représenté en SEQ ID N°l
L'analyse de la séquence de l'ADNc montre que nous avons isolé la totalité de la région codante, la région 5' non codante ainsi qu'une partie de la région 3' non traduite De plus, l'expression de l'ARNm correspondant est détectée, chez l'embryon, sous forme de bandes longitudinales Cette caractéristique a conduit à désigner cet ADNc Relax, pour Rat embryonic longitudinal axis
EXEMPLE 3
Comparaison de séquences en acides aminés du domaine bHLH de Relax avec d'autres protéines de la famille BHLH.
L'analyse de la séquence en acides aminés déduite du l'ADNc Relax indique clairement que cette protéine fait partie de la famille des bHLH Le domaine bHLH de Relax partage une identité de 68% avec le motif bHLH de la protéine NeuroD (Lee et coll , 1995) De plus, il apparaît que Relax partage plus d'identités de séquences avec les protéines homologues de ato (Math-1, Akazawa et coll , 1995) qu'avec celles homologues d' AS-C (Mash-1, Johnson et coll , 1990) (Figure 2) Cependant, l'absence totale d'identité de séquence, en dehors du domaine bHLH, avec les autres membres de la famille révèle que Relax n'est pas le paralogue d'une protéine déjà identifiée Pour cette raison, Relax correspond vraisemblablement au premier membre d'une nouvelle sous-famille de protéines bHLH
EXEMPLE 4 Caractérisation de l'activité transcriptionnelle de la protéine Relax
Les analyses de séquences en acides aminés indiquent que Relax partage une communauté de structure avec les protéines de la famille des bHLH Ces protéines sont des facteurs de transcription II est donc important de démontrer que l'ADNc Relax code une protéine dont les caractéristiques sont celles d'un facteur de transcription, c'est a dire que Relax est capable de se fixer a l'ADN sur les sites cibles de facteurs bHLH, et qu'il peut réguler la transcription
1 Les protéines de la famille bHLH forment des homo ou heterodimeres et se fixent spécifiquement a l'ADN (Murre et coll , 1989, Cell, 558, 537-44) La caractérisation in vitio des sites de liaison a l'ADN a permis l'identification d'une séquence hexanucleotidique consensus, C ANNTG dénommée boîte E (Murre et coll , 1989) Nous avons montre, par des expériences de retard de migration sur gel, que la protéine Relax recombinante purifiée est capable de se lier spécifiquement a une séquence contenant une boîte E Pour se faire, l'ADN codant pour la protéine Relax est insère entre les sites Ndel et Kpnl dans un vecteur pFLAG-CTC Apres expression de la protéine dans E coli la protéine de fusion Relax-Flag est purifiée sur colonne d'affinité puis utilisée dans une reaction de binding en présence d'un oligonucléotide contenant une boîte E 2 L'activité transcriptionnelle de la protéine Relax a pour sa part été testée par des expériences de cotransfection dans la lignée cellulaire PC 12, dérivée de phéochromocytomes de rat
Pour cela, nous avons utilisé un gène rapporteur luciférase placé sous le contrôle, d'une part, d'un promoteur contenant une boîte E (5kb du promoteur de la TH) et, d'autre part, d'un même promoteur contenant une boîte E mutée
Parallèlement nous avons préparé un vecteur d'expression de la protéine Relax comme suit
L'ADNc codant pour la protéine Relax ( de la position 389 à 1235) est inséré entre les sites EcoRI et Xhol dans le vecteur d'expression pcDNA3 en aval du promoteur CMV Le promoteur TH du rat portant une boîte E CAGGTG (SEQ ID N° 6) en position 197 sur un fragment de 5kbp est inséré au site HindIII rendu à extrémité franche dans le plasmide pKSLuc qui devient 5kbTH-Luc Le site est muté en TCCGTG( SEQ ID N°7) et le plasmide résultant désigné 5kbTH(Delta E)-Luc
Le plasmide pcDN A3 -Relax est cotransfecté a différentes quantités variant de 0 à 5pmole, et ramené à 5pmole avec du vecteur pcDNA3 vide, dans des cellules PC 12 (106 cellules/plaque) en mélange à lpmole de plamide 5kbTH-Luc, 5kb-TH(deltaE)- Luc ou pKSLuc Pour évaluer l'efficacité de transfection, 0,2pmol d'un vecteur d'expression du gène codant pour la protéine CAT (acétyltransférase chloramphénicol) sous contrôle du promoteur RSV sont également cotransfectés
La mesure de l'activité luciférase, après cotransfection de ces vecteurs avec des quantités croissantes d'un vecteur d'expression de la protéine Relax, démontre que Relax active la transcription du gène rapporteur d'une manière dépendante de la quantité de vecteur d'expression utilisée et que cette activation nécessite strictement la présence d'une boîte E intacte
EXEMPLE 5 Caractérisation des sites d'expression de l'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire
Nous avons analysé de manière systématique, par hybridation m situ, la distribution de l'ARNm Relax chez le rat au cours du développement embryonnaire Pour se faire, des hybridations m situ chez l'embryon de rats sont effectués selon la méthode de Wilkinson avec des ribosondes antisens soit in toto soit sur des sections de 250μm. Les ribosondes sont préparées en présence de lμg de plamide linéarisé et en présence de 3,5 nmol de Digoxygenin-1 1 -UTP en utilisant le kit Ribosonde de Promega ette analyse détaillée montre que l'expression de l'ARNm Relax est transitoire et spatialement restreinte
Cet ARNm n'est présent que chez l'embryon, entre les jours 1 1 5 et 18 5 de développement Son expression est restreinte au système nerveux central En effet, aucune expression n'a été détectée, ni dans le système nerveux périphérique, ni en dehors du système nerveux A l'intérieur du SNC, l'ARNm Relax est exprimé uniquement dans la moelle épiniere, le cerveau postérieur et le cerveau antérieur
Plus précisément, l'ARNm Relax est exprimé dans des compartiments longitudinaux dans la moelle épiniere et le cerveau postérieur
Sa distribution dans la moelle épiniere y est restreinte à deux bandes continues de symétrie bilatérale, organisées longitudinalement et restreintes, sur l'axe D/V, à la lame basale, l'une a son extrémité ventrale, l'autre a son extrémité dorsale Dans le cerveau antérieur, les ARNm Relax sont localises dans deux groupes de cellules situées de part et d'autre du recessus optique, dans la région ventrale de l'hypothalamus et dans l'aire preoptique Le groupe majoritaire des cellules exprimant Relax est situe dans la partie basale Seules les quelques cellules de l'aire preoptique sont situées dans la région alaire La situation dans le cerveau antérieur est semblable a celle dans la moelle epiniere et le cerveau postérieur En effet, les cellules exprimant Relax sont, dans tous les cas strictement localisées dans la zone ventπculaire
EXEMPLE 6
Caractérisation des moments d'expression de l'ARNm Relax au cours du développement embryonnaire
Tous les sites d'expression de Relax apparaissent simultanément a El i 5 Us disparaissent progressivement dans la moelle epiniere entre E16 5 et El 8 5, suivant un gradient ventro-dorsal qui suit la réduction progressive de la zone ventπculaire Dans le cerveau postérieur, l'expression de Relax s'éteint, en même temps que celle de la bande médiane dans la moelle epiniere Enfin, dans le cerveau antérieur, l'expression de Relax disparaît après El 8 5 U est important de souligner que l'expression de Relax est confinée a la zone ventπculaire et que la fenêtre temporelle d'expression coïncide avec celle de la production des neurones dans ces différentes structures LISTE DE SEQUENCES
INFORMATION GENERALE:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(il) TITRE DE L' INVENTION : Polypeptides de la famille bHLH, sequnces d'acides nucléiques correspondantes
(m) NOMBRE DE SEQUENCES : 7
(îv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1
U) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1491 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc in) HYPOTHETIQUE: NON in) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rat
(xi ι DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: gcaggtΩgcgΩgaggagcagtccctgggcccccgttgctgattggcccgtggcacaggcagcΩgcccggcag 72 gcacgctcctggtccgggGagΩgcogotaaagcgtgccaggggocacacgattΩgcBgctcagaag'tccc' c 144 tgggtGtGaccaGtgGacagaggccgaggaαcGcctGcgβgGttctttgctgGCtceagacgcaot' 'tactG 216 caggogBgggcgcctgœgctcagcaaΩacttGgîïagGg:agcagoggggttGogct:*rtccoocgc :gct:tga 288
GtGtgsGαaGccgcagotctGtgttcttttgagccGggogtΩactaggtaacïitttïiggaîiGetcαaaïiggg 360 tagaΩgaggggagtgggtgggcgtactctagtccGgcgtggagtgΩGCtctaagtcagagactgtcîiCîaccc 432
H A P K P L B fl P T I 11 cGcttccattttttGGoaoGC- σαgg ATG GCG CCT CflT CCC TTG GAT GCG CCC ACC ATC 491
O V S Q Σ T Q Q Ï Σ P G A S B K Σ V 29
Cflfl GTG TCC Cflfl GflG flCC CflG Cflfl CCC TTT CCC GGfl GCC TCG GflC CflC Gflfl GTG 5-15
L S S N S T P P S P T L V P P, D C 3 47
CTC flGT TCC flflT TCC flCC CCfl CCT flGC CCC flCT CTC GTfl CCG flGG GflC TGC TCC 599
Σ A Σ fl G I C P, G T 3 P, K L fc fl P, P, 65
Gflfl GCfl Gflfl GCfl ∞T GflC TGC CGfl GGG flCfl TCG flGG flflG CTC CGT GCG CGG CGC 653
G G P, N P. Ï K S Σ L fi L S K Q P, P, 3 83
GGfl GGG CGC flflC flGG CCC flflG flGC GflG TTG GCfl CTG flGC flflG CflG CGfl CGfl flGC 70?
R R K K A H B R I H M R I1 H N L H S 101
CGG CGC flflG flflG GCC flflC GflC CGG GflG CGC flflC CGC flTG CflC flflC CTT flflC TCC 761
A L Ii A L K G V L î T r î D Ii A L 119
GCG CTG GflT GCG CTG CGC GGT GTC CTG CCC flCC TTC CCG GflT GflC GCC flflfl CTT 815
T K I Σ T L R Γ A K N Ύ I W A L T O 137 flCfl flflG ATC GflG flCC CTG CGC TTC GCC CflC flflC TAC ATT TGG GCfl CTG flCT CflG 869
T L P, I fl lJ K 3 Σ Y G P Σ P P V P C 155 flCG CTG CGC ATA GCG GAC CAC flGC TTC TAC GGC CCC GAG CCC CCT GTG CCC TGT 923
G E L G S P G G G S S G D W G S I Y 173
GGG GflG CTG GGfl flGC CCG GGfl GGG GGC TCC flGC GGC GAC TGG GGC TCT ATC TAC 977
S Ï V S Q A G S L S Î T A S L I Σ Γ 191
TCC CCfl GTT TCC CAA GCT GGT flGC CTG flGC CCC ACA GCC TCfl TPG GflG GflG TTC 1031
P G L Q V P S S P S C L L P G T L V 209
CCT GGC CTG CflG GTG CCC flGC TCC CCfl TCC TGT CTG CTC CCG GGC flCC CTG GTG 1085
Σ 3 u Σ L 214
TTC TCfl GflC TTC TTG tgΩagggccGOΩΩcαggccctgggcggtgggcgctggGïigïiΩîïgggïigggïi 1151 gtcΩgagctgtct aaïA gaΩg tagt Ω coαtc Ω αatctcgcαcc'ttc ct ca'ttogtcïi 1223 gtccctgatttoïiGCΩggattcgcacagttccttgctgctgtgcgtgcacaΩTiggïiQϋ'ttgcaggαtgΩtct 1295
GGtαttaocGctGctcsigtgtggccaGCtcaaactcccgctCGaagGagaggogagα.g'tagcaGtaïiatag 1367 ttgggagaGtccαotarttcctggtgactGGgccctctttGoaatctgαgggcctσcïiîiαcoccgα-tttαtα 1439 cogagtgαcctαQtccîqtgttqcgtctt'-'GC'tcactggctcttgttcGîitîi 1491
INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2: fi CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A- LONGUEUR: 24 oa res de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 AATKHGMGIG AGCGCIDKCG CRYG 24
(4) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (in) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3 GGCSRDTYTC AGGGTSYBGA YCTT 24
(5) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il; TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iιι> HYPOTHETIQUE: NON
(ni* ANTI-SENS: NON (χι DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4
AACCTTAACT CCGCGCTGGA TGCGC 25 (6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (ni) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CGCGGTGTCC TGCCCACC 18
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON
(m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAGGTG 6
(6) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7: (î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D; CONFIGURATION: linéaire
(ni TYPE DE MOLECULE: ADNc
(m HYPOTHETIQUE: NOM ,mi ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: :
TCCGTG 5

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide de type bHLH doté d'une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il partage une homologie de séquence avec les protéines de type bHLH uniquement au niveau de son domaine bHLH
2 Polypeptide possédant une activité transcriptionnelle caractérisé en ce qu'il est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N°l ou l'un de ses dérivés
3 Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il possède la séquence représentée en SEQ ID N°l
4 Polypeptide selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce qu'il s'agit de la protéine Relax
5 Séquence d'acides nucléiques codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 a 4
6. Séquence d'acides nucléiques caractérisée en ce qu'elle est représentée en tout ou partie par la SEQ ID N°l, son brin complémentaire ou son dérivé
7 Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est représentée par la SEQ ID N°l ou son brin complémentaire
8 Vecteur comprenant une séquence nucléique selon l'une des revendications 5 à 7
9 Vecteur selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral 10 Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur dérivé des adénovirus, des rétrovirus, des AAV, du virus HSV, CMV ou du virus de la vaccine.
1 1 Vecteur selon les revendications 9 ou 10 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus defectif pour la réplication.
12 Utilisation des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 4 pour contrôler et/ou participer à l'expression de gènes
13 Composition pharmaceutique comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 5 à 7 un ou plusieurs vecteurs selon l'une des revendications 8 à 1 1
14 Composition pharmaceutique comprenant au moins un polypeptide selon la revendication 1 à 4
15 Utilisation d'une séquence selon l'une des revendications 5 à 7 ou d'un vecteur contenant ladite séquence pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de pathologies affectant le système nerveux
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